特表 2024-517856 ＴＩＥ２アゴニスト抗体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ＴＩＥ２アゴニスト抗体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240416BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61P35/04

A61P27/02

A61P37/06

A61P17/06

A61P27/06

A61P19/02

A61P9/10

A61P37/02

A61P29/00 101

A61P1/04

A61P9/00

A61P29/00

A61P1/00

A61P1/16

A61P3/10

A61P25/00

A61P13/12

A61K39/395 N

A61K45/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568205

(86)(22)【出願日】2022-05-04

(85)【翻訳文提出日】2023-11-24

(86)【国際出願番号】 KR2022006431

(87)【国際公開番号】W WO2022235090

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/184,901

(32)【優先日】2021-05-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】10-2021-0093451

(32)【優先日】2021-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519444052

【氏名又は名称】インスティチュート フォー ベーシック サイエンス

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＡＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥ

(71)【出願人】

【識別番号】518366555

【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】キム ホミン

(72)【発明者】

【氏名】コ ギュヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョ ギョンヒ

(72)【発明者】

【氏名】ペ ジョミル

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA33

4C084ZA36

4C084ZA45

4C084ZA66

4C084ZA68

4C084ZA75

4C084ZA81

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB11

4C084ZB15

4C084ZB26

4C084ZC35

4C084ZC751

4C085AA14

4C085BB31

4C085DD61

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３ドメインに結合するＴｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片に関し、前記抗体の結合により、ホモダイマーＴｉｅ２が多角形組立体を形成し、クラスタリング及び活動化され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片であって、
前記抗体は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインに結合し、
前記抗体の結合により、ホモダイマーＴｉｅ２が多角形組立体を形成し、クラスタリング及び活性化されることを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記抗体は、配列番号１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号３の配列を含む重鎖定常ドメイン（ＣＨ）、配列番号２の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号４の配列を含む軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むＦａｂであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

請求項１乃至４のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸。

【請求項6】

配列番号９乃至１４からなる群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載の核酸。

【請求項7】

請求項５に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項8】

請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。

【請求項9】

次の段階を含むＴｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）請求項８の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。

【請求項10】

請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物。

【請求項11】

前記血管新生疾患は、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒絶反応（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅色症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれたことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸部癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髓血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）で構成された群から選ばれたことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、他の血管新生疾患治療剤との併用投与用組成物。

【請求項14】

Ｔｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片を含み、
前記抗体は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインに結合し、
ホモダイマーＴｉｅ２との結合によって形成された抗体の多角形組立体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインに結合するＴｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片に関し、前記抗体の結合により、ホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）Ｔｉｅ２が多角形組立体（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を形成し、クラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）及び活性化され得る。

【0002】

【背景技術】

【0003】

血管新生は、個体の発生、成長、保存及び恒常性維持過程で多様な調節因子によって躍動的に発生する。この過程で新しく形成された血管は、周囲の細胞に栄養素、酸素、ホルモンなどの多様な生体材料を運送するチャンネルとしての役割をする。機能及び構造的に非正常的な血管は、多様な疾患の発病及び進行の直・間接的な原因になる。腫瘍血管は、機能及び構造の欠陥で低酸素症を悪化させ、腫瘍の進行及び他の組織への転移をもたらし、腫瘍組織の中心に抗癌剤がうまく伝達されないようにする。欠陥がある血管は、癌以外にも、他の各種疾病や疾患で確認され得る。その例としては、多様な眼科疾患（例えば、糖尿病性黄斑浮腫、老人性黄斑変性）、ウイルス感染及び敗血症などの急性炎症反応を挙げることができる。よって、病理的血管を正常化できる治療剤が存在するなら、血管異常を有する多様な患者の治療に適用することができる。

【0004】

非正常的な血管新生を抑制し、血管透過性を減少させるために、直接Ｔｉｅ２を活性化させる方案が考慮されている。Ｔｉｅ２受容体に直接結合し、Ｔｉｅ２のリン酸化及び活性化を誘導する組換えタンパク質も開発されており、多数の前臨床癌及び眼球モデルでその治療効果が試験されている。その代表的な例としては、ＣＯＭＰ－Ａｎｇｌ及びＶａｓｃｕｌｏｔｉｄｅがある。これらの製剤は、抗血管新生活性及び抗浸透活性を示したが、非常に短い半減期及び不安定な物理化学的性質を有するという短所がある。また、小分子化合物（ＡＫＢ－９７７８）が脱リン酸化酵素ＶＥ－ＰＴＰの阻害剤として開発された。ＶＥ－ＰＴＰは、リン酸化されたＴｉｅ２からリン酸基を除去し、Ｔｉｅ２を不活性化させる役割をする。このような化合物は、他の受容体も非特異的に活性化させるという短所があるが、ＶＥ－ＰＴＰを阻害することによってＴｉｅ２活性を間接的に増加させる作用をする。また、Ｔｉｅ２活性化抗体が開発されている（ＵＳ６３６５１５４Ｂ１、ＵＳ２０１７０１７４７８９Ａ１）。このような抗体は、血管内皮細胞の生存率を高め、血管漏出を抑制した。興味深いことに、植物抽出物のうちの一つがＴｉｅ２活性を誘導し、スキンケア化粧品として使用され得ることが請求されている（例えば、ＪＰ２０１１１０２２７３Ａ、ＪＰ２０１８０４３９４９Ａ、ＪＰ２０１５１６８６５６Ａ）。

【0005】

このように、Ｔｉｅ２は、血管の成長及び安定性を促進する内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼであって、虚血性及び炎症性血管疾患の魅力的な治療対象になり得る。Ｔｉｅ２アゴニスト抗体及びオリゴマーアンジオポエチン（Ａｎｇｐｔ１）変異体は、潜在的な治療剤として開発されてきた。ただし、Ｔｉｅ２のクラスター化及び活性化での役割に対する基本メカニズムは明確に確認されなかった。また、Ａｎｇｐｔ１変異体は、生産及び保管に困難を伴う。

【0006】

このような技術的背景の下で、本出願の発明者等は、Ｔｉｅ２アゴニスト抗体を開発するために努力した結果、ヒトＴｉｅ２アゴニスト抗体を開発し、Ｔｉｅ２のＦｎ３ドメインに特異的に結合することによってＴｉｅ２ホモダイマーが多角形組立体に連結され、クラスター化及び活性化され得ることを確認し、本発明を完成するに至った。

【0007】

【0008】

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、Ｔｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

【0010】

本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸を提供することにある。

【0011】

本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。

【0012】

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。

【0013】

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、他の血管新生疾患治療剤との併用投与用組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0014】

前記目的を達成するために、本発明は、Ｔｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインに結合し、前記抗体の結合により、ホモダイマーＴｉｅ２が多角形組立体を形成し、クラスタリング及び活性化されることを特徴とする抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0015】

具体的には、本発明は、配列番号１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号３の配列を含む重鎖定常領域（ＣＨ）、配列番号２の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号４の配列を含む軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むＦａｂを提供する。

【0016】

具体的には、本発明は、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；を含むヒト化抗体を提供する。

【0017】

また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸を提供する。

【0018】

また、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。

【0019】

また、本発明は、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。

【0020】

また、本発明は、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。

【0021】

また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生関連疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

【0022】

また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、他の血管新生疾患治療剤との併用投与用組成物を提供する。本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を患者に投与する段階を含む血管新生疾患の予防又は治療方法に関する。本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を血管新生疾患の予防又は治療用製剤の製造に使用するための用途に関する。

【0023】

また、本発明は、Ｔｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片を含み、前記抗体は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインに結合し、ホモダイマーＴｉｅ２との結合によって形成された抗体の多角形組立体を提供する。

【0024】

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1a-1b】Ｔｉｅ２活性化マウスモノクロナール抗体の生成を示した図である。

【0026】

ａ．Ｔｉｅ２受容体の概略的ドメイン構造及びハイブリドーマ技術によるモノクロナール抗体生成戦略。Ｉｇ免疫グロブリン類似ドメイン；ＥＧＦ表皮成長因子類似ドメイン；Ｆｎ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩドメイン。

【0027】

ｂ．ＳＰＲ及びＢＬＩ分析によってそれぞれ決定されたヒト（左側）又はマウス（右側）Ｔｉｅ２に対するｈＴＡＡＢの結合動態。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、Ｍ）は、オフ速度とオン速度の比率（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）として計算された。速度論的パラメーターは、１：１結合モデルを用いてＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅのグローバルフィッティング機能で決定された。

【0028】

【図2a-2d】Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３の構造比較結果を示した図である。

【0029】

ａ．キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ単独（黒色の線）とＴｉｅ２ ＥＣＤ変異体（Ｉｇ３－Ｆｎ３、マゼンタ色の線；Ｆｎ１－３青色の線；及びＦｎ２－３黄色の線）複合体のサイズ排除クロマトグラフィー（左側）。溶出分画は、還元及び非還元の条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によって分析された（右側）。

【0030】

ｂ．キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ結合Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３モノマー（黒色）と以前に報告されたＴｉｅ２ Ｆｎ２－３（赤色、ＰＤＢ：５ＭＹＢチェーンＡ）及びＦｎ１－３（緑色、ＰＤＢ：５ＵＴＫチェーンＡ）のモノマー構造比較。構造はリボンダイアグラムとして表示。

【0031】

ｃ．キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ結合Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３ダイマー（黒色）と以前に報告されたＴｉｅ２ Ｆｎ２－３ダイマー構造（赤色、ＰＤＢ：５ＭＹＢ）との比較。

【0032】

ｄ．キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ結合Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３ダイマー（黒色）と以前に報告されたＴｉｅ２ Ｆｎ１－３ダイマー構造（ＰＤＢ：５ＵＴＫ）との比較。結晶格子内の２個の非対称単位Ｔｉｅ２ Ｆｎ１－３ダイマーは、それぞれ緑色と青緑色で着色されている。

【0033】

【図3a-3d】Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３と複合体を形成したｈＴＡＡＢ Ｆａｂの全般的構造を示した図である。

【0034】

ａ．２：２ ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の全体構造。ダイマー複合体の２倍軸は、黒色の楕円で表示されている。キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂの重鎖及び軽鎖は、それぞれ濃いオレンジ色及び薄いオレンジ色で表示されている。ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３ダイマーは浅緑色及び青緑色で表示されている。

【0035】

ｂ．ヒト及びマウスＴｉｅ２ Ｆｎ２－３ドメインの配列比較。マウスＴｉｅ２配列での点は、ヒトＴｉｅ２と同一の残基を示す。

【0036】

ｃ．表面の表現は、Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３（上側）とキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ（下側）との相互作用インターフェースを示すオープンブックビューである。ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３とキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂの色相は、図３ａの色相と同一であるが、それぞれの結合面に反転している。キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂの６個のＣＤＲループは、他の色の線で表示されている（下側）。

【0037】

ｄ．ｈＴＡＡＢの重鎖（上側）及び軽鎖（下側）の可変領域と最も近いヒト及びマウス可変領域の生殖細胞系列遺伝子の配列比較。マウス及びヒトの生殖細胞系列配列での点は、ｈＴＡＡＢと同一の残基を示す。（ｂ－ｄ）キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂの重鎖及び軽鎖と相互作用するｈＴｉｅ２残基は、それぞれ濃いオレンジ色及び薄いオレンジ色で表示され、重鎖及び軽鎖の全てと相互作用するＶ７３０は赤色で強調表示される（ｂとｃ、上側）。ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３と相互作用するキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ残基は青緑色で表示されている（ｃ、下側及びｄ）。

【0038】

【図4a-4d】キメラｈＴＡＡＢ ＦａｂとｈＴｉｅ２ Ｆｎ３との間の結合インターフェースに対する分析結果を示した図である。

【0039】

ａ．主要分子相互作用（Ａ、Ｂ、Ｃ領域）の拡大図。ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ相互作用（赤色、緑色及び青色のボックス）及びｈＴｉｅ２二量体化（黒色のボックス）に関与する残基は、ステッキとして表示されてラベリングされている。水素結合及び静電気相互作用は点線で表示されている。

【0040】

ｂ．ｈＴＡＡＢ結合に関与するＡ、Ｂ、Ｃ領域の主要アミノ酸残基。ｈＴＡＡＢ相互作用残基は左側に羅列されており、Ｔｉｅ２の対応する相互作用残基は右側に羅列されている。残基パートナー間の相互作用は、赤色（イオン相互作用）、黒色（水素結合）、青色（疎水性相互作用）で表示される。

【0041】

ｃ．ＰｙＭＯＬのポアソン－ボルツマン（Ｐｏｉｓｓｏｎ－Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）方程式によって計算されたｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の静電気電位。構造は、静電気特性（青色：正電荷で帯電、赤色：負電荷で帯電）を反映したカラー地図と共に、オープンブックビュー及び表面の表現として表示される。相互作用する領域は黄色の線で強調表示される。

【0042】

ｄ．ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３及びキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂの疎水性残基が表面に現れ、相互作用インターフェースは黒色の線で表示されている。

【0043】

【図5a-5d】Ｔｉｅ２、Ｔｉｅ１ Ｆｎ２－Ｆｎ３ドメイン及びキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂの配列アラインメント（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）結果を示した図である。

【0044】

ａ．ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０２７６３）、マウス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０２８５８）、ラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｄ３ＺＣＤ０）、サル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＲＩ３）、ウシ（Ｂ．ｔａｕｒｕｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０６８０７）及びイヌ（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｆ１Ｐ８Ｕ６）Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３の配列整列。

【0045】

ｂ．ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０２７６３）とマウス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０２８５８）Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３、及びヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ３５５９０）とマウス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０６８０６）Ｔｉｅ１ Ｆｎ２－３の配列整列。

【0046】

ｃ．キメラｈＴＡＡＢの重鎖可変領域と最も近いマウス及びヒト生殖細胞系列遺伝子の配列整列（上側）、及びキメラｈＴＡＡＢの重鎖ガンマ１定常領域（ｈＩＧＨＶ１^＊０１）と最も近いマウス生殖細胞系列遺伝子の配列整列（下側）。ｄ．キメラｈＴＡＡＢの軽鎖可変領域と最も近いマウス及びヒト生殖細胞系列遺伝子の配列整列（上側）、及びキメラｈＴＡＡＢの軽鎖カッパ定常領域（ｈＩＧＫＣ１^＊０１）と最も近いマウス生殖細胞系列遺伝子の配列整列（下側）。

【0047】

（ａ－ｄ）青色の四角形は、キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ重鎖とｈＴｉｅ２ Ｆｎ３インターフェースで相互作用する各残基を示す。白色の四角形は、キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ軽鎖とｈＴｉｅ２ Ｆｎ３との間の相互作用残基を示す。赤色の円形は、ｈＴｉｅ２残基Ｖ７３０を示しており、重鎖及び軽鎖の全てと相互作用する。灰色の円形は、キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂの重鎖と軽鎖との間の相互作用に関与する残基を示す。Ｔｉｅ２のＦｎ３ドメインとＦｎ３ドメインとの間のダイマー相互作用に関与する各残基は、オレンジ色の三角形として表示されている。赤色のボックスは完全な配列保存を示し、黄色のボックスは、物理化学的特性によって７０％以上の類似性を有する残基を示す。二次的構造の各構成は、矢印（βスタンド）及び螺旋（α－ヘリックス）の整列で表示されている。配列整列は、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｏｆｆｅｅ．ｃｒｇ．ｃａｔ）及びＥＳＰｒｉｐｔサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ）を用いて作成された。

【0048】

【図6】ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ結合がＴｉｅ２ダイマーの多角形組立体を仲介することを示す結果を示した図である。

【0049】

ａ．ＨＵＶＥＣをキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ又はｈＴＡＡＢマウスＩｇＧ１（１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）で処理した後の、Ｔｉｅ２の相対的リン酸化比率に対する免疫染色分析（左側）。ｐ－Ｔｉｅ２／Ｔｉｅ２の比率の比重計分析（右側；平均±ＳＤ ｎ＝３；^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ． 対照群）。

【0050】

ｂ．キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ又はｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１（１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）でＨＵＶＥＣを処理した後の、Ａｋｔの相対リン酸化比率に対する免疫染色分析（左側）。ｐ－Ａｋｔ／Ａｋｔの比率の比重計分析（右側；平均±ＳＤ ｎ＝３；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ． 対照群）。

【0051】

ｃ．ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３、ｈＴｉｅ２ ＥＣＤ、ｈＴＡＡＢ／ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３複合体及びｈＴＡＡＢ／ｈＴｉｅ２ ＥＣＤ複合体のサイズ排除クロマトグラフィー－ＳＥＣ－ＭＡＬＳ（ｍｕｌｔｉａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析。サンプルは、３ｍｇ／ｍｌ（ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３）又は１ｍｇ／ｍｌ（他の全てのもの）のタンパク質の濃度で０．５ｍｌ／ｍｉｎのＰＢＳ内のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００増加１０／３００ＧＬカラムで分析した。分子量（ｋＤａ）及び２８０ｎｍでの吸光度を溶出体積（ｍｌ）に対してグラフで表示した。

【0052】

ｄ．Ｔｉｅ２ダイマー変異デザイン。Ｆｎ３ドメイン間の逆平行βシート相互作用インターフェースの両末端での残基Ｄ６８２及びＮ６９１（黄色）をシステインに変化させ、２個の二硫化結合を形成できるようにし、構成Ｔｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ダイマーを生成した。

【0053】

ｅ．精製されたｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃは、還元及び非還元の条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によって分析された。

【0054】

ｆ．ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１と複合体を形成したｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃのサイズ排除クロマトグラフィー。精製したｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１ＣをｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１と２：１のモル比（Ｔｉｅ２モノマー：ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１）で２時間にわたってインキュベートし、これをサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。ネガティブ染色ＥＭ及び２Ｄクラス平均に使用される分画はＥＭ分析として表示される。

【0055】

ｇ．Ｔｉｅ２ダイマー変異体／ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１複合体の代表的な２Ｄクラス平均（上側）。４対４、５対５及び６対６組立体内のＴｉｅ２ダイマー／ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１複合体の周期的高次構造は、Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体、Ｔｉｅ２ Ｉｇ１－Ｆｎ１（ＰＤＢ：４Ｋ０Ｖ）及びヒトＩｇＧ１のＦｃ断片（ＰＤＢ：５ＶＧＰ）の結晶構造を使用し、四角形、五角形及び六角形のそれぞれの閉鎖リング構造に対する２Ｄクラス平均に基づいてモデリングされた（下側）。スケールバー、２０ｎｍ。

【0056】

ｈ．ネガティブ染色ＥＭグリッドで観察されたＴｉｅ２ダイマー／ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１複合体内の多角形の５対５組立体の３Ｄモデル。非対称単位の結晶における２：２ Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体は、赤色の線で表示されている。

【0057】

【図7】Ｔｉｅ２ダイマー突然変異／ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１複合体のネガティブ染色ＥＭ分析結果を示した図である。

【0058】

ａ．ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１と複合体を形成した精製されたｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｎ６９１Ｃ／Ｄ６８２Ｃネガティブ染色ＥＭ分析の代表的な顕微鏡写真（左側；スケールバー、１００ｎｍ）。正方晶系、五角形、六角形の閉環構造の代表的な粒子イメージ（右側；スケールバー、２０ｎｍ）。

【0059】

ｂ．ｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｎ６９１Ｃ／Ｄ６８２Ｃ及びｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１複合体のサイズ排除クロマトグラフィーでの凝集ピークのネガティブ染色ＥＭ分析の代表的な顕微鏡写真、スケールバー、１００ｎｍ。

【0060】

【図8】リガンド非依存性Ｔｉｅ２の二量体化は、ｈＴＡＡＢを通じたＴｉｅ２のクラスタリング及び活性化に必須的であることを示す結果を示した図である。

【0061】

ａ．Ｔｉｅ２モノマー変異デザイン。Ｆｎ３－Ｆｎ３’ダイマーインターフェースの残基Ｖ６８５、Ｖ６８７及びＫ７００（黄色）は、電荷反発を通じてＦｎ３－Ｆｎ３’ダイマーインターフェースを破壊するために、負電荷残基（Ｖ６８５Ｄ／Ｖ６８７Ｄ／Ｋ７００Ｅ）に変異され、構成的Ｔｉｅ２モノマーを生産した（左側）。全長Ｔｉｅ２－ＧＦＰＷＴ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのライブセルイメージング及びＴｉｅ２活性化分析に使用された構成的Ｔｉｅ２ダイマー及びモノマー変異に対する概略図（右側）。

【0062】

ｂ．ｈＴＡＡＢ及びＣＯＭＰ－Ａｎｇ１で処理した後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＴｉｅ２（全長Ｔｉｅ２ ＷＴ、Ｔｉｅ２ダイマー変異（Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃ）又はモノマー変異（Ｖ６８５Ｄ／Ｖ６８７Ｄ／Ｋ７００Ｅ））に対する共焦点時間の経過を示す写真。イメージは６０倍の倍率で表示される。スケールバー、１０μｍ。

【0063】

ｃ及びｄ．ＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１（１μｇ／ｍｌ）又はｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１（１０μｇ／ｍｌ）で１時間にわたって処理した後、ＷＴ Ｔｉｅ２、構成的ダイマーＴｉｅ２変異（Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃ）又は構成的モノマーＴｉｅ２変異（Ｖ６８５Ｄ／Ｖ６８７Ｄ／Ｋ７００Ｅ）を一時的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＴｉｅ２とＡｋｔの相対的リン酸化比率に対する免疫ブロット分析（ｃ）。ｐ－Ｔｉｅ２／Ｔｉｅ２及びｐ－Ａｋｔ／Ａｋｔの比率に対する比重計分析（ｄ）が表示されている（平均±ＳＤ ｎ＝３；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ．対照群）。

【0064】

ｅ．細胞膜でのｈＴＡＡＢを通じたＴｉｅ２活性化モデル。ｈＴＡＡＢ ＩｇＧはＴｉｅ２ホモダイマーのＦｎ３ドメインに結合し、リガンド非依存性Ｔｉｅ２ダイマーを高次元の円形組立体にクラスター化するように誘導する。Ｔｉｅ２クラスタリングは、隣接したダイマー間の自己リン酸化に最も適した方式で不活性化キナーゼダイマーを構成する。

【0065】

【図9】ｈＴＡＡＢの構造ベースのヒト化を示した図である。

【0066】

ａ．ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラス形態のうちキメラｈＴＡＡＢ抗体の概略図。鎖間の二硫化結合は黒色の線で表示されている。重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ濃いオレンジ色と薄いオレンジ色で表示されている。重鎖と軽鎖の定常領域はそれぞれ緑色と青色で表示されている。

【0067】

ｂ及びｃ．マウスＩｇＧ１又はヒトキメラＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４（１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）形態のｈＴＡＡＢでＨＵＶＥＣを処理した後の、Ｔｉｅ２とＡｋｔの相対的リン酸化比率に対する免疫染色分析（ｂ）。ｐ－Ｔｉｅ２／Ｔｉｅ２及びｐ－Ａｋｔ／Ａｋｔの比率に対する比重計分析（ｃ）が表示されている（平均±ＳＤ ｎ＝３；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ． 対照群）。

【0068】

ｄ．ｈＴＡＡＢ及びヒト化ＴＡＡＢ（ｈｚＴＡＡＢ）の重鎖及び軽鎖可変領域の配列と最も近いヒト生殖細胞系列遺伝子との整列。ヒト生殖細胞系列及びｈｚＴＡＡＢ配列での点は、親抗体ｈＴＡＡＢと同一の残基を示す。ｈＴＡＡＢのＣＤＲ及びｈｚＴＡＡＢのグラフトＣＤＲは青色で表示される。親抗体ｈＴＡＡＢで逆変異された残基は緑色で表示され、緑色の三角形として表示される。二次構造の構成（β鎖）は矢印として表示されている。

【0069】

ｅ－ｈ．Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－Ｆｎ３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の結晶構造で採用されたキメラｈＴＡＡＢ Ｆｖ構造に重畳したｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１ Ｆｖの相同性モデル構造。キメラｈＴＡＡＢの重鎖及び軽鎖はそれぞれ濃いオレンジ色と明るいオレンジ色で表示され、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１の重鎖及び軽鎖は紫色とピンク色で表示されている。

【0070】

ｆ－ｈ．Ｔｉｅ２活性化抗体の構造ベースのヒト化に対する理論的説明。ＶＨ－ＶＬペアリング及びＣＤＲコンフォメーション（ｆ）及びＴｉｅ２ Ｆｎ３（ｇ）に対する親和力を維持するために重要な軽鎖残基は、マウスｈＴＡＡＢ配列に逆変異した。ＣＤＲコンフォメーションを維持するために重要な重鎖残基は、マウスｈＴＡＡＢ配列に逆変異した（ｈ）。変異は矢印として表示され、各残基は（ｅ）と同じ色で表示される。

【0071】

ｉ．ＳＰＲ分析によって測定されたｈＴｉｅ２ ＥＣＤに対するヒト化ＴＡＡＢ（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ１、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ２及びｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２、及び以前に報告されたヒト化構造３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４）の結合動態。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、Ｍ）は、オフ速度とオン速度の比率（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）として計算された。速度論的パラメーターは、１：１の結合モデルを用いてＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅのグローバルフィッティング機能で決定された。垂直点線は、解離段階の開始を示す。

【0072】

【図10a-10c】ヒト化Ｔｉｅ２活性化抗体を分析した結果を示した図である。

【0073】

ａ．ＩｇＧ１ベースのヒト化Ｔｉｅ２活性化抗体（ｈｚＴＡＡＢ Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１及びＨ２Ｌ２）のサイズ排除クロマトグラフィー。

【0074】

ｂ．ｈｚＴＡＡＢの溶出分画を濃縮し、還元（左側）及び非還元（右側）の条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によって分析した。

【0075】

ｃ．ＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）分析によって測定されたｍＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３に対するｈｚＴＡＡＢの結合キネティック。オクテットＲＥＤ９６機器を用いて得られたセンサーグラムとして確認されたｍＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３の結合（Ａ）及び解離（Ｄ）。表示された抗体を抗ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサーに固定化した後、バイオセンサーをマウスＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３の１６００ｎＭの溶液を含むウェルに浸し、結合を測定した後で力学バッファーで洗浄し、解離を測定した。

【0076】

【図11】ヒト化ＴＡＡＢがＨＵＶＥＣでＴｉｅ２とその下流信号を活性化することを示す結果を示した図である。

【0077】

ａ及びｂ．異なる濃度（０．０２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌ）のｈＴＡＡＢ（ａ）又は３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４（ｂ）でＨＵＶＥＣを処理した後の、Ｔｉｅ２の相対的リン酸化比率に対する免疫染色分析。ＡＢＴＡＡ（２．５μｇ／ｍｌ）＋Ａｎｇｐｔ２を陽性対照群として使用した。ｐ－Ｔｉｅ２／Ｔｉｅ２の比率の比重計分析を示す（右側）。

【0078】

ｃ及びｄ．異なる濃度（１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）のヒト化ＴＡＡＢ（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２）又はｈＴＡＡＢ（ｃ）でＨＵＶＥＣを処理した後の、Ｔｉｅ２とＡｋｔの相対的リン酸化比率に対する免疫染色分析。ｐ－Ｔｉｅ２／Ｔｉｅ２及びｐ－Ａｋｔ／Ａｋｔの比率の比重計分析（ｄ）が表示されている（平均±ＳＤ ｎ＝３；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ． 対照群）。

【0079】

ｅ及びｆ．３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４又はｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２の異なる濃度（０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌ）でＨＵＶＥＣを処理した後の、Ｔｉｅ２とＡｋｔの相対的リン酸化比率に対する免疫染色分析。ｐ－Ｔｉｅ２／Ｔｉｅ２及びｐ－Ａｋｔ／Ａｋｔの比率の比重計分析（ｆ）が表示されている。

【0080】

ｇ及びｈ．ＨＵＶＥＣでのｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２の生物学的効果。ＨＵＶＥＣの血清欠乏誘導細胞死に対するｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２効果（上側）。ＨＵＶＥＣは、１０μｇ／ｍｌのｈｚＴＡＡ－Ｈ２Ｌ２、ｈＴＡＡＢ又は１μｇ／ｍｌのＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１を含む無血清培地で培養した。移動活性は、改変されたボイデンチャンバーアッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙ）（中央）を用いて測定された。ＨＵＶＥＣは、８μｍの空隙膜の上層に播種された。１０μｇ／ｍｌのｈｚＴＡＡ－Ｈ２Ｌ２、ｈＴＡＡＢ又は１μｇ／ｍｌのＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１を含む無血清培地を下部チャンバーに追加した。移動した細胞を固定し、これを９時間培養した後で染色した。ＨＵＶＥＣをマトリゲル被覆ウェル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ－ｃｏａｔｅｄ ｗｅｌｌｓ）にプレーティングし、１０μｇ／ｍｌのｈｚＴＡＡ－Ｈ２Ｌ２、ｈＴＡＡＢ又は１μｇ／ｍｌのＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１を含む無血清培地で培養した。位相差顕微鏡イメージは、処理７時間後に収得した。管形成活性は、管の長さ（下側）として測定された。スケールバー、１００μｍ。ＴＵＮＥＬ陽性細胞、移動したＨＵＶＥＣ及び（ｇ）生成細胞の定量化（ｈ）（平均±ＳＤ ｎ＝３；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ． 対照群）。

【0081】

ｉ．細胞間の接触に対するｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２誘導Ｔｉｅ２電位及びＦＯＸＯ１のｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２誘導核の除去を示すＨＵＶＥＣの共焦点イメージ。血清飢餓ＨＵＶＥＣをｈＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２（１０μｇ／ｍｌ）又はＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１（１μｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。対照群として、未処理群は使用されなかった。ヤギ抗ヒトＴｉｅ２及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８結合ロバ抗ヤギ抗体をＴｉｅ２視覚化に使用し、ウサギ抗ＦＯＸＯ１及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４結合ロバ抗ウサギ抗体をＦＯＸＯ１視覚化に使用した。スケールバー、２０μｍ。ＤＡＰＩ ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール。

【0082】

【図12a-12d】全長Ｔｉｅ２クラスタリングのモデルを示した図である。

【0083】

ａ．キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ／Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３複合体間の結晶パッキング相互作用に対する模式図。キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ及びＴｉｅ２ Ｆｎ２－３の色に対する説明は図３ａに記載される。結晶パッキングによって導入されたＦｎ２ドメイン間の水平方向の相互作用は、黒色のボックスで表示されている。

【0084】

ｂ．（Ａ）黒色のボックスで表示された結晶パッキング相互作用の拡大図。結晶パッキングによって媒介される重要な結合残基が表示されている。水素結合及び静電気相互作用は点線で表示されている。

【0085】

ｃ．ｈＴＡＡＢを介したＴｉｅ２クラスタリング提案モデル。Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片（ＰＤＢ：５ＶＧＰ）の結晶構造、及び以前に報告されたＴｉｅ２構造：Ｔｉｅ２ Ｉｇ１－Ｆｎ１（ＰＤＢ：４Ｋ０Ｖ）、Ｔｉｅ２ Ｆｎ１－３（ＰＤＢ：５ＭＹＡ）及びＴｉｅ２チロシンキナーゼドメイン（ＰＤＢ：６ＭＷＥ）を使用し、五角形の閉鎖リング構造の２Ｄクラス平均を基準にして５対５組立体内の全長Ｔｉｅ２ダイマー／ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１複合体の周期的高次構造をモデリングした。膜貫通ドメインは、以前に報告されたＥＧＦＲの二量体化モチーフのＮＭＲ構造（ＰＤＢ：５ＬＶ６）で採択された。

【0086】

ｄ．ＣＯＭＰ－Ａｎｇ１を通じたＴｉｅ２クラスタリング提案モデル。Ｔｉｅ２ｓ（Ｃ）及びＡｎｇ１ ＦＬＤ／Ｔｉｅ２ Ｉｇ１－Ｆｎ１複合体（ＰＤＢ：４Ｋ０Ｖ）とＣＯＭＰコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）ドメイン（ＰＤＢ：１ＶＤＦ）（ＣとＤ）のモデル構造を使用し、ｈＴＡＡＢ媒介全長Ｔｉｅ２クラスタリング（Ｃ）のモデルにより、全長Ｔｉｅ２ダイマーとＣＯＭＰ－Ａｎｇ１複合体の５：１の組立体の環状複合体をモデリングした。Ａｎｇｐｔ ＦＬＤ結合Ｔｉｅ２ Ｉｇ２ドメインは黄色で表示される。

【0087】

【発明を実施するための形態】

【0088】

他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書の命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。

【0089】

本出願の発明者等は、Ｔｉｅ２ Ｆｎ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインをターゲットとするヒトＴｉｅ２アゴニスト抗体ｈＴＡＡＢを開発した。Ｔｉｅ２／ｈＴＡＡＢ複合体の構造は、Ｔｉｅ２クラスタリングの新しいモードを通じて作動する。

【0090】

ヒトＴｉｅ２アゴニスト抗体であるｈＴＡＡＢがＴｉｅ２／ｈＴＡＡＢ複合体の構造を形成することによってＴｉｅ２クラスタリングの新規モードで作動し、Ｔｉｅ２ Ｆｎ３ドメインに特異的に結合することによって、Ｔｉｅ２ホモダイマーが多角形組立体に連結される。このような構造は、以前に結晶格子で観察された側面Ｔｉｅ２アレイとは対照的である。また、Ｆｎ３－Ｆｎ３'ダイマーインターフェースの破壊は、ｈＴＡＡＢによって誘発されるＴｉｅ２のクラスター化信号を非活性化させた。このような結果は、ｈＴＡＡＢによって誘発されるＴｉｅ２多角形組立体に対するＦｎ３媒介Ｔｉｅ２ホモ二量体化の重要性を強調し、Ｔｉｅ２アゴニストがＴｉｅ２のクラスター化及び活性化をどのように誘導するのかに対する理解を提供する。また、ｈＴＡＡＢの構造ベースのヒト化抗体の製作成功は、潜在的な臨床可能性を作り出す。

【0091】

このような観点で、本発明は、Ｔｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインに結合し、前記抗体の結合により、ホモダイマーＴｉｅ２が多角形組立体を形成し、クラスタリング及び活性化されることを特徴とする抗体又はその抗原結合断片に関する。

【0092】

また、Ｔｉｅ２アゴニスト抗体又はその抗原結合断片を含み、前記抗体は、ヒトＴｉｅ２のＩｇ３ Ｆｎ３（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインに結合し、ホモダイマーＴｉｅ２との結合によって形成された抗体の多角形組立体に関する。

【0093】

本明細書で使用された「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体を意味する。本発明の範囲には、Ｔｉｅ２に特異的に結合する完全な抗体形態のみならず、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

【0094】

完全な抗体は、２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であって、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

【0095】

抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちのＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域及び重鎖の１番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと相違する。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり、又はＣ－末端で直ぐ連結されており、二重鎖Ｆｖのようにダイマー構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体の抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を通じて製作することもできる。

【0096】

一つの実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であったり、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）のうちいずれか一つのイソタイプから選択され得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型であり得る。

【0097】

本明細書で使用される「重鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ＶＨ及び３個の定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で使用される「軽鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ＶＬ及び定常領域ＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。

【0098】

本発明の抗体は、モノクロナール抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又は前記各抗体のエピトープ－結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。

【0099】

前記モノクロナール抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除いては、同一のものを称する。モノクロナール抗体は、高度に特異的であるので、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に相違する決定因子（エピトープ）に対して指示された相違する抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクロナール抗体は、抗原上の単一決定因子に対して指示される。

【0100】

「エピトープ」は、抗体が特異的に結合できるタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴のみならず、特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対する結合は消失しないという点で区別される。

【0101】

前記「ヒト化」形態の非ヒト（例：ミュリン）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有する一つ以上の非ヒト抗体（供与体又は供給源抗体）から由来した一つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域からの残基を目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与体抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域路からの残基に取り替えたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。ヒト化のために、受容体ヒト抗体の可変領域の一つ以上のフレームワークドメイン（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｄｏｍａｉｎ、ＦＲ）内の残基が非ヒト種供与体抗体から相応する残基に取り替えられ得る。これを通じて、グラフティングされたＣＤＲの適切な３次元構成を維持するように助け、これによって、親和性及び抗体安定性を改善することができる。ヒト化された抗体は、例えば、抗体の性能をさらに細密化するために、追加の受容体抗体又は供与体抗体で現れない新しい残基を含むことができる。

【0102】

前記「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域及び構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されていることを意味する。

【0103】

重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、特別な抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であったり、これと相同性である一方で、残りの鎖は、更に他の種から由来したり、更に他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であったり、これと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）のみならず、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。

【0104】

本願で使用された「抗体可変ドメイン」という用語は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及びフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分を称する。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを称する。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを称する。

【0105】

「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を称する。各可変ドメインは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。

【0106】

「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

【0107】

Ｔｉｅ２抗体は、１価又は２価であって、単鎖又は二重鎖を含む。機能的に、Ｔｉｅ２抗体の結合親和性は、１０^－５Ｍ乃至１０^－１２Ｍの範囲内にある。例えば、Ｔｉｅ２抗体の結合親和性は、１０^－６Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－９Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－９Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－１０Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－９Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－８Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－８Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－７Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－７Ｍ又は１０^－５Ｍ乃至１０^－６Ｍである。

【0108】

本出願の具体的な実施例によると、前記抗体は、配列番号１の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号３の配列を含む重鎖定常領域（ＣＨ）、配列番号２の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号４の配列を含む軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むＦａｂであり得る。

【0109】

【0110】

本発明に係る具体的な実施例において、ヒト化抗体ｈｚＴＡＡＢ、例えば、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１とｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１を製作した。前記ヒト化抗体ｈｚＴＡＡＢは、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；を含むことができる。

【0111】

具体的には、第３項において、

【0112】

配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；

【0113】

配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；

【0114】

配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は

【0115】

配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

【0116】

【0117】

本発明の抗体又は抗体断片は、Ｔｉｅ２を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載した本発明の抗Ｔｉｅ２抗体の配列のみならず、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性をさらに改善するために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいて構成される。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形状及び種類に対する分析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは類似するサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似する形状を有することが分かる。よって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、生物学的に機能均等物であると言える。

【0118】

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体が有するアミノ酸配列又はこれをコーディングする核酸分子は、配列番号に記載の配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものとして解釈される。前記実質的な同一性は、前記本発明の配列と任意の他の配列とを最大限に対応するようにアラインし、当業界で通常のアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知となっている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＢＣＩなどで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。

【0119】

これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体の配列と比較して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知となった方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、又は肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。

【0120】

本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸に関する。

【0121】

前記核酸は、配列番号９乃至１４で構成された群から選ばれる配列を含むことができる。

【0122】

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸を分離し、抗体又はその抗原結合断片を組換え的に生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入することによって追加的にクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）、又は追加的に発現させる。これに基づいて、本発明は、更に他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。

【0123】

「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸の配列は変形可能である。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

【0124】

前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には、一般に、次のうちの一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終決配列。

【0125】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて、抗体をコーディングする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。

【0126】

「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。

【0127】

原核細胞を宿主とする場合は、転写を進行できる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終決配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘログロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用可能であり、転写終決配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

【0128】

場合によって、ベクターは、それから発現される抗体断片の精製を容易にするために他の配列と融合されることもある。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などを含む。

【0129】

前記ベクターは、選択標識として当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

【0130】

本発明は、更に他の観点において、前記言及したベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使用された細胞は、原核生物、酵母又は高等真核細胞であり得るが、これに制限されるものではない。

【0131】

エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス及びバチルス・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））などの原核宿主細胞を用いることができる。

【0132】

ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されるものではない。

【0133】

本発明は、更に他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階；を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。

【0134】

前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地は、いずれも制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知となっているその他の全ての必須補充物が適当な濃度で含まれることもある。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明白であろう。

【0135】

前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加的な他の精製技術として、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。

【0136】

本発明は、更に他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物に関する。

【0137】

前記血管新生は、以前に存在した血管からの新しい血管の形成又は成長を意味し、「血管新生関連疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、血管新生の発生又は進行と関連する疾患を意味する。前記抗体で治療可能であれば、その疾病は、限定なく血管新生関連疾患の範囲に含まれ得る。血管新生関連疾患の例としては、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒絶反応（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅色症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含むが、これに限定されるものではない。また、前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸部癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髓血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）で構成された群から選ばれるが、これに限定されるものではない。

【0138】

ここで使用された「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｒ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、本発明の抗体又は組成物を投与し、関心疾患の開始を抑制又は遅延させる全ての措置を示す。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、本発明の抗体又は組成物を投与し、関心疾患の症状を改善又は好転させる全ての措置を示す。

【0139】

本発明の抗体を含む組成物は、好ましくは、薬学的組成物であって、本分野で典型的に使用される適切なビヒクル、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。

【0140】

薬学的に許容可能なビヒクルを含む薬学的組成物は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒剤、カプセル剤、サスペンション、内服液、エマルジョン、シロップ、滅菌水溶液、非水溶液、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅｓ）及び坐薬などの多様な経口又は非経口服用形態であり得る。これと関連して、本発明の薬学的組成物は、フィラー、増粘剤、バインダー、湿潤剤、錠剤分解物質（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）、インターフェース活性剤などの希釈剤又は賦形剤で組み合わせて剤形化され得る。経口投与のための固相製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒剤、カプセル剤などの形態であり得る。これらの固相剤と関連して、本発明の化合物は、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、又はゼラチンなどの一つ以上の賦形剤を組み合わせて剤形化され得る。簡単な賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤をさらに使用することができる。経口投与のための液体製剤は、サスペンション、内服液、エマルジョン、シロップなどであり得る。水又は液体パラフィンなどの簡単な希釈剤、湿潤剤、甘味剤、芳香族、防腐剤などの多様な賦形剤を液体製剤内に含ませることができる。また、本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液、非水溶性溶媒、サスペンション、エマルジョン、凍結乾燥物、坐薬などの非経口服用形態であり得る。注入可能なプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油及びオレイン酸エチルなどのエステルが非水溶性溶媒及びサスペンションに適切であり得る。坐薬の基本物質は、ウイテプゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（ｍａｃｒｏｇｏｌ）、ツイン６１（Ｔｗｅｅｎ ６１）、カカオバター（ｃａｃａｏ ｂｕｔｔｅｒ）、ラウリンバター（ｌａｕｒｉｎ ｂｕｔｔｅｒ）及びグリセロゼラチン（ｇｌｙｃｅｒｏｇｅｌａｔｉｎ）を含む。

【0141】

本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与される。ここで使用された「薬学的に有効な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、全ての医学的治療に適用可能な適合した利益と危険の比率（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）で十分な疾患治療用薬学的組成物の量を示す。有効量は、治療しなければならない疾患の重症度、患者の年齢及び性別、疾患の種類、薬剤の活性度、薬剤に対する敏感度、投与時間、投与経路、分泌速度、治療期間、薬剤の共投与及び本分野で知られている他のパラメーターを含む多様な要因によって変わる。本発明の組成物は、単独で又は他の治療法と組み合わせて投与され得る。この場合、従来の治療法と共に順次又は同時に投与され得る。また、前記組成物は、１回投与されたり、又は多数回に分けて投与され得る。これらの要因を完全に考慮すると、副作用なしで最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、この服用量は、本分野の専門家によって容易に決定され得る。本発明の薬学的組成物の服用量は、特に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬の種類、投与経路及び投与時間を含む多様な要因によって変更される。組成物は、１日に１回又は多数回に分けて、ラット、マウス、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許容された経路、例えば、経口に、直腸に、静脈に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）又は脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与され得る。

【0142】

本発明は、更に他の観点において、前記抗体又は前記組成物を必要とする個体に投与する段階を含む血管新生を抑制する方法、血管新生関連疾患予防又は治療方法に関する。

【0143】

本発明の方法は、血管新生の抑制を必要とする個体に薬学的に有効な量の薬学的組成物を投与する段階を含む。前記個体は、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ及びヒトなどの哺乳類であり得るが、これに限定されるものではない。薬学的組成物は、非経口的に（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、腹腔内に（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、肺内に（ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｉｌｙ）又は鼻内に（ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ）、そして、必要であれば、局所治療のために病変内に（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）適切な方法によって投与され得る。本発明の薬学的組成物の好ましい服用量は、個体の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含む多様な要因によって変わり、本分野の当業者によって容易に決定され得る。

【0144】

本発明は、更に他の観点において、前記抗体を含む癌予防又は治療用薬学的組成物又は前記抗体又は前記組成物を必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法に関する。「抗体」、「予防」及び「治療」などの用語は、上記で言及した通りである。

【0145】

本発明の抗体で治療可能であれば、癌は制限されない。より詳細には、本発明の抗体は、血管新生を抑制することによって癌の発生又は進行を予防することができる。癌の例は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸部癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髓血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）を含むが、これに限定されるものではない。

【0146】

また、本発明の抗体は、他の抗体又は生物学的活性剤又は多様な目的のための物質と組み合わせて使用され得る。本発明は、このような観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、他の血管新生疾患治療剤との併用投与用組成物に関する。

【0147】

前記他の血管新生疾患治療剤としては、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を薬物を挙げることができる。これを通じて、互いの抵抗性を克服させ、効能を増進させることができる。

【0148】

本発明に係る組成物で他の血管新生疾患治療剤と併用投与される場合、Ｔｉｅ２抗体及び他の血管新生疾患治療剤は、順次又は同時に投与され得る。例えば、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を対象体に投与した後、活性成分としてＴｉｅ２に対する抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を前記対象体に投与したり、前記組成物を対象体に投与した後、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を前記対象体に投与する。場合によって、前記組成物は、抗血管新生薬、消炎薬物及び／又は抗癌薬物と同時に対象体に投与することができる。

【0149】

【0150】

【実施例】

【0151】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【0152】

実施例１．Ｔｉｅ２活性化マウスモノクローナル抗体の生成

【0153】

１．１ 組換えタンパク質の発現及び精製

【0154】

マウス免疫のための組換えＴｉｅ２タンパク質は、ｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３（ヒトＴｉｅ２残基３４９－７３８、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＨ３５５１４．２）をコーディングする遺伝子をｐＦｕｓｅ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃベクター（ｐＦｕｓｅ－ｈｇ１ｆｃ１、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一時的に発現することによって生成された。

【0155】

ヒトＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３（３４９Ｔ－７３８Ｐ）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
ＴＰＫＩＶＤＬＰＤＨＩＥＶＮＳＧＫＦＮＰＩＣＫＡＳＧＷＰＬＰＴＮＥＥＭＴＬＶＫＰＤＧＴＶＬＨＰＫＤＦＮＨＴＤＨＦＳＶＡＩＦＴＩＨＲＩＬＰＰＤＳＧＶＷＶＣＳＶＮＴＶＡＧＭＶＥＫＰＦＮＩＳＶＫＶＬＰＫＰＬＮＡＰＮＶＩＤＴＧＨＮＦＡＶＩＮＩＳＳＥＰＹＦＧＤＧＰＩＫＳＫＫＬＬＹＫＰＶＮＨＹＥＡＷＱＨＩＱＶＴＮＥＩＶＴＬＮＹＬＥＰＲＴＥＹＥＬＣＶＱＬＶＲＲＧＥＧＧＥＧＨＰＧＰＶＲＲＦＴＴＡＳＩＧＬＰＰＰＲＧＬＮＬＬＰＫＳＱＴＴＬＮＬＴＷＱＰＩＦＰＳＳＥＤＤＦＹＶＥＶＥＲＲＳＶＱＫＳＤＱＱＮＩＫＶＰＧＮＬＴＳＶＬＬＮＮＬＨＰＲＥＱＹＶＶＲＡＲＶＮＴＫＡＱＧＥＷＳＥＤＬＴＡＷＴＬＳＤＩＬＰＰＱＰＥＮＩＫＩＳＮＩＴＨＳＳＡＶＩＳＷＴＩＬＤＧＹＳＩＳＳＩＴＩＲＹＫＶＱＧＫＮＥＤＱＨＶＤＶＫＩＫＮＡＴＩＴＱＹＱＬＫＧＬＥＰＥＴＡＹＱＶＤＩＦＡＥＮＮＩＧＳＳＮＰＡＦＳＨＥＬＶＴＬＰＥＳＱＡＰ

【0156】

ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
ＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＴＡＧＴＧＧＡＴＴＴＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＡＡＡＴＴＴＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＡＣＧＧＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＴＡＣＴＴＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＡＧＴＡＣＴＡＣＧＡＴＴＧＴＴＡＣＡＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＧＡＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＴＣＧＧＡＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＴＣＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＡＧＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＡＧＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＣＴＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＡＣＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＴＧＧＡＣＣＣＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＴＣＣＧＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣＣＡ

【0157】

【0158】

具体的には、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２×１０^６細胞／ｍｌ）をＥｘｐｉ２９３発現培地（Ａ１４３５１０３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で培養し、ｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３をコーディングするプラスミドを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３形質感染キット（Ａ１４５２４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に形質感染した。細胞を振盪培養器（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ、１２５ｒｐｍ）で８％ ＣＯ_２及び３７℃で５日間培養した。遠心分離によって細胞を除去した後、分泌されたｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３－Ｆｃ融合タンパク質を含む培養上清液を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ親和度カラム（１１００３４９４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＫＴＡ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。精製したｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３－Ｆｃ融合タンパク質をアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）遠心フィルター（ＵＦＣ８０３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、バッファーをＰＢＳに取り替えた。融合タンパク質のＦｃタグは、２２℃で１８時間にわたってトロンビン切断（２７－０８４６－０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって除去された。ｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３タンパク質は、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ親和度カラムで切断されたＦｃタグを除去することによって追加的に精製した。

【0159】

結晶化のためのヒトＴｉｅ２を準備するために、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３（残基５４１－７３５）をコーディングする遺伝子（次に記載）をｐＥＴ－２８ａ（６９８６４、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（２３０２４０、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発現させた。

【0160】

ヒトＴｉｅ２ Ｆｎ２－３（５４１Ｉ－７３５Ｓ）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
ＩＧＬＰＰＰＲＧＬＮＬＬＰＫＳＱＴＴＬＮＬＴＷＱＰＩＦＰＳＳＥＤＤＦＹＶＥＶＥＲＲＳＶＱＫＳＤＱＱＮＩＫＶＰＧＮＬＴＳＶＬＬＮＮＬＨＰＲＥＱＹＶＶＲＡＲＶＮＴＫＡＱＧＥＷＳＥＤＬＴＡＷＴＬＳＤＩＬＰＰＱＰＥＮＩＫＩＳＮＩＴＨＳＳＡＶＩＳＷＴＩＬＤＧＹＳＩＳＳＩＴＩＲＹＫＶＱＧＫＮＥＤＱＨＶＤＶＫＩＫＮＡＴＩＴＱＹＱＬＫＧＬＥＰＥＴＡＹＱＶＤＩＦＡＥＮＮＩＧＳＳＮＰＡＦＳＨＥＬＶＴＬＰＥＳ

【0161】

ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
ＡＴＣＧＧＡＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＡＧＴＣＡＧＡＣＣＡＣＴＣＴＡＡＡＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＴＧＧＡＣＣＣＴＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＴＣＣＧＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＣＴ

【0162】

細胞は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＬＢ培地において３７℃でＯＤ６００が０．４になるまで増殖させた。０．０５ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド）でタンパク質の発現を誘導し、１８℃で１５時間にわたって培養した。遠心分離によって細胞を回収し、これを溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、氷中の超音波処理によって溶解した。遠心分離（１３，０００×ｇ、４℃で０．５時間）によって細胞破片を除去した後、上清液をＮｉ－ＮＴＡアガロース親和性カラム（３０２１０、ＱＩＡＧＥＮ）に適用した。カラム体積の５倍に該当する洗浄バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール）で洗浄した後、タンパク質を溶出バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ ４００ｍＭイミダゾール）で溶出し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５及び２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（２８－９８９３－３５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーで追加的に精製した。結晶化のためのキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂを準備するために、キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂに対する合成された重鎖及び軽鎖を細胞質分泌に対する変形ｐＢＡＤ発現ベクターにクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞をプラスミドｐＢＡＤ－Ｆａｂで形質転換した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地において３７℃で増殖させた。ＯＤ６００ １．０において０．２％のアラビノースでタンパク質の発現を誘導し、細胞を３０℃で１５時間にわたって増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、氷中の超音波処理によって溶解した。遠心分離（１３，０００×ｇ、４℃で３０分間）によって細胞破片を除去した後、可溶性キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂを含む上清液をＮｉ－ＮＴＡアガロース親和性クロマトグラフィーカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に適用し、カラムの５倍洗浄バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。タンパク質を溶出バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ ４００ｍＭイミダゾール）で溶出し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５及び２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。精製したタンパク質と抗体を分注し、これらを－８０℃で保存した。

【0163】

１．２ Ｂ細胞ハイブリドーマの免疫化及び生成

【0164】

５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、精製されたｈＴｉｅ２－Ｉｇ３－Ｆｎ３（１００μｇ／注射）を補助剤と混合した後、週２回６週間免疫化した。免疫化されたマウスの血清における抗Ｔｉｅ２抗体は、ｈＴｉｅ２ ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）によって評価された。抗体（１：５０００希釈）が適切に増加すると（ＯＤ＞１．０）、免疫化したマウスの脾臓からＢリンパ球を分離し、これを（ＳＰ２／０）と融合させた。融合細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）及びチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ））培地で培養し、融合骨髄腫細胞とＢリンパ球のみでハイブリドーマ細胞を選択して培養した。

【0165】

Ｂ細胞ハイブリドーマは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で維持された。Ｂ細胞ハイブリドーマで抗Ｔｉｅ２抗体を生産するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、血清未含有培地（ＳＦＭ、１２０４５－０７６、Ｇｉｂｃｏ）で３日間培養した。

【0166】

生き残ったハイブリドーマ細胞を９６ウェルプレートに分注し、培養上清液をｈＴｉｅ２ ＥＬＩＳＡでテストした。限界希釈によるクローン選択のために、＋信号を示すハイブリドーマプールを選択した。

【0167】

１．３ モノクロナール抗体をコーディングするＤＮＡの配列決定

【0168】

ハイブリドーマ細胞（２×１０^６細胞／ｍｌ）を１０％のＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養した後、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを取得した。ＲＮＡの濃度を測定し、ｃＤＮＡを逆転写（ＲＴ）によって合成した。重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子配列は、マウス（Ｍｏｕｓｅ）Ｉｇ－プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）セット（Ｎｏｖａｇｅｎ）及び合成されたｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより、９４Ｃで５分間、その後、９４Ｃで１分間、５０Ｃで１分間、７２Ｃで２分後、７２Ｃで６分間４℃まで徐々に冷却する過程を３５周期で行った。各反応で得られたＰＣＲ産物をＴＡベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列を決定し、各抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコーディングするヌクレオチド配列を生成した。

【0169】

１．４ Ｔｉｅ２活性化マウスモノクローナル抗体の生成

【0170】

Ｔｉｅ２のＥＣＤは、リガンド結合とは関係なく、膜近位Ｆｎ３を通じてダイマーを形成する。リガンド結合ドメイン（ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ：ＬＢＤ）に結合する多量体Ａｎｇｐｔ１は、Ｔｉｅ２の活性化及びダウンストリーム信号伝達のために、このような事前に形成されたＴｉｅ２ダイマーをさらに高次元のオリゴマー又は「Ｔｉｅ２クラスター」に架橋する。しかし、ＬＢＤをターゲットとする単一抗体に対するＴｉｅ２クラスタリングを誘導するには、事前に形成されたＴｉｅ２ホモダイマーのＬＢＤが非常に遠くにある（～２６０Å）。このような概念に基づいて、膜近位Ｔｉｅ２ Ｆｎドメインに結合する抗Ｔｉｅ２抗体が多量体のＡｎｇｐｔ１のようにＴｉｅ２オリゴマー化及び活性化を誘導できると仮定した。

【0171】

ｍＴｉｅ２ではなく、ｈＴｉｅ２のＩｇ３－Ｆｎ３をターゲットとするｈＴｉｅ２活性化マウスモノクローナル抗体であるｈＴＡＡＢを生成した。

【0172】

【0173】

実施例２．結晶構造を通じてＶ字状のＴｉｅ２ダイマーに結合された２個のｈＴＡＡＢ Ｆａｂ確認

【0174】

マウスｈＴＡＡＢの重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を、ヒト重鎖定常領域（ＣＨ）又は軽鎖定常領域（ＣＬ）のそれぞれを発現するバックボーンベクターにクローニングし、Ｔｉｅ２活性化抗体ｈＴＡＡＢのヒト－マウスキメラＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体が生成された。マウスｈＴＡＡＢの重鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ断片を配列「ＥｃｏＲＶ－信号配列－ＶＨ－ＮｈｅＩ」として合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｉｎｃ）。合成されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶ及びＮｈｅＩで切断し、ｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１（ＩｇＧ１イソタイプ）及びｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ２（ＩｇＧ２イソタイプ）ベクターにそれぞれクローニングした（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）。ヒトＩｇＧ４キメラ抗体を製作するために、マウスｈＴＡＡＢの重鎖可変領域（ＶＨ）をコーディングするＤＮＡを、クローニングのためにＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ部位を含むプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。次に、ＰＣＲ産物を、ヒトＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）を発現する変形ｐＯｐｔｉＶＥＣ－ＴＯＰＯベクターにサブクローニングした。キメラ軽鎖発現ベクターは、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩ制限部位を含むプライマーを使用し、マウスｈＴＡＡＢの軽鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅することによって構築された。

【0175】

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ１～ＣＨ３）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＶＷＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0176】

ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

【0177】

【0178】

ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域（ＣＨ１～ＣＨ３）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＶＦＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0179】

ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＴＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

【0180】

ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（ＣＨ１～ＣＨ３）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＶＱＦＶＷＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0181】

ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＴＧＡＧＣＧＡＣＣＧＡＴＣＧＡＴＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ

【0182】

次に、ＰＣＲ産物を、ヒトカッパ軽鎖の定常領域を発現する変形ｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクタにサブクローニングした。

【0183】

ヒトカッパ軽鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＡ５８９８９．１）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
ＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

【0184】

Ｅｘｐｉ２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてキメラ抗体を製造した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３形質感染キット（Ａ１４５２４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて重鎖及び軽鎖発現ベクターで共同形質感染した後、形質感染した細胞をＥｘｐｉ２９３発現培地で５日間培養した。培養上清液を０．４５μｍのフィルターでろ過し、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（１１００３４９４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて抗体を精製した。

【0185】

ｈＴＡＡＢ結合のエピトープを確認するために、ｈＴＡＡＢ結合のＴｉｅ２の最小ドメインを確認した。ｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３を用いて抗体生成のためのマウスを免疫化したので、まず、ｈＴｉｅ２のＩｇ３－Ｆｎ３、Ｆｎ１－３又はＦｎ２－３を含む３つの組換えタンパク質を製作した（図１、Ｔｉｅ２構造を参照）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用し、ｈＴＡＡＢ重鎖可変領域とヒトγ１定常領域及び軽鎖可変領域とヒトκ定常領域の融合から構築された組換えキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂへの結合をテストした。キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂのみのクロマトグラフィープロフィールは、キメラｈＴＡＡＢ ＦａｂをｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３、Ｆｎ１－３又はＦｎ２－３と混合すると前方に移動する単一ピークを示した（図２ａ）。また、キメラｈＴＡＡＢ ＦａｂとこのようなｈＴｉｅ２ドメインは共溶出した。このような結果は、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３がｈＴＡＡＢ結合に十分であり、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３とキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂが安定した複合体を形成できることを示す（図２ａ、黄色)。

【0186】

【0187】

検索モデルとしてデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）Ｆａｂ（ＰＤＢ：５Ｘ８Ｍ）とＴｉｅ２ Ｆｎ２－３構造（ＰＤＢ：５ＭＹＡチェーンＢ）を使用し、分子置換を通じて２．１Å解像度（表１）でｈＴｉｅ２ Ｆｎ２．３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の結晶構造を決定した。結晶学的非対称ユニットには、２回対称の異種四量体ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２．３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体（２：２化学量論的）が含まれていた。

【0188】

【表1】

【0189】

二つのキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂは、２倍軸に垂直な平面に対して約１５°の勾配で各ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３ドメインの側面に結合した（図３ａの右側）。このような結晶構造は、ｈＴＡＡＢ結合Ｆｎ３ドメインに対する２個の主要エピトープを明らかにし、これらは、重鎖結合の場合は濃いオレンジ色、軽鎖結合の場合は明るいオレンジ色で表示された（図３ｂ及びｃ、上端）。異種四量体ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体のうちの二つのｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３モノマーは同一の全体構造を共有し、以前に報告されたＴｉｅ２ Ｆｎ２－３（ＰＤＢ：５ＭＹＢ；赤色）及びＦｎ１－３（ＰＤＢ：５ＵＴＫ；緑色）の結晶構造と類似することが分かり、Ｆｎ２とＦｎ３との間の堅固な結合を示す（図２ｂ；Ｃα平均二乗偏差は、各ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３モノマー間で約１．０５０Å、５ＭＹＢで１．５０６Å、及び５ＵＴＫで１．９９９Åである）。注目すべきことは、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体におけるｈＴｉｅ２ダイマー間の構成とインターフェースも、以前の研究（５ＭＹＢと５ＵＴＫのダイマー２モデル）（図２ｃ、ｄ）で発見されたものと一致した。

【0190】

このような結果は、ｈＴＡＡＢ結合がｈＴｉｅ２ホモダイマーのコンフォメーション変化を起こさなかったことを示す。４個のキメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂのドメイン（重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、βシートのペアからなる典型的なＩｇドメインフォールドを採用した。重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）ＣＤＲは、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３ドメインとの接触に関与した（図３ｃの下端）。６個のＣＤＲ以外に、軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）残基Ｒ４６、Ｙ４９、Ｓ５３及びＲ６６も、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３ドメインと相互作用した（図３ｄ）。以上の内容をまとめると、結晶構造に関する発見は、二つのｈＴＡＡＢ ＦａｂがＶ字状のＴｉｅ２ダイマーの側面、特にＦｎ３ドメインに結合することを明らかにした。

【0191】

実施例３．Ｔｉｅ２ Ｆｎ３とｈＴＡＡＢの相互作用及び同型Ｆｎ３相互作用

【0192】

キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂは、約５７％の重鎖接触（５１２．８Å^２；濃いオレンジ色）と４３％の軽鎖接触（３８４．７Å２；薄いオレンジ色）からなる８９７．５Å^２の総埋没表面積を有する大きな相互作用インターフェースを介してｈＴｉｅ２ Ｆｎ３に結合する。（図３ｃ）。キメラｈＴＡＡＢ ＦａｂとｈＴｉｅ２ Ｆｎ３との間の結合インターフェースは、Ａ、Ｂ、Ｃ領域の３つの領域に分けることができる（図４ａ、ｂ及び図５）。

【0193】

Ａ領域の相互作用は、主に、ｈＴＡＡＢ重鎖（ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２）とｈＴｉｅ２ Ｆｎ３ドメインとの間のイオン相互作用と水素結合によって媒介される。ｈＴＡＡＢ ＨＣＤＲ１（Ｓ２８、Ｔ３０、Ｓ３１及びＷ３３）及びＨＣＤＲ２（Ｈ５２、Ｄ５５及びＥ５７）の各残基は、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３ βＡ［Ｅ６４３、Ｎ６４４、Ｉ６４５（主鎖）、Ｋ６４６、Ｉ６４７（主鎖）］及びβＧ（Ｈ７２７）残基と多くの相互作用を形成する（図４ａの上端左側と下端左側及び図４ｃ）。

【0194】

Ｂ領域では、ｈＴＡＡＢのＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、疎水性相互作用によってｈＴｉｅ２ Ｆｎ３の広い表面をカバーし、総埋没表面積は４１３．５Ａである。ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３の各残基Ｉ６４７、Ｉ６５０、Ａ７０７、Ｖ７３０及びＬ７３２は、ＨＣＤＲ３残基Ｌ１００及びＹ１０１、及びＬＣＤＲのＩ３１、Ｙ４９、Ａ５０、Ｙ９１及びＡ９２と疎水性コア相互作用のネットワークを形成する（図４ａ、下端左側及び図４ｄ）。このような疎水性相互作用は、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ３残基（Ｑ６７７、Ｅ７０５及びＥ７２８）とｈＴＡＡＢ軽鎖残基（Ｓ５３、Ｒ６６及びＲ４６）との間の水素結合及び静電気相互作用をそれぞれ含む隣接したＣ領域の相互作用によって安定化される（図４ａ、下端中央及び図４ｃ）。

【0195】

興味深いことに、Ｃ領域の相互作用に関与するｈＴＡＡＢ軽鎖残基は、ＣＤＲループではなく、ＦＲのβ鎖（βＣ’のＲ４６、βＣ’のＳ５３及びβＤのＲ６６）にある。ｈＴＡＡＢ相互作用に関与するほとんどのｈＴｉｅ２ Ｆｎ３残基は、多様な種類の間で高度に保存されているが（図５ａ）、ｈＴＡＡＢ結合インターフェースの中心にあるｈＴｉｅ２の疎水性バリン（Ｖ７３０）は、マウス及びラットで長く荷電された側鎖（アルギニン）に置換されており（図３ｂ及び図５ａ）、ｈＴＡＡＢがマウスＴｉｅ２に結合できない理由を説明している（図１ｅの右側）。しかし、ｈＴＡＡＢの全てのエピトープは、ヒトとサルのＴｉｅ２間に貯蔵されており、ｈＴＡＡＢがサルのＴｉｅ２と交差反応を示すことを示唆している（図５ａ）。また、Ｔｉｅ２とＴｉｅ１のＦｎ２－３ドメイン、特に、ｈＴＡＡＢ相互作用に関与する残基間の配列類似性が低いので、ｈＴＡＡＢがＴｉｅ１に結合する可能性は低い（図５ｂ）。

【0196】

以前のＴｉｅ２アポ構造（５ＭＹＢ及び５ＵＴＫのＤｉｍｅｒ２モデル）と一致するように、Ｆｎ３－Ｆｎ３’インターフェースは、同型Ｆｎ３βＣ’（Ｄ６８２～Ｋ６９０）の主鎖原子間の水素結合で構成されており、連続する逆平行βシートを形成する（図４ａの右側）。ダイマーインターフェースは、Ｖ６８５とＶ６８７が関与する疎水性相互作用及び相互静電相互作用、特に、Ｄ６８２－Ｎ６９１’、Ｄ６８２’－Ｎ６９１、Ｙ６９７－Ｑ６８３’、Ｙ６９７’－Ｑ６８３、Ｋ７００－Ｅ７０３’及びＫ７００’－Ｅ７０３（図４ａ、右側下側）によってさらに安定化される。Ｆｎ３－Ｆｎ３’間の広い埋没インターフェース（７０４Å^２）、－４．７ｋｃａｌ／ｍｏｌの低い溶解化自由エネルギー収得（Ｐｉｓａサーバ分析）及びｈＴＡＡＢの存在とは関係なく、Ｔｉｅ２ホモダイマーの一貫したＶ字状構成を通じて、同型膜近位Ｆｎ３ドメイン間の特定の相互作用がリガンド非依存性Ｔｉｅ２ホモダイマーの形成に寄与することを意味する。

【0197】

結晶構造及びＦｎ２変異体を用いた機能分析によると、事前に形成されたＴｉｅ２ダイマーの側面クラスターにＦｎ２相互作用が必須的であると提示されてきた。驚くべきことに、構造にＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／ｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体が含まれており、タンパク質結晶の空間群が二つの構造間で異なる場合にも、結晶パッキングで隣接したホモダイマーのＦｎ２ドメイン間で同一の相互作用が観察された（図１２ａ、ｂ）。しかし、結晶パッキンング格子でＴｉｅ２ Ｆｎ３に結合されたＦａｂ及びＦａｂ^＊は互いにほぼ平行であるので（^＊表示は、Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３／ｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の対称メート内のドメイン又は残基を示すのに使用する。）、一つのＩｇＧ１のうちの２個のＦａｂアーム間の可能な角度（１１５°－１４８°）から逸脱している。したがって、ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１が、事前に形成されたＴｉｅ２ダイマーのＦｎ２媒介側面クラスタリングに関与する可能性は低いが、このような類型のＴｉｅ２クラスタリングは、さらに高い次元のＡｎｇｐｔ１で発生し得る。

【0198】

実施例４．ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ結合を通じてＴｉｅ２ダイマーの多角形組立体を誘導する。

【0199】

ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｃ２５１９Ａ、Ｌｏｎｚａ）をＥＧＭ－２内皮増殖培地（ＣＣ－３１６２；Ｌｏｎｚａ）で維持し、加湿５％ ＣＯ_２培養器において３７℃で培養した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ａ１４５２７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＥｘｐｉ２９３発現培地（Ａ１４３５１０２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で維持し、３７℃及び８％ ＣＯ_２加湿振盪培養器で培養した。

【0200】

多量体Ａｎｇｐｔ１又はＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１は、Ｔｉｅ２の高次クラスタリングを誘発する可能性があり、これは、血管安定化のために、ＥＣでＴｉｅ２とその下流信号を活性化するためのキーである。Ｔｉｅ２受容体の主要下位信号伝達タンパク質であるＡｋｔリン酸化のレベルを免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）技法で測定した。興味深いことに、ｈＴＡＡＢ Ｆａｂのみならず、ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１も、一次培養ＨＵＶＥＣでＴｉｅ２とＡｋｔの濃度依存性活性化を誘導した（図６ａ及び図６ｂ）。この結果は、ｈＴＡＡＢ ＦａｂのＴｉｅ２自体への結合がＴｉｅ２のクラスター化及び活性化を誘導するのに十分であることを意味した。すなわち、ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１は、２価Ｆａｂアームを通じてＴｉｅ２クラスタリングを促進することができる。しかし、異種四量体ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体のうちのＦａｂ重鎖の２個のＣ末端間の距離は１７０Åより大きいことが分かり（図３ａ）、同型Ｔｉｅ２ダイマーに結合する２個のＦａｂは二つの異なるＩｇＧ分子から由来する。異種四量体ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の結晶構造とは異なり、ＳＥＣ－多角度光散乱（ＭＡＬＳ）分析を通じて、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３及びｈＴｉｅ２ ＥＣＤが溶液中でモノマーであることが明らかになった。また、ｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３又はｈＴｉｅ２ ＥＣＤに結合するｈＴＡＡＢは、オリゴマー化を誘導できなかった（図６ｃ）。このデータと以前の各報告は、溶液中の組換えＴｉｅ２外部ドメインの多量体状態に対して矛盾していた。しかし、リガンドに依存しないＴｉｅ２の二量体化は、全長Ｔｉｅ２によって賦課される空間的制約を通じて生理的条件下で細胞膜で発生し得る。このような二量体化は、結晶構造で示される同型のＦｎ３－Ｆｎ３’相互作用と共に、細胞内のキナーゼドメインのうちの触媒ループと活性化ループとの間のＹＩＡ配列を通じて特に発生し得る。

【0201】

生理学的細胞膜でリガンド非依存性Ｔｉｅ２ダイマーを模倣するために、構成的Ｔｉｅ２ダイマーを人為的に生成した。同型Ｆｎ３－Ｆｎ３’相互作用に関与する２個の残基Ｄ６８２とＮ６９１をシステイン（Ｄ６８２Ｃ及びＮ６９１Ｃ）に突然変異させ、二硫化結合を導入した（図６ｄ、ｅ）。その後、精製されたｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１ＣダイマーをｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１と１：１の比率で培養し、全長ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１が予め形成されたＴｉｅ２ダイマーのクラスタリングをどのように誘導するのかを調査した。ＳＥＣによって凝集体を除去した後、ネガティブ染色電子顕微鏡（ＥＭ）を使用し、生成された複合体（肩のピーク）の構造配列を調査した（図６ｆ及び図７）。驚くべきことに、ネガティブ染色ＥＭ粒子の２Ｄ分類は、全長ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ１がｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃダイマーの正方形、五角形及び六角形の高次組立体に交差結合することを示した（図６ｇ）。このような多角形組立体は、各頂点でＩｇＧ１のＦｃドメイン及びＦａｂアームのうちの一つに結合し、２個のＩｇＧ１を連結する一つのＴｉｅ２ダイマーを特徴とする。Ｉｇ３ドメインとＦｎ１ドメインとの間のループの柔軟性により、Ｉｇ３ドメインがネガティブ染色ＥＭの２Ｄ平均で拡散されたように見えたが、多角形の側面を横切るｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃダイマーの堅固なＦｎ１－３ドメインは区別された。ネガティブ染色ＥＭで観察された結果とｈＴｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の結晶構造に基づいて、五角形組立体の３Ｄモデル（５～５ｈＴＡＡＢ ＩｇＧ及びｈＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３ Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃダイマー）を生成することができる（図６ｈ）。

【0202】

実施例５．リガンド非依存性Ｔｉｅ２の二量体化は、ｈＴＡＡＢ媒介Ｔｉｅ２のクラスタリング及び活性化に必須的である。

【0203】

細胞膜内のＴｉｅ２／ｈＴＡＡＢ多角形組立体の生物学的関連性及び重要性を評価した。Ｔｉｅ２ダイマー（Ｄ６８２Ｃ／Ｎ６９１Ｃ）を用いてＦｎ３－Ｆｎ３’ダイマーインターフェース（図８ａ）を破壊することによって、全長Ｔｉｅ２－ＧＦＰ構造体と共にＴｉｅ２モノマー（Ｖ６８５Ｄ／Ｖ６８７Ｄ／Ｋ７００Ｅ）を作った。このような構造を使用し、Ｔｉｅ２を内生的に発現しないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一時的に形質感染させた。細胞で全長Ｔｉｅ２－ＧＦＰ野生型（ＷＴ）と持続的ダイマー及びモノマーＴｉｅ２変異体の適切な原形質膜の発現を確認した後（図８ｂ）、ＧＦＰタグＴｉｅ２ ＷＴ及び変異体のクラスターをモニターした。ライブセルイメージングでＷＴ Ｔｉｅ２及びＴｉｅ２ダイマークラスターがｈＴＡＡＢ又はＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１の添加後に細胞の表面に形成されたが、Ｔｉｅ２モノマーはクラスターを形成できなかった（図８ｂ）。次に、同一の条件でＴｉｅ２とＡｋｔのリン酸化をモニタリングすることによって、ＨＴＡＡＢ ＩｇＧ１又はＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１がＴｉｅ２の活性化に及ぼす影響を調査した。Ｆｎ３－Ｆｎ３ダイマーインターフェースの破壊（Ｔｉｅ２モノマーの構築）により、ｈＴＡＡＢ及びＣＯＭＰ－Ａｎｇｐｔ１によって誘導されたＴｉｅ２及びＡｋｔのリン酸化を除去したが、ＷＴ Ｔｉｅ２及びダイマーＴｉｅ２は、二つのＴｉｅ２アゴニストによって同様に活性化された（図８ｃ、ｄ）。このような結果は、ＷＴ Ｔｉｅ２が原形質膜に同型ダイマーとして存在し、Ｆｎ３ドメイン間の分子間相互作用に起因するリガンド非依存性同型Ｔｉｅ２二量体化が、ｈＴＡＡＢを介したＴｉｅ２のクラスタリング及び活性化に必須的であることを示す。

【0204】

実施例６．ヒト化ＴＡＡＢは、ＨＵＶＥＣでＴｉｅ２とその下流信号を活性化する。

【0205】

６．１ ヒト化抗体の製造

【0206】

マウスｈＴＡＡＢのＦｖ領域は、Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の構造及びＩＧＨＶ１－４６^＊０１及びＩＧＫＶ１－１７^＊０１複合体のモデル構造によってヒト化された。

【0207】

ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）のＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎオンラインツールを使用し、マウスｈＴＡＡＢＦｖ配列をヒト生殖細胞系列遺伝子の配列と比較した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。マウスｈＴＡＡＢの重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれで最も高い配列相同性を示すＩＧＨＶ１－４６^＊０１及びＩＧＫＶ１－１７^＊０１をヒトフレームワーク（ＦＲ）供与体として選択した。ＩＧＨＶ１－４６^＊０１及びＩＧＫＶ１－１７^＊０１のＣＤＲ（ＩＭＧＴナンバリングで定義）をマウスｈＴＡＡＢで対応するものに取り替え、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１及びｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１を生成した。ＶＨ－ＶＬペアリング、ＣＤＲコンフォメーション及びＴｉｅ２ Ｆｎ３に対する親和度を維持するために、重要な選択残基をｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１及びｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１に追加的に置換し、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２及びｈｚＴＡＡＢ－Ｌ２を生成した。得られたヒト化Ｆｖ遺伝子（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２、ｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１、ｈｚＴＡＡＢ－Ｌ２）を合成し（Ｂｉｏｎｅｅｒ）、哺乳動物細胞での発現のために最適化された。まず、ヒト免疫グロブリンカッパの軽鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＡ５８９８９．１）及びヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＷＫ５７４５４．１）をｐＯｐｔｉＶＥＣ－ＴＯＰＯ及びｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクターにクローニングし、ここに合成されたヒト化軽鎖及び重鎖の可変領域（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２、ｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１又はｈｚＴＡＡＢ－Ｌ２）を連続的にクローニングした。

【0208】

ヒトカッパ軽鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＡ５８９８９．１）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0209】

ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
ＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

【0210】

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ１～ＣＨ３）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＷＫ５７４５４．１）
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0211】

ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

【0212】

ヒト化軽鎖及び重鎖を含むプラスミドを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３形質感染キット（Ａ１４５２４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に形質感染した。細胞を振盪培養器（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ、１２５ｒｐｍ）において８％ ＣＯ_２及び３７℃で５日間培養した。収得した培養上清液を遠心分離することによって細胞を除去し、ＰＢＳで平衡化したＰｒｏＡカラム（Ａｍｉｃｏｇｅｎ）で親和度クロマトグラフィーによって抗体を分離した。結合された抗体を０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ９．０で中和した。溶出された抗体は、ＰＢＳで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｇａｉｎ １０／３００ＧＬカラム（２８－９９０９－４４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製された。抗体の純度は、還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて評価し、精製した抗体を分注した後、これを－８０℃で貯蔵した。

【0213】

６．２ ヒト化Ｔｉｅ２活性化抗体の相同性モデリング

【0214】

ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ相同性モデリングは、Ｔｉｅ２ Ｆｎ２－３／キメラｈＴＡＡＢ Ｆａｂ複合体の構造内のｈＴＡＡＢ Ｆｖの構造をテンプレートとして使用し、ｈＴＡＡＢ ＣＤＲをグラフティングしたヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ１－４６^＊０１及びＩＧＫＶ１－１７^＊０１の配列を用いて行われた。最も高いＱＭＥＡＮ－Ｚ（Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｄｅｌ Ｅｎｅｒｇｙ ＡＮａｌｙｓｉｓ－Ｚ）点数（－０．３７）を有する結果モデルは、追加構造ベースのヒト化のためにｈＴＡＡＢＦｖ構造と整列した。

【0215】

【0216】

【0217】

ｈＴＡＡＢ強力なＴｉｅ２アゴニスト活性は、血管疾患の臨床応用で有望である。したがって、Ｔｉｅ２に結合して活性化できる能力を維持しながら、マウスの起源による免疫原性を最小化できるようにマウスｈＴＡＡＢをヒト化しようとした。ＦａｂドメインとＦｃドメインとの間のヒンジでの二硫化結合の長さ、配列及び個数が異なるので、ＩｇＧサブクラスのヒンジの柔軟性はやや変動的であってもよく、それぞれのサブクラスに対するＦｃドメインと関連するＦａｂ－Ｆａｂ角度及びＦａｂ配向も変動的であってもよい。

【0218】

ｈＴＡＡＢのＦａｂ－Ｆａｂ角度とＦａｂ配向がＴｉｅ２の多角形組立体の重要な決定要因になり得ることを考慮した上で、ヒンジの柔軟性がＴｉｅ２の活性化に影響を及ぼすかどうかを調査した。このために、ｈＴＡＡＢの可変領域を含むキメラＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４を製作し（図９ａ）、そのＴｉｅ２アゴニスト活性を親抗体マウスｈＴＡＡＢの活性と比較した。Ｔｉｅ２とＡｋｔのリン酸化は、ＩｇＧサブクラスのヒンジの柔軟性と相関していた（ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２）。最も堅固な鎖を有するＩｇＧ２イソタイプは、最も低いＴｉｅ２アゴニスト活性を示した（図９ｂ、ｃ）。このような結果は、ｈＴＡＡＢによる空間にうまく配置されたＴｉｅ２クラスターの形成がＴｉｅ２活性化に重要であることを示す。このような観察に基づいて、ｈＴＡＡＢヒト化のためにＩｇＧ１形式を選択した。

【0219】

ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）のＩＭＧＴ／Ｄｏｍａｉｎ Ｇａｐ Ａｌｉｇｎツールを用いてＣＤＲの境界を定義し、マウスｈＴＡＡＢの重鎖可変領域（６６％）及び軽鎖可変領域（６８％）において最も高い配列相同を示すので、ヒト生殖細胞系列遺伝子ＩＧＨＶ１－４６^＊０１及びＩＧＫＶ１－１７^＊０１をヒトＦＲ供与体として選択した（図９ｄ及び図５ｃ－ｄ）。

【0220】

ヒトＴｉｅ２に対するマウスｈＴＡＡＢ及びヒト化ＩｇＧ１の結合動態は、認証等級ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ（ＢＲ１００３９９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システムを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。３ｍＭ ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＰ２０製剤（ＨＢＳ－ＥＰ＋）を含むＨＥＰＥＳバッファー生理食塩水（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を反応及びランニングバッファー（ＢＲ１００６６９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）として使用した。ヒトＴｉｅ２ ＥＣＤ（社内製造；ヒトＴｉｅ２の残基２３－７３５、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＨ３５５１４．２）は、ｐＨ５．５ １０ｍＭの酢酸塩を使用したアミンカップリングを通じてＣＭ５センサーチップの表面に固定化された。その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーで希釈したマウスｈＴＡＡＢ及びヒト化ＩｇＧ１を７つの異なる濃度（０ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ及び６４ｎＭ）の抗原固定化センサーチップに３００秒間３０μｌ／分の流動速度で適用した。センサーチップに結合した分析対象物は、ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニングバッファーで３００秒間洗浄して解離した。結合（ｋ_ｏｎ Ｍ－１ｓ－１）及び解離（ｋ_ｏｆｆ、ｓ－１）定数は、両方とも３００秒間隔で測定された。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、Ｍ）は、オフ速度とオン速度の比率（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）として計算された。速度論的パラメータは、１：１結合モデルを用いてＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅのグローバルフィッティング機能で決定された。

【0221】

マウスＴｉｅ２に対するマウスｈＴＡＡＢとヒト化ＩｇＧ１の結合動態は、Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したＢＬＩ（Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）によって測定された。分析は３０℃で実施した。動態バッファー（０．０１％の毒素を含まないＢＳＡ ０．００２％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳ内の０．００５％のＮａＮ_３）で１０分間水和した後、マウスｈＴＡＡＢ（各１０μｇ／ｍｌ）を抗マウスＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＭＣ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にロードした。ＡｂコテーィングされたセンサーをマウスＴｉｅ２ Ｉｇ３－Ｆｎ３（残基３４９－７３７）の１６００ｎＭの溶液とインキュベートし、結合曲線を６００秒間記録した。解離は、反応速度バッファーで６００秒間測定した。

【0222】

選択されたヒト生殖細胞系列ＦＲ供与体のＣＤＲ部分をハイブリドーママウス抗体ｈＴＡＡＢの対応するＣＤＲに単純に取り替え、既存のＣＤＲをグラフティングした。ｈＴＡＡＢ ＨＣＤＲ２のコンフォメーションを維持するために、Ｓ５９をヒト化抗体ｈＴＡＡＢ重鎖のＨＣＤＲ２に隣接したＲ５９残基に取り替えた。ヒト化Ｔｉｅ２活性化抗体（ｈｚＴＡＡＢ）の重鎖及び軽鎖（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１及びｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１）のＣＤＲが移植される可変領域は、ヒトＩｇγ１重鎖の定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＷＫ５７４５４．１）を含むｐＯｐｔｉＶＥＣ－ＴＯＰＯベクターに、及びヒトＩｇκ軽鎖の定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＡ５８９８９．１）を含むｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクターにそれぞれクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞でｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１とｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１を共発現させ、タンパク質Ａ親和度クロマトグラフィー及びＳＥＣによって全長ＩｇＧ１として均一性に対する抗体を精製した後（図１０ａ、ｂ）、ＳＰＲを用いてｈＴｉｅ２ ＥＣＤに対するｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１の結合動態を評価した。ｈＴｉｅ２に結合するｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１は、親抗体ｈＴＡＡＢに比べて遥かに低い親和力及び速い分解速度（ｋ_ｏｎ＝２．５×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１；ｋ_ｏｆｆ＝５．６×１０^－３ｓ^－１；Ｋ_Ｄ＝２．２×１０^－８Ｍ）を示し（図９ｆ）、既存のＣＤＲグラフティングは、ｈＴｉｅ２に対するｈＴＡＡＢの結合親和力を維持するのに不十分であることを示す。

【0223】

ｈＴＡＡＢ構造ベースのヒト化と関連して、結晶構造の親抗体ｈＴＡＡＢのＦｖ（可変断片）構造をテンプレートとして使用し、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１とｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１の相同モデリングを行った。親抗体ｈＴＡＡＢ Ｆｖ構造を製作されたｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１Ｆｖモデルに置き、ＶＨ－ＶＬペアリング、ＣＤＲのコンフォメーション、及びｈＴｉｅ２への結合親和性を維持するために重要なＦＲ残基を確認した（図９ｅ）。ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１と親抗体ｈＴＡＡＢのＶＨ－ＶＬインターフェース比較分析を通じて、ＬＦＲ２のｈＴＡＡＢ軽鎖残基であるＮ３４及びＬ３６（ｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１でのＧ３４及びＹ３６）はＨＣＤＲ３のＹ１０１を安定化し、ＨＦＲ４のＷ１０５で立体障害効果（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を減少させることが明らかになった。また、ＬＦＲ３でのｈＴＡＡＢ軽鎖残基Ｄ５５（ｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１のＱ５５）は、ＬＦＲ２でＲ４６と相互作用することによってＬＣＤＲ２ヘアピンループのコンフォメーションを維持するために重要である（図９ｅのｆ参照）。ＬＦＲ３でのｈＴＡＡＢ軽鎖残基Ｒ６６（ｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１のＧ６６）も、ｈＴｉｅ２のＥ７０５との電荷相互作用を通じてＴｉｅ２に結合するのに重要である（図９ｅのｇ参照）。このような根拠に基づいて、ｈｚＴＡＡＢ－Ｌ１の選択された残基を対応するマウスｈＴＡＡＢ残基（Ｇ３４Ｎ、Ｙ３６Ｌ、Ｑ５５Ｄ及びＧ６６Ｒ）に逆変異させることによってｈｚＴＡＡＢ－Ｌ２を生成した（図９ｄ）。重鎖（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２）に対して、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１のＨＦＲ３でＲ７２及びＴ７４を親抗体ｈＴＡＡＢ残基Ｖ７２及びＫ７４に変異させ、ＨＣＤＲ２のＰ５３及びＳ５４と相互作用することによってＨＣＤＲ２のコンフォメーションを安定化させることができる（図９ｅのｈを参照）。

【0224】

ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１に続いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞での全長ＩｇＧ１として、重鎖及び軽鎖の様々な組み合わせによって他の３個のｈｚＴＡＡＢ（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ２、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ１及びｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２）を生産した（図１０ａ、ｂ）。精製後、ＳＰＲを使用し、得られた抗体ｈＴｉｅ２ ＥＣＤに対する結合キネティックを評価した。ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ１の結合親和力（ｋ_ｏｎ＝２．８×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１；ｋ_ｏｆｆ＝３．３×１０^－３ｓ^－１；Ｋ_Ｄ＝１．１×１０^－８Ｍ）は、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ１（ｋ_ｏｎ＝２．５×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１；ｋ_ｏｆｆ＝５．６×１０^－３ｓ^－１；Ｋ_Ｄ＝２．２×１０^－８Ｍ）よりやや高いが、その解離速度は、親抗体ｈＴＡＡＢ（ｋ_ｏｎ＝１．４×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１；ｋ_ｏｆｆ＝６．０×１０^－４ｓ－１；Ｋ_Ｄ＝４．２×１０^－９Ｍ）より遥かに高かった（図９ｉ）。しかし、軽鎖の逆変異は、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ２（ｋ_ｏｎ＝１．１×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１；ｋ_ｏｆｆ＝９．６×１０^－４ｓ^－１；Ｋ_Ｄ＝８．５×１０^－９Ｍ）及びｈｚＴＡＡＢ Ｈ２Ｌ２（ｋ_ｏｎ＝１．４×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１；ｋ_ｏｆｆ＝７．３×１０^－４ｓ^－１；Ｋ_Ｄ＝５．２×１０^－９Ｍ）のｈＴｉｅ２ ＥＣＤに対する親和度を大幅に改善した（図９ｉ）。得られたヒト化抗体（ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ１Ｌ２及びｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２）の親和度は、親抗体ｈＴＡＡＢの親和度に匹敵する程度であり、主に解離速度が大幅に減少した。また、Ｔｉｅ２結合親和力を、以前に報告された３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４というヒト化抗体３Ｈ７と比較すると、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２は、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４よりも４，７００倍さらに高い親和力を示し、これは、構造ベースのｈＴＡＡＢヒト化過程での改善を提案している（図９ｉ）。親抗体ｈＴＡＡＢと同様に、ヒト化抗体は、いずれもｍＴｉｅ２に結合しなかった（図１０ｃ）。

【0225】

【0226】

その後、ｈｚＴＡＡＢ処理時のＴｉｅ２とＡｋｔのリン酸化を調査し、これをｈＴＡＡＢ又は３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４処理後のリン酸化と比較した。Ｔｉｅ２結合親和力と一致するように、以前に開発された３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４は、ｈＴＡＡＢに比べて遥かに低いＴｉｅ２アゴニスト活性を示した（図１１ａ、ｂ）。４個のｈｚＴＡＡＢのうちのｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２は、ＨＵＶＥＣでＴｉｅ２とＡｋｔのリン酸化を最も強力に誘導した（図１１ｃ、ｄ）。これは、ｈＴＡＡＢのＴｉｅ２アゴニスト活性に匹敵する。また、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２と３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４とを比較すると、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２は、優れたＴｉｅ２アゴニスト活性を示した（図１１ｅ、図１１ｆ）。

【0227】

したがって、ｈｚＴＡＡＢ－Ｈ２Ｌ２は、ＣＯＭ－Ａｎｇｐｔ１及び親抗体ｈＴＡＡＢと類似する程度で、ＥＣの生存、移動、管形成及び細胞間の接触部位へのＴｉｅ２転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）及び核から細胞質ゾルへのＦＯＸＯ１転位を強力に誘導する（図１１ｇ－ｉ）。以上の内容をまとめると、構造ベースのヒト化戦略は、親抗体ｈＴＡＡＢの結合親和度及びＴｉｅ２アゴニスト活性を成功的に保有させる。

【0228】

【産業上の利用可能性】

【0229】

本出願の発明者等は、Ｔｉｅ２ Ｆｎ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ）ドメインをターゲットとするヒトＴｉｅ２アゴニスト抗体ｈＴＡＡＢ及びそのヒト化抗体を開発した。Ｔｉｅ２／ｈＴＡＡＢ複合体の構造は、Ｔｉｅ２クラスタリングの新しいモードを通じて作動する。ｈＴＡＡＢがＴｉｅ２／ｈＴＡＡＢ複合体の構造を形成することによってＴｉｅ２クラスタリングの新規モードで作動し、Ｔｉｅ２ Ｆｎ３ドメインに特異的に結合することによって、Ｔｉｅ２ホモダイマーが多角形組立体に連結されることを確認した。ｈＴＡＡＢによって誘発されるＴｉｅ２多角形組立体に対するＦｎ３媒介Ｔｉｅ２ホモ二量体化の重要性を確認し、Ｔｉｅ２アゴニストがＴｉｅ２のクラスター化及び活性化をどのように誘導するのかを理解することができる。また、ｈＴＡＡＢの構造ベースのヒト化抗体を作製することによって、潜在的な臨床適用可能性を確認した。

【0230】

【0231】

以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図6e】

【図6f】

【図6g】

【図6h】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図8d】

【図8e】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図9d】

【図9e】

【図9f】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【図11a】

【図11b】

【図11c】

【図11d】

【図11e】

【図11f】

【図11g】

【図11h】

【図11i】

【図12a】

【図12b】

【図12c】

【図12d】

【配列表】

2024517856000001.app

【国際調査報告】