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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-30
(54)【発明の名称】酸化還元感受性ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240422BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20240422BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/435 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571219
(86)(22)【出願日】2022-05-18
(85)【翻訳文提出日】2024-01-15
(86)【国際出願番号】 EP2022063473
(87)【国際公開番号】W WO2022243386
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】21174665.6
(32)【優先日】2021-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＮＯＮＩＤＥＴ
(71)【出願人】
【識別番号】520017801
【氏名又は名称】ウニベルズィテート ベルン
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ストッカー、アヒム
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA10
4H045BA50
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA20
(57)【要約】
本発明は、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とＣＲＡＬＢＰ同族リガンドとの複合体を含む組成物であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が、システインによるアミノ酸突然変異の１つまたは複数の対を含む野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、システインの対がジスルフィド結合を形成することができる、組成物、ならびに前記複合体および前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質に関する。さらに、本発明はさらに、前記組成物および複合体を調製する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複合体を含む、好ましくは複合体からなる組成物であって、前記複合体が、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；および
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド、を含む組成物。
【請求項2】
システインによるアミノ酸突然変異の各対の一方のシステインが、配列番号３のアミノ酸２０４～２２９に対応するアミノ酸残基内のアミノ酸の突然変異であり、前記対のシステインによる他方の突然変異アミノ酸が、配列番号３のアミノ酸２４４～２６１に対応するアミノ酸残基内のアミノ酸の突然変異である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ムテインが、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる１、２、３または４対のアミノ酸突然変異を含み、好ましくは、前記ムテインが、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる１または２対のアミノ酸突然変異を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによるアミノ酸突然変異の前記対が、（１）配列番号３のアミノ酸２１２に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に相当するアミノ酸の突然変異；
（２）配列番号３のアミノ酸２１７に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に相当するアミノ酸の突然変異；
（３）配列番号３のアミノ酸２２０に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に相当するアミノ酸の突然変異；
（４）配列番号３のアミノ酸２２４に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に相当するアミノ酸の突然変異、
から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記複合体が、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのモノマー複合体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記複合体が、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体が、少なくとも６００ｋＤａ、好ましくは少なくとも７２０ｋＤａの分子量、好ましくは最大２５００ｋＤａの分子量、さらに好ましくは最大２０００ｋＤａの分子量を有するか、または前記オリゴマー複合体が、約２４～３３ｎｍの平均直径を有し、好ましくは前記オリゴマー複合体が、約２５～３２ｎｍの平均直径を有し、前記平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記複合体が、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのモノマー複合体およびホモオリゴマー複合体を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質が、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質が配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインが、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる１対または２対または３対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異が、（ｉ）配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異；および
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異；
から選択され
前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記２対のアミノ酸突然変異が、
（ａ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるもの；
（ｂ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるもの；および
（ｃ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異であるもの、
から選択され、
前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記３対のアミノ酸突然変異が、
（ｘ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対、システインによるアミノ酸突然変異の第２の対、およびシステインによるアミノ酸突然変異の第３の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第３の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるものである、組成物。
【請求項11】
前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が、配列番号９および配列番号２１から選択されるアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質。
【請求項13】
ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質をコードする核酸配列であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、核酸配列。
【請求項14】
複合体を含む組成物を調製する方法であって、前記複合体が、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンド；を含み、
前記方法が、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；を含み、
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程を含む、方法。
【請求項15】
複合体を含む組成物であって、前記複合体が、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して少なくとも１対のシステインによるアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物が、好ましくは、請求項２～１１のいずれか一項に記載のように定義され；前記組成物が、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；を含む方法によって得られ、
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程を含む方法によって得られる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とＣＲＡＬＢＰ同族リガンドとの複合体を含む組成物であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が、システインによるアミノ酸突然変異の１つまたは複数の対を含む野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、システインの対がジスルフィド結合を形成することが可能な、組成物、ならびに前記複合体および前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質に関する。さらに、本発明はさらに、前記組成物および複合体を調製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞性網膜結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）は、１９７７年にＦｕｔｔｅｒｍａｎらによってウシ網膜の可溶性画分で発見され、レチナールのシス－トランス異性体に提示された場合に１１－シス－レチナールに対して最大の結合を示すことが示された（Ｆｕｔｔｅｒｍａｎ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２（１０）：３２６７－３２７１）。Ｃｒｏｕｃｈらによる研究では、ロドプシン、イソロドプシンおよびイソロドプシンＩＩの形成は、視覚色素アポタンパク質オプシンをそれぞれ１１－シス－、９－シス－および９，１３－ジ－シス－レチナールと組み合わせることによって実証された（Ｃｒｏｕｃｈ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９７５，ＰＮＡＳ．７２（４）：１５３８－１５４２）。まとめると、これらの知見は、ＣＲＡＬＢＰが眼における退色ロドプシンの再生に関与し得るという仮定への道を開いた（Ｃｒｏｕｃｈ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９７５，ＰＮＡＳ．７２（４）：１５３８－１５４２；Ｆｕｔｔｅｒｍａｎ Ｓ．＆Ｓａａｒｉ Ｊ．Ｃ．，１９７７，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１６（８）：７６８－７１；Ｃｒｏｕｃｈ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１７（１０）：１０２４－９）。ＣＲＡＬＢＰはウシ網膜から単離され、９－シス－レチナール（Ｋｄ＝５３ｎＭ）、１１－シス－レチナール（Ｋｄ＝２０ｎＭ）および１１－シス－レチノール（Ｋｄ＝６０ｎＭ）に対してナノモル親和性を有する高親和性結合剤として同定されたが、１３－シスまたは全トランス－レチナールのいずれにも結合しない。さらに、ＣＲＡＬＢＰおよびロドプシンの光異性化の一次速度定数の比を、両方とも１１－シス－レチナールとの複合体において、両方のタンパク質複合体の吸光係数の既知の値と共に使用して、ロドプシンと比較したＣＲＡＬＢＰにおける予想される４％の光異性化を推定した（Ｓａａｒｉ Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７（２２）：１３３２９－１３３３３；Ｓａａｒｉ ＪＣ．，＆Ｂｒｅｄｂｅｒｇ Ｄ．Ｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１６）：７６１８－２２）。１９８８年に、ウシおよびヒトＣＲＡＬＢＰのｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定が記載され（Ｃｒａｂｂ Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（３５）：１８６８８－１８６９２）、その後、ＣＲＡＬＢＰをコードする遺伝子の突然変異が同定され、網膜色素変性症、ニューファンドランド棒状錐体ジストロフィー、眼底白点症、およびＢｏｔｈｎｉａ網膜ジストロフィーを含むいくつかの網膜疾患に関連した（Ｍａｗ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１９８－２００；Ｇｏｌｏｖｌｅｖａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１４）：１２３９７－１２４０２；Ｂｕｒｓｔｅｄｔ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．４３：２５５９－２５７１；Ｓａａｒｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｃｒａｂｂ，Ｊ．２００５，Ｗ．Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．８１：２４５－２４６）。両方とも１１－シス－レチナールと複合体化した野生型ＣＲＡＬＢＰおよびそのＢｏｔｈｎｉａジストロフィー関連突然変異体Ｒ２３４ＷのＸ線構造解明がＨｅらによって報告されたが（Ｈｅ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，ＰＮＡＳ，１０６（４４）：１８５４５－１８５５０）、９－シス－レチナールと複合体化した野生型ＣＲＡＬＢＰのＸ線構造解明はＢｏｌｚｅらによって解明され、結合した９－シス－レチナールを９，１３－ジ－シス－レチナールに内部変換するその能力がさらに実証された（Ｂｏｌｚｅ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＪＡＣＳ，１３６（１）：１３７－１４６）。レチノイド視覚サイクル、すなわち全トランス－レチナールから１１－シス－レチナールへの眼の生化学的再生経路におけるＣＲＡＬＢＰの関与が報告された（Ｋｉｓｅｒ ＰＤ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１４：１９４－２３２；Ｋｉｓｅｒ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：４０９－４１５）。この経路では、ＣＲＡＬＢＰはＲＰＥ６５のイソメラーゼ活性を刺激し、ＲＤＨ５デヒドロゲナーゼへの１１－シス－レチノールの結合および細胞外の細胞質を介したＲＤＨ５からの１１－シス－レチナールのシャペロン移行を促進する。ＲＬＢＰ１－／－ノックアウトマウスを使用して、ＣＲＡＬＢＰが哺乳動物の網膜視覚サイクルおよび錐体視覚をどのように支援するかに関する研究は、ミュラー細胞ＣＲＡＬＢＰを網膜視覚サイクルの重要な構成要素として同定し、この経路が正常な錐体駆動視覚を維持し、錐体暗順応を加速するために重要であることを実証することが報告された（Ｘｕｅ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．，１２５（２）：７２７－７３８）。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、基礎となる野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる１つまたは複数の対のアミノ酸突然変異を有しており、システインの対がジスルフィド結合を形成することができる、新規な操作されたＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を記載する。そのような酸化還元感受性ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、前記新規ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とそれらの同族リガンド、特にシス－レチノイド、好ましくはシス－レチナールとの複合体の生成を可能にし、それらの酸化状態で日光に対する有意に増加した光抵抗性を示す。これらの複合体は、還元条件下で野生型ＣＲＡＬＢＰと比較して同様の生物物理学的特性を有することがさらに示されている。したがって、そのような組成物および複合体、好ましくは酸化複合体の、貯蔵デバイスとしての使用は、好ましくはシス－レチノイドを網膜光受容体に効率的かつ安全に送達するための新しい方法を開くことができる。
【0004】
第１の実施形態および例では、本発明は、システイン残基によるヒトＣＲＡＬＢＰの天然構造内のアラニン２１２およびトレオニン２５０の二重置換（Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ）、ならびに９－シス－レチナールおよび１１－シス－レチナールへのその結合を記載する。ＣＲＡＬＢＰのＡ２１２Ｃ改変はタンパク質のコアのヘリックス１０にマッピングされ、Ｔ２５０Ｃ改変はタンパク質の可動ゲート部分内のヘリックス１２にマッピングされ、残基Ｅ２４３からＥ２５４まで及ぶ。
【0005】
天然のＣＲＡＬＢＰは、低ナノモル濃度範囲で高い親和性で１１－シス－レチナールおよび９－シス－レチナールリガンドの両方に結合する。リガンドが結合すると、ＣＲＡＬＢＰの可動ゲート部分はその「閉じた」立体配座状態をとり、ヘリックス１２およびヘリックス１０は互いにファンデルワールス距離内にある。この立体配座では、突然変異残基Ｃ２１２およびＣ２５０の側鎖硫黄原子は、２つのヘリックスによって形成される界面内で２．４Åの距離で互いに対向する（図１参照）。
【0006】
本発明者らは、２つの対向するシステイン側鎖の距離および配向の両方が共有ジスルフィド結合の形成に役立つことを見出した。直接的な結果として、大気酸素への曝露および適切な酸化剤の添加の両方が、２つの電子（各硫黄原子について１つ）の損失を介して共有ジスルフィド結合の形成を誘導する。Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃにおける可動ゲートの得られた固定化は、持続的な酸化条件下、例えば細胞外区画への進入時に、結合したリガンド（１１－シス－レチナールまたは９－シス－レチナール）の増強された光保護を提供する。天然のＣＲＡＬＢＰの活性プロファイルに関して、感光性シス－レチノイドの安定化は、形成を損なうだけでなく、ＣＲＡＬＢＰ結合ポケットからのトランス－レチナールの早期放出も損なう。
【0007】
したがって、Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ点突然変異は、分子内ジスルフィド結合の可逆的形成を促進する。この観察と一致して、光異性化アッセイは、その酸化状態でＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ突然変異体に結合した場合、シス－レチナールリガンドの光保護の有意な増加を明らかにするが、その還元状態では、Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ突然変異体は、天然のＣＲＡＬＢＰで観察されるものと同様の光保護特性を有する（図９を参照）。
【0008】
本明細書と同様に、ＣＲＡＬＢＰのさらなるジ－システイン突然変異体は、システイン残基の体系的なインシリコ導入およびジスルフィド結合を含む得られたエネルギー最小化構造モデルの分析による計算方法によって同定された。
【0009】
したがって、第１の態様では、本発明は、複合体を含む、好ましくは複合体からなる組成物であって、前記複合体が、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド、を含む組成物を提供する。
【0010】
さらなる態様では、本発明は、複合体を含む、好ましくは複合体からなる組成物であって、前記複合体が、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド、を含む組成物を提供する。
【0011】
別の態様では、本発明は、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供し、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能であり、好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９および配列番号２１から選択されるアミノ酸配列を有し、またさらに好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【0012】
さらなる態様では、本発明は、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質をコードする核酸配列であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、核酸配列を提供する。
【0013】
また別の態様では、本発明は、複合体を含む組成物を調製する方法を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0014】
またさらなる態様では、本発明は、複合体を含む組成物を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記組成物は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記組成物は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0015】
本発明のさらなる態様および実施形態は、この説明が続くにつれて明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ジ－システインＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ突然変異の位置および配向が棒として強調されている、ＣＲＡＬＢＰの可動ゲート領域（閉じた立体配座）の拡大図である。突然変異は、プログラムの回転異性体ライブラリを使用して配置されたＣｏｏｔおよび側鎖回転異性体を使用して導入した。Ｃ２１２およびＣ２５０の末端スルフヒドリル基間の１．９～３．１Åの距離は、酸化条件下でジスルフィド結合（２．０５Å）形成を伴って伝導性である。アルファ－ＴＴＰのアポ形態の可動ゲート部分のＸ線構造モデル（１ｏｉｚ．ｐｄｂ）による３Ｄオーバーレイは、閉状態と開状態との間の立体配座変化の程度を示す。
【図2】形成されたジスルフィド結合の位置が棒として強調されている、ＣＲＡＬＢＰの４つのモノジ－システイン突然変異体の可動ゲート領域のインシリコモデルの拡大図。
【図3】形成されたジスルフィド結合の位置が棒として強調されている、ＣＲＡＬＢＰの３つの二重および三重ジ－システイン突然変異体の可動ゲート領域のインシリコモデルの拡大図。
【図4】可動ゲートを横切る４つの可能なジスルフィド結合を示す全てのインシリコのジ－システイン突然変異体モデルの重ね合わせ。
【図5】９－シス－レチナールとＣＲＡＬＢＰジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃをローディングした後のＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ ２６／６０での分取ＧＦＣのクロマトグラム。
【図6】９－シスレチナールとの複合体におけるモノマー野生型ＣＲＡＬＢＰおよびＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ突然変異体のＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトル。スペクトルは、約２８０ｎｍでのタンパク質の最大吸収に対して正規化される。この値はタンパク質濃度に対応するが、ＣＲＡＬＢＰに結合した９－シスレチナールの吸収最大値は４００ｎｍにある。９－シスレチナールとの複合体における完全飽和ＣＲＡＬＢＰは、ε２８０／ε４００＝２．２の理想的なスペクトル比を特徴とすると報告されている。野生型ＣＲＡＬＢＰ：９－シスレチナールおよびＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ：９－シスレチナール突然変異体について測定された比は、それぞれ２．３１および２．２１である。
【図7】分析用ＧＦＣから対応する画分をプールし濃縮した後のＣＲＡＬＢＰジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのモノマー、ＨＭＷおよびＳＨＭＷ画分の２８０ｎｍでの分析ＧＦＣトレースのオーバーレイ。
【図8】それぞれ、シス－レチナールとの複合体におけるジ－システインＣＲＡＬＢＰ突然変異体の両方の酸化還元状態の光安定性半減期（ｔ１／２）。ＣＲＡＬＢＰ内の本発明のジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃは、１０００ルクスでその光安定性を２０倍増加させる視覚色素をロックする酸化還元スイッチを表す。半減期は、一次反応の標準式（ｔ１／２）＝Ｌｎ（２）／Ｒ）を使用して計算した。
【図9】５ｍＭの酸化グルタチオンを使用して酸化されたときの酸化突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃの光異性化。予め形成された複合体を、５ｍＭ酸化グルタチオンを使用して４℃で一晩酸化した。これらのデータから、異なる分子の反応速度を比較目的のために決定した。値は以下の通りである：ｋ（野生型）＝６．３２４＊１０－５ｓ－１、ｋ（ｏｘ．Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ：１１－シス－レチナール）＝０．６４４＊１０－５ｓ－１、ｋ（ｒｅｄ．Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ：１１－シス－レチナール）＝５．９８８＊１０－５ｓ－１。酸化Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ：９－シス－レチナールの場合、光異性化は検出できなかった。
【図10】９－シス－レチナールをローディングした後のＣＲＡＬＢＰジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃの分取ＧＦＣからの個々の画分を特徴とするネイティブＰＡＧＥの画像。レーンの説明：Ｍ、マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ（商標））；Ｐ１およびＰ１．２ ＳＨＭＷ画分（５－８）；Ｐ２ ＨＭＷ画分（１２－１３）；Ｐ４モノマー画分（２６）。
【図11】９－シス－レチナール、例えばＳＨＷＭ、ＨＭＷ、ダイマーおよびモノマー複合体画分をそれぞれローディングした後のＣＲＡＬＢＰジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃの異なる複合体画分の平均サイズを誤差（±ＳＤ）を含めて示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【0017】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載および開示された実施形態、好ましい実施形態および非常に好ましい実施形態は、具体的に再度言及されているか、または簡潔性のためにその繰り返しが回避されているかにかかわらず、全ての態様および他の実施形態、好ましい実施形態および非常に好ましい実施形態に適用されるべきである。冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で使用される場合、冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。本明細書で使用される「または」という用語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「および／または」を意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、任意の数値に言及する場合の「約」という用語は、記載された値の±１０％の値を意味することを意図している。好ましい実施形態では、任意の数値に言及する場合の前記「約」は、記載された値の±５％の値を意味することを意図している。別の好ましい実施形態では、任意の数値に言及する場合の前記「約」は、記載された値の±３％の値を意味することを意図している。
【0018】
野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質：本明細書で使用される場合、「野生型タンパク質」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトについて天然に存在する細胞性網膜結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）を指す。したがって、好ましくは野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質を指す。
【0019】
ムテイン：本明細書で使用される場合、「ムテイン」という用語は、所与の参照（例えば、天然、野生型など）タンパク質またはポリペプチドと１つまたは複数のアミノ酸が異なるタンパク質またはポリペプチドを指し、そのような違いは、少なくとも１つのアミノ酸の付加、置換もしくは欠失またはそれらの組合せによって引き起こされる。好ましい実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸の置換に由来する、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換に由来する突然変異を含む。保存的置換としては、同配体置換、すなわち、アミノ酸の荷電性、極性、芳香族、脂肪族または疎水性の性質が維持される置換が挙げられる。例えば、システイン残基のセリン残基による置換は保存的置換である。本発明の好ましい実施形態では、「ムテイン」という用語は、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有する野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテイン、または前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大で３０、典型的および好ましくは最大で２０もしくは１０アミノ酸だけ異なる野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインを指す。本発明のさらに好ましい実施形態では、「ムテイン」という用語は、好ましくは配列番号３の前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４、９５％、９６％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号３の野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテイン、または好ましくは配列番号３の前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大で３０、典型的および好ましくは最大で２０もしくは１０、９、８、７、６アミノ酸だけ異なる、好ましくは配列番号３の野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインを指す。
【0020】
アミノ酸残基に対応する位置．．．：別のアミノ酸配列の所与の残基に対応するアミノ酸配列上の位置は、配列アラインメントによって、典型的および好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して、最も好ましくは標準設定を使用して同定することができる。典型的および好ましい標準設定は以下である：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、拡張１；組成調整：条件付き組成スコアマトリックス調整。例として、本発明の好ましい実施形態では、システインによるアミノ酸突然変異の各対の一方のシステインは、配列番号３のアミノ酸２０４～２２９に対応するアミノ酸残基内のアミノ酸の突然変異であり、前記対のシステインによる他方の突然変異アミノ酸は、配列番号３のアミノ酸２４４～２６１に対応するアミノ酸残基内のアミノ酸の突然変異である。配列番号３がヒト野生型ＣＲＡＬＢＰを指すことを考慮すると、対応する特定の動物または哺乳動物のＣＲＡＬＢＰ位置は、したがって、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰに対応する。
【0021】
「ジスルフィド結合を形成することができる」および「ジスルフィド結合を形成することが可能」という用語は、本明細書で互換的に使用され、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してアミノ酸突然変異であるシステインの対を指し、典型的および好ましくは、例３に記載される方法で典型的および好ましくは決定される、突然変異システインがジスルフィド結合を形成する能力および可能性をそれぞれ指す。
【0022】
配列同一性：２つの所与のアミノ酸配列の配列同一性は、両方の配列のアラインメントに基づいて決定される。配列同一性を決定するためのアルゴリズムは当業者に利用可能である。好ましくは、２つのアミノ酸配列の配列同一性は、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）または「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）などの公的に利用可能なコンピュータ相同性プログラムを使用して、本明細書により、好ましくはｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉのＮＣＢＩホームページで提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムによって、そこに提供されるデフォルト設定を使用して決定される。典型的および好ましい標準設定は以下である：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、拡張１；組成調整：条件付き組成スコアマトリックス調整。
【0023】
アミノ酸交換：アミノ酸交換という用語は、アミノ酸配列中の所与のアミノ酸残基の、異なる化学構造を有する任意の他のアミノ酸残基による、好ましくは別のタンパク質原性アミノ酸残基による交換を指す。したがって、アミノ酸の挿入または欠失とは対照的に、アミノ酸交換は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の総数を変化させない。本発明内のアミノ酸交換の場合、典型的および好ましくは非機能性アミノ酸置換に言及する場合、保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸置換は、当業者によって理解されるように、同配体置換、すなわち、アミノ酸の荷電性、極性、芳香族、脂肪族または疎水性の性質が維持される置換を含み、典型的および好ましくはそれからなる。典型的な保存的置換は、以下の群のうちの１つ内のアミノ酸間の置換である：Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ならびにＰｈｅおよびＴｙｒ。
【0024】
ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結されたアミノ酸モノマーで構成されるポリマーを指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語はまた、典型的および好ましくは、前に定義されたポリペプチドを指すべきであり、グリコシル化を含むがこれに限定されない翻訳後修飾などの修飾を包含する。好ましい実施形態では、本明細書で使用される前記「ポリペプチド」という用語は、前に定義されたポリペプチドを指すべきであり、グリコシル化などの翻訳後修飾などの修飾を包含しない特に、前記生物学的に活性なペプチドについては、前記グリコシル化などの前記修飾は、その後のインビボでさえ、例えば細菌によって起こり得る。
【0025】
ＣＲＡＬＢＰの同族リガンド：本明細書で使用される「ＣＲＡＬＢＰの同族リガンド」という用語は、配列番号３の野生型ＣＲＡＬＢＰ、好ましくは野生型ヒトＣＲＡＬＢＰの結合ポケットに、典型的および好ましくは少なくとも１～２００ｎＭ、さらに好ましくは１～１００ｎＭのナノモル親和性で、さらに典型的および好ましくは６～８０ｎＭの親和性で（前記親和性は、典型的および好ましくは、Ｇｏｌｏｖｌｅｖａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１４）に記載の通りに決定される）結合する分子を指し、その分子は、典型的および好ましくはＣＲＡＬＢＰタンパク質と機能的に関連する。機能的に関連する：本明細書で使用される「機能的に関連する」という用語は、ＣＲＡＬＢＰの生理学的機能を指す。
【0026】
シス－レチノイド：本明細書で使用される「シス－レチノイド」という用語は、天然または合成分子、典型的および好ましくはビタミンＡ誘導体を指し、典型的および好ましくは、１つまたは複数のメチルおよび／またはメトキシ置換基で置換されたシクロヘキセンまたはフェニル部分を含み、シクロヘキセンまたはフェニル部分は、その末端炭素原子（シクロヘキセンまたはフェニル部分へのその結合に関連する末端炭素原子）にアルコール、アルデヒド、カルボキシまたはエステル官能基を有するＣ６－Ｃ１４直鎖または分岐アルケニル基で（さらに）置換されており、前記直鎖または分岐アルケニル基は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合、典型的および好ましくは１つ以上、最も好ましくは４つの炭素－炭素二重結合を有し、前記炭素－炭素二重結合の少なくとも１つはシス配置である。前記シス－レチノイドは、レチノール、レチナールアルデヒド、およびトレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、ならびにそのエステルを含み、これらのうち、レチノールおよびレチナールアルデヒドが好ましい。シス－レチノイドが記載されている（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ Ｉｎｔｅｒｖ Ａｇｉｎｇ．１（４）：３２７－４８；Ｋｉｓｅｒ ＰＤ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１４：１９４－２３２）。
【0027】
「複合体」：本明細書で使用される場合、特にＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とＣＲＡＬＢＰの同族リガンドとを含む複合体について言及する場合、用語「複合体」は、（ｉ）前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドとの１：１モノマー複合体であって、ＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質に、典型的および好ましくは少なくとも１～２００ｎＭ、さらに好ましくは１～１００ｎＭのナノモル親和性（前記親和性は、典型的および好ましくは、Ｇｏｌｏｖｌｅｖａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１４）に記載の通りに決定される）で結合する、複合体、および／または（ｉｉ）前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドとのダイマーおよび／またはオリゴマー複合体であって、典型的および好ましくは前記１：１モノマー複合体がダイマー化および／またはオリゴマー化して、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドとの前記ダイマーおよび／またはオリゴマー複合体を形成すると考えられるがこの理論に拘束されない、複合体を指す。典型的および好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの前記ダイマーおよび／またはオリゴマー複合体内の前記同族リガンドの数は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の数に等しい。さらに、拘束されるものではないが、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドとの間の相互作用は、特に野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンド、例えば９－シス－レチナールおよび１１－シス－レチナールについて以前に同定されたような立体特異的相互作用に対応し、典型的な可逆的な非共有結合相互作用を表し、好ましくは水素結合、疎水力、ファンデルワールス力、静電相互作用などを含むと考えられる（Ｈｅ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，ＰＮＡＳ，１０６（４４）：１８５４５－１８５５０）；Ｂｏｌｚｅ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＪＡＣＳ，１３６（１）：１３７－１４６）。
【0028】
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物（例えば、非ヒト動物）、脊椎動物、哺乳動物、げっ歯類（例えば、モルモット、ハムスター）、イヌ（例えば、犬）、ネコ（例えば、猫）、ブタ（例えば、豚）、ウマ（例えば、馬）、霊長類、またはヒトであり得る。好ましい実施形態では、前記動物は哺乳動物である。別の好ましい実施形態では、前記動物はヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、犬、猫、馬など）である。非常に好ましい実施形態では、前記動物はヒトである。
【0029】
第１の態様では、本発明は、複合体を含む、好ましくは複合体からなる組成物であって、前記複合体が、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド、を含む組成物を提供する。
【0030】
さらなる態様では、本発明は、複合体を含む、好ましくは複合体からなる組成物であって、前記複合体が、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド、を含む組成物を提供する。
【0031】
別の態様では、本発明は、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供し、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができ、好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９および配列番号２１から選択されるアミノ酸配列を有し、またさらに好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【0032】
さらなる態様では、本発明は、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質をコードする核酸配列であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、核酸配列を提供する。
【0033】
また別の態様では、本発明は、複合体を含む組成物を調製する方法を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0034】
またさらなる態様では、本発明は、複合体を含む組成物を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記組成物は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは本明細書に記載されるように定義され；前記組成物は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を含む前記組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0035】
さらなる態様では、本発明は、複合体を含む組成物を調製する方法を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を含む組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を含む組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0036】
さらなる態様では、本発明は、複合体を調製する方法を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0037】
さらなる態様では、本発明は、複合体を含む組成物を調製する方法を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程、および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記方法は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程、および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0038】
さらなる態様では、本発明は、複合体を含む組成物を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記組成物は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を含む組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記組成物は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記組成物は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を含む組成物を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記複合体を含む前記組成物を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0039】
さらなる態様では、本発明は、複合体を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記複合体は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することができる、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記複合体は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５であり、好ましくは前記溶液Ｉが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、工程；
ｉｉ．溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であり、好ましくは前記水溶性溶媒がエタノールである、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積が０．５～８％（体積／体積）、好ましくは約１～５％（体積／体積）である、工程；
ｉｖ．前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させる工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0040】
さらなる態様では、本発明は、複合体を提供し、前記複合体は、
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記複合体は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質であって、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質が野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質のムテインであり、前記ムテインが前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる少なくとも１対のアミノ酸突然変異を含み、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成することが可能な、ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質；
（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドであって、好ましくはシス－レチノイドである同族リガンド；を含み、前記複合体は、好ましくは、好ましい実施形態において本明細書に記載されるように定義され；前記複合体は、
ｉ．水溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質を提供する工程であって、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度が１μＭ～５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが５～９、好ましくは７．０～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である、工程；
ｉｉ．水溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを提供する工程であって、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度が５μＭ～５００ｍＭであり；前記溶液ＩＩが界面活性剤を含む、工程；
ｉｉｉ．前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを組み合わせることによって溶液ＩＩＩを生成する工程であって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度とＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比が４：１～１：４（モル／モル）である、工程；
ｉｖ．前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去する工程であって、前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去することにより、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質およびＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドが複合体に集合することが可能になる、工程；
ｖ．前記複合体を前記溶液ＩＩＩから分離する工程；
ｖｉ．場合により、前記錯体を精製する工程；および
ｖｉｉ．前記複合体を含む前記組成物を酸化剤で場合により処理する工程であって、好ましくは前記酸化剤が周囲空気または１～１０００ｍＭ酸化グルタチオンであり、さらに好ましくは前記酸化剤が１～１００ｍＭ酸化グルタチオンである、工程を含む。
【0041】
またさらなる態様において、本発明は、（ａ）本発明の組成物；および（ｂ）薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【0042】
またさらなる態様において、本発明は、（ａ）本発明の複合体；および（ｂ）薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【0043】
好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、（ｉ）９－シス－レチナール；（ｉｉ）９－シス－レチノール；（ｉｉｉ）１１－シス－レチナール；（ｉｖ）１１－シス－レチノール；（ｖ）１１，１３－ジ－シス－レチナール；（ｖｉ）１１，１３－ジ－シス－レチノール；（ｖｉｉ）９，１３－ジ－シス－レチナール；および（ｖｉｉｉ）９，１３－ジ－シス－レチノールから選択される。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、（ｉ）９－シス－レチナール；（ｉｉ）９－シス－レチノール；（ｉｉｉ）１１－シス－レチナール；（ｉｖ）１１－シス－レチノール；（ｖ）９，１３－ジ－シス－レチナール；および（ｖｉ）９，１３－ジ－シス－レチノールから選択される。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、（ｉ）９－シス－レチナール；（ｉｉ）１１－シス－レチナール；および（ｉｉｉ）９，１３－ジ－シス－レチナール；および（ｖｉ）９，１３－ジ－シス－レチノールから選択される。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、（ｉ）９－シス－レチナールおよび（ｉｉ）１１－シス－レチナールから選択される。
【0044】
さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、９－シス－レチナールである。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、９－シス－レチノールである。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、１１－シス－レチナールである。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、１１－シス－レチノールである。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、１１，１３－ジ－シス－レチナールである。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、１１，１３－ジ－シス－レチノールである。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、９，１３－ジ－シス－レチナールである。さらに好ましい実施形態では、前記同族リガンド、好ましくは前記シス－レチノイドは、９，１３－ジ－シス－レチノールである。
【0045】
さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９６％、またさらに好ましくは少なくとも９７％、またさらに好ましくは少なくとも９８％、またより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９６％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９７％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９８％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0046】
さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大３０アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大２０アミノ酸異なる。また別の好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大で１０アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大で８アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大で６、４または２アミノ酸異なる。
【0047】
さらに好ましい実施形態では、システインによるアミノ酸突然変異の各対の一方のシステインは、配列番号３のアミノ酸２０４～２２９に対応するアミノ酸残基内のアミノ酸の突然変異であり、前記対のシステインによる他方の突然変異アミノ酸は、配列番号３のアミノ酸２４４～２６１に対応するアミノ酸残基内のアミノ酸の突然変異である。
【0048】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる１、２、３または４対のアミノ酸突然変異を含み、好ましくは、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる１または２対のアミノ酸突然変異を含む。
【0049】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対のアミノ酸突然変異を含む。別の好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる２対のアミノ酸突然変異を含む。さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる３対のアミノ酸突然変異を含む。
【0050】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによるアミノ酸突然変異の前記対は、以下から選択される：
（１）配列番号３のアミノ酸２１２に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に相当するアミノ酸の突然変異；
（２）配列番号３のアミノ酸２１７に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に相当するアミノ酸の突然変異；
（３）配列番号３のアミノ酸２２０に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に相当するアミノ酸の突然変異；
（４）配列番号３のアミノ酸２２４に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に相当するアミノ酸の突然変異。
（１）配列番号３のアミノ酸２１２に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に相当するアミノ酸の突然変異；
（２）配列番号３のアミノ酸２１７に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に相当するアミノ酸の突然変異；
（３）配列番号３のアミノ酸２２０に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に相当するアミノ酸の突然変異；
（４）配列番号３のアミノ酸２２４に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に相当するアミノ酸の突然変異。
【0051】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２１７に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に対応するアミノ酸の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異である。
【0052】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対または２対または３対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して前記１対のシステインによるアミノ酸突然変異は、以下：
（ｉ）配列番号３のアミノ酸２１２に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に相当するアミノ酸の突然変異；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸２１７に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に相当するアミノ酸の突然変異；および
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸２２０に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に相当するアミノ酸の突然変異；から選択され、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記２対のアミノ酸突然変異は、以下：
（ａ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異であるもの；
（ｂ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異であるもの；および
（ｃ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２１７に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に対応するアミノ酸の突然変異であるもの；から選択され、
前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記３対のアミノ酸突然変異は、
（ｘ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対、システインによるアミノ酸突然変異の第２の対、およびシステインによるアミノ酸突然変異の第３の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第３の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異であるものである。
（ｉ）配列番号３のアミノ酸２１２に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に相当するアミノ酸の突然変異；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸２１７に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に相当するアミノ酸の突然変異；および
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸２２０に相当するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に相当するアミノ酸の突然変異；から選択され、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記２対のアミノ酸突然変異は、以下：
（ａ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異であるもの；
（ｂ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異であるもの；および
（ｃ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２１７に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に対応するアミノ酸の突然変異であるもの；から選択され、
前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記３対のアミノ酸突然変異は、
（ｘ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対、システインによるアミノ酸突然変異の第２の対、およびシステインによるアミノ酸突然変異の第３の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第３の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異であるものである。
【0053】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異は、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異は、配列番号３のアミノ酸２１７に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に対応するアミノ酸の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異は、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異である。
【0054】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異である。
【0055】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異である。
【0056】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２１７に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３に対応するアミノ酸の突然変異である。
【0057】
さらに好ましい実施形態では、前記ムテインは、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる３対のアミノ酸突然変異を含み、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる３対のアミノ酸変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対、システインによるアミノ酸突然変異の第２の対、およびシステインによるアミノ酸突然変異の第３の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２０に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４に対応するアミノ酸の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第３の対が、配列番号３のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７に対応するアミノ酸の突然変異である。
【0058】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのモノマー複合体である。
【0059】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのダイマー複合体である。
【0060】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体である。さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのホモオリゴマー複合体である。
【0061】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は少なくとも２４０ｋＤａ、好ましくは少なくとも３００ｋＤａの分子量を有し、好ましくは前記オリゴマー複合体は最大６６０ｋＤａの分子量を有し、さらに好ましくは前記オリゴマー複合体は最大６００ｋＤａの分子量を有する。
【0062】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は少なくとも７２０ｋＤａ、好ましくは少なくとも８００ｋＤａの分子量を有し、好ましくは前記オリゴマー複合体は最大２５００ｋＤａの分子量を有し、さらに好ましくは前記オリゴマー複合体は最大２０００ｋＤａの分子量を有する。
【0063】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は少なくとも７２０ｋＤａ、好ましくは少なくとも８００ｋＤａの分子量を有し、好ましくは前記オリゴマー複合体は最大２５００ｋＤａの分子量を有し、さらに好ましくは前記オリゴマー複合体は最大２０００ｋＤａの分子量を有する。
【0064】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体内の前記同族リガンドおよび前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の数は、６以上１８以下、好ましくは８以上１６以下であり、さらに好ましくは前記同族リガンドの数と前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の数は等しい。
【0065】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体内の前記同族リガンドおよび前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の数は、２０以上７５以下、好ましくは２２以上６０以下であり、さらに好ましくは前記同族リガンドの数と前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の数は等しい。さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体内の前記同族リガンドおよび前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の数は、２４以上７５以下、好ましくは２６以上６０以下であり、さらに好ましくは前記同族リガンドの数と前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の数は等しい。
【0066】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は約８～２０ｎｍの平均直径を有し、前記平均直径は動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、好ましくは前記オリゴマー複合体は約１０～１８ｎｍの平均直径を有し、前記平均直径は動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。
【0067】
さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質と前記同族リガンドとのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は約２４～３３ｎｍの平均直径を有し、前記平均直径は動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、好ましくは前記オリゴマー複合体は約２５～３２ｎｍの平均直径を有し、前記平均直径は動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。
【0068】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのモノマー複合体およびホモオリゴマー複合体を含む。さらに好ましい実施形態では、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのモノマー複合体およびホモオリゴマー複合体を含む。
【0069】
好ましい実施形態では、システインの前記対の少なくとも１つがジスルフィド結合を形成する。別の好ましい実施形態では、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成する。
【0070】
好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質である。
【0071】
好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによるアミノ酸突然変異の前記対は、
（１）配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異；
（２）配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異；
（３）配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異；
（４）配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異；から選択され、
好ましくは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、またさらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、またさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、またさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
（１）配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異；
（２）配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異；
（３）配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異；
（４）配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異；から選択され、
好ましくは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、またさらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、またさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、またさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0072】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９６％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９７％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９８％の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0073】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大３０アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大２０アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大１０アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大８アミノ酸異なる。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質の前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と最大６、４または２アミノ酸異なる。
【0074】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによるアミノ酸突然変異の前記対は、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異である。
【0075】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対または２対または３対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異は、以下：
（ｉ）配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異；および
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異；から選択され前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記２対のアミノ酸突然変異は、以下：
（ａ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるもの；
（ｂ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるもの；および
（ｃ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異であるもの；から選択され、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記３対のアミノ酸突然変異は、
（ｘ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対、システインによるアミノ酸突然変異の第２の対、およびシステインによるアミノ酸突然変異の第３の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第３の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるものである。
（ｉ）配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異；
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異；および
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異；から選択され前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記２対のアミノ酸突然変異は、以下：
（ａ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるもの；
（ｂ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるもの；および
（ｃ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異であるもの；から選択され、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記３対のアミノ酸突然変異は、
（ｘ）システインによるアミノ酸突然変異の第１の対、システインによるアミノ酸突然変異の第２の対、およびシステインによるアミノ酸突然変異の第３の対であって、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第３の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異であるものである。
【0076】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異は、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異は、配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異である。さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較して、システインによる１対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる前記１対のアミノ酸突然変異は、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異である。
【0077】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異である。
【0078】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異である。
【0079】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる２対のアミノ酸突然変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対およびシステインによるアミノ酸突然変異の第２の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２１７の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５３の突然変異である。
【0080】
さらに好ましい実施形態では、前記野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質は、配列番号３のヒトＣＲＡＬＢＰタンパク質であり、前記ムテインは、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる３対のアミノ酸突然変異を含み、前記ヒト野生型ＣＲＡＬＢＰタンパク質と比較してシステインによる３対のアミノ酸変異は、システインによるアミノ酸突然変異の第１の対、システインによるアミノ酸突然変異の第２の対、およびシステインによるアミノ酸突然変異の第３の対であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第１の対が、配列番号３のアミノ酸２１２の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５０の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第２の対が、配列番号３のアミノ酸２２０の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５４の突然変異であり、前記システインによるアミノ酸突然変異の第３の対が、配列番号３のアミノ酸２２４の突然変異および配列番号３のアミノ酸２５７の突然変異である。
【0081】
さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９および配列番号２１から選択されるアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。前述の実施形態の別の好ましい実施形態では、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成し、したがって、前記本発明の複合体内で、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は完全に酸化形態である。
【0082】
さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。前述の実施形態の別の好ましい実施形態では、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成し、したがって、前記本発明の複合体内で、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は完全に酸化形態である。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成する。
【0083】
さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９および配列番号２１から選択されるアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。前述の実施形態の別の好ましい実施形態では、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成する。したがって、前記本発明の複合体内で、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は完全に酸化形態である。
【0084】
さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列からなる。前述の実施形態の別の好ましい実施形態では、システインの前記対の各々がジスルフィド結合を形成する。したがって、前記本発明の複合体内で、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は完全に酸化形態である。さらに好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列からなり、配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成する。
【0085】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は、複合体を含み、好ましくはそれからなり、前記複合体は、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質（前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる）；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドを含み、前記同族リガンドはシス－レチノイドであり、好ましくは、前記シス－レチノイドは、（ｉ）９－シス－レチナール；（ｉｉ）９－シス－レチノール；（ｉｉｉ）１１シス－レチナール；（ｉｖ）１１シス－レチノール；（ｖ）９，１３ジ－シス－レチナール；および（ｖｉ）９，１３－ジ－シス－レチノールから選択され、さらに好ましくは、前記シス－レチノイドは、（ｉ）９－シス－レチナール；（ｉｉ）１１シス－レチナール；および（ｉｉｉ）９，１３ジ－シス－レチナール；および（ｖｉ）９，１３－ジ－シス－レチノールから選択され、またさらに好ましくは、前記シス－レチノイドは、（ｉ）９－シス－レチナールおよび（ｉｉ）１１－シス－レチナールから選択され；好ましくは、配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成する。
【0086】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は複合体を含み、好ましくはそれからなり、前記複合体は、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質（前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列からなる）；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドを含み、前記同族リガンドは、（ｉ）９－シス－レチナールおよび（ｉｉ）１１－シス－レチナールから選択され；好ましくは、配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成し、好ましくは、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は、少なくとも７２０ｋＤａ、好ましくは少なくとも８００ｋＤａの分子量を有し、好ましくは、前記オリゴマー複合体は、最大２５００ｋＤａの分子量を有し、さらに好ましくは、前記オリゴマー複合体は、最大２０００ｋＤａの分子量を有する。
【0087】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は複合体を含み、好ましくはそれからなり、前記複合体は、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質（前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列からなる）；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドを含み、前記同族リガンドは、（ｉ）９－シス－レチナールおよび（ｉｉ）１１－シス－レチナールから選択され；好ましくは、配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成し、好ましくは、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は、少なくとも８００ｋＤａの分子量を有し、前記オリゴマー複合体は、最大２０００ｋＤａの分子量を有する。
【0088】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は複合体を含み、好ましくはそれからなり、前記複合体は、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質（前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列からなる）；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドを含み、前記同族リガンドは、（ｉ）９－シス－レチナールおよび（ｉｉ）１１－シス－レチナールから選択され；配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成し、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は、少なくとも７２０ｋＤａ、好ましくは少なくとも８００ｋＤａの分子量を有し、好ましくは、前記オリゴマー複合体は、最大２５００ｋＤａの分子量を有し、さらに好ましくは、前記オリゴマー複合体は、最大２０００ｋＤａの分子量を有する。
【0089】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は複合体を含み、好ましくはそれからなり、前記複合体は、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質（前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列からなる）；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドを含み、前記同族リガンドは、（ｉ）９－シス－レチナールおよび（ｉｉ）１１－シス－レチナールから選択され；配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成し、好ましくは、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は、少なくとも８００ｋＤａの分子量を有し、前記オリゴマー複合体は、最大２０００ｋＤａの分子量を有する。
【0090】
さらに好ましい実施形態では、前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度は０．１ｍＭ～１ｍＭであり、さらに好ましくは前記溶液Ｉ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度は０．２５ｍＭ～０．７５ｍＭである。さらに好ましい実施形態では、前記溶液ＩのｐＨは７～８．５、さらに好ましくは７．５～８．５である。
【0091】
さらに好ましい実施形態では、前記溶液Ｉは塩を含み、前記塩の濃度は１０ｍＭ～５００ｍＭである。さらに好ましくは、前記塩の濃度は、３０ｍＭ～３５０ｍＭであり、さらに好ましくは、前記塩の濃度は、１００ｍＭ～２５０ｍＭである。さらに好ましい実施形態では、前記塩は、一価、二価、三価または四価の無機塩または有機塩から選択され、さらに好ましくは、前記塩は、二価、三価または四価の無機塩または有機塩から選択され、またさらに好ましくは、前記塩は、ＨＰＯ４
２－、ＳＯ４
２－、酒石酸、マロン酸、Ｄ－ミオ－イノシトール１，４，５－三リン酸およびＤ－ミオ－イノシトール１，３，４，５－テトラキス（リン酸）カリウム塩から選択される二価、三価または四価アニオンを含む。
【0092】
さらに好ましい実施形態では、前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの前記濃度は３０μＭ～３００ｍＭであり、さらに好ましくは前記溶液Ｉ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度は２００μＭ～２００ｍＭである。
【0093】
前記溶液ＩＩの溶媒は水溶性溶媒である。溶液ＩＩに使用される水溶性溶媒が、少量、すなわち最大１０％（ｖ／ｖ）の水を含んでいてもよいことは本発明の範囲内であるが、典型的および好ましくは、前記水溶性溶媒は、製造業者によって供給される場合に前記水溶性溶媒に典型的に含まれる少量の水以外のいかなる追加量の水も含まない。さらに好ましくは、前記水溶性溶媒は、８％（ｖ／ｖ）超、好ましくは７％（ｖ／ｖ）超、さらに好ましくは５％（ｖ／ｖ）超の水を含まない。
【0094】
本発明の好ましい実施形態では、前記水溶性溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、メチルペンタンジオールおよびグリセロールから選択され、さらに好ましくは、前記水溶性溶媒は、エタノール、イソプロパノールおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択され、またさらに好ましくは、前記水溶性溶媒はエタノールである。
【0095】
溶液ＩＩが界面活性剤を含む本発明の方法では、前記界面活性剤は、前記溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを可溶化するのに役立つ。好ましい実施形態では、前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤から選択される。好ましくは、前記非イオン性界面活性剤は、オクチルβ－Ｄ－グルコシド、ノニルβ－Ｄ－グルコシド、デシルβ－Ｄ－グルコシド、ノニルβ－Ｄ－マルトシド、デシルβ－Ｄ－マルトシド、ウンデシルβ－Ｄ－マルトシド、ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）ＴｒｉｔｏｎＸ１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、ポリエチレングリコール２００から選択される。好ましくは、前記アニオン性界面活性剤は、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシグリココール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムから選択される。さらに好ましい実施形態では、前記非イオン性界面活性剤は、オクチルβ－Ｄ－グルコシド、ノニルβ－Ｄ－グルコシド、デシルβ－Ｄ－グルコシド、ノニルβ－Ｄ－マルトシド、デシルβ－Ｄ－マルトシド、ウンデシルβ－Ｄ－マルトシド、ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）ＴｒｉｔｏｎＸ１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、ポリエチレングリコール２００から選択される。さらに好ましい実施形態では、前記アニオン性界面活性剤は、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシグリココール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムから選択される。好ましい実施形態では、前記界面活性剤はアニオン性界面活性剤であり、前記アニオン性界面活性剤はコール酸ナトリウムである。
【0096】
前記溶液ＩＩ中のＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを可溶化するために、濃度は使用される界面活性剤の性質に依存するので、前記溶液ＩＩ中で使用される前記界面活性剤の濃度は、当業者によって決定することができ、当業者の知識に基づく。典型的および好ましくは、前記溶液ＩＩ中の前記界面活性剤の濃度は、前記界面活性剤、典型的および好ましくは前記非イオン性界面活性剤または前記アニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より高い。典型的および好ましくは、前記界面活性剤、典型的および好ましくは、非イオン性界面活性剤または前記アニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は０．５ｍＭ以上であり、さらに好ましくは、前記非イオン性界面活性剤または前記アニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は１０ｍＭ以上である。
【0097】
さらに好ましい実施形態では、前記溶液ＩＩＩからの前記界面活性剤の前記除去は、透析によって行われる。好ましくは、透析による前記溶液ＩＩＩからの前記界面活性剤の前記除去は、膜を横切って行われ、好ましくは、前記膜は、１～２５ｋＤ、好ましくは５～２０ｋＤ、さらに好ましくは１０～１５ｋＤの分子量カットオフを含む。透析は、好ましくは第１の緩衝液を用いて行われ、前記第１の緩衝液はアルカリ金属のハロゲン化物を含み、好ましくはアルカリ金属の前記ハロゲン化物は塩化カリウムまたは塩化ナトリウムであり、さらに好ましくはアルカリ金属の前記ハロゲン化物は塩化ナトリウムであり、好ましくは前記第１の緩衝液中のアルカリ金属の前記ハロゲン化物、好ましくは前記塩化ナトリウムの濃度は１～１０００ｍＭ、好ましくは１０～５００ｍＭ、より好ましくは５０～２５０ｍＭ、最も好ましくは１００～２００ｍＭである。
【0098】
透析は、好ましくは４℃～３７℃の温度で行われ、好ましくは前記透析は、４～２４時間にわたって行われる。
【0099】
本発明の好ましい実施形態では、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度と前記ＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との前記比は、３：１～１：３（モル／モル）であり、好ましくは前記溶液ＩＩＩ中の前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の濃度と前記ＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドの濃度との比は、２：１～１：２（モル／モル）である。
【0100】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の前記体積は１～５％（体積／体積）であり、好ましくは前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の体積は２～４％（体積／体積）である。
【0101】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記ＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドを複合体に集合させることは、前記溶液ＩＩＩを４～３７℃の温度、好ましくは室温で１時間～２４時間、好ましくは１２～２４時間維持することによって達成される。
【0102】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前記溶液ＩＩＩから、前記複合体を含む前記組成物を分離すること、または前記複合体を分離することは、サイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィによって行われる。
【0103】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記複合体を含む前記組成物を精製すること、または前記複合体を精製することは、サイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィによって行われる。本発明の別の好ましい実施形態では、前記複合体を含む前記組成物を精製すること、または前記複合体を精製することは、酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくは酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィによって、さらに好ましくは酸化グルタチオンを使用する例８に記載のように達成される。
【0104】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記方法は、酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくは酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィによって、さらに好ましくは酸化グルタチオンを使用する例８に記載のように、前記複合体を含む前記組成物を精製すること、または前記複合体を精製することを含む。本発明の別の好ましい実施形態では、前記方法は、酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくは酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィによって、前記複合体を含む前記組成物を精製すること、または前記複合体を精製することを含み、前記サイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくは前記サイズ排除クロマトグラフィは、酸化剤の存在下で行われ、好ましくは前記酸化剤は酸化グルタチオンであり、好ましくは前記酸化剤、好ましくは前記酸化グルタチオンの濃度は１ｍＭ～７．５ｍＭ、好ましくは３ｍＭ～６ｍＭ、さらに好ましくは約５ｍＭである。本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、前記組成物は複合体を含み、好ましくはそれからなり、前記複合体は、（ａ）ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質（前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質は配列番号９のアミノ酸配列からなる）；および（ｂ）ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドを含み、前記同族リガンドは、（ｉ）９－シス－レチナールおよび（ｉｉ）１１－シス－レチナールから選択され；配列番号９のアミノ酸２１２および２５０のシステインの前記対はジスルフィド結合を形成し、前記複合体は、前記ＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質および前記同族リガンドのオリゴマー複合体であり、前記オリゴマー複合体は、少なくとも７２０ｋＤａ、好ましくは少なくとも８００ｋＤａの分子量を有し、好ましくは、前記オリゴマー複合体は、最大２５００ｋＤａの分子量を有し、さらに好ましくは、前記オリゴマー複合体は、最大２０００ｋＤａの分子量を有し、前記方法は、酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくは酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィによって、さらに好ましくは酸化グルタチオンを使用する例８に記載のように、前記複合体を含む前記組成物を精製すること、または前記複合体を精製することを含む。本発明の別の好ましい実施形態では、前記方法は、酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくは酸化条件下でのサイズ排除クロマトグラフィによって、前記複合体を含む前記組成物を精製すること、または前記複合体を精製することを含み、前記サイズ排除クロマトグラフィまたはアニオン交換クロマトグラフィ、好ましくは前記サイズ排除クロマトグラフィは、酸化剤の存在下で行われ、好ましくは前記酸化剤は酸化グルタチオンであり、好ましくは前記酸化剤、好ましくは前記酸化グルタチオンの濃度は１ｍＭ～７．５ｍＭ、好ましくは３ｍＭ～６ｍＭ、さらに好ましくは約５ｍＭである。
【0105】
例
例１
ＲＬＢＰ１のクローニングおよびＣＲＡＬＢＰの発現
ＲＬＢＰ１のクローニングおよびＣＲＡＬＢＰの発現は、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，ＰＮＡＳ，１０６（４４）：１８５４５－１８５５０）に記載されているように同様に行った。簡単に記載すると、ヒトＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡ（ＪＲＡＵｐ９６９Ｄ１０２０Ｄ、配列番号１）を、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＧｍｂＨから入手した。「ＳｔｒｅａｍＬｉｎｅｄ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルに従って、ＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡをｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって、ＣＲＡＬＢＰ過剰発現ベクター構築物を得て、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ＣＲＡＬＢＰ過剰発現プラスミド（配列番号２）をもたらした。インキュベーションを３７℃および７５０ｒｐｍ（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で２．２５時間行い、７４℃で１５分間不活性化し、１％アガロースゲルを介して分離し、Ｐｒｏｍｅｇａ製の「Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ」を用いてユーザマニュアルに従って所望の切断断片を抽出した。熱感受性アルカリホスファターゼを、ｐＥＴ－２８ａ（＋）標的ベクターの消化のためにのみ使用したが、ＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡ（ＪＲＡＵｐ９６９Ｄ１０２０Ｄ）の消化のためには使用しなかった。大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｐＥＴ－２８ａ（＋）ＣＲＡＬＢＰ過剰発現プラスミド（配列番号２）で形質転換し、３０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含む１２０ｍＬのＬＢ培地で３７℃にて一晩撹拌培養した。一晩培養物を使用して、６ＬのＬＢ培地（３０ｍｇ／ｍＬカナマイシン）に接種した。培養物を２０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させ、次いで、１ｍＭイソプロピル－チオガラクトピラノシドで１６時間誘導した。細胞を５０００ｇで４５分間の遠心分離によって回収し、２５０ｍＬの氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１％ ｗｔ／ｖｏｌトリトンＸ－１００）に再懸濁した。細胞を２０分間の超音波処理によって破壊し、ヒト野生型ＣＲＡＬＰＢ（配列番号３）を含む溶解物を２０，０００ｇで３５分間遠心分離して破片を除去した。
例１
ＲＬＢＰ１のクローニングおよびＣＲＡＬＢＰの発現
ＲＬＢＰ１のクローニングおよびＣＲＡＬＢＰの発現は、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，ＰＮＡＳ，１０６（４４）：１８５４５－１８５５０）に記載されているように同様に行った。簡単に記載すると、ヒトＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡ（ＪＲＡＵｐ９６９Ｄ１０２０Ｄ、配列番号１）を、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＧｍｂＨから入手した。「ＳｔｒｅａｍＬｉｎｅｄ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルに従って、ＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡをｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって、ＣＲＡＬＢＰ過剰発現ベクター構築物を得て、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ＣＲＡＬＢＰ過剰発現プラスミド（配列番号２）をもたらした。インキュベーションを３７℃および７５０ｒｐｍ（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で２．２５時間行い、７４℃で１５分間不活性化し、１％アガロースゲルを介して分離し、Ｐｒｏｍｅｇａ製の「Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ」を用いてユーザマニュアルに従って所望の切断断片を抽出した。熱感受性アルカリホスファターゼを、ｐＥＴ－２８ａ（＋）標的ベクターの消化のためにのみ使用したが、ＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡ（ＪＲＡＵｐ９６９Ｄ１０２０Ｄ）の消化のためには使用しなかった。大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｐＥＴ－２８ａ（＋）ＣＲＡＬＢＰ過剰発現プラスミド（配列番号２）で形質転換し、３０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含む１２０ｍＬのＬＢ培地で３７℃にて一晩撹拌培養した。一晩培養物を使用して、６ＬのＬＢ培地（３０ｍｇ／ｍＬカナマイシン）に接種した。培養物を２０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させ、次いで、１ｍＭイソプロピル－チオガラクトピラノシドで１６時間誘導した。細胞を５０００ｇで４５分間の遠心分離によって回収し、２５０ｍＬの氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１％ ｗｔ／ｖｏｌトリトンＸ－１００）に再懸濁した。細胞を２０分間の超音波処理によって破壊し、ヒト野生型ＣＲＡＬＰＢ（配列番号３）を含む溶解物を２０，０００ｇで３５分間遠心分離して破片を除去した。
【0106】
例２
ジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのクローニングおよび発現
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットに記載される説明書に従って、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ＣＲＡＬＢＰ過剰発現プラスミド（配列番号２）における部位特異的突然変異誘発によって、点突然変異を連続的に導入した。対応するプライマー配列、ＰＣＲ反応混合物、およびジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃを生成するために使用した温度プロトコルを、それぞれ表１および表２に示す。したがって、表１では、突然変異の位置は下線付きブロックによって特定される。Ｔ２５０Ｃの場合、点突然変異は新規制限部位の形成に直接つながる。Ａ２１２Ｃ点突然変異の場合、追加のサイレント突然変異を導入した（下線および筆記体を参照）。
ジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのクローニングおよび発現
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットに記載される説明書に従って、ｐＥＴ－２８ａ（＋）ＣＲＡＬＢＰ過剰発現プラスミド（配列番号２）における部位特異的突然変異誘発によって、点突然変異を連続的に導入した。対応するプライマー配列、ＰＣＲ反応混合物、およびジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃを生成するために使用した温度プロトコルを、それぞれ表１および表２に示す。したがって、表１では、突然変異の位置は下線付きブロックによって特定される。Ｔ２５０Ｃの場合、点突然変異は新規制限部位の形成に直接つながる。Ａ２１２Ｃ点突然変異の場合、追加のサイレント突然変異を導入した（下線および筆記体を参照）。
【表1】
【表2】
【0107】
したがって、配列番号２のヌクレオチド配列を部位特異的ＰＣＲにおける出発鋳型として使用した。逐次ＰＣＲ反応の後、ジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのアミノ酸配列番号９をコードする配列番号８の得られたヌクレオチド配列を得た。
【0108】
したがって、ＰＣＲ反応後、２μｌのＤｐｎＩ制限酵素を反応混合物に添加し、試料を３７℃で２時間インキュベートした。この後、１０μｌの反応混合物をコンピテント大腸菌ＸＬ１０Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に直接形質転換した。形質転換およびプレーティング後に得られたクローンを、分析的制限消化によって新たに導入された制限部位の存在についてチェックした。両方の制限部位を含有するクローンを、配列番号８のジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ過剰発現プラスミドを単離するために使用した。プラスミドにおけるＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ点突然変異の存在を配列決定によって確認した（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｂａｌｇａｃｈ）。
【0109】
配列番号８のジ－シス突然変異ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ過剰発現プラスミドで形質転換され、それを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、３０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１２０ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で一晩撹拌しながら培養した。一晩培養物を使用して、６ＬのＬＢ培地（３０ｍｇ／ｍＬカナマイシン）に接種した。培養物を２０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させ、次いで、１ｍＭイソプロピル－チオガラクトピラノシドで１６時間誘導した。細胞を５０００ｇで４５分間の遠心分離によって回収し、２５０ｍＬの氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１％ ｗｔ／ｖｏｌトリトンＸ－１００）に再懸濁した。細胞を２０分間の超音波処理によって破壊し、配列番号９のジ－シス突然変異ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃを含む溶解物を２０，０００ｇで３５分間遠心分離して破片を除去した。
【0110】
例３
ＣＲＡＬＢＰのインシリコ突然変異誘発
上記ジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ（配列番号９）以外の、ＣＲＡＬＢＰにおける可能性として安定化するジスルフィド架橋を同定するために、インシリコシステイン突然変異誘発を行った。このために、１１－シス－レチナールが結合した野生型ＣＲＡＬＢＰのＸ線構造モデルから切断モデルを作成した（ＰＤＢエントリ３ＨＹ５）。野生型ＣＲＡＬＢＰの２つの配列領域（配列番号３）、すなわち配列番号３のアミノ酸残基２０４～２２９）および配列番号３のアミノ酸残基２４４～２６１を、元のモデルを編集することによって定義した。システイン修飾を、ＦｏｌｄＸ Ｖ５コンピュータアルゴリズム（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１；３３：Ｗ３８２－８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ３８７）を使用して両鎖に体系的に導入した。アルゴリズムを使用して、野生型ＣＲＡＬＢＰの切断モデルを２９８Ｋ、ｐＨ７、０．１Ｍのイオン強度で最小化して、インシリコ参照構造（「参照－ＷＴ」）を生成した。それ自体の確率ベースの回転異性体ライブラリを実装するＦｏｌｄＸ Ｖ５「ＢｕｉｌｄＭｏｄｅｌ」コマンドを使用して、ジ－シス突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃを含むモデルを含有する１、２または３対のシステイン突然変異を含む８つのＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質をインシリコで作製した。表３は、前記同定されたＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質ならびにそれらのアミノ酸および核酸配列を列挙している。
ＣＲＡＬＢＰのインシリコ突然変異誘発
上記ジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ（配列番号９）以外の、ＣＲＡＬＢＰにおける可能性として安定化するジスルフィド架橋を同定するために、インシリコシステイン突然変異誘発を行った。このために、１１－シス－レチナールが結合した野生型ＣＲＡＬＢＰのＸ線構造モデルから切断モデルを作成した（ＰＤＢエントリ３ＨＹ５）。野生型ＣＲＡＬＢＰの２つの配列領域（配列番号３）、すなわち配列番号３のアミノ酸残基２０４～２２９）および配列番号３のアミノ酸残基２４４～２６１を、元のモデルを編集することによって定義した。システイン修飾を、ＦｏｌｄＸ Ｖ５コンピュータアルゴリズム（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１；３３：Ｗ３８２－８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ３８７）を使用して両鎖に体系的に導入した。アルゴリズムを使用して、野生型ＣＲＡＬＢＰの切断モデルを２９８Ｋ、ｐＨ７、０．１Ｍのイオン強度で最小化して、インシリコ参照構造（「参照－ＷＴ」）を生成した。それ自体の確率ベースの回転異性体ライブラリを実装するＦｏｌｄＸ Ｖ５「ＢｕｉｌｄＭｏｄｅｌ」コマンドを使用して、ジ－シス突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃを含むモデルを含有する１、２または３対のシステイン突然変異を含む８つのＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質をインシリコで作製した。表３は、前記同定されたＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質ならびにそれらのアミノ酸および核酸配列を列挙している。
【表3】
【0111】
ＦｏｌｄＸからの突然変異モデルを、それぞれ単純なモデル摂動および柔軟な骨格モデリングのためにｐｈｅｎｉｘ．ｄｙｎａｍｉｃ（Ａｄａｍｓ Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６（Ｐｔ ２）：２１３－２１）に供することにより、モデルを脱バイアスし、同時にジスルフィド結合を形成した。分子動力学計算を、それぞれ０．００５ｆｓの２００回反復で、３００Ｋで行い、結合形成の最大閾値を３．１Åに設定した。続いて、界面の自由エネルギーの変化をＥＭＢＬ ＰＩＳＡサーバー１７で評価した。可動ゲート（配列番号３の残基２０４～２２９および配列番号３の残基２４４～２６１）の２つの層の間の界面の形成時の溶媒和自由エネルギー利得を、ΔｉＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）として計算した。参照として野生型ＣＲＡＬＢＰ（配列番号３）を含む記載された本発明のＣＲＡＬＢＰ突然変異体についての計算のまとめを表４に示す。
【表4】
【0112】
表面Å２は、溶媒がアクセス可能な総表面領域（平方オングストローム）であり、界面領域（Å２）は、分離構造と界面構造のアクセス可能な総表面領域の差を２で割ったものである。ΔｉＧは、界面形成時の溶媒和自由エネルギー利得をｋｃａｌ／ｍｏｌで示す。－１１．２ｋｃａｌ／ｍｏｌの参照値よりも負であると報告されているΔｉＧ値はいずれも、野生型ＣＲＡＬＢＰと比較して、対応する突然変異体のさらなる安定化をもたらすと考えられる。
【0113】
図２は、形成されたジスルフィド結合の位置が棒として強調された、ＣＲＡＬＢＰの４つの記載されたモノジ－システイン突然変異体の可動ゲート領域のインシリコモデルの拡大図を個別に示し、一方、図３では、形成されたジスルフィド結合の位置が棒として強調された、ＣＲＡＬＢＰの３つの二重および三重ジ－システイン突然変異体のそれぞれの可動ゲート領域のインシリコモデルの拡大図が示されている。ＣＲＡＬＢＰの可動ゲートを横切る４つの可能な記載されたジスルフィド結合を示す全てのインシリコジ－システイン突然変異体モデルの重ね合わせを図４に示す。
【0114】
例４
インシリコで生成されたジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体のクローニングおよび発現
さらに同定されたジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体の核酸配列ならびにアミノ酸配列を表３に記載する。対応する突然変異ＲＬＢＰ１遺伝子配列のクローニングおよび対応するジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の発現は、例１および２に記載されているのと同様に行われる。これらのさらに同定されたジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体の精製は、以下の例５に記載されるように行われる。
インシリコで生成されたジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体のクローニングおよび発現
さらに同定されたジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体の核酸配列ならびにアミノ酸配列を表３に記載する。対応する突然変異ＲＬＢＰ１遺伝子配列のクローニングおよび対応するジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異タンパク質の発現は、例１および２に記載されているのと同様に行われる。これらのさらに同定されたジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体の精製は、以下の例５に記載されるように行われる。
【0115】
例５
ジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体の精製
例２で得られた配列番号９のジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃを含む溶解物を、製造業者の指示に従って１０ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ ＳＵＰＥＲＦＬＯＷ（Ｑｉａｇｅｎ）でのアフィニティークロマトグラフィによって上清から精製した。簡単に説明すると、溶解物を、予め溶解緩衝液で平衡化したカラムにロードし、溶解緩衝液で洗浄し、３５ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２００ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって判断し、比色ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して決定したところ、典型的な収率は、３５～４０ｍｇの純粋なジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃであった。
ジ－シスＣＲＡＬＢＰ突然変異体の精製
例２で得られた配列番号９のジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃを含む溶解物を、製造業者の指示に従って１０ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ ＳＵＰＥＲＦＬＯＷ（Ｑｉａｇｅｎ）でのアフィニティークロマトグラフィによって上清から精製した。簡単に説明すると、溶解物を、予め溶解緩衝液で平衡化したカラムにロードし、溶解緩衝液で洗浄し、３５ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２００ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって判断し、比色ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して決定したところ、典型的な収率は、３５～４０ｍｇの純粋なジ－シス突然変異体ＣＲＡＬＢＰ Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃであった。
【0116】
例６
リガンドのローディングおよびゲル浸透クロマトグラフィ
シス－レチナールを含む全ての手順は、指定されない限り、４℃で暗赤色照明（４０Ｗルビー電球）下で行った。親和性精製野生型ＣＲＡＬＢＰおよびＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのリガンドのローディングを、エタノールに溶解した９－シス－レチナールまたは１１－シス－レチナールストック（４０ｍＭ）のアリコートを１．５モル過剰および２％ｖｏｌ／ｖｏｌの最終エタノール濃度でタンパク質溶液に添加することによって、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２００ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で行った。試料を４℃で３０分間インキュベートし、次いで、１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。試料をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて３０～５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質に濃縮し、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。最後に、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）によってリガンド複合体から未結合レチノイドを除去した。
リガンドのローディングおよびゲル浸透クロマトグラフィ
シス－レチナールを含む全ての手順は、指定されない限り、４℃で暗赤色照明（４０Ｗルビー電球）下で行った。親和性精製野生型ＣＲＡＬＢＰおよびＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのリガンドのローディングを、エタノールに溶解した９－シス－レチナールまたは１１－シス－レチナールストック（４０ｍＭ）のアリコートを１．５モル過剰および２％ｖｏｌ／ｖｏｌの最終エタノール濃度でタンパク質溶液に添加することによって、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２００ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で行った。試料を４℃で３０分間インキュベートし、次いで、１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。試料をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて３０～５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質に濃縮し、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。最後に、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）によってリガンド複合体から未結合レチノイドを除去した。
【0117】
例７
ＣＲＡＬＢＰのジ－シス突然変異体のゲル濾過クロマトグラフィ
ＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのタンパク質シス－レチナール複合体の精製を、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ ２６／６０カラムで行った。総溶出体積は３３０ｍｌであり、画分を５ｍｌ間隔で収集した。分取ゲル濾過は、野生型ＣＲＡＬＢＰのシス－レチナール複合体と本質的に同じクロマトグラムを明らかにする。
ＣＲＡＬＢＰのジ－シス突然変異体のゲル濾過クロマトグラフィ
ＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのタンパク質シス－レチナール複合体の精製を、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ ２６／６０カラムで行った。総溶出体積は３３０ｍｌであり、画分を５ｍｌ間隔で収集した。分取ゲル濾過は、野生型ＣＲＡＬＢＰのシス－レチナール複合体と本質的に同じクロマトグラムを明らかにする。
【0118】
ここでも、ＣＲＡＬＢＰのアポジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃにシス－レチナールをロードすると、同様の溶出体積を有する４つの有意なピークが観察され得る。図５は、前記４つのピークを特徴とする２８０ｎｍでの典型的なＵＶ／Ｖｉｓ吸収トレースを示す。ピークの順序は以下の通りである：左から右へ、第１のピークは超高分子量（ＳＨＭＷ）画分に対応し、第２のピークは高分子量（ＨＭＷ）画分に対応し、第３のピークはダイマーに対応し、第４のピークはモノマー画分にそれぞれ対応する。９－シスレチナールとの複合体におけるモノマー野生型ＣＲＡＬＢＰおよびＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ突然変異体のＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルを使用して、モノマー複合体のリガンドのローディングを決定した。これのために、吸収スペクトルは、約２８０ｎｍでのタンパク質の最大吸収に対して正規化した。Ｃｒａｂｂら（Ｃｒａｂｂ ＪＷ．ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７（３）：７４６－５７）によれば、２８０ｎｍでの吸収最大値はタンパク質濃度に対応し、４００ｎｍでの吸収最大値は結合した９－シスレチナールに対応した。９－シスレチナールとの複合体における完全飽和ＣＲＡＬＢＰは、ε２８０／ε４００＝２．２の理想的なスペクトル比を有することが後に報告されている。本発明者らの実験では、野生型ＣＲＡＬＢＰ：９－シスレチナールおよびＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ：９－シスレチナール突然変異体の比は、それぞれ２．３１および２．２１であり、完全飽和１：１複合体の形成を示している（図６を参照）。
【0119】
各ピーク下のプール画分の分析用ＧＦＣを濃縮し（約４ｍｇ／ｍｌ）、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムで特性評価した。図７は、２８０ｎｍでのＳＨＭＷ、ＨＭＷおよびモノマー分析用ＧＦＣランの重ねられたトレースを示す。
【0120】
例８
酸化条件下でのＣＲＡＬＢＰのジ－シス突然変異体のゲル濾過クロマトグラフィ
酸化条件下でのＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのタンパク質シス－レチナール複合体の精製を、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＧＳＳＧ、ｐＨ７．５）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ ２６／６０カラムで行った。総溶出体積は３３０ｍｌであり、画分を５ｍｌ間隔で収集した。分取ゲル濾過により、ＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃの還元シス－レチナール複合体または野生型ＣＲＡＬＢＰのシス－レチナール複合体を使用した場合、本質的に同一のクロマトグラムが明らかになった（例７、図５～図７を参照）。酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）をゲル濾過クロマトグラフィ中に使用して、対応する還元複合体と比較して結合したシス－レチナールの光保護が約２０倍増加した酸化ジ－システインＣＲＡＬＢＰ／シス－レチナール複合体をその場で生成する（図８参照）。
酸化条件下でのＣＲＡＬＢＰのジ－シス突然変異体のゲル濾過クロマトグラフィ
酸化条件下でのＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃのタンパク質シス－レチナール複合体の精製を、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＧＳＳＧ、ｐＨ７．５）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ ２６／６０カラムで行った。総溶出体積は３３０ｍｌであり、画分を５ｍｌ間隔で収集した。分取ゲル濾過により、ＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃの還元シス－レチナール複合体または野生型ＣＲＡＬＢＰのシス－レチナール複合体を使用した場合、本質的に同一のクロマトグラムが明らかになった（例７、図５～図７を参照）。酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）をゲル濾過クロマトグラフィ中に使用して、対応する還元複合体と比較して結合したシス－レチナールの光保護が約２０倍増加した酸化ジ－システインＣＲＡＬＢＰ／シス－レチナール複合体をその場で生成する（図８参照）。
【0121】
例９
光異性化アッセイ
シス－レチナールおよび野生型ＣＲＡＬＢＰまたはＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃとのその複合体の光異性化アッセイを、本質的にＳａａｒｉ（Ｓａａｒｉ ＪＣ ａｎｄ Ｂｒｅｄｂｅｒｇ ＤＬ，（１９７８），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２（１６）：７６１８－２２）によって記載されるように行った。このために、ゲル浸透クロマトグラフィで精製したリガンド複合体を（ＧＦＣ）緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で２６μＭに希釈し、等モル量のＢＳＡを添加して、光によって誘導される遊離全ｔｒａｎｓ－レチナールの形成によるタンパク質沈殿を回避した。試料を、１００Ｗの昼光バルブを用いて、暗室において室温で３８０ルクスの照度（Ｖｏｌｔｃｒａｆｔ ＭＳ－１３００ Ｌｕｘｍｅｔｅｒ）に曝露した。同時に、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを、ＥｖｏｌｕｔｉｏｎアレイＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合計３６００秒間、１８０秒ごとに収集した。酸化突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃまたは野生型ＣＲＡＬＢＰの光異性化実験のために、５ｍＭ酸化グルタチオンを予め形成された複合体に添加し、混合物を４℃で一晩維持した。繰り返しの還元のために、まず、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して試料を体積の１０分の１に３回濃縮し、続いて緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で元の体積に再希釈することによって、酸化グルタチオンを試料から除去した。次いで、洗浄した試料を５ｍＭ ＤＴＴを添加することによって還元し、４℃で１時間保持した。図９から分かるように、酸化状態の移動ゲートの閉塞があり、光異性化速度が少なくとも１０倍遅くなった。５ｍＭ ＤＴＴ中の試料の反復還元は、アッセイによって捕捉されたタンパク質の野生型様の挙動を再確立した。したがって、Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ二重突然変異の導入は、ＣＲＡＬＢＰの可動ゲート機能の可逆的なオンおよびオフを可能にするヒトＣＲＡＬＢＰへの操作された酸化還元感受性オン－オフスイッチを表す。２つの突然変異は、ＣＲＡＬＢＰの可動ゲート界面の隣接位置に位置し、酸化条件下で分子内ジスルフィド結合の形成を可能にし、還元条件下でゲートの天然の機能性を回復させる。したがって、Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ：１１－シス－レチナール複合体の酸化状態の光異性化アッセイは、結合した１１シス－レチナールの光保護の増加を明らかにするが、還元状態はＣＲＡＬＢＰの天然のインビトロ光感受性を回復させる。
光異性化アッセイ
シス－レチナールおよび野生型ＣＲＡＬＢＰまたはＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃとのその複合体の光異性化アッセイを、本質的にＳａａｒｉ（Ｓａａｒｉ ＪＣ ａｎｄ Ｂｒｅｄｂｅｒｇ ＤＬ，（１９７８），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２（１６）：７６１８－２２）によって記載されるように行った。このために、ゲル浸透クロマトグラフィで精製したリガンド複合体を（ＧＦＣ）緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で２６μＭに希釈し、等モル量のＢＳＡを添加して、光によって誘導される遊離全ｔｒａｎｓ－レチナールの形成によるタンパク質沈殿を回避した。試料を、１００Ｗの昼光バルブを用いて、暗室において室温で３８０ルクスの照度（Ｖｏｌｔｃｒａｆｔ ＭＳ－１３００ Ｌｕｘｍｅｔｅｒ）に曝露した。同時に、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを、ＥｖｏｌｕｔｉｏｎアレイＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合計３６００秒間、１８０秒ごとに収集した。酸化突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃまたは野生型ＣＲＡＬＢＰの光異性化実験のために、５ｍＭ酸化グルタチオンを予め形成された複合体に添加し、混合物を４℃で一晩維持した。繰り返しの還元のために、まず、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して試料を体積の１０分の１に３回濃縮し、続いて緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で元の体積に再希釈することによって、酸化グルタチオンを試料から除去した。次いで、洗浄した試料を５ｍＭ ＤＴＴを添加することによって還元し、４℃で１時間保持した。図９から分かるように、酸化状態の移動ゲートの閉塞があり、光異性化速度が少なくとも１０倍遅くなった。５ｍＭ ＤＴＴ中の試料の反復還元は、アッセイによって捕捉されたタンパク質の野生型様の挙動を再確立した。したがって、Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ二重突然変異の導入は、ＣＲＡＬＢＰの可動ゲート機能の可逆的なオンおよびオフを可能にするヒトＣＲＡＬＢＰへの操作された酸化還元感受性オン－オフスイッチを表す。２つの突然変異は、ＣＲＡＬＢＰの可動ゲート界面の隣接位置に位置し、酸化条件下で分子内ジスルフィド結合の形成を可能にし、還元条件下でゲートの天然の機能性を回復させる。したがって、Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ：１１－シス－レチナール複合体の酸化状態の光異性化アッセイは、結合した１１シス－レチナールの光保護の増加を明らかにするが、還元状態はＣＲＡＬＢＰの天然のインビトロ光感受性を回復させる。
【0122】
例１０
ＣＲＡＬＢＰのジ－シス突然変異体のネイティブｐａｇｅ
４～１６％ポリアクリルアミドゲル上のシス－レチナールとの複合体におけるＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体のネイティブＰＡＧＥは、シス－レチナールとの複合体における野生型ＣＲＡＬＢＰと同様のバンドを明らかにした。分取ＧＦＣの後、ジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ ＣＲＡＬＰＢ試料のネイティブＰＡＧＥは、野生型ＣＲＡＬＢＰの場合と同様に、ピーク１、２、３および４に由来する画分について同じタンパク質バンドパターンを示した。図１０に示すように、ピーク１およびその右側肩（Ｐ１およびＰ１．２）からの画分５、６、７、および８を含むレーンは、７２０ｋＤａの分子量で始まり、１０４８ｋＤａを超える範囲の連続タンパク質バンドを明らかにした。これらのバンドは、本発明者らが超高分子量（ＳＨＭＷ）と呼ぶＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ ＣＲＡＬＢＰオリゴマー複合体クラスを表す。これに続く、より小さいＣＲＡＬＢＰオリゴマー複合体画分のレーンは、高分子量ＣＲＡＬＢＰ（ＨＭＷ）と呼ばれる。これらは、第２のピーク（Ｐ２）、画分１２および１３の試料を含み、それぞれ２４２ｋＤａ～７２０ｋＤａの分子量を有する連続バンドを特徴とする。
ＣＲＡＬＢＰのジ－シス突然変異体のネイティブｐａｇｅ
４～１６％ポリアクリルアミドゲル上のシス－レチナールとの複合体におけるＣＲＡＬＢＰのジ－システイン突然変異体のネイティブＰＡＧＥは、シス－レチナールとの複合体における野生型ＣＲＡＬＢＰと同様のバンドを明らかにした。分取ＧＦＣの後、ジ－システイン突然変異体Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ ＣＲＡＬＰＢ試料のネイティブＰＡＧＥは、野生型ＣＲＡＬＢＰの場合と同様に、ピーク１、２、３および４に由来する画分について同じタンパク質バンドパターンを示した。図１０に示すように、ピーク１およびその右側肩（Ｐ１およびＰ１．２）からの画分５、６、７、および８を含むレーンは、７２０ｋＤａの分子量で始まり、１０４８ｋＤａを超える範囲の連続タンパク質バンドを明らかにした。これらのバンドは、本発明者らが超高分子量（ＳＨＭＷ）と呼ぶＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ ＣＲＡＬＢＰオリゴマー複合体クラスを表す。これに続く、より小さいＣＲＡＬＢＰオリゴマー複合体画分のレーンは、高分子量ＣＲＡＬＢＰ（ＨＭＷ）と呼ばれる。これらは、第２のピーク（Ｐ２）、画分１２および１３の試料を含み、それぞれ２４２ｋＤａ～７２０ｋＤａの分子量を有する連続バンドを特徴とする。
【0123】
例１１
動的光散乱による本発明の複合体の特性評価
分析用ＧＦＣによって特性評価された分取用ＧＦＣに由来する同じ画分も、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｓ（登録商標）で動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。表５にまとめた設定に従って各ＤＬＳ実験を行い、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアの自動最適化に従って、測定ごとの実行時間および実行回数を設定した。
動的光散乱による本発明の複合体の特性評価
分析用ＧＦＣによって特性評価された分取用ＧＦＣに由来する同じ画分も、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｓ（登録商標）で動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。表５にまとめた設定に従って各ＤＬＳ実験を行い、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアの自動最適化に従って、測定ごとの実行時間および実行回数を設定した。
【表5】
【0124】
動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、ゲル濾過から得られた試料ピークが、それぞれ本発明の組成物および複合体の別個の集団を表すことを示す。ジ－システインＡ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ ＣＲＡＬＢＰと９－シス－レチナールとのモノマー複合体の直径の平均サイズ分布は６．５０±１．５０ｎｍであり、それぞれ、ダイマー複合体８．７２±２．４１ｎｍ、ＨＭＷ １３．５０±０．４７ｎｍおよびＳＨＭＷ ２８．２８±２．１３ｎｍである（図１１参照）。
【配列表フリーテキスト】
【0125】
配列表２ ＜２２３＞ｐＥＴ－２８（＋）ＣＲＡＬＢＰ
配列表４ ＜２２３＞プライマーｆｗ＿Ａ２１２Ｃ
配列表５ ＜２２３＞プライマーｒｖ＿Ａ２１２Ｃ
配列表６ ＜２２３＞プライマーｆｗ＿Ｔ２５０Ｃ
配列表７ ＜２２３＞プライマーｒｖ＿Ｔ２５０Ｃ
配列表８ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ
配列表９ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ
配列表１０ ＜２２３＞Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表１１ ＜２２３＞Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表１２ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ
配列表１３ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ
配列表１４ ＜２２３＞Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１５ ＜２２３＞Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１６ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１７ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１８ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１９ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表２０ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ－Ｔ２５０Ｃ－Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表２１ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ－Ｔ２５０Ｃ－Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表２２ ＜２２３＞２１２－２２０－２２４Ｃ：２５０－２５４－２５７Ｃ
配列表２３ ＜２２３＞２１２－２２０－２２４Ｃ：２５０－２５４－２５７Ｃ
配列表４ ＜２２３＞プライマーｆｗ＿Ａ２１２Ｃ
配列表５ ＜２２３＞プライマーｒｖ＿Ａ２１２Ｃ
配列表６ ＜２２３＞プライマーｆｗ＿Ｔ２５０Ｃ
配列表７ ＜２２３＞プライマーｒｖ＿Ｔ２５０Ｃ
配列表８ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ
配列表９ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ
配列表１０ ＜２２３＞Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表１１ ＜２２３＞Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表１２ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ
配列表１３ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ
配列表１４ ＜２２３＞Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１５ ＜２２３＞Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１６ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１７ ＜２２３＞Ｌ２２０Ｃ：Ｖ２５４Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１８ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表１９ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ：Ｔ２５０Ｃ－Ｖ２２４Ｃ：Ｆ２５７Ｃ
配列表２０ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ－Ｔ２５０Ｃ－Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表２１ ＜２２３＞Ａ２１２Ｃ－Ｔ２５０Ｃ－Ｔ２１７Ｃ：Ｖ２５３Ｃ
配列表２２ ＜２２３＞２１２－２２０－２２４Ｃ：２５０－２５４－２５７Ｃ
配列表２３ ＜２２３＞２１２－２２０－２２４Ｃ：２５０－２５４－２５７Ｃ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】