知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-517977薬物送達のためのリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】薬物送達のためのリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子およびその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 9/51 20060101AFI20240416BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240416BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240416BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240416BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20240416BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240416BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240416BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240416BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20240416BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240416BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240416BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
A61K9/51
A61K31/713
A61K31/7088
A61K48/00
A61P35/00
A61K47/14
A61K47/28
A61K47/24
A61K47/18
A61K47/22
A61K47/42
A61K31/337
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/115 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023570424
(86)(22)【出願日】2022-05-23
(85)【翻訳文提出日】2023-11-14
(86)【国際出願番号】 KR2022007299
(87)【国際公開番号】W WO2022255701
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】10-2021-0070586
(32)【優先日】2021-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521470629
【氏名又は名称】ティオンラボ・セラピューティクス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ドク・ス・イム
(72)【発明者】
【氏名】ジン－ホ・キム
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076CC27
4C076DD46
4C076DD49
4C076DD59
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE41
4C076FF70
4C076GG41
4C084AA13
4C084NA13
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA10
4C086BA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明によれば、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質、カチオン性脂質、トリグリセリドおよびコレステリルエステルを構成とするコア－シェル構造のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を製造することによって、生体利用率に優れ、薬物封入効率が向上した薬物送達体を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トリグリセリドおよびコレステリルエステルを含むコアと；アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を含むシェルと；を含むリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項2】
コレステリルエステルは、コレステロールに炭素数１０～２４の飽和または不飽和脂肪酸がエステル結合したものである、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項3】
トリグリセリドは、グリセロール１分子に炭素数１０～２４の飽和または不飽和脂肪酸３分子がエステル結合したものである、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項4】
アルブミン結合コレステロールは、コレステリルクロロホーメートとアルブミンの反応物であり、前記コレステリルクロロホーメートのクロロホーメート基とアルブミンのアミン基が結合したものである、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項5】
アルブミン結合コレステロールにおいてコレステリルクロロホーメートとアルブミンのモル比は、１：１～５：１である、請求項４に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項6】
融合誘導性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＳＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］（ＤＯＰＳ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］から成る群から選ばれた１つ以上である、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項7】
カチオン性脂質は、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ－コレステロール）、３β－［Ｎ－（Ｎ’－モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ－コレステロール）、３β－［Ｎ－（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ－コレステロール）、Ｎ－（Ｎ’－アミノエタン）カバモイルプロパノイックトコフェロール（ＡＣ－トコフェロール）、Ｎ－（Ｎ’－メチルアミノエタン）カバモイルプロパノイックトコフェロール（ＭＣ－トコフェロール）、Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリール－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイル）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレオイルカルバミル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（Ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ－３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２－スペルミンカルボキサミド）エチル｝－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ］－３－ジメチル－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９’，１２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジアザ－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＴＡＰ）、１，２－ジアザ－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン、および１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパンから成る群から選ばれた１つ以上である、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項8】
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、２０～２００ｎｍの直径を有するものである、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項9】
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子であり、全体高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、コレステリルエステル５～３０重量部、トリグリセリド０．０１～５重量部、アルブミン結合コレステロール１～２０重量部、融合誘導性脂質５～４０重量部およびカチオン性脂質１０～６０重量部を含む、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項10】
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子であり、全体低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、コレステリルエステル３０～６０重量部、トリグリセリド０．０１～５重量部、アルブミン結合コレステロール１～２０重量部、融合誘導性脂質５～４０重量部およびカチオン性脂質１０～４０重量部を含む、請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子。
【請求項11】
有機溶媒でコレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を混合し、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が分散した水性分散液を製造する段階を含む、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項12】
製造された水性分散液を透析して精製し、濃縮させる段階をさらに含む、請求項１１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項13】
アルブミン結合コレステロールは、有機溶媒に溶解したコレステリルクロロホーメートとアルブミン水溶液を混合して製造されたものである、請求項１１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項14】
アルブミン結合コレステロールでコレステロールとアルブミンのモル比は、１：１～５：１である、請求項１２に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項15】
有機溶媒は、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、Ｃ１～Ｃ４の低級アルコール、メチレンクロリド、クロロホルム、アセトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ－メチルピロリドン、ジオキサン、エチルアセテート、メチルエチルケトン、アセトニトリルおよびこれらの混合物から選ばれる、請求項１１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項16】
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の直径は、２０～２００ｎｍである、請求項１１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項17】
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子であり、全体高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、コレステリルエステル５～３０重量部、トリグリセリド０．０１～５重量部、アルブミン結合コレステロール１～２０重量部、融合誘導性脂質５～４０重量部およびカチオン性脂質１０～６０重量部を含む、請求項１１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項18】
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子であり、全体低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、コレステリルエステル３０～６０重量部、トリグリセリド０．０１～５重量部、アルブミン結合コレステロール１～２０重量部、融合誘導性脂質５～４０重量部およびカチオン性脂質１０～４０重量部を含む、請求項１１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項19】
請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を含む、薬物送達用組成物。
【請求項20】
薬物は、核酸および非水溶性薬物のうち１つ以上を含む、請求項１９に記載の薬物送達用組成物。
【請求項21】
核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アプタマー、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびアンチセンス－オリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ－ＯＤＮ）から成る群から選ばれた１つ以上であり、前記核酸は、前記固体脂質ナノ粒子のシェルのカチオン性脂質と静電気的相互作用によって結合したものである、請求項２０に記載の薬物送達用組成物。
【請求項22】
非水溶性薬物は、難溶性薬物、アニオンを帯びるペプチド、タンパク質、ヒアルロン酸－ペプチド結合体、またはヒアルロン酸－タンパク質結合体である、請求項２０に記載の薬物送達用組成物。
【請求項23】
ＫＲＡＳを標的とする核酸および非水溶性薬物のうち１つ以上と；請求項１に記載のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子と；を含む、ＫＲＡＳ遺伝子変異によって誘発されるがんの予防または治療用薬学組成物。
【請求項24】
ＫＲＡＳを標的とする核酸は、還元可能な核酸ダイマー（ｄｉｍｅｒ）である、請求項２３に記載のＫＲＡＳ遺伝子変異によって誘発されるがんの予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬物送達のためのリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子およびその薬物送達体としての用途に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｋ－ｒａｓ遺伝子（ＫＲＡＳ）は、いくつかのがん腫でよく突然変異されるｒａｓ遺伝子の１つであり、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２および１３における突然変異は、この遺伝子の産物であるｐ２１－ｒａｓタンパク質の機能的変化をもたらし、その結果、細胞核に成長シグナルを必要以上に伝達することによって、細胞の成長と分裂を促進し、発がん過程に関与する。ＫＲＡＳの突然変異は、膵がんの約９０％、大腸がんの約５０％、非小細胞肺がんの約３０％に現れ、ヒトのがんにおいて非常に多く見られ、これらの突然変異の大部分は、コドン１２および１３に集中していることが突然変異プロファイルで確認された（非特許文献１）。
【0003】
これより、様々な方法でＫＲＡＳと関連した抗がん剤の開発に関する研究が数十年間試みられてきたが、臨床に至った抗がん剤はなかったので、ＫＲＡＳは、「治療剤として発掘できない（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」ターゲットと見なされてきた。ＫＲＡＳは、ＧＴＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と結合すると活性化するが、ＧＴＰと結合力が非常に高く、表面に結合するほどのポケットが殆どないため、これを標的に新薬開発することが非常に難しい。また、ＫＲＡＳは、細胞内タンパク質であるから、分子量の大きい抗体を使用することもできないという問題がある。
【0004】
また、アルブミンの様々な結合能を活用したアルブミン融合（Ａｌｂｕｍｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ）技術を応用し、抗がん剤であるパクリタキセルをアルブミンに付着した薬剤であるナノ粒子パクリタキセル、商品名アブラクサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）は、パクリタキセルの腫瘍反応を改善することが明らかになったが、アブラクサンの薬物動態学的特性と生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、タキソール（Ｔａｘｏｌ）剤形よりも効果が低いという問題がある。
【0005】
したがって、生体適合的かつ高効率の薬物送達効率を有しながらも、ＫＲＡＳを直接的に標的する薬物送達体の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｓａｍｏｗｉｔｚ ＷＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．９：１１９３－７，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、生体利用率に優れ、高効率の薬物送達効果を有する薬物送達体としてリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子およびその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、天然リポタンパク質と類似の組成の固体脂質ナノ粒子を製造する場合、薬物を高効率で封入できながらも、生体利用率に優れた薬物送達体として活用可能であることを確認し、本発明を完成した。
【0009】
したがって、本発明は、生体適合的かつ高効率で薬物を送達するためのリポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）模倣固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＳＬＮ）およびその用途に関する。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、コレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を構成とするコア－シェル構造のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を製造することによって、粒子間の凝集を防き、構造的安定性を確保することができる。また、生体利用率に優れ、薬物封入効率が向上した薬物送達体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
本発明において数値の限定は、別途の記載がないと、以上または以下を示す。
本発明において数値の限定は、別途の記載がないと、以上または以下を示す。
【0013】
本発明は、コレステリルエステルおよびトリグリセリドを含むコアと；アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を含むシェルと；を含む低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を提供する。
【0014】
本発明において、「固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＳＬＮ）」とは、形態的な観点から、ナノメートル（ｎｍ）単位のサイズを有し、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）やエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）剤形とは異なって、固体マトリックス形態で存在する粒子を意味する。本発明の固体脂質ナノ粒子は、コア－シェル構造を有するものであり、例えば、構造的に中心部（コア）あるいは表面部（シェル）に非水溶性薬物および／または核酸を捕集する形態で構成されてもよい。本発明による固体脂質ナノ粒子は、非水溶性薬物および／または核酸を捕集することによって、前記非水溶性薬物および／または核酸の生体内伝達効率を大きく増加させることができる。前記固体脂質ナノ粒子は、通常の方法で製造することができ、必要に応じてその方法を適切に変形して行うことができる。
【0015】
天然高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）は、サイズが５～１７ｎｍであり、リポタンパク質のうちタンパク質の組成が最も大きいため、１．０６３～１．２１ｇ／ｄＬの最も高い比重を有する。高比重リポタンパク質は、全体成分中、タンパク質が約５０％を占め、コレステロールが約１７％、リン脂質が約２２％を占める。主要タンパク質は、ａｐｏＡ－ＩとａｐｏＡ－ＩＩである。高比重リポタンパク質は、その構造上、２つの脂質相、すなわち、極性脂質相（リン脂質、アポリポタンパク質および遊離コレステロール）および、非極性脂質相（コレステリルエステルおよびトリグリセリド）からなる。リン脂質は、非極性脂質を乳化させて、ナノ粒子の表面を安定化できるという利点がある。
【0016】
本発明による固体脂質ナノ粒子は、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）模倣固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。天然高比重リポタンパク質とは異なって、本発明による高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、アポリポタンパク質を実質的に含まなくてもよい。また、アポリポタンパク質を含む天然高比重リポタンパク質とは異なって、本発明による高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、アポリポタンパク質の代わりに、カチオン性脂質を高含有量で含んでもよい。前記カチオン性脂質によって固体脂質ナノ粒子の表面にカチオン性を付与することによって、薬物と結合し、薬物送達体として活用することができる。
【0017】
また、本発明の高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、天然高比重リポタンパク質とは異なって、遊離コレステロールをアルブミン結合コレステロール形態に変えて含んでもよい。上記のように、アルブミン結合コレステロールを含ませることによって、前記固体脂質ナノ粒子が薬物送達体として活用されるとき、がん細胞標的能を有することができる。このようながん細胞標的能は、コレステロールに結合したアルブミンによるものであり、アルブミンによってがん細胞標的能を発揮するためには、粒子サイズを細胞膜を通過できるレベル、すなわち２０～５０ｎｍレベルとしなければならない。これより、本発明による高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子サイズは、２０～５０ｎｍであることが好ましい。
【0018】
なお、天然低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）は、２つの脂質相、すなわち、極性構成成分（リン脂質およびアポリポタンパク質）およびコレステロールエステルとトリグリセリドで事前構成された非極性中性脂質からなり、サイズは、約１８～２５ｎｍであり、ゼータ電位は、－１１．４±１．９ｍＶである。具体的には、コア部（ｃｏｒｅ）は、コレステロールエステル４５％およびトリグリセリド３％で構成され、表面部（ｓｕｒｆａｃｅ）は、コレステロール１０％、リン脂質２２％およびアポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｂ－１００ ２０％で構成される。
【0019】
本発明による固体脂質ナノ粒子は、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）模倣固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。天然低比重リポタンパク質とは異なって、本発明による低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、アポリポタンパク質を実質的に含まなくてもよい。また、アポリポタンパク質を含む天然低比重リポタンパク質とは異なって、本発明による低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、リン脂質およびアポリポタンパク質の代わりに、融合誘導性脂質、カチオン性脂質を含んでもよい。前記カチオン性脂質によって固体脂質ナノ粒子の表面にカチオン性を付与することによって、薬物と結合し、薬物送達体として活用することができる。
【0020】
また、本発明の低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、天然低比重リポタンパク質とは異なって、遊離コレステロールをアルブミン結合コレステロール形態に変えて含んでもよい。
【0021】
上記のように、アルブミン結合コレステロールを含ませることによって、前記低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が薬物送達体として活用されるとき、がん細胞標的能を有することができる。また、非極性脂質を乳化させて表面の安定性を提供し、粒子間凝集を防き、構造的に安定したナノ粒子を形成することができる。
【0022】
このようながん細胞標的能および透過力は、コレステロールに結合したアルブミンによるものであり、アルブミンによってがん細胞標的能を発揮するためには、粒子サイズを細胞膜を通過できるレベルとしなければならない。すなわち、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果で腫瘍組織の新生血管が不完全で、２００ｎｍ程度に隙間が広がり、２００ｎｍ以内の粒子は、正常組織に入らず、腫瘍血管を浸透することができ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）、または、腫瘍組織は、リンパ系が発達していないため、漏出した物質が滞留しやすい。これより、本発明による固体脂質ナノ粒子サイズは、６０～２００ｎｍとし、ＥＰＲ効果でがん組織などに薬物を安定的に輸送することができる。
【0023】
本発明において、前記高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子および／または低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、カチオン性固体脂質ナノ粒子形態の高比重および／または低比重リポタンパク質模倣カチオン性固体脂質ナノ粒子であってもよい。前記ナノ粒子は、天然高比重および／または低比重リポタンパク質の構成成分を模倣して再構成されたものであり、タンパク質、ペプチド、アプタマーまたはｓｉＲＮＡのような核酸治療剤は、物理化学的特性によって循環系への吸収率が非常に低い。また、固体脂質ナノ粒子は、タンパク質分解酵素、ペプチド分解酵素、または核酸分解酵素などによって分解され、細網内皮系（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ，ＲＥＳ）などを通して除去された後、腎臓を介して迅速に排出されるので、これを改善した天然高比重リポタンパク質模倣ナノ粒子に薬物を封入し、酵素による分解を阻害し、標的臓器や細胞に吸収を促進し、細網内皮系（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ，ＲＥＳ）により分解されることを阻害し、血中滞留時間を延長させることができ、生体内天然リポタンパク質を模倣したという点から、生体内安定性および生体利用率に優れ、高効率で薬物を封入して伝達することができるという利点がある。
【0024】
下記実施例では、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子と低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を製造し、前記リポタンパク質模倣ナノ粒子が優れた薬物封入率を有することを確認した。より具体的には、平均粒子サイズが、低比重リポタンパク質固体脂質ナノ粒子の場合、約１００ｎｍであり、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、約３０ｎｍであり、薬物の封入率は、類似のレベルであることを確認した。
【0025】
本発明では、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を固体脂質ナノ粒子と言及することができる。また、別途の記載がない限り、開示された内容は、低比重および／または高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の両方に適用されると理解すべきである。
【0026】
本発明において、固体脂質ナノ粒子のコアは、常温および体温で固体状態でコアの内部に非水溶性薬物および／または核酸遺伝子の疎水性相互作用を通じて薬物を捕集することができる。前記固体脂質ナノ粒子のコアは、コレステリルエステルおよびトリグリセリドを含む。
【0027】
前記ナノ粒子のコアを成す成分の１つであるコレステリルエステルは、コレステロールに炭素数１０～２４個の飽和または不飽和脂肪酸がエステル結合したものであり、オレイン酸のような炭素数１６～１８個の不飽和脂肪酸のエステルであってもよい。本発明による固体脂質ナノ粒子は、単一または複数種のコレステリルエステルを含んでもよい。
【0028】
一具体例において、前記コレステリルエステルは、コレステリルステアレート、コレステリルパルミテート、コレステロールヒドロキシステアレート、ソイビーンステロールから成る群から選ばれる１種以上またはその誘導体であってもよく、好ましくは、コレステリルオレエートであってもよい。
【0029】
前記コレステリルエステルは、全体リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、５～６０重量部であってもよい。
【0030】
例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、前記コレステリルエステルは、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、５～３０重量部、１０～２５重量部、または１５～２０重量部で含まれてもよい。コレステリルエステルが上記のような範囲で高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子のコアを構成するとき、多量の薬物を封入しながらも、細胞膜を通過することができ、細胞内薬物送達効率に優れた固体脂質ナノ粒子を製造することができる。また、前記含有量のコレステリルエステルを含むことによって、天然高比重リポタンパク質と類似の固体脂質ナノ粒子を製造することができる。
【0031】
また、例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、前記コレステリルエステルは、低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、３０～６０重量部、３０重量部超過～５０重量部以下、４０～５０重量部で含まれてもよい。コレステリルエステルが上記のような範囲で低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子のコアを構成するとき、多量の薬物を封入しながらも、細胞膜を通過することができ、細胞内薬物送達効率に優れた低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を製造することができる。また、前記含有量のコレステリルエステルを含むことによって、天然低比重リポタンパク質と類似の固体脂質ナノ粒子を製造することができる。
【0032】
また、前記ナノ粒子のコアを成す成分の１つであるトリグリセリドは、様々な脂肪酸の組成を有する精製トリグリセリド、または多数の脂肪酸で構成されたトリグリセリドを主成分とする植物油であってもよい。例えば、前記トリグリセリドは、動物または植物油であってもよく、大豆油、オリーブ油、綿実油、ゴマ油および肝油などから成る群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、前記トリグリセリドは、グリセロール１分子に炭素数１０～２４の飽和または不飽和脂肪酸３分子がエステル結合したものであってもよい。
【0033】
一具体例において、前記トリグリセリドは、トリヘプタノイン、トリミリスチン、トリパルミチン、トリステアリン、トリリノレインから成る群から選ばれる１種以上またはその誘導体であってもよく、好ましくは、トリオレインであってもよい。
【0034】
前記トリグリセリドは、全体リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、０．０１～５重量部、０．０５～３．５重量部、０．１～２．５重量部、０．５～１．５重量部で含まれてもよい。トリグリセリドが上記のような範囲でリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子のコアを構成するとき、前記トリグリセリドがコレステリルエステルと疎水性結合し、細胞膜を通過できるサイズを有するナノ粒子を形成することができる。
【0035】
前記コレステリルエステルおよびトリグリセリドは、疎水性結合を通じてリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子のコアを形成することができる。
【0036】
本発明において、固体脂質ナノ粒子のシェルは、コアの上層面に疎水性相互反応によって結合されており、シェルには、薬物、特に非水溶性薬物および／または核酸遺伝子と静電気的相互作用ができるカチオン性脂質が露出している。本発明によるナノ粒子は、上記のようなシェルに露出したカチオン性脂質を通じて薬物、特に非水溶性薬物および／または核酸遺伝子と静電気的相互作用によって結合して複合体を形成することができ、薬物、特に非水溶性薬物および／または核酸遺伝子を細胞内に安定的に伝達することができる。これより、前記ナノ粒子のシェルは、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を含む。
【0037】
本発明において、アルブミン結合コレステロールは、疎水性を有するモイアティであり、天然脂質であるコレステロールに親水性タンパク質であるアルブミンを結合させて製造することができる。特に本発明は、コレステロールにアルブミンを共有結合させることによって、コレステロールとアルブミンをかたく結合させることができる。これを通じて、２つの成分が単純混合されて相互作用によって非特異的に結合した複合体とは異なって、コレステロールにアルブミンが一定の割合でかたく結合したコレステロール－アルブミンを提供することができる。本発明において、前記アルブミン結合コレステロールは、用語「コレステロール－アルブミン」と相互交換的に使用することができる。
【0038】
本発明のアルブミン結合コレステロールは、当業界において一般的に知られている様々な方法によって製造可能である。これらに限定されるものではないが、本発明の一具体例において、前記アルブミン結合コレステロールは、コレステロールクロロホーメートとアルブミンが反応して形成されたものであってもよい。これは、コレステロールクロロホーメートのクロロホーメート基とアルブミンのアミン基が反応して結合したものであってもよい。
【0039】
前記「アルブミン」は、細胞の基本物質を構成するタンパク質の１つであり、自然状態で存在する単純タンパク質のうち最も分子量の小さいタンパク質である。アルブミンは、水溶性（ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ）であり、血漿で多く見られる主要タンパク質であり、水、カルシウム、ナトリウム、カリウムなどのカチオン、脂肪酸、ホルモン、ビリルビン（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）、薬物など様々なリガンドと結合し、血液のコロイド浸透圧を調節および伝達する役割をする。特に薬物とアルブミンの結合は、薬物の薬効発現に大きく寄与する。前記アルブミンは、卵白（ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ、オボアルブミン；ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、ウシ血清またはヒト血清から相当量を収得することができ、大豆、牛乳および穀物から抽出することもできる。または、自然的に存在するアルブミンと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように製造された形質転換体から収得した組換えアルブミンを利用することもできる。
また、前記「コレステロール」は、ステロイドとアルコールの組み合わせであるステロールの一種であり、すべての動物細胞の細胞膜に存在する脂質であり、血液を通じて輸送される有機分子である。コレステロールは、食物を通じて吸収されたり体内で合成され、細胞膜の多い器官に高濃度で存在し、細胞に適切な膜透過性および流動性を付与する。分子内に複数の融合した環構造を含むので、環構造を含む物質と向上した相互作用を示すことができる。
また、前記「コレステロール」は、ステロイドとアルコールの組み合わせであるステロールの一種であり、すべての動物細胞の細胞膜に存在する脂質であり、血液を通じて輸送される有機分子である。コレステロールは、食物を通じて吸収されたり体内で合成され、細胞膜の多い器官に高濃度で存在し、細胞に適切な膜透過性および流動性を付与する。分子内に複数の融合した環構造を含むので、環構造を含む物質と向上した相互作用を示すことができる。
【0040】
前述したように、本発明は、天然リポタンパク質の遊離コレステロールの代わりに、アルブミン結合コレステロールをその構成成分として含んでもよい。
【0041】
前記アルブミン結合コレステロールは、全体固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、１～２０重量部であってもよい。
【0042】
例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、前記アルブミン結合コレステロールは、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、１．５～８重量部、２～５重量部、３．５～４．５重量部で含まれてもよい。また、例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、前記アルブミン結合コレステロールは、低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、３～１５重量部、５～１２重量部、９～１１重量部で含まれてもよい。アルブミン結合コレステロールが上記のような範囲で固体脂質ナノ粒子を構成するとき、天然リポタンパク質を模倣しながらも、粒子間凝集を防ぎ、薬物封入率に優れた固体脂質ナノ粒子を形成することができる。上記のような固体脂質ナノ粒子において多量の薬物を封入しながらも、食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）によるナノ粒子の分解を防止し、標的部位への薬物送達効率を最大化させることができる。さらに、アルブミン結合コレステロールを前記含有量で含ませることによって、アルブミン結合コレステロールによって固体脂質ナノ粒子のシェルをかたく形成することができ、遺伝子伝達のための遺伝子形質感染の効率が向上することができ、後述するカチオン性脂質の細胞毒性が減少するという利点があり、食作用（Ｐｈａｒｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制し、固体脂質ナノ粒子の薬物送達効率が向上することができる。
【0043】
アルブミンは、エンドソーム－リソソーム区画でナノ粒子の放出を促進できるエンドソーム溶解活性を有するので、薬物送達効率の向上に寄与することができる。例えば、下記実施例では、このようなエンドソーム溶解活性によって固体脂質ナノ粒子とｓｉＲＮＡの複合体（ａｌｂｕｍｉｎ＿ＳＬＮ／ｓｉＲＮＡ複合体）が生体内遺伝子伝達（沈黙）効率の向上に寄与することを示す。また、前記ナノ粒子は、血管循環中にもナノ構造を維持できるので、腫瘍組織に優先的に分布し、副作用を最小化すると共に、薬物の治療効能を最大化できるという利点がある。
【0044】
前記融合誘導性脂質は、固体脂質ナノ粒子を形成できるすべての種類の中性、カチオン性、またはアニオン性脂質であってもよく、単一または２種以上のリン脂質の混合物であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記融合誘導性脂質としては、融合誘導可能なすべての種類のリン脂質を使用することができ、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＳＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］（ＤＯＰＳ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］から成る群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0045】
一具体例において、前記融合誘導性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であってもよい。
【0046】
前記融合誘導性脂質は、全体固体脂質ナノ粒子の重量を基準として、５～４０重量部、１５～４０重量部、２０～３５重量部、２０～３０重量部で含まれてもよい。融合誘導性脂質が上記のような範囲で固体脂質ナノ粒子を構成するとき、遺伝子形質感染の効率を向上させ、後述するカチオン性脂質の細胞毒性を減少させるという利点がある。また、融合誘導性脂質は、固体脂質ナノ粒子の細胞膜通過およびエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）を助けて、細胞内薬物送達を容易にする。
【0047】
前記カチオン性脂質は、生理学的ｐＨのように特定のｐＨで正味の負電荷を帯びるカチオン性脂質を含んでもよい。例えば、前記カチオン性脂質は、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ－コレステロール）、３β－［Ｎ－（Ｎ’－モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ－コレステロール）、３β－［Ｎ－（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ－コレステロール）、Ｎ－（Ｎ’－アミノエタン）カバモイルプロパノイックトコフェロール（ＡＣ－トコフェロール）、Ｎ－（Ｎ’－メチルアミノエタン）カバモイルプロパノイックトコフェロール（ＭＣ－トコフェロール）、Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリール－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイル）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレオイルカルバミル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（Ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ－３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２－スペルミンカルボキサミド）エチル｝－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ］－３－ジメチル－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９’，１２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジアザ－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＴＡＰ）、１，２－ジアザ－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン、および１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパンから成る群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0048】
一具体例において、前記カチオン性脂質は、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）であってもよい。前記ＤＣ－コレステロールは、他のカチオン性脂質よりもその毒性が弱く、ＤＣ－コレステロール系遺伝子担体が黒色腫、嚢胞性線維腫、子宮頸がん、乳がんまたは卵巣がんなどの様々な疾患の臨床治療に使用承認を受けたという点から特に好ましい。
【0049】
前記カチオン性脂質は、全体固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、１０～６０重量部で含まれてもよい。
【0050】
例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、前記カチオン性脂質は、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、１０～６０重量部、３５～５８重量部、４０～５０重量部で含まれてもよい。カチオン性脂質が上記のような含有量の範囲で固体脂質ナノ粒子のシェルを構成するとき、固体脂質ナノ粒子が多量の薬物を封入しながらも、細胞膜を通過できるサイズで形成され、効率的に薬物を送達することができる。
【0051】
また、例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、前記カチオン性脂質は、低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、１０～４０重量部、１０～３０重量部、１２～２８重量部で含まれてもよい。カチオン性脂質が上記のような含有量の範囲で固体脂質ナノ粒子のシェルを構成するとき、固体脂質ナノ粒子が多量の薬物を封入しながらも、細胞膜を通過できるサイズで形成され、効率的に薬物を送達することができる。
【0052】
本発明において、前記シェルは、アルブミン結合コレステロールを含むことによって、シェルの表面にアルブミンを露出させて、細胞内薬物送達効率を最大化させることができる。また、前記シェルは、アポリポタンパク質を実質的に含まなくてもよい。本発明による固体脂質ナノ粒子は、従来の固体脂質ナノ粒子とは異なって、アポリポタンパク質の代わりに、カチオン性脂質を固体脂質ナノ粒子の構成に含むことによって、前記カチオン性脂質によって固体脂質ナノ粒子の表面部（シェル）にカチオン特性を付与し、薬物を結合させることができ、細胞膜を通過できるサイズで固体脂質ナノ粒子を形成することができる。
【0053】
本発明において、前記「実質的に含まない」は、固体脂質ナノ粒子の全体１００重量部を基準として３重量部未満、１重量部未満で含まれることを意味する。
【0054】
また、前記固体脂質ナノ粒子は、細胞内薬物送達が容易となるように、平均粒子直径が２０～２００ｎｍであってもよい。
【0055】
例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、平均粒子直径は、２０～５０ｎｍ、２０～４５ｎｍ、２５～４０ｎｍ、２０～４０ｎｍであってもよい。
【0056】
また、例えば、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の場合、平均粒子直径は、６０～２００ｎｍ、６０～１５０ｎｍ、２５～４０ｎｍ、２０～４０ｎｍであってもよい。
【0057】
前記固体脂質ナノ粒子は、均一な粒度分布を有していてもよい。上記のような範囲の直径および均一な粒度分布を有する固体脂質ナノ粒子は、全身薬物送達（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に有用に活用することができる。
【0058】
本発明において、高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、全体高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、コレステリルエステル５～３０重量部、トリグリセリド０．０１～５重量部、アルブミン結合コレステロール１～２０重量部、融合誘導性脂質５～４０重量部およびカチオン性脂質１０～６０重量部を含んでもよい。
【0059】
また、本発明において低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、全体低比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子１００重量部を基準として、コレステリルエステル３０～６０重量部、トリグリセリド０．０１～５重量部、アルブミン結合コレステロール１～２０重量部、融合誘導性脂質５～４０重量部およびカチオン性脂質１０～４０重量部を含んでもよい。
【0060】
また、本発明は、前記リポタンパク質固体脂質ナノ粒子の製造方法を提供する。
前記製造方法は、有機溶媒でコレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を混合し、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が分散した水性分散液を製造する段階を含む。
前記製造方法は、有機溶媒でコレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を混合し、リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子が分散した水性分散液を製造する段階を含む。
【0061】
また、前記製造方法は、アルブミン結合コレステロールを製造する段階；および／または前記水性分散液を透析して精製し、濃縮させる段階をさらに含んでもよい。
【0062】
前記製造方法において、コレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質および前記リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子のすべての説明は、前述したすべての内容をそのまま適用することができる。
【0063】
より具体的には、前記製造方法は、
ｉ）アルブミン結合コレステロールを製造する段階；
ｉｉ）有機溶媒にコレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を混合し、固体脂質ナノ粒子が分散した水性分散液を製造する段階；および
ｉｉｉ）前記水性分散液を蒸留水で一定の時間間隔で１２～３６時間透析した後、透析液を濃縮させる段階を含んでもよい。
ｉ）アルブミン結合コレステロールを製造する段階；
ｉｉ）有機溶媒にコレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を混合し、固体脂質ナノ粒子が分散した水性分散液を製造する段階；および
ｉｉｉ）前記水性分散液を蒸留水で一定の時間間隔で１２～３６時間透析した後、透析液を濃縮させる段階を含んでもよい。
【0064】
前記ｉ）段階は、コレステロールクロロホーメートを有機溶媒に溶解した後、この溶液をアルブミン溶液に滴下して反応させる段階；および前記反応溶液を蒸留水で１２～３６時間透析した後、凍結乾燥させる段階を含んでもよい。この際、前記コレステロールクロロホーメートとアルブミンは、１：１～５：１のモル比で使用することもできるが、これに限定されるものではない。
【0065】
前記ｉｉ）段階で、有機溶媒は、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、Ｃ１～Ｃ４の低級アルコール、メチレンクロリド、クロロホルム、アセトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ－メチルピロリドン、ジオキサン、エチルアセテート、メチルエチルケトン、アセトニトリルおよびこれらの混合物から選ばれることもできるが、これらに限定されるものではない。前記有機溶媒は、固体脂質ナノ粒子の製造段階で全部除去されるので、有機溶媒による毒性は考慮しない。
【0066】
一具体例において、前記ｉｉ）段階で有機溶媒は、クロロホルムとメタノールの混合物であってもよい。
【0067】
また、前記ｉｉ）段階で、有機溶媒にコレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を混合する過程で前記混合物を超音波処理および／または減圧乾燥する過程をさらに含んでもよい。
【0068】
本発明のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、シェルの表面に露出したカチオン性脂質との静電気的相互作用によって各種非水溶性薬物および／または核酸遺伝子のような薬物の伝達体として使用することができる。これより、本発明は、前記リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を含む薬物送達用組成物を提供する。
【0069】
本発明において、前記薬物は、非水溶性薬物、核酸、または非水溶性薬物と核酸を同時に含んでもよい。
【0070】
本発明において、前記非水溶性薬物は、難溶性薬物、アニオンを帯びるペプチド、タンパク質、ヒアルロン酸－ペプチド結合体またはヒアルロン酸－タンパク質結合体であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記難溶性薬物は、パクリタキセル、ドセタキセル、アンフォテリシン、ドキソルビシン、ニフェジピン、プロポフォール、ジアゼパム、エストラジオール、シクロスポリン、リトナビル、サキナビル、ビフェニルジメチルジカルボキシレート、コエンザイムＱ１０、ウルソデオキシコリン酸、イラプラゾール 、イマチニブ、メシラート、アシクロビル、アロプリノール、アミオダロン、アザチオプリン、ベナゼプリル、カルシトリオール、カンデサルタン、エプロサルタン、カルビドパ/レボドパ、クラリスロマイシン、クロザピン、デスモプレシンアセテート、ジクロフェナク、エナラプリル、ファモチジン、フェロジピン、フェノフィブラート、フェンタニル、フェキソフェナジン、フォシノプリル、フロセミド、グリブリド、ヒヨスチアミン、イミプラミン、イトラコナゾール、レボチロキシン、アトルバスタチン、ロバスタチン、メクリジン、メゲステロール、メルカプトプリン、メトラゾン、モメタゾン、ナブメトン、オメプラゾール、パロキセチン、プロパフェノン、キナプリル、シンバスタチン、シロリムス、タクロリムス、チザニジン、フルバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、エピルビシンまたはそれらの混合物から選ばれるものであってもよいが、これらに限定されない。
【0071】
一具体例において、前記非水溶性薬物は、難溶性薬物であってもよい。
前記組成物において、非水溶性薬物および／または核酸と固体脂質ナノ粒子は、１：１～１：１０、１：３～１：８の重量比で複合体を形成することができる。
前記組成物において、非水溶性薬物および／または核酸と固体脂質ナノ粒子は、１：１～１：１０、１：３～１：８の重量比で複合体を形成することができる。
【0072】
前記複合体は、固体脂質ナノ粒子のシェルに非水溶性薬物および／または核酸が相互作用によって結合していてもよく、コアに非水溶性薬物および／または核酸を捕集する形態を全部含んでもよい。
【0073】
前記核酸は、短い干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）、運搬リボ核酸（ｔＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ－ＯＤＮ）から成る群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0074】
一具体例において、前記核酸は、ｓｉＲＮＡであってもよい。
特にｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、または一本鎖ＲＮＡ内部で二本鎖の形態を取る一本鎖ＲＮＡを意味する。二本鎖間の結合は、ヌクレオチド間の水素結合を通じてなされ、二本鎖内部のすべてのヌクレオチドが相補的に完全に結合すべきものではない。ｓｉＲＮＡの長さは、約１５～６０、約１５～５０個、約１５～４０個、約１５～３０個、約１５～２５個、１６～２５個、１９～２５個、２０～２５個、または２０～２３個のヌクレオチドであってもよい。前記ｓｉＲＮＡ長さは、二本鎖ＲＮＡの片方ヌクレオチドの個数、すなわち、塩基対の個数を意味し、一本鎖ＲＮＡの場合には、一本鎖ＲＮＡ内部の二本鎖の長さを意味する。また、ｓｉＲＮＡは、血中安定性を増加させたり免疫反応を弱化させるなどの目的のために様々な官能基を導入したヌクレオチドからなってもよい。
特にｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、または一本鎖ＲＮＡ内部で二本鎖の形態を取る一本鎖ＲＮＡを意味する。二本鎖間の結合は、ヌクレオチド間の水素結合を通じてなされ、二本鎖内部のすべてのヌクレオチドが相補的に完全に結合すべきものではない。ｓｉＲＮＡの長さは、約１５～６０、約１５～５０個、約１５～４０個、約１５～３０個、約１５～２５個、１６～２５個、１９～２５個、２０～２５個、または２０～２３個のヌクレオチドであってもよい。前記ｓｉＲＮＡ長さは、二本鎖ＲＮＡの片方ヌクレオチドの個数、すなわち、塩基対の個数を意味し、一本鎖ＲＮＡの場合には、一本鎖ＲＮＡ内部の二本鎖の長さを意味する。また、ｓｉＲＮＡは、血中安定性を増加させたり免疫反応を弱化させるなどの目的のために様々な官能基を導入したヌクレオチドからなってもよい。
【0075】
したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、典型的なｓｉＲＮＡから非修飾型または修飾型の両方を含んでもよい。
【0076】
また、本発明は、前記リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を用いて標的細胞に非水溶性薬物および／または核酸を伝達する方法を提供する。
【0077】
前記方法は、
ｉ）非水溶性薬物および／または核酸と前記リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の複合体を形成する段階；および
ｉｉ）前記複合体を標的細胞に形質感染させる段階を含んでもよい。
ｉ）非水溶性薬物および／または核酸と前記リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の複合体を形成する段階；および
ｉｉ）前記複合体を標的細胞に形質感染させる段階を含んでもよい。
【0078】
前記ｉ）段階で、複合体は、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または脱塩水内で非水溶性薬物および／または核酸の存在下に前記リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を混合して形成することを特徴とするが、この際、前記ＰＢＳは、ｐＨ７．０～８．０であり、ＮａＣｌを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【0079】
また、前記ｉ）段階で、非水溶性薬物および／または核酸と固体脂質ナノ粒子は、１：１～１：１０、１：３～１：８の重量比で複合体を形成することができる。
【0080】
また、本発明は、ＫＲＡＳを標的とする非水溶性薬物または核酸を捕集した、前記リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を含むＫＲＡＳ遺伝子変異によって誘発されるがんの予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0081】
前記薬学組成物において、非水溶性薬物、核酸および高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、前述した内容をそのまま適用または準用することができる。
【0082】
前記ＫＲＡＳ遺伝子変異によって誘発されるがんは、例えば、非小細胞肺がん、大腸がんまたは膵がんであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0083】
前記薬学組成物において、ＫＲＡＳを標的とする非水溶性薬物または核酸を捕集したリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子は、非水溶性薬物または核酸と高比重リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の複合体形態であってもよい。
【0084】
前記複合体に含まれる非水溶性薬物は、難溶性薬物であってもよい。
また、前記複合体に含まれるＫＲＡＳを標的とする核酸は、還元可能な核酸ダイマーであってもよい。
また、前記複合体に含まれるＫＲＡＳを標的とする核酸は、還元可能な核酸ダイマーであってもよい。
【0085】
本発明の利点および特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述している実施例を参照すると明確になる。しかしながら、本発明は、以下に開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態で具現されるものであり、単に本実施例は、本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【発明を実施するための形態】
【0086】
実施例
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造過程および薬物送達体としてのリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の形態を図式化し、図１に示した。
リポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の製造過程および薬物送達体としてのリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子の形態を図式化し、図１に示した。
【0087】
［製造例１］アルブミン結合コレステロール（コレステロール－アルブミン）の製造
アルブミン結合コレステロールを製造するために、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とコレステリルクロロホーメート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
アルブミン結合コレステロールを製造するために、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とコレステリルクロロホーメート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【0088】
まず、ヒト血清アルブミン０．５ｍｍｏｌをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８．０）２ｍＬに溶解させた。１ｍＬのＤＭＦにコレステロールクロロホーメート１．５ｍｍｏｌを溶解し、この溶液をヒト血清アルブミン溶液に滴下した。この際、コレステリルクロロホルマートとヒト血清アルブミンは、３：１のモル比で使用された。その後、常温で一晩中弱く振って反応させた後、反応溶液を分子カットオフ１２０００ｇ／ｍｏｌ透析チューブを用いて３Ｌの蒸留水に対して３時間透析し、蒸留水は、２４時間の間３～４時間間隔で交換した。その後、生成物溶液を凍結乾燥し、アルブミン結合コレステロール（以下、コレステロール－アルブミンという）を製造した。
【0089】
［製造例２］高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）模倣固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）の製造
ＨＤＬ模倣ＳＬＮは、溶媒乳化法（ｓｏｌｖｅｎｔ－ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を一部変形して製造した。
ＨＤＬ模倣ＳＬＮは、溶媒乳化法（ｓｏｌｖｅｎｔ－ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を一部変形して製造した。
【0090】
コア構造脂質としてコレステリルオレエートおよびトリオレインを使用し、表面（シェル）構造脂質としてＤＯＰＥ、前記製造例１で製造されたコレステロール－アルブミンおよびＤＣ－コレステロールを使用した。下記表１および表２の成分を２ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物（２：１、ｖ／ｖ）に溶解させた。そこへ１０ｍＬの脱イオン水を添加し、混合物を完全にボルテキシングした。懸濁液は、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ(登録商標)（２０ｋＨｚ、デューティサイクル（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）＝４０、出力制御＝３．５）を用いて５分間超音波処理した。乳化した溶液を回転蒸発器に移し、溶媒は、コレステリルオレエートの融点である５２℃以上の温度で蒸発させて除去した。最後に、ＨＤＬ模倣ＳＬＮの水性分散液を一晩中透析（ＭＷＣＯ：５，０００）して精製し、真空蒸発を通じて最大５ｍｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬで濃縮させた。
【0091】
【表1】
【0092】
【表2】
【0093】
また、製造されたＨＤＬ模倣ＳＬＮ（実施例１－１～１－１２）の組成による粒子サイズおよびゼータ電位値を比較した。
【0094】
この際、陰性比較群としては、実施例１－２の組成で製造するものの、コレステロール－アルブミンでなく、コレステロールを使用して製造した固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）を使用した。前記ＳＬＮは、下記実験例１～５におけるＨＤＬ陰性比較群に使用された。
【0095】
その結果、前記表１および表２から明らかなように、コレステリルオレエートおよびアルブミン結合コレステロール（コレステロール＿アルブミン）の量が減少するほどＨＤＬ模倣ＳＬＮのサイズが減少する傾向を示した。また、ＤＣ－Ｃｈｏｌの量が増加するほどＨＤＬ模倣ＳＬＮのサイズが減少する傾向を図２で確認した。
【0096】
図２の結果では、コレステリルオレエートおよびコレステロール（コレステロール＿アルブミン）の含有量が大きいほど、ＤＣ－Ｃｈｏｌの含有量が少ないほどＨＤＬ模倣ＳＬＮのＺ平均値が増加する傾向を確認することができる。
これをベースに実施例１－２を最適なＨＤＬ模倣ＳＬＮの組成に選定した。
これをベースに実施例１－２を最適なＨＤＬ模倣ＳＬＮの組成に選定した。
【0097】
［製造例３］低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）模倣固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）の製造
下記表３および表４の成分および組成を使用したことを除いて、製造例２と同様の方法でＬＤＬ模倣ＳＬＮを製造した。
下記表３および表４の成分および組成を使用したことを除いて、製造例２と同様の方法でＬＤＬ模倣ＳＬＮを製造した。
【0098】
【表3】
【0099】
【表4】
【0100】
また、製造されたＬＤＬ模倣ＳＬＮ（実施例２－１～２－１０）の組成による粒子サイズおよびゼータ電位値を比較した。
【0101】
この際、陰性比較群としては、実施例２－５の組成で製造するものの、コレステロール－アルブミンでなく、コレステロールを使用して製造した固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）を使用した。前記ＳＬＮは、下記実験例１～５におけるＬＤＬ陰性比較群に使用された。
【0102】
その結果、前記表３および表４から明らかなように、コレステリルオレエートおよびアルブミン結合コレステロール（コレステロール－アルブミン）の量が減少するほどＬＤＬ模倣ＳＬＮのサイズが減少する傾向を示すことを確認することができる。また、ＤＣ－Ｃｈｏｌの量が増加するほどＬＤＬ模倣ＳＬＮのサイズが減少することを確認することができる（図２）。
【0103】
図２の結果では、コレステリルオレエートおよびコレステロール（コレステロール－アルブミン）の含有量が大きいほど、ＤＣ－Ｃｈｏｌの含有量が少ないほどＬＤＬ模倣ＳＬＮのＺ平均値が増加する傾向を確認することができる。
これをベースに実施例２－５を最適なＬＤＬ模倣ＳＬＮの組成に選定した。
これをベースに実施例２－５を最適なＬＤＬ模倣ＳＬＮの組成に選定した。
【0104】
［実験例１］最適なＨＤＬ模倣ＳＬＮと最適なＬＤＬ模倣ＳＬＮの薬物封入率の比較
下記表５および表６の組成で構成されたＨＤＬ模倣ＳＬＮ（実施例１－２の組成）とＬＤＬ模倣ＳＬＮ（実施例２－５の組成）の薬物封入率を比較した。
下記表５および表６の組成で構成されたＨＤＬ模倣ＳＬＮ（実施例１－２の組成）とＬＤＬ模倣ＳＬＮ（実施例２－５の組成）の薬物封入率を比較した。
【0105】
【表5】
【0106】
【表6】
【0107】
【表7】
【0108】
【表8】
【0109】
その結果、前記表７および表８から明らかなように、ＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＬＤＬ模倣ＳＬＮは、いずれも、優れた薬物封入率を有することを確認することができる。
【0110】
より具体的には、ＬＤＬ模倣ＳＬＮの場合、ＨＤＬ模倣ＳＬＮに比べて、ナノ粒子の平均粒径が２．５倍以上大きいことが測定されたが、薬物封入率は、類似のレベルであることが分かった。これを通じて、ＨＤＬ模倣ＳＬＮがさらに優れた薬物封入効果を有することを確認することができる。
【0111】
また、図３ａは、表５の組成を有するＳＬＮで、ＬＤＬ陰性比較群（左写真）およびＬＤＬ模倣ＳＬＮ（右写真）のＴＥＭ写真を示す。また、図３ｂは、表６の組成を有するＳＬＮで、ＨＤＬ陰性比較群（左写真）およびＨＤＬ模倣ＳＬＮ（右写真）のＴＥＭ写真を示す。図３から明らかなように、本発明によるＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＬＤＬ模倣ＳＬＮは、粒子間凝集なく、優れた分散度を有する均一なナノ粒子であることを確認することができる。
【0112】
［製造例４］ダイマーｓｉＲＮＡの製造
１）Ｋｒａｓ ｓｉＲＮＡの選定
Ｋｒａｓ ｓｉＲＮＡ配列は、３つのライブラリーを選定して研究を進めた。前記３つの配列は、公開されていないものであり、Ｋｒａｓ自体は、自然的な遺伝子であるが、Ｋｒａｓ遺伝子を構成する全塩基配列中、いずれかの配列をｓｉＲＮＡのターゲット配列として使用するかは、研究者の選択である。本発明者らは、下記表１の配列を使用した。本実験に使用されたすべての二本鎖モノマーｓｉＲＮＡは、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（大田、韓国）に合成依頼して購入した。
１）Ｋｒａｓ ｓｉＲＮＡの選定
Ｋｒａｓ ｓｉＲＮＡ配列は、３つのライブラリーを選定して研究を進めた。前記３つの配列は、公開されていないものであり、Ｋｒａｓ自体は、自然的な遺伝子であるが、Ｋｒａｓ遺伝子を構成する全塩基配列中、いずれかの配列をｓｉＲＮＡのターゲット配列として使用するかは、研究者の選択である。本発明者らは、下記表１の配列を使用した。本実験に使用されたすべての二本鎖モノマーｓｉＲＮＡは、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（大田、韓国）に合成依頼して購入した。
【0113】
【表9】
【0114】
２）ｓｉＲＮＡダイマー合成
切断可能なカップリング剤を介して連結された還元性ダイマーｓｉＲＮＡを合成するために、３’末端（ｓｅｎｓｅ）でチオール基に変更された二本鎖モノマーｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ－Ｋｒａｓ、スクランブルされる）を使用した。
切断可能なカップリング剤を介して連結された還元性ダイマーｓｉＲＮＡを合成するために、３’末端（ｓｅｎｓｅ）でチオール基に変更された二本鎖モノマーｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ－Ｋｒａｓ、スクランブルされる）を使用した。
【0115】
簡単に言えば、５００μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理された脱イオン水（ＤＷ）で５０ｎｍｏｌの二本鎖モノマーｓｉＲＮＡは、ジメチルスルホキシドに含まれた５０ｎｍｏｌの切断可能なカップリング剤であるジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ、１５．６μｇ）で活性化した（ｓｉＲＮＡ：ＤＴＭＥのモル濃度は１：１）。アニオン性の高い二本鎖ｓｉＲＮＡ間の電荷反発を最小化するために、７５０ｍＭ ＮａＣｌを溶液に添加した（最適溶液ｐＨの範囲、６．５～７．５）。常温で弱く振って一晩中培養した後、生成されたダイマーｓｉＲＮＡをＤＷに対して一晩中透析（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ）して精製し、真空蒸発を通じて１ｎｍｏｌ／μｌまで濃縮した。モノマーｓｉＲＮＡを還元可能なダイマーｓｉＲＮＡに合成する過程を図４に図式化した。
【0116】
３）ダイマーｓｉＲＮＡの解離
まず、２）で合成したダイマーｓｉＲＮＡは、細胞内でモノマーの形態で作用するので、モノマーｓｉＲＮＡにさらに分離され得る場合に細胞内におけるｓｉＲＮＡの作用を行うことができる。これより、還元剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）を使用して還元性ダイマーｓｉＲＮＡであるかを証明するための実験を行った。
まず、２）で合成したダイマーｓｉＲＮＡは、細胞内でモノマーの形態で作用するので、モノマーｓｉＲＮＡにさらに分離され得る場合に細胞内におけるｓｉＲＮＡの作用を行うことができる。これより、還元剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）を使用して還元性ダイマーｓｉＲＮＡであるかを証明するための実験を行った。
【0117】
ダイマーｓｉＲＮＡに対する二硫化結合の切断を確認するために、１００ｎｍｏｌのダイマーｓｉＲＮＡサンプル（１００μｌ）を２μｍｏｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ、１００μｌ）で一晩中常温で培養した。溶液の最終ｐＨは、５Ｍ ＮａＯＨを使用して８．０に調整した。生成された切断モノマーｓｉＲＮＡをＤＷに対して一晩中透析（ＭＷＣＯ：１０ ｋＤａ）して精製し、真空蒸発を通じて最大１ｎｍｏｌ／μｌまで濃縮した。
【0118】
また、スクランブルされたモノマーｓｉＲＮＡに対する配列を有する非カップリング連結されたダイマーｓｉＲＮＡをＢｉｏｎｅｅｒ社（大田、韓国）から得た。
【0119】
すべての結果生成物、モノマーｓｉＲＮＡ、切断可能な二硫化結合を通じて連結されたダイマーｓｉＲＮＡ、切断モノマーｓｉＲＮＡおよび非結合ダイマーｓｉＲＮＡは、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析した。
【0120】
その結果、図５から明らかなように、ダイマーｓｉＲＮＡがモノマーｓｉＲＮＡに切断されたことを確認することができた。
【0121】
［製造例５］ダイマーｓｉＲＮＡとリポタンパク質模倣ＳＬＮの複合体の製造
モノマー、切断可能な二硫化結合を通じて連結されたダイマーｓｉＲＮＡおよび非カップリング連結されたダイマーｓｉＲＮＡの複合体は、リポタンパク質模倣ＳＬＮ（実施例１－２および実施例２－５）を使用して形成された。各ｓｉＲＮＡ（１．５μｇ、１００ ｐｍｏｌ）は、１０分間６の重量比（ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ）で固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）と複合体化された（ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体）。
モノマー、切断可能な二硫化結合を通じて連結されたダイマーｓｉＲＮＡおよび非カップリング連結されたダイマーｓｉＲＮＡの複合体は、リポタンパク質模倣ＳＬＮ（実施例１－２および実施例２－５）を使用して形成された。各ｓｉＲＮＡ（１．５μｇ、１００ ｐｍｏｌ）は、１０分間６の重量比（ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ）で固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）と複合体化された（ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体）。
【0122】
複合体の安定性を調査するために、複合体に様々なヘパリン／ｓｉＲＮＡの重量比（０、１、２、５、１０、２０および５０）でヘパリンを添加し、３７℃で３０分間さらに培養した。培養後、分解されたｓｉＲＮＡの量を１％アガロスゲル電気泳動で分析した。
【0123】
血清安定性を分析するために、複合体をあらかじめ定められた時間（０、２、４、８、１２、２４および４８時間）で３７℃、５０％ｖ／ｖ血清で培養し、生成されたサンプルをさらにヘパリン（１００μｇ）およびＤＴＴ溶液（１００ｍＭ）で処理した後、放出されたｓｉＲＮＡ分画を対象にアガロスゲル電気泳動を行った。
【0124】
ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の流体力学的直径および表面ζ電位値は、Ｈｅ－Ｎｅレーザービーム付きＺｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ－ｓｅｒｉｅｓ ｎａｎｏ－ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して６６３ｎｍの波長、９０°の固定された散乱角度で測定された。測定は、すべてのサンプルに対して２５℃で３回行われた。
【0125】
ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の形態およびサイズは、ＡＦＭ（ＸＥ－１００，Ｐａｒｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｋｏｒｅａ）で観察した。ＡＦＭ分析のために、ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体を新しい雲母の表面に配置し、空気中で乾燥させた後、イメージを３１２ｋＨｚの獲得周波数で非接触モードで記録した。
【0126】
［実験例２］ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の細胞内吸収の確認
製造例５で製造したｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の細胞内吸収を確認し、比較するために、ＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡを複合体化に使用し、細胞内吸収をフローサイトメトリー分析装置（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＵＳＡ）で分析した。この際、細胞は、Ｈ４４１細胞株を使用した。
製造例５で製造したｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の細胞内吸収を確認し、比較するために、ＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡを複合体化に使用し、細胞内吸収をフローサイトメトリー分析装置（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＵＳＡ）で分析した。この際、細胞は、Ｈ４４１細胞株を使用した。
【0127】
ＦＩＴＣ標識されたモノマーｓｉＲＮＡの場合、モノマーｓｉＲＮＡは、スクランブルされたモノマーｓｉＲＮＡに対する配列で３’末端（ｓｅｎｓｅ）でチオール基修飾と共に５’末端（ｓｅｎｓｅ）でＦＩＴＣによって末端標識され、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（大田、韓国）に合成依頼して購入した。ＦＩＴＣ標識されたダイマーｓｉＲＮＡは、ダイマーｓｉＲＮＡ合成セクションに説明された通り合成し、１０％ＰＡＧＥで分析した。
【0128】
細胞をウェル当たり２×１０４細胞数の密度で６ウェルプレートに２４時間接種した後、ダイマーｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体をあらかじめ定められた時間（３０分）で３７℃でそれぞれ形質感染させた（１２８ｎｍのｓｉＲＮＡ）。培養培地を除去して細胞吸収を中断させ、形質感染された細胞をＰＢＳで３回滑らかに洗浄した後、ＰＢＳに分散させた。細胞の蛍光は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー分析システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＰｈａｒＭｉｎｕｔｅｓｇｅｎ）を使用して測定された。
【0129】
その結果を図６に示した。図６で、ｄｉｍｅｒｉｃ ｓｉＲＮＡ／ａｌｂｕｍｉｎ ＨＤＬは、実施例１～２によるＨＤＬ模倣ＳＬＮを使用した場合であり、ｄｉｍｅｒｉｃ ｓｉＲＮＡ／ＬＤＬは、ＨＤＬ陰性比較群を使用した場合を示す。また、ｄｉｍｅｒｉｃ ｓｉＲＮＡ／ａｌｂｕｍｉｎ ＬＤＬは、実施例２～５によるＬＤＬ模倣ＳＬＮを使用した場合であり、ｄｉｍｅｒｉｃ ｓｉＲＮＡ／ＬＤＬは、ＬＤＬ陰性比較群を使用した場合を示す。
【0130】
その結果、図６から明らかなように、ｄｉｍｅｒｉｃ ｓｉＲＮＡ／ａｌｂｕｍｉｎ ＨＤＬおよびｄｉｍｅｒｉｃ ｓｉＲＮＡ／ａｌｂｕｍｉｎ ＬＤＬで優れた細胞内吸収程度を示し、ｄｉｍｅｒｉｃ ｓｉＲＮＡ／ａｌｂｕｍｉｎ ＨＤＬで最も高い細胞内吸収程度を示した。
【0131】
このようなデータは、アルブミン融合したＨＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体が約５０ｎｍサイズのナノ粒子サイズで形成され、細胞内吸収性に最も優れていて、効果的な薬物送達体として使用され得ることを示唆する。
【0132】
［実験例３］ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の試験管内活性の確認
２つの類型のダイマーｓｉＲＮＡ、Ｋｒａｓ（内因性）およびスクランブル（対照群）により形成されたｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の遺伝子沈黙効果を確認し、比較した。
２つの類型のダイマーｓｉＲＮＡ、Ｋｒａｓ（内因性）およびスクランブル（対照群）により形成されたｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の遺伝子沈黙効果を確認し、比較した。
【0133】
まず、実施例１～２および実施例２～５で製造されたリポタンパク質模倣ＳＬＮと複合体を形成した後、細胞に処理し、Ｋｒａｓ ｍＲＮＡの細胞レベルで逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、遺伝子沈黙効果を確認した。この際、細胞は、Ｈ４４１細胞株を使用した。
【0134】
簡単に言えば、細胞をウェル当たり２×１０４細胞数の密度で６ウェルプレートに２４時間播種した後、様々なｓｉＲＮＡ濃度でダイマーｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体で形質感染させた（各グループ当たりｎ＝３）。３日間培養した後、細胞を回収し、製造社のプロトコルによってＴｒｉｚｏｌ試薬を使用してトータルＲＮＡを分離した。
【0135】
ｃＤＮＡ合成は、製造社のプロトコルによってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキットを使用して行われた。
【0136】
標的遺伝子（ヒトＫｒａｓ）および対照群遺伝子（ヒトβ－アクチン）に対するＤＮＡ増幅は、２分間９４℃の１サイクル；および３０秒間９４℃、３０秒間５７℃、１分間７２℃の３０サイクル；５分間７２℃の１サイクルの熱循環条件でプライマーおよびＰｒｉｍｅ Ｔａｑ Ｐｒｅｍｉｘで行われた。
プライマー配列は、下記表１０の配列を使用した。
プライマー配列は、下記表１０の配列を使用した。
【0137】
【表10】
【0138】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分析し、ＩｍａｇｅＪプログラムを使用して各バンド強度を定量化した。
【0139】
その結果を図７および図８に示した。図７および図８（および後述する図９～図１２）でａｌｂｕｍｉｎ ＨＤＬは、実施例１～２によるＬＤＬ模倣ＳＬＮを使用した場合（すなわち、ＨＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体使用）であり、ＨＤＬは、ＨＤＬ陰性比較群を使用した場合を示す。また、ａｌｂｕｍｉｎ ＬＤＬは、実施例２～５によるＬＤＬ模倣ＳＬＮを使用した場合（すなわち、ＬＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体を使用）であり、ＬＤＬは、ＬＤＬ陰性比較群を使用した場合を示す。
【0140】
その結果、図７および図８から明らかなように、本発明によるＨＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体において最も優れたｋｒａｓ沈黙効果が現れることを確認することができる。これを通じて、ＨＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の優れた薬物送達効果を確認することができる。
【0141】
［実験例４］ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の生体内活性の確認
１）動物モデルの構築
異種移植マウスモデルを構築するために、雌ＳＰＦ ＢＡＬＢ／Ｃ－ｎｕマウス（８週齢）のわき腹にがん細胞（５×１０５細胞）を皮下注射した。腫瘍が平均体積が５０～１００ｍｍ３に到達すれば、治療を始めた。
１）動物モデルの構築
異種移植マウスモデルを構築するために、雌ＳＰＦ ＢＡＬＢ／Ｃ－ｎｕマウス（８週齢）のわき腹にがん細胞（５×１０５細胞）を皮下注射した。腫瘍が平均体積が５０～１００ｍｍ３に到達すれば、治療を始めた。
【0142】
２つの類型のモノマーまたはダイマーｓｉＲＮＡ、Ｋｒａｓ（内因性）およびスクランブル（対照群）の遺伝子沈黙効果を調査し、比較するために、実施例１～２および実施例２～５で製造されたリポタンパク質模倣ＳＬＮと複合体を形成した後、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈注射を通じて静脈投与し、腫瘍組織でマウスＫｒａｓ ｍＲＮＡの遺伝子沈黙効果は、ＲＴ－ＰＣＲで評価した。
【0143】
簡単に言えば、剤形は、各マウスに投与されるようにｓｉＲＮＡ濃度でＰＢＳに希釈された。２４時間処理後、腫瘍組織を粉砕し、均質化装置（Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で組織溶解物を製造した。次に、製造社のプロトコルによってＴＲＩｚｏｌ試薬を使用してトータルＲＮＡを分離し、β－アクチンに対して正規化されたＫｒａｓ ｍＲＮＡレベルを測定した。
【0144】
ＲＴ－ＰＣＲの場合、標的遺伝子（マウスＫｒａｓ）および対照群遺伝子（マウスβ－アクチン）に対するＤＮＡ増幅をプライマーおよびＰｒｉｍｅｒ Ｔａｑ Ｐｒｅｍｉｘで２分間９４℃の１サイクル；および３０秒間９４℃、３０秒間５７℃、１分間７２℃の２６サイクル；５分間７２℃の１サイクルの熱循環条件で行った。
プライマー配列は、下記表１１の配列を使用した。
プライマー配列は、下記表１１の配列を使用した。
【0145】
【表11】
【0146】
ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動で分析し、ＩｍａｇｅＪプログラムを使用して各バンド強度を定量化した。
【0147】
図９および図１０の結果から明らかなように、動物モデルにおいても前記結果（図７および図８）と同様に、本発明によるＨＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体において最も優れた遺伝子伝達効果を示したことを確認することができる。
【0148】
［実験例５］ｓｉＲＮＡの組織分布および薬物動態学的プロファイルの確認
マウスでダイマーｓｉＲＮＡによって形成されたｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の生体分布および血中クリアランス （ｂｌｏｏｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を確認し、比較するために、１２５Ｉ標識されたｓｉＲＮＡをＢｏｌｔｏｎ－Ｈｕｎｔｅｒ方法を使用して製造し、複合体化に使用した。
マウスでダイマーｓｉＲＮＡによって形成されたｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体の生体分布および血中クリアランス （ｂｌｏｏｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を確認し、比較するために、１２５Ｉ標識されたｓｉＲＮＡをＢｏｌｔｏｎ－Ｈｕｎｔｅｒ方法を使用して製造し、複合体化に使用した。
【0149】
まず、放射性標識されたモノマーｓｉＲＮＡの合成のために、Ｂｏｌｔｏｎ－Ｈｕｎｔｅｒ試薬であるＮ－スクシンイミジル－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ，ＳＨＰＰ）をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、１０μｌの１２５Ｉ溶液（１ｍＣｉ）を１０μｌのＳＨＰＰ溶液に添加した。クロラミン－Ｔを１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解させ、５０μｌのクロラミン－Ｔ溶液をＳＨＰＰのヨウ化のために１５秒間激烈に混合し、準備した２０μｌのＳＨＰＰ／１２５Ｉ混合物に直ちに添加した。ヨード化したＳＨＰＰ溶液をベンゼン／ＤＭＦ混合物１ｍＬ（４０：１、ｖ／ｖ）で抽出した後、有機相をきれいなチューブに移した。有機溶媒を蒸発して除去し、乾燥したヨード化したＳＨＰＰを溶解させ、４℃で２時間１０ｎｍｏｌのアミン作用化したモノマーｓｉＲＮＡ（１００μｌ）に反応させて、ヨード化したＳＨＰＰ相のＮＨＳ基とモノマーｓｉＲＮＡの５’末端で修飾されたアミン基を共有結合した。１２５Ｉ標識されたモノマーｓｉＲＮＡを一晩中透析（ＭＷＣＯ：５ｋＤａ）して精製した（ＮＨＳ基のモル比、ＳＨＰＰのＮＨＳ基／モノマーｓｉＲＮＡのアミン基）。
【0150】
アミン作用化したモノマーｓｉＲＮＡの場合、モノマーｓｉＲＮＡは、スクランブルされたｓｉＲＮＡに対する配列を有する３’末端（ｓｅｎｓｅ）でチオール基修飾と共に５’末端（ｓｅｎｓｅ）でアミン基によって末端標識され、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（大田、韓国）に合成依頼して購入した。１２５Ｉ標識されたダイマーｓｉＲＮＡは、ダイマーｓｉＲＮＡ合成セクションに記述された通り合成され、１０％ＰＡＧＥで分析された。
【0151】
注射時点まで放射性崩壊に対して修正された薬物動態学的プロファイルは、雌ＳＰＣ Ｃ５７ＢＬ／６マウスグループで血液サンプルを収集して測定された。１２５Ｉ標識されたモノマーまたはダイマーｓｉＲＮＡによって形成されたｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体を静脈内（ｉｖ）注射した後、指定された時間にサンプリングを行い、収穫したサンプルの放射能は、γカウンター（１４７０自動ガンマカウンター、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して測定された。実験に使用された時点は、０．２５、０．５、１、２、４、２４および４８時間であり、マウス尾静脈から約２μｌの血液を収集し、血液凝固を防止するために、８μｌのＥＤＴＡ溶液に保存した（各グループに対してｎ＝３）。
【0152】
生体内ｓｉＲＮＡ組織分布を評価するために、１２５Ｉ標識されたダイマーｓｉＲＮＡによって形成されたｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体を雌ＳＰＦ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈（ｉｖ）注入を通じて注射した。注射後、特定の時点（１、４、２４および４８時間）にマウス（ｎ＝３マウス／時点）を犠牲させ、サンプル臓器を収穫し、重さを測った。生体内ｓｉＲＮＡ組織分布は、γ－カウンターを使用して測定された各組織の放射能数値から、最初注射投与時の放射能数値と比較して計算された（％ ｏｆ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｏｓｅ／ｇｒａｍ）。
【0153】
その結果、図１１に示されたように、すべての実験群のうちＨＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体（ａｌｂｕｍｉｎ ＨＤＬ）において最も優れた血液安定性を示し、最も高い血中半減期を示し、これによって、時間が経過するほどがん組織にｓｉＲＮＡが多く分布していることを確認することができた（図１２）。これを通じて、本発明によるＨＤＬ模倣ｓｉＲＮＡ／ＳＬＮ複合体ががん組織への薬物送達効率に最も優れていることを確認した。
【0154】
［実験例６］非水溶性薬物送達体の製造
１）非水溶性薬物としてパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）を封入したリポタンパク質模倣ＳＬＮの製造（Ｔａｘｏｌを封入したＳＬＮ）
下記表１２および表１３に示されたように、構成成分をガラス瓶に含まれた２ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解させた。１０ｍＬの蒸留水を前記ガラス瓶に添加して、１分間撹拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）して混合し、その後、溶液をＢｒａｎｓｏｎ超音波処理器４５０（２０ｋＨｚ、デューティサイクル＝４０、出力制御＝３．５）で３分間超音波処理した。溶液を回転蒸発器に移し、溶媒であるクロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）溶液をコレステリルオレエートの融点である６０℃以上の温度で除去した。蒸留水中で一晩中分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｃｕｔ－ｏｆｆ，ＭＷＣＯ）５０００の透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて精製し、精製された非水溶性薬物（ｔａｘｏｌ）を封入した固体脂質ナノ粒子溶液は、４℃で保管し、非水溶性薬物（ｔａｘｏｌ）を封入した固体脂質ナノ粒子（Ｔａｘｏｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＳＬＮ）を製造した。
１）非水溶性薬物としてパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）を封入したリポタンパク質模倣ＳＬＮの製造（Ｔａｘｏｌを封入したＳＬＮ）
下記表１２および表１３に示されたように、構成成分をガラス瓶に含まれた２ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解させた。１０ｍＬの蒸留水を前記ガラス瓶に添加して、１分間撹拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）して混合し、その後、溶液をＢｒａｎｓｏｎ超音波処理器４５０（２０ｋＨｚ、デューティサイクル＝４０、出力制御＝３．５）で３分間超音波処理した。溶液を回転蒸発器に移し、溶媒であるクロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）溶液をコレステリルオレエートの融点である６０℃以上の温度で除去した。蒸留水中で一晩中分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｃｕｔ－ｏｆｆ，ＭＷＣＯ）５０００の透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて精製し、精製された非水溶性薬物（ｔａｘｏｌ）を封入した固体脂質ナノ粒子溶液は、４℃で保管し、非水溶性薬物（ｔａｘｏｌ）を封入した固体脂質ナノ粒子（Ｔａｘｏｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＳＬＮ）を製造した。
【0155】
ここで、ＨＤＬ模倣ＳＬＮを使用した場合、Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮで表現し、ＬＤＬ模倣ＳＬＮ使用した場合、Ｔａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮで表現した。
【0156】
【表12】
【0157】
【表13】
【0158】
２）Ｔａｘｏｌを封入したＳＬＮの物理化学的特性の確認
実験例６－１）で製造されたＴａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮの平均サイズおよびゼータ電位測定は、レーザー光散乱法で測定し、波長６３２ｎｍおよび検出角度９０°のＨｅ－Ｎｅレーザーが搭載された動的光散乱装置（ＤＳＬ）（Ｚｅｔａ－Ｐｌｕｓ、ブルックヘブンインスツルメント社、ＮＹ）を使用して測定した。２５℃の蒸留水内に分散したＴａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮの濃度が５ｍｇ／ｍｌであるとき、サイズを３回測定し、前記Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮに含まれた薬物の含有量および封入率を評価するために、高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）を使用した。前記Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮ溶液を凍結乾燥（Ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）し、蒸留水を除去した。凍結乾燥した非水溶性薬物（ｔａｘｏｌ）を封入した固体脂質ナノ粒子をメタノール２０ｍＬに分散させて完全に溶かした後、フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＳＲ ０．４５ｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ）を用いて非水溶性薬物を抽出した後、高性能液体クロマトグラフィーを用いて封入した非水溶性薬物の量を分析し、その結果を次の表１４および表１５に示した。この際、薬物の濃度による検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）と共に比較して、非水溶性薬物の量を定量分析し、封入した非水溶性薬物の量（％、ｗ／ｗ）および封入率（％）は、次の数式１および数式２を使用して一緒に分析した。
実験例６－１）で製造されたＴａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮの平均サイズおよびゼータ電位測定は、レーザー光散乱法で測定し、波長６３２ｎｍおよび検出角度９０°のＨｅ－Ｎｅレーザーが搭載された動的光散乱装置（ＤＳＬ）（Ｚｅｔａ－Ｐｌｕｓ、ブルックヘブンインスツルメント社、ＮＹ）を使用して測定した。２５℃の蒸留水内に分散したＴａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮの濃度が５ｍｇ／ｍｌであるとき、サイズを３回測定し、前記Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮに含まれた薬物の含有量および封入率を評価するために、高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）を使用した。前記Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮ溶液を凍結乾燥（Ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）し、蒸留水を除去した。凍結乾燥した非水溶性薬物（ｔａｘｏｌ）を封入した固体脂質ナノ粒子をメタノール２０ｍＬに分散させて完全に溶かした後、フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＳＲ ０．４５ｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ）を用いて非水溶性薬物を抽出した後、高性能液体クロマトグラフィーを用いて封入した非水溶性薬物の量を分析し、その結果を次の表１４および表１５に示した。この際、薬物の濃度による検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）と共に比較して、非水溶性薬物の量を定量分析し、封入した非水溶性薬物の量（％、ｗ／ｗ）および封入率（％）は、次の数式１および数式２を使用して一緒に分析した。
【0159】
【数1】
【0160】
【数2】
【0161】
【表14】
【0162】
【表15】
【0163】
前記表１４は、Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮの結果であり、表１５は、Ｔａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮの結果である。
【0164】
表１４および表１５に示されたように、Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮおよびＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮが水溶液相で安定した物理化学的特性を有していることを確認することができた。
【0165】
より具体的には、Ｔａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮの場合、粒子の重さ対比１１％（ｗ／ｗ）の効率で薬物を封入しており、１１５～１２５ｎｍレベルのサイズと６５～８５ｍＶレベルの表面電荷を有するＴａｘｏｌを封入したＨＤＬ模倣ＳＬＮであることを確認した。
【0166】
また、Ｔａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮの場合、粒子の重さ対比１４．９％（ｗ／ｗ）の効率で薬物を封入しており、１００～１３０ｎｍレベルのサイズと６５～８５ｍＶレベルの表面電荷を有するＴａｘｏｌを封入したＬＤＬ模倣ＳＬＮであることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0167】
本発明によれば、コレステリルエステル、トリグリセリド、アルブミン結合コレステロール、融合誘導性脂質およびカチオン性脂質を構成とするコア－シェル構造のリポタンパク質模倣固体脂質ナノ粒子を製造することによって、粒子間の凝集を防ぎ、構造的安定性を確保することができる。また、生体利用率に優れ、薬物封入効率が向上した薬物送達体を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】