ホーム > 特許ランキング > モグリファイ リミテッド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】細胞変換
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20240416BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20240416BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240416BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20240416BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20240416BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240416BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
C12P19/34 A
A61K48/00
A61K35/76
A61P43/00 105
C12N15/88 Z
C12N7/01
C12N15/12
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023568125
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-12-25
(86)【国際出願番号】 GB2022051129
(87)【国際公開番号】W WO2022234268
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】2106360.7
(32)【優先日】2021-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2111278.4
(32)【優先日】2021-08-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518224495
【氏名又は名称】モグリファイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】アンダーソン，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ルイス・ドス・サントス，ロドリゴ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CB30
4B064CC24
4B064CD12
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB211
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA11
4C087NA14
4C087ZB21
(57)【要約】
本明細書では、少なくとも１つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡを含有する方法および組成物、ならびに多能性幹細胞、複能性幹細胞または分化した起源細胞の所望の標的細胞への細胞変換におけるそれらの使用を記載する。方法および組成物を使用して、ヒト多能性または複能性幹細胞および様々なヒト体細胞型に自己複製ＲＮＡをトランスフェクトし、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで変換することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞、複能性幹細胞、または分化した起源細胞を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す分化した標的細胞へと変換する、少なくとも１つの転写因子をコードする配列を含む自己複製ＲＮＡを含む、自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項2】
２つのＲＮＡ分子：ＲＮＡの複製に必要な非構造タンパク質をコードする配列を含む第１の分子、および多能性幹細胞、複能性幹細胞、または分化した起源細胞を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す分化した標的細胞へと変換する少なくとも１つの転写因子をコードする配列を含む第２の分子を含む、自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項3】
少なくとも１つの転写因子が、ＰＯＵ５Ｆ１；ＳＯＸ２；ＫＬＦ４；ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ；およびＧＬＩＳ１からなる公知の多能性誘導転写因子のリストからの１つより多くの転写因子を含まない、請求項１または２に記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項4】
転写因子が、表１または２または３に列挙した転写因子から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項5】
自己複製ＲＮＡが２つ以上の転写因子をコードする、請求項１から４のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項6】
自己複製ＲＮＡが、（ａ）細胞に送達された場合、自己複製ＲＮＡの複製を指示することができる非構造タンパク質をコードする配列；
（ｂ）ＲＮＡの５’および３’端のｃｉｓ活性複製配列；および
（ｃ）外因性配列の発現を指示し得るプロモーター
を含む、請求項１から５のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項7】
ＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡウイルス由来である、請求項１から６のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項8】
自己複製ＲＮＡが、アルファウイルス；ピコルナウイルス；フラビウイルス；ルビウイルス；ペスチウイルス；ヘパシウイルス；フィロウイルス；カリシウイルス；およびコロナウイルスからなる群から選択される一本鎖ＲＮＡウイルス由来である、請求項７に記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項9】
自己複製ＲＮＡが、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、およびベネズエラ馬脳炎ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス由来である、請求項７または８に記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項10】
自己複製ＲＮＡが、レポーター遺伝子、免疫制御遺伝子、ミクロＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、抗生物質耐性遺伝子、Ｉ型および／もしくはＩＩＩ型インターフェロン応答の阻害剤をコードする配列またはこれらの組合せを含むリストから選択されるエレメントをさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項11】
Ｉ型および／またはＩＩＩ型インターフェロン応答の阻害剤が、ワクシニアウイルスタンパク質Ｅ３、Ｋ３、およびＢ１８Ｒ、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１、ならびに小分子阻害剤ルキソリチニブおよびウパダシチニブを含むリストから選択される、請求項１０に記載の自己複製ＲＮＡ組成物。
【請求項12】
請求項１から１１のＲＮＡ組成物に記載の自己複製ＲＮＡ。
【請求項13】
請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列。
【請求項14】
請求項１３に記載の核酸を含む発現カセット。
【請求項15】
請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡを産生する方法であって、請求項１３に記載のＤＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写するステップを含む方法。
【請求項16】
請求項１から１１のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物、請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡ、または請求項１３に記載のＤＮＡ配列、および脂質または脂質ナノ粒子を含む自己複製ＲＮＡ製剤。
【請求項17】
起源細胞を分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞へと変換する方法であって、起源細胞が分化した標的細胞の表現型特徴を示さず、方法が、請求項１から１１のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物、請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡ、請求項１３に記載のＤＮＡ配列、または請求項１６に記載の製剤を起源細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項18】
起源細胞の集団から分化した標的細胞の集団を生成する方法であって、少なくとも１つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡを前記起源細胞に導入し、それにより起源集団における少なくとも１つの転写因子の量を増加させるステップ、および少なくとも０．１％の起源細胞を分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞へと変換させる条件下で起源細胞を維持するステップを含む方法。
【請求項19】
分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴が、いずれか１つまたは複数の分化した標的細胞マーカーの上方制御および／または分化した標的細胞によりよく似るように細胞形態が変化すること、および／または分化した標的細胞の個々の細胞機能を示すことである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項20】
起源細胞が生きた動物中にあり、方法が、請求項１から１１のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物、請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡ、請求項１３に記載のＤＮＡ配列または請求項１６に記載の製剤を動物に、好ましくは動物の細胞への局所投与により、投与するステップを含む、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項21】
動物が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
起源細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１７から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
請求項１から１１のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物、請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡ、請求項１３に記載のＤＮＡ配列または請求項１６に記載の製剤を、患者に投与するステップを含む、それを必要とする前記患者を処置する方法。
【請求項24】
疾患の処置のための、請求項１から１１のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物、請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡ、請求項１３に記載のＤＮＡ配列または請求項１６に記載の製剤の使用。
【請求項25】
医薬での使用のための、請求項１から１１のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡ組成物、請求項１２に記載の自己複製ＲＮＡ、請求項１３に記載のＤＮＡ配列または請求項１６に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、転写因子をコードする自己複製ＲＮＡを含有する方法および組成物、ならびに多能性幹細胞、複能性幹細胞または分化した起源細胞の所望の標的細胞への細胞変換におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
臓器を移植する必要なく細胞を補充する代替手段の必要性がある。細胞ベースの再生療法は、傷害、疾患または年齢によって損傷した組織を補充する特定の細胞型の生成を必要とする。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト体内の全ての細胞型に分化する能力を有し、したがって補充療法の供給源として熱心に研究されてきた。しかしながら、ｈＥＳＣは培養した胚盤胞から確立されるため、患者特異的な様式に生成できない。したがって、免疫拒絶および倫理的な懸念が、ｈＥＳＣ技術の臨床応用への移行を妨害する主な障害である。２００７年に、４つの転写因子を使用して、分化した細胞を多能性幹細胞状態へと変換し戻すことができることが報告された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７ Ｃｅｌｌ，１３１（５），８６１～８７２；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９）。これらの転写因子は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４およびｃＭｙｃであり、多能性状態の誘導された性質により、これらの細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる。転写因子は、多能性状態、細胞変換、分化転換またはフォワードプログラミングとして公知のプロセスを通過せずに、１つの分化した細胞型から別の細胞型への変換を可能にすることも示された。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび直接ｉｎ ｖｉｖｏの両方で、１つの分化した細胞型の表現型を別の表現型へとスイッチすることが可能であるが、細胞変換に必要とされるエレメントの同定が困難であり、多くの場合未知である。
【0003】
本発明者らは、彼らの適切な技術を使用して１つの細胞型から別の細胞型へ変換する転写因子を効率的に同定することができる（ＷＯ２０１７／１０６９３２）。本発明に関する細胞変換の例は、線維芽細胞の筋芽細胞への変換であり、線維芽細胞においてＭＹＯＤを外因的に発現することによって達成される。
【0004】
典型的には、起源細胞は、同定された転写因子をコードするように操作されたＤＮＡ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスの使用によって標的細胞へと変換される。これらのアプローチによって成功はしたが、これらの方法の主な短所は、悪性腫瘍および他の望ましくない副作用をもたらし得る、宿主細胞ゲノムへのＤＮＡインテグレーションの可能性である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）も、細胞変換研究に用いられ成功しているが、受容細胞中で急速に分解され、起源細胞への複数回トランスフェクションが変換の成功のために必要とされることが多い（Ａｋｉｙａｍａら、２０２０ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｓｃｔｍ．２０～０３０２）。これは、細胞変換のためのその利用を制限する。
【0005】
自己複製ＲＮＡは、宿主細胞に導入されると、ＲＮＡに、それ自身を転写および複製させる配列およびタンパク質をコードするＲＮＡエレメントである。示した配列およびタンパク質は、典型的にはウイルス起源であり、限定はされないが、アルファウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、フィロウイルス、カリシウイルスおよびコロナウイルスを含む一本鎖ＲＮＡウイルスに由来する。特に、アルファウイルス セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）からのエレメントが、通常、自己複製ＲＮＡに組み込まれる。ＲＮＡエレメントを自己複製させるのに必要なアルファウイルスエレメントは、ウイルスの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～４）、５’ゲノムＵＴＲエレメント、サブゲノムプロモーター、および３’ゲノムＵＴＲエレメントを含む。機能的な使用のため、ＲＮＡの複製を可能にするエレメントは、標的タンパク質の発現も可能にしなければならない。
【0006】
公知の組合せの再プログラミング因子をコードする自己複製ＲＮＡを用いて、最終分化した細胞を多能性状態に変換し戻すことができることが実証された（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、２０１３ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１３（２），２４６～２５４；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１３．０６．００１；ＹｏｓｈｉｏｋａおよびＤｏｗｄｙ、２０１７ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１２（７），１～１７；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１８２０１８）。成人線維芽細胞は、少なくとも４つの因子：ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４ならびにｃ－ＭＹＣ、ＧＬＩＳ１およびＬＩＮ２８からの少なくとも１つを含む再プログラミング因子の組合せをコードする自己複製ＲＮＡを使用してｉＰＳＣへと変換された（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、２０１３；ＹｏｓｈｉｏｋａおよびＤｏｗｄｙ ２０１７）。再プログラミング因子の自己複製ＲＮＡにより多能性状態に再プログラムし戻されると、新しく生成した多能性幹細胞は、続いて、標的の所望の細胞型へと分化され得る。さらに、分化した細胞の分化転換は、特定の標的細胞変換に必要とされる特定の増殖培地または転写因子と組み合わせて、上記に詳述した再プログラミング因子の組成物を一過性発現させることによって達成され得ることが実証された（Ｅｆｅら、２０１１ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（３）、２１５～２２２；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｂ２１６４）。再プログラミング因子媒介性分化転換のこの方法は、初期の再プログラミングプロセスを誘導し、エピジェネティックなメカニズムによって細胞のアイデンティティーを消し、細胞を標的細胞系列への分化により感受性にすると考えられる。
【発明の概要】
【0007】
細胞で発現され、１つの型から別の所望の標的細胞へと細胞の安定な形質転換または変換を可能にし得る遺伝子の効率的な送達の必要性がある。
【0008】
本発明は、細胞変換に必要な因子の発現のための自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）の使用に関する。第１の実施形態では、本発明は、多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞）、複能性幹細胞、または分化した起源細胞（例えば、線維芽細胞）を、分化した細胞の多能性状態への再プログラミングを促進することが公知の転写因子を使用せずに、分化した標的細胞（すなわち、起源細胞が分化した細胞である場合、異なる分化した標的細胞）の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞へと変換する、転写因子またはそのバリアントをコードする配列を含む自己複製ＲＮＡ組成物を提供する。
【0009】
第２の実施形態では、多能性幹細胞、複能性幹細胞、または分化した起源細胞を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現系特徴を示す細胞へと変換する方法であって、起源細胞が分化した標的細胞の表現系特徴を示さず、方法が、転写因子（１つまたは複数）をコードする自己複製ＲＮＡを、多能性幹細胞、複能性幹細胞、または分化した起源細胞へと導入することによって少なくとも１つの転写因子を発現するステップを含み、転写因子（１つまたは複数）が、分化した細胞の多能性状態への再プログラミングを促進することが公知の転写因子ではない、方法を提供する。多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞である。複能性幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）である。分化した起源細胞は、任意の分化した細胞、典型的には、初代細胞、例えば筋細胞、脂肪細胞、メラニン形成細胞、骨芽細胞、オリゴデンドロサイト、ニューロン、内皮細胞、膵臓ベータ細胞、肝細胞、心筋細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞、網膜色素上皮細胞、ミュラーグリア細胞、または筋芽細胞であり得る。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび他のリンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分から単離された細胞、例えばＣＤ４＋リンパ球；ＣＤ８＋リンパ球；ＣＤ５６＋ＮＫ細胞またはＣＤ１９＋Ｂリンパ球であり得る。分化した標的細胞は、任意の所望の分化した標的細胞であり、典型的には、中でも治療細胞、例えば筋細胞、脂肪細胞、メラニン形成細胞、骨芽細胞、オリゴデンドロサイト、ニューロン、内皮細胞、膵臓ベータ細胞、肝細胞、心筋細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞、網膜色素上皮細胞、光受容細胞、筋芽細胞、または前駆細胞であり得る。
【0010】
特定の実施形態では、分化した標的細胞は、神経細胞、筋細胞、マクロファージまたは肝臓前駆細胞である。
【0011】
本発明の一態様では、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルス構造遺伝子を欠く一本鎖ＲＮＡウイルス由来であり、それが発現されるように転写因子をコードする。
【0012】
本発明の一態様では、自己複製ＲＮＡは、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のオープンリーディングフレーム、例えば転写調節因子、蛍光受容体（例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＢＦＰ、ｍＫａｔｅ等）、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン、ブラストシジン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン）、またはＩ型および／もしくはＩＩＩ型インターフェロン免疫応答の阻害剤（例えば、ワクシニアウイルスタンパク質Ｅ３、Ｋ３、およびＢ１８Ｒならびにインフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１）（Ｂｅｉｓｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、２０１７ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２８（１２），１１３８～１１４６；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１７．１２１）をコードする１つまたは複数の配列（転写因子（１つまたは複数）に加えて）を含有する。一実施形態では、および分化した標的細胞への細胞変換を確実にする１つより多くの転写因子を必要とするそれらの起源細胞に有利には、自己複製ＲＮＡは１つより多くの転写因子をコードする。これは、２つ以上の転写因子が同じ細胞に送達されるのを確実にする。自己複製ＲＮＡは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つの転写因子をコードする。
【0013】
本発明のさらなる態様では、２つ以上の転写因子をコードする１つまたは複数の自己複製ＲＮＡは、細胞変換を達成するため、単一ステップで送達される。起源細胞への単一ステップトランスフェクションで導入された複数の転写因子は、転写因子のより効率的な送達を提供する。単一ステップトランスフェクションは、連続的な転写因子導入法において、トランスフェクションが成功した細胞のいずれの濃縮プロセスの必要性も除外する。
【0014】
有利には、本発明は、自己複製ＲＮＡをヒト多能性幹細胞および様々なヒト体細胞型にトランスフェクトする方法を提供する。有利には、細胞の集団において、本発明者らは、自己複製ＲＮＡによってコードされたオープンリーディングフレームの非常に高効率の発現を実証する。自己複製ＲＮＡにコードされた蛍光レポータータンパク質ＧＦＰの発現によって測定した場合、７０％より多くの細胞がタンパク質を発現することが示された。実施例に示すように、ＧＦＰレポーターの発現は、２週間またはそれ以上まで検出され、それはＧＦＰのプラスミドまたはｍＲＮＡベースの発現によって観察されたよりも実質的に長かった。
【0015】
有利には、この延長された発現期間は、細胞変換実験が、典型的には７日より長い転写因子の発現を必要とするため、効率的な細胞変換が達成され得るのを確実にする重要な要素である（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、２０１３）。有利には、自己複製ＲＮＡの単一トランスフェクションによって観察されたこの発現期間の延長は、ｍＲＮＡによる細胞変換に必要とされる、長期の遺伝子発現を達成するためのトランスフェクションの繰り返しの回避、およびそれらの遺伝子改変をもたらす宿主細胞ＤＮＡにインテグレートするレンチウイルスの使用の回避を可能にする。トランスフェクションの繰り返しは技術的に困難であり、細胞生存に有害なこともあり、遺伝子改変は治療細胞型において望ましくない。有利には、本発明者らは、細胞が、レンチウイルスまたはｍＲＮＡと比較して自己複製ＲＮＡをトランスフェクトされた場合、ｉＰＳＣのより高効率な神経変換も実証した。本発明の方法および組成物を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで細胞を変換することができる。
【0016】
ヒト多能性幹細胞の例は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。
【0017】
有利には、本発明は、高効率で自己複製ＲＮＡをヒトの分化した細胞にトランスフェクトする方法を提供する。例えば、起源細胞がヒト皮膚線維芽細胞またはｉＰＳＣである場合、集団の５０％、６０％、または７０％より多くが、自己複製ＲＮＡによってコードされたオープンリーディングフレームを発現する。これは、古典的なｍＲＮＡアプローチと比較して、自己複製ＲＮＡにコードされた蛍光レポータータンパク質ＧＦＰの発現によって実証された。ヒト初代細胞の例は、皮膚線維芽細胞、ヒト軟骨細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞等である。さらに、発現の期間は、２週間まで、またはそれ以上示された。オープンリーディングフレーム発現効率のそのような増加は、転写因子の発現が十分に強力であり、起源細胞の、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞への効率的な形質転換を可能にすることを実証した。
【0018】
多能性誘導再プログラミング因子を使用して、分化転換のプロセスを駆動または開始することを可能にする（Ｅｆｅら、２０１１）。再プログラミング因子媒介性分化転換のメカニズムは完全には理解されていないが、分化した起源細胞における再プログラミングプロセスの初期段階を誘導する多能性誘導因子の組合せの使用は、分化転換プロセスの直前またはその間のいずれかに、発がん細胞を生成する望ましくない可能性をもたらす。有利には、本発明は、自己複製ＲＮＡを使用して、転写因子を発現し、多能性誘導転写因子の組合せを使用せず、異なる分化した標的細胞に分化した起源細胞を直接分化転換する方法を提供する。これは、分化した起源細胞の異なる分化した標的細胞への細胞変換のため、多能性誘導転写因子の組合せ（例えば、ＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＫＬＦ４＋ＭＹＣ；ＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＮＡＮＯＧ＋ＬＩＮ２８Ａ；ＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＫＬＦ４＋ＭＹＣＬ＋ＬＩＮ２８Ａ＋ＧＬＩＳ１；ＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＫＬＦ４＋ＭＹＣ／ＧＬＩＳ１）を除く転写因子をコードする自己複製ＲＮＡの使用によって実証される。好ましくは、転写因子は、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧおよびＧＬＩＳ１からなる公知の多能性誘導転写因子のリストから１つより多くの転写因子を含まない。より好ましくは、転写因子は、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧおよびＧＬＩＳ１からなる公知の多能性誘導転写因子のリストからいずれの転写因子も含まない。さらにより好ましくは、転写因子はＧＬＩＳ１ではないか、またはＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃＭＹＣまたはＧＬＩＳ１の組合せではない。
【0019】
一部の実施形態では、多能性幹細胞および分化した細胞への自己複製ＲＮＡのトランスフェクションの効率、および経時的な自己複製ＲＮＡ発現の持続性は、細胞の抗ウイルス応答の阻害によって増強され得る。これらの細胞の抗ウイルス応答は、インターフェロン応答経路の小分子阻害剤、例えば小分子ＪＡＫ１／２阻害剤ルキソリチニブの使用、組換えウイルスタンパク質、例えばワクシニアウイルス由来Ｂ１８Ｒの使用により、または自己複製ＲＮＡ自体内に遺伝的にコードされるウイルス由来タンパク質、例えばワクシニアウイルスタンパク質Ｂ１８Ｒの配列の発現により弱められ得るＩ型および／またはＩＩＩ型インターフェロン応答を含む（Ｂｌａｋｎｅｙら、２０２１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２９（３）、１１７４～１１８５；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０２０．１１．０１１）。インターフェロン応答経路の小分子またはタンパク質阻害剤は、限定はされないが、フェドラチニブ、ウパダシチニブ、フィルゴチニブ、バリシチニブ、デュークラバシチニブ、リトレシチニブ、デセルノチニブ、ＲＩＧ０１１、ＢＸ７９５、ＭＲＴ６７３０７およびＹ１３６Ｒを含む。多能性幹細胞における自己複製ＲＮＡ発現を増加させるために小分子、遺伝子ノックダウンまたは遺伝子過剰発現のいずれかにより操作され得る細胞の抗ウイルス応答は、ＲＮＡｉ経路、内因性発現されたＰＫＲ、ＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬ、抗ウイルスダイサーとして公知の幹細胞特異的ＤＩＣＥＲアイソフォーム、および内因性のレトロウイルスがコードする逆転写酵素を利用するメカニズムを含み得る。一部の実施形態では、細胞の抗ウイルス応答を調節するために利用される分子は自己複製ＲＮＡ内にコードされ、限定はされないが、ウイルスタンパク質（例えば、ワクチンウイルスＢ１８Ｒ、およびヤバウイルス様Ｙ１３６Ｒ）、免疫応答経路タンパク質を標的化し、その発現の減少をもたらす、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、免疫応答経路の受容体（例えばＰＲＯＴＡＣ）またはシグナル伝達タンパク質を遮断もしくは分解するように操作された抗体、およびインターフェロン応答経路を破壊する手段としてタンパク質の天然または優性ネガティブバージョンを含む。
【0020】
さらなる実施形態では、自己複製ＲＮＡ組成物は、２６Ｓプロモーターを含む。
【0021】
別の態様では、自己複製ＲＮＡは、例えば、１つのＲＮＡ分子にコードされた５’ゲノムＵＴＲエレメント、非構造タンパク質（ｎｓＰ１～４）、および３’ゲノムＵＴＲ、ならびに第２のＲＮＡ分子にコードされた５’ゲノムＵＴＲエレメント、サブゲノムプロモーター、標的ＯＲＦ、例えば１つまたは複数の転写因子、および３’ゲノムＵＴＲエレメントを有する２つの分子に分けられる。自己複製ＲＮＡの機能は、２つのＲＮＡ分子に分けられる：自己複製ＲＮＡの複製に必要な非構造タンパク質をコードする配列を含む第１の分子、ならびに複製を可能にし、５’ゲノムＵＴＲエレメント、サブゲノムプロモーターおよび３’ゲノムＵＴＲエレメントを含む、少なくとも１つの転写因子およびＲＮＡ内の構造エレメントをコードする配列を含む第２の分子。アルファウイルス由来自己複製ＲＮＡの非構造タンパク質は、アセンブルして多酵素レプリカーゼ複合体を生成し、自己複製ＲＮＡレプリコン内の配列エレメントを認識し、全ＲＮＡ鋳型を複製することができる。レプリカーゼ複合体は、トランスで全長およびトランケートＲＮＡを複製することもでき、それらの複製のためのこれらの「トランス－レプリコン」における一連の保存配列エレメントを最小限に必要とする（Ｂｅｉｓｓｅｒｔら、２０１９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２８（１）、１１９～１２８；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１９．０９．００９）。レプリカーゼ活性は、必要な非構造タンパク質をコードするプラスミド、ｍＲＮＡまたは別々の自己複製ＲＮＡの送達によるものを含むいくつかの方法で供給され得る。有利には、このトランス複製ＲＮＡシステムは、発現される転写因子からのウイルス由来複製タンパク質の分離を付与し、治療安全性の向上および転写因子発現動態の調節の向上を可能にする。
【0022】
本発明の一部の実施形態では、多能性幹細胞、複能性幹細胞、または分化した細胞から選択される起源細胞を、標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す分化した細胞へと変換する方法であって、転写因子をコードする自己複製ＲＮＡによって起源細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。一実施形態では、方法は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡによって起源細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップを含む。起源細胞は、多能性幹細胞、例えば人工多能性幹細胞、複能性幹細胞、または分化した細胞であり得る。例えば、分化した起源細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ ｃｅｌｌ）は、任意の分化した細胞であり得るが、典型的には、初代細胞、例えば線維芽細胞、例えば皮膚線維芽細胞、軟骨細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞、例えばヒト臍静脈内皮細胞、上皮細胞、または筋芽細胞である。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび他のリンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された細胞、例えばＣＤ４＋リンパ球；ＣＤ８＋リンパ球；ＣＤ５６＋ＮＫ細胞またはＣＤ１９＋Ｂリンパ球であり得る。好ましくは、起源細胞は線維芽細胞または内皮細胞である。より好ましくは、起源細胞は皮膚線維芽細胞である。
【0023】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡをトランスフェクトした起源細胞の集団から標的細胞の集団を生成する方法を提供する。
【0024】
有利には、本発明に記載の自己複製ＲＮＡ組成物または自己複製ＲＮＡ、および脂質または脂質ナノ粒子を含む自己複製ＲＮＡ製剤を提供する。好ましくは、ＲＮＡは、脂質ナノ粒子中の製剤化される。脂質は、カチオン性脂質、またはカチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｐｈｏｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）のリポソーム製剤であり得る。好ましくは、自己複製ＲＮＡ製剤は、カチオン性ナノエマルジョンである。
【0025】
一部の実施形態では、本発明は、転写因子Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ－２（Ａｌｉａｓｅｓ：ＮＥＵＲＯＧ２、Ａｔｏｈ４、Ｍａｔｈ４Ａ、ＮＧＮ２、ｂＨＬＨａ８、ｎｇｎ－２）をコードする自己複製ＲＮＡを多能性幹細胞に導入し、それにより多能性幹細胞集団のＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ－２の量を増加させ、少なくとも０．１％の多能性幹細胞集団を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴、例えばＮＣＡＭ発現を示すニューロンへと変換させる条件下で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の集団から神経細胞の集団を生成する方法を提供する。好ましくは、少なくとも１％の多能性幹細胞集団が、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示すニューロンへと変換されるか、またはより好ましくは少なくとも１０％の多能性幹細胞集団が変換される。
【0026】
別の実施形態では、本発明は、転写因子ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌをコードする自己複製ＲＮＡ（１つまたは複数）を線維芽細胞に導入し、それにより線維芽細胞集団の各転写因子の量を増加させ、少なくとも０．１％の線維芽細胞集団を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴、例えばＮＣＡＭ発現を示すニューロンへと変換させる条件下で線維芽細胞を培養することにより、線維芽細胞の集団から神経細胞の集団を生成する方法を提供する。好ましくは、少なくとも１％の線維芽細胞集団が、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示すニューロンへと変換されるか、またはより好ましくは少なくとも１０％の線維芽細胞集団が変換される。
【0027】
別の実施形態では、本発明は、転写因子ＭＹＯＤをコードする自己複製ＲＮＡを多能性幹細胞または線維芽細胞に導入し、それにより多能性幹細胞または線維芽細胞集団のＭＹＯＤの量を増加させ、少なくとも０．１％の起源細胞集団を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴、例えばミオシン重鎖発現を示す筋芽細胞へと変換させる条件下で多能性幹細胞または線維芽細胞を培養することにより、多能性幹細胞または線維芽細胞の集団から筋芽細胞の集団を生成する方法を提供する。好ましくは、少なくとも１％の起源細胞集団が、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す筋芽細胞へと変換されるか、またはより好ましくは１０％の起源細胞集団が変換される。
【0028】
別の実施形態では、本発明は、転写因子ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡをコードする自己複製ＲＮＡ（１つまたは複数）を線維芽細胞に導入し、それにより線維芽細胞集団の各転写因子の量を増加させ、少なくとも０．１％の線維芽細胞集団を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴、例えばＣＤ１１ｂ発現を示すマクロファージ様細胞へと変換させる条件下で線維芽細胞を培養することにより、線維芽細胞の集団からマクロファージ様細胞の集団を生成する方法を提供する。好ましくは、少なくとも１％の線維芽細胞集団が、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示すマクロファージ様細胞へと変換されるか、またはより好ましくは１０％の線維芽細胞集団が変換される。
【0029】
別の実施形態では、本発明は、転写因子ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１およびＦＯＸＡ３をコードする自己複製ＲＮＡ（１つまたは複数）を内皮細胞に導入し、それにより内皮細胞集団の各転写因子の量を増加させ、少なくとも０．１％の内皮細胞集団を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴、例えばアルブミン発現を示す肝臓前駆細胞へと変換させる条件下で内皮細胞を培養することにより、内皮細胞の集団から肝臓前駆細胞の集団を生成する方法を提供する。好ましくは、少なくとも１％の内皮細胞集団が、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す肝臓前駆細胞へと変換されるか、またはより好ましくは１０％の内皮細胞集団が変換される。
【0030】
一部の態様では、本発明は、起源細胞を、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞へと変換させる方法であって、起源細胞が生きた動物中にあり、方法が、少なくとも１つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡ組成物または自己複製製剤を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、生きた動物は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図１は、ＶＥＥＶ ５’および３’ｃｉｓ活性非コード制御領域に隣接するＶＥＥＶ非構造タンパク質ｎｓＰ１～４、多重クローニング部位の上流に位置するＴ７プロモーターおよび２６Ｓサブゲノムプロモーターを含む自己複製ＲＮＡの生成に使用されるプラスミドＤＮＡ鋳型の特徴を示す概略図である。
【図2】図２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるプラスミドＤＮＡ鋳型からの自己複製ＲＮＡの生成のプロトコールを示す図である。自己複製ＲＮＡレプリコンをコードするプラスミドは、ＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼによって線状にされ、次いで、Ｔ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として使用した。ＲＮＡ沈降および再懸濁後、自己複製ＲＮＡはゲル電気泳動によって可視化することができる。
【図3】図３は、ｉＰＳＣにおけるＧＦＰをコードする自己複製ＲＮＡの発現を示す図である。ｉＰＳＣは、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）をコードする自己複製ＲＮＡによりヌクレオフェクトされ、トランスフェクションの２４時間後に解析した。図３Ａは、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳＣにおけるＧＦＰの効率的な発現を示すフローサイトメトリープロット（右のパネル）を示し、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしていないｉＰＳＣ ｍｏｃｋ（対照）と比較して９６．４％のｉＰＳＣがＧＦＰ陽性である。図３Ｂは、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしていないｉＰＳＣ ｍｏｃｋ（対照）およびＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳＣの顕微鏡画像を示す。
【図4】図４は、自己複製ＲＮＡ、従来のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡ、プラスミドまたはレンチウイルスとして送達されたＧＦＰの発現キネティクスを示す図である。図４Ａは、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示し、図４Ｂは、２１日の時間経過にわたりフローサイトメトリーによって決定したＧＦＰ陽性細胞のＧＦＰ発現の強度を示すグラフである（ＭＦＩ＝平均蛍光強度）。
【図5】図５は、選択圧下での自己複製ＲＮＡの発現キネティクスを示すグラフである。データは、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡのトランスフェクションと、続いてピューロマイシンおよび組換えＢ１８Ｒによる細胞の処理後、さらなる処理をしない対照に対する、ｉＰＳＣにおけるｒｅｐＲＮＡ媒介ＧＦＰ発現の時間経過フローサイトメトロリーを要約する。ＧＦＰ発現の時間経過は、レンチウイルスによって達成されたものと比較した。
【図6】図６は、ｉＰＳＣ、ＨＥＫ２９３Ｔ、および初代ヒト皮膚線維芽細胞を含む多様な細胞型におけるＧＦＰ自己複製ＲＮＡ機能の検証を示す図である。ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）をコードする自己複製ＲＮＡを、ｉＰＳＣ、ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＤＦにトランスフェクトし、細胞をトランスフェクションの２４時間後にフローサイトメトリーによって、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしない対照細胞のｍｏｃｋと比較して解析した（図６Ａ）。ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）をコードする自己複製ＲＮＡをトランスフェクトし、組換えＢ１８Ｒまたはルキソリチニブを補足した培地中で培養したＨＤＦにおけるＧＦＰの発現を１４日間の時間経過にわたりフローサイトメトリーによって評価した（図６Ｂ）。
【図7】図７は、自己複製ＲＮＡによる細胞変換を検証するための実験系を示す図である。図７Ａは、ＩＲＥＳ配列によって分けられたＮＥＵＲＯＧ２転写因子およびＰｕｒｏ（登録商標）－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ（ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ）をコードするｒｅＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を可能にするプラスミドの概略図を示す。図７Ｂは、ｉＰＳＣの神経細胞への細胞変換のための実験の時系列を詳述する図解である。
【図8】図８は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＮＥＵＲＯＧ２が、トランスフェクション後２日目および７日目に、ｉＰＳＣにおいて神経形態を誘導することを示す画像である。左のパネルは、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳＣを示し、右のパネルは、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳＣを示す。
【図9A】図９は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＮＥＵＲＯＧ２が、ｉＰＳＣをニューロンに効率的に変換することを示す図である。ｉＰＳＣは、対照ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡまたはＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、トランスフェクション後７日まで培養を継続した。図９Ａは、ｑＰＣＲ発現データを示す図である。図９Ｂは、フローサイトメトリー解析を示し、図９Ｃは、神経マーカーの発現およびＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡを使用するｉＰＳＣの神経細胞への変換の成功を示す免疫細胞化学である。
【図9B】図９は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＮＥＵＲＯＧ２が、ｉＰＳＣをニューロンに効率的に変換することを示す図である。ｉＰＳＣは、対照ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡまたはＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、トランスフェクション後７日まで培養を継続した。図９Ａは、ｑＰＣＲ発現データを示す図である。図９Ｂは、フローサイトメトリー解析を示し、図９Ｃは、神経マーカーの発現およびＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡを使用するｉＰＳＣの神経細胞への変換の成功を示す免疫細胞化学である。
【図9C】図９は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＮＥＵＲＯＧ２が、ｉＰＳＣをニューロンに効率的に変換することを示す図である。ｉＰＳＣは、対照ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡまたはＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、トランスフェクション後７日まで培養を継続した。図９Ａは、ｑＰＣＲ発現データを示す図である。図９Ｂは、フローサイトメトリー解析を示し、図９Ｃは、神経マーカーの発現およびＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡを使用するｉＰＳＣの神経細胞への変換の成功を示す免疫細胞化学である。
【図10】図１０は、ニューロンへのｉＰＳＣのＮＥＵＲＯＧ２駆動変換の効率が、自己複製ＲＮＡとして送達される場合により効率的であることを示す図である。レンチウイルスおよび自己複製ＲＮＡは、ＮＥＵＲＯＧ２をｉＰＳＣに送達し、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトした対照細胞と比較して、ＴＵＢＢ３免疫細胞化学（図１０Ａ）およびＮＣＡＭフローサイトメトリー（図１０Ｂ）によって証明したように、それらを神経へと変換することができる。ＮＥＵＲＯＧ２の自己複製ＲＮＡ送達は、レンチウイルスと比較して、およそ３倍高い効率のｉＰＳＣの神経細胞変換をもたらす。
【図11A】図１１は、自己複製ＲＮＡによってコードされたＡＳＣＬ１＋ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）＋ＭＹＴ１Ｌ＋ＮＥＵＲＯＤ１の組合せが、皮膚線維芽細胞をニューロンに変換することを示す図である。ポリシストロニックなＡＳＣＬ１－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡの概略図を示す（図１１Ａ）。ＨＤＦは、ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌをコードする個々のｒｅｐＲＭＡまたはＭＹＴ１Ｌをコードする別のｒｅｐＲＮＡと共にＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２およびＮＥＵＲＯＤ１をコードするポリシストロニックｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後１４日間培養を継続した。ニューロンへの変換は、ＴＵＢＢ３を検出する免疫細胞化学（図１１Ｂ）およびＮＣＡＭフローサイトメトリー（図１１Ｃ）によって、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしない対照細胞のｍｏｃｋと比較して評価した。
【図11B】図１１は、自己複製ＲＮＡによってコードされたＡＳＣＬ１＋ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）＋ＭＹＴ１Ｌ＋ＮＥＵＲＯＤ１の組合せが、皮膚線維芽細胞をニューロンに変換することを示す図である。ポリシストロニックなＡＳＣＬ１－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡの概略図を示す（図１１Ａ）。ＨＤＦは、ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌをコードする個々のｒｅｐＲＭＡまたはＭＹＴ１Ｌをコードする別のｒｅｐＲＮＡと共にＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２およびＮＥＵＲＯＤ１をコードするポリシストロニックｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後１４日間培養を継続した。ニューロンへの変換は、ＴＵＢＢ３を検出する免疫細胞化学（図１１Ｂ）およびＮＣＡＭフローサイトメトリー（図１１Ｃ）によって、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしない対照細胞のｍｏｃｋと比較して評価した。
【図11C】図１１は、自己複製ＲＮＡによってコードされたＡＳＣＬ１＋ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）＋ＭＹＴ１Ｌ＋ＮＥＵＲＯＤ１の組合せが、皮膚線維芽細胞をニューロンに変換することを示す図である。ポリシストロニックなＡＳＣＬ１－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡの概略図を示す（図１１Ａ）。ＨＤＦは、ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌをコードする個々のｒｅｐＲＭＡまたはＭＹＴ１Ｌをコードする別のｒｅｐＲＮＡと共にＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２およびＮＥＵＲＯＤ１をコードするポリシストロニックｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後１４日間培養を継続した。ニューロンへの変換は、ＴＵＢＢ３を検出する免疫細胞化学（図１１Ｂ）およびＮＣＡＭフローサイトメトリー（図１１Ｃ）によって、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしない対照細胞のｍｏｃｋと比較して評価した。
【図12】図１２は、自己複製ＲＮＡによってコードされたＭＹＯＤ１が、ｉＰＳＣおよび皮膚線維芽細胞を筋細胞に効率的に変換することを示す画像である。ｉＰＳＣ（図１２Ａ）およびＨＤＦ（図１２Ｂ）は、ＭＹＯＤ１をコードするｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後７～１０日間培養を継続し、筋細胞への変換を免疫細胞化学によって評価し、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしない対照細胞のｍｏｃｋと比較してミオシン重鎖を検出した。
【図13-1】図１３は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＳＰＩ１＋ＣＥＢＰＡの組合せが、皮膚線維芽細胞をマクロファージ様細胞へと変換することを示す図である。ＨＤＦは、ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡをコードするｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後１０日間培養を継続し、マクロファージへの変換をフローサイトメトリー（図１３Ａおよび１３Ｂ）およびｑＰＣＲ（図１３Ｃ）によって評価し、ｍｏｃｋ（ｒｅｐＲＮＡなし）および対照（ＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡ）をトランスフェクトした細胞と比較した。図１３Ｂのフローサイトメトリープロットは、図１３Ａの相当するプロットのＣＤ４５＋細胞からゲートしたイベントを示す。
【図13-2】図１３は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＳＰＩ１＋ＣＥＢＰＡの組合せが、皮膚線維芽細胞をマクロファージ様細胞へと変換することを示す図である。ＨＤＦは、ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡをコードするｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後１０日間培養を継続し、マクロファージへの変換をフローサイトメトリー（図１３Ａおよび１３Ｂ）およびｑＰＣＲ（図１３Ｃ）によって評価し、ｍｏｃｋ（ｒｅｐＲＮＡなし）および対照（ＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡ）をトランスフェクトした細胞と比較した。図１３Ｂのフローサイトメトリープロットは、図１３Ａの相当するプロットのＣＤ４５＋細胞からゲートしたイベントを示す。
【図14】図１４は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＨＮＦ１Ａ＋ＨＮＦ４Ａ＋ＯＮＥＣＵＴ１＋ＦＯＸＡ３の組合せが、内皮細胞を肝臓前駆細胞へと変換することを示す図である。ポリシストロニックＨＮＦ１Ａ－ＨＮＦ４Ａ－ＯＮＥＣＵＴ１ ｒｅｐＲＮＡの概略図を示す（図１４Ａ）。ＨＵＶＥＣに、ＦＯＸＡ３をコードする別のｒｅｐＲＮＡと共に、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、およびＯＮＥＣＵＴ１をコードするポリシストロニックｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後１４日間培養を継続した。肝臓前駆細胞への変換は、免疫細胞化学によって評価してアルブミンを検出し、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしない対照細胞のｍｏｃｋと比較した（図１４Ｂ）。
【図15】図１５は、複数の小分子および組換えタンパク質が、皮膚線維芽細胞において高レベルの自己複製ＲＮＡ発現を支持できることを示す図である。図１５Ａは、処理されないかまたはＤＭＳＯ処理を受けたＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトした対照細胞と比較して、ＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡのトランスフェクションおよび示した小分子または組換えタンパク質による処理後７日目の皮膚線維芽細胞におけるフローサイトメトリーによるＧＦＰ発現（ＧＦＰ陽性細胞のパーセント）の検出を示す。図１５Ｂは、ＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡのトランスフェクション、続いて詳述した筋細胞変換条件での維持、および示した小分子または組換えタンパク質による処理後１０日目に皮膚線維芽細胞におけるミオシン重鎖発現の免疫細胞化学検出の例を示す。対照は、ＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、ＤＭＳＯによって処理した。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本明細書で使用される場合、「転写因子」は、その機能が細胞内で特定の遺伝子（１つまたは複数）の発現を制御し、前記遺伝子のＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの転写の割合を調節するタンパク質を指す。特定の転写因子は、細胞の表現型特徴を提供する遺伝子の発現を制御する。特定の関連転写因子の例は、表１、表２および表３に列挙する。一部の実施形態では、転写因子は、表１、表２または表３に列挙した転写因子のいずれか１つまたは複数である。他の実施形態では、転写因子は、表１、表２または表３の１列に列挙した転写因子のいずれか１つまたは複数である。一部の実施形態では、表１、表２または表３の１列に列挙した全ての転写因子が使用され得る。表１、表２または表３の「＋」は、「および／または」を示す。場合により、転写因子は、表１、表２または表３に開示した転写因子の特定の組合せ由来である。一部の実施形態では、転写因子はＧＬＩＳ１ではないか、または転写因子は、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣＬ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ－ＭＹＣおよびＧＬＩＳ１を含む公知の再プログラミング転写因子のリストから１つより多くの転写因子を含有する転写因子の組合せの一部ではない。
【0033】
本明細書で使用される場合、「転写調節因子」は、その機能が細胞内での特定の遺伝子（１つまたは複数）の発現の制御において転写因子の活性を捕捉することであるタンパク質を指す。これらのタンパク質は、ヒストンアセチル化およびメチル化ならびにＤＮＡメチル化の改変を担うエピジェネティック修飾因子、ならびに遺伝子発現に影響するシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質、例えば増殖因子およびタンパク質キナーゼを含む。転写改変因子（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）は、構成的に活性なタンパク質の変異形態であり得る。特定の関連転写改変因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）の例は、表４に列挙する。
【0034】
本明細書で使用される場合、「起源細胞」は、初めの細胞型を所望の分化した標的細胞型へと変換する細胞変換プロセスの初めの細胞型として使用される細胞である。起源細胞は、任意の型の細胞であり、限定はされないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたかまたは生物の一部としてｉｎ ｖｉｖｏで同定された任意の幹細胞または分化した細胞を含み得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、様々な型の細胞に分化し、無限に増殖してより多くの同じ幹細胞を産生し得る、未分化または部分的に分化した細胞である。幹細胞は、多能性幹細胞または複能性幹細胞を含む。
【0036】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」は、成体の全ての細胞型へと分化し得る細胞である。胚盤胞の内部細胞塊、初期の着床前胚、および人工多能性幹細胞に由来し、体細胞の再プログラミング転写因子の発現によって生成される胚性幹細胞は、多能性幹細胞の両型である。
【0037】
本明細書で使用される場合、「複能性幹細胞」、例えば「成体幹細胞」は、規定された系列のわずかな異なる細胞型へと分化することができる複能性細胞である。成体幹細胞の例は、限定はされないが、脂肪由来幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞および神経幹細胞を含む。一代替では、本発明に記載の起源細胞は、成体幹細胞ではない。
【0038】
好ましくは、起源細胞は分化した細胞である。本明細書で使用される場合、「分化した細胞」または「分化した起源細胞」は、特定の表現型特徴によって規定された任意の分化した細胞型であり、成体細胞（例えば初代細胞）であってもよく、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養を継続した成体細胞由来の細胞型（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養線維芽細胞または細胞株）、または成体の１つまたは複数の検出可能な表現型特徴を示す成体由来の細胞であってもよい。
【0039】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」または「分化した標的細胞」は、特定の表現型特徴によって規定された任意の分化した細胞型であってもよく、成体細胞、前駆細胞、部分的に分化した細胞、または成体に見出されない分化したかまたは部分的に分化した細胞型であってもよい。用語「標的細胞」は、人工多能性幹細胞を包含しない。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「表現型特徴」は、細胞の異なるバリアントまたは特徴である。そのような特徴は、形態学的または生化学的であり、観察できる特性である。分化した標的細胞と組み合わせて使用される場合、表現型特性は、分化した標的細胞に表れるが、起源細胞にはない。例えば、ドーパミン作動性ニューロンの表現型特徴は、（ｉ）長く、細い軸索および樹状突起を有する小さい細胞体からなる形態である、（ｉｉ）電気的に興奮性である、および（ｉｉｉ）遺伝子ＬＲＲＫ２、ＭＡＰ２およびＰＩＴＸ３を発現する。ＮＫ細胞の表現型特徴は、（ｉ）外見が顆粒の、小さくて丸い細胞である、（ｉｉ）細胞傷害性である（他の細胞を死滅させることができる）、および（ｉｉｉ）それらの細胞表面上にタンパク質ＣＤ５６を発現するが、ＣＤ３は発現しない。心室心筋細胞の表現型特徴は、（ｉ）電気刺激時に、収縮性である、（ｉｉ）細胞を収縮させる、筋節と呼ばれる組織されたタンパク質構造を有する、および（ｉｉｉ）遺伝子ＭＹＬ２、ＮＫＸ２－５およびＭＹＨ６を発現する。
【0041】
本明細書で使用される場合、「細胞変換」は、起源細胞型の表現型特徴が別の細胞型のものに変更されるように、起源細胞を標的細胞へと変更する方法を指す。
【0042】
用語「再プログラミング」は、分化した起源細胞を多能性標的細胞、例えば人工多能性幹細胞へと変更する方法を指す。
【0043】
用語「フォワードプログラミング」は、起源細胞型の表現型特徴が別の細胞型のものへと変更されるように、多能性起源細胞、例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を分化した標的細胞へと変更する方法を指す。
【0044】
用語「分化転換」は、起源細胞型の表現型特徴が、中間多能性状態を通って転換せずに別の細胞型のものへと変更されるように、分化した起源細胞を異なる分化した標的細胞へと変更する方法を指す。
【0045】
用語「再プログラム因子媒介性分化転換」は、公知の多能性誘導転写因子のリストから取られた転写因子の組合せの使用を必要とし、分化した起源細胞における初期の再プログラミングプロセスを誘導し、それらを分化転換により許容性にする分化転換の方法を指す。公知の多能性誘導因子の組合せは、ＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＫＬＦ４＋ＭＹＣ；ＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＮＡＮＯＧ＋ＬＩＮ２８Ａ；ＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＫＬＦ４＋ＭＹＣＬ＋ＬＩＮ２８Ａ＋ＧＬＩＳ１；およびＰＯＵ５Ｆ１＋ＳＯＸ２＋ＫＬＦ４＋ＭＹＣ／ＧＬＩＳ１を含む。
【0046】
用語「由来する」は、それにより第１の成分またはその第１の成分からの情報を使用して、異なる第２の成分を単離および作製するプロセスを指す。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスに由来し、ウイルスのＲＮＡは操作され、構造ウイルスタンパク質遺伝子を除去される。
【0047】
用語「バリアント」は、全長ポリペプチドに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを指す。用語「転写因子またはそのバリアント」は、本明細書に記載の転写因子のバリアントの使用を指す。バリアントは、全長ポリペプチドのフラグメントまたは天然に存在するスプライスバリアントであり得る。バリアントは、ポリペプチドのフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のポリペプチドであり、フラグメントは全長野生型ポリペプチドまたはそのドメインの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の長さであり、目的の機能活性、例えば起源細胞型の分化した標的細胞型への変換を促進する能力を有する。一部の態様では、ドメインは、少なくとも１００、２００、３００、または４００アミノ酸長であり、配列中の任意のアミノ酸位置で開始し、Ｃ末端に伸長する。タンパク質の活性を除去するかまたは実質的に減少させる当技術分野で公知のバリエーションは、好ましくは回避される。一部の態様では、バリアントは、全長ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端部分を欠損し、例えばいずれかの末端から１０、２０、または５０アミノ酸までを欠損する。一部の態様では、ポリペプチドは、成熟（全長）ポリペプチドの配列を有し、それにより、１つまたは複数の部分、例えばシグナルペプチドを有するポリペプチドが、正常な細胞内タンパク質分解プロセシング中（例えば、同時翻訳または翻訳後プロセシング中）に除去されることを意味する。一部の態様では、自然にタンパク質を発現する細胞からタンパク質を精製する以外にタンパク質が産生され、タンパク質はキメラポリペプチドであり、それにより２つ以上の異なる種からの部分を含有することを意味する。一部の態様では、自然にタンパク質を発現する細胞からタンパク質を精製する以外にタンパク質が産生され、タンパク質は誘導体であり、それによりタンパク質が、その配列がタンパク質の生物活性を実質的に減少しない限りタンパク質に関連しないさらなる配列を含むことを意味する。当業者は、特定のポリペプチドバリアント、フラグメント、または誘導体が当技術分野で公知のアッセイを使用して機能的であるかどうか分かるか、または容易に確かめることができる。他の有用なアッセイは、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結された転写因子結合部位を含有するレポーター構築物の転写を活性化する能力を測定することを含む。本発明のある特定の態様では、機能性バリアントまたはフラグメントは、全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を有する。
【0048】
用語「外因性」は、細胞または生物内のタンパク質、遺伝子、核酸またはポリヌクレオチドに関して使用される場合、人工または自然の手段によって細胞または生物へと導入されるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指すか；あるいは細胞に関して使用される場合、人工もしくは自然の手段によって単離されたかまたは他の細胞もしくは生物に続いて導入された細胞を指す。外因性細胞は、異なる生物に由来するか、または同じ生物に由来し得る。用語「外因性」は、用語「異所性」と交換可能に使用され得る。
【0049】
本明細書で参照する用語「オープンリーディングフレーム」は、タンパク質に翻訳される能力を有する核酸の配列である。転写因子を含む、本発明に関連する全ての目的のタンパク質は、オープンリーディングフレームとしてコードされる。用語「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と交換可能に使用され得る。
【0050】
本明細書で参照する用語「細胞培養培地」（本明細書では、「培養培地」または「培地」とも呼ばれる）は、細胞生存を維持し、増殖を支持する栄養を含有する細胞を培養または維持するための培地である。細胞培養培地は、任意の以下の適切な組合せを含有し得る：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、および他の成分、例えばペプチド増殖因子、サイトカイン等。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【0051】
起源細胞に、自己複製ＲＮＡをトランスフェクトし、１つもしくは複数の転写因子、またはそのバリアントの発現または量を増加させる。用語「発現」は、機能性タンパク質および必要に応じて、限定はされないが、適用可能な例えば転写、フォールディング、修飾およびプロセシングを含む、分泌タンパク質の合成および産生に関与する細胞プロセスを指す。
【0052】
本明細書で使用される用語「自己複製ＲＮＡ」、「自己増幅ＲＮＡ」、「ＲＮＡレプリコン」、「自己増幅メッセンジャーＲＮＡ」、「ｓａＲＮＡ」、「ＳＡＭ」、「ｓａ－ｍＲＮＡ」および「ｒｅｐＲＮＡ」は、交換可能に使用され得る。
【0053】
【表1-1】
【0054】
【表1-2】
【0055】
【表2】
【0056】
【表3-1】
【0057】
【表3-2】
【0058】
【表4】
【0059】
【表5-1】
【0060】
【表5-2】
【0061】
自己複製ＲＮＡは、宿主細胞に導入される場合、ＲＮＡを転写およびそれ自身複製させ、所望の遺伝子産物の発現を増幅させる配列およびタンパク質をコードするＲＮＡウイルス由来のＲＮＡエレメントである。哺乳動物細胞に導入される場合、自己複製ＲＮＡ分子は宿主の翻訳機構によって翻訳され、ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質を産生し、５’および３’端ｃｉｓ活性複製配列と一緒に作用し、ＲＮＡを複製させる。外因性タンパク質は、自己複製ＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質と一緒に発現を達成することができる。自己複製ＲＮＡが由来するＲＮＡウイルスは、アルファウイルスであることが多く、研究した例は、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）を含む。
【0062】
自己複製ＲＮＡは、ｍＲＮＡの基本エレメント（ｃａｐ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および様々な長さのポリ（Ａ）テイル）を含有するが、４つのウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ１～４）およびサブゲノムポロモーターをコードする５’端の大きなオープンリーディングフレームを有する。通常サブゲノムプロモーターの下流であり、ウイルス構造タンパク質をコードするウイルスゲノム中の遺伝子は、発現するのが好ましい外因性配列によって置き換えられる（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ ２０２０ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２１（１４），１～２９；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｉｊｍｓ２１１４５１３０）。所望であれば、外因性配列は、自己複製ＲＮＡの自己切断２Ａペプチドを使用して他のオープンリーディングフレームにインフレームで融合され得る、および／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の調節下にあり得る。
【0063】
続いて、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からのＲＮＡを転写および複製し得る、ウイルス非構造タンパク質（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス由来のｎｓＰ１～４）および（ｉｉ）例えば表１～３に列挙した、転写因子をコードする所望のオープンリーディングフレームをコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡは、例えばＩＲＥＳの調節下にあり得るさらなる所望の遺伝子産物をコードする、さらなる（下流または上流）オープンリーディングフレームを有し得る。
【0064】
一態様では、少なくとも１つの自己複製ＲＮＡ分子が、アルファウイルスに由来するかまたはアルファウイルスに基づく。他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖ＲＮＡウイルス、およびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するかまたはそれらに基づく。好適な野生型アルファウイルス配列は周知である。好適なアルファウイルスの代表的な例は、アウラウイルス、ベバルウイルス、カバソウ（Cabassou）ウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、フォートモーガン（Fort Morgan）ウイルス、ゲタウイルス、キジラガッチェ（Kyzylagach）ウイルス、マヤロウイルス、マヤロウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇ）ウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、ピクスナウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、トナテウイルス、Ｔｒｉｎｉｔｉ、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロアウイルス、およびＹ－６２－３３を含む。好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびシンドビスウイルスからなる種の群から選択されるウイルスを含むかまたはそれらに由来する。他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は：オルソミクソウイルス；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス；メタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）およびモルビリウイルス；ニューモウイルス；パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）；メタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）；モルビリウイルス；ピコマウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）；エンテロウイルス；ブニヤウイルス；フレボウイルス；ナイロウイルス；ヘパマウイルス（Ｈｅｐａｍａｖｉｒｕｓｅｓ）；トガウイルス；アルファウイルス；アルテリウイルス；フラビウイルス；ペスチウイルス；ヘパドナウイルス；ラブドウイルス；カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）；コロナウイルス；レトロウイルス；レオウイルス；パルボウイルス；デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）；Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）；ヒトヘルペスウイルス；およびパポバウイルスを含むリストからのウイルスに由来するかまたはそれに基づく。
【0065】
一態様では、自己複製ＲＮＡは、ゲノムまたはサブゲノムのいずれかの、少なくとも１つのプロモーターを含む。好ましくは、プロモーターは、サブゲノムプロモーターである。好ましくは、サブゲノムプロモーターは、アルファウイルス由来の２６Ｓサブゲノムプロモーターである。好ましくは、サブゲノムプロモーターは、２６Ｓサブゲノムプロモーターであり、本明細書では、以下：
ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴ（配列番号１）
のように、配列番号１として提供される。
ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴ（配列番号１）
のように、配列番号１として提供される。
【0066】
一実施形態では、記載したプロモーターは、例えば表１～３の１つに列挙されるように、少なくとも１つの目的の転写因子をコードする配列に作動可能に連結される。別の実施形態では、第１のプロモーターは、少なくとも１つの目的の転写因子をコードする配列に作動可能に連結され、第２のプロモーターは、別の少なくとも１つの目的の転写因子をコードする配列に作動可能に連結される。
【0067】
自己複製ＲＮＡは、少なくとも２つの目的の転写因子をコードする配列間に配置されたリンカー配列をさらに含み得る。一実施形態では、リンカー配列は、それにより少なくとも２つの目的の転写因子を分けるように消化されるように構成されるペプチドスペーサーをコードする配列を含む。したがって、好ましくは、スペーサー配列は、少なくとも２つの目的の転写因子をコードする配列間に配置される。
【0068】
そのため、スペーサー配列は、好ましくは、切断可能なペプチド、例えば２Ａペプチドである（ＷＯ２０２０／２５４８０４号）。好適な２Ａペプチドは、ブタテッショウイルス－ｉ ２Ａ（Ｐ２Ａ）－ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２）、ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）－ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、および口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４）を含む。
【0069】
一実施形態では、少なくとも２つの目的の転写因子をコードする配列は、終止コドンの後の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって分けられ、下流の配列の翻訳を開始することができる。典型的なＩＲＥＳ配列は、例えば脳心筋炎ウイルスまたは血管内皮増殖因子およびＩ型コラーゲン誘導タンパク質（ＶＣＩＰ）のＩＲＥＳ配列を含み、当業者に公知である。
【0070】
したがって、好ましくは、ＩＲＥＳ配列は、少なくとも２つの目的の転写因子をコードする配列間に配置される。少なくとも２つの目的の転写因子をコードする複数の配列が使用される場合、スペーサー配列は、公知の切断配列および／またはＩＲＥＳ配列の組合せを含み得る。
【0071】
一実施形態では、ＩＲＥＳは、以下：
ＧＣＴＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＡＡＴ（配列番号５）
のように、配列番号５に規定するヌクレオチド配列によってコードされる。
ＧＣＴＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＡＡＴ（配列番号５）
のように、配列番号５に規定するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0072】
別の実施形態では、少なくとも２つの目的の転写因子をコードする配列は、終止コドンの後の、第１のサブゲノムプロモーター配列と同一かまたは異なり、下流の配列の転写を開始することができる、第２のサブゲノムプロモーター配列によって分けられる。
【0073】
別の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、本発明に記載の少なくとも１つの目的の転写因子に加えて目的のタンパク質をコードする配列をさらに含み得る。これらの目的のタンパク質は、転写調節因子、蛍光レポーター（例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＢＦＰ、ｍＫａｔｅ等）、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン、ブラスチシジン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン）、またはＩ型およびＩＩＩ型インターフェロン免疫応答の阻害剤（例えば、ワクシニアウイルスタンパク質Ｂ１８Ｒ）であり得る。これらの目的のタンパク質は、本明細書内に記載の少なくとも１つの目的の転写因子から分けられ得る。
【0074】
好ましくは、自己複製ＲＮＡは、ポリ（Ａ）テイルを含む。好ましくは、ポリ（Ａ）テイルは、レプリコンの３’端に配置される。レプリコンは、５’ｃａｐをさらに含み得る。本発明の文脈では、用語「５’－ｃａｐ」は、ＲＮＡ ｃａｐ構造と似ており、そこに付加されている場合、細胞内で、ＲＮＡを安定化する、および／またはＲＮＡの翻訳を増強する能力を持つように改変される５’－ｃａｐアナログを含む。５’ｃａｐは、当業者に公知のもの、例えば、７－メチルグアニル酸ｃａｐ、またはアンチリバースｃａｐアナログ３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ＰＰＰ（５’）Ｇもしくは別のアナログｃａｐ構造であり得る。
【0075】
一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、好ましくは５’から３’に、５’ｃａｐ、５’ＵＴＲ、少なくとも１つの非構造タンパク質をコードする配列、サブゲノムプロモーター、少なくとも１つの転写因子をコードする配列、３’ＵＴＲおよびポリ（Ａ）テイルを含む。
【0076】
本発明の自己複製ＲＮＡは、鋳型としてＤＮＡプラスミドを使用して作製され得る。ＲＮＡコピーは、次いでポリメラーゼ、例えばＴ７ポリメラーゼを使用して、ＤＮＡプラスミド鋳型内のＲＮＡレプリコン配列の５’端にコードされるＴ７プロモーターより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって作製され得る。他のＲＮＡポリメラーゼ、例えばＳＰ６またはＴ３ポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼの代わりに使用され、その場合には、ＲＮＡレプリコンのＤＮＡプラスミド鋳型は、代わりにＳＰ６またはＴ３プロモーターを含み得る。
【0077】
一実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡをコードする核酸配列を含むカセットで送達され得る。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＤＮＡプラスミドまたはアデノウイルスもしくはレンチウイルスにコードされ得る。自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡプラスミド鋳型は、他の機能性エレメントも含み得る。例えば、それらは、宿主細胞においてベクターの導入時に導入遺伝子発現を開始するための好適なプロモーターを含む様々な他の機能性エレメントをさらに含み得る。例えば、ベクターは、好ましくは、起源細胞の核で自主的に複製することができる。この場合、ＤＮＡ複製を誘導または制御するエレメントは、組換えベクターに必要とされ得る。あるいは、ＤＮＡプラスミド鋳型は、宿主細胞のゲノムにインテグレートするように設計され得る。この場合、標的化インテグレーション（例えば、相同組換えによる）を好むＤＮＡ配列が想定される。
【0078】
好適なプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、ウイルスの長い末端反復配列、ならびに誘導性プロモーター、例えば、例のようにテトラサイクリン誘導性システムを含み得る。ＤＮＡプラスミド鋳型は、終結因子、例えば、ベータグロビン、ＳＶ４０ポリアデニル化配列または合成ポリアデニル化配列も含み得る。ＤＮＡプラスミド鋳型は、プロモーターまたは制御因子またはエンハンサーも含み、必要に応じて核酸の発現を調節する。プロモーターまたは制御因子またはエンハンサーは、ＤＮＡプラスミド鋳型上のＲＮＡレプリコンの組織特異性発現を付与し得る。
【0079】
したがって、本発明は、一実施形態において、少なくとも１つの転写因子が発現され、細胞を維持して、細胞の、標的の分化した細胞型の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞への変換を可能にするように、少なくとも１つの転写因子をコードする少なくとも１つの自己複製ＲＮＡを、前記起源細胞へと導入することによる、起源細胞の分化した標的細胞への変換のための方法を提供する。
【0080】
宿主細胞は、真核または原核宿主細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、真核宿主細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。
【0081】
本発明の方法では、自己複製ＲＮＡ媒介細胞変換の効率は、自己複製ＲＮＡの導入に応答する起源細胞の免疫応答経路を阻害することにより改善され得る。好ましくは、起源細胞の免疫応答経路の阻害剤は、細胞のインターフェロン応答またはｄｓＲＮＡ応答経路の阻害剤である。例えば、細胞変換の効率は、組換えワクシニアウイルスＢ１８Ｒタンパク質、Ｉ型インターフェロンデコイを含むことにより、またはルキソリチニブ、ＪＡＫ１／２阻害剤を含むことにより改善され得る。インターフェロン応答経路の小分子またはタンパク質阻害剤は、限定はされないが、フェデラチニブ、ウパダシチニブ、フィルゴチニブ、バリシチニブ、デュークラバシチニブ、リトレシチニブ、デセルノチニブ、ＲＩＧ０１１、ＢＸ７９５、ＭＲＴ６７３０７およびＹ１３６Ｒを含む。一実施形態では、起源細胞の免疫応答経路の阻害剤は、自己複製ＲＮＡ内にコードされたＯＲＦであり得、起源細胞に導入された場合に発現される。例えば、細胞変換の効率は、所望の細胞変換に必要とされる少なくとも１つの転写因子をコードする少なくとも１つの自己複製ＲＮＡと同時に、ワクシニアウイルスタンパク質Ｂ１８Ｒ、Ｉ型インターフェロンデコイをコードする自己複製ＲＮＡを起源細胞に導入することによって改善され得る。
【0082】
一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、１つまたは複数の修飾された塩基を含む。例えば、骨格は、１つまたは複数のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｒｔｈｉｏａｔｅ）修飾の導入によって安定化され得る。代替の実施形態では、５－メチルシトシン、シュードウリジンおよび１－メチルシュードウリジン。より詳細には、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡを含み、少なくとも１つの化学修飾を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含む組成物であって、修飾されたヌクレオシドは、ヒポキサンチン、イノシン、８－ｏｘｏ－アデニン、その７－置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃｌ～Ｃ６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃｌ～Ｃ６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７－置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８－置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７－置換プリン、７－デアザ－８－置換プリン、水素（脱塩基残基）からなる群から選択される、組成物を提供する。自己複製ＲＮＡは、２つ以上の修飾されたヌクレオシドを有し、各修飾は、同じであるかまたは異なり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を含むヌクレオシドは、ジヒドロウリジン、メチルアデノシン、メチルシチジン、メチルグアノシン、メチルウリジン、メチルシュードウリジン、チオウリジン、デオキシシトジンおよびデオキシウリジンからなる群から選択されるか、または修飾ヌクレオチドは、これらからなる群から選択されるヌクレオシドを含む。
【0083】
一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを有する。
【0084】
本発明の方法では、自己複製ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで起源細胞へと導入される。自己複製ＲＮＡは、化学もしくは非化学ベースの方法によってまたはネイキッドＲＮＡとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞へと導入され得る。化学的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質によるリポフェクション、Ｆｕｇｅｎｅ、ポリエチレンイミンおよびデンドリマーを含む。非化学的な方法は、エレクトロポレーション（ヌクレオフェクションを含む）、細胞スクイージング（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、ソノポレーションおよびインペイルフェクションを含む。それは、静脈内または標的部位に局所的にネイキッドＲＮＡまたはＲＮＡ脂質ナノ粒子の注射によってｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入されてもよい。
【0085】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用のため、自己複製ＲＮＡは、好ましくは、カチオン性脂質製剤、例えばリポフェクタミン３０００に製剤化される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで自己複製ＲＮＡを導入するためのカチオン性脂質製剤は、様々な比率の、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウム トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）の混合物に基づく様々な製剤を含み得る。これは、限定はされないが、リポフェクタミン３０００、リポフェクタミン２０００、リポフェクタミン ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸおよびトランスフェクチンを含む、市販の脂質トランスフェクション試薬を含む。自己複製ＲＮＡは、カチオン性ナノエマルジョン中に製剤化され得る。自己複製ＲＮＡは、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーションまたは当技術分野で公知の任意の好適な手段によっても、起源細胞に導入され得る。
【0086】
自己複製ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡとして（ＲＮＡの水溶液として）ｉｎ ｖｉｖｏで送達され得るが、送達系ではＲＮＡを製剤化することが好ましい。ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のため、ＲＮＡは、カチオン性脂質エマルジョンの一部、生分解性ポリマー粒子もしくは脂質ナノ粒子または細胞へのＲＮＡの進入を促進し、ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する他の材料として投与されることが好ましい。核酸の送達系は、当技術分野で公知である（Ｐａｒｄｉら、２０２０．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６５、１４～２０；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｏｉ．２０２０．０１．００８）。
【0087】
カチオン性脂質は、典型的には、様々な組成物の正に荷電した頭部に続いて疎水性テイルを特徴とする。通常、不飽和であり、短い（＜３０の単量体）炭化水素鎖が最高の形質導入効率と関連する。水性製剤では、これらの脂質は正に荷電した表面を有するミセルを形成し、ＲＮＡと複合体化する（必ずしもカプセル化されない）。ＭＦ５９の構成成分（スクアレン ｓｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８０）と乳化したカチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）が好ましい。
【0088】
ワクチン使用のための自己複製ＲＮＡの脂質ナノ粒子送達が公知である。典型的には、脂質ナノ粒子は、４つの成分、カチオン性またはイオン化脂質；コレステロール；ヘルパーリン脂質およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質で構成される。イオン化脂質は、酸性条件下および生理的ｐＨでＲＮＡをカプセル化させるが、製剤が細胞に進入すると、脂質をイオン化し、ＲＮＡを粒子から分けるため、好ましい。
【0089】
ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、複製を可能にするｃｉｓ活性配列をそれぞれ含有する２つの分子として起源細胞に送達され、第１の分子は非構造遺伝子を運び、第２の分子は少なくとも１つの目的の転写因子をコードし得る。
【0090】
したがって、本発明の一実施形態では、転写因子をコードする自己複製ＲＮＡを含む医薬組成物および群：脂質ナノ粒子、カチオン性脂質エマルジョンおよび生分解性ポリマー粒子から選択される送達系が提供される。
【0091】
したがって、本明細書に記載の本発明は、少なくとも１つの転写因子、および場合により、少なくとも１つの他のオープンリーディングフレーム配列をコードする自己複製ＲＮＡの組成物、例えば転写調節因子、抗生物質耐性、Ｉ型およびＩＩＩ型インターフェロン応答の阻害剤、またはレポータータンパク質をコードするものならびに送達系を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で所望の細胞変換を達成する。
【0092】
本発明は、起源細胞から分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す少なくとも１つの細胞を生成する方法であって、少なくとも１つの転写因子が発現されるように、転写因子をコードする自己複製ＲＮＡの導入によって起源細胞において１つまたは複数の転写因子の量を増加させるステップ、ならびに細胞を分化した標的細胞へと変換させる十分な時間および条件下で起源細胞を培養し、それにより起源細胞から分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞を生成するステップを含む方法をさらに提供する。一実施形態では、方法は、自己複製ＲＮＡの導入によって起源細胞における２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の転写因子の量を増加させるステップを含む。
【0093】
本発明は、起源細胞の集団から分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す少なくとも１つの細胞を生成する方法であって、起源細胞の集団の少なくとも１つの細胞における転写因子をコードする自己複製ＲＮＡの導入によって１つまたは複数の転写因子の量を増加させるステップ；ならびに細胞を分化した標的細胞へと変換させる十分な時間および条件下で起源細胞の集団を培養し、それにより起源細胞の集団から分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞の集団を生成するステップを含む方法を提供する。
【0094】
起源細胞または起源細胞の集団は、人工多能性幹細胞、または分化した細胞を含む、本明細書に記載の任意の多能性細胞または分化した細胞型であり得る。一部の態様では、起源細胞集団は、異なる起源細胞の混合であり得る。分化した細胞は、成体細胞または、成体もしくは非胚細胞の１つまたは複数の検出可能な表現型特徴を示す成体由来の細胞であり得る。本発明の起源細胞または起源細胞の集団は、典型的には、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、霊長類細胞、げっ歯類細胞（例えば、マウスまたはラット）、ウマ細胞およびウシ細胞、好ましくはヒト細胞である。本発明に記載の分化した起源細胞または分化した標的細胞は、３つの胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の任意の細胞であり得る。分化した細胞の例は、心細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、赤血球、肺細胞、膵臓細胞、ニューロン細胞、軟骨細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞または筋芽細胞を含む。本明細書で使用される「分化した細胞」は、初代細胞（非不死化細胞）であってもよく、または細胞株（不死化細胞）由来細胞であってもよい。分化した細胞は、健常細胞または疾患細胞であり得る。
【0095】
一部の態様では、起源細胞は、多能性幹細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、人工多能性幹細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は胚性幹細胞であり得る。
【0096】
一部の態様では、起源細胞は、複能性幹細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、間葉系幹細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、神経幹細胞であり得る。
【0097】
一部の態様では、起源細胞は、線維芽細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、皮膚線維芽細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、歯肉（口腔）線維芽細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、包皮線維芽細胞であり得る。
【0098】
一部の態様では、起源細胞は、内皮細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、血管内皮細胞であり得る。一部の態様では、起源細胞は、リンパ管内皮細胞であり得る。
【0099】
一部の態様では、起源細胞は、血液に由来し得る。一部の態様では、起源細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離され得る。一部の態様では、起源細胞は、血液由来ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の態様では、起源細胞は、血液由来ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の態様では、起源細胞は、血液由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞である。一部の態様では、起源細胞は、血液由来ＣＤ１９＋Ｂ細胞である。
【0100】
本発明は、起源細胞の集団から分化した標的細胞の集団を生成する方法であって、少なくとも１つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡを導入することによって、起源細胞の集団の１つまたは複数の転写因子の量を増加させるステップ；ならびに細胞を分化した標的細胞の集団へと変換させる十分な時間および条件下で起源細胞の集団を維持するステップであって、分化した標的細胞の集団において少なくとも０．１％の細胞が分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示し；それにより、起源細胞の集団から分化した標的細胞の集団を生成するステップを含む方法を提供する。
【0101】
本発明の方法の一部の態様では、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、もしくは少なくとも１０％の分化した標的細胞または分化した標的細胞の集団は、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す。
【0102】
他の態様では、少なくとも１０％から２０％、好ましくは５０％より多く、より好ましくは７０％より多く、より好ましくは少なくとも８５％、９５％もしくは１００％の分化した標的細胞または分化した標的細胞の集団が、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す。
【0103】
一部の態様では、分化した標的細胞は、ニューロン、マクロファージ、肝細胞または筋細胞である。
【0104】
本発明の方法は、オリジナルの非改変起源細胞と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、１つまたは複数の転写タンパク質の量を増加させる。
【0105】
一部の態様では、分化した標的細胞の集団の少なくとも１％の細胞は、ニューロンの少なくとも１つの表現型特徴を示す。他の実施形態では、分化した標的細胞の集団は、筋細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す。典型的には、細胞変換に好適な条件は、十分な時間および好適な培地中で細胞を培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０日であり得る。
【0106】
本明細書に記載の任意の方法では、方法は、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞を拡大し、その表現型特徴を示す集団の細胞の割合を増加させるステップをさらに含み得る。細胞を拡大するステップは、本明細書に記載の細胞の集団を生成するために十分な時間および条件下で培養され得る。本明細書に記載の任意の方法では、方法は、分化した標的細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞、またはその細胞を含む細胞集団を投与するステップをさらに含む。
【0107】
本明細書に記載の細胞変換方法は、自家治療（すなわち、起源細胞が対象から単離され、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡを使用して細胞変換され、分化した標的細胞を生成し、次いで同じ対象に注射し戻される）または他家治療（すなわち、起源細胞が対象から単離され、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡを使用して細胞変換され、分化した標的細胞を生成し、次いで異なる対象に注射し戻される）に利用され得る。起源細胞の細胞変換の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞変換法であり、それにより、少なくとも１つの転写因子をコードする自己複製ＲＮＡが対象に送達され、所望の分化した標的細胞への起源細胞の細胞変換はｉｎ ｖｉｖｏで生じる。
【実施例】
【0108】
実施例１
自己複製ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
アルファウイルスベースのレプリコンを含有するプラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）を生成した。利用したアルファウイルスベースのレプリコンは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス株ＴＣ－８３ゲノムに由来した。それは、ＶＥＥＶゲノムからの配列を直接コードするが、ウイルスの構造タンパク質コード配列は、感染性ウイルス粒子の産生を防ぐために除去した（図１）。ウイルスの非構造タンパク質コード領域は、ウイルスの５’－および３’－ｃｉｓ活性配列、５’－端のＴ７プロモーターに隣接し、合成のポリアデニル化配列が続いた。プラスミド鋳型を改変し、ウイルスの２６Ｓサブゲノムプロモーターの直後に、ウイルスゲノム配列内に多重クローニング部位を含み、標的オープンリーディングフレームの発現を可能にした。
自己複製ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
アルファウイルスベースのレプリコンを含有するプラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって自己複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）を生成した。利用したアルファウイルスベースのレプリコンは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス株ＴＣ－８３ゲノムに由来した。それは、ＶＥＥＶゲノムからの配列を直接コードするが、ウイルスの構造タンパク質コード配列は、感染性ウイルス粒子の産生を防ぐために除去した（図１）。ウイルスの非構造タンパク質コード領域は、ウイルスの５’－および３’－ｃｉｓ活性配列、５’－端のＴ７プロモーターに隣接し、合成のポリアデニル化配列が続いた。プラスミド鋳型を改変し、ウイルスの２６Ｓサブゲノムプロモーターの直後に、ウイルスゲノム配列内に多重クローニング部位を含み、標的オープンリーディングフレームの発現を可能にした。
【0109】
鋳型プラスミドは、ＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化された（図２）。線状の鋳型を使用して、Ｔ７ ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってラン・オフ転写物を生成した。完全にｃａｐされ、ポリアデニル化したｒｅｐＲＮＡ転写物は、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ＡＵ Ｃａｐ １ ｃａｐｐｉｎｇ試薬（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する同時転写ｃａｐｐｉｎｇ反応で産生された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、０．５μｇの線状化プラスミド鋳型と、ヌクレオチド三リン酸および７．５ｍＭの最終濃度でＣｌｅａｎＣａｐ ＡＵ ｃａｐｐｉｎｇ試薬により、２時間３７℃で実施した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後、プラスミド鋳型は１５分間３７℃でのＤＮａｓｅＩ処理によって除去された。ＲＮＡは、２．５Ｍ酢酸アンモニウムによって氷上で沈殿させ、７０％エタノールによって洗浄し、水中で再構築した。ＲＮＡは、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって解析して純度および濃度を評価し、アガロースゲル電気泳動により純度およびサイズをさらに評価した（図２）。図２のアガロースゲル画像は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって分けられた、ＧＦＰおよびピューロマイシン ｎ－アセチル化トランスフェラーゼ（Ｐｕｒｏ（登録商標））をコードするオープンリーディングフレームを有する１１ｋｂのｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡの生成の成功を示す。
【0110】
実施例２
ＧＦＰ発現自己複製ＲＮＡの送達およびｉＰＳＣでのＧＦＰ発現の評価
プラスミド鋳型は、ＩＲＥＳ配列によって分けられた、ＧＦＰおよびピューロマイシン ｎ－アセチル化トランスフェラーゼ（Ｐｕｒｏ（登録商標））をコードする自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入された配列によって構築された（図２）。このプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡを生成した（図２は、アガロースゲルで解析したこのＲＮＡスプライスを示す）。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、通常、完全Ｅ８増殖培地（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ ＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持し、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるコロニー解離によって４～５日ごとに継代した。ｉＰＳＣのコンフルエントな培養は、ヌクレオフェクションの前に９０分間、１０μＭ Ｙ－２７６３２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって前処理した。ヌクレオフェクションのため、ｉＰＳＣをＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって４分間処理し、単一細胞の懸濁液を作製し、回収および計数した。必要な数の細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、完全Ｐ３緩衝液（Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ；Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。ｉＰＳＣは、１×１０６個の細胞当たり２μｇのＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡによって、Ｌｏｎｚａ４Ｄシステムを使用してヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした細胞を、１０μＭ Ｙ－２７６３２を含む完全Ｅ８増殖培地中、１×１０５個の細胞／ｃｍ２の密度で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ ＸＦコートした培養プレートにプレートした。ある特定の実験では、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を、最終濃度５００ｎｇ／ｍＬで、組換えＢ１８Ｒタンパク質（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ）を、最終濃度２００ｎｇ／ｍＬで、細胞に添加した。ＧＦＰ発現は、顕微鏡およびフローサイトメトリーによって評価した（図３）。ライブセル蛍光顕微鏡を、ＧＦＰフィルターセットを使用してＬｅｉｃａ ＤＭｉ１倒立顕微鏡で実施した。フローサイトメトリーのため、細胞を、ＴｒｙｐＬＥと５分間インキュベートし、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ中に回収した。次いで、細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、解析のため、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ中に再懸濁した。調製した細胞を、標準フィルターセットを使用するＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で解析した。
ＧＦＰ発現自己複製ＲＮＡの送達およびｉＰＳＣでのＧＦＰ発現の評価
プラスミド鋳型は、ＩＲＥＳ配列によって分けられた、ＧＦＰおよびピューロマイシン ｎ－アセチル化トランスフェラーゼ（Ｐｕｒｏ（登録商標））をコードする自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入された配列によって構築された（図２）。このプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡを生成した（図２は、アガロースゲルで解析したこのＲＮＡスプライスを示す）。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、通常、完全Ｅ８増殖培地（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ ＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持し、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるコロニー解離によって４～５日ごとに継代した。ｉＰＳＣのコンフルエントな培養は、ヌクレオフェクションの前に９０分間、１０μＭ Ｙ－２７６３２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって前処理した。ヌクレオフェクションのため、ｉＰＳＣをＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって４分間処理し、単一細胞の懸濁液を作製し、回収および計数した。必要な数の細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、完全Ｐ３緩衝液（Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ；Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。ｉＰＳＣは、１×１０６個の細胞当たり２μｇのＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡによって、Ｌｏｎｚａ４Ｄシステムを使用してヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした細胞を、１０μＭ Ｙ－２７６３２を含む完全Ｅ８増殖培地中、１×１０５個の細胞／ｃｍ２の密度で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ ＸＦコートした培養プレートにプレートした。ある特定の実験では、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を、最終濃度５００ｎｇ／ｍＬで、組換えＢ１８Ｒタンパク質（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ）を、最終濃度２００ｎｇ／ｍＬで、細胞に添加した。ＧＦＰ発現は、顕微鏡およびフローサイトメトリーによって評価した（図３）。ライブセル蛍光顕微鏡を、ＧＦＰフィルターセットを使用してＬｅｉｃａ ＤＭｉ１倒立顕微鏡で実施した。フローサイトメトリーのため、細胞を、ＴｒｙｐＬＥと５分間インキュベートし、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ中に回収した。次いで、細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、解析のため、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ中に再懸濁した。調製した細胞を、標準フィルターセットを使用するＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で解析した。
【0111】
データは、フローサイトメトリー（図３Ａ）と顕微鏡（図３Ｂ）との両方によって観察されたＧＦＰ発現によって確認したように、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡがｉＰＳＣで効率的に発現されたことを示す。フローサイトメトリー解析は、９６．４％のｉＰＳＣがＧＦＰ陽性であることによって証明されたように、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡが非常に高効率でｉＰＳＣにトランスフェクトされたことを示した。
【0112】
実施例３
ｉＰＳＣにおける自己複製ＲＮＡ、標準非複製ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはレンチウイルスのいずれかによってコードされたＧＦＰの発現キネティクス
標準ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型は、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡプラスミド鋳型からのＰＣＲに由来する。ＰＣＲは、鋳型として１ｎｇのＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡプラスミドＤＮＡと、ＧＦＰ開始コドンの上流のＴ７プロモーター、５’ＵＴＲおよびカノニカルＫｏｚａｋ配列、ならびにＧＦＰ終止コドンの下流の１２０残基のポリアデニル化配列を組み込むように設計されたプライマー（配列番号６および７）と、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｒａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。
ｉＰＳＣにおける自己複製ＲＮＡ、標準非複製ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはレンチウイルスのいずれかによってコードされたＧＦＰの発現キネティクス
標準ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型は、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡプラスミド鋳型からのＰＣＲに由来する。ＰＣＲは、鋳型として１ｎｇのＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡプラスミドＤＮＡと、ＧＦＰ開始コドンの上流のＴ７プロモーター、５’ＵＴＲおよびカノニカルＫｏｚａｋ配列、ならびにＧＦＰ終止コドンの下流の１２０残基のポリアデニル化配列を組み込むように設計されたプライマー（配列番号６および７）と、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｒａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。
【0113】
【表6】
【0114】
ＧＦＰを発現するレンチウイルス粒子を生成するため、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）は、１０％ウシ胎仔血清およびピルビン酸ナトリウムを補足したＤＭＥＭ高グルコース中で維持した。シーディング後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔに、ｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド、ｐＭＤ２．ＧエンベローププラスミドおよびＧＦＰの発現を駆動するＥＦ１ａプロモーターをコードするトランスファープラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用してトランスフェクトした。培地は、トランスフェクションの１８時間後に注意深く置き換え、ウイルスを含有する上清をトランスフェクション後４８時間に、ＰＥＧ ６０００（Ｓｉｇｍａ）を使用するウイルス濃縮の前に採取した。濃縮したウイルスをＤＭＥＭ中で希釈し、使用前に－８０℃で保存した。
【0115】
ｉＰＳＣは、１０μＭのＹ－２７６３２を補足した完全Ｅ８増殖培地中、６．５×１０４個の細胞／ｃｍ２でシードし、６時間後、最終濃度６．２５μｇ／ｍＬに、ポリブレンの添加によりＭＯＩ ２でレンチウイルスによって形質導入した。ｉＰＳＣは、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＭＡ、ＧＦＰｍＲＮＡまたはＥＦ１ａプロモーター－ＧＦＰプラスミドによってヌクレオフェクトした。形質導入およびヌクレオフェクトした細胞を複数回継代して培養を継続し、設定した時点でフローサイトメトリーによって解析した。ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡをヌクレオフェクトしたｉＰＳＣのサブセットは、５００ｎｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加した標準増殖培地中で維持した（ヌクレオフェクション後２４時間から）。
【0116】
データは、ｒｅｐＲＮＡによって媒介されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（図４Ａ）およびＧＦＰ発現の強度（図４Ｂ）の両方が、相当する時点での標準ｍＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡからのＧＦＰ発現と比較して上昇されることを示す。レンチウイルス形質導入細胞は、延長された高パーセンテージのＧＦＰ細胞を示す（図４Ａ）が、ｒｅｐＲＮＡは、形質導入／ヌクレオフェクション後、最初の４日でのＧＦＰ発現のはるかにより高い強度を示す（図４Ｂ）。さらに、ピューロマイシン選択を適用することによってＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）カセットの機能性の試験は、ｒｅｐＲＮＡ媒介ＧＦＰ発現が、増殖するｉＰＳＣ培養中において維持され、ヌクレオフェクション後３週間まで少なくとも８０％のｉＰＳＣにおいてＧＦＰ発現が観察され、レンチウイルス形質導入ｉＰＳＣ培養で観察されたレベルと類似することを示した（図５）。
【0117】
これらのデータを合わせると、ｒｅｐＲＮＡがレンチウイルスと同等の効率で細胞に送達され、その発現のために宿主ゲノムへのインテグレーションを必要とするレンチウイルスとは違い、ｒｅｐＲＮＡからの発現は、宿主細胞の遺伝子改変なく延長された期間細胞内で維持され得ることが実証された。さらに、ｒｅｐＲＮＡからの発現レベルは、トランスフェクション後最初の４日で、任意の他の送達方法で達成されたよりも著しく高い。これは、外因性遺伝子発現のための現在の技術を超えるｒｅｐＲＮＡの利点を示し、プラスミドおよびｍＲＮＡを超えて発現レベルを増加させるが、発現のためにレンチウイルスが必要とする宿主細胞の遺伝子改変を不要とする。
【0118】
実施例４
ＧＦＰ発現自己複製ＲＮＡの送達ならびに皮膚線維芽細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現の評価
ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ；ＡＴＣＣ）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）は、通常、１０％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ中で維持した。トランスフェクションのため、ＨＤＦおよびＨＥＫ２９３Ｔを、ＴｒｙｐＬＥによって５分間処理し、単一細胞の懸濁液を作製し、回収および計数した。必要な数の細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、緩衝液Ｒ（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に再懸濁した。細胞は、３×１０５個の細胞当たり１μｇのＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡによって、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎシステムを使用して電気穿孔した。電気穿孔したＨＤＦを３×１０４個の細胞／ｃｍ２の密度で、ＨＥＫ２９３Ｔを１×１０５個の細胞／ｃｍ２の密度でプレートした。ＧＦＰ発現は、トランスフェクション後７２時間にフローサイトメトリーによって評価した（図６Ａ）。
ＧＦＰ発現自己複製ＲＮＡの送達ならびに皮膚線維芽細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現の評価
ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ；ＡＴＣＣ）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）は、通常、１０％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ中で維持した。トランスフェクションのため、ＨＤＦおよびＨＥＫ２９３Ｔを、ＴｒｙｐＬＥによって５分間処理し、単一細胞の懸濁液を作製し、回収および計数した。必要な数の細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、緩衝液Ｒ（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に再懸濁した。細胞は、３×１０５個の細胞当たり１μｇのＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡによって、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎシステムを使用して電気穿孔した。電気穿孔したＨＤＦを３×１０４個の細胞／ｃｍ２の密度で、ＨＥＫ２９３Ｔを１×１０５個の細胞／ｃｍ２の密度でプレートした。ＧＦＰ発現は、トランスフェクション後７２時間にフローサイトメトリーによって評価した（図６Ａ）。
【0119】
データは、ｉＰＳＣと同様に、標準細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）および初代細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）も効率的にトランスフェクトされ、ｒｅｐＲＮＡを機能的に発現し得ることも示す（図６Ａ）。
【0120】
ワクシニアウイルス由来Ｂ１８Ｒタンパク質および小分子ＪＡＫ１／２阻害剤であるルキソリチニブは、細胞の抗ウイルス応答を阻害することにより、自己複製ＲＮＡの発現動態を改善することができることが以前に実証されている（Ｂｌａｋｎｅｙら、２０２１）。一部の実施形態では、組換えウイルスＢ１８Ｒタンパク質（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ）またはルキソリチニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）は、トランスフェクションの時点で、およびＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡからのＧＦＰの発現を維持する試みで実験の時間経過にわたり維持培地に含まれる。トランスフェクション後、ＨＤＦは、標準培地中、または２００ｎｇ／ｍＬ Ｂ１８Ｒまたは１０μＭルキソリチニブを含有する標準培地により維持し、２～３日ごとに培地交換し、ＧＦＰ発現を１０日間経時的にフローサイトメトリーによって評価した（図６Ｂ）。
【0121】
データは、インターフェロン応答経路ブロッカーＢ１８Ｒまたはルキソリチニブの標準培養培地への添加は、１４日間経時的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＦＰのｒｅｐＲＮＡ媒介発現の維持をもたらすことを示す（図６Ｂ）。
【0122】
実施例５
ＮＥＵＲＯＧ２発現自己複製ＲＮＡを使用する、ニューロンへのｉＰＳＣの変換
ｉＰＳＣのニューロンへの急速な変換は、単一の転写因子によって効率的に達成され、細胞変換を試験するための理想的なモデルシステムを提示し得る。ＮＥＵＲＯＧ２の強制的な発現が７日未満にｉＰＳＣをニューロンに変換するのに十分であることを実証する多くの公開された報告がある（Ｚｈａｎｇら、２０１３ Ｎｅｕｒｏｎ，７８（５）、７８５～７９８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１３．０５．０２９）。ＮＥＵＲＯＧ２発現後、ｉＰＳＣは、樹状突起様突出および小さい細胞体により、古典的な神経形態を急速に取り入れる。変換された細胞は、それらの細胞表面にＮＣＡＭ、ならびにニューロン特異的遺伝子ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２およびＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）も発現する。
ＮＥＵＲＯＧ２発現自己複製ＲＮＡを使用する、ニューロンへのｉＰＳＣの変換
ｉＰＳＣのニューロンへの急速な変換は、単一の転写因子によって効率的に達成され、細胞変換を試験するための理想的なモデルシステムを提示し得る。ＮＥＵＲＯＧ２の強制的な発現が７日未満にｉＰＳＣをニューロンに変換するのに十分であることを実証する多くの公開された報告がある（Ｚｈａｎｇら、２０１３ Ｎｅｕｒｏｎ，７８（５）、７８５～７９８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１３．０５．０２９）。ＮＥＵＲＯＧ２発現後、ｉＰＳＣは、樹状突起様突出および小さい細胞体により、古典的な神経形態を急速に取り入れる。変換された細胞は、それらの細胞表面にＮＣＡＭ、ならびにニューロン特異的遺伝子ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２およびＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）も発現する。
【0123】
ＮＥＵＲＯＧ２媒介細胞変換を促進するｒｅｐＲＮＡの能力を試験するため、ＩＲＥＳ配列によって分けられたＮＥＵＲＯＧ２およびＰｕｒｏ（登録商標）－Ｔ２Ａ－ＧＦＰをコードする、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入された配列により、プラスミド鋳型を構築した（図７Ａ）。このプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＮＥＵＲＯＧ２－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）：Ｔ２Ａ：ＧＦＰ（ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ）ｒｅｐＲＮＡを生成した。ｉＰＳＣのニューロン変換実験のため、ｉＰＳＣは、先に記載したように、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡによってヌクレオフェクトされ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）コートした培養プレートにプレートした。ヌクレオフェクション後２４時間に、培地を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２＋Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に交換し、２～３日ごとに半培地交換した（図７Ｂ）。
【0124】
画像は、対照ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡまたはＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡのいずれかによるヌクレオフェクション後２日目および７日目のｉＰＳＣ由来細胞の形態を示す（図８）。ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡによってヌクレオフェクトしたｉＰＳＣは、２日目と７日目の両方で典型的なｉＰＳＣ様形態を示した。２日目に、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡによってヌクレオフェクトした細胞は、対照と比較して、それらの形態に明確な変化を示し、７日目には、複数の樹状突起様伸長および小さい細胞体による神経形態を示した。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による遺伝子発現解析
ＲＮＡは、ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して培養細胞から単離された。細胞は、ＴｒｙｐＬＥによって４分間処理後、３００ｇで４分間遠心分離によって回収し、ＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って単離され、カラム上でのＤＮａｓｅ消化により夾雑ＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、１０００ｎｇの鋳型ＲＮＡにより、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、精製したＲＮＡから生成した。定量的ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、予め指定したＴａｑＭａｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって実施し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を実行した。ＦＢＸＬ１２およびＳＲＰ７２を、ハウスキーピング遺伝子対照として使用した。相対遺伝子発現は、ΔΔＣＴ法を使用して算出した。
ＮＣＡＭのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーのため、細胞を５分間ＴｒｙｐＬＥとインキュベートし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に回収した。次いで、細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）マウスモノクローナル抗体（１：５００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ中に再懸濁した。調製した細胞は、標準フィルターセットを使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで解析した。
ＴＵＢＢ３の免疫細胞化学（ＩＣＣ）検出
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ＋４％パラホルムアルデヒドによって室温で１５分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、室温で１５分間、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により１ステップでブロックおよび透過処理した。細胞を、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清中の精製した抗チューブリンβ３（ＴＵＢＢ３）抗体（１：１００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と室温で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート二次抗体（１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と室温で１時間インキュベートした。抗体ステップ後、細胞は、Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ１倒立顕微鏡での画像化の前に、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中４℃で保存した。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による遺伝子発現解析
ＲＮＡは、ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して培養細胞から単離された。細胞は、ＴｒｙｐＬＥによって４分間処理後、３００ｇで４分間遠心分離によって回収し、ＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って単離され、カラム上でのＤＮａｓｅ消化により夾雑ＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、１０００ｎｇの鋳型ＲＮＡにより、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、精製したＲＮＡから生成した。定量的ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、予め指定したＴａｑＭａｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって実施し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を実行した。ＦＢＸＬ１２およびＳＲＰ７２を、ハウスキーピング遺伝子対照として使用した。相対遺伝子発現は、ΔΔＣＴ法を使用して算出した。
ＮＣＡＭのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーのため、細胞を５分間ＴｒｙｐＬＥとインキュベートし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に回収した。次いで、細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）マウスモノクローナル抗体（１：５００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ中に再懸濁した。調製した細胞は、標準フィルターセットを使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで解析した。
ＴＵＢＢ３の免疫細胞化学（ＩＣＣ）検出
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ＋４％パラホルムアルデヒドによって室温で１５分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、室温で１５分間、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により１ステップでブロックおよび透過処理した。細胞を、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清中の精製した抗チューブリンβ３（ＴＵＢＢ３）抗体（１：１００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と室温で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート二次抗体（１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と室温で１時間インキュベートした。抗体ステップ後、細胞は、Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ１倒立顕微鏡での画像化の前に、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中４℃で保存した。
【0125】
分化した培養の解析は、ＮＥＵＲＯＧ２ ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡがｉＰＳＣを神経細胞に効率的に変換したことを示した。トランスフェクション後７日目のｑＰＣＲによる神経細胞マーカー遺伝子発現の評価は、対照細胞と比較して、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡによってヌクレオフェクトしたｉＰＳＣにおいて神経細胞特異的遺伝子発現の増加を示す（図９Ａ）。多能性関連遺伝子の発現は、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡによってトランスフェクションされず、ニューロンに変換されなかった増殖性ｉＰＳＣの存在によって維持された（最初の細胞集団のおよそ３％）。神経細胞表面マーカーＮＣＡＭを検出するフローサイトメトリーは、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡをヌクレオフェクトした培養中、高パーセンテージのＮＣＡＭ陽性細胞を示し、さらに、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧからのＧＦＰ発現はＮＣＡＭ発現を伴った（図９Ｂ）。最後に、ＴＵＢＢ３発現のＩＣＣ解析は、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡをヌクレオフェクトした培養中の予想されるクラスＩＩＩ β－チューブリン細胞内分布を有する神経細胞を検出するが、対照培養では検出されなかった（図９Ｃ）。
【0126】
これらのデータを合わせると、ＮＥＵＲＯＧ２をコードするｒｅｐＲＮＡはｉＰＳＣへ送達され、それらのニューロンへの早く、高効率の変換を誘導し得ることが実証された。これは、ｒｅｐＲＮＡが、細胞変換を駆動するための転写因子を送達する確かな様式であることを示す。
【0127】
実施例６
ニューロンへの変換のため、ｉＰＳＣにＮＥＵＲＯＧ２を送達する異なる方法の比較
ＮＥＵＲＯＧ２をｉＰＳＣに送達し、それらのニューロンへの変換を駆動する異なる方法の効率を試験するため、３つの異なるｉＰＳＣ株を、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡもしくはＥＦ１ａプロモーター－ＮＥＵＲＯＧ２プラスミドのいずれかによってヌクレオフェクトするか、またはＮＥＵＲＯＧ２を発現するレンチウイルス粒子によって形質導入した。ＮＥＵＲＯＧ２を発現するレンチウイルス粒子は、ＮＥＵＲＯＧ２の発現を駆動するＥＦ１ａプロモーターをコードする移行プラスミドを使用して、先に記載したように生成した。ヌクレオフェクション後および形質導入後、細胞を維持し、先に記載したようにＩＣＣおよびフローサイトメトリーによって解析した。
ニューロンへの変換のため、ｉＰＳＣにＮＥＵＲＯＧ２を送達する異なる方法の比較
ＮＥＵＲＯＧ２をｉＰＳＣに送達し、それらのニューロンへの変換を駆動する異なる方法の効率を試験するため、３つの異なるｉＰＳＣ株を、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡもしくはＥＦ１ａプロモーター－ＮＥＵＲＯＧ２プラスミドのいずれかによってヌクレオフェクトするか、またはＮＥＵＲＯＧ２を発現するレンチウイルス粒子によって形質導入した。ＮＥＵＲＯＧ２を発現するレンチウイルス粒子は、ＮＥＵＲＯＧ２の発現を駆動するＥＦ１ａプロモーターをコードする移行プラスミドを使用して、先に記載したように生成した。ヌクレオフェクション後および形質導入後、細胞を維持し、先に記載したようにＩＣＣおよびフローサイトメトリーによって解析した。
【0128】
異なる培養の解析は、ＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡは、プラスミドＤＮＡまたはレンチウイルスよりも高効率で、３つ全てのｉＰＳＣ株からのｉＰＳＣを神経細胞に変換したことを示した、ＴＵＢＢ３発現のＩＣＣ解析は、ＮＥＵＲＯＧ２レンチウイルスまたはＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡのいずれかでヌクレオフェクトした培養により、ニューロンに変換されたｉＰＳＣの培養における予想されるクラスＩＩＩ β－チューブリンの細胞内分布を有する神経細胞を検出した（図１０Ａ）。神経細胞表面マーカーＮＣＡＭを検出するフローサイトメトリーは、レンチウイルス形質導入した培養よりもＮＥＵＲＯＧ２－ｉＰＴＧ ｒｅｐＲＮＡをヌクレオフェクトした培養において高パーセンテージのＮＣＡＭ陽性細胞を示し、複数のｉＰＳＣ株で確認した（図１０Ｂ）。
【0129】
これらのデータを合わせると、ｒｅｐＲＮＡによる転写因子の送達は、プラスミドまたはレンチウイルス媒介送達よりも細胞変換の効率がよく、プロセス中に宿主細胞を遺伝的に改変しない利点を伴うことが実証される。データは、異なるドナーからの３つの異なるｉＰＳＣ株からの細胞の高効率の神経変換によって証明されたように、プロトコールのロバスト性も強調する。
【0130】
実施例７
ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌ発現自己複製ＲＮＡを使用する、ニューロンへの皮膚線維芽細胞の変換
ニューロンへの線維芽細胞の変換は、皮膚線維芽細胞における転写因子ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌの発現によって達成され得る（Ｐａｎｇら、２０１１ Ｎａｔｕｒｅ、４７６（７３５９）、２２０～２２３；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０２０２）。細胞変換のための自己複製ＲＮＡの利用をさらに例示するため、ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌを発現する自己複製ＲＮＡを、ＨＤＦをニューロンに変換するそれらの能力について試験した。
ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌ発現自己複製ＲＮＡを使用する、ニューロンへの皮膚線維芽細胞の変換
ニューロンへの線維芽細胞の変換は、皮膚線維芽細胞における転写因子ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌの発現によって達成され得る（Ｐａｎｇら、２０１１ Ｎａｔｕｒｅ、４７６（７３５９）、２２０～２２３；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０２０２）。細胞変換のための自己複製ＲＮＡの利用をさらに例示するため、ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌを発現する自己複製ＲＮＡを、ＨＤＦをニューロンに変換するそれらの能力について試験した。
【0131】
皮膚線維芽細胞のニューロン変換実験のため、ＨＤＦに、先に記載したように、等モル量のＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌ ｒｅｐＲＮＡ、またはポリシストロニックＡＳＣＬ１－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡとＭＹＴ１ ｒｅｐＲＮＡを同時トランスフェクトし、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）コートした培養プレート上にプレートした。ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌ ｒｅｐＲＮＡを得るため、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入されたＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１またはＭＹＴ１Ｌのいずれかをコードする配列を有する別々のプラスミド鋳型を構築した。ＡＳＣＬ１－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１ポリシストロニックｒｅｐＲＮＡを得るため、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーによってプラスミド鋳型を構築し、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位にＡＳＣＬ１－Ｐ２Ａ－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１をコードする配列を挿入した（図１１Ａ参照）。これらのプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭＹＴ１ＬおよびＡＳＣＬ１－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１ポリシストロニックｒｅｐＲＮＡを生成した。同時トランスフェクション後、細胞は皮膚線維芽細胞増殖培地中にシードし、２４時間で、ＤＭＥＭ：Ｆ１２の１：１混合物、および２％ Ｂ２７サプリメント、０．５％ Ｎ２サプリメント、５００μＭ バルプロ酸、２００ｎＭ Ｌ－アスコルビン酸、１０μＭ Ｙ－２７６３２、＋５００μＭ ｄＢｃＡＭＰ、２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ ＳＢ４３１５４２、０．５μＭ ＬＤＮ１９３１８９、１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１０μＭルキソリチニブを補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａからなる神経誘導培地によって完全に置き換え、２～３日ごとに培地交換した。ＮＣＡＭ１発現のフローサイトメトリーおよびＴＵＢＢ３発現のＩＣＣ解析を、先に記載したようにトランスフェクション後１４日目に実施した（図１１）。
【0132】
分化した培養の解析は、ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌが、個々のｒｅｐＲＮＡとして導入されるかまたはポリシストロニックなｒｅｐＲＮＡによって部分的にコードされる場合、皮膚線維芽細胞をニューロンに変換できることを示した。ＴＵＢＢ３発現のＩＣＣ解析は、ＡＳＣＬ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＮＥＵＲＯＤ１およびＭＹＴ１Ｌのいずれかの個々のｒｅｐＲＮＡまたはポリシストロニックＡＳＣＬ１－ＰＯＵ３Ｆ２－ＮＥＵＲＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡとＭＹＴ１Ｌ ｒｅｐＲＮＡによって電気穿孔したＨＤＦの培養中の予測されるクラスＩＩＩ β－チューブリン細胞内分布を有する神経細胞を検出した（図１１Ｂ）。神経細胞表面マーカーＮＣＡＭを検出する例示的フローサイトメトリーは、変換されたＨＤＦの培養において神経細胞マーカー発現を確認した（図１１Ｃ）。
【0133】
これらのデータは、特定の転写因子をコードするｒｅｐＲＮＡが、皮膚線維芽細胞をニューロンに変換することができ、転写因子の組合せの少なくとも一部はポリシストロニックｒｅｐＲＮＡにうまくコードされ得ることを実証する。これは、異なる開始起源細胞型にわたる細胞変換のためのｒｅｐＲＮＡの使用の広範な適用可能性をさらに示す。
【0134】
実施例８
ＭＹＯＤ１発現自己複製ＲＮＡを使用する、筋細胞へのｉＰＳＣおよび皮膚線維芽細胞の変換
ｉＰＳＣと線維芽細胞の両方の筋細胞への変換は、単一転写因子としてＭｙｏＤ／ＭＹＯＤ１の発現によって達成され、細胞変換を駆動するｒｅｐＲＮＡの能力を検証するさらなるモデルシステムを提示する（Ａｂｕｊａｒｏｕｒら、２０１４ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３（２）、１４９～１６０；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５９６６／ｓｃｔｍ．２０１３～００９５；Ｃｈｏｉら、１９９０ ＰＮＡＳ、８７（２０），７９８８～７９９２；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．８７．２０．７９８８）。
ＭＹＯＤ１発現自己複製ＲＮＡを使用する、筋細胞へのｉＰＳＣおよび皮膚線維芽細胞の変換
ｉＰＳＣと線維芽細胞の両方の筋細胞への変換は、単一転写因子としてＭｙｏＤ／ＭＹＯＤ１の発現によって達成され、細胞変換を駆動するｒｅｐＲＮＡの能力を検証するさらなるモデルシステムを提示する（Ａｂｕｊａｒｏｕｒら、２０１４ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３（２）、１４９～１６０；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５９６６／ｓｃｔｍ．２０１３～００９５；Ｃｈｏｉら、１９９０ ＰＮＡＳ、８７（２０），７９８８～７９９２；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．８７．２０．７９８８）。
【0135】
細胞変換を駆動するｒｅｐＲＮＡの能力をさらに試験するため、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入されたＭＹＯＤ１をコードする配列を有するプラスミド鋳型を構築した。このプラスミドを鋳型として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡを生成した。ｉＰＳＣの筋細胞への変換実験のため、先に記載したようにｉＰＳＣをＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡによってヌクレオフェクトし、Ｇｅｌｔｒｅｘコートした培養プレートにプレートした。ヌクレオフェクション後２４時間で、培地をαＭＥＭ＋５％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋５０μＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）＋１μＭの全トランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）に交換し、２～３日ごとに培地を交換した。線維芽細胞の筋細胞への変換実験のため、先に記載したようにＨＤＦにＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、Ｇｅｌｔｒｅｘコートした培養プレートにプレートした。トランスフェクション後、細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清＋８μｇ／ｍＬインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）＋０．１μＭ ＬＤＮ－１９３１８９（Ｔｏｃｒｉｓ）＋１μＭ ＲＮ－１（Ｔｏｃｒｉｓ）（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉら、２０１８ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、７（３）、２５８～２６８．ｅ３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１８．０７．００６）＋１０μＭルキソリチニブに直接シードし、２～３日ごとに培地を交換した。トランスフェクション後７～１０日目に、細胞はＩＣＣによって解析した。先に記載したようにＰＢＳ洗浄、固定およびブロッキング後、細胞を、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清中の精製した抗ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）抗体（１：１００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、室温で３時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ＋４％正常ヤギ血清中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート二次抗体（１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）と室温で１時間インキュベートした。抗体ステップ後、細胞は、Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ１倒立顕微鏡での画像化の前に、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中４℃で保存した。
【0136】
解析は、ＭＹＯＤ１をコードするｒｅｐＲＮＡが、ｉＰＳＣとＨＤＦの両方を高効率で筋細胞に変換し得ることを示した。ＭｙＨＣ ＩＣＣは、トランスフェクション後７～１０日目に、ＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳＣおよびＨＤＦの培養中の筋細胞の存在を示した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。これは、異なる起源細胞型にわたる細胞変換および異なる分化した標的細胞型を得るためのｒｅｐＲＮＡを使用する広範な適用可能性のさらなる例である。
【0137】
実施例９
ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡを発現する自己複製ＲＮＡを使用する、マクロファージ様細胞への皮膚線維芽細胞の変換
線維芽細胞のマクロファージ様細胞への変換は、皮膚線維芽細胞での転写因子ＳＰＩ１およびＣＥＰＢＡの発現によって達成され得る（Ｆｅｎｇら、２００８ ＰＮＡＳ、１０５（１６）、６０５７～６０６２；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７１１９６１１０５）。細胞変換のための自己複製ＲＮＡの利用をさらに例示するため、ＳＰＩ１およびＣＥＰＢＡを発現する自己複製ＲＮＡを、ＨＤＦをマクロファージ様細胞に変換するそれらの能力について試験した。
ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡを発現する自己複製ＲＮＡを使用する、マクロファージ様細胞への皮膚線維芽細胞の変換
線維芽細胞のマクロファージ様細胞への変換は、皮膚線維芽細胞での転写因子ＳＰＩ１およびＣＥＰＢＡの発現によって達成され得る（Ｆｅｎｇら、２００８ ＰＮＡＳ、１０５（１６）、６０５７～６０６２；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７１１９６１１０５）。細胞変換のための自己複製ＲＮＡの利用をさらに例示するため、ＳＰＩ１およびＣＥＰＢＡを発現する自己複製ＲＮＡを、ＨＤＦをマクロファージ様細胞に変換するそれらの能力について試験した。
【0138】
皮膚線維芽細胞のマクロファージ様細胞変換実験のため、ＨＤＦに、先に記載したように、等モル量のＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡ ｒｅｐＲＮＡを同時トランスフェクトし、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）コートした培養プレート上にプレートした。ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡ ｒｅｐＲＮＡを得るため、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入されたＳＰＩ１またはＣＥＰＢＡのいずれかをコードする配列を有する別々のプラスミド鋳型を構築した。これらのプラスミドを鋳型として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＳＰＩ１およびＣＥＰＢＡ ｒｅｐＲＮＡを生成した。同時トランスフェクション後、細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清＋１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）＋１０μＭルキソリチニブに直接シードし、２～３日ごとに培地を交換した。先に記載したように、トランスフェクション後１０日目に、フローサイトメトリーおよびｑＰＣＲ解析を実施した。フローサイトメトリーのため、白血球共通抗原、ＣＤ４５の発現を、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６５０（商標）コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５マウスモノクローナル抗体（１：３００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して検出し、マクロファージ－１抗原（Ｍａｃ－１）、ＣＤ１１ｂの発現を、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ１１ｂマウスモノクローナル抗体（１：１００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して検出した。先に記載したように、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ１ＲおよびＬＹＺに対する予め指定したＴａｑＭａｎアッセイを使用してｑＰＣＲを実施した。
【0139】
解析は、ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡをコードするｒｅｐＲＮＡのＨＤＦへの同時トランスフェクションが、皮膚線維芽細胞をマクロファージ様細胞に向けることができることを示した。フローサイトメトリー解析は、対照ｍｏｃｋおよびＣＤ４５発現を示さないＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトした培養と比較して、ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡ ｒｅｐＲＮＡを同時トランスフェクトしたＨＤＦにおいて、白血球共通抗原、ＣＤ４５の顕著な発現を示した（図１３Ａ）。ＳＰＩ１およびＣＥＰＢＡ ｒｅｐＲＮＡを同時トランスフェクトした細胞のＣＤ４５＋陽性集団内で、ほとんどの細胞が、マクロファージが１つのサブタイプである抗原提示細胞のマーカーであるＨＬＡ－ＤＲを発現した。細胞の集団は、マクロファージ特異的ＣＤ１１ｂも発現する（図１３Ｂ）。さらに、ｑＰＣＲによる遺伝子発現の評価は、ＳＰＩ１およびＣＥＢＰＡ ｒｅｐＲＮＡを同時トランスフェクトしたＨＤＦが、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ１ＲおよびＬＹＺを含むマクロファージ関連遺伝子を発現することを示した（図１３Ｃ）。これは、異なる分化した標的細胞型を得る細胞変換のためのｒｅｐＲＮＡを使用する広範な適用可能性のさらなる例である。
【0140】
実施例１０
ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１およびＦＯＸＡ３を発現する自己複製ＲＮＡを使用する、肝臓前駆細胞への内皮細胞の変換
内皮細胞の肝臓前駆細胞への変換は、内皮細胞での転写因子ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１およびＦＯＸＡ３の発現によって達成され得る（Ｉｎａｄａら、２０２０ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１１（１）、１～１７；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９０４１－ｚ）。細胞変換のための自己複製ＲＮＡの利用をさらに例示するため、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１およびＦＯＸＡ３を発現する自己複製ＲＮＡを、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を肝臓前駆細胞に変換するそれらの能力について試験した。
ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１およびＦＯＸＡ３を発現する自己複製ＲＮＡを使用する、肝臓前駆細胞への内皮細胞の変換
内皮細胞の肝臓前駆細胞への変換は、内皮細胞での転写因子ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１およびＦＯＸＡ３の発現によって達成され得る（Ｉｎａｄａら、２０２０ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１１（１）、１～１７；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９０４１－ｚ）。細胞変換のための自己複製ＲＮＡの利用をさらに例示するため、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＯＮＥＣＵＴ１およびＦＯＸＡ３を発現する自己複製ＲＮＡを、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を肝臓前駆細胞に変換するそれらの能力について試験した。
【0141】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；ＡＴＣＣ）は、通常、完全ＥＧＭ２内皮増殖培地（Ｌｏｎｚａ）中で維持し、３～４日ごとに１：３～１：５の比で継代した。ヌクレオフェクションのため、ＨＵＶＥＣをＴｒｙｐＬＥによって５分間処理し、単一細胞の懸濁液を作製し、回収および計数した。必要な数の細胞を３００ｇで４分間遠心分離し、完全Ｐ５緩衝液（Ｐ５ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ；Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。ＨＵＶＥＣは、１×１０６個の細胞当たり５μｇの全ｒｅｐＲＮＡによって、Ｌｏｎｚａ４Ｄシステムを使用してヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした細胞を、完全ＥＧＭ２内皮増殖培地中にプレートした。
【0142】
内皮細胞の肝臓前駆細胞変換実験のため、ＨＵＶＥＣに、等モル量のＨＮＦ１Ａ－ＨＮＦ４Ａ－ＯＮＥＣＵＴ１ポリシストロニックｒｅｐＲＮＡ、およびＦＯＸＡ３ ｒｅｐＲＮＡを同時トランスフェクトし、Ｇｅｌｔｒｅｘコートした培養プレート上にプレートした。ＦＯＸＡ３ ｒｅｐＲＮＡを得るため、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入されたＦＯＸＡ３をコードする配列を有するプラスミド鋳型を構築した。ＨＮＦ１Ａ－ＨＮＦ４Ａ－ＯＮＥＣＵＴ１ポリシストロニックｒｅｐＲＮＡを得るため、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーによってプラスミド鋳型を構築し、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位にＨＮＦ１Ａ－Ｐ２Ａ－ＨＮＦ４Ａ－Ｔ２Ａ－ＯＮＥＣＵＴ１をコードする配列を挿入した（図１４Ａ参照）。これらのプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＦＯＸＡ３およびポリシストロニックＨＮＦ１Ａ－Ｐ２Ａ－ＨＮＦ４Ａ－Ｔ２Ａ－ＯＮＥＣＵＴ１ ｒｅｐＲＮＡを生成した。同時トランスフェクション後、細胞は完全ＥＧＭ２内皮増殖培地＋２００ｎｇ／ｍＬ Ｂ１８Ｒ中にシードし、７２時間で、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭニコチンアミド、１μＭ Ａ８３－０１、２μＭ ＳＢ４３１５４２、５μＭ Ｙ－２７６３２＋２００ｎｇ／ｍＬ Ｂ１８Ｒを補足した肝細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ）からなる肝細胞増殖培地によって完全に置き換え、２～３日ごとに培地交換した。ＩＣＣを、トランスフェクション後１４日目に実施した。先に記載したように、ＰＢＳ洗浄、固定およびブロッキング後、細胞を、ＰＢＳ＋４％正常ロバ血清中の精製した抗アルブミン抗体（１：５００；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、室温で終夜インキュベートし、次いで、ＰＢＳ＋４％ロバヤギ血清中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４コンジュゲート二次抗体（１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と室温で１時間インキュベートした。抗体ステップ後、細胞は、Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ１倒立顕微鏡での画像化の前に、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中４℃で保存した（図１４Ｂ）。
【0143】
解析は、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４ＡおよびＯＮＥＣＵＴ１をコードするｒｅｐＲＮＡがＨＤＦを肝臓前駆細胞に変換し得ることを示した。アルブミンＩＣＣは、トランスフェクション後１４日目に、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトしたＨＤＦの培養中の肝細胞の存在を示した（図１４Ｂ）。これは、異なる起源細胞型にわたる細胞変換のためにｒｅｐＲＮＡを使用する広範な適用可能性のさらなる例であり、これは、前駆細胞を得るためにｒｅｐＲＮＡを使用する適用可能性を確証する。
【0144】
実施例１１
皮膚線維芽細胞において自己複製ＲＮＡの発現を改善し、細胞変換を増強する異なるアプローチ
先に述べたように、ワクシニアウイルス由来Ｂ１８Ｒタンパク質および小分子ＪＡＫ１／２阻害剤であるルキソリチニブは、自己複製ＲＮＡの発現動態を改善できることが以前に実証された（Ｂｌａｋｎｅｙら、２０２１）。自己複製ＲＮＡに対する細胞の抗ウイルス応答を阻害する、いくつかの可能性のある方法がある。
皮膚線維芽細胞において自己複製ＲＮＡの発現を改善し、細胞変換を増強する異なるアプローチ
先に述べたように、ワクシニアウイルス由来Ｂ１８Ｒタンパク質および小分子ＪＡＫ１／２阻害剤であるルキソリチニブは、自己複製ＲＮＡの発現動態を改善できることが以前に実証された（Ｂｌａｋｎｅｙら、２０２１）。自己複製ＲＮＡに対する細胞の抗ウイルス応答を阻害する、いくつかの可能性のある方法がある。
【0145】
細胞の抗ウイルス応答を阻害し、皮膚線維芽細胞において自己複製ＲＮＡの発現を改善する異なるアプローチは、ＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡからのＧＦＰ発現を改善し、筋細胞へのＨＤＦのＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡ媒介変換を増強するそれらの能力を評価することによって試験した。これらは、さらなる小分子ＪＡＫ経路阻害剤（例えば、フェデラチニブ、ウパダシチニブ、フィルゴチニブ、バリシチニブ、デュークラバシチニブ、リトレシチニブ、デセルノチニブ）、ＲＩＧ－Ｉ阻害剤（例えば、ＲＩＧ０１２）、ＴＢＫ１阻害剤（例えば、ＢＸ７９５、ＭＲＴ６７３０７）、ウイルス由来インターフェロンデコイ（例えば、Ｙ１３６Ｒ）および自己複製ＲＮＡ内に遺伝的にコードされる組換えタンパク質阻害剤を含んだ（例えば、遺伝的にコードされたＢ１８Ｒ）。
【0146】
これらの実験のため、先に記載したように、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）およびＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡをＨＤＦにトランスフェクトし、遺伝的にコードされたＢ１８Ｒを試験するため、Ｂ１８Ｒ ｒｅｐＲＮＡを、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）またはＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡのいずれかと、等モル量で同時トランスフェクトした。Ｂ１８Ｒ ｒｅｐＲＮＡを得るため、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位に挿入されたＢ１８Ｒ遺伝子をコードする配列を有するプラスミド鋳型を構築した。このプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＢ１８Ｒ ｒｅｐＲＮＡを生成した。
【0147】
ＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡの維持への細胞の抗ウイルス応答の阻害剤の効果を評価するため、ＨＤＦに、ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、様々な小分子および組換えタンパク質を添加した増殖培地に直接シードした。細胞は、２～３日ごとに培地を交換し、トランスフェクション後７日目にフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を評価した。培地は、５μＭルキソリチニブ、２μＭフェデラチニブ、５μＭウパダシチニブ、５μＭフィルゴチニブ、５μＭバリシチニブ、５μＭデュークラバシチニブ、５μＭリトレシチニブ、５μＭデセルノチニブ、５μＭ ＢＸ７９５、５μＭ ＭＲＴ６７３０７（全てＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、１μＭ ＲＩＧ０１２（Ａｘｏｎｍｅｄｃｈｅｍ）、２００ｎｇ／ｍＬ Ｂ１８Ｒまたは２００ｎｇ／ｍＬ Ｙ１３６Ｒ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ）を含む小分子を補足した。ＤＭＳＯを補足した培地による条件は、対照として含めた。フローサイトメトリー解析は、いくつかの処理が対照処理（培地への添加なしまたはＤＭＳＯ添加）よりもＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージの増加を維持することができ、通常使用される阻害剤、ルキソリチニブおよびＢ１８Ｒ組換えタンパク質と同等のレベルであることを示した（図１５Ａ）。
【0148】
ＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡの維持への細胞の抗ウイルス応答の阻害剤の効果を評価するため、線維芽細胞の筋細胞変換実験を先に記載したように設定し、次いで、様々な小分子および組換えタンパク質を添加した増殖培地に直接シードした。小分子および組換えタンパク質の添加は、その後の全ての培地交換で維持され、トランスフェクション後７～１０日目に、先に記載したように、ＭｙＨＣ ＩＣＣによって細胞変換を評価した。解析は、ルキソリチニブおよびＢ１８Ｒと同様に、さらなる小分子（例えば、ウパダシチニブ）および細胞の抗ウイルス応答の組換えタンパク質（例えば、Ｙ１３６Ｒ）阻害剤が、細胞変換を可能にするのに十分なレベルにｒｅｐＲＮＡ発現を維持できることを示した（図１５Ｂ）。先に観察されたように、ＭＹＯＤ１ ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトし、細胞の抗ウイルス応答の阻害剤を補足しない標準培地中で維持した線維芽細胞の対照培養は、骨格筋細胞への変換が失敗した（図１５Ｂ－対照）。
【0149】
これらのデータを合わせると、ｒｅｐＲＮＡに対する宿主の自然免疫応答を調節し、細胞変換を駆動するのに十分なレベルにｒｅｐＲＮＡ発現を延長する複数の異なる方法が実証された。
【0150】
実施例１２
トランス－増幅ＲＮＡ
自己複製ＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子：ＲＮＡの複製に必要な非構造タンパク質をコードする配列を含む第１の分子、および少なくとも１つの転写因子をコードする配列を含む第２の分子を含み、トランス複製ＲＮＡシステムを提供し得る。
トランス－増幅ＲＮＡ
自己複製ＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子：ＲＮＡの複製に必要な非構造タンパク質をコードする配列を含む第１の分子、および少なくとも１つの転写因子をコードする配列を含む第２の分子を含み、トランス複製ＲＮＡシステムを提供し得る。
【0151】
アルファウイルス由来自己複製ＲＮＡの非構造タンパク質は、アセンブルして、自己複製ＲＮＡレプリコン内の配列エレメントを認識し、全ＲＮＡ鋳型を複製することができる多酵素レプリカーゼ複合体を生成する。レプリカーゼ複合体は、全長およびトランケートＲＮＡをトランスに複製することもでき、それらの複製のためのこれらの「トランス－レプリコン」における一連の保存配列エレメントの必要性を最小限にする（Ｂｅｉｓｓｅｒｔら、２０１９）。レプリカーゼ活性は、プラスミド、ｍＲＮＡまたは必要な非構造タンパク質をコードする別々の自己複製ＲＮＡの送達を含む、いくつかの方法で供給され得る。
【0152】
トランス－複製ＲＮＡシステムの適用可能性を評価するため、トランス－レプリコン構築物を開発した。自己複製ＲＮＡプラスミドの非構造タンパク質内の制限酵素部位を利用して、２つの非構造タンパク質欠失構築物を生成した。ＴＲ１ ＧＦＰプラスミド鋳型は、ＢｓｔＺ１７Ｉ＋ＳｗａＩ消化後の先に記載したＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）自己複製ＲＮＡベクターの再ライゲーションによって生成され、ｎｓＰ１の５’５０３ｂｐとｎｓＰ４の３’６０３ｂｐとの間でトランス－レプリコンを欠失させた。ＴＲ２ ＧＦＰプラスミド鋳型は、ＢｓｔＺ１７Ｉ＋ＭｓｃＩ消化後の再ライゲーションによって生成され、ｎｓＰ１の５’５０３ｂｐとｎｓＰ４の３’１１６ｂｐとの間でトランス－レプリコンを欠失させた（図１６Ａ）。これらのプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって、ＴＲ１ ＧＦＰおよびＴＲ２ ＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡを生成した。ｍＣｈｅｒｒｙ ｒｅｐＲＮＡを得るため、自己複製ＲＮＡベクターの多重クローニング部位で挿入されたｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列を有するプラスミド鋳型を構築した。このプラスミドを鋳型として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってｍＣｈｅｒｒｙ ｒｅｐＲＮＡを生成した。非構造タンパク質１～４のｍＲＮＡは、鋳型としてＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（登録商標）自己複製ＲＮＡプラスミドＤＮＡおよび詳述したプライマー（配列番号８および９）を使用することによって生成した、ＰＣＲ鋳型により、先に記載したようにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生した。
【0153】
【表7】
【0154】
解析は、機能性レプリカーゼを欠損する、ＧＦＰ発現トランス－レプリコンのみのｉＰＳＣへのトランスフェクションが、ＧＦＰ発現をもたらさないことを示した（図１６Ｂ）。ｍＣｈｅｒｒｙ ｒｅｐＲＮＡまたはｎｓＰ１～４ ｍＲＮＡのいずれかによってコードされる、ＧＦＰ発現トランスレ－プリコン、およびレプリカーゼの起源のｉＰＳＣへの同時トランスフェクションは、トランス－レプリコンからの機能性ＧＦＰ発現をもたらし、機能性トランス－レプリコンシステムを実証する。４８時間での画像化および９６時間でのフローサイトメトリー解析は、ＴＲ１－ＧＦＰまたはＴＲ２－ＧＦＰ ｒｅｐＲＮＡのいずれかを単独でトランスフェクトしたｉＰＳＣではＧＦＰ発現を示さなかったが、ＴＲ１－ＧＦＰまたはＴＲ２－ＧＦＰがｍＣｈｅｒｒｙ ｒｅｐＲＮＡまたはｎｓＰ１～４ ｍＲＮＡのいずれかと同時トランスフェクトされた場合、高レベルのＧＦＰ発現が観察された。
【0155】
これらのデータを合わせると、原則として、ｎｓＰ１～４がコードするレプリカーゼによって駆動されるｒｅｐＲＮＡの複製能は、２つの分子間で分けられ得ることが示される。これは、ｒｅｐＲＮＡの短いトランス－レプリコンへのトランケーションを可能にし、別のｒｅｐＲＮＡまたはｎｓＰ１～４をコードするｍＲＮＡからのレプリカーゼ活性の同時添加時に、複製されおよびそのカーゴが発現され得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【配列表】
【国際調査報告】