特表 2024-517760 抗５Ｔ４抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】抗５Ｔ４抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240416BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566750

(86)(22)【出願日】2022-05-02

(85)【翻訳文提出日】2023-11-13

(86)【国際出願番号】 IL2022050451

(87)【国際公開番号】W WO2022234570

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/183,636

(32)【優先日】2021-05-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523405959

【氏名又は名称】イミュノリゾン リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ボギン，オレン

(72)【発明者】

【氏名】ダッサ，リアット

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C085CC02

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、いくつかの抗５Ｔ４抗体を記載する。いくつかの実施形態では、ある特定の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗５Ｔ４抗体が開示される。本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、がんなどの様々な疾患を治療するために使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む、単離された抗５Ｔ４抗体であって、
（ｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２～４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６～８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１０～１２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号１４～１６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号２２～２４のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号３４～３６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号４６～４８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号５４～５６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６２～６４のアミノ酸配列を含む、抗５Ｔ４抗体。

【請求項2】

前記抗体が、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、配列番号１及び５、配列番号９及び１３、配列番号１７及び２１、配列番号２５及び２９、配列番号３３及び３７、配列番号４１及び４５、配列番号４９及び５３、配列番号５７及び６１、配列番号６５～６６、配列番号６７～６８、配列番号６９～７０、配列番号７１～７２、配列番号７３～７４、配列番号７５～７６、配列番号７７～７８、配列番号７９～８０、配列番号８１～８２、配列番号８３～８４、配列番号８５～８６、配列番号８７～８８、配列番号８９～９０、配列番号９１～９２、配列番号９３～９４、配列番号９５～９６、配列番号９７～９８、配列番号９９～１００、配列番号１０１～１０２、配列番号１０３～１０４、配列番号１０５～１０６、配列番号１０７～１０８、配列番号１０９～１１０、配列番号１１１～１１２、配列番号１１３～１１４、配列番号１１５～１１６、配列番号１１７～１１８、配列番号１１９～１２０、配列番号１２１～１２２、配列番号１２３～１２４、配列番号１２５～１２６、配列番号１２７～１２８、配列番号１２９～１３０、配列番号１３１～１３２、配列番号１３３～１３４、配列番号１３５～１３６、配列番号１３７～１３８、配列番号１３９～１４０、配列番号１４１～１４２、配列番号１４３～１４４、配列番号１４５～１４６、配列番号１４７～１４８、配列番号１４９～１５０、又は配列番号１５１～１５２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗５Ｔ４抗体。

【請求項3】

前記抗体が、ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、ナノボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、又は単一ドメイン抗体である、請求項１又は２に記載の抗５Ｔ４抗体。

【請求項4】

前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である、請求項３に記載の抗５Ｔ４抗体。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の抗５Ｔ４抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。

【請求項6】

前記抗５Ｔ４抗体が、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含み、
（ｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２～４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６～８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１０～１２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号１４～１６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号２２～２４のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号３４～３６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号４６～４８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号５４～５６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６２～６４のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記抗５Ｔ４抗体が、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、配列番号１及び５、配列番号９及び１３、配列番号１７及び２１、配列番号２５及び２９、配列番号３３及び３７、配列番号４１及び４５、配列番号４９及び５３、配列番号５７及び６１、配列番号６５～６６、配列番号６７～６８、配列番号６９～７０、配列番号７１～７２、配列番号７３～７４、配列番号７５～７６、配列番号７７～７８、配列番号７９～８０、配列番号８１～８２、配列番号８３～８４、配列番号８５～８６、配列番号８７～８８、配列番号８９～９０、配列番号９１～９２、配列番号９３～９４、配列番号９５～９６、配列番号９７～９８、配列番号９９～１００、配列番号１０１～１０２、配列番号１０３～１０４、配列番号１０５～１０６、配列番号１０７～１０８、配列番号１０９～１１０、配列番号１１１～１１２、配列番号１１３～１１４、配列番号１１５～１１６、配列番号１１７～１１８、配列番号１１９～１２０、配列番号１２１～１２２、配列番号１２３～１２４、配列番号１２５～１２６、配列番号１２７～１２８、配列番号１２９～１３０、配列番号１３１～１３２、配列番号１３３～１３４、配列番号１３５～１３６、配列番号１３７～１３８、配列番号１３９～１４０、配列番号１４１～１４２、配列番号１４３～１４４、配列番号１４５～１４６、配列番号１４７～１４８、配列番号１４９～１５０、又は配列番号１５１～１５２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

請求項１又は２に記載の抗５Ｔ４抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項11】

対象における疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載の抗５Ｔ４抗体を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項12】

前記疾患が、がん、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ、ウイルス感染、又は細菌感染である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記抗５Ｔ４抗体が、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含み、
（ｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２～４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６～８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１０～１２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号１４～１６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号２２～２４のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号３４～３６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号４６～４８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号５４～５６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６２～６４のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記抗５Ｔ４抗体が、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、配列番号１及び５、配列番号９及び１３、配列番号１７及び２１、配列番号２５及び２９、配列番号３３及び３７、配列番号４１及び４５、配列番号４９及び５３、配列番号５７及び６１、配列番号６５～６６、配列番号６７～６８、配列番号６９～７０、配列番号７１～７２、配列番号７３～７４、配列番号７５～７６、配列番号７７～７８、配列番号７９～８０、配列番号８１～８２、配列番号８３～８４、配列番号８５～８６、配列番号８７～８８、配列番号８９～９０、配列番号９１～９２、配列番号９３～９４、配列番号９５～９６、配列番号９７～９８、配列番号９９～１００、配列番号１０１～１０２、配列番号１０３～１０４、配列番号１０５～１０６、配列番号１０７～１０８、配列番号１０９～１１０、配列番号１１１～１１２、配列番号１１３～１１４、配列番号１１５～１１６、配列番号１１７～１１８、配列番号１１９～１２０、配列番号１２１～１２２、配列番号１２３～１２４、配列番号１２５～１２６、配列番号１２７～１２８、配列番号１２９～１３０、配列番号１３１～１３２、配列番号１３３～１３４、配列番号１３５～１３６、配列番号１３７～１３８、配列番号１３９～１４０、配列番号１４１～１４２、配列番号１４３～１４４、配列番号１４５～１４６、配列番号１４７～１４８、配列番号１４９～１５０、又は配列番号１５１～１５２のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表の記述）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体で参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２２年５月２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ－６０４１３３－ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが１３０キロバイトである。

【0002】

（発明の分野）
本開示は、一般的に抗体に関する。一実施形態では、本開示は、抗５Ｔ４抗体及びその抗５Ｔ４抗原結合断片の作製及び使用を記載する。

【背景技術】

【0003】

がんの治療のための免疫療法アプローチの開発を対象とした、かなりの努力がなされてきた。これらの多くは、腫瘍関連抗原（tumor-associated antigen、ＴＡＡ）の標的化に依存する。多数のＴＡＡが同定されているが、全てが安全かつ効果的な免疫標的化を可能にするための適切な特性を有するわけではない。そのような特性としては、正常組織上では高度に制限された発現プロファイルであるが、多くの異なるがん型にわたる広範な発現が挙げられる。更に、細胞表面発現は、抗体標的療法にとって重要な特性である。

【0004】

栄養膜糖タンパク質としても知られている５Ｔ４は、急速に内在化される細胞表面抗原である。５Ｔ４は、母親における半同種移植片としての胎児、又はその宿主における腫瘍の生存を可能にするように機能し得る、共有細胞表面分子を同定しようとする状況において発見された。マウスモノクローナル抗体は、満期ヒト胎盤由来の栄養膜調製物由来の精製糖タンパク質に対して育生され、最初に、異なるがん細胞株及びヒト末梢血単核細胞に対してスクリーニングされた。

【0005】

免疫組織化学によって定義される５Ｔ４の発現が、種々の固形腫瘍（すなわち、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、膵臓がん、食道がん、及び胃がん）において観察されている一方で、正常な成体組織における発現は、限定されていることが見出された。５Ｔ４発現は、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、又は胃がん及び前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病を有する患者における進行疾患及び／又はより悪い臨床転帰に関連している。

【0006】

正常組織再生特性を反映する腫瘍開始細胞の重要な亜集団が、発生しているがんによって利点のために保持及び利用されるという証拠が増えている。ＮＳＣＬＣにおける低分化腫瘍は、より短い患者生存及び治療後の再発までのより短い期間に関連している。ＮＳＣＬＣにおける細胞階層を描写するために患者腫瘍の臨床病理学的分析を伴う複数の実験モデルを使用して、５Ｔ４が腫瘍開始細胞上で発現され、より悪い臨床転帰に関連することが示されている。ＮＳＣＬＣ患者由来異種移植片における５Ｔ４の不均一な発現にもかかわらず、抗５Ｔ４抗体薬物コンジュゲートを用いた治療は、完全かつ持続的な腫瘍退縮をもたらした。したがって、不均一な固形腫瘍の攻撃的増殖は、細胞の５Ｔ４発現亜集団を標的とする治療剤によって遮断することができる。

【0007】

５Ｔ４分子は、いくつかの胚細胞及び腫瘍細胞における細胞表面でのＣＸＣＲ４の機能的発現に関与することが示されている。ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４発現の両方は、多くのがんにおける腫瘍形成に関連しており、ＣＸＣＲ４発現は、肺、肝臓、リンパ節及び骨髄を含む、ＣＸＣＬ１２を高度に発現する組織への拡散を促進すると考えられている。５Ｔ４は、ＢＣＰ－ＡＬＬにおいて推定白血病開始細胞によって発現され、これらの細胞は、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４走化性の関連特性を示す。５Ｔ４陽性白血病開始細胞は、骨髄外部位によって産生されるＣＸＣＬ１２によって引き付けられる可能性が高く、ここでは、治療後の疾患再発につながる、治療的バイオアベイラビリティの減少がある。

【0008】

Ｗｎｔタンパク質細胞内シグナル伝達は、正常な発達、恒常性、及び再生に重要な細胞調節の多くの局面の中心的構成要素であるが、誤調節は、がんを含む疾患につながり得る。２つの経路が存在し、最も特徴付けられているものが、正準Ｗｎｔ／β－カテニン経路である一方で、細胞自律的平面内細胞極性（planar cell polarity、ＰＣＰ）型経路を通した非正準Ｗｎｔシグナル伝達は、がんの発生における細胞移動を促進するアクチン及び微小管骨格の調節を駆動することができる。５Ｔ４は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に干渉し、同時に、非正準Ｗｎｔ経路を活性化することが示されている。

【0009】

５Ｔ４の選択的発現パターン、及び腫瘍開始表現型とのその関連性、並びにがん拡散への機構的関与を考慮して、５Ｔ４を伴ういくつかの異なる免疫療法方略が開発されている。５Ｔ４ワクチン、５Ｔ４抗体、５Ｔ４抗体標的スーパー抗原、並びに５Ｔ４抗体－薬物及び５Ｔ４抗体－キメラ抗原受容体は全て、前臨床研究及び臨床研究においてがん治療のために調査されている。５Ｔ４分子の特異的なペプチド又は配列に対して作製されたいくつかの「５Ｔ４特異的」抗体が生成されているが、そのエピトープは、しばしば同定されておらず、多様な機能及び発現の多数のタンパク質によって共有されるロイシンが豊富な反復を含む５Ｔ４分子の部分を含み得る。したがって、免疫療法的使用のための抗５Ｔ４抗体を更に開発する必要性がある。

【発明の概要】

【0010】

一実施形態では、本開示は、いくつかの抗５Ｔ４抗体を提供する。一実施形態では、抗５Ｔ４抗体の各々は、重鎖上の３つの相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含み、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２～４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号６～８のアミノ酸配列を含むか、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１０～１２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１４～１６のアミノ酸配列を含むか、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号２２～２４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号３４～３６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含むか、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号４６～４８のアミノ酸配列を含むか、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号５４～５６のアミノ酸配列を含むか、又は
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号６２～６４のアミノ酸配列を含む。

【0011】

一実施形態では、抗５Ｔ４抗体の各々は、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の対のうちの１つであり得る：配列番号１及び５、配列番号９及び１３、配列番号１７及び２１、配列番号２５及び２９、配列番号３３及び３７、配列番号４１及び４５、配列番号４９及び５３、配列番号５７及び６１、配列番号６５～６６、配列番号６７～６８、配列番号６９～７０、配列番号７１～７２、配列番号７３～７４、配列番号７５～７６、配列番号７７～７８、配列番号７９～８０、配列番号８１～８２、配列番号８３～８４、配列番号８５～８６、配列番号８７～８８、配列番号８９～９０、配列番号９１～９２、配列番号９３～９４、配列番号９５～９６、配列番号９７～９８、配列番号９９～１００、配列番号１０１～１０２、配列番号１０３～１０４、配列番号１０５～１０６、配列番号１０７～１０８、配列番号１０９～１１０、配列番号１１１～１１２、配列番号１１３～１１４、配列番号１１５～１１６、配列番号１１７～１１８、配列番号１１９～１２０、配列番号１２１～１２２、配列番号１２３～１２４、配列番号１２５～１２６、配列番号１２７～１２８、配列番号１２９～１３０、配列番号１３１～１３２、配列番号１３３～１３４、配列番号１３５～１３６、配列番号１３７～１３８、配列番号１３９～１４０、配列番号１４１～１４２、配列番号１４３～１４４、配列番号１４５～１４６、配列番号１４７～１４８、配列番号１４９～１５０、又は配列番号１５１～１５２。

【0012】

一実施形態では、本開示は、薬学的に受容可能な担体と、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体と、を含む、組成物を提供する。

【0013】

本開示はまた、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体をコードするポリヌクレオチド配列、並びにそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター及び宿主細胞も提供する。

【0014】

一実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、がん、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ、ウイルス感染、又は細菌感染などの疾患を治療するために使用することができる。

【0015】

抗５Ｔ４抗体のこれらの局面及び他の局面は、抗５Ｔ４抗体の図面及び詳細な説明の以降の記載から理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

抗５Ｔ４抗体及びその使用のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、一例のみとして本明細書に記載される。ここで特に図面を詳細に参照すると、示されている詳細は、一例によるものであり、抗５Ｔ４抗体及びその使用の実施形態の例証的考察の目的で示されることが強調されている。この点に関して、図面と併せて行われる説明により、抗５Ｔ４抗体及びその使用の実施形態がどのように実践され得るかが当業者に明らかとなる。

【図1A】ＥＬＩＳＡ（図１Ａ～図１Ｂ）及びＦＡＣｓ（図１Ｃ～図１Ｄ）を使用した、ヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質の結合を示す。図１Ａ～図１Ｂは、皮下（subcutaneous、ｓ．ｃ．）免疫付与（図１Ａ）又は腹腔内（intraperitoneal、ｉ．ｐ）免疫付与（図１Ｂ）後のＥＬＩＳＡによるヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質への血清結合を示す。図１Ｃ～図１Ｄは、ＦＡＣＳ（図１Ｃ）又はＣＨＯ親細胞（図１Ｄ）による５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞への血清結合を示す。ＴＢ２－試験採血２。異なるマウスの参照番号が提供される。ｈＩｇＧ１－陰性結合対照。抗ＴＰＢＧ（anti-trophoblast glycoprotein、抗－栄養膜糖タンパク質）が陽性対照として使用される。

【図1B】ＥＬＩＳＡ（図１Ａ～図１Ｂ）及びＦＡＣｓ（図１Ｃ～図１Ｄ）を使用した、ヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質の結合を示す。図１Ａ～図１Ｂは、皮下（subcutaneous、ｓ．ｃ．）免疫付与（図１Ａ）又は腹腔内（intraperitoneal、ｉ．ｐ）免疫付与（図１Ｂ）後のＥＬＩＳＡによるヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質への血清結合を示す。図１Ｃ～図１Ｄは、ＦＡＣＳ（図１Ｃ）又はＣＨＯ親細胞（図１Ｄ）による５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞への血清結合を示す。ＴＢ２－試験採血２。異なるマウスの参照番号が提供される。ｈＩｇＧ１－陰性結合対照。抗ＴＰＢＧ（anti-trophoblast glycoprotein、抗－栄養膜糖タンパク質）が陽性対照として使用される。

【図1C】ＥＬＩＳＡ（図１Ａ～図１Ｂ）及びＦＡＣｓ（図１Ｃ～図１Ｄ）を使用した、ヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質の結合を示す。図１Ａ～図１Ｂは、皮下（subcutaneous、ｓ．ｃ．）免疫付与（図１Ａ）又は腹腔内（intraperitoneal、ｉ．ｐ）免疫付与（図１Ｂ）後のＥＬＩＳＡによるヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質への血清結合を示す。図１Ｃ～図１Ｄは、ＦＡＣＳ（図１Ｃ）又はＣＨＯ親細胞（図１Ｄ）による５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞への血清結合を示す。ＴＢ２－試験採血２。異なるマウスの参照番号が提供される。ｈＩｇＧ１－陰性結合対照。抗ＴＰＢＧ（anti-trophoblast glycoprotein、抗－栄養膜糖タンパク質）が陽性対照として使用される。

【図1D】ＥＬＩＳＡ（図１Ａ～図１Ｂ）及びＦＡＣｓ（図１Ｃ～図１Ｄ）を使用した、ヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質の結合を示す。図１Ａ～図１Ｂは、皮下（subcutaneous、ｓ．ｃ．）免疫付与（図１Ａ）又は腹腔内（intraperitoneal、ｉ．ｐ）免疫付与（図１Ｂ）後のＥＬＩＳＡによるヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質への血清結合を示す。図１Ｃ～図１Ｄは、ＦＡＣＳ（図１Ｃ）又はＣＨＯ親細胞（図１Ｄ）による５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞への血清結合を示す。ＴＢ２－試験採血２。異なるマウスの参照番号が提供される。ｈＩｇＧ１－陰性結合対照。抗ＴＰＢＧ（anti-trophoblast glycoprotein、抗－栄養膜糖タンパク質）が陽性対照として使用される。

【図2】選択されたマウスハイブリドーマクローンの同一性の表を提供する。

【図3A】還元条件下での精製ｍＡｂクローンのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図3B】還元条件下での精製ｍＡｂクローンのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図4A】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4B】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4C】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4D】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4E】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4F】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4G】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4H】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4I】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4J】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4K】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4L】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4M】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4N】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4O】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図4P】代表的な精製ｍＡｂクローン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８、及び１９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。

【図5A】代表的な精製ｍＡｂクローンのＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

【図5B】代表的な精製ｍＡｂクローンのＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

【図5C】代表的な精製ｍＡｂクローンのＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

【図5D】代表的な精製ｍＡｂクローンのＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

【図6A】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図6B】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図6C】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図6D】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図6E】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図6F】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図6G】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図6H】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図６Ａ～図６Ｃ）、ｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ（図６Ｄ～図６Ｆ）、及びＭＣＦ－７乳がん細胞株（図６Ｇ～図６Ｈ）との代表的な精製ｍＡｂクローンのＦＡＣＳ結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｍＩｇＧ（mouseIgG、マウスＩｇＧ）は、陰性対照マウスＩｇＧである。ｈＩｇＧ（human IgG、ヒトＩｇＧ）は、陰性対照ヒトＩｇＧである。抗５Ｔ４ Ａｂは、陽性対照ｈＩｇＧ抗体である。

【図7A】選択された精製ｍＡｂのＯｃｔｅｔ分析を示し、図７Ａ～図７Ｆは、代表的なｍＡｂクローンのＯｃｔｅｔ試験分析データを提供し、図７Ｇは、ランク付けされたＫＤ値を要約する。

【図7B】選択された精製ｍＡｂのＯｃｔｅｔ分析を示し、図７Ａ～図７Ｆは、代表的なｍＡｂクローンのＯｃｔｅｔ試験分析データを提供し、図７Ｇは、ランク付けされたＫＤ値を要約する。

【図7C】選択された精製ｍＡｂのＯｃｔｅｔ分析を示し、図７Ａ～図７Ｆは、代表的なｍＡｂクローンのＯｃｔｅｔ試験分析データを提供し、図７Ｇは、ランク付けされたＫＤ値を要約する。

【図7D】選択された精製ｍＡｂのＯｃｔｅｔ分析を示し、図７Ａ～図７Ｆは、代表的なｍＡｂクローンのＯｃｔｅｔ試験分析データを提供し、図７Ｇは、ランク付けされたＫＤ値を要約する。

【図7E】選択された精製ｍＡｂのＯｃｔｅｔ分析を示し、図７Ａ～図７Ｆは、代表的なｍＡｂクローンのＯｃｔｅｔ試験分析データを提供し、図７Ｇは、ランク付けされたＫＤ値を要約する。

【図7F】選択された精製ｍＡｂのＯｃｔｅｔ分析を示し、図７Ａ～図７Ｆは、代表的なｍＡｂクローンのＯｃｔｅｔ試験分析データを提供し、図７Ｇは、ランク付けされたＫＤ値を要約する。

【図7G】選択された精製ｍＡｂのＯｃｔｅｔ分析を示し、図７Ａ～図７Ｆは、代表的なｍＡｂクローンのＯｃｔｅｔ試験分析データを提供し、図７Ｇは、ランク付けされたＫＤ値を要約する。

【図8】そのエピトープにおいて区別される３つの主要な群を同定するＥＬＩＳＡによって実施されたエピトープビニング分析を示す。群１（連続線の円）、群２（破線の四角）、及び群３（破線の円）。

【図9A】ＥＬＩＳＡによる（図９Ａ）、ＣＨＯ細胞を用いたＦＡＣＳによる（図９Ｂ）、及びＭＣＦ－７細胞を用いたＦＡＣＳによる（図９Ｃ）、精製キメラ５Ｔ４ ｍＡｂのいくつかの実施形態の結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｈＩｇＧは、陰性対照ヒトＩｇＧである。

【図9B】ＥＬＩＳＡによる（図９Ａ）、ＣＨＯ細胞を用いたＦＡＣＳによる（図９Ｂ）、及びＭＣＦ－７細胞を用いたＦＡＣＳによる（図９Ｃ）、精製キメラ５Ｔ４ ｍＡｂのいくつかの実施形態の結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｈＩｇＧは、陰性対照ヒトＩｇＧである。

【図9C】ＥＬＩＳＡによる（図９Ａ）、ＣＨＯ細胞を用いたＦＡＣＳによる（図９Ｂ）、及びＭＣＦ－７細胞を用いたＦＡＣＳによる（図９Ｃ）、精製キメラ５Ｔ４ ｍＡｂのいくつかの実施形態の結合を示す。Ｔａｂは、陽性対照抗体である。ｈＩｇＧは、陰性対照ヒトＩｇＧである。

【図10A】トリボディ（Tribody）構造の実施形態（図１０Ａ）及びプロトリボディ（ProTribody）構造の実施形態（図１０Ｂ）を示す。ＶＬ－抗ＣＤ３ Ｆａｂの軽鎖可変領域、ＶＨ－抗ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖可変領域、ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン、抗ＮＫ－抗ナチュラルキラー細胞抗原、抗ＴＡＡ－抗腫瘍関連抗原。ＣＤ３ＣＡＰ－Ｃｄ３抗原への抗ＣＤ３結合を遮断するマスキング部分。これらの２つの実施形態に示されるリンカー（プロテアーゼ切断を伴う、又は伴わない）は、同じであり得るか、若しくは異なり得るか、又はいくつかの実施形態では、いずれの所与の位置にも存在しない場合がある。

【図10B】トリボディ（Tribody）構造の実施形態（図１０Ａ）及びプロトリボディ（ProTribody）構造の実施形態（図１０Ｂ）を示す。ＶＬ－抗ＣＤ３ Ｆａｂの軽鎖可変領域、ＶＨ－抗ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖可変領域、ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン、抗ＮＫ－抗ナチュラルキラー細胞抗原、抗ＴＡＡ－抗腫瘍関連抗原。ＣＤ３ＣＡＰ－Ｃｄ３抗原への抗ＣＤ３結合を遮断するマスキング部分。これらの２つの実施形態に示されるリンカー（プロテアーゼ切断を伴う、又は伴わない）は、同じであり得るか、若しくは異なり得るか、又はいくつかの実施形態では、いずれの所与の位置にも存在しない場合がある。

【図11】ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析された発現されたトリボディ抗体構築物の実施形態を示す。各構築物の配列番号の同定については、表１を参照されたい。Ｒ－還元条件下。ＮＲ－非還元条件下。

【図12A】抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ５３）を含むトリボディ抗体構築物（ＩＭ－１２２２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図１２Ａ）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析（図１２Ｂ）を示す。

【図12B】抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ５３）を含むトリボディ抗体構築物（ＩＭ－１２２２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図１２Ａ）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析（図１２Ｂ）を示す。

【図13A】還元条件下にある（図１３Ａ）及びインタクトである（図１３Ｂ）、抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ５３）を含むトリボディ構築物（ＩＭ－１２２２）のＭＳ分析を示す。

【図13B】還元条件下にある（図１３Ａ）及びインタクトである（図１３Ｂ）、抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ５３）を含むトリボディ構築物（ＩＭ－１２２２）のＭＳ分析を示す。

【図14A】抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ２４）を含むトリボディ抗体構築物（ＩＭ－１１７８）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１４Ａ）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図１４Ｂ）分析を示す。

【図14B】抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ２４）を含むトリボディ抗体構築物（ＩＭ－１１７８）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１４Ａ）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図１４Ｂ）分析を示す。

【図15A】還元条件下にある（図１５Ａ）及びインタクトである（図１５Ｂ）、抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ２４）を含むトリボディ構築物のＭＳ分析を示す。

【図15B】還元条件下にある（図１５Ａ）及びインタクトである（図１５Ｂ）、抗５Ｔ４結合ドメイン（５Ｔ４＿ＩＭ２４）を含むトリボディ構築物のＭＳ分析を示す。

【図16A】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図16B】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図16C】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図16D】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図16E】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図16F】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図16G】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図16H】異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ抗体構築物の異なる実施形態の結合についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。

【図17A】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17B】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17C】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17D】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17E】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17F】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17G】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17H】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17I】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17J】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17K】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17L】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17M】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17N】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図17O】ヒト５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞（図１７Ａ～図１７Ｈ）又はＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞株（図１７Ｉ～図１７Ｏ）への異なる抗５Ｔ４結合ドメインを含む精製ヒト化トリボディ構築物の結合についてのＦＡＣＳスクリーニングを示す。

【図18A】ＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞（図１８Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳腺がん細胞（図１８Ｂ）についてヒト化トリボディ構築物の異なる実施形態によって媒介されるインビトロ細胞傷害性を示す。トリボディＩＭ１２２２は、５Ｔ４＿ＩＭ５３抗５Ｔ４結合ドメインを含む。トリボディＩＭ１０６２は、陽性対照抗５Ｔ４結合ドメインを含み、トリボディＩＭ１１８４は、ＣＤ３ ＣＡＰ部分を有する陽性対照抗５Ｔ４結合ドメインを含む。

【図18B】ＮＣＩ－Ｈ２２６肺がん細胞（図１８Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳腺がん細胞（図１８Ｂ）についてヒト化トリボディ構築物の異なる実施形態によって媒介されるインビトロ細胞傷害性を示す。トリボディＩＭ１２２２は、５Ｔ４＿ＩＭ５３抗５Ｔ４結合ドメインを含む。トリボディＩＭ１０６２は、陽性対照抗５Ｔ４結合ドメインを含み、トリボディＩＭ１１８４は、ＣＤ３ ＣＡＰ部分を有する陽性対照抗５Ｔ４結合ドメインを含む。

【図19】異種移植マウスモデルにおけるトリボディ構築物のインビボ有効性。使用されたトリボディ構築物は各々、単一の５Ｔ４結合ドメインを含む。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示は、単離された抗５Ｔ４抗体を提示し、抗５Ｔ４ ｍＡｂの独自のＣＤＲ配列は、ヒト化フレームワーク内に提供される（キメラ抗体、ヒト化抗体）。加えて、多価抗体構築物へのこれらの抗５Ｔ４抗体の５Ｔ４抗原結合領域の組み込みが実証される。本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、医学的状態、例えば、がんに対する免疫療法的治療として潜在的に使用され得る。

【0018】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、全て同じ質及び意味を有する、「免疫グロブリン」という用語と互換的に使用され得る。抗体結合ドメイン又は抗原結合部位は、抗体の断片、又は抗体の１つ以上の断片の遺伝子操作された産物であり得、この断片は、標的抗原との特異的結合に関与する。「特異的に結合する」とは、結合が目的の抗原について選択的であり、不要又は非特異的な相互作用と区別することができることを意味する。例えば、抗体は、平衡解離定数が≦１０^－５、１０^－６、又は１０^－７Ｍであるときに、５Ｔ４エピトープに特異的に結合すると言われる。いくつかの実施形態では、平衡解離定数は、≦１０^－８Ｍ又は１０^－９Ｍであり得る。いくつかの更なる実施形態では、平衡解離定数は、≦１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、又は１０^－１２Ｍであり得る。いくつかの実施形態では、平衡解離定数は、≦１０^－５Ｍ～１０^－１２Ｍの範囲内であり得る。

【0019】

最大半量有効濃度（half maximal effective concentration、ＥＣ_５０）は、指定された曝露時間後にベースラインと最大応答との間の中間の応答を誘導する、薬物、抗体、又は毒物の濃度を指す。いくつかの実施形態では、応答は、結合親和性を含む。いくつかの実施形態では、応答は、機能的応答、例えば、アゴニスト応答を含む。当業者は、ある特定の実施形態において本明細書で使用される場合、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体のＥＣ_５０測定が、５Ｔ４抗原への抗５Ｔ４抗体の最大半量結合（ＥＣ_５０結合）の尺度を提供することを理解するであろう。当業者は、ある特定の実施形態において本明細書で使用される場合、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体のＥＣ_５０測定が、アゴニスト応答を誘導する抗５Ｔ４抗体の最大半量有効濃度（ＥＣ_５０機能的アゴニズム）の尺度を提供することを理解するであろう。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＥＣ_５０は、抗体結合時に観察されるであろう５０％アゴニスト応答を得るために必要とされる抗体の濃度を含む。ある特定の実施形態では、ＥＣ_５０の尺度は、薬物の効力の尺度として一般に使用され、いくつかの実施形態では、受容体への抗体の結合を反映し得る。いくつかの実施形態では、ナノモルＥＣ_５０結合濃度測定値を有する抗５Ｔ４抗体は、緊密結合抗５Ｔ４抗体を含む。いくつかの実施形態では、ナノモルＥＣ_５０機能的アゴニズム濃度測定値を有する抗５Ｔ４抗体は、機能的に有効なアゴニスト抗体を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ４分子への緊密な結合剤を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ４分子に対するアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ４分子に対する緊密結合アゴニストを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、ナノモル範囲内である。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約２０～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約４０～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約６０～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約８０～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０５～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約０．０１～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の結合ＥＣ_５０は、約１～１５ｎＭの範囲を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、機能的アゴニズムを測定するＥＣ_５０は、本明細書では全て同じ性質を有する機能ＥＣ_５０と称される。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、ナノモル範囲内である。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの態様において、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は約０．１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの態様において、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～２０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約２０～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約４０～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約６０～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約８０～１００ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～４０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～６０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～８０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～５０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～２０ｎＭの範囲を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は約０．１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は約１～５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約５～１０ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０５～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約０．０１～１５ｎＭの範囲を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体の機能的ＥＣ_５０は、約１～１５ｎＭの範囲を含む。

【0025】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ＩｇＧ、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び単一ドメイン抗体を含むがこれらに限定されない、結合特異性を保持する１つ又は複数の抗体断片を包含する（例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照）。また、ヒト化抗体、霊長類化抗体、及びキメラ抗体も、これらの用語が当技術分野で一般に理解されるため、包含される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、抗原結合部位が調節ドメインによって遮断され得る前駆体構築物を含み、結合部位の曝露は、環境条件に基づく調節された曝露、例えば、限定されないが、腫瘍微小環境への曝露を含む。

【0026】

本明細書で使用される場合、「重鎖可変領域」という用語は、全て同じ意味及び質を有する、「ＶＨドメイン」という用語又は「ＶＨ」という用語と互換的に使用され得る。本明細書で使用される場合、「軽鎖可変領域」という用語は、全て同じ意味及び質を有する、「ＶＬドメイン」という用語又は「ＶＬ」という用語と互換的に使用され得る。当業者は、抗体に関する「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」が、フレームワーク領域として知られる隣接伸長間に間置された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖の断片を包含することを認識するであろう。フレームワーク領域は、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを支持する足場を形成する。同様に、当業者はまた、抗体に関する「軽鎖可変領域」又は「ＶＬ」が、フレームワーク領域間に間置された３つのＣＤＲを含む軽鎖の断片を包含することも認識するであろう。

【0027】

本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、重鎖又は軽鎖可変領域の超可変領域を指す。Ｎ末端から進んで、重鎖又は軽鎖ポリペプチドの各々は、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」として表される３つのＣＤＲを有する。いくつかの抗原－抗体複合体の結晶学的分析は、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原と広範な接触を形成することを実証している。したがって、ＣＤＲ領域は、主に抗原結合部位の特異性に関与する。一実施形態では、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖可変領域の各々からのＣＤＲを含む、６つのＣＤＲを含む。

【0028】

本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」という用語は、重鎖又は軽鎖可変領域のＣＤＲをフレーム化する４つの隣接アミノ酸配列を指す。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原に接触し得る。しかしながら、ＦＲ残基は、主に可変領域を抗原結合部位に折り畳むことに関与する。いくつかの実施形態では、可変領域の折り畳みに関与するＦＲ残基は、ＣＤＲに直接隣接する残基を含む。ＦＲ内では、ある特定のアミノ残基及びある特定の構造的特徴が、非常に高度に保存されている。この点に関して、全ての可変領域配列は、約９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。可変領域が抗原結合部位に折り畳まれるとき、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして表される。正確なＣＤＲアミノ酸配列にかかわらず、ある特定の「正準」構造へのＣＤＲループの折り畳み形状に影響を及ぼすＦＲの保存された構造領域が存在することが一般に認識されている。更に、ある特定のＦＲ残基は、抗体重鎖及び軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合性ドメイン間接触に関与することが知られている。

【0029】

抗体は、限定されないが、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域（Ｆｖ）、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、及びＦａｂ断片を含む、様々な形態で、又は様々なドメインを有して存在し得る。

【0030】

当業者は、ｓｃＦｖが、短いリンカーペプチドによって連結された免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む、融合ポリペプチドであることを理解するであろう。リンカーは、例えば、１０～約２５個のアミノ酸を有し得る。

【0031】

当業者はまた、抗体に関する「Ｆａｂ」という用語が、一般に、ジスルフィド結合によって単一重鎖の可変領域及び第１の定常領域に結合された単一軽鎖（可変領域及び定常領域の両方）からなる抗体の部分を包含する一方で、Ｆ（ａｂ’）_２が、ＶＨドメインを含む重鎖及びＶＬドメインを含む軽鎖の断片を含むことも理解するであろう。

【0032】

いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む、全抗体分子を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）断片、可変軽鎖（ＶＬ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディを含むがこれらに限定されない、結合特異性を保持する１つ又は複数の抗体断片を包含する。

【0033】

一実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、二重特異性抗体の一部として組み込まれ得る。一実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、多重特異性抗体の一部として組み込まれ得る。当技術分野で一般に公知であるように、二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片を含み、それによって、２つの異なる抗原に結合することが可能である、組換えタンパク質である。一実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、三重特異性抗体の一部として組み込まれ得る。一実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、多重特異性抗体の一部として組み込まれ得る。同様に、多重特異性抗体は、２つ、３つ又は４つの異なるモノクローナル抗体などの少なくとも２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片を含む、組換えタンパク質である。

【0034】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ４に対して二価である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ５の結合に対して一価である。

【0035】

いくつかの実施形態では、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性抗体は、１つより多くの抗原標的、例えば、限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T cell、ＣＴＬ）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を同時に標的化することによって、又は１つより多くのＣＴＬを同時に標的化すること、例えば、ＣＤ３、エフェクターナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞、及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などのＣＴＬ受容体成分を標的化することによって、がん免疫療法に使用され、例えば、ＴＡＡは、５Ｔ４を含む。

【0036】

抗５Ｔ４抗体
本開示は、いくつかの抗５Ｔ４抗体を提供する。一実施形態では、抗５Ｔ４抗体の各々は、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、軽鎖上の３つのＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む。

【0037】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２～４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号６～８のアミノ酸配列を含む。

【0038】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１０～１２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１４～１６のアミノ酸配列を含む。

【0039】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号２２～２４のアミノ酸配列を含む。

【0040】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を含む。

【0041】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号３４～３６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含む。

【0042】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号４６～４８のアミノ酸配列を含む。

【0043】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号５４～５６のアミノ酸配列を含む。

【0044】

一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号６２～６４のアミノ酸配列を含む。

【0045】

一実施形態では、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖上の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗５Ｔ４抗体は、
（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２～４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６～８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１０～１２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号１４～１６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号２２～２４のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号３４～３６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号４６～４８のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号５４～５６のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖｉｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、配列番号６２～６４のアミノ酸配列を含む、抗体を含む。

【0046】

別の実施形態では、抗５Ｔ４抗体は、上記に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一である重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。

【0047】

一実施形態では、本明細書に提示される抗５Ｔ４抗体の各々は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の対のうちの１つであり得る：配列番号１及び５、配列番号９及び１３、配列番号１７及び２１、配列番号２５及び２９、配列番号３３及び３７、配列番号４１及び４５、配列番号４９及び５３、配列番号５７及び６１、配列番号６５～６６、配列番号６７～６８、配列番号６９～７０、配列番号７１～７２、配列番号７３～７４、配列番号７５～７６、配列番号７７～７８、配列番号７９～８０、配列番号８１～８２、配列番号８３～８４、配列番号８５～８６、配列番号８７～８８、配列番号８９～９０、配列番号９１～９２、配列番号９３～９４、配列番号９５～９６、配列番号９７～９８、配列番号９９～１００、配列番号１０１～１０２、配列番号１０３～１０４、配列番号１０５～１０６、配列番号１０７～１０８、配列番号１０９～１１０、配列番号１１１～１１２、配列番号１１３～１１４、配列番号１１５～１１６、配列番号１１７～１１８、配列番号１１９～１２０、配列番号１２１～１２２、配列番号１２３～１２４、配列番号１２５～１２６、配列番号１２７～１２８、配列番号１２９～１３０、配列番号１３１～１３２、配列番号１３３～１３４、配列番号１３５～１３６、配列番号１３７～１３８、配列番号１３９～１４０、配列番号１４１～１４２、配列番号１４３～１４４、配列番号１４５～１４６、配列番号１４７～１４８、配列番号１４９～１５０、又は配列番号１５１～１５２。別の実施形態では、抗５Ｔ４抗体は、上記に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一であるＶＨ及びＶＬ配列を含む。

【0048】

一実施形態では、本明細書に開示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を考慮して、当業者は、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖを構築するために当技術分野で公知の標準的技法を容易に採用するであろう。

【0049】

ある特定の実施形態では、本開示は、好適な条件下で二量体化され得るＶＨ及びＶＬドメインを含むポリペプチドを提供する。例えば、ＶＨ及びＶＬドメインは、好適な緩衝液中で組み合わせられ、疎水性相互作用などの適切な相互作用を通して二量体化され得る。別の実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインの二量体化を促進し得る酵素及び／又は補因子を含有する好適な緩衝液中で組み合わせられ得る。別の実施形態では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、好適な試薬及び／又は触媒の存在下でそれらが互いに反応することを可能にする好適なビヒクル中で組み合わせられ得る。

【0050】

ある特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、定常領域、ヒンジ領域、リンカー領域、Ｆｃ領域、若しくはジスルフィド結合領域、又はそれらの任意の組み合わせを含み得るがこれらに限定されない、より長いポリペプチド配列内に含まれ得る。定常ドメインは、定常領域のドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｃｋ、Ｃｌ）とも称される、免疫グロブリン分子の定常部分の免疫グロブリン折り畳み単位である。いくつかの実施形態では、より長いポリペプチドは、例えば、本明細書で生成されるポリペプチドが、ダイアボディ又はトリアボディを形成するために使用されるときに、本明細書に開示される方法に従って生成されるＶＨ及びＶＬドメインの一方又は両方の複数のコピーを含み得る。

【0051】

一実施形態では、本明細書に提示される抗５Ｔ４抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、ナノボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、又は単一ドメイン抗体であり得る。例えば、抗５Ｔ４抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などのＩｇＧであり得る。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体は、ＩｇＧ１を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体は、ＩｇＧ２を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体は、ＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４抗体は、ＩｇＧ４を含む。

【0052】

一実施形態では、本開示は、５Ｔ４に高い親和性で結合する抗体を提供する。一実施形態では、結合親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１－１０６，１９７９）によって記載されるスキャッチャード法の修正によって計算される。別の実施形態では、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。別の実施形態では、結合親和性は、競合放射免疫測定法によって測定される。別の実施形態では、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。別の実施形態では、抗体親和性は、フローサイトメトリーによって測定される。

【0053】

一実施形態では、本開示はまた、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖ＣＤＲをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列も提供する。別の実施形態では、本開示はまた、そのようなポリヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。本明細書に開示されるアミノ酸配列を考慮して、当業者は、アミノ酸配列をコードするようにベクター又はプラスミドを容易に構築するであろう。別の実施形態では、本開示はまた、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞も提供する。使用及び実験条件に応じて、当業者は、上述のポリヌクレオチド配列を担持及び／又は発現するために好適な宿主細胞を容易に採用するであろう。

【0054】

一実施形態では、本開示はまた、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖可変領域をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列も提供する。別の実施形態では、本開示はまた、そのようなポリヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。本明細書に開示されるアミノ酸配列を考慮して、当業者は、このアミノ酸配列をコードするようにベクター又はプラスミドを容易に構築するであろう。別の実施形態では、本開示はまた、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞も提供する。使用及び実験条件に応じて、当業者は、上述のポリヌクレオチド配列を担持及び／又は発現するために好適な宿主細胞を容易に採用するであろう。

【0055】

使用のための組成物
一実施形態では、本開示はまた、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物も提供する。有用な薬学的に受容される担体は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５は、本明細書に開示される抗体の薬学的送達に好適な組成物及び製剤を記載している。一実施形態では、組成物は、重鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、軽鎖上の３つのＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む、抗５Ｔ４抗体を含む。

【0056】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２～４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号６～８のアミノ酸配列を含む。

【0057】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、配列番号１０～１２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１４～１６のアミノ酸配列を含む。

【0058】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号２２～２４のアミノ酸配列を含む。

【0059】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号２６～２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３０～３２のアミノ酸配列を含む。

【0060】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、配列番号３４～３６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含む。

【0061】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号４６～４８のアミノ酸配列を含む。

【0062】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号５４～５６のアミノ酸配列を含む。

【0063】

組成物のいくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、配列番号６２～６４のアミノ酸配列を含む。

【0064】

他の実施形態では、組成物は、上記に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一である重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。

【0065】

別の実施形態では、組成物は、以下の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の対のうちの１つを有する抗５Ｔ４抗体を含む：配列番号１及び５、配列番号９及び１３、配列番号１７及び２１、配列番号２５及び２９、配列番号３３及び３７、配列番号４１及び４５、配列番号４９及び５３、配列番号５７及び６１、配列番号６５～６６、配列番号６７～６８、配列番号６９～７０、配列番号７１～７２、配列番号７３～７４、配列番号７５～７６、配列番号７７～７８、配列番号７９～８０、配列番号８１～８２、配列番号８３～８４、配列番号８５～８６、配列番号８７～８８、配列番号８９～９０、配列番号９１～９２、配列番号９３～９４、配列番号９５～９６、配列番号９７～９８、配列番号９９～１００、配列番号１０１～１０２、配列番号１０３～１０４、配列番号１０５～１０６、配列番号１０７～１０８、配列番号１０９～１１０、配列番号１１１～１１２、配列番号１１３～１１４、配列番号１１５～１１６、配列番号１１７～１１８、配列番号１１９～１２０、配列番号１２１～１２２、配列番号１２３～１２４、配列番号１２５～１２６、配列番号１２７～１２８、配列番号１２９～１３０、配列番号１３１～１３２、配列番号１３３～１３４、配列番号１３５～１３６、配列番号１３７～１３８、配列番号１３９～１４０、配列番号１４１～１４２、配列番号１４３～１４４、配列番号１４５～１４６、配列番号１４７～１４８、配列番号１４９～１５０、又は配列番号１５１～１５２。別の実施形態では、組成物は、上記に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一であるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。

【0066】

組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、コンジュゲートの形態であり得る。本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」は、エフェクター分子又は第２のタンパク質（第２の抗体など）に共有結合された抗体又は抗体断片（抗原結合断片など）である。エフェクター分子は、例えば、薬物、毒素、治療剤、検出可能な標識、タンパク質、核酸、脂質、ナノ粒子、炭水化物、又は組換えウイルスであり得る。抗体コンジュゲートは、「イムノコンジュゲート」とも称され得る。コンジュゲートが薬物（例えば、細胞傷害剤）に連結された抗体を含むとき、コンジュゲートは、「抗体薬物コンジュゲート」と称され得る。他の抗体コンジュゲートとしては、例えば、多重特異性（例えば、二重特異性又は三重特異性）抗体及びキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）が挙げられる。

【0067】

抗５Ｔ４抗体又はその抗原結合断片を含む組成物は、単独で、又は担体、すなわち、薬学的に受容される担体と組み合わせて、対象（例えば、ヒト又は動物）に投与することができる。薬学的に許容されるとは、生物学的に又は別様に望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、当該物質は、いずれの望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、又はそれが含有される医薬組成物の他の成分のうちのいずれかと有害な様式で相互作用することなく、対象に投与することができる。当業者に周知となるように、担体は、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれの分解も最小限にするように、かつ対象におけるいずれの有害な副作用も最小限にするように選択される。医薬組成物は、医薬分野で周知の任意の方法論によって調製され得る。

【0068】

本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、局所又は全身治療が所望されるかどうかに応じて、任意の好適な様式で（例えば、哺乳動物、細胞、又は組織に）投与することができる。例えば、組成物は、局所的に（例えば、眼科的に、経膣的に、直腸に、鼻腔内に、経皮的に、及び同等物）、経口で、吸入によって、又は非経口で（静脈内点滴、又は皮下、腔内、腹腔内、皮内、若しくは筋肉内注射によるものを含む）投与することができる。局所鼻腔内投与は、鼻孔の一方又は両方を通した鼻及び鼻腔内への組成物の送達を指す。組成物は、噴霧機構若しくは液滴機構によって、又はエアロゾル化を通して送達することができる。代替的に、投与は、腫瘍内、例えば、局所又は静脈内注射であり得る。

【0069】

組成物が非経口で投与される場合、投与は、一般に注射によるものである。注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液、注射前の液体中の懸濁に好適な固体形態、又はエマルションのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。加えて、非経口投与は、一定の投与量を維持するように、徐放又は持続放出系の調製を伴うことができる。

【0070】

使用方法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、疾患又は状態を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、がんなどの疾患を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、ワクチンの成分として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、抗体薬物コンジュゲート（antibody-drug conjugate、ＡＤＣ）の一部として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、がんを治療する、例えば、限定されないが、非小細胞肺がん（non-small-cell lung carcinoma、ＮＳＣＬＣ）、乳がん、中皮腫、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、又は結腸がんを治療する方法で使用することができる。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ４に関連する疾患を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ４の過剰発現に関連する疾患を治療するために使用することができる。

【0072】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、細胞傷害活性を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、がん又は腫瘍細胞に対して細胞傷害性である。

【0073】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体は、がん又は腫瘍に対する方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、がん又は腫瘍は、固形がん又は腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がん又は腫瘍は、非固形（びまん性）がん又は腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がん又は腫瘍は、がん又は腫瘍の転移を含む。

【0074】

本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、化学、薬学、生物学、生化学、及び医学分野の従事者に公知であるか、又は彼らによって公知の様式、手段、技法、及び手順から容易に開発されるかのいずれかである、様式、手段、技法、及び手順を含むがこれらに限定されない、所与の作業を達成するための様式、手段、技法、及び手順を指す。

【0075】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、又は「療法」という用語（並びにそれらの異なる形態）は、予防又は防止手段を含む療法的治療を指し、その目的は、疾患又は状態に関連する望ましくない生理学的変化を予防又は減速（軽減）することである。有益な又は所望の臨床結果としては、検出可能又は検出不可能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患又は状態の程度の減少、疾患又は状態の安定化（すなわち、疾患又は状態が悪化しない場合）、疾患又は状態の進行の遅延又は減速、疾患又は状態の改善又は緩和、及び疾患又は状態の寛解（部分的又は完全であるかにかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。治療を必要とする者には、既に疾患若しくは状態を有する者、並びに疾患若しくは状態を有する傾向がある者、又は疾患若しくは状態が予防されるべき者が含まれる。

【0076】

「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、本抗５Ｔ４抗体による組成物又は製剤を用いた治療が提供されるヒト又は非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（例えば、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウス若しくはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどの哺乳動物、又は爬虫類、両生類、ニワトリ、及びシチメンチョウなどの非哺乳動物を含む。本明細書に記載される組成物は、サル及びヒトなどの霊長類、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギ、並びにラット及びマウスなどのげっ歯類を含む、任意の好適な哺乳動物を治療するために使用することができる。一実施形態では、治療されるべき哺乳動物は、ヒトである。ヒトは、任意の年齢の任意のヒトであり得る。一実施形態では、ヒトは、成人である。別の実施形態では、ヒトは、小児である。ヒトは、男性、女性、妊婦、中年、青年、又は高齢者であり得る。

【0077】

本発明に開示される方法で使用するために好適な医薬組成物には、活性成分が意図された目的を達成するために有効な量で含有される、組成物が含まれる。一実施形態では、治療有効量は、治療されている対象の疾患の症状を予防、緩和、若しくは改善するか、又は対象の生存を延長するために有効な活性成分の量を意味する。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0078】

本明細書で使用される場合、「調節すること」は、分子標的又は経路の活性を「刺激すること」又は「阻害すること」を指す。例えば、組成物は、同じ条件下であるが組成物の存在のみを欠く分子標的又は経路の活性に対して、分子標的又は経路の活性を少なくとも１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は約９９％以上刺激又は阻害する場合、分子標的又は経路の活性を調節する。別の例では、組成物は、同じ条件下であるが組成物の存在のみを欠く分子標的又は経路の活性に対して、分子標的又は経路の活性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍刺激又は阻害する場合、分子標的又は経路の活性を調節する。分子標的又は経路の活性は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。分子標的又は経路の活性は、インビトロ又はインビボで測定され得る。例えば、分子標的又は経路の活性は、活性を測定する当技術分野で公知の適切なアッセイによってインビトロ又はインビボで測定され得る。対照試料（組成物で治療されていない）は、１００％の相対活性値を割り当てられ得る。

【0079】

一実施形態では、本方法は、有効量の本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体を含む組成物を対象に投与するステップを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。

【0080】

当業者は、いくつかの実施形態では、免疫応答の調節が、本明細書に記載される抗５Ｔ４抗体の使用を伴わない予期される転帰が炎症であったであろう状況での炎症の軽減又は炎症の排除を包含することを理解するであろう。当業者は、いくつかの実施形態では、腫瘍又はがんを治療することが、本明細書に記載される抗５Ｔ４抗体の使用を伴わない転帰と比較して、腫瘍又はがんの腫瘍サイズ、増殖、及び／又は拡散の低減を包含することを理解するであろう。

【0081】

一実施形態では、本開示は、有効量の本明細書に開示される抗５Ｔ４抗体を含む組成物を対象に投与するステップを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。

【0082】

一実施形態では、本開示はまた、対象における疾患を治療するための抗５Ｔ４抗体を含む組成物の使用も提供する。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗５Ｔ４抗体を含む。

【0083】

一実施形態では、所望の効果を誘発するために必要とされる本ポリペプチド又はその組成物の正確な量は、対象の種、年齢、性別、体重、及び全身状態、特定のポリペプチド、投与経路、並びに他の薬物がレジメンに含まれるかどうかに応じて、対象によって変化するであろう。したがって、全ての組成物の正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定することができる。投与量は、変化し得、ポリペプチドは、１日以上にわたって１日１回以上（例えば、２回以上、３回以上、４回以上、又は５回以上）の用量で投与することができる。抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスが、文献で容易に見出され得る。

【0084】

別の実施形態では、疾患は、がん、肉腫、リンパ種、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨肉種、横紋筋肉腫、心臓がん、脳がん、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞種、乳がん、髄様がん、副腎皮質腫瘍、甲状腺がん、メルケル細胞がん、眼がん、胃腸がん、結腸がん、胆嚢がん、胃（gastric、stomach）がん、消化管カルチノイド腫瘍、肝細胞ガン、膵臓がん、直腸がん、膀胱がん、子宮頸部がん、子宮内膜がん、卵巣がん、腎細胞がん、前立腺がん、精巣がん、尿道がん、子宮肉腫、腟がん、頭部がんン、頸部がん、上咽頭がん、造血がん、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、基底細胞がん、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、又はそれらの任意の組み合わせであり得るがこれらに限定されない、がんである。

【0085】

別の実施形態では、疾患は、アカラシア、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ｇｂｍ／抗ｔｂｍ腎炎、抗リン脂質症候群、関節炎、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性じんましん、ベーチェット病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、コーガン症候群、先天性心ブロック、クローン病、皮膚炎、皮膚筋炎、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜炎、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、妊娠性疱疹、免疫性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、扁平苔癬、ループス、ライム病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、新生児ループス、好中球減少症、回帰性リウマチ、末梢性神経障害、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開術後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、反応性関節炎、後腹膜線維化症、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、類肉腫症、シュミット症候群、強膜炎、硬皮症、シェーグレン症候群、血小板減少性紫斑病、１型糖尿病、潰瘍性結腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、及び白斑であり得るがこれらに限定されない、自己免疫疾患である。

【0086】

いくつかの実施形態では、疾患は、移植片対宿主病（graft-versus-host disease、ＧｖＨＤ）などの移植関連疾患である。一実施形態によれば、ＧＶＨＤは、急性ＧＶＨＤである。別の実施形態によれば、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤである。

【0087】

別の実施形態では、本開示は、上記に記載される疾患又は状態を治療するためにポリヌクレオチドを使用する方法を提供し、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗５Ｔ４抗体をコードする。

【0088】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、及びそれらの活用形は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。

【0089】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「抗体」又は「少なくとも１つの抗体」という用語は、複数の抗体を含み得る。

【0090】

本出願の全体を通して、本開示の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためであり、抗５Ｔ４抗体及びその使用の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、並びに１、２、３、４、５及び６などのその範囲内の個々の数字を有するとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0091】

本明細書で数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意図している。第１の表示数～第２の表示数の「範囲である（ranging/ranges）」及び第１の表示数「から」第２の表示数「までの範囲である（ranging/ranges）」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１及び第２の表示数、並びにそれらの間の全ての分数及び整数の数字を含むように意図されている。

【0092】

値が先行詞「約」の使用によって近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。全ての範囲は、包含的かつ組み合わせ可能である。一実施形態では、「約」という用語は、示された数又は数の範囲からの０．１～５％の逸脱を指す。別の実施形態では、「約」という用語は、示された数又は数の範囲からの１～１０％の逸脱を指す。別の実施形態では、「約」という用語は、示された数又は数の範囲から最大２０％の逸脱を指す。一実施形態では、「約」という用語は、示された数又は数の範囲から±１０％の逸脱を指す。別の実施形態では、「約」という用語は、示された数又は数の範囲から±５％の逸脱を指す。

【0093】

別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、抗５Ｔ４抗体及びその使用が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、抗５Ｔ４抗体及びその使用の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、方法及び／又は材料は、以下に記載される。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び例は、例証的にすぎず、必ずしも限定的であることを意図していない。本明細書で参照される各参考文献又は他の引用は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。

【0094】

本明細書に提示される説明では、抗５Ｔ４抗体及びそのバリエーションを作製及び使用するステップの各々が記載される。この説明は、限定的であることを意図しておらず、成分、ステップの順序、及び他の変形例の変更は、本抗５Ｔ４抗体及びその使用の範囲内であると理解されるであろう。

【0095】

明確にするために別個の実施形態に関連して説明される抗５Ｔ４抗体及びその使用のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に関連して説明される抗５Ｔ４抗体及びその使用の様々な特徴はまた、抗５Ｔ４抗体及びその使用の任意の他の説明された実施形態において別個に、又は任意の好適な副次的組み合わせで、若しくは好適であるように提供され得る。様々な実施形態に関連して説明されるある特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の不可欠な特徴とみなされるべきではない。

【0096】

上記で描写され、以下の特許請求の範囲で請求される本抗５Ｔ４抗体の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的確証を見出す。

【実施例】

【0097】

実施例１
５Ｔ４のためのマウスハイブリドーマモノクローナル抗体生成
目的：マウスハイブリドーマ技術を使用して５Ｔ４に対するモノクローナル抗体を生成すること。

【0098】

方法：マウスハイブリドーマ抗５Ｔ４抗体の生成。ＳＪＬマウスを５Ｔ４－ＥＣＤ－ｈＦｃで腹腔内／皮下免疫付与することによって、抗５Ｔ４抗体を開発した。動物から採血し、ＥＬＩＳＡを用いて抗体力価について試験した（試験採血１及び試験採血２）。高力価を有する免疫化マウス由来の脾臓細胞を単離し、標準的な融合手順によって融合して、特異的抗体を産生するハイブリドーマを作成した。これらの細胞のプールによって産生された抗体を含有する上清を、ヒトＦｃに融合した５Ｔ４－ＥＣＤタンパク質（５Ｔ４－ＥＣＤ－ｈＦｃ）との反応性についてＥＬＩＳＡによって一次スクリーニングし、５Ｔ４タンパク質過剰発現細胞との反応性についてＦＡＣＳによって二次スクリーニングした。スクリーニングのために、ＦＡＣＳによる標的抗体活性について多数のハイブリドーマ上清を試験した。

【0099】

標的過剰発現細胞を９６ウェル丸底ポリスチレンプレートに入れ、ハイブリドーマ培養物からの未混合上清とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、蛍光標識二次抗体とインキュベートした。陰性対照として、非標的タンパク質遺伝子をトランスフェクトした親細胞を採用して、上清を試験し（陰性であることが見出された）、反応性抗体が標的タンパク質を特異的に認識することを確認した。陽性プールを同定し、限界希釈によってクローニングした。１～２回の融合後、特異的抗体を産生する陽性クローンを同定し、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって選択した。

【0100】

結果：動物の免疫付与後、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって、ヒトＦｃに融合した組換えヒト５Ｔ４ ＥＣＤタンパク質への結合について血清を試験した。図１Ａ～図１Ｂに示されるように、様々な希釈において、皮下（図１Ａ）又は腹腔内（図１Ｂ）免疫付与された動物の試験採血２は、採血前試料と比較して、ＥＬＩＳＡによってヒト５Ｔ４に対して陽性力価を示した。図１Ｃ～図１Ｄが、ＣＨＯ細胞において過剰発現されたヒト５Ｔ４に対する試験採血２陽性力価の連続希釈を示す（図１Ｃ）一方で、ＣＨＯ親細胞上では結合が観察されず（図１Ｄ）、５Ｔ４特異性を示す。試験採血分析後、動物ＳＪＬ＃７２１１及び＃７２１５を融合のために選択した。一次スクリーニング用の９６ウェルプレート及び二次スクリーニング用の２４ウェルプレートを電気融合後に得て、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＦｃが陰性対照として機能する、組換えヒト５Ｔ４－ＥＣＤ－Ｆｃに対して陽性クローンを同定し、ＣＨＯ親細胞が陰性対照として機能する、ヒト－５Ｔ４又はｃｙｎｏ－５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞に対して交差反応性クローンを同定した。一次スクリーニングでは、２００個のクローンを二次スクリーニングのために選択した。二次スクリーニングは、更にサブクローニングされた３０個のクローンを明らかにし、１９個のクローンを２００ｍｌ発現及びプロテインＡ精製のために進めた。図２は、選択されたクローンの同一性を示す。５Ｔ４抗体の完全な一覧及び図２は、選択されたクローンの同一性を提示する。本明細書に開示される５Ｔ４抗体及びその成分の一覧が、対応する配列番号とともに以下の表１で提供される。

【0101】

概要：ヒト５Ｔ４タンパク質に対するマウスモノクローナルハイブリドーマ生成は、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる一次及び二次スクリーニング後に、ヒト及びｃｙｎｏ ５Ｔ４に対する特異的結合剤であると同定された１９個のクローンを生じさせた。これらのクローンは、更に発現され、精製され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析され、結合効力について特性評価された。

【0102】

実施例２
ヒト－５Ｔ４に対するマウスハイブリドーマモノクローナル抗体の結合特性評価。

【0103】

目的：結合によって５Ｔ４に対するマウスモノクローナルＡｂを発現させ、精製し、特性評価すること。

【0104】

方法：ハイブリドーマクローンの発現及び精製。簡潔には、約（０．２５－０．５）×１０^７ 個の細胞を、１００ｍＬの抗体生産培地（ハイブリドーマ－ＳＦＭ＋２．５％ＦＢＳ（低ＩｇＧ））で事前充填されたローラーボトル内に接種し、ローラー培養装置内で３００ｒ／ｈの速度で１４～１６日間、３７℃、無ＣＯ２条件でインキュベートした。その後、細胞懸濁液を３５０ｍＬの遠心分離ボトルに移し、３，２２０ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、次いで、０．４５μｍの濾過カプセルで濾過して細胞及び細胞残屑を除去した。次いで、培養上清を、親和性精製のために事前平衡プロテインＡ親和性カラム上に装填した。抗体を、５ＣＶの溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出し、Ｔｒｉｚｍａ塩基を用いて最終ｐＨ７．０に中和し、次いで、ｐＨ ７．４のＰＢＳの１００倍の溶出体積に対して２～８℃で一晩透析し、生物学的安全キャビネット内で０．２２μｍシリンジフィルターで滅菌濾過した。次いで、精製した抗体を等分し、使用するまで－２０℃又は－８０℃で保管した。

【0105】

標的タンパク質へのＥＬＩＳＡ結合。簡潔には、標的タンパク質ｈ５Ｔ４－Ｈｉｓ（カタログ番号１９８４５－Ｈ０８Ｈ、供給業者Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を０．３μｇ／ｍＬの最終濃度のｈ５Ｔ４－Ｈｉｓを含むＰＢＳ中に希釈し、それぞれ、ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号９０１８、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で１００μＬ／ウェルをコーティングする。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートする。プレートを、ＰＢＳＴ中の２５０μＬの１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで４回洗浄した。全ての洗浄は、Ｂｉｏｔｅｋ（Ｅｌｘ ４０５）を使用して行われる。全てのＡｂを連続希釈し、１００μＬ／ウェルの希釈抗体をプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）－ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ Ａ３６８２）を１：１００００で添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣｌで反応を終了させた。プレートを、４５０ｎｍ波長においてＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った（機器ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ）。非線形回帰（曲線適合）を使用することによって、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用して、データ分析を実施した：ｌｏｇ（アゴニスト）対応答、アゴニストは、抗体濃度（ｎＭ）であり、応答は、ＯＤ値である。

【0106】

細胞へのＦＡＣＳ結合。簡潔には、懸濁培養細胞を直接採取するか、又は採取前にＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（カタログ番号１２６０４－０１３、供給業者Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が接着細胞を消化する。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を２×１０^６／ｍＬの濃度でＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に懸濁させ、１００μＬ／ウェルの細胞懸濁液をプレート（カタログ番号３７９９、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加する。プレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を１００μＬ／ウェルのトリボディセット抗体（４００ｎＭ開始、４倍希釈、０点を含む８点）に再懸濁させ、プレートを４℃で６０分間インキュベートする。プレートを２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄する。次いで、細胞を１７０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄する。細胞を二次抗体とともに１００μＬ／ウェルで再懸濁し、プレートを暗所にて４℃で３０分間インキュベートする。プレートを２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄する。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、試料をＦＡＣＳ ｖｅｒｓｅで分析する。

【0107】

Ｏｃｔｅｔ試験による結合親和性。簡潔には、ｍＡｂをＯｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４機器によって分析し、２００ｎＭ及び１００ｎＭにおけるヒト５Ｔ４－ＥＣＤ Ｆｃ抗原が、被分析物として機能し、５ｕｇ／ｍｌにおける精製ｍＡｂが、１８０秒の固定化相、３００秒の会合相、１８０秒の解離相を有するＡＭＣセンサー（抗マウスＦｃ抗体）に結合されたリガンドとして機能した。

【0108】

ＥＬＩＳＡによるエピトープビニング。簡潔には、ヒト５Ｔ４の標的抗体を、１μｇ／ｍｌの最終濃度でＰＢＳ中に希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号９０１８、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で１００μＬ／ウェルをコーティングする。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートする。ＰＢＳＴ中の２５０μＬの１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロックした後、一連の濃度のビオチン化抗原ｈ５Ｔ４－Ｈｉｓ（ロット：１９０６１９１７０１、ＣＰ）を添加する。３７℃で１．５時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、１００μＬのストレプトアビジン－ＨＲＰ（カタログ：Ｓ５５１２、供給業者Ｓｉｇｍａ、１：１００００）を各ウェルに添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣＬで反応を終了させた。プレートを、４５０ｎｍ波長においてＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用して、抗原のＥＣ８０を見出す。

【0109】

結果：図３Ａ～図３Ｂは、ＨＣ及びＬＣの予期されるバンドサイズ（それぞれ、５０ｋＤａ及び２５ｋＤａ）における各々について、２つのバンドを有する１６個の十分に産生されたクローンを示す、１９個の選択された精製抗体の還元状態におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を実証する。図４Ａ～図４Ｐは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにおいて約８～約１３分の保持時間範囲で単一の鋭く均一なピークを示す、選択された精製クローンのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を提示する。これらの結果は、質量較正曲線に基づく予期されるＭｗの予期される保持時間と一致する。

【0110】

図５Ａ～図５Ｄは、ＥＬＩＳＡによる５Ｔ４－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原への精製ｍＡｂの結合を提示する。ｍＡｂ２、４、６、７、１１、及び１２を除外して、ＥＣ５０値は、これらの抗体の間で０．１３ｎＭ～０．４２ｎＭの範囲であった。

【0111】

図６Ａ～図６Ｈは、ヒト５Ｔ４（図６Ａ～図６Ｃ）及びｃｙｎｏ ５Ｔ４（図６Ｄ～図６Ｆ）を過剰発現するＣＨＯ、並びにヒト５Ｔ４抗原を内因的に発現する乳がん細胞株であるＭＣＦ－７（図６Ｇ～図６Ｈ）への選択された精製ｍＡｂのＦＡＣＳ結合を提示する。図６Ａ～図６Ｈに示されるように、ｍＡｂ００１及び０１７を除外して、全ての試験されたｍＡｂが、ヒト又はｃｙｎｏ ５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞に対して約１～４．９ｎＭのＥＣ５０値範囲を有していた一方で、より広い範囲のＥＣ５０値が、ヒト５Ｔ４タンパク質を内因的に発現するＭＣＦ－７細胞を使用したときに観察された。結合はＣＨＯ親細胞上で観察されていない（データは示されていない）。

【0112】

図７Ａ～図７Ｇは、選択されたｍＡｂのＫＤ親和性を決定したＯｃｔｅｔデータを提示する。図７Ａ～図７Ｆは、Ｏｃｔｅｔ試験分析を実証し、図７Ｇは、それぞれ、以下のｍＡｂ、ｍＡｂ００８＞ｍＡｂ０１６／ｍＡｂ０１８＞ｍＡｂ０１０＞ｍＡｂ００５／ｍＡｂ００６に対する、２．０８８Ｅ－１０Ｍ、２．３２１Ｅ－１０Ｍ、２．６８８Ｅ－１０Ｍ、４．６３４Ｅ－１０Ｍ、２．６９１Ｅ－０９Ｍ、及び５．６７４Ｅ－０９Ｍのランク付けされたＫＤ値を要約する。

【0113】

図８は、ＥＬＩＳＡによって実施されたエピトープビニング分析を要約する。ＥＬＩＳＡ分析は、以下のようにそのエピトープビンにおいて区別される３つの主要な群を示唆する：群１（連続線の円）は、ｍＡｂ００１、ｍＡｂ００３、ｍＡｂ００８、ｍＡｂ００９、ｍＡｂ０１０、ｍＡｂ０１４、ｍＡｂ０１５、及びｍＡｂ０１７を集める。群２（破線の正方形）は、ｍＡｂ００４、ｍＡｂ００５、及びｍＡｂ００６を集め、群３（破線の円）は、ｍＡｂ０１３、ｍＡｂ０１６、ｍＡｂ０１８、及びｍＡｂ０１９を集める。

【0114】

概要：ハイブリドーマ技術を使用して、ヒト５Ｔ４に対するモノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）の生成に成功した。１９個のクローンを同定し、特性評価した。ｍＡｂを更に発現させ、ハイブリドーマクローンによって産生し、更に精製し、５Ｔ４抗原へのＥＬＩＳＡ結合、ヒト及びｃｙｎｏ ５Ｔ４を発現する細胞へのＦＡＣＳ結合、Ｏｃｔｅｔ試験による親和性について、最終的にＥＬＩＳＡによるエピトープビニングについて特性評価した。２つのｍＡｂを更なる処理のために更に選択した。

【0115】

実施例３
ヒト５Ｔ４に対するマウスハイブリドーマクローンに由来するキメラＭａｂ抗ヒト５Ｔ４の組換え産生
目的：抗ヒト５Ｔ４ ｍＡｂのマウスＣＤＲ配列をヒトＩｇＧ１構築物フォーマット又はトリボディ構築物フォーマットに導入して、キメラＡｂを産生する。

【0116】

方法：簡潔には、選択された陽性モノクローナルハイブリドーマ細胞（約１×１０^７個）を、ＮｕｃｌｅｏＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ、７４０４０４．２００）のプロトコルに従って全ＲＮＡ単離のために収集した。全ＲＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＲＡＣＥ ５’／３’のキットマニュアルに従ってｃＤＮＡ合成に使用し、ランダムプライマーを第１鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。重鎖及び軽鎖可変領域をＰＣＲで増幅するために、合成ｃＤＮＡをテンプレートとして採用し、マウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、６９８３１－３）由来のプライマーを遺伝子特異的プライマー（Gene-Specific Primer
、ＧＳＰ）として採用した。正しいサイズを有するＰＣＲ産物を収集し、キットのマニュアルに従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、７４０６０９．２５０）で精製し、ＴＡクローニング及び配列決定を受けた。

【0117】

５Ｔ４－ｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）をヒトＩｇＧ１にクローニングしてキメラＩｇＧ１を作製し、これをＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって結合について再スクリーニングした。同様に、５Ｔ４－ｍＡｂのＶＨ及びＶＬをトリボディにクローニングし、５Ｔ４へのＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合によって特性評価した。

【0118】

結果：選択されたハイブリドーマクローン（ｍＡｂ００３、ｍＡｂ００６、ｍＡｂ００８、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ０１４、ｍＡｂ０１６、及びｍＡｂ０１８）を上記の方法に記載されるように配列決定し、クローンの各々について可変重鎖（ＨＣ）及び可変軽鎖（ＬＣ）配列を生じさせた。ｍＡｂ００８及びｍＡｂ００１６の可変重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列を、ｈＩｇＧ１発現ベクター又はトリボディ発現ベクターのいずれかに導入し、同時トランスフェクトし、ｈＩｇＧ１フォーマットについてはプロテインＡカラムによって、又はトリボディフォーマットについては親和性クロマトグラフィーによって精製した。Ｏｃｔｅｔ分析は、ｍＡｂ００１６－ＩｇＧ１に対する１．４７Ｅ－０８Ｍ及び４．５２Ｅ－１０Ｍの親和性を確認した（データは示されていない）。

【0119】

表１は、分析された５Ｔ４抗体の異なる実施形態の実施例の全体を通して提供されたデータの参照を提供する。

【0120】

【表1-1】

【0121】

【表1-2】

【0122】

【表1-3】

【0123】

キメラｈＩｇＧ１Ａｂを、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合について試験した。結合がＥＬＩＳＡによって組換え５Ｔ４タンパク質で実施されたときに、それぞれ、ｍＡｂ００８－ｈＩｇＧ１及びｍＡｂ０１６－ｈＩｇＧ１キメラＡｂについて０．４ｎＭ及び０．３ｎＭのＥＣ５０が観察された（図９Ａ）。結合がＦＡＣＳによってヒト５Ｔ４タンパク質を過剰発現するＣＨＯで実施されたときに、それぞれ、ｍＡｂ０１６－ｈＩｇＧ１及びｍＡｂ００８－ｈＩｇＧ１キメラＡｂについて５ｎＭ及び１．１ｎＭのＥＣ５０が観察された（図９Ｂ）。ＦＡＣＳ結合が５Ｔ４タンパク質を内因的に発現するＭＣＦ－７細胞株で実施されたときに、同様の結合データが観察され、それぞれ、ｍＡｂ０１６－ｈＩｇＧ１及びｍＡｂ００８－ｈＩｇＧ１キメラＡｂについて４．４ｎＭ及び０．９ｎＭのＥＣ５０があった（図９Ｃ）。結合がｃｙｎｏ ５Ｔ４タンパク質を過剰発現するＣＨＯで実施されたときに、同様のＦＡＣＳ結合データが観察され、それぞれ、ｍＡｂ００８－ｈＩｇＧ１及びｍＡｂ０１６－ｈＩｇＧ１キメラＡｂについて５．７ｎＭ及び２．２ｎＭのＥＣ５０があった（データは示されていない）。

【0124】

同様に、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合はまた、キメラトリボディフォーマットについて検証された（データは示されていない）。

【0125】

概要：マウス軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、選択されたハイブリドーマクローンから配列決定し、ｓｃＦｖに変換し、ｈＩｇＧ又はトリボディ構築物のいずれかの成分として合成して、キメラ分子を形成した。これらの分子は、発現され、精製され、結合アッセイによって更に特性評価され、ヒト５Ｔ４に対する結合特性が維持されていることを示した。

【0126】

実施例４
完全ヒト化トリボディ抗体構築物のヒト化、発現、精製、及び特性評価
目的：マウス抗ヒト５Ｔ４配列のヒト化後に完全ヒト化トリボディ三重特異性抗体構築物を発現させ、精製し、選択すること。

【0127】

方法：ヒト化：簡潔には、ｍＡｂ０１６の重鎖及び軽鎖可変領域内のＣＤＲ残基（ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲ）を決定し、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって注釈を付けた。分析後、脱アミドモチーフの危険なホットスポット（ＮＧ）を、ＱＧ、ＳＧ、ＮＡに変異するように設計されたＣＤＲ Ｈ２領域内で同定した。

【0128】

２つの別個のＩｇ ＢＬＡＳＴ検索を、ｍＡｂ０１６のＶＨ及びＶＬについて実施した。ｍＡｂ０１６に対するフレームワーク配列の高い同一性を有するヒト生殖系列ＩＧＨＶ－２＊０２及びＩＧＫＶ３－１１＊０１を、それぞれ、ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲを移植するためのアクセプターヒト生殖系列フレームワークとして選択した。その一方で、ＪＨ６及びＪＫ４を、最良の配列相同性に基づいてＶＨ及びＶＬのＪ領域として選択した。

【0129】

相同性モデルを構築するために、ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒスイートソフトウェアのＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅモデリングパッケージを使用した。抗体構造２Ｗ９Ｄ（ＰＤＢコード）を重鎖及び軽鎖モデリングのためのテンプレートとして選択した。ＣＤＲループ構造及びＶＨ／ＶＬ界面を潜在的に支持するフレームワーク領域内の残基を同定するために、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅによって生成されたモデルを更に分析した。ＣＤＲループ立体構造及びＶＨ／ＶＬ界面に影響を及ぼし得る残基を復帰変異させた。最後に、ｍＡｂ０１６のヒト化バリアントのパネルを設計し、トリボディフォーマットで構築した。

【0130】

追加のヒト化方略を実施した。簡潔には、ｍａｂＨｕｍａｎ技術を使用して、ｍＡｂ００８及びｍＡｂ０１６のＣＤＲを新しい抗体のフレームワークに移植した。様々なＶＨ及びＶＬ配列が、配列アラインメント後のＮＧＳ実験に基づいて、ヒト抗体フレームワーク配列データベース内で見出されている。

【0131】

遺伝子合成及びプラスミド構築。三重特異性抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のコード配列を、ＤＮＡ合成及びＰＣＲによって生成し、その後、哺乳動物細胞系におけるタンパク質発現のためにｐＣＤＮＡ３．４ベースのプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。最後に、発現ベクター中の遺伝子配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。

【0132】

三重特異性抗体構築物の発現。トリボディ／プロトリボディ抗体の一過性発現を、ＰＥＩ法を使用した、ＣＨＯ細胞への対合ＨＣ及びＬＣ構築物の（トリボディフォーマットについては１：１のＨＣ／ＬＣ比、又はプロトリボディフォーマットについて２．５：１のＨＣ／ＬＣ比での）同時トランスフェクションによって実施した。簡潔には、３Ｌ振盪フラスコ内の約５．５×１０^６／ｍｌにおける１ＬのＣＨＯ細胞を宿主として使用した。１００ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１ｍｇの全ＤＮＡ及び４ｍｇのＰＥＩの混合物を細胞に添加し、穏やかに混合することによって、トランスフェクションを開始した。次いで、細胞を、インキュベーターシェーカー内で１２０ｒｐｍ、３７℃、及び８％ＣＯ_２において８～１０日間培養した。細胞密度及び生存率に応じて、ペプトン及びグルコースの供給を２４時間後、及びその後の２～３日毎に実行した。細胞生存率が＜８０％まで低減した８～１０日目に細胞培養を終了した。馴化培地をタンパク質精製のために採取した。

【0133】

三重特異性抗体構築物の精製。親和性クロマトグラフィー及びＳＥＣによるタンパク質精製を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１－ＸＬ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のカラム上に採取された上清を通過させることによって、トリボディの親和性捕捉を達成した。カラムを緩衝液Ａ（２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で洗浄した後、タンパク質を緩衝液Ｂ（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で溶出し、１／６容量の緩衝液Ｄ（１Ｍのアルギニン、４００ｍＭのコハク酸、ｐＨ９．０）で即時に中和した。次いで、親和性精製タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ ３０ ｋＤ濃縮器（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５～１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ＳＥＣ緩衝液：２００ｍＭのアルギニン、１３７ｍＭのコハク酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－８０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＳＥＣ精製を受けた。標的トリボディ画分を収集し、次いで、５％トレハロース（１４６ｍＭ）を添加した。トリボディ産物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣを使用して分析した。

【0134】

三重特異性抗体構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。トリボディのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、事前成型ポリアクリルアミドゲル中の還元及び非還元条件下で実行した。簡潔には、２ｕｇのトリボディ試料を、７０ｍＭのＤＴＴ添加を含むか、又は含まないＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ－ＮＰ０００８）によって混合した。２５℃又は９０℃で１０分間インキュベートした後、試料及び未染色タンパク質標準（ＢＩＯ ＲＡＤ－１６１－０３６３をゲル上に装填した。電気泳動を、１×トリス－グリシン－ＳＤＳ泳動緩衝液を用いて１２０Ｖの定電圧で実施した。電気泳動後、ゲルを、クーマシーブルーを使用して一晩染色し、脱染色溶液（１０％の酢酸、４０％のメタノール、及び５０％の水）で脱染色した。脱染色したゲルを、ゲルイメージングシステム（Ｔａｎｏｎ－２５００Ｒ）でスキャンした。

【0135】

前駆体三重特異性抗体構築物のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析。分析ＳＥＣ－ＨＰＬＣを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－１０ ＨＰＬＣ機器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）を使用して実施した。１ｍｇ／ｍｌにおける２０μｌ試料が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ＧＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填されるであろう。移動相は、０．３ｍｌ／分の流量、１５分で２＊ＰＢＳであった。

【0136】

トリボディ構築物のＬＣ－ＭＳ分析。トリボディを、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ Å、ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ １．７μｍ、４．６×３００ｍｍ）を用いて室温で分離し、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＳ－Ｂ２０－０３）によって検出した。移動相は、０．２ｍＬ／分の流量で０．１％ギ酸：アセトニトリル（７５：２５、ｖ／ｖ）であった。質量分析を陽イオンで実施した。質量分析のための他のパラメータは、１７５００の分解能、１０００～５０００ｍ／ｚのスキャン範囲、６０ｅＶのインソースＣＩＤ、３０Ｌ／分のシースガス流量、３５０℃のキャピラリー温度、２．５ＫＶのスプレー電圧であった。

【0137】

結果：両方の方略からの５Ｔ４ ｍＡｂのヒト化プロセスは、以下のような新しいトリボディ配列：５Ｔ４＿ＩＭ１１－２０配列に対応するＩＭ－１１００－１１０９分子、５Ｔ４＿ＩＭ２９－５８配列に対応するＩＭ－１１９８－１２２７分子、及び５Ｔ４＿ＩＭ２１－２８配列に対応するＩＭ－１１７５－１１８２分子を生じさせ、図１０Ａに概略的に示されるように、トリボディ分子のＨＣは、抗ＮＫｅｎｇａｇｅｒ（ｓｃＦｖ）に融合した抗ＣＤ３重鎖（ＶＨ－ＣＨ）から構成され、トリボディ分子のＬＣは、抗５Ｔ４（ＶＨ－ＶＬ／ＶＬ－ＶＨ）に融合したＣＤ３軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）から構成される。（５Ｔ４クローン名及び関連配列番号については、上記の表１を参照されたい）。図１０Ｂでは、プロトリボディ構造は、以前に記載された条件的に活性化された分子を生成するためのＣＡＰマスキングドメイン、ＨＳＡ部分、及びプロテアーゼ切断リンカーなどの追加の調節ドメインを伴って示され、例えば、本明細書に完全に組み込まれる国際公開第２０２０／２２５８０５号を参照されたい。

【0138】

図１１は、発現されたタンパク質の広範囲の品質を実証するための様々な構築物の種々のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【0139】

発現されたＨＣ及びＬＣトリボディＩＭ－１２２２構築物は、（非還元条件で）ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて観察された単一の約１００ｋＤＡバンドによって、及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにおける約５．８分の保持時間での単一の主要ピークによって示されるように（それぞれ、図１２Ａ及び図１２Ｂ）、会合して単一分子を形成した。これらの結果は、質量較正曲線に基づく予期されるＭＷの予期される保持時間と一致する。

【0140】

トリボディＩＭ－１２２２構築物のＭＳ分析は、還元条件でＬＣについては５０ｋＤａのピーク、ＨＣについては５２ｋＤのピーク（図１３Ａ）、及びインタクトなタンパク質については１０２ｋＤａ（図１３Ｂ）を確認した。

【0141】

発現されたＨＣ及びＬＣトリボディＩＭ－１１７８構築物は、（非還元条件で）ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて観察された単一の約１００ｋＤＡバンドによって、及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにおける約５．８分の保持時間での主要ピークによって示されるように（それぞれ、図１４Ａ及び図１４Ｂ）、会合して単一分子を形成した。これらの結果は、質量較正曲線に基づく予期されるＭｗの予期される保持時間と一致する。

【0142】

トリボディＩＭ－１１７８構築物のＭＳ分析は、還元条件でＬＣについては４９ｋＤａのピック、ＨＣについては５１ｋＤのピック（図１５Ａ）、及びインタクトなタンパク質については１００ｋＤａ（図１５Ｂ）を確認した。

【0143】

概要：トリボディ構造中の５Ｔ４ヒト化配列の複数の分子を発現させ、精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、及び質量分析によって分析した。様々な生成物は、純度及び収率に関して様々な品質を有していた。図１３Ａ～図１３Ｂは、ｍＡｂ０１６に由来する５Ｔ４＿ＩＭ５３配列に対応する選択された構築物ＩＭ－１２２２トリボディの例を実証する。図１４Ａ～図１４Ｂは、ＣＤ３ｘ５Ｔ４＿ＩＭ２４ｘＮＫＧ２Ｄを含む、ｍＡｂ００８に由来する５Ｔ４＿ＩＭ２４配列に対応する選択された構築物ＩＭ－１１７８トリボディの例を実証する。

【0144】

実施例５
ＥＬＩＳＡによる組換えタンパク質への完全ヒト化トリボディ抗体構築物の結合
目的：ＥＬＩＳＡによって５Ｔ４へのヒト化トリボディ抗体構築物の結合有効性を研究すること。これらの構築物は、抗ＴＡＡ ＳｃＦｖドメイン（抗５Ｔ４ヒト化）、Ｔ細胞エンゲージャードメイン（抗ＣＤ３ε Ｆａｂ）、及びＮＫエンゲージャードメイン（抗ＮＫＧ２Ａ／抗ＮＫＧ２Ｄ）から構成された。追加のバリアントは、ＣＡＰマスキング配列、切断可能リンカー、非切断可能リンカー、並びに特異的エンゲージャーに対する結合活性を欠き、トリボディ／プロトリボディバリアントの陰性対照として機能する点変異エンゲージャー配列から構成され得る。

【0145】

方法：抗原へのトリボディ抗体構築物のＥＬＩＳＡ結合：標的タンパク質ｈ５Ｔ４－Ｈｉｓ（カタログ番号１９８４５－Ｈ０８Ｈ、供給業者Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を０．３μｇ／ｍＬの最終濃度でＰＢＳ中に希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号９０１８、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で１００μＬ／ウェルをコーティングする。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートする。プレートを、ＰＢＳＴ中の２５０μＬの１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで４回洗浄した。全ての洗浄は、Ｂｉｏｔｅｋ（Ｅｌｘ ４０５）を使用して行われる。全てのトリボディセット抗体を４００ｎＭに希釈し、４倍連続希釈（０点を含む１２点）を作製した。１００μＬ／ウェルの希釈抗体構築物溶液をプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルの抗ヒトカッパ軽鎖－ＨＲＰ（１：１００００）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣｌで反応を終了させた。プレートを、４５０ｎｍ波長においてＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った（機器ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ）。非線形回帰（曲線適合）を使用することによって、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用して、データ分析を実施した：ｌｏｇ（アゴニスト）対応答、アゴニストは、抗体濃度（ｎＭ）であり、応答は、ＯＤ値である。

【0146】

結果：ヒト化５Ｔ４配列から構成される発現された三重特異性構築物を、５Ｔ４タンパク質に対するその結合有効性について分析した。ヒト５Ｔ４タンパク質に対するヒト化５Ｔ４配列（５Ｔ４＿ＩＭ１１－２０又は５Ｔ４＿ＩＭ２９－５８）の広範囲のＥＣ５０値が観察された（図１６）。ほとんどのバリアントは、元の非ヒト化クローンよりも低いＥＣ５０値を示す。

【0147】

結論：図１６Ａ～図１６Ｈに示されるように、ヒト化５Ｔ４配列を保有するトリボディの結合が、ヒト化構築物のうちのいくつかで確認された一方で、他の構築物は、低いＥＣ５０値を有し、いくつかの構築物は、５Ｔ４組換え抗原タンパク質への結合を欠いていた。異なるフレームワークがｈ５Ｔ４に向けた異なる結合親和性を伴って生じるという事実は、特異的フレームワークに対するＣＤＲの適合性の結果であり得、これは、正しいＣＤＲ配向を妨げる構造的摂動をもたらし得る。

【0148】

実施例６
ＦＡＣＳによる細胞への完全ヒト化三重特異性抗体構築物の結合
目的：ＦＡＣＳによって、膜結合型内因性５Ｔ４を発現する細胞（ＮＣＩ－Ｈ２２６）又は異所性５Ｔ４を発現する細胞（５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞）へのヒト化トリボディ抗体構築物の結合有効性を研究すること。これらの構築物は、抗ＴＡＡ ＳｃＦｖドメイン（抗５Ｔ４ヒト化）、Ｔ細胞エンゲージャードメイン（抗ＣＤ３ε Ｆａｂ）、及びＮＫエンゲージャードメイン（抗ＮＫＧ２Ａ／抗ＮＫＧ２Ｄ）から構成された。追加のバリアントは、ＣＡＰマスキング配列、切断可能リンカー、非切断可能リンカー、並びに特異的エンゲージャーに対する結合活性を欠き、トリボディ／プロトリボディバリアントの陰性対照として機能する点変異エンゲージャー配列から構成され得る。

【0149】

方法：細胞へのトリボディ抗体構築物のＦＡＣＳ結合。懸濁培養細胞を直接採取し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（カタログ番号：１２６０４－０１３、供給業者Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して接着細胞を消化した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を２×１０^６／ｍＬの濃度でＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に懸濁させ、１００μＬ／ウェルの細胞懸濁液をプレート（カタログ番号３７９９、供給業者Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加する。プレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を１００μＬ／ウェルのトリボディセット抗体（４００ｎＭ開始、４倍希釈、０点を含む８点）に再懸濁させ、プレートを４℃で６０分間インキュベートする。プレートを２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄する。次いで、細胞を１７０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルにおける細胞を、１：４００希釈で二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇ Ｆａｂ－ＦＩＴＣ、カタログ番号２０８５－０２、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）と再懸濁させ、プレートを暗所にて４℃で３０分間インキュベートする。プレートを２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄する。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、試料をＦＡＣＳ ｖｅｒｓｅで分析する。染色の蛍光強度を、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ）を使用して測定した。セット抗体染色の幾何平均蛍光強度（geometric mean fluorescence intensity、ＧＭＦＩ；蛍光強度中央値（median fluorescence intensity、ＭＦＩ））を計算した（ＢＤ ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア）。用量応答曲線を生成し、三重特異性バリアント結合のＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。

【0150】

結果：ヒト化５Ｔ４から構成される発現された三重特異性構築物を分析し、５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞に対するその結合有効性について確認した（図１７Ａ～図１７Ｈ）が、結合はＣＨＯ親細胞上で観察されなかった（データは示されていない）。結合はまた、内因性５Ｔ４を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞上でも確認された（図１７Ｉ～図１７Ｏ）。データは、様々なバリアントで観察される広範囲のＥＣ５０値を示す。具体的には、ＩＭ－１１７８トリボディバリアントについては１．４ｎＭ及びＩＭ－１２２２トリボディバリアントについては２．３ｎＭのＥＣ５０が、５Ｔ４を過剰発現するＣＨＯ細胞上で決定され、ＩＭ－１１７８トリボディバリアントについては１．２４ｎＭ及びＩＭ－１２２２トリボディバリアントについては３．９ｎＭのＥＣ５０が、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞上で決定された。選択された構築物はまた、ＮＫＧ２Ａを過剰発現する細胞へのその結合についても評価され、５Ｔ４ヒト化配列がＮＫＧ２Ａへの結合に影響を及ぼさないことを確認した（データは示されていない）。

【0151】

結論：図１７Ａ～図１７Ｏに示されるように、５Ｔ４を発現する細胞へのヒト化５Ｔ４配列を保有するトリボディバリアントの結合が、ヒト化構築物のうちのいくつかで確認された一方で、他の構築物は、低いＥＣ５０値を有し、いくつかの構築物は、結合を欠いていた。５Ｔ４＿ＩＭ５３配列に対応する選択された構築物トリボディＩＭ－１２２２が、インビトロ及びインビボ有効性について更に特性評価された。

【0152】

実施例７
完全ヒト化トリボディ抗体構築物のインビトロ機能評価。

【0153】

目的：乳がん細胞及び肺がん細胞（それぞれ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＮＣＩ－Ｈ２２６）に対するトリボディ／プロトリボディバリアントのインビトロ用量依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を評価すること。

【0154】

方法：乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase、ＬＤＨ）細胞傷害性アッセイ。トリボディ及びプロトリボディバリアントを、５Ｔ４発現がん細胞においてＴ細胞細胞媒介性細胞傷害性を誘導するその可能性について分析した。簡潔には、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１７９５１）を使用して、Ｔ細胞を単離する。標的細胞の濃度を、アッセイ緩衝液（ブランクＲＰＭＩ １６４０、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ－１０４９１＋５％ＦＢＳ）中で２×１０^５／ｍＬに調整し、５０μＬを丸底９６ウェルプレート（Ｃａｔ－３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加する。エフェクト細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳからの単離されたＴ細胞又はＰＢＭＣ）の濃度をアッセイ緩衝液中で２Ｅ６／ｍＬに調整し、５０μＬを１０：１のＥＴ比でウェルに添加する。次いで、１００μＬ／ウェルの２倍希釈抗体を添加し、十分に混合する。３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートする。プレートを３００ｇで５分間遠心分離し、上清を収集する。ＬＤＨ放出は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）によって試験されるであろう。２０μＬの溶解溶液（１０＊）を最大ウェルに添加し、十分に混合し、３７℃で４５分間インキュベートする。次いで、全ての試験ウェル及び対照ウェルからの５０μＬのアリコートを新しい９６ウェル透明平底プレート（Ｃａｔ－３５９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移す。５０μＬのＣｙｔｏＴｏｘ試薬を各ウェルに添加する。プレートを光から保護し、室温で３０分間インキュベートする。最後に、５０μＬの停止溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。停止溶液の添加後１時間以内に４９０ｎｍ又は４９２ｎｍでの吸光度を記録する。計算の結果は、細胞傷害性％＝（実験－Ｅのみ－Ｔのみ）／（Ｔ Ｍａｘ－Ｔのみ）×１００）である。

【0155】

結果：乳酸脱水素酵素を使用して、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を、それぞれ、ＮＣＩ－Ｈ２２６（図１８Ａ）又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図１８Ｂ）について達成し、ＩＭ－１２２２トリボディ（四角）については０．０２ｎＭ、ＩＭ－１０６２トリボディ（丸）については０．３８ｎＭのＥＣ５０であった。

【0156】

結論：Ｔ細胞媒介性細胞傷害性アッセイでは、２つのがん細胞株が、トリボディＩＭ－１０６２及びＩＭ２２２の存在下で細胞死滅を受けており、ＩＭ－１２２２に対するより高い有効性は、以前に記載されたｍＡｂ ０１６に由来する５Ｔ４＿ＩＭ－５３ヒト化配列を表す。

【0157】

実施例８
異種移植ＮＳＧマウスモデルにおけるインビボ有効性
目的：ＮＣＧマウスにおけるｈＰＢＭＣ移植ＮＣＩ－Ｈ２２６モデル上でのＩＭ－１２２２トリボディ５Ｔ４＿ＩＭ５３－ＣＤ３－ＮＫＧ２Ａの有効性を研究し、ヒト化マウスモデルにおけるＩＭ－１２２２トリボディによって誘導される腫瘍増殖の阻害を調査すること。

【0158】

方法：インビボ異種移植アッセイ。ＮＣＩ－Ｈ２２６（ヒト肺がん、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－５８２６、ロット番号５８０９４７４６）細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０中で単層培養としてインビトロで維持し、空気中に５％ＣＯ２を含有する雰囲気中で３７℃に維持した。指数増殖期に増殖する細胞を採取し、腫瘍接種のために計数する。雌、６～７週齢、約１９～２１ｇの体重のＮＣＧマウスを、ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，ＬＴＤから購入した。マウスに、腫瘍発生のために０．２ｍｌの混合物（基礎培地：マトリゲル＝１００ｕｌ：１００ｕｌ）中の５×１０＾６個のＮＣＩ－Ｈ２２６細胞を右脇腹で皮下に接種した）０日目）。７日目に、マウスに、２匹の健康なドナーからの１×１０＾７個のｈＰＢＭＣを静脈内注射した。各アームについて、動物の半分に１匹のドナーからＰＢＭＣを注射し、動物の半分に第２のドナーで注射した。マトリゲルが腫瘍有効性研究のために完全に吸収される細胞接種後約１週間で、腫瘍が約１５０ｍｍ３の平均サイズに達したときに、治療を開始した。マウスに、２０ｕｇ／Ｋｇを毎日（腹腔内に）投与した。腫瘍サイズを、カリパスを使用して二次元で週２回測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ^２を使用してｍｍ^３単位で表し、式中、ａ及びｂは、それぞれ、腫瘍の最長直径及び最短直径である。次いで、腫瘍サイズを、腫瘍増殖阻害（tumor growth inhibition、ＴＧＩ）の計算に使用する。具体的には、この研究は、ＴＴ２緩衝液（２００ｍＭのアルギニン、１３７ｍＭのコハク酸、５％トレハロース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－８０、ｐＨ５．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）のみが注射された、ビヒクルアームとして使用された１０匹の動物、及びＩＭ－１０６２又はＩＭ－１２２２が注射された各々６匹のマウスの２つの追加のアームを含んだ。

【0159】

結果：図１９は、トリボディＩＭ－１２２２で治療されたマウス（丸）、トリボディＩＭ－１０６２で治療されたマウス（四角）、及びＴＴ２緩衝液対照（三角）について、腫瘍体積（ｍｍ３）を提示する。図１９に示されるように、トリボディの投与は、対照試料と比較して腫瘍サイズを劇的に縮小し、ＩＭ－１２２２については１１日目に８４％、１８日目に４４％の有意なＴＧＩがあった。

【0160】

結論：ｍＡｂ０１６に由来するヒト化５Ｔ４＿ＩＭ５３配列を表すトリボディＩＭ－１２２２の有効性は、約４０～８４％ＴＧＩの応答範囲を有するインビボ異種移植モデルで実証された。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図4M】

【図4N】

【図4O】

【図4P】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図16H】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図17F】

【図17G】

【図17H】

【図17I】

【図17J】

【図17K】

【図17L】

【図17M】

【図17N】

【図17O】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【手続補正書】

【提出日】2024-01-11

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024517760000001.app

【国際調査報告】