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特表2024-517966同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法のために幹細胞を操作すること
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法のために幹細胞を操作すること
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240416BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240416BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240416BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240416BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240416BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0783
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/867 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023570368
(86)(22)【出願日】2022-05-12
(85)【翻訳文提出日】2024-01-11
(86)【国際出願番号】 US2022028996
(87)【国際公開番号】W WO2022241120
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】63/188,872
(32)【優先日】2021-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523429139
【氏名又は名称】アピア バイオ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107489
【弁理士】
【氏名又は名称】大塩 竹志
(72)【発明者】
【氏名】カン， ジンジュ エス．
(72)【発明者】
【氏名】ウィゾレック， ジェフリー スコット
(72)【発明者】
【氏名】ワン， シー
(72)【発明者】
【氏名】クリストファー， マイケル
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
(57)【要約】
本開示は、増強された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞を生産する方法を提供する。Ｔ細胞は、造血幹細胞にＴＣＲ、ＣＡＲおよび少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を導入することによって、造血幹細胞から作製される。同種異系細胞療法は、一用量の処置のために、しばしば数十億個の細胞を必要とする。幹細胞の能力は拡大増殖に関して潜在的に限界がないため、本発明の方法は、大規模に高品質の細胞生産物を生産し、それらの生産物を処置のために迅速に利用可能にするのに極めて適している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を生産する方法であって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする１またはそれを超える核酸を造血幹細胞（ＨＳＣ）に導入することと、前記ＨＳＣを、前記ＴＣＲおよびＣＡＲを発現し、ならびに前記導入遺伝子を含むインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞に変換させることと
を含む、方法。
【請求項2】
前記１またはそれを超える核酸が単一のベクターによって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記単一のベクターがレンチウイルスベクターを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記１またはそれを超える核酸を導入することが、複数のベクターを介して少なくとも２つの異なる核酸分子を前記ＨＳＣに組み込むことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも２つの異なる核酸分子がレンチウイルスベクターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも２つの異なる核酸分子が前記ＨＳＣに順次にまたは同時に導入される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ＨＳＣが前駆細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記前駆細胞が多能性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記１またはそれを超える核酸が、リボソームスキッピングを誘導する配列をさらにコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記配列が２Ａ配列をコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ｉＮＫＴ細胞が、α／βｉＮＫＴ細胞またはγ／δｉＮＫＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記１またはそれを超えるさらなる導入遺伝子が、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤または神経毒性の阻害剤の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１の１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＣＡＲが単一ドメイン抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ＣＡＲが重鎖抗体の可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１８８，８７２号に基づく恩典および優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本出願は、２０２１年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１８８，８７２号に基づく恩典および優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
【0002】
本開示は、同種異系細胞療法において使用するために幹細胞を操作する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
インビトロでのＴ細胞の生成および拡大増殖は、癌処置を含む広範囲の臨床用途に有用である。例えば、臨床データは、腫瘍抗原特異的受容体を有する操作されたＴ細胞が、転移性癌の退縮を引き起こすために、一部の患者において有用であることを示す。残念ながら、すべての患者がそのような処置から恩恵を受けるわけではない。１つの説明は、インビトロでの拡大増殖中に、いくつかのＴ細胞が疲弊または老化し、これがインビボでの治療の有効性および持続性を制限することである。
インビトロでのＴ細胞の生成および拡大増殖は、癌処置を含む広範囲の臨床用途に有用である。例えば、臨床データは、腫瘍抗原特異的受容体を有する操作されたＴ細胞が、転移性癌の退縮を引き起こすために、一部の患者において有用であることを示す。残念ながら、すべての患者がそのような処置から恩恵を受けるわけではない。１つの説明は、インビトロでの拡大増殖中に、いくつかのＴ細胞が疲弊または老化し、これがインビボでの治療の有効性および持続性を制限することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
要旨
本開示は、増強された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞を生産するためのシステムおよび方法を提供する。特に、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含む複数の導入遺伝子で操作された幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴ細胞を作製する方法を提供する。ＨＳＣから出発することによって、本発明のシステムおよび方法は、改善された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞の製造のために、幹細胞の自己再生および細胞分化能を活用する。特に、本開示は、ＴＣＲ、ＣＡＲおよび少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸の、ＣＤ３４＋幹細胞内への導入を提供する。ＴＣＲおよびＣＡＲの組み合わされた発現は、Ｔ細胞に特異的癌細胞標的化特性を提供するのに有用である。さらに、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を与えられているため、本発明の方法によって生産されたＴ細胞は、標的癌細胞と接触したときに癌を処置するのに有用なカーゴ（例えば、サイトカイン）を装備する。
本開示は、増強された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞を生産するためのシステムおよび方法を提供する。特に、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含む複数の導入遺伝子で操作された幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴ細胞を作製する方法を提供する。ＨＳＣから出発することによって、本発明のシステムおよび方法は、改善された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞の製造のために、幹細胞の自己再生および細胞分化能を活用する。特に、本開示は、ＴＣＲ、ＣＡＲおよび少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸の、ＣＤ３４＋幹細胞内への導入を提供する。ＴＣＲおよびＣＡＲの組み合わされた発現は、Ｔ細胞に特異的癌細胞標的化特性を提供するのに有用である。さらに、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を与えられているため、本発明の方法によって生産されたＴ細胞は、標的癌細胞と接触したときに癌を処置するのに有用なカーゴ（例えば、サイトカイン）を装備する。
【0005】
幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の利点には、再生および拡大増殖の能力が含まれる。同種異系細胞療法は、一用量の処置のために、しばしば数十億個の細胞を必要とする。幹細胞の能力は拡大増殖に関して潜在的に限界がないため、本発明の方法は、大規模に高品質の細胞生産物を生産し、それらの生産物を処置のために迅速に利用可能にするのに極めて適している。さらに、幹細胞の顕著な特徴は、異なる細胞型に分化する能力である。本開示の文脈において、分化の能力は、例えば、とりわけ、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞を含む多岐にわたるＴ細胞サブタイプを生産し得る細胞製造プラットフォームを提供する。
【0006】
一局面において、本発明は、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を生産する方法を提供する。この方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする１またはそれを超える核酸を造血幹細胞（ＨＳＣ）に導入することと、前記ＨＳＣを、前記ＴＣＲおよびＣＡＲを発現し、ならびに前記導入遺伝子を含むインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞に変換させることとを含む。好ましい態様において、１またはそれを超える核酸は、レンチウイルスベクターなどの単一のベクターによって提供される。しかし、いくつかの例では、例えば、大きな導入遺伝子を組み込む場合、複数のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）など、少なくとも２つの異なる核酸分子を使用して１またはそれを超える核酸を組み込むことが有用であり得る。少なくとも２つの異なる核酸分子は、ＨＳＣに順次にまたは同時に導入され得る。
【0007】
好ましい態様において、本発明の方法は、レンチウイルス形質導入を介して核酸をＨＳＣに導入することを含む。１またはそれを超える核酸の導入は、少なくとも１つの、ＴＣＲ、ＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子を発現するＨＳＣを提供する。さらなる導入遺伝子の組み込みは、改善された細胞拡大増殖、持続性、安全性および／または抗腫瘍活性などの改善された機能的特性を有する治療用Ｔ細胞を提供するために有用である。１またはそれを超えるさらなる導入遺伝子は、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤または神経毒性の阻害剤の任意の１つまたはそれより多くを含み得る。例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１の１つまたはそれより多くをコードする導入遺伝子が提供され得る。
【0008】
したがって、いくつかの例において、本発明の方法は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１－１５の１つまたはそれより多くをコードする核酸を導入することによって、改善された拡大増殖および持続能力を有するＣＡＲ Ｔ細胞の製造を提供する。いくつかの例において、方法は、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８の１つまたはそれより多くをコードする導入遺伝子の導入によって、ＣＡＲ Ｔ細胞に増加したＩＦＮ－ｇ生産、したがって改善されたＴ細胞効力を提供し得る。他の例において、本発明の方法は、ＩＬ－２１を含む導入遺伝子を導入することによってナイーブＴ細胞生産を増強するのに有用である。いくつかの例において、本明細書に記載されている方法は、例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦまたはサイトカイン放出症候群および神経毒性の他の媒介物質の阻害剤を導入することによって、改善された安全性特性を有するＣＡＲ Ｔ細胞の生産を提供する。方法は、例えば、ＴＧＦ－Ｂ、チェックポイントの阻害剤を介して、腫瘍微小環境に対抗するのに有用な搭載物を提供することによって、改善された有効性を有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。
図面の簡単な説明
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
詳細な説明
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の臨床試験は、Ｂ細胞悪性腫瘍などのある種の病状の処置において顕著な結果を示す。しかしながら、現在、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を伴う商業的方法は、特定の目的のための生成に伴う物流および高いコストによってその広範な使用が制約される自己ＣＡＲ Ｔ細胞を伴う。同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、患者の処置のために直ちに利用可能な予め作製された細胞ストックを提供することによって、自己細胞の限界に対処する。しかし、その潜在的可能性にもかかわらず、治療上有効な同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の一貫した生産のための方法は確立されていない。ほとんどのプロトコルは、例えば、少なくとも２つの活性化工程を有する長期間のエクスビボ培養を必要とし、これは潜在的に過剰な分化、Ｔ細胞疲弊および／または細胞の老化をもたらし、インビボでの有効性を低下させる。参照により組み入れられる、Ｊａｆａｒｚａｄｅｈ，２０２０，Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｔ Ｃｅｌｌ ｉｎ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｗａｙｓ Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１（７０２）：１－１７を参照されたい。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の臨床試験は、Ｂ細胞悪性腫瘍などのある種の病状の処置において顕著な結果を示す。しかしながら、現在、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を伴う商業的方法は、特定の目的のための生成に伴う物流および高いコストによってその広範な使用が制約される自己ＣＡＲ Ｔ細胞を伴う。同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、患者の処置のために直ちに利用可能な予め作製された細胞ストックを提供することによって、自己細胞の限界に対処する。しかし、その潜在的可能性にもかかわらず、治療上有効な同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の一貫した生産のための方法は確立されていない。ほとんどのプロトコルは、例えば、少なくとも２つの活性化工程を有する長期間のエクスビボ培養を必要とし、これは潜在的に過剰な分化、Ｔ細胞疲弊および／または細胞の老化をもたらし、インビボでの有効性を低下させる。参照により組み入れられる、Ｊａｆａｒｚａｄｅｈ，２０２０，Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｔ Ｃｅｌｌ ｉｎ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｗａｙｓ Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１（７０２）：１－１７を参照されたい。
【0013】
本開示は、改善された表現型および細胞機能を有するＴ細胞を製造するための信頼できる方法を提供する。いくつかの局面によれば、本開示は、短縮されたエクスビボ培養時間を有するＴ細胞生産のための方法を提供する。本発明のある方法は、エクスビボ活性化を省略することによってエクスビボ培養を短縮させ、これにより、エクスビボ製造プロセスが最長２～３週間短縮する。本発明の他の方法は、単一の活性化工程を提供する。本発明の方法は、長時間に及ぶ活性化および／または拡大増殖プロセスが、対象への投与後にインビボで起こり得ることを認識する。エクスビボ細胞培養を短縮することによって、本発明の方法は、Ｔ細胞生産中に転写の変化および／または表現型の変化が起こる機会を最小限に抑える。さらに、エクスビボ培養時間を短縮することは、Ｔ細胞維持のために必要とされる高価な細胞培養消耗品の量を低減させる。
【0014】
異なる局面において、本開示は、単一の活性化工程でＴ細胞生産物を作製するための多段階ワークフローを提供する。この方法は、１つ以下のインビトロＴ細胞活性化工程を用いて、ＨＳＣの、Ｔ細胞へのインビトロ分化および成熟を含むプロセスを実施することを含む。Ｔ細胞生産物は、処置または研究のために使用され得る。Ｔ細胞製造の従来の方法は、少なくとも２つの別個のインビトロＴ細胞活性化工程を必要とする。
【0015】
複数の活性化工程は、一般に、複数の培地の種類、すなわち異なる活性化因子を含有する培地を含む。有利には、単一の活性化工程によってＴ細胞を生産することは、細胞培養の時間を短縮し、Ｔ細胞疲弊に関連するより少ないマーカーを発現するより効果的なＴ細胞生産物を生産する。
【0016】
本発明の方法は、より少ないインビトロ細胞培養物でＴ細胞生産物を生産するのに有用である。インビトロ細胞培養を減少させることによって、本発明の方法は、より効果的であり、より少ない疲弊した／機能不全のＴ細胞を含有するＴ細胞生産物を生産する。Ｔ細胞生産物は、２またはそれを超えるＴ細胞活性化工程によって生産されるＴ細胞より、より低いレベルのＴ細胞疲弊に関与するタンパク質、例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴを発現し得る。Ｔ細胞生産物はまた、より高レベルのＩＬ－２を発現し得る。
【0017】
ある態様は、Ｔ細胞を生産するための多段階プロセスを含み、工程の１つのみＴ細胞活性化。単一の活性化工程は、活性化培地、例えば抗体などのＴ細胞活性化試薬を含む培地中でＴ細胞を培養することによって行われ得る。
【0018】
いくつかの例において、活性化工程は、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）をベースとする活性化を含む。ＰＭＢＣをベースとする活性化は、α－ガラクトシルセラミド（ａＧＣ）を搭載したＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／２８陽性ＰＢＭＣおよび可溶性抗ＣＤ２／３／２８陽性ＰＢＭＣにＴ細胞を導入することを含むことができる。いくつかの例において、活性化工程は、抗原提示細胞（ａＡＰＣ）をベースとするＴ細胞活性化工程を含む。したがって、活性化工程は、Ｔ細胞をａＡＰＣに導入することを含むことができる。好ましくは、ａＡＰＣは照射される。ａＡＰＣは、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ抗原を発現する操作されたＫ５６２細胞であり得る。ａＡＰＣは、ａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄおよび／またはａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣであり得る。他の例において、活性化工程は、フィーダーを用いないことをベースとするＴ細胞活性化工程を含む。フィーダーを用いないことをベースとするＴ細胞活性化工程は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、ＣＤ３／２８を含む可溶性抗体をＴ細胞に導入することを含むことができる。いくつかの態様において、方法は、ＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２またはＩＬ－１８の１つまたはそれより多くを含む培養培地を含む。いくつかの態様において、培地はＩＬ－１５を含有する。
【0019】
さらに、他の局面によれば、本発明の方法は、増強された抗腫瘍活性を有するＴ細胞を生産するのに有用である。本開示は、ＴＣＲ、ＣＡＲおよび少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含む複数の導入遺伝子が組み込まれた幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴ細胞を生産するためのシステムおよび方法を提供する。幹細胞から生産プロセスを開始することによって、本発明のシステムおよび方法は、「より若い」表現型および増強された抗腫瘍活性を有するＴ細胞の製造のために、自己再生および細胞分化能力を活用する。特に、本開示は、少なくとも１つの、ＴＣＲ、ＣＡＲおよび少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸の、ＣＤ３４陽性幹細胞への導入を提供する。ＴＣＲおよびＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子の組み合わされた発現は、癌を処置するのに有用な特異的癌細胞標的化特性をＴ細胞に提供するのに有用である。
【0020】
図１は、Ｔ細胞を生産するための方法１０１を図示する。特に、本発明の局面にしたがってＴ細胞を生産するための方法の一般的な概要を提供するために、単純なフロー図が例示されている。方法１０１は、幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞）を取得すること１０５と；（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子をコードする）１またはそれを超える核酸を幹細胞に導入すること１０９と；Ｔ細胞を生産するために幹細胞のインビトロ分化および成熟を実施すること１１１と；Ｔ細胞活性化工程を行わずに（例えば、同種異系療法または研究のために）細胞を提供すること１１３と、を含む。
【0021】
方法１０１は、幹細胞を得ること１０５を含む。好ましくは、細胞はＣＤ３４＋細胞である。１つの非限定的な例において、ＣＤ３４＋幹細胞は、造血幹細胞／前駆細胞である。造血幹細胞または前駆細胞は、造血と呼ばれるプロセスにおいて他の血液細胞を生じさせる幹細胞である。
【0022】
造血幹細胞／前駆細胞は、健康なドナーから取得され得る。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、骨髄、末梢血、羊水または臍帯血から取得され得る。造血幹細胞／前駆細胞は、臍帯の末端をクランプで締め、クランプで締められた末端の間から血液を針で吸引することによって、臍帯血から取得され得る。造血幹細胞／前駆細胞は、正の免疫磁気分離技術を用いて臍帯血から単離され得、シトラート－ホスファート－デキストロース（ＣＰＤ）が抗凝固剤として臍帯血に添加され得る。臍帯血からの細胞は凍結保存され、使用するまで例えば－８０℃の温度で保存され得る。
【0023】
本開示の方法を実施する際に、幹細胞を得ること１０５は、好ましくは、造血幹細胞／前駆細胞を含む凍結保存されたＣＤ３４＋臍帯血細胞のバイアルを受け取ることを含む。凍結保存された臍帯血細胞のバイアルは、例えばドライアイス上の断熱容器に入れて、細胞バンクから受け取られ得る。
【0024】
凍結保存された臍帯血細胞のバイアルは、当技術分野で公知の方法に従って解凍され得る。例えば、３７度の水浴中にバイアルを約１～２分間配置することによって、細胞のバイアルを解凍し得る。いくつかの好ましい態様において、細胞が解凍されると、形質導入効率を高めるためにウイルスと標的細胞の共局在化を促進する試薬で予め被覆された組織培養皿の上に細胞を播種する。
【0025】
ＣＤ３４＋細胞は、標準的な６ウェル皿に、例えば、１０，０００細胞／ウェル、１５，０００細胞／ウェルまたは２０，０００細胞／ウェルまたは２５，０００細胞／ウェルまたはそれを超えて播種され得る。好ましくは、細胞はウェルあたり１５，０００細胞で播種される。
【0026】
方法１０１は、ＴＣＲ、ＣＡＲおよび／またはさらなる導入遺伝子の１つまたはそれより多くをコードする１またはそれを超える核酸をＣＤ３４＋幹細胞に導入すること１０９をさらに含む。好ましくは、１またはそれを超える核酸は、ＴＣＲ、ＣＡＲまたはさらなる導入遺伝子の少なくとも２つをコードする。例えば、いくつかの態様において、幹細胞に導入１０９された１またはそれを超える核酸は、少なくともＴＣＲおよびＣＡＲをコードし、癌細胞の表面上に発現された特定のタンパク質を標的とすることができるＴ細胞を生産する。他の態様において、幹細胞に導入１０９された１またはそれを超える核酸は、ＴＣＲ、ＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子のそれぞれをコードする。
【0027】
好ましい態様において、核酸を介して導入されるＴＣＲはｉＮＫＴ ＴＣＲである。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、ｉＮＫＴ細胞受容体のα鎖、ｉＮＫＴ細胞受容体のβ鎖の一方または両方を含み得る。好ましくは、ｉＮＫＴ細胞受容体は、幹細胞がα－ガラクトシルセラミドを認識するように幹細胞によって発現される。さらに、好ましい態様は、少なくとも１つのＣＡＲをコードする核酸を導入することを含む。ＣＡＲは、後述されているように、第１世代、第２世代または第３世代のＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、癌に関連する抗原に対して特異的な受容体を細胞に提供するのに有用である。例えば、いくつかの態様において、抗原はメソテリン、グリピカン３、ＣＤ１９またはＢＣＭＡのうちの１つを含む。
【0028】
本発明の方法によって生産されるＴ細胞は、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を発現するように遺伝子改変され得る。導入遺伝子は、例えば、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤または神経毒性の阻害剤のうちの１つであり得る。したがって、本発明の方法は、増強されたエフェクター機能を有するＴ細胞を生産するのに有用であり得る。
【0029】
例えば、いくつかの例において、本発明の方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１－１５の１つまたはそれより多くをコードする導入遺伝子の導入によって提供される、改善された拡大増殖および持続能力を有するＣＡＲ Ｔ細胞の製造に有用である。いくつかの例において、方法は、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８の１つまたはそれより多くをコードする導入遺伝子の導入によって、ＣＡＲ Ｔ細胞に増加したＩＦＮ－ｇ生産、したがって改善されたＴ細胞効力を提供し得る。いくつかの例において、本発明の方法は、ＩＬ－２１を含む導入遺伝子を導入することによってナイーブＴ細胞生産を増強するのに有用である。いくつかの例において、本明細書に記載されている方法は、例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦまたはサイトカイン放出症候群および神経毒性の他の媒介物質の阻害剤を導入することによって、改善された安全性特性を有するＣＡＲ Ｔ細胞の生産を提供する。方法は、例えば、ＴＧＦ－Ｂ、チェックポイントの阻害剤を介して、腫瘍微小環境に対抗するのに有用な搭載物を提供することによって、改善された有効性を有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。
【0030】
幹細胞に１またはそれを超える核酸を導入すること１０９は、ウイルス形質導入法または非ウイルス形質移入によって達成され得る。いくつかの例において、例えば、１またはそれを超える核酸を導入するための方法は、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン／トランスポザーゼ系を使用する非ウイルス法を含む。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、正確に定義されたＤＮＡ配列を細胞の染色体に導入するように設計された合成ＤＮＡトランスポゾンを含む。この系は、トランスポザーゼが複数の不活性な魚配列から復活された、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型系を使用する。有利には、非バイアル（ｖｉａｌ）法は、費用節約という利益を提供し、ある種のウイルスの使用に関連するリスクを低減し得る。しかしながら、非ウイルス方法には、低下した効率が伴い得る。したがって、好ましい態様は、ウイルス形質導入によって、例えばレトロウイルスを介して、核酸を幹細胞に導入する。
【0031】
ウイルス形質導入方法は、その汎用性がよく知られており、レンチウイルスベクターの使用を含み、これは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を有意な量の核酸で形質導入するのに有用である。レンチウイルスベクターの使用は安全であると考えられており、しばしば長期の導入遺伝子発現を提供する。したがって、方法１０１は、好ましくは、レンチウイルス形質導入を介して３４＋幹細胞に１またはそれを超える核酸を導入する１０９。幹細胞のレンチウイルス形質導入に関する論述については、参照によって組み入れられるＪａｎｇ，２０２０，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２７）：５４５－５５６を参照のこと。
【0032】
本発明の方法は、核酸を幹細胞に導入するための任意の１つのプロセスまたは検査手順によって限定されない。いくつかの例において、単一のレンチウイルスベクターが使用される。単一のレンチウイルスベクターは、ＴＣＲ、ＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子のそれぞれをコードし得る。他の例では、少なくとも２つの異なるレンチウイルスベクターが使用され、少なくとも２つのレンチウイルスベクターのそれぞれ１つは、形質導入に際して、ＴＣＲ、ＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子のそれぞれが幹細胞に形質導入されるように、ＴＣＲ、ＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子の少なくとも１つをコードする。さらに、１つより多くのレンチウイルスベクターが使用される例では、方法１０１は、２つ（またはそれを超える）のレンチウイルスベクターを幹細胞に導入する時間的順序によって限定されない。ベクターは、同じ形質導入において、同時に、または順次に導入され得る。
【0033】
方法１０１は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の、Ｔ細胞へのインビトロ分化および成熟を含むプロセスを実施すること１１１をさらに含む。
【0034】
細胞製造方法１０１の１つの利点は、単一の出発材料、すなわち幹細胞から多岐にわたるＴ細胞サブタイプを生産する能力にある。本発明の方法によって生産されるＴ細胞としては、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞が挙げられ得る。好ましい態様において、方法１０１は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞を生産することを含む。インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の生産は、それらの同種異系細胞療法用途にとって好ましい。特に、移植片対宿主病を誘発することなく、癌を処置するために抗原特異的Ｔ細胞応答を活性化および拡大するその能力。
【0035】
したがって、方法１０１は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の、Ｔ細胞（例えば、ｉＮＫＴ）へのインビトロ分化および成熟プロセスを実施すること１１１を含む。以下で詳細に論述されているように、幹細胞のインビトロ分化および成熟を実施すること１１１は、好ましくは、そのプロセスがＴ細胞の活性化および拡大増殖のその後のインビトロ工程を含まないという条件で行われる。
【0036】
ＣＤ３４陽性細胞のＴ細胞への分化は段階的に起こり得る。第１の段階は、ＣＤ３４陽性幹細胞の、ＣＤ４およびＣＤ８二重陰性Ｔ細胞へのインビトロ分化を含み得る。ＣＤ３４陽性幹細胞の分化は、一般に、例えば１～２週間、培養下で、ＣＤ３４陽性幹細胞をサイトカインおよび／またはケモカインの組み合わせに導入することを含む。いくつかの例において、サイトカインおよび／またはケモカインは、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で販売されている補助物質などの市販の前駆細胞拡大増殖補助物質によって提供され得る。インビトロプロセスを実施すること１１１の態様は、ＣＤ４およびＣＤ８二重陰性Ｔ細胞の、ＣＤ４およびＣＤ８二重陽性細胞への成熟をさらに含む。いくつかの例において、二重陰性細胞を成熟させることは、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供される前駆細胞成熟培地などの市販の前駆細胞成熟培地中で細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、細胞は、前駆細胞成熟培地中で７日間培養される。
【0037】
方法１０１のある態様によれば、ＣＤ３４＋幹細胞のＴ細胞へのインビトロ分化および成熟プロセスを実施すること１１１は、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を生産する。ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞はナイーブＴ細胞であり得る。ナイーブＴ細胞は、一般に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）およびＣ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）の表面発現を特徴とする。いくつかの例において、活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９の非存在およびメモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在。ナイーブＴ細胞は、サブユニットＩＬ－７受容体α、ＣＤ１２７および共通γ鎖、ＣＤ１３２からなる機能的ＩＬ－７受容体も発現し得る。ナイーブＴ細胞は、保存のために凍結保存され得るか、または同種異系細胞療法処置中に対象に導入され得る。対象の内部では、ナイーブＴ細胞は、最初の抗原刺激を待ちながら末梢リンパ管を循環し得る。ナイーブ細胞のＴＣＲを通じて最初の刺激時が発生すると、細胞は、活性化、共刺激および接着に関連する表面分子の発現を調節し始める。これらの分子の発現パターンは、エフェクターおよび抗原を経験したＴ細胞サブセットをさらに定義するために使用され得る。
【0038】
いくつかの態様において、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、凍結保存および／または同種異系細胞療法レシピエントへの投与の前に、インビトロで拡大増殖される。ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の拡大増殖は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、α－ガラクトシルセラミドの１つまたはそれより多くの存在下で細胞を培養することを含み得る。
【0039】
本発明の方法は、インビトロ培養工程を減らすためにインビボ活性化機構を利用する。２つの活性化工程を経ることなくＴ細胞が生産され、対象の体内に導入されると、Ｔ細胞が例えば二次リンパ器官において樹状細胞などの適切に活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に遭遇したときに、Ｔ細胞は完全に活性化される。ＡＰＣが主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して適切なペプチドリガンドを提示すれば、ペプチドリガンドはＴＣＲによって認識される。これは、Ｔ細胞を活性化するために重要である。ＡＰＣによって送達される２つの他の刺激シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルは、ＣＤ８０およびＣＤ８６などの、ＡＰＣ表面上の２つの異なるリガンドによって、Ｔ細胞上の表面分子、例えばＣＤ２８に提供され得る。活性化のために重要な他の因子には、エフェクターＴ細胞の異なるサブセットへのＴ細胞分化を指示することに関与する因子、例えばＩＬ－６、ＩＬ－１２およびＴＧＦ－βなどのサイトカインが含まれる。活性化されたＴ細胞のＣＤ２８依存性共刺激は、活性化されたＴ細胞自体によるＩＬ－２の生産をもたらすことができる。ＩＬ－２の発現に続いて、ＩＣＯＳおよびＣＤ４０Ｌなどの他の制御分子に加えて、ＣＤ２５としても知られるＩＬ－２受容体の第３の成分（α鎖と呼ばれる）の上方制御も存在し得る。ＩＬ－２のその高親和性受容体への結合は細胞増殖を促進するが、ＡＰＣ、主に樹状細胞は、環境条件に応じて、様々なサイトカインを生成するか、またはサイトカイン産生エフェクター細胞へのＣＤ４＋Ｔリンパ球の分化を誘導する表面タンパク質を発現する。
【0040】
図２は、３つの異なるプロセスによるエクスビボＴ細胞製造の段階を例示する。具体的には、Ｔ細胞を作製するための従来のエクスビボプロセス２０３を、本発明の短縮されたエクスビボプロセス２０５、２０７と比較して例示する。従来のプロセス２０３では、成熟Ｔ細胞は、少なくとも２回のインビトロ活性化工程に供され、そのうちの２つが示されている。このプロセス２０３は、少なくとも３５日のエクスビボ細胞培養完了、例えば少なくとも４２日、しばしばより長い時間を必要とし得る。逆に、プロセス２０５は、Ｔ細胞活性化を省略するので、わずか２１日以内にＴ細胞を生成することができる。活性化工程を省略することによって、Ｔ細胞のエクスビボ培養は実質的に短縮され、例えば２～３週間である。第３のプロセス２０７は、単一の活性化工程を含む。単一の活性化工程は、有効量のＴ細胞を生産するのに役立ち得る。２つの活性化工程ではなくただ１つの活性化を使用することによって、本発明の方法は、先行技術のＴ細胞製造プロセスよりも少なくとも１４日間短い時間でＴ細胞を生成することができる。
【0041】
図３は、インビトロでＴ細胞を生産するための２つの培養プロセスの比較を提供する。第１のプロセス３０３は、２つの活性化工程を含む。例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２およびＩＬ－１５を含む異なる活性化培地で二重陽性Ｔ細胞を処理することによって達成される２段階活性化プロセスは、製造プロセスを少なくとも１週間、一般にはそれを超えて増加させる。第２のプロセス３０５は、インビトロ活性化を省略する。
【0042】
本発明の方法は、単一の活性化工程を含み得る。単一の活性化工程は、Ｔ細胞を活性化試薬とともに７日以下の期間培養することを含むことができる。他の態様において、単一の活性化工程は、活性化培地中でＴ細胞を６日以下または５日以下または４日以下または３日以下または２日以下または１日以下培養することを含む。他の態様において、単一の活性化工程は、活性化培地中でＴ細胞を８日より長く、または９日より長く、または１０日より長く、または１１日より長く、または１２日より長く、または１３日より長く、または１４日より長く培養しないことを含む。単一の活性化工程は、単一の種類の活性化培地とともにＴ細胞を培養することを含むことができる。単一の種類の活性化培地は、可溶性抗体などの活性化試薬を含むことができる。単一の活性化工程は、Ｔ細胞をａＡＰＣなどの抗原提示細胞と共培養することを含むことができる。単一の活性化工程は、Ｔ細胞をＰＢＭＣと共培養することを含むことができる。
【0043】
本発明の方法は、造血幹細胞／前駆細胞からのＴ細胞の生産を含む。造血幹細胞／前駆細胞は、一般に、臍帯血中に見出され得るＣＤ３４＋細胞に関連した。いくつかの例において、細胞は前駆細胞に由来し得る。いくつかの例において、細胞は、胚性幹細胞などの多能性幹細胞である。
【0044】
ＨＳＣから生産された同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞は、ある種の病状に対する治癒的治療アプローチを提供し得る。しかしながら、いくつかの制約としては、同種異系細胞療法に関連する罹患率および死亡率の大部分の原因であるドナーＴ細胞媒介性のアロ反応性プロセスであるＧＶＨＤが挙げられる。いくつかの臨床研究は、ドナーｉＮＫＴ細胞が疾患再発のリスクを増加させることなくＧＶＨＤを予防することができることを示す。ドナーＣＡＲ ｉＮＫＴ細胞の養子移入とそれに続くインビボ活性化および／または拡大増殖は、ＧＶＨＤの症候を予防または緩和し得る。この保護効果は、アロ反応性Ｔ細胞のＴｈ２極性化およびドナー制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の拡大増殖を通じて媒介され得る。同種異系ｉＮＫＴ細胞は、本発明の方法によって作製された場合、ＧＶＨＤを引き起こさないので、本明細書中に記載されている方法は、「オフザシェルフの」ＣＡＲ免疫療法のための理想的なプラットフォームを提供する。
【0045】
本発明の方法は、ＴＣＲの抗原認識領域の機能的再編成を介して抗原特異性を獲得する治療的に活性を有するＴ細胞を製造するのに有用である。ＴＣＲは、主要組織適合抗原複合体分子に結合された抗原を認識することに関与するＴ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見出される分子である。ＴＣＲは、少なくとも２つの異なるタンパク質鎖（例えば、ヘテロ二量体）から構成され得る。ほとんどの（例えば、９５％）Ｔ細胞では、これはα鎖およびβ鎖からなるのに対して、いくつかの（例えば、５％）Ｔ細胞では、これはγ鎖およびδ鎖からなる。このようなＴ細胞は、細胞表面ＴＣＲ分子に抗原特異性を有し得、古典的ＣＤ３陽性、α－βＴＣＲ ＣＤ４陽性、ＣＤ３陰性α－βＴＣＲ ＣＤ８陽性、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞などを含むがこれらに限定されない異なる表現型のサブセットへインビボで分化する。さらに、Ｔ細胞は、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、ターミナルエフェクターなどを含むがこれらに限定されない様々な活性化状態をさらに含み得る。
【0046】
好ましい態様において、本発明の方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞の製造を提供する。ＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫療法において使用するための、人工Ｔ細胞受容体を産生するように遺伝子操作されたＴ細胞である。ＣＡＲ（すなわち、キメラ抗原受容体）は、例えばレトロウイルスベクターによって促進されるＣＡＲのコード配列の導入を介して、ＴＣＲを有する幹細胞にモノクローナル抗体の特異性を移植するために使用され得る。ＣＡＲは、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的とする新しい能力を与えるように操作された受容体タンパク質である。これらの受容体は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を単一の受容体中に組み合わせるので、キメラである。したがって、本発明の方法は、癌細胞をより効果的に標的とし、破壊するために、癌細胞を認識する改変されたＴ細胞を生産することによる免疫療法のための生産物を提供する。
【0047】
本発明の方法を実施する際には、養子免疫療法治療において使用されるエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を操作するのに適した任意のＣＡＲが本発明において使用され得る。本発明において使用され得るＣＡＲとしては、参照によって組み入れられるＫｉｍ ａｎｄ Ｃｈｏ，２０２０，Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０（２）：２６３に記載されているものが挙げられる。
【0048】
ＣＡＲは一般に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、抗原結合／認識領域／ドメインを含み得る。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、特定の抗原、例えば腫瘍抗原、病原体抗原（例えば、ウイルス抗原）、ＣＤ（表面抗原分類）抗原に結合するのに有用である。細胞外ドメインは、新生タンパク質を小胞体内に誘導するシグナルペプチドも含み得る。ＣＡＲがグリコシル化され、細胞膜に固定されるべき場合には、シグナルペプチドは必須であり得る。膜貫通ドメインは、膜を貫く疎水性αヘリックスである。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。抗原認識後、受容体はクラスターを形成し、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用される細胞内成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３Ｘｉである。これは、抗原が結合された後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域も含むことができる。スペーサー領域は、抗原認識を容易にするために抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを許容するのに十分に柔軟であるべきである。スペーサーは、ＩｇＧ１からのヒンジ領域または免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域およびＣＤ３の一部であり得る。
【0049】
現在、３つの世代のＣＡＲが存在する。第１世代ＣＡＲは、典型的には、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質シグナル伝達ドメインに融合された、膜貫通ドメインに融合された抗体由来の抗原認識ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む。第１世代ＣＡＲは、典型的には、内因性ＴＣＲからのシグナルの一次伝達物質であるＣＤ３ Ｘｉ鎖由来の細胞内ドメインを有する。第１世代ＣＡＲは、デノボ抗原認識を提供し、ＨＬＡによって媒介される抗原提示とは無関係に、単一融合分子内のＣＡＲのＣＤ３ Ｘｉ鎖シグナル伝達ドメインを介してＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を引き起こすことができる。１つの非限定的な例では、Ｔ細胞は、細胞傷害性を腫瘍細胞に向けるように指示する人工ＴＣＲを発現するように遺伝子操作することができ、考察については、参照により組み入れられるＥｓｈｈａｒ １９９３，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｏｒ ｚｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，９０，７２０－７２４を参照されたい。第２世代ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲと類似しているが、ＣＤ２８または４－１ＢＢなどの２つの共刺激ドメインを含む。これらの細胞内シグナル伝達ドメインの関与は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌、アポトーシスに対する耐性およびインビボ持続性を改善する。第３世代ＣＡＲは、Ｔ細胞活性をさらに増強するために、ＣＤ２８－４１ＢＢまたはＣＤ２８－ＯＸ４０などの複数の共刺激ドメインを組み合わせる。
【0050】
いくつかの例において、本発明の方法は、さらなる導入遺伝子（すなわち、ＣＡＲまたはＴＣＲの１つに加えた導入遺伝子）を提供するためにＨＳＣの遺伝子改変を行うことを含む。例えば、いくつかの態様において、さらなる導入遺伝子は１またはそれを超えるサイトカインをコードする。サイトカインは、免疫系のある種の細胞によって分泌され、他の細胞に影響を及ぼすインターフェロン、インターロイキンおよび増殖因子などの物質に関する。本発明の態様によれば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１の１つまたはそれより多くをコードする導入遺伝子が、Ｔ細胞機能または腫瘍有効性を促進するために提供され得る。
【0051】
ＣＡＲ Ｔ細胞への１またはそれを超える導入遺伝子の導入は、Ｔ細胞拡大増殖および持続性（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７／１５を使用する）、ＩＦＮ－ｇ産生およびＴ細胞効力（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８による）などの特性を改善し、ナイーブサブセットを増強し（例えば、ＩＬ－２１）、安全性を改善し（例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦまたはＣＲＳおよび神経毒性の他の媒介物質の阻害剤を介して）または腫瘍微小環境と対抗することによって有効性を改善し得る（ＴＧＦ－Ｂ、チェックポイント等）。
【0052】
例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８は、ＣＡＲ Ｔ細胞のある種のエフェクター機能を増強することにおいて主要な役割を果たす。ＩＬ－１２は、ある種のＮＫ細胞およびＴリンパ球を活性化し、Ｔｈ－１型応答を誘導し、ＩＦＮ－γ分泌を増加させることが知られている。ＩＬ－１２の誘導性発現は、リンパ腫、肝細胞癌腫、卵巣腫瘍およびＢ１６黒色腫などのある種の病状に対するＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍能力を増強し得る。ＩＬ－１８はまた、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療可能性を改善するために使用されてきた。最初にＩＦＮ－γの強力な誘導物質として同定されたＩＬ－１８は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化ならびにＴｈ－１細胞の極性化に寄与し得る。例えば、Ｍｅｓｏ標的化ＣＡＲ Ｔ細胞には、ＩＦＮ－γの分泌を増強し、癌細胞を根絶するために、ＩＬ－１８をコードする導入遺伝子が提供され得る。さらなる考察については、参照により組み入れられる、Ｔｉａｎ，２０２０，Ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ １３（５）を参照されたい。
【0053】
ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１は、幹細胞様メモリーＴ細胞表現型の生成を促進するのに有用である。この表現型は、インビボでのＴ細胞の増加された拡大増殖および持続性をもたらし得る。いくつかの例において、ＩＬ－２をコードする導入遺伝子が提供され得る。Ｔ細胞をＩＬ－２とともに生産することにより、例えば、栄養素の感知および取り込みに関与するタンパク質の誘導および生産を促進することによって、腫瘍環境に応答する改善された能力を有するＴ細胞が提供され得る。
【0054】
いくつかの態様において、導入遺伝子はサイトカイン放出症候群の阻害剤である。サイトカイン放出症候群は、しばしばＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関連する重篤で生命を脅かす可能性がある副作用に関する。サイトカイン放出症候群は、例えばＩＦＮ－γおよびＩＬ－６を含む過剰な炎症性サイトカイン放出によって引き起こされる急速な（過剰）免疫反応として現れる。サイトカイン放出症候群に関与する多くのサイトカインは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を通じて機能することが知られている。したがって、いくつかの態様において、本発明の方法は、インビボＣＡＲ－Ｔ細胞増殖、抗腫瘍活性およびサイトカインレベルを改善するために、ＪＡＫ経路の阻害剤を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を生産することを含む。例えば、ＩＬ－６、ＪＡＫ－ＳＴＡＴまたはＢＴＫの機能を阻害する導入遺伝子が提供され得る。さらに、阻害剤は、神経毒性の阻害にさらに有用であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞関連神経毒性は、発作および昏睡などの重度の神経障害をしばしば引き起こす症候群である。
【0055】
他の例において、方法は、導入遺伝子をＨＳＣに導入することを含み、導入遺伝子は、チェックポイント阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイントは、免疫系のある種の局面の制御因子である。正常な生理的条件では、チェックポイントは、免疫系が宿主抗原に応答することを可能にし、健康な組織を保存する。癌では、これらの分子は腫瘍細胞の回避を促進する。いくつかの例において、導入遺伝子は、抗カテプシン抗体、ガレクチン－１遮断および抗ＯＸ４０アゴニスト抗体などの抗体または抗体断片をコードし得る。抗体は、分泌されるか、または細胞の表面上に発現され得る。例えば、ＰＤ１またはＰＤＬ１を標的とする抗体が分泌され得る。
【0056】
複数の態様において、トランスフォーミング増殖因子βの阻害剤を発現するＣＡＲ Ｔ細胞が生産される。操作された細胞は、それらの有効性を制限する不利な微小環境に直面する。環境を調節することは、ＣＡＲ Ｔ細胞が増殖し、生存し、および／または癌細胞を死滅させる能力を促進するために有用であり得る。腫瘍環境内の主な阻害機構の１つは、トランスフォーミング増殖因子βである。したがって、本発明のいくつかの局面は、トランスフォーミング増殖因子βの阻害剤をコードする導入遺伝子を導入することを含む。阻害剤は、例えば、抗体またはその断片であり得る。抗体または抗体断片は、トランスフォーミング増殖因子βの正常な機能を妨害するためにＣＡＲ Ｔ細胞から分泌され得る。
【0057】
いくつかの態様において、方法は、腫瘍微小環境のマーカーを通じて固形腫瘍型を標的とするためにＣＡＲ Ｔ細胞を作製することを含む。他の態様において、方法は、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）をベースとするキメラ抗原受容体を有するＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、これは腫瘍特異的標的を必要とせずに腫瘍微小環境のマーカーを認識するために使用され得る。本発明によるＶＨＨをベースとするＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫チェックポイント受容体を通じてまたは間質および細胞外マトリックスマーカーを通じて腫瘍微小環境を標的とし得、同系の免疫適格動物モデルにおいて固形腫瘍に対して有効である。したがって、本発明の方法は、腫瘍特異的抗原発現を欠如し得る腫瘍を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を作製するのに有用である。重鎖のみの抗体の可変領域（ＶＨＨまたはナノボディ）は、伝統的な短鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と同等の親和性を有する小さい安定なラクダ類由来の単一ドメイン抗体断片である。ＶＨＨは一般にｓｃＦｖよりも免疫原性が低く、そのサイズが小さいため、ｓｃＦｖによって見られるエピトープとは異なるエピトープにアクセスすることができる。したがって、本発明によって提供されるＶＨＨは、ＣＡＲ Ｔ細胞において適切な抗原認識ドメインとしての役割を果たすことができる。ｓｃＦｖとは異なり、ＶＨＨは、Ｖ領域対合に伴う追加の折り畳みおよび組み立て工程を必要としない。ＶＨＨは、大規模なリンカー最適化または他の種類の再設定を必要とせずに表面ディスプレイを可能にする。様々な、ＶＨＨをベースとする認識ドメインを切り替えることができるため、それぞれの新しい通常の抗体の形式をｓｃＦｖに設定し直す必要なしに利用できる高度にモジュラー式のプラットフォームが得られる。
【0058】
さらに、多くの微小環境は、ＰＤ－Ｌ１などの阻害性分子の発現を伴う。認識ドメインとしてＶＨＨを使用して、例えばＰＤ－Ｌ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞、本発明の方法によって生産されたＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境を標的とすることができる。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍細胞上ならびに浸潤骨髄細胞およびリンパ球上に広く発現される。ＰＤ－Ｌ１を認識するＣＡＲは、免疫阻害を軽減し、同時に腫瘍微小環境におけるＣＡＲ Ｔ細胞活性化を可能にするはずである。したがって、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境を再プログラムし、免疫抑制シグナルを減衰させ、炎症を促進し得る。例えば、Ｘｉｅ，２０１９に論述されているように、腫瘍微小環境を標的とする、ナノボディをベースとするＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫適格マウスにおける固形腫瘍の成長を阻害する、参照によって組み入れられるＰＮＡＳ Ａｐｒｉｌ １６，２０１９ １１６（１６）７６２４－７６３１。
【0059】
本開示の態様によれば、ＣＤ３４＋幹細胞は、ＣＡＲ、ＴＣＲおよびさらなる導入遺伝子（例えば、サイトカイン）の１つまたはそれより多くを発現するように遺伝子操作される。腫瘍またはウイルス抗原特異的細胞を提供するための細胞の最初の遺伝子改変のために、レトロウイルスベクターがウイルス形質導入のために使用され得る。レトロウイルスベクターと培養中のヒト細胞に感染する適切なパッケージングとの組み合わせは、当技術分野で公知である。好ましい態様において、第３世代レンチウイルスベクターが使用され得る。ベクターは、好ましい抗原を標的とするために抗体または抗体断片の配列を含有するｃＤＮＡ配列で改変され得る。例えば、各々が参照により組み入れられるＣａｒｐｅｎｉｔｏ，２００８，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ，ＰＮＡＳ，１０６（９）３３６０－３３６５；Ｌｉ，２０１７，Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３ ｗｉｔｈ ４１ＢＢ Ｚｅｔａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｔｈ１ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２８（５）：４３７－４４８；Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ，２０１４，Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｌａｓｔｉｎｇ ＣＤ４－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６１（６）：１－１４に記載されているように。
【0060】
本開示のいくつかの局面は、複数の導入遺伝子をＨＳＣに導入し、発現させることを含む。複数の遺伝子の発現を促進するために、核酸上において、２Ａ配列、すなわち２Ａペプチドのコードドメインで導入遺伝子を分離することが有用であり得る。２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａペプチドは、タンパク質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘導することができる１８～２２アミノ酸長のペプチドのクラスである。細胞内では、２Ａペプチドのコードドメインが２つのタンパク質（例えば、ＴＣＲおよびＣＡＲ）の２つのコードドメインの間に挿入されると、ペプチドは、リボソームスキッピングのために、独立して折り畳まれる２つのタンパク質に翻訳される。
【0061】
本発明の方法は、臨床適用のために、操作されたＨＳＣをＴ細胞に形質転換するのに有用である。形質転換の方法は、一般に、ＨＳＣのＴ細胞への分化を含む。細胞分化は、細胞がある細胞型から別の細胞型に変化するプロセスである。通常、細胞は、より特殊化された型に変化する。ＨＳＣのＴ細胞への分化は、多段階の分化を含み得る。第１段階として、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ４ ＣＤ８二重陰性Ｔ細胞に分化させ得る。二重陰性Ｔ細胞の生成は、造血サイトカインを含む細胞因子のカクテルの存在下でのＣＤ３４＋細胞の培養によって達成され得る。カクテルは、造血系指定のために、ＳＣＦ（例えば、ｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３Ｌ（例えば、ｈＦｌｔ３Ｌ）および少なくとも１つのサイトカインおよびｂＦＧＦを含み得る。サイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２およびＩＬ－２１を含むがこれらに限定されないＴｈ１サイトカインであり得る。細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４１ａ、ｃｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ１、ＩＬ７Ｒαの発現について、ＦＡＣＳによって免疫表現型的に分析され得る。
【0062】
二重陰性Ｔ細胞は、機能的な不活化されたＴ細胞を生産するために抗原非依存性成熟プロセスを介してさらに分化され得る。このプロセスは、リンパ系前駆細胞拡大増殖培地中で二重陰性Ｔ細胞を培養することを含み得る。培地は、例えば、フィーダー細胞およびＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌおよび少なくとも１つのサイトカインを含み得る。サイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２およびＩＬ－２１を含むがこれらに限定されないＴｈ１サイトカインであり得る。いくつかの態様において、サイトカインは、細胞の生存および／または機能的可能性を増大させ得る。
【0063】
活性化および／または拡大増殖工程を経ていないＴ細胞を含むＴ細胞を含む細胞生産物は、新生物、病原体感染または感染性疾患の処置のために、対象に全身的にまたは直接提供することができる。一態様において、本発明のＴ細胞は、関心対象の器官（例えば、新生物によって影響を受けた器官）に直接注射され得る。あるいは、Ｔ細胞およびそれを含む組成物は、例えば循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、関心対象の器官に間接的に提供することができる。好ましくは、Ｔ細胞の活性化および拡大増殖は、対象への導入後にインビボで起こる。
【0064】
本発明のＴ細胞およびそれを含む組成物は、任意の生理学的に許容され得るビヒクルに入れて、通常は血管内に投与され得るが、骨または細胞が再生および分化のための適切な部位を見出し得る他の好都合な部位（例えば、胸腺）にも導入され得る。通常、少なくとも１０万個の細胞が投与され、時には１００億個またはそれを超える細胞が投与される。
【0065】
本発明の方法は、同種異系細胞療法の投与のための薬学的組成物と組み合わされ得る細胞の組成物を提供する。本発明の治療用組成物（例えば、ＨＳＣ由来のＣＡＲ Ｔ細胞を含む薬学的組成物）を投与する場合、本発明の治療用組成物は、一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で調合される。組成物は、治療有効濃度で提供され得る。治療有効濃度は、処置に際して有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１またはそれを超える用量で対象に投与され得る。処置に関して、有効量は、疾患の進行を緩和し、改善し、安定化し、逆転させ、もしくは遅延させるか、またはその他、疾患の病理学的帰結を軽減するのに十分な量である。有効量は、一般に、症例ごとに医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定するときには、通例、いくつかの因子が考慮に入れられる。これらの因子には、対象の年齢、性別および体重、処置されている症状、症状の重症度ならびに投与される抗原結合断片の形態および有効濃度が含まれる。
【0066】
本発明の抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法の場合、１，０００万～１００億の範囲の細胞用量が注入され得る。Ｔ細胞を対象に投与すると、Ｔ細胞は抗原依存性活性化プロセスを経験し得る。
【0067】
本開示は、細胞療法および／または研究のためのＴ細胞の製造方法を提供する。いくつかの局面において、方法は、エクスビボ細胞培養の時間を短縮することによってＴ細胞製造の経済的な方法を提供する。いくつかの関連する局面において、本発明の方法は、増強された細胞傷害効果を有するＴ細胞の製造を提供する。以前には、長期細胞培養には、ある種の細胞型の転写および表現型の変化が伴っていた。培養中のＴ細胞の転写および表現型の変化はあまり特性評価されていないが、本開示は、長期培養中の細胞の意図せぬ変化が、同種異系細胞において認められた治療有効性の観察された低下および生産物バッチの変動性を説明し得ることを認識している。例えば、Ｔ細胞の長期細胞培養は、エフェクター機能の喪失を反映する上昇したレベルの疲弊マーカーを生じ得る。例えば、長期培養には、ＰＤ１、ＬＡＧ３の増加した発現が伴い得る。ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、さらなる考察については、参照により組み入れられる、Ｗｈｅｒｒｙ，２０１６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５（８）：４８６－４９９を参照されたい。エクスビボ製造を短縮することによって、本発明の方法は、治療上有効なＴ細胞の一貫した生産に有用である。
【0068】
したがって、一局面において、本開示は、Ｔ細胞を生産する方法を提供する。この方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）のＴ細胞へのインビトロ分化および成熟を含むプロセスを実施することを含み、ただし、このプロセスは、Ｔ細胞の活性化および／または拡大増殖のその後のインビトロ工程を含まない。むしろ、Ｔ細胞の活性化および／または拡大増殖は、好ましくは、対象への導入後にインビボで起こる。有利なことに、インビトロ活性化および／またはＴ細胞拡大増殖を省略することにより、従来のＴ細胞製造プロセスから数週間（例えば、少なくとも２週間）が節約され、これは増強された細胞傷害効果を有するＴ細胞を生産するのに有用であり得る。
【0069】
本発明の方法は、安全であり、有効である同種異系療法を生産するのに有用である。いくつかの例において、方法は、生産物の品質を確保するために、製造中の１またはそれを超える時点で細胞生産物を性質決定することを含み得る。いくつかの態様において、本発明の方法は、Ｔ細胞によって発現される１またはそれを超えるタンパク質を同定するために、Ｔ細胞を分析することを含む。１またはそれを超えるタンパク質は、１またはそれを超えるＣＣＲ７、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ４５ＲＡを含み得る。タンパク質は、ナイーブ幹細胞に伴われるマーカーを含み得る。分析することは、好ましくは、細胞表面タンパク質を分析するハイスループット法、例えば、ＦＡＣＳなどのバルク中の個々の細胞の蛍光シグナルに基づく方法を含む。
【0070】
要求に応じて処置を利用できることは、同種異系細胞療法の１つの利点である。方法は、臨床適用前に細胞の製造を含み得るので、いくつかの好ましい方法は、Ｔ細胞を凍結保存することを含み得る。Ｔ細胞を凍結保存することは、患者によって細胞が必要とされるまで細胞を安全かつ効果的に保存するのに有用である。凍結保存することは、そこで細胞生産物を患者に投与することができる臨床施設への細胞生産物の輸送にも有用である。いくつかの好ましい態様において、二重陽性Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）は、インビトロ活性化工程を行わずに凍結保存される。
【0071】
過去１０年間にわたって、免疫療法は新世代の癌医療となってきた。特に、細胞ベースの細胞療法は大いに有望であることが示されている。顕著な例はＣＡＲ操作された養子Ｔ細胞療法であり、これはある種の血液癌を顕著な有効性で標的とする。しかしながら、処置のための現在のプロトコルのほとんどは、患者から収集された免疫細胞が製造され、この単一の患者を処置するために使用される自家養子細胞移入からなる。このようなアプローチは、費用がかかり、製造労働集約的であり、必要とするすべての患者に広く送達することが困難である。同種異系免疫細胞生産物は、本明細書に記載されている方法によって、大規模に製造することができ、したがって、より多数の患者を処置するために容易に配布することができ、したがって、大きな需要がある。
【0072】
いくつかの態様は、操作されたｉＮＫＴ細胞または操作されたｉＮＫＴ細胞の集団に関する。少なくともいくつかの事例では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび／または操作されたＴ細胞受容体を含む。細胞との関連で論じられる任意の態様は、このような細胞の集団に適用され得る。特定の態様において、操作されたｉＮＫＴ細胞は、以下の：ｉ）インバリアントαＴ細胞受容体コード配列の全部もしくは一部；ｉｉ）インバリアントβＴ細胞受容体コード配列の全部もしくは一部またはｉｉｉ）自殺遺伝子の１つ、２つおよび／または３つを含む核酸を含む。さらなる態様において、ｉ）インバリアントαＴ細胞受容体の全部もしくは一部；ｉｉ）インバリアントβＴ細胞受容体の全部もしくは一部および／またはｉｉｉ）自殺遺伝子産物をコードする配列を有する核酸を含む操作されたｉＮＫＴ細胞が存在する。
【0073】
さらなる局面は、ＮＫ活性化受容体の増加したレベル、ＮＫ阻害受容体の減少したレベルおよび／または細胞傷害性分子の増加したレベルを有する操作されたｉＮＫＴ細胞に関する。いくつかの態様において、ＮＫ活性化受容体は、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＤＮＡＭ－１を含む。いくつかの態様において、細胞傷害性分子は、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢを含む。いくつかの態様において、阻害剤受容体はＫＩＲを含む。増加または減少は、健康な個体から単離された遺伝子操作されていないｉＮＫＴにおける同じマーカーのレベルに対するものであり得る。さらなる局面は、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団に関し、細胞の集団はＮＫ活性化受容体の増加したレベル、ＮＫ阻害受容体の減少したレベルおよび／または細胞傷害性分子の増加したレベルを有する。
【0074】
いくつかの態様において、操作されたｉＮＫＴ細胞は、異種プロモーターの調節下にある核酸を含み、異種プロモーターとは、そのプロモーターが核酸の転写を調節する同じゲノムプロモーターではないことを意味する。操作されたｉＮＫＴ細胞は、その一部または全部が本明細書に記載されている多くの態様において異種プロモーターの調節下にある１またはそれを超えるコード配列を含む外因性核酸を含むことが企図される。
【0075】
特定の態様において、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラーＴ細胞受容体（ｉＮＫＴ ＴＣＲ）および外因性自殺遺伝子産物を発現する操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞が存在し、少なくとも１つのｉＮＫＴ ＴＣＲは、外因性核酸からおよび／または組換え的に修飾されたプロモーター領域の転写調節下にある内因性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現される。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、「ＣＤ Ｉｄ分子によって提示される脂質抗原を認識するＴＣＲ」を指す。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、α－ＴＣＲ、β－ＴＣＲまたはその両方を含み得る。いくつかの事例において、利用されるＴＣＲは、ＭＡＩＴ細胞ＴＣＲ、ＧＥＭ細胞ＴＣＲまたはγ／δＴＣＲなどの、「インバリアントＴＣＲ」のより広い群に属することができ、それぞれ、ＨＳＣ操作されたＭＡＩＴ細胞、ＧＥＭ細胞またはγ／δＴ細胞をもたらす。
【0076】
ある態様において、自殺遺伝子は酵素ベースである、すなわち自殺遺伝子の遺伝子産物は酵素であり、自殺機能は酵素活性に依存する。１またはそれを超える自殺遺伝子は、単一の細胞またはクローン集団において利用され得る。いくつかの態様において、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、βラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡまたは誘導性カスパーゼ９をコードする。すべて参照によりそれらの全体が組み入れられる米国特許第８６２８７６７号、米国特許出願公開第２０１４０３６９９７９号、米国特許出願公開第２０１４０２４２０３３号および米国特許出願公開第２００４００１４１９１号におけるなどの、自殺遺伝子使用のための当該技術分野における方法が使用され得る。さらなる態様において、ＴＫ遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子、すなわちウイルス（ｖｉｍｓ）由来のＴＫ遺伝子である。特定の態様において、ＴＫ遺伝子は単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である。いくつかの態様において、自殺遺伝子産物は、基質によって活性化される。チミジンキナーゼは、ガンシクロビル、ペンシクロビルまたはこれらの誘導体によって活性化される自殺遺伝子産物である。ある態様において、自殺遺伝子産物を活性化する基質は、検出されるために標識される。いくつかの例において、画像化のために標識され得る基質。いくつかの態様において、自殺遺伝子産物は、ＴＣＲ－αまたはＴＣＲ－βの一方または両方をコードする同じまたは異なる核酸分子によってコードされ得る。ある態様において、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である。代替の態様において、細胞は外因性自殺遺伝子を発現しない。いくつかの態様において、操作されたｉＮＫＴ細胞は、α－ガラクトシルセラミド（ａ－ＧＣ）に特異的に結合する。
【0077】
さらなる態様において、細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩもしくはＨＬＡ－ＩＩ分子を欠如しているか、または少なくとも１つのＨＬＡ－ＩもしくはＨＬＡ－ＩＩ分子の低下した表面発現を有する。いくつかの態様において、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－Ｐ分子の表面発現の欠如は、個々のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子をコードする遺伝子を破壊することによって、またはすべてのＨＬＡ－Ｉ複合体分子の共通成分であるＢ２Ｍ（β２ミクログロブリン）をコードする遺伝子を破壊することによって、またはすべてのＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現を調節する極めて重要な転写因子であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合抗原複合体トランス活性化因子）をコードする遺伝子を破壊することによって達成される。特定の態様において、細胞は、１もしくはそれを超えるＨＬＡ－Ｉおよび／もしくはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠如しているか、または５０、６０、７０、８０、９０、１００％（またはその中の任意の導出可能な範囲）だけ（または少なくともそれだけ）低下したレベルのこのような分子を発現する。いくつかの態様において、細胞が遺伝子編集によって操作されたので、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩは、ｉＮＫＴ細胞において発現されない。
【0078】
いくつかの態様において、ｉＮＫＴ細胞は、細胞に導入された、組換えベクターまたは組換えベクターからの核酸配列を含む。ある態様において、組換えベクターはウイルスベクターであるか、またはウイルスベクターであった。さらなる態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスもしくはアデノウイルスであるか、またはそれらであった。ある種のウイルスベクターの核酸は、宿主ゲノム配列に組み込まれることが理解される。
【0079】
「ベクター」または「構築物」（遺伝子送達または遺伝子導入「ビヒクル」と称されることがある。）は、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む高分子、分子の複合体またはウイルス粒子を指す。ポリヌクレオチドは、直鎖状または環状分子であり得る。ベクターの一般的な種類である「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。ある事例において、プラスミドは環状であり、二本鎖である。
【0080】
特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「導入遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」または「導入遺伝子」は、適切な制御配列の調節下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボで転写され、必要に応じて遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ形態のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子には、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、遺伝子配列の３’側に位置する。
【0081】
「細胞」という用語は、本明細書では当技術分野におけるその最も広い意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、細胞を外部から隔離する膜構造によって取り囲まれ、自己複製能を有し、遺伝情報および遺伝情報を発現するための機構を有する生体（ｌｉｖｉｎｇ ｂｏｄｙ）を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
【0082】
ｉＮＫＴ細胞は、マウスからヒトまで高度に保存されたαβＴリンパ球の小さな集団である。ｉＮＫＴ細胞は、癌、感染症、アレルギーおよび自己免疫を含む多くの疾患の制御において重要な役割を果たすことが示唆されてきた。刺激されると、ｉＮＫＴ細胞は、細胞集団としておよび単一細胞レベルで、大量のエフェクターサイトカイン、例えばＩＦＮ－γおよびＩＬ－４などを迅速に放出する。次いで、これらのサイトカインは、自然免疫系のナチュラルキラー細胞および樹状細胞（ＤＣ）ならびに活性化されたＤＣを介した適応免疫系のＣＤ４ヘルパーおよびＣＤ８細胞傷害性通常型αβＴ細胞などの様々な免疫エフェクター細胞を活性化する。それらの固有の活性化機構のために、ｉＮＫＴ細胞は、抗原およびＭＨＣ、拘束とは無関係に複数の疾患を攻撃することができ、ｉＮＫＴ細胞を魅力的な普遍的治療剤にする。
【0083】
以前に、主に癌を標的とする一連のｉＮＫＴ細胞をベースとした臨床試験が行われてきた。最近の試験は、頭頸部扁平上皮細胞癌腫を有する患者における抗腫瘍免疫の促進を報告し、ｉＮＫＴ細胞をベースとする免疫療法の可能性が証明された。しかしながら、今日までのほとんどの臨床試験は、内因性ｉＮＫＴ細胞の直接的な活性化またはエクスビボ拡大増殖に基づいており、それによって少数の患者に短期的な限定された臨床的利益しかもたらさないので、満足のいく結果を与えていない。ヒトにおけるｉＮＫＴ細胞の低い頻度および高い変動性（血中で約０．０１～１％）ならびに活性化後のこれらの細胞の急速な枯渇は、これらの試験の成功を制限する主な障害であると考えられる。
【0084】
ｉＮＫＴ細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から操作されてきた。参照により組み入れられる、米国特許第８，９４５，９２２号を参照されたい。ｉＰＳ細胞は、外因性の核再プログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃなどで体細胞を形質導入することによって生産される。残念ながら、外因性核再プログラミング因子の転写レベルは、多能性状態への細胞移行とともに減少するので、安定なｉＰＳ細胞株生産の効率は減少し得る。さらに、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃは腫瘍形成をもたらす癌遺伝子であるので、外因性核再プログラミング因子の転写がｉＰＳ細胞中で再開し、ｉＰＳ細胞に由来する細胞からの新生物の発生を引き起こすことができる。
【0085】
本発明の方法は、例えば、それらの各々が参照により組み入れられる米国特許出願公開第２０１７０２８３４８１号および国際出願第２０１９２４１４００号に論述されているように、ｉＮＫＴ細胞を生産するために使用され得る。
【0086】
一例として、いくつかの態様において、本発明の方法は、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列がＣＤ４／ＤＮ／ＣＤ８サブセットまたはＴｈ１、Ｔｈ２もしくはＴｈ１７サイトカインを生産するサブセットなどのｉＮＫＴ細胞のサブセットから得られ、二重陰性ｉＮＫＴ細胞を含むｉＮＫＴ細胞を生産する。いくつかの態様において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列は、黒色腫、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、リンパ腫、白血病、血液悪性腫瘍などの癌を有したかまたは有するドナー由来のｉＮＫＴ細胞から得られる。いくつかの態様において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、１つのｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲα鎖配列および異なるｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲβ鎖配列を有する。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列がそれから得られるｉＮＫＴ細胞およびＴＣＲβ鎖配列がそれから得られるｉＮＫＴ細胞は、同じドナーに由来する。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列がそれから得られるｉＮＫＴ細胞のドナーは、ＴＣＲβ鎖配列がそれから得られるｉＮＫＴ細胞のドナーとは異なる。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列および／またはＴＣＲβ鎖配列は、発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列および／またはＴＣＲβ鎖配列は、修飾されていない配列によってコードされるポリペプチドと比較して１またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失および／または切断を有するポリペプチドをコードするように修飾されている。いくつかの態様において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、ＣＤ１ｄ上に提示されるα－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）を認識するＴ細胞受容体をコードする。いくつかの態様において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は発現ベクター中に含有される。いくつかの態様において、発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである。いくつかの態様において、発現ベクターは、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子がＭＩＧベクターのＩＲＥＳ－ＥＧＦＰセグメントを置き換えるＭＩＧベクターである。いくつかの態様において、発現ベクターはｐｈｉＮＫＴ－ＥＧＦＰである。
【0087】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植する操作された受容体を指す。これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞上に移植するために使用され、それらのコード配列の導入はレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって促進される。これらの受容体は、異なる供給源由来の部分から構成されるので、キメラと呼ばれる。これらの分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３－ζ膜貫通およびエンドドメイン、ＣＤ２８もしくは４１ＢＢ細胞内ドメインまたはこれらの組み合わせに融合された、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物である。このような分子は、ｓｃＦｖによるその標的の認識に応答してシグナルの伝達をもたらす。このような構築物の例は、（ジシアロガングリオシドＧＤ２を認識する）ハイブリドーマ１４ｇ２ａに由来するｓｃＦｖの融合物である１４ｇ２ａ－ζである。Ｔ細胞がこの分子を発現すると（例として、オンコレトロウイルスベクター形質導入によって達成される）、Ｔ細胞は、ＧＤ２を発現する標的細胞（例えば、神経芽細胞腫細胞）を認識して死滅させる。悪性Ｂ細胞を標的とするために、研究者らは、Ｂ系列分子であるＣＤ１９に対して特異的なキメラ免疫受容体を使用して、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトした。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分は、柔軟なリンカーによって融合されてｓｃＦｖを形成する。このｓｃＦｖの前には、新生タンパク質を小胞体およびその後の表面発現に導くシグナルペプチド（これは切断される）が存在する。柔軟なスペーサーは、抗原結合を可能にするために、ｓｃＦｖが異なる方向に配向することを可能にする。膜貫通ドメインは、細胞内に突出し、所望のシグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメインの元の分子に通常由来する典型的な疎水性αヘリックスである。
【0088】
好ましくは、ＣＡＲは特定の腫瘍抗原に向けられる。ＣＡＲが向けられ得る腫瘍細胞抗原の例としては、例えば、少なくとも５Ｔ４、８Ｈ９、ａｎｂｂインテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体－ａ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲｃｃ、ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＩＬ－１３Ｒｃｘ２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、カッパ、ＫＤＲ、ＭＡＧＥ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、癌胎児性抗原、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ－１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ラミニン受容体、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ－４、カルシウム活性化型塩化物チャネル２、サイクリン－Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ－１、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ－２、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＧＰ１００／ｐｍｅｌｌ７、ＴＲＰ－１／－２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原、ｂ－カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ－２、ＴＧＦ＾ＲＩＩ、またはＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２）が挙げられる。ＣＡＲは、第１世代、第２世代、第３世代またはそれより後の世代のＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、任意の２つの同一でない抗原に対して二重特異性であり得るか、または２つより多い同一でない抗原に対して特異的であり得る。
【0089】
いくつかの態様において、核酸は、本明細書に論述されているように、ａ－ＴＣＲおよび／またはｂ－ＴＣＲをコードする核酸配列を含み得る。ある態様において、１つの核酸は、ａ－ＴＣＲとｂ－ＴＣＲの両方をコードする。さらなる態様において、核酸は、自殺遺伝子産物をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、選択されたＣＤ３４＋細胞に導入される核酸分子は、ａ－ＴＣＲ、ｂ－ＴＣＲおよび自殺遺伝子産物をコードする。他の態様において、方法は、選択されたＣＤ３４＋細胞に自殺遺伝子産物をコードする核酸を導入することも含み、この場合には、ＴＣＲ遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸とは異なる核酸分子が、自殺遺伝子産物をコードする。
【0090】
操作されたｉＮＫＴ細胞およびｉＮＫＴ細胞集団を調製し、作製し、製造し、および使用するための方法が提供される。方法は、複数の態様において、以下の工程の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くを含む：造血細胞を得る工程；造血前駆細胞を得る工程；１またはそれを超える造血細胞になることができる前駆細胞を得る工程；ｉＮＫＴ細胞になることができる前駆細胞を得る工程；１またはそれを超える細胞表面マーカーを使用して混合された細胞の集団から細胞を選択する工程；細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を選択する工程；細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離する工程；ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４－細胞を互いに分離する工程；ＣＤ３４以外のまたはＣＤ３４に追加した細胞表面マーカーに基づいて細胞を選択する工程；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸を細胞に導入する工程；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするウイルスベクターに細胞を感染させる工程；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸で細胞を形質移入する工程；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする発現構築物で細胞を形質移入する工程；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込む工程；自殺遺伝子産物をコードする１またはそれを超える核酸を細胞に導入する工程；自殺遺伝子産物をコードするウイルスベクターに細胞を感染させる工程；自殺遺伝子産物をコードする１またはそれを超える核酸で細胞を形質移入する工程；自殺遺伝子産物をコードする発現構築物で細胞を形質移入する工程；自殺遺伝子産物をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込む工程；１もしくはそれを超えるポリペプチドをコードする１もしくはそれを超える核酸および／または遺伝子編集のための核酸分子を細胞に導入する工程；１もしくはそれを超えるポリペプチドをコードするウイルスベクターおよび／または遺伝子編集のための核酸分子に細胞を感染させる工程；１もしくはそれを超えるポリペプチドをコードする１もしくはそれを超える核酸および／または遺伝子編集のための核酸分子で細胞を形質移入する工程；１もしくはそれを超えるポリペプチドをコードする発現構築物および／または遺伝子編集のための核酸分子で細胞を形質移入する工程；１もしくはそれを超えるポリペプチドをコードする外因性核酸および／または遺伝子編集のための核酸分子を組み込む工程；細胞のゲノムを編集する工程；細胞のプロモーター領域を編集する工程；ｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子のプロモーター領域および／またはエンハンサー領域を編集する工程；１またはそれを超える遺伝子の発現を排除する工程；単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を排除する工程；遺伝子編集のための１またはそれを超える核酸を細胞に形質移入する工程；単離されたまたは選択された細胞を培養する工程；単離されたまたは選択された細胞を拡大増殖させる工程；１またはそれを超える細胞表面マーカーについて選択された細胞を培養する工程；ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養する工程；単離されたＣＤ３４＋細胞を拡大増殖させる工程；ｉＮＫＴ細胞を生産または拡大増殖させるための条件下で細胞を培養する工程；人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系において細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を生産する工程；無血清培地中で細胞を培養する工程；Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団と無血清培地とを含む３Ｄ細胞凝集体を含む、ＡＴＯ系において細胞を培養する工程。一態様において、１またはそれを超える工程が除外され得ることが特に企図されている。
【0091】
操作されたｉＮＫＴ細胞を作製するために使用され得る細胞は、造血前駆幹細胞である。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞またはこれらの組み合わせに由来し得る。本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）から操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞である「ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞」ならびにその作製方法および使用方法を包含する。本明細書で使用される場合、「ＨＳＣ」は、ＨＳＣ、ＨＰＣまたはＨＳＣとＨＰＣの両方を指すために使用される。「造血幹および前駆細胞」または「造血前駆体細胞」は、造血系列に運命づけられているが、さらなる造血分化が可能な細胞を指し、造血幹細胞、多分化能造血幹細胞（血液芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞およびリンパ球系前駆細胞を含む。「造血幹細胞（ＨＳＣ）」は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ球系系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じる多分化能性幹細胞である。本開示において、ＨＳＣは、「造血幹および前駆細胞」および「造血前駆体細胞」の両方を指す。造血幹および前駆細胞は、ＣＤ３４を発現してもよく、または発現しなくてもよい。造血幹細胞は、ＣＤ１３３を共発現し得、ＣＤ３８発現について陰性、ＣＤ９０について陽性、ＣＤ４５ＲＡについて陰性、系列マーカーについて陰性またはこれらの組み合わせであり得る。造血前駆／前駆体細胞には、ＣＤ３４（＋）／ＣＤ３８（＋）細胞およびＣＤ３４（＋）／ＣＤ４５ＲＡ（＋）／ｌｉｎ（－）ＣＤ１０＋（リンパ球系共通前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ６２Ｌ（ｈｉ）（リンパ球系への分化能を保持する多分化能性前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３＋（顆粒球－単球前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３＋（骨髄系共通前駆細胞）またはＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３－（巨核球－赤血球前駆細胞）が含まれる。
【0092】
ある方法は、１またはそれを超える核酸を細胞に導入する前に、選択されたＣＤ３４＋細胞を培地中で培養することを含む。細胞を培養することは、選択されたＣＤ３４＋細胞を、１またはそれを超える増殖因子を含む培地とインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様において、１またはそれを超える増殖因子は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよび／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む。さらなる態様において、培地は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよびＴＰＯを含む。いくつかの態様において、１またはそれを超える増殖因子の濃度は、それぞれの増殖因子またはこれらの特定の増殖因子の全ての合計のいずれかに関して約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌである。培地中の単一の増殖因子または増殖因子の組み合わせの濃度は、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、約２４０、約２４５、約２５０、約２５５、約２６０、約２６５、約２７０、約２７５、約２８０、約２８５、約２９０、約２９５、約３００、約３０５、約３１０、約３１５、約３２０、約３２５、約３３０、約３３５、約３４０、約３４５、約３５０、約３５５、約３６０、約３６５、約３７０、約３７５、約３８０、約３８５、約３９０、約３９５、約４００、約４１０、約４２０、約４２５、約４３０、約４４０、約４４１、約４５０、約４６０、約４７０、約４７５、約４８０、約４９０、約５００（または導出可能な任意の範囲）ｎｇ／ｍｌもしくはｍｇ／ｍｌもしくはそれより多く、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約２０５、少なくとも約２１０、少なくとも約２１５、少なくとも約２２０、少なくとも約２２５、少なくとも約２３０、少なくとも約２３５、少なくとも約２４０、少なくとも約２４５、少なくとも約２５０、少なくとも約２５５、少なくとも約２６０、少なくとも約２６５、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８５、少なくとも約２９０、少なくとも約２９５、少なくとも約３００、少なくとも約３０５、少なくとも約３１０、少なくとも約３１５、少なくとも約３２０、少なくとも約３２５、少なくとも約３３０、少なくとも約３３５、少なくとも約３４０、少なくとも約３４５、少なくとも約３５０、少なくとも約３５５、少なくとも約３６０、少なくとも約３６５、少なくとも約３７０、少なくとも約３７５、少なくとも約３８０、少なくとも約３８５、少なくとも約３９０、少なくとも約３９５、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４２５、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４４１、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４７５、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００（または導出可能な任意の範囲）ｎｇ／ｍｌもしくはｍｇ／ｍｌもしくはそれより多く、または多くとも約５、多くとも約１０、多くとも約１５、多くとも約２０、多くとも約２５、多くとも約３０、多くとも約３５、多くとも約４０、多くとも約４５、多くとも約５０、多くとも約５５、多くとも約６０、多くとも約６５、多くとも約７０、多くとも約７５、多くとも約８０、多くとも約８５、多くとも約９０、多くとも約９５、多くとも約１００、多くとも約１０５、多くとも約１１０、多くとも約１１５、多くとも約１２０、多くとも約１２５、多くとも約１３０、多くとも約１３５、多くとも約１４０、多くとも約１４５、多くとも約１５０、多くとも約１５５、多くとも約１６０、多くとも約１６５、多くとも約１７０、多くとも約１７５、多くとも約１８０、多くとも約１８５、多くとも約１９０、多くとも約１９５、多くとも約２００、多くとも約２０５、多くとも約２１０、多くとも約２１５、多くとも約２２０、多くとも約２２５、多くとも約２３０、多くとも約２３５、多くとも約２４０、多くとも約２４５、多くとも約２５０、多くとも約２５５、多くとも約２６０、多くとも約２６５、多くとも約２７０、多くとも約２７５、多くとも約２８０、多くとも約２８５、多くとも約２９０、多くとも約２９５、多くとも約３００、多くとも約３０５、多くとも約３１０、多くとも約３１５、多くとも約３２０、多くとも約３２５、多くとも約３３０、多くとも約３３５、多くとも約３４０、多くとも約３４５、多くとも約３５０、多くとも約３５５、多くとも約３６０、多くとも約３６５、多くとも約３７０、多くとも約３７５、多くとも約３８０、多くとも約３８５、多くとも約３９０、多くとも約３９５、多くとも約４００、多くとも約４１０、多くとも約４２０、多くとも約４２５、多くとも約４３０、多くとも約４４０、多くとも約４４１、多くとも約４５０、多くとも約４６０、多くとも約４７０、多くとも約４７５、多くとも約４８０、多くとも約４９０、多くとも約５００（または導出可能な任意の範囲）ｎｇ／ｍｌもしくはｍｇ／ｍｌもしくはそれより多くであり得る。
【0093】
いくつかの態様において、細胞は無細胞培地中で培養される。ある態様において、無血清培地は、外から添加されたアスコルビン酸をさらに含む。特定の態様において、方法は、アスコルビン酸培地を添加することを含む。さらなる態様において、無血清培地は、以下の外から添加された成分：ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、インターフェロン－γ、インターフェロン－λ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレオトロフィンまたはミッドカインのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６全て（またはその中の導出可能な範囲）をさらに含む。さらなる態様において、無血清培地は１またはそれを超えるビタミンを含む。いくつかの事例において、無血清培地は、以下のビタミンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２（またはその中の任意の導出可能な範囲）を含む：ビオチン、ＤＬαトコフェロールアセタート、ＤＬα－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２またはこれらの塩を含む。ある態様において、培地は、ビオチン、ＤＬα－トコフェロールアセタート、ＤＬα－トコフェロール、ビタミンＡもしくはこれらの組み合わせもしくは塩を含むか、またはビオチン、ＤＬα－トコフェロールアセタート、ＤＬα－トコフェロール、ビタミンＡもしくはこれらの組み合わせもしくは塩を少なくとも含む。さらなる態様において、無血清培地は１またはそれを超えるタンパク質を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、以下のタンパク質：アルブミンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼのうちの１、２、３、４、５、６つもしくはそれより多く（またはその中の任意の導出可能な範囲）またはこれらの組み合わせを含む。他の態様において、無血清培地は、以下の化合物：コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カミチン（ｃａｍｉｔｉｎｅ）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウムもしくはトリヨード－Ｉ－チロニンのうちの１、２、３、４、５、、７、８、９、１０もしくは１１またはこれらの組み合わせを含む。さらなる態様において、無血清培地は、Ｂ－２７サプリメント、異種成分不含有のＢ－２７サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメントまたはこれらの組み合わせを含む。さらなる態様において、無血清培地は、アミノ酸、単糖類および／もしくは無機イオンを含むか、またはアミノ酸、単糖類および／もしくは無機イオンをさらに含む。いくつかの局面において、無血清培地は、以下のアミノ酸：アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシンもしくはバリンのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３、またはこれらの組み合わせを含む。他の局面において、無血清培地は、以下の無機イオン：ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素もしくはリンのうちの１、２、３、４、５もしくは６つ、またはこれらの組み合わせもしくは塩を含む。さらなる局面において、無血清培地は、以下の元素：モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅もしくはマンガンのうちの１、２、３、４、５、６もしくは７つ、またはこれらの組み合わせを含む。
【0094】
いくつかの方法において、細胞は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系中で培養される。ＡＴＯ系は、細胞の凝集体である三次元（３Ｄ）細胞凝集体を含む。ある態様において、３Ｄ細胞凝集体は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む。いくつかの態様において、３Ｄ細胞凝集体は、ＣＤ３４＋形質導入細胞を物理的マトリックスまたは足場上の間質細胞の選択された集団と混合することによって作製される。さらなる態様において、方法は、ＣＤ３４＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックスまたは足場上に配置された細胞ペレットを形成することを含む。ある態様において、間質細胞は、完全なままの、部分的なもしくは改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２またはこれらの組み合わせであるＮｏｔｃｈリガンドを発現する。さらなる態様において、ＮｏｔｃｈリガンドはヒトＮｏｔｃｈリガンドである。他の態様において、ＮｏｔｃｈリガンドはヒトＤＬＬ１である。
【0095】
細胞は直ちに使用され得、または将来の使用のために保存され得る。ある態様において、ｉＮＫＴ細胞を作製するために使用される細胞は凍結されるが、生産されたｉＮＫＴ細胞は、いくつかの態様において凍結され得る。いくつかの局面において、細胞は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯを含む溶液中にある。他の態様において、細胞は、無菌であり、非発熱原性であり、および等張性である溶液中に存在する。いくつかの態様において、操作されたｉＮＫＴ細胞は、造血幹細胞に由来する。いくつかの態様において、操作されたｉＮＫＴ細胞は、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋細胞に由来する。いくつかの態様において、細胞は、癌を有しないヒト患者からの細胞に由来する。いくつかの態様において、細胞は内因性ＴＣＲを発現しない。
【0096】
操作されたｉＮＫＴ細胞は、患者を処置するために使用され得る。いくつかの態様において、方法は、以前に凍結および解凍されたことがあってもよく、またはなくてもよい細胞集団に１またはそれを超える追加の核酸を導入することを含む。この使用は、オフザシェルフのｉＮＫＴ細胞を作製することの利点の１つを提供する。特定の態様において、１またはそれを超える追加の核酸は、１またはそれを超える治療用遺伝子産物をコードする。治療用遺伝子産物の例としては、少なくとも以下のものが挙げられる：１。抗原認識分子、例えばＣＡＲ（キメラ抗原受容体）および／もしくはＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；２。共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ；ならびに／または３。サイトカイン、例えば、ＩＬ－１ｃｃ、ＩＬ－Ｉｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－ａ、ＴＧＦ－ｂ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ；４。
【0097】
転写因子、例えば、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＲＯＲｙｔ、ＦＯＸＰ３およびＢｃｌ－６。治療用抗体は、キメラ抗原受容体、一本鎖抗体、モノボディ、ヒト化抗体、抗体、二重特異性抗体、一本鎖ＦＶ抗体またはこれらの組み合わせと同様に含まれる。
【0098】
いくつかの態様において、本発明は、操作された細胞または組成物を対象に送達するための薬物送達装置、例えばシリンジとともに一括された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、操作された細胞を培養および／または保存するための１またはそれを超える試薬とともに一括された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、細胞、例えばＣＡＲおよび少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含むｉＮＫＴ細胞を活性化する１またはそれを超える作用物質とともに一括された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＯＰ９－ＤＬ１間質細胞および／またはＭＳ５－ＤＬ４間質細胞とともに一括された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、抗原提示細胞またはＣＤ１ｄ発現人工抗原提示細胞とともに一括された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。
【0099】
本発明の方法は、任意の数の症状および／または疾患を処置するための操作された細胞を製造する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、対象を処置する方法であって、本発明による１もしくはそれを超える操作された細胞、本発明の方法に従って作製された１もしくはそれを超える操作された細胞、または本発明による１もしくはそれを超える組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、マウスまたは試験動物などの動物である。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は、癌、細菌感染症、ウイルス感染症、アレルギーまたは自己免疫疾患を有する。いくつかの態様において、癌は、黒色腫、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、リンパ腫、白血病または血液悪性腫瘍である。いくつかの態様において、対象は、結核、ＨＩＶまたは肝炎を有する。いくつかの態様において、対象は、喘息または湿疹を有する。いくつかの態様において、対象は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症または関節炎を有する。いくつかの態様において、対象は、治療有効量の１またはそれを超える操作された細胞が投与される。いくつかの態様において、１またはそれを超える操作された細胞の治療有効量は、処置されている対象の体重１ｋｇ当たり約１０×１０７～約１０×１０９細胞である。いくつかの態様において、方法は、前記１またはそれを超える操作された細胞の投与前、投与中および／または投与後に、ｉＮＫＴ細胞を活性化する作用因子、例えば、α－ＧａｌＣｅｒまたはその塩またはエステル、α－ＧａｌＣｅｒを提示する樹状細胞または人工ＡＰＣを投与することをさらに含む。
【0100】
ある局面において、本開示は、増強された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞を生産するためのシステムおよび方法を提供する。特に、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含む複数の導入遺伝子で操作された幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴ細胞を作製する方法を提供する。ＨＳＣから出発することによって、本発明のシステムおよび方法は、改善された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞の製造のために、幹細胞の自己再生および細胞分化能を活用する。特に、本開示は、ＴＣＲ、ＣＡＲおよび少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸の、ＣＤ３４＋幹細胞内への導入を提供する。ＴＣＲおよびＣＡＲの組み合わされた発現は、Ｔ細胞に特異的癌細胞標的化特性を提供するのに有用である。さらに、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を与えられているため、本発明の方法によって生産されたＴ細胞は、標的癌細胞と接触したときに癌を処置するのに有用なカーゴ（例えば、サイトカイン）を装備する。
【0101】
例えば、好ましい態様において、本発明の方法は、レンチウイルス形質導入を介して核酸をＨＳＣに導入することを含む。１またはそれを超える核酸の導入は、少なくとも１つの、ＴＣＲ、ＣＡＲおよびさらなる導入遺伝子を発現するＨＳＣを提供する。さらなる導入遺伝子の組み込みは、改善された細胞拡大増殖、持続性、安全性および／または抗腫瘍活性などの改善された機能的特性を有する治療用Ｔ細胞を提供するために有用である。
【0102】
１またはそれを超えるさらなる導入遺伝子は、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤または神経毒性の阻害剤の任意の１つまたはそれより多くを含み得る。例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１の１つまたはそれより多くをコードする導入遺伝子が提供され得る。
【0103】
したがって、いくつかの例において、本発明の方法は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１－１５の１つまたはそれより多くをコードする核酸を導入することによって、改善された拡大増殖および持続能力を有するＣＡＲ Ｔ細胞の製造を提供する。いくつかの例において、方法は、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８の１つまたはそれより多くをコードする導入遺伝子の導入によって、ＣＡＲ Ｔ細胞に増加したＩＦＮ－ｇ生産、したがって改善されたＴ細胞効力を提供し得る。他の例において、本発明の方法は、ＩＬ－２１を含む導入遺伝子を導入することによってナイーブＴ細胞生産を増強するのに有用である。いくつかの例において、本明細書に記載されている方法は、例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦまたはサイトカイン放出症候群および神経毒性の他の媒介物質の阻害剤を導入することによって、改善された安全性特性を有するＣＡＲ Ｔ細胞の生産を提供する。方法は、例えば、ＴＧＦ－Ｂ、チェックポイントの阻害剤を介して、腫瘍微小環境に対抗するのに有用な搭載物を提供することによって、改善された有効性を有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。
【0104】
本発明のある方法は、単一のインビトロ活性化工程を含む。いくつかの例において、Ｔ細胞は、試薬で短時間、例えば１～３日間活性化され、この後、活性化試薬は、細胞を継続的に刺激しないように、したがって細胞を疲弊させないようにしばしば培地から除去される。活性化後、活性化されたＴ細胞集団は、急速に拡大増殖し得る、例えば、２４時間ごとに数が倍増し得る。拡大増殖を促進するために、いくつかの試薬が添加され得る。いくつかの態様において、方法は、ＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２またはＩＬ－１８の１つまたはそれより多くが補充され得る培養培地を含む。
【0105】
いくつかの例において、単一の活性化工程は、ＰＭＢＣをベースとするＴ細胞活性化を含む。したがって、活性化工程は、ａＧＣを搭載したＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／２８陽性ＰＢＭＣおよび可溶性抗ＣＤ２／３／２８陽性ＰＢＭＣをＴ細胞に導入することを含み得る。いくつかの例において、活性化工程は、抗原提示細胞（ａＡＰＣ）をベースとするＴ細胞活性化工程を含む。したがって、活性化工程は、Ｔ細胞をａＡＰＣに導入することを含むことができる。ａＡＰＣは、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ抗原を発現する操作されたＫ５６２細胞であり得る。ａＡＰＣは、ａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄおよび／またはａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣであり得る。他の例において、活性化工程は、フィーダーを用いないことをベースとするＴ細胞活性化工程を含む。フィーダーを用いないことをベースとするＴ細胞活性化工程は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、ＣＤ３／２８を含む可溶性抗体をＴ細胞に導入することを含むことができる。いくつかの態様において、Ｔ細胞活性化工程は、活性化拡大増殖培養培地に添加された異なるサイトカインＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８の存在下でＴ細胞を培養することを含む。
【実施例】
【0106】
以下の実施例は、本発明の方法によって提供される、ＣＤ３４＋細胞からＴ細胞（例えば、ｉＮＫＴ）を製造するための有用な例示的プロトコルを提供する。さらなる例および考察については、参照により組み入れられる国際公開第２０１９２４１４００号を参照されたい。
【0107】
実施例１：ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ細胞培養およびレンチウイルス形質導入
－２日目：刺激前
－２日目：刺激前
【0108】
１．０．５ｍＬ／ウェルの、ＰＢＳ中に希釈された２０μｇ／ｍｌレトロネクチン（ＲＮ）で、２４ウェル非組織培養処理済プレートの適切な数のウェル（約１５×１０３細胞／ウェルまたは０．１×１０６アリコートに対して６ウェルを播種することが推奨される）をコートする。１ｍｇ／ｍＬのＲＮ原液アリコートは、６０マイクロリットルのアリコートで、－２０℃で保存され得る。
【0109】
２．室温（ＲＴ）で２時間（ｈ）インキュベートする。
【0110】
３．ＲＮを吸引し、０．５ｍｌ／ウェルの、ＰＢＳ中に希釈された２％ＢＳＡと交換する。３０％ＢＳＡアリコートは、－２０℃で保存される。
【0111】
４．室温で３０分間インキュベートする。
【0112】
５．吸引し、０．５ｍｌ／ウェルのＰＢＳと交換する。
【0113】
６．標準的な手順に従ってＣＤ３４＋細胞の０．１×１０６アリコートをＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａ中に解凍し、３００ｇで１０分間回転させる。
【0114】
７．上清を吸引し、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａ中に再懸濁し、血球計数器を用いて計数し、細胞数を記録する。いくつかの例において、本出願人は、０．１×１０６アリコートの細胞数が低すぎて信頼性がないことを認めた。
【0115】
８．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＭｅｄｉａでＣＤ３４＋細胞を０．０５×１０６細胞／ｍｌに希釈する。
【0116】
９．ＲＮコートされたウェルからＰＢＳを吸引し、３００ｕｌ細胞／ウェル（約１５×１０３細胞／ウェル）を播種する。
【0117】
１０．３７℃、５％ＣＯ２で１２～１８時間インキュベートする。
【0118】
－１日目：形質導入
【0119】
１．濃縮されたレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を解凍し、穏やかにピペット操作して混合する（ボルテックス撹拌は行わず、再凍結させない）。
【0120】
２．形質導入チューブを準備する。
ａ．１００～２００のＭＯＩに十分な体積を計算することによって、適切な体積のＬＶＶを１．５ｍｌチューブに移す。
ｂ．適切な体積のＰＧＥ２を同じチューブに添加して、総培養体積の１０ｎＭの最終濃度を達成する。
ｃ．適切な体積のポロキサマーを同じチューブに添加して、１μｇ／μｌ総培養体積の最終濃度を達成する。
ａ．１００～２００のＭＯＩに十分な体積を計算することによって、適切な体積のＬＶＶを１．５ｍｌチューブに移す。
ｂ．適切な体積のＰＧＥ２を同じチューブに添加して、総培養体積の１０ｎＭの最終濃度を達成する。
ｃ．適切な体積のポロキサマーを同じチューブに添加して、１μｇ／μｌ総培養体積の最終濃度を達成する。
【0121】
３．形質導入チューブの内容物を適切な培養ウェルに添加し、プレートを穏やかに揺り動かして混合する
【0122】
４．細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【0123】
０日目 採取
【0124】
１．穏やかにピペット操作することによって細胞を収集して、プレートから細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
【0125】
２．等体積の冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５でウェルを洗浄して、まだプレートに付着しているすべての細胞を除去し、コニカルチューブに移す。
【0126】
３．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５でさらなる洗浄を行って、プレートからすべての細胞を収集する。
【0127】
４．３００ｇで１０分間回転させ、上清を吸引する。
【0128】
５．段階２（すなわち、実施例２）に進む。
【0129】
実施例２：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の作製；分化
０～１４日目：分化（期間：２週間）
０～１４日目：分化（期間：２週間）
【0130】
１．ＰＢＳ中に１：２００希釈された、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されるリンパ系分化材料などのリンパ系分化コーティング材料（ＬＤＣＭ）で、１ｍｌ／ウェルで、１２ウェル非組織培養処理済プレートの適切な数のウェル（１，０００～２，０００細胞／ウェルまたは１２ウェル／１５，０００細胞を播種することが推奨される）をコートする。４℃で１２～１８時間インキュベートする。
【0131】
２．ＬＤＣＭを吸引し、２ｍｌ／ウェルのＰＢＳを添加する
【0132】
３．ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で販売されているリンパ系前駆細胞拡大増殖培地などのリンパ系前駆細胞拡大増殖培地（ＬＰＥＭ）中に、段階１（すなわち、実施例１）で収集された形質導入されたＣＤ３４＋細胞を再懸濁する。
【0133】
４．ＬＰＥＭで細胞密度を１～２×１０３細胞／ｍｌに調整する
【0134】
５．ＬＤＣＭでコートされたプレートからＰＢＳを吸引する
【0135】
６．ＬＣＤＭでコートされたプレート中に０．７５ｍｌ細胞／ウェルを播種する
【0136】
７．細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする
【0137】
８．３日目に、０．２５ｍｌ／ウェルの新鮮なＬＰＥＭを添加し、培養を継続する
【0138】
９．７および１１日目に、細胞を乱すことなく、＜０．５ｍｌ／ウェルを慎重に除去し、０．５ｍｌ／ウェルの新鮮なＬＰＥＭを補充する。
【0139】
１０．１４日目まで培養を継続する
【0140】
１１．段階３（すなわち、実施例３）に進む
【0141】
実施例３：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の作製；成熟
１４～２１＋日目：成熟（期間：１～２週間）
１４～２１＋日目：成熟（期間：１～２週間）
【0142】
１．ＰＢＳ中に１：２００希釈された２ｍｌ／ウェルのＬＤＣＭで、６ウェル非組織培養処理済プレートの適切な数のウェル（５０～１００×１０３／ウェルを播種することが推奨される）をコートする。播種の前日に調製する場合には４℃で１２～１８時間インキュベートし、または播種の当日に調製する場合には３７℃で２時間インキュベートする。
【0143】
２．ＬＤＣＭを吸引し、４ｍＬ／ウェルのＰＢＳを添加する
【0144】
３．１４日目に、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒによってＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲの商品名で提供される細胞生存率計数器などの細胞生存率計数器を使用して細胞を採取し、計数する。
ａ．穏やかにピペット操作することによって細胞を収集して、プレートから細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
ｂ．１ｍｌ／４ウェルの冷ＳＦＥＭ ＩＩでウェルを洗浄して、まだプレートに付着しているすべての細胞を除去し、コニカルチューブに移す
ｃ．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷ＳＦＥＭ ＩＩでさらなる洗浄を行って、プレートから細胞を収集する。
ａ．穏やかにピペット操作することによって細胞を収集して、プレートから細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
ｂ．１ｍｌ／４ウェルの冷ＳＦＥＭ ＩＩでウェルを洗浄して、まだプレートに付着しているすべての細胞を除去し、コニカルチューブに移す
ｃ．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷ＳＦＥＭ ＩＩでさらなる洗浄を行って、プレートから細胞を収集する。
【0145】
４．０．２×１０６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
【0146】
５．適切な体積の細胞を取り出して段階３のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
【0147】
６．上清を吸引する。
【0148】
７．ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されるＴ細胞前駆細胞成熟培地などのＴ細胞前駆細胞成熟培地（ＴＰＭＭ）中に２．５～５×１０４細胞／ｍｌで細胞を再懸濁する。
【0149】
８．ＬＤＣＭでコートされたプレートからＰＢＳを吸引する。
【0150】
９．ＬＤＣＭでコートされたプレート中に２ｍｌ細胞／ウェルを播種する。
【0151】
１０．細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする
【0152】
１１．残存する細胞を３００ｇで１０分間ペレット化する。
【0153】
１２．残存する細胞を吸引し、適切な体積の、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０の商品名で販売されている凍結保存溶液などの凍結保存溶液中に再懸濁して、２～５×１０６細胞／ｍＬを達成する。
【0154】
１３．１ｍｌ／クライオバイアルの一定分量に分割し、適切に（例えば、マイナス８０℃の冷凍庫内で）凍結し、凍結の２４時間以内に液体窒素保存に移す。
【0155】
１４．１７日目に、２ｍｌ／ウェルの新鮮なＴＰＭＭを添加し、培養を継続する。
【0156】
１５．２１日目に、ウェルの中央の細胞から１００μｌをピペットで取ることによってフローサイトメトリー用の試料を採取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
【0157】
１６．ウェルの中心の細胞からさらに１００μｌを採取し、細胞生存率計数器を用いて計数する。
【0158】
１７．ＴＣＲ発現が５０％超であり、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性発現が２０％超であり、および細胞サイズが減少している場合には（ＨＳＣからＴ細胞への発達を示す）、細胞は凍結保存され、同種異系療法に対して提供され得るか、または必要に応じて、段階４によって提供されるように拡大増殖され得る。これらのパラメータが満たされなければ、必要な栄養供給および分割を行って培養を継続する。２ｍｌ／ウェル未満を除去し、３～４日ごとに２ｍｌ／ウェルの新鮮なＴＰＭＭを補充し、集密状態に近づけば培養物を分割する。上記の基準が満たされるまで、２４／２５日目および２８日目にこの確認を再度行う。
【0159】
段階４：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の作製；必要に応じた拡大増殖：
２１～２８日目（２１日目に基準が満たされたと仮定して、しかるべく調整する）：刺激（期間：１週間）
２１～２８日目（２１日目に基準が満たされたと仮定して、しかるべく調整する）：刺激（期間：１週間）
【0160】
１．２１日目に、細胞を採取し、細胞生存率計数器を使用して細胞を計数する（関連するエクセルシート中に計数を記録する）
ａ．穏やかにピペット操作することによって細胞を収集して、プレートから細胞を取り出し、コニカルチューブに移す
ｂ．４ウェルあたり２ｍｌの、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによってＯｐＴｍｉｚｅｒの商品名で提供される細胞拡大増殖培地などの冷細胞拡大増殖培地（ＥＭ）でウェルを洗浄して、プレートにまだ付着しているすべての細胞を除去し、コニカルチューブに移す
ｃ．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷ＥＭでさらなる洗浄を行って、プレートから細胞を収集する。
ｄ．０．２×１０６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
ｅ．適切な体積の細胞を取り出して段階４のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
ｆ．上清を吸引する。
ｇ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ中に、２×１０６細胞／ｍｌで細胞を再懸濁する
ａ．穏やかにピペット操作することによって細胞を収集して、プレートから細胞を取り出し、コニカルチューブに移す
ｂ．４ウェルあたり２ｍｌの、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによってＯｐＴｍｉｚｅｒの商品名で提供される細胞拡大増殖培地などの冷細胞拡大増殖培地（ＥＭ）でウェルを洗浄して、プレートにまだ付着しているすべての細胞を除去し、コニカルチューブに移す
ｃ．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷ＥＭでさらなる洗浄を行って、プレートから細胞を収集する。
ｄ．０．２×１０６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
ｅ．適切な体積の細胞を取り出して段階４のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
ｆ．上清を吸引する。
ｇ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ中に、２×１０６細胞／ｍｌで細胞を再懸濁する
【0161】
２．所望の刺激の方法に応じて、以下の指示の一部に従う。ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度は、１×１０６ｍｌの条件の間に固定される
ａ．刺激なし
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ培地で細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する
ｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする
ｂ．コートされたＣＤ３／可溶性ＣＤ２８
ｉ．１．２３μｇ／ｍｌのＣＤ３でプレートを３７℃で２時間コートし、使用前にＰＢＳで洗浄する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭで細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉｉ．可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍｌで添加する。
ｉｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｃ．ＰＢＭＣと可溶性ＣＤ３／可溶性ＣＤ２８
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、６，０００ラドで照射する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ中にＰＢＭＣを再懸濁する。
ｉｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をＰＢＭＣと１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比で組み合わせる。
ｉｖ．可用性ＣＤ３および可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍｌで添加する。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｄ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化因子などのＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子を与える。
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ培地で細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子を２５μｌ／ｍｌで細胞懸濁液に添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｅ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化因子などのＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を与える。
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭで細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を２５μｌ／ｍｌで細胞懸濁液に添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｆ．ａＧＣを搭載したＰＢＭＣ
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍する。
ｉｉ．２μｇ／ｍｌのａＧＣを含むＥＭ中に１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣを搭載したＰＢＭＣを収集し、６，０００ラドで照射した。
ｉｖ．ＥＭで少なくとも２回細胞の洗浄を行い、結合していないａＧＣを除去する
ｖ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ中にＰＢＭＣを再懸濁する。
ｖｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をＰＢＭＣと１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比で組み合わせる。
ｖｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｇ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
ｉ．培養物中からａＡＰＣを収集し、１０，０００ラドで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｈ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物中からａＡＰＣを収集し、１０，０００ラドで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｉ．ａＧＣを搭載したＫ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物中からａＡＰＣを収集する。
ｉｉ．２μｇ／ｍｌのａＧＣを含むＥＭ中に（α－ＧａｌＣｅｒ Ｐｒｅｐ ＳＯＰ参照）１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣを搭載したａＡＰＣを収集し、１０，０００ラドで照射した。
ｉｖ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ａ．刺激なし
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ培地で細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する
ｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする
ｂ．コートされたＣＤ３／可溶性ＣＤ２８
ｉ．１．２３μｇ／ｍｌのＣＤ３でプレートを３７℃で２時間コートし、使用前にＰＢＳで洗浄する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭで細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉｉ．可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍｌで添加する。
ｉｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｃ．ＰＢＭＣと可溶性ＣＤ３／可溶性ＣＤ２８
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、６，０００ラドで照射する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ中にＰＢＭＣを再懸濁する。
ｉｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をＰＢＭＣと１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比で組み合わせる。
ｉｖ．可用性ＣＤ３および可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍｌで添加する。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｄ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化因子などのＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子を与える。
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ培地で細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子を２５μｌ／ｍｌで細胞懸濁液に添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｅ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化因子などのＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を与える。
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭで細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を２５μｌ／ｍｌで細胞懸濁液に添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｆ．ａＧＣを搭載したＰＢＭＣ
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍する。
ｉｉ．２μｇ／ｍｌのａＧＣを含むＥＭ中に１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣを搭載したＰＢＭＣを収集し、６，０００ラドで照射した。
ｉｖ．ＥＭで少なくとも２回細胞の洗浄を行い、結合していないａＧＣを除去する
ｖ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ中にＰＢＭＣを再懸濁する。
ｖｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をＰＢＭＣと１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比で組み合わせる。
ｖｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｇ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
ｉ．培養物中からａＡＰＣを収集し、１０，０００ラドで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｈ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物中からａＡＰＣを収集し、１０，０００ラドで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｉ．ａＧＣを搭載したＫ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物中からａＡＰＣを収集する。
ｉｉ．２μｇ／ｍｌのａＧＣを含むＥＭ中に（α－ＧａｌＣｅｒ Ｐｒｅｐ ＳＯＰ参照）１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣを搭載したａＡＰＣを収集し、１０，０００ラドで照射した。
ｉｖ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【0162】
３．２４日目に、細胞計数器を使用して細胞を計数し（関連するエクセルシートに計数を記録する）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈し、必要に応じて培養容器を移動する。ＰＢＭＣまたはａＡＰＣを利用する場合、この時点で得られた細胞数は解釈することがより困難なことがあり得、この場合には、細胞を乱すことなく培養培地の半分を慎重に除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含む等しい体積の新鮮なＥＭを添加する。ＰＢＭＣまたはａＡＰＣなしの条件が希釈を必要としなければ、同じくこの半培地交換を行う。
【0163】
４．２６日目に、細胞生存率計数器を使用して細胞を計数し（関連するエクセルシートに計数を記録する）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈し、必要に応じて培養容器を移動する。
【0164】
５．２８日目に細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌを使用して計数する（関連するエクセルシートに計数を記録する）
ａ．０．２×１０６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
ｂ．さらなるフロー染色性質決定のために、０．２×１０６個の細胞のアリコートを取り出し、９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
ｃ．１×１０６個の細胞のアリコートを取り出し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭを使用して１×１０６細胞／ｍｌに希釈し、長期的な追跡のために播種する（必要に応じて行われる工程、細胞凍結が完了した後に優先順位を決める）。
ｄ．残存する細胞を３００ｇで１０分間ペレット化し、上清を吸引する。
ｅ．適切な体積の凍結保存培地中に再懸濁して、２５～５０×１０６細胞／ｍＬを達成する。
ｆ．１ｍｌ／クライオバイアルの一定分量に分割し、適切に凍結し、凍結の２４時間以内に液体窒素保存に移す。
参照による組み入れ
ａ．０．２×１０６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
ｂ．さらなるフロー染色性質決定のために、０．２×１０６個の細胞のアリコートを取り出し、９６ウェルＶ底プレート中に播種する。
ｃ．１×１０６個の細胞のアリコートを取り出し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭを使用して１×１０６細胞／ｍｌに希釈し、長期的な追跡のために播種する（必要に応じて行われる工程、細胞凍結が完了した後に優先順位を決める）。
ｄ．残存する細胞を３００ｇで１０分間ペレット化し、上清を吸引する。
ｅ．適切な体積の凍結保存培地中に再懸濁して、２５～５０×１０６細胞／ｍＬを達成する。
ｆ．１ｍｌ／クライオバイアルの一定分量に分割し、適切に凍結し、凍結の２４時間以内に液体窒素保存に移す。
参照による組み入れ
【0165】
特許、特許出願、特許公報、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書の参照および引用が、本開示を通じて為されている。このような文書はすべて、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
均等物
均等物
【0166】
本明細書で示され、記述されるものに加えて、本発明の種々の改変および多くのそのさらなる態様が、本明細書で引用される科学的文献および特許文献への参照を含む本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書の主題には、その種々の態様およびその均等物において、本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスが含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】