特表 2024-517843 ステレオシリン二重ベクター系を使用して感音性難聴を治療するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ステレオシリン二重ベクター系を使用して感音性難聴を治療するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 15/90 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240416BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240416BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/90 104Z

C12N15/12

C12N15/864 100Z

C12N5/10

C12N5/071

C12P21/02 C

A61K35/76

A61K31/7088

A61K48/00

A61P27/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568104

(86)(22)【出願日】2022-05-05

(85)【翻訳文提出日】2023-12-26

(86)【国際出願番号】 US2022027870

(87)【国際公開番号】W WO2022235933

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/184,737

(32)【優先日】2021-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】520299511

【氏名又は名称】デシベル セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＤＥＣＩＢＥＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】バーンズ、ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】シュワンダー、マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ウー、シュドン

(72)【発明者】

【氏名】ベッカー、ラーズ

(72)【発明者】

【氏名】ギブソン、タイラー

(72)【発明者】

【氏名】パン、ニン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084MA56

4C084NA14

4C084ZA34

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA56

4C086NA14

4C086ZA34

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA56

4C087NA14

4C087ZA34

(57)【要約】

本開示は、外有毛細胞特異的なプロモーターの調節性制御下にあるステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と同様に外有毛細胞にて特異的にステレオシリンの発現を促進するのに使用することができる、前記ポリヌクレオチドを含有する２ベクター系を含有する組成物を提供する。さらに、本明細書に記載されている組成物は、ステレオシリンの突然変異に関連する難聴のような難聴を有する対象または難聴を発症するリスクがある対象の治療に使用されてもよい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２ベクター系であって、
ａ）ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のポリヌクレオチドに操作可能に連結された配列番号１～３のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するオンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーターを含む第１の核酸ベクターと；
ｂ）ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の核酸ベクターと、を含む、前記２ベクター系。

【請求項2】

前記第１のポリヌクレオチドが前記第２のポリヌクレオチドと部分的に重複する、請求項１に記載の２ベクター系。

【請求項3】

前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、少なくとも２００塩基（ｂ）の長さを有する重複領域を有する、請求項１または２に記載の２ベクター系。

【請求項4】

前記第１の核酸ベクターが配列番号４３のヌクレオチド２２５～４５７４の配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項5】

前記第２の核酸ベクターが配列番号４４のヌクレオチド２１１～４２１９の配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項6】

哺乳類細胞に導入されると、前記第１の核酸ベクター及び前記第２の核酸ベクターが相同組換えを受け、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを形成する、請求項１～５のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項7】

前記第１の核酸ベクターが前記第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置するスプライスドナーシグナル配列を含み、前記第２の核酸ベクターが前記第２のポリヌクレオチドの５’末端に位置するスプライスアクセプターシグナル配列を含む、請求項１に記載の２ベクター系。

【請求項8】

前記第１の核酸ベクターが前記第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置するスプライスドナーシグナル配列と、前記スプライスドナーシグナル配列の３’に位置する第１の組換え誘導領域とを含み、前記第２の核酸ベクターが第２の組換え誘導領域と、前記組換え誘導領域の３’でのスプライスアクセプターシグナル配列と、前記スプライスアクセプターシグナル配列の３’での前記第２のポリヌクレオチドとを含む、請求項１に記載の２ベクター系。

【請求項9】

前記第１及び第２のポリヌクレオチドが重複しない、請求項１、７及び８のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項10】

前記第１の核酸ベクターが配列番号４５のヌクレオチド２２５～４４５４の配列を含むポリヌクレオチドを含み、前記第２の核酸ベクターが配列番号４６のヌクレオチド２５７～３５９７の配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項８または９に記載の２ベクター系。

【請求項11】

前記第１の核酸ベクターがさらに、前記組換え誘導領域の３’に位置する分解シグナル配列を含み、前記第２の核酸ベクターがさらに、前記組換え誘導領域と前記スプライスアクセプターシグナル配列との間に位置する分解シグナル配列を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項12】

前記第２の核酸ベクターがさらに、前記第２のポリヌクレオチドに操作可能に連結された配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＯＣＭプロモーターを含み、前記プロモーターは前記第２のポリヌクレオチドの５’に位置する、請求項１に記載の２ベクター系。

【請求項13】

前記第１の核酸ベクターがさらに、前記第１のポリヌクレオチドの３’に位置するＮ末端インテイン（Ｎ－インテイン）をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１または１２に記載の２ベクター系。

【請求項14】

前記第２の核酸ベクターがさらに、前記ＯＣＭプロモーターと前記第２のポリヌクレオチドとの間に位置するＣ末端インテイン（Ｃ－インテイン）をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１２または１３に記載の２ベクター系。

【請求項15】

前記Ｎ－インテイン及び前記Ｃ－インテインが分割インテイントランススプライシングシステムの構成成分である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項16】

前記分割インテイントランススプライシングシステムが１以上の細菌のＤｎａＥ遺伝子に由来する、請求項１５に記載の２ベクター系。

【請求項17】

前記ＯＣＭプロモーターが配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項18】

前記２ベクター系が、哺乳類の外有毛細胞（ＯＨＣ）にて完全長ステレオシリンタンパク質の蝸牛ＯＨＣ特異的な発現を指示する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項19】

前記ステレオシリンタンパク質が、配列番号４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヒトのステレオシリンタンパク質であり、前記ヒトのステレオシリンタンパク質が、配列番号６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１～１８のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項20】

前記第１及び第２のベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、またはＰＨＰ．Ｓのカプシドを有する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の２ベクター系。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項22】

請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系または請求項２１に記載の医薬組成物を含む、ヒトＯＨＣ。

【請求項23】

ヒトＯＨＣにてステレオシリンタンパク質を発現させる方法であって、ヒトＯＨＣを請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系または請求項２１に記載の医薬組成物と接触させることを含む、前記方法。

【請求項24】

前記細胞が対象にある、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

感音性難聴を有する、または感音性難聴を発症するリスクがある対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象の内耳に投与することを含む、前記方法。

【請求項26】

前記感音性難聴が、遺伝性の感音性難聴であり、任意で、前記遺伝性の感音性難聴が常染色体劣性難聴である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

ＳＴＲＣの発現を増やすことを必要とする対象にてＳＴＲＣの発現を増やす方法であって、治療有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象の内耳に投与することを含む、前記方法。

【請求項28】

ＯＨＣの損傷または死滅を防止するまたは軽減することを必要とする対象にてＯＨＣの損傷または死滅を防止するまたは軽減する方法であって、有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象の内耳に投与することを含む、前記方法。

【請求項29】

ＯＨＣの生存を増やすことを必要とする対象にてＯＨＣの生存を増やす方法であって、有効量の請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象の内耳に投与することを含む、前記方法。

【請求項30】

前記対象がＳＴＲＣに突然変異を有する、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記対象がＳＴＲＣに突然変異を有するとして特定されている、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記方法がさらに、前記２ベクター系または組成物を投与する前に、ＳＴＲＣに突然変異を有するものとして前記対象を特定することを含む、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記方法がさらに、前記２ベクター系または前記組成物を投与する前にまたは投与した後で、前記対象の聴力を評価することを含む、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記２ベクター系または前記組成物が耳に局所性に投与される、請求項２５～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記２ベクター系における前記ベクターが同時にまたは順次、投与される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記２ベクター系または前記医薬組成物が、難聴を予防もしくは軽減する、難聴の発症を遅延させる、難聴の進行を遅らせる、聴力を改善させる、語音弁別を改善する、有毛細胞機能を改善する、有毛細胞の損傷を予防もしくは軽減する、有毛細胞死を予防もしくは軽減する、有毛細胞生存を促進もしくは増加させる、または、有毛細胞にてＳＴＲＣの発現を増やすのに十分な量で投与される、請求項２５～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記対象がヒトである、請求項２５～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

請求項１～２０のいずれか１項に記載の２ベクター系または請求項２１に記載の医薬組成物を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年５月４日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名称は５１４７１－０１１ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿５＿４＿２２＿ＳＴ２５であり、サイズは１１３，２５１バイトである。

【0002】

技術分野
本明細書に記載されているのは、難聴、特にステレオシリン（ＳＴＲＣ）遺伝子治療による、ＳＴＲＣにおける突然変異に関連する疾患の形態の治療のための組成物及び方法であり、その際、ＳＴＲＣ遺伝子の発現はオンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーターの調節性制御下にある。本開示は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する第１の核酸ベクターと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する第２の核酸ベクターとを含む２ベクター発現系を提供する。これらのベクターを使用して、細胞または対象、例えば、難聴（例えば、感音性難聴）を患う対象に対して野生型ＳＴＲＣの発現を増やす、または野生型ＳＴＲＣを提供することができる。

【背景技術】

【0003】

感音性難聴は、内耳の細胞の欠陥、または内耳から脳に張り出す神経経路の欠陥によって引き起こされる種類の難聴である。感音性難聴は後天性であることが多く、騒音、感染症、頭部外傷、耳毒性薬物、または加齢によって引き起こされ得るが、常染色体劣性突然変異に関連する感音性難聴の先天性形態もある。そのような常染色体劣性感音性難聴の形態の１つはステレオシリン（ＳＴＲＣ）遺伝子の突然変異と関連している。ステレオシリンは、染色体１５ｑ１５におけるＳＴＲＣ遺伝子によってコードされた大きなタンパク質であり、約１９ｋｂのゲノムにまたがる２９のエクソンを含有する。ＳＴＲＣ遺伝子は直列に複製され、その際、２番目のコピーは、エクソン２０内に早期停止コドンを含有し、それによってＳＴＲＣ偽遺伝子が生成される。以前の研究では、常染色体劣性非症候群性感音性難聴がある家族にてＳＴＲＣにおける突然変異が同定されている（Ｖｅｒｐｙ等，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３４５－９（２００１））ステレオシリンタンパク質の発現は内耳有毛細胞の毛束中の不動毛に限定される。ステレオシリンタンパク質は、聴覚装置の正常な機能に必要とされる水平上部コネクタ及び蓋膜取り付けクラウンを形成すると考えられる（Ａｖａｎ等，ＰＮＡＳ １１６：２５９４８－５７（２０１９）；Ｖｅｒｐｙ等，Ｊ． Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５１９：１９４－２１０ （２０１１））。ステレオシリンを欠いたマウスは、凝集不良を伴う異常な有毛細胞束及び聴覚障害を呈することが示されている（Ｖｅｒｐｙ等，Ｎａｔｕｒｅ，４５６：２５５－８（２００８））。

【0004】

近年、難聴を治療するための取り組みは、可能な解決策として遺伝子治療にますます注目が集まっている；しかしながら、ＳＴＲＣ遺伝子は大きすぎて標準的な遺伝子治療の手法を使用する治療を可能にできない。ＳＴＲＣ関連の感音性難聴を治療するための新しい治療法が求められている。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、対象、例えば、ヒト対象における感音性難聴を治療するための組成物及び方法を提供する。本開示の組成物及び方法は、感音性難聴を有する対象、または感音性難聴を発症するリスクがある対象（例えば、ＳＴＲＣに突然変異を有する対象）にステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達するための二重ベクター系に関する。例えば、本明細書に記載されている組成物及び方法を使用して、それぞれが機能的なステレオシリンタンパク質の一部をコードする、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターがウイルス遺伝子治療によって対象に送達されてもよい。本明細書に記載されている組成物及び方法は、蝸牛有毛細胞（例えば、外有毛細胞）における野生型ステレオシリンタンパク質の発現を増加させるために使用されてもよい。

【0006】

第１の態様では、本発明は、（ａ）ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のポリヌクレオチドと操作可能に連結された配列番号１～３のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するオンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーターを含む第１の核酸ベクターと、（ｂ）ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の核酸ベクターと、を含む２ベクター系を提供する。

【0007】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと部分的に重複する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、少なくとも２００塩基（ｂ）（例えば、少なくとも２００ｂ、３００ｂ、４００ｂ、５００ｂ、６００ｂ、７００ｂ、８００ｂ、９００ｂ、１．０キロ塩基（ｋｂ）、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ以上）の長さを有する重複領域を有する。これらの実施形態では、哺乳類細胞に導入されると、第１及び第２の核酸ベクターは相同組換えを受け、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターは配列番号４３のヌクレオチド２２５～４５７４の配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターは配列番号４４のヌクレオチド２１１～４２１９の配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターは第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置するスプライスドナーシグナル配列を含み、第２の核酸ベクターは第２のポリヌクレオチドの５’末端に位置するスプライスアクセプターシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチドは重複しない。

【0009】

いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターは、第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置するスプライスドナーシグナル配列と、当該スプライスドナーシグナル配列の３’に位置する第１の組換え誘導領域とを含み、第２の核酸ベクターは、第２の組換え誘導領域と、当該組換え誘導領域の３’でのスプライスアクセプターシグナル配列と、当該スプライスアクセプターシグナル配列の３’での第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチドは重複しない。いくつかの実施形態では、第１の組換え誘導領域及び第２の組換え誘導領域は同じである。いくつかの実施形態では、第１の組換え誘導領域及び第２の組換え誘導領域はＡＰ遺伝子断片である。いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は配列番号４７～５２のうちのいずれか１つの配列を含む、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は配列番号５０の配列を含む、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターはさらに、組換え誘導領域の３’に位置する分解シグナル配列を含み、第２の核酸ベクターはさらに、組換え誘導領域とスプライスアクセプターシグナル配列との間に位置する分解シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターは配列番号４５のヌクレオチド２２５～４４５４の配列を含むポリヌクレオチドを含み；第２の核酸ベクターは配列番号４６のヌクレオチド２５７～３５９７の配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターはさらに、第２のポリヌクレオチドに操作可能に連結された配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＯＣＭプロモーターを含み、当該プロモーターは第２のポリヌクレオチドの５’に位置する。いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターにおけるＯＣＭプロモーターは第１の核酸ベクターにおけるＯＣＭプロモーターと同じである（すなわち、同じヌクレオチド配列を有する）。いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターにおけるＯＣＭプロモーターは第１の核酸ベクターにおけるＯＣＭプロモーターとは異なるヌクレオチド配列を有する。

【0011】

いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターはさらに、第１のポリヌクレオチドの３’に位置するＮ末端インテイン（Ｎ－インテイン）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターはさらに、ＯＣＭプロモーターと第２のポリヌクレオチドとの間に位置するＣ末端インテイン（Ｃ－インテイン）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテイン及びＣ－インテインは分割インテイントランススプライシングシステムの構成成分である。

【0012】

いくつかの実施形態では、第１のベクター及び／または第２のベクターはインテイン分解シグナルを含む。いくつかの実施形態では、分解シグナルはＮ－デグロン及び／またはＣ－デグロンである。いくつかの実施形態では、Ｎ－デグロン及び／またはＣ－デグロンは独立してＣＬ１、ＰＢ２９、ＳＭＮ、ＣＩＩＴＡまたはＯＤＣのデグロンである。いくつかの実施形態では、分解シグナルはＥ．ｃｏｌｉのジヒドロ葉酸還元酵素（ｅｃＤＨＦＲ）分解シグナルである。いくつかの実施形態では、分解シグナルはＦＫＢＰ１２の分解ドメインである（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ等，Ｃｅｌｌ，１２６：９９５－１００４，２００６）。いくつかの実施形態では、分解シグナルはＰＥＳＴの分解ドメインである（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ及びＲｏｇｅｒｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７－２７１，１９９６）。いくつかの実施形態では、分解シグナルはＵｂＲタグユビキチン化シグナルである（Ｃｈａｓｓｉｎ等，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：２０１３，２０１９）いくつかの実施形態では、分解シグナルはヒトＥＬＲＢＤの不安定化突然変異である（Ｍｉｙａｚａｋｉ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４：３９４２－３９４５，２０１２）。

【0013】

いくつかの実施形態では、第１及び第２のベクターは、哺乳類細胞に導入されると、それぞれ第１及び第２の融合タンパク質を産生し、その際、第１の融合タンパク質はステレオシリンのＮ末端部分とそれに対して３’に位置するＮ－インテインとを含み、第２の融合タンパク質は、Ｃ－インテインとそれ対して３’に位置するステレオシリンのＣ末端部分とを含む。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質のＮ－インテインのＣ末端と第２の融合タンパク質のＣ－インテインのＮ末端とはペプチド結合を形成することができ、それによって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ステレオシリンのＮ末端部分と、Ｎ－インテインと、Ｃ－インテインと、ステレオシリンのＣ末端部分とを含むポリペプチドを生成し、その際、結合したＮ－インテイン及びＣ－インテインは、ステレオシリンのＮ末端部分のＣ末端及びステレオシリンのＣ末端部分のＮ末端を自己切除し、且つ連結し、それによって完全長ステレオシリンタンパク質を生成することができる。

【0014】

いくつかの実施形態では、分割インテイントランススプライシングシステムは１以上の細菌のＤｎａＥ遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、１以上の細菌は、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（Ｎｐｕ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３（Ｓｓｐ）、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ ｓｐ．ＰＣＣ９６０５（Ｆｓｐ）、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｃｈｏｉｄｅｓ（Ｓｔｏ）、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＷ＿９＿４７＿５、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ（Ｎｓｐ）、Ｎｏｓｔｏｃ ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｅ（Ｎｆｌ）、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ（Ｃｗａ）ＷＨ８５０２、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ ｃｕｂａｎａ（Ｃｃｕ）ＣＣＡＬＡ０４３、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ（Ｔｅｒ）、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ（Ｒｍａ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃｅ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ （Ｓｃａ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ（Ｓｕｎ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（Ｚｂｉ）、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ（Ｔｐｒ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｕ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ（Ｍｌｅ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｍｓｍ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ（Ｐａｂ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｃｂｕ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（Ｃｎｅ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｇａｔｔｉｉ（Ｃｇａ）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ（Ｈｃａ）、及びＰｏｒｐｈｙｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（Ｐｐｕ）から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、分割インテイントランススプライシングシステムは、望ましい安定性及び活性を持つ分割インテインを設計するためにコンセンサス設計（例えば、Ｃｆａ）を特定するためのＤｎａＥの複数の配列アライメント研究に由来する。

【0015】

いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号８、１０、１３、１５、１７～２２、２７、２９、３１、３３、３５、３７及び３９のいずれか１つの配列を有し、且つＣ－インテインは配列番号９、１１、１２、１４、１６、２３～２６、２８、３０、３２、３４、３６，３８及び４０のいずれか１つの配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号８の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号９の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号８の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号１１の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号８の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号１２の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号１０の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号９の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号１０の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号１１の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号１０の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号１２の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号１３の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号１４の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号１５の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号１６の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号１７の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号２３の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号２０の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号２４の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号２１の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号２５の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号２２の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号２６の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号２７の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号２８の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号２９の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号３０の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号３１の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号３２の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号３３の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号３４の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号３５の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号３６の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号３７の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号３８の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号３９の配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号４０の配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインは配列番号１７～２２のいずれか１つの配列を有し、Ｃ－インテインは配列番号２３～２６のいずれか１つの配列を有する。

【0016】

いくつかの実施形態では、分割インテイントランススプライシングシステムは、リガンドとの接触時のみタンパク質のトランススプライシングを行う１以上のインテインを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは４－ヒドロキシタモキシフェン、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、アミノ酸、またはヌクレオチドから成る群から選択される。

【0017】

いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターはさらに、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に配置される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に配置される。いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターはさらに、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に配置される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に配置される。

【0018】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドも第２のポリヌクレオチドも完全長のステレオシリンタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドのそれぞれは、ステレオシリンタンパク質配列の約半分をコードする。

【0019】

いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターはさらに、第２のポリヌクレオチドの３’にポリ（Ａ）配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸ベクターはＳＴＲＣの非翻訳領域（ＵＴＲ）を含まない。いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸ベクターはＳＴＲＣのＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターは第１のポリヌクレオチドの５’にＳＴＲＣの５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターは第２のポリヌクレオチドの３’にＳＴＲＣの３’ＵＴＲを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質をコードする第１及び第２のポリヌクレオチドは、イントロンを含まない（例えば、第１及び第２のポリヌクレオチドはＳＴＲＣのｃＤＮＡの部分である）。いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質をコードする第１及び第２のポリヌクレオチドはイントロンを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号１に対して少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号２に対して少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号３に対して少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する。

【0022】

いくつかの実施形態では、２ベクター系は、哺乳類の蝸牛外有毛細胞（ＯＨＣ）にて完全長ステレオシリンタンパク質の蝸牛ＯＨＣ特異的な発現を指示することができる。いくつかの実施形態では、哺乳類ＯＨＣはヒトＯＨＣである。いくつかの実施形態では、哺乳類ＯＨＣはマウスＯＨＣである。

【0023】

いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質は、配列番号４に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するヒトのステレオシリンタンパク質である。いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質は、配列番号４の配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒトのステレオシリンタンパク質は、配列番号６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、配列番号６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリヌクレオチドは配列番号４のステレオシリンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトのステレオシリンタンパク質は配列番号６の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＳＴＲＣタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の）の配列同一性を有するマウスのステレオシリンタンパク質である。いくつかの実施形態では、マウスのステレオシリンタンパク質は配列番号５の配列を有する。いくつかの実施形態では、マウスのステレオシリンタンパク質は、配列番号７に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、配列番号７に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを以上）の配列同一性を有するポリヌクレオチドは配列５のステレオシリンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、マウスのステレオシリンタンパク質は、配列番号７の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。

【0024】

いくつかの実施形態では、第１及び第２のベクターはウイルスベクター、プラスミド、コスミド、または人工染色体である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、またはＰＨＰ．Ｓのカプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡＡＶ１カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡＡＶ９カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡＡＶ６カプシドを含む。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡＡＶ８カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡｎｃ８０カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡｎｃ８０Ｌ６５カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＤＪ／９カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれは７ｍ８カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡＡＶ２カプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＰＨＰ．Ｂカプシドを有する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターのそれぞれはＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）カプシドを有する。

【0025】

別の態様では、本発明は前述の態様及び実施形態の２ベクター系を含有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物はさらに、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

【0026】

別の態様では、本発明は、前述の態様及び実施形態のいずれかの２ベクター系を含む細胞（例えば、哺乳類細胞、例えば、ＯＨＣ、例えば、ＳＴＲＣ遺伝子に病原性の突然変異を有するＯＨＣのようなヒト細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類ＯＨＣである。いくつかの実施形態では、哺乳類ＯＨＣはヒトＯＨＣである。

【0027】

別の態様では、本開示は、前述の態様及び実施形態の２ベクター系または医薬組成物と細胞を接触させることによって、哺乳類細胞にてステレオシリンタンパク質を発現させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は蝸牛有毛細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＯＨＣである。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は対象に存在する（例えば、接触は生体内で生じる）。

【0028】

別の態様では、本発明は、治療有効量の前述の態様及び実施形態の２ベクター系または医薬組成物を対象の内耳に投与することによって、感音性難聴を有する、または感音性難聴を発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、感音性難聴は遺伝性の感音性難聴である。いくつかの実施形態では、遺伝性難聴は常染色体劣性難聴である。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、難聴はＯＨＣの喪失またはＯＨＣの機能不全に関連している。いくつかの実施形態では、難聴は、ＯＨＣ不動毛束の異常な偏向またはＯＨＣ毛束と蓋膜との間の連結性障害に関連する。

【0029】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象にてＳＴＲＣ発現を増加させる（例えば、野生型ＳＴＲＣの発現、例えば、野生型ステレオシリンタンパク質を産生させる）方法を提供し、当該方法は、前述の態様及び実施形態の２ベクター系または医薬組成物の治療有効量を対象の内耳に投与することを含む。

【0030】

別の態様では、本発明は、前述の態様及び実施形態の２ベクター系または医薬組成物の有効量を対象の内耳に投与することを含む、それを必要とする対象にてＯＨＣの損傷または死滅を防止する、または軽減する方法を提供する。

【0031】

別の態様では、本発明は、前述の態様及び実施形態の２ベクター系または医薬組成物の有効量を対象の内耳に投与することを含む、それを必要とする対象にてＯＨＣ生存を増加させる方法を提供する。

【0032】

別の態様では、本発明は、前述の態様及び実施形態の２ベクター系または医薬組成物の有効量を対象の内耳に投与することを含む、それを必要とする対象にて蓋膜へのＯＨＣ毛束の付着を増やす、または改善する方法を提供する。

【0033】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象はＳＴＲＣに突然変異を有する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象はＳＴＲＣに突然変異を有すると特定されている。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本方法はさらに、２ベクター系または医薬組成物を投与する前に、ＳＴＲＣに突然変異を有するものとして対象を特定することを含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は常染色体劣性難聴１６（ＤＦＮＢ１６）を有する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象はＤＦＮＢ１６を有すると特定されている。

【0034】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法はさらに、２ベクター系または医薬組成物を投与する前に、対象の聴力を評価すること（例えば、聴力検査、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、または耳音響放射のような標準的な検査を使用して聴力を評価すること）を含む。

【0035】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法はさらに、２ベクター系または医薬組成物を投与した後に、対象の聴力を評価すること（例えば、聴力検査、ＡＢＲ、ＥＣＯＧ、または耳音響放射のような標準的な検査を使用して聴力を評価すること）を含む。

【0036】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、２ベクター系または医薬組成物は局所に投与される。いくつかの実施形態では、２ベクター系または医薬組成物は、対象の耳に投与される（例えば、内耳に、例えば、外リンパまたは内リンパ内に、例えば、卵円窓、正円窓もしくは水平半規管にもしくはそれを介して、または経鼓膜注入または鼓室内注入によって投与される）。いくつかの実施形態では、２ベクター系におけるベクターは同時に投与される。いくつかの実施形態では、２ベクター系におけるベクターは順次投与される。

【0037】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸ベクターまたは組成物は、難聴を予防もしくは軽減する、難聴の発症を遅延させる、難聴の進行を遅らせる、聴力を改善する、語音弁別を改善する、有毛細胞の機能を改善する、有毛細胞の損傷を予防もしくは軽減する、有毛細胞死を予防もしくは軽減する、有毛細胞の生存を促進もしくは増加させる、ＯＨＣ毛束の蓋膜への付着を改善する、または有毛細胞におけるＳＴＲＣ発現を増加させるのに十分な量で投与される。

【0038】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象はヒトである。
別の態様では、本発明は、前述の態様及び実施形態の２ベクター系または医薬組成物を含有するキットを提供する。

【0039】

定義
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は記載されている値から１０％以内で上回る、または下回る値を指す。

【0040】

本明細書で使用されるとき、「投与」とは、任意の有効な経路によって、対象に治療剤（例えば、ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたオンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーターを含有する２ベクター系）を提供すること、または付与することを指す。例示的な投与経路は本明細書で以下に記載されている。

【0041】

本明細書で使用されるとき、「内耳に投与する」という表現は、内耳細胞の形質導入を可能にする任意の経路によって、本明細書に記載されている治療剤を対象に提供すること、または付与することを指す。内耳への例示的な投与経路には、外リンパまたは内リンパへの、例えば、卵円窓、正円窓、もしくは半規管（例えば、水平半規管）への、もしくはそれを介した、または経鼓膜注入もしくは鼓室内注入による投与、例えば、ＯＨＣへの投与が含まれる。

【0042】

本明細書で使用されるとき、「細胞型」という用語は遺伝子発現データに基づいて統計的に分離可能である表現型を共有する細胞の群を指す。例えば、一般的な細胞型の細胞は、同様の構造的特徴及び／または機能的特徴、例えば、同様の遺伝子活性化パターン及び抗原提示特性を共有している場合がある。一般的な細胞型の細胞には、生体内の一般的な組織（例えば、上皮組織、神経組織、結合組織、または筋肉組織）及び／または一般的な臓器、組織系、血管、または他の構造及び／または領域から分離された細胞が含まれ得る。

【0043】

本明細書で使用されるとき、用語「蝸牛有毛細胞」とは、音の感知に関与する内耳内の特殊な細胞群を指す。蝸牛有毛細胞には、内有毛細胞と外有毛細胞の２種類がある。蝸牛有毛細胞への損傷と蝸牛有毛細胞の機能を破壊する遺伝子変異は、難聴及び聴覚消失に関係している。

【0044】

本明細書で使用されるとき、「保存的変異」、「保存的置換」、及び「保存的アミノ酸置換」という用語は、１以上のアミノ酸から、極性、静電荷、及び立体的容量のような同様の物理化学的特性を示す１以上の異なるアミノ酸への置換を指す。２０種の天然に存在するアミノ酸のそれぞれについて、これらの特性を以下の表１に要約する。

【0045】

【表1】

【0046】

この表については、保存的アミノ酸のファミリーには（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ；（ｉｉ）Ｄ及びＥ；（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ及びＴ；（ｉｖ）Ｈ、Ｋ及びＲ；（ｖ）Ｎ及びＱ；ならびに（ｖｉ）Ｆ、Ｙ及びＷが含まれる。したがって、保存的変異または保存的置換とは、あるアミノ酸を同じアミノ酸ファミリーのメンバーと置き換えるものである（例えば、ＳｅｒをＴｈｒに、ＬｙｓをＡｒｇに置き換える）。

【0047】

本明細書で使用されるとき、「分解シグナル配列」という用語は、それが含まれるポリペプチドの分解に介在する配列（例えば、アミノ酸配列に翻訳することができるヌクレオチド配列）を指す。分解シグナル配列を本発明の核酸ベクターに含めて、組換え及び／またはスプライシングを受けていないステレオシリンタンパク質の部分の発現を低減する、または防止することができる。

【0048】

本明細書で使用されるとき「由来する」及び「誘導体」という用語は、対応する完全長野生型の核酸、ペプチド、またはタンパク質と比較して、１以上の突然変異及び／または化学修飾を含む核酸、ペプチド、またはタンパク質、またはその変異型もしくは類似体を指す。核酸が関与する化学修飾の非限定的な例には、例えば、塩基部分、糖部分、リン酸部分、リン酸－糖骨格、またはそれらの組み合わせへの修飾が挙げられる。

【0049】

本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されている組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの「有効量」、「治療有効量」、及び「十分な量」という用語は、哺乳類、例えば、ヒトを含む対象に投与する場合に、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量を指し、したがって、「有効量」またはその同義語はそれが適用されている状況に依存する。例えば、感音性難聴を治療する文脈では、それは、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターを投与せずに得られる応答と比較して、治療応答を達成するのに十分な組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの量である。そのような量に対応する本明細書に記載されている所与の組成物の量は、例えば、所与の薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患もしくは障害の種類、対象の独自性（例えば、年齢、性別、体重）または治療されている宿主などのような種々の因子に応じて変化するであろうが、それにもかかわらず、当業者によって日常的に決定することができる。また、本明細書で使用されるとき、本開示の組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの「治療有効量」は、対照と比較して対象にて有益なまたは所望の結果をもたらす量である。本明細書で定義されているように、本開示の組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの治療有効量は、当該技術分野で既知の日常的な方法によって当業者が容易に決定してもよい。投与計画を調整して最適な治療応答を提供してもよい。

【0050】

本明細書で使用されるとき、「内在性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）または生物内の特定の位置（例えば、器官、組織、または細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、ＯＨＣ）にて自然に見いだされる分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を指す。

【0051】

本明細書で使用されるとき、「発現する」という用語は、以下の事象（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡからポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの１以上を指す。

【0052】

本明細書で使用されるとき、「外来性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）または生物内の特定の位置（例えば、器官、組織、または細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、ヒトＯＨＣ）にて天然には見いだされない分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を表す。外来性物質には、生物またはそこから抽出された培養物に対して外部供給源から提供される物質が含まれる。

【0053】

本明細書で使用されるとき、「エクソン」という用語は、そのヌクレオチド配列が、対応するタンパク質のアミノ酸配列を決定する遺伝子のコード領域内の領域を指す。エクソンという用語はまた、遺伝子から転写されたＲＮＡの対応する領域を指す。エクソンは、ｍＲＮＡ前駆体に転写され、遺伝子の選択的スプライシングに応じて成熟ｍＲＮＡに含まれてもよい。プロセシング後の成熟ｍＲＮＡに含まれるエクソンは、タンパク質に翻訳されるが、その際、エクソンの配列がタンパク質のアミノ酸組成を決定する。

【0054】

本明細書で使用されるとき、「異種の」という用語は天然に存在しない要素の組み合わせを指す。例えば、異種導入遺伝子とは、それが操作可能に連結されているプロモーターによって自然に発現されない導入遺伝子を指す。

【0055】

本明細書で使用されるとき、「増加する」及び「減少する」という用語は、それぞれ、基準値に対する測定指標の機能、発現、または活性の、さらに多い、またはさらに少ない量をもたらす調節を指す。例えば、本明細書に記載されている方法での組成物の投与に続いて、本明細書に記載されている測定指標（例えば、導入遺伝子の発現）のマーカーの量を、対象にて投与前のマーカー量と比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％またはそれ以上、増加または減少させてもよい。一般に、測定指標は、投与後、例えば、治療レジメン開始後少なくとも１週間、１ヵ月、３ヵ月、または６ヵ月など、投与が前述の効果を発揮した時点で測定される。

【0056】

本明細書で使用されるとき、「タンパク質イントロン」とも呼ばれる「インテイン」という用語は、通常１００～９００のアミノ酸残基長であり、且つ隣接タンパク質断片（「エクステイン」）の自己切除及びペプチド結合による連結が可能であるタンパク質の一部を指す。タンパク質スプライシングの際にインテインが生成される。「インテイン」という用語は、マキシインテイン、ミニインテイン、トランススプライシングインテイン及びアラニンインテインを含む４つの異なるクラスのインテインを包含する。マキシインテインとは、エンドヌクレアーゼドメインを含有するタンパク質のＮ末端及びＣ末端のスプライシング領域を指す。「ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子」または「ＨＥＧ」としても知られているエンドヌクレアーゼドメインは、イントロン内の単独で動作する遺伝子として、他のタンパク質とのタンパク質融合として、または自己スプライシングインテインとしてコードされるエンドヌクレアーゼのクラスを指す。ＨＥＧは一般に、非常に僅かな、且つ標的とされることが多いＤＮＡ領域を加水分解する。ＨＥＧがＤＮＡの小片を加水分解すると、ＨＥＧをコードする遺伝子は通常、切断部位にそれ自体組み込まれ、それによってその対立遺伝子の頻度を高める。ミニインテインとは、エンドヌクレアーゼドメインを欠くＮ末端及びＣ末端のスプライシングドメインを指す。トランススプライシングインテインは、さらにＮ末端とＣ末端とに分割される２以上のドメインに分割されるインテインを指す。アラニンインテインとは、システインまたはセリンの代わりにアラニンのスプライシングジャンクションを有するインテインを指す。前駆体タンパク質のインテインは２つの遺伝子に分けられてもよく；そのような場合、インテインは分割「インテイン」と呼ばれる。

【0057】

本明細書で使用されるとき、「イントロン」という用語は、そのヌクレオチド配列が、対応するタンパク質のアミノ酸配列に翻訳されない遺伝子のコード領域内の領域を指す。イントロンという用語はまた、遺伝子から転写されたＲＮＡの対応する領域も指す。イントロンはｍＲＮＡ前駆体に転写されるが、プロセシング中に除去され、成熟ｍＲＮＡには含まれない。

【0058】

本明細書で使用されるとき、「外有毛細胞特異的な発現」または「ＯＨＣ特異的な発現」という用語は、蝸牛の他の細胞型（例えば、らせん神経節ニューロン、グリアまたは他の蝸牛細胞型）と比較したとき、主に蝸牛ＯＨＣ内でのＲＮＡ転写物またはポリペプチドの産生を指す。導入遺伝子のＯＨＣ特異的な発現は、任意の標準的な技術（例えば、定量的ＲＴ ＰＣＲ、免疫組織化学、ウェスタンブロット分析、またはプロモーターに操作可能に連結されたレポーター（例えば、ＧＦＰ）の蛍光測定）を使用して、蝸牛の種々の細胞型の間で（例えば、ＯＨＣ対非ＯＨＣ）、導入遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の発現）を比較することによって確認することができる。ＯＨＣ特異的なプロモーターは、それが操作可能に連結されている導入遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の発現）を誘導し、その誘導される発現は、以下の内耳細胞型：内有毛細胞、境界細胞、内指節細胞、内柱細胞、外柱細胞、第１列目のダイテルス細胞、第２列目のダイテルス細胞、第３列目のダイテルス細胞、ヘンゼン細胞、クラウディウス細胞、内溝細胞、外溝細胞、らせん隆起細胞、根細胞、歯間細胞、血管条の基底細胞、血管条の中間細胞、血管条の辺縁細胞、らせん神経節ニューロン、シュワン細胞のうち少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）と比べてＯＨＣにて、少なくとも５０％（例えば、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上）大きい。ＯＨＣ特異的プロモーターは、それが操作可能に連結されている導入遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の発現）を誘導し、その誘導される発現は、蝸牛の他の細胞と比べて、蝸牛のＯＨＣにて少なくとも５０％（例えば、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上）大きい。

【0059】

本明細書で使用されるとき、「局所的」または「局所的投与」とは、全身的効果ではなく局所的効果を目的とした身体の特定の部位での投与を意味する。局所投与の例は、対象の皮膚上、吸入、関節内、髄腔内、膣内、硝子体内、子宮内、病変内投与、リンパ節投与、腫瘍内投与、内耳への投与、及び粘膜への投与であり、その場合、投与は、全身的効果ではなく、局所的効果をもたらすことを目的とする。

【0060】

本明細書で使用されるとき、用語「操作可能に連結された」とは、第１の分子が第２の分子に結合されることを指し、その場合、この第１の分子は、第１の分子が第２の分子の機能に影響を与えるように配置される。２つの分子は、単一の切れ目のない分子の一部であってもよく、そうでなくてもよく、隣接していても、隣接していなくてもよい。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節するならば、そのプロモーターは転写可能なポリヌクレオチド分子に操作可能に連結されている。さらに、転写調節エレメントの２つの部分は、一方の部分の転写活性化機能が他方の部分の存在により悪影響を受けないようにそれらが結合している場合、互いに操作可能に連結している。２つの転写調節エレメントは、リンカーポリヌクレオチド（例えば、介在非コードポリヌクレオチド）を介して互いに操作可能に連結されるか、または介在ヌクレオチドが存在せずに互いに操作可能に連結されてもよい。

【0061】

本明細書で使用されるとき、用語「プラスミド」とは、追加のＤＮＡセグメントをライゲートし得る染色体外環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。プラスミドとは、ベクターのタイプであり、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子である。特定のプラスミドは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌プラスミド及びエピソーム性哺乳類プラスミド）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。特定のプラスミドは、それらが操作可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。

【0062】

本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのポリマーを指す。一般に、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合した、ＤＮＡまたはＲＮＡに天然に見いだされるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）から構成される。この用語には、天然の核酸に見いだされるかどうかにかかわらず、化学的または生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む分子が包含され、そのような分子は特定の用途に好ましい場合がある。本出願がポリヌクレオチドに言及する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方と、それぞれの場合における一本鎖及び二本鎖形態の両方（及び各一本鎖分子の相補体）が提供されることが理解される。本明細書中で使用する「ポリヌクレオチド配列」とは、ポリヌクレオチド物質自体及び／または特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、塩基の略語として使用される一連の文字）を指し得る。本明細書中に提示するポリヌクレオチド配列は、特に明記しない限り、５’から３’の方向で示される。

【0063】

本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ上の認識部位を指す。ポリメラーゼは導入遺伝子の転写を促進する。本開示の代表的なプロモーターは、オンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーター、例えば、配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列を有するＯＣＭプロモーター、または配列番号１～３のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異型である。

【0064】

参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」とは、配列を並べ、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性の割合を達成した後、参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列における核酸またはアミノ酸と同一である候補配列における核酸またはアミノ酸の割合として定義される。核酸またはアミノ酸配列同一性割合を測定する目的のアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアのような、一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の能力の範囲内の様々な方法で達成することができる。当業者は、比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を並べるのに適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性割合の値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成されてもよい。一例として、所与の核酸配列またはアミノ酸配列Ｂについての、との、に対する所与の核酸配列またはアミノ酸配列Ａの配列同一性パーセント（これは代わりに、所与の核酸配列またはアミノ酸配列Ｂについての、との、に対する特定のパーセントの配列同一性を有する所与の核酸配列またはアミノ酸配列Ａと言い換えることができる）は、以下のように計算される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、ＡとＢとのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって同一の一致としてスコアリングされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの核酸の総数である。核酸配列またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸配列またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性割合は、Ａに対するＢの配列同一性割合と等しくないと考えられる。

【0065】

本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」という用語は、対象に影響を与える、または対象に影響を与える可能性がある特定の疾患または病態を予防、治療または制御するために、任意で、１以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、及び／または担体と組み合わせて、哺乳類、例えばヒトのような対象に投与される治療剤を含有する混合物を指す。

【0066】

本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応及び他の問題となる合併症がなく、妥当な利益／リスク比がある、哺乳類（例えば、ヒト）のような対象の組織との接触に好適である化合物、物質、組成物、及び／または剤形を指す。

【0067】

本明細書で使用されるとき、「組換え誘導領域」という用語は２つの異なる配列間の組換えに介在する相同性の領域を指す。
本明細書で使用されるとき、「調節配列」という用語は、ＳＴＲＣをコードするポリヌクレオチドの転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州，１９９０）に記載されており、それは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0068】

本明細書で使用されるとき、「試料」という用語は、対象から単離された検体（例えば、血液、血液成分（例えば、血清または血漿）、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織（例えば、胎盤または皮膚）、膵液、絨毛膜絨毛試料、及び細胞）を指す。

【0069】

本明細書で使用されるとき、「ステレオシリン」及び「ＳＴＲＣ」（ＤＦＮＢ１６としても知られている）という用語はそれぞれ、ＳＴＲＣ遺伝子によってコードされるタンパク質、及びこのタンパク質をコードする遺伝子を指す。ヒトでは、ＳＴＲＣは直列に複製され、その際、２番目のコピーは、エクソン２０内に早期停止コドンを含有し、それによってＳＴＲＣ偽遺伝子が生成される。本開示の文脈では、ＳＴＲＣはＳＴＲＣ偽遺伝子を指さない。以前の研究では、常染色体劣性非症候群性感音性難聴があるヒト患者にてＳＴＲＣの完全長コピーにおける突然変異が同定されている（Ｖｅｒｐｙ等，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３４５－９（２００１））ステレオシリンタンパク質の発現は有毛細胞の毛束における不動毛に限定される。ステレオシリンは、聴覚装置の正常な機能に必要である水平上部コネクタ及び蓋膜取り付けクラウンを形成すると考えられる（Ａｖａｎ等，ＰＮＡＳ，１１６：２５９４８－５７（２０１９）；Ｖｅｒｐｙ等，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５１９：１９４－２１０（２０１１））。ステレオシリンを欠いたマウスは、凝集不良を伴う異常な有毛細胞束及び聴覚障害を呈することが示されている（Ｖｅｒｐｙ等，、Ｎａｔｕｒｅ，４５６：２５５－８（２００８））。本開示は、本明細書に記載されているベクター系に組み込まれると、それを必要とする対象にて難聴（例えば、感音性難聴）を治療するための治療剤として使用されてもよい、完全長ステレオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。「ステレオシリン」及び「ＳＴＲＣ」という用語は、野生型ステレオシリンタンパク質及びそれをコードする核酸のそれぞれ変異型、例えば、野生型ステレオシリンタンパク質（例えば、配列番号４または５）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型タンパク質、または野生型ＳＴＲＣ遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号６または７）に対して少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％の同一性またはそれ以上）の配列同一性を有するポリヌクレオチドも指し、ただし、コードされるＳＴＲＣ類似体が野生型ＳＴＲＣの治療機能を保持していることを条件とする。

【0070】

本明細書で使用されるとき、「転写調節エレメント」という用語は、目的の遺伝子の転写を少なくとも部分的に制御するポリヌクレオチドを指す。転写調節エレメントは、遺伝子転写を制御するか、または制御するのを支援するプロモーター、エンハンサー、及び他のポリヌクレオチド（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含み得る。転写調節エレメントの例は、例えば、Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，ニューヨーク州，２０１２）に記載されている。

【0071】

本明細書で使用されるとき、「対象」及び「患者」という用語は動物（例えば、ヒトのような哺乳類）を指す。本明細書に記載されている方法に従って治療される対象は、難聴（例えば、ＳＴＲＣにおける突然変異に関連する難聴）と診断されている対象、またはこの病態を発症するリスクがある対象であってもよい。診断は、当該技術分野で既知の任意の方法または技法によって実施されてもよい。当業者は、本開示に従って治療される対象が、標準検査を受けていてもよく、または検査を受けていないが疾患もしくは病態に関連する１以上のリスク因子の存在に起因するリスクを有する対象として特定されていてもよいことを理解するであろう。

【0072】

本明細書で使用されるとき、用語「形質導入」及び「形質導入する」とは、ベクター構築物またはその一部を細胞に導入する方法を指す。ベクター構築物が、例えば、ＡＡＶベクターのようなウイルスベクターに含まれる場合、形質導入とは、細胞のウイルス感染、及びその後のベクター構築物またはその一部の細胞ゲノムへの移入及び組み込みを指す。

【0073】

本明細書で使用されるとき、疾患または病態に関連した「治療」及び「治療すること」とは、有益な、または所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指す。有益な、または所望の結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、１以上の症状または病態の緩和または改善；疾患または病態の程度の減少；疾患、障害、または病態の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）；疾患または病態の拡大の予防；疾患または病態の進行の遅延または減速；疾患または病態の改善または一時的軽減；及び、（部分的または完全）寛解を挙げることができるが、これらに限定されない。疾患または病態を「改善すること」または「一時的に軽減すること」とは、治療がない場合の程度または時間経過と比較して、疾患、障害、または病態の程度及び／または望ましくない臨床発現を減少させ、及び／または進行の時間経過を減速または延長させることを意味する。「治療」はまた、治療を受けていなかった場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。治療を必要とする者としては、病態もしくは障害を既に有する者、及び病態もしくは障害を有する傾向にある者、または病態もしくは障害を予防する必要がある者が挙げられる。

【0074】

本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」とは、核酸ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、または人工染色体のようなＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルス、または任意の他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）を指す。外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するために、様々なベクターが開発されてきた。そのような発現ベクターの例は、例えば、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，マーブルヘッド，マサチューセッツ州，２００６）に記載されている。本明細書に記載されている組成物及び方法での使用に好適な発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、と同様に、例えば、タンパク質の発現及び／または哺乳類細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチド配列の組み込みに使用される追加の配列要素を含有する。本明細書に記載されているＳＴＲＣの発現に使用することができる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーター及びエンハンサーの領域のような調節配列を含有するベクターが含まれる。ＳＴＲＣの発現に有用な他のベクターは、ＳＴＲＣの翻訳速度を高める、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を向上させるポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列要素には、例えば、５’及び３’非翻訳領域、及び発現ベクターに搭載された遺伝子の効率的な転写を指示するポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載されている組成物及び方法での使用に好適な発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドも含有してもよい。好適なマーカーの例には、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオスリシンのような抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。

【0075】

本明細書で使用されるとき、用語「野生型」とは、所与の生物における特定の遺伝子について最も出現頻度が高い遺伝子型を指す。

【図面の簡単な説明】

【0076】

【図1A】遍在性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで形質導入したマウス蝸牛の一連の蛍光画像である。ネイティブのＧＦＰ蛍光を示す。遍在性プロモーターを使用して、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰは内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、間葉細胞、及びグリアを含む蝸牛内の多くの細胞型でＧＦＰ発現を誘導した。

【図1B】オンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーターの制御下にてＧＦＰを発現するＡＡＶベクター（配列番号１）で形質導入したマウス蝸牛の一連の蛍光画像である。ネイティブのＧＦＰ蛍光を示す。ＯＨＣ特異的プロモーターを使用して、ＡＡＶ－ＯＣＭ（配列番号１）－ＧＦＰはＯＨＣでのみＧＦＰ発現を誘導した。

【図2A】配列番号１のＯＣＭプロモーターの制御下でＨ２Ｂ－ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを投与した２匹の非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の蝸牛の基底回転からの単一パラフィン切片の一連の顕微鏡写真を示す。Ａは、第１の動物由来の単一パラフィン切片の顕微鏡写真であり、Ｂは第２の動物由来の単一パラフィン切片の顕微鏡写真である。ＡのパネルＡ及びＢのパネルＢ（上の画像）は、元々は青色でヘマトキシリン染色された核及び元々は赤色で染色されたＨ２Ｂ－ＧＦＰ抗体を伴うコルチ器の周囲の領域のグレースケールの変換を示す。ＡのパネルＡ’及びＢのパネルＢ’（下の画像）は、青色ヘマトキシリンのシグナルを除去した後の残りのシグナルを示し、Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ陽性（赤色）の核はグレースケール変換後、さらに暗い色として見えるままである。スケールバーは１００μｍを表す。内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）は配向のために強調表示されている。

【図2B】配列番号１のＯＣＭプロモーターの制御下でＨ２Ｂ－ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを投与した２匹の非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の蝸牛の基底回転からの単一パラフィン切片の一連の顕微鏡写真を示す。Ａは、第１の動物由来の単一パラフィン切片の顕微鏡写真であり、Ｂは第２の動物由来の単一パラフィン切片の顕微鏡写真である。ＡのパネルＡ及びＢのパネルＢ（上の画像）は、元々は青色でヘマトキシリン染色された核及び元々は赤色で染色されたＨ２Ｂ－ＧＦＰ抗体を伴うコルチ器の周囲の領域のグレースケールの変換を示す。ＡのパネルＡ’及びＢのパネルＢ’（下の画像）は、青色ヘマトキシリンのシグナルを除去した後の残りのシグナルを示し、Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ陽性（赤色）の核はグレースケール変換後、さらに暗い色として見えるままである。スケールバーは１００μｍを表す。内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）は配向のために強調表示されている。

【図3A】１６ｋＨｚでの２００μｍ^２のＲＯＩにおけるマウスのコルチ器でのステレオシリン発現の一連の蛍光画像である。Ａは、野生型ＣＢＡ／ＣａＪマウスにおける外有毛細胞（ＯＨＣ）の不動毛の先端部で染色しているステレオシリン抗体を示す。Ｂに示すように、塩基対２３２のＳＴＲＣノックアウト（ＫＯ）動物は抗体についてのシグナルを欠いていた。Ｃは、二重Ａｎｃ８０ベクターを投与された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにおけるステレオシリン抗体の染色を示し、その際、第１のベクターはＣＭＶプロモーターとマウスＳＴＲＣのｃＤＮＡのヌクレオチド１～３２００を保有し、第２のベクターはヌクレオチド２２０１～５４３０を保有し、２つのベクターにおける２つのｃＤＮＡ間で１０００塩基対の重複を作り出した。処理された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにてＯＨＣ不動毛の先端で、及びコルチ器の内有毛細胞の本体内で新たなステレオシリンタンパク質の発現を観察することができた。

【図3B】１６ｋＨｚでの２００μｍ^２のＲＯＩにおけるマウスのコルチ器でのステレオシリン発現の一連の蛍光画像である。Ａは、野生型ＣＢＡ／ＣａＪマウスにおける外有毛細胞（ＯＨＣ）の不動毛の先端部で染色しているステレオシリン抗体を示す。Ｂに示すように、塩基対２３２のＳＴＲＣノックアウト（ＫＯ）動物は抗体についてのシグナルを欠いていた。Ｃは、二重Ａｎｃ８０ベクターを投与された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにおけるステレオシリン抗体の染色を示し、その際、第１のベクターはＣＭＶプロモーターとマウスＳＴＲＣのｃＤＮＡのヌクレオチド１～３２００を保有し、第２のベクターはヌクレオチド２２０１～５４３０を保有し、２つのベクターにおける２つのｃＤＮＡ間で１０００塩基対の重複を作り出した。処理された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにてＯＨＣ不動毛の先端で、及びコルチ器の内有毛細胞の本体内で新たなステレオシリンタンパク質の発現を観察することができた。

【図3C】１６ｋＨｚでの２００μｍ^２のＲＯＩにおけるマウスのコルチ器でのステレオシリン発現の一連の蛍光画像である。Ａは、野生型ＣＢＡ／ＣａＪマウスにおける外有毛細胞（ＯＨＣ）の不動毛の先端部で染色しているステレオシリン抗体を示す。Ｂに示すように、塩基対２３２のＳＴＲＣノックアウト（ＫＯ）動物は抗体についてのシグナルを欠いていた。Ｃは、二重Ａｎｃ８０ベクターを投与された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにおけるステレオシリン抗体の染色を示し、その際、第１のベクターはＣＭＶプロモーターとマウスＳＴＲＣのｃＤＮＡのヌクレオチド１～３２００を保有し、第２のベクターはヌクレオチド２２０１～５４３０を保有し、２つのベクターにおける２つのｃＤＮＡ間で１０００塩基対の重複を作り出した。処理された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにてＯＨＣ不動毛の先端で、及びコルチ器の内有毛細胞の本体内で新たなステレオシリンタンパク質の発現を観察することができた。

【図4A】Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃで処理した塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにおける聴覚機能の改善及びＯＨＣのＳＴＲＣ発現との相関を示す一連のグラフである。未処理の反対側耳は、ＤＰＯＡＥがほぼ存在せず、ＯＨＣ機能の喪失を示すＡＢＲ閾値が非常に高いことを（図４Ａ～４Ｂ、白丸）示した一方で、処理された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯ動物は聴力の閾値の回復が示した（図４Ａ～４Ｂ、黒丸）。処理した動物の最良の応答者（図４Ａ～図４Ｂ、黒い四角形）は、野生型（図４Ａ～図４Ｂ、三角形）の聴力閾値に近いことを示した。ＡＡＶ－Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃによる処理の後にステレオシリンを発現している塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスのＯＨＣの高い割合は聴覚回復を促進することが見いだされた（図４Ｃ）。

【図4B】Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃで処理した塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにおける聴覚機能の改善及びＯＨＣのＳＴＲＣ発現との相関を示す一連のグラフである。未処理の反対側耳は、ＤＰＯＡＥがほぼ存在せず、ＯＨＣ機能の喪失を示すＡＢＲ閾値が非常に高いことを（図４Ａ～４Ｂ、白丸）示した一方で、処理された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯ動物は聴力の閾値の回復が示した（図４Ａ～４Ｂ、黒丸）。処理した動物の最良の応答者（図４Ａ～図４Ｂ、黒い四角形）は、野生型（図４Ａ～図４Ｂ、三角形）の聴力閾値に近いことを示した。ＡＡＶ－Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃによる処理の後にステレオシリンを発現している塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスのＯＨＣの高い割合は聴覚回復を促進することが見いだされた（図４Ｃ）。

【図4C】Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃで処理した塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスにおける聴覚機能の改善及びＯＨＣのＳＴＲＣ発現との相関を示す一連のグラフである。未処理の反対側耳は、ＤＰＯＡＥがほぼ存在せず、ＯＨＣ機能の喪失を示すＡＢＲ閾値が非常に高いことを（図４Ａ～４Ｂ、白丸）示した一方で、処理された塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯ動物は聴力の閾値の回復が示した（図４Ａ～４Ｂ、黒丸）。処理した動物の最良の応答者（図４Ａ～図４Ｂ、黒い四角形）は、野生型（図４Ａ～図４Ｂ、三角形）の聴力閾値に近いことを示した。ＡＡＶ－Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃによる処理の後にステレオシリンを発現している塩基対２３２のＳＴＲＣのＫＯマウスのＯＨＣの高い割合は聴覚回復を促進することが見いだされた（図４Ｃ）。

【図5】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の２ベクター分割インテインシステムによる形質移入が完全長ステレオシリンの再構成に繋がることを示す画像及びグラフである。Ａはステレオシリンタンパク質及びβ－アクチンに対するウェスタンブロットの代表的な画像である。Ｂは、アクチンに対する完全長ステレオシリンのバンド強度の濃度測定の定量であり、陰性（ＧＦＰ）対照、陽性の完全長対照、及びＮｐｕインテイン構築物に関する完全長ステレオシリンタンパク質の相対発現を示す。

【図6A】マウスＯＣＭプロモーターの制御下でステレオシリン（ＳＴＲＣ）を発現させるための重複二重ベクター系を作り出すのに使用されるそれぞれプラスミドＰ９５９及びＰ７２４のマップである。

【図6B】マウスＯＣＭプロモーターの制御下でステレオシリン（ＳＴＲＣ）を発現させるための重複二重ベクター系を作り出すのに使用されるそれぞれプラスミドＰ９５９及びＰ７２４のマップである。

【図7A】マウスＯＣＭプロモーターの制御下でＳＴＲＣを発現させるための二重ハイブリッドベクター系を作り出すのに使用されるそれぞれプラスミドＰ９６０及びＰ７２６のマップである。

【図7B】マウスＯＣＭプロモーターの制御下でＳＴＲＣを発現させるための二重ハイブリッドベクター系を作り出すのに使用されるそれぞれプラスミドＰ９６０及びＰ７２６のマップである。

【発明を実施するための形態】

【0077】

本明細書に記載されているのは、オンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーターのようなプロモーターと、ステレオシリン（ＳＴＲＣ）タンパク質（例えば、野生型（ＷＴ）ＳＴＲＣタンパク質）のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドと含有する第１の核酸ベクターと、ＳＴＲＣタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドとポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ））配列とを含有する第２の核酸ベクターとを投与することによって、対象（哺乳類対象、例えば、ヒト）にて感音性難聴を治療するための組成物及び方法である。蝸牛外有毛細胞（ＯＨＣ）のような哺乳類細胞に導入されると、２つの核酸ベクターによってコードされるポリヌクレオチドが結合して、完全長ＳＴＲＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを形成することができる。本開示はまた、前述のポリヌクレオチドを含有する２ベクター発現系（例えば、重複二重ベクター、トランススプライシングベクター、二重ハイブリッドベクター、及び分割トランススプライシングベクター）も特徴とする。本明細書に記載されている組成物及び方法を使用して、ＯＨＣにてＳＴＲＣをコードするポリヌクレオチドを特異的に発現させることができるので、本明細書に記載されている組成物は対象（例えば、哺乳類対象、例えば、ヒト）に投与されて、難聴（例えば、感音性難聴）及び聴覚神経障害のようなＯＨＣの機能不全が原因の障害を治療することができる。

【0078】

ステレオシリン
ステレオシリン（ＤＦＮＢ１６としても知られる）は、染色体１５ｑ１５におけるＳＴＲＣ遺伝子によってコードされたタンパク質であり、約１９ｋｂのゲノムにまたがる２９のエクソンを含有する。ＳＴＲＣ遺伝子は直列に複製され、その際、２番目のコピーはエクソン２０内に早期停止コドンを含有し、それによってＳＴＲＣ偽遺伝子が生成される。以前の研究では、常染色体劣性非症候群性の感音性難聴がある２つの家族にて２つのフレームシフト突然変異とＳＴＲＣの完全長コピーにおける大きな欠失とが確認されている（Ｖｅｒｐｙ等，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３４５－９（２００１））。ステレオシリンタンパク質の発現は、内耳有毛細胞の毛束における不動毛に限定されており、聴覚装置の正常な機能に必要な水平上部コネクタ及び蓋膜取り付けクラウンを形成すると考えられる（Ａｖａｎ等，ＰＮＡＳ，１１６：２５９４８－５７（２０１９）；Ｖｅｒｐｙ等，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５１９：１９４－２１０（２０１１））。ステレオシリンを欠いたマウスは、凝集不良を伴う異常な有毛細胞束及び聴覚障害を呈することが示されている（Ｖｅｒｐｙ等，Ｎａｔｕｒｅ，４５６：２５５－８（２００８））。

【0079】

本明細書に記載されている組成物及び方法を使用して、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する第１の核酸ベクターと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する第２の核酸ベクターとを投与することによって感音性難聴を治療することができる。完全長ＳＴＲＣのコード配列は大きすぎて、遺伝子治療に一般に使用されるベクターの種類（例えば、５ｋｂのパッケージング制限があると考えられているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）に含めることはできない。本明細書に記載されている組成物及び方法は、完全長のＳＴＲＣ配列が細胞にて再構成することができるように、ＳＴＲＣのコード配列を２つの異なる核酸ベクターに分割することによってこの課題を克服する。これらの組成物及び方法を使用して、ＳＴＲＣ遺伝子に１以上の突然変異、例えば、ＳＴＲＣ発現を低下させる、ＳＴＲＣ機能を低下させる、または難聴に関連する（例えば、ＤＦＮＢ１６を有する対象）ＳＴＲＣの突然変異を有する対象を治療することができる。第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターが組成物で投与される場合、ステレオシリンのＮ末端部分及びＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドは、細胞（例えば、ヒト細胞、例えば、蝸牛有毛細胞）内で結合して、完全長のＳＴＲＣコード配列を含有する単一のポリヌクレオチドを（例えば、相同組換え及び／またはスプライシングを介して）形成することができる。

【0080】

本明細書に記載されている組成物及び方法に使用される核酸ベクターは、野生型ステレオシリンまたはその変異型をコードするポリヌクレオチド配列を含み、例えば、結合すると、野生型哺乳類（例えば、ヒトまたはマウス）のステレオシリンのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載されている核酸ベクターに使用されるポリヌクレオチドは、以下の表２のステレオシリンアミノ酸配列のＮ末端部分及びＣ末端部分（例えば、結合すると、表２に列挙されている完全長のステレオシリンアミノ酸配列、例えば、配列番号４または配列番号５をコードする２つの部分）をコードする。

【0081】

本明細書に記載されている方法によれば、対象には、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または配列番号４もしくは配列番号５に対して１以上の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換）を含有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれＮ末端部分及びＣ末端部分を含有する第１の核酸ベクターと第２の核酸ベクターとを含有する組成物を投与することができ、ただし、コードされるステレオシリン類似体は野生型ＳＴＲＣの治療機能を保持するという条件がある。いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分のアミノ酸の１０％以下、及びステレオシリンタンパク質のＣ末端部分のアミノ酸の１０％以下を保存的アミノ酸置換で置き換えてもよい。ステレオシリンタンパク質は、配列番号５または配列番号６の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。ステレオシリンタンパク質はまた、ヒト対象では非病原性であることが分かっている、一塩基変異型（ＳＮＶ）を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。ステレオシリンタンパク質はヒトのステレオシリンタンパク質であってもよく、または別の哺乳類種（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、または他の哺乳類）からのヒトのステレオシリンタンパク質の相同体であってもよい。

【0082】

【表2-1】

【0083】

【表2-2】

【0084】

【表2-3】

【0085】

【表2-4】

【0086】

【表2-5】

【0087】

【表2-6】

【0088】

【表2-7】

【0089】

【表2-8】

【0090】

【表2-9】

【0091】

【表2-10】

【0092】

哺乳類細胞でのステレオシリンの発現
ＳＴＲＣでの突然変異は感音性難聴に関連付けられている。本明細書に記載されている組成物及び方法を使用して、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する第１の核酸ベクターと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する第２の核酸ベクターとを対象に投与する、または細胞に接触させることによって、ＷＴステレオシリンの発現を誘導する、または増加させることができる。感音性難聴の治療での治療用途について核酸ベクターを利用するために、それらを細胞の内部、特に特定の細胞型に向けることができる。タンパク質を哺乳類細胞に送達するための、及び哺乳類細胞にてタンパク質をコードする遺伝子を安定的に発現させるための幅広い方法が確立されている。

【0093】

ステレオシリンをコードするポリヌクレオチド
哺乳類細胞にてステレオシリンの治療上有効な細胞内濃度を到達するのに使用することができるプラットフォームの１つは、ステレオシリンをコードする遺伝子を安定的に発現させる（例えば、哺乳類細胞の核ゲノムもしくはミトコンドリアゲノムへの組み込みによって、または哺乳類細胞の核におけるエピソーム鎖状体形成によって）ことによる。遺伝子は対応するタンパク質の一次アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。哺乳類細胞内に外来性遺伝子を導入するために、遺伝子をベクター内に組み込むことができる。ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入、直接取り込み、粒子衝撃法、及びリポソームへのベクターのカプセル化を含む、様々な方法によって、細胞内に導入することができる。細胞を形質移入または形質転換する適切な方法の例として、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション、及び直接取り込みが挙げられる。そのような方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ，等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ２０１４）、及びＡｕｓｕｂｅｌ，等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１５）にさらに詳細に記載されており、それぞれの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0094】

ステレオシリンタンパク質をコードする遺伝子の一部を含有するベクターを細胞膜リン脂質に向けることによって、ＳＴＲＣを哺乳類細胞内に導入することもできる。例えば、すべての細胞膜リン脂質に親和性を持つウイルスタンパク質であるＶＳＶ－Ｇタンパク質にベクター分子を結合させることによって、ベクターを細胞膜の細胞外表面上のリン脂質に向けることができる。そのような構築物は、当業者に周知の方法を使用して生成することができる。

【0095】

ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドが哺乳類ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、結合されることは、遺伝子発現にとって重要である。したがって、ＲＮＡポリメラーゼを動員し、転写開始部位での転写複合体の集合を促進する転写因子に対して高い親和性を示す配列要素をポリヌクレオチド内に含めてもよい。そのような配列要素には、例えば、哺乳類プロモーターが挙げられ、その配列は、特定の転写開始因子、そして最終的にはＲＮＡポリメラーゼによって認識され、結合され得る。哺乳類プロモーターの例は、Ｓｍｉｔｈ，等，Ｍｏｌ．Ｓｙｓ．Ｂｉｏｌ．，３：７３（オンライン公開）に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。

【0096】

本明細書に記載されている組成物及び方法での使用に好適なポリヌクレオチドには、哺乳類プロモーターの下流でステレオシリンタンパク質をコードするもの（例えば、哺乳類プロモーターの下流でステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド）が含まれる。哺乳類細胞におけるステレオシリンタンパク質の発現に有用なプロモーターには、オンコモジュリン（ＯＣＭ）プロモーターのようなＯＨＣ特異的なプロモーター（例えば、表３の列挙されたＯＣＭプロモーター配列のいずれか１つ（配列番号１～３のいずれか１つ）と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチド）が挙げられる。

【0097】

オンコモジュリンプロモーター
本発明者らは、ＯＨＣにおける遺伝子発現を駆動するのに十分であるＯＣＭ翻訳開始部位の上流に位置する１，１４０塩基対（ｂｐ）の領域を発見した。したがって、本明細書に記載されている組成物及び方法を使用して、難聴（例えば、ＤＦＮＢ１６のようなＳＴＲＣにおける突然変異に関連する感音性難聴）を有する対象またはそれを発症するリスクがある対象を治療するために、ＯＨＣにてステレオリニンを発現させることができる。本明細書に記載されているＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するＯＣＭプロモーター）を使用してＯＨＣ特異的な遺伝子発現を誘導することができるので、他の内耳細胞（例えば、ＯＨＣ以外の細胞）における的外れの発現を低減する、または排除することができ、それによって、ＳＴＲＣが内在性に発現される細胞をＳＴＲＣ発現の標的にし、的外れの発現に関連する毒性を低減することにより遺伝子治療の安全性及び有効性を改善する。

【0098】

本明細書に記載されている組成物及び方法は、配列番号１～３のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチド配列のような、ＯＨＣにてステレオシリンを特異的に発現することができる表３に挙げたＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）を含む。

【0099】

例示的なＯＣＭプロモーター配列を表３に列挙する。

【0100】

【表3-1】

【0101】

【表3-2】

【0102】

【表3-3】

【0103】

【表3-4】

【0104】

前述のポリヌクレオチドを核酸ベクターに含め、導入遺伝子に操作可能に連結させて、ＯＨＣにて導入遺伝子を特異的に発現させることができる。本明細書に記載されているベクターでは、導入遺伝子はステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードすることができる。本明細書に記載されている方法によれば、対象には、例えば、難聴の治療のために、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４または配列番号５のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されている前述のポリヌクレオチド（例えば、表３に列挙されるポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１～３）のいずれか１つ、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性（例えば、配列番号１～３のいずれか１つと８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチド配列の１つ）を含有する組成物を投与することができる。

【0105】

ステレオシリンをコードするポリヌクレオチドが哺乳類細胞の核ＤＮＡに組み込まれると、このポリヌクレオチドの転写は、当該技術分野にて既知の方法によって誘導することができる。例えば、哺乳類プロモーターへの転写因子及び／またはＲＮＡポリメラーゼの結合を調節し、したがって遺伝子発現を調節する薬剤のような外部化学試薬に哺乳類細胞を曝露することによって、発現を誘導することができる。化学試薬は、例えば、プロモーターに結合したリプレッサータンパク質を除去することによって、哺乳類プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子の結合を促進するように機能することができる。あるいは、化学試薬は、化学試薬の存在下でプロモーターの下流に位置する遺伝子の転写速度を高めるようにＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子に対する哺乳類プロモーターの親和性を高めるのに役立つことができる。上記のメカニズムによってポリヌクレオチド転写を増強する化学試薬の例としては、テトラサイクリン及びドキシサイクリンが挙げられる。これらの試薬は市販されており（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カールスバッド，カリフォルニア州）、確立されたプロトコールに従って遺伝子発現を促進するために哺乳類細胞に投与することができる。

【0106】

本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するためのポリヌクレオチドに含めてもよい他のＤＮＡ配列要素としては、エンハンサー配列が挙げられる。エンハンサーは、ＤＮＡが転写開始部位での転写因子及びＲＮＡポリメラーゼの結合に有利な三次元配向をとるように、目的の遺伝子を含有するポリヌクレオチドの立体構造変化を誘導する別のクラスの調節エレメントを表す。したがって、本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するためのポリヌクレオチドには、ＳＴＲＣをコードするポリヌクレオチドが含まれ、さらに哺乳類のエンハンサー配列が含まれる。今や、哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られており、例には、哺乳類のグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリンをコードする遺伝子由来のエンハンサーが挙げられる。本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するためのエンハンサーには、真核細胞に感染することができるウイルスの遺伝物質に由来するエンハンサーも含まれる。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物の遺伝子転写の活性化を誘導するさらなるエンハンサー配列としては、ＣＭＶエンハンサー及びＲＳＶエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター内に、例えば、この遺伝子の５’または３’の位置にてスプライシングされてもよい。好ましい配向では、エンハンサーはプロモーターの５’側に配置され、次いでプロモーターはステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して５’側に配置される。

【0107】

本明細書に記載されている核酸ベクターには、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれてもよい。ＷＰＲＥは、ｍＲＮＡレベルで作用し、転写産物の核外輸送を促進することによって、及び／または新生の転写産物のポリアデニル化の効率を高めることによって、細胞内のｍＲＮＡの総量を増加させる。ベクターへのＷＰＲＥの付加は、試験管内及び生体内の両方で、いくつかの異なるプロモーターからの導入遺伝子発現のレベルの実質的な改善をもたらすことができる。

【0108】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている核酸ベクターはレポーター配列を含み、これは、例えば、細胞及び組織（例えば、ＯＨＣでの）でのステレオシリンの発現を検証するのに有用であることができる。導入遺伝子にて提供されてもよいレポーター配列には、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野で周知の他のレポーターをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。レポーター配列は、それらの発現を駆動するＯＨＣ特異的プロモーターのような調節エレメントに関連付けられる場合、酵素アッセイ、放射線アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイまたは他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを保有するベクターの存在はβ－ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを保有するベクターはルミノメーターにおける発色または光の生成によって視覚的に測定されてもよい。

【0109】

二重ベクター発現系
重複二重ベクター
哺乳類細胞内で大きなタンパク質を発現させるための１つのアプローチには重複する二重ベクターの使用が含まれる。このアプローチは、そのそれぞれが目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部を含有し、且つ他のポリヌクレオチドとの配列重複の規定された領域を有する２つの核酸ベクターの使用に基づく。相同組換えは、重複領域で生じることができ、目的の完全長タンパク質（例えば、ステレオシリンタンパク質）をコードする単一ポリヌクレオチドの形成につながることができる。

【0110】

本明細書に記載されている方法及び組成物で使用するための重複二重ベクターは、少なくとも２００塩基の重複する配列（例えば、少なくとも２００ｂ、３００ｂ、４００ｂ、５００ｂ、６００ｂ、７００ｂ、８００ｂ、９００ｂ、１．０キロ塩基（ｋｂ）、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ以上の重複する配列）を含有する。重複する領域がステレオシリンをコードするポリヌクレオチドの長さの約半分に相当するステレオシリンをコードするポリヌクレオチド内の位置またはその近傍の位置を中心とし、上記中心位置の両側で等量の重複があるように、核酸ベクターを設計する。プロモーターのサイズと、ステレオシリンをコードするポリヌクレオチドにおける目的の配列要素の位置とに基づいて、重複する領域の中心を選択することもできる。いくつかの実施形態では、ステレオシリンをコードするポリヌクレオチドはいくつかの程度の重複（例えば、５０ｂ、１００ｂ、１５０ｂ、２００ｂ、２５０ｂ、３００ｂ、３５０ｂ、４００ｂ、４５０ｂ、５００ｂ、６００ｂ、７００ｂ、８００ｂ、９００ｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂまたはそれ以上）を伴って、ほぼ等しい長さの２つの半部に分割されるが、その際、ポリヌクレオチドの５’半分がステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードし、且つポリヌクレオチドの３’半分がステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする。本明細書に記載されている方法及び組成物で使用するための核酸ベクターはまた、ステレオシリンをコードするポリヌクレオチドの約半分が各ベクター内に含有されるようにも設計される（例えば、各ベクターはステレオシリンタンパク質の約半分をコードするポリヌクレオチドを含有する）。

【0111】

いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクターはステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする。いくつかの実施形態では、第２の核酸ベクターはステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする。いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質は配列番号４の配列を有する、またはそれに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性の配列を有する。いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質は配列番号５の配列を有する、またはそれに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性の配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒトの完全長ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６の配列を有する、または配列番号６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異型である。いくつかの実施形態では、マウスの完全長ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７の配列を有する、または配列番号７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異型である。

【0112】

１つの例示的な重複二重ベクター系は、中心位置として選択された位置のすぐ３’に５００塩基を含むステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４または配列番号５のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結された上記に記載されているＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＯＣＭプロモーター）を含有する第１の核酸ベクターと、中央位置として選択された位置のすぐ５’に５００塩基を含むステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＣ末端部分とポリ（Ａ）配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列）とを含有する第２の核酸ベクターとを含む。核酸ベクターは任意で、ＳＴＲＣ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有することができる。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは配列番号２の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号２に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは配列番号３の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号３に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。

【0113】

いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチドに操作可能に連結された、配列番号１（配列番号４３のヌクレオチド２２５～１３６４によっても表される）のＯＣＭプロモーターを含む。特定の実施形態では、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列は配列番号４３のヌクレオチド１３７５～４５７４である。ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列は、発現のために部分的にまたは完全にコドン最適化することができる。特定の実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは、逆方向末端反復によって５’側及び３’側のそれぞれに隣接する配列番号４３のヌクレオチド２２５～４５７４を含む。いくつかの実施形態では、隣接する逆方向末端反復は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子を保有するプラスミドによってカプシド形成され得る、ＡＡＶ２逆方向末端反復の任意の変異型である。特定の実施形態では、５’隣接逆方向末端反復は、配列番号４３のヌクレオチド１～１３０に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有し；且つ３’隣接逆方向末端反復は、配列番号４３のヌクレオチド４６６２～４７９１に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有する。ウイルスベクターを作り出す（通常、ウイルスベクター形成に必要なＡＡＶ遺伝子を保有する他のプラスミドとともにそのプラスミドを細胞に形質移入することによって）のに使用される伝達プラスミドにおける逆方向末端反復配列の所与の対について（例えば、配列番号４３）、組換え時にＩＴＲが「フリップ」または「フロップ」の配向をとるため、ウイルスベクターにおける対応する配列が変化し得ることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、伝達プラスミドにおけるＩＴＲの配列は、それから調製されたウイルスベクターに見られる配列と必ずしも同じではない。しかしながら、いくつかの非常に特定の実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは配列番号４３のヌクレオチド１～４７９１を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは、直後に停止コドンが続くステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ステレオシリンタンパク質のＣ末端アミノ酸をコードするヌクレオチド配列は配列番号４４のヌクレオチド２１１～３４４０である。ＳＴＲＣタンパク質のＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列は、発現のために部分的にまたは完全にコドン最適化することができる。いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは、配列番号４４のヌクレオチド３４５２～３９９９に対応するＷＰＲＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは、配列番号４４のヌクレオチド４０１２～４２１９に対応するポリ（Ａ）配列を含む。特定の実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは逆方向末端反復によって５’側及び３’側のそれぞれに隣接する配列番号４４のヌクレオチド２１１～４２１９を含む。いくつかの実施形態では、隣接する逆方向末端反復は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子を保有するプラスミドによってカプシド形成され得る、ＡＡＶ２逆方向末端反復の任意の変異型である。特定の実施形態では、５’隣接逆方向末端反復は、配列番号４４のヌクレオチド１～１３０に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有し；且つ３’隣接逆方向末端反復は、配列番号４４のヌクレオチド４３０７～４４３６に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有する。ウイルスベクターを作り出す（通常、ウイルスベクター形成に必要なＡＡＶ遺伝子を保有する他のプラスミドとともにそのプラスミドを細胞に形質移入することによって）のに使用される伝達プラスミドにおける逆方向末端反復配列の所与の対について（例えば、配列番号４４）、組換え時にＩＴＲが「フリップ」または「フロップ」の配向をとるため、ウイルスベクターにおける対応する配列が変化し得ることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、伝達プラスミドにおけるＩＴＲの配列は、それから調製されたウイルスベクターに見られる配列と必ずしも同じではない。しかしながら、いくつかの非常に特定の実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは配列番号４４のヌクレオチド１～４４３６を含む。

【0115】

本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するための核酸ベクターを産生するのに使用されてもよい伝達プラスミドを表４及び表５に提供する。伝達プラスミド（例えば、核酸ベクターによって送達される、例えば、ＡＡＶによって送達されるＤＮＡ配列を含有するプラスミド）は、ヘルパープラスミド（例えば、ＡＡＶ製造に必要なタンパク質を提供するプラスミド）及びｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質とカプシドシェルに伝達プラスミドＤＮＡ配列を挿入するタンパク質を提供するプラスミド）とともに産生細胞内に同時送達されて、投与用の核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を生成する。ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸ベクター（例えば、核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、及びステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター））は投与前に（例えば、単一の製剤に）組み合わせることができる。

【0116】

重複二重ベクター系における同時処方または同時投与（例えば、同時のまたは逐次の投与）のための核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を生成するのに使用されてもよい伝達プラスミドは表４（配列番号４３及び配列番号４４）に提供されている。

【0117】

【表4-1】

【0118】

【表4-2】

【0119】

【表4-3】

【0120】

【表4-4】

【0121】

【表4-5】

【0122】

【表4-6】

【0123】

【表4-7】

【0124】

【表4-8】

【0125】

【表4-9】

【0126】

【表4-10】

【0127】

トランススプライシング二重ベクター
哺乳類細胞で大きなタンパク質を発現するための第２のアプローチはトランススプライシング二重ベクターの使用を含む。このアプローチでは、別個の核酸配列を含有する２つの核酸ベクターを使用し、目的タンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドとは重複しない。その代わりに、第１の核酸ベクターは、目的タンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’にスプライスドナー配列を含み、且つ第２の核酸ベクターは、目的タンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’にスプライスアクセプター配列を含む。第１及び第２の核酸が同じ細胞内に存在する場合、それらのＩＴＲは連結して、連結されたＩＴＲがスプライスドナーとスプライスアクセプターとの間に配置される単一の核酸構造を形成することができる。その後、転写中にトランススプライシングが発生し、目的タンパク質のＮ末端部分及びＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドが隣接している核酸分子が生成され、それによって完全長コード配列が形成される。

【0128】

本明細書に記載されている方法及び組成物で使用するためのトランススプライシング二重ベクターは、ステレオシリンのコード配列の約半分が各ベクター内に含有されるように設計される（上記で議論したように、例えば、各ベクターはステレオシリンタンパク質の約半分をコードするポリヌクレオチドを含有する）。２つの核酸ベクター間でポリヌクレオチド配列をどのように分割するかの決定は、プロモーターのサイズと、ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＳＴＲＣ遺伝子のエクソン）中の目的の配列要素の位置とに基づいて行われる。トランススプライシング二重ベクター系における第１のベクターは、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’にプロモーター配列を含有することができる。核酸ベクターは任意でＳＴＲＣのＵＴＲ（例えば、５’及び３’の両方のＳＴＲＣのＵＴＲ、例えば、完全長ＵＴＲ）を含有することができる。本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するための１つの例示的なトランススプライシング二重ベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、ヒトのステレオシリンタンパク質のＮ末端部分、例えば、配列番号４のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドと操作可能に連結されているＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）と当該ポリヌクレオチド配列の３’でのスプライスドナー配列とを含有する第１の核酸ベクターと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、ヒトのステレオシリンのＣ末端部分、例えば、配列番号４のＣ末端部分）をコードするポリヌクレオチドの５’でのスプライスアクセプター配列とポリ（Ａ）配列とを含有する第２の核酸ベクターとを含む。代替的なトランススプライシング二重ベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、マウスのステレオシリンタンパク質のＮ末端部分、例えば、配列番号５のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されているＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）と当該ポリヌクレオチド配列の３’でのスプライスドナー配列とを含有する第１の核酸ベクターと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、マウスのステレオシリンのＣ末端部分、例えば、配列番号５のＣ末端部分）をコードするポリヌクレオチドの５’でのスプライスアクセプター配列とポリ（Ａ）配列とを含有する第２の核酸ベクターとを含む。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号２の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号２に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドまたは配列番号３に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。これらの核酸ベクターはまた、第１及び第２の核酸ベクターにてそれぞれ完全長５’及び／または３’ＳＴＲＣのＵＴＲを含有することもできる（例えば、第１の核酸ベクターは、ヒトのステレオシリンをコードする二重ベクター系にて５’ヒトＳＴＲＣのＵＴＲまたはマウスのステレオシリンをコードする二重ベクター系にて５’マウスＵＴＲを含有することができ、第２の核酸ベクターは、ヒトのステレオシリンをコードする二重ベクター系にて３’ヒトＳＴＲＣのＵＴＲまたはマウスのステレオシリンをコードする二重ベクター系にて３’マウスＳＴＲＣのＵＴＲを含有することができる）。ＳＴＲＣのＵＴＲに対応するために、ステレオシリンのコード配列は、プロモーター配列及びステレオシリンのＮ末端部分をコードする配列の長さに対応するような位置で分割することができる。

【0129】

いくつかの実施形態では、ヒトの完全長ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６の配列を有する、または配列番号６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異型である。いくつかの実施形態では、マウスの完全長ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７の配列を有する、または配列番号７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異型である。

【0130】

二重ハイブリッドベクター
哺乳類細胞で大きなタンパク質を発現させるための第３のアプローチは二重ハイブリッドベクターの使用を含む。このアプローチは、相同組換えが起こり得る重複する領域と、スプライスドナー及びスプライスアクセプターの配列との双方を特徴とするという点で、重複二重ベクター戦略及びトランススプライシング戦略の要素を兼ね備えている。二重ハイブリッドベクター系では、重複領域は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の一部ではなく、第１及び第２の核酸ベクターの両方に含有される組換え誘導領域であり、目的のタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドとはこのアプローチでは重複しない。組換え誘導領域は第１の核酸ベクターのスプライスドナー配列の３’であり、第２の核酸ベクターのスプライスアクセプター配列の５’である。次に、第１の核酸配列及び第２の核酸配列が結合して、２つのメカニズム：１）重複領域での組換え、または２）ＩＴＲのコンカテマー化のうちの１つに基づいて単一の配列を形成することができる。残りの組換え誘導領域（複数可）及び／またはコンカテマー化されたＩＴＲは、スプライシングによって除去することができ、目的の完全長タンパク質をコードする隣接したポリヌクレオチド配列の形成をもたらす。本明細書に記載されている組成物及び方法に使用され得る組換え誘導領域、スプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列には当業者に周知のものが含まれる。例示的な組換え誘導領域には、米国特許第１０，４９４，６４５号及び同第８，２３６，５５７号に記載されているようなＦ１ファージＡＫ遺伝子及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子の断片が挙げられ、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は以下の配列を有する：
ＣＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＧＴＡＴＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＡＣＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＣＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＴＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＴＧＴＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡ（配列番号４７）。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は以下の配列を有する：
ＣＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＧＴＡＴＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＧ ＣＴＧＧＴＧＡ（配列番号４８）。

【0132】

いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は以下の配列を有する：
ＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＡＣＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＣＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＴＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＴＧＴＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡ（配列番号４９）。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は以下の配列を有する：
ＣＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＴＴＣ（配列番号５０）。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は以下の配列を有する：
ＣＧＴＡＴＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧ（配列番号５１）。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＡＰ遺伝子断片は以下の配列を有する：
ＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＡＣＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＣＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＴＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＴＧＴＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡ（配列番号５２）。

【0136】

本明細書に記載されている方法及び組成物で使用するための二重ハイブリッドベクターは、ステレオシリンのコード配列の約半分が各ベクター内に含有されるように設計される（例えば、各ベクターはステレオシリンタンパク質の約半分をコードするポリヌクレオチドを含有する）。２つの核酸ベクター間でポリヌクレオチド配列をどのように分割するかの決定は、プロモーターのサイズと、ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＳＴＲＣ遺伝子のエクソン）中の目的の配列要素の位置とに基づいて行われる。トランススプライシング二重ベクター系における第１のベクターは、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’にプロモーター配列を含有することができる。核酸ベクターは任意で、ＳＴＲＣのＵＴＲ（例えば、完全長５’及び３’ＵＴＲ）を含有することができる。

【0137】

１つの例示的な二重ハイブリッドベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、ヒトのステレオシリンタンパク質のＮ末端部分、例えば、配列番号４のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されているＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）と当該ポリヌクレオチド配列の３’でのスプライスドナー配列とスプライスドナー配列の３’での組換え誘導領域とを含有する第１の核酸ベクターと、組換え誘導領域（例えば、第１の核酸ベクターに含まれる同じ組換え誘導領域）と当該組換え誘導領域の３’でのスプライスアクセプター配列とステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、ヒトのステレオシリンのＣ末端部分、例えば、配列番号４のＣ末端部分）をコードするスプライスアクセプター配列の３’でのポリヌクレオチドとポリ（Ａ）配列とを含有する第２の核酸ベクターとを含む。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号２の配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号２に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは、配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドまたは配列番号３に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型である。第１及び第２の核酸ベクターはそれぞれ完全長の５’及び／または３’ＳＴＲＣのＵＴＲを含有することもできる（例えば、ヒトＳＴＲＣの５’ＵＴＲは第１の核酸ベクターに含まれ、ヒトＳＴＲＣの３’ＵＴＲは第２の核酸ベクターに含まれ得る）。別の例示的な二重ハイブリッドベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、マウスのステレオシリンタンパク質のＮ末端部分、例えば、配列番号５のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されているＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）と当該ポリヌクレオチド配列の３’でのスプライスドナー配列とスプライスドナー配列の３’での組換え誘導領域とを含有する第１の核酸ベクターと、組換え誘導領域（例えば、第１のベクターに含まれる同じ組換え誘導領域）と当該組換え誘導領域の３’でのスプライスアクセプター配列とステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、マウスのステレオシリンのＣ末端部分、例えば、配列番号５のＣ末端部分）をコードするスプライスアクセプター配列の３’でのポリヌクレオチドとポリ（Ａ）配列とを含有する第２の核酸ベクターとを含む。第１核酸ベクター及び第２の核酸ベクターはまた、それぞれ完全長の５’及び／または３’ＳＴＲＣのＵＴＲも含有することができる（例えば、マウスＳＴＲＣの５’ＵＴＲは第１の核酸ベクターに含まれ、マウスＳＴＲＣの３’ＵＴＲは第２の核酸ベクターに含まれ得る）。ＳＴＲＣのＵＴＲに対応するために、ステレオシリンのコード配列は、ＳＴＲＣのＵＴＲを含まない二重ハイブリッドベクター系にてとは異なる位置で分割することができる。

【0138】

いくつかの実施形態では、ヒトの完全長ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６の配列を有する、または配列番号６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異型である。いくつかの実施形態では、マウスの完全長ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７の配列を有する、または配列番号７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異型である。

【0139】

本明細書に記載されている方法及び組成物で使用される二重ハイブリッドベクターは任意で、第１及び第２の核酸ベクターの両方にて分解シグナル配列を含むことができる。分解シグナル配列は、組換え及び／またはスプライシングに失敗したポリヌクレオチドからのステレオシリンタンパク質の部分の発現を防止または低減するために含まれ得る。分解シグナル配列は、第１の核酸ベクターでは組換え誘導領域の３’に位置し、第２の核酸ベクターでは組換え誘導領域とスプライスアクセプターの間に位置する。本明細書に記載されている組成物及び方法で使用することができる好適な分解シグナル配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１６／１３９３２１号に記載されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0140】

いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチドに操作可能に連結された、配列番号１のＯＣＭプロモーター（配列番号４５のヌクレオチド２２５～１３６４によっても表される）を含む。特定の実施形態では、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列は配列番号４５のヌクレオチド１３７８～４０７７である。ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列は、発現のために部分的にまたは完全にコドン最適化することができる。いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは配列番号４５のヌクレオチド４０７８～４１６１に対応するスプライスドナー配列を含む。いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは配列番号４５のヌクレオチド４１６８～４４５４に対応するＡＰヘッド配列を含む。特定の実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは、逆方向末端反復によって５’側及び３’側のそれぞれに隣接する配列番号４５のヌクレオチド２２５～４４５４を含む。いくつかの実施形態では、隣接する逆方向末端反復は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子を保有するプラスミドによってカプシド形成され得る、ＡＡＶ２逆方向末端反復の任意の変異型である。特定の実施形態では、５’隣接逆方向末端反復は、配列番号４５のヌクレオチド１～１３０に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有し；且つ３’隣接逆方向末端反復は、配列番号４５のヌクレオチド４５４８～４６７７に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有する。ウイルスベクターを作り出す（通常、ウイルスベクター形成に必要なＡＡＶ遺伝子を保有する他のプラスミドとともにそのプラスミドを細胞に形質移入することによって）のに使用される伝達プラスミドにおける逆方向末端反復配列の所与の対について（例えば、配列番号４５）、組換え時にＩＴＲが「フリップ」または「フロップ」の配向をとるため、ウイルスベクターにおける対応する配列が変化し得ることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、伝達プラスミドにおけるＩＴＲの配列は、それから調製されたウイルスベクターに見られる配列と必ずしも同じではない。しかしながら、いくつかの非常に特定の実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは配列番号４５のヌクレオチド１～４６７７を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは、直後に停止コドンが続くステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列は配列番号４６のヌクレオチド６１５～３３４４である。ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列は、発現のために部分的にまたは完全にコドン最適化することができる。いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは配列番号４６のヌクレオチド５６６～６１４に対応するスプライスアクセプター配列を含む。いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは配列番号４６のヌクレオチド２５７～５４３に対応するＡＰヘッド配列を含む。いくつかの実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは配列番号４６のヌクレオチド３３７６～３５９７に対応するポリ（Ａ）配列を含む。特定の実施形態では、二重ベクター系の第２のメンバーは逆方向末端反復によって５’側及び３’側のそれぞれに隣接する配列番号４６のヌクレオチド２５７～３５９７を含む。いくつかの実施形態では、隣接する逆方向末端反復は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子を保有するプラスミドによってカプシド形成され得る、ＡＡＶ２逆方向末端反復の任意の変異型である。特定の実施形態では、５’隣接逆方向末端反復は、配列番号４６のヌクレオチド１２～１４１に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有し；且つ３’隣接逆方向末端反復は、配列番号４６のヌクレオチド３６８５～３８１４に対応する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列を有する。ウイルスベクターを作り出す（通常、ウイルスベクター形成に必要なＡＡＶ遺伝子を保有する他のプラスミドとともにそのプラスミドを細胞に形質移入することによって）のに使用される伝達プラスミドにおける逆方向末端反復配列の所与の対について（例えば、配列番号４６）、組換え時にＩＴＲが「フリップ」または「フロップ」の配向をとるため、ウイルスベクターにおける対応する配列が変化し得ることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、伝達プラスミドにおけるＩＴＲの配列は、それから調製されたウイルスベクターに見られる配列と必ずしも同じではない。しかしながら、いくつかの非常に特定の実施形態では、二重ベクター系の第１のメンバーは配列番号４６のヌクレオチド１２～３８１４を含む。

【0142】

二重ハイブリッドベクター系における同時処方または同時投与（例えば、同時のまたは逐次の投与）のための核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を産生するのに使用されてもよい伝達プラスミドは表５（配列番号４５及び配列番号４６）に提供されている。

【0143】

【表5-1】

【0144】

【表5-2】

【0145】

【表5-3】

【0146】

【表5-4】

【0147】

【表5-5】

【0148】

【表5-6】

【0149】

【表5-7】

【0150】

【表5-8】

【0151】

重複、トランススプライシング、及び二重ハイブリッドベクターの他の例示的なペアを以下の表６に記載する。

【0152】

【表6】

【0153】

インテイン発現系
哺乳類細胞で大きなタンパク質を発現させるための別の遺伝子治療アプローチはインテインの使用を含む。「タンパク質イントロン」としても知られているインテインは通常、１００～９００アミノ酸残基長であり、且つ隣接するタンパク質断片（「エクステイン」）のＮ末端及びＣ末端の残基の自己切除及び連結が可能であるタンパク質の一部である。インテインは、マキシインテイン、ミニインテイン、及び分割インテインを含む３つの異なるクラスに分けることができる。マキシインテインは、ホーミングエンドヌクレアーゼドメイン（ＨＥＧ）によって中断されたタンパク質のＮ末端及びＣ末端のスプライシング領域を指す。ＨＥＧは、イントロン内の独立した遺伝子として、他のタンパク質とのタンパク質の融合体として、または自己スプライシングインテインとしてコードされるエンドヌクレアーゼのクラスを指す。ＨＥＧは一般に非常に少量を加水分解し、ＤＮＡ領域を選択する。ＨＥＧがＤＮＡの小片を加水分解すると、ＨＥＧをコードする遺伝子は通常、切断部位にそれ自体組み込まれ、それによってその対立遺伝子の頻度を高める。「ミニインテイン」は、ＨＥＧドメインを欠くＮ末端及びＣ末端のスプライシングドメインを指す。「分割インテイン」は、転写され、エクステインと連結される２つの別個のポリペプチドとして翻訳されるインテインを指す。アラニンインテインは、システインまたはセリンの代わりにアラニンのスプライシングジャンクションを有する別のクラスのインテインである。

【0154】

インテインのスプライシングドメインは、２つのサブドメイン、すなわち、Ｎ末端スプライシング領域及びＣ末端スプライシング領域を含有し、これらは、スプライシング活性に介在する保存された残基による保存されたモチーフを含有する。Ｎ末端スプライシング領域はＡ、Ｎ２、Ｂ、Ｎ４の構造モチーフを含有するのに対して、Ｃ末端スプライシング領域はＦ及びＧのモチーフを含有する。Ａモチーフは保存された残基としてＣｙｓ／ＳｅｒまたはＴｈｒを含有し、ＢモチーフはＨｉｓ及びＴｈｒの残基を含有し、ＦモチーフはＡｓｐ及びＨｉｓの残基を含有し、Ｇモチーフは最後から２番目のＨｉｓ及び最後のＡｓｎを含む２つの保存された残基を保有する。Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＨのモチーフは一般に、マキシインテインのＨＥＧドメインに関連する。

【0155】

インテインスプライシングは３つの異なる戦略：１）（ａ）Ｎ末端のスプライスジャンクションのペプチド結合をチオ（エステル）結合に変換する（Ｎ－Ｓ／Ｎ－Ｏ）アシルシフト、（ｂ）分岐した中間体を形成するトランスエステル化反応、（ｃ）Ｃ末端のスプライスジャンクションを切断することによって分岐した中間体を除去するＡｓｎ環化反応、及び（ｄ）アミド結合形成を介して隣接するエクステインセグメントを連結する第２の（Ｓ－Ｎ／Ｏ－Ｎ）アシルシフトを含むクラス１（または古典的／標準的な）インテインスプライシング；２）古典的スプライシング反応の工程（ａ）を迂回するクラス２インテイン（アラニンインテインとも知られる）；ならびに３）２つの分岐中間体の形成を伴うクラス３のメカニズムに分類される。

【0156】

上述の種々のインテインシステムの中でも、従来の遺伝子治療ベクターのサイズ制限（例えば、ＡＡＶ：約５ｋｂの最大サイズ制限）をうまく克服するために、分割インテイントランス－スプライシングのアプローチが実証されている。例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ等，（ＰＮＡＳ，１１０：１５４６１－６（２０１３））は、心筋細胞内のＬ型カルシウムチャネルのα１Ｃサブユニットを２つに分けた半部から再構成するために分割インテインシステムを採用した。同様に、Ｔｒｕｏｎｇ等，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３：６４５０－８（２０１５）には分割インテインシステムを使用したＣａｓ９タンパク質の２つの半部の再構成の成功が示されている。したがって、本開示は、ＯＣＭプロモーターに操作可能に連結されているステレオシリンコード配列をパッケージングし、送達するための分割インテイントランス－スプライシングシステムを提供する。この方法は、それぞれＳＴＲＣ遺伝子の約半分を含有し、Ｎ－インテイン断片またはＣ－インテイン断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む２つの別々のポリヌクレオチドが、２つの別々の発現ベクター（例えば、本明細書に開示されている核酸ベクターのいずれか１つ）から発現され、翻訳後再構成されて完全長のステレオシリンタンパク質を生成することを可能にする。そのようなシステムは、例えば、ｒＡＡＶベクターのような、本明細書に開示されている核酸発現ベクターに組み込まれてもよい。

【0157】

一例では、本開示は、ａ）ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする配列がその３’末端にＮ－インテインをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ヒトのステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４のＮ末端部分）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む第１の核酸ベクターと；ｂ）ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする配列がその５’末端にＣ－インテインをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ヒトのステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、配列番号４のＣ末端部分）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含有する第２のベクターと、を含有する２ベクター分割インテインシステムを提供する。

【0158】

別の例では、本開示は、ａ）ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする配列がその３’末端にＮ－インテインをコードするポリヌクレオチド配列を含む、マウスのステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号５のＮ末端部分）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含有する第１のベクターと；ｂ）ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする配列がその５’末端にＣ－インテインをコードする核酸配列を含む、マウスのステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、配列番号５のＮ末端部分）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含有する第２のベクターと、を含有する２ベクター分割インテインシステムを提供する。

【0159】

いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターの両方はさらに、第１の融合タンパク質（Ｎ－インテインに融合したステレオシリンタンパク質のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドの５’末端及び／または第２の融合タンパク質（Ｃ－インテインに融合したステレオシリンタンパク質のＣ末端部分）をコードするポリヌクレオチドの５’末端に操作可能に連結されたＯＣＭプロモーター配列（例えば、配列番号１～３のいずれか１つのＯＣＭプロモーター配列）のようなプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは配列番号１の配列、または配列番号１に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型を有する。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは配列番号２の配列、または配列番号２に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型を有する。いくつかの実施形態では、ＯＣＭプロモーターは配列番号３の配列、または配列番号３に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する変異型を有する。

【0160】

いくつかの実施形態では、Ｎ－インテイン及びＣ－インテインは同じインテイン又は分割されたインテイン遺伝子に由来する。あるいは、Ｎ－インテイン及びＣ－インテインの配列は、タンパク質トランススプライシングを行って完全長のステレオシリンタンパク質を再構成することができる２つの異なるインテイン遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、同じ遺伝子は同じ生物または異なる生物に由来する。一般的に使用されている分割インテインは種々の生物由来のＤｎａＥ遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ステレオシリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、２つの部分に分割され、各部分は完全長遺伝子の全コード配列の約半分に相当し、すなわち、Ｎ末端部分とＣ末端部分に相当する。ステレオシリンのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドはその３’末端でＮ－インテインをコードするポリヌクレオチドとインフレームで融合されるのに対して、ステレオシリンのＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドはその５’末端でＣ－インテインをコードするポリヌクレオチドとインフレームで融合される。

【0161】

いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターは、細胞（例えば、感音性難聴、例えば、ＤＦＮＢ１６を有する対象のような対象の細胞）に導入されると、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を生成する。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質はそのＣ末端でＮ－インテインと融合したステレオシリンタンパク質のＮ末端部分を含有する。いくつかの実施形態では、第２の融合タンパク質はそのＮ末端でＣ－インテインと融合したステレオシリンタンパク質のＣ末端部分を含有する。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質のＮ－インテインと第２の融合タンパク質のＣ－インテインとが選択的に結合し、Ｎ末端からＣ末端に向かって：ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分と、そのＣ末端にてＣ－インテインに結合したＮ－インテインと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分とを含有する第３の融合タンパク質を生成する。いくつかの実施形態では、Ｃ－インテインに結合したＮ－インテインは、Ｎ－インテイン及びＣ－インテインを切除し、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分のＣ末端とＣ末端部分のＮ末端を連結するトランススプライシング反応を行うことができる。

【0162】

本明細書に記載されている分割インテインシステムは、その後、日常的な方法を使用して操作されて２つの別個のインテイン断片（例えば、分割インテイン）をコードする１つの遺伝子によってコードされる分割インテインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、分割インテインは２つの別個の遺伝子によってコードされる。

【0163】

開示されている組成物及び方法の分割インテインは、例えば、とりわけ、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｅｎｔｒｔｉｆｏｒｍｅ（Ｎｐｕ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３（Ｓｓｐ）、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ ｓｐ．ＰＣＣ９６０５（Ｆｓｐ）、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｃｈｏｉｄｅｓ（Ｓｔｏ）、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＷ＿９＿４７＿５、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ（Ｎｓｐ）、Ｎｏｓｔｏｃ ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｅ（Ｎｆｌ）、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ（Ｃｗａ）ＷＨ８５０２、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ ｃｕｂａｎａ（Ｃｃｕ） ＣＣＡＬＡ０４３、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ（Ｔｅｒ）、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ（Ｒｍａ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃｅ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ（Ｓｃａ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ（Ｓｕｎ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（Ｚｂｉ）、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ（Ｔｐｒ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｕ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ（Ｍｌｅ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｍｓｍ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ（Ｐａｂ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈｏ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｃｂｕ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（Ｃｎｅ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｇａｔｔｉｉ（Ｃｇａ）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ（Ｈｃａ）、及びＰｏｒｐｈｙｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（Ｐｐｕ）のようなシアノバクテリア由来のＤｎａＥ遺伝子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットアルファ）に由来してもよい。いくつかの実施形態では、分割は、望ましい安定性及び活性を持つ分割インテイン（例えば、分割インテインはＣｆａインテインである）を設計するためにコンセンサス設計（例えば、Ｃｆａ）を特定するためのＤｎａＥの複数の配列アライメント研究に由来する。現在開示されている組成物及び方法と共に使用するのに好適な他の分割インテインシステムには、国際特許出願公開番号第ＷＯ２０１７／１３２５８０号、同第ＷＯ２０２０／０７９０３４号、同第ＷＯ２０１８／０７１８６８号、同第ＷＯ２０２０／２４９７２３号、同第ＷＯ２０２１／０９９６０７号、同第ＷＯ２０２１／０４０７０３号、同第ＷＯ２０１３／０４５６３２号、同第ＷＯ２０２０／１４６６２７号、及び同第ＷＯ２０２１／０４７５５８号、ならびに米国特許第１０，０６６，０２７号、同第１０，５２６，４０１号、及び同第８，３９４，６０４号に記載されているものが挙げられ、そのそれぞれが、分割インテインシステムに関するものとして参照によって本明細書に組み込まれる。

【0164】

いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターはさらに、その５’末端にて５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’末端にて３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲはＡＡＶのＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶのＩＴＲはＡＡＶ２のＩＴＲである。

【0165】

いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは：ａ）５’から３’に向かって：ｉ）任意で５’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ）と；ｉｉ）ＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つのＯＣＭプロモーター）を含有するポリヌクレオチドと；ｉｉｉ）ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４または配列番号５のステレオシリンタンパク質のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドと；ｉｖ）Ｎ－インテインをコードするポリヌクレオチドと；ｖ）任意でポリ（Ａ）配列と；ｖｉ）任意で３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲ）と、を含有する第１のベクターと、ｂ）５’から３’に向かって：ｉ）任意で５’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ）と；ｉｉ）ＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つのＯＣＭプロモーター）を含有するポリヌクレオチドと；ｉｉｉ）Ｃ－インテインをコードするポリヌクレオチドと；ｉｖ）ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、配列番号４または配列番号５のＳＴＲＣタンパク質のＣ末端部分）をコードするポリヌクレオチドと；（ｖ）任意でポリ（Ａ）配列と；（ｖｉ）任意で３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲ）とを含有する第２のベクターとを含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号８のアミノ酸配列を有する、または配列番号８に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0167】

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬ（配列番号８）
いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号９のアミノ酸配列を有する、または配列番号９に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0168】

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号９）
いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号１０のアミノ酸配列を有する、または配列番号１０に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0169】

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号１０）
いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号１１のアミノ酸配列を有する、または配列番号１１に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0170】

ＭＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１１）
いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号１２のアミノ酸配列を有する、または配列番号１２に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0171】

ＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＧＥＰＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１２）
いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターと、を含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号１３のアミノ酸配列を有する、または配列番号１３に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0173】

ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号１３）
いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号１４のアミノ酸配列を有する、または配列番号１４に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0174】

ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号１４）
いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターとを含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号１５のアミノ酸配列を有する、または配列番号１５に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0176】

ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号１５）
いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような配列番号１６のアミノ酸配列を有する、または配列番号１６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0177】

ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１６）
いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターとを含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＣＦＳＧＤＴＬＶＡＬＴＤ（配列番号１７）のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＣＬＡＧＤＴＬＩＴＬＡ（配列番号１８）のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＣＬＱＮＧＴＲＬＬＲ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＣＬＴＧＤＳＱＶＬＴＲ（配列番号２０）のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＣＬＴＹＥＴＥＩＭＴＶ（配列番号２１）のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＣＬＳＧＮＴＫＶＲＦＲＹ（配列番号２２）のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、配列番号１７～２２に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＧＶＦＶＨＮ（配列番号２３）のアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＧＬＬＶＨＮ（配列番号２４）のアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＧＬＩＡＳＮ（配列番号２５）のアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、ＧＬＶＶＨＮ（配列番号２６）のアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、配列番号２３～２６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0180】

いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターとを含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、本開示の２ベクター分割インテインシステムは、以下に示すような表７に記載されているＮ－インテイン及びＣ－インテインのペアをコードする１以上のポリヌクレオチド、または表７に記載されているＮ－インテイン及びＣ－インテインのペアに対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するＮ－インテイン及びＣ－インテインのペアをコードする１以上のポリヌクレオチドをまとめて含む。いくつかの実施形態では、２ベクター分割インテインシステムは、表７に列挙されるアミノ酸配列を有するＮ－インテインペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドの３’に位置する）を含む第１のベクターと、Ｎ－インテインのアミノ酸配列として表７の行に列挙されるアミノ酸配列を有するＣ－インテインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドの５’に位置する）を含む第２のベクターと、を含む。

【0182】

【表7】

【0183】

配列番号２７のＮｐｕ Ｎ－インテインは、以下に示すような配列番号４１のＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
ＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣ（配列番号４１）
配列番号２８のＮｐｕ Ｃ－インテインは、以下に示すような配列番号４２のＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。

【0184】

ＡＴＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴ（配列番号４２）
本開示の分割インテイン（すなわち、Ｎ－インテイン及びＣ－インテイン）は、トランススプライシング反応を行うことができるそのＮ末端またはＣ末端にまたはその近傍に求核性アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、求核性アミノ酸はセリン、スレオニン、システインまたはアラニンから選択される。

【0185】

いくつかの実施形態では、第１のベクター及び／または第２のベクターはさらに、例えば、とりわけ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、エンハンサー配列、ポリ（Ａ）配列、ターミネーター配列、または分解シグナルのような１以上の追加の調節配列を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている分割インテインシステムは、リガンド（例えば４－ヒドロキシタモキシフェン、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ヌクレオチド等のような小分子）との接触時にタンパク質スプライシングを行うリガンド依存性のインテインを含む。種々のリガンド依存性のインテインは、米国特許出願公開第２０１４／００６５７１１号に記載されており、その開示はリガンド依存性のインテインに関して参照によって本明細書に組み込まれる。

【0187】

本開示は、ユビキチン－プロテアソーム系及び／またはオートファジー－リソソーム経路によるタンパク質分解に介在する、インテイン（例えば、Ｎ－インテインまたはＣ－インテイン）ポリペプチド（複数可）内に１以上の分解シグナルを含有するベクターを提供する。そのような配列を本開示のベクター系に組み込んで、標的細胞内での切除されたインテインタンパク質の蓄積を回避または低減してもよい。例示的な分解シグナルには、Ｎ－デグロン及びＣ－デグロンが含まれ、これらは、ポリユビキチン化し、その後分解を標的とすることができるリジン残基を含有するモチーフを含有するペプチド配列である。いくつかの実施形態では、デグロンは、タンパク質配列のＮ末端にもＣ末端にも存在しないタンパク質配列（例えばインテイン配列）内に位置する分解シグナルである。いくつかの実施形態では、Ｎ－インテインタンパク質は１以上の（例えば２、３、４、５またはそれ以上の）デグロンを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ－インテインタンパク質は１以上の（例えば２、３、４、５またはそれ以上の）デグロンを含む。いくつかの実施形態では、デグロンはＣＬ１デグロンであり、これは、誤って折り畳まれたタンパク質と構造類似性を共有し、且つユビキチン化系によって認識されるＣ末端不安定化ペプチドである。いくつかの実施形態では、デグロンはＰＢ２９、ＳＭＮ、ＣＩＩＴＡまたはＯＤＣのデグロンである。そのような分解シグナルは、国際公開第ＷＯ２０１６／１３９３２号に記載されており、これは、分解シグナルに関するものとして参照によって本明細書に組み込まれる。分解シグナルの別の例には、ＷＯ２０２０／０７９０３４（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているようなＥ．ｃｏｌｉのジヒドロ葉酸還元酵素（ｅｃＤＨＦＲ）由来のデグロンが挙げられる。追加の分解シグナルには、ＦＫＢＰ１２分解ドメイン（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ等，Ｃｅｌｌ，１２６：９９５－１００４，２００６）、ＰＥＳＴ分解ドメイン（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ及びＲｏｇｅｒｓ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２１：２６７－２７１，１９９６）、ＵｂＲ タグユビキチン化シグナル（Ｃｈａｓｓｉｎ等，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：２０１３，２０１９）、及びヒトＥＬＲＢＤの不安定化突然変異（Ｍｉｙａｚａｋｉ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４：３９４２－３９４５，２０１２）が挙げられる。

【0188】

ステレオシリンの発現のためのベクター
高速の転写及び翻訳を達成することに加えて、哺乳類細胞での外来性遺伝子の安定した発現は、その遺伝子を含有するポリヌクレオチドを哺乳類細胞の核ゲノムに組み込むことによって達成することができる。ステレオシリンをコードするポリヌクレオチドを哺乳類細胞の核ＤＮＡに送達し、組み込むための種々のベクターが開発されてきた。発現ベクターの例は、例えば、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，マーブルヘッド，マサチューセッツ州，２００６）に記載されている。本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するための発現ベクターは、ステレオシリンタンパク質の一部（例えば、配列番号４または配列番号５の一部）をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結されたＯＣＭプロモーター（例えば、表３に挙げたプロモーター配列のいずれか１つ（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチド）、と同様に、例えば、これらの作用物質の発現及び／またはこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳類細胞ゲノムへの組み込みに使用される追加の配列要素を含有する。ステレオシリンタンパク質の一部をコードする導入遺伝子に操作可能に連結されたＯＣＭ特異的プロモーターを含有することができるベクターには、プラスミド（例えば、細胞内で自律的に複製できる環状ＤＮＡ分子）、コスミド（例えば、ｐＷＥベクターまたはｓＣｏｓベクター）、人工染色体（例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、及びウイルスベクターが挙げられる。ステレオシリンの発現に使用できる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するエンハンサー領域のような調節配列を含有するプラスミドが挙げられる。ステレオシリンタンパク質の発現に有用な他のベクターは、この遺伝子の翻訳速度を高める、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を向上させるポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列要素には、例えば、発現ベクターが保有する遺伝子の効率的な転写を指示するための、５’及び３’非翻訳領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載されている組成物及び方法での使用に好適な発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドも含有してもよい。好適なマーカーの例には、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオスリシンのような抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。

【0189】

ポリヌクレオチド送達用のウイルスベクター
ウイルスゲノムは、ＳＴＲＣを標的細胞（例えば、ヒト細胞のような哺乳類細胞）のゲノムに効率的に送達するために使用することができるベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、そのようなゲノム内に含有されるポリヌクレオチドが通常、一般化された形質導入または特殊な形質導入によって哺乳類細胞の核ゲノムに組み込まれるので、遺伝子送達のための特に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として発生し、遺伝子の組み込みを誘導するためにタンパク質や試薬を追加する必要がない。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例には：トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳類Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，フィラデルフィア，１９９６））。他の例としては、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン－ファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号に記載されており、その開示は、それが遺伝子治療で使用するためのウイルスベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。

【0190】

ポリヌクレオチド送達用のＡＡＶベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている組成物及び方法のポリヌクレオチドは、細胞へのそれらの導入を促進するためにｒＡＡＶベクター及び／またはｒＡＡＶウイルス粒子に組み込まれる。本明細書に記載されている組成物及び方法で有用なｒＡＡＶベクターは、（１）本明細書に記載されているＯＣＭプロモーター（例えば、表３に挙げたプロモーター配列のいずれか１つ（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性））を有するポリヌクレオチド）と、（２）発現される異種配列（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分またはＣ末端部分をコードするポリヌクレオチド）と、（３）異種遺伝子の組み込み及び発現を促進するウイルス配列とを含む組み換えポリヌクレオチド構築物である。ウイルス配列は、ＤＮＡの複製及びウイルス粒子へのパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされるＡＡＶの配列を含んでもよい。典型的な応用では、導入遺伝子は、難聴または聴覚障害と関連する突然変異（例えば、ＤＦＮＢ１６）を保有する対象にて聴力を改善するのに有用であってもよい遺伝性難聴の形態での対象にて変異しているタンパク質（例えば、ステレオシリン）の野生型形態をコードする。そのようなｒＡＡＶベクターはまた、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含有してもよい。有用なｒＡＡＶベクターでは、１以上のＡＡＶのＷＴ遺伝子の全体または一部が欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列は保持されている。ＡＡＶのＩＴＲは特定の応用に好適な任意の血清型であってもよい。本明細書に記載されている方法及び組成物で使用するために、ＩＴＲはＡＡＶ２のＩＴＲであり得る。ｒＡＡＶベクターの使用方法は、例えば、Ｔａｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９（２０００）、及びＭｏｎａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７：２４（２０００）に記載されており、それらの各開示は、それらが遺伝子送達用のＡＡＶベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。

【0191】

本明細書に記載されているポリヌクレオチド及びベクター（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分、またはいくつかの実施形態ではＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたＯＣＭプロモーター）は、ポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入を容易にするために、ｒＡＡＶウイルス粒子に組み込むことができる。ＡＡＶのカプシドタンパク質はウイルス粒子の外部の非核酸部分を構成し、ＡＡＶキャップ遺伝子によってコードされる。ｃＡＰ遺伝子は、ウイルス粒子アセンブリに必要な３つのウイルスコートタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶウイルス粒子の構築は、例えば、ＵＳ５，１７３，４１４；ＵＳ５，１３９，９４１；ＵＳ５，８６３，５４１；ＵＳ５，８６９，３０５；ＵＳ６，０５７，１５２；及びＵＳ６，３７６，２３７；ならびにＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１（２００２）及びＢｏｗｌｅｓ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３（２００３）に記載されており、それらの各開示は、それらが遺伝子送達用のＡＡＶベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。

【0192】

本明細書に記載されている組成物及び方法と組み合わせて有用なｒＡＡＶウイルス粒子としては、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、及びＰＨＰ．Ｓを含む様々なＡＡＶ血清型に由来するウイルス粒子が挙げられる。有毛細胞を標的とする場合、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／９、７ｍ８、及びＰＨＰ．Ｂが特に有用であり得る。網膜の形質導入のために進化させた血清型もまた、本明細書に記載されている方法及び組成物において使用されてもよい。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ等，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９（２０００）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：３４２８（２０００）；Ｘｉａｏ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４（１９９８）；Ｈａｌｂｅｒｔ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）；Ｈａｌｂｅｒｔ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５（２００１）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ等，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されており、それらの各開示は、それらが遺伝子送達用のＡＡＶベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。

【0193】

本明細書に記載されている組成物及び方法と併せて有用なものは偽型ｒＡＡＶベクターである。偽型ベクターには、所与の血清型（例えば、ＡＡＶ９）のＡＡＶベクターが、所与の血清型以外の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８など）に由来するカプシド遺伝子で偽型化されたものが含まれる。偽型ｒＡＡＶウイルス粒子の構築及び使用を含む技術は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｄｕａｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７６６２（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ等，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されている。

【0194】

ウイルス粒子のカプシド内に変異を有するＡＡＶウイルス粒子を使用して、変異していないカプシドウイルス粒子よりも効果的に特定の細胞型に感染させ得る。例えば、適切なＡＡＶ変異型は、ＡＡＶを特定の細胞型に標的化することを容易にするためのリガンド挿入変異を有し得る。挿入変異型、アラニンスクリーニング変異型、及びエピトープタグ変異型を含むＡＡＶカプシド変異型の構築及び特徴決定は、Ｗｕ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５（２０００）に記載されている。本明細書に記載されている方法で使用することができる他のｒＡＡＶウイルス粒子としては、ウイルスの分子育種によって、及びエクソンシャッフリングによって生成されるカプシドハイブリッドが挙げられる。例えば、Ｓｏｏｎｇ等，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３６（２０００）及びＫｏｌｍａｎ及びＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４２３（２００１）を参照されたい。

【0195】

医薬組成物
本明細書に記載されている核酸ベクターは、感音性難聴を患っているヒト患者のような患者に投与するための媒体内に組み込まれてもよい。ステレオシリンタンパク質の一部をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターのようなベクターを含有する医薬組成物は、当該技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。例えば、そのような組成物は、例えば、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｅｄ．（２０１３）；参照によって本明細書に組み込まれる）を使用して、所望の形態、例えば、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。

【0196】

本明細書に記載されている核酸ベクター（例えば、ウイルスベクター）の混合物は、１以上の賦形剤、担体、または希釈剤と好適に混合された水中で調製されてもよい。分散系もまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、及び油中で調製されてもよい。これらの製剤は、通常の保存条件下及び使用条件下で、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有してもよい。注射用途に好適な医薬形態として、注射可能な無菌溶液または無菌分散液を即時調製するための無菌水溶液または無菌分散液及び無菌粉末が挙げられる（ＵＳ５，４６６，４６８に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される）。任意の場合において、製剤は、無菌であってもよく、容易に注射できる程度の流動性を有していてもよい。製剤は、製造及び保管条件下で安定であってもよく、細菌及び真菌のような微生物の混入作用から保護され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、及び／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散系の場合には必要とされる粒度の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持されてもよい。微生物の作用の抑制は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらされ得る。

【0197】

例えば、本明細書に記載されている医薬組成物を含有する溶液は、必要に応じて好適に緩衝化され、液体希釈液は先ず十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与に特に好適である。これに関して、採用することができる無菌水性媒体は本開示に照らして当業者に知られているであろう。例えば、１用量を１ｍｌのＮａＣｌ等張液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注射液に加えるか、または注入予定部位に注射してもよい。治療する対象の状態に応じて、用量にはいくらかの変動が必然的に生じる。内耳への局所投与のために、組成物を、合成外リンパ溶液を含有するように製剤化してもよい。例示的な合成外リンパ溶液は、２０～２００ｍＭのＮａＣｌ、１～５ｍＭのＫＣｌ、０．１～１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１～１０ｍＭのグルコース、及び２～５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有し、約６と９の間のｐＨ、及び約３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いずれにしても、投与を担当する者が個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、製剤は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たしていてもよい。

【0198】

治療方法
本明細書に記載されている組成物は、感音性難聴を有する、または感音性難聴を発症するリスクがある対象に、内耳への局所投与（例えば、外リンパまたは内リンパへの投与、例えば、卵円窓、正円窓、または半規管（水平半規管）へのまたはそれを介した，あるいは経鼓膜注入または鼓室内注入による投与、例えば、ＯＨＣへの投与）、静脈内、非経口、皮内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、灌流、洗浄、及び経口での投与のような種々の経路によって投与されてもよい。所与の場合における投与に最も好適な経路は、投与される特定の組成物、患者、医薬製剤化方法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、患者の年齢、体重、性別、治療される疾患の重症度、患者の食事、及び患者の排泄率に依存するであろう。組成物は１回、または２回以上（例えば、年１回、年２回、年３回、隔月、または毎月）投与されてもよい。いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターは、同時に（例えば、１つの組成物にて）投与される。いくつかの実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターは順次投与される（例えば、第２の核酸ベクターは、第１の核酸ベクターの直後、または第１の核酸ベクターから５分後、１０分後、１５分後、２０分後、２５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、８時間後、１２時間後、１日後、２日後、７日後、２週間後、１ヵ月後、またはそれ以上後に投与される）。第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターは同じカプシドまたは異なるカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）を有することができる。

【0199】

本明細書に記載されているように治療されてもよい対象は、感音性難聴を有する、またはそれを発症するリスクがある対象である。本明細書に記載されている組成物及び方法は、ＳＴＲＣに突然変異（例えば、ＳＴＲＣの機能もしくは発現を低下させる突然変異、もしくはＤＦＮＢ１６を有する対象のような感音性難聴に関連するＳＴＲＣ突然変異）を有する対象、常染色体劣性感音性難聴もしくは聴覚障害の家族歴（例えば、ＳＴＲＣ関連の難聴の家族歴）を有する対象、またはＳＴＲＣの変異状態及び／またはＳＴＲＣの活性レベルが不明である対象を治療するのに使用することができる。本明細書に記載されている方法は、本明細書に記載されている組成物による治療または組成物の投与の前に、ＳＴＲＣでの突然変異について対象をスクリーニングする工程を含んでもよい。当業者に既知の標準的な方法（例えば、遺伝子検査）を使用して、対象をＳＴＲＣの突然変異についてスクリーニングすることができる。本明細書に記載されている方法はまた、本明細書に記載されている組成物による治療または組成物の投与の前に対象にて聴覚を評価する工程を含んでもよい。聴力検査、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、及び耳音響放射のような標準的な検査を使用して聴力を評価することができる。本明細書に記載されている組成物及び方法はまた、難聴または聴覚神経障害を発症するリスクのある患者、例えば、遺伝性難聴の家族歴を有する患者、またはまだ難聴もしくは聴覚障害を示していないＳＴＲＣ突然変異を保有する患者への予防的治療として投与されてもよい。

【0200】

治療は、種々の単位用量で本明細書に記載されている核酸ベクター（例えば、ＡＡＶウイルスベクター）を含有する組成物の投与を含んでもよい。各単位用量は通常、所定の量の治療用組成物を含有するであろう。投与される量、ならびに特定の投与経路及び製剤化は臨床技術分野の当業者の技術の範囲内である。単位用量は単回注射として投与される必要はないが、設定された期間にわたる持続注入を含んでもよい。投与は、内耳（例えば、蝸牛）への損傷を最小限に抑えるために、シリンジポンプを使用して実施して注入速度を制御してもよい。核酸ベクターがＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、またはＰＨＰ．Ｓベクター）である場合、ウイルスベクターは、例えば、約１×１０^９ベクターゲノム（ＶＧ）／ｍＬ～約１×１０^１６ＶＧ／ｍＬ（例えば、１×１０^９ＶＧ／ｍＬ、２×１０^９ＶＧ／ｍＬ、３×１０^９ＶＧ／ｍＬ、４×１０^９ＶＧ／ｍＬ、５×１０^９ＶＧ／ｍＬ、６×１０^９ＶＧ／ｍＬ、７×１０^９ＶＧ／ｍＬ、８×１０^９ＶＧ／ｍＬ、９×１０^９ＶＧ／ｍＬ、１×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、２×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、３×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、４×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、５×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、６×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、７×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、８×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、９×１０^１０ＶＧ／ｍＬ、１×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、２×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、３×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、４×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、５×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、６×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、７×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、８×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、９×１０^１１ＶＧ／ｍＬ、１×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、２×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、３×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、４×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、５×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、６×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、７×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、８×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、９×１０^１２ＶＧ／ｍＬ、１×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、２×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、３×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、４×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、５×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、６×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、７×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、８×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、９×１０^１３ＶＧ／ｍＬ、１×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、２×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、３×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、４×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、５×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、６×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、７×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、８×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、９×１０^１４ＶＧ／ｍＬ、１×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、２×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、３×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、４×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、５×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、６×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、７×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、８×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、９×１０^１５ＶＧ／ｍＬ、または１×１０^１６ＶＧ／ｍＬ）の用量で１μＬ～２００μＬ（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μＬ）の容量にて患者に投与してもよい。ＡＡＶベクターは、約１×１０^７ＶＧ／耳～約２×１０^１５ＶＧ／耳（例えば、１×１０^７ＶＧ／耳、２×１０^７ＶＧ／耳、３×１０^７ＶＧ／耳、４×１０^７ＶＧ／耳、５×１０^７ＶＧ／耳、６×１０^７ＶＧ／耳、７×１０^７ＶＧ／耳、８×１０^７ＶＧ／耳、９×１０^７ＶＧ／耳、１×１０^８ＶＧ／耳、２×１０^８ＶＧ／耳、３×１０^８ＶＧ／耳、４×１０^８ＶＧ／耳、５×１０^８ＶＧ／耳、６×１０^８ＶＧ／耳、７×１０^８ＶＧ／耳、８×１０^８ＶＧ／耳、９×１０^８ＶＧ／耳、１×１０^９ＶＧ／耳、２×１０^９ＶＧ／耳、３×１０^９ＶＧ／耳、４×１０^９ＶＧ／耳、５×１０^９ＶＧ／耳、６×１０^９ＶＧ／耳、７×１０^９ＶＧ／耳、８×１０^９ＶＧ／耳、９×１０^９ＶＧ／耳、１×１０^１０ＶＧ／耳、２×１０^１０ＶＧ／耳、３×１０^１０ＶＧ／耳、４×１０^１０ＶＧ／耳、５×１０^１０ＶＧ／耳、６×１０^１０ＶＧ／耳、７×１０^１０ＶＧ／耳、８×１０^１０ＶＧ／耳、９×１０^１０ＶＧ／耳、１×１０^１１ＶＧ／耳、２×１０^１１ＶＧ／耳、３×１０^１１ＶＧ／耳、４×１０^１１ＶＧ／耳、５×１０^１１ＶＧ／耳、６×１０^１１ＶＧ／耳、７×１０^１１ＶＧ／耳、８×１０^１１ＶＧ／耳、９×１０^１１ＶＧ／耳、１×１０^１２ＶＧ／耳、２×１０^１２ＶＧ／耳、３×１０^１２ＶＧ／耳、４×１０^１２ＶＧ／耳、５×１０^１２ＶＧ／耳、６×１０^１２ＶＧ／耳、７×１０^１２ＶＧ／耳、８×１０^１２ＶＧ／耳、９×１０^１２ＶＧ／耳、１×１０^１３ＶＧ／耳、２×１０^１３ＶＧ／耳、３×１０^１３ＶＧ／耳、４×１０^１３ＶＧ／耳、５×１０^１３ＶＧ／耳、６×１０^１３ＶＧ／耳、７×１０^１３ＶＧ／耳、８×１０^１３ＶＧ／耳、９×１０^１３ＶＧ／耳、１×１０^１４ＶＧ／耳、２×１０^１４ＶＧ／耳、３×１０^１４ＶＧ／耳、４×１０^１４ＶＧ／耳、５×１０^１４ＶＧ／耳、６×１０^１４ＶＧ／耳、７×１０^１４ＶＧ／耳、８×１０^１４ＶＧ／耳、９×１０^１４ ＶＧ／耳、１×１０^１５ＶＧ／耳、または２×１０^１５ ＶＧ／耳）の用量で対象に投与されてもよい。

【0201】

本明細書に記載されている組成物は、聴力を改善する、ステレオシリンタンパク質（例えば、配列番号４または５の配列を有するステレオリシンタンパク質などの、ＷＴステレオシリンタンパク質、例えば、蝸牛有毛細胞、例えば、外有毛細胞における発現）の発現を増やす、ステレオシリン機能を高める、ＯＨＣ構造を改善する、ＯＨＣ機能を改善する、ＯＨＣの損傷または死滅を防止するもしくは減らす、蓋膜へのＯＨＣ毛束の付着を改善する、またはＯＨＣの生存率を改善するのに十分な量で投与される。聴力は、標準的な聴力検査（例えば、聴力検査、ＡＢＲ、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、及び耳音響放射）を使用して評価されてもよく、治療前に得られた聴力測定と比較して５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％以上）改善されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は対象の発話を理解する能力を改善するのに十分な量で投与される。本明細書に記載されている組成物はまた、感音性難聴（例えば、難聴に関連するＳＴＲＣ遺伝子の遺伝子変異を保有する、または難聴の家族歴（例えば、常染色体劣性難聴）を有するが、聴覚障害を示さない対象、または軽度から中等度の難聴を示す対象にて）の発症または進行を遅らせる、または防止するのに十分な量で投与されてもよい。ステレオシリンの発現は、免疫組織化学、ウェスタンブロット分析、定量的リアルタイムＰＣＲ、またはタンパク質もしくはｍＲＮＡを検出するための当該技術分野で既知の他の方法を使用して評価されてもよく、本明細書に記載されている組成物の投与前のステレオシリンの発現と比べて５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％またはそれ以上）増えてもよい。ＯＨＣの機能、または対象に投与される核酸ベクターによってコードされるステレオシリンタンパク質の機能は、聴力検査に基づいて間接的に評価されてもよく、またそれらは、本明細書に記載されている組成物の投与前のＯＨＣの機能、またはタンパク質の機能と比べて５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％またはそれ以上）向上してもよい。これらの効果は、本明細書に記載されている組成物の投与後、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間以内、またはそれ以上の間に生じてもよい。治療に使用される用量及び投与経路に応じて、組成物を投与してから、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月後またはそれ以上後に患者を評価してもよい。評価の結果に応じて、患者は追加の治療を受けてもよい。

【0202】

キット
本明細書に記載されている組成物は、例えば、ＳＴＲＣ遺伝子の突然変異に関連する感音性難聴のような感音性難聴がある対象を治療するのに使用するためのキットで提供することができる。組成物は、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結された、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、表３に列挙されるＯＣＭプロモーター配列のいずれか１つ（例えば、配列番号１～３のいずれか１つ）と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチドと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチド）と、そのようなポリヌクレオチドを含有する核酸ベクター系（例えば、本明細書に記載されている２ベクター系）とを含んでもよい。核酸ベクターは、ＡＡＶウイルスカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／９、７ｍ８、またはＰＨＰ．Ｂ）にパッケージングされてもよい。キットはさらに、キットのユーザー、例えば、医師に、本明細書に記載されている方法を実施するように指示する添付文書を含むことができる。キットには、場合により、組成物を投与するための注射器または他の器具を含ませてもよい。

【0203】

実施例
以下の実施例は、本明細書に記載されている組成物及び方法をどのように使用し、製造し、評価し得るかについての説明を当業者に提供するために提示し、純粋に本開示を例示することを意図するものであり、発明者らが自身の開示と見なすものの範囲を限定することを意図しない。

【0204】

実施例１：ＯＣＭプロモーター配列は生体内でマウスの蝸牛におけるＯＨＣにて導入遺伝子の発現を誘導する。
生体内でＯＨＣにて導入遺伝子を誘導することにおける構築されたＯＣＭプロモーター（配列番号１）の有効性を判定するために、マウス蝸牛に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＡＡＶベクターまたはＯＣＭプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＡＡＶベクターのいずれかで形質導入した。具体的には、ＡＡＶ－ＯＣＭ－ＧＦＰウイルスを、後半規管を介して２日齢のＣＢＡ／ＣａＪマウスに片耳あたり７．７Ｅ＋９ベクターゲノムの用量で注入した。マウスを手術から回復させ、１９日後に安楽死させ、１０％中性緩衝ホルマリンで灌流した。内耳側頭骨を採取し、８％ＥＤＴＡ中で３日間脱灰した。脱灰した側頭骨から蝸牛を取り出し、有毛細胞すべてを標識するミオシン７ａ（Ｍｙｏ７ａ）抗体で免疫染色し、共焦点画像解析のためにスライドに載せた。ネイティブのＧＦＰ蛍光を示す。ユビキタスプロモーターを使用して、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰは内有毛細胞、外有毛細胞、らせん神経節ニューロン、間葉細胞、及びグリアを含む蝸牛内の多くの細胞型でＧＦＰ発現を誘導した（図１Ａ）。外有毛細胞特異的プロモーターを使用して、ＡＡＶ－ＯＣＭ（配列番号１）－ＧＦＰは外有毛細胞でのみＧＦＰ発現を誘導した（図１Ｂ）。

【0205】

実施例２．ＯＣＭプロモーター駆動のＧＦＰ発現は非ヒト霊長類のコルチ器にて外有毛細胞で高められる。
非ヒト霊長類にて生体内での配列番号１のＯＣＭプロモーターの特異性を調べるために、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の耳に、配列番号１のＯＣＭプロモーターに操作可能に連結された、核を標的とするＨ２Ｂ－ｅＧＦＰを含むＡＡＶベクターを注射した。成獣非ヒト霊長類に、正円窓膜、手順の間での外リンパの流出を可能にする外側半規管の開窓を介して配列番号１のＯＣＭプロモーターの制御下でＨ２Ｂ－ｅＧＦＰを発現するＡＡＶベクターについて４０μｌのベクター（３．４１×１０^１３／ｍｌ）を注入した。

【0206】

生後４週間で、動物を屠殺し、１０％のＮＢＦ中で心灌流を介して固定した後、それらの側頭骨を採取し、１０％のＮＢＦ中でさらに４～１０日間保持した。耳をギ酸（Ｉｍｍｕｎｏｃａｌ）中で６日間脱灰し、パラフィンに埋め込み、５μｍ切片に切断した。

【0207】

切片をＧＦＰに対する抗体で標識し、アルカリホスファターゼと結合した二次抗体で染色し、高速赤色染料と二次抗体のアルカリホスファターゼとの反応によって赤色の色染色を発色させた。切片を青色のヘマトキシリンで対比染色して、すべての核を視覚化し、２０倍の倍率にてカラーカメラで撮像して、グレースケールに変換した（図２Ａ～図２Ｂ、上の画像（それぞれパネルＡ及びＢ）。図２Ａは第１の動物からの単一のパラフィン切片の顕微鏡写真であり、図２Ｂは第２の動物からの単一のパラフィン切片の顕微鏡写真である）。色付き抗ＧＦＰ染色の赤色シグナルを視覚化するために、選択した色ツールを利用する画像処理ソフトウェアＧＩＭＰを使用して、カラー画像からすべての青色（ヘマトキシリン）の色を抽出し、その後グレースケールに変換した。赤色シグナルの核Ｈ２Ｂ－ＧＦＰを持つ核のみが見えたままであった（図２Ａ～図２Ｂ、下の画像（それぞれパネルＡ’及びＢ’））。スケールは１００μｍを示す。内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）は配向のために強調表示されている。

【0208】

実施例３．Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃ重複二重ベクター系はステレオシリン欠損マウスにて聴覚を救済した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用して、ＳＴＲＣの塩基対位置２３２でフレームシフトを作り出すことによって、ＣＢＡ／ＣａＪ背景系統にてステレオシリン欠損マウスを生成した。ＣＢＡ／ＣａＪ背景系統の野生型動物は、外有毛細胞（ＯＨＣ）の不動毛の先端部で明確なステレオシリン抗体染色を示した（図３Ａ、下パネル）一方で、塩基対２３２のＳｔｒｃ－ＫＯ動物は抗体のシグナルを欠いた（図３Ｂ、下パネル）。マウスＳＴＲＣを二重Ａｎｃ８０ベクターにて被包し、その際、第１のベクターはＣＭＶプロモーターとマウスＳＴＲＣのｃＤＮＡヌクレオチド１～３２００とを保有し、第２のベクターはアミノ酸２２０１～５４３０を保有し、完全長ｃＤＮＡの２つの半部間に１０００塩基対の重複を生じた。生後早期の塩基対２３２のＳｔｒｃ－ＫＯマウスの蝸牛に、両ベクターを１Ｅ１０ｖｇ／耳の濃度で後三半規管を介して送達した後、処理した塩基対２３２のＳｔｒｃ－ＫＯマウスでは、ＯＨＣの先端及びコルチ器の内有毛細胞の本体にて、新たなステレオシリンタンパク質の発現が観察された（図３Ｃ、下パネル）。Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃ（重複）による処理の４週間後に、ＯＨＣ機能の直接的な指標として歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を評価し、無傷の上行性聴覚経路の指標として聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を測定した。塩基対２３２のＳｔｒｃ－ＫＯ動物における未処理の反対側耳（「未処理耳」）は、ＤＰＯＡＥがほぼ存在せず、ＯＨＣ機能の喪失を示すＡＢＲ閾値が非常に高いことを（図４Ａ～４Ｂ、白丸）示した一方で、処理された塩基対２３２のＳｔｒｃ－ＫＯ動物（「処理耳」）は聴力閾値の回復を示した（図４Ａ～４Ｂ、黒丸）。処理した塩基対２３２のＳｔｒｃ－ＫＯ動物の最良の応答者（図４Ａ～図４Ｂ、黒四角）は野生型（「ＣＢＡ／ＣａＪ」）（図４Ａ～図４Ｂ、三角）の聴力閾値に近いことを示した。ＡＡＶ－Ａｎｃ８０－ＣＭＶ－ｍＳｔｒｃによる処理の後にステレオシリンを発現する塩基対２３２のＳｔｒｃ－ＫＯマウスのＯＨＣの高い割合が聴力回復を促進することが見いだされた（図４Ｃ）。

【0209】

実施例４．２ベクター分割インテインシステムは試験管内で完全長ステレオシリンを再構成した。
実験的なプラスミドを生成するために、ステレオシリンのアミノ酸１～７４６をコードするＤＮＡ（「Ｎ－Ｓｔｒｃ」）を、Ｎｐｕ Ｎ－インテイン断片（配列番号２７のＮｐｕ Ｎ－インテインをコードする配列番号４１）と遺伝子融合させ、構成的に活性があるＣＭＶプロモーターを含有するプラスミドにクローニングしてＣＭＶ．Ｎ－Ｓｔｒｃ－Ｎ－Ｎｐｕを生成した。ステレオシリンのアミノ酸７４７～１８０９をコードするＤＮＡ（「Ｃ－Ｓｔｒｃ」）を、Ｎｐｕ Ｃ－インテイン断片（配列番号２８のＮｐｕ Ｃ－インテインをコードする配列番号４２）の下流で遺伝子融合させ、ＣＭＶプロモーターを含有するプラスミドにクローニングしてＣＭＶ．Ｃ－Ｎｐｕ－Ｃ－Ｓｔｒｃを生成した。対照として、完全長ステレオシリンコード配列（「ＦＬ－Ｓｔｒｃ」）もＣＭＶプラスミドにクローニングし、ＣＭＶ．ＦＬ－Ｓｔｒｃを生成した。陰性対照としてＣＭＶ．ＧＦＰを使用した。

【0210】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン３０００キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、対照プラスミドまたはＮ－ＳｔｒｃプラスミドとＣ－Ｓｔｒｃプラスミドとの組み合わせのいずれかで形質移入し、標準的な細胞培養条件下で３日間インキュベートした。細胞培養物をＰＢＳで洗浄し、細胞を溶解してタンパク質を抽出した。タンパク質溶解物の濃度はＢＣＡアッセイを使用して測定し、ベータアクチン及びステレオシリンに対する抗体を使用したウェスタンブロッティングのために一定質量のタンパク質を負荷した。タンパク質バンドの強度のデンシトメーター測定を使用して試料に由来する完全長ステレオシリンの相対量を決定した。

【0211】

図５Ａ～図５Ｂに示すように、調べたインテインの設計により完全長ステレオシリンのバンドが生成された。
実施例５．ＯＣＭプロモーター駆動のステレオシリン発現のためのＡＡＶ二重ベクター系。

【0212】

相同組換えのためにステレオシリンのコード配列の重複を使用するＡＡＶ二重ベクター系を、２つのプラスミドを使用して設計した。第１のプラスミドは、コード配列の最初の３２００ヌクレオチドによってコードされるマウスＳＴＲＣのＮ末端部分に操作可能に連結され、且つ５’及び３’のＩＴＲ配列が隣接する配列番号１のマウスＯＣＭプロモーターを含有した（プラスミドＰ９５９；配列番号４３；図６Ａ）。第２のプラスミド（Ｐ７２４；配列番号４４；図６Ｂ）は、５’から３’の順に、第１のプラスミドによってコードされるＳＴＲＣ配列の５００ヌクレオチドの重複と、それに続くマウスＳＴＲＣの残りのＣ末端部分をコードする２７３０ヌクレオチドと、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のポリアデニル配列とを含有した。第２のプラスミドにおけるこれらの要素にも５’及び３’のＩＴＲ配列が隣接した。

【0213】

ＡＡＶウイルスベクターは、標準的なプロトコールを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｒｅｐ／ｃａｐ含有プラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミドと一緒にこれらのプラスミドの１つで形質移入することによって合成する。標準的な方法を使用してプラスミドをＡＡＶ８血清型ベクターにパッケージングし、市販業者から入手する。細胞培養培地と細胞をその後回収して、ＡＡＶを抽出し、精製する。細胞からのＡＡＶを３サイクルの凍結融解を経て細胞から放出させ、細胞培養培地を採取して分泌されたＡＡＶを得る。ＰＥＧ８０００を溶液に添加することによって細胞培養培地からのＡＡＶを濃縮し、４℃でインキュベートし、遠心分離してＡＡＶ粒子を回収する。全てのＡＡＶをヨードキサノール密度勾配遠心分離に通してＡＡＶ粒子を精製し、精製したＡＡＶと緩衝液を１００ｋＤａの分子量カットオフの遠心分離カラムに通すことによって、緩衝液を０．０１％のプルロニックＦ６８を伴うＰＢＳに交換する。２つのプラスミドのそれぞれから得られたＡＡＶベクターは、マウスの耳に投与（例えば、内耳への局所投与）することによって組み合わせて使用される。

【0214】

ＡＡＶ二重ベクター系の代替的な設計は、５’から３’の順序で５’ＩＴＲ配列と、マウスのステレオシリンのＮ末端部分をコードする２７００ヌクレオチドに操作可能に連結された配列番号１のマウスＯＣＭプロモーターと、ＡＰスプライスドナーと、ＡＰヘッド配列と、３’ＩＴＲ配列とを含有する第１のプラスミド（Ｐ９６０；配列番号４５；図７Ａ）を利用した。この系の第２のプラスミドは、５’から３’の順序で、５’ＩＴＲ配列と、第１のプラスミドにおけるＡＰヘッド配列と相同なＡＰヘッド配列と、ＡＰスプライスアクセプターと、マウスのステレオシリンの残りのＣ末端部分をコードする２７３０ヌクレオチドと、ｂＧＨポリＡ配列と３’ＩＴＲとを含有した（Ｐ７２６；配列番号４６；図７Ｂ）。これら２つのプラスミドの一部を組み込んだＡＡＶウイルスベクターは上記のように合成される。

【0215】

実施例６．感音性難聴がある対象へのステレオシリンのコード配列に操作可能に連結されたＯＣＭプロモーターを含有する２ベクター系を含有する組成物の投与。
本明細書に開示されている方法によれば、当該技術分野の医師は、聴力を改善または回復させるように、感音性難聴（例えば、ＤＦＮＢ１６のようなＳＴＲＣの突然変異に関連する感音性難聴）がある患者、例えば、ヒト患者を治療することができる。この目的のために、当該技術分野の医師は２ベクター核酸発現系を含有する組成物をヒト患者に投与することができ、そのような系は、ＳＴＲＣ導入遺伝子に操作可能に連結されたＯＣＭプロモーター（例えば、配列番号１～３のいずれか１つの配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するポリヌクレオチド）をあわせて含む、２つのＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｑｕａｄ（Ｙ－Ｆ）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／９、７ｍ８、またはＰＨＰ．Ｂベクター）を利用する。

【0216】

２ベクター系は、第１及び第２のＡＡＶベクターを含有する重複二重ベクター系であってもよい。重複二重ベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたＯＣＭプロモーターを含む第１のＡＡＶベクターと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶベクターとを含んでもよく、その際、第１のベクターにおけるステレオシリンのコード配列の３’末端は第２のベクターにおけるステレオシリンのコード配列の５’末端と重複する。別の例では、２ベクター系は、第１及び第２のＡＡＶベクターを含有するトランススプライシング二重ベクター系であってもよい。トランススプライシング二重ベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたＯＣＭプロモーターと当該ポリヌクレオチドの３’でのスプライスドナーシグナル配列とを含む第１のＡＡＶベクターと、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部をコードするポリヌクレオチドの５’でのスプライスアクセプターシグナル配列を含む第２のＡＡＶベクターとを含んでもよい。別の例では、２ベクター系は第１及び第２のＡＡＶベクターを含有する二重ハイブリッドベクター系であってもよい。二重ハイブリッドベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたＯＣＭプロモーターと、当該ポリヌクレオチドの３’でのスプライスドナーシグナル配列と、当該スプライスドナーシグナル配列の３’での第１の組換え誘導領域とを含む第１のＡＡＶベクターと、第２の組換え誘導領域と、当該組換え誘導領域の３’でのスプライスアクセプターシグナル配列と、当該スプライスアクセプターシグナル配列の３’のステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドと、を含む第２のＡＡＶベクターとを含んでもよい。さらに別の例では、２ベクター系は第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを含む分割インテイントランススプライシングシステムであってもよい。分割インテイントランススプライシング２ベクター系は、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、配列番号４のＮ末端部分）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたＯＣＭプロモーターと、その３’のＮ末端インテイン（Ｎ－インテイン）をコードするポリヌクレオチドとを含む第１のＡＡＶベクターと、Ｃ末端インテイン（Ｃ－インテイン）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたＯＣＭプロモーターと、その３’のステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドと、を含む第２のＡＡＶベクターと、を含んでもよい。前述の２ベクター系はさらに、例えば、エンハンサー、ポリ（ａ）配列、及び非翻訳領域（ＵＴＲ、例えば、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ）のような調節配列を含んでもよい。

【0217】

ＡＡＶベクターを含有する組成物を、例えば、内耳への局所投与（例えば、外リンパへの注射、または正円窓膜を介して）によって患者に投与して、感音性難聴を治療してもよい。

【0218】

組成物を患者に投与した後、当該技術分野の医師は、導入遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現、及び治療に応答した患者の改善を種々の方法によってモニターすることができる。例えば、医師は、組成物の投与後に、聴力検査、ＡＢＲ、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、及び耳音響放射のような標準的な検査を実施することによって患者の聴力をモニターすることができる。組成物の投与前の聴力検査結果に比べて、組成物の投与後に１以上の検査にて患者が聴力の改善を示すという知見は、患者が治療に対して良好に応答していることを示している。その後の用量を必要に応じて決定し、投与することができる。

【0219】

他の実施形態
本開示に記載されている種々の改変及び変形が、本開示の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本開示を特定の実施形態に関連して記載してきたが、特許請求される本開示はそのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、当業者には明らかである、本開示を実施するために記載されている様式の種々の改変は本開示の範囲内にあることが意図される。他の実施形態は特許請求の範囲にある。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

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【国際調査報告】