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特表2024-518302ＲＡＳ誘導性再発性ネオアンチゲンに対するＴ細胞受容体およびそれらを同定するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】ＲＡＳ誘導性再発性ネオアンチゲンに対するＴ細胞受容体およびそれらを同定するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20240423BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240423BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240423BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240423BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240423BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240423BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240423BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240423BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240423BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240423BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240423BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
C12N5/0783
C12N5/10
C12Q1/02
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
A61P37/02
A61K48/00
A61K39/395 E
A61K45/00
G01N33/68
C12N15/13 ZNA
C12N15/12
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564575
(86)(22)【出願日】2022-04-29
(85)【翻訳文提出日】2023-12-20
(86)【国際出願番号】 IL2022050443
(87)【国際公開番号】W WO2022229966
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】282814
(32)【優先日】2021-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IL
(31)【優先権主張番号】63/223,114
(32)【優先日】2021-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】502379147
【氏名又は名称】イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サミュエルズ ヤルデナ
(72)【発明者】
【氏名】フリードマン ニール
(72)【発明者】
【氏名】ペリ アヴィヤー
(72)【発明者】
【氏名】グリーンスタイン エレッツ
(72)【発明者】
【氏名】アロン ミカル
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
2G045CB02
2G045DA36
2G045FB06
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QR51
4B063QS33
4B063QS40
4B063QX10
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA60
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB072
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC751
4C085AA13
4C085BB31
4C085CC22
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB43
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC75
(57)【要約】
対象の癌を治療する方法が開示される。当該方法は、対象に治療有効量のＴ細胞集団を投与することを含み、集団内のＴ細胞の少なくとも１０％が、ＴＣＲのα鎖に配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量のＴ細胞の集団を投与することを含み、前記集団内の前記Ｔ細胞の少なくとも１０％が、ＴＣＲのα鎖に配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、前記投与によって前記対象の癌を治療する、方法。
【請求項2】
対象の癌を治療する方法であって、（ａ）対象のＨＬＡプロファイルを確かめ、
（ｂ）対象によるＮＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒの発現を決定し、そして
（ｃ）前記対象がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒであると同定されたとき、治療有効量の、ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を対象に投与し、前記ＴＣＲのα鎖が配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＴＣＲのβ鎖が配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有することを含み、前記投与によって前記対象の癌を治療する、方法。
【請求項3】
対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量のＴ細胞の集団を投与することを含み、前記集団内の前記Ｔ細胞が、ＴＣＲのα鎖に配列番号２に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＣＤＲのβ鎖に配列番号１７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、前記投与によって前記対象の癌を治療する、方法。
【請求項4】
対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量のＴ細胞の集団を投与することを含み、前記集団内の前記Ｔ細胞が、ＴＣＲのα鎖に配列番号１６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＣＤＲのβ鎖に配列番号３に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、前記投与によって前記対象の癌を治療する、方法。
【請求項5】
前記集団内の前記Ｔ細胞の少なくとも１０％が、配列番号２に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＣＤＲのβ鎖に配列番号１７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記集団内の前記Ｔ細胞の少なくとも１０％が、配列番号１６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＣＤＲのβ鎖に配列番号３に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記対象内のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１アレルとの複合体において、前記ＴＣＲが、配列番号１または配列番号３４に示す配列を有するペプチドと結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｔ細胞が前記対象にとって自家性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｔ細胞が前記対象にとって非自家性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝的に修飾されたものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記癌が、メラノーマ、大腸癌、乳癌、甲状腺癌、胃癌、結腸直腸癌、白血病、膀胱癌、肺癌、卵巣癌、乳癌および前立腺癌からなる群より選ばれる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記癌がメラノーマである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記対象をチェックポイント阻害薬で治療することをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に修飾されたＴ細胞の単離集団であって、前記ＴＣＲのα鎖が配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＴＣＲのβ鎖が配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団。
【請求項16】
Ｔ細胞の単離集団であって、前記集団内のＴ細胞の少なくとも１０％がＴＣＲのα鎖に配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＴＣＲのβ鎖に配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団。
【請求項17】
Ｔ細胞の単離集団であって、前記集団内のＴ細胞がＴＣＲのα鎖に配列番号２に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＴＣＲのβ鎖に配列番号１７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団。
【請求項18】
Ｔ細胞の単離集団であって、前記集団内のＴ細胞がＴＣＲのα鎖に配列番号１６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つ前記ＴＣＲのβ鎖に配列番号３に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団。
【請求項19】
前記ＴＣＲを発現するように遺伝的に修飾されている、請求項１７または１８に記載のＴ細胞の単離集団。
【請求項20】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項１５または１６に記載のＴ細胞の単離集団。
【請求項21】
癌の治療における、請求項１５～２０のいずれか一項に記載のＴ細胞の単離集団の使用。
【請求項22】
癌免疫療法の標的となり得る再発性ＨＬＡ提示ネオアンチゲンを選択する方法であって、（ａ）複数の癌患者の腫瘍細胞内の個別のＨＬＡアレルにおける癌関連変異タンパク質の発生頻度を分析する工程と、
（ｂ）前記癌関連変異タンパク質から誘導された長さが８～１４アミノ酸のペプチドの、前記個別のＨＬＡアレルに対する結合親和性を決定する工程であって、前記ペプチドが野性型タンパク質と比べて変異した部分を含み、
第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して、第１の所定レベルを超える親和性をもって結合する候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択し、
（ｃ）前記候補ペプチドが、抗原提示細胞内のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において前記ＨＬＡアレルによって提示されたことを立証する工程と、
（ｄ）立証された前記ペプチドが、腫瘍細胞内の前記ＨＬＡアレルによって提示されていることを確認する工程と
を含む、方法。
【請求項23】
前記決定が、予測アルゴリズムを用いて前記結合親和性を予測することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記予測アルゴリズムがＮｅｔＭＨＣｐａｎを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記確認を、標的化質量分析を用いて実施する、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
前記ＨＬＡがＨＬＡクラスＩを含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記複数の患者が、少なくとも１種の癌療法に耐性である患者を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項28】
前記工程（ｃ）の前に、前記癌関連変異タンパク質を内包する腫瘍細胞の割合分析する工程をさらに含み、第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して、第１の所定レベルを超える親和性をもって結合し、且つ所定レベルを超える割合の腫瘍細胞に内包された候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択する、請求項２２に記載の方法。
【請求項29】
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系が、２５～２７アミノ酸または４５～４７アミノ酸の伸長ペプチドを発現することを含み、前記伸長ペプチドが癌関連変異タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項30】
前記抗原提示細胞がＢ細胞を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項31】
前記癌関連変異タンパク質がＲＡＳファミリーのメンバーである、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記メンバーが、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳおよびＨＲＡＳからなる群より選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記メンバーがＮＲＡＳである、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
前記癌関連変異タンパク質がＲＡＦキナーゼである、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＲＡＦキナーゼがＢ－ＲＡＦである、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記癌患者が、メラノーマ患者、甲状腺癌患者、褐色細胞腫患者、セミノーマ患者、胃底腺型胃癌患者、胆管癌患者、膵臓腺癌患者、結腸直腸腺癌、白血病患者、膀胱尿路上皮癌患者、子宮内膜癌患者、胸腺上皮性腫瘍患者、非小細胞肺癌患者、肉腫患者、卵巣癌患者および前立腺癌患者を含む、請求項２２～３５のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２２３，１１４号および２０２１年４月２９日に出願されたイスラエル国特許出願第２８２８１４号の優先権を主張し、その内容のすべてを本参照により本願に援用する。
本出願は、２０２１年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２２３，１１４号および２０２１年４月２９日に出願されたイスラエル国特許出願第２８２８１４号の優先権を主張し、その内容のすべてを本参照により本願に援用する。
【0002】
配列表に関する陳述
本出願の出願と同時に提出された、２０２２年４月２６日付作成の「９１６５１ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題された９，２１７バイトのＡＳＣＩＩファイルを本参照により本願に援用する。
本出願の出願と同時に提出された、２０２２年４月２６日付作成の「９１６５１ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題された９，２１７バイトのＡＳＣＩＩファイルを本参照により本願に援用する。
【0003】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、再発性変異ネオペプチド、より詳細にはＲａｓ誘導変異ネオペプチド、に結合するＴ細胞受容体の同定に関する。
【背景技術】
【0004】
免疫療法は、転移性癌の長期腫瘍退縮を誘導するその優れた能力故に、近年の癌研究に新しい希望をもたらした。この特徴は、チェックポイント遮断およびＴＩＬの養子細胞移植（ＡＣＴ）の両方を含む免疫療法モダリティ間で共通する。上記２種の治療の最終共通経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球による腫瘍抗原の特異的認識であると信じられている。具体的には、シーケンシング技術の発展に伴い、免疫療法の成功例の徹底解剖から、抗腫瘍免疫応答の仲介における、ネオアンチゲンと呼ばれる変異誘導抗原の重要な役割が明らかとなった。
【0005】
ネオアンチゲンとは、細胞表面ペプチド／ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体であって、ペプチド成分、即ち、ネオペプチドが、変異タンパク質の変化した分解産物であるものである。患部組織において発現が制限され、免疫寛容によって抑制されないネオアンチゲンは、ＴＣＲエンゲージメントの際に特異的な抗腫瘍反応性を惹起することがあり、故に、治療用標的として理想的である。
【0006】
治療した患者から同定されたネオアンチゲンのほとんどが、特有な、非再発性の変異から誘導されたものであり、それ故に、効果的であっても、個別の患者を超えて一般化することはできない。ホットスポットのネオアンチゲン、即ち、癌患者の大きな群に出現するネオアンチゲンは、再発性発癌性変異と一般的なＨＬＡアレルとの交差点においてのみ明確に形成される。このようなネオアンチゲンは、２つの主たる理由により強く求められている。第１に、ホットスポットネオアンチゲンは、「既成の」細胞治療、ワクチンおよび患者スクリーニング手法への道を形成し得る。立証済みの変異／ＨＬＡ組み合わせを発現する腫瘍細胞には、免疫療法を施すことができるはずである。先験的な免疫認識が不在であっても、他の患者のみならず、健常なドナーまでもから予め決定したＴＣＲは、無視されたホットスポットネオアンチゲンに対して自家性Ｔ細胞を再度向かわせるために使用することができる。加えて、治療前には検出不可能であったネオアンチゲン特異的Ｔ細胞は、変異に基づくワクチンに続いて有意に増殖することが示されている。第２に、ホットスポットネオアンチゲンは、治療用標的として個体のネオアンチゲンよりも潜在的に優れている。これは、ヘテロ接合性の腫瘍の副クローン性変異に対する免疫療法が、免疫逃避の道を提供する可能性がある一方、クローン性発癌性変異から誘導したホットスポットネオアンチゲンは、腫瘍内でより均一に存在することが期待されている。
【0007】
過去数年で見いだされたホットスポットネオアンチゲンは、主たる癌遺伝子（例えば、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳおよびｐ５３）を元とするものである。しかしながら、このようなネオアンチゲンの臨床的有用性は、新たに発見されたＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２／ＫＲＡＳ．Ｇ１２Ｄホットスポットネオアンチゲンに対する自家性ＴＩＬを用いたＡＣＴ治療の、転移性大腸癌の患者における成功を通じて直接示された。これら最近の成功例は、ホットスポットネオアンチゲンを発見するための探求の再興を促進した。ｐ５３を中止とするスクリーニングは、誘導したネオアンチゲンに対する本来のＴＩＬ反応性をスクリーニングした患者の８％で明らかとし、その全症例においてホットスポットネオアンチゲンが提示されていた。他の試みは、患者または健常ドナーの末梢血から特定のホットスポットを標的とするＴ細胞を同定して、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの両方に対する公知のＫＲＡＳおよび他の癌遺伝子誘導ネオアンチゲンのレパートリーを拡大することに集中していた。
【0008】
今日まで、ネオアンチゲンを発見する試みはほとんど全てがＴ細胞を中心とするものであった。これらの方法において、候補ネオペプチドは、パルスされた合成ペプチドとして、またはミニジーンの過剰発現を介した、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって人工的に発現されるものである。ＡＰＣは次にＴ細胞、最も一般的にはＴＩＬ、と共インキュベートされ、ネオアンチゲンの間接的な道程のためにそれらの応答プロファイルが解釈される。さらなる特徴付けおよび立証はｉｎ ｓｉｌｉｃｏの結合予測に大きく依存し、そのため同定されたネオアンチゲンは、結合すると予測され、且つ試験した患者で免疫原性である者に限定される。加えて、腫瘍の進化において提示されたレパートリーから編集した無関係のネオアンチゲンは、一度でも免疫原性であるかぎり、いずれにせよ同定される。
【0009】
ＲＡＳタンパク質の因果的な役割は、全ヒト癌の三分の一に見られる活性化変異によって長い間認識されていた。３種の主たるアイソフォームであるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳおよびＨＲＡＳには、同一の８６－アミノ酸長のＮ末端が共通する。この同一な伸長鎖内には３種の変異ホットスポットが、１２位、１３位および６１位に認識された。汎癌であるＫＲＡＳは最も高度に変異したＲＡＳアイソフォームである（ＲＡＳ変異の８５％）。しかしながら、メラノーマにおいては、今日までに最も成功した免疫療法標的であるＮＲＡＳ変異が優性である。特にＮＲＡＳ．６１は、メラノーマにおいて２番目に高度に変異した部位であり、患者の２０％にも出願する。ＮＲＡＳ変異体メラノーマは、非ＮＲＡＳ変異体メラノーマと比べて、より少ない結果を示す。ＲＡＳ標的療法を開発する複数の試みが未だ効果的ではなく、特にＮＲＡＳ変異体メラノーマに対する承認済み療法、は得られていない。
【0010】
背景技術には以下が含まれる。
国際公開第２０２０／２３４８７５号号、国際公開第２０２０／０３７３０２号、国際公開第２０１９／０７５１１２号、国際公開第２０２０／１８０６４８号、国際公開第２０１９／２２６９３９号、国際公開第２０１９／１６８９８４号、国際公開第２０１９／２２６９４１号、国際公開第２０１９／１３３８５３号、国際公開第２０１９／０３６６８８号、国際公開第２０１８／２２７０３０号、国際公開第２０１９／０５０９９４号、国際公開第２０１８／２０８８５６号、国際公開第２０１８／１９５３５７号、国際公開第２０１８／０９８３６２号、国際公開第２０１９／１０４２０３および国際公開第２０１７／１０６６３８号。
国際公開第２０２０／２３４８７５号号、国際公開第２０２０／０３７３０２号、国際公開第２０１９／０７５１１２号、国際公開第２０２０／１８０６４８号、国際公開第２０１９／２２６９３９号、国際公開第２０１９／１６８９８４号、国際公開第２０１９／２２６９４１号、国際公開第２０１９／１３３８５３号、国際公開第２０１９／０３６６８８号、国際公開第２０１８／２２７０３０号、国際公開第２０１９／０５０９９４号、国際公開第２０１８／２０８８５６号、国際公開第２０１８／１９５３５７号、国際公開第２０１８／０９８３６２号、国際公開第２０１９／１０４２０３および国際公開第２０１７／１０６６３８号。
【発明の概要】
【0011】
本発明の一実施形態によると、対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量のＴ細胞の集団を投与することを含み、集団内のＴ細胞の少なくとも１０％が、ＴＣＲのα鎖に配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、投与によって対象の癌を治療する、方法が提供される。
【0012】
本発明の一実施形態によると、対象の癌を治療する方法であって、
（ａ）対象のＨＬＡプロファイルを確かめ、
（ｂ）対象によるＮＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒの発現を決定し、そして
（ｃ）対象がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒであると同定されたとき、治療有効量の、ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を対象に投与し、ＴＣＲのα鎖が配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＴＣＲのβ鎖が配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有することを含み、投与によって対象の癌を治療する、方法が提供される。
（ａ）対象のＨＬＡプロファイルを確かめ、
（ｂ）対象によるＮＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒの発現を決定し、そして
（ｃ）対象がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒであると同定されたとき、治療有効量の、ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を対象に投与し、ＴＣＲのα鎖が配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＴＣＲのβ鎖が配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有することを含み、投与によって対象の癌を治療する、方法が提供される。
【0013】
対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量のＴ細胞の集団を投与することを含み、集団内のＴ細胞が、ＴＣＲのα鎖に配列番号２に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号１７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、投与によって対象の癌を治療する、方法が提供される。
【0014】
本発明の一実施形態によると、対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量のＴ細胞の集団を投与することを含み、集団内のＴ細胞が、ＴＣＲのα鎖に配列番号１６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号３に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、投与によって対象の癌を治療する、方法が提供される。
【0015】
本発明の一実施形態によると、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に修飾されたＴ細胞の単離集団であって、ＴＣＲのα鎖が配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＴＣＲのβ鎖が配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団が提供される。
【0016】
本発明の一実施形態によると、Ｔ細胞の単離集団であって、集団内のＴ細胞の少なくとも１０％がＴＣＲのα鎖に配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＴＣＲのβ鎖に配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団が提供される。
【0017】
本発明の一実施形態によると、Ｔ細胞の単離集団であって、集団内のＴ細胞がＴＣＲのα鎖に配列番号２に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＴＣＲのβ鎖に配列番号１７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団が提供される。
【0018】
本発明の一実施形態によると、Ｔ細胞の単離集団であって、集団内のＴ細胞がＴＣＲのα鎖に配列番号１６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＴＣＲのβ鎖に配列番号３に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、集団が提供される。
【0019】
本発明の一実施形態によると、癌免疫療法の標的となり得る再発性ＨＬＡ提示ネオアンチゲンを選択する方法であって、
（ａ）複数の癌患者の腫瘍細胞内の個別のＨＬＡアレルにおける癌関連変異タンパク質の発生頻度を分析する工程と、
（ｂ）癌関連変異タンパク質から誘導された長さが８～１４アミノ酸のペプチドの、個別のＨＬＡアレルに対する結合親和性を決定する工程であって、ペプチドが野性型タンパク質と比べて変異した部分を含み、
第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して、第１の所定レベルを超える親和性をもって結合する候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択し、
（ｃ）候補ペプチドが、抗原提示細胞内のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系においてＨＬＡアレルによって提示されたことを立証する工程と、
（ｄ）立証されたペプチドが、腫瘍細胞内のＨＬＡアレルによって提示されていることを確認する工程と
を含む、方法が提供される。
（ａ）複数の癌患者の腫瘍細胞内の個別のＨＬＡアレルにおける癌関連変異タンパク質の発生頻度を分析する工程と、
（ｂ）癌関連変異タンパク質から誘導された長さが８～１４アミノ酸のペプチドの、個別のＨＬＡアレルに対する結合親和性を決定する工程であって、ペプチドが野性型タンパク質と比べて変異した部分を含み、
第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して、第１の所定レベルを超える親和性をもって結合する候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択し、
（ｃ）候補ペプチドが、抗原提示細胞内のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系においてＨＬＡアレルによって提示されたことを立証する工程と、
（ｄ）立証されたペプチドが、腫瘍細胞内のＨＬＡアレルによって提示されていることを確認する工程と
を含む、方法が提供される。
【0020】
本発明の実施形態によると、集団内のＴ細胞の少なくとも１０％は、配列番号２に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号１７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
【0021】
本発明の実施形態によると、集団内のＴ細胞の少なくとも１０％は、配列番号１６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号３に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
【0022】
本発明の実施形態によると、対象内のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１アレルとの複合体において、ＴＣＲは、配列番号１または配列番号３４に示す配列を有するペプチドと結合する。
【0023】
本発明の実施形態によると、Ｔ細胞は対象にとって自家性である。
【0024】
本発明の実施形態によると、Ｔ細胞は対象にとって非自家性である。
【0025】
本発明の実施形態によると、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝的に修飾されたものである。
【0026】
本発明の実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。
【0027】
本発明の実施形態によると、癌は、メラノーマ、大腸癌、乳癌、甲状腺癌、胃癌、結腸直腸癌、白血病、膀胱癌、肺癌、卵巣癌、乳癌および前立腺癌からなる群より選ばれる。
【0028】
本発明の実施形態によると、癌はメラノーマである。
【0029】
本発明の実施形態によると、方法は、対象をチェックポイント阻害薬で治療することをさらに含む。
【0030】
本発明の実施形態によると、Ｔ細胞の単離集団は、ＴＣＲを発現するように遺伝的に修飾されている。
【0031】
本発明の実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【0032】
本発明の実施形態によると、Ｔ細胞の単離集団は癌の治療用である。
【0033】
本発明の実施形態によると、決定は、予測アルゴリズムを用いて結合親和性を予測することを含む。
【0034】
本発明の実施形態によると、予測アルゴリズムはＮｅｔＭＨＣｐａｎを含む。
【0035】
本発明の実施形態によると、確認を、標的化質量分析を用いて実施する。
【0036】
本発明の実施形態によると、ＨＬＡはＨＬＡクラスＩを含む。
【0037】
本発明の実施形態によると、複数の患者は、少なくとも１種の癌療法に耐性である患者を含む。
【0038】
本発明の実施形態によると、工程（ｃ）の前に、癌関連変異タンパク質を内包する腫瘍細胞の割合分析する工程をさらに含み、第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して、第１の所定レベルを超える親和性をもって結合し、且つ所定レベルを超える割合の腫瘍細胞に内包された候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択する。
【0039】
本発明の実施形態によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系は、２５～２７アミノ酸または４５～４７アミノ酸の伸長ペプチドを発現することを含み、伸長ペプチドは癌関連変異タンパク質のアミノ酸配列を含む。
【0040】
本発明の実施形態によると、抗原提示細胞はＢ細胞を含む。
【0041】
本発明の実施形態によると、癌関連変異タンパク質はＲＡＳファミリーのメンバーである。
【0042】
本発明の実施形態によると、メンバーは、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳおよびＨＲＡＳからなる群より選ばれる。
【0043】
本発明の実施形態によると、メンバーはＮＲＡＳである。
【0044】
本発明の実施形態によると、癌関連変異タンパク質はＲＡＦキナーゼである。
【0045】
本発明の実施形態によると、ＲＡＦキナーゼはＢ－ＲＡＦである。
【0046】
本発明の実施形態によると、癌患者は、メラノーマ患者、甲状腺癌患者、褐色細胞腫患者、セミノーマ患者、胃底腺型胃癌患者、胆管癌患者、膵臓腺癌患者、結腸直腸腺癌、白血病患者、膀胱尿路上皮癌患者、子宮内膜癌患者、胸腺上皮性腫瘍患者、非小細胞肺癌患者、肉腫患者、卵巣癌患者および前立腺癌患者を含む。
【0047】
特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本願に記載のものと同様の又は均等な方法及び材料を、本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含め、本願特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本願に記載する。以下、特に図面に詳細に言及するが、示される詳細は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の例証的説明を目的とすることを強調する。この点に関して、図面を用いて説明することで、当業者には、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】図１のＡ～Ｃ： 有効な、ネオアンチゲン特異的ＴＣＲのレパートリー。健常ドナーのＴ細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したＴＣＲα鎖およびβ鎖のエレクトロポレーションを実施した。（Ａ）Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）－テトラマーで染色した細胞のフローサイトメトリープロット。陰性対照－ｍＲＮＡ無しでエレクトロポレーションした細胞（‘Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ Ｎｏｔｈｉｎｇ’，ＥＮ）（Ｂ－Ｃ）ペプチドでパルスしたＩＨＷ０１１６１細胞と一晩共インキュベートしたエレクトロポレーション済Ｔ細胞（Ｂ）ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ、１０μＭのペプチド、多重比較用テューキー補正付きの一元配置ＡＮＯＶＡ、エラーバーは生物学的な３回の繰り返しに対するＳＥＭを表す。（Ｃ）４－１ＢＢペプチド滴定アッセイ、多重比較用シダック補正付きの二元配置ＡＮＯＶＡ。
【図2】図２のＡ～Ｂ： ネオアンチゲン特異的ＴＣＲはネオアンチゲンを内在性発現する腫瘍細胞に対して反応性および細胞傷害能を伝達する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したＴＣＲα鎖およびβ鎖をエレクトロポレーションし、腫瘍誘導細胞系と共インキュベートした健常ドナー（Ｄ３）のＴ細胞。Ｔ細胞陰性対照：ｍＲＮＡ無しでエレクトロポレーションしたドナー細胞（‘Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ Ｎｏｔｈｉｎｇ’，ＥＮ）。（Ａ）一晩の１：１の共インキュベート後に活性化マーカー４－１ＢＢを発現するＴ細胞のパーセント、１０８Ｔ－Ａ＊０１：０１＋／ＮＲＡＳ野性型、ＭＭ１５０４１４－Ａ＊０１：０１－／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ、多重比較用シダック補正付きの二元配置ＡＮＯＶＡ。（Ｂ）開裂されたカスパーゼ３殺傷アッセイ：３：１のエフェクター対標的比で３－時間共インキュベートした後に開裂されたカスパーゼ３を発現する腫瘍細胞のパーセント。多重比較用テューキー補正付きの一元配置ＡＮＯＶＡ。エラーバーは、全体を通じて生物学的な３回の繰り返しに対するＳＥＭを表す。
【図3】図３のＡ～Ｆ： １７ＴＩＬレパートリーの検査は、Ｎ１３５．１：Ｎ１７．３．２、Ｎ１７．５、Ｎ１７．６およびＮ１７．７に類似した４つのＴＣＲのクラスターを明らかにする。このリストの中で最も頻繁に存在するＴＣＲであるＮ１７．３．２およびＮ１７．５は、効力があり、ネオアンチゲン特異的であると立証された。（Ａ）類似クラスターのα鎖およびβ鎖の両方が、テトラマー＋のサブ集団において富化されている。α／βペアリングは単一細胞ＴＣＲシーケンシングによって確認された。バルクＴＣＲシーケンシングの複製＃１からの代表的データ。（Ｂ）ＴＣＲの可変領域の配列比較。４アミノ酸までのレーベンシュタイン距離およびＶ／Ｊ遺伝子の類似性に着目されたい。（Ｃ）ＴＣＲを、そのα鎖（Ｘ軸）およびβ鎖（Ｙ軸）の発生確率に応じて、プロットした。Ｎ１３５．１類似クラスターを丸で囲った。ＮＨ１（ＮＲＡＳハイブリッドＴＣＲ ＃１）は類似クラスター内で最も確率の高いα／βの組み合わせであり、それはＮ１３５．１とＮ１７．５との間のチェーンスワッピング（ｃｈａｉｎ ｓｗａｐｐｉｎｇ）によって作製される。ＮＨ２はＮＨ１の相対物であり、ＮＡ１７．５とＮＢ１３５．１の混合物である。（Ｄ）ＮＨ１を作製する、ＮＡ１３５．１とＮＢ１７．５を組み合わせるチェーンスワッピングの模式図。（Ｅ－Ｆ）ＮＨ１およびＮＨ２を発現させるために、ドナー（Ｄ３）Ｔ細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したＴＣＲのα鎖およびβ鎖でエレクトロポレーションを行った。Ｔ細胞陰性対照：ｍＲＮＡ無しでエレクトロポレーションしたドナー細胞（‘Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ Ｎｏｔｈｉｎｇ’，ＥＮ）。（Ｅ）ＣＤ８およびテトラマー染色細胞のフローサイトメトリー解析。（Ｆ）野性型または変異ペプチドでパルスされたＩＨＷ０１１６１提示細胞と１：１で一晩共インキュベートした後のＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡ。ペプチドなパルス無し（ＤＭＳＯのみ）のＩＨＷ０１１６１が陰性対照となる。エラーバーは生物学的な３回の繰り返しに対するＳＥＭを表し、多重比較用テューキー補正付きの一元配置ＡＮＯＶＡ。
【発明を実施するための形態】
【0050】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、再発性変異ネオペプチドに対して結合するＴ細胞受容体に関する。
【0051】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途は、以下の発明を実施するための形態に示される詳細又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は他の実施形態が可能であり、又はさまざまな方法で実施若しくは実現することが可能である。
【0052】
免疫療法は、特にメラノーマに対して示されているように、転移性癌に対する治療可能性を有する。抗腫瘍効果は、多くの場合、ネオアンチゲン、即ち、ＨＬＡ提示変異含有ペプチド、のＴ細胞認識を媒介とする。わずかな例外を除き、反応者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）から同定されたネオアンチゲンは個人的な変異に基づくものであり、よって、患者個人を超えて一般化することができない。定義上、「再発性ネオアンチゲン」は、の定義は、患者の群間で共通するものである。自然界でこれらは、一般的なドライバー変異から誘導され、一般的なＨＬＡアレル上に存在する抗原である。加えて、ドライバー変異のクローン性故に、腫瘍および転移部位にわたって均一に存在すると予測される。故に再発性ネオアンチゲンは、効果的で腫瘍特異的な「既成」の療法の開発に役立ち得ることから、大きな臨床的価値があるべきである。
【0053】
過去には、本発明者らは、再発性変異の存在と患者ＨＬＡアロタイプの療法を考慮するバイオインフォマティクス解析と、結合予測とを組み合わせた、再発性ネオアンチゲンの同定のための新規な手法を明らかにした（国際公開第２０２０／２３４８７５号）。この手法を用いて、彼らは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋホットスポットネオアンチゲンが、数千人の患者に関連するロバストな免疫原性標的であると予測した。
【0054】
今回、本発明者らは、この手法を合理化する方法を見出し、ｉｎ ｖｉｖｏでの実証の前に潜在的候補ネオアンチゲンの数を更に絞り込むためにｉｎ ｖｉｔｒｏシステムを使用する。この工程は、上述したバイオインフォマティクス解析と結合予測解析に続き実施され、より迅速でより効率的な同定工程を可能にする。Ｉｎ ｖｉｖｏ工程は高額な試薬（例：質量スペクトル解析のために腫瘍サンプルにスパイクされたアイソトープ標識候補）を使用することもあるため、立証工程の前に潜在的候補のリストを狭めることは、方法の効率に大きな影響を与える。
【0055】
よって、本発明の第１の態様によると、癌免疫療法の標的となり得る再発性ＨＬＡ提示ネオアンチゲンを選択する方法であって、
（ａ）複数の癌患者の腫瘍細胞内の個別のＨＬＡアレルにおける癌関連変異タンパク質の発生頻度を分析する工程と、
（ｂ）癌関連変異タンパク質から誘導された長さが８～１４アミノ酸のペプチドの、個別のＨＬＡアレルに対する結合親和性を決定する工程であって、ペプチドが野性型タンパク質と比べて変異した部分を含み、
第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して、第１の所定レベルを超える親和性をもって結合する候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択し、
（ｃ）候補ペプチドが、抗原提示細胞内のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系においてＨＬＡアレルによって提示されたことを立証する工程と、
（ｄ）立証されたペプチドが、腫瘍細胞内の前記ＨＬＡアレルによって提示されていることを確認する工程と
を含む、方法が提供される。
（ａ）複数の癌患者の腫瘍細胞内の個別のＨＬＡアレルにおける癌関連変異タンパク質の発生頻度を分析する工程と、
（ｂ）癌関連変異タンパク質から誘導された長さが８～１４アミノ酸のペプチドの、個別のＨＬＡアレルに対する結合親和性を決定する工程であって、ペプチドが野性型タンパク質と比べて変異した部分を含み、
第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して、第１の所定レベルを超える親和性をもって結合する候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択し、
（ｃ）候補ペプチドが、抗原提示細胞内のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系においてＨＬＡアレルによって提示されたことを立証する工程と、
（ｄ）立証されたペプチドが、腫瘍細胞内の前記ＨＬＡアレルによって提示されていることを確認する工程と
を含む、方法が提供される。
【0056】
本明細書で使用する「ネオアンチゲン」という用語は、例えば、対応する野生型親抗原とは、腫瘍細胞における変異又は腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾により異なるものにする、少なくとも１つの変更を有するエピトープである。ネオアンチゲンは、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列を含み得る。変異は、フレームシフト若しくは非フレームシフト型のインデル（インデル）、ミスセンス若しくはナンセンス置換、スプライス部位の変更、ゲノム再編成若しくは遺伝子融合、又はネオＯＲＦを生じる、任意のゲノム若しくは発現における変更を含み得る。変異はまた、スプライスバリアントを含み得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれ得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソームにより作製されるスプライシングされた抗原を含み得る。
【0057】
一実施形態において、ネオアンチゲンは、クラスＩ又はＩＩのＭＨＣ受容体と結合して三量複合体を形成する短いペプチドであり、この三量複合体は、適当な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体を結合するのに適したＴ細胞受容体を担持しているＴ細胞によって認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的には約８～１４アミノ酸長である。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＴ細胞エピトープは、典型的には約１２～３０アミノ酸長である。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの場合、同じペプチドと、対応するＴ細胞エピトープとは共通のコア部分を共有し得るが、それぞれ、コア配列のアミノ末端の上流及びそのカルボキシ末端の下流の隣接配列の長さが異なることに起因して全長が異なり得る。Ｔ細胞エピトープは、免疫応答を引き起こす場合、抗原として分類され得る。
【0058】
ネオアンチゲンが誘導されるタンパク質は癌－関連修飾を含む。例示的な修飾としては、癌関連変異および癌関連リン酸化パターンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0059】
「変異」という用語は、参照と比べ際の核酸配列の変化または差異（ヌクレオチド置換、付加、又は欠失）である。「体性変異」は、胚細胞（精子および卵子）以外の体の任意の細胞で起こり得るため、子供に遺伝することはない。これら変化は、（常にではないが）癌または他の疾患を起こし得る。好ましくは、変異は非同義変異である。「非同義変異」という用語は、翻訳産物中のアミノ酸置換等のアミノ酸変化をもたらすことのない変異，好ましくはヌクレオチド置換を示す。
【0060】
本発明によると、「変異」という用語には、点変異、インデル、融合、クロモスリプシスおよびＲＮＡ編集が含まれる。
【0061】
特定の実施形態によると、変異は点変異、即ち、単一アミノ酸置換である。
【0062】
本発明によると、「インデル」という用語は、挿入と欠失の共存およびヌクレオチドの純増加または純損失をもたらす変異と定義される特別な変異クラスを表す。ゲノムのコード領域においては、インデルの長さが３の倍数でない限り、これらはフレームシフト変異を産生する。インデルは点変異と比較することができ、インデルが配列に対してヌクレオチドを挿入および欠失させるのに対して、点変異は１つのヌクレオチドを置き換える置換を形成する。一実施形態において、インデルはフレームシフト欠失変異である。他の実施形態において、インデルはフレームシフト挿入変異である。
【0063】
融合は、２つの以前は分離した遺伝子から形成されたハイブリッド遺伝子を作製することができる。これは転移、中間部欠損または染色体逆位の結果として生じ得る。多くの場合、融合遺伝子は癌遺伝子である。発癌性融合遺伝子は、２つの融合パートナーとは異なるまたは新しい機能を有する遺伝子産物につながる場合もある。代わりに、原癌遺伝子を強力なプロモーターと融合し、上流の融合パートナーの強力なプロモーターによって生じるアップレギュレーションによって発癌性機能が機能する用に設定する。発癌性融合転写産物は、トランススプライシングまたはリードスルー事象によって発生することもある。
【0064】
本発明によると、「クロモスリプシス」という用語は、単一の破棄的事象によってゲノムの特定の領域が破砕され、その後、縫い合わされる遺伝的現象を意味する。
【0065】
本発明によると、「ＲＮＡ編集」または「ＲＮＡの編集」という用語は、基礎的構造の化学的変化を通じてＲＮＡ分子内の情報が変更される分子過程を意味する。ＲＮＡの編集には、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）およびアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化等のヌクレオシド修飾のみならず、非鋳型ヌクレオチド付加および挿入が含まれる。ｍＲＮＡのＲＮＡ編集は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を効果的に変更するため、それはゲノムＤＮＡ配列から予測されるものとは異なる。
【0066】
好ましくは、変異は非同義変異であり、好ましくは、腫瘍または癌細胞で発現されるタンパク質の非同義変異である。
【0067】
特定の実施形態において、癌関連修飾パターンを発現するタンパク質は、メラノーマ細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞または頭頸部扁平上皮癌細胞によって発現される。
【0068】
好ましくは、癌関連修飾パターンを発現するタンパク質は、メラノーマ細胞によって発現される。
【0069】
好ましくは、癌関連修飾パターンを発現するタンパク質は、ヒトタンパク質である。
【0070】
癌関連修飾パターンを発現し得るタンパク質の例としては、ＲＡＳファミリーのメンバー、例えば、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス（Ｖ－Ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１１）、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１６）およびＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１２）、が挙げられる。
【0071】
具体的に想定されるＮＲＡＳバリアントとしては、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１ＬおよびＱ６１Ｈが挙げられる。
【0072】
癌関連の変異したタンパク質の他の例としては、ＲＡＦキナーゼ、例えば、Ｂ－ＲＡＦ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１５０５６が挙げられる。
【0073】
具体的なＢ－ＲＡＦバリアントとしては、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｍ、Ｇ４６６Ｅ、Ｈ７２５Ｙ、Ｋ６０１ＥおよびＶ６００Ｇが挙げられる。
【0074】
他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
カリクレイン４、パピローマウイルス結合因子（ＰＢＦ）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（ＨＳＤＬ１）、メソテリン、癌精巣抗原（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３、ヒト上皮成長因子受容体２／神経受容体チロシンキナーゼ（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）、癌腫関連上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、卵巣および子宮抗原（ＣＡ１２５）、葉酸受容体ａ、精子タンパク質１７、腫瘍関連差別的発現遺伝子－１２（ＴＡＤＧ－１２）、ムチン－１６（ＭＵＣ－１６）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、マンナン－ＭＵＣ－１、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ）、北九州肺癌抗原－１（ＫＫ－ＬＣ－１）、ヒト癌／精巣抗原（ＫＭ－ＨＮ－１）、癌精巣抗原（ＬＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原－Ａ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、精子表面透明帯結合タンパク質（Ｓｐ１７）、滑膜肉腫 Ｘブレークポイント４（ＳＳＸ－４）、一過性軸索糖タンパク質－１（ＴＡＧ－１）、一過性軸索糖タンパク質－２（ＴＡＧ－２）、Ｅｎａｂｌｅｄホモログ（ＥＮＡＨ）、マンモグロブリンＡ、ＮＹ－ＢＲ－１、乳癌抗原、（ＢＡＧＥ－１）、Ｂメラノーマ抗原、メラノーマ抗原－Ａ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メラノーマ抗原－Ａ２（ＭＡＧＥ－Ａ２）、ムチンｋ、滑膜肉腫 Ｘブレークポイント（ＳＳＸ－２）、タキソール耐性関連遺伝子３（ＴＲＡＧ－３）、トリ骨髄細胞腫ウイルス癌遺伝子（ｃ－ｍｙｃ）、サイクリンＢ１、ムチン１（ＭＵＣ１）、ｐ６２、サバイビン、リンパ球共通抗原（ＣＤ４５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ＷＮＴシグナル伝達経路阻害因子１（ＤＫＫ１）、テロメラーゼ、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（Ｋ－ｒａｓ），Ｇ２５０、腸管カルボキシエステラーゼ、アルファフェトタンパク質、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、カスパーゼ５（ＣＡＳＰ－５）、チトクロームＣオキシダーゼアセンブリー因子１ホモログ（ＣＯＡ－１）、Ｏ結合（３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＯＧＴ）、骨肉腫増幅９、小胞体レクチン（ＯＳ－９）、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦ－ベータＲＩＩ）、マウス白血病糖タンパク質７０（ｇｐ７０）、カルシトニン関連ポリペプチドアルファ（ＣＡＬＣＡ）、プログラム細胞死１リガンド１（ＣＤ２７４）、マウス二重微小染色体２ホモログ（ｍｄｍ－２）、アルファ－アクチン４、伸長因子２、マリック酵素１（ＭＥ１）、核転写因子ＹサブユニットＣ（ＮＦＹＣ）、Ｇ抗原１，３（ＧＡＧＥ－１，３）、メラノーマ抗原－Ａ６（ＭＡＧＥ－Ａ６）、癌精巣抗原ＸＡＧＥ－１ｂ、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原１（ＳＴＥＡＰ１）、ＰＡＰ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、線維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ５）、ヒートショックタンパク質ｈｓｐ７０－２、メラノーマ抗原－Ａ９（ＭＡＧＥ－Ａ９）、Ａｒｇ特異的ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼファミリーＣ（ＡＲＴＣ１）、Ｂ－Ｒａｆ原癌遺伝子（Ｂ－ＲＡＦ）、セリン／スレオニンキナーゼ、ベータ－カテニン、細胞分裂サイクル２７ホモログ（Ｃｄｃ２７）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、サイクリン依存性キナーゼ１２（ＣＤＫ１２）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、カゼインキナーゼ１アルファ１（ＣＳＮＫ１Ａ１）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、成長停止特異的タンパク質７（ＧＡＳ７），糖タンパク質非転移性メラノーマタンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、ＨＡＵＳオーグミン様複合体サブユニット３（ＨＡＵＳ３）、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼ、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原２（ＭＡＲＴ２）、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）、メラノーマ関連抗原（変異）１（ＭＵＭ－１－２－３）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼガンマ（ネオＰＡＰ）、ミオシンクラスＩ、タンパク質ホスファターゼ１制御サブユニット３Ｂ（ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ）、ペルオキシレドキシン５（ＰＲＤＸＳ）、受容体型チロシンタンパク質ホスファターゼカッパ（ＰＴＰＲＫ）、トランスフォーミングタンパク質Ｎ－Ｒａｓ（Ｎ－ｒａｓ）、網膜芽細胞腫関連因子６００（ＲＢＡＦ６００）、サーチュイン２（ＳＩＲＴ２）、ＳＮＲＰＤ１、トリオースリン酸イソメラーゼ、眼白皮症１型タンパク質（ＯＡ１）、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢ３８）、チロシナーゼ関連タンパク質１－２（ＴＲＰ－１－２）、メラノーマ抗原Ｇｐ７５（ｇｐ７５）、チロシナーゼ、メランＡ（ＭＡＲＴ－１），糖タンパク質１００メラノーマ抗原（ｇｐ１００）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子（ＧｎＴＶｆ）、リンパ球抗原６複合体遺伝子座Ｋ（ＬＹ６Ｋ）、メラノーマ抗原－Ａ１０（ＭＡＧＥ－Ａ１０）、メラノーマ抗原－Ａ１２（ＭＡＧＥ－Ａ１２）、メラノーマ抗原－Ｃ２（ＭＡＧＥ－Ｃ２）、メラノーマ抗原ＮＡ８８－Ａ、タキソール耐性関連タンパク質３（ＴＲＡＧ－３），ＢＤＺ結合キナーゼ（ｐｂｋ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ－８）、肉腫抗原１（ＳＡＧＥ）、ブレークポイントクラスター領域－Ａｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子（ＢＣＲ－ＡＢＬ）、白血病の融合タンパク質ｄｅｋ－ｃａｎ、伸長因子Ｔｕ ＧＴＰ結合ドメイン含有２（ＥＦＴＵＤ２）、ＥＴＳバリアント遺伝子６／急性骨髄性白血病融合タンパク質（ＥＴＶ６－ＡＭＬ１）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３内部タンデム重複（ＦＬＴ３－ＩＴＤ）、サイクリンＡ１、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有３Ｂ（ＦＤＮＣ３Ｂ）、前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体アルファ融合タンパク質（ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ）、メラノーマ抗原－Ｃ１（ＭＡＧＥ－Ｃ１）、膜タンパク質アルタネイティブスプライシングアイソフォーム（Ｄ３９３－ＣＤ２０）、メラノーマ抗原－Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）又はメラノーマ抗原Ａ３（ＭＡＧＥ－Ａ３）。
カリクレイン４、パピローマウイルス結合因子（ＰＢＦ）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（ＨＳＤＬ１）、メソテリン、癌精巣抗原（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３、ヒト上皮成長因子受容体２／神経受容体チロシンキナーゼ（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）、癌腫関連上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、卵巣および子宮抗原（ＣＡ１２５）、葉酸受容体ａ、精子タンパク質１７、腫瘍関連差別的発現遺伝子－１２（ＴＡＤＧ－１２）、ムチン－１６（ＭＵＣ－１６）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、マンナン－ＭＵＣ－１、ヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ）、北九州肺癌抗原－１（ＫＫ－ＬＣ－１）、ヒト癌／精巣抗原（ＫＭ－ＨＮ－１）、癌精巣抗原（ＬＡＧＥ－１）、メラノーマ抗原－Ａ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、精子表面透明帯結合タンパク質（Ｓｐ１７）、滑膜肉腫 Ｘブレークポイント４（ＳＳＸ－４）、一過性軸索糖タンパク質－１（ＴＡＧ－１）、一過性軸索糖タンパク質－２（ＴＡＧ－２）、Ｅｎａｂｌｅｄホモログ（ＥＮＡＨ）、マンモグロブリンＡ、ＮＹ－ＢＲ－１、乳癌抗原、（ＢＡＧＥ－１）、Ｂメラノーマ抗原、メラノーマ抗原－Ａ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メラノーマ抗原－Ａ２（ＭＡＧＥ－Ａ２）、ムチンｋ、滑膜肉腫 Ｘブレークポイント（ＳＳＸ－２）、タキソール耐性関連遺伝子３（ＴＲＡＧ－３）、トリ骨髄細胞腫ウイルス癌遺伝子（ｃ－ｍｙｃ）、サイクリンＢ１、ムチン１（ＭＵＣ１）、ｐ６２、サバイビン、リンパ球共通抗原（ＣＤ４５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ＷＮＴシグナル伝達経路阻害因子１（ＤＫＫ１）、テロメラーゼ、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（Ｋ－ｒａｓ），Ｇ２５０、腸管カルボキシエステラーゼ、アルファフェトタンパク質、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、カスパーゼ５（ＣＡＳＰ－５）、チトクロームＣオキシダーゼアセンブリー因子１ホモログ（ＣＯＡ－１）、Ｏ結合（３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＯＧＴ）、骨肉腫増幅９、小胞体レクチン（ＯＳ－９）、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦ－ベータＲＩＩ）、マウス白血病糖タンパク質７０（ｇｐ７０）、カルシトニン関連ポリペプチドアルファ（ＣＡＬＣＡ）、プログラム細胞死１リガンド１（ＣＤ２７４）、マウス二重微小染色体２ホモログ（ｍｄｍ－２）、アルファ－アクチン４、伸長因子２、マリック酵素１（ＭＥ１）、核転写因子ＹサブユニットＣ（ＮＦＹＣ）、Ｇ抗原１，３（ＧＡＧＥ－１，３）、メラノーマ抗原－Ａ６（ＭＡＧＥ－Ａ６）、癌精巣抗原ＸＡＧＥ－１ｂ、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原１（ＳＴＥＡＰ１）、ＰＡＰ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、線維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ５）、ヒートショックタンパク質ｈｓｐ７０－２、メラノーマ抗原－Ａ９（ＭＡＧＥ－Ａ９）、Ａｒｇ特異的ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼファミリーＣ（ＡＲＴＣ１）、Ｂ－Ｒａｆ原癌遺伝子（Ｂ－ＲＡＦ）、セリン／スレオニンキナーゼ、ベータ－カテニン、細胞分裂サイクル２７ホモログ（Ｃｄｃ２７）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、サイクリン依存性キナーゼ１２（ＣＤＫ１２）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、カゼインキナーゼ１アルファ１（ＣＳＮＫ１Ａ１）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、成長停止特異的タンパク質７（ＧＡＳ７），糖タンパク質非転移性メラノーマタンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、ＨＡＵＳオーグミン様複合体サブユニット３（ＨＡＵＳ３）、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼ、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原２（ＭＡＲＴ２）、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）、メラノーマ関連抗原（変異）１（ＭＵＭ－１－２－３）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼガンマ（ネオＰＡＰ）、ミオシンクラスＩ、タンパク質ホスファターゼ１制御サブユニット３Ｂ（ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ）、ペルオキシレドキシン５（ＰＲＤＸＳ）、受容体型チロシンタンパク質ホスファターゼカッパ（ＰＴＰＲＫ）、トランスフォーミングタンパク質Ｎ－Ｒａｓ（Ｎ－ｒａｓ）、網膜芽細胞腫関連因子６００（ＲＢＡＦ６００）、サーチュイン２（ＳＩＲＴ２）、ＳＮＲＰＤ１、トリオースリン酸イソメラーゼ、眼白皮症１型タンパク質（ＯＡ１）、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢ３８）、チロシナーゼ関連タンパク質１－２（ＴＲＰ－１－２）、メラノーマ抗原Ｇｐ７５（ｇｐ７５）、チロシナーゼ、メランＡ（ＭＡＲＴ－１），糖タンパク質１００メラノーマ抗原（ｇｐ１００）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子（ＧｎＴＶｆ）、リンパ球抗原６複合体遺伝子座Ｋ（ＬＹ６Ｋ）、メラノーマ抗原－Ａ１０（ＭＡＧＥ－Ａ１０）、メラノーマ抗原－Ａ１２（ＭＡＧＥ－Ａ１２）、メラノーマ抗原－Ｃ２（ＭＡＧＥ－Ｃ２）、メラノーマ抗原ＮＡ８８－Ａ、タキソール耐性関連タンパク質３（ＴＲＡＧ－３），ＢＤＺ結合キナーゼ（ｐｂｋ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ－８）、肉腫抗原１（ＳＡＧＥ）、ブレークポイントクラスター領域－Ａｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子（ＢＣＲ－ＡＢＬ）、白血病の融合タンパク質ｄｅｋ－ｃａｎ、伸長因子Ｔｕ ＧＴＰ結合ドメイン含有２（ＥＦＴＵＤ２）、ＥＴＳバリアント遺伝子６／急性骨髄性白血病融合タンパク質（ＥＴＶ６－ＡＭＬ１）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３内部タンデム重複（ＦＬＴ３－ＩＴＤ）、サイクリンＡ１、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有３Ｂ（ＦＤＮＣ３Ｂ）、前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体アルファ融合タンパク質（ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ）、メラノーマ抗原－Ｃ１（ＭＡＧＥ－Ｃ１）、膜タンパク質アルタネイティブスプライシングアイソフォーム（Ｄ３９３－ＣＤ２０）、メラノーマ抗原－Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）又はメラノーマ抗原Ａ３（ＭＡＧＥ－Ａ３）。
【0075】
癌関連修飾パターンを発現し得るタンパク質の追加の例も知られており、例えば、以下の文献に記載されている。Reuschenbach et al., Cancer Immunol. Immunother. 58:1535-1544 (2009)、Parmiani et al., J. Nat. Cancer Inst. 94:805-818 (2002)、Zarour et al., Cancer Medicine. (2003)、Bright et al., Hum. Vaccin. Immunother. 10:3297-3305 (2014)、Wurz et al., Ther. Adv. Med. Oncol. 8:4-31 (2016)、Criscitiello, Breast Care 7:262-266 (2012)、Chester et al., J. Immunother. Cancer 3:7 (2015)、Li et al., Mol. Med. Report 1:589-594 (2008)、Liu et al., J. Hematol. Oncol. 3:7 (2010)、Bertino et al., Biomed. Res. Int. 731469 (2015)、およびSuri et al., World J. Gastrointest. Oncol. 7:492-502 (2015)。
【0076】
一実施形態において変異は、癌特異的体性変異である。
【0077】
配列変化を検出するための方法は当業界で広く知られており、ＤＮＡシーケンシング、電気泳動、酵素に基づくミスマッチ検出アッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、サザンブロット、ノーザンブロットおよびドットブロット解析等のハイブリダイゼーションアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
特定遺伝子の配列変化は、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動的手法、並びにＥＬＩＳＡと、ウエスタンブロット解析と、免疫組織化学等の免疫検出アッセイによって、タンパク質レベルでも決定することができる。
【0079】
一実施形態において、癌特異的体性変異の同定または配列の差異を同定するための工程は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の使用を含む。
【0080】
一実施形態において、癌特異的体性変異の同定または配列の差異を同定するための工程は、腫瘍検体のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡのシーケンシングを含む。
【0081】
癌特異的体性変異または配列の差異を明らかにするために、腫瘍検体から得た配列情報を、好ましくは参照、例えば、核酸（患者または別の個人から得られる生殖細胞系細胞等の正常な非癌性細胞のＤＮＡまたはＲＮＡ等）のシーケンシングで得られた配列情報と比較する。一実施形態において、正常ゲノム生殖細胞系ＤＮＡは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から得る。
【0082】
「ゲノム」という用語は、生物または細胞内の染色体の遺伝的情報の総量に関連する。
【0083】
「エキソーム」という用語は、発現された遺伝子のコード部分であるエキソンで形成された生物のゲノムの一部分を意味する。エキソームはタンパク質および他の機能的遺伝子産物の合成に用いる遺伝的青写真を提供する。これはゲノムの最も機能的に重要な部分であり、それ故に、生物の表現型に最も貢献する可能性が高い。ヒトゲノムのエキソームは、総ゲノムに対して１．５％を占めると推定されている（Ng, P C et al., PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008）。
【0084】
「トランスクリプトーム」という用語は、１つの細胞または細胞の集団によって産生される、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および他の非コードＲＮＡを含む、一群の全ＲＮＡ分子に関連する。本発明の文脈において、トランスクリプトームは、１つの細胞、細胞の集団、好ましくは癌細胞の集団、または特定の個体のある時点の全細胞によって産生される全ＲＮＡ分子を意味する。
【0085】
本発明によると、「参照」は、腫瘍検体から本発明の方法によって得られた結果を相関させ。比較するために使用してもよい。典型的には、「参照」は、１以上の正常な検体、具体的には、患者、または１以上の異なる個体（好ましくは健康な個体、特に同種の個体）から得た癌疾患に罹患していない検体から得てもよい。「参照」は、十分に大きな数の正常検体を試験することで実験的に決定することもできる。
【0086】
本発明によると、変異を決定するために任意の適切なシーケンシング方法を使用することができ、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術が好ましい。将来的には、本方法のシーケンシング工程のスピードアップのために、ＮＧＳ技術は第三世代シーケンシング方法によって置き換わるかもしれない。明確にすることを目的とすると、本発明の文脈において「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として知られる「従来」のシーケンシング方法に対して、全ゲノムを細かく分割して、並行して全ゲノムに沿って核酸テンプレートをランダムに読み取る、全ての新規なハイスループットシーケンシング技術を意味する。
【0087】
疾患特異的リン酸化パターンを同定するための方法は当業界で知られており、例としては、培養細胞中のアミノ酸の安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）、ＲＲＰＡ、およびホスホ特異的ウエスタンブロットが挙げられる。
【0088】
好ましい実施形態においては、ＨＬＡアレルはクラスＩ ＨＬＡアレルである。特定の実施形態においては、クラスＩ ＨＬＡアレルはＨＬＡ－ＡアレルまたはＨＬＡ－Ｂアレルである。好ましい実施形態においては、ＨＬＡアレルはクラスＩＩ ＨＬＡアレルである。クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡアレルの配列は、ＩＰＤ－ＥＶＩＧＴ／ＨＬＡデータベースに見出すことができる。例示的なＨＬＡアレルとしては、Ａ＊０１：０１、Ａ＊０２：０１、Ａ＊０２：０３、Ａ＊０２：０４、Ａ＊０２：０７、Ａ＊０３：０１、Ａ＊２４：０２、Ａ＊２９：０２、Ａ＊３１：０１、Ａ＊６８：０２、Ｂ＊３５：０１、Ｂ＊４４：０２、Ｂ＊４４：０３、Ｂ＊５１：０１、Ｂ＊５４：０１またはＢ５７：０１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態においては、ＨＬＡアレルはＨＬＡ－Ａ＊０１：０１である。
【0089】
対象特異的ＨＬＡアレルまたは対象のＨＬＡ遺伝子型は、任意の公知の方法で決定してもよい。特定の実施形態において、ＨＬＡ遺伝子型は国際公開第２０１５０８５１４７号として２０１５年６月１１日に発行された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６８７４６号に記載の方法で決定する。まとめると、方法は、多型遺伝子のアレルバリアントを含む遺伝子参照セットに合わせたシーケンシングデータから抽出したリードのアライメントの作製を含んでもよい、多型遺伝子型を決定することと、アライメント内の各アレルバリアントに対して第１の事後確率または事後確率誘導スコアを決定することと、第１の事後確率または事後確率誘導スコアの最大値を示すアレルバリアントを第１のアレルバリアントとして同定することと、第１のアレルバリアントおよび１以上の他のアレルバリアントとアラインする１以上のオバーラップするリードを同定することと、１以上のアレルバリアントに対して、重みづけ係数を用いて、第２の事後確率または事後確率誘導スコアを決定することと、第２の事後確率または事後確率誘導スコアの最大値を示すアレルバリアントを第２のアレルバリアントとして同定し、第１および第２のアレルバリアントは各多型遺伝子の遺伝子型を定義することと、第１および第２のアレルバリアントに対するアウトプットを提供すること、とを含む。
【0090】
個別のＨＬＡアレルの文脈において癌関連変異タンパク質は、好ましくは所定数の癌患者において高頻度のもの（例：少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００またはそれ以上）を選択する
【0091】
癌患者群は同じ癌型（メラノーマ）を患うもの、または種々の異なる癌型を患う汎癌群の一部から選択してもよい。
【0092】
癌患者群には、メラノーマ患者、甲状腺癌患者、褐色細胞腫患者、セミノーマ患者、胃底腺型胃癌患者、胆管癌患者、膵臓腺癌患者、結腸直腸腺癌、白血病患者、膀胱尿路上皮癌患者、子宮内膜癌患者、胸腺上皮性腫瘍患者、非小細胞肺癌患者、肉腫患者、卵巣癌患者および前立腺癌患者、または上記癌患者が含まれてもよい。
【0093】
一実施形態において、癌患者群はメラノーマ癌患者のみを含む。
【0094】
他の実施形態において、癌患者群は、特定の療法に耐性であることが判明したばかりのものを含む。
【0095】
群内でＨＬＡステータスが高頻度を有する、および／または群内で特定の変異が高頻度で存在することが望ましい。好ましくは、ＨＬＡステータス頻度は高く（例：０．５％超、１％、２％、３％、４％、５％，６％、７％、８％、９％、１０％）且つ群内で特定変異の頻度も高い（例：０．５％超、１％、２％、３％、４％、５％，６％、７％、８％、９％、１０％）。
【0096】
特定の実施形態において、癌関連変異タンパク質を内包する腫瘍細胞の割合（即ち、クローン性）も、初期スクリーニング段階で考慮する。よって、第２の所定レベルを超える発生頻度を有するＨＬＡアレルに対して第１の所定レベルを超える親和性で結合し、且つ第３の所定レベルを超える割合で腫瘍細胞に内包されている候補ペプチドを、癌免疫療法の標的となり得る候補ＨＬＡ提示ネオアンチゲンとして選択する。
【0097】
一実施形態において、クローン性の基準はバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）である。
【0098】
一実施形態において、バリアントアレル頻度は、変異部位を網羅し且つ変異を含む、検出された配列（特にリード）の合計を、変異部位を網羅する全検出配列（特にリード）の合計で除したものである。一実施形態において、バリアントアレル頻度は、変異部位の変異したヌクレオチドの合計を変異部位で決定された全ヌクレオチドの合計で除したものである。一実施形態において、癌関連変異タンパク質を内包する腫瘍細胞の割合を確かめるためのスコアを確かめるために、修飾の関連するタンパク質の発現レベルのスコアを、修飾が関連するタンパク質中の修飾タンパク質の頻度のスコアと掛け合わせる。
【0099】
一般的に、バリアントアレル頻度の値は０～１であり得、ここでバリアントアレル頻度が０であることは、その位置に代わりのアレルを有する配列リードは無いことを示し、バリアントアレル頻度が１であることは、全ての配列リードがその位置に代わりのアレルを有することを示す。他の実施形態において、バリアントアレル頻度の他の範囲および／または値を使用することができる。
【0100】
よって、例えば、一実施形態において、腫瘍サンプルの平均ＶＡＦが０．１～０．５５の間の場合、タンパク質の変異を考慮する。他の実施形態において、腫瘍サンプルの中央ＶＡＦが０．１～０．５５の間の場合、タンパク質の変異を考慮する。
【0101】
一旦、ＨＬＡアレルと特定の変異タンパク質を選択したら、選択した癌関連変異タンパク質から誘導した８～１４アミノ酸長のペプチド（選択した変異を含むもの）の選択したＨＬＡアレルに対する結合親和性を分析する。
【0102】
ペプチドのＨＬＡアレルに対する結合親和性を分析する方法は当業界で知られている。
【0103】
一実施形態において、結合親和性は、ＨＬＡ結合のための予測アルゴリズムを用いて予測することができる。このような予測アルゴリズムとしては、ＮｅｔＭＨＣ、ＮｅｔＭＨＣＩＩ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＩＥＤＢ解析リソース（ＵＲＬ：ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ（ｄｏｔ）ｏｒｇ）、ＲａｎｋＰｅｐ、ＰＲＥＤＥＰ、ＳＶＭＨＣ、Ｅｐｉ予測、ＨＬＡ結合および他の方法（例：J Immunol Methods 2011; 374:1-4を参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない
【0104】
このような予測を用いて、所定量を超える親和性でＨＬＡに結合する候補ネオアンチゲンのリストを作製することができる。特定の実施形態によると、％Ｒａｎｋ≦０．５（ＮｅｔＭＨＣｐａｎのデフォルトパラメーター）または異なる予測アルゴリズムを用いて対応するレベルの結合を示す候補ペプチドのみを選択する。別の実施形態によると、その結合％Ｒａｎｋ≦２（ｓｏｆＮｅｔＭＨＣｐａｎのデフォルトパラメーター）または異なる予測アルゴリズムを用いて対応するレベルと特徴づけられる候補ペプチドを選択する。
【0105】
ＨＬＡアレル頻度および／または変異の頻度が高ければ、上記レベルよりも結合親和性が低いこともある点を理解されたい。
【0106】
よって、３種のパラメーター、即ち、ＨＬＡアレルの頻度、変異の発生頻度、および結合親和性、の組み合わせであり、これらが候補ネオアンチゲンの選択を決定し、単一パラメーターのみに基づくものではないと理解されている。よって、上記パラメーターのいずれもについて所定量は固定値ではなく、むしろ流動的であり、他の２種のパラメーターのレベルに応じて変化させることができる。
【0107】
上述した工程を用いて候補ネオアンチゲンを決定する際には、潜在的候補をさらに絞り込むために、候補ネオアンチゲンをｉｎ ｖｉｔｒｏシステムで試験する。
【0108】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムは、典型的には、候補ネオアンチゲンとその同種ＨＬＡを発現するように遺伝的に修飾された抗原提示細胞を含む。
【0109】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）とは、その細胞表面ＨＬＡ（ＭＨＣ）分子と共同してタンパク質抗原のペプチド断片を提示する細胞である。
【0110】
ＡＰＣの例としては、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞およびＢ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0111】
特定の実施形態によると、ＡＰＣは樹状細胞またはＢ細胞である。最も好ましくはＢ細胞である。
【0112】
一実施形態において、ＡＰＣは不死化されている、即ち、形質転換細胞系（例えばエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞）である。
【0113】
一実施形態において、ＡＰＣは、候補ネオアンチゲンに結合すると予測された特定のＨＬＡアレルを発現するように遺伝的に修飾されている。
【0114】
ＨＬＡを不足したＢ細胞（例：Ｂ７２１．２２１）は、システムが無関係のＨＬＡから「クリーン」な状態になるように使用することができる。
【0115】
無関係のＨＬＡアレルを発現する抗原提示細胞の内在性クラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子を欠損／不活化させる例示的な方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９仲介ゲノム編集である。
【0116】
典型的には、２５～２７量体のミニジーンシステムおよび／または４５～４７量体のミニジーンシステムを用いて候補ペプチドを細胞内で発現させる。
【0117】
このようにして、同定された変異を取り囲む種々の長さの伸長ペプチドを細胞内で発現させる。発現の際に、細胞の内在性プロテアゾーム性システムが伸長ペプチドをより短いペプチドに消化し、ＨＬＡのコンテキストで細胞表面にネオアンチゲンが提示される。
【0118】
ミニジーンは、伸長したネオアンチゲンをコードする核酸分子を含む。上述したいずれかの実施形態においては、発現構築物はタンデムなミニジーンを含んでもよく、各ミニジーンはネオアンチゲンをコードする核酸分子を含む。例えば、タンデムなミニジーンは、２～約２０のネオアンチゲン、または２～約１０のネオアンチゲン、または２～約５のネオアンチゲンをコードする核酸分子を含んでもよい。
【0119】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムの使用は、ネオアンチゲンが内在性の量と比べて高レベルで発現されることを確実とするため、質量分析や他の同等の技術（薄層クロマトグラフィー、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解後の高速原子衝撃法（ＦＡＢ）質量分析によるアミノ酸解析、さらにはＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ質量分析が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、ＨＬＡによって提示された特定のペプチドの同定が容易になる。
【0120】
特定の実施形態において、液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）および／またはＨＰＬＣを用いて解析することもできる、例えば、本参照をもって本願に援用する、Kalaora et al., Oncotarget. 2016 Feb 2; 7(5): 5110-5117
を参照。
を参照。
【0121】
同種ＨＬＡによって候補ネオアンチゲンが提示されたことが確認できたら、腫瘍細胞（例：新鮮腫瘍細胞、ＰＤＸまたは腫瘍細胞系）を用いて候補ペプチドとＨＬＡとのペアを立証する。特定の実施形態によると、候補ペプチドとＨＬＡとのペアは、適切なＨＬＡステータスを有することがわかっている癌患者から誘導した腫瘍細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏシステムで立証する。
【0122】
特定されたＨＬＡによるネオアンチゲンの提示は、公知の方法を用いて腫瘍細胞内で立証される。例えば、腫瘍細胞からまたは腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子からペプチドを酸で溶出し、質量分析を用いて同定することができる。同定工程の間に、スパイクした重いペプチド（候補ネオアンチゲン）を対照となるシステムに導入してもよい。こうすることで、腫瘍サンプル内のネオアンチゲンの定量も可能になる。
【0123】
選択したネオアンチゲンの反応性を、次に後述するように求めることができる。
【0124】
一実施形態において、候補ペプチドを、ＡＰＣの表面への提示が可能となる条件下で、ＡＰＣにロードする。
【0125】
ＡＰＣの表面に提示されるためには、ＡＰＣの細胞膜を横断し、新規に合成されたＨＬＡクラスＩまたはＩＩ受容体にロードされなければならない。形成されたＨＬＡ－ペプチド複合体は、細胞膜へ移動され、そこではＴ細胞認識のためにすぐに利用可能である。
【0126】
一実施形態において、ペプチドを、ＡＰＣを生存状態に維持する培地（例：ＲＰＭＩ）内のＡＰＣと、１２～４８時間、１２～２４時間、６～４８時間または８～４８時間の間の時間にわたりインキュベートする。ロード工程の際のペプチドの濃度は、好ましくは１０～５０μＭの間、より好ましくは１０～３０μＭの間である。
【0127】
次に、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を決定することができる。特定のＴ細胞活性を検出するための方法には、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例：リンホカイン、インターフェロンガンマ、ＴＮＦアルファ）の産生、または細胞溶解活性の発生の検出が挙げられる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の場合、特定のＴ細胞活性を検出する好ましい方法は、Ｔ細胞増殖の検出である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の場合、特定のＴ細胞活性を検出する好ましい方法は、細胞溶解活性の発生の検出である。
【0128】
特定の実施形態によると、抗原特異的エフェクター細胞によるＩＦＮ－ガンマの産生を測定することで求めることのできるＣＤ８＋ ＣＴＬ応答を、双眼実体顕微鏡下でスポット形成単位（ＳＦＵ）を計数することで定量化するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施することで、ペプチドの反応性を決定することができる（Rininsland et al., (2000) J Immunol Methods: 240(1-2):143-155）。このアッセイでは、マイクロタイターウエルのプラスチック製表面に抗原提示細胞（ＡＰＣ）を固定し、そこに種々のエフェクター：標的比でエフェクターＴ細胞を添加する。抗原提示細胞は好ましくはＢ細胞または樹状細胞である。抗原特異的エフェクター細胞によるＡＰＣの結合は、エフェクター細胞によるサイトカイン（ＩＦＮガンマを含む）産生のトリガーとなる（Murali-Krishna et al., (1998) Adv Exp Med Biol.: 452:123-142）。一実施形態においては、対象特異的Ｔ細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いる。ＴＩＬから分泌される可溶性ＩＦＮγの量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（例：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって測定してもよい。
【0129】
ペプチドの反応性を検出するための別の方法は、ＣＴＬ活性のための古典的なアッセイ、即ち、クロミウム放出アッセイ、によって細胞溶解を測定することで直接決定する方法（Walker et al., (1987) Nature: 328:345-348、Scheibenbogen et al., (2000) J Immunol Methods: 244(1-2):81-89）である。エフェクター細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、クラスＩＭＨＣ上に抗原性ペプチドを有する標的に結合し、標的がアポトーシスするようにシグナルを伝達する。ＣＴＬの添加前に標的が５１クロミウムで標識されていると、上清に不出される５１Ｃｒの量は殺傷された標的の数に比例する。抗原特異的溶解は、疾患または対照抗原を発現する標的細胞の溶解を患者エフェクター細胞の存在下または不存在下で比較することで計算し、通常、％特異的溶解として表される。パーセント特異的細胞傷害は、（特異的放出－突発的放出）／（最大放出－突発的放出）によって計算し陽性アッセイでは２０％～８５％となり得る。パーセント特異的細胞傷害は、通常、数種のエフェクター（ＣＴＬ）対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で決定する。加えて、標準溶解アッセイは定性的であり、定量的結果を得るためには限定希釈解析（ＬＤＡ）に依拠する必要があり、ＬＤＡ頻度はＣＴＬ応答の真のレベルを過小評価する。ＣＴＬはそれぞれがｉｎｖｉｖｏで複数の標的を殺傷可能であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏのこのアッセイは、検出可能な殺傷のために標的の数と同等またはそれ以上の複数のＣＴＬを必要とする。一実施形態においてＣＴＬ応答は、適切な抗原－ＭＨＣ複合体を発現する、放射線標識したＨＬＡ適合「標的細胞」を溶解するＴ細胞（エフェクター細胞）の能力をモニタリングする、クロミウム放出アッセイで測定する。
【0130】
本願で上述したように、本発明者らは以前に、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋホットスポットネオアンチゲンが、年間数千人の患者に適応するロバストな免疫原性標的であると予測していた（国際公開２０２０／２３４８７５号）。本発明者らは、今回はこのＨＬＡ提示ネオアンチゲンに対して高反応性のＴ細胞受容体を同定した。
【0131】
具体的には、このＴＣＲは、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）およびＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）ネオペプチドの療法を１ｎＭという低濃度で認識し、適切な癌細胞系（例：メラノーマ細胞系および肺腺癌細胞系）との共インキュベーションによって４－１ＢＢのアップレギュレーションを誘導することを示した。
【0132】
よって、本発明の第１の態様によると、対象の癌を治療する方法であって、対象に治療有効量のＴ細胞の集団を投与することを含み、集団内の前記Ｔ細胞の少なくとも１０％が、ＴＣＲのα鎖に配列番号６に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、且つＣＤＲのβ鎖に配列番号７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、投与によって前記対象の癌を治療する、方法が提供される。
【0133】
癌の例としては、メラノーマ、大腸癌、乳癌、甲状腺癌、胃癌、結腸直腸癌、白血病、膀胱癌、肺癌、卵巣癌、乳癌および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0134】
一実施形態において、癌は、癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１１）関連癌（例：Ｑ６１Ｋ，Ｑ６１Ｒ ＮＲＡＳ）等のＲＡＳ関連癌である。
【0135】
一実施形態において、癌は転移性癌である。
【0136】
本願に記載した癌の治療に用いるＴ細胞は、癌を患う対象から誘導したものでもよい（養子細胞療法、ＡＣＴ）。一実施形態において、Ｔ細胞は、対象の末梢血リンパ球から誘導したものである。
【0137】
一実施形態において、Ｔ細胞は自家性Ｔ細胞である。
【0138】
他の実施形態において、Ｔ細胞は非自家性Ｔ細胞である。
【0139】
ＡＣＴは、新規ホストの免疫機能および特徴を移植することを目的とした、細胞、最も一般的には免疫誘導細胞、の同じ患者への、または新たなレシピエントホストへの移植を意味する。可能であれば、自家性細胞の使用は、ＧＶＨＤ事象を最小化することによってレシピエントを助ける。自家性腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移植（Besser et al., (2010) Clin. Cancer Res 16 (9) 2646-55、Dudley et al., (2002) Science 298 (5594): 850-4、およびDudley et al., (2005) Journal of Clinical Oncology 23 (10): 2346-57）または遺伝的にリダイレクトした末梢血単核球（Johnson et al., (2009) Blood 114 (3): 535-46、およびMorgan et al., (2006) Science 314(5796) 126-9）の養子移植は、メラノーマおよび結腸直腸癌を含む進行した固形腫瘍を患者、さらにはＣＤ１９発現を有する血液癌の患者の治療における使用に成功している（Kalos et al., (2011) Science Translational Medicine 3 (95): 95ra73）。一実施形態においては、本願で同定したネオアンチゲンへの結合に基づき、対象への投与用のＴＣＲを選択する。一実施形態においてＴ細胞は、公知の方法を用いて増殖させる。腫瘍特異的ＴＣＲを発現する増殖したＴ細胞を対象に戻してもよい。他の実施形態においては、ＰＢＭＣにＴＣＲ発現用のポリヌクレオチドを形質導入またはトランスフェクトしてから対象に投与する。ネオアンチゲンに特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞を増殖させて、対象に戻す。
【0140】
Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞集団は、配列番号１および３４に示す配列を有するペプチドエピトープの少なくとも１種に結合し、且つ対応するペプチドに対して抗原特異性を有する。一実施形態において、Ｔ細胞は、配列番号１に示すペプチドエピトープおよび配列番号３４に示すペプチドエピトープの両方に対して抗原特異性を有する。
【0141】
本願で使用する「抗原特異性」という成句は、ＴＣＲが免疫学的に認識される変異標的（例：変異したＮＲＡＳまたはＢＲＡＦ）に対して、高い活性をもって、特異的に結合し得ることを意味する。例えば、ＴＣＲは、（ａ）低濃度の、配列番号１または３４に示す配列を有する変異標的ペプチドでパルスされた抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞（例：約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または任意の２つの上記値によって定められる範囲）、もしくは（ｂ）標的細胞が変異標的を発現するように、配列番号１または３４に示す配列を有する変異標的ペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞との共培養によって、ＴＣＲを発現するＴ細胞が少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例：２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、または任意の２つの上記値によって定められる範囲）のＩＦＮガンマを分泌したら、変異標的に対して「抗原特異性」であると言える。本発明のＴＣＲを発現する細胞はより高濃度の変異標的ペプチドでパルスされた抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞との共培養の際にもＩＦＮガンマを分泌してもよい。
【0142】
代わりに、または加えて、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、（ａ）低濃度の変異標的ペプチドでパルスされた抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞、または（ｂ）標的細胞が変異標的を発現するように、変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞のいずれかと共培養した際に、陰性対照によって発現されるＩＦＮ－ガンマの量と比べて少なくとも２倍のＩＦＮ－ガンマを分泌するときは、ＴＣＲが変異標的に対して「抗原特異性」を有するとみなしてもよい。陰性対照は、例えば、（ｉ）ＴＣＲを発現するＴ細胞であって、（ａ）同じ濃度の無関係のペプチド（例：変異した標的ペプチドとは異なる配列の他のペプチド）でパルスされた抗原－陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞、または（ｂ）標的細胞が無関係のペプチドを発現するように、無関係のペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞と共培養したもの、もしくは（ｉｉ）非形質導入Ｔ細胞（例：ＴＣＲを発現しないＰＢＭＣから誘導したもの）であって、（ａ）同じ濃度の変異標的ペプチドでパルスされた抗原－陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞、または（ｂ）標的細胞が変異標的を発現するように、変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞との共培養したものでもよい。ＩＦＮ－ガンマ分泌は公知の方法、例えば、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定してもよい。
【0143】
代わりに、または加えて、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、（ａ）低濃度の変異標的ペプチドでパルスされた抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞、または（ｂ）標的細胞が変異標的を発現するように、変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋標的細胞のいずれかと共培養した際に、陰性対照によって発現されるＩＦＮ－ガンマの量と比べて少なくとも２倍のＩＦＮ－ガンマを分泌するときは、ＴＣＲが変異標的に対して「抗原特異性」を有するとみなしてもよい。ペプチド濃度及び陰性対照は、本発明の他の観点から語ることもできる。ＩＦＮガンマを発現する細胞数は、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定することができる。
【0144】
癌治療用に、組換えＴ細胞受容体を発現するようにＴ細胞を改変する方法は、Ping et al Protein Cell. 2018 Mar; 9(3): 254-266に開示されている。
【0145】
本発明は、ＴＣＲのアルファ（アルファ）鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＴＣＲのガンマ（ガンマ）鎖、ＴＣＲのデルタ（デルタ）鎖、またはこれらの組み合わ等の２つのポリペプチド（即ち、ポリペプチド鎖）を含むＴＣＲを発現するＴ細胞を提供する。本発明のＴＣＲのポリペプチドは、ＴＣＲが変異標的（例：変異ＮＲＡＳ）に対して抗原特異性を有するかぎり、任意のアミノ酸配列を含み得る。
【0146】
本発明の一実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む可変領域をそれぞれが含む２つのポリペプチド鎖を含む。
【0147】
ＣＤＲと同様に、本願に開示するＴＣＲもＶ領域とＪ領域を含む。Ｖ領域とＪ領域の特定の組み合わせは、下記の表１に開示されている。
【0148】
本発明の本態様に従って使用してもよいＴ細胞受容体の例示的なβ鎖のＣＤＲ３領域の配列を配列番号７に示した。
【0149】
本発明の本態様に従って使用してもよいＴ細胞受容体の例示的なα鎖のＣＤＲ３領域の配列を配列番号６に示した。
【0150】
本発明はＴ細胞集団を想定し、集団内のＴ細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するβ鎖ＣＤＲ３および配列番号６に示すアミノ酸配列を有するα鎖ＣＤＲ３を有するＴ細胞受容体を発現する。
【0151】
一実施形態において、集団内のＴ細胞の少なくとも９５％が、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するβ鎖ＣＤＲ３および配列番号６に示すアミノ酸配列を有するα鎖ＣＤＲ３を有するＴ細胞受容体を発現する。
【0152】
本発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞、即ち、配列番号６および７に示すＣＤＲ３アミノ酸配列を有するキメラ抗体を発現するＴ細胞、をさらに想定する。
【0153】
ＣＤＲ３領域の配列は含む少なくとも１種または２種のアミノ酸置換を含み、且つ結合活性を有してもよいことを理解されたい。
【0154】
一実施形態において、アミノ酸置換は保存性置換である。
【0155】
本願で使用する「保存性置換」という用語は、ペプチドの本来の配列に存在するアミノ酸を天然または非天然のアミノまたは同様の立体特性を有するペプチドミメティックによる置換を意味する。置換される本来のアミノ酸の側鎖が極性または疎水性の場合、保存性置換に用いる天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、またはペプチドミメティック部分も、（置換されるアミノ酸の側鎖と同じ立体特性を有することに加えて）極性または疎水性であるべきである。
【0156】
天然のアミノ酸が典型的にはその性質によってグループ分けされることから、天然のアミノ酸による保存性置換は、本発明によると帯電アミノ酸の構造的に類似した非帯電アミノ酸による置換は、保存性置換とすることを念頭に、容易に決定することができる。
【0157】
非天然アミノ酸によって保存性置換を産生するには、当業界で公知のアミノ酸類似体（合成アミノ酸）を使用することもできる。天然アミノ酸のペプチドミメティックは当業者に知られる文献に広く記述されている。
【0158】
保存性 置換を実施する際には、置換するアミノ酸は元のアミノ酸と同様に、その側鎖に同一または類似した官能基を有するべきである。
【0159】
本願で使用する「非保存性置換」は、親配列に存在するアミノ酸の、異なる電気化学的および／または立体特性を有する他の天然または非天然アミノ酸による置換を意味する。よって、側鎖のアミノ酸置換は、置換される本来のアミノ酸の側鎖よりも有意に大きい（または小さい）、および／または置換されるアミノ酸とは有意に異なる電子的性質を有する官能基を有し得る。このような非保存性置換の例としては、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンによるアラニンの置換、イソロイシンによるグリシンの置換、または－ＮＨ－ＣＨ［（－ＣＨ２）５－ＣＯＯＨ］－ＣＯ－によるアスパラギン酸の置換が挙げられる。本発明の範囲に入るこれらの非保存性置換は、引き続き抗細菌特性を今でも発揮するペプチドを形成するものである。
【0160】
特定の実施形態によると、ＴＣＲ受容体は、配列番号６に示すＣＤＲ３領域を含むα鎖と、および配列番号７に示すＣＤＲ３領域を含むβ鎖を含む。
【0161】
さらに別の実施形態によると、ＴＣＲ受容体は、配列番号６に示すＣＤＲ３領域を含むα鎖と、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に示すＣＤＲ３領域を含むβ鎖とを含む。
【0162】
さらに別の実施形態によると、ＴＣＲ受容体は、配列番号７に示すＣＤＲ３領域を含むβ鎖と、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に示すＣＤＲ３領域を含むα鎖とを含む。
【0163】
特定の実施形態によると、ＴＣＲ受容体は、配列番号２に示すＣＤＲ３領域を含むα鎖と、配列番号１７に示すＣＤＲ３領域を含むβ鎖とを含む。
【0164】
特定の実施形態によると、ＴＣＲ受容体は、配列番号１６に示すＣＤＲ３領域を含むα鎖と、配列番号３に示すＣＤＲ３領域を含むβ鎖とを含む。
【0165】
本願で特定したＣＤＲ配列の少なくとも１種を含む単離された抗体および／または二重特異性抗体も想定される。
【0166】
本発明のＴＣＲ（および抗体）は１以上の天然アミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。このような合成アミノ酸は当業界で知られており、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、アルファ－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、ベータ－フェニルセリンベータ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、アルファ－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、アルファ－アミノシクロペンタンカルボン酸、アルファ－アミノシクロヘキサンカルボン、アルファ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、アルファ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、アルファ，ガンマ－ジアミノ酪酸、アルファ，ベータ－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびアルファ－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。
【0167】
本発明のＴＣＲ（および抗体）（その機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、（例：ジスルフィド架橋による）環化、または酸付加塩に変換される、および／または任意で二量体化または重合体化または結合され得る。
【0168】
本発明のＴＣＲ（および抗体）は当業界で公知の方法、例えば、ｄｅ ｎｏｖｏ合成によって得ることができる。さらに、ＴＣＲは、本願に記載した核酸を用いて、標準的な組換え方法を用いて組換え的に製造することもできる。例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.sup.th ed., Cold Spring Harbor Pres、Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)を参照。代わりに、本願に記載したＴＣＲ、ポリペプチド、および／またはタンパク質（その機能的バリアントを含む）は、Ｓｙｎｐｅｐ（カリフォルニア州、ダブリン）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（メリーランド州、ゲイザースバーグ）、およびＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（（カリフォルニア州、サンディエゴ）等の業者に合成してもらうこともできる。この観点から、本発明のＴＣＲは、合成、組換え、単離および／または精製であり得る。本発明の範囲には、本発明のＴＣＲを含むコンジュゲート（例：バイオコンジュゲート）も含まれる。コンジュゲートのみならず、一般的なコンジュゲートの合成方法も当業界で広く知られている。
【0169】
対象特異的ＴＣＲを発現する腫瘍反応性Ｔ細胞の集団は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞の個別化細胞集団を含む医薬組成物を得てもよい。好ましくは、担体は薬学的に許容される担体である。医薬組成物については、担体は細胞の投与に一般的に使用される任意のものであり得る。このような薬学的に許容される担体は当業者には広く知られており、一般的に入手が容易である。薬学的に許容される担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性を示さないものが好ましい。細胞の注射に適した薬学的に許容される担体としては、等張性の担体、例えば、正常生理食塩水（水中に約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中に約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、または１リットルの水に対して約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（イリノイ州、シカゴ、Ａｂｂｏｔｔ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（イリノイ州、ディアーフィールド、Ｂａｘｔｅｒ）、水中に約５％のデキストロース、または乳酸リンゲル液等が挙げられる。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒト血清アルブミンが添加されている。
【0170】
Ｔ細胞は、当業界で公知の任意の適切な経路で投与することができる。Ｔ細胞は、好ましくは３０～６０分間にわたる動脈内または静脈内点滴で投与することが好ましい。他の投与経路の例としては、腹腔内、髄腔内およびリンパ系内が挙げられる。Ｔ細胞は注射で投与してもよい。Ｔ細胞は腫瘍部位に導入してもよい。
【0171】
本願に記載するＴ細胞は、対象にとって自家性または非自家性でもよい。
【0172】
本発明の目的において、投与される用量（例：対象特異的ＴＣＲを発現する本発明の細胞集団内の細胞数）は、一定の時間枠内で対象に効果（例：治療的または予防的応答）を引き起こすのに十分な量であるべきである。例えば、癌抗原に結合する、もしくは投与時から約２時間またはそれ以上（例：１２～２４時間以上）の期間内に癌を検出、治療または予防するのに十分な細胞数であるべきである。ある実施形態においては、期間はさらに長くてもよい。細胞数は、例えば、特定の細胞の効能および対象（例：ヒト）の状態のみならず、処置される対象（例：ヒト）の体重によって決定される。
【0173】
対象特異的ＴＣＲを発現する本発明の細胞集団から投与した細胞数を決定するための多くのアッセイが当業界で知られている。本発明の目的において、一定数のこのような細胞を対象に投与した際の標的細胞の溶解または１以上のサイトカイン（例：ＩＦＮガンマおよびＩＬ－２等）の分泌の程度を比較することを含むアッセイを、哺乳動物に投与する開始数を決定するために使用することができる。一定数の細胞を対象に投与した際の標的細胞の溶解または１以上のサイトカイン（例：ＩＦＮガンマおよびＩＬ－２等）の分泌の程度は、当業界で公知の方法によって解析することができる。サイトカイン（例：ＩＬ－２）の分泌は、細胞製剤の品質（例：表現型および／または効果）の指標を提供することもある。
【0174】
対象特異的ＴＣＲを発現する本発明の細胞集団から投与される細胞の数は、特定の細胞集団の投与に伴う可能性のある副反応の存在、性質および程度によって決定することもできる。
【0175】
処置される対象は、典型的には哺乳類、例えば、ヒトである。
【0176】
一実施形態において、対象は、彼／彼女がＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ変異またはＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ変異を発現するか、およびＨＬＡ－Ａ＊０１：０１アロタイプを有すると同定されているかに基づき、予め選択される。
【0177】
対象特異的ＨＬＡアレルまたは対照のＨＬＡ遺伝子型は、当業界で公知の任意の方法で決定してもよい。特定の実施形態において、ＨＬＡ遺伝子型は、２０１５年６月１１日付で国際公報２０１５０８５１４７号として公開された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６８７４６号に記載の任意の方法によって決定してもよい。まとめると、当該方法は、シーケンシングデータセットから抽出したリードと、多型遺伝子のアレルバリアントを含む遺伝子参照セットとのアライメントを作製することと、アライメント内の各アレルバリアントについて第１の事後確率または事後確率誘導スコアを決定することと、最大の第１の事後確率または事後確率誘導スコアを有するアレルバリアントを第１のアレルバリアントとして同定することと、第１のアレルバリアントおよび１以上の他のアレルバリアントとアラインする１以上の重なるリードを同定することと、重みづけ因子を用いて１以上の他のアレルバリアントの第２の事後確率または事後確率誘導スコアを決定することと、最大の第２の事後確率または事後確率誘導スコアを有するアレルバリアントを選択することで第２のアレルバリアントを同定し、第１および第２のアレルバリアントは多型遺伝子の遺伝子型を定義することと、第１の所定レベルおよび第２のアレルバリアントのアウトプットを提供することを含む。
【0178】
本願で開示するＴ細胞集団は、少なくとも１種の他の治療薬との併用が可能である。本願で開示するＴ細胞集団との併用が可能な治療薬の例としては、免疫調節性サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦが挙げられるが、これらに限定されない）のみならず、更に免疫応答を増強可能な任意の他のサイトカイン、免疫調節性抗体（抗ＣＴＬＡ４、抗ＣＤ４０、抗４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ１ａｎｄ抗ＰＤＬ１が挙げられるが、これらに限定されない）、および免疫調節薬（レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）（レブラミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ））が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0179】
加えて、本願で開示するＴ細胞集団は、低用量シクロホスファミドおよびタキソールが挙げられるが、これらに限定されない、免疫系を阻害しない治療レジメンにおいて、化学療法と併用して癌治療のために投与してもよい。癌に対して、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ハーセプチン）および抗ＣＤ２０（リツキサン）が挙げられるが、これらに限定されない治療用抗体と併用してワクチンも投与してもよい。
【0180】
Ｔ細胞集団は、抗ウイルス薬、抗レトロウイルス薬、抗マラリア薬等が挙げられるが、これらに限定されない特定の感染症を治療するための薬剤と併用して慢性感染症の治療のために投与することができる。
【0181】
一実施形態において、本発明の本態様における試薬は、免疫チェックポイント阻害薬と共に投与される。
【0182】
本願で使用する「免疫チェックポイント阻害薬」という成句は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害することのできる化合物を意味する。阻害には、機能の減少と、完全遮断とが含まれる。特に免疫チェックポイントタンパク質はヒト免疫チェックポイントタンパク質である。よって免疫チェックポイントタンパク質阻害薬は、好ましくはヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害薬である。免疫チェックポイントタンパク質は公知文献に記載されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev. Cancer 12: 252-264を参照）。相手となる（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）免疫チェックポイントとしては、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫チェックポイントタンパク質の阻害による、抗原－受容体をトリガーとしたＴリンパ球応答の促進の実験的説明が挙げられ、例えば、免疫チェックポイントタンパク質の発現しないマウスが増強された抗原特異的Ｔリンパ球反応または自己免疫のサインを示すこと（Waterhouse et al., 1995. Science 270:985-988、Nishimura et al., 1999. Immunity 11:141-151等に開示）である。Ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫チェックポイントタンパク質の意図的な促進による抗原－受容体をトリガーとしたＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の阻害を示すことも含まれてもよい（例：Zhu et al., 2005. Nature Immunol. 6:1245-1252）。
【0183】
好ましい免疫チェックポイントタンパク質阻害薬は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体である。複数のＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３およびＫＩＲ阻害薬が公知であり、これら公知の免疫チェックポイントタンパク質阻害薬と同様に、代替的な免疫チェックポイント阻害薬が（近い）将来開発されることもある。例えば、イピリムマブは、現在、ヤーボイ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の名称で市販されている完全ヒトＣＴＬＡ－４遮断抗体である。第２のＣＴＬＡ－４阻害薬はトレメリムマブ（Ribas et al, 2013, J. Clin. Oncol. 31:616-22において参照）である。ＰＤ－１阻害薬の例としては、限定するものではないが、ラムブロリズマブ（例：国際公開第２００８／１５６７１２号においてｈＰＤ１０９Ａおよびそのヒト化誘導体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７と開示、Hamid et al., N. Engl. J. Med. 369: 134-144 2013）またはピジリズマブ（Rosenblatt et al., 2011. J. Immunother. 34:409-18に開示）等のヒトＰＤ－１を遮断するヒト化抗体、さらにはニボルマブ（以前はＭＤＸ－１１０６またはＢＭＳ－９３６５５８として知られる、Topalian et al., 2012. N. Eng. J. Med. 366:2443-2454、米国特許第８，００８，４４９号に開示）等の完全ヒト抗体が挙げられる。他のＰＤ－１阻害薬としては、可溶性ＰＤ－１リガンドの提示が挙げられ、限定されるものではないが、Ｂ７－ＤＣ－ＩｇまたはＡＭＰ－２４４（Mkrtichyan M, et al. J Immunol. 189:2338-47 2012に開示）としても知られるＰＤ－Ｌ２ Ｆｃ融合タンパク質、および治療用に現在研究中および／または開発中の他のＰＤ－１阻害薬が挙げられる。加えて、免疫チェックポイント阻害薬としては、限定されるものではないが、ＭＥＤＩ－４７３６（国際公開第２０１１０６６３８９号に開示），ＭＰＤＬ３２８０Ａ（米国特許第８，２１７，１４９号に開示）およびＭＩＨ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（１６．５９８３．８２）より入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）等のＰＤ－Ｌを遮断するヒト化または完全ヒト抗体および現在研究中および／または開発中の他のＰＤ－Ｌ１阻害薬が挙げられる。本発明によると、免疫チェックポイント阻害薬は、好ましくは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１の阻害薬から選択され、例えば、上述した公知のＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害薬（イピリムマブ、トレメリムマブ、ラムブロリズマブ（ｌａｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ－２４４、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＩＨ１）から選択される。これら免疫チェックポイントタンパク質の公知の阻害薬はそのまま使用してもよいし、類似体、特にキメラ化、ヒト化またはヒト型の抗体を使用してもよい。
【0184】
本願で使用する「約」という用語は、±１０％を表す。
【0185】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【0186】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
【0187】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、組成物、方法又は構造が、追加の成分、工程、及び／又は部分を含み得るが、当該追加の成分、工程、及び／又は部分が、特許請求の範囲に記載された組成物、方法、又は構造の基本的及び新規な特徴を大きく変化させない場合に限られることを意味する。
【0188】
本明細書で使用する場合、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数も対象とする。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１種の化合物」は、複数の化合物を含み、それらの混合物も含み得る。
【0189】
本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限をなすものと解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲の全部、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も具体的に開示するとみなされるべきである。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
【0190】
本明細書において数値範囲を示す場合は常に、示された範囲内の任意の記載された数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数と「の間の範囲」という語句と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という語句とは、本明細書で互換的に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、第１の指示数と第２の指示数との間の分数及び整数の全部とを含むことを意図する。
【0191】
本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の従事者に既知のもの、又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものを含むが、これらに限定されない。
【0192】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行を抑制し、実質的に阻害し、遅延、又は逆転させ、状態の臨床的若しくは審美的な症状を実質的に改善することを含む。一実施形態において、方法は、状態の臨床的又は審美的症状の出現を実質的に予防するためのものである。
【0193】
明確さのために別個の実施形態との関連において記載した本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施形態との関連において記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、又は任意の好適な部分的な組み合わせ、又は適宜、本発明の他の任意の記載された実施形態に対しても提供され得る。さまざまな実施形態に関連して記載される特定の特徴は、その要素なしでは実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須の特徴であるとみなすべきではない。
【0194】
本明細書に上記され、特許請求の範囲において特許請求される本発明のさまざまな実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的裏付けが見出される。
【実施例】
【0195】
以下では実施例を参照する。本実施例は、上記の説明とともに本発明のいくつかの実施形態を非限定的な様式で例示するものである。
【0196】
材料及び方法
再発性ネオアンチゲン候補の優先順位付けのためのデータ駆動型解析
患者データを用いたＨＬＡ／変異の同時発生解析
ＴＣＧＡ仮コホートデータを使用し、合計８０３８人の患者を蓄積した３７，６１，６２。９１７６人のＴＣＧＡ患者に関する既報のようの高分解能ＨＬＡ－Ｉタイピングも入手した。２種の情報源の交点は、変異とＨＬＡによりアノテーションされた合計６８４０人の患者からなるコホートをもたらし、その内の３６８人はメラノーマ患者であった。１１０３３人の患者の変異とＨＬＡのデータは汎癌であり、２２１人のメラノーマ患者を含み、これらを用いて、記載済みの方法で処理した。ＨＬＡタイピングをしたサンプルについて、それらのＲＡＳ．Ｑ６１ステータスに基づくアノテーションを行った。２０２０年８月３１日付でＮＲＡＳ（ＥＮＳＴ０００００３６９５３５）、ＫＲＡＳ（ＥＮＳＴ０００００２５６０７８）およびＨＲＡＳ（ＥＮＳＴ０００００４５１５９０） Ｅｎｓｅｍｂｌ ｖ１０１のカノニカルな転写産物識別子を得、２０２０年８月３０日付でそれらのタンパク質コード配列の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）をＧｅｎｃｏｄｅ ｖ３５から得た。６９人のメラノーマ患者からなる既報のＭＥＬＡ－ＡＵデータセットを得た。これら３種のデータセットのそれぞれについて、ＲＡＳ．Ｑ６１変異と共に出現する全てのＨＬＡ－Ｉアレルのリストを汎癌およびメラノーマについて計算した。各ＨＬＡ／変異組み合わせについてメラノーマおよび汎癌における頻度を計算した。ＴＣＧＡデータセットについては、ＨＬＡ－Ｉ頻度をＲＡＳ．Ｑ６１変異と一般的な集団との間で比較した（ＦＤＲ補正付きのフィッシャー抽出試験）。
再発性ネオアンチゲン候補の優先順位付けのためのデータ駆動型解析
患者データを用いたＨＬＡ／変異の同時発生解析
ＴＣＧＡ仮コホートデータを使用し、合計８０３８人の患者を蓄積した３７，６１，６２。９１７６人のＴＣＧＡ患者に関する既報のようの高分解能ＨＬＡ－Ｉタイピングも入手した。２種の情報源の交点は、変異とＨＬＡによりアノテーションされた合計６８４０人の患者からなるコホートをもたらし、その内の３６８人はメラノーマ患者であった。１１０３３人の患者の変異とＨＬＡのデータは汎癌であり、２２１人のメラノーマ患者を含み、これらを用いて、記載済みの方法で処理した。ＨＬＡタイピングをしたサンプルについて、それらのＲＡＳ．Ｑ６１ステータスに基づくアノテーションを行った。２０２０年８月３１日付でＮＲＡＳ（ＥＮＳＴ０００００３６９５３５）、ＫＲＡＳ（ＥＮＳＴ０００００２５６０７８）およびＨＲＡＳ（ＥＮＳＴ０００００４５１５９０） Ｅｎｓｅｍｂｌ ｖ１０１のカノニカルな転写産物識別子を得、２０２０年８月３０日付でそれらのタンパク質コード配列の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）をＧｅｎｃｏｄｅ ｖ３５から得た。６９人のメラノーマ患者からなる既報のＭＥＬＡ－ＡＵデータセットを得た。これら３種のデータセットのそれぞれについて、ＲＡＳ．Ｑ６１変異と共に出現する全てのＨＬＡ－Ｉアレルのリストを汎癌およびメラノーマについて計算した。各ＨＬＡ／変異組み合わせについてメラノーマおよび汎癌における頻度を計算した。ＴＣＧＡデータセットについては、ＨＬＡ－Ｉ頻度をＲＡＳ．Ｑ６１変異と一般的な集団との間で比較した（ＦＤＲ補正付きのフィッシャー抽出試験）。
【0197】
ＮｅｔＭＨＣｐａｎ予測
ＲＡＳ．Ｑ６１誘導ネオペプチドの予測にｎｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０を使用した３。ＵｓｉｎｇＮＲＡＳタンパク質配列を用いて、６１位に隣接する２７アミノ酸長の伸長さを抽出した。この配列は、ＲＡＳバリアント間で保存されており、よってＮＲＡＳ、ＫＲＡＳおよびＨＲＡＳを代表するものである。６１位のグルタミンをアルギニン、リシン、ロイシンまたはヒスチジンで置換することで４種の変異バリアントを構築した。全５種の配列をＦＡＳＴＡフォーマットに包み込み、解析した患者データベースにおいてＲＡＳ．Ｑ６１変異と共に出願するＨＬＡアレルについて作製したリスト共にｎｅｔＭＨＣｐａｎに対するインプットとして機能した。長さ８～１４アミノ酸の結合ペプチドについてスキャンするようにアルゴリズムを設定し、０．５≦％Ｒａｎｋ≦２とランク付けされたペプチドは弱い結合物であり、％Ｒａｎｋ≦０．５とランク付けされたペプチドは強い結合物である。６１位をまたぐペプチドのみが残るようにアウトプットをフィルタリングした。‘ｂｅｓｔ ％Ｒａｎｋ’スコアを予測ネオペプチドにわたって列挙することで、各ＨＬＡ／変異組み合わせにアサインした。
ＲＡＳ．Ｑ６１誘導ネオペプチドの予測にｎｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０を使用した３。ＵｓｉｎｇＮＲＡＳタンパク質配列を用いて、６１位に隣接する２７アミノ酸長の伸長さを抽出した。この配列は、ＲＡＳバリアント間で保存されており、よってＮＲＡＳ、ＫＲＡＳおよびＨＲＡＳを代表するものである。６１位のグルタミンをアルギニン、リシン、ロイシンまたはヒスチジンで置換することで４種の変異バリアントを構築した。全５種の配列をＦＡＳＴＡフォーマットに包み込み、解析した患者データベースにおいてＲＡＳ．Ｑ６１変異と共に出願するＨＬＡアレルについて作製したリスト共にｎｅｔＭＨＣｐａｎに対するインプットとして機能した。長さ８～１４アミノ酸の結合ペプチドについてスキャンするようにアルゴリズムを設定し、０．５≦％Ｒａｎｋ≦２とランク付けされたペプチドは弱い結合物であり、％Ｒａｎｋ≦０．５とランク付けされたペプチドは強い結合物である。６１位をまたぐペプチドのみが残るようにアウトプットをフィルタリングした。‘ｂｅｓｔ ％Ｒａｎｋ’スコアを予測ネオペプチドにわたって列挙することで、各ＨＬＡ／変異組み合わせにアサインした。
【0198】
腫瘍組織、細胞系、ＴＩＬおよびＰＢＭＣ
転移性メラノーマ細胞系１７Ｔ、１３５Ｔ、１０８Ｔ、並びにその同種ＴＩＬ産物を確立した。確立されたＴＩＬを、既報のように、高速増殖プロトコル（ＲＥＰ）で増殖させた６。
転移性メラノーマ細胞系１７Ｔ、１３５Ｔ、１０８Ｔ、並びにその同種ＴＩＬ産物を確立した。確立されたＴＩＬを、既報のように、高速増殖プロトコル（ＲＥＰ）で増殖させた６。
【0199】
市販のメラノーマ細胞系ＳＫ－ＭＥＬ－３０（ＡＣＣ－１５１）をＤＳＭＺより購入した。追加の腫瘍細胞系： ＨｕＴ７８、Ｈｓ９４０ＴおよびＣａｌｕ６、さらにはＨＢ９５（Ｗ６／３２）およびＨＢ１４５（ＩＶＡ１２）ハイブリドーマ細胞をＡＴＣＣより購入した。研究目的の献血由来の健常ドナー白血球調製物はＭＤＡ（イスラエル国の国立血液事業者）より購入した。ＰＢＭＣは、フィコール－プラーク（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、密度勾配遠心分離によりこれらから抽出し、ＦＣＳ／１０％ ＤＭＳＯ内で等量を凍結保存し、実験ごとに必要に応じて融解した。
【0200】
ＨＬＡ親和性カラムの調製のためのｐａｎ－ＨＬＡ－Ｉおよびｐａｎ－ＨＬＡ－ＩＩ抗体の精製にハイブリドーマ細胞ＨＢ９５およびＨＢ１４５を使用した。全細胞系を定期的に試験し、マイコプラズマのコンタミネーションについて陰性であるとわかった（ＥＺ－ＰＣＲマイコプラズマキット、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）。
【0201】
メラノーマ細胞系を、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、２．５％のＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩからなる完全ＲＰＭＩ培地で培養した。Ｂ－ＬＣＬは、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加した完全ＲＰＭＩ培地からなるＢ細胞培地で培養した。ＴＩＬおよびＰＢＭＣは、１０％の熱不活化ヒト血清ＡＢ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５．５×１０－５Ｍのβ－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩからなるＴ細胞培地で培養した。ＴＩＬは、下流のアッセイで使用する３日前に融解し、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を含有するＴ細胞培地で回復させた。ＰＢＭＣは実験の７日前に融解し、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２と５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体（＃３１７３０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有するＴ細胞培地内でＴ細胞を選択した。ＰＢＭＣは、融解から３～４日後に、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴ細胞培地で継代培養した。カスパーゼ３殺傷アッセイおよびネオアンチゲン誘導増殖アッセイにおいて、Ｔ細胞培地を共インキュベーションに使用した。完全ＲＰＭＩ培地を一晩のＴＩＬ／Ｂ－ＬＣＬとＰＢＭＣ／Ｂ－ＬＣＬの共インキュベーションに使用した。
【0202】
複合体ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）内のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の構造モデリング
ＲＡＳ．６１誘導ペプチドと複合体化したＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の構造について、ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体デカペプチドとの複合体内のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の結晶構造を用いてモデリングを実施した（ＰＤＢ：６ａｔ９）１。ＨＬＡ受容体と複合体化したＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ペプチドおよびＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ（配列番号３５）ペプチドを得るために、結晶学的に結合したペプチドを手動で変異させた。ＨＬＡ構造をペプチド結合ドメイン（Ａ鎖、１から１８０残基）まで切り詰めた。得られたペプチド－ＨＬＡ構造を、ペプチドドッキングおよび分子動力学計算の開始立体構造として用いた。
ＲＡＳ．６１誘導ペプチドと複合体化したＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の構造について、ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体デカペプチドとの複合体内のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の結晶構造を用いてモデリングを実施した（ＰＤＢ：６ａｔ９）１。ＨＬＡ受容体と複合体化したＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ペプチドおよびＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ（配列番号３５）ペプチドを得るために、結晶学的に結合したペプチドを手動で変異させた。ＨＬＡ構造をペプチド結合ドメイン（Ａ鎖、１から１８０残基）まで切り詰めた。得られたペプチド－ＨＬＡ構造を、ペプチドドッキングおよび分子動力学計算の開始立体構造として用いた。
【0203】
ペプチドのドッキングは、自由にアクセス可能なウエブサーバー上のインターフェースであるＦｌｅｘＰｅｐＤｏｃｋ２、ＣｌｕｓＰｒｏ３およびＤＩＮＣ４を用いて実施した。加えて、分子動力学計算を、ＧＲＯＭＡＣＳバージョン２０１８．３．５とＧＲＯＭＯＳ ５４ａ７ユナイテッドアトム力場６を用いて実施した。複合体を、溶質と箱の壁との最小距離が１０Åとなる斜方形１２面体の箱に入れて、ＳＰＣ水により溶媒和させた。５Ｎａ＋の対イオンの添加によりシステムの電荷を中和した。最大５，０００工程の最急降下アルゴリズムを用いた最小化により立体不調和を除去した。システムを一定の容量と温度（ＮＶＴ アンサンブル）で平衡化し、全てのタンパク質とペプチドの重原子を１０Ｋ、１００ｐｓで拘束し、続いて３００Ｋ、１００ｐｓ、拘束なしでさらに平衡化した。システムの圧力を、００Ｋ、３００ｐｓで一定大気圧下（ＮＰＴアンサンブル）のシミュレーションにより、平衡化した。全ての平衡化工程において、ＬＩＮＣＳアルゴリズム７を用いて、タンパク質の残基に位置的な拘束を加えた。平衡化によってもたらされる最終座標を、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）システムおよびＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ（配列番号３５）システムの両方について、５つの独立した生産工程を開始するために使用し、それぞれをＮＰＴアンサンブルで５００ｎｓ実施した。温度は、０．１ｐｓの時定数とカップリングした速度スケーリングサーモスタット８を用いて３００Ｋで一定に保ち、システムの圧力は、２ｐｓの時定数とカップリングしたＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ－Ｒａｈｍａｎ圧調節器９を用いて１バールで一定に保った。システムの動きを統合するために、２ｆｓの時間ステップを使用した。長距離静電場を粒子 Ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ１０法を用いて計算し、一方、短距離カットオフ値は、ｖｄＷおよびクーロン効果の両方について、１．０ｎｍに設定した。結合したときの立体構造に着目するために、ＲＡＳペプチドのＮ末およびＣ末がそれぞれＨＬＡ のＢポケットおよびＦポケットの７Å以内である立体構造のみを解析した。下記原子間の距離を測定した：ＨＬＡのＴｙｒ１７１の側鎖ヒドロキシの酸素（ＯＨ）とペプチドのＩｌｅ１主鎖アミドの窒素（Ｎ）の間、並びにＨＬＡのＴｙｒ１２３の側鎖フェノールの炭素（ＣＺ）とペプチドのＴｙｒ１０の側鎖ガンマ炭素（ＣＧ）との間。分子構造はＰｙＭＯＬバージョン１．３１１を用いて視覚化した。ドッキングシミュレーションフレームの立体構造および結合シミュレーションフレームの立体構造を、ＨＬＡペプチド水素結合相互作用によってクラスター化した。ＭＤＴｒａｊ１３バージョン１．９．２に実装されるＷｅｒｎｅｔ－Ｎｉｌｓｓｏｎの判断基準を用いて水素結合を検出した。クラスターの重心は、対応する水素結合フィンガープリントが全クラスターメンバーに対して最も小さいＭａｎｈａｔｔａｎ／Ｃｉｔｙｂｌｏｃｋ距離を有するシミュレーションフレームとして同定した。
【0204】
腫瘍組織のＲＡＳ．Ｑ６１変異ステータスおよびＨＬＡタイピング
１７Ｔおよび１０８Ｔについて、ＲＡＳ．Ｑ６１ステータスおよびＨＬＡタイピングの両方を、全エキソームシーケンシングから抽出し、ＨＬＡタイピングは、ＰｏｌｙＳｏｌｖｅｒソフトウエア１４を用いて決定した。ＭＭ１２１２２４ ＨＬＡとＭＭ１５０４１４ ＨＬＡおよび変異データは協力者によって提供された。１３５Ｔおよび急速冷凍腫瘍については、ＲＡＳ．Ｑ６１ステータスはは協力者によって提供され、一方、ＱＩＡＧＥＮのＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（＃６９５０４）を用いて抽出したゲノムＤＮＡをＨＬＡタイピング（ＧｅｎＤｘ ＳＢＴｅｘｃｅｌｌｅｒａｔｏｒ ＨＬＡ－Ａキット＃４１００２３４またはＭＸ６－１ ＮＧＳタイピングきっと、＃７３７１４６４）に利用した。細胞系ＳＫ－ＭＥＬ－３０、ＭＺ２－ｍｅｌ、ＨｕＴ７８、Ｈｓ９４０ＴおよびＣａｌｕ６に関する変異およびＨＬＡデータは、“ＴＲＯＮ細胞系ポータル”１４，１５から抽出した。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のＨＬＡタイピングはＩＨＷＧＣｅｌｌ ａｎｄ ＤＮＡＢａｎｋ１６より提供された。
１７Ｔおよび１０８Ｔについて、ＲＡＳ．Ｑ６１ステータスおよびＨＬＡタイピングの両方を、全エキソームシーケンシングから抽出し、ＨＬＡタイピングは、ＰｏｌｙＳｏｌｖｅｒソフトウエア１４を用いて決定した。ＭＭ１２１２２４ ＨＬＡとＭＭ１５０４１４ ＨＬＡおよび変異データは協力者によって提供された。１３５Ｔおよび急速冷凍腫瘍については、ＲＡＳ．Ｑ６１ステータスはは協力者によって提供され、一方、ＱＩＡＧＥＮのＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（＃６９５０４）を用いて抽出したゲノムＤＮＡをＨＬＡタイピング（ＧｅｎＤｘ ＳＢＴｅｘｃｅｌｌｅｒａｔｏｒ ＨＬＡ－Ａキット＃４１００２３４またはＭＸ６－１ ＮＧＳタイピングきっと、＃７３７１４６４）に利用した。細胞系ＳＫ－ＭＥＬ－３０、ＭＺ２－ｍｅｌ、ＨｕＴ７８、Ｈｓ９４０ＴおよびＣａｌｕ６に関する変異およびＨＬＡデータは、“ＴＲＯＮ細胞系ポータル”１４，１５から抽出した。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のＨＬＡタイピングはＩＨＷＧＣｅｌｌ ａｎｄ ＤＮＡＢａｎｋ１６より提供された。
【0205】
ｃＤＮＡシーケンシング
ＲＮｅａｓｙミニキット（＃７４１０４，ＱＩＡＧＥＮ）を製造社のプロトコルに従って使用し、メラノーマ細胞系１７Ｔ、１３５Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－３０、ＭＭ１２１２２４、ＭＺ２－ｍｅｌ、ＨｕＴ７８、Ｃａｌｕ６およびＨｓ９４０Ｔから全ＲＮＡを抽出し、３０μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理－蒸留水で溶出した。ＲＴ－ｑＰＣＲキット用のｉＳｃｒｉｐｔ逆転写スーパーミックス（＃１７０８８４１，Ｂｉｏｒａｄ）を製造社のプロトコルに従って使用し、一本鎖相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成に合計５００ｎｇのＲＮＡを使用した。６１位を含むＮＲＡＳ領域およびＫＲＡＳ領域を、下記プライマーを用いるＰＣＲで増幅した。
ＮＲＡＳフォワード： ５’－ＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号３６）、
ＮＲＡＳリバース： ５’－ＧＴＡＴＣＡＡＣＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣ３’（配列番号３７）、
ＫＲＡＳフォワード： ５’－ＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴ－３’（配列番号３８）、と
ＫＲＡＳリバース： ５’－ＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡ－３’（配列番号３９）。
ＲＮｅａｓｙミニキット（＃７４１０４，ＱＩＡＧＥＮ）を製造社のプロトコルに従って使用し、メラノーマ細胞系１７Ｔ、１３５Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－３０、ＭＭ１２１２２４、ＭＺ２－ｍｅｌ、ＨｕＴ７８、Ｃａｌｕ６およびＨｓ９４０Ｔから全ＲＮＡを抽出し、３０μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理－蒸留水で溶出した。ＲＴ－ｑＰＣＲキット用のｉＳｃｒｉｐｔ逆転写スーパーミックス（＃１７０８８４１，Ｂｉｏｒａｄ）を製造社のプロトコルに従って使用し、一本鎖相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成に合計５００ｎｇのＲＮＡを使用した。６１位を含むＮＲＡＳ領域およびＫＲＡＳ領域を、下記プライマーを用いるＰＣＲで増幅した。
ＮＲＡＳフォワード： ５’－ＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号３６）、
ＮＲＡＳリバース： ５’－ＧＴＡＴＣＡＡＣＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣ３’（配列番号３７）、
ＫＲＡＳフォワード： ５’－ＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴ－３’（配列番号３８）、と
ＫＲＡＳリバース： ５’－ＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡ－３’（配列番号３９）。
【0206】
２μｌのｃＤＮＡをＰＣＲ反応用に取り出し、最終容量が２５μｌとなるように２×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（＃ＫＭ２６０５，ＫＡＰＡＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）と混合し、以下のパラメーターを用いる標準ＰＣＲプログラムを使用した：ｏｎｅサイクルａｔ９５℃で３分を１サイクル、ｓｏｆ９８℃で２０秒を３５サイクル、５８℃のアニーリング温度で３０秒、および７２℃で１分。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分離し、次にＷｉｚａｒｄ ＳＶゲル及びＰＣＲクリーンアップシステム（＃Ａ９２８１，Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製し、続いて３７３０ ＤＮＡアナライザー（ＡＢＩ）を用いてサンガーシーケンシングを実施した。シーケンシングプライマーはＰＣＲプライマーと同一であった。ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウエア（バージョン４．３．２）を用いてシーケンシング結果を解析した。
【0207】
二重トランスフェクタント７２１．２２１の確立
ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１および２５－ｍｅｒのミニジーン（ＲＡＳ．Ｑ６１ＫおよびＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ）のそれぞれをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ５’末および３’末の隣接するＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有するように設計した。設計したものは合成二本鎖ＤＮＡとしてＴｗｉｓｔ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＩＤＴ（ｇＢｌｏｃｋ）から購入し、対応する会社のプラットフォームに基づき、ヒト発現のために最適化した。ＰＣＲ増幅テンプレートをＸｂａＩ／ＮｏｔＩ（ＮＥＢ，＃Ｒ０１４５Ｌおよび＃Ｒ０１８９Ｌ）を用いて、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１α－Ｎｅｏ（ＳＢＩ，＃ＣＤ５１４Ｂ－１）およびｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１α－ＧｒｅｅｎＰｕｒｏ（ＳＢＩ，＃ＣＤ５１３Ｂ－１）内に制限的にクローニングした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，＃Ｍ０２０２Ｌ）を用いて、ＨＬＡ挿入物およびミニジーン挿入物をそれぞれネオマイシンベクターおよびプロマイシンベクターに連結し、ｐＣＤＨ－Ｎｅｏ－Ａ＊０１：０１、ｐＣＤＨ－Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ｍＲＡＳ．Ｑ６１ＫおよびｐＣＤＨ－Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｒを得た。配列の立証されているクローンプラスミドを、エンベローププラスミドおよびパッケージングプラスミドＰＭＤ２．ＧおよびｐｓＰＡＸ２とのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１６６８０２７）を製造社の説明書に従って使用した共トランスフェクションによるレンチウイルス粒子の製造に使用した。回収したウイルス含有上清をろ過し、等量に分け、－８０℃で保存した。ＨＬＡ－Ｉ不足ヒトＢ－ＬＣＬ ７２１．２２１細胞を段階的に感染させ、具体的には、第１にＨＬＡ－Ａ＊０１：０１を発現するようにし、次にミニジーンウイルス（ＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ）に感染させた。感染から４８～７２時間後に８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）または１μｇ／ｍｌのプロマイシンのいずれかによる選択を開始した。感染細胞を選択下で連続的に増殖させた。ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の産生的な過剰発現は、感染から約２週間後に、モノクローナル抗体Ｗ６／３２を用いたフローサイトメトリーにより立証された。ＨＬＡ発現の立証後に、ミニジーン過剰発現を誘導するために、上述したように７２１．２２１Ａ＊０１：０１細胞を感染させて選択した。７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ細胞および７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ細胞を両方の選択試薬を含む培地中で約２週間培養し、その後、ＨＬＡペプチドミクスのための拡張の前に、抗生物質無しの培地でさらに２週間増殖させた。
ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１および２５－ｍｅｒのミニジーン（ＲＡＳ．Ｑ６１ＫおよびＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ）のそれぞれをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ５’末および３’末の隣接するＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有するように設計した。設計したものは合成二本鎖ＤＮＡとしてＴｗｉｓｔ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＩＤＴ（ｇＢｌｏｃｋ）から購入し、対応する会社のプラットフォームに基づき、ヒト発現のために最適化した。ＰＣＲ増幅テンプレートをＸｂａＩ／ＮｏｔＩ（ＮＥＢ，＃Ｒ０１４５Ｌおよび＃Ｒ０１８９Ｌ）を用いて、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１α－Ｎｅｏ（ＳＢＩ，＃ＣＤ５１４Ｂ－１）およびｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１α－ＧｒｅｅｎＰｕｒｏ（ＳＢＩ，＃ＣＤ５１３Ｂ－１）内に制限的にクローニングした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，＃Ｍ０２０２Ｌ）を用いて、ＨＬＡ挿入物およびミニジーン挿入物をそれぞれネオマイシンベクターおよびプロマイシンベクターに連結し、ｐＣＤＨ－Ｎｅｏ－Ａ＊０１：０１、ｐＣＤＨ－Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ｍＲＡＳ．Ｑ６１ＫおよびｐＣＤＨ－Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｒを得た。配列の立証されているクローンプラスミドを、エンベローププラスミドおよびパッケージングプラスミドＰＭＤ２．ＧおよびｐｓＰＡＸ２とのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１６６８０２７）を製造社の説明書に従って使用した共トランスフェクションによるレンチウイルス粒子の製造に使用した。回収したウイルス含有上清をろ過し、等量に分け、－８０℃で保存した。ＨＬＡ－Ｉ不足ヒトＢ－ＬＣＬ ７２１．２２１細胞を段階的に感染させ、具体的には、第１にＨＬＡ－Ａ＊０１：０１を発現するようにし、次にミニジーンウイルス（ＲＡＳ．Ｑ６１ＫまたはＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ）に感染させた。感染から４８～７２時間後に８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）または１μｇ／ｍｌのプロマイシンのいずれかによる選択を開始した。感染細胞を選択下で連続的に増殖させた。ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の産生的な過剰発現は、感染から約２週間後に、モノクローナル抗体Ｗ６／３２を用いたフローサイトメトリーにより立証された。ＨＬＡ発現の立証後に、ミニジーン過剰発現を誘導するために、上述したように７２１．２２１Ａ＊０１：０１細胞を感染させて選択した。７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ細胞および７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ細胞を両方の選択試薬を含む培地中で約２週間培養し、その後、ＨＬＡペプチドミクスのための拡張の前に、抗生物質無しの培地でさらに２週間増殖させた。
【0208】
ＨＬＡペプチドミクス
膜ＨＬＡ分子の産生および精製
それぞれ２×１０８細胞からなる細胞ペレットを回収し、ＰＢＳ中に０．２５％のデオキシコレートナトリウム、０．２ｍＭのヨードアセトアミド、１ｍＭのＥＤＴＡ、１：２００のプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８３４０）、１ｍＭのＰＭＳＦおよび１％のオクチル－β－Ｄ－グルコピラノシドを含有する溶解バッファーを用いて氷上で溶解した。サンプルを次に４℃で１時間インキュベートした。溶解物を４℃、４８，０００ｇで６０分の遠心分離によって清澄化、次にプロテインＡセファロースビーズを含有する前清澄化カラムに通した。
膜ＨＬＡ分子の産生および精製
それぞれ２×１０８細胞からなる細胞ペレットを回収し、ＰＢＳ中に０．２５％のデオキシコレートナトリウム、０．２ｍＭのヨードアセトアミド、１ｍＭのＥＤＴＡ、１：２００のプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８３４０）、１ｍＭのＰＭＳＦおよび１％のオクチル－β－Ｄ－グルコピラノシドを含有する溶解バッファーを用いて氷上で溶解した。サンプルを次に４℃で１時間インキュベートした。溶解物を４℃、４８，０００ｇで６０分の遠心分離によって清澄化、次にプロテインＡセファロースビーズを含有する前清澄化カラムに通した。
【0209】
プロテインＡセファロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，既報の通り）１７，１８．の共有結合したｐａｎ－ＨＬＡ－Ｉ抗体（ＨＢ９５ハイブリドーマ細胞から精製したＷ６／３２抗体）を用いて、清澄化溶解物からＨＬＡ－Ｉ分子の免疫親和性精製を行った。親和性カラムを、第１に４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０で洗浄し、次に２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０で洗浄した。ＨＬＡペプチドおよびＨＬＡ分子を次に１％のトリフルオロ酢酸で溶出させ、続いて溶出画分をＳｅｐ－Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）に結合させることで、タンパク質からペプチドを分離した。ペプチドの溶出は、０．１％のトリフルオロ酢酸中の２８％のアセトニトリルで実施した１７。
【0210】
溶出ＨＬＡペプチドの同定
液体クロマトグラフィー：
細胞系１７Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－３０およびＭＭ１２１２２４： ＨＬＡペプチドを真空遠心分離によって乾燥し、０．１％のギ酸で可溶化し、０．１％ギ酸中の７～４０％のアセトニトリル勾配で１８０分、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８－Ａｑｕａ（ドイツ国、アンマーブーフエントリンゲン、Ｄｒ． Ｍａｉｓｃｈ，ＧｍｂＨ）を圧縮したキャピラリーカラムで０．１５μＬ／分で既報１９のように分離させた。細胞系１７Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－３０およびＭＭ１２１２２４については、クロマトグラフィーを、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ－Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のタンデム質量分析機にエレクトスプレーを介して結合したＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ＲＳＬＣナノキャピラリーＵＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。ＨＬＡペプチドは、０．１％のギ酸中の５％～２８％のアセトニトリルの直線勾配、流速０．１５μｌ／分で、２時間かけて溶出させた。
液体クロマトグラフィー：
細胞系１７Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－３０およびＭＭ１２１２２４： ＨＬＡペプチドを真空遠心分離によって乾燥し、０．１％のギ酸で可溶化し、０．１％ギ酸中の７～４０％のアセトニトリル勾配で１８０分、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８－Ａｑｕａ（ドイツ国、アンマーブーフエントリンゲン、Ｄｒ． Ｍａｉｓｃｈ，ＧｍｂＨ）を圧縮したキャピラリーカラムで０．１５μＬ／分で既報１９のように分離させた。細胞系１７Ｔ、ＳＫ－ＭＥＬ－３０およびＭＭ１２１２２４については、クロマトグラフィーを、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ－Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のタンデム質量分析機にエレクトスプレーを介して結合したＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ＲＳＬＣナノキャピラリーＵＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。ＨＬＡペプチドは、０．１％のギ酸中の５％～２８％のアセトニトリルの直線勾配、流速０．１５μｌ／分で、２時間かけて溶出させた。
【0211】
細胞系７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ，７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ，１３５Ｔ、ＭＺ２－ＭＥＬ、ＨｕＴ７８、Ｈｓ９４０Ｔおよび４腫瘍のサンプル（Ｍｅｌａ－１８３、Ｍｅｌａ－４９、ＭＭ－１３６９およびＭＭ－１３１９）： ＨＬＡペプチドを真空遠心分離によって乾燥し、９７：３の水：アセトニトリル ０．１％のギ酸で可溶化した。サンプルの脱塩は、逆相Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８補足カラム（内径１８０μｍ、長さ２０ｍｍ、粒子径５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いてオンラインで実施した。ペプチドの分離は、流速０．３５μｌ／分のＴ３ＨＳＳナノカラム（内径７５μｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子径１．８μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用い、０．１％のギ酸中の５％～２８％のアセトニトリル勾配で１２０分かけて行った。クロマトグラフィーは、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ－Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のタンデム質量分析機にエレクトスプレーを介して結合した、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ（Ｗａｔｅｒｓ）で実施した。
【0212】
質量分析： 細胞系７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ，７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｒおよび１７Ｔをディスカバリーモードで走らせた。細胞系ＳＫ－ＭＥＬ－３０、ＭＭ１２１２２４および１３５Ｔのみならず、等量の７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ、７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ、１７Ｔ、ＭＺ２－ＭＥＬ、ＨｕＴ７８、Ｈｓ９４０Ｔのサンプルおよび４種の腫瘍サンプル（Ｍｅｌａ－１８３、Ｍｅｌａ－４９、ＭＭ－１３６９およびＭＭ－１３１９）を絶対標的化質量分析で解析し、特にＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）またはＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）について探索し、重ペプチドスパイクインを利用して、ペプチドの定量も可能にした。重リシン（１３Ｃ６；１５Ｎ２）を導入した合成重同位体標識ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）または重アルギニン（１３Ｃ６；１５Ｎ４）を導入した合成重同位体標識ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）はＪＰＴから純度＞９５％のものを購入した。
【0213】
ディスカバリーモード： 高エネルギー衝突誘起解離によってペプチドを断片化する、データ依存“トップ１０”法を用いてデータを獲得した。標的値が３×１０６イオン、２００ｍ／ｚで分解能解像度７０，０００の条件でフルスキャンのＭＳスペクトルを獲得した。最大射出時間が通常１００ｍｓｅｃの条件で、自動利得制御（ＡＧＣ）標的値が１０５となるまでイオンを蓄積した。ペプチド一致のオプションはＰｒｅｆｅｒｒｅｄに設定した。正常化衝突エネルギーは２５％に設定し、ＭＳ／ＭＳ分解能は２００ｍ／ｚで１７，５００とした。断片化したｍ／ｚ値は、さらなる選択から動的に２０秒間排除した。ＭＳデータは、ＦＤＲを０．０５として、ＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．５．８．３）２０を用いて解析した。ペプチドの同定は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース２１（２０１７年４月）のヒトセクションおよびＷＥＳによって１７Ｔに対して同定された変異配列を含むカスタマイズされた参照データベースに基づいていた。
【0214】
ＳＫ－ＭＥＬ－３０、ＭＭ１２１２２４絶対標的化モード： 質量分析計に注入したペプチドームサンプルに０．１ｐｍｏｌの重ペプチドを加えた。次に解析を、ＰＲＭ法を用いて実施した。ＭＳ／ＭＳ獲得のために、インクルージョンリストを方法にインポートした。インクルージョンリスト内のイオンを断片化するために、装置をフルＭＳとＭＳ／ＭＳ獲得との間で切り替えた。フルスキャンＭＳスペクトルは、分解能７０，０００で、質量／電荷数比（ｍ／ｚ）が３５０～１，４００ＡＭＵの条件で獲得した。断片化した質量はＡＧＣ標的値が１０５となるまで蓄積し、最大放射時間を４００ｍｓｅｃおよび１．８ｍ／ｚウインドウとした。解析には、アンドロメダ検索エンジン２２を伴うＭａｘＱｕａｎｔソフトウエア（バージョン１．５．８．３）２０を再度使用した。ペプチドの同定はＵｎｉＰｒｏｔデータベース２１（２０１７年４月）のヒトセクションおよびＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオアンチゲンを含むカスタマイズされた参照データベースに基づいていた。以下のパラメーターを使用した：前駆体イオン質量および断片質量許容差を２０ｐｐｍ、偽陽性率（ＦＤＲ）をＳＫ－ＭＥＬ－３０は０．０５でＭＭ１２１２２４は０．３、並びに、酸化（Ｍｅｔ）、アセチル化（タンパク質のＮ末）および重リシン（１３Ｃ６；１５Ｎ２）の可変修飾。７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ、７２１．２２１Ａ＊０１：０１、ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ、１７Ｔ、１３５Ｔ、ＭＺ２－ＭＥＬ、ＨｕＴ７８、Ｈｓ９４０Ｔおよび４種の腫瘍サンプル（Ｍｅｌａ－１８３、Ｍｅｌａ－４９、ＭＭ－１３６９およびＭＭ－１３１９）：絶対標的化モード。
【0215】
ナノＵＰＬＣを、ナノＥＳＩエミッター（１０μｍのチップ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、米国、マサチューセッツ州、ウォバーン）を介して、ＦｌｅｘＩｏｎナノスプレイ装置（Ｐｒｏｘｅｏｎ）を使用して、四重極型質量分析計（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にオンラインでカップリングした。１０のＰＲＭスキャンごとに１のＭＳ１スキャンを行う並発反応モニタリング（ＰＲＭ）によってデータを獲得した。ＭＳ１スキャン範囲は３００～１８００ｍ／ｚ、分解能は７０，０００、ＡＧＣは３ｅ６および最大放射時間は１２０ｍｓｅｃに設定した。ＰＲＭチャネルは３５，０００の分解能、最大放射時間が２００ｍｓｅｃ、ＡＧＣが２ｅ５、ＮＣＥが２７および単離が１．７ｍ／ｚで獲得した。
【0216】
ペプチドの定量化：
生ＰＲＭデータをＳｋｙｌｉｎｅ２３にインポートした。絶対定量値は、ペプチドごとの全断片化の抽出イオンクロマトグラムを合計し、本来のペプチドの総シグナル対サンプルにスパイクした重標識化内部標準の総シグナルの比を内部標準の量で掛けた値をエクスポートして得た。
生ＰＲＭデータをＳｋｙｌｉｎｅ２３にインポートした。絶対定量値は、ペプチドごとの全断片化の抽出イオンクロマトグラムを合計し、本来のペプチドの総シグナル対サンプルにスパイクした重標識化内部標準の総シグナルの比を内部標準の量で掛けた値をエクスポートして得た。
【0217】
蛍光に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏの殺傷アッセイ
本アッセイにおいては、蛍光量の減少を標的細胞死の定量に用いた２４。レンチウイルス感染および抗生物質選択によってＧＦＰ＋細胞を確立した。蛍光標的細胞を実験の前日に７０％のコンフルエンシーで４８－穴プレート（１７Ｔおよび１３５Ｔをそれぞれ１×１０５および５×１０４細胞／ウエル）に植え付けて付着させた。０：１から４：１の範囲内のエフェクター対標的比で同種ＴＩＬを加え、メラノーマと共に１６時間共インキュベートした。各条件について３組の実験を準備した。インキュベーション後に、非付着ＴＩＬおよび死滅標的細胞をＰＢＳで洗い流した。残存生標的細胞の蛍光をＴｅｃａｎ－Ｍ２００プレートリーダーで定量した。蛍光の読み取りはプレート表面の３ｍｍ上を中心に行った。特異的溶解のパーセントを１００×（Ｃ－Ｘ）／Ｃ（但し、ＣはＴＩＬ無しの条件の蛍光およびＸはＴＩＬ存在下の蛍光）として計算した。
本アッセイにおいては、蛍光量の減少を標的細胞死の定量に用いた２４。レンチウイルス感染および抗生物質選択によってＧＦＰ＋細胞を確立した。蛍光標的細胞を実験の前日に７０％のコンフルエンシーで４８－穴プレート（１７Ｔおよび１３５Ｔをそれぞれ１×１０５および５×１０４細胞／ウエル）に植え付けて付着させた。０：１から４：１の範囲内のエフェクター対標的比で同種ＴＩＬを加え、メラノーマと共に１６時間共インキュベートした。各条件について３組の実験を準備した。インキュベーション後に、非付着ＴＩＬおよび死滅標的細胞をＰＢＳで洗い流した。残存生標的細胞の蛍光をＴｅｃａｎ－Ｍ２００プレートリーダーで定量した。蛍光の読み取りはプレート表面の３ｍｍ上を中心に行った。特異的溶解のパーセントを１００×（Ｃ－Ｘ）／Ｃ（但し、ＣはＴＩＬ無しの条件の蛍光およびＸはＴＩＬ存在下の蛍光）として計算した。
【0218】
Ｂ－ＬＣＬのペプチドのパルス化
合成純度９５％超のペプチド（ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）、ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）、ＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ）（配列番号３５）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔより購入し、ＤＭＳＯに溶解した。ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１を保有するＢ－ＬＣＬを完全培地に１×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、所望のペプチドと、所望の濃度（１０－１１～１０－５）で２～４時間、３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーター内、または直立した１５ｍｌの三角フラスコ内でインキュベートした。全サンプルにおいてＤＭＳＯの容積は１％に維持した。ペプチドなしの対照については、ペプチドのないＤＭＳＯを添加した。ＴＩＬとの共インキュベーションに進む前にＢ細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
合成純度９５％超のペプチド（ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）、ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）、ＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ）（配列番号３５）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔより購入し、ＤＭＳＯに溶解した。ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１を保有するＢ－ＬＣＬを完全培地に１×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、所望のペプチドと、所望の濃度（１０－１１～１０－５）で２～４時間、３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーター内、または直立した１５ｍｌの三角フラスコ内でインキュベートした。全サンプルにおいてＤＭＳＯの容積は１％に維持した。ペプチドなしの対照については、ペプチドのないＤＭＳＯを添加した。ＴＩＬとの共インキュベーションに進む前にＢ細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
【0219】
ＩＦＮγ放出アッセイによるＴ細胞の反応性の解析
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した、ＴＩＬからのＩＦＮγの放出を、反応性の測定に用いた。ＴＩＬを同種メラノーマまたはＢＬＣＬのいずれかと１：１の比（１０５～２×１０６細胞）で、丸底９６穴プレート内で共培養し、３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーター内で一晩インキュベートした。ＴＩＬから分泌された可溶性ＩＦＮγを、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸＤｅｌｕｘｅ（＃４３０１０６）を用い、Ｔｅｃａｎ－Ｍ２００プレートリーダーを使用して共培養上清から定量した。全ての実験を生物学的な３回の繰り返しで実施した。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した、ＴＩＬからのＩＦＮγの放出を、反応性の測定に用いた。ＴＩＬを同種メラノーマまたはＢＬＣＬのいずれかと１：１の比（１０５～２×１０６細胞）で、丸底９６穴プレート内で共培養し、３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーター内で一晩インキュベートした。ＴＩＬから分泌された可溶性ＩＦＮγを、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸＤｅｌｕｘｅ（＃４３０１０６）を用い、Ｔｅｃａｎ－Ｍ２００プレートリーダーを使用して共培養上清から定量した。全ての実験を生物学的な３回の繰り返しで実施した。
【0220】
フローサイトメトリー解析および蛍光活性セルソーティング
特に断りがない限り、フローサイトメトリー実験における染色および解析バッファーとしてＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを使用した。ソーティングの前に細胞を４０μｍのセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃４３１７５０）に通した。フローサイトメトリーのために、単一細胞懸濁液をＢＤ ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩまたはＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を蛍光活性化セルソーティングに使用した。４℃の暗条件で細胞を抗体／テトラマーと共に３０分間インキュベートし、その後、洗浄した。起こり得る干渉を防止するために、テトラマーおよびＴＣＲβまたは抗ＣＤ８染色を順番に実施した。
特に断りがない限り、フローサイトメトリー実験における染色および解析バッファーとしてＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを使用した。ソーティングの前に細胞を４０μｍのセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃４３１７５０）に通した。フローサイトメトリーのために、単一細胞懸濁液をＢＤ ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩまたはＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を蛍光活性化セルソーティングに使用した。４℃の暗条件で細胞を抗体／テトラマーと共に３０分間インキュベートし、その後、洗浄した。起こり得る干渉を防止するために、テトラマーおよびＴＣＲβまたは抗ＣＤ８染色を順番に実施した。
【0221】
テトラマーをＮＩＨテトラマーコア施設から入手し、バックグラウンド染色を最小にするために校正した： ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）（ＢＶ４２１結合）を１：８０００～１００００で使用し、Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）（ＦＩＴＣ結合）を１：４０００で使用した。以下の抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄより購入し、１：１００希釈で使用した：ＣＤ３（ＰＥ／Ｃｙ７，＃３００３１６）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ，＃３１７４０７）、ＣＤ８（ＡＰＣ＃３００９１１またはＦＩＴＣ＃３０１００６）、４－１ＢＢ（ＡＰＣ＃３０９８０９）、マウスＴＣＲβ定常領域（ＡＰＣ，＃１０９２１１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９（ＢＶ４２１，＃３０２２３４）。ｗｉｔｈＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ、抗カスパーゼ３およびＩＦＮγ補足抗体による染色を、開裂カスパーゼ３殺傷およびＩＦＮγ分泌アッセイに記載したように実行した。
【0222】
サイズおよび顆粒度の測定値は生単一細胞のゲートとして機能した。特定した場合、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｐ３５６６）を生／死染色に使用した。ソーティング実験は陽性および陰性のサブ集団を重複無しにゲートした。
【0223】
ＩＦＮγ分泌アッセイ
Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）反応性ＴＩＬのパーセンテージを求めるために、ＩＦＮγ分泌アッセイ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９０－７６２）を製造社の説明書に従って実施した。このアッセイでは、ＩＦＮγ特異的抗体を細胞表面に取り付け、細胞から放出された際に分泌サイトカインを補足する。細胞表面に結合したＩＦＮγ分子は、次に人工表面分子として染色し、細胞をフローサイトメトリーで解析する。この手法では、ＴＣＲ認識ではなく、誘導反応性に基づいてネオアンチゲン特異的細胞が同定されることから、テトラマー染色を補完する。これら実験においてＡＰＣとして機能するＩＨＷ０１１６１細胞を、ペプチドなし（ＤＭＳＯ）または１０μｇ／ｍｌの変異ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ）（配列番号１）または野性型（ＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ）（配列番号３５）ペプチドのいずれかでパルスした。ＴＩＬを４時間にわたり、ＡＰＣと共インキュベートした。ペプチドなしおよび野性型の条件は対照シナリオとなり、ネオアンチゲン特異的反応によるバックグラウンドを区別することを可能にした。
Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）反応性ＴＩＬのパーセンテージを求めるために、ＩＦＮγ分泌アッセイ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９０－７６２）を製造社の説明書に従って実施した。このアッセイでは、ＩＦＮγ特異的抗体を細胞表面に取り付け、細胞から放出された際に分泌サイトカインを補足する。細胞表面に結合したＩＦＮγ分子は、次に人工表面分子として染色し、細胞をフローサイトメトリーで解析する。この手法では、ＴＣＲ認識ではなく、誘導反応性に基づいてネオアンチゲン特異的細胞が同定されることから、テトラマー染色を補完する。これら実験においてＡＰＣとして機能するＩＨＷ０１１６１細胞を、ペプチドなし（ＤＭＳＯ）または１０μｇ／ｍｌの変異ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ）（配列番号１）または野性型（ＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ）（配列番号３５）ペプチドのいずれかでパルスした。ＴＩＬを４時間にわたり、ＡＰＣと共インキュベートした。ペプチドなしおよび野性型の条件は対照シナリオとなり、ネオアンチゲン特異的反応によるバックグラウンドを区別することを可能にした。
【0224】
抗原誘導性ＴＩＬ増幅アッセイ
ＡＰＣとして機能するＩＨＷ０１１６１細胞に７０グレイを照射し、ＰＢで１度洗浄し、１０μｇ／ｍｌの変異ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ）（配列番号１）または野性型ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ）（配列番号３５）のいずれかで、上述したようにパルスした。２．５×１０６細胞／ｍｌの１７ＴＩＬ懸濁液をＴ細胞培地で調製し、９６穴の丸底組織培養プレートに１００μ１等量を分注した。変異体および野性型でパルスされたＡＰＣを、それぞれ、２．５×１０６細胞／ｍｌをＴ細胞培地に再懸濁した。各ウエルにＴ細胞培地またはパルスされたＡＰＣ懸濁液のいずれを１００μｌ追加した。追加の１μｇ／ｍｌの変異体または野性型ペプチドをそれぞれ変異体／野性型ウエルに添加した。続いて、細胞を３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーターで合計１０日間培養した。インキュベーションの３日目に、培地の半量を１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－０７）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－１５）を含有する新鮮Ｔ細胞培地と交換した。インキュベーションの７日目に、培地の半量を２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－０７）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－１５）を含有する新鮮Ｔ細胞培地と再び交換した。インキュベーションの１０日目に、細胞を回収し、抗ＣＤ４抗体とＡ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）テトラマーとで共染色し、フローサイトメトリーで解析した。
ＡＰＣとして機能するＩＨＷ０１１６１細胞に７０グレイを照射し、ＰＢで１度洗浄し、１０μｇ／ｍｌの変異ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ）（配列番号１）または野性型ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ）（配列番号３５）のいずれかで、上述したようにパルスした。２．５×１０６細胞／ｍｌの１７ＴＩＬ懸濁液をＴ細胞培地で調製し、９６穴の丸底組織培養プレートに１００μ１等量を分注した。変異体および野性型でパルスされたＡＰＣを、それぞれ、２．５×１０６細胞／ｍｌをＴ細胞培地に再懸濁した。各ウエルにＴ細胞培地またはパルスされたＡＰＣ懸濁液のいずれを１００μｌ追加した。追加の１μｇ／ｍｌの変異体または野性型ペプチドをそれぞれ変異体／野性型ウエルに添加した。続いて、細胞を３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーターで合計１０日間培養した。インキュベーションの３日目に、培地の半量を１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－０７）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－１５）を含有する新鮮Ｔ細胞培地と交換した。インキュベーションの７日目に、培地の半量を２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－０７）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，＃２００－１５）を含有する新鮮Ｔ細胞培地と再び交換した。インキュベーションの１０日目に、細胞を回収し、抗ＣＤ４抗体とＡ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）テトラマーとで共染色し、フローサイトメトリーで解析した。
【0225】
バルクＴＣＲシーケンシング
ソートされたＴＩＬに対して、既報２５に従い、ＴＣＲライブラリーの調製を実施したまとめると、ＲＮＡをＴＩＬプールから抽出し、ＤＮａｓｅ（ＲＮｅａｓｙマイクロキット（ＱＩＡＧＥＮ）、ＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で処理した。次に、ＴＣＲのα／β鎖の定常領域に対するプライマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ，＃１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を実施した。ユニバーサルプライマー領域と独自の分子同定部（ＵＭＩ）の両方からなる一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＴＣＲ ｃＤＮＡ転写産物（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ，＃０２０４、ＮＥＢ）の３’末に連結した。３回の連続したＰＣＲ工程によって、ライブラリーを適切に増幅させ、α鎖プールおよびβ鎖プールに分割した。ライブラリーに対して、ＮｅｘｔＳｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で３００サイクルのシーケンシングを実施し、所内のパイプラインを用いて処理した。主として、リードは、（１）正確な頻度評価のために、ＵＭＩに従ってクラスター化、（２）により、手動でＴＲＤＶ遺伝子を添加したＩＭＧＴ所定ライブラリーに従い、ＶおよびＪ生殖細胞系遺伝子セグメントをアノテートした２６、および（３）ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方でそれらのＣＤＲ３配列を決定。アノテートしたアウトプットはα鎖およびβ鎖の個別のコレクションからなり、非産生的なシングルトン配列を除去するように更にフィルタリングした。各実験条件について０．５×１０６細胞を回収した。テトラマーでソートした実験においては、ＴＩＬをＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）テトラマーおよび抗ＣＤ４抗体で染色し、バルクＣＤ４－およびそのテトラマー＋およびテトラマーサブ集団にソートした、全３種の集団のシーケンシングを行い、実験は生物学的な３回の繰り返しで実施した。
ソートされたＴＩＬに対して、既報２５に従い、ＴＣＲライブラリーの調製を実施したまとめると、ＲＮＡをＴＩＬプールから抽出し、ＤＮａｓｅ（ＲＮｅａｓｙマイクロキット（ＱＩＡＧＥＮ）、ＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で処理した。次に、ＴＣＲのα／β鎖の定常領域に対するプライマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ，＃１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を実施した。ユニバーサルプライマー領域と独自の分子同定部（ＵＭＩ）の両方からなる一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＴＣＲ ｃＤＮＡ転写産物（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ，＃０２０４、ＮＥＢ）の３’末に連結した。３回の連続したＰＣＲ工程によって、ライブラリーを適切に増幅させ、α鎖プールおよびβ鎖プールに分割した。ライブラリーに対して、ＮｅｘｔＳｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で３００サイクルのシーケンシングを実施し、所内のパイプラインを用いて処理した。主として、リードは、（１）正確な頻度評価のために、ＵＭＩに従ってクラスター化、（２）により、手動でＴＲＤＶ遺伝子を添加したＩＭＧＴ所定ライブラリーに従い、ＶおよびＪ生殖細胞系遺伝子セグメントをアノテートした２６、および（３）ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方でそれらのＣＤＲ３配列を決定。アノテートしたアウトプットはα鎖およびβ鎖の個別のコレクションからなり、非産生的なシングルトン配列を除去するように更にフィルタリングした。各実験条件について０．５×１０６細胞を回収した。テトラマーでソートした実験においては、ＴＩＬをＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）テトラマーおよび抗ＣＤ４抗体で染色し、バルクＣＤ４－およびそのテトラマー＋およびテトラマーサブ集団にソートした、全３種の集団のシーケンシングを行い、実験は生物学的な３回の繰り返しで実施した。
【0226】
単一細胞ＲＮＡおよびＣＤ８＋ ＴＩＬのＴＣＲシーケンシング
ＴＩＬ：メラノーマの共インキュベーションおよびテトラマーソーティング
１７ＴＩＬ／１７Ｔおよび１３５ＴＩＬ／１３５Ｔを２４穴組織培養プレートにウエル当たり４×１０６細胞となるように１：１の比で植え付けた。一晩の共インキュベーション後に、細胞をピペッティングにより再懸濁し、ＰＢＳで洗浄し、７～１０×１０６細胞／ｍｌをＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０（＃０７９３０，ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で凍結した。１０×ライブラリー調製の日に細胞をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（＃Ｅ８２６３，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）添加完全培地に融解し、洗浄後に、完全培地で染色した。細胞をＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）テトラマーで染色し、続いてＣＤ４およびＣＤ８を染色した。ヨウ化プロピジウムを生／死染色に使用した。
ＴＩＬ：メラノーマの共インキュベーションおよびテトラマーソーティング
１７ＴＩＬ／１７Ｔおよび１３５ＴＩＬ／１３５Ｔを２４穴組織培養プレートにウエル当たり４×１０６細胞となるように１：１の比で植え付けた。一晩の共インキュベーション後に、細胞をピペッティングにより再懸濁し、ＰＢＳで洗浄し、７～１０×１０６細胞／ｍｌをＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０（＃０７９３０，ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で凍結した。１０×ライブラリー調製の日に細胞をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（＃Ｅ８２６３，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）添加完全培地に融解し、洗浄後に、完全培地で染色した。細胞をＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）テトラマーで染色し、続いてＣＤ４およびＣＤ８を染色した。ヨウ化プロピジウムを生／死染色に使用した。
【0227】
サンプルを完全培地内にソートして、ＣＤ８＋テトラマー＋（ＣＤ８＋ＣＤ４－テトラマー＋）集団をＣＤ８＋テトラマー－（ＣＤ８＋ＣＤ４－テトラマー－）集団から分離した。テトラマー染色無しのＣＤ４およびＣＤ８の染色およびＣＤ８＋ＣＤ４－集団のソーティングによってバルクＣＤ８＋のサンプルも得た。ソーティング後に直ちに細胞を１０×ライブラリー調製に回した。
【0228】
１０×ライブラリーの調製およびシーケンシング
上述したように、単一細胞ライブラリーの構築のために、ソーティング直後にサンプルを処理した。まとめると、ソートした細胞を洗浄し、０．０４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳに再懸濁し、トリパンブルー染色を用いて計数した。サンプル当たり１０，０００細胞のであるＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにロードすることで単一細胞を液滴に補足した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ 単一細胞 ５’ Ｖ（Ｄ）Ｊｖ１．１キット（１０×ゲノム）を製造業者のプロトコルに従って使用し、単一細胞遺伝子発現ライブラリーおよびＴＣＲ富化ライブラリーを調製した。サンプルのシーケンシングは、遺伝子発現ライブラリーは２６ｂｐのリード１、８ｂｐのｉ７インデックスおよび５８ｂｐのリード２で、ＴＣＲライブラリーは１５０ｂｐのペア化リードで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑで実施した。
上述したように、単一細胞ライブラリーの構築のために、ソーティング直後にサンプルを処理した。まとめると、ソートした細胞を洗浄し、０．０４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳに再懸濁し、トリパンブルー染色を用いて計数した。サンプル当たり１０，０００細胞のであるＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにロードすることで単一細胞を液滴に補足した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ 単一細胞 ５’ Ｖ（Ｄ）Ｊｖ１．１キット（１０×ゲノム）を製造業者のプロトコルに従って使用し、単一細胞遺伝子発現ライブラリーおよびＴＣＲ富化ライブラリーを調製した。サンプルのシーケンシングは、遺伝子発現ライブラリーは２６ｂｐのリード１、８ｂｐのｉ７インデックスおよび５８ｂｐのリード２で、ＴＣＲライブラリーは１５０ｂｐのペア化リードで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑで実施した。
【0229】
ｓｃＲＮＡライブラリーおよびＴＣＲ－ｓｅｑライブラリーのデータプロセッシング
１０×のｓｃＲＮＡ発現ライブラリーから得たリードをヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８）に対してアラインし、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｃｏｕｎｔ（１０×ゲノム、バージョン３．１．０）を用いて定量した。細胞バーコードのみを含む、フィルタリングした変数バーコードマトリクス（ｆｅａｔｕｒｅ－ｂａｒｃｏｄｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ）をさらなる解析に使用した単一細胞遺伝子発現マトリクスをＲ（バージョン３．６．１）にインポートし、Ｓｅｕｒａｔ（バージョン３．１．１）を用いて解析した。検出された、ＵＭＩが４，０００未満または２０，０００超の細胞を除いた。さらにミトコンドリアのリードが１０％超の細胞を続く分析から除外した。
１０×のｓｃＲＮＡ発現ライブラリーから得たリードをヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８）に対してアラインし、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｃｏｕｎｔ（１０×ゲノム、バージョン３．１．０）を用いて定量した。細胞バーコードのみを含む、フィルタリングした変数バーコードマトリクス（ｆｅａｔｕｒｅ－ｂａｒｃｏｄｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ）をさらなる解析に使用した単一細胞遺伝子発現マトリクスをＲ（バージョン３．６．１）にインポートし、Ｓｅｕｒａｔ（バージョン３．１．１）を用いて解析した。検出された、ＵＭＩが４，０００未満または２０，０００超の細胞を除いた。さらにミトコンドリアのリードが１０％超の細胞を続く分析から除外した。
【0230】
単一細胞ＴＣＲリードをヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８）に対してアラインし、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｖｄｊ（１０×ゲノム、バージョン３．１．０）を用いて、再構築したＴＣＲコンセンサス配列に組み立てた。生産性ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列のみをさらなる分析で考慮した。全体としては、ＴＣＲ配列は、９５．２％の細胞においてアノテーションされ、ペアになったＴＣＲαβ配列は４１，５４２細胞の内の３７，９３４細胞（９１．３％）で検出された。従来のペア化ＴＣＲ鎖の組み合わせであるαβまたはααβのみを下流の分析のために残した（３４，９６６細胞、８４．１％）。同じＣＤＲ３αβアミノ酸配列が共通する細胞を同じＴＣＲクローンに属すると定義した。
【0231】
ネオアンチゲン反応性クローンの同定：
ＴＣＲクローン頻度を、各患者のソートしたテトラマー＋とテトラマー集団との間で比較した。クローンは、以下の場合はテトラマー特異的とみなした：（１）テトラマー－集団と比べてテトラマー＋のクローン頻度が１００倍以上高い、および（２）バルクＴＣＲシーケンシング実験の少なくとも１種の複製において、テトラマー集団と比べてテトラマー＋の各ＴＣＲ鎖が１００倍以上富化されている。１２および１ネオアンチゲン反応性クローンを、上記基準に基づき、それぞれ１７ＴＩＬおよび１３５ＴＩＬに対してテトラマー特異的と定義した。少なくとも５細胞からなるテトラマー特異的クローンを下流のネオアンチゲン特異的単一細胞分析のために保持した。ＴＣＲ類似性基準に基づき、Ｎ１７．５（７細胞）、Ｎ１７．６（２細胞）およびＮ１７．７（１細胞）を含めた。
ＴＣＲクローン頻度を、各患者のソートしたテトラマー＋とテトラマー集団との間で比較した。クローンは、以下の場合はテトラマー特異的とみなした：（１）テトラマー－集団と比べてテトラマー＋のクローン頻度が１００倍以上高い、および（２）バルクＴＣＲシーケンシング実験の少なくとも１種の複製において、テトラマー集団と比べてテトラマー＋の各ＴＣＲ鎖が１００倍以上富化されている。１２および１ネオアンチゲン反応性クローンを、上記基準に基づき、それぞれ１７ＴＩＬおよび１３５ＴＩＬに対してテトラマー特異的と定義した。少なくとも５細胞からなるテトラマー特異的クローンを下流のネオアンチゲン特異的単一細胞分析のために保持した。ＴＣＲ類似性基準に基づき、Ｎ１７．５（７細胞）、Ｎ１７．６（２細胞）およびＮ１７．７（１細胞）を含めた。
【0232】
単一細胞データの統合およびクラスター化
ネオアンチゲン反応性クローンの遺伝子発現プログラムを解析するために、両患者のテトラマー＋の集団（ネオアンチゲン反応性クローンのためにフィルタリングしたもの）およびバルクサンプルを統合した。具体的には、分散安定化変換に基づく、対数正規化および可変変数選択を初めに各サンプルに対して個別に実行した。次に、バルクサンプルを参照とし、相互ＰＣＡを３０ディメンションとしたＦｉｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＡｎｃｈｏｒを用い、データセット間のアンカーを同定した。３０ディメンションのＩｎｔｅｇｒａｔｅＤａｔａを用いてサンプルを統合した。統合した発現マトリクスを次に各変数についてスケーリングし、センタリングした。次に、ＰＣＡを用いて、統合したスケーリング後のデータに対して直線次元削減を実施し、ＴＣＲおよび細胞周期遺伝子を除いた。可視化のために、初めの３０の主成分を用いてＵＭＡＰプロジェクションを計算した。遺伝子発現プロファイルに基づきクラスターを同定するために、ｋパラメーターを２０、分解能を０．５として共有近傍法（ＳＮＮ）モジュール性最適化クラスター化を実施した。
ネオアンチゲン反応性クローンの遺伝子発現プログラムを解析するために、両患者のテトラマー＋の集団（ネオアンチゲン反応性クローンのためにフィルタリングしたもの）およびバルクサンプルを統合した。具体的には、分散安定化変換に基づく、対数正規化および可変変数選択を初めに各サンプルに対して個別に実行した。次に、バルクサンプルを参照とし、相互ＰＣＡを３０ディメンションとしたＦｉｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＡｎｃｈｏｒを用い、データセット間のアンカーを同定した。３０ディメンションのＩｎｔｅｇｒａｔｅＤａｔａを用いてサンプルを統合した。統合した発現マトリクスを次に各変数についてスケーリングし、センタリングした。次に、ＰＣＡを用いて、統合したスケーリング後のデータに対して直線次元削減を実施し、ＴＣＲおよび細胞周期遺伝子を除いた。可視化のために、初めの３０の主成分を用いてＵＭＡＰプロジェクションを計算した。遺伝子発現プロファイルに基づきクラスターを同定するために、ｋパラメーターを２０、分解能を０．５として共有近傍法（ＳＮＮ）モジュール性最適化クラスター化を実施した。
【0233】
ＴＣＲ類似性解析
３回繰り返したバルク１７ＴＩＬＴＣＲ－シーケンシング実験のそれぞれについて、テトラマー＋のレパートリーをバルクレパートリーと比較した。各アミノ酸クロノタイプについて、テトラマー＋レパートリーの頻度と、テトラマーレパートリーの頻度との比を計算した。バルクレパートリーに配列が存在しないときは、その頻度を、レパートリーの最小頻度よりもわずかに低い３×１０－５と概算した。この比が１を超える（即ち、テトラマー＋の集団の方が高頻度の）配列を選択した。３回繰り返した実験の全てにおいてこの集団に出現した配列に集中した。この手順では１０のα鎖および１１のβ鎖を得た。この集団内では、Ｎ１３５．１からのハミング距離が低い配列を探した。各β配列について、エマーソンデータセット２７内のその共有レベルを計算し、各α配列またはβ配列については、与えられたＣＤＲ３（αまたはβ）の発生確率を概算するためのモデルである、ＯＬＧＡ２８によって提供された．標準ヒトモデルに基づき、その発生確率を計算した。エマーソンデータセット内にＨＬＡ－Ａ＊０１：０１がどれだけ普及しているかの研究は、DeWitt et al.２９のＨＬＡアノテーションに基づいていた。
３回繰り返したバルク１７ＴＩＬＴＣＲ－シーケンシング実験のそれぞれについて、テトラマー＋のレパートリーをバルクレパートリーと比較した。各アミノ酸クロノタイプについて、テトラマー＋レパートリーの頻度と、テトラマーレパートリーの頻度との比を計算した。バルクレパートリーに配列が存在しないときは、その頻度を、レパートリーの最小頻度よりもわずかに低い３×１０－５と概算した。この比が１を超える（即ち、テトラマー＋の集団の方が高頻度の）配列を選択した。３回繰り返した実験の全てにおいてこの集団に出現した配列に集中した。この手順では１０のα鎖および１１のβ鎖を得た。この集団内では、Ｎ１３５．１からのハミング距離が低い配列を探した。各β配列について、エマーソンデータセット２７内のその共有レベルを計算し、各α配列またはβ配列については、与えられたＣＤＲ３（αまたはβ）の発生確率を概算するためのモデルである、ＯＬＧＡ２８によって提供された．標準ヒトモデルに基づき、その発生確率を計算した。エマーソンデータセット内にＨＬＡ－Ａ＊０１：０１がどれだけ普及しているかの研究は、DeWitt et al.２９のＨＬＡアノテーションに基づいていた。
【0234】
ＰＢＭＣにおけるＴＣＲ過剰発現
後述するように、この比六発表されている技術をわずかな改変後に使用した３０。ＣＤＲ３ヌクレオチド配列をＩＭＧＴ参照文献２６に示される適切なＶおよびＪ配列によって再構築し、既報３１のように、マウス定常領域に結合した。最適化マウス定常領域配列を得た。各ＴＣＲ鎖をＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位の間に埋め込んだ。配列はＴｗｉｓｔ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに二本鎖ＤＮＡと発注し、販売社のプラットフォームを用いてヒト発現用に配列を最適化した。ＴＣＲ鎖をｐＧＥＭ－４Ｚ－ＥＧＦＰ－Ａ６４内に制限的にクローニングした。配列の立証されたクローンプラスミドをＳｐｅＩ消化で直線化し、ＡｍｐｌｉＣａｐ－Ｍａｘ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒキット（＃Ｃ－ＡＣＭ０４０３７，ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、ＲＮＡｃｌｅａｎｕｐキット（＃２３６００，ＮｏｒｇｅｎＢｉｏｔｅｋ）を用いて精製した。形成されたｍＲＮＡを５μｇの等量で－８０℃に保存した。ＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）を用い、ＰＢＭＣをα／β ｍＲＮＡ混合物、１×１０６細胞当たり１０μｇ、４００Ｖ／５００μでエレクトロポレーションに付した。エレクトロポレーションした細胞を、下流の実験で使用する前に少なくとも２時間休ませた。マウス定常ＴＣＲβ染色を用いたフローサイトメトリーにより、ＴＣＲ発現を立証した。
後述するように、この比六発表されている技術をわずかな改変後に使用した３０。ＣＤＲ３ヌクレオチド配列をＩＭＧＴ参照文献２６に示される適切なＶおよびＪ配列によって再構築し、既報３１のように、マウス定常領域に結合した。最適化マウス定常領域配列を得た。各ＴＣＲ鎖をＸｂａＩ／ＮｏｔＩ制限部位の間に埋め込んだ。配列はＴｗｉｓｔ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに二本鎖ＤＮＡと発注し、販売社のプラットフォームを用いてヒト発現用に配列を最適化した。ＴＣＲ鎖をｐＧＥＭ－４Ｚ－ＥＧＦＰ－Ａ６４内に制限的にクローニングした。配列の立証されたクローンプラスミドをＳｐｅＩ消化で直線化し、ＡｍｐｌｉＣａｐ－Ｍａｘ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒキット（＃Ｃ－ＡＣＭ０４０３７，ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、ＲＮＡｃｌｅａｎｕｐキット（＃２３６００，ＮｏｒｇｅｎＢｉｏｔｅｋ）を用いて精製した。形成されたｍＲＮＡを５μｇの等量で－８０℃に保存した。ＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）を用い、ＰＢＭＣをα／β ｍＲＮＡ混合物、１×１０６細胞当たり１０μｇ、４００Ｖ／５００μでエレクトロポレーションに付した。エレクトロポレーションした細胞を、下流の実験で使用する前に少なくとも２時間休ませた。マウス定常ＴＣＲβ染色を用いたフローサイトメトリーにより、ＴＣＲ発現を立証した。
【0235】
ペプチド滴定アッセイ
ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋Ｂ－ＬＣＬを、上述したように、１０－１１Ｍ～１０－５Ｍの範囲内の濃度の合成ペプチドでパルスし、続いて、ＴＩＬまたはエレクトロポレーションしたリンパ球のいずれかと、１：１の比で、９６穴の丸底プレート内、３７℃、５％のＣＯ２の加湿したインキュベーターで１６～２０時間共インキュベートした。共インキュベーションに続き、プレートを３００ｇの遠心分離に付した。４－１ＢＢのリードアウトについて、細胞ペレットをＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ８および４－１ＢＢに対して染色し、フローサイトメトリーで解析した。ＣＤ８＋の集団内の４－１ＢＢ＋の細胞のパーセンテージを種々の条件について比較した。分泌ＩＦＮγのリードアウトについては、上清を回収し、上述のように、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，＃４３０１０６）を用いて解析した。
ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋Ｂ－ＬＣＬを、上述したように、１０－１１Ｍ～１０－５Ｍの範囲内の濃度の合成ペプチドでパルスし、続いて、ＴＩＬまたはエレクトロポレーションしたリンパ球のいずれかと、１：１の比で、９６穴の丸底プレート内、３７℃、５％のＣＯ２の加湿したインキュベーターで１６～２０時間共インキュベートした。共インキュベーションに続き、プレートを３００ｇの遠心分離に付した。４－１ＢＢのリードアウトについて、細胞ペレットをＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ８および４－１ＢＢに対して染色し、フローサイトメトリーで解析した。ＣＤ８＋の集団内の４－１ＢＢ＋の細胞のパーセンテージを種々の条件について比較した。分泌ＩＦＮγのリードアウトについては、上清を回収し、上述のように、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，＃４３０１０６）を用いて解析した。
【0236】
カスパーゼ３開裂アッセイ
メラノーマ標的細胞の細胞傷害Ｔ細胞誘導性アポトーシスを測定するために開裂カスパーゼ３の細胞内染色を既報３２のように使用した。簡単には、メラノーマ細胞を、製造社のプロトコルに従い、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｃ３４５６４）で染色した。１×１０５の標的メラノーマ細胞を次にリンパ球と３：１のエフェクター：標的比で、丸底９６穴プレート内、３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーター内で３時間インキュベートした。インキュベーションに続き、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し、カスパーゼ３アポトーシスＰＥキット（ＢＤ，＃５５０９１４）を製造社のプロトコルに従って使用して抗開裂化カスパーゼ３－ＰＥ抗体で標識した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ＋の標的細胞中のカスパーゼ３＋細胞のパーセントを決定するために、洗浄した細胞をフローサイトメトリーで解析した。目的のＴＣＲのエレクトロポレーションを実施したドナー由来リンパ球を、ＲＮＡ無しのエレクトロポレーションに付したリンパ球またはメラノーマ細胞のみのいずれかである陰性対照と比較した。実験は生物学的な３回の繰り返しとして実施した。
メラノーマ標的細胞の細胞傷害Ｔ細胞誘導性アポトーシスを測定するために開裂カスパーゼ３の細胞内染色を既報３２のように使用した。簡単には、メラノーマ細胞を、製造社のプロトコルに従い、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｃ３４５６４）で染色した。１×１０５の標的メラノーマ細胞を次にリンパ球と３：１のエフェクター：標的比で、丸底９６穴プレート内、３７℃、５％のＣＯ２、加湿したインキュベーター内で３時間インキュベートした。インキュベーションに続き、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し、カスパーゼ３アポトーシスＰＥキット（ＢＤ，＃５５０９１４）を製造社のプロトコルに従って使用して抗開裂化カスパーゼ３－ＰＥ抗体で標識した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ＋の標的細胞中のカスパーゼ３＋細胞のパーセントを決定するために、洗浄した細胞をフローサイトメトリーで解析した。目的のＴＣＲのエレクトロポレーションを実施したドナー由来リンパ球を、ＲＮＡ無しのエレクトロポレーションに付したリンパ球またはメラノーマ細胞のみのいずれかである陰性対照と比較した。実験は生物学的な３回の繰り返しとして実施した。
【0237】
統計解析
統計解析をＭａｃＯ用のＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン９．０．２、ベースＲ（バージョン３．５．０）およびエクセル用Ｒｅａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐａｃｋソフトウエア（リリース７．７．１、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｒｅａｌ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ｄｏｔ）ｃｏｍ）で実行した。汎癌、メラノーマおよびＲＡＳ．Ｑ６１－変異したＴＣＧＡ集団の間のHLAアレル頻度の比較をＦＤＲ補正付きのフィッシャー抽出試験で実施した。ＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡ、４－１ＢＢに基づく反応性および開裂カスパーゼ３アッセイを多重比較用テューキー補正付きの一元配置ＡＮＯＶＡ、で解析した。複数のアッセイを同時に行い、よって信頼性の高い比較が可能な場合、二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。ペプチド－滴定アッセイを多重比較用シダック補正付きの二元配置ＡＮＯＶＡで解析した。単一細胞の表現型の割合はカイ２乗検定で行った。ＴＣＲクローン間の活性化スコアの差はボンフェローニ多重仮設試験補正付きのウィルコクソンの順位和検定で解析した。補正後のＰ値は≦０．０５のとき有意とした。
統計解析をＭａｃＯ用のＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン９．０．２、ベースＲ（バージョン３．５．０）およびエクセル用Ｒｅａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐａｃｋソフトウエア（リリース７．７．１、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｒｅａｌ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ｄｏｔ）ｃｏｍ）で実行した。汎癌、メラノーマおよびＲＡＳ．Ｑ６１－変異したＴＣＧＡ集団の間のHLAアレル頻度の比較をＦＤＲ補正付きのフィッシャー抽出試験で実施した。ＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡ、４－１ＢＢに基づく反応性および開裂カスパーゼ３アッセイを多重比較用テューキー補正付きの一元配置ＡＮＯＶＡ、で解析した。複数のアッセイを同時に行い、よって信頼性の高い比較が可能な場合、二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。ペプチド－滴定アッセイを多重比較用シダック補正付きの二元配置ＡＮＯＶＡで解析した。単一細胞の表現型の割合はカイ２乗検定で行った。ＴＣＲクローン間の活性化スコアの差はボンフェローニ多重仮設試験補正付きのウィルコクソンの順位和検定で解析した。補正後のＰ値は≦０．０５のとき有意とした。
【0238】
材料と方法の参照文献
1 . Toor JS, Rao AA, McShan AC, et al. A Recurrent Mutation in Anaplastic Lymphoma Kinase with Distinct Neoepitope Conformations. Front Immunol. 2018;9:99. doi:10.3389/fimmu.2018.00099
2. London N, Raveh B, Cohen E, Fathi G, Schueler-Furman O. Rosetta FlexPepDock web server--high resolution modeling of peptide-protein interactions. Nucleic Acids Res. 2011;39(Web Server issue):W249-53. doi:10.1093/nar/gkr431
3. Vajda S, Yueh C, Beglov D, et al. New Additions to the ClusPro Server Motivated by CAPRI. doi:10.1002/prot.25219
4. Antunes DA, Moll M, Devaurs D, Jackson KR, Lizeue G, Kavraki LE. DINC 2.0: A New Protein-Peptide Docking Webserver Using an Incremental Approach. Cancer Res. 2017;77(21):e55-e57. doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-0511
5. Pall S, Abraham MJ, Kutzner C, Hess B, Lindahl E. Tackling Exascale Software Challenges in Molecular Dynamics Simulations with GROMACS. In: Springer, Cham; 2015:3-27. doi:10.1007/978-3-319-15976-8_1
6. Schmid N, Eichenberger AP, Choutko A, et al. Definition and testing of the GROMOS force-field versions 54A7 and 54B7. Eur Biophys J. 2011;40(7):843-856. doi:10.1007/s00249-011-0700-9
7. Hess B, Bekker H, Berendsen HJC, Fraaije JGEM. LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations. J Comput Chem. 1997;18(12):1463-1472. doi:10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:12<1463::AID-JCC4>3.0.CO;2-H
8. Bussi G, Donadio D, Parrinello M. Canonical sampling through velocity rescaling. J Chem Phys. 2007;126(1):014101. doi:10.1063/1.2408420
9. Parrinello M, Rahman A. Polymorphic transitions in single crystals: A new molecular dynamics method. J Appl Phys. 1981;52(12):7182-7190. doi:10.1063/1.328693
10. Essmann U, Perera L, Berkowitz ML, Darden T, Lee H, Pedersen LG. A smooth particle mesh Ewald method. J Chem Phys. 1995;103(19):8577-8593. doi:10.1063/1.470117
11. Schrodinger LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. 2015.
12. Wernet P, Nordlund D, Bergmann U, et al. The Structure of the First Coordination Shell in Liquid Water. Science (80- ). 2004;304(5673):995 LP - 999. doi:10.1126/science.1096205
13. McGibbon RT, Beauchamp KA, Harrigan MP, et al. MDTraj: A Modern Open Library for the Analysis of Molecular Dynamics Trajectories. Biophys J. 2015;109(8):1528-1532. doi:10.1016/J.BPJ.2015.08.01521
14. Shukla SA, Rooney MS, Rajasagi M, et al. Comprehensive analysis of cancer associated somatic mutations in class I HLA genes. Nat Biotechnol. 2015;33(11):1152-1158. doi:10.1038/nbt.3344
15. Scholtalbers J, Boegel S, Bukur T, et al. TCLP: an online cancer cell line catalogue integrating HLA type, predicted neo-epitopes, virus and gene expression. Genome Med. 2015;7(1):118. doi:10.1186/s13073-015-0240-5
16. IHWG FRED HUTCH Cell Lines & Genes. fredhutchdotorg/en/labs/clinical/projects/ihwg/cell-lines-genesdothtml. Accessed March 4, 2018.
17. Milner E, Gutter-Kapon L, Bassani-Strenberg M, Barnea E, Beer I, Admon A. The Effect of Proteasome Inhibition on the Generation of the Human Leukocyte Antigen (HLA) Peptidome. Mol Cell Proteomics. 2013;12(7):1853-1864. doi:10.1074/mcp.M112.026013
18. Bassani-Sternberg M, Barnea E, Beer I, Avivi I, Katz T, Admon A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proc Natl Acad Sci.2010;107(44):18769-18776. doi:10.1073/pnas.1008501107
19. Ishihama Y, Rappsilber J, Andersen JS, Mann M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. J Chromatogr A. 2002;979(1-2):233-239. www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/pubmed/12498253. Accessed March 5, 2019.
20. Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367-1372. doi:10.1038/nbt.1511
21. UniProt: a worldwide hub of protein knowledge. Nucleic Acids Res.2019;47(D1):D506-D515. doi:10.1093/nar/gky1049
22. Cox J, Neuhauser N, Michalski A, Scheltema RA, Olsen J V., Mann M. Andromeda: A Peptide Search Engine Integrated into the MaxQuant Environment. J Proteome Res. 2011;10(4):1794-1805. doi:10.1021/pr101065j
23. Riaz N, Havel JJ, Makarov V, et al. Tumor and Microenvironment Evolution during
Immunotherapy with Nivolumab. Cell. 2017;171(4):934-949.e16. doi:10.1016/J.CELL.2017.09.028
24. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-243. doi:10.1002/1097-0320(20011201)45:4<237::AID-CYTO10024>3.0.CO;2-J
25. Bosselut R, Huseby E, Oakes T, et al. Quantitative Characterization of the t Cell Receptor Repertoire of Naive and Memory subsets Using an Integrated experimental and Computational Pipeline Which Is Robust, economical, and Versatile. Immunol. 2017;8:1267. doi:10.3389/fimmu.2017.01267
26. Greiff V, Miho E, Menzel U, Reddy ST. Bioinformatic and Statistical Analysis of Adaptive Immune Repertoires. Trends Immunol. 2015;36(11):738-749. doi:10.1016/j.it.2015.09.006
27. Emerson RO, DeWitt WS, Vignali M, et al. Immunosequencing identifies signatures of cytomegalovirus exposure history and HLA-mediated effects on the T cell repertoire. Nat Genet. 2017;49(5):659-665. doi:10.1038/ng.3822
28. Sethna Z, Elhanati Y, Callan CG, Walczak AM, Mora T. OLGA: fast computation of generation probabilities of B- and T-cell receptor amino acid sequences and motifs. Bioinformatics. 2019;35(17):2974-2981. doi:10.1093/bioinformatics/btz035
29. DeWitt WS, Smith A, Schoch G, Hansen JA, Matsen FA, Bradley P. Human T cell receptor occurrence patterns encode immune history, genetic background, and receptor specificity. Elife. 2018;7. doi:10.7554/eLife.3835822
30. Zhao Y, Zheng Z, Cohen CJ, et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation. Mol Ther. 2006;13(1):151-159. doi:10.1016/j.ymthe.2005.07.688
31. Cohen CJ, Zhao Y, Zheng Z, Rosenberg SA, Morgan RA. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 2006;66(17):8878-8886. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-1450
32. He L, Hakimi J, Salha D, Miron I, Dunn P, Radvanyi L. A sensitive flow cytometrybased cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 2005;304(1-2):43-59. doi:10.1016/j.jim.2005.06.005.
1 . Toor JS, Rao AA, McShan AC, et al. A Recurrent Mutation in Anaplastic Lymphoma Kinase with Distinct Neoepitope Conformations. Front Immunol. 2018;9:99. doi:10.3389/fimmu.2018.00099
2. London N, Raveh B, Cohen E, Fathi G, Schueler-Furman O. Rosetta FlexPepDock web server--high resolution modeling of peptide-protein interactions. Nucleic Acids Res. 2011;39(Web Server issue):W249-53. doi:10.1093/nar/gkr431
3. Vajda S, Yueh C, Beglov D, et al. New Additions to the ClusPro Server Motivated by CAPRI. doi:10.1002/prot.25219
4. Antunes DA, Moll M, Devaurs D, Jackson KR, Lizeue G, Kavraki LE. DINC 2.0: A New Protein-Peptide Docking Webserver Using an Incremental Approach. Cancer Res. 2017;77(21):e55-e57. doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-0511
5. Pall S, Abraham MJ, Kutzner C, Hess B, Lindahl E. Tackling Exascale Software Challenges in Molecular Dynamics Simulations with GROMACS. In: Springer, Cham; 2015:3-27. doi:10.1007/978-3-319-15976-8_1
6. Schmid N, Eichenberger AP, Choutko A, et al. Definition and testing of the GROMOS force-field versions 54A7 and 54B7. Eur Biophys J. 2011;40(7):843-856. doi:10.1007/s00249-011-0700-9
7. Hess B, Bekker H, Berendsen HJC, Fraaije JGEM. LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations. J Comput Chem. 1997;18(12):1463-1472. doi:10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:12<1463::AID-JCC4>3.0.CO;2-H
8. Bussi G, Donadio D, Parrinello M. Canonical sampling through velocity rescaling. J Chem Phys. 2007;126(1):014101. doi:10.1063/1.2408420
9. Parrinello M, Rahman A. Polymorphic transitions in single crystals: A new molecular dynamics method. J Appl Phys. 1981;52(12):7182-7190. doi:10.1063/1.328693
10. Essmann U, Perera L, Berkowitz ML, Darden T, Lee H, Pedersen LG. A smooth particle mesh Ewald method. J Chem Phys. 1995;103(19):8577-8593. doi:10.1063/1.470117
11. Schrodinger LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. 2015.
12. Wernet P, Nordlund D, Bergmann U, et al. The Structure of the First Coordination Shell in Liquid Water. Science (80- ). 2004;304(5673):995 LP - 999. doi:10.1126/science.1096205
13. McGibbon RT, Beauchamp KA, Harrigan MP, et al. MDTraj: A Modern Open Library for the Analysis of Molecular Dynamics Trajectories. Biophys J. 2015;109(8):1528-1532. doi:10.1016/J.BPJ.2015.08.01521
14. Shukla SA, Rooney MS, Rajasagi M, et al. Comprehensive analysis of cancer associated somatic mutations in class I HLA genes. Nat Biotechnol. 2015;33(11):1152-1158. doi:10.1038/nbt.3344
15. Scholtalbers J, Boegel S, Bukur T, et al. TCLP: an online cancer cell line catalogue integrating HLA type, predicted neo-epitopes, virus and gene expression. Genome Med. 2015;7(1):118. doi:10.1186/s13073-015-0240-5
16. IHWG FRED HUTCH Cell Lines & Genes. fredhutchdotorg/en/labs/clinical/projects/ihwg/cell-lines-genesdothtml. Accessed March 4, 2018.
17. Milner E, Gutter-Kapon L, Bassani-Strenberg M, Barnea E, Beer I, Admon A. The Effect of Proteasome Inhibition on the Generation of the Human Leukocyte Antigen (HLA) Peptidome. Mol Cell Proteomics. 2013;12(7):1853-1864. doi:10.1074/mcp.M112.026013
18. Bassani-Sternberg M, Barnea E, Beer I, Avivi I, Katz T, Admon A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proc Natl Acad Sci.2010;107(44):18769-18776. doi:10.1073/pnas.1008501107
19. Ishihama Y, Rappsilber J, Andersen JS, Mann M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. J Chromatogr A. 2002;979(1-2):233-239. www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/pubmed/12498253. Accessed March 5, 2019.
20. Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367-1372. doi:10.1038/nbt.1511
21. UniProt: a worldwide hub of protein knowledge. Nucleic Acids Res.2019;47(D1):D506-D515. doi:10.1093/nar/gky1049
22. Cox J, Neuhauser N, Michalski A, Scheltema RA, Olsen J V., Mann M. Andromeda: A Peptide Search Engine Integrated into the MaxQuant Environment. J Proteome Res. 2011;10(4):1794-1805. doi:10.1021/pr101065j
23. Riaz N, Havel JJ, Makarov V, et al. Tumor and Microenvironment Evolution during
Immunotherapy with Nivolumab. Cell. 2017;171(4):934-949.e16. doi:10.1016/J.CELL.2017.09.028
24. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-243. doi:10.1002/1097-0320(20011201)45:4<237::AID-CYTO10024>3.0.CO;2-J
25. Bosselut R, Huseby E, Oakes T, et al. Quantitative Characterization of the t Cell Receptor Repertoire of Naive and Memory subsets Using an Integrated experimental and Computational Pipeline Which Is Robust, economical, and Versatile. Immunol. 2017;8:1267. doi:10.3389/fimmu.2017.01267
26. Greiff V, Miho E, Menzel U, Reddy ST. Bioinformatic and Statistical Analysis of Adaptive Immune Repertoires. Trends Immunol. 2015;36(11):738-749. doi:10.1016/j.it.2015.09.006
27. Emerson RO, DeWitt WS, Vignali M, et al. Immunosequencing identifies signatures of cytomegalovirus exposure history and HLA-mediated effects on the T cell repertoire. Nat Genet. 2017;49(5):659-665. doi:10.1038/ng.3822
28. Sethna Z, Elhanati Y, Callan CG, Walczak AM, Mora T. OLGA: fast computation of generation probabilities of B- and T-cell receptor amino acid sequences and motifs. Bioinformatics. 2019;35(17):2974-2981. doi:10.1093/bioinformatics/btz035
29. DeWitt WS, Smith A, Schoch G, Hansen JA, Matsen FA, Bradley P. Human T cell receptor occurrence patterns encode immune history, genetic background, and receptor specificity. Elife. 2018;7. doi:10.7554/eLife.3835822
30. Zhao Y, Zheng Z, Cohen CJ, et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation. Mol Ther. 2006;13(1):151-159. doi:10.1016/j.ymthe.2005.07.688
31. Cohen CJ, Zhao Y, Zheng Z, Rosenberg SA, Morgan RA. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 2006;66(17):8878-8886. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-1450
32. He L, Hakimi J, Salha D, Miron I, Dunn P, Radvanyi L. A sensitive flow cytometrybased cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 2005;304(1-2):43-59. doi:10.1016/j.jim.2005.06.005.
【0239】
実施例１
ネオアンチゲン候補の選択
ネオアンチゲン候補のデータ駆動選択
ＮＲＡＳ．Ｑ６１は、メラノーマ内で２番目に最も高度に変異したタンパク質の位置であるが、その誘導ネオアンチゲンの全てが等しく再発性ではない。「興味深い」ホットスポット－ネオアンチゲンとなるためには、組み合わせるＨＬＡアレル／変異頻度が癌患者で高くなければならない。ここで、ネオアンチゲンの発見のために、高い有効性の候補に修するために患者の遺伝的データ分析するデータ駆動アプローチを採用する。解析データセット内でＲＡＳ．Ｑ６１変異と共に発生するＨＬＡアレルのみを考慮し、８～１４長のＲＡＳ．Ｑ６１誘導ネオペプチドであるＮｅｔＭＨＣｐａｎを結合の予測のために使用した。これらデータを用いて、各ＨＬＡ／変異の組み合わせに２つのスコア：（１）コホート内のその頻度、および（２）その最良結合予測スコア（即ち、予測された結合性ネオペプチドに対して列挙した最良の％Ｒａｎｋ）。次に段階的なフィルタリング／ソーティングを適応して、頻度閾値を設定し、残りの候補をその概算結合ポテンシャルに基づき順位づけた。
ネオアンチゲン候補の選択
ネオアンチゲン候補のデータ駆動選択
ＮＲＡＳ．Ｑ６１は、メラノーマ内で２番目に最も高度に変異したタンパク質の位置であるが、その誘導ネオアンチゲンの全てが等しく再発性ではない。「興味深い」ホットスポット－ネオアンチゲンとなるためには、組み合わせるＨＬＡアレル／変異頻度が癌患者で高くなければならない。ここで、ネオアンチゲンの発見のために、高い有効性の候補に修するために患者の遺伝的データ分析するデータ駆動アプローチを採用する。解析データセット内でＲＡＳ．Ｑ６１変異と共に発生するＨＬＡアレルのみを考慮し、８～１４長のＲＡＳ．Ｑ６１誘導ネオペプチドであるＮｅｔＭＨＣｐａｎを結合の予測のために使用した。これらデータを用いて、各ＨＬＡ／変異の組み合わせに２つのスコア：（１）コホート内のその頻度、および（２）その最良結合予測スコア（即ち、予測された結合性ネオペプチドに対して列挙した最良の％Ｒａｎｋ）。次に段階的なフィルタリング／ソーティングを適応して、頻度閾値を設定し、残りの候補をその概算結合ポテンシャルに基づき順位づけた。
【0240】
３種のＲＡＳアイソフォーム、即ち、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳおよびＨＲＡＳ、は同一のＮ末配列を有し、４種の最も高頻度のＲＡＳ．Ｑ６１アミノ酸置換：アルギニン、リシン、ロイシンおよびヒスチジンと同様に、全てを解析に加えた。
【0241】
上述のスキームを使用し、３種のメラノーマコホート：３６３メラノーマ症例において変異およびＨＬＡ－Ｉアノテーションを集計するＴＣＧＡ、このような患者２２１人を育成するＨａｒｔｗｉｇデータベースおよび既報の６９患者のＭＥＬＡ－ＡＵデータセット。
【0242】
これらコホート内の９５（２６％）、６０（２７％）および１５（２２％）の個体はそれぞれ変異をＲＡＳ．Ｑ６１に有する。予想通り、６１位で最も高頻度のアミノ酸置換はアルギニン（４６～６０％）およびリシン（３５～４７％）であり、６１位の最も多い変異ＲＡＳアイソフォームがＮＲＡＳであった（ＲＡＳ．６１変異の９６～１００％）。
【0243】
ＲＡＳ．Ｑ６１変異体患者および－野性型メラノーマ患者の間のＴＣＧＡ ＨＬＡアレル頻度の比較は、有意な有病傾向（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｓｋｅｗｓ）を示さなかった（ＦＤＲ補正付きフィッシャー抽出試験）。
【0244】
ＨＬＡ／変異の組み合わせをそれらのスコアでプロットすると、最も約束された候補が優位である理由が示される。３種のデータセットにわたり、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１が候補のツートップ：ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１ＲおよびＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ、を押し上げるために飛びぬけて貢献している。よって、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１をさらなる解析に選択した。
【0245】
一般集団において多く存在することと一致し、分析した癌コホート内の患者の２６～３８％はＨＬＡ－Ａ＊０１：０１３を保有していた。重要な点は、ＲＡＳ．６１変異体集団に拘束してもアレル頻度が抄出しない点である：ＲＡＳ．Ｑ６１変異体メラノーマ患者の２７～４０％が保有する。７～８．７％のメラノーマにおいてＨＬＡ－Ａ＊０１：０１はＲＡＳ．Ｑ６１変異と共に出現する。特に、我々の解析では、３．３～４．５％および３～４．３％はそれぞれＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１Ｒの組み合わせおよびＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋの組み合わせを保有する。
【0246】
ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０は、Ａ＊０１：０１に対して３２のＲＡＳ．Ｑ６１誘導ネオペプチドを予測し、そこには９の予測された強い結合体が含まれる。重要な点は、同じ「基準ペプチド」、ＩＬＤＴＡＧＸＥＥＹ（配列番号４０）、がＲＡＳ．Ｑ６１ＲおよびＲＡＳ．Ｑ６１Ｋの両方に対して最も結合すると予測されるものであり（予測された結合親和性はそれぞれ２０２．４ｎＭおよび２１８．５ｎＭ）、一方、より存在の少ないバリアント（ＲＡＳ．Ｑ６１ＬおよびＲＡＳ．Ｑ６１Ｈ）もＡ＊０１：０１アレルを結合すると予測されている（それぞれ５８．２ｎＭおよび１０１．８ｎＭ）。
【0247】
注目すべきは、汎癌解析が我々のメラノーマに基づく候補優先化を要約する点である。今でも頻繁にＲＡＳ．Ｑ６１変異は汎癌症例の３．３～５．９％に出現する（ＴＣＧＡおよびＨａｒｔｗｉｇデータセットのそれぞれで２２６／６８２４個体および１２３／２０９１個体）。ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１ネオアンチゲンの妥当性は、よってメラノーマに制限されるものではない。
【0248】
単アレル過剰発現系を用いたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１誘導ネオアンチゲンの直接同定
ＲＡＳ．Ｑ６１Ｒとは異なり、高再発性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ組み合わせに対してネオアンチゲンは過去に報告されていない。ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋに注目し、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１結合ネオアンチゲンランドスケープに対する不偏なクエリを設定した。このために、２５－ｍｅｒのＲＡＳ．Ｑ６１Ｋミニジーンを共過剰発現する、７２１．２２１に基づくＨＬＡ－Ａ＊０１：０１単アレル細胞系を確立し、ＨＬＡペプチドミクスに付した。この過剰発現セットアップは存在頻度およびネオアンチゲン増幅において有利でありながら、本来の抗原プロセシングおよび提示を維持している。質量分析（ＭＳ）結果をＭａｘＱｕａｎｔで解析し、ミニジーン配列を手動で加えたヒトプロテオームデータセット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）に対してクエリを実行した。合計２４０３ペプチドを７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋに対して検出した。ＮｅｔＭＨＣｐａｎが７種の異なるＨＬＡ－Ａ＊０１：０１結合ネオペプチドをＲＡＳ．Ｑ６１Ｋに予測するのに対して、単一のデカペプチドであるＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）が同定された。この知見は合成ペプチドの同定スペクトルの比較によって更に立証された。興味深いことに、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）と、それに非常に関連したＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）は、それぞれがＨＬＡ－Ａ＊０１：０１拘束的に、ＲＡＳ．Ｑ６１ＫおよびＲＡＳ．Ｑ６１Ｒに対して予測された最もスコアの高いネオペプチドであった。高感度絶対標的化ＭＳを用いて、我々の過剰発現系でネオペプチドの提示を定量化し、さらにうＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ誘導ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）の提示を立証した。ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）およびＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）はそれぞれ７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋおよび７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｒに対して、１×１０６細胞当たり３．２８５０および３８．２３７５ａｍｏｌが検出された。
ＲＡＳ．Ｑ６１Ｒとは異なり、高再発性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ組み合わせに対してネオアンチゲンは過去に報告されていない。ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋに注目し、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１結合ネオアンチゲンランドスケープに対する不偏なクエリを設定した。このために、２５－ｍｅｒのＲＡＳ．Ｑ６１Ｋミニジーンを共過剰発現する、７２１．２２１に基づくＨＬＡ－Ａ＊０１：０１単アレル細胞系を確立し、ＨＬＡペプチドミクスに付した。この過剰発現セットアップは存在頻度およびネオアンチゲン増幅において有利でありながら、本来の抗原プロセシングおよび提示を維持している。質量分析（ＭＳ）結果をＭａｘＱｕａｎｔで解析し、ミニジーン配列を手動で加えたヒトプロテオームデータセット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）に対してクエリを実行した。合計２４０３ペプチドを７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋに対して検出した。ＮｅｔＭＨＣｐａｎが７種の異なるＨＬＡ－Ａ＊０１：０１結合ネオペプチドをＲＡＳ．Ｑ６１Ｋに予測するのに対して、単一のデカペプチドであるＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）が同定された。この知見は合成ペプチドの同定スペクトルの比較によって更に立証された。興味深いことに、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）と、それに非常に関連したＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）は、それぞれがＨＬＡ－Ａ＊０１：０１拘束的に、ＲＡＳ．Ｑ６１ＫおよびＲＡＳ．Ｑ６１Ｒに対して予測された最もスコアの高いネオペプチドであった。高感度絶対標的化ＭＳを用いて、我々の過剰発現系でネオペプチドの提示を定量化し、さらにうＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ誘導ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）の提示を立証した。ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）およびＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）はそれぞれ７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｋおよび７２１．２２１Ａ＊０１：０１；ｍＲＡＳ．Ｑ６１Ｒに対して、１×１０６細胞当たり３．２８５０および３８．２３７５ａｍｏｌが検出された。
【0249】
ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）は、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ－発現腫瘍にいてロバストに提示される
我々の知見を悪性のコンテキストおよび内在性変異／ＨＬＡ発現下で更に立証するために、１７Ｔ腫瘍誘導細胞系をＨＬＡペプチドミクスに付した。過去に完全エキソームによる試みが１７ＴメラノーマをＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ変異体として同定し、ＨＬＡタイピングがそれをＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋であると認めたことから、予測または過去の同定に関わらず、ネオアンチゲンを不偏的に同定するために、ＭＳをディスカバリーモードで使用した。データベースとしてヒトプロテオームに手動で加えたＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋバリアントを含む１７Ｔ変異したタンパク質配列に対して上述したように解析を実行した。その結果、２３５６ペプチドの中から、単一ネオペプチドであるデカペプチドＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）（図４）が検出された。
我々の知見を悪性のコンテキストおよび内在性変異／ＨＬＡ発現下で更に立証するために、１７Ｔ腫瘍誘導細胞系をＨＬＡペプチドミクスに付した。過去に完全エキソームによる試みが１７ＴメラノーマをＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ変異体として同定し、ＨＬＡタイピングがそれをＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋であると認めたことから、予測または過去の同定に関わらず、ネオアンチゲンを不偏的に同定するために、ＭＳをディスカバリーモードで使用した。データベースとしてヒトプロテオームに手動で加えたＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋバリアントを含む１７Ｔ変異したタンパク質配列に対して上述したように解析を実行した。その結果、２３５６ペプチドの中から、単一ネオペプチドであるデカペプチドＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）（図４）が検出された。
【0250】
提示のロバスト度を探索するために、いずれもがＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋの組み合わせを内在性発現する、４種の瞬間凍結腫瘍および５種の追加の腫瘍誘導細胞系からなるパネルを作製した。ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）の内在性提示も試験するためにＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒメラノーマ細胞系であるＨｓ９４０Ｔを我々の解析に含めた。全ての細胞系が変異体ＮＲＡＳ転写産物を発現することが立証された。
【0251】
高感度絶対標的化ＭＳを用いたＨＬＡペプチドミクスは、全ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ－変異体サンプルからＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオペプチドを、１ｍｇの腫瘍組織当たり１×１０８の推定の下、１×１０６細胞あたり０．１２５０～２．９１３８ａｍｏｌの範囲内の量で同定した４１。ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）はＨｓ９４０Ｔに対して予想された通り、同定された。重要な点は、我々のパネルの細胞系ＨｕＴ７８はＴ細胞リンパ腫から誘導されたものであり、同定されたネオアンチゲンが癌種を超える適応性を有することを明示する。
【0252】
我々は、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）が、ＨＬＡアレルＡ＊０１：０１のコンテキストで提示された、ロバストで、天然にプロセッシングされるＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ誘導ネオペプチドであると結論付けた。
【0253】
実施例２
ネオアンチゲンを結合する新規ＴＣＲの同定
結果
上述したように、変異体ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）はＨＬＡ－Ａ＊０１：０１に協力に結合すると予測され、そうすることが既に立証されている（国際公開第２０２０／２３４８７５号）。
ネオアンチゲンを結合する新規ＴＣＲの同定
結果
上述したように、変異体ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）はＨＬＡ－Ａ＊０１：０１に協力に結合すると予測され、そうすることが既に立証されている（国際公開第２０２０／２３４８７５号）。
【0254】
ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオアンチゲンを標的とするＴＣＲには翻訳価値があり、組換えＴ細胞を有し、それを利用するＡＣＴは、メラノーマ症例の３％および２．９：１０００の個体の汎癌が該当すると期待される。ＲＮＡに基づくＴＣＲシーケンシングは、関連するα鎖およびβ鎖を同定するために、テトラマーでソートしたＴＩＬに対して実施した。１７ＴＩＬおよび１３５ＴＩＬのそれぞれに対して、３種の細胞集団をそれぞれ別個にシーケンシングした： バルクＣＤ４－およびそのＡ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）－テトラマー＋およびテトラマー－のサブ集団。テトラマー富化（即ち、テトラマー特異的）鎖を抽出するためにテトラマー＋のレパートリーおよびテトラマー－のレパートリーを対比させ、一方、バルク集団のシーケンシングは、これらの鎖をコンテキスト下に置くことを可能にした。ソーティング実験およびシーケンシング実験は生物学的な３回の繰り返しで実施し、非常に一定していた。各シーケンシング実験が数百から数千の明確な、産生性ＴＣＲ鎖を明らかにし、１７ＴＩＬおよび１３５ＴＩＬはいずれもオリゴクローン性分布を明確に示した。１％以上の転写産物からなるアミノ酸配列に限定すると、１１のβ鎖（１２のα鎖）が１７ＴＩＬのＣＤ４－のレパートリーを独占し、その累積カバー率は転写産物の７５．４％であった。同様に、１３５ＴＩＬにおいては、６のβ鎖（７のα鎖）がＣＤ４－のレパートリーの９２．２％を担う。テトラマー＋のサブ集団およびテトラマー－のサブ集団も同様にオリゴクローン性ＴＣＲ分布によって特徴づけられた。さらに少なくとも１００倍の
転写産物頻度富化を示すＴＣＲ鎖に集中すると、１７ＴＩＬに対してネオアンチゲン特異的なものとして４のβ鎖および５のα鎖が現れた。テトラマー＋、バルクＣＤ４－およびテトラマー－の集団のそれぞれにおけるこれら４のβ鎖の累積頻度は、６８．５％、３％および０．００５％であった。同様に、テトラマー＋、バルクＣＤ４－およびテトラマー－の集団のそれぞれにおけるこれら５のα鎖の累積頻度は、６８．９％、３．２％および０％であった。単一αβペアである１３５ＴＩＬは上記基準を満たし（ＮＡ１３５．１鎖およびＮＢ１３５．１鎖）、テトラマー＋１３５ＴＩＬ内の頻度はそれぞれ８９．６％および８５％であった。
【数1】
【0255】
同種メラノーマとの一晩の共インキュベーション後のソートした４－１ＢＢ＋ＴＩＬのＴＣＲ－のシーケンシングは、目的鎖の全てがメラノーマ反応性レパートリー内の一部を成しており、４－１ＢＢ＋のサブ集団において２のα鎖および１のβ鎖が有意に富化されていることを確証した（多重比較のために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正付きの二項検定）。
【0256】
ＴＣＲレパートリーの単一細胞の特徴付け
これらＴＣＲレパートリーについて更に探求し、テトラマー－結合性のαβペアリングについて明らかにするために、単一細胞ＴＣＲ－シーケンシングを実施した。ＴＩＬと同種メラノーマとの（即ち、１７ＴＩＬと１７Ｔ、１３５ＴＩＬと１３５Ｔ）一晩の共インキュベーション後に、サンプルを目的の集団にソートし、次に１０×プラットフォームを用いた二重ＲＮＡシーケンシングおよびＴＣＲ単一細胞シーケンシングを実施した。バルクシーケンシング実験と同様に、本発明者らはバルクＣＤ８＋およびそのＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）－テトラマー＋およびテトラマー－のサブ集団の３種のＴＩＬ集団に着目した。テトラマー特異的クローンへと突き進むために、
頻度富化を使用した。
これらＴＣＲレパートリーについて更に探求し、テトラマー－結合性のαβペアリングについて明らかにするために、単一細胞ＴＣＲ－シーケンシングを実施した。ＴＩＬと同種メラノーマとの（即ち、１７ＴＩＬと１７Ｔ、１３５ＴＩＬと１３５Ｔ）一晩の共インキュベーション後に、サンプルを目的の集団にソートし、次に１０×プラットフォームを用いた二重ＲＮＡシーケンシングおよびＴＣＲ単一細胞シーケンシングを実施した。バルクシーケンシング実験と同様に、本発明者らはバルクＣＤ８＋およびそのＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）－テトラマー＋およびテトラマー－のサブ集団の３種のＴＩＬ集団に着目した。テトラマー特異的クローンへと突き進むために、
【数2】
【0257】
期待通り、バルクおよび単一細胞のシーケンシングデータは高度に一致していた。バルクＴＣＲ－シーケンシングから演繹した候補鎖のペアリングは単一細胞データによって確証された。
【0258】
本発明者らは、単一細胞テトラマー＋のサブ集団内の少なくとも２の細胞によって再提示されたクローンに集中した。１７ＴＩＬ内の主要なテトラマー特異的クローンを本願において、頻度の減少する順に、Ｎ１７．１～５と称する。１３５ＴＩＬに対する単一ドミナントテトラマー特異的クローンをＮ１３５．１と称する。Ｎ１７．２、Ｎ１７．４、Ｎ１７．５およびＮ１３５．１は全てαβ細胞であり、一方、Ｎ１７．３はααβである。従来の解析パイプラインはＮ１７．１をαβクローンとした。しかし、下記でさらに明らかにするように、このクローンは、実際はδ遺伝子ＴＲＤＶ１とリアレンジメントされた第２のα鎖を有する。上記クローンのそれぞれのＴＣＲ鎖を次のように表す：Ｎ｛鎖種：Ａ／Ｂ｝｛ＴＩＬ：１７／１３５｝．｛クローン番号｝．｛鎖番号１｝。例えば、クローンＮ１７．２のβ鎖はＮＢ１７．２と記載し、一方、クローンＮ１７．３の第２のα鎖はＮＡ１７．３．２である。
【0259】
受容体の配列を下記表１にまとめた。
【表1】
【0260】
ネオアンチゲン－結合ＴＣＲレパートリーの立証および特徴付け
複数のテトラマー特異的Ｔ細胞クローン同定したため、本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオアンチゲンに対する個別の感度および特異度を立証することを試みた。
複数のテトラマー特異的Ｔ細胞クローン同定したため、本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオアンチゲンに対する個別の感度および特異度を立証することを試みた。
【0261】
これまでに、健常ドナー末梢Ｔ細胞内で目的のα／β組み合わせを過剰発現させてきた。図１のＡに示したように、テトラマー結合実験は、Ｎ１７．２、Ｎ１７．５およびＮ１３５．１に対するネオアンチゲン結合を確証し、ααβクローンＮ１７．３（ＮＡ１７．３．２／ＮＢ１７．３）に対する適切なαβ組み合わせを識別した。驚くべきことに、１７ＴＩＬのテトラマー特異的クローンの中で最も多く存在するＮ１７．１に関連するαβペアは、効率的な発現にもかかわらず、立証されなかった（図１のＡ）。単一細胞ＲＮＡシーケンシングで見られるような、クローンによるδ遺伝子ＴＲＤＶ１のクローン発現はＴＣＲシーケンシングデータの再調査およびＮ１７．１の第２のα鎖、即ち、ＴＲＤＶ１／ＴＲＡＪ２７組換え体の一般的でないイベントによって生じるＮＡ１７．１．２の解明へとつなげた４６。ＮＡ１７．１．２はバルクＴＣＲ－シーケンシングにおいてＮＡ１７．１．１と同等の頻度で同定されていた。他のＴＲＤＶ遺伝子はα鎖の再編成に関与していなかった。予測通り、ＮＡ１７．１．２／ＮＢ１７．１鎖の組み合わせは、テトラマー染色によって立証された（図１のＡ）。
【0262】
本発明者らは、異なるＴＣＲ組換えＴ細胞と、種々の濃度のＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオペプチドまたはその対応野性型のいずれかでパルスされたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋Ｂ－ＬＣＬとの共インキュベーションへと進めた。超生理学的なパルスペプチド濃度における変異したペプチドに対する差異的な反応性によって証明されるように、全５種の試験したＴＣＲがネオアンチゲン特異的であることが証明された（図１のＢ）。ペプチド滴定実験は、これらＴＣＲが０．０１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の濃度においてＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオペプチドを強力に認識することをさらに明らかにした（図１のＣ）。興味深いことに、ＴＣＲ頻度と感度との逆比例関係の傾向が１７ＴＩＬ内で観察された。内在性発現ネオアンチゲンに対するＴＣＲの反応性および細胞傷害能をさらに正確に測定するために、本発明者らは、ＴＣＲ組換えＴ細胞と、ｓｗｉｔｈＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ＋腫瘍細胞系との共インキュベーションを実施した。２つの最も強力なＴＣＲであるＮ１７．１．２およびＮ１７．２を腫瘍細胞系のパネルに対する反応性アッセイによる試験は、免疫ペプチドミクスの結果を再現した（図２のＡ）。加えて、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋ＫＲＡＳ．Ｑ６１Ｋ＋肺腺癌細胞系Ｃａｌｕ６の共インキュベーションにおいて有意な４－１ＢＢアップレギュレーションが観察され、これは予測通り、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号１）ネオアンチゲンの交差アイソフォーム、交差癌種関連性（ｃｒｏｓｓ－ｃａｎｃｅｒ－ｔｙｐｅｒｅｌｅｖａｎｃｅ）を裏付けた。全５種の試験したＴＣＲが、開裂カスパーゼ３アッセイで示されたように、ネオアンチゲン発現メラノーマに対して細胞傷害能を有していた（図２のＢ）。
【0263】
テトラマー結合性１７ＴＩＬの大部分がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１／ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）－テトラマーにも交差結合することから、両方の反応性を保有するのはＮ１７．１．２であると推測した。注目すべきことに、実際、Ｎ１７．１．２は、１ｎＭの低濃度でＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）ネオペプチドを認識し、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１＋／ＮＲＡＳ．Ｑ６１Ｒ＋細胞系との共インキュベーションの際に４－１ＢＢのアップレギュレーションを誘導することが証明された（図１のＣおよび図２のＡ）。残りの４のＴＣＲはＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３４）ネオペプチドを認識しないことが確認された。
【0264】
ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞受容体の患者内および患者間の配列収束
本発明者らは、（表１に提示したような）未発見のα／β鎖のいくつかは代替可能ではないか探索した。図３のＡ～Ｆに示したように、ＮＨ１（ＮＡ１３５．１／ＮＢ１７．５）は、類似クラスター内でαおよびβの両方のＰｇｅｎを最大化した仮説クローンである。ＮＨ１のネオアンチゲン－反応性を試験し、テトラマー染色およびネオアンチゲン特異的ＩＦＮγ放出の両方で立証した（図３のＡ～Ｆ）。逆向きの組み合わせであるＮＡ１７．５／ＮＢ１３５．１についても立証された。
本発明者らは、（表１に提示したような）未発見のα／β鎖のいくつかは代替可能ではないか探索した。図３のＡ～Ｆに示したように、ＮＨ１（ＮＡ１３５．１／ＮＢ１７．５）は、類似クラスター内でαおよびβの両方のＰｇｅｎを最大化した仮説クローンである。ＮＨ１のネオアンチゲン－反応性を試験し、テトラマー染色およびネオアンチゲン特異的ＩＦＮγ放出の両方で立証した（図３のＡ～Ｆ）。逆向きの組み合わせであるＮＡ１７．５／ＮＢ１３５．１についても立証された。
【0265】
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替、改変、及び変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、このような代替、改変、及び変形はすべて、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるものとする。
【0266】
本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書中に援用されることが言及されるときに具体的かつ個別に言及されているかのように、その全体が参照により本明細書中に援用されることは本出願人の意図である。加えて、本出願における任意の参考文献の引用又は特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。章の見出しが使用される範囲において、当該見出しは必ずしも限定を加えるものと解釈されるべきではない。さらに、本出願の任意の優先権書類は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【配列表フリーテキスト】
【0267】
配列番号１： ネオペプチドアミノ酸配列
配列番号２： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号３： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号４： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号５： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号６： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号７： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号８： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号９： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１０： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１１： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１２： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１３： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１４： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１５： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１６： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１７： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１８： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号１９： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２０： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２１： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２２： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２３： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２４： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２５： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２６： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２７： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２８： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２９： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３０： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３１： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３２： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３３： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３４： ネオペプチドアミノ酸配列
配列番号３５： 合成ペプチド
配列番号３６： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３７： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３８： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３９： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４０： 合成ペプチド、７位のＸａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号２： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号３： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号４： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号５： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号６： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号７： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号８： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号９： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１０： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１１： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１２： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１３： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１４： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１５： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１６： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１７： ｃｄｒ３ｓアミノ酸配列
配列番号１８： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号１９： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２０： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２１： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２２： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２３： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２４： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２５： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２６： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２７： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２８： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号２９： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３０： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３１： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３２： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３３： ｃｄｒ３ｓ核酸配列
配列番号３４： ネオペプチドアミノ酸配列
配列番号３５： 合成ペプチド
配列番号３６： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３７： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３８： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３９： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４０： 合成ペプチド、７位のＸａａは任意の天然アミノ酸であり得る
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】