特表 2024-517857 組換えハプトグロビン（Ｈｐ）ベータ鎖を作製するための発現系

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-04-23

(54)【発明の名称】組換えハプトグロビン（Ｈｐ）ベータ鎖を作製するための発現系

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240416BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 38/38 20060101ALI20240416BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240416BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N5/10

C12P21/02 C

C07K14/47

C07K16/00

A61P7/00

A61K38/02

A61K38/38

A61K39/395 Y

A61P9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568209

(86)(22)【出願日】2022-05-06

(85)【翻訳文提出日】2023-12-13

(86)【国際出願番号】 EP2022062257

(87)【国際公開番号】W WO2022234070

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】2021901366

(32)【優先日】2021-05-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】501091604

【氏名又は名称】ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト

(71)【出願人】

【識別番号】515098691

【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート チューリッヒ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】レベッカ・ブッチャー

(72)【発明者】

【氏名】キャサンリン・オウザレク

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・ジェンティネッタ

(72)【発明者】

【氏名】ドミニク・シャー

(72)【発明者】

【氏名】ミヒャエル・ヒューゲルスホーファー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA02

4C084BA03

4C084BA22

4C084BA41

4C084BA44

4C084DA36

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZA511

4C084ZA512

4C085AA34

4C085BB42

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、組換えハプトグロビン（Ｈｐ）ベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現系、組換えＨｐ分子、ならびに無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態を処置および／または防止するためのその使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物細胞内で組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現系であって、
（ａ）Ｎ末端切断型プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）をコードし、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、（ｉ）ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基、および（ｉｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含み、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、内部酵素切断部位を含む、第１の核酸配列；ならびに
（ｂ）Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、酵素切断部位において切断することが可能である酵素をコードする、第２の核酸配列
を含み；
第１の核酸配列および第２の核酸配列が、哺乳動物細胞へと導入され、その後、細胞内で、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐおよび酵素が発現されると、酵素は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、内部酵素切断部位において切断し、これにより、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐから放出することが可能である
発現系。

【請求項2】

ｐｒｏＨｐは、ヒトｐｒｏＨｐである、請求項１に記載の発現系。

【請求項3】

ヒトｐｒｏＨｐは、配列番号１との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の発現系。

【請求項4】

Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の発現系。

【請求項5】

Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６との、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の発現系。

【請求項6】

Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６との、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の発現系。

【請求項7】

Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６から本質的になる、請求項２に記載の発現系。

【請求項8】

内部酵素切断部位は、フーリン切断部位、セリンプロテアーゼ切断部位、システインプロテアーゼ切断部位、アスパラギン酸プロテアーゼ切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、およびトレオニンプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の発現系。

【請求項9】

内部酵素切断部位は、セリンプロテアーゼ切断部位である、請求項８に記載の発現系。

【請求項10】

セリンプロテアーゼ切断部位は、Ｃ１ｒ様タンパク質（Ｃ１ｒＬＰ）切断部位またはその機能的変異体である、請求項９に記載の発現系。

【請求項11】

プロテアーゼは、Ｃ１ｒＬＰまたはその機能的変異体である、請求項９または請求項１０に記載の発現系。

【請求項12】

Ｃ１ｒＬＰは、配列番号４との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の発現系。

【請求項13】

Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、Ｈｐα鎖の１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、Ｈｐβ鎖との間に、ジスルフィド結合を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の発現系。

【請求項14】

Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基の中のシステイン残基と、配列番号１のアミノ酸位置２６６に対応する位置におけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含む、請求項１３に記載の発現系。

【請求項15】

Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸位置１４９に対応する位置におけるシステイン残基と、２６６に対応する位置におけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含む、請求項１３に記載の発現系。

【請求項16】

第１の核酸配列によりコードされる、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、さらなる機能的部分を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の発現系。

【請求項17】

さらなる機能的部分は、治療剤である、請求項１６に記載の発現系。

【請求項18】

さらなる機能的部分は、アルブミン、免疫グロブリンのＦｃドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片、およびヘモペキシンまたはそのヘム結合性断片からなる群から選択される、請求項１６または請求項１７に記載の発現系。

【請求項19】

さらなる機能的部分は、ヘモペキシンまたはそのヘム結合性断片である、請求項１８に記載の発現系。

【請求項20】

さらなる機能的部分は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基のうちの１つまたはそれ以上へと連結されている、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の発現系。

【請求項21】

さらなる機能的部分は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基のＮ末端へと連結されている、請求項２０に記載の発現系。

【請求項22】

さらなる機能的部分は、リンカーを介して、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基のＮ末端へと連結されている、請求項２１に記載の発現系。

【請求項23】

リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項２２に記載の発現系。

【請求項24】

哺乳動物細胞内のＮ末端切断型ｐｒｏＨｐの発現は、第１の核酸配列に作動可能に連結された、第１の哺乳動物調節配列により駆動され、哺乳動物細胞内のセリンプロテアーゼの発現は、第２の核酸配列に作動可能に連結された、第２の哺乳動物調節配列により駆動される、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の発現系。

【請求項25】

第１の哺乳動物調節配列は、第２の哺乳動物調節配列と異なる、請求項２０に記載の発現系。

【請求項26】

哺乳動物細胞内のポリペプチドの発現は、第１の核酸配列に作動可能に連結された、第１の哺乳動物調節配列により駆動され、哺乳動物細胞内のセリンプロテアーゼの発現は、第２の核酸配列に作動可能に連結された、第２の哺乳動物調節配列により駆動される、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の発現系。

【請求項27】

第１の哺乳動物調節配列は、第２の哺乳動物調節配列と異なる、請求項２６に記載の発現系。

【請求項28】

哺乳動物細胞内で、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現ベクターであって、
（ａ）請求項１～２７のいずれか１項に記載の、第１の核酸配列；および
（ｂ）請求項１～２７のいずれか１項に記載の、第２の核酸配列
を含む発現ベクター。

【請求項29】

第１の核酸配列と、第２の核酸配列とは、共通の哺乳動物調節配列に作動可能に連結されている、請求項２８に記載の発現ベクター。

【請求項30】

第１の核酸配列は、第１の哺乳動物調節配列に作動可能に連結され、第２の核酸配列は、第２の哺乳動物調節配列に作動可能に連結され、第１の哺乳動物調節配列は、第２の哺乳動物調節配列と異なる、請求項２８に記載の発現ベクター。

【請求項31】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の発現系、または請求項２８～３０のいずれか１項に記載の発現ベクターをトランスフェクトされるか、またはこれらにより形質導入された哺乳動物細胞。

【請求項32】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項33】

ヒト胎児腎細胞である、請求項３１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項34】

組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製する方法であって、
（ａ）請求項１～２７のいずれか１項に記載の発現系、または請求項２８～３０のいずれか１項に記載の発現ベクターを、哺乳動物細胞へと導入して、トランスフェクト哺乳動物細胞を作製する工程；
（ｂ）トランスフェクト哺乳動物細胞による、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の作製を可能とするのに十分な条件下で、十分な時間にわたり、工程（ａ）のトランスフェクト哺乳動物細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で作製された、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を回収する工程
を含む方法。

【請求項35】

細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

細胞は、ヒト胎児腎細胞である、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

（ｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、および（ｉｉ）Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖を含み、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基を含み、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基は、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片と非連続であり、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片へと接合されている、組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項38】

Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンベータ鎖内またはそのヘモグロビン結合性断片内の、第１のシステイン残基と、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基の中の、第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合により、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片へと接合されている、請求項３７に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項39】

さらなる機能的部分をさらに含む、請求項３７または請求項３８に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項40】

さらなる機能的部分は、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖へと接合されている、請求項３９に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項41】

さらなる機能的部分は、ヘム結合性部分、免疫グロブリンのＦｃドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片、およびアルブミンからなる群から選択される、請求項３９または請求項４０に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項42】

さらなる機能的部分は、ヘム結合性部分である、請求項４１に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項43】

ヘム結合性部分は、ヘモペキシンまたはそのヘム結合性断片である、請求項４２に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項44】

ハプトグロビンベータ鎖は、配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７～４３のいずれか１項に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項45】

請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法により作製される組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片。

【請求項46】

治療有効量の、請求項４５に記載の組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片、または請求項３７～４４のいずれか１項に記載の組換えヘモグロビン結合性分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項47】

対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態を処置または防止する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、請求項４５に記載の組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片、または請求項３７～４４のいずれか１項に記載の組換えヘモグロビン結合性分子を、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより、無細胞Ｈｂを中和することを可能とするのに十分な期間にわたり投与する工程を含む方法。

【請求項48】

対象における赤血球溶解および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の放出と関連する状態の処置または防止における使用のための医薬組成物であって、治療有効量の、請求項４５に記載の組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片、または請求項３７～４４のいずれか１項に記載の組換えヘモグロビン結合性分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項49】

対象における赤血球溶解および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の放出と関連する状態の処置または防止のための医薬の製造における、治療有効量の、請求項４５に記載の組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片、または請求項３７～４４のいずれか１項に記載の組換えヘモグロビン結合性分子の使用。

【請求項50】

対象における赤血球溶解および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の放出と関連する状態の処置または防止における使用のための、治療有効量の、請求項４５に記載の組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片、または請求項３７～４４のいずれか１項に記載の組換えヘモグロビン結合性分子。

【請求項51】

状態は、出血性脳卒中または異常ヘモグロビン症である、請求項４７に記載の方法、請求項４８に記載の使用のための組成物、または請求項４９に記載の使用。

【請求項52】

状態は、異常ヘモグロビン症である、請求項５１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項53】

異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病である、請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項54】

異常ヘモグロビン症は、α－サラセミアまたはβ－サラセミアである、請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項55】

状態は、出血性脳卒中である、請求項５１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項56】

出血性脳卒中は、自発性出血または外傷性出血である、請求項５５に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項57】

出血性脳卒中は、脳室内出血またはくも膜下出血である、請求項５６に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項58】

くも膜下出血は、動脈瘤性くも膜下出血である、請求項５７に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、組換えハプトグロビン（Ｈｐ）ベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現系、組換えＨｐ分子、ならびに無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの異常と関連する状態を処置および／または防止するためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

赤血球溶解は、ヘモグロビン（Ｈｂ）の、血漿への放出を引き起こす、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｏｃｙｔｅｓ））の破裂により特徴付けられ、酵素欠損、異常ヘモグロビン症（例えば、サラセミア）、遺伝性球状赤血球症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、およびＳＣＡ（ｓｐｕｒ ｃｅｌｌ ａｎａｅｍｉａ）などの赤血球異常の他、脾腫、自己免疫障害（例えば、新生児の溶血性疾患）、遺伝子障害（例えば、鎌状赤血球病またはＧ６ＰＤ欠損症）、微小血管症性溶血、グラム陽性菌感染（例えば、連鎖球菌属、腸球菌属、およびブドウ球菌属）、寄生虫感染（例えば、プラスモディウム属）、毒素、外傷（例えば、火傷）、出血性脳卒中、敗血症、アテローム性動脈硬化、輸血（特に、大量輸血）などの外因性因子と関連する貧血性障害、ならびに人工心肺支援を使用する患者における貧血性障害の顕著な特徴である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５を参照されたい）。

【0003】

溶血と関連する状態を伴う患者において見られる有害作用は、大部分が、Ｈｂおよびヘムなど、赤血球に由来する鉄および鉄含有化合物の放出に帰せられる。生理学的条件下で、無細胞ヘモグロビンは、典型的に、ハプトグロビン（Ｈｐ）などの可溶性タンパク質が結合しており（非特許文献６を参照されたい）、マクロファージおよび肝細胞へと輸送される。しかし、溶血の発生が、加速し、かつ／または病理学的性格を帯びる状況下では、Ｈｐの緩衝能は圧倒される。結果として、Ｈｂは、第２鉄含有ヘモグロビンへと、急速に酸化され、第２鉄含有ヘモグロビンは、遊離ヘム（プロトポルフィリンＩＸおよび鉄を含む；非特許文献７を参照されたい）を放出する。ヘムは、いくつかの生物学的過程において（例えば、ヘモグロビンおよびミオグロビンなどの必須タンパク質の部分として）、極めて重要な役割を果たすが、遊離ヘムは、毒性が高い。例えば、遊離ヘムは、酸化還元活性鉄の供給源であり、酸化還元活性鉄は、脂質膜（非特許文献８を参照されたい）、タンパク質、および核酸を損傷する、毒性の高い反応性酸素分子種（ＲＯＳ）をもたらす。ヘム毒性は、脂質膜へと介入するその能力により、さらに悪化し、この場合、ヘム毒性は、膜構成要素の酸化を引き起こし、細胞の溶解および死を促進する（非特許文献９を参照されたい）。

【0004】

持続的な低レベルの細胞外Ｈｂ／ヘムへの曝露による進化圧力は、生理学的定常状態下、および軽度の溶血時における、遊離Ｈｂ／ヘムの有害作用をコントロールする代償機構をもたらした。これらのシステムは、Ｈｂまたはヘムに結合する血漿タンパク質であって、ＨｂスカベンジャーであるＨｐ、ならびにヘモペキシン（Ｈｐｘ）およびα１マイクログロビンなどのヘムスカベンジャータンパク質を含む血漿タンパク質の群の放出を含む（非特許文献１０を参照されたい）。

【0005】

上記で言及された通り、血漿Ｈｐは、無細胞Ｈｂに対するスカベンジャーとして作用し、無細胞Ｈｂに結合して、中和Ｈｂ：Ｈｐ複合体を形成する（非特許文献１１を参照されたい）。しかし、Ｈｂの量が、血漿Ｈｐのスカベンジング能を超えると、特に、血管内および腎臓組織内における、Ｈｂの局所的蓄積は、患者に有害な二次転帰をもたらしうる酸化ストレスを結果としてもたらす。Ｈｐによりもたらされる保護は、Ｈｂによる、少なくとも２つの毒性学的帰結を弱める。第１に、Ｈｂ：Ｈｐ複合体の大きな分子サイズは、無細胞Ｈｂの溢出を防止する。この機構は、腎機能を保護し、遊離Ｈｂの、血管壁へのアクセスを限定することにより、血管内の一酸化窒素（ＮＯ）ホメオスタシスを保存する（非特許文献１２を参照されたい）。第２に、Ｈｂ：Ｈｐ複合体の形成は、ヘムの、そのグロビン鎖から、タンパク質および反応性脂質への転移を限定する形で、Ｈｂ分子の構造を安定化させる（非特許文献７を参照されたい）。これらの機構は、大部分が、溶血に続く、Ｈｐの抗酸化機能の一因をなす。

【0006】

内因性Ｈｐは、主に、無細胞Ｈｂ毒性に対して、著明な保護をもたらしうるが、より顕著な急性溶血時、または遷延性溶血時には、急速に消費され、枯渇させられる（非特許文献１３を参照されたい）。したがって、Ｈｐの置換は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび溶血についての動物モデルにおいて、前臨床概念実証を裏付ける治療モダリティーであると考えられている。前臨床研究は、プールされたヒト血漿画分から精製されたＨｐの治療的可能性について、大部分を査定した。しかし、この手法は、（１）異なるＨｐ表現型（１－１、２－１、および２－２）の混合物は、置換療法が長期化すると、一部の患者において、中和抗体応答を誘発しうること；（２）表現型が異なると、効能も異なりうること；および（３）表現型の形態が、異なる薬物動態を裏付けうることなど、臨床的実践に関連する、いくつかの限界を有する。したがって、血漿由来Ｈｐの潜在的限界を考慮すると、組換えタンパク質の作製は、血漿由来Ｈｐについての前述の限界のうちの少なくとも一部を回避するか、または他の形で緩和する、妥当な治療戦略をもたらしうる。加えて、組換えタンパク質作製戦略は、機能性、バイオアベイラビリティー、および薬物動態が増強された治療剤をもたらしうる。しかし、前駆体分子（ｐｒｏＨｐ）を発現させることによって組換えＨｐを作製しようとする近年の試みは、Ｈｂへの結合の低減について言及している（非特許文献１４を参照されたい）。よって、ＨｐのＨｂスカベンジング特性が有益となる、無細胞Ｈｂと関連する状態を処置および／または防止する代替的治療または改善された治療が、依然として必要とされつつある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｈｏｐｐｅら（１９９８、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ、１０（１）：４９～５２）

【非特許文献2】Ｒｏｕｍｅｎｉｎａ（２０１６、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２２（３）：２００～２１３）

【非特許文献3】Ｍｅｒｌｅ（２０１９、ＰＮＡＳ、１１６（１３）：６２８０～６２８５）

【非特許文献4】Ｌａｒｓｅｎ（２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：２（５１）：５１～７１）

【非特許文献5】Ｂａｌｌａ Ｇ（２０１９、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ、２０（１５）：３６７５）

【非特許文献6】Ｃ．Ｂ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ、４８９（７４１６）：４５６～４５９

【非特許文献7】Ｓｃｈａｅｒら（２０１４、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ、５：１～１３）

【非特許文献8】Ｄｅｕｅｌら（２０１５、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８９：９３１～９４３

【非特許文献9】Ｊｅｎｅｙら（２００２、Ｂｌｏｏｄ、１００（３）：８７９～８７）

【非特許文献10】Ｓｃｈａｅｒら、２０１３、Ｂｌｏｏｄ、１２１（８）：１２７６～８４

【非特許文献11】Ｓｈｉｍら、１９６５、Ｎａｔｕｒｅ、２０７：１２６４～１２６７

【非特許文献12】Ａｚａｒｏｖら、２００８、Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ、１８（４）：２９６～３０２

【非特許文献13】Ｂｏｒｅｔｔｉら、２０１４、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、５：３８５

【非特許文献14】Ｈｅｉｎｄｅｒｙｃｋｘら、１９８８～１９８９、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ、１３（４）：２２５～３２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、少なくとも部分的に、機能的なハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、哺乳動物発現系内において、Ｎ末端切断型プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）から作製されることの、本発明者らによる驚くべき発見に基づく。さらに、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、Ｈｐｘ、Ｆｃ、またはアルブミンなどの機能的部分を運び、これにより、治療特性が改善された構築物を作製するように修飾されると有利である。

【課題を解決するための手段】

【0009】

したがって、本明細書で開示される一態様では、哺乳動物細胞内で組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現系であって、
（ａ）Ｎ末端切断型プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）をコードし、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、（ｉ）ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基、および（ｉｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含み、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、内部酵素切断部位を含む、第１の核酸配列；ならびに
（ｂ）Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、酵素切断部位において切断することが可能である酵素をコードする、第２の核酸配列
を含み；
第１の核酸配列および第２の核酸配列が、哺乳動物細胞へと導入され、その後、細胞内で、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐおよび酵素が発現されると、酵素は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、内部酵素切断部位において切断し、これにより、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐから放出することが可能である
発現系が提供される。

【0010】

本明細書で開示される別の態様では、哺乳動物細胞内で、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現ベクターであって、
（ａ）本明細書に記載される、第１の核酸配列；および
（ｂ）本明細書に記載される、第２の核酸配列
を含む発現ベクターが提供される。

【0011】

本開示はまた、本明細書で記載される発現系または発現ベクターを含む哺乳動物細胞へも拡張される。

【0012】

本明細書で開示される別の態様では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製する方法であって、
（ａ）哺乳動物細胞へと、本明細書に記載される発現系を導入して、改変哺乳動物細胞を作製する工程；
（ｂ）組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の作製を可能とするのに十分な条件下で、十分な時間にわたり、工程（ａ）で作製された改変哺乳動物細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で作製された、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を回収する工程
を含む方法が提供される。

【0013】

本明細書で開示される別の態様では、本明細書で記載される方法により作製される組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が提供される。

【0014】

本明細書で開示される別の態様では、（ｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、および（ｉｉ）Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖を含み、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基を含み、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基は、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片と非連続であり、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片へと接合されている、組換えヘモグロビン結合性分子が提供される。

【0015】

本開示はまた、治療有効量の、本明細書で記載される組換えヘモグロビン結合性分子、または本明細書で記載される組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物へも拡張される。

【0016】

本明細書で開示される別の態様では、対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態を処置または防止する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、本明細書で記載される組換えヘモグロビン結合性分子、または本明細書で記載される組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片を、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより、無細胞Ｈｂを中和することを可能とするのに十分な期間にわたり投与する工程を含む方法が提供される。ある実施形態では、状態は、赤血球溶解と関連する。

【0017】

本明細書ではまた、対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態の処置または防止における使用のための医薬組成物であって、治療有効量の、本明細書で記載される組換えヘモグロビン結合性分子、または本明細書で記載される組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も開示される。

【0018】

本明細書で開示される別の態様では、対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態の処置または防止のための医薬の製造における、治療有効量の、本明細書で記載される組換えヘモグロビン結合性分子、または本明細書で記載される組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片の使用が提供される。

【0019】

本開示はまた、対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態の処置または防止における使用のための、治療有効量の、本明細書で記載される組換えヘモグロビン結合性分子、または本明細書で記載される組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片へも拡張される。

【0020】

本明細書で引用される、任意の特許または特許出願を含む、全ての参考文献は、本発明の十分な理解を可能とするように、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書における、任意の既往刊行物（またはこれに由来する情報）、または任意の公知の対象物に対する言及は、この既往刊行物（またはこれに由来する情報）、または公知の対象物が、本明細書が関する企図の分野における、共通の一般的知見の一部を形成することの承認もしくは容認、または任意の形態の示唆ではなく、示唆として理解されるべきではない。

【0021】

ここで、例示的なものであるに過ぎないことが意図される、以下の図面を参照しながら、本発明の実施形態が記載される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ヒトハプトグロビンの例示的な例についての構造を示す図であり；（Ａ）ヒトＨｐ１およびヒトＨｐ２についての概略表示である。Ｈｐ１のα鎖と、Ｈｐ２のα鎖とに共通であるアミノ酸配列を示し、緑色で強調する（配列番号１４および１７）。Ｈｐ２のα鎖内の、青色で影を付されたアミノ酸配列（Ｈｐ２配列の２行目［中］）は、顕著に異なる分子表現型を決定する。アステリスクは、ジスルフィド結合の形成に要求されるシステイン残基を指定する。矢印は、Ｃ１ｒＬＰ切断部位を指し示す。（Ｂ）１つのα鎖間ジスルフィド結合を伴う、Ｈｐ１－１ホモ二量体、および２つのα鎖間ジスルフィド結合を伴う、３つの変異体Ｈｐ２－２環状ホモ多量体のタンパク質四次構造である。

【図2】ヘム－アルブミンの、ヘム－Ｈｐｘへの転移を追跡するためのスペクトルデコンボリューションを描示する図である。１２．５μＭのヘム－アルブミンおよびヒトＨｐｘを含有する反応混合物について、時間経過（３７℃で、３時間）にわたり、一連のＵＶ－ＶＩＳスペクトルを記録した。最初のスペクトル（ｔ＝０）を、オレンジ（明色）で強調し、最後のスペクトル（ｔ＝３時間後）を、青色（暗色）で強調する。

【図3-1】（Ａ）ヒトプロハプトグロビン２ＦＳのアミノ酸配列を示す図である。シグナルペプチド（アミノ酸残基１～１８；ＭＳＡＬＧＡＶＩＡＬＬＬＷＧＱＬＦＡ；配列番号１５）を、黄色で強調する。Ａｒｇ１６１（Ｒ）の後におけるＣ１ｒＬＰ切断部位を、矢印で指し示す。アルファ（α）鎖は、青色で強調し（アミノ酸残基１９～１６１）、ベータ（β）鎖は、明緑色で強調する（アミノ酸残基１６２～４０６）。鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、アミノ酸位置３３、５２、８６、９２、１４９、２６６、３０９、３４０、３５１、および３８１にある。ＣＤ１６３結合性部位は、アミノ酸残基３１８、３２０、３２２、および３２３により同定される。本明細書で記載される変異体のアミノ酸残基は、開始メチオニンとしての＋１により番号付けされ、Ｈｐ２ＦＳのアミノ酸配列に基づく。この関連で、アミノ酸Ａｓｐ７０、Ｌｙｓ７１、Ａｓｎ１２９、およびＧｌｕ１３０を強調する。（Ｂ）プロハプトグロビン２ＦＳポリペプチド鎖の、アルファ鎖およびベータ鎖へプロセシングについての概略表示である。鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｃ）トランスフェクトＦＳ２９３Ｆ細胞内で作製された、ｒＨｐ１ＳおよびｒＨｐ２ＦＳについての、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色である。Ｈｐα鎖は、１２ｋＤａまたは１９ｋＤａに現れ、Ｈｐβ鎖は、４７ｋＤａに現れる。加えて、切断されなかったｐｒｏＨｐ１およびｐｒｏＨｐ２は、それらの予測サイズである、５３ｋＤａまたは５７ｋＤａに現れる。Ｃ１ｒ－ＬＰ（＋）の共発現により、全てのｐｒｏＨｐは、そのサブユニットへと、効率的に切断される。Ｃ１ｒ－ＬＰは、６８ｋＤａに現れる。（Ｄ）Ｃ１ｒ－ＬＰの非存在下で切断されなかったｐｒｏＨｐ、および低分子Ｈｐβ鎖の他、Ｃ１ｒ－ＬＰの共発現の存在下におけるＨｉｓタグ付けプロテアーゼを示す抗８Ｈｉｓウェスタンブロットである。

【図3-2】図３－１の続き。

【図3-3】図３－２の続き。

【図3-4】図３－３の続き。

【図4-1】ハプトグロビンベータ断片の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内における発現および精製を示す図である。（Ａ）各々が、Ｃ末端８×Ｈｉｓタグを伴う、組換えベータ断片構築物を描示する概略図である。アミノ酸および鎖内ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｂ）Ｃ末端８×Ｈｉｓタグを伴う、さらなる１４アミノ酸を伴う、組換えベータ断片構築物を描示する概略図である。Ｃ１ｒ－ＬＰによる、プレタンパク質のプロセシング、アミノ酸、ならびに鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｃ）（左パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色である。Ｎ末端伸長型ベータ断片である、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓをコードする構築物と、Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧをコードする構築物とによる共トランスフェクションを行って、新生ポリペプチドの切断を確認した。（中パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｉｓウェスタンブロットである。（右パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｐウェスタンブロットである。（Ｄ）（左パネル）ニッケルアフィニティー精製された、Ｎ末端伸長型Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓについて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴うＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ上で実施された、解析用ＳＥＣのクロマトグラムである。（右パネル）２９．９ｋＤａである、そのバックグラウンド分子量を上回って泳動する、ハプトグロビンのダブレットバンドである、特徴的な糖型を示す、４～１２％のビス－トリスによるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。

【図4-2】図４－１の続き。

【図4-3】図４－２の続き。

【図4-4】図４－３の続き。

【図5】ハプトグロビンベータ断片融合タンパク質の分子デザインを示す概略を提示する図である。（Ａ）Ｎ末端融合パートナーまたはＣ末端融合パートナーのいずれかを伴う、組換えＨｐベータ断片構築物（アミノ酸１６２～４０６）を描示する概略図である。アミノ酸および鎖内ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｂ）Ｎ末端融合パートナーまたはＣ末端融合パートナーのいずれかを伴う、さらなるＮ末端の１４アミノ酸を伴う、組換えＨｐベータ断片構築物（アミノ酸１４８～４０６）を描示する概略図である。Ｃ１ｒ－ＬＰによる、プレタンパク質のプロセシングである。アミノ酸、ならびに鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。

【図6-1】Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内における発現および精製を示す図である。（Ａ）（ｉ）Ｎ末端におけるヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ；アミノ酸１～４６２）に続き、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含有し、次いで、アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片）；（ｉｉ）アミノ酸２６６における不対合システインが、アラニンへと突然変異させられた、アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片；（ｉｉｉ）Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片と融合された、組換えベータ断片構築物を描示する概略図である。アミノ酸および鎖間ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｂ）（左パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐｘ－Ｈｐベータ断片構築物についての、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色である。Ｎ末端伸長型ベータ断片である、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）をコードする構築物と、Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧをコードする構築物とによる共トランスフェクションを行って、新生ポリペプチドの切断を確認した。（中パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐｘ－Ｈｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｉｓウェスタンブロットである。（右パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｐウェスタンブロットである。（Ｃ）ＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、凝集物含量およびタンパク質プロセシングについての解析である。（ｉ）ニッケルアフィニティー精製された、Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１６２～４０６）－８Ｈｉｓについて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴うＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム上で実施された、調製用ＳＥＣのクロマトグラムである。矢印の位置は、予測サイズの融合タンパク質を含有するピークを示す。（ｉｉ）ニッケルアフィニティー精製された、Ｎ末端伸長型Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ／Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧについて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴う、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム上で実施された、解析用ＳＥＣのクロマトグラムである。矢印の位置は、予測サイズの融合タンパク質を含有するピークを示す。（ｉｉｉ）ニッケルアフィニティー精製された、Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓの純度および適正なプロセシングを示す、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよび非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１２％のビス－トリス）である。

【図6-2】図６－１の続き。

【図6-3】図６－２の続き。

【図6-4】図６－３の続き。

【図7-1】ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内における発現および精製を示す図である。（Ａ）Ｎ末端におけるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有し、（ｉ）Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーに続く、アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片）；（ｉｉ）Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーに続く、アミノ酸２６６における不対合システインが、アラニンへと突然変異させられた、アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片；（ｉｉｉ）Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片と融合された、組換えベータ断片構築物を描示する概略図である。アミノ酸および鎖間ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｂ）（左パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨＳＡ－Ｈｐベータ断片構築物についての、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色である。Ｎ末端伸長型ベータ断片である、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）をコードする構築物と、Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧをコードする構築物とによる共トランスフェクションを行って、新生ポリペプチドの切断を確認した。（中パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨＳＡ－Ｈｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗ＨＳＡウェスタンブロットである。（右パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｐウェスタンブロットである。（Ｃ）ＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、凝集物含量およびタンパク質プロセシングについての解析である。（ｉ）ＨＳＡアフィニティー精製された、ＨＳＡ－ＧＳ１３－Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴うＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム上で実施された、調製用ＳＥＣのクロマトグラムである。矢印の位置は、予測サイズの融合タンパク質を含有するピークを示す。（ｉｉ）ＨＳＡアフィニティー精製された、Ｎ末端伸長型ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）／Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧについて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴う、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム上で実施された、解析用ＳＥＣのクロマトグラムである。矢印の位置は、予測サイズの融合タンパク質を含有するピークを示す。（ｉｉｉ）ＨＳＡアフィニティー精製された、ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）の純度および適正なプロセシングを示す、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよび非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１２％のビス－トリス）である。

【図7-2】図７－１の続き。

【図7-3】図７－２の続き。

【図7-4】図７－３の続き。

【図7-5】図７－４の続き。

【図8-1】Ｆｃ－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内における発現および精製を示す図である。（Ａ）（ｉ）アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片のＮ末端と融合された、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ；（ｉｉ）マウスＩｇＧ２ａに続く、Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片を含有する、組換えベータ断片構築物を描示する概略図である。アミノ酸および鎖間ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｂ）（左パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＦｃ－Ｈｐベータ断片構築物についての、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色である。Ｎ末端伸長型ベータ断片である、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）をコードする構築物と、Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧをコードする構築物とによる共トランスフェクションを行って、新生ポリペプチドの切断を確認した。（中パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＦｃ－Ｈｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｆｃウェスタンブロットである。（右パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｐウェスタンブロットである。（Ｃ）ＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、凝集物含量およびタンパク質プロセシングについての解析である。（ｉ）プロテインＡアフィニティー精製された、Ｎ末端伸長型ｍｕＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）／Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧについて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴うＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステム上で実施された、解析用ＳＥＣのクロマトグラムである。矢印の位置は、予測サイズの融合タンパク質を含有するピークを示す。（ｉｉ）プロテインＡアフィニティー精製された、ｍｕＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）の純度および適正なプロセシングを示す、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよび非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１２％のビス－トリス）である。

【図8-2】図８－１の続き。

【図8-3】図８－２の続き。

【図8-4】図８－３の続き。

【図9-1】ヘモペキシン－ＭＳＡ－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内における発現および精製を示す図である。（Ａ）Ｎ末端におけるヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ；アミノ酸１～４６２）に続き、マウス血清アルブミン（ｍｓａ）を含有し、次いで、ｉ）アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片；ｉｉ）Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片と融合された、組換えＨｐベータ断片構築物を描示する概略図である。アミノ酸および鎖間ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｂ）（左パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐｘ－ｍｓａ－Ｈｐベータ断片構築物についての、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色である。Ｎ末端伸長型ベータ断片である、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）をコードする構築物と、Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧをコードする構築物とによる共トランスフェクションを行って、新生ポリペプチドの切断を確認した。（中パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＦｃ－Ｈｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗ＭＳＡウェスタンブロットである。（右パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｐウェスタンブロットである。（Ｃ）ＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、凝集物含量およびタンパク質プロセシングについての解析である。（ｉ）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＨＳＡアフィニティー精製された、Ｈｕヘモペキシン－ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１６２～４０６）について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴うＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム上で実施された、調製用ＳＥＣのクロマトグラムである。矢印の位置は、予測サイズの融合タンパク質を含有するピークを示す。（ｉｉ）Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅアフィニティー精製された、Ｎ末端伸長型Ｈｕヘモペキシン－ＭＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）／Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧについて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴う、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム上で実施された、解析用ＳＥＣのクロマトグラムである。矢印の位置は、予測サイズの融合タンパク質を含有するピークを示す。（ｉｉｉ）Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅアフィニティー精製された、Ｈｕヘモペキシン－ＭＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）の純度および適正なプロセシングを示す、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよび非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１２％のビス－トリス）である。

【図9-2】図９－１の続き。

【図9-3】図９－２の続き。

【図9-4】図９－３の続き。

【図10-1】Ｈｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）融合タンパク質の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内における発現および精製を示す図である。（Ａ）Ｎ末端におけるヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ；アミノ酸１～４６２）に続き、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー、マウスＩｇＧ２ａＦｃを含有し、次いで、Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片と融合された、組換えＨｐベータ断片構築物を描示する概略図である。アミノ酸および鎖間ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）の位置を指し示す。（Ｂ）（左パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）構築物についての、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色である。構築物と、Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧをコードする構築物とによる共トランスフェクションを行って、新生ポリペプチドの切断を確認した。（中パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＦｃ－Ｈｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｆｃウェスタンブロットである。（右パネル）一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で作製された、組換えＨｐベータ断片構築物についての還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する抗Ｈｐウェスタンブロットである。（Ｃ）ＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、凝集物含量およびタンパク質プロセシングについての解析である。（ｉ）プロテインＡアフィニティー精製された、Ｎ末端伸長型Ｈｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）／Ｈｕ－Ｃ１ｒ－ＬＰ－ＦＬＡＧについて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラム、およびＭＴ－ＰＢＳ移動相を伴うＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステム上で実施された、解析用ＳＥＣのクロマトグラムである。（ｉｉ）プロテインＡアフィニティー精製された、Ｈｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）の純度および適正なプロセシングを示す、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよび非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１２％のビス－トリス）である。

【図10-2】図１０－１の続き。

【図10-3】図１０－２の続き。

【図10-4】図１０－３の続き。

【図11-1】サイズ除外ＨＰＬＣクロマトグラムに基づく、定性的Ｈｂ結合データを示す図である。青線は、Ｈｂ＋ｒＨｐ混合物（等モル濃度における）のシグナル（４０５ｎｍ）を表す。（Ａ）Ｈｕハプトグロビン（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ、ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ、およびｍｕＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン（１４８～４０６）－８Ｈｉｓである。（Ｂ）Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ、Ｈｕヘモペキシン－ｍｓａ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ、およびＨｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－Ｈｉｓである。ヘモペキシンは、陰性対照として使用した。赤線は、４０５ｎｍにおいて記録された、Ｈｂ単独のシグナルを表す。全てのサイズ除外ＨＰＬＣトレースは、赤色のＨｂピーククロマトグラムに適合するように、スケーリングを同一とした。

【図11-2】図１１－１の続き。

【図12】ヘモグロビンに結合するその能力に関して解析された、各Ｈｐ変異体についての、代表的センサーグラムを示す図である。個々のＨｐ変異体を、バイオセンサー表面上に固定化した。ベースラインを記録した後、７つの濃度にわたるヘモグロビンについて調べた（１５、７．５、３．７５、１．８８、０．９４、０．４７、および０．３２ｎＭ）。参照（アッセイ緩衝液参照）を減算した後、データを加工し、１：１結合モデルを使用してグローバルフィッティングした。当てはめの精度は、カイ２およびＲ２により記載した。Ｈｂを、グレーの曲線で示し、当てはめられた曲線を、赤の実線として示す。（Ａ）Ｈｕハプトグロビン１－１である。（Ｂ）Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓである。（Ｃ）Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓである。

【図13】ヘモペキシンドメインを含有する、異なるハプトグロビン変異体のヘム結合能を示す図である。１２．５μＭのＨｂ（Ｆｅ３＋）および５μＭのＨｐタンパク質（Ｈｕヘモペキシン－ｍｓａ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）を除き、４μＭを使用した）を含有する反応混合物について、経過時間にわたり（３７℃で、５時間にわたり）、一連のＵＶ－ＶＩＳスペクトルを記録することにより、表示の異なるＨｐ変異体の存在下で、ヘム－アルブミンからのヘムの放出を測定した。ヘム－アルブミン（青色の曲線）は、所与の任意の時点において、Ｈｂに結合したヘムの濃度を示す。ヘモペキシン：ヘム（赤色の曲線）は、所与の任意の時点において、ヘム－アルブミンから転移したヘムの濃度を示す。

【図14】スカベンジャー受容体であるＣＤ１６３に結合するその能力に関して解析された、各Ｈｐ変異体についての、代表的センサーグラムを示す図である。ヒトＣＤ１６３受容体を、バイオセンサー表面上に固定化した。ベースラインを記録した後、６つの濃度にわたる複合体について調べた。参照（アッセイ緩衝液参照）を減算した後、データを加工し、１：１結合モデルを使用してグローバルフィッティングした。当てはめの精度は、カイ２およびＲ２により記載した。Ｈｂを、グレーの曲線で示し、当てはめられた曲線を、赤の実線として示す。加えて、２つの組換え変異体についての定常状態解析により、ＫＤを決定した。（Ａ）Ｈｕハプトグロビン１－１：Ｈｂ複合体（５０～１．５６ｎＭ）である。（Ｂ）Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）：Ｈｂ複合体（２０００～３１．２５ｎＭ）である。（Ｃ）Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）：Ｈｂ複合体（１５００～２３４．４ｎＭ）である。

【図15】異なるＨｐ変異体の添加の後における、ＮＯ依存性血管拡張のレスキューを比較して、血管機能を示す図である。ＮＯに対する血管拡張性応答は、Ｈｂの添加の後で測定し、その後における、Ｈｂスカベンジャーの添加の後で、再度測定した。Ｈｐ変異体（血漿Ｈｐ１－１、ｒｅｃＨｐ１－１、ｒｅｃＨｐＣＤ１６３ｌｏｗ、ｍｉｎｉＨｐ、およびＳｕｐｅｒＳｃａｖｅｎｇｅｒ）の効果を、基準である、Ｈｐ２－２（青色；各ウィンドウの左側のデータセット）と比較した。

【図16-1】異なるＨｐ変異体の保護効果を比較して、脂質過酸化を示す図である。（Ａ）３７℃で４時間にわたるインキュベーションの後における蛍光発光を使用して、等モル濃度のＨｐ変異体と、ｒＬＰとを伴うＨｂの混合物中における、ＭＤＡの発生を測定した。スカベンジャータンパク質を伴わないＨｂを、陽性対照として使用し、ｒＬＰ単独を、陰性対照として使用した。（Ｂ）異なるＨｂスカベンジャー（１０μＭ）およびｒＬＰ（２ｇ／Ｌ）を、ある範囲にわたる濃度（０～１００μＭ）のＨｂと共に、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした。脂質過酸化は、ＴＢＡＲＳアッセイを使用して定量した。

【図16-2】図１６－１の続き。

【図17-1】（Ａ）血漿由来ヘム：Ｈｘ；ならびに（Ｂ）ヘム：Ｈｘ－Ｈｐ複合体および複合体化していない（挿入図）スカベンジャータンパク質の、ビオチニル化ＬＲＰ１クラスターＩＩＩに対する結合アフィニティーを示す図である。グレーの曲線は、流体相にある、ある範囲のリガンド濃度（全ての濃度は、２０００～３１．２５ｎＭである）についてのセンサーグラムを表す。当てはめは、赤色の曲線により指し示される。

【図17-2】図１７－１の続き。

【発明を実施するための形態】

【0023】

そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。

【0024】

そうでないことが指定されない限りにおいて、本明細書で使用される不定冠詞である「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数形の側面を含む。したがって、例えば、「ある薬剤」への言及は、単一の薬剤、ならびに２つまたはそれ以上の薬剤を含む；「ある組成物」への言及は、単一の組成物、ならびに２つまたはそれ以上の組成物を含む；などである。

【0025】

本明細書で使用される、「約」という用語は、列挙された値の±１０％を意味する。

【0026】

文脈が、そうでないことを要求しない限りにおいて、本明細書および後続の特許請求の範囲を通して、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「～を含むこと」などの変化形は、言明された整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の包含を含意するが、他の任意の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の除外は含意しないように理解されるものとする。

【0027】

「～からなること」という用語は、その整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含み、かつ、これらに限定され、他の任意の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を除外することである、「～だけからなること」を意味する。

【0028】

「～から本質的になること」という用語は、言明された整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の包含を含意するが、本発明の作業を実質的に変更しないか、または本発明の作業に寄与する、他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群もまた含まれる。

【0029】

逆の指定がない場合、本明細書を通して、含量「％」に対してなされる言及は、ｗ／ｗ（重量／重量）％を意味すると理解されるものとする。例えば、全タンパク質に対して、少なくとも８０％ハプトグロビン含量を含む溶液は、全タンパク質に対する、少なくとも８０ｗ／ｗ％のハプトグロビン含量を含む組成物を意味すると理解されるものとする。

【0030】

本明細書の他の箇所で言及される通り、本発明は、少なくとも部分的に、機能的なハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、哺乳動物発現系内において、Ｎ末端切断型プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）から作製されることの、本発明者らによる驚くべき発見に基づく。Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、Ｈｐｘ、Ｆｃ、およびアルブミンなどの機能的部分を運び、これにより、治療特性が改善された構築物を作製するように改変されると有利でありうる。さらに、本発明者らは、予測外に、本明細書で記載される発現系が、機能的ハプトグロビンβ鎖の、安定的なトランスフェクションおよび発現を結果としてもたらし、これにより、一過性のトランスフェクションを達成するのがせいぜいであり、一般に、機能的Ｈｐβ鎖を発現することができない既存の発現系と識別されるので有利であることを見出した。本明細書で記載される発現系はまた、融合パートナーが、β鎖断片に対してＮ末端に配置され、ジスルフィド結合を介してシステイン間残基へと好都合なことに連結されている、融合タンパク質またはコンジュゲートを含む、融合タンパク質またはコンジュゲートの作出も可能として有利である。

【0031】

したがって、本明細書で開示される一態様では、哺乳動物細胞内で組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現系であって、
（ａ）Ｎ末端切断型プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）をコードし、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、（ｉ）ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基、および（ｉｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含み、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、内部酵素切断部位を含む、第１の核酸配列；ならびに
（ｂ）Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、酵素切断部位において切断することが可能である酵素をコードする、第２の核酸配列
を含み；
第１の核酸配列および第２の核酸配列が、哺乳動物細胞へと導入され、その後、細胞内で、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐおよび酵素が発現されると、酵素は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、内部酵素切断部位において切断し、これにより、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐから放出することが可能である
発現系が提供される。

【0032】

Ｎ末端切断型プロハプトグロビン
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、主に、肝臓内で合成される、豊富な血漿タンパク質である。Ｈｐは、溶血時に赤血球から放出されることがある遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）に対する、高アフィニティーのスカベンジャーである。２つのタンパク質の間で形成される複合体（Ｈｂ：Ｈｐ複合体）は、腎臓内、血管内、および遊離Ｈｂにアクセス可能な周囲組織内における遊離Ｈｂの毒性影響を弱める、多数の保護活性をもたらす。Ｈｐによりもたらされる保護は、Ｈｂによる、２つの主な毒性学的帰結を弱める。第１に、Ｈｂ：Ｈｐ複合体の大きな分子サイズは、遊離Ｈｂの溢出を防止する。この機構は、腎機能を保護し、遊離Ｈｂの、血管壁へのアクセスを限定することにより、血管内の一酸化窒素（ＮＯ）ホメオスタシスを保存する。第２に、Ｈｂ：Ｈｐ複合体の形成は、ヘムの、そのグロビン鎖から、タンパク質および反応性脂質への転移を限定する形で、Ｈｂ分子の構造を安定化させる。これらの機構は、大部分が、溶血時における、Ｈｐの抗酸化機能の一因をなす。Ｈｐはまた、Ｔ細胞の免疫応答、細胞増殖の調節、血管新生、および動脈の再構築においても役割を果たすことが示されている。

【0033】

Ｈｐは、プロテアーゼであるＣ１ｒＬＰにより、タンパク質分解的にプロセシングされる単一のポリペプチド前駆体である、プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）として合成される（ＫｒｚｙｓｚｔｏｆおよびＦｒｉｅｓ、ＰＮＡＳ、２００４、１０１（４０）：１４３９０～１４３９５）。プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）は、Ｈｐ ｍＲＮＡの一次翻訳産物である。小胞体内で、ｐｒｏＨｐは、ジスルフィド結合の形成を介して二量体化し、Ｃ１ｒ－ＬＰ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ１ｒ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）により、タンパク質分解的に切断される。結果として、Ｈｐは、大半の哺乳動物において、２つのα鎖の間における、単一のジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ）により連結された、２つのα軽鎖および２つのβ重鎖からなる、１５０ｋＤａの二量体タンパク質として存在する。大半の哺乳動物のＨｐタンパク質は、（αβ）２構造（ヒトでは、Ｈｐ１－１と称される）をもたらす２つのα鎖の間の界面を介して一体に連結された、２つの（αβ）単量体から構成される。ヒトでは、Ｈｐ１およびＨｐ２と名指される、Ｈｐ遺伝子の２つの対立遺伝子の存在に起因して、３つのＨｐ表現型が存在する。Ｈｐ１対立遺伝子の遺伝子内重複により発生する、Ｈｐ２対立遺伝子は、わずかに大きなα鎖をコードするが、他の点では、Ｈｐ１対立遺伝子と同一である。α鎖を接続するシステイン残基は、コードされるＨｐ２タンパク質内で重複しているため、表現型である、Ｈｐ２－１と、Ｈｐ２－２とは、あるスペクトルにわたる、多様なＨｐ（αβ）多量体を提示する。ハプトグロビン－ヘモグロビンは、各々が、ヘモグロビンのαβ二量体と相互作用する、ハプトグロビン鎖の二量体からなる。各末端において、ハプトグロビンのβ鎖は、ヘモグロビン二量体と、安定的な複合体を形成する。クリアランス受容体であるＣＤ１６３との相互作用もまた、β鎖により媒介される。

【0034】

Ｈｐの主要な機能（すなわち、ＨｂおよびＣＤ１６３に結合する機能）は、配列番号１において示される、ヒトｐｒｏＨｐのアミノ酸残基１６２～４０６に対応するアミノ酸残基によりコードされるβ鎖により媒介される。しかし、これらのアミノ酸配列をコードする構築物の、哺乳動物細胞内における組換え発現は、タンパク質産物の発現を結果としてもたらさない。ここで、驚くべきことに、ｐｒｏＨｐのタンパク質分解性切断部位に対してＮ末端側において、少なくともさらなる１４アミノ酸を導入し、この構築物を、セリンプロテアーゼと共に共発現させることにより、ＨｂおよびＣＤ１６３への結合を保持するＨｐβ鎖のロバストな発現が達成されることが、本発明者らにより見出された。本発明者らはまた、驚くべきことに、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのβ鎖構成要素を、Ｆｃ、アルブミン、またはヘモペキシン（Ｈｐｘ）などの機能的部分とコンジュゲートまたは連結することにより改変され、それでもなお、改変構築物を、比較的高収量でもたらすことも見出し、また、機能的部分が、それらのそれぞれの標的である、Ｈｂおよびヘム（かつ、Ｈｐｘ融合タンパク質の場合、ＣＤ１６３またはＣＤ９１）に対する結合アフィニティーを保持することにも言及した。

【0035】

「Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐ」という用語は、切断されなければ、完全なＨｐα鎖の一部を形成する、切断型Ｎ末端により、天然（自然に存在する）ｐｒｏＨｐ分子の長さより短いアミノ酸配列を有する、ｐｒｏＨｐの断片を意味するように理解されるものとする。ｐｒｏＨｐは、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、少なくともＨｐα鎖の１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基を保持する限りにおいて、そのＮ末端において、任意の数のアミノ酸残基だけ切断される場合がある。ある実施形態では、発現されるＮ末端切断型ｐｒｏＨｐは、Ｈｐα鎖の１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、Ｈｐβ鎖との間に、ジスルフィド結合を含む。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基の中のシステイン残基と、配列番号１のアミノ酸位置２６６に対応する位置におけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含む。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１において示される、ヒトｐｒｏＨｐのアミノ酸位置１４９および２６６に対応する位置において、システイン残基を含む。

【0036】

本開示は、特異的アミノ酸配列を有するＮ末端切断型ｐｒｏＨｐ、または特異的核酸配列によりコードされるＮ末端切断型ｐｒｏＨｐに限定されず、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、
（ｉ）ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基；
（ｉｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片；および
（ｉｉｉ）ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、内部酵素切断部位
を、適切に含む限りにおいて、任意の適切なＮ末端切断型ｐｒｏＨｐが、本発明に従い使用されることが理解されるものとする。

【0037】

当業者はまた、Ｈｐα鎖の、適切なアミノ酸配列についても熟知しており、それについての例示的な例は、配列番号１のアミノ酸残基１９～１６０、配列番号２のアミノ酸残基１９～１００、および配列番号３のアミノ酸残基１９～１０１を含む。ある実施形態では、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基１４８～１６１（すなわち、ＶＣＧＫＰＫＮＰＡＮＰＶＱＲ；配列番号８）に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0038】

当業者はまた、ＨｂおよびＣＤ１６３に結合することが可能なＨｐβ鎖の領域から構成される、Ｈｐβ鎖の、適切なアミノ酸配列についても熟知しており、それについての例示的な例は、配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６（ヒトｐｒｏＨｐアイソフォーム１；ｐｒｏＨｐ１）、配列番号２のアミノ酸残基１０２～３４０（ヒトｐｒｏＨｐアイソフォーム２；ｐｒｏＨｐ２）、および配列番号３のアミノ酸残基１０３～３４３（ヒトｐｒｏＨｐアイソフォーム３；ｐｒｏＨｐ３）を含む。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号２のアミノ酸残基１０２～３４０に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号３のアミノ酸残基１０３～３４３に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号２のアミノ酸残基１０２～３４０に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号３のアミノ酸残基１０３～３４３に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号２のアミノ酸残基１０２～３４０に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号３のアミノ酸残基１０３～３４３に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0039】

ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号２のアミノ酸残基１０２～３４０に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｈｐβ鎖は、配列番号３のアミノ酸残基１０３～３４３に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0040】

当業者により、一部の場合に、選択される、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐの配列は、意図される治療的使用を含む、意図される使用に依存することもまた理解されるであろう。例を目的として述べると、組換えＨｐが、ヒト対象における状態の処置および／または防止のために使用される場合、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのアミノ酸配列は、組換えＨｐの、対象への投与が、ヒトｐｒｏＨｐに由来するのでなければｉｎ ｖｉｖｏにおける、その効能を低減する、組換えＨｐに対する抗体を生成させる可能性を最小化することを含む理由で、ヒトｐｒｏＨｐに由来すると有利であろう。同様に、組換えＨｐが、獣医科適用のためなど、非ヒト対象における状態の処置および／または防止のために使用される場合、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのアミノ酸配列は、非ヒト対象に天然である、ｐｒｏＨｐアイソフォームに由来すると有利であろう。当業者は、適切なｐｒｏＨｐの非ヒトアイソフォームについて熟知しており、それについての例示的な例は、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、ウシ科動物、ヒツジ科動物、および霊長動物のｐｒｏＨｐを含む。霊長動物ｐｒｏＨｐの例示的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦＨ３２２００およびＪＡＢ０４８２０において記載されている。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、ヒトＮ末端切断型ｐｒｏＨｐに由来するアミノ酸配列を有する。したがって、ある実施形態では、ハプトグロビンは、ヒトハプトグロビンである。当業者は、適切なヒトｐｒｏＨｐのアミノ酸配列について熟知しており、それについての例示的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００５１３４（ヒトＨｐアイソフォーム１の前駆体であるｐｒｏＨｐ；配列番号１；また、アイソフォームＨｐ１またはＨｐ１Ｆとも称される）、ＮＰ＿００１１１９５７４（ヒトＨｐアイソフォーム２の前駆体であるｐｒｏＨｐ；配列番号２；また、アイソフォームＨｐ２またはＨｐ２ＳＳとも称される）、およびＮＰ＿００１３０５０６７（ヒトＨｐアイソフォーム３の前駆体であるｐｒｏＨｐ；配列番号３；また、アイソフォームＨｐ３とも称される）において記載されている、ヒトｐｒｏＨｐのアミノ酸配列を含む。ヒトＨｐアイソフォームの亜型もまた、当業者に公知であり、それについての例示的な例は、（ｉ）配列番号１において示される、それぞれ、アミノ酸位置７０および７１における残基ＡｓｐおよびＬｙｓを含む、Ｈｐ１Ｆ（配列番号１）；（ｉｉ）配列番号１の、それぞれ、アミノ酸位置７０および７１に対応する位置における残基ＡｓｎおよびＧｌｕを含む、Ｈｐ１Ｓ；（ｉｉｉ）配列番号２において示される、それぞれ、アミノ酸位置７０および７１における残基ＡｓｎおよびＧｌｕ、ならびに、それぞれ、アミノ酸位置１２９および１３０における残基ＡｓｎおよびＧｌｕを含む、Ｈｐ２ＳＳ（配列番号２）；ならびに（ｉｖ）配列番号２の、それぞれ、アミノ酸位置７０および７１に対応する位置における残基ＡｓｐおよびＬｙｓ、ならびに、それぞれ、アミノ酸位置１２９および１３０に対応する位置における残基ＡｓｎおよびＧｌｕを含む、Ｈｐ２ＦＳを含む。

【0041】

ある実施形態では、ハプトグロビンは、本明細書で記載されるヒトハプトグロビンアイソフォームである、Ｈｐ１Ｆである。別の実施形態では、ハプトグロビンは、本明細書で記載されるヒトハプトグロビンアイソフォームである、Ｈｐ１Ｓである。別の実施形態では、ハプトグロビンは、本明細書で記載されるヒトハプトグロビンアイソフォームである、Ｈｐ２ＦＳである。別の実施形態では、ハプトグロビンは、本明細書で記載されるヒトハプトグロビンアイソフォームである、Ｈｐ２ＳＳである。

【0042】

ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号１に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号１に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号１に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号１に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号２に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号２に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号２に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号２に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号３に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号３に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号３に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ｐｒｏＨｐは、配列番号３に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0043】

ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0044】

ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0045】

ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0046】

「少なくとも８０％」への言及は、例えば、最適アライメント解析または最良適合解析の後における、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および１００％の配列同一性を含む。比較ウィンドウを位置合わせするための、最適の配列アライメントは、アルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡによる、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０内の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータへの実装により行われる場合もあり、または選択される多様な方法のうちのいずれかによりもたらされる、精査および最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり、最高相同性百分率を結果としてもたらすアライメント）により行われる場合もある。また、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２５：３３８９により開示される、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照される。配列解析についての詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４～１９９８）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃの、１９．３部において見出される。

【0047】

本明細書で使用される、「配列同一性」という用語は、配列が、比較ウィンドウにわたり、ヌクレオチド対ヌクレオチドベースで、またはアミノ酸対アミノ酸ベースで、同一であるか、または構造的に類似する程度を指す。したがって、「配列同一性百分率」は、例えば、比較ウィンドウにわたり最適にアライメントされた２つの配列を比較し、同一である核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）、または同一であるアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が、両方の配列内で生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を求め、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性百分率を求めることにより計算される。例えば、「配列同一性」とは、ソフトウェアに付属するリファレンスマニュアルにおいて使用される、標準デフォルト値を使用して、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ；米国、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ、日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社から入手可能である）により計算される「マッチ百分率」である。

【0048】

本明細書で使用される、「配列同一性」という用語は、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで比較される配列の間の、正確な同一性を含む。本明細書では、この用語はまた、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける、不正確な同一性（すなわち、類似性）を含むようにも使用され、この場合、配列の間の任意の差違（複数可）は、しかしながら、構造レベル、機能レベル、生化学レベル、および／またはコンフォメーションレベルにおいて、互いと類縁であるアミノ酸に関する任意の差違である（またはヌクレオチド、前記ヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の文脈における任意の差違）。例えば、アミノ酸レベルにおいて、非同一性（類似性）が見られる場合、「類似性」は、しかしながら、構造レベル、機能レベル、生化学レベル、および／またはコンフォメーションレベルにおいて、互いと類縁であるアミノ酸を含む。ある実施形態では、ヌクレオチドおよび配列の比較は、類似性ではなく、同一性のレベルでなされる。例えば、ロイシンで、イソロイシン残基またはバリン残基が置換される。これは、保存的置換と称される。ある実施形態では、アミノ酸配列は、修飾が、修飾されたポリペプチドの結合特異性または機能活性に対して、非修飾ポリペプチドと比較した場合に、影響を及ぼさないか、または影響が無視できるように、その中に含有されるアミノ酸残基のうちのいずれかの保存的置換を目的として修飾される。

【0049】

本明細書で記載される配列同一性は、典型的に、配列をアライメントし、必要な場合、最大の相同性百分率を達成するように、ギャップを導入し、任意の保存的置換を、配列同一性の部分としては考慮せずにおいた後において、対応するペプチド配列の残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基の百分率に関する。Ｎ末端またはＣ末端のいずれの伸長も、挿入も、配列同一性または配列相同性を低減するものとしてはみなされないものとする。

【0050】

本明細書ではまた、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐの機能的変異体も想定される。本明細書で使用される、「機能的変異体」という用語は、ｐｒｏＨｐ（ヒトｐｒｏＨｐまたは非ヒトｐｒｏＨｐ）の天然（自然に存在する）アイソフォームとの、少なくとも一部のアミノ酸配列同一性を共有するが、Ｈｂに結合する能力を保持するペプチドを指す。本明細書のこの文脈では、「機能的変異体」および「Ｈｂ結合性機能変異体」という用語は、互換的に使用される。機能的変異体は、Ｃ末端が切断されたｐｒｏＨｐ（すなわち、Ｃ末端切断型Ｈｐβ鎖）へと拡張されるが、Ｃ末端切断型ｐｒｏＨｐは、当業者が熟知する、Ｈｐβ鎖のＨｂ結合性領域のうちの、少なくとも一部を適切に保持することが理解されるものとする。さらに、当業者は、Ｈｂ結合活性を保持する、Ｃ末端切断型Ｈｐβ鎖を含む機能的変異体についてスクリーニングする適切な方法について熟知しており、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびサイズ除外クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）など、それについての例示的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。これらの方法についてはまた、その内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｅｒら（２０１８、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：１５）においても記載されている。

【0051】

本開示はまた、保存的なアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換により、天然配列と異なる機能的変異体へも拡張される。ある実施形態では、機能的変異体は、修飾が、機能的変異体の、Ｈｂへの結合特異性または機能活性に対して、非修飾（例えば、天然）分子と比較した場合に、影響を及ぼさないか、または影響が無視できるように、その中に含有されるアミノ酸残基のうちのいずれかの保存的置換を目的として、天然配列と異なるアミノ酸配列を含む。当業者はまた、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含み、Ｈｂ結合活性を保持する機能的変異体についてスクリーニングする適切な方法についても熟知しており、それについての例示的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0052】

一部の実施形態では、機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７、または配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７に対する、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９７％、好ましくは、少なくとも９８％、または、好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0053】

ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６との、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６との、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号１のアミノ酸残基１４８～４０６を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0054】

ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７との、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７との、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0055】

ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７との、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号３のアミノ酸残基８９～３４７との、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、配列番号２のアミノ酸残基８９～３４７を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0056】

好ましい実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、天然の内部酵素切断部位を含む；すなわち、内部酵素切断部位は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのアミノ酸配列が由来するｐｒｏＨｐに対して、天然である。ヒトｐｒｏＨｐアイソフォーム１（配列番号１）において、内部酵素切断部位は、この部位における酵素的切断が、Ｈｐアルファ鎖（配列番号１のアミノ酸残基１９～１６１）を、Ｈｐベータ鎖（配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６）から切り離すように、配列番号１のアミノ酸位置１６１および１６２に配置される。ヒトｐｒｏＨｐアイソフォーム２（配列番号２）において、内部酵素切断部位は、この部位における酵素的切断が、Ｈｐアルファ鎖（配列番号２のアミノ酸残基１９～１６２）を、Ｈｐベータ鎖（配列番号２のアミノ酸残基１６３～４０７に対応する）から切り離すように、配列番号１のアミノ酸位置１６２および１６３に配置される。ヒトｐｒｏＨｐアイソフォーム３（配列番号３）において、内部酵素切断部位は、この部位における酵素的切断が、Ｈｐアルファ鎖（配列番号３のアミノ酸残基１９～１６２）を、Ｈｐベータ鎖（配列番号３のアミノ酸残基１６３～４０７に対応する）から切り離すように、配列番号３のアミノ酸位置１６２および１６３に配置される。

【0057】

他の実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐをコードする、第１の核酸配列は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、内部酵素切断部位を含みうる；すなわち、内部酵素切断部位は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのアミノ酸配列が由来するｐｒｏＨｐに対して、非天然である。この文脈では、内部酵素切断部位は、第２の核酸配列によりコードされる酵素が、非天然の酵素切断部位において、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを切断することが可能であるよう、それが、発現系の第２の核酸配列によりコードされる酵素と適合性となるように選択される。当業者は、それらの対応する酵素と同様に、適切な非天然の内部酵素切断部位を熟知しているであろう。適切な非天然の内部酵素切断部位の例示的な例は、フーリン切断部位、非天然のセリンプロテアーゼ切断部位、システインプロテアーゼ切断部位、アスパラギン酸プロテアーゼ切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、およびトレオニンプロテアーゼ切断部位を含む。したがって、本明細書で開示される、ある実施形態では、内部酵素切断部位は、フーリン切断部位、非天然のセリンプロテアーゼ切断部位、システインプロテアーゼ切断部位、アスパラギン酸プロテアーゼ切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、およびトレオニンプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される。

【0058】

ある実施形態では、内部酵素切断部位は、セリンプロテアーゼ以外の切断部位である。好ましい実施形態では、セリンプロテアーゼ切断部位は、本明細書の他の箇所で記載される、Ｃ１ｒ様タンパク質（Ｃ１ｒＬＰ）切断部位またはその機能的変異体である。

【0059】

さらなる機能的部分
本明細書で開示される発現系では、第１の核酸配列によりコードされる、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、１つまたはそれ以上の、さらなる機能的部分をさらに含みうる。ある実施形態では、機能的部分は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基のうちの１つまたはそれ以上と、連結されているか、融合されているか、コンジュゲートされているか、カップリングされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている。ある実施形態では、さらなる機能的部分は、ハプトグロビンベータ鎖のアミノ酸残基のうちの１つまたはそれ以上と、連結されているか、融合されているか、コンジュゲートされているか、カップリングされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている。ある実施形態では、さらなる機能的部分は、少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基の中のシステイン残基において、ジスルフィド結合により、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐと、連結されているか、融合されているか、コンジュゲートされているか、カップリングされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている。ある実施形態では、さらなる機能的部分は、配列番号１の１４９位に対応するアミノ酸位置に対応するシステイン残基において、ジスルフィド結合により、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐと、連結されているか、融合されているか、コンジュゲートされているか、カップリングされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている。

【0060】

一部の実施形態では、機能的部分は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐに、共有結合的に結合している。他の実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、融合タンパク質の一部としての、１つまたはそれ以上の異種部分と融合されているか、カップリングされているか、または他の形で接合されている。１つまたはそれ以上の、さらなる機能的部分は、本明細書で記載されるハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の活性および／または安定性を、適切に改善するか、増強するか、または他の形で拡張するであろう。

【0061】

本明細書で記載される組換えタンパク質の単離を容易とするために、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐまたはその機能的変異体が、アフィニティークロマトグラフィーによる単離などの単離を可能とする、異種ポリペプチドと、翻訳により融合された（共有結合的に連結された）、融合ポリペプチドが作製される。適切な異種ポリペプチドは、当業者に公知であり、それについての例示的な例は、Ｈｉｓタグ（例えば、８ヒスチジン残基）、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）、Ｖ５タグ、ＨＡタグ、ＣＢＰ（キチン結合性タンパク質）タグ、ＭＢＰ（マルトース結合性タンパク質）タグ、ストレプトアビジンタグ、ＳＢＰ（ストレプトアビジン結合性タンパク質）、Ｍｙｃタグ、およびビオチンタグを含む。

【0062】

一部の実施形態では、本明細書で記載される、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の半減期を延長するための機能的部分へと接合されていると適切である。当業者は、適切な半減期を延長する機能的部分について熟知しており、それについての例示的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、およびヒアルロン酸を含む。本明細書で開示される、ある実施形態では、機能的部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、およびヒアルロン酸からなる群から選択される。半減期を延長する機能的部分は、当業者に公知である、任意の適切な手段により、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐまたはその機能的変異体と連結されており（例えば、融合されているか、コンジュゲートされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている）、これについての例示的な例は、例えば、その全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２５６，２５３号において記載されている、化学的リンカーを介する例である。

【0063】

他の実施形態では、機能的部分は、半減期増強タンパク質（ＨＬＥＰ）である。当業者は、適切な半減期増強タンパク質について熟知しており、それについての例示的な例は、アルブミンおよびその断片を含む。したがって、ある実施形態では、ＨＬＥＰは、アルブミンまたはその断片である。アルブミンまたはその断片のＮ末端は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのアルファ鎖および／またはベータ鎖のＣ末端と、連結されているか、融合されているか、コンジュゲートされているか、カップリングされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている。代替的に、または加えて、アルブミンまたはその断片のＣ末端は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのアルファ鎖および／またはベータ鎖のＮ末端と、連結されているか、融合されているか、コンジュゲートされているか、カップリングされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている。１つまたはそれ以上のＨＬＥＰは、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、無細胞Ｈｂに結合する能力を消失させないことを条件として、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐのアルファ鎖および／またはベータ鎖のＮ末端部分またはＣ末端部分（複数可）と融合されている。しかし、やはり、無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより、無細胞Ｈｂを中和することが可能である限りにおいて、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の、無細胞Ｈｂへの結合の、ある程度の低減は、許容可能であることが理解されるものとする。

【0064】

本明細書では、「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）および「アルブミン」（ＡＬＢ）という用語は、互換的に使用される。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は、より広義の用語であり、ヒト血清アルブミン（ならびにその断片および変異体）の他、他の分子種に由来するアルブミン（ならびにその断片および変異体）を包含する。

【0065】

本明細書で使用される、「アルブミン」とは、集合的に、アルブミンの１つまたはそれ以上の機能活性（例えば、生物学的活性）を有する、アルブミンのポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミンの断片もしくは変異体を指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンもしくは他の脊椎動物に由来するアルブミンの成熟形態もしくはその断片、またはこれらの分子もしくはその断片の類似体もしくは変異体を含む、ヒトアルブミンまたはその断片を指す。

【0066】

本明細書で記載される融合タンパク質は、ヒトアルブミンの自然に存在する多型変異体および／またはヒトアルブミンの断片を含むと適切でありうる。一般的に述べると、アルブミンの断片または変異体は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも４０、または、最も好ましくは、７０アミノ酸を超える長さであろう。

【0067】

ある実施形態では、ＨＬＥＰは、ＦｃＲｎ受容体への結合が増強されたアルブミン変異体である。このようなアルブミン変異体は、Ｈｐまたはその機能的類似体の血漿半減期の、野生型アルブミンと融合されたＨｐまたはその機能的な断片と比較した延長をもたらしうる。本明細書で記載される融合タンパク質のアルブミン部分は、ヒトアルブミンの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメイン、またはこれらの保存的修飾を含むと適切でありうる。

【0068】

一部の実施形態では、リンカー配列は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐと、機能的部分との間に配置される。リンカー配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸、特に、１つ～５０、好ましくは、１つ～３０、好ましくは、１つ～２０、好ましくは、１つ～１５、好ましくは、１つ～１０、好ましくは、１つ～５つ、または、より好ましくは、１つ～３つ（例えば、１つ、２つ、または３つ）のアミノ酸からなり、互いと同等の場合もあり、互いと異なる場合もあるペプチドリンカーでありうる。前記リンカー配列内に存在する、好ましいアミノ酸は、ＧｌｙおよびＳｅｒを含む。好ましい実施形態では、リンカー配列は、本明細書で開示される方法に従い処置される対象に対して、実質的に非免疫原性である。実質的に非免疫原性であるとは、リンカー配列が、それが投与される対象において、リンカー配列または組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片に対する検出可能な抗体応答を惹起しないことを意味する。好ましいリンカーは、グリシン残基とセリン残基との交替から構成される。当業者は、適切なリンカーについて熟知しており、それについての例示的な例は、ＷＯ２００７／０９０５８４において記載されている。ある実施形態では、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐと、機能的部分との間のペプチドリンカーは、ヒトタンパク質内で、天然のドメイン間リンカーとして用いられるペプチド配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。それらの天然環境におけるこのようなペプチド配列は、この配列に対する、天然の寛容を仮定しうるように、タンパク質表面に近接して配置され、免疫系にアクセス可能である。例示的な例は、ＷＯ２００７／０９０５８４において与えられている。適切な切断可能リンカー配列は、例えば、ＷＯ２０１３／１２０９３９において記載されている。

【0069】

適切なＨＬＥＰ配列についての例示的な例は、下記に記載される。同様に、本明細書では、Ｎ末端における、ＨＬＥＰの１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失を含む、それぞれのＨＬＥＰの正確な「Ｎ末端アミノ酸」、もしくは正確な「Ｃ末端アミノ酸」との融合体、またはそれぞれのＨＬＥＰの「Ｎ末端部分」もしくは「Ｃ末端部分」との融合体が開示される。融合タンパク質は、１つを超えるＨＬＥＰ配列、例えば、２つまたは３つのＨＬＥＰ配列を含みうる。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、Ｈｐのアルファ鎖および／またはベータ鎖のＣ末端部分と、タンデムで、例えば、一連のリピートとして融合されている。

【0070】

本明細書で記載される、融合タンパク質のＨＬＥＰ部分は、野生型ＨＥＬＰの変異体でありうる。融合タンパク質のＨＥＬＰ部分に関して使用される場合における、「変異体」という用語は、保存的であるか、または非保存的である、挿入、欠失、および／または置換を含むように理解されるものとし、この場合、このような変化は、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより、無細胞Ｈｂを中和する能力を、実質的に変更しない。ＨＬＥＰは、任意の脊椎動物、とりわけ、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来すると適切でありうる。哺乳動物以外のＨＬＥＰは、雌鶏およびサケのＨＬＥＰを含むがこれらに限定されない。

【0071】

ある実施形態では、機能的部分は、半減期延長ポリペプチドである。ある実施形態では、半減期延長ポリペプチドは、アルブミン、アルブミン－ファミリーのメンバーまたはその断片、ヘモペキシン、流体力学体積が大きな溶媒和ランダム鎖（例えば、ＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６～１１９０を参照されたい））、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）またはプロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ－フェトタンパク質、ビタミンＤ結合性タンパク質、トランスフェリンまたはその変異体もしくは断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特に、免疫グロブリン定常領域およびその部分、例えば、Ｆｃ断片に結合することが可能であるポリペプチド、生理学的条件下で、アルブミン、アルブミン－ファミリーのメンバー、もしくはこれらの断片、または免疫グロブリン定常領域またはその部分に結合することが可能であるポリペプチドまたは脂質からなる群から選択される。ある実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその部分は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ断片、免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）のＦｃ断片、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）のＦｃ断片、またはこれらのＦｃ受容体結合性断片である。本明細書で使用される、半減期増強ポリペプチドは、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療活性または生物学的活性を安定化させるか、または延長する、特に、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長することが可能である、全長半減期増強タンパク質、またはその１つもしくはそれ以上の断片でありうる。このような断片は、１０またはそれ以上のアミノ酸の長さの断片である場合もあり、ＨＬＥＰ配列に由来する、少なくとも約１５、好ましくは、少なくとも約２０、好ましくは、少なくとも約２５、好ましくは、少なくとも約３０、好ましくは、少なくとも約５０、または、より好ましくは、少なくとも約１００、またはそれ以上の連続アミノ酸を含む場合もあり、あるいは、ＨＬＥＰ断片が、ＨＬＥＰの非存在下における、それぞれのＨｐと比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、または、より好ましくは、少なくとも２５％の、機能的な半減期の延長をもたらす限りにおいて、それぞれのＨＬＥＰの特異的ドメインの一部または全部を含む場合もある。当業者は、機能的部分が、機能的な半減期の延長を、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片にもたらす（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて）のかどうかを決定する方法について熟知しており、それについての例示的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0072】

本明細書で記載される、コンジュゲートおよび融合タンパク質は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐと、ＨＬＥＰなど、１つまたはそれ以上の機能的部分とをコードする、少なくとも２つのＤＮＡ配列の、インフレームにおける接続により創出される。当業者は、コンジュゲートまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の翻訳が、単一のペプチド配列を結果としてもたらすことを理解するであろう。本明細書で開示される実施形態に従うペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列の、インフレームにおける挿入の結果として、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、適切なリンカー、および機能的部分を含むコンジュゲートまたは融合タンパク質が得られる。

【0073】

本明細書で開示される、ある実施形態では、機能的部分は、アルブミンまたはその断片、ヘモペキシン、トランスフェリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ－フェトタンパク質、ビタミンＤ結合性タンパク質、生理学的条件下で、アルブミンまたは免疫グロブリン定常領域に結合することが可能であるポリペプチド、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特に、免疫グロブリン定常領域およびその部分、好ましくは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合することが可能であるポリペプチド、ならびに前出のうちのいずれかの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。別の実施形態では、機能的部分は、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合性リガンド、例えば、脂肪酸鎖、および前出のうちのいずれかの組合せからなる群から選択される。

【0074】

ある実施形態では、機能的部分は、ヘモペキシンまたはそのヘム結合性断片である。ヘモペキシンは、９０°の角度で、一体にかみ合う、２つの厚い円板に相似する、２つの４枚羽βプロペラドメインにより形成され、ドメイン間リンカーペプチドにより接続される、４３９アミノ酸長の単一ペプチド鎖から構成される、６１ｋＤａの血漿β－１Ｂ糖タンパク質である。血管内溶血および血管外溶血の結果として、血中へと放出されるヘムは、ドメイン間リンカーペプチドにより形成されるポケット内の、２つの４枚羽βプロペラドメインの間で結合している。残基である、Ｈｉｓ２１３およびＨｉｓ２６６は、ヘムの鉄原子に配位結合して、ヘモグロビンと同様の、安定的なビス－ヒスチジル錯体をもたらす。「ヘム結合性断片」という用語は、それが、天然分子としての無細胞ヘムに対する結合アフィニティーのうちの、少なくとも一部を保持するように、天然ヘモペキシン分子のうちの、十分な数の連続アミノ酸残基または非連続アミノ酸残基を含む、天然ヘモペキシン分子の断片を意味する用語として理解されるものとする。当業者は、ヘモペキシンの断片が、ヘム結合性活性を保持するのかどうかを決定するための適切な方法について熟知しており、例示的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。ある実施形態では、ヘモペキシンのヘム結合性断片は、天然のヘモペキシンタンパク質に対する、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも５５％、好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、または、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、ヘモペキシンは、ヒトヘモペキシンである。ある実施形態では、ヒトヘモペキシンは、ＮＰ＿０００６０４（配列番号１２）において示されるアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。

【0075】

ヘモペキシンは、シアル酸、マンノース、ガラクトース、およびグルコサミンを含む、約２０％の炭水化物を含有する。おそらく、６つのジスルフィド架橋を占める、１２のシステイン残基が、タンパク質配列内で見出された。ヘモペキシンは、高アフィニティー（Ｋ_ｄ＜１ｐＭ）でヘムに結合し、血流から、肝臓へのヘム特異的キャリアとして機能するその能力のために、ヘム毒性に対する防御の最前線を表す。ヘモペキシンは、ヘムに、等モル比で結合するが、ヘムが、タンパク質に共有結合的に結合している証拠は存在しない。ヘムへの結合に加えて、ヘモペキシン調製物はまた、セリンプロテアーゼ活性（Ｌｉｎら、２０１６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２２：２２～３１）、ならびに抗炎症活性および炎症促進活性、細胞接着の阻害、ならびにある特定の二価金属イオンへの結合を呈することなど、他のいくつかの機能を有することも報告されている。内因性ヘモペキシンは、生理学的定常状態下における遊離ヘムの有害作用を制御しうる一方、高レベルのヘムが、内因性ヘモペキシンの枯渇をもたらし、ヘム媒介性酸化性組織損傷を引き起こす、溶血と関連する状態などの病態生理状態下では、定常ヘムレベルの維持に、ほとんど効果を及ぼさない。研究は、鎌状赤血球病（ＳＣＤ）およびβ－サラセミアなどの溶血性障害についての実験マウスモデルにおいて、ヘモペキシン注入が、ヘム誘導性内皮活性化、炎症、および酸化性損傷を緩和することを示した。ヘモペキシンの投与はまた、溶血性動物において、炎症促進性サイトカインのレベルを著明に低減し、ヘム誘導性血管収縮に対抗することも示されている。

【0076】

ある実施形態では、機能的部分は、Ｆｃ領域またはそのＦｃＲｎ結合性断片を含む、免疫グロブリン分子である。免疫グロブリンＦｃ領域（Ｆｃ）は、治療用タンパク質の半減期を延長することが、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｍｏｎｔ ＪＡら、２００６．ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２０：１５１～１６０を参照されたい）。重鎖のＩｇＧ定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１～ＣＨ３）およびヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、任意の哺乳動物に由来する場合もあり、サブグラスである、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のそれぞれに由来する場合もある。抗原結合性ドメインを伴わないＩｇＧおよびＩｇＧ断片もまた、ＨＬＥＰとして使用される場合を含む、機能的部分として使用される。Ｈｐまたはその機能的類似体は、抗体のヒンジ領域、なおまたは、切断可能な場合もある、ペプチドリンカーを介して、ＩｇＧまたはＩｇＧ断片へと接続されると適切でありうる。いくつかの特許および特許出願が、治療用タンパク質の、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増強する、治療用タンパク質の、免疫グロブリン定常領域への融合について記載している。例えば、ＵＳ２００４／００８７７７８およびＷＯ２００５／００１０２５は、融合されていなければｉｎ ｖｉｖｏにおいて急速に消失させられるペプチドの半減期を延長する、生物学的に活性であるペプチドとの、Ｆｃドメインまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部の融合タンパク質について記載している。Ｆｃ－ＩＦＮ－β融合タンパク質は、生物学的活性の増強、循環半減期の延長、および可溶性の増大を達成することが記載された（ＷＯ２００６／０００４４８Ａ２）。血清半減期が延長され、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効力が増大した、Ｆｃ－ＥＰＯタンパク質（ＷＯ２００５／０６３８０８Ａ１）の他、全てが、半減期増強特性を伴う、Ｇ－ＣＳＦ（ＷＯ２００３／０７６５６７Ａ２）、グルカゴン様ペプチド１（ＷＯ２００５／０００８９２Ａ２）、凝結因子（ＷＯ２００４／１０１７４０Ａ２）、およびインターロイキン１０（米国特許第６，４０３，０７７号）とのＦｃ融合体も開示された。

【0077】

本発明に従い使用される、適切なＨＬＥＰの例示的な例はまた、その内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１においても記載されている。

【0078】

発現系
他の箇所で言及される通り、本開示は、
（ａ）Ｎ末端切断型プロハプトグロビン（ｐｒｏＨｐ）をコードし、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、（ｉ）ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基、および（ｉｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含み、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、内部酵素切断部位を含む、第１の核酸配列；ならびに
（ｂ）Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、酵素切断部位において切断することが可能である酵素をコードする、第２の核酸配列
を含み；
第１の核酸配列および第２の核酸配列が、哺乳動物細胞へと導入され、その後、細胞内で、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐおよび酵素が発現されると、酵素は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、内部酵素切断部位において切断し、これにより、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐから放出することが可能である、
哺乳動物発現系を提示する。

【0079】

本明細書で記載される発現系は、例えば、発現されるタンパク質（複数可）内の機能を保存するのに要求される、タンパク質の適正なフォールディングおよび翻訳後修飾を容易とすることにより、生物学的活性を維持する可能性が高い組換えタンパク質を産生することが可能であるので、哺乳動物細胞を利用すると有利である。本明細書の他の箇所で言及される通り、本発明者らは、予測外に、それらの発現系が、機能的ハプトグロビンβ鎖の、安定的なトランスフェクションおよび発現を結果としてもたらし、これにより、一過性のトランスフェクションを達成するのがせいぜいであり、一般に、機能的タンパク質を作出することができない、既存の発現系と識別されるので有利であることを見出した。したがって、本明細書で記載される発現系は、哺乳動物細胞内における、機能的な組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の、安定的なトランスフェクションおよび発現が可能である。当業者は、組換えタンパク質を調製する適切な方法について熟知しており、それについての例示的な例は、所望される、本明細書で記載される組換えタンパク質をコードする、１つまたはそれ以上の核酸配列を含む、１つまたはそれ以上の核酸分子の、前記核酸配列を発現することが可能である、適切な宿主細胞への導入、前記宿主細胞を、前記核酸配列の発現に適する条件下でインキュベートする工程、および前記組換えタンパク質を回収する工程を含む。

【0080】

遺伝子コードについての知見に基づき、組換えタンパク質をコードする核酸分子を調製するための適切な方法であって、おそらく、組換え融合タンパク質を発現させ、かつ／またはこれを分泌させるために使用される宿主細胞（例えば、ヒト細胞および非ヒト哺乳動物細胞）の性質に基づき、コドンを最適化する工程を含む方法もまた、当業者に公知であろう。組換えタンパク質の発現に適する哺乳動物細胞もまた、当業者に公知であり、それについての例示的な例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびその派生細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＣＨＯ ｐｒｏ－３細胞）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０細胞およびＳｐ２／０細胞）、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を含む。哺乳動物細胞内のタンパク質発現はまた、ＢａｃＭａｍシステムなどの技法により、ウイルス媒介形質導入を使用しても達成される。この技術は、哺乳動物細胞への単純な形質導入のために、組換えバキュロウイルスを利用し、構造研究のための、ミリグラム単位量のタンパク質の作製を可能とする。ＣＯＳ細胞およびＶｅｒｏ細胞（いずれも、アフリカグリーンモンキー腎臓細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん）、ならびにＮＳ０（マウス骨髄腫）など、他の細胞系もまた、構造研究のために使用されている。ＮＳ０など、これらの細胞系の一部は、トランスフェクトすることが、より困難である。トランスフェクションは、通例、電気穿孔を使用して達成され、安定的な細胞系を作製する場合に限り使用される。本明細書で記載される組換えタンパク質を含む、組換えタンパク質の発現に適する哺乳動物細胞の例示的な例については、Ｕ２ＯＳ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＣＡＤ細胞、Ｐ１９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｎ２ａ細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞系、ＭＣＦ－７、Ｙ７９細胞、ＳＯ－Ｒｂ５０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＤＵＫＸ－Ｘ１１細胞、Ｊ５５８Ｌ細胞、およびベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞など、Ｋｈａｎ ＫＨ（２０１３、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３（２）：２５７～２６３）において記載されている。

【0081】

また、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５版、全２巻、Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編著）、Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ（編）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（編）、Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ（編）、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（編）、Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ（編）、Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ（編）、Ｊ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）も参照される。

【0082】

本発明のある態様では、本発明に従う第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む哺乳動物細胞が提供され、この場合、哺乳動物は、細胞内における、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐおよびセリンプロテアーゼの発現が可能であり、セリンプロテアーゼは、Ｃ１ｒＬＰ切断部位内部におけるＮ末端切断型ｐｒｏＨｐを切断し、これにより、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、本発明のＮ末端切断型ｐｒｏＨｐから放出することが可能である。適切な哺乳動物細胞は、当業者に公知であり、それについての例示的な例は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｎ２ａ細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＥＳ細胞、およびＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、Ｕ２０Ｓ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＷＩ－３８細胞、ＭＲＣ－５細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞などのヒト細胞を含む。

【0083】

本明細書で使用される、「～をコードする」、「～をコードすること」などの用語は、核酸が、別の核酸またはポリペプチドをもたらす能力を指す。例えば、核酸配列は、それが、典型的に、宿主細胞内で、転写および／または翻訳されて、ポリペプチドを産生するか、または転写および／または翻訳されて、ポリペプチドを産生する形態へとプロセシングされる場合に、ポリペプチド「をコードする」と言われる。このような核酸配列は、コード配列、またはコード配列および非コード配列の両方を含みうる。したがって、「～をコードする」、「～をコードすること」などの用語は、ＤＮＡ分子の転写の結果として得られるＲＮＡ産物、ＲＮＡ分子の翻訳の結果として得られるタンパク質、ＲＮＡ産物を形成するＤＮＡ分子の転写、および、その後における、ＲＮＡ産物の翻訳の結果として得られるタンパク質、またはＲＮＡ産物をもたらすＤＮＡ分子の転写、プロセシングされたＲＮＡ産物（例えば、ｍＲＮＡ）をもたらすＲＮＡ産物のプロセシング、および、その後における、プロセシングされたＲＮＡ産物の翻訳の結果として得られるタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるペプチド配列、または本明細書で記載される融合タンパク質をコードする核酸配列は、適切な宿主細胞内の発現のためにコドン最適化される。例えば、組換えタンパク質が、ヒト対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態を処置または防止するために使用される場合、核酸配列は、コドン最適化ヒト核酸配列でありうる。Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｕｉｌｄ ａ Ｇｅｎｏｍｅウェブサイト上の、「Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｏｏｌｓ」内に配置された、「Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ」ツールの、「Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」オプションを使用する方法など、コドン最適化に適する方法は、当業者に公知であろう。

【0084】

本明細書の他の箇所で言及される通り、配列は、組換えタンパク質内で、当業者に公知である任意の手段により、互いと連結されている。「連結する」および「連結された」という用語は、ペプチド結合を介する、２つの配列（例えば、ペプチド配列）の直接的な連結を含む；すなわち、１つの配列のＣ末端は、ペプチド結合を介して、別の配列のＮ末端に、共有結合的に結合している。「連結する」および「連結された」という用語はまた、それらの意味の中に、２つの配列（例えば、ペプチド配列）の、散在したリンカーエレメントを介する連結も含む。

【0085】

核酸配列の単離およびクローニングは、標準的技法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、同前を参照されたい）を使用して達成される。例えば、所望される任意の核酸配列は、標準的技法により、ＲＮＡを抽出し、次いで、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成することにより（例えば、ＲＴ－ＰＣＲにより）、ウイルスから直接得られる。次いで、核酸配列は、直接、または１つもしくはそれ以上のサブクローニング工程の後で、適切な発現ベクターへと挿入される。当業者は、使用される正確なベクターの詳細が、それほど重要ではないことを理解するであろう。適切なベクターについての例示的な例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、またはＤＮＡウイルスを含む。次いで、所望の組換えタンパク質（複数可）は、下記でより詳細に記載される通りに、発現され、精製される。代替的に、核酸配列は、当業者に公知である、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ部位指向性突然変異誘発法により、上で記載された突然変異など、１つまたはそれ以上の突然変異を導入するように、さらに操作される。突然変異は、コード配列を構成する、適切なヌクレオチドのうちの１つまたはそれ以上の、欠失、挿入、置換、反転、またはこれらの組合せにより導入される。これは、例えば、そのためのプライマーがデザインされ、１つまたはそれ以上のヌクレオチドのミスマッチ、挿入、または欠失を組み込む、ＰＣＲベースの技法により達成される。突然変異の存在は、多数の標準的技法、例えば、制限解析またはＤＮＡシーケンシングにより検証される。組換えタンパク質を作製するための方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、その選択が当業者に公知である、適切な発現ベクターへと挿入される。発現ベクターについての適切な例は、以下の発現ベクターを含むが、これらに限定されない。組換えタンパク質（複数可）が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞内で発現される場合、発現ベクターは、これらの細胞内の発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２７７：１０８（１９７９））（例えば、初期サルウイルス４０プロモーター）、ＭＭＬＶ－ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：５３２２（１９９０））、またはＣＭＶプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス即初期プロモーター）を含む。組換え発現ベクターは、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）、および選択用マーカー遺伝子など、さらなる配列も運びうる。選択用マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的に、選択用マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなど、薬物に対する耐性を付与する。選択用マーカーを伴うベクターの例は、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３を含む。

【0086】

発現ベクターは、コートタンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の、効率的な転写に要求される転写エレメントなどの調節エレメントをさらに含みうることが理解されるであろう。ベクターへと組み込まれる適切な調節エレメントの例示的な例は、高レベルの核酸の転写を駆動する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリアデニル化シグナル（例えば、宿主細胞に従い選択される、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなど、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する）を含む。

【0087】

ある実施形態では、本明細書で記載される核酸は、本明細書ではまた、発現カセットとも称される、核酸カセットへと組み込まれる。核酸カセットまたは発現カセットは、核酸配列、典型的に、異種核酸配列（例えば、本明細書では、核酸構築物として記載される）を、ベクターへと導入するようにデザインされた核酸配列を意味することが意図される。発現カセットは、カセットの配列の各末端において、目的の核酸配列（複数可）の挿入を容易とする、末端制限酵素リンカー（すなわち、制限酵素認識ヌクレオチド）を含みうる。各末端における末端制限酵素リンカーは、同じ末端制限酵素リンカーの場合もあり、異なる末端制限酵素リンカーの場合もある。一部の実施形態では、末端制限酵素リンカーは、核酸、またはカセットが導入されたアルファウイルスゲノムの、意図されない消化が生じないように、希少な制限酵素認識／切断配列を含みうる。適切な末端制限酵素リンカーは、当業者に公知であろう。ある実施形態では、Ｐａｃ Ｉのための制限酵素認識ヌクレオチド（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）が、各発現カセットの５’末端へと付加され、Ｓｂｆ Ｉのための制限酵素認識ヌクレオチド（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）が、各発現カセットの３’末端へと付加される。

【0088】

ある実施形態では、転写調節的制御配列および翻訳調節的制御配列は、プロモーター配列、５’側非コード領域、転写調節タンパク質もしくは翻訳調節タンパク質に対する機能的結合性部位などのシス側調節領域、上流のオープンリーディングフレーム、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写開始部位、翻訳開始部位、ならびに／またはリーダー配列、終結コドン、翻訳停止部位、および３’側非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0089】

ある実施形態では、第１の核酸と、第２の核酸とは、同じ発現カセットへとクローニングされ、個別のプロモーターの制御下にある。別の実施形態では、第１の核酸と、第２の核酸とは、同じ発現カセットへとクローニングされ、同じプロモーターの制御下にある。この文脈では、単一のプロモーターは、２つのオープンリーディングフレームの発現を駆動する。別の実施形態では、第１の核酸と、第２の核酸とは、個別の発現カセットへとクローニングされる。本明細書で記載される発現系は、一部の文脈では、個別の発現ベクター内の、第１の核酸配列および第２の核酸配列の各々を含むので有利であることが理解されるものとする。したがって、ある実施形態では、発現系は、（ｉ）本明細書で記載される、第１の核酸配列を含む、第１の発現ベクターと、（ｉｉ）本明細書で記載される、第２の核酸配列を含む、第２の発現ベクターとを含む。

【0090】

本明細書で想定される発現カセットはまた、発現カセットにより感染させられるか、形質転換されるか、もしくはトランスフェクトされている宿主細胞、または発現カセットにより感染させられていないか、形質転換されていないか、もしくはトランスフェクトされていない宿主細胞の同定における使用のために適する、１つまたはそれ以上の選択用マーカー配列も含みうる。マーカーは、例えば、抗生剤または他の化合物に対する耐性または感受性を増大させるか、または低下させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が、当技術分野で公知である標準的アッセイにより検出可能である酵素（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子、および発現カセットを有する形質転換細胞またはトランスフェクト細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に、目視可能な影響を及ぼす遺伝子（例えば、緑色蛍光のタンパク質であるＧＦＰなど、多様な蛍光タンパク質）を含む。

【0091】

本開示はまた、本明細書で記載されるポリヌクレオチド組成物を含む宿主細胞へも拡張される。

【0092】

本明細書で使用された、宿主細胞は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド組成物を含む細胞を意味するように理解される。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞系、または哺乳動物細胞系でありうる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド組成物が投与される対象の内部の細胞である。

【0093】

宿主細胞は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド組成物を発現し、本明細書で記載される組換えタンパク質を産生しうるように、ベクターによりトランスフェクトされ、かつ／または感染させられる場合もあり、その後代の場合もある。

【0094】

適切な宿主細胞系は、当業者に公知であり、例えば、確立された細胞培養物コレクションを介して市販されている。次いで、このような細胞は、組換えｐｒｏＨｐを作製するのに使用されるか、または要求に応じて、他の使用のために使用される。例示的方法は、ポリヌクレオチド組成物（例えば、場合により、発現配列の制御下にある）を含む細胞を、組換えタンパク質の最適の作製を可能とする細胞培養条件下で培養し、次いで、当業者に公知である標準的技法を使用して、組換えタンパク質が、細胞または細胞培養物培地から単離される工程を含みうる。本開示はまた、組換えハプトグロビンベータ鎖およびそのヘモグロビン結合性断片の他、本明細書の他の箇所で記載される、１つまたはそれ以上の機能的部分のうちのいずれかを含む、本明細書で記載される、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを発現するように改変された培養哺乳動物細胞から単離された組換えタンパク質へも拡張される。

【0095】

本発明に従う発現系は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片とを含む、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐをコードする、第１の核酸配列を含む。ハプトグロビンベータ鎖のヘモグロビン結合性断片は、断片が、無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより、その生物学的活性を中和する能力を保持することを条件として、任意の適切な長さでありうる。Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐは、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間に、内部Ｃ１ｒ様タンパク質（Ｃ１ｒＬＰ）切断部位をさらに含む。好ましい実施形態では、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも１つのシステイン残基を含む。ある実施形態では、システイン残基は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基アミノ酸位置１４に配置される。ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基の中のシステイン残基は、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の発現および／または精製の一助となりうる、ジスルフィド結合がなければ遊離である、ベータ鎖のシステイン残基とのジスルフィド結合を形成しうると有利である。

【0096】

一部の実施形態では、哺乳動物細胞内のＮ末端切断型ｐｒｏＨｐの発現は、第１の核酸配列に作動可能に連結された、第１の哺乳動物調節配列により駆動され、哺乳動物細胞内のセリンプロテアーゼの発現は、第２の核酸配列に作動可能に連結された、第２の哺乳動物調節配列により駆動される。第１の哺乳動物調節配列は、第２の哺乳動物調節配列と同じ配列の場合もあり、異なる配列の場合もある。ある実施形態では、第１の哺乳動物調節配列は、第２の哺乳動物調節配列と異なる。

【0097】

本開示はまた、本明細書で記載される通り、哺乳動物細胞内で、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製するための発現ベクターへも拡張される。ベクターは、本明細書で記載される、第１の核酸配列と、本明細書で記載される、第２の核酸配列とを含みうる。第１の核酸と、第２の核酸とは、同じ哺乳動物調節配列に作動可能に連結されている場合もあり、異なる哺乳動物調節配列に作動可能に連結されている場合もある。したがって、一部の実施形態では、第１の核酸配列と、第２の核酸配列とは、共通の哺乳動物調節配列に作動可能に連結されている。他の実施形態では、第１の核酸配列は、第１の哺乳動物調節配列に作動可能に連結され、第２の核酸配列は、第２の哺乳動物調節配列に作動可能に連結され、この場合、第１の哺乳動物調節配列は、第２の哺乳動物調節配列と異なる。本明細書の他の箇所で言及される通り、本開示はまた、（ｉ）本明細書で記載される、第１の核酸配列を含む、第１の発現ベクターと、（ｉｉ）本明細書で記載される、第２の核酸配列を含む、第２のベクターとを含む発現系へも拡張される。第１の核酸配列および第２の核酸配列は各々、本明細書で記載される通り、調節配列、好ましくは、哺乳動物調節配列に作動可能に連結されている。

【0098】

本開示はまた、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を作製する方法であって、哺乳動物細胞へと、本明細書で記載される発現系または本明細書で記載される発現ベクター（複数可）を導入する工程を含む方法へも拡張される。当業者は、発現系または発現ベクター（複数可）を、哺乳動物細胞へと導入する適切な方法について熟知しているであろう。例えば、生物学的トランスフェクション法（例えば、ウイルス媒介型トランスフェクション法）、化学的トランスフェクション法（例えば、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、またはカチオン性アミノ酸によるトランスフェクション法）または物理的トランスフェクション法（例えば、直接的な注射、バイオリスティック法による粒子送達、電気穿孔、レーザー照射、超音波穿孔、または磁気ナノ粒子によるトランスフェクション法）が利用される。ある実施形態では、発現系または発現ベクター（複数可）の、哺乳動物細胞への導入は、カチオン性、脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して達成される。

【0099】

本明細書で記載される発現系またはベクター（複数可）が、哺乳動物細胞へと導入され、細胞が、適切な条件下で培養される場合、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐおよびセリンプロテアーゼは、細胞内で発現される。理論または特定の適用方式に限定されずに述べると、発現時に、発現されたセリンプロテアーゼは、Ｃ１ｒＬＰ切断部位の内部で発現されるＮ末端切断型ｐｒｏＨｐを切断し、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐから放出することが理解される。細胞は、組換えハプトグロビンベータ鎖、またはそのヘモグロビン結合性断片の作製を可能とするのに十分な条件下で、これに十分な時間にわたり培養されると適切であろう。当業者は、市販の細胞培養培地を含む、適切な培養条件および培養培地について熟知しており、それについての例示的な例は、例えば、ＬａｕｒｅｎｔｉおよびＯｏｉ（２０１３、９９８：１０．１００７／９７８－１－６２７０３－３５１－０＿２、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；ならびにＫａｕｆｍａｎ ＲＪ（２０００、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：１５１～１６０）において記載されている。組換えタンパク質発現の反応速度解析は哺乳動物細胞型の間で変動しうることに留意して、本明細書で開示される発現系を有する哺乳動物細胞内の組換えタンパク質の適切な発現を可能とするのに十分な培養条件および時間は、利用される哺乳動物細胞（複数可）の種類に依存することに留意されたい。いずれにせよ、培養条件および培養時間は、規定の実験により最適化される。

【0100】

適切な哺乳動物細胞の非限定例は、本明細書の他の箇所に記載されており、ヒト細胞、ウシ科動物細胞、ヒツジ科動物細胞、ウマ科動物細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、モルモット細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、またはマウス細胞、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、およびマウス骨髄腫細胞を含む。適切な哺乳動物細胞の、他の例示的な例は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＣＡＤ細胞、Ｐ１９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｎ２ａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｙ７９細胞、ＳＯ－Ｒｂ５０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＤＵＫＸ－Ｘ１１細胞、Ｊ５５８Ｌ細胞、およびＢＨＫ細胞を含む。ある実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト胎児細胞、好ましくは、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）である。

【0101】

本発明は、本明細書で記載される発現系を運ぶように改変された哺乳動物細胞をさらに提供する。

【0102】

組換えハプトグロビンベータ鎖、またはそのヘモグロビン結合性断片は、当技術分野で公知である、任意の適切な方法を使用して単離および精製される。一部の例では、精製は、実施例において例示されるタンデムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにより実施される。

【0103】

第２の核酸配列によりコードされる酵素
本明細書の他の箇所で言及される通り、本明細書で開示される発現系は、本明細書で記載される酵素切断部位において、第１の核酸配列によりコードされる、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを切断することが可能である酵素をコードする、第２の核酸配列を含む。したがって、第２の核酸配列によりコードされる酵素の選出は、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐの、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基と、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片との間の、内部酵素切断部位に依存することが理解されるであろう；すなわち、第２の核酸配列によりコードされる酵素は、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、哺乳動物細胞内で発現されると、酵素切断部位において、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを、適切に切断することが可能であるように、内部酵素切断部位と適合性となるであろう。当業者は、適切な内部酵素切断部位について熟知しており、フーリン切断部位、非天然のセリンプロテアーゼ切断部位、システインプロテアーゼ切断部位、アスパラギン酸プロテアーゼ切断部位、メタロプロテアーゼ切断部位、およびトレオニンプロテアーゼ切断部位など、それについての例示的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。ある実施形態では、本明細書で記載される、発現系の第２の核酸配列によりコードされる酵素は、フーリン、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびトレオニンプロテアーゼからなる群から選択される。ある実施形態では、本明細書で記載される、発現系の第２の核酸配列によりコードされる酵素は、セリンプロテアーゼである。

【0104】

当業者は、適切なセリンプロテアーゼについて熟知しており、それについての例示的な例は、例えば、Ｄｉ Ｃｅｒａ（ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ、２００９、６１（５）：５１０～５１５）において記載されている。ある実施形態では、セリンプロテアーゼは、Ｃ１ｒ様セリンプロテアーゼであるＣ１ｒＬＰまたはその機能的変異体である。Ｃ１ｒＬＰに関して使用される場合の、「機能的変異体」という用語は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を含む、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入により、その天然の対応物と異なり、このような差違が、内部Ｃ１ｒＬＰ切断部位において、変異体が、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐを切断する能力を、実質的に変更しないアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼを含むように理解されるものとする。機能的変異体は、自然に存在する機能的変異体の場合もあり、当業者に公知の方法を使用する、組換えまたは合成による（例えば、化学合成により作製される）機能的変異体の場合もある。Ｃ１ｒＬＰの機能的変異体は、Ｃ１ｒＬＰアイソフォーム１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０５７６３０；配列番号４）、Ｃ１ｒＬＰアイソフォーム２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１２８４５６９；配列番号５）、Ｃ１ｒＬＰアイソフォーム３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１２８４５７１；配列番号６）、およびＣ１ｒＬＰアイソフォーム４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１２８４５７２；配列番号７）など、その例が当業者に公知である、自然に存在するアイソフォームへと拡張される。ある実施形態では、セリンプロテアーゼであるＣ１ｒＬＰは、配列番号４～７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。別の実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。別の実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。別の実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、例えば、最適のアライメントまたは最良適合解析の後で、配列番号４～７のうちのいずれか１つに対する、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも８６％、好ましくは、少なくとも８７％、好ましくは、少なくとも８８％、好ましくは、少なくとも８９％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９１％、好ましくは、少なくとも９２％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９４％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９７％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％、または、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣ１ｒＬＰである。ある実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、例えば、最適のアライメントまたは最良適合解析の後で、配列番号４に対する、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも８６％、好ましくは、少なくとも８７％、好ましくは、少なくとも８８％、好ましくは、少なくとも８９％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９１％、好ましくは、少なくとも９２％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９４％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９７％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％、または、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣ１ｒＬＰである。ある実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、例えば、最適のアライメントまたは最良適合解析の後で、配列番号５に対する、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも８６％、好ましくは、少なくとも８７％、好ましくは、少なくとも８８％、好ましくは、少なくとも８９％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９１％、好ましくは、少なくとも９２％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９４％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９７％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％、または、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣ１ｒＬＰである。ある実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、例えば、最適のアライメントまたは最良適合解析の後で、配列番号６に対する、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも８６％、好ましくは、少なくとも８７％、好ましくは、少なくとも８８％、好ましくは、少なくとも８９％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９１％、好ましくは、少なくとも９２％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９４％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９７％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％、または、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣ１ｒＬＰである。ある実施形態では、セリンプロテアーゼまたはその機能的変異体は、例えば、最適のアライメントまたは最良適合解析の後で、配列番号７に対する、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも８６％、好ましくは、少なくとも８７％、好ましくは、少なくとも８８％、好ましくは、少なくとも８９％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９１％、好ましくは、少なくとも９２％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９４％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９７％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％、または、好ましくは、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣ１ｒＬＰである。

【0105】

医薬組成物およびその使用
本開示はまた、本明細書で記載される方法に従い調製される、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含み、場合により、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物へも拡張される。

【0106】

本開示はまた、（ｉ）ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、および（ｉｉ）Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖を含み、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基を含み、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基は、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片と非連続であり、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片へと接合されている、組換えヘモグロビン結合性分子へも拡張される。「非連続的」とは、組換えヘモグロビン結合性分子が、天然ｐｒｏＨｐのアルファ鎖と、ベータ鎖とを架橋するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含まないことを意味する。

【0107】

ある実施形態では、組換えヘモグロビン結合性分子の、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖は、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片内のシステイン残基と、ハプトグロビンアルファ鎖の少なくとも１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基の中のシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により、本明細書で記載される、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片へと接合されている。ある実施形態では、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片は、配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６との、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0108】

別の実施形態では、ヘモグロビン結合性分子は、さらなる機能的部分をさらに含む。ある実施形態では、さらなる機能的部分は、Ｎ末端切断型ハプトグロビンアルファ鎖へと接合されている。当業者は、適切な機能的部分について熟知しており、それについての例示的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。ある実施形態では、さらなる機能的部分は、ヘム結合性部分、免疫グロブリンのＦｃドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片、およびアルブミンからなる群から選択される。ある実施形態では、さらなる機能的部分は、ヘム結合性部分である。好ましい実施形態では、ヘム結合性部分は、ヘモペキシンまたはそのヘム結合性断片である。

【0109】

ある実施形態では、組成物は、約２μＭ～約２０ｍＭの組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含む。ある実施形態では、組成物は、約２μＭ～約５ｍＭの組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含む。ある実施形態では、組成物は、約１００μＭ～約５ｍＭの組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片、またはこれらの機能的類似体を含む。ある実施形態では、組成物は、約２μＭ～約３００μＭの組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含む。ある実施形態では、組成物は、約５μＭ～約５０μＭの組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含む。ある実施形態では、組成物は、約１０μＭ～約３０μＭの組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を含む。

【0110】

本明細書で開示される医薬組成物は、任意の適切な投与経路のために製剤化され、その例示的な例は、血管内投与、髄腔内投与、頭蓋内投与、および脳室内投与を含む。

【0111】

ある実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、髄腔内投与のために製剤化される。当業者は、適切な髄腔内送達系について熟知しており、それについての例示的な例は、その内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｋｉｌｂｕｒｎら（２０１３、「Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」、Ｒｕｄｅｋ Ｍ．、Ｃｈａｕ Ｃ．、Ｆｉｇｇ Ｗ．、ＭｃＬｅｏｄ Ｈ．（編）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）により記載されている。

【0112】

別の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、頭蓋内投与のために製剤化される。当業者は、適切な頭蓋内送達系について熟知しており、それについての例示的な例は、その内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｕｐａｄｈｙａｙら（２０１４、ＰＮＡＳ、１１１（４５）：１６０７１～１６０７６）により記載されている。

【0113】

別の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、脳室内投与のために製剤化される。当業者は、適切な脳室内送達系について熟知しており、それについての例示的な例は、その内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｃｏｏｋら（２００９、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ．２９（７）：８３２～８４５）により記載されている。

【0114】

本開示はまた、本明細書で記載される医薬組成物の単位剤形へも拡張される。適切な医薬組成物およびその単位剤形は、さらなる活性化合物または主要成分を伴うか、またはこれを伴わずに、常套的比率で常套的成分を含むことが可能であり、このような単位剤形は、利用されることが意図される、毎日の投与量範囲に見合う、任意の適切な有効量の有効成分を含有しうる。

【0115】

本明細書で記載される組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、およびこれを含む医薬組成物は、出血性脳卒中、鎌状赤血球病、赤血球溶解、および異常ヘモグロビン症を含むがこれらに限定されない、無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態の処置のために使用される。

【0116】

出血性脳卒中は、典型的に、局所的出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）（出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ））を引き起こす、脳内血管の破断により特徴付けられる。出血の位置は、変動する場合があり、出血性脳卒中の種類は、この位置により特徴付けられる。出血性脳卒中の例は、ｉ）脳内血管の破裂を伴う、脳内出血；ｉｉ）脳血管系への出血である、脳室内出血；およびｉｉｉ）くも膜下腔として公知である、脳と、脳を覆う組織との間の空隙内の出血を伴う、くも膜下出血（ＳＡＨ）を含む。ＳＡＨは、動脈瘤性くも膜下出血（ａＳＡＨ）と称される、動脈瘤破裂により引き起こされることが最も多い。ＳＡＨの他の原因は、頭部損傷、出血障害、および抗凝血剤の使用を含む。出血性脳卒中は、当業者が熟知している通り、自然経過、評価、および管理が異なる、ある範囲の病態からなる。一般に、病因に応じて、原発性出血性脳卒中、または続発性出血性脳卒中と類別される。

【0117】

当業者は、対象における出血性脳卒中を診断し、特に、ＳＡＨを診断する方法について熟知しており、それについての例示的な例は、脳血管造影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ならびに対象のＣＳＦ中における、ｏｘｙＨｂおよびビリルビンについての分光光度解析（例えば、Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ ＡＭ．、２００１、「ＡＣＰ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｏ １６６」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、５４（１１）：８２７～８３０を参照されたい）を含む。

【0118】

当業者により、出血性脳卒中は、自発性出血（例えば、動脈瘤の破裂の結果としての）の場合もあり、外傷性出血（例えば、頭部に対する外傷の結果としての）の場合もあることが理解されるであろう。ある実施形態では、出血性脳卒中は、また、非外傷性出血としても公知である、自発性出血である。ある実施形態では、出血性脳卒中は、外傷性出血である。

【0119】

一部の実施形態では、出血性脳卒中は、脳室内出血またはくも膜下出血である。くも膜下出血は、動脈瘤性くも膜下出血（ａＳＡＨ）でありうる。

【0120】

異常ヘモグロビン症とは、ヘモグロビンに影響を及ぼす遺伝子異常により特徴付けられる遺伝性障害群である。これらの異常は、αグロビン遺伝子内、またはβグロビン遺伝子内の、突然変異および／または欠失により引き起こされる。異常ヘモグロビン症の例は、ヘモグロビン内の構造異常と関連する、鎌状赤血球病、およびヘモグロビン産生の不全と関連する、サラセミアを含む。赤血球溶解および無細胞Ｈｂの放出と関連する、他の異常ヘモグロビン症も、当業者に公知である。αグロビン鎖合成の欠損と関連するのか、βグロビン鎖合成の欠損と関連するのかに応じて、広く、αサラセミアおよびβサラセミアとして類別されるサラセミアには、多くの形態が見られる。異常ヘモグロビン症の各障害は、当業者が熟知している通り、自然経過、評価、および管理が異なる、固有かつ高度に可変的な病態と関連する。当業者は、対象における異常ヘモグロビン症を診断する方法について熟知しているであろう。例えば、診断は、赤血球指数を伴う赤血球数、ならびにヘモグロビンについての電気泳動および／またはクロマトグラフィーなどのヘモグロビン検査に続き、該当する場合におけるＤＮＡ検査を伴いうる。

【0121】

一部の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病である。他の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、サラセミアである。サラセミアは、α－サラセミアの場合もあり、β－サラセミアの場合もある。

【0122】

当業者は、本明細書で開示される組換えハプトグロビンベータ鎖もしくはそのヘモグロビン結合性断片、または医薬組成物が、無細胞Ｈｂと関連する、任意の疾患、状態、または障害の処置または防止における使用に適することを理解するであろう。このような疾患、状態、および障害は、当業者に公知である。

【0123】

本明細書で使用される、「治療有効量」という用語は、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の量または濃度が、Ｈｐが、存在する無細胞Ｈｂに結合し、この無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能とし、これにより、中和しなければ有害である、無細胞Ｈｂの生物学的作用を中和するのに十分であることを意味する。当業者により、ペプチドの治療有効量は、それらについての例示的な例が、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、対象へと、直接投与（例えば、血管内投与、髄腔内投与、頭蓋内投与、または脳室内投与）されるのか、医薬組成物として投与されるのか、処置される対象の健康状態および全身状態、処置される対象の分類群、状態の重症度（例えば、出血の程度）、投与経路、中和される無細胞Ｈｂの濃度および／または量、ならびに前出のうちのいずれかの組合せを含む、いくつかの因子に応じて変動しうることが理解されるであろう。

【0124】

本明細書では、「～を処置すること」、「処置」、「～を処置する」などの用語は、無細胞Ｈｂと関連する状態と関連する１つまたはそれ以上の症状を和らげるか、最小化するか、軽減するか、緩和するか、改善するか、または他の形で阻害することを意味するように、互換的に使用される。本明細書では、「～を処置すること」、「処置」などの用語はまた、無細胞Ｈｂと関連する状態の発生を防止すること、または無細胞Ｈｂと関連する状態を発症する素因があるか、もしくはこの危険性があるが、未だ、それを有すると診断されていない対象における、無細胞Ｈｂと関連する状態の発症もしくは後続の進行を遅延させることを意味するようにも、互換的に使用される。この文脈では、「～を処置すること」、「処置」などの用語は、「予防」、「予防的」、および「防止的」などの用語と、互換的に使用される。しかし、本明細書で開示される方法は、処置される対象において、無細胞Ｈｂと関連する状態が生じることを、完全に防止する必要はないことを理解されたい。本明細書で開示される方法は、対象における無細胞Ｈｂと関連する状態を、処置の非存在下で、それらが他の形で観察される場合より、症状の減少および／または有害症状の重症度の低下が見られる程度に和らげるか、軽減するか、緩和するか、改善するか、または他の形で阻害すれば十分でありうる。したがって、本明細書で記載される方法は、無細胞Ｈｂと関連する状態の数および／または重症度を低減しうる。

【0125】

組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、典型的に、当業者により決定される、比較的広範な範囲内に収まるであろう。組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の適切な治療有効量についての例示的な例は、約２μＭ～約２０ｍＭ、好ましくは、約２μＭ～約５ｍＭ、好ましくは、約１００μＭ～約５ｍＭ、好ましくは、約２μＭ～約３００μＭ、好ましくは、約５μＭ～約１００μＭ、好ましくは、約５μＭ～約５０μＭ、または、より好ましくは、約１０μＭ～約３０μＭを含む。

【0126】

ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、約２μＭ～約２０ｍＭである。ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、約２μＭ～約５ｍＭである。ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、約１００μＭ～約５ｍＭである。ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、約２μＭ～約３００μＭである。ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、約５μＭ～約５０μＭである。ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、約１０μＭ～約３０μＭである。

【0127】

ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、Ｈｂ中和される無細胞の濃度と、少なくとも等モル量である。出血性脳卒中の場合、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の治療有効量は、ＣＳＦ中に、約３μＭ～約３００μＭの無細胞Ｈｂを複合体化させるのに十分な量である。ＣＳＦ中の、無細胞Ｈｂの濃度を測定する、適切な方法は、当業者に公知であり、それについての例示的な例は、その内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ ＡＭ．、２００１、「ＡＣＰ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｏ １６６」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、５４（１１）：８２７～８３０；およびＨｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒ Ｍ．ら、２０１８、Ｗｏｒｌｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、１２０：ｅ６６０～ｅ６６６において記載されている。

【0128】

組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の投与量はまた、最適の治療応答をもたらすようにも調整される。例えば、いくつかの分割用量が、毎日の、毎週、もしくは他の適切な時間間隔で投与されるか、または投与量は、状況の要請により指し示されるのに応じて低減される。

【0129】

ある実施形態では、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の投与量は、無細胞Ｈｂを実質的に中和するのに十分である。「～を実質的に中和する」とは、本明細書で記載される、治療用組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の非存在下における、無細胞Ｈｂの生物学的効果と比較した、少なくとも１０％、好ましくは、約１０％～約２０％、好ましくは、約１５％～約２５％、好ましくは、約２０％～約３０％、好ましくは、約２５％～約３５％、好ましくは、約３０％～約４０％、好ましくは、約３５％～約４５％、好ましくは、約４０％～約５０％、好ましくは、約４５％～約５５％、好ましくは、約５０％～約６０％、好ましくは、約５５％～約６５％、好ましくは、約６０％～約７０％、好ましくは、約６５％～約７５％、好ましくは、約７０％～約８０％、好ましくは、約７５％～約８５％、好ましくは、約８０％～約９０％、好ましくは、約８５％～約９５％、または、最も好ましくは、約９０％～１００％の低減百分率として、主観的に、または定性的に表される、無細胞Ｈｂの量の低減であって、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の低減を含む低減を意味する。当業者は、無細胞Ｈｂの量が、（定性的に、または定量的に）測定または決定される方法について熟知しているであろう。

【0130】

本発明はまた、対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態を処置または防止する方法であって、それを必要とする対象へと、本明細書で記載される方法に従い調製された、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片が、無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより、無細胞Ｈｂを中和することを可能とするのに十分な期間にわたり投与する工程を含む方法も提供する。

【0131】

本明細書で記載されるハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、および医薬組成物は、当技術分野で公知である、任意の適切な方法により、対象へと投与される。例えば、本明細書で記載されるハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、および医薬組成物は、経口送達、注射による送達、非経口送達、皮下送達、静脈内送達、硝子体内送達、または筋内送達投与される。一部の実施形態では、ハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片、および医薬組成物はまた、持続送達のためにも製剤化される。

【0132】

ある実施形態では、方法は、対象へと、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、血管内投与する工程を含む。

【0133】

ある実施形態では、方法は、対象へと、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、頭蓋内投与する工程を含む。

【0134】

ある実施形態では、方法は、対象へと、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、髄腔内投与する工程を含む。ある実施形態では、方法は、対象の脊柱管へと、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、髄腔内投与する工程を含む。ある実施形態では、方法は、対象のくも膜下腔へと、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、髄腔内投与する工程を含む。

【0135】

ある実施形態では、方法は、対象へと、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片を、脳室内投与する工程を含む。

【0136】

本明細書で使用される、「対象」という用語は、処置または予防が所望される哺乳動物対象を指す。適切な対象の例示的な例は、霊長動物、とりわけ、ヒト、ネコおよびイヌなどの愛玩動物、ウマ、ロバなどの作業動物、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタなどの家畜、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの実験動物、ならびにシカ、ディンゴなど、動物園および野生動物公園における捕獲野生動物などの捕獲野生動物を含む。ある実施形態では、対象は、ヒトである。さらなる実施形態では、対象は、（ｉ）出生～約２歳、（ｉｉ）約２～約１２歳、または（ｉｉｉ）約１２～約２１歳の年齢の小児科患者である。

【0137】

本開示はまた、対象における無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する状態の処置または防止のための医薬の製造における、本明細書で記載される方法に従い調製される、治療有効量の、組換えハプトグロビンベータ鎖またはそのヘモグロビン結合性断片の使用へも拡張される。

【0138】

補助治療
本明細書で記載される、無細胞Ｈｂと関連する状態を処置または防止する方法は、無細胞Ｈｂと関連する状態を低減、阻害、防止するか、または他の形で緩和するようにデザインされた、１つまたはそれ以上の別の処置戦略と併せて、逐次的に実施されると適切な場合もあり、組み合わせて（例えば、同時に）実施されると適切な場合もある。ある実施形態では、本明細書で記載される方法は、対象へと、赤血球溶解および無細胞Ｈｂの放出と関連する状態を処置または防止するための、少なくとも１つのさらなる治療剤を投与する工程をさらに含む。当業者は、無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）と関連する、１つまたはそれ以上の状態を処置または防止するための、適切な補助治療および治療剤について熟知しており、それについての例示的な例は、
（ｉ）凝血障害の是正：例えば、ビタミンＫアンタゴニスト（ＶＫＡ）、新規経口抗凝血剤（ダビガトラン、リバーロキサバン、およびアピキサバンなどのＮＯＡＣ）、ＦＥＩＢＡ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｂｙｐａｓｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、および活性化組換え第ＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮製剤、活性炭、抗血小板療法（ＡＰＴ）、およびアスピリン単剤療法を使用する；
（ｉｉ）降圧：例えば、それについての例示的な例が、（ｉ）クロルサリドン、クロルチアジド、ジクロロフェンアミド、ヒドロフルメチアジド、インダパミド、およびヒドロクロロチアジドを含むチアジド；ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、およびトルセミドなどのループ利尿剤；アミロリドおよびトリアムテレンなどのカリウム保持剤；およびスピロノラクトン、エピレノンなどのアルドステロンアンタゴニストなどの利尿剤；（ｉｉ）アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、エスモロール、インデノロール、メタプロロール、ナドロール、ネビボロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、ソタロール、テルタトロール、チリソロール、およびチモロールなどのベータ遮断剤；（ｉｉｉ）アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、ベプリジル、シナルジピン、クレビジピン、ジルチアゼム、エホニジピン、フェロジピン、ガロパミル、イスラジピン、ラシジピン、レミルジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモデピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、マニジピン、プラニジピン、およびベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断剤；（ｉｖ）ベナゼプリル；カプトプリル；シラザプリル；デラプリル；エナラプリル；ホシノプリル；イミダプリル；ロシノプリル；モエキシプリル；キナプリル；キナプリラト；ラミプリル；ペリンドプリル；ペリンドロプリル；クァニプリル；スピラプリル；テノカプリル；トランドラプリル、およびゾフェノプリルなどのアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；（ｖ）オマパトリラト、カドキサトリルおよびエカドトリル、フォシドトリル、サムパトリラト、ＡＶＥ７６８８、ＥＲ４０３０などの中性エンドペプチダーゼ阻害剤；（ｖｉ）テゾセンタン、Ａ３０８１６５、およびＹＭ６２８９９などのエンドセリンアンタゴニスト；（ｖｉｉ）ヒドララジン、クロニジン、ミノキシジル、およびニコチニルアルコールなどの血管拡張剤；（ｖｉｉｉ）カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、プラトサルタン、タソサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、ならびにＥＸＰ－３１３７、ＦＩ６８２８Ｋ、およびＲＮＨ６２７０、などのアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト；（ｉｘ）ニプラジロール、アロチノロール、およびアモスラロールなどのα／β遮断剤；（ｘ）テラゾシン、ウラピジル、プラゾシン、ブナゾシン、トリマゾシン、ドキサゾシン、ナフトピジル、インドラミン、ＷＨＩＰ１６４、およびＸＥＮＯｌＯなどのアルファ１遮断剤；ならびに（ｘｉ）ロフェキシジン、チアメニジン、モキソニジン、リルメニジン、およびグアノベンズなどのアルファ２アゴニストを含む降圧剤；
（ｉｉ－ｂ）血管拡張剤：例えば、ヒドララジン（アプレゾリン）、クロニジン（カタプレス）、ミノキシジル（ロニテン）、ニコチニルアルコール（ロニアコール）、シドノン、およびニトロプルシドナトリウム；
（ｉｉｉ）発作、グルコース、および温度の管理：例えば、抗てんかん薬、血中グルコースレベルを制御するインスリン注入、正常体温の維持および低体温療法；
（ｉｖ）手術による処置：例えば、血腫除去（手術による血栓除去）、減圧開頭術（ＤＣ）、低侵襲手術（ＭＩＳ；大脳基底核出血の針吸引など）、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）を伴うＭＩＳ；
（ｖ）手術のタイミング：例えば、発症の４～９６時間後；
（ｖｉ）トロンビン阻害：例えば、ヒルジン、アルガトロバン、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、ナファモスタットメシル酸塩）；
（ｖｉｉ）ヘムおよび鉄毒性の防止：例えば、スズ－メソポルフィリンなどの非特異的ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）阻害剤、デフェロキサミンなどの鉄キレート剤；
（ｖｉｉｉ）ＰＰＡＲｇアンタゴニストおよびアゴニスト：例えば、ロシグリタゾン、１５ｄ－ＰＧＪ２、およびピオグリタゾン；
（ｉｘ）ミクログリア活性化の阻害：例えば、ツフツシン断片１～３（ミクログリア／マクロファージ阻害因子）またはミノサイクリン（テトラサイクリンクラスの抗生剤）；
（ｘ）Ｎｒｆ２（ＮＦ－ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ－２－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）の上方調節；
（ｘｉ）シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害：例えば、セレコキシブ（選択的ＣＯＸ－２阻害剤）；
（ｘｉｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼ；
（ｘｉｉｉ）ＴＮＦ－αモジュレーター：例えば、ＣＧＳ２１６８０などのアデノシン受容体アゴニスト、ＯＲＦ４－ＰＥなどのＴＮＦ－α特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド；
（ｘｉｖ）昇圧：例えば、カテコールアミン；および
（ｘｖ）ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害剤：例えば、抗体である、Ｍｔｓ５１０およびＴＡＫ－２４２（シクロヘキサン誘導体）
を含む。

【0139】

ある実施形態では、さらなる治療剤は、本明細書の他の箇所で記載される通り、Ｎ末端切断型ｐｒｏＨｐが、連結されているか、コンジュゲートされているか、テザリングされているか、または他の形で接合されている、１つまたはそれ以上の機能的部分である。ある実施形態では、さらなる治療剤は、免疫グロブリンＦｃ領域またはそのＦｃ受容体結合性断片、アルブミンまたはその断片、ヘモペキシン、トランスフェリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ－フェトタンパク質、ビタミンＤ結合性タンパク質、生理学的条件下で、アルブミンまたは免疫グロブリン定常領域に結合することが可能であるポリペプチド、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特に、免疫グロブリン定常領域およびその部分、好ましくは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合することが可能であるポリペプチド、ならびに前出のうちのいずれかの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、機能的部分は、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合性リガンド、例えば、脂肪酸鎖、および前出のうちのいずれかの組合せからなる群から選択される。

【0140】

ある実施形態では、さらなる治療剤は、血管拡張剤である。当業者は、適切な血管拡張剤について熟知しており、それについての例示的な例は、シドノンおよびニトロプルシドナトリウムを含む。したがって、本明細書で開示される、ある実施形態では、さらなる治療剤は、シドノンおよびニトロプルシドナトリウムからなる群から選択される。

【0141】

鎌状赤血球病およびα－サラセミアまたはβ－サラセミアなど、異常ヘモグロビン症の処置に適する補助治療は、骨髄移植および／または輸血を含む。鎌状赤血球病の症状を処置するのに使用される、さらなる治療剤は、鎮痛剤、抗生剤、ＡＣＥ阻害剤、ヒドロキシ尿素、Ｌ－グルタミン、鉄キレート剤、葉酸、ヘモグロビン酸素アフィニティーモジュレーター（例えば、ボクセロトール）、および抗体（例えば、クリザンルズマブ）を含みうる。

【0142】

当業者は、本明細書で記載される本発明が、具体的に記載された変動および改変以外の変動および改変の下に置かれることを承知しているであろう。本明細書で記載される本発明は、全てのこのような変動および改変を含むことが理解されるものとする。本発明はまた、本明細書で、個別に、または集合的に言及されるか、または指し示される、全てのこのような工程、構成、方法、組成物、および化合物、ならびに前記の工程または構成のうちのいずれか２つまたはそれ以上の、任意の組合せおよび全ての組合せも含む。

【0143】

ここで、例示だけを目的とすることが意図され、本明細書の前出で記載された一般性の範囲を限定することは意図されない、以下の実施例に言及しながら、本発明のある特定の実施形態が記載される。

【0144】

配列表：
配列番号１：ハプトグロビン２ＦＳヒトＨｐアイソフォーム１の前駆体であるｐｒｏＨｐ；ＮＰ＿００５１３４
1 MSALGAVIAL LLWGQLFAVD SGNDVTDIAD DGCPKPPEIA HGYVEHSVRY QCKNYYKLRT
61 EGDGVYTLND KKQWINKAVG DKLPECEADD GCPKPPEIAH GYVEHSVRYQ CKNYYKLRTE
121 GDGVYTLNNE KQWINKAVGD KLPECEAVCG KPKNPANPVQ RILGGHLDAK GSFPWQAKMV
181 SHHNLTTGAT LINEQWLLTT AKNLFLNHSE NATAKDIAPT LTLYVGKKQL VEIEKVVLHP
241 NYSQVDIGLI KLKQKVSVNE RVMPICLPSK DYAEVGRVGY VSGWGRNANF KFTDHLKYVM
301 LPVADQDQCI RHYEGSTVPE KKTPKSPVGV QPILNEHTFC AGMSKYQEDT CYGDAGSAFA
361 VHDLEEDTWY ATGILSFDKS CAVAEYGVYV KVTSIQDWVQ KTIAEN
配列番号２：ヒトＨｐアイソフォーム２の前駆体であるｐｒｏＨｐ；ＮＰ＿００１１１９５７４
1 MSALGAVIAL LLWGQLFAVD SGNDVTDIAD DGCPKPPEIA HGYVEHSVRY QCKNYYKLRT
61 EGDGVYTLNN EKQWINKAVG DKLPECEAVC GKPKNPANPV QRILGGHLDA KGSFPWQAKM
121 VSHHNLTTGA TLINEQWLLT TAKNLFLNHS ENATAKDIAP TLTLYVGKKQ LVEIEKVVLH
181 PNYSQVDIGL IKLKQKVSVN ERVMPICLPS KDYAEVGRVG YVSGWGRNAN FKFTDHLKYV
241 MLPVADQDQC IRHYEGSTVP EKKTPKSPVG VQPILNEHTF CAGMSKYQED TCYGDAGSAF
301 AVHDLEEDTW YATGILSFDK SCAVAEYGVY VKVTSIQDWV QKTIAEN
配列番号３：ヒトＨｐアイソフォーム３の前駆体であるｐｒｏＨｐ；ＮＰ＿００１３０５０６７
1 MSALGAVIAL LLWGQLFAVD SGNDVTDIAD DGCPKPPEIA HGYVEHSVRY QCKNYYKLRT
61 EGDGVYTLND KKQWINKAVG DKLPECEAVC GKPKNPANPV QRILGGHLDA KGSFPWQAKM
121 VSHHNLTTGA TLINEQWLLT TAKNLFLNHS ENATAKDIAP TLTLYVGKKQ LVEIEKVVLH
181 PNYSQVDIGL IKLKQKVSVN ERVMPICLPS KDYAEVGRVG YVSGWGRNAN FKFTDHLKYV
241 MLPVADQDQC IRHYEGSTVP EKKTPKSPVG VQPILNEHTF CAGMSKYQED TCYGDAGSAF
301 AVHDLEEDTW YATGILSFDK SCAVAEYGVY VKVTSIQDWV QKTIAEN
配列番号４：ヒトＣ１ｒ－ＬＰ；ＮＰ＿０５７６３０
1 MPGPRVWGKY LWRSPHSKGC PGAMWWLLLW GVLQACPTRG SVLLAQELPQ QLTSPGYPEP
61 YGKGQESSTD IKAPEGFAVR LVFQDFDLEP SQDCAGDSVT ISFVGSDPSQ FCGQQGSPLG
121 RPPGQREFVS SGRSLRLTFR TQPSSENKTA HLHKGFLALY QTVAVNYSQP ISEASRGSEA
181 INAPGDNPAK VQNHCQEPYY QAAAAGALTC ATPGTWKDRQ DGEEVLQCMP VCGRPVTPIA
241 QNQTTLGSSR AKLGNFPWQA FTSIHGRGGG ALLGDRWILT AAHTIYPKDS VSLRKNQSVN
301 VFLGHTAIDE MLKLGNHPVH RVVVHPDYRQ NESHNFSGDI ALLELQHSIP LGPNVLPVCL
361 PDNETLYRSG LLGYVSGFGM EMGWLTTELK YSRLPVAPRE ACNAWLQKRQ RPEVFSDNMF
421 CVGDETQRHS VCQGDSGSVY VVWDNHAHHW VATGIVSWGI GCGEGYDFYT KVLSYVDWIK
481 GVMNGKN
配列番号５：ヒトＣ１ｒ－ＬＰ；ＮＰ＿００１２８４５６９
1 MPGPRVWGKY LWRSPHSKGC PGAMWWLLLW GVLQACPTRG SVLLAQELPQ QLTSPGYPEP
61 YGKGQESSTD IKAPEGFAVR LVFQDFDLEP SQDCAGDSVT ISFVGSDPSQ FCGQQGSPLG
121 RPPGQREFVS SGRSLRLTFR TQPSSENKTA HLHKGFLALY QTVGALTCAT PGTWKDRQDG
181 EEVLQCMPVC GRPVTPIAQN QTTLGSSRAK LGNFPWQAFT SIHGRGGGAL LGDRWILTAA
241 HTIYPKDSVS LRKNQSVNVF LGHTAIDEML KLGNHPVHRV VVHPDYRQNE SHNFSGDIAL
301 LELQHSIPLG PNVLPVCLPD NETLYRSGLL GYVSGFGMEM GWLTTELKYS RLPVAPREAC
361 NAWLQKRQRP EVFSDNMFCV GDETQRHSVC QGDSGSVYVV WDNHAHHWVA TGIVSWGIGC
421 GEGYDFYTKV LSYVDWIKGV MNGKN
配列番号６：ヒトＣ１ｒ－ＬＰ；ＮＰ＿００１２８４５７１
1 MPGPRVWGKY LWRSPHSKGC PGAMWWLLLW GVLQACPTRG SVLLAQELPQ QLTSPGYPEP
61 YGKGQESSTD IKAPEGFAVR LVFQDFDLEP SQDCAGDSVT ISFVGSDPSQ FCGQQGSPLG
121 RPPGQREFVS SGRSLRLTFR TQPSSENKTA HLHKGFLALY QTVAVNYSQP ISEASRGSEA
181 INAPGDNPAK VQNHCQEPYY QAAAAASTPS LFLCLSSFTP QGHSPVQPQG PGKTDRMGRR
241 FFSVCLSADG QSPPLPRIRR PSVLPEPSWA TSPGKPSPVS TAVGAGPCWG TDGSSLLPTP
301 STPRTVFLSG RTRV
配列番号７：ヒトＣ１ｒ－ＬＰ；ＮＰ＿００１２８４５７２
1 MPGPRVWGKY LWRSPHSKGC PGAMWWLLLW GVLQACPTRG SVLLAQELPQ QLTSPGYPEP
61 YGKGQESSTD IKAPEGFAVR LVFQDFDLEP SQDCAGDSVT ISFVGSDPSQ FCGQQGSPLG
121 RPPGQREFVS SGRSLRLTFR TQPSSENKTA HLHKGFLALY QTVGECPSWG CREGASVPSH
181 DPGIFKP
配列番号８：Ｈｐα鎖の１４の連続Ｃ末端アミノ酸残基
VCGKPKNPANPVQR
配列番号９：ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）；ＮＰ＿０００４６８
1 MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF
61 EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP
121 ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF
181 FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV
241 ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK
301 ECCEKPLLEK SHCIAEVEND EMPADLPSLA ADFVESKDVC KNYAEAKDVF LGMFLYEYAR
361 RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE FKPLVEEPQN LIKQNCELFE
421 QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV
481 LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNRRP CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL
541 SEKERQIKKQ TALVELVKHK PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV
601 AASQAALGL
配列番号１０：ヒトＣＤ１６３；ＮＰ＿９８１９６１
1 MSKLRMVLLE DSGSADFRRH FVNLSPFTIT VVLLLSACFV TSSLGGTDKE LRLVDGENKC
61 SGRVEVKVQE EWGTVCNNGW SMEAVSVICN QLGCPTAIKA PGWANSSAGS GRIWMDHVSC
121 RGNESALWDC KHDGWGKHSN CTHQQDAGVT CSDGSNLEMR LTRGGNMCSG RIEIKFQGRW
181 GTVCDDNFNI DHASVICRQL ECGSAVSFSG SSNFGEGSGP IWFDDLICNG NESALWNCKH
241 QGWGKHNCDH AEDAGVICSK GADLSLRLVD GVTECSGRLE VRFQGEWGTI CDDGWDSYDA
301 AVACKQLGCP TAVTAIGRVN ASKGFGHIWL DSVSCQGHEP AIWQCKHHEW GKHYCNHNED
361 AGVTCSDGSD LELRLRGGGS RCAGTVEVEI QRLLGKVCDR GWGLKEADVV CRQLGCGSAL
421 KTSYQVYSKI QATNTWLFLS SCNGNETSLW DCKNWQWGGL TCDHYEEAKI TCSAHREPRL
481 VGGDIPCSGR VEVKHGDTWG SICDSDFSLE AASVLCRELQ CGTVVSILGG AHFGEGNGQI
541 WAEEFQCEGH ESHLSLCPVA PRPEGTCSHS RDVGVVCSRY TEIRLVNGKT PCEGRVELKT
601 LGAWGSLCNS HWDIEDAHVL CQQLKCGVAL STPGGARFGK GNGQIWRHMF HCTGTEQHMG
661 DCPVTALGAS LCPSEQVASV ICSGNQSQTL SSCNSSSLGP TRPTIPEESA VACIESGQLR
721 LVNGGGRCAG RVEIYHEGSW GTICDDSWDL SDAHVVCRQL GCGEAINATG SAHFGEGTGP
781 IWLDEMKCNG KESRIWQCHS HGWGQQNCRH KEDAGVICSE FMSLRLTSEA SREACAGRLE
841 VFYNGAWGTV GKSSMSETTV GVVCRQLGCA DKGKINPASL DKAMSIPMWV DNVQCPKGPD
901 TLWQCPSSPW EKRLASPSEE TWITCDNKIR LQEGPTSCSG RVEIWHGGSW GTVCDDSWDL
961 DDAQVVCQQL GCGPALKAFK EAEFGQGTGP IWLNEVKCKG NESSLWDCPA RRWGHSECGH
1021 KEDAAVNCTD ISVQKTPQKA TTGRSSRQSS FIAVGILGVV LLAIFVALFF LTKKRRQRQR
1081 LAVSSRGENL VHQIQYREMN SCLNADDLDL MNSSGGHSEP H
配列番号１１：ヒトＬＲＰ１；ＮＰ＿００２３２３
1 MLTPPLLLLL PLLSALVAAA IDAPKTCSPK QFACRDQITC ISKGWRCDGE RDCPDGSDEA
61 PEICPQSKAQ RCQPNEHNCL GTELCVPMSR LCNGVQDCMD GSDEGPHCRE LQGNCSRLGC
121 QHHCVPTLDG PTCYCNSSFQ LQADGKTCKD FDECSVYGTC SQLCTNTDGS FICGCVEGYL
181 LQPDNRSCKA KNEPVDRPPV LLIANSQNIL ATYLSGAQVS TITPTSTRQT TAMDFSYANE
241 TVCWVHVGDS AAQTQLKCAR MPGLKGFVDE HTINISLSLH HVEQMAIDWL TGNFYFVDDI
301 DDRIFVCNRN GDTCVTLLDL ELYNPKGIAL DPAMGKVFFT DYGQIPKVER CDMDGQNRTK
361 LVDSKIVFPH GITLDLVSRL VYWADAYLDY IEVVDYEGKG RQTIIQGILI EHLYGLTVFE
421 NYLYATNSDN ANAQQKTSVI RVNRFNSTEY QVVTRVDKGG ALHIYHQRRQ PRVRSHACEN
481 DQYGKPGGCS DICLLANSHK ARTCRCRSGF SLGSDGKSCK KPEHELFLVY GKGRPGIIRG
541 MDMGAKVPDE HMIPIENLMN PRALDFHAET GFIYFADTTS YLIGRQKIDG TERETILKDG
601 IHNVEGVAVD WMGDNLYWTD DGPKKTISVA RLEKAAQTRK TLIEGKMTHP RAIVVDPLNG
661 WMYWTDWEED PKDSRRGRLE RAWMDGSHRD IFVTSKTVLW PNGLSLDIPA GRLYWVDAFY
721 DRIETILLNG TDRKIVYEGP ELNHAFGLCH HGNYLFWTEY RSGSVYRLER GVGGAPPTVT
781 LLRSERPPIF EIRMYDAQQQ QVGTNKCRVN NGGCSSLCLA TPGSRQCACA EDQVLDADGV
841 TCLANPSYVP PPQCQPGEFA CANSRCIQER WKCDGDNDCL DNSDEAPALC HQHTCPSDRF
901 KCENNRCIPN RWLCDGDNDC GNSEDESNAT CSARTCPPNQ FSCASGRCIP ISWTCDLDDD
961 CGDRSDESAS CAYPTCFPLT QFTCNNGRCI NINWRCDNDN DCGDNSDEAG CSHSCSSTQF
1021 KCNSGRCIPE HWTCDGDNDC GDYSDETHAN CTNQATRPPG GCHTDEFQCR LDGLCIPLRW
1081 RCDGDTDCMD SSDEKSCEGV THVCDPSVKF GCKDSARCIS KAWVCDGDND CEDNSDEENC
1141 ESLACRPPSH PCANNTSVCL PPDKLCDGND DCGDGSDEGE LCDQCSLNNG GCSHNCSVAP
1201 GEGIVCSCPL GMELGPDNHT CQIQSYCAKH LKCSQKCDQN KFSVKCSCYE GWVLEPDGES
1261 CRSLDPFKPF IIFSNRHEIR RIDLHKGDYS VLVPGLRNTI ALDFHLSQSA LYWTDVVEDK
1321 IYRGKLLDNG ALTSFEVVIQ YGLATPEGLA VDWIAGNIYW VESNLDQIEV AKLDGTLRTT
1381 LLAGDIEHPR AIALDPRDGI LFWTDWDASL PRIEAASMSG AGRRTVHRET GSGGWPNGLT
1441 VDYLEKRILW IDARSDAIYS ARYDGSGHME VLRGHEFLSH PFAVTLYGGE VYWTDWRTNT
1501 LAKANKWTGH NVTVVQRTNT QPFDLQVYHP SRQPMAPNPC EANGGQGPCS HLCLINYNRT
1561 VSCACPHLMK LHKDNTTCYE FKKFLLYARQ MEIRGVDLDA PYYNYIISFT VPDIDNVTVL
1621 DYDAREQRVY WSDVRTQAIK RAFINGTGVE TVVSADLPNA HGLAVDWVSR NLFWTSYDTN
1681 KKQINVARLD GSFKNAVVQG LEQPHGLVVH PLRGKLYWTD GDNISMANMD GSNRTLLFSG
1741 QKGPVGLAID FPESKLYWIS SGNHTINRCN LDGSGLEVID AMRSQLGKAT ALAIMGDKLW
1801 WADQVSEKMG TCSKADGSGS VVLRNSTTLV MHMKVYDESI QLDHKGTNPC SVNNGDCSQL
1861 CLPTSETTRS CMCTAGYSLR SGQQACEGVG SFLLYSVHEG IRGIPLDPND KSDALVPVSG
1921 TSLAVGIDFH AENDTIYWVD MGLSTISRAK RDQTWREDVV TNGIGRVEGI AVDWIAGNIY
1981 WTDQGFDVIE VARLNGSFRY VVISQGLDKP RAITVHPEKG YLFWTEWGQY PRIERSRLDG
2041 TERVVLVNVS ISWPNGISVD YQDGKLYWCD ARTDKIERID LETGENREVV LSSNNMDMFS
2101 VSVFEDFIYW SDRTHANGSI KRGSKDNATD SVPLRTGIGV QLKDIKVFNR DRQKGTNVCA
2161 VANGGCQQLC LYRGRGQRAC ACAHGMLAED GASCREYAGY LLYSERTILK SIHLSDERNL
2221 NAPVQPFEDP EHMKNVIALA FDYRAGTSPG TPNRIFFSDI HFGNIQQIND DGSRRITIVE
2281 NVGSVEGLAY HRGWDTLYWT SYTTSTITRH TVDQTRPGAF ERETVITMSG DDHPRAFVLD
2341 ECQNLMFWTN WNEQHPSIMR AALSGANVLT LIEKDIRTPN GLAIDHRAEK LYFSDATLDK
2401 IERCEYDGSH RYVILKSEPV HPFGLAVYGE HIFWTDWVRR AVQRANKHVG SNMKLLRVDI
2461 PQQPMGIIAV ANDTNSCELS PCRINNGGCQ DLCLLTHQGH VNCSCRGGRI LQDDLTCRAV
2521 NSSCRAQDEF ECANGECINF SLTCDGVPHC KDKSDEKPSY CNSRRCKKTF RQCSNGRCVS
2581 NMLWCNGADD CGDGSDEIPC NKTACGVGEF RCRDGTCIGN SSRCNQFVDC EDASDEMNCS
2641 ATDCSSYFRL GVKGVLFQPC ERTSLCYAPS WVCDGANDCG DYSDERDCPG VKRPRCPLNY
2701 FACPSGRCIP MSWTCDKEDD CEHGEDETHC NKFCSEAQFE CQNHRCISKQ WLCDGSDDCG
2761 DGSDEAAHCE GKTCGPSSFS CPGTHVCVPE RWLCDGDKDC ADGADESIAA GCLYNSTCDD
2821 REFMCQNRQC IPKHFVCDHD RDCADGSDES PECEYPTCGP SEFRCANGRC LSSRQWECDG
2881 ENDCHDQSDE APKNPHCTSQ EHKCNASSQF LCSSGRCVAE ALLCNGQDDC GDSSDERGCH
2941 INECLSRKLS GCSQDCEDLK IGFKCRCRPG FRLKDDGRTC ADVDECSTTF PCSQRCINTH
3001 GSYKCLCVEG YAPRGGDPHS CKAVTDEEPF LIFANRYYLR KLNLDGSNYT LLKQGLNNAV
3061 ALDFDYREQM IYWTDVTTQG SMIRRMHLNG SNVQVLHRTG LSNPDGLAVD WVGGNLYWCD
3121 KGRDTIEVSK LNGAYRTVLV SSGLREPRAL VVDVQNGYLY WTDWGDHSLI GRIGMDGSSR
3181 SVIVDTKITW PNGLTLDYVT ERIYWADARE DYIEFASLDG SNRHVVLSQD IPHIFALTLF
3241 EDYVYWTDWE TKSINRAHKT TGTNKTLLIS TLHRPMDLHV FHALRQPDVP NHPCKVNNGG
3301 CSNLCLLSPG GGHKCACPTN FYLGSDGRTC VSNCTASQFV CKNDKCIPFW WKCDTEDDCG
3361 DHSDEPPDCP EFKCRPGQFQ CSTGICTNPA FICDGDNDCQ DNSDEANCDI HVCLPSQFKC
3421 TNTNRCIPGI FRCNGQDNCG DGEDERDCPE VTCAPNQFQC SITKRCIPRV WVCDRDNDCV
3481 DGSDEPANCT QMTCGVDEFR CKDSGRCIPA RWKCDGEDDC GDGSDEPKEE CDERTCEPYQ
3541 FRCKNNRCVP GRWQCDYDND CGDNSDEESC TPRPCSESEF SCANGRCIAG RWKCDGDHDC
3601 ADGSDEKDCT PRCDMDQFQC KSGHCIPLRW RCDADADCMD GSDEEACGTG VRTCPLDEFQ
3661 CNNTLCKPLA WKCDGEDDCG DNSDENPEEC ARFVCPPNRP FRCKNDRVCL WIGRQCDGTD
3721 NCGDGTDEED CEPPTAHTTH CKDKKEFLCR NQRCLSSSLR CNMFDDCGDG SDEEDCSIDP
3781 KLTSCATNAS ICGDEARCVR TEKAAYCACR SGFHTVPGQP GCQDINECLR FGTCSQLCNN
3841 TKGGHLCSCA RNFMKTHNTC KAEGSEYQVL YIADDNEIRS LFPGHPHSAY EQAFQGDESV
3901 RIDAMDVHVK AGRVYWTNWH TGTISYRSLP PAAPPTTSNR HRRQIDRGVT HLNISGLKMP
3961 RGIAIDWVAG NVYWTDSGRD VIEVAQMKGE NRKTLISGMI DEPHAIVVDP LRGTMYWSDW
4021 GNHPKIETAA MDGTLRETLV QDNIQWPTGL AVDYHNERLY WADAKLSVIG SIRLNGTDPI
4081 VAADSKRGLS HPFSIDVFED YIYGVTYINN RVFKIHKFGH SPLVNLTGGL SHASDVVLYH
4141 QHKQPEVTNP CDRKKCEWLC LLSPSGPVCT CPNGKRLDNG TCVPVPSPTP PPDAPRPGTC
4201 NLQCFNGGSC FLNARRQPKC RCQPRYTGDK CELDQCWEHC RNGGTCAASP SGMPTCRCPT
4261 GFTGPKCTQQ VCAGYCANNS TCTVNQGNQP QCRCLPGFLG DRCQYRQCSG YCENFGTCQM
4321 AADGSRQCRC TAYFEGSRCE VNKCSRCLEG ACVVNKQSGD VTCNCTDGRV APSCLTCVGH
4381 CSNGGSCTMN SKMMPECQCP PHMTGPRCEE HVFSQQQPGH IASILIPLLL LLLLVLVAGV
4441 VFWYKRRVQG AKGFQHQRMT NGAMNVEIGN PTYKMYEGGE PDDVGGLLDA DFALDPDKPT
4501 NFTNPVYATL YMGGHGSRHS LASTDEKREL LGRGPEDEIG DPLA
配列番号１２：ヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ）；ＮＰ＿０００６０４
1 MARVLGAPVA LGLWSLCWSL AIATPLPPTS AHGNVAEGET KPDPDVTERC SDGWSFDATT
61 LDDNGTMLFF KGEFVWKSHK WDRELISERW KNFPSPVDAA FRQGHNSVFL IKGDKVWVYP
121 PEKKEKGYPK LLQDEFPGIP SPLDAAVECH RGECQAEGVL FFQGDREWFW DLATGTMKER
181 SWPAVGNCSS ALRWLGRYYC FQGNQFLRFD PVRGEVPPRY PRDVRDYFMP CPGRGHGHRN
241 GTGHGNSTHH GPEYMRCSPH LVLSALTSDN HGATYAFSGT HYWRLDTSRD GWHSWPIAHQ
301 WPQGPSAVDA AFSWEEKLYL VQGTQVYVFL TKGGYTLVSG YPKRLEKEVG TPHGIILDSV
361 DAAFICPGSS RLHIMAGRRL WWLDLKSGAQ ATWTELPWPH EKVDGALCME KSLGPNSCSA
421 NGPGLYLIHG PNLYCYSDVE KLNAAKALPQ PQNVTSLLGC TH
配列番号１３：Ｈｕ－ＬＲＰＡＰ１；ＮＰ＿００２３２８
1 MAPRRVRSFL RGLPALLLLL LFLGPWPAAS HGGKYSREKN QPKPSPKRES GEEFRMEKLN
61 QLWEKAQRLH LPPVRLAELH ADLKIQERDE LAWKKLKLDG LDEDGEKEAR LIRNLNVILA
121 KYGLDGKKDA RQVTSNSLSG TQEDGLDDPR LEKLWHKAKT SGKFSGEELD KLWREFLHHK
181 EKVHEYNVLL ETLSRTEEIH ENVISPSDLS DIKGSVLHSR HTELKEKLRS INQGLDRLRR
241 VSHQGYSTEA EFEEPRVIDL WDLAQSANLT DKELEAFREE LKHFEAKIEK HNHYQKQLEI
301 AHEKLRHAES VGDGERVSRS REKHALLEGR TKELGYTVKK HLQDLSGRIS RARHNEL
配列番号１４：Ｈｐ１のα鎖と、Ｈｐ２のα鎖とに共通であるアミノ酸配列
VDSGNDVTDIADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLN
配列番号１５：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のアミノ酸配列
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号１６：マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域のアミノ酸配列
APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
配列番号１７：Ｈｐ１のα鎖と、Ｈｐ２のα鎖とに共通であるアミノ酸配列
NEKQWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPANPVQR

【0145】

実施例
Ａ．略号

【表1】

【0146】

Ｂ．一般的手順
Ｂ．１．細胞の培養
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞および哺乳動物用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒ７９０－０７、Ｖ７９０－２０）から得た。細胞は、ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。全ての組織培養培地に、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：１５２４０－０９６）を補充し、細胞は、３７℃、８％ＣＯ_２の雰囲気を伴うインキュベーター内で維持した。

【0147】

Ｂ．２．抗体
Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体［ＦＩＴＣ］；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；型番：Ａ０１６２０
ヤギ抗ヒトＩｇＧ［ＦＩＴＣ］；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ハプトグロビンに対するポリクローナル抗体；Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；型番：ＡＰ０８５４６ＰＵ－Ｎ

【0148】

Ｂ．３．ｃＤＮＡプラスミドの作出
本明細書で使用される、多様なタンパク質のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）データベースに記録されており、受託番号を割り当てられている（下記の表１を参照されたい）。

【0149】

【表2】

【0150】

各々が、開始メチオニンのすぐ上流（＋１位）に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ１９８７）（ＧＣＣＡＣＣ）を伴うｃＤＮＡを、ヒトにおける発現のために、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりコドン最適化し、合成した。標準的なＰＣＲベースの突然変異誘発法を使用して、変異体分子を作出した。各ｃＤＮＡが完成したら、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へとライゲーションした。製造元の指示書に従い、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａキット（１２１９１）を使用して、プラスミドＤＮＡの大スケール調製を実行した。ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、両方の鎖をシーケンシングすることにより、全てのプラスミド構築物のヌクレオチド配列を検証した。

【0151】

Ｂ．４．組換えタンパク質の作出のための一過性トランスフェクション
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用する、発現プラスミドの一過性トランスフェクションは、製造元の指示書に従い、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。細胞は、１ｍｌ当たりの生存細胞１×１０^６個の最終濃度でトランスフェクトし、シェーキングインキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ）内、８％ＣＯ_２中、３７℃で、６日間にわたりインキュベートした。トランスフェクションの４時間後に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、０．１％ｖ／ｖの最終濃度まで添加した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養物に、ＬｕｃｒａＴｏｎｅ Ｌｕｐｉｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、０．５％ｖ／ｖの最終濃度まで補充した。細胞培養物上清を、２５００ｒｐｍにおける遠心分離により採取し、次いで、ｔｈｒｏｕｇｈ０．４５μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）内を流過させてから精製した。

【0152】

ＥｘｐｉＣＨＯ
ｈｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体結合性ドメインＩＩＩ（９０％）を、ｈｕＬＲＰＡＰ１（ｈｕｍａｎ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＲＡＰ、１０％）と併せてコードする発現プラスミドの、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を使用する、一過性トランスフェクションは、製造元の指示書に従い、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。細胞は、１ｍｌ当たりの生存細胞６×１０^６個の最終濃度でトランスフェクトし、シェーキングインキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ）内、８％ＣＯ_２中、３７℃で、２０時間にわたりインキュベートした。２０時間後、エンハンサー（商標）およびＦｅｅｄ（商標）を、培養物へと添加した。次いで、培養物を、３２℃、５％ＣＯ２、７０％の湿度で、さらに５日間にわたりインキュベートした。トランスフェクション後５日目に、第２のＦｅｅｄ（商標）を、培養物へと添加し、３２℃、５％ＣＯ２、湿度７０％のインキュベーターへと戻した。細胞培養物上清を、２５００ｒｐｍにおける遠心分離により採取し、次いで、ｔｈｒｏｕｇｈ０．４５μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）内を流過させてから精製した。培養物上清中における、組換えｈｕＬＲＰ１可溶性ミニ受容体の発現は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）により確認し、また、抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体［ＦＩＴＣ］、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、型番：Ａ０１６２０）を使用するウェスタンブロット解析によっても確認した。

【0153】

Ｂ．５．Ｈｉｓタグ付けタンパク質の精製
Ｈｐ（１４８～４０６）変異体
Ｈｉｓタグ付け組換えＨｐ（１４８～４０６）変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）上で精製した。具体的には、３０ｍｌのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、１０ｍＭのイミダゾール；２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４；５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で平衡化させた、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ）へとロードした。その後、５００ｍＭのイミダゾール；２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４；５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を使用する、保持ループへの溶出の前に、結合したＨｉｓタグ付けタンパク質を、２５ｍＭのイミダゾール；２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４；５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄して、非特異的相互作用タンパク質を低減した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳへの緩衝液交換のために、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラムから捕捉された溶出液を、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入した。

【0154】

０．２２ｕｍのフィルターを介する流過の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離限外濾過デバイス（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳ、ＵＳＡ）を使用して、全てのサイズの分子種を含有するタンパク質含有画分を、プールし、濃縮した。次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0155】

Ｈｐ（１６２～４０６）変異体
Ｈｉｓタグ付け組換えＨｐ（１６２～４０６）変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）上で精製した。具体的には、１～２ＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、１０ｍＭのイミダゾール；２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４；５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で平衡化させた、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ）へとロードした。その後、５００ｍＭのイミダゾール；２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４；５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を使用する、保持ループへの溶出の前に、結合したＨｉｓタグ付けタンパク質を、２５ｍＭのイミダゾール；２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４；５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄して、非特異的相互作用タンパク質を低減した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳ移動相中の、凝集物と、サイズ分子種との調製用分離のために、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラムから捕捉された溶出液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０ ＨｉＰｒｅｐサイズ除外カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入した。

【0156】

０．２２ｕｍのフィルターを介する流過の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離限外濾過デバイス（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳ、ＵＳＡ）を使用して、予測されたサイズのタンパク質を含有する画分を、プールし、濃縮した。次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0157】

Ｂ．６．アルブミン融合タンパク質の精製
マウスアルブミン融合タンパク質
Ｈｐ（１４８～４０６）変異体
マウスアルブミン（ＭＳＡ）融合型Ｈｐ（１４８～４０６）変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）上で精製した。具体的には、３０ｍｌのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中で平衡化させた、５ｍｌのＭｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ ｍｕｌｔｉ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｌｂｕｍｉｎアフィニティーカラム（Ａｓｔｒｅａ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）へとロードした。その後、３０ｍＭのオクタノエート；１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を使用する、保持ループへの溶出の前に、結合したＭＳＡ融合タンパク質を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄して、非特異的相互作用タンパク質を低減した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳへの緩衝液交換のために、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅカラムから捕捉された溶出液を、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入した。

【0158】

０．２２ｕｍのフィルターを介する流過の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離限外濾過デバイス（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳ、ＵＳＡ）を使用して、全てのサイズの分子種を含有するタンパク質含有画分を、プールし、濃縮した。次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0159】

Ｈｐ（１６２～４０６）変異体
ＭＳＡ融合型Ｈｐ（１６２～４０６）変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）上で精製した。具体的には、１～２ＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中で平衡化させた、５ｍｌのＭｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ ｍｕｌｔｉ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｌｂｕｍｉｎアフィニティーカラム（Ａｓｔｒｅａ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）へとロードした。その後、３０ｍＭのオクタノエート；１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を使用する、保持ループへの溶出の前に、結合したＭＳＡ融合タンパク質を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄して、非特異的相互作用タンパク質を低減した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳ移動相中の、凝集物と、サイズ分子種との調製用分離のために、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅカラムから捕捉された溶出液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０ ＨｉＰｒｅｐサイズ除外カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入した。

【0160】

０．２２ｕｍのフィルターを介する流過の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離限外濾過デバイス（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、予測されたサイズのタンパク質を含有する画分を、プールし、濃縮した。次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0161】

ヒトアルブミン融合タンパク質
Ｈｐ（１４８～４０６）変異体
ヒトアルブミン（ＨＳＡ）融合型Ｈｐ（１４８～４０６）変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、Ｊａｎｕｓ Ｇ３ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で精製した。具体的には、３．５ｍｌのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中で平衡化させた、２００μｌのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＨＳＡアフィニティーカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）へとロードした。その後、２ＭのＭｇＣｌ_２；２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）中における溶出の前に、結合したＨＳＡ融合タンパク質を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄して、非特異的相互作用タンパク質を低減した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳへの緩衝液交換のために、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＨＳＡアフィニティーカラムから回収された溶出液を、ＣｅｎｔｒｉＰｕｒｅ ９６脱塩アレイ（ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）へと分注した。脱塩試料は、それ以上濃縮しなかった。

【0162】

次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0163】

Ｈｐ（１６２～４０６）変異体
ＨＳＡ融合型Ｈｐ（１６２～４０６）変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）上で精製した。具体的には、１～２ＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中で平衡化させた、５ｍｌのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＨＳＡアフィニティーカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）へとロードした。その後、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）を使用する、保持ループへの溶出の前に、結合したＨＳＡ融合タンパク質を、１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄して、非特異的相互作用タンパク質を低減した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳ移動相中の、凝集物と、サイズ分子種との調製用分離のために、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＨＳＡアフィニティーカラムから捕捉された溶出液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０ ＨｉＰｒｅｐサイズ除外カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入した。

【0164】

０．２２ｕｍのフィルターを介する流過の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離限外濾過デバイス（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、予測されたサイズのタンパク質を含有する画分を、プールし、濃縮した。次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0165】

Ｂ．７．Ｆｃ融合タンパク質の精製
Ｈｐ（１４８～４０６）変異体
Ｈｐ Ｆｃ融合変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）上で精製した。具体的には、３０ｍｌのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、ＭＴ－ＰＢＳ中で平衡化させた、１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｃｃカラム（Ｃｙｔｉｖａ）へとロードした。その後、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用する、保持ループへの溶出の前に、結合したＦｃ融合タンパク質を、５００ｍＭのＬ－Ａｒｇ；１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄して、凝集物および内毒素を低減した。次いで、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｃｃカラムから捕捉された溶出液を、ＭＴ－ＰＢＳ中で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０サイズ除外カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入して、サイズにより、Ｈｐ分子種を分離した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳへの緩衝液交換のために、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅカラムから捕捉された溶出液を、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入した。

【0166】

０．２２ｕｍのフィルターを介する流過の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離限外濾過デバイス（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳ、ＵＳＡ）を使用して、全てのサイズの分子種を含有するタンパク質含有画分を、プールし、濃縮した。次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0167】

Ｈｐ（１６２～４０６）変異体
Ｈｐ Ｆｃ融合変異体を、タンデムクロマトグラフィーのための自動化法を使用する、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）上で精製した。具体的には、３０ｍｌのＥｘｐｉ２９３Ｆ上清を、ＭＴ－ＰＢＳ中で平衡化させた、５ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｃｃカラム（Ｃｙｔｉｖａ）へとロードした。その後、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用する、保持ループへの溶出の前に、結合したＦｃ融合タンパク質を、５００ｍＭのＬ－Ａｒｇ；１０ｍＭのトリス；１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄して、凝集物および内毒素を低減した。次いで、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｃｃカラムから捕捉された溶出液を、ＭＴ－ＰＢＳ中で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０サイズ除外カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入して、サイズにより、Ｈｐ分子種を分離した。次いで、ＭＴ－ＰＢＳ移動相中の、凝集物と、サイズ分子種との調製用分離のために、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅカラムから捕捉された溶出液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０ ＨｉＰｒｅｐサイズ除外カラム（Ｃｙｔｉｖａ）へと注入した。

【0168】

０．２２ｕｍのフィルターを介する流過の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離限外濾過デバイス（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、予測されたサイズのタンパク質を含有する画分を、プールし、濃縮した。次いで、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６システム（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、ＯＤ２８０により、タンパク質濃度を測定し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離により、純度を検証した。ＭＴ－ＰＢＳを移動相とする、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣへと接続された、解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１５／５０）サイズ除外カラムを使用して、溶液の高次分子種レベルを評価した。比較のために、１ｕｌの、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＡｑｕｅｏｕｓ ＳＥＣ１（ＡＬ０－３０４２）分子量標準物質を、解析の一部として試行にかけ、結果を重ね合わせた。

【0169】

Ｂ．８．ヘモグロビンの、新規タンパク質への結合の定性的測定
Ｈｂ結合性タンパク質を、ヒトヘモグロビン（ＨｂＡ）と共に、３７℃、異なる濃度で、１時間にわたりインキュベートした。ＨｂのＨｐ結合画分およびＨｐ非結合画分（無細胞Ｈｂ）は、ＬＰＧ－３４００ＳＤ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｐｕｍｐおよび光ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へと接合された、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＳＤ ＨＰＬＣを使用する、ＳＥＣ－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により決定した。血漿試料およびＨｂ標準物質は、流量を１ｍＬ／分とする移動相としてのＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｂｉｃｈｓｅｌ）により、Ｄｉｏｌ－３００（３μｍ、３００×８．０ｍｍ）カラム（ＹＭＣ ＣＯ Ｌｔｄ．）上で分離した。全ての試料について、２つの波長（λ＝２８０ｎｍおよびλ＝４１４ｎｍ）を記録した。血漿の結合Ｈｂおよび非結合Ｈｂは、両方のピークのピーク面積を計算することにより決定した（Ｈｂ：Ｈｐについて６分間の保持時間；無細胞Ｈｂについて８分間の保持時間）。

【0170】

Ｂ．９．ハプトグロビンのビオチニル化
ビオチニル化は、製造プロトコールに従い、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）ＮＨＳ－ＰＥＧ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキット（型番：２１４５０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により実施した。略述すると、タンパク質を、ＰＢＳ中で、０．５～０．２ｍｇ／ｍｌの間の濃度へと希釈した。蒸留水を、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎへと添加して、１ｍＭの溶液を作出した。目的の各タンパク質へと、以下：

【数1】

の通りに計算される、適量の１ｍＭビオチン試薬を添加する。

【0171】

反応物を、速やかに混合し、室温で、３０分間にわたりインキュベートした。反応は、平衡化させた脱塩カラムを使用する、１０００×ｇで、２分間ずつ、３回にわたる遠心分離を介して、過剰量のビオチン試薬を除去することにより停止させる。新たな回収チューブを取り付け、１０００×ｇで、２分間にわたり、ビオチニル化試料を、稠密樹脂ベッドの中心へゆっくりと適用して、試料を回収する。タンパク質濃度を計算した。

【0172】

Ｂ．１０．ヘモグロビンの、新規タンパク質への結合の定量的測定
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｒｅ－ｃｏａｔｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（型番：１８－５０１９；ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用した。異なるＨｐ変異体を、上で記載された通りにビオチニル化させ、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％のＢＳＡ、０．００２％のＴｗｅｅｎ２０）中、各実験について表示の濃度で固定化させた。Ｈｐ変異体を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％のＢＳＡ、０．００２％のＴｗｅｅｎ２０）中で希釈した。Ｈｐ変異体についての会合／解離反応速度解析は、各実験について表示のＨｂ濃度で実施した。各結合工程についての設定は、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓについての例としての、表２（「表２：Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ^＊について使用された、反応速度評価のためのＯｃｔｅｔＲＥＤ９６の実験設定」）において示される通りに選び出した。参照のための対照（リガンドを伴うが、解析物を伴わずにロードされたセンサー）を、あらゆる実験に組み入れた。データは、以下の設定によるＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上、３０℃で得た：

【0173】

【表3】

【0174】

データは、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）により解析した。データは、ｙ軸に照らしたベースラインアライメント、工程間補正、参照センサー減算、およびサビツキー－ゴーレイフィルタリングを介する曲線の平滑化を実施することにより加工した。加工された反応速度データセットは、１：１結合モデルを使用してグローバルフィッティングした。当てはめの精度は、測定結果が、データを解析するのに使用されるモデルから計算された結果に、どのくらいよく相似するのかを表すパラメータである、カイ２およびＲ^２により記載した。

【0175】

Ｂ．１１．ヘムの、新規タンパク質への結合の測定
ヘム結合法については、Ｌｉｐｉｓｋｉ、２０１３において記載されており、若干適合させた。略述すると、ヘム－アルブミン（ＰＢＳ中に１２．５μＭである）を、ヘム結合性タンパク質（例えば、ヒトヘモペキシン）と共にインキュベートした。ヘム－アルブミンの、ヘム－Ｈｐｘへの転移を、時間経過にわたり追跡するために、Ｃａｒｙ ６０ ＵＶ－ＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、一連のＵＶ－ＶＩＳスペクトルを記録した（３５０～６５０ｎｍ）。各時点について、反応混合物中のヘム－アルブミンおよびヘム－Ｈｐｘの濃度を、ＳｃｉＰｙによるローソン－ハンソンＮＮＬＳ（Ｎｏｎ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ）アルゴリズム（ｗｗｗ．ｓｃｉｐｙ．ｏｒｇ）を適用することによる、フルスペクトルのデコンボリューションにより分解した。ｍｅｔ－Ｈｂからの、ヘム喪失速度（急速速度および緩徐速度）を、Ｒ（ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用する非線形回帰により、以下の双指数関数モデル：

【数2】

を、データへと当てはめることにより計算した。

【0176】

Ｂ．１２．ＢＬＩによる、ＣＤ１６３クリアランス受容体への結合
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｒｅ－ｃｏａｔｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（型番：１８－５０１９；ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用した。ビオチニル化ヒトＣＤ１６３受容体を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％のＢＳＡ、０．００２％のＴｗｅｅｎ２０）中、各実験において表示の濃度で固定化させた。Ｈｐ：ヘモグロビン複合体を、アッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％のＢＳＡ）中で希釈した。ハプトグロビン：ヘモグロビンについての会合／解離反応速度解析は、各実験について表示のＨｂ濃度で実施した。各結合工程についての設定は、表において示される通りに選び出した。参照のための対照（リガンドを伴うが、解析物を伴わずにロードされたセンサー）を、あらゆる実験に組み入れた。データは、以下の表３の設定によるＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上、３０℃で得た：

【0177】

【表4】

【0178】

データは、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）により解析した。データは、ｙ軸に照らしたベースラインアライメント、工程間補正、参照センサー減算、およびサビツキー－ゴーレイフィルタリングを介する曲線の平滑化を実施することにより加工した。加工された反応速度データセットは、１：１結合モデルを使用してグローバルフィッティングした。当てはめの精度は、測定結果が、データを解析するのに使用されるモデルから計算された結果に、どのくらいよく相似するのかを表すパラメータである、カイ２およびＲ^２により記載した。

【0179】

Ｂ．１３．ＢＬＩによる、ＬＲＰ１クリアランス受容体断片への結合
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｒｅ－ｃｏａｔｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（型番：１８－５０１９；ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用した。ビオチニル化ＬＲＰ１／ＣＤ９１ドメイン３を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０）中、１５μｇ／ｍＬの濃度で固定化させた。ヘム－Ｈｐｘ複合体を、アッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％、０．１％のＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０）中で希釈した。ヘム－ヘモペキシン複合体についての会合／解離反応速度解析は、各実験について表示の濃度で実施した。各結合工程についての設定は、表４において示される通りに選び出した。参照のための対照（リガンドを伴うが、解析物を伴わずにロードされたセンサー）を、あらゆる実験に組み入れた。データは、以下の設定によるＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上、３０℃で得た：

【0180】

【表5】

【0181】

データは、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）により解析した。データは、ｙ軸に照らしたベースラインアライメント、工程間補正、参照センサー減算、およびサビツキー－ゴーレイフィルタリングを介する曲線の平滑化を実施することにより加工した。加工された反応速度データセットは、１：１結合モデルを使用してグローバルフィッティングした。当てはめの精度は、測定結果が、データを解析するのに使用されるモデルから計算された結果に、どのくらいよく相似するのかを表すパラメータである、カイ２およびＲ^２により記載した。

【0182】

Ｂ．１４．ＢＬＩ実験のための許容基準
正確な反応速度の当てはめのために、最大で１つのデータ点（合計で７つのデータ点のうち）を、計算から除外して、表５における基準を達成した。

【0183】

【表6】

【0184】

Ｃ．結果

【実施例1】

【0185】

野生型ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列およびプロセシング
Ｈｐを、小胞体内で、補体Ｃ１ｒ様タンパク質を介するタンパク質分解により、αサブユニット（９ｋＤａ）およびβサブユニット（３３ｋＤａ）へとプロセシングされ、これらが、ジスルフィド結合を介して連結されて、Ｈｐ単量体を形成する、単一のポリペプチド鎖（ｐｒｏＨｐ）として合成した。各Ｈｐ単量体タンパク質は、１つのＨｂ α－β二量体に結合しうる（Ｋ_ｄを１０^－１５として）。脱酸素化Ｈｂは、Ｈｐに結合しない。ヒトでは、Ｈｐは、それらのそれぞれのα鎖内だけにおいて異なる、すなわち、ベータ鎖は、不変体である、Ｈｐ１およびＨｐ２という、２つの対立遺伝子形態として存在する。Ｈｐ２対立遺伝子は、エクソン３と、エクソン４との重複により、Ｈｐ１対立遺伝子から生じる（ＹａｎｇＦら、１９８３、ＰＮＡＳ、８０（２１９）：５８７５～５８７９）。Ｈｐ１対立遺伝子は、Ｈｐ １Ｆ＝Ｄ６９ Ｋ７０およびＨｐ１Ｓ＝Ｎ６９ Ｅ７０を、本明細書で使用される番号付けの慣例とする、アルファ鎖内の２つのアミノ酸：Ａｓｐ５２Ａｓｎ、Ｌｙｓ５３Ｇｌｕだけ異なる、Ｈｐ １ＦおよびＨｐ １Ｓへとさらに細分される（ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｒａｔｅｎ Ａら、１９８４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１６８：１０３～１０７）。Ｈｐの構造を、図１に示す。

【実施例2】

【0186】

哺乳動物細胞内における、Ｈｕハプトグロビンベータ鎖タンパク質の作出
Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）－８Ｈｉｓ、およびＨｕハプトグロビン２ＦＳβ（１６２～４０６、Ｃ２６６Ａ）－８Ｈｉｓ
哺乳動物細胞内で作出されるＨｐのベータ断片を作出するために、ｃＤＮＡ構築物である、ヒトＨｐのベータ断片が、Ｈｐ ２ＦＳポリペプチド鎖内の、アミノ酸１６２におけるＣ１ｒＬＰ切断部位の直後において開始される、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）－８Ｈｉｓをデザインした（図３Ａ、図４Ａ）。アミノ酸２６６における不対合システインが、アラニンへと突然変異させられた、さらなる変異体である、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳβ（１６２～４０６、Ｃ２６６Ａ）－８Ｈｉｓ（Ｃ２６６Ａ、図４Ａ）もまた作出した。これらの発現構築物の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞への、一過性トランスフェクションが、いかなるタンパク質も作出できなかったことは、β鎖の構造が破壊されたため、哺乳動物細胞内で不安定であったことを指し示す（図４Ｂ）。

【0187】

Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ
Ｃ１ｒＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片構築物である、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓを作出し（図４Ｂ）、これらを、α鎖の残りのＮ末端アミノ酸のプロセシングを可能とする、Ｃ１ｒＬＰをコードする構築物と併せて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。融合パートナーが、ベータ断片に対してＮ末端側に配置され、ドメイン間ジスルフィド結合を介して連結されている、将来的なタンパク質の作出を可能とするように、プロセシングを保持した。図４Ｃは、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）－８Ｈｉｓ、およびＨｕハプトグロビン２ＦＳβ（１６２～４０６、Ｃ２６６Ａ）－８Ｈｉｓと対照的に、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓのロバストな発現が観察されたことを示す。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラムを使用する、精製培養物上清についてのサイズ除外クロマトグラフィー解析（さらなる脱塩工程と組み合わされた、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー）は、タンパク質が、凝集を伴わずに均質であることを指し示した（図４Ｄ）。タンパク質の純度、および適正なプロセシングは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により検証した（図４Ｄ）。

【実施例3】

【0188】

哺乳動物細胞内における、Ｎ末端融合パートナーまたはＣ末端融合パートナーを伴うＨｕハプトグロビンベータ鎖タンパク質変異体の作出
Ｎ末端またはＣ末端において、ヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ）、Ｈｐｘ＋マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、またはヒトＨｐｘ＋Ｆｃ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインと融合された、ｈｕハプトグロビンベータ鎖（１６２～４０６または１４８～４０６）をコードする、一連のタンパク質を作出した（図５Ａおよび５Ｂ）。融合パートナーが、ベータ断片（アミノ酸１４８～４０６）に対してＮ末端側に配置され、ドメイン間ジスルフィド結合を介して連結されている、将来的なタンパク質の作出を可能とするように、プロセシングを保持した。

【0189】

ヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の作出
Ｎ末端におけるヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ；アミノ酸１～４６２；配列番号１２）に続き、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含有する、一連の構築物を作出し、次いで、配列番号１のアミノ酸１６２～４０６に対応するヒトＨｐベータ断片（図６Ａｉ）；配列番号１のアミノ酸残基２６６に対応する位置における不対合システインが、アラニンへと突然変異させられた、配列番号１のアミノ酸１６２～４０６に対応するヒトＨｐベータ断片（図６Ａｉｉ）；およびＣ１ｒ－ＬＰ切断部位（配列番号４）と、鎖内ジスルフィド結合の形成のために要求されるシステインを保持する、配列番号１のアミノ酸１４８～４０６に対応するヒトＨｐベータ断片（図６Ａｉｉｉ）と融合した。Ｈｐアルファ鎖と、Ｈｐベータ鎖との接合部におけるプロセシングを可能とするＣ１ｒ－ＬＰをコードする構築物との比を、９０：１０として、ハプトグロビンのアミノ酸１４８～４０６を含有する構築物を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトした。図６Ｂは、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）またはＨｕハプトグロビン（１６２～４０６、Ｃ２６６Ａ）を含有するＨｐｘ構築物と対照的に、構築物であるＨｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－Ｈｉｓのロバストな発現、および予測された部位における、Ｃ１ｒ－ＬＰによるタンパク質分解性切断が観察されたことを示す。精製培養物上清についての解析用ＳＥＣ（脱塩を後続させる、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー）は、Ｈｕヘモペキシン（１～４６２）－Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）－８Ｈｉｓについて観察されたブロードピーク（図６Ｃｉ）と比較して、Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－Ｈｉｓは、凝集が劇的に低減された、予測サイズの均質タンパク質（図６Ｃｉｉ）として作製されたことを指し示した。タンパク質の純度、および適正なプロセシングは、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、および非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により検証した（図６Ｃｉｉｉ）。

【0190】

ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の作出
Ｎ末端リンカーにおけるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有し、次いで、介在１３×Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを伴う、アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片（図７Ａｉ）；アミノ酸２６６における不対合システインが、アラニンへと突然変異させられた、アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片、および介在１３×Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（図７Ａｉｉ）；Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片（図７Ａｉｉｉ）と融合された、一連の構築物を作出し、これらを、この部位を含有する構築物のための、α鎖の残りのＮ末端アミノ酸のプロセシングを可能とするＣ１ｒ－ＬＰをコードする構築物と併せて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。図７Ｂは、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）またはＨｕハプトグロビン（１６２～４０６、Ｃ２６６Ａ）を含有するＨＳＡ構築物と対照的に、構築物であるＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）のロバストな発現、および予測された部位における、Ｃ１ｒ－ＬＰによるタンパク質分解性切断が観察されたことを示す。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラムを使用する、精製培養物上清についての解析用ＳＥＣ解析（さらなる脱塩工程と組み合わされた、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー）は、ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）が、均質であり、凝集も、ほぼ無視できる程度であることを指し示した（図７Ｃｉｉ）。これに対し、調製用ＳＥＣクロマトグラムは、予測サイズ（矢印により指し示される）のＨＳＡ－ＧＳ１３－Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）が、極めて少量であり、作製された素材の大部分が、多量体化されるか、または凝集させられたことを示す（図７Ｃｉ）。タンパク質の純度、および適正なプロセシングは、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、および非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により検証した（図７Ｃｉｉｉ）。

【0191】

Ｆｃ－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の作出
アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片（図８Ａｉ）へと融合された、Ｎ末端におけるヒトＩｇＧ１Ｆｃを含有する構築物；およびＣ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片へと融合された、マウスＩｇＧ２ａＦｃを含有する構築物を作出し（図８Ａｉｉ）；これらを、この部位を含有する構築物のための、α鎖の残りのＮ末端アミノ酸のプロセシングを可能とする、Ｃ１ｒＬＰをコードする構築物と併せて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。図８Ｂは、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）を含有するＦｃ構築物と対照的に、構築物であるＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）の発現、および予測された部位における、Ｃ１ｒ－ＬＰによるタンパク質分解性切断が観察されたことを示す。ＨｕＩｇＧ１Ｆｃ－Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）構築物からは、いかなるタンパク質も発現されず、精製されなかった。これに対し、ｍｕＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）は、ロバストに発現され、Ｃ１ｒ－ＬＰにより、適正にプロセシングされ、アフィニティー精製された素材についての解析用ＳＥＣは、Ｆｃ二量体について、予測サイズの主要ピークを明らかにした。しかし、発現された融合タンパク質は、均質ではなく、高分子量の分子種、および低分子量の分子種の両方を含有した（図８Ｃｉｉ）。

【0192】

ヘモペキシン－ＭＳＡ－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の作出
Ｎ末端におけるヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ；アミノ酸１～４６２）に続き、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を含有し、次いで、アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片（図９Ａｉ）；アミノ酸１６２～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片、またはＣ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片（図９Ａｉｉ）へと融合された構築物を作出し；これらを、この部位を含有する構築物のための、α鎖の残りのＮ末端アミノ酸のプロセシングを可能とする、Ｃ１ｒＬＰをコードする構築物と併せて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。図９Ｂは、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）を含有するＨｐｘ構築物と対照的に、構築物であるＨｕヘモペキシン－ｍｓａ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）のロバストな発現、および予測された部位における、Ｃ１ｒ－ＬＰによるタンパク質分解性切断が観察されたことを示す。Ｈｕヘモペキシン－ｍｓａ－Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）についての調製用ＳＥＣは、それが、高次分子種の比率が大きな、極めて低収量であることを示した（図９Ｃｉ）。これに対し、精製培養物上清についての解析用ＳＥＣ（脱塩を後続させる、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅアフィニティー）は、Ｈｕヘモペキシン－ｍｓａ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）が、予測サイズの均質タンパク質として作製されることを指し示した（図９Ｃｉｉ）。精製Ｈｕヘモペキシン－ｍｓａ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）の純度およびプロセシングは、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、および非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により検証した（図９Ｃｉｉｉ）。

【0193】

ヘモペキシン－Ｆｃ－Ｈｕハプトグロビンベータ融合タンパク質の作出
Ｎ末端におけるヒトヘモペキシン（Ｈｐｘ；アミノ酸１～４６２）に続き、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー、マウスＩｇＧ２ａＦｃを含有し、次いで、Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、アミノ酸１４８～４０６をコードするヒトＨｐベータ断片へと融合された構築物を作出し（図１０Ａ）、これらを、この部位を含有する構築物のための、α鎖の残りのＮ末端アミノ酸のプロセシングを可能とする、Ｃ１ｒＬＰをコードする構築物と併せて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。図１０Ｂは、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）を含有する構築物が、Ｈｕハプトグロビン（１６２～４０６）高発現、および予測された部位における、Ｃ１ｒ－ＬＰによるタンパク質分解性切断を裏付けたことを示す。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラムを使用する、精製培養物上清についてのサイズ除外クロマトグラフィー解析（さらなる脱塩工程と組み合わされた、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＰＣＣアフィニティークロマトグラフィー）は、Ｈｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）から作製されたタンパク質が、均質ではなく、大きな比率の凝集物を含有し（図１０Ｃｉ）、これはまた、ウェスタンブロットでも目視可能である（図１０Ｂ）ことを指し示した。精製Ｈｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）の純度およびプロセシングは、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、および非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により検証した（図１０Ｃｉｉ）。

【実施例4】

【0194】

ヘモグロビンへの結合の測定
Ｈｐベータ断片のアミノ酸１４８～４０６をコードする変異体を、ヘモグロビンへの結合について評価した（発現不良およびタンパク質凝集のために、野生型ベータ断片（配列番号１のアミノ酸残基１６２～４０６）を含有する、いかなる変異体も、ヘモグロビンへの結合について調べなかった）。

【0195】

ＳＥＣによる、ヘモグロビンへの定性的結合
以下の変異体：Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；ＨＳＡ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；ｍｕＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；Ｈｕヘモペキシン－ｍｓａ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；およびＨｕヘモペキシン－ｍＩｇＧ２ａＦｃ－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－Ｈｉｓを、ヘモグロビンへの結合能力に関して、定性的に解析した。

【0196】

第１の工程では、上記の組換え変異体の全てを、Ｈｂへの結合との関係で、定性的に解析した。略述すると、組換え変異体を、３７℃で、１時間にわたり、異なる濃度のヒトヘモグロビンと共にインキュベートした。試料は、ＳＥＣカラム（Ｄｉｏｌ－３００；３μｍ、３００×８．０ｍｍ）上で分離し、吸光度を４０５ｎｍとして記録した。図１１に示される通り、Ｈｂ結合性変異体と共にインキュベートされると、ヘモグロビンについてのＨＰＬＣトレース（青線）が、左へとシフトしたことは、Ｈｂ単独についてのＨＰＬＣトレースと比較した、サイズの増大（赤線）を指し示す。この定性的結合評価に基づき、全てのＨｐベータ断片（１４８～４０６）は、融合タンパク質と独立に、ヘモグロビンに結合することが可能である。

【0197】

ＢＬＩによる、ヘモグロビンへの定量的結合
ヒトにおいて、血漿ハプトグロビン（Ｈｐ）は、ヘモグロビンに、高アフィニティーで結合する。定量的査定のために、Ｈｐ媒介性Ｈｂ結合を、以下のＨｐ変異体について決定し、データを、ヒト血漿由来Ｈｐ１－１：Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；およびＨｕハプトグロビン１－１（血漿由来）と比較した。

【0198】

ビオチニル化変異体を、ストレプトアビジンコーティングバイオセンサー上に固定化し、Ｈｂへの結合について評価した。表６に示される通り、ヒトＨｐ１－１（血漿由来）への結合は、高アフィニティーの相互作用（１４４ｐＭ±３９）を結果としてもたらす。Ｈｐベータ断片（Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ）だけについても、Ｋ_Ｄを１８８ｐＭ±４２とする、同一の結合挙動が観察された。興味深いことに、固定化二官能性のＳｕｐｅｒＳｃａｖｅｎｇｅｒ（Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ）は、他の２つの被験変異体と比較して、ほぼ２倍速いオン速度（ｋ_ｏｎ：４．４×１０^５１／Ｍ秒）、およびやや遅いオフ速度（ｋ_ｏｆｆ：１．９×１０^－５１／秒）に帰せられる、結合アフィニティーの増大を示した。

【0199】

【表7】

【実施例5】

【0200】

ヘムへの結合の測定
ヘモペキシンドメイン（ヘム結合性ドメイン）を含有する変異体を、それらのヘム結合能について評価し、野生型ヘモペキシン（血漿由来ヘモペキシン）と比較した。略述すると、かつ、上で記載された通りに、各々変異体を、ヘモペキシンと同様に低アフィニティーのヘムドナーとして作用する、ヘム－アルブミンと共にインキュベートした。スペクトルは、５時間にわたり、持続的に記録し、データは、ヘム－アルブミンおよびヘモペキシン：ヘムからなる参照スペクトルに対して、デコンボリューションした。Ｒ Ｓｔｕｄｉｏを使用して、データに、双指数関数モデル（方法において記載される）を当てはめ、図１３に示される通りにプロットした。表７は、３つの被験変異体のヘム結合能について、血漿由来ヘモペキシンと比較してまとめる。３つの変異体は全て、表示の時点における、ヘモペキシンに結合したヘムの濃度を示す赤色の曲線により指し示される通り、ヘム－アルブミンヘムから転移したヘムに結合すると考えられる。ヘムへの結合は、最初の数分間中の極めて急速な結合に続く、飽和近傍における、はるかに緩徐な結合挙動のために、双指数関数として記載される。これは、全ての変異体について当てはまり、血漿由来ヘモペキシンとほぼ同等である。活性との関連で、興味深いことに、全ての変異体は、ｍＩｇ２ａＦｃを含有する融合タンパク質（約８０％の活性である）を除き、ほぼ１００パーセント結合する。速度定数を、表にまとめる。

【0201】

【表8】

【実施例6】

【0202】

ＣＤ１６３への結合の測定
ヒトＣＤ１６３（Ｈｂスカベンジャー受容体）は、単球系統の細胞内でほぼもっぱら発現される、１３０ｋＤａの糖タンパク質であり、最高の発現は、クッパー細胞および赤脾髄マクロファージを含む、成熟組織内のマクロファージ内で検出される。構造的に、ＣＤ１６３は、細胞外領域内のＳＲＣＲドメインの存在により特徴付けられる、タンパク質のＳＲＣＲ（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ）ファミリーに属する。ＣＤ１６３は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体に対する、天然の高アフィニティースカベンジャー受容体であり、主に、単球上およびマクロファージ上において、高レベルで発現され、このため、単球／マクロファージ系統に由来する細胞のマーカーとしてもまた使用される。正常生理学的条件下では、Ｈｐは、放出されたＨｂを捕捉し、これを、複合体を内部化するＣＤ１６３発現マクロファージへと方向付けることによりＨｂの毒性に対抗する。

【0203】

全ての被験Ｈｐ変異体におけるＨｂへの結合挙動が、極めて類似することの帰結として、ヘモグロビンとの複合体を作出し、ハプトグロビン１－１（血漿由来）：ヘモグロビン複合体と比較された、固定化ＣＤ１６３受容体に結合するそれらの能力について探索した。

【0204】

ヒトヘモグロビンと複合体させられた、以下の変異体：Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；Ｈｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）－８Ｈｉｓ；およびＨｕハプトグロビン１－１（血漿由来）を、ＣＤ１６３受容体に対する結合能との関係で解析した。

【0205】

図１４に示される通り、いずれの組換えＨｐ変異体も、血漿由来の野生型ハプトグロビン１－１：ヘモグロビン複合体と比較して、異なるアフィニティーはでではあるが、固定化ＣＤ１６３に結合することが見出された。いずれの組換え変異体の結合挙動も、Ｈｐ１－１：Ｈｂと比較して、解離の増大を示し、１：１反応速度当てはめモデルによる、適正なＫＤの決定は困難であった。したがって、定常状態解析を実施して、反応速度定数（ＫＤ）を推定した。下記の表８にまとめられる通り、ヘモグロビンと複合体化した、Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）およびＨｕヘモペキシン－Ｈｕハプトグロビン２ＦＳ（１４８～４０６）のいずれも、Ｈｐ１－１を用いて生成させたハプトグロビン：ヘモグロビン複合体と比較して、約７分の１および５０分の１のアフィニティーを有した。この観察は、潜在的に、血漿から精製されたＨｐ１－１と比較して、１つの結合性部位（Ｈｐのベータ鎖内の結合性部位）だけの存在により説明される。

【0206】

【表9】

【実施例7】

【0207】

ヘモグロビンの存在下における、血管一酸化窒素シグナル伝達の保存
Ａ．材料および方法
血管機能アッセイ
血管機能アッセイは、Ｈｕｇｅｌｈｏｆｅｒら、２０１９、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、１２９（１２）：５２１９～５２３５に記載されている通りに、地域の食肉処理場から得られた、新鮮なブタ脳底動脈（ｎ＝２０）を使用して実施した。略述すると、脳底動脈を摘出した後で、これを、２ｍｍ長の切片へと切断した。次いで、血管輪切片を、Ｍｕｌｔｉ－Ｃｈａｎｎｅｌ Ｍｙｏｇｒａｐｈ Ｓｙｓｔｅｍ ６２０ Ｍ（Ｄａｎｉｓｈ Ｍｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のピンへとマウントし、クレブス－ヘンゼライト緩衝液中に浸漬した。既に、Ｈｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒら、２０２０、Ｊ Ｖａｓｃ Ｒｅｓら、５７：１０６～１１２において記載されている通り、最適の受動前張力（因子ｋ＝０．８０とするＩＣ１）に達するように血管を伸張させた後で、１０μＭのプロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α；Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、収縮前作用剤（ｐｒｅ－ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として添加した。これに続き、ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅ（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加により、ＮＯ依存性血管拡張を誘導した。全ての血管について、実験は、３つの段階：第１段階：Ｈｂの非存在下における、クレブス－ヘンゼライト緩衝液（ＫＨＢ）中におけるＮＯ依存性血管拡張（ＮＯ－ｄｉｐ）；第２段階：１０μＭのＨｂの添加の後における血管拡張（ｄｉｐ）；および第３段階：等モル量のハプトグロビン（１０μＭ）の添加の後における血管拡張からなった。各血管について記録された拡張応答を、Ｈｂ曝露を伴わない、ＮＯ性最大拡張（初期血管拡張：１００％と同等）、およびＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅの添加の前における緊張性収縮のレベル（０％と同等）に対して正規化した。

【0208】

ＨｂおよびｒＬＰ（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）
ｅｘ ｖｉｖｏ実験における使用のためのＨｂは、既に記載されている通り、期限切れのヒト血液濃縮製剤から精製した（Ｅｌｍｅｒら、２０１１、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、８７９（２）：１３１～１３８）。Ｈｂ濃度は、スペクトルデコンボリューションを伴う分光光度法により決定され、総ヘム量に対するモル濃度として与えられ、これは、Ｈｂの単鎖サブユニットと同等量である（α鎖またはβ鎖；１ＭのＨｂ四量体は、４Ｍのヘムと同等量である）。スカベンジャータンパク質（Ｈｐ；組換えＨｐ構築物およびヘモペキシン）について、１モルは、１モルのヘムと同等の結合能であると考えられた。これらの研究で使用された全てのＨｂについて、分光光度法により決定された第１鉄含有Ｈｂ（ＨｂＦｅ^２＋Ｏ_２）の画分は、常に９８％を超えた。ｒＬＰ（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得た。

【0209】

リポタンパク質過酸化アッセイ
ハプトグロビン変異体が、Ｈｂ酸化反応を防止する効果は、ｒＬＰを伴う、Ｈｂ－ハプトグロビン複合体のインキュベーションの後における脂質過酸化の最終産物である、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の形成を測定することにより定量した。ｒＬＰ（２ｍｇ／ｍＬ）と、Ｈｂまたはハプトグロビン変異体と複合体化したＨｂ（１０μＭ）とを含有する、３０μＬの９６ウェルプレートを、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした。その後、ＴＢＡＲＳアッセイを使用して、ＭＤＡの濃度を測定した（Ｄｅｕｅｌら、２０１５、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８９：９３１～９４３）。略述すると、１ＭのＨＣｌ中に７５０ｍＭのトリクロロ酢酸１２５μＬを、試料へと添加するのに続き、ボルテクシング（５秒間）した後、１ＭのＮａＯＨ中に２５ｍＭの２－チオバルビツール酸１００μＬを添加した。８０℃で、６０分間にわたるインキュベーション時間の後、上清中のＴＢＡＲＳを定量した。より高感度であるが、相対的な定量を達成するために、励起波長として５１０ｎｍを使用して、蛍光発光を５５０ｎｍで測定した。

【0210】

Ｂ．結果
ｅｘ ｖｉｖｏ血管機能実験における、血管一酸化窒素シグナル伝達の保存は、Ｈｐのサイズおよび融合パートナーに依存する
異なるＨｐ変異体のＮＯ温存能について評価するために、Ｈｂスカベンジャーの添加の後における、ＮＯ依存性血管拡張性応答に対するレスキューが測定される、確立されたｅｘ ｖｉｖｏ血管機能アッセイを使用した。全ての実験において、１０μＭのＨｂの、ＫＨＢへの添加は、Ｈｂを伴わない対照血管拡張を１０％（相対弛緩の中央値：９．７％）下回る、血管弛緩の抑制を結果としてもたらした。その後における、Ｈｂスカベンジャーの添加は、全てのＨｐ変異体について、ＮＯドナーを施した場合における、血管拡張の回復を結果としてもたらした（図１５）。全ての実験において、ヒト血漿由来Ｈｐ２－２を、比較のための基準／ゴールドスタンダードとして使用した。血漿Ｈｐ１－１、ｒｅｃＨｐ１－１、およびｒｅｃＨｐＣＤ１６３ｌｏｗによる群では、レスキューは、Ｈｐ２－２と比較して同様であり、差違の証拠は、見られなかった（表９）。分子量が小さいｍｉｎｉＨｐについて、レスキューは、Ｈｐ２－２によるレスキューほど顕著ではなかった（Ｈｐ２－２の中央値：８７．９３％、ｍｉｎｉＨｐの中央値：６７．９９％、ｐ値＜０．０００１）。二官能性構築物（ＳｕｐｅｒＳｃａｖｅｎｇｅｒ、Ｈｐｘ－Ｈｐ構築物）は、中間のレスキューを示した（中央値：４８．１３％）。これは、Ｈｂ（αβ）_２－Ｈｐ １－１複合体より小さいが、Ｈｂ（αβ）_１－ｍｉｎｉＨｐ複合体より大きい、Ｈｂ（αβ）_１－Ｈｐ－Ｈｐｘ複合体のサイズと関連する可能性が高い。

【0211】

【表10】

【0212】

脂質過酸化の防止は、Ｈｐ変異体に依存しない
組換えハプトグロビン変異体の抗酸化能について査定するために、本発明者らは、Ｈｂと、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨｂ過酸化反応のための、主要な生理学的脂質基質である、不飽和ホスファチジルコリンを含有するｒＬＰとの混合物中における、ＭＤＡの発生を測定した（Ｄｅｕｅｌら、２０１５；Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．、８９：９３１－４３）。Ｈｂを、等モル量のＨｐと混合したところ、査定されるＨｐ変異体に関わらず、３７℃で、４時間にわたるインキュベーションの後において、ＭＤＡは、検出されなかった（図１６Ａ）。次いで、本発明者らは、Ｈｐに関して、化学量論未満～化学量論を超える濃度の範囲の漸増濃度のＨｂで実験を繰り返した（図１６Ｂ）。この実験で、本発明者らは、組換えＨｐ変異体が、Ｈｐβ鎖と等モルであるＨｂ濃度までの濃度で、脂質過酸化を防止することを見出した。Ｈｐを超える、Ｈｂの過剰濃度においても、濃度－酸化関係は、Ｈｂ単独の場合と同一の形状に従った。唯一の例外は、化学量論を超えるＨｂ濃度においてもなお、ＭＤＡの発生の著明な低下を示す、Ｈｐ－Ｈｐｘ ＳｕｐｅｒＳｃａｖｅｎｇｅｒにより観察された。この観察は、Ｈｐによる相乗作用的保護をもたらす、Ｈｐｘのヘム指向性抗酸化機能（Ｄｅｕｅｌら、２０１５）と符合した。

【0213】

血漿由来Ｈｘを伴うヘム：Ｈｘ複合体、およびＨｘ－Ｈｐ融合タンパク質を伴うヘム：Ｈｘ複合体の、ＬＲＰ１への結合
Ｈｘの、ヘムとの複合体形成は、そのスカベンジング受容体である、ＣＤ９１／ＬＲＰ１との会合をもたらす（Ｈｖｉｄｂｅｒｇら、２００５、Ｂｌｏｏｄ、１０６（７）：２５７２～９）。したがって、結合実験の最後のセットにおいて、本発明者らは、Ｈｘ－Ｈｐ融合タンパク質が、ＣＤ９１／ＬＲＰ１に結合する能力について、ヘムと複合体化した血漿由来Ｈｘと比較して探索した。全長受容体は、組換え発現が困難であるので、本発明者らは、ＣＤ９１／ＬＲＰ１の断片（クラスターＩＩＩ）だけを固定化させた。既往の研究において、本発明者らは、４つのクラスターのうち、クラスターＩＩＩが、ヘム：Ｈｘに対する結合性部位を含有することを同定した（未公表データ）。表１０に示される通り、本発明者らは、いずれのヘム複合体も、高ナノモル範囲のＫＤにより、ほぼ同等な形で、固定化受容体断片に結合することを見出した。図１７に例示された通り、ヘムの非存在では、ＬＲＰ１に結合しないＨｘと対照的に、非複合体化Ｈｘ－Ｈｐは、極めて低度ながら、固定化ＬＲＰ１への結合アフィニティーを示した。これが、融合タンパク質の人工足場に起因するのかどうかは、未だ探索されていない。

【0214】

【表11】

【0215】

考察
本発明者らは、Ｈｐが、適切なサイズ、構造、および機能を有する分子をもたらす、一過性真核生物発現系内で、機能的タンパク質としての高収量の発現が可能であることを既に示している（Ｓｃｈａｅｒ、Ｏｗｃｚａｒｅｋら、２０１８，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：１５）。

【0216】

Ｈｐの主要な機能（Ｈｂによる結合およびＣＤ１６３への結合）は、Ｈｐβ鎖により媒介される（Ｍｅｌａｍｅｄ－Ｆｒａｎｋ、２００１、Ｂｌｏｏｄ、９８（１３）：３６９３～８；およびＡｌａｙａｓｈ、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２０１３、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１（１）：２～３を参照されたい）。Ｈｂへの結合に要求される、ハプトグロビンの最小ドメインをさらに特徴付けるために、ヒトＨｐのβ鎖が、Ｈｐポリペプチド鎖内の、Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位の直後に起始する構築物を作出した。アミノ酸２６６における不対合システインが、アラニンへと突然変異させられた、さらなる変異体もまた作出した。しかし、これらの発現構築物の、一過性トランスフェクションが、タンパク質を作出できなかったことは、β鎖の構造が破壊されたために、哺乳動物細胞内で不安定であったことを指し示す。予測外にも、ヒトＨｐβ鎖が、Ｈｐα鎖の、さらなる１４の連続Ｎ末端アミノ酸をさらに含み、これにより、Ｃ１ｒ－ＬＰ切断部位と、鎖内ジスルフィド結合のために要求されるシステインとを保持する、代替デザイン構築物は、機能的Ｈｐβ鎖タンパク質の、ロバストかつ安定的な発現を結果としてもたらした。改変構築物はまた、ドメイン間ジスルフィド結合を介して、Ｈｐβ鎖断片へと連結された融合パートナー（例えば、さらなる機能的部分）が、例えば、Ｎ末端切断型Ｈｐアルファ鎖のＮ末端に配置された、融合タンパク質の作出も可能とする。これは、二重ターゲティング型治療用分子の作製を可能とするので有利であり、その例示的な例は、無細胞ヘモグロビンおよび無細胞ヘムの、いずれのスカベンジャーとしても使用される、ハプトグロビン－ヘモペキシン（Ｈｐ－Ｈｐｘ）コンジュゲートを含む。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17-1】

【図17-2】

【配列表】

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【国際調査報告】