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特表2024-518192ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞系統、そのスクリーニング、その同定およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-26
(54)【発明の名称】ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞系統、そのスクリーニング、その同定およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/07 20100101AFI20240419BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240419BHJP
【ＦＩ】
C12N5/07 ZNA
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571499
(86)(22)【出願日】2022-12-23
(85)【翻訳文提出日】2023-11-17
(86)【国際出願番号】 CN2022141358
(87)【国際公開番号】W WO2023165231
(87)【国際公開日】2023-09-07
(31)【優先権主張番号】202210194024.X
(32)【優先日】2022-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521288091
【氏名又は名称】成都威斯克生物医▲薬▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】沈国波
(72)【発明者】
【氏名】魏霞蔚
(72)【発明者】
【氏名】魏于全
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼莉
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA45
(57)【要約】
本発明は、遺伝子工学及び細胞工学の技術分野に属し、特に、ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞系統、そのスクリーニング、同定及び使用に関する。本発明によれば、ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞系統ＷＳＫ－Ｓｆ９はスクリーニング及び同定により得られ、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ ２０２２４６の下に寄託される。細胞系統は、ネステッドＰＣＲ、トランスクリプトーム次世代シークエンシング、蛍光ベースの定量的ＰＣＲ及びプローブベースの定量的ＰＣＲ等の様々な異なる高感度アッセイ法で検証され、スクリーニングにより最終的に得られる。細胞は、薬局方の要件に従って無菌、マイコプラズマ、外因性ウイルス、腫瘍形成性等について試験され、結果は、細胞が全試験で要件を満たすことを示す。細胞は、バキュロウイルス発現系に基づいて組換えタンパク質を生産でき、組換えタンパク質ワクチンの生産に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＣＴＣＣ受託番号Ｃ２０２２４６を有するラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９。
【請求項2】
バキュロウイルス発現系に基づく組換えタンパク質の生産における、請求項１に記載の細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の適用。
【請求項3】
前記バキュロウイルス発現系に基づく組換えタンパク質医薬品またはワクチンの生産の適用を含む、請求項２に記載の適用。
【請求項4】
前記組換えタンパク質医薬品が、サイトカイン、ホルモン、組換え酵素または抗体を含む、請求項３に記載の適用。
【請求項5】
前記サイトカインが、組換えヒトインターロイキン、組換えヒト上皮成長因子、組換えヒトインターフェロン、組換えヒト線維芽細胞成長因子、組換えヒトエリスロポエチンまたは組換えヒト顆粒球マクロファージ刺激因子を含む、請求項４に記載の適用。
【請求項6】
前記ホルモンが、組換えヒト成長ホルモン、組換えヒトインスリン、インスリン類似体または組換えヒト卵胞成熟ホルモンを含む、請求項４に記載の適用。
【請求項7】
前記組換え酵素が、組換えヒトα－グルコシダーゼまたは組換えヒトプロウロキナーゼを含む、請求項４に記載の適用。
【請求項8】
前記抗体が、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体、ｓｃＦｖ抗体またはナノボディを含む、請求項４に記載の出願。
【請求項9】
前記ワクチンが、組換えタンパク質ワクチンまたはウイルス様粒子ワクチンを含む、請求項３に記載の適用。
【請求項10】
前記組換えタンパク質ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ワクチン、インフルエンザウイルスタンパク質ワクチン、合胞体ウイルス組換えタンパク質ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質ワクチン又は狂犬病ウイルスタンパク質ワクチン、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ワクチンを含む、請求項９に記載の適用。
【請求項11】
前記ウイルス様粒子ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子ワクチン、ヒトパピローマウイルス様粒子ワクチン、インフルエンザウイルス様粒子ワクチン、ポリオウイルス様粒子ワクチン、呼吸器合胞体ウイルス様粒子ワクチンまたは手足口病ウイルス様粒子ワクチン、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子ワクチンを含む、請求項９に記載の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子工学および細胞工学の技術分野に関し、新規のスポドプテラ・フルギペルダ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞株に関し、特に、ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ならびにそのスクリーニング、同定および適用に関する。
【背景技術】
【0002】
昆虫細胞発現系は、組換えタンパク質の生産に広く使用されており、他の発現系と比較して多くの利点を有する。例えば、昆虫バキュロウイルスは無脊椎動物にのみ寄生するため、発現系は安全性が高く、組換えタンパク質の発現量が高く、翻訳後の組換えタンパク質を正しく折り畳んで修飾して生物活性を有するタンパク質を得ることができ、昆虫細胞発現系はウイルス様粒子などの多遺伝子発現の複雑な設計に適合し、大規模無血清培養などに適用することができる。
【0003】
現在、昆虫細胞発現系によって生産された複数の組換えタンパク質ワクチンは、良好な効果および安全性を示しており、ＧＳＫによって生産されたＣｅｒｖａｒｉｘ子宮頸がんワクチン、Ｄｅｎｄｒｅｏｎによって生産されたＰｒｏｖｅｎｇｅ前立腺がんワクチン、およびＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅｓによって生産されたＦｌｕＢｌｏｋインフルエンザワクチンを含むリストについて世界中で承認されている。さらに、前臨床実験段階の多くの組換えタンパク質ワクチンもまた、適用について良好な見通しを示している。
【0004】
Ｓｆ９細胞（スポドプテラ・フルギペルダ細胞）は、抗体、ワクチンおよび組換えタンパク質を含む外来タンパク質を発現および生産するために昆虫バキュロウイルス発現系において最も一般的に使用される昆虫細胞である。Ｓｆ９細胞は、１９７７年に単離培養されたオータムフライワーム（スポドプテラ・フルギペルダ）蛹の卵巣組織に由来するＩＰＬＢＳＦ－２１細胞株（Ｓｆ２１とも呼ばれる）に由来する。Ｓｆ－ラブドウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞株Ｓｆ９およびその親細胞株Ｓｆ２１において２０１４年にＦＤＡ研究者によって発見された新しいマイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧおよびＬの構造タンパク質の遺伝子情報を含む。さらに、ＧとＬとの間の未知の機能を有する余分な遺伝子配列Ｘを試験した。Ｓｆ－ラブドウイルスは、宿主細胞のゲノムに組み込まれていないが、完全なゲノムを有し、完全なウイルス粒子にパッケージングされ得、これは、Ｓｆ９細胞のバキュロウイルス発現系に基づいて得られるワクチンなどの組換えタンパク質の生産および使用に対する潜在的なリスクを有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明によれば、スクリーニングおよび同定を経てラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９（ＷＳＫ－Ｓｆ９と略す）が得られ、この細胞株は、バキュロウイルス発現系に基づく組換えタンパク質および組換えタンパク質ワクチンの生産に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の目的は、ＣＣＴＣＣ受託番号Ｃ２０２２４６を有するラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９を提供することである。２０２２年２月１６日にスポドプテラ・フルギペルダＳｆ９由来細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の名称で細胞株を収集した。コレクションセンターは、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）であり、その住所は、郵便番号４３００７２、Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｏ．２９９ Ｂａｙｉ Ｒｏａｄ，Ｗｕｃｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｗｕｈａｎ Ｃｉｔｙ，Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅである。
【0007】
本発明のラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９は、限定希釈法を用いてモノクローナル細胞をスクリーニングし、ネステッドＰＣＲ、トランスクリプトーム次世代シークエンシング、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ、ＴａｑｍａｎプローブベースのリアルタイムＰＣＲなどの種々の高感度試験法で検証した後、ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９を得ることを特徴とする。細胞は、薬局方の要件に従って無菌性、マイコプラズマ、外因性ウイルスおよび腫瘍形成性について試験され、結果は、すべての指標が要件を満たし、細胞を生産のための細胞マトリックスとして使用することができることを示す。
【0008】
本発明の別の目的は、バキュロウイルス発現系に基づく組換えタンパク質の生産におけるラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の適用を提供することである。
【0009】
当該適用は、バキュロウイルス発現系に基づく組換えタンパク質医薬品またはワクチンの生産の適用を含む。
【0010】
組換えタンパク質医薬品は、サイトカイン、ホルモン、組換え酵素又は抗体を含む。
【0011】
サイトカインは、組換えヒトインターロイキン、組換えヒト上皮成長因子、組換えヒトインターフェロン、組換えヒト線維芽細胞成長因子、組換えヒトエリスロポエチンまたは組換えヒト顆粒球マクロファージ刺激因子を含む。
【0012】
ホルモンは、組換えヒト成長ホルモン、組換えヒトインスリン、インスリン類似体または組換えヒト卵胞成熟ホルモンを含む。
【0013】
組換え酵素は、組換えヒトα－グルコシダーゼまたは組換えヒトプロウロキナーゼを含む。
【0014】
抗体は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体、ｓｃＦｖ抗体またはナノボディを含む。
【0015】
ワクチンは、組換えタンパク質ワクチンまたはウイルス様粒子ワクチンを含む。
【0016】
組換えタンパク質ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ワクチン、インフルエンザウイルスタンパク質ワクチン、合胞体ウイルス組換えタンパク質ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質ワクチン又は狂犬病ウイルスタンパク質ワクチン、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ワクチンを含む。
【0017】
ウイルス様粒子ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子ワクチン（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＶＬＰ）、ヒトパピローマウイルス様粒子ワクチン（ＨＰＶ－ＶＬＰ）、インフルエンザウイルス様粒子ワクチン（ＨＡ－ＶＬＰ）、ポリオウイルス様粒子ワクチン（ＰＶ－ＶＬＰ）、呼吸器合胞体ウイルス様粒子ワクチン（ＲＳＶ－ＶＬＰ）または手足口病ウイルス様粒子ワクチン（ＥＶ７１－ＶＬＰ）を含む。好ましくは、ウイルス様粒子ワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子ワクチンである。
【0018】
バキュロウイルス発現系に基づく組換えタンパク質またはワクチンの生産におけるＷＳＫ－Ｓｆ９の適用を実現するための技術的解決策は以下の通りである。Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ昆虫バキュロウイルス発現系を用いて、バキュロウイルスをパッケージングおよび生産し、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞に感染させて標的タンパク質を発現させ、アフィニティー精製技術により標的組換えタンパク質を得る。
【発明の効果】
【0019】
本発明の有益な効果は、以下の通りである。限定希釈法を用いてモノクローナル細胞をスクリーニングし、ネステッドＰＣＲ、トランスクリプトーム次世代シークエンシング、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ、ＴａｑｍａｎプローブベースのリアルタイムＰＣＲなどの種々の高感度試験法で検証した後、ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９を得る。細胞は、薬局方の要件に従って無菌性、マイコプラズマ、外因性ウイルスおよび腫瘍形成性について試験され、結果は、すべての指標が要件を満たし、細胞を、臨床使用のためのタンパク質ワクチンなどの組換えタンパク質産物の生産のために使用することができることを示す。加えて、本発明によれば、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ昆虫バキュロウイルス発現系を用いて、バキュロウイルスをパッケージングおよび生産し、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞に感染させて標的タンパク質を発現させ、アフィニティー精製技術または他の技術的方法により標的組換えタンパク質を得る。
【0020】
本発明によれば、スクリーニングおよび同定によって得られたラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９は、ＣＣＴＣＣ受託番号Ｃ２０２２４６を有する。２０２２年２月１６日に細胞株を収集した。コレクションセンターは、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）であり、その住所は、郵便番号４３００７２、Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｏ．２９９ Ｂａｙｉ Ｒｏａｄ，Ｗｕｃｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｗｕｈａｎ Ｃｉｔｙ，Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅである。収集された培養物の名称および識別特性はスポドプテラ・フルギペルダＳｆ９由来細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９である。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】本発明によるＷＳＫ－Ｓｆ９細胞の同定のためのネステッドＰＣＲアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図2】本発明によるスクリーニングによって得られたラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の形態学的特徴を示す図である。
【図3】本発明によるスクリーニングによって得られたラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の核型分析を示す図である。
【図4】本発明によるスクリーニングによって得られたラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の増殖曲線を示す図である。
【図5】本発明によるスクリーニングによって得られたラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の連続継代曲線を示す。
【図6】本発明によるスクリーニングによって得られたラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９によって発現された外因性組換えタンパク質の時間勾配試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下では、特定の実施形態を参照して本発明の解決策を説明する。当業者は、以下の実施形態が本発明を例示することのみを意図しており、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解するであろう。特定の技術または条件が実施形態で指定されていない場合、当該技術分野の文献または製品仕様書に記載されている技術または条件が優先するものとする。使用される試薬または機器に製造業者が示されていない場合、それらはすべて、市販の試薬会社から購入することができる従来の製品である。
【0023】
ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９のスクリーニング、同定および適用を以下の実施形態でさらに例示し、本発明を添付の図面を参照してさらに説明する。
【実施例】
【0024】
実施形態１：Ｓｆ－ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９のスクリーニングおよび同定
【0025】
唯一市販されているＳｆ－ラブドウイルス陰性Ｓｆ－ＲＶＮ細胞（Ｓｆ－ラブドウイルス陰性Ｓｆ９）は、Ｊａｒｖｉｓ教授のチームによって、抗ウイルス薬治療（Ｍａｇｈｏｄｉａ ＡＢら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２０１６；１２２：４５－５５．）と組み合わせた限定希釈法によってＳｆ９からスクリーニングされ、Ｌ遺伝子のネステッドＰＣＲによってＳｆ－ラブドウイルス陰性であることが確認され、細胞は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．と提携してＭｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａに販売を委託したＧｌｙｃｏＢａｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｂａｃ．ｃｏｍ／ｓｆ－ｒｖｎ－ｃｅｌｌｓ）に帰属される。
【0026】
非特許文献「Ｍａ Ｈ、Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ Ｓ、Ｂａｅ ＥＨ、Ｃｈｉｎ ＰＪ、Ｋｈａｎ ＡＳ、ｔｈｅ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｓ ａ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ Ｘ－ｇｅｎｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１９；５３６：１２５－３３」によると、スポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞株は、二種類の細胞集団：Ｓｆ－ラブドウイルス感染細胞およびＳｆ－ラブドウイルス陰性細胞を含む異種細胞集団である。単一のＳｆ－ラブドウイルス陰性細胞集団は、限定希釈法によって得ることができる。本発明によれば、限定希釈法によってモノクローナル細胞を選択し、次いで、ネステッドＰＣＲ、トランスクリプトーム次世代シークエンシング、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲおよびＴａｑｍａｎプローブベースのリアルタイムＰＣＲなどの方法によって、Ｓｆ－ラブドウイルス陰性細胞をスクリーニングおよび同定する。
【0027】
１）Ｓｆ９の親細胞株をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ（ロット番号：２０４３３３１）から購入し、購入した細胞を継代０（Ｐ０）と定義した。このスクリーニング実験で用いた継代は継代４（Ｐ４）であり、細胞培養培地はＳＩＭ ＳＦ無血清培地（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、ＭＳＦ１）であった。懸濁したＳｆ９細胞を１０倍勾配で希釈し、ウェルプレートに播種し、数日ごとに細胞を観察した。別個のモノクローナル細胞が目立つようになったとき、それらを増殖のために新しいウェルプレートに移した。その後、適当な細胞を収集し、全ＲＮＡを抽出し、Ｓｆ－ラブドウイルス特異的Ｍ遺伝子に対するネステッドＰＣＲプライマー（表１）により候補細胞を予備同定した。
【0028】
【表1】
【0029】
２）候補のＳｆ－ラブドウイルス陰性細胞を連続的に継代培養し、細胞試料を収集し、その後の使用のために－８０℃で凍結した。連続培養の４５継代後、ネステッドＰＣＲ技術を用いて細胞試料を検出したところ、結果は、ＷＳＫ－Ｓｆ９のＰ１－Ｐ４５中のＳｆ－ラブドウイルスＭ遺伝子が一貫して陰性であることを示した（図１）。
【0030】
３）トランスクリプトーム次世代シーケンシング：次世代シーケンシングのために５×１０６個の親Ｓｆ９細胞および５×１０６個のＷＳＫ－Ｓｆ９細胞を別々に収集したところ、結果は、Ｓｆ－ラブドウイルスのＲＮＡ遺伝子情報が親Ｓｆ９細胞（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ ９４７０７８．１）のトランスクリプトームで検出されたが、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞では検出されないことを示した。
【0031】
４）リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ：Ｓｆ－ラブドウイルスＭ遺伝子用の２対の定量ＰＣＲプライマーを設計し（表２）、蛍光定量ＰＣＲ試験にＢｉｏ－Ｒａｄ ＳｓｏＦａｓｔＥｖａＧｒｅｅｎｓｕｐｅｒｍｉｘキットを用いたところ、結果は、ＷＳＫ－Ｓｆ９ Ｐ３世代およびＰ２８世代では蛍光シグナルが検出されないことを示し、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞がＳｆ－ラブドウイルス陰性であることを証明した（表３）。
【0032】
【表2】
【0033】
【表3】
【0034】
５）プローブ法による定量的ＰＣＲ：Ｓｆ－ラブドウイルスＭ遺伝子のためのｔａｑＭａｎプローブを設計したところ（表４）、定量的ＰＣＲの結果は、ＷＳＫ－Ｓｆ９のメインセルバンク（ＭＣＢ）およびワーキングセルバンク（ＷＣＢ）で蛍光シグナルが試験されないことを示し、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞がＳｆ－ラブドウイルス陰性であることを証明した（表５）。
【0035】
【表4】
【0036】
【表5】
【0037】
実施形態２：Ｓｆ－ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の増殖特性
【0038】
１）ＷＳＫ－Ｓｆ９の培養特性：細胞は、２７℃の無血清培地中で、接着または懸濁の方法で増殖することができ、懸濁増殖の平均直径は１６．２８±０．３４μｍであり、ＷＳＫ－Ｓｆ９の形態学的特性は図２に示されている。
【0039】
２）ＷＳＫ－Ｓｆ９の核型分析：親Ｓｆ９細胞について核型分析を行ったところ、結果は、６０個の中期細胞のうち、染色体の数が主に１８０～２５０本の間に分布し、細胞あたり平均２１５本の染色体であったことを示した。一方、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞についても核型分析を行ったところ、結果は、６０個の中期細胞のうち、染色体の数が主に１９１～５３８本の間に分布し、細胞あたり平均２９９本の染色体であったことを示した（図３）。これはまた、Ｓｆ－ラブドウイルス陰性細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９がその親Ｓｆ９細胞とは異なることを意味する。
【0040】
３）ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞増殖曲線：対数増殖期のＷＳＫ－Ｓｆ９細胞を約１×１０６細胞／ｍｌに希釈し、２５０ｍｌの通気振盪フラスコに継代した。培養容量は１００ｍｌとし、フラスコを２７℃の恒温振盪器に入れて連続培養した。細胞密度および生存率を２４時間毎に計数した。３つの異なるバッチの培養後、増殖曲線および生存率を図４に示す。細胞密度は９６時間後に約１×１０７細胞／ｍｌに達し、６日間このレベルのままであった。最高細胞密度は１．２×１０７細胞／ｍｌに近づき、１１日目から細胞生存率は徐々に低下し、平均倍加時間は２３時間前後であった。
【0041】
４）ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞の連続継代曲線：対数増殖期のＷＳＫ－Ｓｆ９細胞を約１×１０６細胞／ｍｌに希釈し、２５０ｍｌの通気振盪フラスコに継代した。培養容量は１００ｍｌとし、フラスコを２７℃の恒温振盪器に入れて連続培養した。細胞密度および生存率を３日ごとに計数し、継代を行った。概して、３日間の培養後、細胞密度は６～８×１０６細胞／ｍｌに達することができ、生存率は９８％を超えた。連続継代増殖曲線および生存率を図５に示す。１００回の連続継代後、細胞増殖特性は安定したままであった。
【0042】
実施形態３：Ｓｆ－ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９の安全性試験
【0043】
以下の試験を、中国薬局方のパートＩＩＩ（２０２０年版）に従ってＷＳＫ－Ｓｆ９細胞で行った。
【0044】
１）種の同定：ＤＮＡバーコーディング法を用いてＷＳＫ－Ｓｆ９細胞を検出したところ、結果は、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞がスポドプテラ・フルギペルダ由来であることを示した。
【0045】
２）無菌試験：膜ろ過法を採用して無菌試験を行ったところ、結果は、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞の増殖が無菌であることを示した。
【0046】
３）マイコバクテリウム試験：培養法を採用してマイコバクテリウムを試験したところ、結果は、マイコバクテリウムが陰性であることを示した。
【0047】
４）マイコプラズマ試験：培養法、指標細胞培養法、タッチダウンＰＣＲ法を採用してマイコプラズマを試験したところ、結果は、マイコプラズマが陰性であることを示した。
【0048】
５）スピロプラズマ試験：蛍光ＰＣＲ法を採用してスピロプラズマを試験したところ、結果は、スピロプラズマが陰性であることを示した。
【0049】
６）外因性ウイルス試験：（１）インビトロ細胞観察法、赤血球吸着試験および赤血球凝集阻害試験を採用して、サル由来Ｖｅｒｏ細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、Ｓｆ９細胞、ＢＨＫ－２１細胞、蚊由来細胞Ａｅｄｅｓおよびショウジョウバエ由来細胞Ｄ．Ｍｅｌの異なる細胞の継代培養を試験したところ、すべての細胞が正常な形態を示し、試験した細胞は陰性であった。
【0050】
（２）哺乳マウス、成体マウスおよびニワトリ胚（５～６日齢のニワトリ胚および９～１１日齢のニワトリ胚）にインビボ法によって接種したところ、結果は、それらがすべて要件を満たすことを示した。
【0051】
７）レトロウイルス試験：透過型電子顕微鏡、ＨＥＫ２９３細胞接種継代感染試験及び化学試薬誘発ウイルス試験により、ウイルス様粒子は認められず、結果は、これらがいずれも要件を満たすことを示した。
【0052】
８）ウシ由来ウイルス試験およびブタ由来ウイルス試験の細胞は陰性であった。
【0053】
９）バキュロウイルス、Ｔ．ｎｉフロックハウスウイルス変異体（ＦＨＶｖａｒ）、ラブドウイルス、レオウイルス科、トガウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス、アスファウイルス、アスコウイルス科、イリドウイルス科、ポックスウイルス科、バキュロウイルス科、ポリダウイルス科（Ｐｏｌｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科、ビルナウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌｓｅｓ）、ジシストロウイルス科（Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｔｉｄａｅ）、ノダウイルス科およびテトラウイルス科を含む他の特定のウイルスを試験したところ、結果は、いずれも陰性であり、要件を満たすことを示した。
【0054】
１０）腫瘍形成性試験：実験マウスにＷＳＫ－Ｓｆ９細胞を接種したところ、結果は、細胞が腫瘍形成性ではなく、要件を満たすことができることを示した。
【0055】
結論として、Ｓｆ－ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９は、すべての安全性試験の要件および生物製剤の生産のための細胞マトリックスの要件を満たす。
【0056】
実施形態４：Ｓｆ－ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９によって発現される外因性組換えタンパク質
【0057】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ構造ドメインを含むバキュロウイルス発現ベクターを構築し、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞を用いて組換えタンパク質発現バキュロウイルスをパッケージングした。Ｓｆ９およびＷＳＫ－Ｓｆ９細胞を別々に培養し、密度が２．５×１０６／ｍｌに達したとき、ＭＯＩ＝０．５の比でウイルスを別々に感染させた。
【0058】
感染前（０時間）および感染後（２４時間後、４８時間後、７２時間後、および９６時間後）に上清を収集し、これをＨｉｓタグに対する抗体を用いたウエスタンブロットによって検出したところ、結果は、ＷＳＫ－Ｓｆ９細胞における組換えタンパク質の発現レベルが、Ｓｆ９細胞のものと比較して上方制御されていることを示した。ＧＭＰワークショップでの生産および精製、ならびにその後のアジュバント製剤化後、組換えタンパク質を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を予防することができる。これは、Ｓｆ－ラブドウイルス陰性スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞株ＷＳＫ－Ｓｆ９を用いて、タンパク質ワクチンなどの外因性組換えタンパク質を発現および生産することができ、かつ発現レベルがＳｆ９細胞よりも高いことを実証する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】