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特表2024-517998核酸のホスホラミダイトフリー酵素合成のための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-23
(54)【発明の名称】核酸のホスホラミダイトフリー酵素合成のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240416BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20240416BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20240416BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20240416BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12P19/34
C12N15/115 Z
C12N15/10 110Z
C12N9/16
C12N9/16 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508996
(86)(22)【出願日】2022-04-26
(85)【翻訳文提出日】2023-12-11
(86)【国際出願番号】 US2022026333
(87)【国際公開番号】W WO2022232134
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】63/179,828
(32)【優先日】2021-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523404033
【氏名又は名称】カメナ バイオサイエンス リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】デレク ステンプル
(72)【発明者】
【氏名】シルビア マンコウスカ
(72)【発明者】
【氏名】ニール ベル
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CB30
4B064CC24
(57)【要約】
大規模なホスホラミダイト媒介化学合成を必要とすることなく完全に天然の核酸源を使用して任意の核酸（ＮＡ）配列を合成するための組成物及び方法が本明細書に記載される。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二本鎖アダマー(Ａｄｄａｍｅｒ)であって、ａ）第１のＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）配列と、
ｂ）Ｎ－ｍｅｒ配列と、
ｃ）少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列と、を含み、
前記アダマーの少なくとも一方の末端がヘアピン構造を含む、二本鎖アダマー。
【請求項2】
前記アダマーが、前記アダマーの両末端にヘアピン構造を含む、請求項１に記載のアダマー。
【請求項3】
前記アダマーが、ａ）第１のＩＩＳＲＥ配列と、
ｂ）第２のＩＩＳＲＥ配列と、
ｃ）Ｎ－ｍｅｒ配列と、
ｄ）少なくとも第３のＩＩＳＲＥ配列と、を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のアダマー。
【請求項4】
前記アダマーが、ａ）第１のＩＩＳＲＥ配列と、
ｂ）第２のＩＩＳＲＥ配列と、
ｃ）Ｎ－ｍｅｒ配列と、
ｄ）第３のＩＩＳＲＥ配列と、
ｅ）少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列と、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のアダマー。
【請求項5】
前記アダマーが多重クローニング部位（ＭＣＳ）配列を更に含み、前記ＭＣＳ配列が１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のアダマー。
【請求項6】
前記ＩＩＳＲＥ配列のうちの少なくとも１つが、ＭｌｙＩ配列、ＮｇｏＡＶＩＩ配列、ＳｓｐＤ５Ｉ配列、ＡｌｗＩ配列、ＢｃｃＩ配列、ＢｃｅｆＩ配列、ＰｌｅＩ配列、ＢｃｅＡＩ配列、ＢｃｅＳＩＶ配列、ＢｓｃＡＩ配列、ＢｓｐＤ６Ｉ配列、ＦａｕＩ配列、ＥａｒＩ配列、ＢｓｐＱＩ配列、ＢｆｕＡＩ配列、ＰａｑＣＩ配列、Ｅｓｐ３Ｉ配列、ＢｂｓＩ配列、ＢｂｖＩ配列、ＢｔｇＺＩ配列、ＦｏｋＩ配列、ＢｓｍＦＩ配列、ＢｓａＩ配列、ＢｃｏＤＩ配列、及びＨｇａＩ配列から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のアダマー。
【請求項7】
少なくとも１つのヘアピン構造がアプタマー配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のアダマー。
【請求項8】
前記アプタマー配列が、ｐＬ１アプタマー配列、トロンビン２９－ｍｅｒアパタマー配列、Ｓ２．２アプタマー配列、ＡＲＴ１１７２アプタマー配列、Ｒ１２．４５アプタマー配列、Ｒｂ００８アプタマー配列、及び３８ＮＴ ＳＥＬＥＸアパタマー配列から選択される、請求項７に記載のアダマー。
【請求項9】
固体支持体に固定化された請求項１～８のいずれか一項に記載のアダマーを含む、組成物。
【請求項10】
前記固体支持体がビーズである、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記ビーズが、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アガロース、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記固体支持体がウェル又はチャンバーの表面である、請求項９に記載の組成物。
【請求項13】
前記ウェル又はチャンバーがマルチウェルプレートの一部である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記アダマーが、少なくとも１つのアプタマー配列を含むヘアピン構造を含み、前記固体表面が、前記アプタマー配列に結合する少なくとも１つのリガンドを含み、
前記アダマーが、前記少なくとも１つのアプタマー配列の前記少なくとも１つのリガンドへの結合を介して前記固体表面に固定化されている、請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記アダマーが、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを含み、前記固体表面が、前記少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングに相補的な一本鎖部分を有する少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸分子を含み、
前記アダマーが、前記少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを前記固体表面上の前記少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸にハイブリダイズすることによって、前記固体表面に固定化されている、請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
前記アダマーが、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを含み、前記固体表面が、前記少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングに相補的な一本鎖部分を有する少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸分子を含み、
前記アダマーが、前記少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを前記固体表面上の前記少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸にハイブリダイズし、かつ前記アダマーと前記少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸をライゲートすることによって、前記固体表面に固定化されている、請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
請求項１～８のいずれか一項に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を化学的に合成することであって、前記第１の一本鎖核酸分子の配列及び前記第２の一本鎖核酸分子の配列が、生成される前記アダマーの一部を含み、
前記第１の一本鎖核酸分子が、前記第２の一本鎖核酸分子上の第２の領域に相補的な第１の領域と、自己相補的な前記第２の領域とを含み、
前記第２の一本鎖核酸分子が、自己相補的な第１の領域と、前記第１の一本鎖核酸分子上の第１の領域に相補的な第２の領域とを含む、合成することと、
ｂ）前記第１の一本鎖核酸及び前記第２の一本鎖核酸をハイブリダイズして、部分二本鎖核酸分子を生成することと、
ｃ）前記部分二本鎖核酸分子をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンにより両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することと、を含む、方法。
【請求項18】
ステップ（ｃ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ステップ（ｂ）の後であり、かつステップ（ｃ）の前に、前記部分二本鎖核酸分子をＭｕｔＳ酵素と接触させることを更に含む、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
請求項１～８のいずれか一項に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）前記アダマー配列が選択的に活性化され得る１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接するように、前記アダマー配列をファージミドにクローニングすることと、
ｂ）ヘルパーファージを使用して前記ファージミドをパッケージングされたバクテリオファージに変換することであって、前記パッケージングされたバクテリオファージが、１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接する前記アダマー配列を含む一本鎖ＤＮＡを生成する、変換することと、
ｃ）前記パッケージングされたバクテリオファージによって生成された前記一本鎖ＤＮＡを精製することと、
ｄ）前記精製された一本鎖ＤＮＡの折り畳みを許可して、前記１つ以上のＤＮＡザイムの構造及び前記二本鎖アダマー配列の大部分を生成することと、
ｅ）前記１つ以上のＤＮＡザイムを活性化し、それにより、前記パッケージングされたバクテリオファージによって生成された前記一本鎖ＤＮＡから前記アダマー配列を切除することと、
ｆ）前記切除されたアダマーをリガーゼ酵素と接触させることと、を含む、方法。
【請求項21】
ステップ（ｆ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
請求項１～８のいずれか一項に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）前記アダマー配列をプラスミドにクローニングすることと、
ｂ）好適な宿主生物中で前記プラスミドを増殖させることと、
ｃ）前記宿主生物から前記プラスミドを精製することと、
ｄ）前記精製されたプラスミドをニッカーゼ酵素及び制限エンドヌクレアーゼ酵素のうちの１つ以上で処理して、前記プラスミドから前記アダマー配列を切除することと、
ｅ）前記切除されたアダマー配列をリガーゼと接触させて、ヘアピン構造により両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を生成することと、を含む、方法。
【請求項23】
標的核酸配列を含む核酸分子を合成する方法であって、ａ）固体支持体に固定化された請求項１～８のいずれか一項に記載の第１のアダマーを提供することであって、前記第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、
ｂ）固体支持体に固定化された請求項１～８のいずれか一項に記載の第２のアダマーを提供することであって、前記第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、
ｃ）前記第１のアダマーを、前記第１のアダマー内に位置する前記第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、前記固体支持体に固定化されており、かつ前記第１のＩＩＳＲＥ配列と、前記第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、
ｄ）前記第２のアダマーを、前記第２のアダマー内に位置する前記第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ前記第２のＮ－ｍｅｒ配列と、前記第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、前記第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、
ｅ）リガーゼ酵素を使用して前記第１の切断された産物と前記第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、
ｆ）ステップ（ｅ）の前記産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、
ｇ）前記標的核酸配列を含む前記核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の前記産物及び／又は請求項１～８のいずれか一項に記載の１つ以上の追加のアダマーを使用して、ステップ（ａ）～（ｆ）の任意の組み合わせを繰り返すことと、を含む、方法。
【請求項24】
前記リガーゼ酵素がヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ｈＬｉｇ３）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記リガーゼ酵素がＴ４ ＤＮＡリガーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記標的核酸配列が、少なくとも約１００、又は少なくとも約５００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約２０００、又は少なくとも約３０００、又は少なくとも約４０００、少なくとも約５０００ヌクレオチド長である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記標的核酸配列を含む前記合成された核酸分子が、少なくとも８０％の純度を有する、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記標的核酸配列を含む前記合成された核酸分子が、少なくとも９０％の純度を有する、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、内容が全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１７９，８２８号に対する優先権及びその利益を主張する。
本出願は、内容が全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１７９，８２８号に対する優先権及びその利益を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されており、かつ参照により全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年４月２６日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＤＮＷＲ－００９＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前であり、約１７，４２０バイトのサイズである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されており、かつ参照により全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年４月２６日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＤＮＷＲ－００９＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前であり、約１７，４２０バイトのサイズである。
【背景技術】
【0003】
ホスホラミダイト媒介化学合成に関連するエラー率及び有機廃棄物の発生を著しく減少させる核酸の合成が当該技術分野で必要とされている。加えて、当該技術分野では、著しく削減されたコストでの核酸の合成が当該技術分野で必要とされている。大規模なホスホラミダイト媒介化学合成を必要とすることなく完全に天然の核酸源を使用して任意の核酸（ＮＡ）配列を合成するための組成物及び方法が本明細書に記載される。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、少なくとも３つの塩基対（ｂｐ）のペイロードを各々有する１つ以上のアダマー(Ａｄｄａｍｅｒｓ)を提供する。３－ｍｅｒドナー又はアクセプターアダマー設計の全セットは、ペイロードとして、６４個全ての３－ｍｅｒ ｂｐの可能性を含む。他の実施形態は、増加した長さのペイロードを有する類似のヘアピン設計を有する。ペイロードが３である場合、６４個の可能なアダマーが存在する。４ｂｐのペイロードでは、所与のライブラリ内に２５６個の可能なアダマーが存在する。同様に、５－ｍｅｒのペイロードの場合、１，０２４個の要素が存在し、６－ｍｅｒのペイロードの場合、４，０９６個の要素が存在する。アダマーが二本鎖であるため、様々な設計特徴の配置により、所与のライブラリに対して全ての可能なＮ－ｍｅｒ最大値よりも少ない数を使用し、依然として完全な配列カバレッジを達成することが可能である。
【0005】
アダマーは、いくつかの塩基のヘアピンターン及び短い配列のストレッチを含むことができ、これを使用して、エンドヌクレアーゼを有するヘアピン領域からのペイロードの切断をガイドすることができる。加えて、固体支持体への結合を容易にするために、ヘアピン領域は、親和性精製又は結合のためのアプタマー配列、制御された自己切断のための酵素配列（ＤＮＡザイム）、固体支持体への粘着末端ライゲーションによる結合のための入れ子状エンドヌクレアーゼ認識部位、又は固体支持体結合アンカー配列へのハイブリダイゼーションによる結合のための不対合一本鎖領域などのいくつかの可能な特定の構造配列のうちのいずれかを含むことができる。
【0006】
アダマーは、様々なオーバーハング長さを可能にするか、又は所与の構築物全体が特定のより短い長さに切断されることを許可するために、様々なオフセット切断ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むことができる。左側エンドヌクレアーゼ部位と右側エンドヌクレアーゼ部位の差異により、より長いＮＡ配列が生成された際に、特定の「ドナー」対「アクセプター」アダマー中間体の生成が可能になる。当業者に理解されるであろうように、何百ものＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）が特定されている。それらは、二本鎖ＤＮＡ認識部位が切断部位から分離されているという事実を特徴とする。アダマーからオリゴヌクレオチドを合成するための方法がライゲーションに依存するため、５’オーバーハングが好ましく、１、２、３、４、及び５塩基の５’オーバーハング並びに平滑末端をもたらす様々なＩＩＳＲＥが存在する。
【0007】
一実施形態では、固有のアクセプター及びドナー開始ペイロードのアレイは、３－ｍｅｒアダマーの連続結合によって生成される。最初に、ローディング段階では、二本鎖多重クローニング部位（ＭＣＳ）を有する「結合スタッド」をプリロードされた別個の固体表面を、ＢａｍＨＩなどの適切な制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）で消化する。同様に、第１の３－ｍｅｒアダマーをＲＥ消化し、「結合スタッド」にライゲートする。エクソヌクレアーゼで処理し、すすいだ後、結合したアダマー構築物を適切な平滑切断ＩＩＳＲＥで消化して、平滑末端の、露出した３－ｍｅｒ配列を末端に有する結合したアダマー（アクセプター）、又は露出した３－ｍｅｒを末端に有する遊離平滑末端アダマー（ドナー）のいずれかが得られる。ドナーアダマー含有溶液を所望のアクセプターアダマー含有ウェルに移し、これらの２つのアダマーを、平滑ライゲーションに対して６０％超の高い効率を有するヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ｈＬｉｇ３）を使用して一緒に平滑ライゲートする。ライゲートした後、エクソヌクレアーゼをウェルに適用して未反応部位を除去し、ウェルをすすぐ。この時点で、ウェルは、六量体ペイロードを有する固体支持体結合アダマーを含む（図８を参照されたい）。その後、六量体ペイロードを適切なＩＩＳＲＥの適用により組み合わせて、アクセプターバージョン及びドナーバージョンを生成することができる。その後、ドナー溶液をアクセプターウェルに適用し、粘着末端を介してライゲートして、伸長したペイロードが得られ、その後、これをエクソヌクレアーゼで処理し、すすぎ、所望の中間ペイロードが得られる。この反応サイクルを繰り返し、所望のＮＡ配列のペイロードが得られるまでペイロード長を増加させる（図８を参照されたい）。
【0008】
本開示は、以下の特徴：ａ）ｄ二本鎖二重ヘアピン全体構造、及びｂ）０、１、２、３、４、又は５ｂｐのオーバーハングの生成を可能にする固有の左側及び右側ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位を有する、６４個の可能な３－ｍｅｒペイロード、２５６個の可能な４－ｍｅｒペイロード、１，０２４個の可能な５－ｍｅｒペイロード、又は４，０９６個の可能な６－ｍｅｒペイロードを含むアダマーライブラリを提供する。
【0009】
いくつかの態様では、ヘアピン領域は、アプタマーなどの構造的特徴を含むことができ、これを使用して、いくつかの態様では、アプタマーリガンドに対する分子親和性によりアダマーを固体支持体に固定することができ、ヘアピン領域は、制限エンドヌクレアーゼ切断のための制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、固体支持体に以前に固定された核酸へのアダマーライゲーションを可能にすることができる。いくつかの態様では、ヘアピン領域は、ラムダターミナーゼによって切断されて、固体支持体に以前に結合された核酸へのアダマーライゲーションを可能にすることができるラムダファージｃｏｓ部位を含むことができる。いくつかの態様では、ヘアピン領域は、固体支持体に以前に結合された核酸にハイブリダイズされ得る一本鎖領域を含むことができる。
【0010】
本開示は、制限エンドヌクレアーゼ切断及びその後のライゲーション後のアダマーの組み合わせに由来する核酸配列を提供する。
【0011】
本開示は、多重クローニング部位、ヘアピン構造、及び修飾されたエクソヌクレアーゼ耐性の３’末端を含む、固体支持体に結合するための５’末端修飾を有する二本鎖ＤＮＡアンカー配列を提供する。
【0012】
本開示は、適切なアダマー配列に相補的な配列及び修飾されたエクソヌクレアーゼ耐性の３’末端を含む、固体支持体に結合するための５’末端修飾を有する一本鎖ＤＮＡアンカー配列を提供する。
【0013】
本開示は、アダマーライブラリを生成するための方法であって、ａ）ヘアピンの配列及び配置、ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ部位、ペイロード、他の制限エンドヌクレアーゼ部位、並びに挿入切除のための標的部位を含むライブラリ要素の設計、ｂ）当該ライブラリの異なるアダマー要素の各々を単一コピーインサート又は複数コピーインサートのいずれかとして高コピー数プラスミドにクローニングすることと、ｃ）各々のプラスミド又はバクテリオファージＤＮＡを精製することと、ｄ）ｉ）ニッカーゼ、ｉｉ）適切なガイドＲＮＡを有するＣａｓ９ニッカーゼ、及びｉｉｉ）トランス作用性又はシス作用性ＤＮＡザイムのうちの少なくとも１つを使用して当該インサートを切除することと、ｅ）当該インサートをライゲートして、アダマー構造を生成することと、ｆ）任意選択で、当該アダマーを精製するための処理を行うことと、を含む、方法を提供する。
【0014】
本開示は、アダマーライブラリを生成するための方法であって、ａ）ヘアピンの配列及び配置、ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ部位、ペイロード、他の制限エンドヌクレアーゼ部位、並びに挿入除去のための標的部位を含むライブラリ要素を設計することと、ｂ）特定のアダマーの別個の上鎖及び下鎖のホスホラミダイト合成を行うことと、ｃ）任意選択で、プレアダマー二本鎖をＭｕｔＳ又は類似のエラー補正酵素で処理することと、ｄ）特定のアダマーの上鎖及び下鎖をリガーゼ酵素と接触させて、アダマー構造を生成することと、ｅ）ステップ（ｄ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理して、機能的アダマーを精製することと、を含む、方法を提供する。
【0015】
本開示は、１つ以上のアダマーを固体支持体に結合させるための方法であって、ａ）５’修飾を含む二本鎖アンカー配列を固体表面上にロードすることと、ｂ）アンカー配列のバクテリオファージラムダターミナーゼ消化を行うことと、ｃ）１つ以上のアダマーのバクテリオファージラムダターミナーゼ消化を行うことと、ｄ）消化された１つ以上のアダマーを消化されたアンカー配列とインキュベートすることと、ｅ）消化された１つ以上のアダマーと消化されたアンカー配列をライゲートすることと、を含む、方法を提供する。
【0016】
本開示は、１つ以上のアダマーを固体支持体に結合させるための方法であって、ａ）５’修飾を含む二本鎖アンカー配列を固体表面上にロードすることと、ｂ）アンカー配列の制限エンドヌクレアーゼ消化を行うことと、ｃ）１つ以上のアダマーの制限エンドヌクレアーゼ消化を予形成することと、ｄ）消化された１つ以上のアダマー配列及び消化されたアンカー配列をインキュベートすることと、消化された１つ以上のアダマーと消化されたアンカー配列をライゲートすることと、を含む、方法を提供する。
【0017】
本開示は、アプタマー配列を含む１つ以上のアダマーを固体支持体に結合させるための方法であって、ａ）少なくとも１つの化学リガンドを固体支持体に結合させることであって、少なくとも１つの化学リガンドがアプタマー配列に結合する、結合することと、ｂ）１つ以上のアダマー及び固体支持体をインキュベートし、それにより、１つ以上のアダマーを固体支持体に結合させることと、を含む、方法を提供する。
【0018】
本開示は、核酸を合成する方法であって、ａ）１つ以上のアダマーを少なくとも１つの固体支持体に結合させることと、ｂ）適切なＩＩＳＲＥによるアクセプターアダマー及びドナーアダマーの独立した制限酵素消化を行うことと、ｃ）アクセプターアダマー反応体積を洗浄することと、ｄ）ドナーアダマー溶液をアクセプターアダマー反応体積とインキュベートすることと、ｅ）消化されたドナーアダマーと消化されたアクセプターアダマーをライゲートすることと、ｆ）エクソヌクレアーゼ消化を行うことと、ｇ）任意選択で、ステップ（ｆ）の産物を洗浄することと、を含む、方法を提供する。所望の最終産物が生成されるまでａ～ｇが繰り返されるように、結果として得られた産物を、その後のステップでアクセプターアダマー又はドナーアダマーのいずれかとして使用することができる。
【0019】
本開示は、二本鎖アダマーであって、当該アダマーが、ａ）第１のＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）配列、ｂ）Ｎ－ｍｅｒ配列、ｃ）少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列を含み、当該アダマーの少なくとも一方の末端がヘアピン構造を含む、二本鎖アダマーを提供する。いくつかの態様では、アダマーは、アダマーの両末端にヘアピン構造を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、ａ）第１のＩＩＳＲＥ配列、ｂ）第２のＩＩＳＲＥ配列、ｃ）Ｎ－ｍｅｒ配列、及びｄ）少なくとも第３のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、ａ）第１のＩＩＳＲＥ配列、ｂ）第２のＩＩＳＲＥ配列、ｃ）Ｎ－ｍｅｒ配列、ｄ）第３のＩＩＳＲＥ配列、及びｅ）少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、多重クローニング部位（ＭＣＳ）配列を更に含むことができ、ＭＣＳ配列は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ配列を含む。
【0020】
いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、ＭｌｙＩ配列、ＮｇｏＡＶＩＩ配列、ＳｓｐＤ５Ｉ配列、ＡｌｗＩ配列、ＢｃｃＩ配列、ＢｃｅｆＩ配列、ＰｌｅＩ配列、ＢｃｅＡＩ配列、ＢｃｅＳＩＶ配列、ＢｓｃＡＩ配列、ＢｓｐＤ６Ｉ配列、ＦａｕＩ配列、ＥａｒＩ配列、ＢｓｐＱＩ配列、ＢｆｕＡＩ配列、ＰａｑＣＩ配列、Ｅｓｐ３Ｉ配列、ＢｂｓＩ配列、ＢｂｖＩ配列、ＢｔｇＺＩ配列、ＦｏｋＩ配列、ＢｓｍＦＩ配列、ＢｓａＩ配列、ＢｃｏＤＩ配列、及びＨｇａＩ配列から選択することができる。
【0021】
いくつかの態様では、ヘアピン構造は、アプタマー配列を含むことができる。いくつかの態様では、アプタマー配列は、ｐＬ１アプタマー配列、トロンビン２９－ｍｅｒアプタマー配列、Ｓ２．２アプタマー配列、ＡＲＴ１１７２アプタマー配列、Ｒ１２．４５アプタマー配列、Ｒｂ００８アプタマー配列、及び３８ＮＴ ＳＥＬＥＸアプタマー配列から選択することができる。
【0022】
本開示は、固体支持体に固定化された本開示のアダマーを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、固体支持体は、ビーズとすることができる。いくつかの態様では、ビーズは、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アガロース、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ウェル又はチャンバーの表面とすることができる。いくつかの態様では、ウェル又はチャンバーは、マルチウェルプレートの一部とすることができる。
【0023】
アダマーが固体支持体に固定化されているいくつかの態様では、アダマーは、少なくとも１つのアプタマー配列を含むヘアピン構造を含み、固体表面は、アプタマー配列に結合する少なくとも１つのリガンドを含み、アダマーは、少なくとも１つのアプタマー配列の少なくとも１つのリガンドへの結合を介して固体表面に固定化されている。
【0024】
アダマーが固体支持体に固定化されているいくつかの態様では、アダマーは、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを含み、固体表面は、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングに相補的な一本鎖部分を有する少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸分子を含み、アダマーは、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを、固体表面上の少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸にハイブリダイズすることによって、固体表面に固定化されている。
【0025】
アダマーが固体支持体に固定化されているいくつかの態様では、アダマーは、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを含み、固体表面は、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングに相補的な一本鎖部分を有する少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸分子を含み、アダマーは、少なくとも１つの５’オーバーハング又は３’オーバーハングを、固体表面上の少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸にハイブリダイズし、かつアダマーと少なくとも１つの一本鎖又は部分二本鎖核酸をライゲートすることによって、固体表面に固定化されている。
【0026】
本開示は、本開示のアダマーを生成する方法であって、ａ）第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を化学的に合成することであって、第１の一本鎖核酸分子の配列及び第２の一本鎖核酸分子の配列が、生成されるアダマーの一部を含み、第１の一本鎖核酸分子が、第２の一本鎖核酸分子上の第２の領域に相補的な第１の領域と、自己相補的な第２の領域とを含み、第２の一本鎖核酸分子が、自己相補的な第１の領域と、第１の一本鎖核酸分子上の第１の領域に相補的な第２の領域とを含む、化学的に合成することと、ｂ）第１の一本鎖核酸及び第２の一本鎖核酸をハイブリダイズして、二本鎖核酸分子を生成することと、ｃ）二本鎖核酸分子をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンにより両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することと、を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、前述の方法は、ステップ（ｃ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することを更に含むことができる。いくつかの態様では、前述の方法は、ステップ（ｂ）の後であり、かつステップ（ｃ）の前に、部分二本鎖核酸分子をＭｕｔＳ酵素と接触させることを更に含むことができる。
【0027】
本開示は、本開示のアダマーを生成する方法であって、ａ）アダマー配列が選択的に活性化され得る１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接するように、アダマー配列をファージミドにクローニングすることと、ｂ）ヘルパーファージを使用してファージミドをパッケージングされたバクテリオファージに変換することであって、パッケージングされたバクテリオファージが、１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接するアダマー配列を含む一本鎖ＤＮＡを生成する、変換することと、ｃ）パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡを精製することと、ｄ）精製された一本鎖ＤＮＡの折り畳みを許可して、１つ以上のＤＮＡザイムの構造及び二本鎖アダマー配列の大部分を生成することと、ｅ）１つ以上のＤＮＡザイムを活性化し、それにより、パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡからアダマー配列を切除することと、ｆ）切除されたアダマーをリガーゼ酵素と接触させることと、を含む、方法を提供する。前述の方法は、ステップ（ｆ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することを更に含むことができる。
【0028】
本開示は、本開示のアダマーを生成する方法であって、ａ）アダマー配列をプラスミドにクローニングすることと、ｂ）好適な宿主生物内でプラスミドを増殖させることと、ｃ）宿主生物からプラスミドを精製することと、ｄ）精製されたプラスミドを、ニッカーゼ酵素及び制限エンドヌクレアーゼ酵素のうちの１つ以上、又は単に１つ以上のニッカーゼ酵素で処理して、プラスミドからアダマー配列を切除することと、ｅ）切除されたアダマー配列をリガーゼと接触させて、ヘアピン構造により両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を生成することと、を含む、方法を提供する。
【0029】
本開示は、標的核酸配列を含む核酸分子を合成する方法であって、ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示のいずれか１つの第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列、第１のＮ－ｍｅｒ配列、及び３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列、第４のＩＩＳＲＥ配列、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ａ）～（ｆ）を繰り返すことと、を含む、方法を提供する。
【0030】
いくつかの態様では、リガーゼ酵素は、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ｈＬｉｇ３）とすることができる。いくつかの態様では、リガーゼ酵素は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとすることができる。
【0031】
いくつかの態様では、標的核酸配列は、少なくとも約１００、又は少なくとも約５００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約２０００、又は少なくとも約３０００、又は少なくとも約４０００、少なくとも約５０００ヌクレオチド長とすることができる。
【0032】
いくつかの態様では、本開示の方法によって合成された標的核酸配列を含む核酸分子は、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の純度を有することができる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
上記の特徴及び更なる特徴は、添付の図面と併せて以下の発明を実施するための形態からより明確に理解されるであろう。
【0034】
【図1】両末端にヘアピンを含む二本鎖核酸分子である、アダマーの例示的な概略図である。
【図2】本開示の様々なアダマー設計の例示的な概略図を示す。エクソヌクレアーゼ耐性を促進するための固体支持体及び二重ヘアピンへの結合手段である、アダマー設計のいくつかの例が示されており、各々のアダマータイプが隣接するＩＩＳＲＥ部位を有するペイロードを有する。凡例には、いくつかの可能なＩＩＳＲＥ部位及びＲＥ部位、並びにトロンビンアプタマーヘアピンが示されている。
【図3】本開示のアダマーの６つの非限定的な例の配列を示す。アダマー設計は、単純なヘアピン、多重クローニング部位、及び対合ＩＩＳＲＥ結合部位を含む。この事例では、各々が１つの平滑切断ＩＩＳＲＥであるＭｌｙＩを有し、これにより、３－ｍｅｒペイロードであるＮＮＮの末端が平滑ライゲーションのために露出したまま残される。各々の設計の左側には、下流ペイロード伸長反応のための５’４塩基オーバーハング又は３塩基オーバーハングＩＩＳＲＥ部位がある。図３に提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１～１２に記載のものに対応する。
【図4】本開示のアダマーに使用するための例示的な入れ子状ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）配列（以下、「ＩＩＳＲＥ配列」）を示す。図４に提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１３～２８に記載のものに対応する。
【図5】本開示のアダマーを生成する方法の例示的な概略図である。本方法では、２つの別個のオリゴヌクレオチドを一緒に合成し、ハイブリダイズする。ミスマッチ塩基に結合し、かつＤＮＡをエクソヌクレアーゼ消化に曝露するＭｕｔＳでの処理を、ライゲーションと組み合わせ、Ｔ７エクソヌクレアーゼ消化が続く。このプロセスにより、実質的に純粋なアダマーが残る。これらのアダマーをオリゴヌクレオチド合成反応で評価し、その後、アダマーのクローン生成用の鋳型として機能することができる。図５に提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２９～３２に記載のものに対応する。
【図6】本開示のアダマーの生成に使用するためのファージミドの概略図である。このファージミド構築物は、二本鎖ＤＮＡからバクテリオファージを生成するための情報、並びにクローン性起源の純粋なアダマーの効率的な切除のためのＤＮＡザイムを含む。任意のペイロード長の化学的に合成されたアダマーから、Ｆｏｒプライマー及びＲｅｖプライマーを使用してインサートを生成し、ファージミドベクターにライゲートする。
【図7A】ファージミド及びＤＮＡザイムを使用して本開示のアダマーを生成する方法の例示的な概略図である。入れ子状ＩＩＳＲＥ（４塩基オーバーハング部位が入れ子状になった平滑切断部位及び４塩基部位が入れ子状になった平滑部位）及び対合ＭＣＳ（ＭＳＣ左及びＭＣＳ右）を含むアダマー設計における特定のアダマー３－ｍｅｒペイロードＧＣＣの概略図を示す。この設計は、フォワード増幅プライマー部位及びリバース増幅プライマー部位（Ｆｏｒ及びＲｅｖ）並びにＤＮＡザイム瘢痕配列も含む。隣接するＤＮＡザイム対も示されている。Ｅ．ｃｏｌｉ内でのバクテリオファージ増殖によって生成される一本鎖ＤＮＡを精製し、折り畳みを許可して、ＤＮＡザイム構造及び二本鎖アダマー配列の大部分を生成する。Ｚｎ＋での処理による活性化、ライゲーション、及びＴ７エクソヌクレアーゼ処理後、純粋なクローンアダマーが生成される。
【図7B】アダマー配列の二分子トランス切断除去を使用して本開示のアダマーを生成する方法の例示的な概略図である。
【図8】本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。最初に第１のアダマー及び第２のアダマーを、ＤＮＡライゲーションを使用して、既に固体支持体にロードしたＭＣＳを有する結合スタッドに結合させる。ドナー構築物及びアクセプター構築物が別個の体積で生成される。ドナー構築物及びアクセプター構築物を別個のＩＩＳＲＥで処理して、ライゲート可能な末端が生成される。この図では、アクセプターがＲ１ ＩＩＳＲＥでの消化によって生成され、放出された末端及び酵素がすすぎによって廃棄される。ドナー構築物が紫色のＬ２酵素での消化によって生成される。ドナー構築物溶液（Ｌ２酵素を有する）をアクセプターウェルに移し、２、３、又は４塩基粘着末端ライゲーションに対して８０％超の高い効率を有するＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートする。ウェルをエクソヌクレアーゼで処理し、すすぐ。その後、結果として得られたアダマー構築物は、その後の伸長サイクルの準備が整った状態である。
【図9A】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【図9B】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【図9C】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【図9D】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【図9E】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【図9F】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【図9G】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【図9H】２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図９Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３に記載のものに対応する。図９Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４～３５に記載のものに対応する。図９Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３６～４７に記載のものに対応する。図９Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４８～５８に記載のものに対応する。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本開示は、特定の標的核酸配列を含む核酸分子を合成するための組成物及び方法を対象とする。本組成物は、本明細書により詳細に記載されるアダマーを含むことができる。本方法は、標的核酸配列を含む核酸分子を生成するための、連続制限酵素切断反応及びライゲーション反応におけるこれらのアダマーの使用を含むことができる。これらの方法は、本明細書により詳細に記載される。
【0036】
重要なことに、既存の核酸合成法とは異なり、本開示の組成物及び方法は、大規模なホスホラミダイト合成を必要としない。結果として、本開示の組成物及び方法は、既存の核酸合成法よりも安価かつ高速である。更に、本開示の組成物及び方法は、既存の核酸合成法よりも毒性の低い有機廃棄物を発生させ、それ故に、環境意識が高い。
【0037】
アダマー
本開示は、少なくとも１つのアダマーを含む組成物を提供する。本明細書で使用される場合、アダマーという用語は、両末端にヘアピン構造を含む二本鎖核酸分子を説明するために使用される。アダマーが固体表面に固定化されているいくつかの態様では、アダマーは、固体表面に結合していない分子の末端に位置する単一のヘアピンを含み得る。固体表面に固定化されたアダマー及び２つのアダマーの例示的な概略図が、図１に示される。アダマーは、本明細書に記載の１つ以上の特徴を含むことができる。
本開示は、少なくとも１つのアダマーを含む組成物を提供する。本明細書で使用される場合、アダマーという用語は、両末端にヘアピン構造を含む二本鎖核酸分子を説明するために使用される。アダマーが固体表面に固定化されているいくつかの態様では、アダマーは、固体表面に結合していない分子の末端に位置する単一のヘアピンを含み得る。固体表面に固定化されたアダマー及び２つのアダマーの例示的な概略図が、図１に示される。アダマーは、本明細書に記載の１つ以上の特徴を含むことができる。
【0038】
いくつかの態様では、アダマーは、ＤＮＡを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。
【0039】
いくつかの態様では、アダマーは、１つ以上の多重クローニング部位（ＭＣＳ）配列を含むことができる。いくつかの態様では、ＭＣＳ配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼで切断されて、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を生成することができる１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）配列を含むことができる。
【0040】
当業者に理解されるであろうように、「平滑末端」は、不対合ヌクレオチドが存在しないＤＮＡ断片の末端を説明するために使用される。
【0041】
当業者に理解されるであろうように、５’オーバーハングという用語は、鎖の一方の５’末端に位置する部分的二本鎖核酸分子の一本鎖部分を指すために使用される。
【0042】
当業者に理解されるであろうように、３’オーバーハングという用語は、鎖の一方の３’末端に位置する部分的二本鎖核酸分子の一本鎖部分を指すために使用される。
【0043】
いくつかの態様では、アダマーは、対応するＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（以下、ＩＩＳＲＥ）で切断され得る少なくとも１つのオフセット切断ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）配列（以下、ＩＩＳＲＥ配列）を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、少なくとも１つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、少なくとも３つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、少なくとも４つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。
【0044】
いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により「平滑末端」の作製がもたらされるような配列である。
【0045】
いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により１ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により２ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により３ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により４ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により５ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により約１ヌクレオチド～約５ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。
【0046】
ＩＩＳＲＥ配列の非限定的な例に加えて、それらの対応するＩＩＳＲＥ、並びにＩＩＳＲＥ配列及び対応するＩＩＳＲＥの切断によって作製されるオーバーハング／平滑末端の説明が表１に示される。したがって、アダマーは、表１に記載のＩＩＳＲＥ配列のうちの１つ以上を含むことができる。
【表1-1】
【表1-2】
【0047】
いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピン構造又はヘアピン（互換的に使用される）は、少なくとも約１、又は少なくとも約２、又は少なくとも約３、又は少なくとも約４、又は少なくとも約５、又は少なくとも約６、又は少なくとも約７、又は少なくとも約８、又は少なくとも約９、又は少なくとも約１０、又は少なくとも約１１、又は少なくとも約１２、又は少なくとも約１３、又は少なくとも約１４、又は少なくとも約１５、又は少なくとも約１６、又は少なくとも約１７、又は少なくとも約１８、又は少なくとも約１９、又は少なくとも約２０、又は少なくとも約２１、又は少なくとも約２２、又は少なくとも約２３、又は少なくとも約２４、又は少なくとも約２５、又は少なくとも約２６、又は少なくとも約２７、又は少なくとも約２８、又は少なくとも約２９、又は少なくとも約３０、又は少なくとも約３１、又は少なくとも約３２、又は少なくとも約３３、又は少なくとも約３４、又は少なくとも約３５、又は少なくとも約３６、又は少なくとも約３７、又は少なくとも約３８、又は少なくとも約３９、又は少なくとも約４０、又は少なくとも約４１、又は少なくとも約４２、又は少なくとも約４３、又は少なくとも約４４、又は少なくとも約４５、又は少なくとも約４６、又は少なくとも約４７、又は少なくとも約４８、又は少なくとも約４９、又は少なくとも約５０ヌクレオチドを含むことができる。
【0048】
上述のように、アダマーは、ヘアピン構造によりいずれかの末端がキャップされている。ヘアピン構造は、いくつかの役割を果たす。第一に、ヘアピンは、アダマーのエクソヌクレアーゼ消化に対する保護を提供する。これにより、本開示の方法における所与の反応からの未反応中間体の除去が可能になり、これにより、生成中のアダマー及びアダマー伸長後の産物の両方に純度が提供される。第二に、ヘアピン構造は、アダマーを固体支持体に結合させるための手段を提供する。これらの結合は、特定の固体支持結合リガンドに結合するアプタマーの結合によって、ＢａｍＨＩなどの従来のＲＥでの消化後のＭＣＳによるライゲーションによって、ラムダファージｃｏｓ部位によるライゲーションによって、又は一本鎖固体支持体結合アンカーＮＡへのハイブリダイゼーションによって、直接生成される。最後に、本明細書に記載のヘアピンは、ビオチンなどの非天然修飾を必要とすることなく、アダマーの固体支持体（例えば、ビーズ）への結合を可能にする。したがって、本開示のアダマーは、完全に天然の手段を使用して合成することができ、小規模及び／又は大規模なホスホラミダイト合成の必要性を取り除く。したがって、本開示のアダマー及び方法は、核酸分子のより高速で安価な合成を可能にし、毒性の低い廃棄物を発生させることができる。
【0049】
いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、アダマーの親和性精製及び／又はアダマーの固体支持体（例えば、ビーズ）への結合を可能にする構造配列を含むことができる。
【0050】
いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、制御された自己切断を可能にする酵素配列（例えば、ＤＮＡザイム配列）を含むことができる。
【0051】
いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、１つ以上の制限酵素部位を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、ヘアピン内の１つ以上の制限酵素部位は、対応する制限酵素で切断されて、少なくとも１つの一本鎖オーバーハングを生成することができ、その後、これを使用して、切断されたアダマーを、少なくとも１つの一本鎖オーバーハングに相補的な核酸を含む固体支持体（例えば、ビーズ）にハイブリダイズ及び／又はライゲートすることができる。
【0052】
いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、アプタマー配列を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、アプタマー配列は、親和性精製及び／又は固体支持体（例えば、ビーズ）への結合に使用することができる。アプタマー配列の非限定的な例が表２に示される。
【表2】
【0053】
いくつかの態様では、アダマーは、ラムダファージｃｏｓ部位を含むことができる。
【0054】
いくつかの態様では、アダマーは、本明細書に記載の方法のうちの１つを使用して合成される核酸の断片を含む「Ｎ－ｍｅｒ配列」を含むことができる。「Ｎ－ｍｅｒ配列」、「ペイロード」、及び「Ｎ－ｍｅｒペイロード」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【0055】
いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約３ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約３ヌクレオチド長である。３ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で３－ｍｅｒと称される。
【0056】
いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約４ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約４ヌクレオチド長である。４ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で４－ｍｅｒと称される。
【0057】
いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約５ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約５ヌクレオチド長である。５ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で５－ｍｅｒと称される。
【0058】
いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約６ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約６ヌクレオチド長である。６ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で６－ｍｅｒと称される。
【0059】
いくつかの態様では、アダマーは、ＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、及び少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、ＭＣＳ配列、続いて第１のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号１～４として図２に示される。図２に示されるアダマー設計番号１～３の非限定的な例では、第１のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列である。図２に示されるアダマー設計番号４の非限定的な例では、第１のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに３ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列である。
【0060】
いくつかの態様では、アダマーは、ＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列、第２のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、第３のＩＩＳＲＥ配列、及び少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、ＭＣＳ配列、続いて第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号５として図２に示される。図２に示されるアダマー設計番号５の非限定的な例では、第１のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、第２のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、第３のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列である。
【0061】
いくつかの態様では、アダマーは、第１のＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列、及び少なくとも第２のＭＣＳ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、第１のＭＣＳ配列、続いて第１のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第２のＭＣＳ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号６として図２に示される。図２に示されるアダマー設計番号６の非限定的な例では、第１のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５－オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列である。
【0062】
いくつかの態様では、アダマーは、第１のＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列、第２のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、第３のＩＩＳＲＥ配列、少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列、及び少なくとも第２のＭＣＳ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、第１のＭＣＳ配列、続いて第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第２のＭＣＳ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号７として図２に示される。図２に示されるアダマー設計番号７の非限定的な例では、第１のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列であり、第２のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、第３のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、少なくとも第４のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列である。
【0063】
いくつかの態様では、アダマーは、アプタマー配列、第１のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列、及びＭＣＳ配列を含むヘアピンを含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、アプタマー配列、続いて第１のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてＭＣＳ配列を含むヘアピンを含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号７として図２に示される。図２に示されるアダマー設計番号７の非限定的な例では、アプタマー配列は、トロンビンアプタマー配列であり、第１のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第２のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥである。
【0064】
図３は、アダマーの６つの非限定的な例の配列を示す。図３に示されるアダマーは各々、単純なヘアピンターンでキャップされている。図３に示されるアダマーは各々、ＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列（「Ｎ」で示される）、及び第２のＩＩＳＲＥ配列を含む。具体的には、図３のアダマーに示されるＮ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、ＩＩＳＲＥ配列は、ＢｂｓＩ、ＭｌｙＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｆｕＡＩ、ＰａｑＣＩ、ＦｏｋＩ、及びＥａｒＩから選択される。
【0065】
２つのＩＩＳＲＥ配列がアダマー内で互いに隣接して含まれている場合、これらのＩＩＳＲＥ配列は、「入れ子状ＩＩＳＲＥ配列」又は「入れ子状ＩＩＳＲＥ部位」と呼ぶことができる。いくつかの態様では、入れ子状ＩＩＳＲＥ配列は、互いに直接隣接する２つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、入れ子状ＩＩＳＲＥ配列は、互いに隣接しているが、約１～約１０ヌクレオチド離れている２つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。
【0066】
理論に束縛されることを望むものではないが、いくつかのＩＩＳＲＥ部位が第１の部位とペイロードとの間の他のＩＩＳＲＥ部位に適合するようにそれらの認識部位から十分に離間された切断部位を有するため、ＩＩＳＲＥ部位を入れ子状にすることが可能である（図４を参照されたい）。したがって、いくつかの態様では、アダマーは、ペイロード（Ｎ－ｍｅｒ配列）の両側に固有の平滑切断部位及び４塩基オーバーハング部位を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、これにより、日常的な核酸生成を行うのに必要とされるアダマー試薬の数が有意に減少する。
【0067】
理論に束縛されることを望むものではないが、入れ子状ＩＩＳＲＥ配列をアダマーに含めることにより、本開示の方法において２つの別個の部位を有する同じ位置で切断するためのいくつかの選択肢が提供される。２つの別個の部位を有する同じ位置で切断する選択肢は、一般的な核酸合成のためにライブラリ（以下を参照されたい）で必要とされる別個のアダマーの数を減少させることができる。図４は、入れ子状ＢｂｖＩ部位及びＢｂｓＩ部位を含む、入れ子状ＩＩＳＲＥ部位の非限定的な例を示す。図４は、本明細書に記載のアダマーのヘアピンに含めることができるアプタマー配列の３つの非限定的な例も示す。
【0068】
いくつかの態様では、アダマーは、増幅プライマーの同族配列を含むが、これに限定されない、クローニングを容易にするために当該技術分野で既知の任意の要素を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、増幅プライマーの同族配列をアダマーに含めることにより、クローン増殖のための特定のアダマー設計の回復が可能になり得る。
【0069】
いくつかの態様では、アダマーは、プラスミド又はバクテリオファージ内での発酵によるアダマーの大規模な生成を容易にするために当該技術分野で既知の任意の要素を含むことができる。かかる要素には、ＤＮＡザイム瘢痕に対応する配列、及び／又はある特定のＤＮＡザイムを使用した切除後のアダマーの円滑な折り畳みを容易にする配列が含まれるが、これらに限定されない（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５５２，８４－８７を参照されたい）。
【0070】
アダマーライブラリ
本開示は、複数のアダマーを含むアダマーライブラリを提供し、これらの複数のアダマーは、１つ以上の異なるアダマー種（すなわち、固有の配列を有するアダマー）を含む。
本開示は、複数のアダマーを含むアダマーライブラリを提供し、これらの複数のアダマーは、１つ以上の異なるアダマー種（すなわち、固有の配列を有するアダマー）を含む。
【0071】
本開示は、複数のアダマーを含む３－ｍｅｒアダマーライブラリを提供し、これらの複数のアダマーは、少なくとも６４個の異なるアダマー種を含み、これらのアダマー種は各々、アデニン、サイトシン、グアニン、及びチミン（４×４×４＝６４）で作製され得る６４個の可能な３－ｍｅｒ配列のうちの１つを含む。
【0072】
本開示は、複数のアダマーを含む４－ｍｅｒアダマーライブラリを提供し、これらの複数のアダマーは、少なくとも２５６個の異なるアダマー種を含み、これらのアダマー種は各々、アデニン、サイトシン、グアニン、及びチミン（４×４×４×４＝２５６）で作製され得る２５６個の可能な４－ｍｅｒ配列のうちの１つを含む。
【0073】
本開示は、複数のアダマーを含む５－ｍｅｒアダマーライブラリを提供し、これらの複数のアダマーは、少なくとも１，０２４個の異なるアダマー種を含み、これらのアダマー種は各々、アデニン、サイトシン、グアニン、及びチミン（４×４×４×４×４＝１，０２４）で作製され得る１，０２４個の可能な５－ｍｅｒ配列のうちの１つを含む。
【0074】
本開示は、複数のアダマーを含む６－ｍｅｒアダマーライブラリを提供し、これらの複数のアダマーは、少なくとも２５６個の異なるアダマー種を含み、これらのアダマー種は各々、アデニン、サイトシン、グアニン、及びチミン（４×４×４×４×４×４＝４，０９６）で作製され得る２５６個の可能な６－ｍｅｒ配列のうちの１つを含む。
【0075】
アダマーを生成する方法
本明細書に記載のアダマーは、図５に概略的に示される方法において化学的に合成された核酸を使用して生成することができる。この方法では、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子は、（例えば、ホスホラミダイト合成を使用して）化学的に合成される。図５の上パネルに示されるように、第１の一本鎖核酸分子は、第２の一本鎖核酸分子上の第２の領域に相補的な第１の領域と、自己相補的な第２の領域とを含み、第２の一本鎖核酸分子は、自己相補的な第１の領域と、第１の一本鎖核酸分子上の第１の領域に相補的な第２の領域とを含む。その後、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子が一緒にハイブリダイズされて、部分二本鎖核酸分子が生成される。その後、部分二本鎖核酸分子が、任意選択で、ミスマッチ塩基に結合し、かつＤＮＡをエクソヌクレアーゼ消化に曝露する酵素ＭｕｔＳと接触することができる。その後、部分二本鎖核酸分子がリガーゼ酵素と接触して、ヘアピンにより両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することができる。リガーゼ酵素との接触後、産物がＴ７エクソヌクレアーゼと接触して、適切に形成されたアダマーを精製及び濃縮することができる。
本明細書に記載のアダマーは、図５に概略的に示される方法において化学的に合成された核酸を使用して生成することができる。この方法では、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子は、（例えば、ホスホラミダイト合成を使用して）化学的に合成される。図５の上パネルに示されるように、第１の一本鎖核酸分子は、第２の一本鎖核酸分子上の第２の領域に相補的な第１の領域と、自己相補的な第２の領域とを含み、第２の一本鎖核酸分子は、自己相補的な第１の領域と、第１の一本鎖核酸分子上の第１の領域に相補的な第２の領域とを含む。その後、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子が一緒にハイブリダイズされて、部分二本鎖核酸分子が生成される。その後、部分二本鎖核酸分子が、任意選択で、ミスマッチ塩基に結合し、かつＤＮＡをエクソヌクレアーゼ消化に曝露する酵素ＭｕｔＳと接触することができる。その後、部分二本鎖核酸分子がリガーゼ酵素と接触して、ヘアピンにより両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することができる。リガーゼ酵素との接触後、産物がＴ７エクソヌクレアーゼと接触して、適切に形成されたアダマーを精製及び濃縮することができる。
【0076】
理論に束縛されることを望むものではないが、化学的に合成された一本鎖核酸分子を使用してアプタマーを生成する前述の方法により、新たなアダマー設計を試験するための迅速な所要時間が可能になる。理論に束縛されることを望むものではないが、前述の方法を使用して生成されたアダマーは、プラスミド又はバクテリオファージを使用するアダマーのクローン生成を含むが、これに限定されない、ホスホラミダイト合成を必要としない方法を使用して、前述のアダマーの大規模な生成のための鋳型として使用することができる。
【0077】
したがって、本開示は、本明細書に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を提供することであって、第１の一本鎖核酸分子の配列及び第２の一本鎖核酸分子の配列が、生成されるアダマーの一部を含み、第１の一本鎖核酸分子が、第２の一本鎖核酸分子上の第２の領域に相補的な第１の領域と、自己相補的な第２の領域とを含み、第２の一本鎖核酸分子が、自己相補的な第１の領域と、第１の一本鎖核酸分子上の第１の領域に相補的な第２の領域とを含む、提供することと、ｂ）第１の一本鎖核酸及び第２の一本鎖核酸をハイブリダイズして、部分二本鎖核酸分子を生成することと、ｃ）部分二本鎖核酸分子をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンにより両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することと、を含む、方法を提供する。
【0078】
したがって、本開示は、本明細書に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を化学的に合成することであって、第１の一本鎖核酸分子の配列及び第２の一本鎖核酸分子の配列が、生成されるアダマーの一部を含み、第１の一本鎖核酸分子が、第２の一本鎖核酸分子上の第２の領域に相補的な第１の領域と、自己相補的な第２の領域とを含み、第２の一本鎖核酸分子が、自己相補的な第１の領域と、第１の一本鎖核酸分子上の第１の領域に相補的な第２の領域とを含む、化学的に合成することと、ｂ）第１の一本鎖核酸及び第２の一本鎖核酸をハイブリダイズして、部分二本鎖核酸分子を生成することと、ｃ）部分二本鎖核酸分子をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンにより両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することと、を含む、方法を提供する。
【0079】
いくつかの態様では、前述の方法は、ステップ（ｃ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することを更に含むことができる。
【0080】
いくつかの態様では、前述の方法は、ステップ（ｂ）の後であり、かつステップ（ｃ）の前に、部分二本鎖核酸分子をＭｕｔＳ酵素と接触させることを更に含むことができる。
【0081】
本明細書に記載のアダマーは、図６及び図７Ａに概略的に示されるファージミドベースの方法を使用して生成することができる（各々全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５５２，８４－８７、及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１９０２０３２４２Ａ１号も参照されたい）。この方法では、アダマー配列は、図６に示されるように、ファージミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ又は当該技術分野で既知の任意の他のファージミド）にクローニングされる。アダマー配列は、図６及び図７Ａの上パネルに示されるように、（例えば、ＤＮＡザイムをＺｎ２＋と接触させることによって）選択的に活性化され得る１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接する。その後、ファージミドは、当業者に周知の方法によって、ヘルパーファージを使用してＭ１３パッケージングバクテリオファージに変換される。Ｍ１３パッケージングバクテリオファージは、図７Ａの上パネルに示されるように、アダマー配列及び隣接するＤＮＡザイムを含む一本鎖ＤＮＡを生成する。図７Ａの上から２番目のパネルに示されるように、バクテリオファージによって生成される一本鎖ＤＮＡが精製され、折り畳みを許可して、ＤＮＡザイム構造及び二本鎖アダマー配列の大部分を生成する。その後、図７Ａの下から２番目のパネルに示されるように、ＤＮＡザイムが（例えば、ＤＮＡザイムをＺｎ２＋と接触させることによって）活性化され、バクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡからアダマー配列を切除する。ＤＮＡザイム切断後、図７Ａの下パネルに示されるように、アダマーの折り畳みが許可され、その後、リガーゼと接触して、アダマーを閉じる。任意選択で、ライゲートされていない又は不適切に形成されたアダマーは、ライゲーション反応の産物をＴ７エクソヌクレアーゼで処理することによって除去することができる。図７Ａに示される例示的なアダマーは、第１のＭＣＳ配列、続いて第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＭＣＳ配列を含む。図７Ａ中のアポストロフィーは、アダマーが自己相補的であり、かつヘアピンドメインにより両末端がキャップされた二本鎖構造を形成するような逆相補配列を意味する。
【0082】
あるいは、類似のバクテリオファージＤＮＡ調製物が、Ｚｎ２＋によって活性化されたＭ１３ ＤＮＡにハイブリダイズされたトランス作用性ＤＮＡザイム要素で処理され、その後、非自己切断様式でアダマーを切除することができる。当業者に理解されるであろうように、ＤＮＡザイムは二分子試薬として作用することが示されている（内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１３，１３５，２４，９１２１－９１２９を参照されたい）。したがって、いくつかの態様では、アダマー切除は、トランスで提供され、バクテリオファージ調製物にハイブリダイズされ、かつＺｎ２＋で活性化されるヘミ－ＤＮＡザイム配列を用いて達成することができる（図７Ｂを参照されたい）。
【0083】
本開示は、本明細書に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）アダマー配列が選択的に活性化され得る１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接するように、アダマー配列をファージミドにクローニングすることと、ｂ）ヘルパーファージを使用してファージミドをパッケージングされたバクテリオファージに変換することであって、パッケージングされたバクテリオファージが、１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接するアダマー配列を含む一本鎖ＤＮＡを生成する、変換することと、ｃ）パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡを精製することと、ｄ）精製された一本鎖ＤＮＡの折り畳みを許可して、１つ以上のＤＮＡザイムの構造及び二本鎖アダマー配列の大部分を生成することと、ｅ）１つ以上のＤＮＡザイムを活性化し、それにより、パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡからアダマー配列を切除することと、ｆ）切除されたアダマーをリガーゼ酵素と接触させることと、を含む、方法を提供する。
【0084】
本開示は、本明細書に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）アダマー配列が選択的に活性化され得るＤＮＡザイムの１つ以上の第１の部分と両側で隣接するように、アダマー配列をファージミドにクローニングすることと、ｂ）ヘルパーファージを使用してファージミドをパッケージングされたバクテリオファージに変換することであって、パッケージングされたバクテリオファージが、１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接するアダマー配列を含む一本鎖ＤＮＡを生成する、変換することと、ｃ）パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡを精製することと、ｄ）精製された一本鎖ＤＮＡの折り畳みを許可して、１つ以上のＤＮＡザイムの構造及び二本鎖アダマー配列の大部分を生成することと、ｅ）精製された一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡザイムの第２の部分を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させることであって、１つ以上のオリゴヌクレオチドが精製された一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、これにより、１つ以上の完全なＤＮＡザイムが形成されるようになる、接触させることと、ｆ）１つ以上のＤＮＡザイムを活性化し、それにより、パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡからアダマー配列を切除することと、ｇ）切除されたアダマーをリガーゼ酵素と接触させることと、を含む、方法を提供する。
【0085】
本開示は、本明細書に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）アダマー配列が選択的に活性化され得るＤＮＡザイムの１つ以上の第１の部分と両側で隣接するように、アダマー配列をファージミドにクローニングすることと、ｂ）ヘルパーファージを使用してファージミドをパッケージングされたバクテリオファージに変換することであって、パッケージングされたバクテリオファージが、１つ以上のＤＮＡザイムと両側で隣接するアダマー配列を含む一本鎖ＤＮＡを生成する、変換することと、ｃ）パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡを精製することと、ｄ）精製された一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡザイムの第２の部分を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させることであって、１つ以上のオリゴヌクレオチドが精製された一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、これにより、１つ以上の完全なＤＮＡザイムが形成されるようになる、接触させることと、ｅ）ステップ（ｄ）の産物の折り畳みを許可して、二本鎖アダマー配列の大部分を生成することと、ｆ）１つ以上のＤＮＡザイムを活性化し、それにより、パッケージングされたバクテリオファージによって生成された一本鎖ＤＮＡからアダマー配列を切除することと、ｇ）切除されたアダマーをリガーゼ酵素と接触させることと、を含む、方法を提供する。
【0086】
いくつかの態様では、前述の方法は、切除されたアダマーをリガーゼ酵素で処理した後、当該産物を少なくとも１つのエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することを更に含むことができる。
【0087】
本明細書に記載のアダマーは、プラスミドベースの方法を使用して生成することができる。プラスミドベースの方法では、アダマーは、大規模で増殖及び精製され得るプラスミド（例えば、細菌及び／又は酵母）にクローニングされる。その後、アダマー配列を含む精製されたプラスミドが１つ以上のニカーゼ酵素（例えば、適切なガイドＲＮＡを有するＣａｓ９ニカーゼ）及び／又は制限エンドヌクレアーゼ酵素で処理されて、プラスミドからアダマー配列を切除して、各々の末端にＤＮＡフラップを有する二本鎖アダマーを得ることができる。その後、ＤＮＡフラップを有する二本鎖アダマーが１つ以上のリガーゼ酵素で処理されて、ヘアピン構造により両末端がキャップされた二本鎖アダマーを生成することができる。
【0088】
したがって、本開示は、本明細書に記載のアダマーを生成する方法であって、ａ）アダマー配列をプラスミドにクローニングすることと、ｂ）好適な宿主生物内でプラスミドを増殖させることと、ｃ）宿主生物からプラスミドを精製することと、ｄ）精製されたプラスミドをニカーゼ酵素及び制限エンドヌクレアーゼ酵素のうちの１つ以上で処理して、プラスミドからアダマー配列を切除することと、ｅ）切除されたアダマー配列をリガーゼと接触させて、ヘアピン構造により両末端がキャップされた二本鎖アダマー構造を生成することと、を含む、方法を提供する。
【0089】
本明細書に記載のアダマーを生成するための方法を使用して、３－ｍｅｒアダマーライブラリ、４－ｍｅｒアダマーライブラリ、５－ｍｅｒアダマーライブラリ、及び６－ｍｅｒアダマーライブラリを含むが、これらに限定されない、アダマーライブラリを生成することができる。
【0090】
いくつかの態様では、６－ｍｅｒアダマーライブラリは、３－ｍｅｒアダマーライブラリから生成され得る。理論に束縛されることを望むものではないが、可能な六量体の総数は多いが、六量体ペイロードは、オリゴヌクレオチド合成に非常に有用なアダマータイプである。加えて、これにより、左側三量体要素でコードされたＩＩＳＲＥ部位と右側三量体要素でコードされたＩＩＳＲＥ部位との間の定期的な切り替えが可能になる。非限定的な例では、初期ライブラリは、最初に、従来のホスホラミダイト合成を使用して、６４個の要素三量体アダマーのライブラリが個別に又はＤＮＡマイクロアレイプール中の完全なセットとして生成される。アダマー三量体ライブラリのプールは、まとめてバクテリオファージにクローニングされるか、又はインビボで増幅される。左側及び右側アダマー三量体ライブラリが調製され、消化されて、ペイロード部位に平滑末端が生成される。その後、右側ライブラリと左側ライブラリがライゲートされて、アダマーの大きいプールが形成される。ライゲートされていない物質は、エクソヌクレアーゼによって消化される。その後、残りのインタクトなアダマーが鋳型として使用されて、ＰＣＲによって特定の六量体アダマーが増幅される。その後、各々の独立した六量体ＰＣＲ産物を適切な規模での生成のためにバクテリオファージにクローニングすることができ、将来使用するために保管することもできる。
【0091】
本開示のアダマーを使用した核酸合成法
本明細書に記載のアダマーは、本明細書に記載の方法で使用されて、任意の標的核酸配列を含む核酸分子を合成することができる。
本明細書に記載のアダマーは、本明細書に記載の方法で使用されて、任意の標的核酸配列を含む核酸分子を合成することができる。
【0092】
いくつかの態様では、標的核酸配列は、少なくとも約１００、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約３００、又は少なくとも約５００、又は少なくとも約６００、又は少なくとも約７００、又は少なくとも約８００、又は少なくとも約９００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約１５００、又は少なくとも約２０００、又は少なくとも約２５００、又は少なくとも約３０００、又は少なくとも約３５００、又は少なくとも約４０００、又は少なくとも約４５００、又は少なくとも約５０００ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、標的二本鎖核酸は、少なくとも１つのホモポリマー配列を含むことができる。
【0093】
いくつかの態様では、標的核酸配列は、少なくとも１つのホモポリマー配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、ホモポリマー配列という用語は、一塩基の反復又は小さいモチーフの反復を含むが、これらに限定されない、任意のタイプの反復核酸配列を指すために使用される。いくつかの態様では、ホモポリマー配列は、少なくとも約１０ヌクレオチド、又は少なくとも約２０ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチド、又は少なくとも約４０ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約７０ヌクレオチド、又は少なくとも約８０ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチド長とすることができる。
【0094】
いくつかの態様では、標的核酸配列は、少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約のＧＣ含有量を有することができる。
【0095】
本開示の合成法の一部として、１つ以上のアダマーを固体支持体に固定化することができる。固体支持体は、少なくとも１つのビーズを含むが、これに限定されない、当該技術分野で既知の任意の固体支持体とすることができる。いくつかの態様では、少なくとも１つのビーズは、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アガロース、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、少なくとも１つのビーズは、磁性とすることができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ウェル又はチャンバーを含む。いくつかの態様では、固体支持体は、複数のウェル又はチャンバーを含むことができる。いくつかの態様では、複数のウェルは、マルチウェルプレートを含む。いくつかの態様では、固体支持体は、ガラスを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ガラススライドを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、石英を含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、石英スライドを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ポリスチレンを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ポリスチレンスライドを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、コーティングを含むことができ、コーティングは、望ましくないタンパク質、望ましくない核酸、又は他の望ましくない生体分子の非特異的結合を防止する。いくつかの態様では、コーティングは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。いくつかの態様では、コーティングは、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含むことができる。
【0096】
アパマーがアプタマー配列を含むヘアピンを含むいくつかの態様では、アパマーは、アプタマー配列への結合を介して固体支持体に固定化することができる。すなわち、固体支持体は、アダマー上のアプタマー配列に結合する少なくとも１つの部分を含むことができる。したがって、アダマーが表２に記載のアプタマー配列のうちの１つを含むヘアピンを含む非限定的な例では、固体支持体は、表２に列記される対応するリガンドを含むことができる。
【0097】
アダマーがＭＣＳ配列を含むいくつかの態様では、アダマーは、ａ）アダマーを少なくとも１つの対応する制限エンドヌクレアーゼと接触させてＭＣＳ配列を切断し、それにより、５’オーバーハング又は３’オーバーハングを生成することと、ｂ）５’オーバーハング又は３’オーバーハングを固体支持体上の相補的な一本鎖核酸分子にハイブリダイズし、それにより、アダマーを固体支持体に固定化することとを含む方法によって、固体支持体に固定化することができる。前述の方法は、固体支持体上の相補的な一本鎖核酸分子にハイブリダイズされたアダマーをリガーゼと接触させ、それにより、アダマーと固体支持体上の相補的な一本鎖核酸分子をライゲートすることを更に含むことができる。
【0098】
アダマーがＭＣＳ配列を含むいくつかの態様では、アダマーは、ａ）アダマーを少なくとも１つの対応する制限エンドヌクレアーゼと接触させてＭＣＳ配列を切断し、それにより、平滑末端を生成することと、ｂ）アダマーの平滑末端を固体支持体上に位置する核酸分子にライゲートし、それにより、アダマーを固体支持体に固定化することとを含む方法によって、固体支持体に固定化することができる。
【0099】
いくつかの態様では、固体支持体に結合したアダマーは、本明細書で「結合スタッド」と称することができる。
【0100】
本開示の核酸合成法の概略図が図８に示される。
【0101】
本方法の第１のステップでは、固体支持体（図８ではビーズ又は表面として示されている）上に固定化されたアダマーが提供される。このアダマーは、本明細書で「結合スタッド」と称され、上述の方法のうちのいずれかを使用して一方の末端が固体支持体に接続されており、他方の末端がヘアピンでキャップされている。結合スタッドは、ＭＣＳ配列も含む。本方法の次のステップでは、結合スタッドが、ＭＣＳ配列を切断する制限エンドヌクレアーゼと接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑端部が生成される。本方法の次のステップでは、ＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（図８では「Ｌ１」として示されている）、第１のＮ－ｍｅｒ配列（図８では「ペイロード番号１」として示されている）、及び第２のＩＩＳＲＥ配列（図８では「Ｒ１」として示されている）を含む第１のアダマーが、ＭＣＳ配列を切断する制限エンドヌクレアーゼと接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端が生成される。
【0102】
本方法の次のステップでは、切断された第１のアダマーは、切断された結合スタッドと、切断されたアダマーと、リガーゼ酵素とを接触させることによって、切断された結合スタッドにライゲートされ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列、ペイロード番号１配列、及び第２のＩＩＳＲＥ配列を含む第１のライゲーション生成産物が生成される（図８の左側を参照されたい）。その後、第１のライゲーション産物がエクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない結合スタッド及び／又は第１のアダマーが除去される。
【0103】
その後、上述のステップが、固体支持体上に固定化された別のアダマーと、ＭＣＳ配列、第３のＩＩＳＲＥ配列（図８では「Ｒ２」として示されている）、第２のＮ－ｍｅｒ配列（図８では「ペイロード番号２」として示されている）、及び第４のＩＩＳＲＥ配列（図８では「Ｌ２」として示されている）を含む第２のアダマーとを用いて繰り返されて、固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第３のＩＩＳＲＥ配列、ペイロード番号２配列、及び第４のＩＩＳＲＥ配列を含む第２のライゲーション産物が生成される（図８の右側を参照されたい）。
【0104】
本方法の次のステップでは、第１のライゲーション産物が、第２のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を切断するＩＩＳＲＥ（「図８ではＲ１酵素」として示されている）と接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端が生成され、それにより、ａ）固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）、ペイロード番号１配列、及び３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を含む第１の切断された産物と、ｂ）第２のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を含む第２の切断された産物とが作製される。その後、第２の切断された産物が洗浄によって廃棄される。
【0105】
本方法の次のステップでは、第２のライゲーション産物が、第４のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）を切断するＩＩＳＲＥ（図８では「Ｌ２酵素」として示されている）と接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端が生成され、それにより、ａ）溶液中に放出され、かつ一方の末端にヘアピン、第３のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）、ペイロード番号２配列、及び３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を含む第３の切断された産物と、ｂ）固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列及び第４のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）を含む第４の切断された産物とが作製される。
【0106】
次のステップでは、第１の切断された産物と第３の切断された産物が、第１の切断された産物と、第３の切断された産物と、リガーゼ酵素とを接触させる（例えば、第３の切断された産物を含む溶液が固体表面に固定化された第１の切断された産物を含む溶液に移され、リガーゼ酵素が溶液に添加される）ことによって一緒にライゲートされ、それにより、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、ペイロード番号１配列、ペイロード番号２配列、及び第３のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含む第３のライゲーション産物が生成される。その後、このライゲーション反応がエクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第３の切断された産物が除去される。
【0107】
上述のステップは、標的核酸配列が合成されるまで繰り返すことができる。
【0108】
例示的な２７ヌクレオチド長の標的核酸配列の合成の概略図が図９Ａ～９Ｈに示される。合成される配列は、図９Ａの上部に示されている。配列は、標的核酸配列を合成するために一緒にライゲートされるアダマーに組み込まれる３個のヌクレオチド又は４個のヌクレオチドのいずれかと重複する１１個の６－ｍｅｒ断片に細分される。図９Ｂは、６－ｍｅｒ断片を含むアダマーがライゲートされて標的核酸配列を効率的に合成する順序をマッピングする例示的な標的核酸配列のアセンブリツリーを示す。アセンブリ及び奇数対偶数のオーバーハングの配置に矛盾するいくつかの異なる方法が存在するが、このアセンブリ順序は、ＩＩＳＲＥ酵素部位と生成される配列の適合性によって決定されるべきである。図９Ｂでは、番号付けされた６－ｍｅｒ（１）～（１１）は、図９Ｃ～９Ｈの番号付けされた６－ｍｅｒに対応する。ツリーの各々のノードにおける数は、アセンブリの各々のステップにおけるペイロード長に対応する。「４」及び「３」は、使用されるオーバーハングの長さを示す。結果として得られるペイロード配列の長さは、長さ＝ａ＋ｂ－ｎであり、式中、「ａ」及び「ｂ」は入力ペイロードの長さであり、「ｎ」はオーバーハングの長さである。
【0109】
標的核酸配列の合成の第１のステップが図９Ｃに示されており、ＧＡＣの３－ｍｅｒ配列を含むアダマー及びＡＴＣの３－ｍｅｒ配列を含むアダマーのロードによりＧＡＣＡＴＧ ６－ｍｅｒを含むアダマーが形成されることを示しており、これは、図９Ｂでは６－ｍｅｒ番号１である。ＧＡＣＡＴＧ六量体を生成するために、ＭＣＳ配列を含む第１の結合スタッドと、ＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（図９Ｃでは「Ｌ１」として示されている）、配列ＧＡＣを含む３－ｍｅｒ配列、及び第２のＩＩＳＲＥ配列（図９Ｃでは「Ｒ１」として示されている）を含む第１のアダマーとが１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触してＭＣＳ配列を切断し、それにより、相補的なオーバーハングが生成される。その後、これらの相補的なオーバーハングがハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた複合体をリガーゼ酵素と接触させることによってアダマーと結合スタッドが一緒にライゲートされて、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、３－ｍｅｒ配列ＧＡＣ及び第２のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を含むライゲーション産物番号１が得られる。同じプロセスを、ＭＣＳ配列を含む第２の結合スタッドと、ＭＣＳ配列、第３のＩＩＳＲＥ配列（図９Ｃでは「Ｌ２」として示されている）、配列ＡＴＧを含む３－ｍｅｒ配列決定、及び第４のＩＩＳＲＥ配列（図９Ｃでは「Ｒ２」として示されている）を含む第２のアダマーを用いて繰り返して、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第３のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）、３－ｍｅｒ配列ＡＴＧ、及び第４のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含むライゲーション産物番号２を得ることができる。次に、ライゲーション産物番号１が、第２のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を切断するＩＩＳＲＥ（図９Ｃでは「Ｒ１酵素」として示されている）と接触し、それにより、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、及び３－ｍｅｒ配列ＧＡＣ、続いて平滑末端を含む切断された産物番号１が生成される。同様に、ライゲーション産物番号２は、第３のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）を切断するＩＩＳＲＥ（図９Ｃでは「Ｌ２酵素」として示されている）と接触し、それにより、溶液中に放出され、かつ平滑末端、３－ｍｅｒ配列ＡＴＧ、及び第４のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含む切断された産物番号２が生成される。その後、切断された産物番号１と切断された産物番号２がリガーゼ酵素を使用して一緒にライゲートされて、固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、６－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧ、及び第４のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含むライゲーション産物番号３が得られる。これらの産物は、任意選択で、エクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない切断された産物番号１及び／又は切断された産物番号２を除去することができる。本段落に記載のステップを、異なる３－ｍｅｒ配列を含む追加のアダマーを用いて繰り返して、図９Ｂに示される６－ｍｅｒ配列番号２～１１を含むアダマーを生成することができる。
【0110】
本方法は図９Ｄに続き、６－ｍｅｒ配列番号１を含むアダマーと６－ｍｅｒ配列番号２を含むアダマーのライゲーションを示している（図９Ｂを参照されたい）。アダマー番号１は、固体表面に固定化されており、ＭＣＳ配列、図９Ｃの第１のＩＩＳＲＥ部位（Ｌ１）、６－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧ（図９Ｂの６－ｍｅｒ配列番号１）、及び図９Ｃの第４のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含む。アダマー番号２は、固体表面に固定化されており、ＭＣＳ配列、第５のＩＩＳＲＥ部位（図９Ｄでは「Ｌ３」）、６－ｍｅｒ配列ＡＴＧＡＧＧ（図９Ｂの６－ｍｅｒ配列番号２）、及び第６のＩＩＳＲＥ部位（図９Ｄでは「Ｒ３」として示されている）を含む。アダマー番号１が第４のＩＩＳＲＥ部位（Ｒ２）を切断するＩＩＳＲＥと接触して、Ｎ－ｍｅｒ配列に一本鎖オーバーハングが生成され、それにより、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、及び一本鎖オーバーハングを有するＮ－ｍｅｒ配列を含む切断された産物番号３が生成される。アダマー番号２が第５のＩＩＳＲＥ部位（Ｌ３）を切断するＩＩＳＲＥと接触して、Ｎ－ｍｅｒ配列に一本鎖オーバーハングが生成され、それにより、溶液中に放出され、かつ一本鎖オーバーハングを有するＮ－ｍｅｒ配列及び第６のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ３）を含む切断された産物番号４が生成される。その後、切断された産物番号３と切断された産物番号４がリガーゼ酵素を使用して一緒にライゲートされて、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第１のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、Ｎ－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧＡＧＧ（合成される標的核酸配列中の最初の９個のヌクレオチド）、及び第６のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ３）を含むライゲーション産物番号４が得られる。ライゲーション産物番号４は、任意選択で、エクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない切断された産物番号１及び／又は切断された産物番号２を除去することができる。
【0111】
本方法は図９Ｅに続き、ここで、ライゲーション産物番号４及び６－ｍｅｒ配列番号３（図９Ｂを参照されたい）を含むアダマーが対応するＩＩＳＲＥで処理されて、切断された産物が生成され、その後、これらが一緒にライゲートされて、固体表面に固定化されており、かつ合成される標的核酸配列の最初の１１個のヌクレオチドであるＮ－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴ（配列番号７５）を含むアダマーが生成される。
【0112】
２７ヌクレオチド長の標的核酸配列に対応するＮ－ｍｅｒ配列を含むアダマーが合成されるまで、連続ＩＩＳＲＥ消化及びライゲーションが図９Ｂに示されるアセンブリマップに従って図９Ｆ～９Ｈで繰り返される。最終ステップでは、最終合成アダマーを、２７ヌクレオチド長の標的核酸配列に隣接するＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥで処理することによって、２７ヌクレオチド長の標的核酸配列を最終合成アダマーから切除することができる。
【0113】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ａ）～（ｆ）を繰り返すことと。
【0114】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｃ）～（ｆ）を繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。
【0115】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、１つ以上の追加のアダマーを用いてステップ（ａ）～（ｆ）を繰り返すことと。
【0116】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、１つ以上の追加のアダマーを用いてステップ（ｃ）～（ｆ）を繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。
【0117】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び１つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ａ）～（ｆ）を繰り返すことと。
【0118】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び１つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ｃ）～（ｆ）を繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。
【0119】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び／又は１つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ａ）～（ｆ）の任意の組み合わせを繰り返すことと。
【0120】
前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第１のアダマーを提供することであって、第１のアダマーが、第１のＩＩＳＲＥ配列、続いて第１のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第２のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第２のアダマーを提供することであって、第２のアダマーが、第３のＩＩＳＲＥ配列、続いて第２のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第４のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第１のアダマーを、第１のアダマー内に位置する第２のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第１のＩＩＳＲＥ配列と、第１のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第１の切断された産物を生成することと、ｄ）第２のアダマーを、第２のアダマー内に位置する第３のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第２のＮ－ｍｅｒ配列と、第４のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも１つとを含む第２の切断された産物を生成することであって、第２の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第１の切断された産物と第２の切断された産物をライゲートして、第１のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第２の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び／又は１つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ｃ）～（ｆ）の任意の組み合わせを繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。
【0121】
本開示の方法のいくつかの態様では、リガーゼ酵素は、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ｈＬｉｇ３）とすることができる。当業者に理解されるであろうように、ｈＬｉｇ３は、高い平滑末端ライゲーション効率（６０％超）を呈する。本開示の方法のいくつかの態様では、リガーゼ酵素は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとすることができる。当業者に理解されるであろうように、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、２、３、又は４ヌクレオチド長の３’オーバーハング又は５’オーバーハングを含む核酸断片の高いライゲーション効率（８０％超）を呈する。リガーゼ酵素は、当該技術分野で既知の任意のリガーゼ酵素とすることができる。
【0122】
本開示の方法のいくつかの態様では、エクソヌクレアーゼは、Ｔ７エクソヌクレアーゼとすることができる。
【0123】
本開示の方法のいくつかの態様では、合成された標的核酸配列は、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の純度を有する。
【0124】
いくつかの態様では、合成された標的核酸配列の純度は、正しい／所望のライゲーション産物に対応する、単回のライゲーション反応又は複数回のライゲーション反応の一部として形成された総ライゲーション産物のパーセンテージを指す。理論に束縛されることを望むものではないが、核酸分子のライゲーションを含む本開示の方法は、複数のライゲーション産物を生成することができ、それらのうちのいくつかは正しい／所望のライゲーション産物に対応し、それらのうちのいくつかは望ましくないもの（副反応、誤ったライゲーションなど）である。ライゲーション産物又は合成される標的分子の純度は、正しい／所望のライゲーション産物に対応する、形成された総ライゲーション産物のパーセンテージに対応するパーセンテージとして表すことができる。
【0125】
実施例１－アダマーベースの合成
以下は、標的核酸分子を合成するために使用される本開示のアダマーベースの合成法の非限定的な例である。この実施例では、一連の制限酵素消化及びその後のライゲーションを図１０に概説するように行った。ライゲーション反応の各々の産物を、ゲル電気泳動を使用して分析した。この分析の結果を図１１に示す。図１１に示す結果は、本開示のアダマーを使用した反復制限酵素消化及びその後のライゲーション反応を含む本開示の方法が核酸分子を効率的に合成することができることを示す。
以下は、標的核酸分子を合成するために使用される本開示のアダマーベースの合成法の非限定的な例である。この実施例では、一連の制限酵素消化及びその後のライゲーションを図１０に概説するように行った。ライゲーション反応の各々の産物を、ゲル電気泳動を使用して分析した。この分析の結果を図１１に示す。図１１に示す結果は、本開示のアダマーを使用した反復制限酵素消化及びその後のライゲーション反応を含む本開示の方法が核酸分子を効率的に合成することができることを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】