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特表2024-517776ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート並びにその調製方法及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート並びにその調製方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20240416BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20240416BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20240416BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20240416BHJP
A61K 38/12 20060101ALI20240416BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20240416BHJP
A61K 31/357 20060101ALI20240416BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20240416BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240416BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240416BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240416BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240416BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240416BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240416BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240416BHJP
C07K 1/20 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240416BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240416BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240416BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240416BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68 ZNA
A61K38/07
A61K31/537
A61K38/05
A61K38/12
A61K31/704
A61K31/357
A61K31/4745
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P35/02
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/12
C07K16/28
C07K1/20
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/21
C12N1/19
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023566911
(86)(22)【出願日】2022-04-29
(85)【翻訳文提出日】2023-12-26
(86)【国際出願番号】 CN2022090450
(87)【国際公開番号】W WO2022228563
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】202110481199.4
(32)【優先日】2021-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523408662
【氏名又は名称】江▲蘇▼▲邁▼威康新▲薬▼研▲発▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】522261352
【氏名又は名称】▲邁▼威（上海）生物科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】周 ▲偉▼
(72)【発明者】
【氏名】▲譚▼ 小▲釘▼
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 大涛
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD14
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF63
4C076FF67
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA14
4C084BA16
4C084BA24
4C084MA02
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA06
4C084NA07
4C084NA13
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA32
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085BB41
4C085BB43
4C085BB44
4C085CC22
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA02
4C086CA01
4C086CB22
4C086EA08
4C086EA10
4C086EA16
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA03
4C086NA05
4C086NA06
4C086NA07
4C086NA13
4C086ZB26
4C086ZB27
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087BC83
4C087NA03
4C087NA05
4C087NA06
4C087NA07
4C087NA13
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA72
4H045DA76
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA25
(57)【要約】
ポリオウイルス受容体様分子４（ネクチン－４）を標的とする抗体薬物コンジュゲート。抗体薬物コンジュゲートを使用して、ネクチン－４関連疾患を治療する薬物を調製することができる。抗体薬物コンジュゲートは、ネクチン－４に対する強力な標的化特性と、標的を介した強力なエンドサイトーシス効果とを有し、かつ優れた腫瘍殺傷効果を有する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬物に共有結合により連結された抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを含む、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩であって、前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、重鎖相補性決定領域１～重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）と、軽鎖相補性決定領域１～軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）とをそれぞれ以下の通りに含む：
（ｉ）それぞれ配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含むか、
（ｉｉ）それぞれ配列番号１１、配列番号１７、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１８、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含むか、又は、
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む、
重鎖及び軽鎖を含む、抗体薬物コンジュゲート又はその塩。
【請求項2】
前記抗体薬物コンジュゲート又はその塩は、次の式：Ａｂ－［Ｌ－ＣＴＤ］ｍを有し、式中、Ａｂは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを表し、Ｌは、リンカーを表し、ＣＴＤは、前記薬物を表し、かつｍは、Ａｂ分子１つ当たりに接続された前記薬物の平均数を表し、好ましくは、ＣＴＤは、細胞傷害性薬物であり、好ましくは、ＣＴＤは、微小管阻害剤のＭＭＡＥ、ＤＭ１、ＤＭ４、ツブリシン、アマニチン、カリケアマイシン、エリブリン、及びそれらの誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤のＳＮ３８、エキサテカン、及びそれらの誘導体、並びにＤＮＡ結合性作用物質のＰＢＤ、ドキソルビシン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上であり、
好ましくは、ｍは、１．０～５．０、好ましくは３．０～４．２、より好ましくは３．５～４．５、なおもより好ましくは３．８～４．２、更により好ましくは３．９～４．１、特に好ましくは４．０である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその塩。
【請求項3】
前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる前記重鎖及び前記軽鎖は、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含み、かつ前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含み、好ましくは、前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる前記重鎖可変領域（ＶＨ）及び前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ、
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
（ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
（ｉｉｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、又は、
（ｉｖ）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
を含む、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその塩。
【請求項4】
前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、あらゆる形態で、例えば、ネクチン－４に対するモノクローナル抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ナノボディ、完全ヒト化抗体若しくは部分的ヒト化抗体、又はキメラ抗体等で存在し、代替的には、前記抗体又はそのフラグメントは、ネクチン－４に対する半抗体又は半抗体の抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖであり、好ましくは、前記ネクチン－４は、哺乳動物ネクチン－４、好ましくは霊長類ネクチン－４、より好ましくはヒトネクチン－４である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその塩。
【請求項5】
前記抗体は、モノクローナル抗体、好ましくはマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体であり、より好ましくは、前記モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプのものであり、かつ前記モノクローナル抗体の軽鎖定常領域は、カッパ型のものであり、代替的には、前記抗体は、免疫グロブリン、特にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭのヒトサブタイプ、より好ましくはヒトＩｇＧ１サブタイプ、ヒトＩｇＧ２サブタイプ、ヒトＩｇＧ３サブタイプ、又はヒトＩｇＧ４サブタイプであり、
好ましくは、前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含む重鎖定常領域を含み、代替的には、前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその塩。
【請求項6】
前記抗体薬物コンジュゲート又はその塩は、以下の式Ｉａ【化1】
【化2】
（式中、
Ａｂは、前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントであり、
Ａｒ’は、置換又は非置換のＣ６～Ｃ１０アリーレン及び置換又は非置換の５員～１２員のヘテロアリーレンからなる群から選択されるいずれか１つであり、ここで、前記置換は、基上の水素原子を、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、ハロゲン化アルキル（例えば、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはハロゲン化Ｃ１～Ｃ４アルキル、例えばトリフルオロメチル）及びアルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、例えばメトキシ）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置き換えることを指し、
Ｌ１は、Ａｒ’に連結された－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－であり、ここで、ｎは、１～２４、好ましくは１～１０、より好ましくは３～５の範囲内の整数であり、
Ｌ２は、酵素切断可能な断片、例えばジペプチド若しくはトリペプチド若しくはテトラペプチド、又は切断可能な自己犠牲リンカーとのそれらの組合せ（すなわち、２個～４個のアミノ酸からなるポリペプチド断片、又は前記ポリペプチド断片と、切断可能な自己犠牲リンカーとの組合せ）、例えば、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ（ＧＧＦＧ）、ＭＡＣグルクロニドフェノールである）により表される構造を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又はその塩。
【請求項7】
Ｌ２－ＣＴＤは、ＶｃＭＭＡＥ、ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ、又はＶＣ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡであり、好ましくは、Ａｒ’が置換又は非置換の５員～１２員のヘテロアリーレンである場合、ヘテロ原子は、Ｎであり、
好ましくは、Ａｒ’は、置換若しくは非置換のＣ６アリーレン、又は置換若しくは非置換の６員のヘテロアリーレンであり、
より好ましくは、前記抗体薬物コンジュゲート又はその塩は、以下の構造：
コンジュゲートＡＤＣ－１
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【請求項8】
以下の式Ｉａ【化10】
【化11】
により表される構造を有する、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩の調製方法であって、
前記方法は、以下の工程：
（１）抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを緩衝液中で還元剤と反応させて、還元された抗体又はそのフラグメントを得る工程、
（２）緩衝液と有機溶媒との混合物中で、工程（１）で得られた還元された抗体又はそのフラグメントに薬物－リンカー（リンカー薬物コンジュゲート）をコンジュゲートさせて、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートを得る工程、
を含む、調製方法。
【請求項9】
前記薬物－リンカーは、以下の式Ｉｃ：【化12】
Ｒは、Ｘ又はＲ’Ｓであり、ここで、Ｘは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、好ましくはＢｒ又はＩであり、Ｒ’は、置換若しくは非置換のＣ６～Ｃ１０アリール又は置換若しくは非置換の５員～１２員のヘテロアリールであり、ここで、前記置換は、基上の水素原子を、アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル）、アルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、例えばメトキシ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、エステル、アミド、及びシアノからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置き換えることを指し、
好ましくは、Ｒは、Ｒ’Ｓであり、ここで、Ｒ’は、フェニル又は置換フェニルであり、前記置換フェニルにおける置換基は、アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル）、アルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、より好ましくはメトキシ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、エステル、アミド、及びシアノからなる群から選択され、好ましくは、Ｒ’は、フェニル、４－メチルホルムアミド置換フェニル（
【化13】
【化14】
Ａｒ’、Ｌ１、Ｌ２、及びＣＴＤは、請求項６～８のいずれか一項に規定される通りである）により表される構造を有する、請求項８に記載の調製方法。
【請求項10】
前記薬物－リンカーは、【化15】
【請求項11】
前記調製方法は、以下の工程：ａ．抗体の還元：５ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬの濃度で前記抗体を含むリン酸緩衝液に還元剤を５．５以上：１（前記還元剤：前記抗体）の当量モル比で添加し、前記還元剤と前記抗体とを１．５時間～２時間反応させる工程、
なお、前記還元剤は、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、２－ＭＥＡ、及びＤＴＢＡからなる群から選択される１つ以上である；
ｂ．抗体のコンジュゲーション：工程ａで得られた還元された抗体をｐＨ６．５～７．８のリン酸緩衝液中へと置き換え、それによって前記抗体を前記緩衝液中で３．５ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、希釈された抗体溶液を得て、有機共溶媒中に溶解された薬物含有リンカーを前記希釈された抗体溶液に４．５～６．５：１（前記薬物含有リンカー：前記抗体）の当量モル比で添加し、次いで、この反応系を撹拌しながら１５℃～３５℃で０．５時間以上反応させる工程、
なお、前記有機共溶媒は、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、及びＡＣＮからなる群から選択される１つ以上である；
ｃ．疎水性クロマトグラフィー：得られた抗体コンジュゲート生成物を、疎水性充填剤を使用する疎水性クロマトグラフィーによる精製に供する工程、
を含み、
好ましくは、前記調製方法は、工程ｂの後、又は工程ｃの後に、以下の工程：
ｄ．加水分解：前記抗体コンジュゲート生成物をｐＨ７．４～９．０のリン酸緩衝液中へと置き換え、次いで、前記緩衝液を３５±１０℃で２時間～２４時間加熱して加水分解生成物を得る工程、
を更に含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項12】
重鎖及び軽鎖を含む抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントであって、前記重鎖及び前記軽鎖は、重鎖相補性決定領域１～重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）と、軽鎖相補性決定領域１～軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）とをそれぞれ以下の通りに含む：それぞれ配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント。
【請求項13】
前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる前記重鎖及び前記軽鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、かつ前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号５若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含み、かつ前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含み、好ましくは、前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントの前記重鎖可変領域（ＶＨ）及び前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
（Ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、又は、
（Ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
を含み、
更に好ましくは、前記抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、請求項４又は５において規定される通りである、請求項１２に記載の抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント。
【請求項14】
請求項１２又は１３に記載の抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項15】
請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項16】
請求項１４に記載の核酸分子及び／又は請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項17】
請求項１～７のいずれか一項に記載のネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩、請求項１２又は１３に記載の抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、及び／又は請求項１６に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項18】
腫瘍を治療する医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載のネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩、請求項１２又は１３に記載の抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１７に記載の組成物の使用。
【請求項19】
前記腫瘍は、ネクチン－４の高発現に関連する腫瘍又は癌であり、好ましくは、前記腫瘍又は癌は、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、未分化大細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性黒色腫、扁平上皮癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、消化管腫瘍、結腸直腸癌、神経膠腫、及び中皮腫からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１８に記載の使用。
【請求項20】
腫瘍を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、請求項１～７のいずれか一項に記載のネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩、請求項１２又は１３に記載の抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１７に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項21】
前記被験体は、哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトであり、好ましくは、前記腫瘍は、ネクチン－４の高発現に関連する腫瘍又は癌であり、
好ましくは、前記腫瘍又は癌は、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、未分化大細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性黒色腫、扁平上皮癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、消化管腫瘍、結腸直腸癌、神経膠腫、及び中皮腫からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された中国特許出願第２０２１１０４８１１９９．４号の優先権を主張し、その特許出願の内容は引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された中国特許出願第２０２１１０４８１１９９．４号の優先権を主張し、その特許出願の内容は引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【0002】
本発明は、抗体薬物コンジュゲート、特にポリオウイルス受容体様分子４（ネクチン－４）を標的とする抗体薬物コンジュゲート並びにその調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ネクチン（ポリオウイルス受容体様分子）は、カドヘリンと協調して又はカドヘリンとは独立して細胞間接着を制御する新規のクラスの細胞接着タンパク質である。ネクチンには、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、及びネクチン－４の４つのメンバーのファミリーが含まれる。全てのネクチンは、３つのＩｇ様ループを含む１つの細胞外領域と、１つの膜貫通セグメントと、１つの細胞質尾部とを有している。これらのメンバーの中で、ネクチン－４は、胚及び胎盤だけでなく腫瘍細胞においても特異的に発現されており、一部の研究では、様々な腫瘍細胞の発生及び発達に密接に関連していることが判明している。例えば、２３９４名の腫瘍患者由来の病理学的切片の分析により、ネクチン－４が膀胱癌、乳癌、及び膵臓癌に罹患している患者集団において広く発現されていることが明らかになった。したがって、ネクチン－４は、多くの腫瘍又は癌の診断及び治療のための重要な標的となっている。
【0004】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）技術は、抗体が腫瘍細胞の表面上の特異抗原を特異的に認識する能力を利用することによって抗腫瘍薬（例えば、細胞傷害性作用物質、細胞増殖抑制剤、小分子化学療法剤等）を標的腫瘍細胞に正確に送達し、抗腫瘍薬を集積して細胞内に放出し、それにより腫瘍を正確に殺傷する技術である。抗体薬物コンジュゲートは一般に、抗体又は抗体様リガンドと、小分子薬物と、それら２つを互いに接続するリンカーとの３つの部分から構成されている。抗体薬物コンジュゲートは、それらの適切な分子量、高い安定性、強力な標的化特性、並びに小さな毒性効果及び副作用のため、最も有望な抗悪性腫瘍薬の１つと考えられている。
【0005】
しかしながら、ＡＤＣの開発を成功させるには、多くの問題を検討し、それらに対処しなければならない。例えば、抗体が罹患領域を特異的に認識する必要があり、低いアレルゲン性を有し、エンドサイトーシスを介して効率的かつ迅速に細胞内移行され得ること、抗体と薬物とを接続するリンカーが血中で非常に安定であるべきであり、かつ特異的に活性化されて標的化細胞内で小分子薬物を効率的に放出する必要があること（そうでなければ正常細胞に対する許容することができないレベルの毒性を生ずることとなる）、接続された小分子薬物が強力な細胞殺傷活性等を有する必要があること等である。現在臨床試験中の抗体薬物コンジュゲートにおいては、高活性の細胞傷害性小分子薬物は典型的には、２～４の最適な薬物対抗体比（ＤＡＲ）でリンカーを介して抗体表面上のリジン残基又はヒンジ領域中のシステイン残基のいずれかに接続されている。しかしながら、抗体表面上の多数のリジン残基（８０個超）及びコンジュゲーション反応の非選択性により、接続される薬物の数とコンジュゲーション部位とが不確実となり、ひいては不均一な抗体薬物コンジュゲートの生成につながる。例えば、標的化薬トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）及び微小管阻害剤ＤＭ１（マイタンシン誘導体）から作られた抗体薬物コンジュゲートＴ－ＤＭ１は、０～８のＤＡＲ分布（平均ＤＡＲは３．５）を有する。同様に、抗体のヒンジ領域には４つの鎖間ジスルフィド結合しか存在しないが、最適な平均ＤＡＲ（２～４）を達成するには鎖間ジスルフィド結合の部分的な還元が必要とされる。しかしながら、現在利用可能な還元剤（ＤＴＴ、ＴＣＥＰ等）は鎖間ジスルフィド結合を選択的に還元することができないため、得られるコンジュゲートは均一ではなく、複数の構成要素から構成される。構成要素の中でも、主要な構成要素は、０、２、４、６、又は８のＤＡＲを有し、１つの対応する特定のＤＡＲを有する構成要素は、異なるコンジュゲーション部位により形成される異性体で存在する。ＡＤＣ製品の不均一性は、構成要素間の薬物動態特性、効力、及び毒性の不均一性につながる可能性がある。例えば、より高いＤＡＲを有する構成要素はｉｎ ｖｉｖｏでより迅速にクリアランスされ、より高い毒性をもたらす。
【0006】
Seattle GeneticsはAstellasと協力し、ランダムなコンジュゲーションを介した独自のリンカーｍｃ－ｖｃ－ＭＭＡＥ及び抗ネクチン－４抗体エンホルツマブを利用して、エンホルツマブベドチン（Ｐａｄｃｅｖ）という名称の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを提供した。或る臨床試験の結果では、化学療法及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤のレジメンを受けた患者において、エンホルツマブベドチンを受けた患者が、コントロール群における化学療法を受けた患者よりも３．９ヶ月長い１２．９ヶ月という中程度の全生存期間を示し、それによりエンホルツマブベドチンによる腫瘍治療について良好な有効性が示されることが明らかになった。しかしながら、臨床研究では、エンホルツマブベドチン治療が発熱、皮膚の痒み、末梢神経障害、ドライアイ、好中球減少症等を伴うことが多いことも判明した。これらの有害反応は、抗体への小分子の過剰な接続及び不安定な接続様式に直接関連している。
【0007】
したがって、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートの研究開発のための効率的で簡単かつ実用的な化学的コンジュゲーション方法が依然として必要に迫られている。
【発明の概要】
【0008】
本発明が解決すべき技術的問題は、ハイブリドーマスクリーニング技術及びヒト化技術を使用し、それによりヒト化設計を通じて最も少ない数のマウスアミノ酸を有することになり、ひいてはより良好なｉｎ ｖｉｖｏでの安全性及び応用の見通しのある、ヒトネクチン－４に高い親和性で特異的に結合することができる抗体を提供し、この抗体に基づいて、より強力な細胞内移行効果を有する抗体を更にスクリーニングすることであり、この抗体は小分子化学薬物との抗体薬物コンジュゲートへと調製されることになる。抗体薬物コンジュゲートは、抗体のネクチン－４発現細胞への標的化及び標的ネクチン－４を介した強力な細胞内移行効果と、小分子化学薬物の作用とを兼ね備えて、優れた腫瘍殺傷効果を達成することになる。
【0009】
したがって、本開示の１つの目的は、ネクチン－４に特異的に結合することができる抗体又はそのフラグメントを提供することである。本開示の文脈において、抗体のフラグメントは、抗体の様々な機能的フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又はｓｃＦｖフラグメント等のその抗原結合部分を包含する。本開示のもう１つの目的は、抗体又はそのフラグメントを使用して調製されるネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩を提供することである。
【0010】
本開示は、以下の技術的解決策を提供する。
【0011】
一態様において、本開示は、薬物に共有結合により連結された抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを含む、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩を提供する。
【0012】
本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩において、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、重鎖相補性決定領域１～重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）と、軽鎖相補性決定領域１～軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）とをそれぞれ以下の通りに含む：
（ｉ）それぞれ配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含むか、
（ｉｉ）それぞれ配列番号１１、配列番号１７、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１８、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含むか、又は、
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む、
重鎖及び軽鎖を含む。
（ｉ）それぞれ配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含むか、
（ｉｉ）それぞれ配列番号１１、配列番号１７、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１８、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含むか、又は、
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む、
重鎖及び軽鎖を含む。
【0013】
好ましくは、本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩は、次の式：Ａｂ－［Ｌ－ＣＴＤ］ｍを有し、式中、Ａｂは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを表し、Ｌは、リンカーを表し、ＣＴＤは、薬物を表し、かつｍは、Ａｂ分子１つ当たりに接続された薬物の平均数を表す。
【0014】
好ましくは、本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩において、ＣＴＤは、細胞傷害性薬物であり、好ましくは、ＣＴＤは、微小管阻害剤のＭＭＡＥ、ＤＭ１、ＤＭ４、ツブリシン、アマニチン、カリケアマイシン、エリブリン、及びそれらの誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤のＳＮ３８、エキサテカン、及びそれらの誘導体、並びにＤＮＡ結合性作用物質のＰＢＤ、ドキソルビシン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上である。
【0015】
ｍは、１．０～５．０、好ましくは３．０～４．２、より好ましくは３．５～４．５、なおもより好ましくは３．８～４．２、更により好ましくは３．９～４．１、特に好ましくは４．０である。
【0016】
好ましくは、本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩において、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる重鎖及び軽鎖は、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含み、かつ軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含む。
【0017】
より好ましくは、本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩において、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ、
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
（ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
（ｉｉｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、又は、
（ｉｖ）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
を含む。
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
（ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
（ｉｉｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、又は、
（ｉｖ）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
を含む。
【0018】
本開示の文脈において、アミノ酸配列の「変異体」とは、そのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性（７５％以上のあらゆる同一性パーセント、例えば、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は更には９９％の同一性等）を有するアミノ酸配列を指す。
【0019】
特に、本開示による抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を少なくとも含み、どちらも上記のＣＤＲ及び間隔を置いて配置されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、これらのドメインは、次のように配置される：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。このように、本開示により提供される抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に関して、「少なくとも７５％の配列同一性」による最大２５％の差異は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域におけるどのフレームワーク領域に存在してもよい。あるいは、本開示による抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントの全体に関して、最大２５％の差異が、本開示による抗体又はそのフラグメントにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域以外のどのドメイン又は配列に存在してもよい。差異は、あらゆる位置でのアミノ酸の欠失、付加、又は置換から生じ得るものであり、置換は保存的置換又は非保存的置換であってもよい。
【0020】
本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩において、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、あらゆる形態で、例えば、ネクチン－４に対するモノクローナル抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ナノボディ、完全ヒト化抗体若しくは部分的ヒト化抗体、又はキメラ抗体等で存在し、代替的には、抗体又はそのフラグメントは、ネクチン－４に対する半抗体又は半抗体の抗原結合フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二価の一本鎖可変フラグメント（ＢｓＦｖ）、ジスルフィド安定化可変フラグメント（ｄｓＦｖ）、（ジスルフィド安定化可変フラグメント）２（（ｄｓＦｖ）２）、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’フラグメント（Ｆａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｆ（ａｂ’）２）、又は可変フラグメント（Ｆｖ）である。本開示により提供されるフラグメントに関して、好ましくは、フラグメントは、哺乳動物ネクチン－４、好ましくは霊長類ネクチン－４、より好ましくはヒトネクチン－４に結合することができる抗体のあらゆるフラグメントである。
【0021】
好ましくは、本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩において、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは定常領域を更に含んでいてもよい。好ましくは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、ヒト又はマウスの重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）、より好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域及び／又はカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域を更に含む。
【0022】
好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体、好ましくはマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体であり、より好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプのものであり、かつモノクローナル抗体の軽鎖定常領域は、カッパ型のものである。代替的には、例えば、抗体は、免疫グロブリン、特にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭのヒトサブタイプ、より好ましくはヒトＩｇＧ１サブタイプ、ヒトＩｇＧ２サブタイプ、ヒトＩｇＧ３サブタイプ、又はヒトＩｇＧ４サブタイプである。
【0023】
本開示の特定の一実施の形態によれば、好ましくは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含む重鎖定常領域を含む。代替的には、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含む軽鎖定常領域を含む。上に定義されるように、アミノ酸配列の「変異体」とは、そのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を指す。
【0024】
さらに、本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩は、以下の式Ｉａ
及び／又は式Ｉｂ：
及び／又は
（式中、
Ａｂは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントであり、
Ａｒ’は、置換又は非置換のＣ６～Ｃ１０アリーレン及び置換又は非置換の５員～１２員のヘテロアリーレンからなる群から選択されるいずれか１つであり、ここで、置換は、基上の水素原子を、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、ハロゲン化アルキル（例えば、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはハロゲン化Ｃ１～Ｃ４アルキル、例えばトリフルオロメチル）及びアルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、例えばメトキシ）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置き換えることを指し、
Ｌ１は、Ａｒ’に連結された－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－であり、ここで、ｎは、１～２４、好ましくは１～１０、より好ましくは３～５の範囲内のいずれかの整数であり、
Ｌ２は、酵素切断可能な断片、例えばジペプチド若しくはトリペプチド若しくはテトラペプチド、又は切断可能な自己犠牲リンカーとのそれらの組合せ（すなわち、２個～４個のアミノ酸からなるポリペプチド断片、又はポリペプチド断片と、切断可能な自己犠牲リンカーとの組合せ）、例えば、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ（ＧＧＦＧ）、ＭＡＣグルクロニドフェノールである）により表される構造を有する。
【化1】
【化2】
（式中、
Ａｂは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントであり、
Ａｒ’は、置換又は非置換のＣ６～Ｃ１０アリーレン及び置換又は非置換の５員～１２員のヘテロアリーレンからなる群から選択されるいずれか１つであり、ここで、置換は、基上の水素原子を、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、ハロゲン化アルキル（例えば、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはハロゲン化Ｃ１～Ｃ４アルキル、例えばトリフルオロメチル）及びアルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、例えばメトキシ）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置き換えることを指し、
Ｌ１は、Ａｒ’に連結された－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－であり、ここで、ｎは、１～２４、好ましくは１～１０、より好ましくは３～５の範囲内のいずれかの整数であり、
Ｌ２は、酵素切断可能な断片、例えばジペプチド若しくはトリペプチド若しくはテトラペプチド、又は切断可能な自己犠牲リンカーとのそれらの組合せ（すなわち、２個～４個のアミノ酸からなるポリペプチド断片、又はポリペプチド断片と、切断可能な自己犠牲リンカーとの組合せ）、例えば、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ（ＧＧＦＧ）、ＭＡＣグルクロニドフェノールである）により表される構造を有する。
【0025】
好ましくは、Ｌ２－ＣＴＤは、ＶｃＭＭＡＥ、ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ、又はＶＣ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡである。
【0026】
好ましくは、Ａｒ’が置換又は非置換の５員～１２員のヘテロアリーレンである場合、ヘテロ原子は、Ｎである。
【0027】
好ましくは、Ａｒ’は、置換若しくは非置換のＣ６アリーレン、又は置換若しくは非置換の６員のヘテロアリーレンである。
【0028】
本開示の特定の実施の形態によれば、本開示により提供される抗体薬物コンジュゲート又はその塩は、以下の構造：
コンジュゲートＡＤＣ－１
コンジュゲートＡＤＣ－２
コンジュゲートＡＤＣ－３
コンジュゲートＡＤＣ－４
コンジュゲートＡＤＣ－５
コンジュゲートＡＤＣ－６
コンジュゲートＡＤＣ－７
を有する。
コンジュゲートＡＤＣ－１
【化3】
【化4】
【化5】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【0029】
別の態様において、本開示は、以下の式Ｉａ
及び／又は式Ｉｂ：
及び／又は
により表される構造を有する、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩の調製方法であって、
方法は、以下の工程：
（１）抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを緩衝液中で還元剤と反応させて、還元された抗体又はそのフラグメントを得る工程、
（２）緩衝液と有機溶媒との混合物中で、工程（１）で得られた還元された抗体又はそのフラグメントに薬物－リンカー（リンカー薬物コンジュゲート）をコンジュゲートさせて、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩を得る工程、
を含む、調製方法を提供する。
【化9】
【化10】
により表される構造を有する、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩の調製方法であって、
方法は、以下の工程：
（１）抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを緩衝液中で還元剤と反応させて、還元された抗体又はそのフラグメントを得る工程、
（２）緩衝液と有機溶媒との混合物中で、工程（１）で得られた還元された抗体又はそのフラグメントに薬物－リンカー（リンカー薬物コンジュゲート）をコンジュゲートさせて、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩を得る工程、
を含む、調製方法を提供する。
【0030】
本開示により提供される調製方法において、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは上記に定義される通りである。薬物－リンカーは、以下の式Ｉｃ：
（式中、
Ｒは、Ｘ又はＲ’Ｓであり、ここで、Ｘは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、好ましくはＢｒ又はＩであり、Ｒ’は、置換若しくは非置換のＣ６～Ｃ１０アリール又は置換若しくは非置換の５員～１２員のヘテロアリールであり、ここで、置換は、基上の水素原子を、アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル）、アルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、より好ましくはメトキシ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、エステル、アミド、及びシアノからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置き換えることを指し、
好ましくは、Ｒは、Ｒ’Ｓであり、ここで、Ｒ’は、フェニル又は置換フェニルであり、置換フェニルにおける置換基は、アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル）、アルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、より好ましくはメトキシ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、エステル、アミド、及びシアノからなる群から選択され、好ましくは、Ｒ’は、フェニル、４－メチルホルムアミド置換フェニル（
）、又は４－ホルミルモルホリン置換フェニル（
）であり、かつ、
Ａｒ’、Ｌ１、Ｌ２、及びＣＴＤは、上記に規定される通りである）により表される構造を有する。
【化11】
Ｒは、Ｘ又はＲ’Ｓであり、ここで、Ｘは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、好ましくはＢｒ又はＩであり、Ｒ’は、置換若しくは非置換のＣ６～Ｃ１０アリール又は置換若しくは非置換の５員～１２員のヘテロアリールであり、ここで、置換は、基上の水素原子を、アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル）、アルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、より好ましくはメトキシ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、エステル、アミド、及びシアノからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置き換えることを指し、
好ましくは、Ｒは、Ｒ’Ｓであり、ここで、Ｒ’は、フェニル又は置換フェニルであり、置換フェニルにおける置換基は、アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル）、アルコキシ（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコキシ、より好ましくはメトキシ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、エステル、アミド、及びシアノからなる群から選択され、好ましくは、Ｒ’は、フェニル、４－メチルホルムアミド置換フェニル（
【化12】
【化13】
Ａｒ’、Ｌ１、Ｌ２、及びＣＴＤは、上記に規定される通りである）により表される構造を有する。
【0031】
本開示の文脈において、「薬物－リンカー」、「［Ｌ－Ｄ］」、「薬物含有リンカー」、「リンカー薬物コンジュゲート」等は互換的に使用される。本出願の特定の実施の形態によれば、薬物－リンカーは、
からなる群から選択されるいずれか１つである。
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【0032】
好ましくは、本開示により提供される調製方法は、以下の工程：
ａ．抗体の還元：５ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬの濃度で抗体を含むリン酸緩衝液に還元剤を５．５以上：１（還元剤：抗体）の当量モル比で添加し、還元剤と抗体とを１．５時間～２時間反応させる工程、
なお、還元剤は、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、２－ＭＥＡ、及びＤＴＢＡからなる群から選択される１つ以上である；
ｂ．抗体のコンジュゲーション：工程ａで得られた還元された抗体をｐＨ６．５～７．８のリン酸緩衝液中へと置き換え、それによって抗体を緩衝液中で３．５ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、希釈された抗体溶液を得て、有機共溶媒中に溶解された薬物含有リンカーを希釈された抗体溶液に４．５～６．５：１（薬物含有リンカー：抗体）の当量モル比で添加し、次いで、この反応系を撹拌しながら１５℃～３５℃で０．５時間以上反応させる工程、
なお、有機共溶媒は、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、及びＡＣＮからなる群から選択される１つ以上である；
ｃ．疎水性クロマトグラフィー：得られた抗体コンジュゲーション生成物を、疎水性充填剤を使用する疎水性クロマトグラフィーによる精製に供する工程、
を含む。
ａ．抗体の還元：５ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬの濃度で抗体を含むリン酸緩衝液に還元剤を５．５以上：１（還元剤：抗体）の当量モル比で添加し、還元剤と抗体とを１．５時間～２時間反応させる工程、
なお、還元剤は、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、２－ＭＥＡ、及びＤＴＢＡからなる群から選択される１つ以上である；
ｂ．抗体のコンジュゲーション：工程ａで得られた還元された抗体をｐＨ６．５～７．８のリン酸緩衝液中へと置き換え、それによって抗体を緩衝液中で３．５ｍｇ／ｍＬ～１５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、希釈された抗体溶液を得て、有機共溶媒中に溶解された薬物含有リンカーを希釈された抗体溶液に４．５～６．５：１（薬物含有リンカー：抗体）の当量モル比で添加し、次いで、この反応系を撹拌しながら１５℃～３５℃で０．５時間以上反応させる工程、
なお、有機共溶媒は、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、及びＡＣＮからなる群から選択される１つ以上である；
ｃ．疎水性クロマトグラフィー：得られた抗体コンジュゲーション生成物を、疎水性充填剤を使用する疎水性クロマトグラフィーによる精製に供する工程、
を含む。
【0033】
更に好ましくは、調製方法は、工程ｂの後、又は工程ｃの後に、以下の工程：
ｄ．加水分解：抗体コンジュゲーション生成物をｐＨ７．４～９．０のリン酸緩衝液中へと置き換え、緩衝液を３５±１０℃で２時間～２４時間加熱して加水分解生成物を得る工程、
を更に含む。
ｄ．加水分解：抗体コンジュゲーション生成物をｐＨ７．４～９．０のリン酸緩衝液中へと置き換え、緩衝液を３５±１０℃で２時間～２４時間加熱して加水分解生成物を得る工程、
を更に含む。
【0034】
好ましくは、工程ａ、工程ｂ、及び工程ｄにおける置き換えは、モレキュラーシーブ、超遠心分離チューブ、又は限外濾過膜を使用して実施される。好ましくは、工程ｃにおいて使用される疎水性充填剤は、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ Ｉｍｐｒｅｓ、又はＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦであり得る。
【0035】
更に別の態様において、本開示は、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを提供する。上記のネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩に含まれる抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに関する説明及び定義は、この態様における抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに適用される。詳細な配列に関して、本開示により提供される抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントは重鎖及び軽鎖を含み、重鎖及び軽鎖は、重鎖相補性決定領域１～重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）と、軽鎖相補性決定領域１～軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）とをそれぞれ以下の通りに含む：
それぞれ配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。
それぞれ配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。
【0036】
好ましくは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる重鎖及び軽鎖は、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号５若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含み、かつ軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含む。
【0037】
より好ましくは、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
（Ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、又は、
（Ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
を含む。
（Ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、又は、
（Ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列若しくはその変異体、
を含む。
【0038】
更にこの態様において、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントはまた、抗体薬物コンジュゲートにおける抗体部分について本明細書において上記で定義したそれぞれの特徴を有し得る。
【0039】
上記のように本開示により提供される抗体によれば、本開示は、本開示による抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントに含まれる重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。
【0040】
本開示による核酸分子は、ベクターにクローニングすることができ、次にこのベクターが宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換する。したがって、更に別の態様において、本開示は、本開示の核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、人工染色体、ファージベクター等であり得る。
【0041】
本開示により提供されるベクター又は核酸分子は、宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトするために、又は抗体の保存若しくは発現等のために宿主細胞に入るために任意の方法で使用され得る。したがって、更なる態様において、本開示は、本開示の核酸分子及び／又はベクターを含む宿主細胞、又は本開示の核酸分子及び／又はベクターで形質転換若しくはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞又は真核生物細胞、例えば細菌若しくは昆虫、真菌、植物又は動物の細胞であり得る。
【0042】
本開示により提供される抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメントを、当該技術分野において知られるあらゆる従来の技術を使用して得ることができる。例えば、抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖を本開示により提供される核酸分子から得ることができ、次いで、これらを抗体の任意の他のドメインと集成して抗体を得ることができ、代替的には、本開示により提供される宿主細胞は、宿主細胞が抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖を発現し、これらが集成して抗体となることができる条件下で培養される。任意に、この方法は更に、生成された抗体を回収する工程を含む。
【0043】
ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート若しくはその塩、抗ネクチン－４抗体若しくはそのフラグメント、核酸分子、ベクター、又は宿主細胞を、組成物中、より詳細には医薬調剤中に含めて、実際に必要とされるときに様々な目的に使用することができる。したがって、なおも更なる態様において、本開示はまた、本開示のネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント、核酸分子、ベクター、及び／又は宿主細胞を含む組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、薬学的に許容可能な担体、補助物質、又は賦形剤を任意に含む医薬組成物である。
【0044】
なおも別の態様において、本開示は、腫瘍を治療する医薬の製造における、ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物の使用を提供する。代替的に、本開示は、腫瘍を治療する方法であって、治療を必要とする被験体にネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート又はその塩、抗ネクチン－４抗体又はそのフラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物を投与することを含む、方法を提供する。被験体は、哺乳動物、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【0045】
好ましくは、腫瘍は、ネクチン－４の高発現に関連する腫瘍又は癌であり、好ましくは、腫瘍又は癌は、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、未分化大細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性黒色腫、扁平上皮癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、消化管腫瘍、前立腺癌、結腸直腸癌、神経膠腫、及び中皮腫からなる群から選択されるいずれか１つである。
【0046】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1A】ＡＤＣの３ｄの特性評価結果を示す図である。パネル１Ａ：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロファイル。
【図1B】ＡＤＣの３ｄの特性評価結果を示す図である。パネル１Ｂ：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイル。
【図1C】ＡＤＣの３ｄの特性評価結果を示す図である。パネル１Ｃ：非還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ）プロファイル。
【図1D】ＡＤＣの３ｄの特性評価結果を示す図である。パネル１Ｄ：液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）スペクトル。
【図2】様々なＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の結果を示す図である。
【図3】様々なＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の結果を示す図である。
【図4】様々なＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の結果を示す図である。
【図5】様々なＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の結果を示す図である。
【図6】様々なＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0048】
以下に本発明を、具体例を参照して説明する。これらの実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではないことが当業者には理解されよう。
【0049】
以下の実施例における実験手順は、特に明示がない限り、全て慣用のものである。以下の実施例で用いた原材料及び試薬は、特に明示がない限り、いずれも市販品である。
【実施例】
【0050】
実施例群１ 抗ネクチン－４抗体のスクリーニング及び調製
マウスを組換えヒトネクチン－４タンパク質（Novoprotein Scientific Inc.から購入した、カタログ番号：ＣＪ１９）で免疫化し、Ｂ細胞を免疫化マウスから取得し、事前に調製されたＳＰ２０骨髄腫細胞と融合させて、ヒトネクチン－４抗原に結合することができる陽性ハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。それぞれが１種の抗体のみを分泌する陽性ハイブリドーマ細胞株を最終的に得た。
マウスを組換えヒトネクチン－４タンパク質（Novoprotein Scientific Inc.から購入した、カタログ番号：ＣＪ１９）で免疫化し、Ｂ細胞を免疫化マウスから取得し、事前に調製されたＳＰ２０骨髄腫細胞と融合させて、ヒトネクチン－４抗原に結合することができる陽性ハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。それぞれが１種の抗体のみを分泌する陽性ハイブリドーマ細胞株を最終的に得た。
【0051】
抗ネクチン－４抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を拡大培養した後、細胞から全ＲＮＡを抽出し、次いでｃＤＮＡに逆転写した。抗体の軽鎖可変領域ＩｇＶＬ（κ）及び重鎖可変領域ＶＨの配列をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｔベクターにライゲーションした。得られたベクターをＥ．コリ（E. coli）細胞へと形質転換した。細胞の伸展培養後、ＤＮＡ配列決定用にプラスミドを抽出して、モノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を取得した。
【0052】
各マウス抗ヒトネクチン－４モノクローナル抗体の重鎖可変領域配列と、公開されているヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１サブクラスの重鎖定常領域配列（配列番号９）とを共にスプライシングして、哺乳動物細胞発現ベクターへと構築し、各マウス抗ヒトネクチン－４モノクローナル抗体の軽鎖可変領域配列と、公開されているヒトモノクローナル抗体κサブクラスの軽鎖定常領域配列（配列番号１０）とを共にスプライシングして、哺乳類細胞発現ベクターへと構築した。構築した抗ヒトネクチン－４キメラ抗体調製用の重鎖ベクター及び軽鎖ベクターをペアで混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３細胞にベクターをトランスフェクトし、約７日後に細胞上清を収集した。抗ヒトネクチン－４キメラ抗体を、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔを使用して取得した。
【0053】
抗体コードスキームを用いた包括的な分析に従って、各マウス抗体の重鎖及び軽鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、並びに保存された三次元立体構造を支持するフレームワーク領域を決定した。続いて、マウス抗体とほぼ似通ったヒト抗体の重鎖可変領域配列を既知のヒト抗体配列から検索し、例えばＩＧＨＶ１｜ＩＧＨＪ４＊０１を選択した。その中のフレームワーク領域配列を鋳型として選択し、マウス抗体の重鎖ＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域と組み合わせて、最終的にヒト化重鎖可変領域配列を作製した。同様にして、ヒト化軽鎖可変領域配列を作製した。結合活性の変化に応じて、フレームワーク領域における個々のアミノ酸が復帰突然変異に供されて、ヒトのものからマウスのものに変化し、及び／又は翻訳後修飾が行われる場合には個々のアミノ酸が修飾された。代替的なヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域を最終的に得た。
【0054】
ヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域をペアで組み合わせ、上記のキメラ抗体の調製方法を参照することによりヒト化抗体を得た。ヒトネクチン－４に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞結合アッセイ、標的癌細胞におけるエンドサイトーシスアッセイ、標的癌細胞増殖阻害アッセイによるだけでなく、既知の薬物含有リンカーを用いてＡＤＣへと調製した際の抗体の抗原結合能力、細胞内移行活性、又は薬力学等を測定することを通じても、以下のヒト化抗体をスクリーニングした（ＣＤＲに下線を付した）：
【0055】
４２Ｄ２０－ｈｚ６３
ＶＨ（配列番号１、順次のＣＤＲ：配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＧＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号２、順次のＣＤＲ：配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＥＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
ＶＨ（配列番号１、順次のＣＤＲ：配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＧＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号２、順次のＣＤＲ：配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＥＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
【0056】
４２Ｄ２０－ｈｚ１０：
ＶＨ（配列番号３、順次のＣＤＲ：配列番号１１、配列番号１７、配列番号１３、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＤＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号４、順次のＣＤＲ：配列番号１８、配列番号１５、配列番号１６、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
ＶＨ（配列番号３、順次のＣＤＲ：配列番号１１、配列番号１７、配列番号１３、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＤＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号４、順次のＣＤＲ：配列番号１８、配列番号１５、配列番号１６、ＣＨＯＴＨＩＡナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
【0057】
ｈＨ２Ｌ１：
ＶＨ（配列番号５、順次のＣＤＲ：配列番号１９、配列番号２０、配列番号１３、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＧＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号６、順次のＣＤＲ：配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号５、順次のＣＤＲ：配列番号１９、配列番号２０、配列番号１３、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＧＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号６、順次のＣＤＲ：配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【0058】
ｈＬ２Ｈ１ｍｕｔ１：
ＶＨ（配列番号７、順次のＣＤＲ：配列番号１９、配列番号２０、配列番号１３、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＧＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号８、順次のＣＤＲ：配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＥＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号７、順次のＣＤＲ：配列番号１９、配列番号２０、配列番号１３、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＧＧＫＩＹＹＮＳＶＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＧＬＬＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ（配列番号８、順次のＣＤＲ：配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、ＫＡＢＡＴナンバリングスキームによる）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＴＹＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＥＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＨＹＮＴＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【0059】
実施例群２ 抗体薬物コンジュゲートの調製及び物理化学的特性評価
実例となる実験に以下の方法を使用する：
２．１ 薬物含有リンカーＣ－１、Ｃ－２、Ｃ－３、及びＣ－４の調製
実例となる実験に以下の方法を使用する：
２．１ 薬物含有リンカーＣ－１、Ｃ－２、Ｃ－３、及びＣ－４の調製
【化34】
【化35】
【化36】
【化37】
【0060】
国際公開第２０１８／０９５４２２号に開示された方法を使用して化合物を合成し、全ての生成物は黄色の固体であった。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）Ｍ＋１：それぞれ、１９２７（Ｃ－１）、１９８７（Ｃ－２）、１９６３（Ｃ－３）、及び１９９５（Ｃ－４）。
【0061】
薬物含有リンカーＭＣ－ＶＣ－ＭＭＡＥをMCE（MedChemExpress）から購入した。
【化38】
【0062】
２．２ 部位特異的にコンジュゲートされた抗体薬物コンジュゲートの調製
【化39】
【0063】
抗体薬物コンジュゲートを調製する方法は、中国特許出願第２０２０１１０４６９１１．Ｘ号に記載される通りであり、抗体を還元してジスルフィド結合を切断することと、還元された抗体を薬物含有リンカーとコンジュゲートさせて抗体薬物コンジュゲートを形成することと、抗体薬物コンジュゲートに含まれるマレイミド環を、加水分解を介して開環することと、得られた生成物を精製して、４のＤＡＲを有する抗体薬物コンジュゲートを得ることとを含むものであった（中国特許出願第２０２０１１０４６９１１．Ｘ号の内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。
【0064】
使用される例示的な方法は詳細には以下の通りである：
【0065】
試料の還元及びコンジュゲーション：抗体を含む試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５を充填したＮＡＰ－２５脱塩カラムを用いて、５０ｍＭの塩化ナトリウム及び５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７．４）中へと置き換え、抗体濃度を１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍＬの希釈された抗体試料（合計１００ｍｇ）を取り、これに１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＴＣＥＰ（Sigma-Aldrich）の水溶液を１０：１（還元剤：抗体）の当量モル比で加えた。２時間インキュベートした後、反応溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５脱塩カラムを用いて、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７．０）中への緩衝液交換に供した。
【0066】
還元された抗体を緩衝液中で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、その中に総反応容量の７．４％を占める１．３３ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、前溶媒として）及びＤＭＡ中の薬物含有リンカーの溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を５．５：１（薬物：抗体）の当量モル比で順次加えた。反応物を室温で６０分間撹拌した後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５を充填したＮＡＰ－２５脱塩カラムを用いて、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ８．０）中への緩衝液交換に供して、過剰な薬物含有リンカーを除去した。得られた溶液を水浴中で３７℃にて３時間加熱した。水浴中での加熱の前後に、溶液を採取して、質量分析法を使用してその中に含まれるコンジュゲート生成物の構造を分析した。様々なコンジュゲート生成物の分析結果によれば、水浴中で加熱する前にコンジュゲート生成物は式Ｉａにより表される構造であったのに対し、水浴中で加熱した後にはコンジュゲート生成物について式Ｉｂにより表される完全に開環した構造が得られた、すなわちこれらが１００％加水分解されたことが明らかになった。
【0067】
試料の精製：上記の溶液を、ＡＭＩＣＯＭ限外濾過遠心分離チューブを使用して、約１５ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム及び３Ｍのリン酸アンモニウムからなる緩衝液を溶液へと加えて、７４ｍｓ／ｃｍの導電率を達成した。次いで、これを、相Ａ：５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム及び０．４５Ｍの硫酸アンモニウムからなる緩衝液、相Ｂ：５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムからなる緩衝液を使用して、Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦ（GE Healthcareから購入した）を充填した疎水性カラムに適用した。０％→８０％の相Ｂでの１２カラム容量の線形グラジエント溶離及び１００％の相Ｂでの均一濃度グラジエント溶離を行い、主ピークを収集した。
【0068】
得られた最終試料を、ＡＭＩＣＯＭ限外濾過遠心分離チューブを使用して、５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７．４）中への緩衝液交換に供した後に、これを０．２２μｍフィルター（Sartorius stedimのＭｉｎｉｓｔａｒｔ）を通して濾過した。
【0069】
実際の反応規模が１ｇ以上である場合、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５を充填したＮＡＰ－２５脱塩カラム及びＡＭＩＣＯＭ限外濾過遠心分離チューブを、反応で使用された当量比を変更せずにＨＹＤＲＯ－３０ｋＤ（Sartorius）限外濾過膜に交換した。他の主要なパラメーターも変更しなかった。
【0070】
２．３ 部位特異的にコンジュゲートされた抗体薬物コンジュゲートの物理化学的特性評価
ａ．薬物対抗体比（ＵＶ－ＤＡＲ法）及び濃度を決定するのに使用される紫外分光光度法
抗体薬物コンジュゲートの濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度及び小分子に特徴的な吸収波長を測定し、以下の通りに計算することによって得ることができる。
ａ．薬物対抗体比（ＵＶ－ＤＡＲ法）及び濃度を決定するのに使用される紫外分光光度法
抗体薬物コンジュゲートの濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度及び小分子に特徴的な吸収波長を測定し、以下の通りに計算することによって得ることができる。
【0071】
ａ１．ランダムにコンジュゲートされたＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）の決定
これは、文献（Clin Cancer Res. 2004 Oct 15; 10(20): 7063-70）から、ＤＡＲ（薬物対抗体比）＝
（式中、
は、２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数であり、Ａ２８０は、２８０ｎｍでの抗体を含む抗体薬物コンジュゲートのＵＶ吸光度であり、Ａ２４８は、抗体薬物コンジュゲート中の薬物含有リンカーに特徴的な吸収波長である２４８ｎｍでの抗体薬物コンジュゲートのＵＶ吸光度であり、
は、薬物含有リンカーに特徴的な吸収波長である２４８ｎｍでの抗体のモル吸光係数であり、
は、２４８ｎｍでの薬物含有リンカーのモル吸光係数であり、かつ
は、２８０ｎｍでの薬物含有リンカーのモル吸光係数である）であることが知られており、以下の通りである：
これは、文献（Clin Cancer Res. 2004 Oct 15; 10(20): 7063-70）から、ＤＡＲ（薬物対抗体比）＝
【0072】
【表1】
【0073】
ａ２．部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）の決定
これは、文献（Clin Cancer Res. 2004 Oct 15; 10(20): 7063-70）から、ＤＡＲ（薬物対抗体比）＝
（式中、
は、２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数であり、Ａ２８０は、２８０ｎｍでの抗体を含む抗体薬物コンジュゲートのＵＶ吸光度であり、Ａ２５１は、抗体薬物コンジュゲート中の薬物含有リンカーに特徴的な吸収波長である２５１ｎｍでの抗体薬物コンジュゲートのＵＶ吸光度であり、
は、薬物含有リンカーに特徴的な吸収波長である２５１ｎｍでの抗体のモル吸光係数であり、
は、２５１ｎｍでの薬物含有リンカーのモル吸光係数であり、かつ
は、２８０ｎｍでの薬物含有リンカーのモル吸光係数である）であることが知られており、以下の通りである：
これは、文献（Clin Cancer Res. 2004 Oct 15; 10(20): 7063-70）から、ＤＡＲ（薬物対抗体比）＝
【0074】
【表2】
【0075】
ａ３．ＡＤＣの濃度の決定
或る特定の波長での総吸光度は、系内に存在する全ての吸収性化学種の吸光度の合計に等しいため（吸光度の相加的性質）、ＡＤＣに含まれる抗体及び薬物含有リンカーのモル吸光係数が、抗体と薬物含有リンカーとのコンジュゲーションの前後に変化しない場合、そのときのＡＤＣの濃度は以下の関係に従うと仮定される：
或る特定の波長での総吸光度は、系内に存在する全ての吸収性化学種の吸光度の合計に等しいため（吸光度の相加的性質）、ＡＤＣに含まれる抗体及び薬物含有リンカーのモル吸光係数が、抗体と薬物含有リンカーとのコンジュゲーションの前後に変化しない場合、そのときのＡＤＣの濃度は以下の関係に従うと仮定される：
【0076】
したがって、抗体薬物コンジュゲートのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）は、
である。
【0077】
したがって、抗体薬物コンジュゲートの濃度（ｇ／Ｌ）は、
（式中、ＭＷＡＤＣは、抗体薬物コンジュゲートの分子量であり、ＭＷａｂは、抗体の分子量であり、ＭＷＤは、薬物含有リンカーの分子量であり、ＤＡＲ値を式に代入することによりタンパク質濃度を得ることができる）である。
【0078】
ｂ－１．部位特異的にコンジュゲートされた抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲ値を決定するのに使用される疎水性クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）
試料の準備：試料を移動相Ｂで２．０ｍｇ／ｍＬに希釈した後に、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣ分析用に採取した。
試料の準備：試料を移動相Ｂで２．０ｍｇ／ｍＬに希釈した後に、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣ分析用に採取した。
【0079】
クロマトグラフィーカラム：Ｓｅｐａｘ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ ＨＩＣ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰ５、５μｍ、４．６ｍｍ×３５ｍｍ、
移動相Ａ：０．０２５Ｍのリン酸塩＋１．２Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０）、
移動相Ｂ：０．０２５Ｍのリン酸塩（ｐＨ７．０）、
移動相Ｃ：１００％のＩＰＡ、
流速：０．８ｍＬ／分、
検出波長：２８０ｎｍ、
カラム温度：３０℃、
ローディング容量：２０μＬ。
移動相Ａ：０．０２５Ｍのリン酸塩＋１．２Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０）、
移動相Ｂ：０．０２５Ｍのリン酸塩（ｐＨ７．０）、
移動相Ｃ：１００％のＩＰＡ、
流速：０．８ｍＬ／分、
検出波長：２８０ｎｍ、
カラム温度：３０℃、
ローディング容量：２０μＬ。
【0080】
【表3】
【0081】
ＤＡＲについての計算式：
ＤＡＲ＝Σ（加重ピーク面積）／１００、すなわち、ＤＡＲ＝（Ｄ０ピーク面積比×０＋Ｄ１ピーク面積比×１＋Ｄ２ピーク面積比×２＋Ｄ３ピーク面積比×３＋Ｄ４ピーク面積比×４＋Ｄ５ピーク面積比×５＋Ｄ６ピーク面積比×６＋Ｄ７ピーク面積比×７＋Ｄ８ピーク面積比×８）／１００。
ＤＡＲ＝Σ（加重ピーク面積）／１００、すなわち、ＤＡＲ＝（Ｄ０ピーク面積比×０＋Ｄ１ピーク面積比×１＋Ｄ２ピーク面積比×２＋Ｄ３ピーク面積比×３＋Ｄ４ピーク面積比×４＋Ｄ５ピーク面積比×５＋Ｄ６ピーク面積比×６＋Ｄ７ピーク面積比×７＋Ｄ８ピーク面積比×８）／１００。
【0082】
ｂ－２．ランダムにコンジュゲートされた抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲ値を決定するのに使用される疎水性クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）
試料の準備：試料を移動相Ｂで２．０ｍｇ／ｍＬに希釈した後に、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣ分析用に採取した。
試料の準備：試料を移動相Ｂで２．０ｍｇ／ｍＬに希釈した後に、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣ分析用に採取した。
【0083】
クロマトグラフィーカラム：東ソー株式会社、Ｂｕｔｙｌ ＮＰＲ、２．５μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、
移動相Ａ：１２５ｍＭのリン酸塩＋２．５Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．８）、
移動相Ｂ：１２５ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）、
移動相Ｃ：１００％のＩＰＡ、
移動相Ｄ：Ｈ２Ｏ、
流速：０．７ｍＬ／分、
検出波長：２８０ｎｍ、
カラム温度：３０℃、
ローディング容量：１０μＬ。
移動相Ａ：１２５ｍＭのリン酸塩＋２．５Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．８）、
移動相Ｂ：１２５ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）、
移動相Ｃ：１００％のＩＰＡ、
移動相Ｄ：Ｈ２Ｏ、
流速：０．７ｍＬ／分、
検出波長：２８０ｎｍ、
カラム温度：３０℃、
ローディング容量：１０μＬ。
【0084】
【表4】
【0085】
ＤＡＲについての計算式：
ＤＡＲ＝Σ（加重ピーク面積）／１００、すなわち、ＤＡＲ＝（Ｄ０ピーク面積比×０＋Ｄ１ピーク面積比×１＋Ｄ２ピーク面積比×２＋Ｄ３ピーク面積比×３＋Ｄ４ピーク面積比×４＋Ｄ５ピーク面積比×５＋Ｄ６ピーク面積比×６＋Ｄ７ピーク面積比×７＋Ｄ８ピーク面積比×８）／１００。
ＤＡＲ＝Σ（加重ピーク面積）／１００、すなわち、ＤＡＲ＝（Ｄ０ピーク面積比×０＋Ｄ１ピーク面積比×１＋Ｄ２ピーク面積比×２＋Ｄ３ピーク面積比×３＋Ｄ４ピーク面積比×４＋Ｄ５ピーク面積比×５＋Ｄ６ピーク面積比×６＋Ｄ７ピーク面積比×７＋Ｄ８ピーク面積比×８）／１００。
【0086】
ｃ．ＤＡＲ値を決定するのに使用される質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）
試料の準備：適量の試料を限外濾過チューブに入れ、これを５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３からなる緩衝液（ｐＨ７．１）中への緩衝液交換に供した。緩衝液を補充したら、得られた試料を限外濾過遠心分離（１３０００ｇ×５分）に供した。８μＬのＰＮＧアーゼＦを試料中に添加し、これを更に３７℃で５時間インキュベートして脱糖した。インキュベートした後に、試料を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清を後の試験用の試験試料として試料バイアル中に添加した。
試料の準備：適量の試料を限外濾過チューブに入れ、これを５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３からなる緩衝液（ｐＨ７．１）中への緩衝液交換に供した。緩衝液を補充したら、得られた試料を限外濾過遠心分離（１３０００ｇ×５分）に供した。８μＬのＰＮＧアーゼＦを試料中に添加し、これを更に３７℃で５時間インキュベートして脱糖した。インキュベートした後に、試料を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清を後の試験用の試験試料として試料バイアル中に添加した。
【0087】
クロマトグラフィーカラム：ＰｏｌｙＬＣ（商標）ＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬＡカラム、３００Å、５μｍ、２．１ｍｍ×２００ｍｍ、
移動相：５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）、
溶出時間：１０分、
流速：０．１ｍＬ／分、
ローディング容量：２μＬ、
カラム温度：２５℃、
検出波長：２８０ｎｍ、
イオン化モード：ＥＳＩポジティブ、
乾燥ガス温度：３２５℃、
乾燥ガス流速：８Ｌ／分、
アトマイザー圧力：２０ｐｓｉｇ、
シースガス温度：３２５℃、
シースガス流速：１２Ｌ／分、
スキャン設定：９００ｍ／ｚ～８０００ｍ／ｚ。
移動相：５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）、
溶出時間：１０分、
流速：０．１ｍＬ／分、
ローディング容量：２μＬ、
カラム温度：２５℃、
検出波長：２８０ｎｍ、
イオン化モード：ＥＳＩポジティブ、
乾燥ガス温度：３２５℃、
乾燥ガス流速：８Ｌ／分、
アトマイザー圧力：２０ｐｓｉｇ、
シースガス温度：３２５℃、
シースガス流速：１２Ｌ／分、
スキャン設定：９００ｍ／ｚ～８０００ｍ／ｚ。
【0088】
ｄ．分子の分子サイズの不均一性を決定するのに使用されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）
試料の準備：試料を移動相で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した後に、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を分析用に採取した。
試料の準備：試料を移動相で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した後に、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を分析用に採取した。
【0089】
クロマトグラフィーカラム：東ソー株式会社、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ、
移動相：１００ｍＭのリン酸塩＋２００ｍＭのアルギニン塩酸塩、５％のイソプロパノール（ｐＨ６．８）、
流速：０．６ｍＬ／分、
検出波長：２８０ｎｍ、
カラム温度：３０℃、
ローディング容量：２０μＬ、
溶離時間：２５分、
溶離グラジエント：均一濃度溶離。
移動相：１００ｍＭのリン酸塩＋２００ｍＭのアルギニン塩酸塩、５％のイソプロパノール（ｐＨ６．８）、
流速：０．６ｍＬ／分、
検出波長：２８０ｎｍ、
カラム温度：３０℃、
ローディング容量：２０μＬ、
溶離時間：２５分、
溶離グラジエント：均一濃度溶離。
【0090】
ｅ．非還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ）による純度の決定
この決定は、中国薬局方の第ＩＶ部の総則３１２７に記載される「モノクローナル抗体の分子サイズ変異体の決定（Determination of molecular size variants of monoclonal antibodies）」の方法に従って行った。
この決定は、中国薬局方の第ＩＶ部の総則３１２７に記載される「モノクローナル抗体の分子サイズ変異体の決定（Determination of molecular size variants of monoclonal antibodies）」の方法に従って行った。
【0091】
実施例１ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートの調製及び物理化学的分析
抗ネクチン－４抗体Ｒｅｆ（WHO Drug Informationにおいて提供されるエンホルツマブの配列を参照して調製した）、４２Ｄ２０－ｈｚ６３、４２Ｄ２０－ｈｚ１０、ｈＨ２Ｌ１、ｈＨ１Ｌ２ｍｕｔ１、及び無関係のＩｇＧ１（Bio-Rad Antibodies、カタログ番号：ＭＣＡ９２８）（各１００ｍｇ）を、本実施例群２におけるセクション２．２に記載されるように、薬物含有リンカーＣ－１及びＣ－３とそれぞれコンジュゲートさせ、部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣの１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ及び２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅを得た。
抗ネクチン－４抗体Ｒｅｆ（WHO Drug Informationにおいて提供されるエンホルツマブの配列を参照して調製した）、４２Ｄ２０－ｈｚ６３、４２Ｄ２０－ｈｚ１０、ｈＨ２Ｌ１、ｈＨ１Ｌ２ｍｕｔ１、及び無関係のＩｇＧ１（Bio-Rad Antibodies、カタログ番号：ＭＣＡ９２８）（各１００ｍｇ）を、本実施例群２におけるセクション２．２に記載されるように、薬物含有リンカーＣ－１及びＣ－３とそれぞれコンジュゲートさせ、部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣの１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ及び２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅを得た。
【0092】
本実施例群２におけるセクション２．２に記載されるように、中国特許出願第２０２０１１０４６９１１．Ｘ号に記載される抗体薬物コンジュゲートの調製方法を使用して、抗ネクチン－４抗体ｈＨ２Ｌ１を、薬物含有リンカーＣ－３と大規模にコンジュゲートさせ、ＡＤＣの３ｄを得た。
【0093】
米国特許出願公開第２００９／００１０９４５号に記載される方法を使用して、抗ネクチン－４抗体の４２Ｄ２０－ｈｚ６３、４２Ｄ２０－ｈｚ１０、及びＩｇＧ１（各１００ｍｇ）、並びにＲｅｆ、ｈＨ２Ｌ１、及びｈＨ１Ｌ２ｍｕｔ１（各５００ｍｇ）を、薬物含有リンカーＭＣ－ＶＣ－ＭＭＡＥとコンジュゲートさせ、ランダムにコンジュゲートされたＡＤＣの４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、及び４ｆを得た。
【0094】
得られた部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣ及びランダムにコンジュゲートされたＡＤＣの物理化学的特性を、本実施例群２におけるセクション２．３ａ、２．３ｂ－１、２．３ｂ－２、２．３ｄ、並びに２．３ｃ、及び２．３ｅに記載されるように決定した。結果を第１表～第３表及び図１にそれぞれ示す。
【0095】
【表5】
【0096】
【表6】
【0097】
【表7】
【0098】
質量分析法により測定された分子量によって、加水分解前の試料には、式Ｉａ及び式Ｉｂにより表される構造を有する化合物の混合物が含まれているのに対し、加水分解後の試料には、マレイミド環の完全な開環によって得られる式Ｉｂにより表される構造を有する化合物のみが含まれていることが明らかになった。
【0099】
実施例群３ 抗体薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷効果及びｉｎ ｖｉｖｏ有効性の研究
実例となる実験に以下の方法を使用する：
実例となる実験に以下の方法を使用する：
【0100】
３．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷効果を研究する方法
この実験において、ＢＴ４７４細胞、すなわちヒト乳管癌細胞（ATCCから購入した）を利用した。ＢＴ４７４細胞の密度を、完全培地（４５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地及び５ｍＬのＦＢＳを混合することによって調製した）中で１ｍＬ当たり１．５×１０４個に調整した。細胞を細胞培養プレートに１ウェル当たり１００μＬで加え、一晩培養した。翌日、ＡＤＣ試料を上記の完全培地で５０μｇ／ｍＬに希釈し、続いて４倍の勾配希釈を行って、合計９通りの勾配に加えてゼロ濃度を得た。全ての試料を３つの反復ウェル用に調製した。ネガティブコントロール（細胞＋培養培地）及びブランクコントロール（細胞なし、培養培地のみ）を用意した。希釈したＡＤＣ試料を、一晩培養した細胞培養プレートに１ウェル当たり１００μＬで加えた。次いで、細胞プレートを細胞インキュベーター内で９６時間インキュベートした。細胞培養プレートを取り出し、ＭＴＳを１ウェル当たり４０μＬでプレートへと加えた後に、これらを３７℃のインキュベーター内で２時間～４時間インキュベートした。細胞プレートを取り出し、４９０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。
この実験において、ＢＴ４７４細胞、すなわちヒト乳管癌細胞（ATCCから購入した）を利用した。ＢＴ４７４細胞の密度を、完全培地（４５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地及び５ｍＬのＦＢＳを混合することによって調製した）中で１ｍＬ当たり１．５×１０４個に調整した。細胞を細胞培養プレートに１ウェル当たり１００μＬで加え、一晩培養した。翌日、ＡＤＣ試料を上記の完全培地で５０μｇ／ｍＬに希釈し、続いて４倍の勾配希釈を行って、合計９通りの勾配に加えてゼロ濃度を得た。全ての試料を３つの反復ウェル用に調製した。ネガティブコントロール（細胞＋培養培地）及びブランクコントロール（細胞なし、培養培地のみ）を用意した。希釈したＡＤＣ試料を、一晩培養した細胞培養プレートに１ウェル当たり１００μＬで加えた。次いで、細胞プレートを細胞インキュベーター内で９６時間インキュベートした。細胞培養プレートを取り出し、ＭＴＳを１ウェル当たり４０μＬでプレートへと加えた後に、これらを３７℃のインキュベーター内で２時間～４時間インキュベートした。細胞プレートを取り出し、４９０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。
【0101】
３．２ ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を研究する方法
ＢＴ４７４細胞、すなわちヒト乳管癌細胞（ATCCから購入した）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、すなわちヒト乳癌細胞（ATCCから購入した）を利用してヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＪＧｐｔ－Ｆｏｘｎ １ｎｕ／Ｇｐｔ、４週齢～５週齢）にそれぞれ接種することで、マウスモデルを樹立した。腫瘍が１００ｍｍ３～２００ｍｍ３に成長したとき、マウスにそれぞれ１ｋｇ当たり１０ｍＬの容量で静脈内注射（ＩＶ）し、ビヒクル群のマウスには同容量のビヒクル（生理食塩水）を静脈内注射した。投与量及び投与スキームを以下で詳細に示す。腫瘍体積を１週間に２回測定し、マウスを秤量してデータを記録した。
ＢＴ４７４細胞、すなわちヒト乳管癌細胞（ATCCから購入した）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、すなわちヒト乳癌細胞（ATCCから購入した）を利用してヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＪＧｐｔ－Ｆｏｘｎ １ｎｕ／Ｇｐｔ、４週齢～５週齢）にそれぞれ接種することで、マウスモデルを樹立した。腫瘍が１００ｍｍ３～２００ｍｍ３に成長したとき、マウスにそれぞれ１ｋｇ当たり１０ｍＬの容量で静脈内注射（ＩＶ）し、ビヒクル群のマウスには同容量のビヒクル（生理食塩水）を静脈内注射した。投与量及び投与スキームを以下で詳細に示す。腫瘍体積を１週間に２回測定し、マウスを秤量してデータを記録した。
【0102】
実験が終了したときに、実験のエンドポイントに達したときに、又は腫瘍体積が１５００ｍｍ３に達したら、動物をＣＯ２麻酔下で屠殺し、腫瘍を解剖して写真を撮った。
【0103】
３．３ ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価する方法
この実験は、腫瘍成長に対するＡＤＣの影響を調べるものであり、特定の指数Ｔ／Ｃ（％）又は腫瘍成長阻害（ＴＧＩ（％））を使用した。
この実験は、腫瘍成長に対するＡＤＣの影響を調べるものであり、特定の指数Ｔ／Ｃ（％）又は腫瘍成長阻害（ＴＧＩ（％））を使用した。
【0104】
腫瘍直径を、ノギスを用いて１週間当たり２回測定し、腫瘍体積（Ｖ）を次のように計算した：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂは、それぞれ長さ及び幅である）。
【0105】
Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００（式中、Ｔ及びＣは、実験終了時の腫瘍体積であり、Ｔ０及びＣ０は、実験開始時の腫瘍体積である）。
【0106】
腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）（％）＝１００－Ｔ／Ｃ（％）。
【0107】
腫瘍退縮が起こった場合、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）（％）＝１００－（Ｔ－Ｔ０）／Ｔ０×１００である。
【0108】
腫瘍がその初期体積から縮小した場合、すなわちＴ＜Ｔ０又はＣ＜Ｃ０であった場合、部分腫瘍退縮（ＰＲ）を記録し、腫瘍が完全に消失した場合は、完全腫瘍退縮（ＣＲ）を記録した。
【0109】
実施例１ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷効果の研究
様々な薬物含有リンカーを様々な抗ネクチン－４抗体とコンジュゲートさせることによって生成されたＡＤＣを群分けし、本実施例群３におけるセクション３．１に記載されるように研究した。所見（founding）は以下の通りであった。
様々な薬物含有リンカーを様々な抗ネクチン－４抗体とコンジュゲートさせることによって生成されたＡＤＣを群分けし、本実施例群３におけるセクション３．１に記載されるように研究した。所見（founding）は以下の通りであった。
【0110】
様々な抗体をＭＣ－ＶＣ－ＭＭＡＥとコンジュゲートさせてＡＤＣを形成した場合、抗体ｈＨ２Ｌ１がコンジュゲートされたＡＤＣは、コントロール抗体Ｒｅｆ（エンホルツマブ）がコンジュゲートされたＡＤＣと同等のレベルのｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷効果を示し、一方で、抗体４２Ｄ２０－ｈｚ１０、４２Ｄ２０－ｈｚ６３、及びｈＨ１Ｌ２ｍｕｔ１がコンジュゲートされたＡＤＣよりも僅かに良好であった。さらに、ＡＤＣの２ａと、１ａと、２ｅとの間の比較により、化合物Ｃ－３及び化合物Ｃ－１が同等のｉｎ ｖｉｖｏ活性を有することが明らかになった。結果を第４表に示す。
【0111】
【表8】
【0112】
実施例２ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の研究（１）
マウスモデルを、ＢＴ４７４細胞を使用して樹立し、様々な薬物含有リンカーを様々な抗ネクチン－４抗体とコンジュゲートさせることによって生成されたＡＤＣを群分けし、本実施例群３におけるセクション３．２及びセクション３．３に記載されるように研究した。
マウスモデルを、ＢＴ４７４細胞を使用して樹立し、様々な薬物含有リンカーを様々な抗ネクチン－４抗体とコンジュゲートさせることによって生成されたＡＤＣを群分けし、本実施例群３におけるセクション３．２及びセクション３．３に記載されるように研究した。
【0113】
【表9】
【0114】
結果を図２及び第６表に示す。
【0115】
【表10】
【0116】
実施例３ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の研究（２）
マウスモデルをＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を使用して樹立し、様々な薬物含有リンカーを様々な抗ネクチン－４抗体とコンジュゲートさせることによって生成されたＡＤＣを群分けし、本実施例群３におけるセクション３．２及びセクション３．３に記載されるように研究した。
マウスモデルをＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を使用して樹立し、様々な薬物含有リンカーを様々な抗ネクチン－４抗体とコンジュゲートさせることによって生成されたＡＤＣを群分けし、本実施例群３におけるセクション３．２及びセクション３．３に記載されるように研究した。
【0117】
【表11】
【0118】
結果を図３及び第８表に示す。
【0119】
【表12】
【0120】
実施例群４ 様々な腫瘍モデルにおける候補薬剤としての抗体薬物コンジュゲート３ｄの有効性の評価
実例となる実験に以下の方法を使用する：
実例となる実験に以下の方法を使用する：
【0121】
４．１ 群分け及び実験設計
ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、すなわちヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣから購入した）、ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞、すなわち肺癌細胞（ＡＴＣＣから購入した）、及びＴ２４／ネクチン－４、すなわち膀胱癌細胞（中国科学院の細胞バンクから入手可能）をそれぞれ利用してヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＪＧｐｔ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｇｐｔ、４週齢～５週齢）に接種して、マウスモデルを樹立した。
ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、すなわちヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣから購入した）、ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞、すなわち肺癌細胞（ＡＴＣＣから購入した）、及びＴ２４／ネクチン－４、すなわち膀胱癌細胞（中国科学院の細胞バンクから入手可能）をそれぞれ利用してヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＪＧｐｔ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｇｐｔ、４週齢～５週齢）に接種して、マウスモデルを樹立した。
【0122】
抗体薬物コンジュゲート３ｄ及びコントロール薬物ＰＡＤＣＶＥ（エンホルツマブベドチン、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｔｉｃｓから購入した）を群分けして研究した（以下の第９表に示す）。マウスにそれぞれ１ｋｇ当たり１０ｍＬの容量で静脈内注射（ＩＶ）し、ビヒクル群のマウスには同容量のビヒクル（生理食塩水）を静脈内注射した。投与量及び投与スキームを第９表において詳細に示す。腫瘍体積を１週間に２回測定し、マウスを秤量してデータを記録した。
【0123】
実験が終了したときに、実験のエンドポイントに達したときに、又は腫瘍体積が１５００ｍｍ３に達したら、動物をＣＯ２麻酔下で屠殺し、腫瘍を解剖して写真を撮った。
【0124】
【表13】
【0125】
４．２ ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価する方法
ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価する方法は、実施例群３におけるセクション３．３に記載されるものと同じとした。
ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価する方法は、実施例群３におけるセクション３．３に記載されるものと同じとした。
【0126】
実施例１ 乳癌動物モデルにおけるネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の研究
マウスモデルをＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を使用して樹立し、ＡＤＣの３ｄ及びＰＡＤＣＶＥを群分けし、本実施例群４におけるセクション４．１及びセクション４．２に記載されるように研究した。結果を図４及び第１０表に示す。
マウスモデルをＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を使用して樹立し、ＡＤＣの３ｄ及びＰＡＤＣＶＥを群分けし、本実施例群４におけるセクション４．１及びセクション４．２に記載されるように研究した。結果を図４及び第１０表に示す。
【0127】
【表14】
【0128】
実施例２ 肺癌動物モデルにおけるネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の研究
マウスモデルをＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を使用して樹立し、ＡＤＣの３ｄ及びＰＡＤＣＶＥを群分けし、本実施例群４におけるセクション４．１及びセクション４．２に記載されるように研究した。結果を図５及び第１１表に示す。
マウスモデルをＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を使用して樹立し、ＡＤＣの３ｄ及びＰＡＤＣＶＥを群分けし、本実施例群４におけるセクション４．１及びセクション４．２に記載されるように研究した。結果を図５及び第１１表に示す。
【0129】
【表15】
【0130】
実施例３ 膀胱癌動物モデルにおけるネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の研究
マウスモデルをＴ２４／ネクチン－４細胞を使用して樹立し、ＡＤＣの３ｄ及びＰＡＤＣＶＥを群分けし、本実施例群４におけるセクション４．１及びセクション４．２に記載されるように研究した。結果を図６及び第１２表に示す。
マウスモデルをＴ２４／ネクチン－４細胞を使用して樹立し、ＡＤＣの３ｄ及びＰＡＤＣＶＥを群分けし、本実施例群４におけるセクション４．１及びセクション４．２に記載されるように研究した。結果を図６及び第１２表に示す。
【0131】
【表16】
【0132】
実施例群５ 抗体薬物コンジュゲートの機能の評価
実施例１ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのＦａｂ領域の親和性の分析
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して、抗原、すなわちヒトネクチン－４タンパク質の組換え細胞外ドメインに対する抗体薬物コンジュゲート３ｄ及びＰａｄｃｅｖの親和性を求めた。
実施例１ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのＦａｂ領域の親和性の分析
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して、抗原、すなわちヒトネクチン－４タンパク質の組換え細胞外ドメインに対する抗体薬物コンジュゲート３ｄ及びＰａｄｃｅｖの親和性を求めた。
【0133】
ヒトネクチン－４タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から購入した）を、脱塩カラムを用いて、ランニング試薬１（１０ｍＭのＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ－２スルホン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨを７．４に調整した）を使用して緩衝液交換に供した。検出対象の試料をランニング試薬１で５μｇ／ｍＬに希釈し、約４００ＲＵについて１０μｇ／分の流速でＨｉｓ捕捉チップを備えた実験流路に順次注入した。参照流路にはリガンドの捕捉は必要とされなかった。ヒトネクチン－４タンパク質を、対応するランニング試薬で５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６３ｎＭ、０．７８１ｎＭ、０．３９１ｎＭ、及び０ｎＭに希釈した後に、希釈したヒトネクチン－４タンパク質を３０μＬ／分の流速で実験流路及び参照流路へと注入した。会合時間及び解離時間はそれぞれ１２０秒及び３００秒とした。Ｂｉｏｃｏｒｅ ８Ｋ分析ソフトウェアを使用して、各抗体についてのＫＤ値を計算した。参照流路を使用してバックグラウンドの減算を行った。
【0134】
ヒトネクチン－４に対するｈＨ２Ｌ１、３ｄ、及びＰａｄｃｅｖの親和性の検出結果を第１３表に示す。これらの結果により、ヒトネクチン－４に対するｈＨ２Ｌ１、３ｄ、及びＰａｄｃｅｖの親和性（ＫＤ）が全てナノモル規模であるとともに、バッチ間の一貫性が良好であることが明らかになった。ｈＨ２Ｌ１の親和性は基本的にＡＤＣの３ｄの親和性と一致していたことから、ＡＤＣを調製するコンジュゲーション過程が抗体のネクチン－４への結合に大きな影響を及ぼさないことが示され、また、Ｐａｄｃｅｖは、ＡＤＣの３ｄよりも高い会合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）の両方を有したため、ＡＤＣの３ｄは全体として、Ｐａｄｃｅｖよりも約２倍高いＰａｄｃｅｖよりも良好な親和性を示した。
【0135】
【表17】
【0136】
実施例２ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートのＦｃ領域の分析
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して、ＦｃＲｎ、ヒトＦｃγＲ Ｉ（ＣＤ６４）、ヒトＦｃγＲ ＩＩａ（ヒトＣＤ３２ａ（Ｈ１６７））、ヒトＦｃγＲ ＩＩｂ（ヒトＣＤ３２ｂ）、及びヒトＦｃγＲ ＩＩＩａ（ヒトＣＤ１６ａ（Ｖ１７６））を含むＦｃ受容体に対する抗体ｈＨ２Ｌ１、並びに抗体薬物コンジュゲートの３ｄ及びＰａｄｃｅｖの親和性を求めた。ヒトのＦｃγＲ Ｉ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲ ＩＩａ（ＣＤ３２ａ（Ｈ１６７））、ＦｃγＲ ＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、及びＦｃγＲ ＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６））のタンパク質を、ランニング試薬１（１０ｍＭのＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ－２スルホン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨを７．４に調整した）で０．２５μｇ／ｍＬに希釈し、ＦｃＲｎタンパク質をランニング試薬２（２ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨを６．０に調整した）で０．２５μｇ／ｍＬに希釈し、全ての希釈したタンパク質を、約４０ＲＵについて１０μｇ／分の流速でＨｉｓ捕捉チップを備えた実験流路（ＦＣ２）に順次注入した。参照流路（ＦＣ１）にはリガンドの捕捉は必要なかった。検出対象の試料を対応するランニング試薬で希釈した後に、３０μＬ／分の流速で実験流路及び参照流路に注入した。会合及び解離を或る特定の時間間隔にわたって監視した。Ｂｉｏｃｏｒｅ ８Ｋ分析ソフトウェアを使用して、各抗体についてのＫＤ値を計算した。参照流路（ＦＣ１）を使用してバックグラウンドの減算を行った。
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して、ＦｃＲｎ、ヒトＦｃγＲ Ｉ（ＣＤ６４）、ヒトＦｃγＲ ＩＩａ（ヒトＣＤ３２ａ（Ｈ１６７））、ヒトＦｃγＲ ＩＩｂ（ヒトＣＤ３２ｂ）、及びヒトＦｃγＲ ＩＩＩａ（ヒトＣＤ１６ａ（Ｖ１７６））を含むＦｃ受容体に対する抗体ｈＨ２Ｌ１、並びに抗体薬物コンジュゲートの３ｄ及びＰａｄｃｅｖの親和性を求めた。ヒトのＦｃγＲ Ｉ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲ ＩＩａ（ＣＤ３２ａ（Ｈ１６７））、ＦｃγＲ ＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、及びＦｃγＲ ＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６））のタンパク質を、ランニング試薬１（１０ｍＭのＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ－２スルホン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨを７．４に調整した）で０．２５μｇ／ｍＬに希釈し、ＦｃＲｎタンパク質をランニング試薬２（２ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨを６．０に調整した）で０．２５μｇ／ｍＬに希釈し、全ての希釈したタンパク質を、約４０ＲＵについて１０μｇ／分の流速でＨｉｓ捕捉チップを備えた実験流路（ＦＣ２）に順次注入した。参照流路（ＦＣ１）にはリガンドの捕捉は必要なかった。検出対象の試料を対応するランニング試薬で希釈した後に、３０μＬ／分の流速で実験流路及び参照流路に注入した。会合及び解離を或る特定の時間間隔にわたって監視した。Ｂｉｏｃｏｒｅ ８Ｋ分析ソフトウェアを使用して、各抗体についてのＫＤ値を計算した。参照流路（ＦＣ１）を使用してバックグラウンドの減算を行った。
【0137】
Ｆｃ受容体に対するｈＨ２Ｌ１、３ｄ、及びＰａｄｃｅｖの親和性の検出結果を第１４表に示す。これらの結果により、Ｆｃ受容体に対するｈＨ２Ｌ１及び３ｄの４つのバッチの親和性がバッチ間の有意差を示さず、ＦｃγＲ ＩＩＩａに対するＡＤＣの３ｄ及びＰａｄｃｅｖの１つのバッチの親和性はｈＨ２Ｌ１の親和性より僅かに劣っており、また他の各受容体に対する３つのバッチの親和性には明らかな差異は見られないことが明らかになった。
【0138】
【表18】
【0139】
実施例３ ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲートの細胞内移行活性の研究
ネクチン－４を高発現する安定的にトランスフェクトされた細胞株ＰＣ－３－Ｎｅｃｔｉｎ４（２－４）（自作）を標的細胞株として使用して、ｈＨ２Ｌ１、３ｄ、及びＰａｄｃｅｖの細胞内移行活性を検出した。
ネクチン－４を高発現する安定的にトランスフェクトされた細胞株ＰＣ－３－Ｎｅｃｔｉｎ４（２－４）（自作）を標的細胞株として使用して、ｈＨ２Ｌ１、３ｄ、及びＰａｄｃｅｖの細胞内移行活性を検出した。
【0140】
実験方法は以下の通りとした：対数成長期にある標的細胞を遠心分離により採取し、完全培地（１０％のＦＢＳ及び２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ－１２Ｋ培地）中で１ｍｌ当たり５×１０５個の細胞の密度に調整した。１ｍＬの得られた細胞懸濁液（すなわちそれぞれ５×１０５個の細胞）をＥＰチューブにピペットで移した後に、これらを遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ｈＨ２Ｌ１、３ｄ、及びＰａｄｃｅｖのそれぞれの２００μＬの試料を細胞に添加した後に、これらをそれぞれ４℃（コントロール群として）及び３７℃（実験群として）に置いた。２時間インキュベートした後、蛍光標識された二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定し、以下の式により各試料の細胞内移行効率を計算した：時点ｔｘでの細胞内移行のパーセント＝（１－３７℃での試料の蛍光強度）／４℃での試料の蛍光強度）×１００％（ｔｘは、試料を細胞とともにインキュベートした期間ｘである）。
【0141】
この結果により、比較的高レベルの標的タンパク質ネクチン－４がＰＣ－３－Ｎｅｃｔｉｎ４（２－４）細胞の表面に発現され、これに対して対象となるＡＤＣ、裸の抗体、及びＰａｄｃｅｖの全てが、無関係な抗体と比較してかなり強力なネクチン－４に対する結合能力を示すことが明らかになった。得られた結果から、ＡＤＣの３ｄ及びＡＤＣのストック溶液の３つのバッチの細胞内移行活性と、Ｐａｄｃｅｖの細胞内移行活性との間に有意差は見られなかった。
【0142】
結果を第１５表に示す。
【0143】
【表19】
【0144】
本開示の実施形態に関する以上の説明は、本開示を限定することを意図するものではなく、当業者は、本開示の趣旨を逸脱しない範囲で本開示に種々の変更及び修正を加えることができ、これは添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】