特表 2024-518375 ＲＮＡ送達のためのイオン化可能なカチオン性脂質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-01

(54)【発明の名称】ＲＮＡ送達のためのイオン化可能なカチオン性脂質

(51)【国際特許分類】

   C07C 229/12 20060101AFI20240423BHJP

   C07C 327/32 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20240423BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240423BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240423BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240423BHJP

【ＦＩ】

C07C229/12 CSP

C07C327/32

A61K31/7088

A61K31/713

A61K31/7105

A61K48/00

A61K9/127

A61K9/51

A61K47/69

A61K47/24

A61K47/28

A61K47/60

A61K9/19

A61K47/20

A61K47/26

A61K47/10

A61K47/02

A61P43/00 105

A61P37/04

A61K38/02

A61K38/43

A61K39/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023567891

(86)(22)【出願日】2022-05-05

(85)【翻訳文提出日】2023-12-27

(86)【国際出願番号】 US2022027874

(87)【国際公開番号】W WO2022235935

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/185,303

(32)【優先日】2021-05-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513269893

【氏名又は名称】アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ａｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】ラジャッパン，クマール

(72)【発明者】

【氏名】タニス，スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】サギ，アミット

(72)【発明者】

【氏名】カルマリ，プリヤ プラカシュ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H006

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA65

4C076AA95

4C076BB13

4C076BB15

4C076CC07

4C076CC26

4C076DD23

4C076DD38

4C076DD57

4C076DD63

4C076DD67

4C076DD70

4C076EE23

4C076GG06

4C084AA13

4C084BA35

4C084BA44

4C084DC01

4C084MA24

4C084MA38

4C084MA66

4C084NA13

4C084ZB09

4C084ZB21

4C085AA13

4C085BA01

4C085BB23

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA05

4C086MA24

4C086MA38

4C086MA66

4C086NA13

4C086ZB09

4C086ZB21

4H006AA01

4H006AA03

4H006AB20

4H006BT12

4H006BU32

4H006TN50

4H006TN60

(57)【要約】

本開示は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を記載し、式中、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－であり、ｍが、４～１１であり、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しないか、直鎖Ｃ_１－５アルキレン、若しくは（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑであり、ｐ及びｑが各々独立して、１～３であり、Ｒ^３は、１つ又は２つのメチル基で任意選択的に置換された直鎖Ｃ_２－５アルキレンであり、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＳであり、ｎは、０～２である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩であって、

【化1】

式中、
Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－であり、ｍが、４～１１であり、
Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しないか、直鎖Ｃ_１－５アルキレン、若しくは（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑであり、ｐ及びｑが、各々独立して、１～３であり、
Ｒ^３は、１つ又は２つのメチル基で任意選択的に置換された直鎖Ｃ_２－５アルキレンであり、
Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０～２である、化合物。

【請求項2】

Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、及び（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－である、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－である、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、及び（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ^１が、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－であり、Ｒ^２が、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、及び（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項7】

ｍが、４～８である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項8】

ｍが、５～７である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

ｍが、５である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

ｍが、６である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項11】

ｍが、７である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項12】

Ｌ^１及びＬ^２が、各々独立して、Ｃ_２－５アルキレン又は（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑである、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項13】

Ｌ^１及びＬ^２が、各々独立して、Ｃ_２－５アルキレンである、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項14】

Ｌ^１及びＬ^２が各々、プロピレンである、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項15】

Ｌ^１及びＬ^２が各々、存在しない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項16】

Ｒ^３が、Ｃ_３－５アルキレンである、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項17】

Ｒ^３が、プロピレンである、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項18】

Ｒ^４及びＲ^５が、各々独立して、Ｃ_１－６アルキルである、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項19】

Ｒ^４及びＲ^５が各々、メチルである、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項20】

ｎが、０～１である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項21】

ｎが、０である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項22】

ｎが、１である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項23】

【化2】

【化3】

、又はその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項24】

前記化合物が、ＡＴＸ－１９３：

【化4】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項25】

前記化合物が、ＡＴＸ－２００：

【化5】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項26】

前記化合物が、ＡＴＸ－２０１：

【化6】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項27】

前記化合物が、ＡＴＸ－２０２：

【化7】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項28】

前記化合物が、ＡＴＸ－２０９：

【化8】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項29】

前記化合物が、ＡＴＸ－２１０：

【化9】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項30】

前記化合物が、ＡＴＸ－２３０：

【化10】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項31】

前記化合物が、ＡＴＸ－２３１：

【化11】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項32】

前記化合物が、ＡＴＸ－２３２：

【化12】

である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項33】

核酸と、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物と、を含む、脂質組成物。

【請求項34】

前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、請求項３３に記載の脂質組成物。

【請求項35】

前記核酸が、目的の治療用タンパク質をコードするコード領域を含むｍＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡである、請求項３３又は３４に記載の脂質組成物。

【請求項36】

前記目的の治療用タンパク質が、酵素、及び抗体、抗原、受容体、又は輸送体である、請求項３５に記載の脂質組成物。

【請求項37】

前記目的の治療用タンパク質が、遺伝子編集酵素である、請求項３５又は３６に記載の脂質組成物。

【請求項38】

前記遺伝子編集酵素が、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、請求項３７に記載の脂質組成物。

【請求項39】

前記脂質組成物が、リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を含む、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の脂質組成物。

【請求項40】

複数のリガンドを含む、脂質ナノ粒子であって、各リガンドが、独立して、請求項１～３２のいずれか一項に記載の化合物であり、前記複数のリガンドが、自己集合して、内部及び外部を含む前記脂質ナノ粒子を形成する、脂質ナノ粒子。

【請求項41】

前記脂質ナノ粒子の平均粒径が、約１００ｎｍ未満である、請求項４０に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項42】

前記脂質ナノ粒子の前記平均粒径が、約５５ｎｍ～約８５ｎｍである、請求項４０又は４１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項43】

前記脂質ナノ粒子が、前記内部に封入された核酸を更に含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項44】

前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、請求項４３に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項45】

前記核酸が、目的の治療用タンパク質をコードするコード領域を含むｍＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡである、請求項４３又は４４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項46】

前記目的の治療用タンパク質が、酵素、及び抗体、抗原、受容体、又は輸送体である、請求項４５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項47】

前記目的の治療用タンパク質が、遺伝子編集酵素である、請求項４５又は４６に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項48】

前記遺伝子編集酵素が、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、請求項４７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項49】

前記脂質ナノ粒子が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）から選択されるヘルパー脂質を更に含む、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項50】

前記ヘルパー脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項４９に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項51】

コレステロールを更に含む、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項52】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを更に含む、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項53】

ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ－ＤＭＧである、請求項５２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項54】

前記ＰＥＧ－ＤＭＧが、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧである、請求項５３に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項55】

前記脂質ナノ粒子が、約４５モル％～６５モル％の請求項１～３２のいずれか一項に記載の化合物、約２モル％～約１５モル％のヘルパー脂質、約２０モル％～約４２モル％のコレステロール、及び約０．５モル％～約３モル％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む、請求項４０～５４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項56】

前記脂質ナノ粒子が、約５０モル％～約６１モル％の請求項１～３２のいずれか一項に記載の化合物、約５モル％～約９モル％の前記ヘルパー脂質、約２９モル％～約３８モル％のコレステロール、及び約１モル％～約２モル％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む、請求項５５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項57】

前記脂質ナノ粒子が、約５６モル％～約５８モル％の請求項１～３２のいずれか一項に記載の化合物、約６モル％～約８モル％のＤＳＰＣ、約３１モル％～約３４モル％のコレステロール、及び約１．２５モル％～約１．７５モル％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む、請求項５５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項58】

前記脂質ナノ粒子が、約５０：１～約１０：１の総脂質：核酸重量比を有する、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項59】

前記脂質ナノ粒子が、約４０：１～約２０：１の総脂質：核酸重量比を有する、請求項５８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項60】

前記脂質ナノ粒子が、約３５：１～約２５：１の総脂質：核酸重量比を有する、請求項５８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項61】

前記脂質ナノ粒子が、約３２：１～約２８：１の総脂質：核酸重量比を有する、請求項５８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項62】

前記脂質ナノ粒子が、約３１：１～約２９：１の総脂質：核酸重量比を有する、請求項５８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項63】

請求項１～３２のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項４０～６２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項64】

前記医薬が、凍結乾燥組成物である、請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項65】

前記脂質ナノ粒子が、約７．４のｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝液を含む、請求項６３又は６４に記載の医薬組成物。

【請求項66】

前記ＨＥＰＥＳ緩衝液が、約７ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項６５に記載の医薬組成物。

【請求項67】

前記脂質ナノ粒子が、約２．０ｍｇ／ｍＬ～約４．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌを更に含む、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項68】

前記脂質ナノ粒子が、１つ以上の凍結保護剤を更に含む、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項69】

前記１つ以上の凍結保護剤が、スクロース、グリセロール、又はスクロースとグリセロールとの組み合わせから選択される、請求項６８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項70】

前記脂質ナノ粒子が、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースと、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールとの組み合わせを含む、請求項６９に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項71】

疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の、請求項４０～６２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項６３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項72】

前記組成物又は脂質ナノ粒子が、静脈内又は筋肉内投与される、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

標的細胞においてタンパク質又はポリペプチドを発現する方法であって、前記標的細胞を、請求項４０～６２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項６３に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項74】

前記タンパク質又はポリペプチドが、抗原であり、前記抗原の発現が、インビボ免疫原性応答を提供する、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

核酸の送達を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の前記核酸を、４０～６２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子に封入することと、前記脂質ナノ粒子を前記対象に投与することと、を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書の実施形態は、概して、脂質に関する。具体的には、本明細書の実施形態は、生物活性分子及び治療用分子の細胞内送達を促進する、新しい脂質及び脂質組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

標的送達のための様々な核酸系の治療薬は、脂質系送達ビヒクルにとっての課題を生み出す。例えば、核酸は、サイズ及びタイプが構造的に多様である。例としては、遺伝子療法で使用されるＤＮＡ、プラスミド、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で使用するためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス分子、リボザイム、アンタゴミル、及びアプタマーが挙げられる。

【0003】

かかる脂質系送達ビヒクルに含むためのカチオン性脂質及びイオン化可能なカチオン性脂質の設計及び使用は、大きな利点を示している。しかしながら、これらの脂質の使用は、インビボで投与された場合、有意な副作用に寄与し得る。観察されている１つの問題には、低い生分解性及び標的組織からのクリアランスが含まれ、したがって、脂質のインビボでの蓄積が生じる。別の問題は、大量の脂質が、対象における不快感及び活性成分の治療効果の減少をもたらし得る、有害な免疫原性効果を引き起こし得ることである。多くのカチオン性脂質に関連する第３の問題は、標的への効果的な送達の割合が低いことであり、したがって、比較的低い治療効果又は低い効力をもたらす。最後に、送達ビヒクル中のカチオン性脂質が、特別に調整されたｐＨを有し、それにより、活性剤と製剤化し、投与中に分解から保護することができるが、ビヒクルがその標的に到達すると、活性剤を放出することができることが重要である。したがって、当該技術分野において、脂質－核酸送達系の特別な必要性を満たすことができる新しい脂質の開発の必要性がある。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、疾患を治療するための核酸及び他の治療剤の脂質系送達に有用な、本明細書に記載の式（Ｉ）の脂質を提供する。これら及び他の使用は、当業者には明らかであろう。主題技術の追加的な特徴及び利点は以下の説明に記載され、部分的には、説明から明らかになるか、又は主題技術の実施によって学習され得る。主題技術の利点は、本明細書の書面による説明及び実施形態、並びに添付図面で具体的に指摘される構造によって実現及び達成されるであろう。

【0005】

前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的であり、また主題技術の更なる説明を提供することが意図されていることが理解されるべきである。

【0006】

いくつかの実施形態では、本開示は、式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、

【化1】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－であり、ｍが、４～１１であり、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しないか、直鎖Ｃ_１－５アルキレン、若しくは（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑであり、ｐ及びｑが各々独立して、１～３であり、Ｒ^３は、１つ又は２つのメチル基で任意選択的に置換された直鎖Ｃ_２－５アルキレンであり、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＳであり、ｎは、０～２である。

【0007】

いくつかの実施形態では、本開示は、複数のリガンドを含む脂質ナノ粒子を提供し、各リガンドは独立して、本明細書に記載の化合物であり、複数のリガンドは、自己集合して、内部及び外部を含む脂質ナノ粒子を形成する。

【0008】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物又は本明細書に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態では、本開示は、疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、治療有効量の、本明細書に記載の化合物、本明細書に記載の脂質ナノ粒子、又は本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、本開示は、核酸の送達を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、治療有効量の核酸を、本明細書に記載の脂質ナノ粒子に封入することと、脂質ナノ粒子を対象に投与することと、を含む。

【発明を実施するための形態】

【0011】

Ｉ．一般
主題技術の様々な構成は、本開示から当業者には容易に明らかになり、主題技術の様々な構成は、例示として示され、かつ説明されることが理解される。当然のことながら、主題技術は、その他の構成及び異なる構成の能力を有し、そしてそのいくつかの詳細は全て、主題技術の範囲から逸脱することなく、様々な他の点で修正することができる。したがって、概要及び発明を実施するための形態は、本質的に例示とみなされ、制限的とみなされるべきではない。

【0012】

以下に記載される発明を実施するための形態は、主題技術の様々な構成の説明として意図されており、主題技術が実践され得る唯一の構成を表すことを意図していない。添付図面は本明細書に組み込まれ、発明を実施するための形態の一部を構成する。発明を実施するための形態には、主題技術の完全な理解を提供する目的での具体的な詳細が含まれる。しかしながら、当業者には、主題技術がこれらの具体的な詳細なしに実施され得ることが明らかであろう。一部の事例では、周知の構造及び構成要素は、主題技術の概念を不明瞭にすることを回避するために、ブロック図の形態で示されている。同様の構成要素は、理解の簡単のために同一の要素番号でラベル付けされる。

【0013】

ＩＩ．定義
本明細書の様々な箇所で、本開示の化合物の置換基が、群又は範囲で開示される。本開示は、こうした群及び範囲の一員のありとあらゆる個々の部分組み合わせを含むことが特に意図される。例えば、「Ｃ_１－６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ_３アルキル、Ｃ_４アルキル、Ｃ_５アルキル、及びＣ_６アルキルを個々に開示することを特に意図している。

【0014】

「～と組み合わせて投与する」又は「～と組み合わせた投与」という語句は、２つ以上の薬剤が、患者に対する各薬剤の効果の重複があってもよいように、同時に又は間隔内で対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、又は１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、組み合わせ効果（例えば、相乗効果）が達成されるように、相互十分に近い間隔が置かれる。

【0015】

１つ以上の興味のある値に適用される「およそ」又は「約」という用語は、記載された参照値と類似した値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、別段の記載がない限り、又は別の方法で文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向（その値から超又は未満）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満内に収まる値の範囲を指す（ただし、そのような数が可能性のある値の１００％を超えることになる場合を除く）。

【0016】

特許請求の範囲において、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」などの冠詞は、相反することが示されない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ以上を意味する場合がある。１つ以上の群のメンバーの間に「又は」を含む特許請求の範囲又は説明は、群のメンバーの１つ、２つ以上、又は全てが、相反することが示されない限り、又は別の方法で文脈から明白でない限り、所与の生成物又はプロセスに存在するか、採用されるか、又は別の方法で関連する場合に、充足されるとみなされる。本開示は、群の厳密に１つのメンバーが所与の生成物又はプロセスに存在するか、採用されるか、又は別の方法で関連する実施形態を含む。本開示は、群のメンバーの２つ以上又は全てが所与の生成物又はプロセスに存在するか、採用されるか、又は別の方法で関連する実施形態を含む。

【0017】

本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合又は三重結合を含有しない）直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有してもよい（本明細書に現れるときは常に、「１～２０」などの数値範囲は、所与の範囲内の各整数を指し、例えば、「１～２０個の炭素原子」は、アルキル基が、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などからなってもよく、最大２０個の炭素原子を含むが、本定義は、数値範囲が指定されていない「アルキル」という用語の発生も包含することを意味する）。アルキル基はまた、１～９個の炭素原子を有する中サイズのアルキルであってもよい。アルキル基はまた、１～６個の炭素原子を有する低級アルキルとすることも可能である。アルキル基は、「Ｃ_１－４アルキル」又は類似の指定として指定されてもよい。一例としてのみであるが、「Ｃ_１－４アルキル」は、アルキル鎖に１～４個の炭素原子が存在することを示し、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔ－ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらにいかなるやり方でも限定されない。

【0018】

「アルキレン」とは、示される炭素原子の数を有し、少なくとも２つの他の基を結合する、直鎖又は分岐鎖の飽和脂肪族ラジカル、すなわち二価炭化水素ラジカルを指す。アルキレンに結合された２つの部分は、アルキレン基の同じ原子又は異なる原子に結合され得る。例えば、直鎖アルキレンは、－（ＣＨ_２）_ｎ－の二価ラジカルであり得、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である。代表的なアルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ－ブチレン、ペンチレン、及びヘキシレンが挙げられるが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換又は非置換であり得る。

【0019】

「低級アルキル」という用語は、鎖が直鎖又は分岐鎖であってもよい鎖内に１～６個の炭素を有する基を意味する。好適なアルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、及びヘキシルが挙げられる。

【0020】

本明細書で使用される場合、「アミノ」という用語は、－Ｎ（Ｒ^Ｎ１）_２を表し、各Ｒ^Ｎ１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ_２、Ｎ（Ｒ^Ｎ２）_２、ＳＯ_２ＯＲ^Ｎ２、ＳＯ_２Ｒ^Ｎ２、ＳＯＲ^Ｎ２、Ｎ保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリル、シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、カルボキシアルキル（例えば、Ｏ－保護基で任意選択的に置換された、例えば、任意選択的に置換されたアリールアルコキシカルボニル基若しくは本明細書に記載の任意のもの）、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載の他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、Ｏ－保護基で任意選択的に置換された、例えば、任意選択的に置換されたアリールアルコキシカルボニル基若しくは本明細書に記載の任意のもの）、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又はアルキルヘテロシクリル（例えば、アルキルヘテロアリール）であり、これらの列挙されたＲ^Ｎ１基の各々は、各基について本明細書に定義されるように、任意選択的に置換され得るか、又は２つのＲ^Ｎ１を組み合わせて、ヘテロシクリル若しくはＮ保護基を形成することができ、各Ｒ^Ｎ２は、独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールである。本開示のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち、－ＮＨ_２）又は置換アミノ（すなわち、－Ｎ（Ｒ′）_２）であり得る。好ましい実施形態では、アミノは、－ＮＨ_２又は－ＮＨＲ^Ｎ１であり、Ｒ^Ｎ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＲ^Ｎ２ _２、ＳＯ_２ＯＲ^Ｎ２、ＳＯ_２Ｒ^Ｎ２、ＳＯＲ^Ｎ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載の他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、ｔ－ブトキシカルボニルアルキル）、又はアリールであり、各Ｒ^Ｎ２は、Ｈ、Ｃ_１－２０アルキル（例えば、Ｃ_１－６アルキル）、又はＣ_１－１０アリールであり得る。

【0021】

「アニオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨで負に荷電した脂質を意味する。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合された他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0022】

一連の項目の前に置かれ、項目のいずれかを分離する「及び（ａｎｄ）」又は「又は（ｏｒ）」という用語を伴う「少なくとも１つの」という語句は、リストの各メンバー（すなわち、各項目）ではなく、全体としてリストを修飾する。「少なくとも１つの」という語句は、列挙された各項目のうちの少なくとも１つの選択を必要とせず、むしろ、この語句は、項目のうちのいずれか１つ、及び／又は項目の任意の組み合わせのうちの少なくとも１つ、及び／又は項目の各々のうちの少なくとも１つのうちの少なくとも１つを含む意味を可能にする。一例として、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つ」又は「Ａ、Ｂ又はＣのうちの少なくとも１つ」という語句は各々、Ａのみ、Ｂのみ、又はＣのみ、Ａ、Ｂ、及びＣの任意の組み合わせ、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣの各々のうちの少なくとも１つを指す。

【0023】

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、又はそれに類する用語が記載又は特許請求の範囲で使用され、こうした用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語が特許請求の範囲の移行語として用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語と同様の様態で包括的であることが意図される。

【0024】

単数形の要素への言及は、特に明記されない限り、「１つのみ」を意味することを意図するものではなく、むしろ「１つ以上」を意味することを意図する。男性の代名詞（例えば、彼の）には、女性及び中性の性別（例えば、彼女の及びその）が含まれ、その逆も同様である。「いくつかの」という用語は、１つ以上を指す。下線付き及び／又は斜体の見出し及び小見出しは、便宜上のみ使用され、主題技術を限定せず、また主題技術の記載の解釈に関連しては言及されない。当業者に既知であるか、又は後に既知となる、本開示全体を通して記載される様々な構成の要素に対する全ての構造的及び機能的均等物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、主題技術によって包含されることが意図される。更に、本明細書に開示されるいかなる開示も、かかる開示が上記の記載に明示的に列挙されているか否かにかかわらず、一般公衆専用であることを意図するものではない。

【0025】

「カチオン性脂質」という用語は、正の親水性頭部基、１つ、２つ、３つ以上の疎水性脂肪酸又は脂肪アルキル鎖、及びこれら２つのドメイン間のコネクタを有する、両親媒性脂質及びその塩を意味する。イオン性カチオン性脂質又はプロトン化可能なカチオン性脂質は、典型的に、そのｐＫａを下回るｐＨでプロトン化（すなわち、正に荷電）され、ｐＫａを上回るｐＨで実質的に中性である。好ましいイオン性カチオン性脂質は、生理的ｐＨよりも低いｐＫａを有する脂質であり、典型的に約７．４である。本開示のカチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質と称されてもよい。カチオン性脂質は、プロトン化可能な三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭部基を有する「アミノ脂質」とすることができる。いくつかのアミノ例示的なアミノ脂質は、Ｃ１８アルキル鎖を含むことができ、各アルキル鎖は、独立して、０～３個（例えば、０、１、２、又は３個）の二重結合、及び頭部基とアルキル鎖との間にエーテル結合、エステル結合、又はケタール結合を有する。かかるカチオン性脂質としては、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られる）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭ Ａ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られる）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られる）、及び（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂｌ １としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0026】

「含む」という用語は、開かれたものであることが意図され、追加の要素又は工程を含むことを許容するが、必要とはしない。本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が使用されるときは、それゆえに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も包含され、かつ開示される。

【0027】

「と組み合わせて」という用語は、本開示の脂質製剤化されたｍＲＮＡを、本開示の治療方法において他の薬剤とともに投与することを意味し、本開示の脂質製剤化されたｍＲＮＡ及び他の薬剤が、別個の剤形で逐次的に若しくは同時に投与されるか、又は同じ剤形で同時に投与されることを意味する。

【0028】

本明細書に記載される実施例で使用される「市販の化学物質」という用語及び化学物質は、標準的な商業的供給源から得られてもよく、そのような供給源としては、例えば、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、Ｓｉｇｍａ－Ａｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ａｖｏｃａｄｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，Ｕ．Ｋ．）、Ｂｏｒｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｎｄｈａｍ，Ｎ．Ｈ．）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，Ｕ．Ｋ．）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．）、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒ．）、及びＷａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．）が挙げられる。

【0029】

「化学文献に記載される化合物」という語句は、当業者には既知のように、化学化合物及び化学反応を対象とする参考書及びデータベースを介して特定され得る。本明細書に開示される化合物の調製に有用な反応物質の合成を詳述する、又は本明細書に開示される化合物の調製を記載する記事への参照を提供する、好適な参考文献及び論文としては、例えば、“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｓ．Ｒ．Ｓａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，“Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，”２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３、Ｈ．Ｏ．Ｈｏｕｓｅ，“Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，”２ｎｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９７２、Ｔ．Ｌ．Ｇｌｉｃｈｒｉｓｔ，“Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”２ｎｄ Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１が挙げられ、具体的かつ類似の反応物質はまた、ほとんどの公共図書館及び大学図書館で入手可能である、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙによって調製された既知の化学物質の索引を通して、並びにオンラインデータベース（更なる詳細については、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に連絡することが可能である）を通して特定され得る。既知であるがカタログで市販されていない化学物質は、カスタム化学合成企業によって調製されてもよく、ここで、標準化学物質供給企業の多く（上記に列挙したものなど）は、カスタム合成サービスを提供する。

【0030】

本明細書で使用される場合、薬剤の「有効量」という用語は、有益な又は所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、そのため、「有効量」はそれが適用される状況に依存する。例えば、がんを治療する薬剤を投与する文脈では、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与なく得られた応答と比較して、本明細書に定義されるようながんの治療を達成するのに十分な量である。

【0031】

「完全に封入された」という用語は、核酸－脂質粒子中の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が、遊離ＲＮＡを有意に分解するであろう血清又はヌクレアーゼアッセイへの曝露後に有意に分解されないことを意味する。完全に封入されると、通常では遊離核酸の１００％を分解するであろう処理で、好ましくは粒子中の核酸の２５％未満が分解され、より好ましくは１０％未満が分解され、最も好ましくは５％未満が分解される。「完全に封入された」は、核酸脂質粒子が、インビボ投与時にその成分部分へと急速に分解しないことも意味する。

【0032】

「化合物」という用語は、示される構造の全ての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、及び同位体を含むことを意味する。

【0033】

「送達」という用語は、化合物、物質、実体、部分、積荷、又はペイロードを送達する行為又は方法を指す。

【0034】

「特徴」という用語は、特性（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性（ｐｒｏｐｅｒｔｙ）、又は特有の要素を指す。

【0035】

本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られたポリペプチドを含んでもよい。

【0036】

「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和脂肪族炭化水素基及び不飽和脂肪族炭化水素基、並びに１つ以上の芳香族基、脂環式基、又は複素環式基によって任意選択的に置換されたかかる基が挙げられるが、これらに限定されない、無極性基を有する化合物を意味する。好適な例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含み、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物を意味する。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分けられる：（１）脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、及び（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。

【0038】

「脂質送達ビヒクル」という用語は、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を興味のある標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用することができる脂質製剤を意味する。脂質送達ビヒクルは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）、及び任意選択的にコレステロールから形成することができる核酸脂質粒子とすることができる。典型的には、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、粒子の脂質部分に封入され、それによって酵素分解から保護されてもよい。

【0039】

「脂質封入」という用語は、完全封入、部分封入、又はその両方を有するｍＲＮＡなどの治療用核酸を提供する脂質粒子を意味する。好ましい実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質粒子内に完全に封入される。

【0040】

「両親媒性脂質（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｌｉｐｉｄ）」又は「両親媒性脂質（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｌｉｐｉｄ）」という用語は、脂質材料の疎水性部分が疎水性相に配向する一方で、親水性部分が水相に配向する材料を意味する。親水性の特性は、極性、又は炭水化物、リン酸塩、カルボン酸、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル、及び他の同様の基などの荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖飽和脂肪族炭化水素基及び不飽和脂肪族炭化水素基、並びに１つ以上の芳香族基、脂環式基、又は複素環式基によって置換されたかかる基が挙げられるがこれらに限定されない無極性基の包含によって与えられることが可能である。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

「リンカー」又は「結合部分」という用語は、原子の群、例えば、１０～１００個の原子を指し、またそれらは、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなど、しかしこれらに限定されない原子又は基からなることができる。リンカーは、アミノ酸配列への組み込みに干渉しない十分な長さであってもよい。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルが挙げられるがそれらに限定されず、それらの各々は、本明細書に記載されるように、任意選択的に置換することができる。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレン又はプロピレングリコール単量体単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、又はテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。その他の例としては、還元剤又は光分解を使用して開裂され得る、リンカー内の開裂可能な部分、例えば、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）又はアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）が挙げられるが、これらに限定されない。選択的に開裂可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、又は他の還元剤の使用によって開裂することができるアミド結合、及び／又は光分解、並びに、例えば、酸性加水分解若しくは塩基性加水分解によって開裂することができるエステル結合が挙げられる。

【0042】

哺乳動物という用語は、ヒト若しくは他の哺乳動物を意味するか、又はヒトを意味する。

【0043】

「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、興味のあるタンパク質又はポリペプチドをコードし、インビトロ、インビボ、インサイチューで、又はエクスビボで、コードされた興味のあるタンパク質又はポリペプチドを産生するように翻訳することができる任意のポリヌクレオチドを指す。

【0044】

「修飾」という用語は、本開示の分子の状態又は構造の変化を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む多くの方法で修飾される場合がある。一実施形態では、核酸活性成分は、例えば、天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するため、非天然ヌクレオシド及び／又はヌクレオチドの導入によって修飾される。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なる場合があるが、「修飾」とは考えられない。

【0045】

「天然に存在する」という用語は、人工的な補助を有しないで自然界に存在することを意味する。

【0046】

「非ヒト脊椎動物」という用語は、野生種及び家畜種を含むホモサピエンスを除く全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、哺乳動物、例えばアルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、モルモット、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤクが挙げられるが、これらに限定されない。

【0047】

「患者」という用語は、治療を求めるか、又は治療を必要とする対象、治療が必要とされる患者、治療を受けている対象、又は治療を受ける予定の対象、又は特定の疾患若しくは状態について訓練を受けた専門家からケアを受けている対象を指す。

【0048】

「任意選択的に置換されるＸ」（例えば、任意選択的に置換されるアルキル）という語句は、「Ｘが任意選択的に置換される、Ｘ」と均等であることが意図され、（例えば、「当該アルキルが任意選択的に置換される、アルキル」）である。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）それ自体が任意選択的であることを意味することを意図するものではない。

【0049】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に匹敵する、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために使用される。

【0050】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」という語句は、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁又は溶解することができるビヒクル）を指し、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性である特性を有する。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成体又はコーティング、風味剤、香味剤、滑剤（流動促進剤）、潤滑剤、保存剤、印刷インク、吸収剤、懸濁剤又は分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられてもよい。例示的な賦形剤としては、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、プレゼラチン化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリコール酸デンプンナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。

【0051】

「薬学的に許容可能な塩」という語句は、開示された化合物の誘導体を指し、親化合物は、既存の酸又は塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって）修飾される。薬学的に許容可能な塩の例としては、アミンなどの塩基性残基のミネラル塩又は有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウ脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩が挙げられる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどだけでなく、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオンも挙げられるが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどに限定されない。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、非毒性無機酸又は非毒性有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学方法によって塩基性部分又は酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般的に、こうした塩は、これらの化合物の遊離酸形態又は遊離塩基形態を、水中又は有機溶媒中、又は２つの混合物中の化学量論的な量の適切な塩基又は酸と反応させることによって調製することができ、一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５、ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見られ、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0052】

「薬物動態」という用語は、生きている生命体に投与される物質の運命の決定に関連する際の分子又は化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、及び排泄の程度及び速度を含むいくつかの領域に分けられる。これは一般的に、ＡＤＭＥと称され、以下である。（Ａ）吸収は血液循環に入る物質のプロセスであり、（Ｄ）分布は身体の流体及び組織全体にわたる物質の分散又は播種であり、（Ｍ）代謝（又は生体内変換）は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的な変換であり、（Ｅ）排泄（又は排除）は、身体からの物質の除去を指す。まれに、一部の薬剤は身体組織に不可逆的に蓄積する。

【0053】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれる、本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投与量において生理学的に忍容性がある。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、又はそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶、又は沈殿によって調製されてもよい。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。

【0054】

「物理化学的」という用語は、物理的及び／又は化学的特性を意味する、又は物理的及び／又は化学的特性に関連する。

【0055】

「リン酸塩」という用語は、当業者によって理解されるその通常の意味で使用され、そのプロトン化形態、例えば、

【化2】

を含む。
本明細書で使用される場合、「一リン酸塩」、「二リン酸塩」、及び「三リン酸塩」という用語は、当業者によって理解されるような、通常の意味で使用され、プロトン化形態を含む。

【0056】

「予防」という用語は、感染、疾患、障害、及び／又は状態の発症を部分的又は完全に遅延させること、１つ以上の症状、機能、又は特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは状態の臨床的な兆候の発症を部分的又は完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ以上の症状、機能、又は兆候の発症を部分的又は完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害及び／又は状態からの進行を部分的又は完全に遅延させること、並びに／又は感染、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病理が進展するリスクを減少させることを指す。

【0057】

「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボ－フラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生ＲＮＡ、並びに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。そのような改変は、干渉ＲＮＡの末端への、又は内部への、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。本開示のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチド、又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、類似体又は天然に存在するＲＮＡの類似体と称することができる。本明細書で使用される場合、「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」という用語は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、及び多価ＲＮＡを含む、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含有する分子を指す。

【0058】

「試料」又は「生体試料」という用語は、その組織、細胞、又は成分部分のサブセット（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜血、尿、膣液、及び精液が挙げられるが、これらに限定されない体液）を指す。試料は、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸、及び生殖器管の外部切片、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器が挙げられるがしかしこれらに限定されない、全生物体、又はその組織、細胞、若しくは成分部分のサブセット、又はその画分若しくは部分から調製された均質物、溶解物、又は抽出物を更に含んでもよい。試料は更に、タンパク質又は核酸分子などの細胞成分を含有し得る栄養ブロス又はゲルなどの培地を指す。

【0059】

「有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）」又は「有意に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」という用語は、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語と同義で使用される。

【0060】

「単回単位用量」という語句は、１回の用量／一回／単一の経路／単一の接触点、すなわち、単一の投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。

【0061】

「ｓｉＲＮＡ」という用語又は低分子干渉ＲＮＡは、時として短干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとして知られており、典型的に、ｍｉＲＮＡと類似した１８～２７塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ非コードＲＮＡ分子のクラスを指し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する。これは、転写後にｍＲＮＡを分解し、それによって翻訳を防止することによって相補的ヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現と干渉する。

【0062】

溶媒和物という用語は、本開示の化合物と１つ以上の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、水素結合を含む、様々な程度のイオン結合を伴う。ある特定の事例では、溶媒和物は、例えば、１つ以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれるときに、単離する能力を有する。「溶媒和物」は、溶液相及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。好適な溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール酸塩、メタノール酸塩などが挙げられる。

【0063】

「分割用量」という用語は、単回単位用量又は総１日用量を２回以上の用量に分割することである。

【0064】

「安定」という用語は、反応混合物から有用な純度までの単離に耐えるのに十分に堅牢であり、好ましくは有効な治療剤に製剤化することができる化合物を指す。

【0065】

「安定化する（ｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」、「安定化した（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）」、「安定化領域（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、安定させる、又は安定するようになることを意味する。

【0066】

「置換」という用語は、水素以外の特定の基による置換、又は、例えば、独立して選択される各々が同一であっても異なっていてもよい、１つ以上の基、部分、若しくはラジカルによる置換を意味する。

【0067】

「実質的に」という用語は、興味のある特性（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）又は特性（ｐｒｏｐｅｒｔｙ）の合計又はほぼ合計の範囲又は程度を示す定性的条件を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的現象及び化学的現象は、もし存在する場合であっても、完了すること、及び／若しくは完全性に進むこと、又は絶対的な結果を達成若しくは回避することはほとんどないことを理解するであろう。したがって、本明細書では、多くの生物学的現象及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如の可能性を捕捉するために、「実質的に」という用語が使用される。

【0068】

「実質的に等しい」という語句は、用量間の時間差に関し、用語は、±２％を意味する。

【0069】

「実質的に同時に」という語句は、複数の用量に関し、用語は、２秒以内を意味する。

【0070】

「に罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ）」という語句は、疾患、障害、及び／又は状態「に罹患している」個人が、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状と診断されたか、あるいは疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状を示すことに関連する。

【0071】

「感受性」という語句は、疾患、及び／又は状態に対する「感受性が高い」個人が、疾患、障害、及び／又は状態は診断されていない、及び／あるいは疾患、障害、及び／又は状態の症状を示さないが、疾患又はその症状を発症する傾向を有する個人に関する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態（例えば、がん）に対する感受性が高い個人は、以下のうちの１つ以上によって特徴解析される場合がある：（１）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する遺伝子変異、（２）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する遺伝子多型、（３）疾患、障害、及び／又は状態に関連するタンパク質及び／若しくは核酸の発現並びに／又は活性の増加及び／若しくは減少、（４）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する習慣及び／又はライフスタイル、（５）疾患、障害、及び／又は状態についての家族歴、並びに（６）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する微生物への曝露及び／又は感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態に対して感受性が高い個人は、疾患、障害、及び／又は状態を発症する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態に対して感受性を有する個人は、疾患、障害、及び／又は状態を発症しない。

【0072】

「合成」という用語は、人の手によって生成、調製、及び／又は製造されることを意味する。本開示のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド又は他の分子の合成は、化学的合成又は酵素的合成であってもよい。

【0073】

「治療剤」という用語は、対象に投与されたとき、治療効果、診断効果、及び／若しくは予防効果を有し、かつ／又は所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。

【0074】

「治療有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／又は状態に罹患しているか、感染、疾患、障害、及び／又は状態に対して感受性が高い対象に投与された場合、感染、疾患、障害、及び／又は状態を治療、その症状の改善、診断、予防、及び／又はその発症を遅延させるのに十分である、送達される薬剤（例えば、核酸、薬剤、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。

【0075】

「治療的に有効な転帰」という用語は、感染、疾患、障害、及び／又は状態に罹患しているか、又は感染、疾患、障害、及び／又は状態に対して感受性が高い対象において、感染、疾患、障害、及び／又は状態を治療、その症状の改善、診断、予防、及び／又はその発症を遅延させるのに十分である転帰を意味する。

【0076】

「総１日用量」という用語は、２４時間の期間に与えられる、又は処方される量である。これは、単回単位用量として投与されてもよい。

【0077】

「治療」という用語は、特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴の部分的又は完全な軽減、軽快、改善、緩和、その発症の遅延、その進行の阻害、その重症度の低減、及び／又はその発生率の低減を指す。例えば、がんの「治療」とは、腫瘍の生存、成長、及び／又は拡散を阻害することを指す場合がある。治療は、疾患、障害、及び／又は状態に関連する病理の発症リスクを減少させる目的で、疾患、障害、及び／若しくは状態の徴候を示さない対象、並びに／又は疾患、障害、及び／又は状態の早期の徴候のみを示す対象に投与されてもよい。

【0078】

「非修飾」という用語は、いかなる方法であれ変更される前の任意の物質、化合物、又は分子を指す。非修飾は、必ずしもではないが、野生型又は天然型の生体分子を指す場合がある。分子は、一連の修飾を受けてもよく、それによって、各修飾分子は、その後の修飾のための「非修飾」開始分子として機能してもよい。

【0079】

本明細書に記載される化合物は、非対称であってもよい（例えば、１つ以上の立体中心を有する）。別段の指示がない限り、エナンチオマー及びジアステレオマーなどの全ての立体異性体が意図される。非対称的に置換された炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学的活性形態又はラセミ体において単離することができる。光学的活性出発材料から光学的活性形態を調製する方法は、ラセミ混合物の分解能、又はエナンチオ選択的及び／若しくは立体選択的合成によるなど、当該技術分野では既知である。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合、及びこれに類するものの多くの幾何異性体も、本明細書に記載される化合物中に存在することができ、本開示ではこのような安定した異性体の全てが意図される。本開示の化合物のシス幾何異性体及びトランス幾何異性体が記載され、異性体の混合物として、又は分離された異性体形態として単離されてもよい。

【0080】

本開示の化合物はまた、互変異性型も含む。互変異性型は、隣接する二重結合との一重結合のスワッピング及びプロトンの同時移動からもたらされる。互変異性型は、同じ経験式及び総電荷を有する異性体プロトン化状態であるプロトトロピック互変異性体を含む。プロトトロピック互変異性体の例としては、ケトン－エノール対、アミド－イミド酸対、ラクタム－ラクチム対、エナミン－イミン対、及び環状形態が挙げられ、プロトンは、１Ｈ－及び３Ｈ－イミダゾール、１Ｈ－、２Ｈ－及び４Ｈ－１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－及び２Ｈ－イソインドール、並びに１Ｈ－及び２Ｈ－ピラゾールなどの複素環系の２つ以上の位置を占めることができる。互変異性型は、平衡状態であってもよく、又は適切な置換によって１つの形態に立体的に係止されてもよい。

【0081】

本開示の化合物はまた、中間化合物又は最終化合物で生じる原子の同位体の全ても含む。「同位体」とは、核内の異なる数の中性子からもたらされる、同じ原子数を有するが異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体は、三重水素及び重水素を含む。

【0082】

本開示の化合物及び塩は、溶媒又は水分子と組み合わせて調製されて、日常的な方法によって溶媒和物及び水和物を形成することができる。

【0083】

「半減期」という用語は、核酸又はタンパク質の濃度又は活性などの量が、ある期間の開始時に測定した際のその値の半分に減少するのに必要とされる時間である。

【0084】

「インビトロ」という用語は、生命体（例えば、動物、植物、又は微生物）の中ではなく、人工的な環境内、例えば、試験管又は反応容器内、細胞培養物内、シャーレ内などで生じる事象を指す。

【0085】

「インビボ」という用語は、生命体（例えば、動物、植物、若しくは微生物、又はその細胞若しくは組織）の中で生じる事象を指す。

【0086】

「モノマー」という用語は、単一の単位、例えば、同じ又は異なるタイプの別の分子と結合してオリゴマーを形成し得る単一の核酸を指す。いくつかの実施形態では、モノマーは、非固定核酸、すなわち、ＵＮＡモノマーであってもよい。

【0087】

「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電性又は中性双性イオン性形態のいずれかで存在する脂質種を意味する。生理的ｐＨにおいて、かかる脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが挙げられる。

【0088】

「非カチオン性脂質」という用語は、両親媒性脂質又は中性脂質又はアニオン性脂質を意味し、本明細書に記載される。

【0089】

「対象」又は「患者」という用語は、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療目的のために、本開示による組成物が投与されてもよい任意の生命体を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）及び／又は植物が挙げられる。

【0090】

「翻訳可能」という用語は、「発現可能」という用語と互換的に使用されてもよく、宿主細胞によってポリペプチドに変換されるポリヌクレオチド又はその一部分の能力を指す。当該技術分野で理解されるように、翻訳は、細胞の細胞質中のリボソームがポリペプチドを生成するプロセスである。翻訳では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、リボソーム複合体中のｔＲＮＡによって復号されて、特定のアミノ酸鎖又はポリペプチドを産生する。更に、オリゴマーに関して本明細書で使用される場合、「翻訳可能」という用語は、オリゴマーの少なくとも一部分、例えば、オリゴマー配列のコード領域（コード配列又はＣＤＳとしても知られる）が、タンパク質又はその断片に変換される能力を有することを意味する。

【0091】

治療的に有効な転帰：本明細書で使用される場合、「治療的に有効な転帰」という用語は、感染、疾患、障害、及び／又は状態に罹患しているか、又は感染、疾患、障害、及び／又は状態に対して感受性が高い対象において、感染、疾患、障害、及び／又は状態を治療、その症状の改善、診断、予防、及び／又はその発症を遅延させるのに十分である転帰を意味する。

【0092】

「単位用量」という用語は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、概して、対象に投与されることになる活性成分の用量、及び／又はそのような用量の１／２又は１／３が挙げられるが、しかしこれらに限定されない、そのような用量の好都合な画分と等しくてもよい。

【0093】

本開示は、ある特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細が例示の目的で説明されているが、本開示は、追加の実施形態を含み、本明細書に記載される詳細の一部は、本開示から逸脱することなく大幅に変化する場合があることが、当業者には明らかであろう。本開示は、このような追加の実施形態、修飾、及び均等物を含む。特に、本開示は、様々な例示的な構成要素及び実施例の特徴、用語、又は要素の任意の組み合わせを含む。

【0094】

ＩＩＩ．化合物
いくつかの実施形態では、本開示は、式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩を提供し、

【化3】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－であり、ｍが、４～１１であり、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しないか、直鎖Ｃ_１－５アルキレン、若しくは（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑであり、ｐ及びｑが各々独立して、１～３であり、Ｒ^３は、１つ又は２つのメチル基で任意選択的に置換された直鎖Ｃ_２－５アルキレンであり、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＳであり、ｎは、０～２である。

【0095】

いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、及び（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－である。いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、及び（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ^１は、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－であり、Ｒ^２は、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、及び（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－から選択される。

【0096】

いくつかの実施形態では、ｍは、４～１１である。いくつかの実施形態では、ｍは、４～９である。いくつかの実施形態では、ｍは、４～８である。いくつかの実施形態では、ｍは、５～７である。いくつかの実施形態では、ｍは、５である。いくつかの実施形態では、ｍは、６である。いくつかの実施形態では、ｍは、７である。

【0097】

いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しないか、直鎖Ｃ_１－５アルキレン、又は（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑである。いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、Ｃ_１－５アルキレン又は（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑである。いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、Ｃ_２－５アルキレン又は（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑである。いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、Ｃ_２－５アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は各々、プロピレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、Ｃ_２－５アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑである。いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しない。

【0098】

いくつかの実施形態では、ｐ及びｑは、各々独立して、１～３である。いくつかの実施形態では、ｐ及びｑは、各々独立して、１～２である。いくつかの実施形態では、ｐ及びｑは、各々独立して、１である。いくつかの実施形態では、ｐ及びｑは、各々独立して、２である。いくつかの実施形態では、ｐ及びｑは、各々独立して、３である。

【0099】

いくつかの実施形態では、Ｒ^３は、１つ又は２つのメチル基で任意選択的に置換された直鎖Ｃ_２－５アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｒ^３は、直鎖Ｃ_２－５アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｒ^３は、Ｃ_３－５アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｒ^３は、Ｃ_１－３アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｒ^３は、プロピレンである。

【0100】

いくつかの実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｃ_１－６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｃ_１－３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈである。

【0101】

いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｏ又はＳである。いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｏである。いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｓである。

【0102】

いくつかの実施形態では、ｎは、０～２である。いくつかの実施形態では、ｎは、０～１である。いくつかの実施形態では、ｎは、０である。いくつかの実施形態では、ｎは、１である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。

【0103】

いくつかの実施形態では、化合物は、

【化4】

【化5】

、又はその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。

【0104】

いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－１９３である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２００である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２０１である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２０２である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２０９である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２１０である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２３０である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２３１である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡＴＸ－２３２である。

【0105】

いくつかの実施形態では、本発明は、核酸と、本発明の化合物と、を含む、脂質組成物を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、目的の治療用タンパク質をコードするコード領域を含むｍＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、目的の治療用タンパク質は、酵素、及び抗体、抗原、受容体、又はトランスポーターである。いくつかの実施形態では、目的の治療用タンパク質は、遺伝子編集酵素である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集酵素は、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を含む。

【0106】

ＩＶ．脂質製剤及びナノ粒子
脂質系製剤
標的細胞への核酸の細胞内送達に基づく療法は、細胞外バリア及び細胞内バリアの両方に直面する。実際に、裸の核酸材料は、それらの毒性、血清中での低い安定性、急速な腎クリアランス、標的細胞による取り込みの低減、食細胞の取り込み、及び免疫応答を活性化するそれらの能力、それらの臨床開発を妨げる全ての特徴に起因して、簡単に全身投与することができない。外因性核酸材料（例えば、ｍＲＮＡ）がヒト生物系に入るとき、それは、細網内皮系（ＲＥＳ）によって外来病原体として認識され、そして血管系内又は血管系外の標的細胞に遭遇する機会を有する前に血液循環から除去される。血流中の裸の核酸の半減期は、おおよそ数分であることが報告されている（Ｋａｗａｂａｔａ Ｋ，Ｔａｋａｋｕｒａ Ｙ，Ｈａｓｈｉｄａ ＭＰｈａｒｍ Ｒｅｓ．１９９５ Ｊｕｎ；１２（６）：８２５－３０）。化学修飾及び適正な送達方法は、ＲＥＳによる取り込みを低減し、かつ遍在するヌクレアーゼによる分解から核酸を保護することができ、これは核酸ベースの療法の安定性及び有効性を増加させる。加えて、ＲＮＡ又はＤＮＡは、細胞による取り込みについては好ましくない、表面でもアニオン性であるアニオン性親水性ポリマーである。したがって、核酸ベースの療法の成功は、主に、遺伝子材料を標的細胞へと効率的かつ効果的に送達し、かつ最小限の毒性かつインビボで十分なレベルの発現を得ることができるビヒクル又はベクターの開発に依存する。

【0107】

更に、標的細胞への内部移行時に、核酸送達ベクターは、細胞内バリアによって、エンドソームの取り込み、リソソーム分解、ベクターからの核酸の開梱、核膜を横切る移行（ＤＮＡについて）、及び細胞質での放出（ＲＮＡについて）を含む課題を突き付けられる。したがって、順調な核酸ベースの療法は、遺伝子の発現などの十分なレベルの望ましい活性を得るために、ベクターが核酸を細胞内側の標的部位に送達する能力に依存する。

【0108】

いくつかの遺伝子療法は、ウイルス送達ベクター（例えば、ＡＡＶ）を首尾よく利用することができるが、脂質系製剤は、その生体適合性及び大規模な生産の簡単さに起因して、ＲＮＡ及び他の核酸化合物のための最も有望な送達システムの１つとしてますます認識されている。脂質系の核酸療法の最も重要な進歩の１つは、パチシラン（ＡＬＮ－ＴＴＲ０２）が最初のｓｉＲＮＡ治療薬として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び欧州委員会（ＥＣ）から承認された２０１８年８月に生じた。ＡＬＮ－ＴＴＲ０２は、いわゆる安定した核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）トランスフェクション技術に基づくｓｉＲＮＡ製剤である。パチシランの成功にもかかわらず、脂質製剤を介した、ｍＲＮＡを含む核酸治療薬の送達は、依然として開発中である。脂質送達ビヒクルにおけるｍＲＮＡの使用は、ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックの結果として急速に注目されるようになり、ＣＯＶＩＤ－１９のスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するいくつかのワクチンは、強力な保護能力を示す。かかる脂質系のｍＲＮＡワクチンには、Ｐｆｉｚｅｒ及びＢｉｏＮｔｅｃｈのＢＮＴ１６２ｂ２並びにＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡ－１２７３が含まれ、これらは、世界中で緊急使用の認可を受けている。

【0109】

核酸治療薬のための一部の当技術分野で認識されている脂質製剤送達ビヒクルとしては、様々な実施形態による、ポリマー系担体、（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子及びリポソームなど）、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、多小胞リポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成の両方に由来するエクソソーム、天然、合成及び半合成の層状体、ナノ粒子、ミセル、及びエマルションが挙げられる。これらの脂質製剤は、それらの構造及び組成物が異なることが可能であり、また急速に発展する分野で期待することができるため、当該技術分野では、単一のタイプの送達ビヒクルを説明するためにいくつかの異なる用語が使用されている。同時に、脂質製剤の用語は、科学文献全体を通してそれらの意図される意味に関して変化しており、この一貫性のない使用は、脂質製剤のいくつかの用語の正確な意味に関して混乱を引き起こしている。いくつかの潜在的な脂質製剤の中でも、リポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子は、本開示の目的のために詳細に具体的に記載され、かつ本明細書で定義される。

【0110】

リポソーム
従来のリポソームは、少なくとも１つの二重層及び内部水性区画からなる小胞である。リポソームの二重層膜は、典型的に、空間的に分離された親水性ドメイン及び疎水性ドメインを含む合成起源又は天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７－３２１，１９９８）。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ニオソームなど）によっても形成することができる。それらは、一般的に球状小胞として存在し、２０ｎｍ～数ミクロンのサイズの範囲である可能性がある。リポソーム製剤は、コロイド分散体として調製することができ、又は安定性リスクを低減し、かつリポソーム系薬剤の貯蔵寿命を改善するために凍結乾燥することができる。リポソーム組成物を調製する方法は、当技術分野で知られており、当業者の技能範囲内である。

【0111】

１つの二重層のみを有するリポソームは、単層と称され、２つ以上の二重層を有するリポソームは、多層と称される。リポソームの最も一般的なタイプは、小型単層小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、及び多層小胞（ＭＬＶ）である。リポソームとは対照的に、リソソーム、ミセル、及び逆ミセルは、脂質の単層から構成される。一般的に、リポソームは、単一の内部区画を有すると考えられるが、一部の製剤は、いくつかの非同心性脂質二重層によって分離された多数の不連続な内部水性区画からなる、多小胞リポソーム（ＭＶＬ）とすることができる。

【0112】

リポソームは、リポソームが基本的には生体膜の類似体であり、また天然リン脂質及び合成リン脂質の両方から調製することができることを考慮して、その優れた生体適合性のために、リポソームは薬剤送達ビヒクルとして長い間認識されてきた（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；９：１８３３－１８４３）。薬剤送達ビヒクルとしてのそれらの使用では、リポソームは疎水性膜によって囲まれた水溶液コアを有するため、コアに溶解した親水性溶質は、二重層を容易に通過することができず、疎水性化合物は二重層と会合する。したがって、リポソームには、疎水性分子及び／又は親水性分子を搭載することができる。ＲＮＡなどの核酸を担持するためにリポソームが使用される場合、核酸は水相においてリポソーム区画内に含有される。

【0113】

カチオン性リポソーム
リポソームは、カチオン性脂質、アニオン性脂質、及び／又は中性脂質から構成することができる。リポソームの重要なサブクラスとして、カチオン性リポソームは、正に荷電した脂質、すなわちより具体的には、カチオン性基及び親油性部分の両方を含む脂質から全体的又は部分的に作製されるリポソームである。リポソームについて上記で描かれた一般的な特性に加えて、カチオン性リポソームで使用されるカチオン性脂質の正に荷電した部分は、いくつかの利点及びいくつかの固有の構造的特徴を提供する。例えば、カチオン性脂質の親油性部分は疎水性であり、したがって、リポソームの水性内部から離れるようにそれ自体を方向付け、そして他の非極性種及び疎水性種と会合する。反対に、カチオン性部分は、水性媒体と、そしてより重要なことに、カチオン性リポソームの水性内部で複合体化することができる極性分子及び種と会合する。これらの理由から、カチオン性リポソームは、静電相互作用を介して負に荷電した核酸に対するそれらの好ましさにより、遺伝子治療での使用についてますます研究され、生体適合性、低毒性、及びインビボ臨床用途に必要とされる大規模な生産の可能性を提供する複合体をもたらす。カチオン性リポソームでの使用のために好適なカチオン性脂質は、以下にリストされている。

【0114】

脂質ナノ粒子
リポソーム及びカチオン性リポソームとは対照的に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、固相で化合物を封入する脂質の単一の単層又は二重層を含む構造を有する。したがって、リポソームとは異なり、脂質ナノ粒子は、その内部に水相又は他の液相を有しないが、むしろ、二重層シェル又は単層シェルからの脂質は、内部化合物に直接的に複合体化され、それによって固体コア内にそれを封入する。脂質ナノ粒子は典型的に、形状及びサイズの比較的均一な分散を有する球状小胞である。脂質粒子をナノ粒子として認定するサイズに関しては情報源によって異なるが、脂質ナノ粒子が１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の直径を有することができることで、いくらかの重複した一致がみられる。しかしながら、より一般的には、それらは１２０ｎｍよりも小さい、又は１００ｎｍよりも小さいと考えられる。

【0115】

脂質ナノ粒子核酸送達システムについては、脂質シェルは、核酸コアの負に荷電した骨格と複合体化しかつ会合することができるイオン性カチオン性脂質を含むように製剤化することができる。約７未満の見かけのｐＫａ値を有するイオン性カチオン性脂質は、核酸の負に荷電した骨格と複合体化し、それが正に荷電したイオン化脂質のｐＫａ未満のｐＨ値で脂質ナノ粒子に搭載するためのカチオン性脂質を提供する、という利点を有する。次いで、生理的ｐＨ値では、脂質ナノ粒子は、比較的中性の外部を適合することができ、静脈内投与後の粒子の循環半減期の有意な増加を可能にする。核酸送達の文脈において、脂質ナノ粒子は、高い核酸封入効率、強力なトランスフェクション、治療薬を送達するための組織への浸透の改善、及び細胞毒性及び免疫原性の低いレベルを含む、他の脂質系核酸送達システムよりも多くの利点を提供する。

【0116】

核酸用の脂質ナノ粒子送達システムの開発に先立ち、カチオン性脂質が、核酸医薬品の送達のための合成材料として広く研究されてきた。これらの早期の取り組みでは、生理的ｐＨで一緒に混合した後、核酸をカチオン性脂質によって凝縮して、リポプレックスとして知られる脂質－核酸複合体を形成した。しかしながら、リポプレックスは不安定であることが証明され、またサブミクロンスケールから数ミクロンの範囲の幅広いサイズ分布によって特徴解析された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬などのリポプレックスは、インビトロトランスフェクションに対するかなりの有用性を見出した。しかしながら、これらの第一世代リポプレックスがインビボで有用であることは証明されていない。大きな粒子サイズ及び正電荷（カチオン性脂質によって付与される）は、急速な血漿クリアランス、溶血性、及び他の毒性、並びに免疫系活性化をもたらす。

【0117】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、式Ｉの脂質：

【化6】

、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含み、式中、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－であり、ｍが、４～１１であり、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しないか、直鎖Ｃ_１－５アルキレン、若しくは（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑであり、ｐ及びｑが各々独立して、１～３であり、Ｒ^３は、１つ又は２つのメチル基で任意選択的に置換された直鎖Ｃ_２－５アルキレンであり、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＳであり、ｎは、０～２である。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書に列挙される任意の１つ以上の脂質は、明示的に除外される場合がある。

【0119】

いくつかの実施形態では、本開示は、複数のリガンドを含む脂質ナノ粒子を提供し、各リガンドは独立して、本明細書に記載の化合物であり、複数のリガンドは、自己集合して、内部及び外部を含む脂質ナノ粒子を形成する。

【0120】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の平均サイズは、約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の平均サイズは、約１００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の平均粒径は、約４０ｎｍ～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の平均粒径は、約５０ｎｍ～約９０ｎｍである。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の平均粒径は、約５５ｎｍ～約８５ｎｍである。

【0121】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、内部に核酸を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、目的の治療用タンパク質をコードするコード領域を含むｍＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、目的の治療用タンパク質は、酵素、及び抗体、抗原、受容体、又はトランスポーターである。いくつかの実施形態では、目的の治療用タンパク質は、遺伝子編集酵素である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集酵素は、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。

【0122】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、内部にｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、内部にｍＲＮＡを更に含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、以下に記載されるヘルパー脂質を更に含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを更に含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約４５モル％～６５モル％の本発明の化合物、約２モル％～約１５モル％のヘルパー脂質、約２０モル％～約４２モル％のコレステロール、及び約０．５モル％～約３モル％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０モル％～約６１モル％の本発明の化合物、約５モル％～約９モル％のヘルパー脂質、約２９モル％～約３８モル％のコレステロール、及び約１モル％～約２モル％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５６モル％～約５８モル％の本発明の化合物、約６モル％～約８モル％のＤＳＰＣ、約３１モル％～約３４モル％のコレステロール、及び約１．２５モル％～約１．７５モル％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０モル％～６１モル％の本発明の化合物、約２モル％～約１２モル％のＤＳＰＣ、約２５モル％～約４２モル％のコレステロール、及び約０．５モル％～約３モル％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０モル％～約６１モル％の本発明の化合物、約５モル％～約９モル％のＤＳＰＣ、約２９モル％～約３８モル％のコレステロール、及び約１モル％～約２モル％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５６モル％～約５８モル％の本発明の化合物、約６モル％～約８モル％のＤＳＰＣ、約３１モル％～約３４モル％のコレステロール、及び約１．２５モル％～約１．７５モル％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。

【0126】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０：１～約１０：１の総脂質：核酸重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約４０：１～約２０：１の総脂質：核酸重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３５：１～約２５：１の総脂質：核酸重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３２：１～約２８：１の総脂質：核酸重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３１：１～約２９：１の総脂質：核酸重量比を有する。

【0127】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０：１～約１０：１の総脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約４０：１～約２０：１の総脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３５：１～約２５：１の総脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３２：１～約２８：１の総脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３１：１～約２９：１の総脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。

【0128】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子ナノ粒子は、約７．４のｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、約７ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２．０ｍｇ／ｍＬ～約４．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌを更に含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上の凍結保護剤を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の凍結保護剤は、スクロース、グリセロール、又はスクロースとグリセロールとの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースと、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールとの組み合わせを含む。

【0130】

脂質－核酸製剤
核酸又はその薬学的に許容可能な塩は、脂質製剤（すなわち、脂質系送達ビヒクル）に組み込むことができる。

【0131】

本開示の文脈では、脂質系送達ビヒクルは、典型的に、所望の核酸（ｓｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡなど）を標的細胞又は標的組織に輸送するように機能する。脂質系送達ビヒクルは、当技術分野で知られている任意の好適な脂質系送達ビヒクルとすることができる。いくつかの実施形態では、脂質系送達ビヒクルは、リポソーム、カチオン性リポソーム、又は核酸を含有する脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、脂質系送達ビヒクルは、脂質分子及び核酸のナノ粒子又は二重層を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、中性脂質又はポリマーを更に含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、液体媒体を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、製剤は、好ましくは、核酸を更に封入する。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、好ましくは、核酸及び中性脂質又はポリマーを更に含む。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、好ましくは、核酸を封入する。

【0132】

本明細書は、脂質製剤内に封入された１つ以上の治療用核酸分子を含む脂質製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、リポソームを含む。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、カチオン性リポソームを含む。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、脂質ナノ粒子を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、核酸は、脂質製剤の脂質部分内に完全に封入され、これにより脂質製剤中の核酸はヌクレアーゼ分解に対して水溶液中で耐性である。他の実施形態では、本明細書に記載の脂質製剤は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。

【0134】

本開示の脂質製剤はまた、典型的に、約１：１～約１００：１、約１：１～約５０：１、約２：１～約４５：１、約３：１～約４０：１、約５：１～約３８：１、約６：１～約４０：１、約７：１～約３５：１、約８：１～約３０：１、約１０：１～約２５：１、約８：１～約１２：１、約１３：１～約１７：１、約１８：１～約２４：１、又は約２０：１～約３０：１の総脂質：核酸比（質量／質量比）も有する。いくつかの好ましい実施形態では、総脂質：核酸比（質量／質量比）は、約１０：１～約２５：１である。比は、端点を含む、列挙された範囲内の任意の値又はサブ値であってもよい。

【0135】

本開示の脂質製剤は、典型的に、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、又は約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、又は約１５０ｎｍの平均直径を有し、また実質的に非毒性である。直径は、端点を含めて、列挙された範囲内の任意の値又はサブ値であってもよい。加えて、核酸は、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する場合、ヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で耐性である。

【0136】

好ましい実施形態では、脂質製剤は、核酸、カチオン性脂質（例えば、本明細書に記載の１つ以上のカチオン性脂質又はその塩）、リン脂質、及び粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質（例えば、本開示の１つ以上のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び／又は他の脂質コンジュゲート）を含む。脂質製剤はまた、コレステロールも含むことができる。

【0137】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＤＭＧは、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧである。

【0138】

核酸脂質製剤では、核酸は製剤の脂質部分内に完全に封入されてもよく、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。好ましい実施形態では、核酸を含む脂質製剤は、脂質製剤の脂質部分内に完全に封入され、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。ある特定の事例では、脂質製剤中の核酸は、粒子を３７℃で少なくとも２０、３０、４５、又は６０分間ヌクレアーゼに曝露した後、実質的に分解されない。ある特定の他の事例では、脂質製剤中の核酸は、３７℃で少なくとも３０、４５、若しくは６０分間、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間の間、血清中の製剤のインキュベーション後、実質的に分解されない。他の実施形態では、核酸は、製剤の脂質部分と複合体化される。

【0139】

核酸との文脈では、完全な封入は、核酸と会合したときに蛍光が強化された染料を使用する、膜不透過性蛍光染料除外アッセイを実施することによって決定され得る。封入は、脂質製剤に染料を添加し、結果として生じる蛍光を測定し、そして少量の非イオン性洗剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質層の洗剤媒介性破壊は、封入された核酸を放出し、膜不透過性染料と相互作用することを可能にする。核酸封入は、Ｅ＝（Ｉ０－Ｉ）／Ｉ０として計算されてもよく、式中、Ｉ及びＩ０は、洗剤の添加前後の蛍光強度を指す。

【0140】

他の実施形態では、本開示は、複数の核酸－リポソーム、核酸－カチオン性リポソーム、又は核酸－脂質ナノ粒子を含む核酸－脂質組成物を提供する。いくつかの実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数の核酸－リポソームを含む。いくつかの実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数の核酸－カチオン性リポソームを含む。いくつかの実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数の核酸－脂質ナノ粒子を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、脂質製剤は、製剤の脂質部分内に完全に封入された核酸を含み、これにより、粒子の約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、又は少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％（又はその任意の画分若しくはその中の範囲）が、その中に封入された核酸を有する。量は、端点を含めて、列挙された範囲内の任意の値又はサブ値であってもよい。

【0142】

脂質製剤の意図される使用に応じて、構成成分の比率を変化させることができ、また当技術分野で知られているアッセイを使用して、特定の製剤の送達効率を測定することができる。

【0143】

いくつかの実施形態によると、発現可能なポリヌクレオチド、核酸活性剤、及びｍＲＮＡ構築物は、脂質製剤化することができる。脂質製剤は、好ましくは、リポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子から選択されるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、脂質製剤は、カチオン性リポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり、
（ａ）核酸（ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）と、
（ｂ）カチオン性であり得る本開示の脂質と、
（ｃ）任意選択的に、非カチオン性脂質（中性脂質など）と、
（ｄ）任意選択的に、ステロールと、を含む。

【0144】

カチオン性脂質
脂質製剤は、好ましくは、カチオン性リポソーム又は脂質ナノ粒子を形成するために好適なカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に荷電した膜に結合し、かつ取り込みを誘導することができるため、核酸送達について幅広く研究されている。一般的に、カチオン性脂質は、正の親水性頭部基、２つ（又はそれ以上）の親油性尾部、又はステロイド部分、及びこれらの２つのドメイン間のコネクタを含有する両親媒性物質である。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理的ｐＨにおいて正味の正電荷を担持する。カチオン性リポソームは、従来、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、及びｓｉＲＮＡ／小ヘアピンＲＮＡ－ｓｈＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドに最も一般的に使用される非ウイルス送達システムであった。ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－硫酸メチルアンモニウム）などのカチオン性脂質は、静電相互作用によって負に荷電した核酸と複合体又はリポプレックスを形成し、高いインビトロトランスフェクション効率を提供することができる。

【0145】

本開示の脂質製剤において、カチオン性脂質としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジ－９－シス－オクタデセニルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）（Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド及び１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩としても知られる）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－ｙ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、又は３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソル－５－アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、３－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＭＣ３エーテル）、４－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルブタン－１－アミン（ＭＣ４エーテル）、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。他のカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３Ｐ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及び２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＸＴＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、カチオン性脂質の市販調製物、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む）、及びリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む）を使用することができる。

【0146】

他の好適なカチオン性脂質は、国際公開第０９／０８６５５８号、同第０９／１２７０６０号、同第１０／０４８５３６号、同第１０／０５４４０６号、同第１０／０８８５３７号、同第１０／１２９７０９号、及び同第２０１１／１５３４９３号、米国特許公開第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０１２８７６０号、及び同第２０１２／００２７８０３号、米国特許第８，１５８，６０１号、並びにＬｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７（５），１８６４－６９，２０１０に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0147】

他の好適なカチオン性脂質としては、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ－、及びＮ－プロピル－Ｎ－エチルアミノ－）を含む、代替的な脂肪酸基及び他のジアルキルアミノ基を有するものが挙げられる。これらの脂質は、アミノ脂質と呼ばれるカチオン性脂質のサブカテゴリーの一部である。本明細書に記載の脂質製剤のいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、アミノ脂質である。一般に、飽和度が低いアルキル鎖を有するアミノ脂質は、フィルター滅菌の目的で、特に複合体が約０．３ミクロン未満にサイズ設定されなければならない場合に、より簡単にサイズ設定される。Ｃ_１４～Ｃ_２２の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質が使用されてもよい。他の足場を使用して、アミノ基と、アミノ脂質の脂肪酸又は脂肪アルキル部分を分離することもできる。

【0148】

いくつかの実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、イオン化可能であり、また脂質が生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨで正に荷電し、かつ第２のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨ以上の中性であるように、少なくとも１つのプロトン化可能又は脱プロトン化可能な基を有する。当然のことながら、ｐＨの関数としてのプロトンの付加又は除去は平衡プロセスであり、また荷電脂質又は中性脂質への言及は、優勢種の性質を指し、脂質の全てが荷電形態又は中性型で存在する必要はない。２つ以上のプロトン化可能基若しくは脱プロトン化可能基を有するか、又は双性イオン性である脂質は、本開示での使用から除外されない。ある特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質は、約４～約１１の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、イオン性カチオン性脂質は、約５～約７のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、イオン性カチオン性脂質のｐＫａは、約６～約７である。

【0149】

いくつかの実施形態では、脂質製剤は、式Ｉの脂質：

【化7】

、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含み、式中、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨ－、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－２）ＣＨ、（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）_２ＣＨＣＨ_２－、又は（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ）（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ－１）ＣＨＣＨ_２－であり、ｍが、４～１１であり、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、存在しないか、直鎖Ｃ_１－５アルキレン、若しくは（ＣＨ_２）_ｐ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｑであり、ｐ及びｑが各々独立して、１～３であり、Ｒ^３は、１つ又は２つのメチル基で任意選択的に置換された直鎖Ｃ_２－５アルキレンであり、Ｒ^４及びＲ^５は、各々独立して、Ｈ又はＣ_１－６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＳであり、ｎは、０～２である。

【0150】

いくつかの実施形態では、本明細書に列挙される任意の１つ以上の脂質は、明示的に除外される場合がある。

【0151】

ヘルパー脂質及びステロール
本開示のｍＲＮＡ脂質製剤は、ヘルパー脂質を含むことができ、これは、中性脂質、中性ヘルパー脂質、非カチオン性脂質、非カチオン性ヘルパー脂質、アニオン性脂質、アニオン性ヘルパー脂質、又は双性イオン性脂質と称することができる。脂質製剤、特にカチオン性リポソーム及び脂質ナノ粒子は、ヘルパー脂質が製剤中に存在する場合、細胞取り込みが増加していることが見出されている。（Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２０１４；１５（９）：８８２－９２）。例えば、一部の研究は、カチオン性脂質よりも融合性が高い（すなわち、融合を促進する）中性脂質及び双性イオン性脂質、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジ－オレオイル－ホスファチジル－エタノアラミン（ＤＯＰＥ）及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、カチオン性脂質より融合性（すなわち、融合を容易にする）であることを示しており、脂質－核酸複合体の多型の特徴に影響を与える可能性があり、ラメラ相から六方相への移行を促進し、それゆえに細胞膜の融合及び破壊を誘発する。（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１４ Ｊａｎ；９（１）：１０５－２０）。加えて、ヘルパー脂質の使用は、毒性及び免疫原性などの多くの一般的なカチオン性脂質を使用することによるあらゆる潜在的な有害作用を低減するのに役立つ可能性がある。

【0152】

本開示の脂質製剤のために好適な非カチオン性脂質の非限定的な例としては、レシチンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンのリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０－Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルに由来するアシル基である。

【0153】

いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）から選択される。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。

【0154】

非カチオン性脂質の追加的な例としては、コレステロールなどのステロール及びその誘導体が挙げられる。ある研究は、ヘルパー脂質として、コレステロールは、核酸と調和する脂質層の電荷の間隔を増加させ、電荷分布を核酸の電荷分布とより密接に一致させると結論付けた。（Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．２０１２ Ｍａｒ ７；９（６８）：５４８－５６１）。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、５α－コレスタノール、５α－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５α－コレスタノン、及びデカン酸コレステリルなどの非極性類似体、並びにそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。

【0155】

いくつかの実施形態では、脂質製剤中に存在するヘルパー脂質は、１つ以上のリン脂質及びコレステロール又はその誘導体の混合物を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、脂質製剤中に存在するヘルパー脂質は、１つ以上のリン脂質、例えば、コレステロールを含まない脂質製剤を含むか、又はそれからなる。なおも他の実施形態では、脂質製剤中に存在するヘルパー脂質は、コレステロール又はその誘導体、例えば、リン脂質を含まない脂質製剤を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、コレステロールを更に含む。

【0156】

ヘルパー脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン－ラウリル硫酸、アルキル－アリール硫酸ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、及びスフィンゴミエリンなどの脂質を含有する非リン性が挙げられる。

【0157】

いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、脂質製剤中に存在する総脂質の約１モル％～約５０モル％、約５モル％～約４８モル％、約５モル％～約４６モル％、約２５モル％～約４４モル％、約２６モル％～約４２モル％、約２７モル％～約４１モル％、約２８モル％～約４０モル％、又は約２９モル％、約３０モル％、約３１モル％、約３２モル％、約３３モル％、約３４モル％、約３５モル％、約３６モル％、約３７モル％、約３８モル％、若しくは約３９モル％（若しくはその任意の画分若しくはその中の範囲）を構成する。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、約１モル％～約２０モル％、約２モル％～約１２モル％、約５モル％～約９モル％、又は約６モル％～約８モル％を構成する。

【0158】

いくつかの実施形態では、製剤中のヘルパー脂質の合計は、２つ以上のヘルパー脂質を含み、またヘルパー脂質の総量は、脂質製剤中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％、約２２モル％～約４８モル％、約２４モル％～約４６モル％、約２５モル％～約４４モル％、約２６モル％～約４２モル％、約２７モル％～約４１モル％、約２８モル％～約４０モル％、又は約２９モル％、約３０モル％、約３１モル％、約３２モル％、約３３モル％、約３４モル％、約３５モル％、約３６モル％、約３７モル％、約３８モル％、若しくは約３９モル％（若しくはその任意の画分若しくはその中の範囲）を構成する。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣとＤＯＴＡＰの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣとＤＯＴＭＡの組み合わせである。

【0159】

脂質製剤中のコレステロール又はコレステロール誘導体は、脂質製剤中に存在する総脂質の最大約４０モル％、約４５モル％、約５０モル％、約５５モル％、又は約６０モル％を含んでもよい。いくつかの実施形態では、コレステロール又はコレステロール誘導体は、脂質製剤中に存在する総脂質の約１５モル％～約４５モル％、約２０モル％～約４０モル％、約３０モル％～約４０モル％、又は約３５モル％、約３６モル％、約３７モル％、約３８モル％、約３９モル％、若しくは約４０モル％を含む。

【0160】

脂質製剤中に存在するヘルパー脂質の割合は、標的量であり、また製剤中に存在するヘルパー脂質の実際の量は、例えば、±５モル％変化する場合がある。

【0161】

脂質製剤の細胞取り込みのための作用機序
核酸の細胞内送達のための脂質製剤、特にリポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子は、脂質送達ビヒクルの内容物が標的細胞のサイトゾルに送達される標的細胞のエンドサイトーシス機構を利用することによって標的細胞に浸透することによって、細胞取り込みのために設計される。（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２８（３）：１４６－１５７，２０１８）。具体的には、本明細書に記載される核酸脂質製剤の場合、脂質製剤は、受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞に入る。エンドサイトーシスの前に、脂質送達ビヒクルの表面における本開示の脂質コンジュゲートなどの官能化リガンドを表面から脱落させることができ、これは標的細胞への内部移行を誘発する。エンドサイトーシスの間、細胞の原形質膜の一部はベクターを囲み、それを小胞の中へと飲み込み、次いで小胞を挟んで細胞膜から挟み出し、サイトゾルに入り、最終的にエンドリソソーム経路を経る。イオン性カチオン性脂質を含有する送達ビヒクルについては、エンドソームが老化するにつれて酸性度が増加すると、表面上に強い正電荷を有するビヒクルがもたらされる。次いで、送達ビヒクルとエンドソーム膜との間の相互作用は、ペイロードの細胞質性の送達につながる膜融合事象をもたらす。ｍＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡペイロードについては、細胞自身の内部翻訳プロセスが次にＲＮＡをコードされたタンパク質に翻訳する。コードされたタンパク質は、標的の細胞小器官への輸送又は細胞内の位置を含む、翻訳後処理を更に受けることができる。

【0162】

脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質製剤から交換する速度、及び次に脂質製剤が融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の可変要素を使用して、脂質製剤が融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質製剤が融合性になる速度を制御するために使用することができる他の方法は、本開示を読むと当業者には明らかになるであろう。また、脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによっても、リポソーム又は脂質粒子サイズを制御することができる。

【0163】

脂質製剤製造
核酸を含む脂質製剤の調製のためには、多くの異なる方法がある。（Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．２０１４，１５，８８２－８９２；Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ２０１４，１７７，８－１８；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｔｕｄ．Ｒｅｓ．２０１２，３，１４－２０）。薄膜水和、二重エマルション、逆相蒸発、マイクロ流体調製、二重非対称遠心分離、エタノール注入、洗剤透析、エタノール希釈による自発的な小胞形成、及び予め形成されたリポソームへの封入の技法を、本明細書において簡潔に説明する。

【0164】

薄膜水和
薄膜水和法（ＴＦＨ）又はバンガム法では、脂質は有機溶媒中に溶解され、次いでロータリーエバポレータの使用を通して蒸発して、薄い脂質層の形成をもたらす。搭載される化合物を含有する水性緩衝溶液による層水和の後、多層小胞（ＭＬＶ）が形成され、これは、膜を通して押出成形することによって、又は開始ＭＬＶの超音波処理によって、サイズを減少させて、小型単層小胞（ＬＵＶ）又は大型単層小胞（ＳＵＶ）を生成することができる。

【0165】

二重エマルション
脂質製剤はまた、水／有機溶媒混合物中の脂質溶解を伴う二重エマルション技法を通しても調製することができる。水滴を含有する有機溶液を過剰な水媒体と混合し、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルション形成をもたらす。機械的に激しく振とうした後、水滴の一部が崩壊し、大型単層小胞（ＬＵＶ）が得られる。

【0166】

逆相蒸発
逆相蒸発（ＲＥＶ）法はまた、核酸を搭載したＬＵＶを達成することもできる。この技法では、有機溶媒及び水性緩衝液中のリン脂質溶解によって二相系が形成される。次いで、得られた懸濁液を、混合物が透明な一相分散液になるまで短時間超音波処理する。脂質製剤は、減圧下での有機溶媒蒸発後に達成される。この技法は、核酸を含む異なる大きい親水性分子及び小さい親水性分子を封入するために使用される。

【0167】

マイクロ流体調製
マイクロ流体法は、他のバルク技法とは異なり、脂質水和プロセスを制御する可能性を与える。方法は、流れが操作される方法に従って、連続流マイクロ流体及び液滴ベースのマイクロ流体に分類することができる。連続流モードで動作するマイクロ流体力学的集束（ＭＨＦ）法では、脂質はイソプロピルアルコール中に溶解され、イソプロピルアルコールは、２つの水性緩衝液流の間のマイクロチャネルクロスジャンクション中で流体力学的に集束される。小胞サイズは、流量を調節することによって制御することができ、したがって脂質溶液／緩衝液希釈プロセスを制御することができる。方法は、３つの入口ポート及び１つの出口ポートからなるマイクロ流体装置を使用することによって、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）脂質製剤を生成するために使用することができる。

【0168】

二重非対称遠心分離
二重非対称遠心分離（ＤＡＣ）は、それ自体の垂直軸の周りの追加の回転を使用するため、より一般的な遠心分離とは異なる。効率的な均質化は、作成された２つのオーバーレイ移動によって達成される。すなわち、試料は、通常の遠心分離器のように外向きに押され、その後、追加の回転によってバイアルの中心に向かって押される。脂質とＮａＣｌ溶液を混合することによって、粘稠な小胞リン脂質ゲル（ＶＰＣ）が達成され、次いで、これを希釈して脂質製剤分散液を得る。脂質製剤サイズは、ＤＡＣスピード、脂質濃度、及び均質化時間を最適化することによって調節することができる。

【0169】

エタノール注入
エタノール注入（ＥＩ）法は、核酸封入のために使用することができる。この方法は、脂質が溶解されたエタノール溶液の、針の使用を通して封入される核酸を含有する水媒体の中への迅速な注入を提供する。リン脂質が媒体全体を通して分散されると、小胞が自発的に形成される。

【0170】

洗剤透析
洗剤透析法を使用して、核酸を封入することができる。簡潔に述べると、脂質及びプラスミドは、適切なイオン強度の洗剤溶液中で可溶化され、透析によって洗剤を除去した後、安定化された脂質製剤が形成される。次いで、封入されていない核酸をイオン交換クロマトグラフィーによって除去し、小胞をスクロース密度勾配遠心分離によって空にする。この技法は、カチオン性脂質含有量及び透析緩衝液の塩濃度に非常に敏感であり、この方法の規模拡大もまた困難である。

【0171】

エタノール希釈による自発的な小胞形成
安定した脂質製剤はまた、エタノール希釈による自発的な小胞形成法を介して生成することができ、この方法において、段階的又は滴加的なエタノール希釈は、核酸を含有する急速に混合する水性緩衝液へのエタノール中に溶解した脂質の制御された添加によって、核酸を搭載した小胞の自発的な形成を提供する。

【0172】

Ｖ．医薬組成物及び送達方法
インビボでの核酸活性（例えば、ｍＲＮＡ発現、又はＡＳＯ若しくはｓｉＲＮＡによるノックダウン）を促進するために、本明細書に記載の脂質製剤の送達ビヒクルは、１つ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンド、若しくは安定化試薬と組み合わされ得るか、又はそれが好適な賦形剤と混合される薬理学的組成物中にあり得る。薬剤の製剤化及び投与の技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ、最新版）に見出され得る。

【0173】

本開示の脂質製剤及び医薬組成物は、対象の臨床状態、投与部位及び投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、並びに当業者に関連する他の要因を考慮して、現在の医療行為に従って投与及び投薬されてもよい。本明細書の目的のための「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、及び医療技術の当業者に既知であるような関連する考慮事項によって決定され得る。いくつかの実施形態では、投与される量は、当業者によって疾患進行、退行、又は改善の適切な尺度として選択される症状及び他の指標の少なくともいくらかの安定化、改善、又は除去を達成するために有効である。例えば、適切な量及び投与レジメンは、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）の産生を引き起こすものである。

【0174】

本明細書に記載の医薬組成物は、吸入可能な組成物とすることができる。好適な投与経路としては、例えば、気管内、吸入、又は鼻腔内が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与は、肺上皮細胞への核酸の送達をもたらす。いくつかの実施形態では、投与は、他のタイプの肺細胞及び気道の細胞よりも肺上皮細胞に対する選択性を示す。

【0175】

本明細書に開示される医薬組成物は、１つ以上の賦形剤を使用して、（１）安定性を増加させる、（２）細胞トランスフェクションを増加させる、（３）徐放性又は遅延放出（例えば、核酸のデポ製剤から）を許容する、（４）生体内分布を変更する（例えば、核酸を特定の組織又は細胞型に標的化する）、（５）インビボで、それらから発現される核酸又はタンパク質の活性を増加させる、及び／又は（６）インビボで、核酸又はコードされたタンパク質の放出プロファイルを変化させるように製剤化することができる。

【0176】

好ましくは、脂質製剤は、全身的ではなく局所的な様態で投与されてもよい。局所送達は、標的とされる組織に応じて、様々な方法で影響を与えることができる。例えば、本開示の組成物を含有するエアロゾルは、（鼻、気管、又は気管支送達のために）吸入することができる。

【0177】

医薬組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示の脂質製剤又は組成物によって送達される核酸は、脂質製剤及び／又は組成物が投与された組織において活性である。いくつかの実施形態では、核酸は、脂質製剤及び／又は組成物が投与された組織とは異なる組織で活性である。核酸が送達され得る組織の例としては、肺、気管、及び／又は鼻腔、筋肉、肝臓、眼、又は中枢神経系が挙げられるが、これらに限定されない。

【0178】

本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の技術分野で既知又は今後開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般に、こうした調製方法は、活性成分（すなわち、核酸）を賦形剤及び／又は１つ以上の他の副成分と会合させる工程を含む。本開示による医薬組成物は、単回単位用量として、及び／又は複数の単回単位用量として、バルクで調製、包装、及び／又は販売されてもよい。

【0179】

医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を追加的に含んでもよく、これは、本明細書で使用される場合、望ましい特定の剤形に適したありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散剤又は懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0180】

ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又はその他の液体ビヒクル、分散剤若しくは懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤などの従来の賦形剤に加えて、本開示の賦形剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、一次ＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた細胞、又はｍＲＮＡ（例えば、対象への移植のための）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体及びそれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0181】

したがって、本明細書に記載の製剤は、各々が脂質製剤中の核酸の安定性を一緒に増加させる量、核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）による細胞トランスフェクションを増加させる量、コードされたタンパク質の発現を増加させる量、及び／又はコードされたタンパク質の放出プロファイルを変更する量、又は標的天然核酸のノックダウンを増加させる量で、１つ以上の賦形剤を含むことができる。更に、核酸は、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して製剤化されてもよい。

【0182】

医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤、及び組成物を調製するための技法は、当該技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６を参照のこと、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の実施形態の範囲内で企図され得るが、任意の従来の賦形剤媒体が、何らかの望ましくない生物学的効果を生じさせること、又は別の方法で医薬組成物の任意の他の成分と有害な様態で相互作用することなどによって、物質又はその誘導体と不適合であり得る場合を除く。

【0183】

本開示の組成物の剤形は、投与前に液体中で再構成することができる、固体とすることができる。固体は、粉末として投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥された核酸脂質製剤を含む。

【0184】

好ましい実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物の剤形は、本明細書に記載の核酸脂質ナノ粒子の液体懸濁液とすることができる。いくつかの実施形態では、液体懸濁液は、緩衝溶液中にある。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、及びＴＲＩＳからなる群から選択される緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７．４のｐＨを有する。いくつかの好ましい実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳである。いくつかの更なる実施形態では、緩衝溶液は、凍結保護剤を更に含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、糖及びグリセロール、又は糖及びグリセロールの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、糖は二量体糖である。いくつかの実施形態では、糖はスクロースである。いくつかの好ましい実施形態では、緩衝液は、７．４のｐＨでＨＥＰＥＳ、スクロース、及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、保存中は凍結され、そして投与前に解凍される。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約－７０℃未満の温度で凍結される。いくつかの実施形態では、懸濁液は、吸入可能な投与の前に滅菌水で希釈される。いくつかの実施形態では、吸入可能な投与は、懸濁液を約１体積～約４体積の滅菌水で希釈することを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された核酸－脂質ナノ粒子製剤は、本明細書に記載される緩衝液中で再懸濁することができる。

【0185】

本開示の組成物及び方法は、鼻腔内及び／又は肺内を含む様々な粘膜投与モードによって対象に投与されてもよい。本開示の一部の態様では、粘膜組織層は上皮細胞層を含む。上皮細胞は、肺、気管、気管支、肺胞、鼻腔、及び／又は口腔とすることができる。本開示の組成物は、機械的スプレー装置などの従来のアクチュエータ、並びに加圧、電気的に作動する、又は他のタイプのアクチュエータを使用して投与することができる。

【0186】

本開示の組成物は、鼻腔スプレー又は肺スプレーとして水溶液中で投与されてもよく、当業者に既知の様々な方法によってスプレー形態で分注されてもよい。本開示の組成物の肺送達は、例えば、エアロゾル化、霧化、又は噴霧化することができる、液滴、粒子、又はスプレーの形態で組成物を投与することによって達成される。組成物、スプレー、又はエアロゾルの粒子は、液体又は固体形態のいずれか、例えば、凍結乾燥された脂質製剤とすることができる。鼻腔スプレーとして液体を分注するための好ましいシステムは、米国特許第４，５１１，０６９号に開示されている。こうした製剤は、本開示による組成物を水中に溶解して水溶液を生成し、当該溶液を滅菌することによって好都合に調製され得る。製剤は、多剤容器内、例えば、米国特許第４，５１１，０６９号に開示されている密閉された分注システム内で示され得る。他の好適な鼻腔スプレー送達システムは、ＴＲＡＮＳＤＥＲＭＡＬ ＳＹＳＴＥＭＩＣ ＭＥＤＩＣＡＴＩＯＮ，Ｙ．Ｗ．Ｃｈｉｅｎ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５及び米国特許第４，７７８，８１０号に記載されている。追加のエアロゾル送達形態は、例えば、圧縮空気式、ジェット式、超音波式、及び圧電式のネブライザーを含んでもよく、これは、核酸脂質製剤を送達するか、又は薬学的溶媒、例えば、水、エタノール、又はそれらの混合物中に懸濁される。

【0187】

本開示の鼻腔及び肺スプレー溶液は、典型的に、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート－８０）などの表面活性剤、及び１つ以上の緩衝液で任意選択的に製剤化された核酸を含むが、ただし、界面活性剤の含有は脂質製剤の構造を破壊しないことを条件とする。本開示のいくつかの実施形態では、鼻腔スプレー溶液は、噴射剤を更に含む。鼻腔スプレー溶液のｐＨは、ｐＨ６．８～７．２であってもよい。用いられる医薬溶媒はまた、ｐＨ４～６のわずかに酸性の水性緩衝液とすることもできる。保存剤、界面活性剤、分散剤、又はガスを含む他の成分を添加して、化学的安定性を強化又は維持してもよい。

【0188】

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の組成物を含有する溶液と、肺、粘膜、又は鼻腔内スプレー又はエアロゾル用のアクチュエータと、を含む、医薬品を提供する。

【0189】

本開示の組成物の剤形は、液体、液滴若しくはエマルションの形態、又はエアロゾルの形態とすることができる。

【0190】

本開示の組成物の剤形は、投与前に液体中で再構成することができる、固体とすることができる。固体は、粉末として投与することができる。固体は、カプセル、錠剤、又はゲルの形態とすることができる。

【0191】

本開示内の肺送達のための組成物を製剤化するために、核酸脂質製剤は、様々な薬学的に許容可能な添加剤、並びに核酸脂質製剤の分散のための塩基又は担体と組み合わせることができる。添加剤の例としては、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、及びそれらの混合物などのｐＨ調整剤が挙げられる。他の添加剤としては、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）、溶解性促進剤（例えば、シクロデキストリン及びその誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、及び還元剤（例えば、グルタチオン）が挙げられる。粘膜送達のための組成物が液体である場合、１として取られる０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩水溶液の張性を参照して測定される製剤の張性は、典型的に、投与部位で粘膜に実質的に不可逆的な組織損傷を誘発しない値に調整される。一般的に、溶液の張性は、１／３～３、より典型的には１／２～２、ほとんどの場合は３／４～１．７の値に調整される。

【0192】

核酸脂質製剤は、核酸脂質製剤及び任意の所望の添加剤を分散する能力を有する親水性化合物を含む場合がある、塩基又はビヒクル中に分散されてもよい。塩基は、幅広い範囲の好適な担体から選択されてもよく、ポリカルボン酸又はその塩のコポリマー、他のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸など）とのカルボン酸無水物（例えば、無水マレイン酸）、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの親水性ビニルポリマー、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、及びキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸及びそれらの非毒性金属塩などの天然ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。生分解性ポリマーは、しばしば、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸－グリコール酸）コポリマー、及びそれらの混合物などの塩基又は担体として選択される。別の方法として又は追加的に、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステルなどの合成脂肪酸エステルを担体として用いることができる。親水性ポリマー及び他の担体は、単独で又は組み合わせて使用することができ、構造的完全性の向上は、部分結晶化、イオン結合、架橋などによって担体に付与することができる。担体は、鼻粘膜に直接適用するための流体又は粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、マイクロスフェア、及びフィルムを含む、様々な形態で提供することができる。この文脈における選択された担体の使用は、核酸脂質製剤の吸収の促進をもたらす場合がある。

【0193】

あるいは、本開示の組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、並びに湿潤剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、及びそれらの混合物などの生理学的条件に近似させるために必要とされる薬学的に許容可能な担体物質を含有してもよい。固体組成物については、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む、従来の非毒性の薬学的に許容可能な担体を使用することができる。

【0194】

本開示のある特定の実施形態では、核酸脂質製剤は、時間放出製剤、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物で投与されてもよい。核酸脂質製剤は、急速放出から保護する担体、例えばポリマー、マイクロカプセル化送達システム、又は生体接着ゲルなどの制御放出ビヒクルを用いて調製することができる。本開示の様々な組成物における核酸脂質製剤の長期間送達は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムハイドロゲル及びゼラチンなどの吸収を遅延させる組成物剤中に含むことによってもたらすことができる。

【0195】

核酸は、核酸組成物の液体懸濁液の気管内投与、及び液体ネブライザーによって生成されるエアロゾルミストの吸入、又は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８０，０１４号に記載されるものなどの乾燥粉末設備の使用によって、肺に送達され得る。

【0196】

ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、対象への投与前又は投与時にエアロゾル化されるか、又は別の方法で微粒子液体若しくは固体として送達されてもよいように製剤化されてもよい。こうした組成物は、こうした固体又は液体微粒子組成物（例えば、エアロゾル化した水溶液又は懸濁液など）を投与して、対象によって簡単に呼吸可能又は吸入可能な粒子を発生させるための１つ以上の好適な装置の助けを借りて投与されてもよい。いくつかの実施形態では、こうした装置（例えば、定量吸入器、ジェット式ネブライザー、超音波式ネブライザー、乾燥粉末吸入器、噴射剤ベースの吸入器、又は気腹装置）は、対象への所定の質量、体積、又は用量（例えば、用量当たり約０．０１０～約０．５ｍｇ／ｋｇの核酸）の組成物の投与を容易にする。例えば、ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、組成物及び好適な噴射剤を含む懸濁液又は溶液を含有する定量吸入器を使用して対象に投与される。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、吸入のために意図された微粒子粉末（例えば、呼吸に適した乾燥粒子）として製剤化されてもよい。ある特定の実施形態では、呼吸に適した粒子として製剤化された本開示の組成物は、対象によって呼吸に適する場合があるか、又は好適な装置を使用して送達されてもよいように、適切にサイズ決めされる（例えば、約５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、７５μｍ、５０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１５μｍ、１２．５μｍ、１０μｍ、５μｍ、２．５μｍ又はそれ未満の平均Ｄ５０又はＤ９０粒子サイズ）。更に他の実施形態では、本開示の組成物は、１つ以上の肺界面活性剤（例えば、層状体）を含むように製剤化される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．０１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９５ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも１００ｍｇの濃度が単回投与で投与されるように、対象に投与される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも０．１ｍｇ、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも１．０ｍｇ、少なくとも２．０ｍｇ、少なくとも３．０ｍｇ、少なくとも４．０ｍｇ、少なくとも５．０ｍｇ、少なくとも６．０ｍｇ、少なくとも７．０ｍｇ、少なくとも８．０ｍｇ、少なくとも９．０ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも５５ｍｇ、少なくとも６０ｍｇ、少なくとも６５ｍｇ、少なくとも７０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、少なくとも８０ｍｇ、少なくとも８５ｍｇ、少なくとも９０ｍｇ、少なくとも９５ｍｇ又は少なくとも１００ｍｇの総量の核酸が一回以上の用量で投与されるように、対象に投与される。

【0197】

いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、月に１回対象に投与される。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、月に２回対象に投与される。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、月に３回対象に投与される。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、月に４回対象に投与される。

【0198】

本開示によれば、提供される組成物の治療的に有効な用量は、定期的に投与される場合、治療前のベースライン活性レベルと比較して、対象における核酸活性レベルの増加をもたらす。典型的に、活性レベルは、血液、血漿若しくは血清、尿、又は固形組織抽出物などの対象から得られた生体試料中で測定される。ベースラインレベルは、治療直前に測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物を投与することにより、生体試料（例えば、血漿／血清又は肺上皮スワブ）中の核酸活性レベルは、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％増加する結果をもたらす。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、生体試料（例えば、血漿／血清又は肺上皮スワブ）の核酸活性レベルは、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、又は少なくとも約１５日間、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％増加する結果をもたらす。

【0199】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物又は本明細書に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0200】

いくつかの実施形態では、本開示は、核酸の送達を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、治療有効量の核酸を、本明細書に記載の脂質ナノ粒子に封入することと、脂質ナノ粒子を対象に投与することと、を含む。

【0201】

いくつかの実施形態では、本開示は、ｍＲＮＡの送達を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、治療有効量のｍＲＮＡを、本明細書に記載の脂質ナノ粒子に封入することと、脂質ナノ粒子を対象に投与することと、を含む。

【0202】

ＶＩ．治療方法
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、治療有効量の、本明細書に記載の化合物、本明細書に記載の脂質ナノ粒子、又は本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、化合物又は脂質ナノ粒子は、静脈内又は筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、化合物又は脂質ナノ粒子は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、化合物又は脂質ナノ粒子は、筋肉内投与される。

【0203】

いくつかの実施形態では、それを必要とする対象において疾患を治療する方法が提供され、方法は、本明細書に記載される脂質組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、静脈内又は筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、筋肉内投与される。

【0204】

いくつかの実施形態では、哺乳動物対象における疾患又は障害を治療する方法が提供される。本明細書に開示される脂質、特にカチオン性脂質、核酸、両親媒性物質、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ結合コレステロールを含む組成物の治療有効量が、組成物によって低減され得る、減少し得る、下方制御され得る、又はサイレンシングされ得る遺伝子の発現又は過剰発現に関連する疾患又は障害を有する対象に投与され得る。本明細書に記載の組成物は、がん又は炎症性疾患を治療するための方法で使用され得る。疾患は、中枢神経系障害、末梢神経系障害、筋萎縮、筋ジストロフィー、免疫障害、がん、腎疾患、線維性疾患、遺伝的異常、炎症、及び心血管障害からなる群から選択されるものであり得る。

【0205】

いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞においてタンパク質又はポリペプチドを発現する方法を提供し、方法は、標的細胞を、本明細書に記載の脂質ナノ粒子、又は本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質又はポリペプチドは、抗原であり、抗原の発現は、インビボ免疫原性応答を提供する。

【実施例】

【0206】

ＶＩＩ．実施例
実施例１．ＡＴＸ－１９３の合成

【化8】

一般スキーム：

【化9】

【0207】

ＡＴＸ－１９３－１の合成

【化10】

【0208】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、１，３シクロヘキサンジオン（２０ｇ、１．００当量）及びジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）を入れた。アクリル酸エチル（２１．４５ｇ、１．２０当量）及びＣｓ_２ＣＯ_３（３５．００ｇ、０．６０当量）を添加し、得られた溶液を８０℃で１６時間撹拌した。次いで、６００ｍＬの水／氷を添加することによって、反応をクエンチした。溶液のｐＨ値を、ＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）で６に調整した。得られた溶液を２×１Ｌの酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。合わせた有機層を２×１Ｌのブラインで洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。これにより、２９ｇ（７８％）の３－（２，６－ジオキソシクロヘキシル）プロパン酸エチルを黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ １．０１分、ｍ／ｚ（計算値）２１２．１０、（実測値）２１３．１０（Ｍ＋Ｈ）。

【0209】

ＡＴＸ－１９３－２の合成

【化11】

【0210】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、３－（２，６－ジオキソシクロヘキシル）プロパン酸エチル（２９ｇ、１．００当量）及びＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ、３００ｍＬの水溶液）を入れた。得られた溶液を、９５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物を真空下で濃縮した。残渣を１ＬのＥｔＯＡｃ中に溶解した。未溶解固体を濾過して除去した。得られたＥＡ相を真空下で濃縮乾固した。これにより、２３ｇ（粗製）の５－オキソノナン二酸を黄色固体として得た。

【0211】

ＡＴＸ－１９３－３の合成

【化12】

【0212】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、５－オキソノナン二酸（２３ｇ、１．００当量）及びＤＣＭ（３４５ｍＬ）を室温で入れた。これに続いて、ペンタデカン－８－オール（６２ｇ、２．２当量）及びＤＭＡＰ（１３ｇ、１．００当量）を室温で添加し、次いで、ＥＤＣＩ（５２ｇ、２．２０当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、７５ｍＬのＨＣｌ水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を２×１ＬのＤＣＭで抽出し、有機層を合わせた。有機層を２×１Ｌのブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で約５００ｍＬまで濃縮した。これに、１００ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）を添加し、混合物を真空下で濃縮した。このシリカゲルをシリカゲルカラム（１Ｋｇ、タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）上に適用し、生成物をＰＥ／ＥＡ、１／０～８０／１の勾配で溶出した。画分を収集し、生成物画分を真空下で濃縮した。これにより、２６ｇ（３８％）の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－オキソノナンジオエートを黄色油として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ２．９９分、ｍ／ｚ（計算値）６２３．０２、（実測値）６４５．３５（Ｍ＋Ｎａ）。

【0213】

ＡＴＸ－１９３－４の合成

【化13】

【0214】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－オキソノナンジオエート（１８ｇ、１．００当量）及びＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（１０：１、１８０ｍＬ）を添加した。これに続いて、ＮａＢＨ_４（１．０８ｇ、１．００当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で４時間撹拌した。次いで、２００ｍＬの水／氷を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を３×３００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。有機層を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。これにより、１７．３ｇ（９５％）の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－ヒドロキシノナンジオエートを淡黄色油として得た。

【0215】

ＡＴＸ－１９３－６の合成

【化14】

【0216】

１Ｌの四つ口丸型ボトルフラスコに、Ｎ_２下で機械的に撹拌しながら、ＴＨＦ（１８０ｍＬ）中の４８６ｍＬのブロモ（ヘプチル）マグネシウム（１ｍｏｌ／Ｌ）を２５℃で充填した。ギ酸エチル（１８．００ｇ、１．００当量）を、０℃において３０分で撹拌しながら滴下して充填する。得られた溶液を室温で１５時間撹拌した。次いで、５００ｍＬの飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を添加することによって、反応をクエンチした。相を分離し、水層を２×５００ｍＬの酢酸エチルで抽出した。次いで、合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。固体残渣は、６０ｍＬのＣＨ_３ＣＮ中のスラリーであった。固体を濾過によって収集し、真空乾燥させた。これにより、５０ｇ（７８％）のペンタデカン－８－オールを白色粉末として得た。これを、次の反応工程でそのまま使用した。

【0217】

ＡＴＸ－１９３の合成

【化15】

【0218】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（１８０ｍＬ）中の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－ヒドロキシノナンジオエート（１７．３ｇ、１．００当量）の溶液を室温で入れた。４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（５．５８ｇ、１．２０当量）及びＤＭＡＰ（０．６９ｇ、０．２０当量）を室温で添加し、続いて、ＥＤＣＩ（６．３９ｇ、１．２０当量）を０℃で少量ずつ添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、３００ｍＬのＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を２×５００ｍＬのＤＣＭで抽出し、有機層を合わせた。有機層を２×５００ｍＬのブラインで洗浄した。得られた有機層を真空下で濃縮し、得られた４０ｇの粗生成物を８０ｇのシリカゲルに吸着させた。残渣を、ＤＣＭ／ＭＥ、１００：０～９０：１０の勾配を用いたシリカゲルカラム（８００ｇ、タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）で精製した。画分を含有する生成物を真空下で濃縮した。次いで、生成物をヘプタン（３００ｍＬ、２０Ｖ）中に溶解し、次いで、有機層をＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（３：１）３００ｍＬ（２０Ｖ）で洗浄した。ヘプタン相を真空下で濃縮した。これにより、１０．５ｇ（４９％）の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－［［４－（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ］ノナンジオエートを無色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ２．７６分、ｍ／ｚ（計算値）７３７．６、（実測値）７３８．５（Ｍ＋Ｈ）；Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，ｐｐｍ）：δ ４．８８１（ｈ，３Ｈ），２．３３２（ｄｔ，８Ｈ），２．２４１（ｓ，６Ｈ），１．８１２（ｍ，２Ｈ），１．７１０－１．４１３（ｍ，１６Ｈ），１．２８２（ｓ，４０Ｈ），０．９５２－０．８４４（ｍ，１２Ｈ）．

【0219】

実施例２．ＡＴＸ－２００の合成

【化16】

一般スキーム：

【化17】

【0220】

ＡＴＸ－２００－４の合成

【化18】

【0221】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した５００ｍＬの四つ口丸底フラスコに、臭化メチルトリフェニルホスファニウム（４５４０．３１ｍｇ、１２．４５６ｍｍｏｌ、１．６０当量、９８％）、ＴＨＦ（１５０．００ｍＬ、９９％）を入れた。これに続いて、ｔ－ＢｕＯＫ（１３２３．５４ｍｇ、１１．６７７ｍｍｏｌ、１．５０当量、９９％）を０℃において１０分で、いくつかのバッチで添加した。これに、ＴＨＦ（２５ｍｌ）中の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－オキソノナンジオエート（５．００ｇ、７．７８５ｍｍｏｌ、１．００当量、９７％）を０℃において２０分で添加した。得られた溶液を２５℃で１８時間撹拌した。得られた混合物を濃縮した。残渣を、酢酸エチル／石油エーテル（１：５０）とともにシリカゲルカラム上に適用した。これにより、３．７ｇ（７５．００％）の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－メチリデンノナンジオエートを無色油として得た。

【0222】

ＡＴＸ－２００－５の合成

【化19】

【0223】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１００ｍＬの四つ口丸底フラスコに、１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－メチリデンノナンジオエート（３．７ｇ、５．７７９ｍｍｏｌ、１．００当量、９７％）、ＴＨＦ（３．７０ｍＬ）を入れた。これに続いて、９－ＢＢＮ（１４．９０ｍＬ、ＮａＮｍｍｏｌ、１．２５当量）を１８℃において２０分で、撹拌しながら滴下した。混合物を１８℃で１８時間撹拌した後、水（１ｍＬ）及び３Ｎ ＮａＯＨ（５ｍＬ）を連続的に添加した。次いで、温度を５０℃未満に維持しながら、３０％Ｈ_２Ｏ_２（１０ｍＬ）を滴下した。室温で１８時間撹拌した後、得られた溶液を２×５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。得られた混合物を３×５０ｍＬのブラインで洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。残渣を、酢酸エチル／石油エーテル（１：２０）とともにシリカゲルカラム上に適用した。これにより、２．６ｇ（６８．２９％）の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－（ヒドロキシメチル）ノナンジオエートを白色油として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ３．１９分、ｍ／ｚ（計算値）６３８．５、（実測値）６６１．５（Ｍ＋Ｎａ）。

【0224】

ＡＴＸ－２００の合成

【化20】

【0225】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１００ｍＬの四つ口丸底フラスコに、１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－（ヒドロキシメチル）ノナンジオエート（２．６０ｇ、３．９４６ｍｍｏｌ、１．００当量、９７％）、ＴＨＦ（１５．００ｍＬ）を入れた。これに続いて、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（６３３．８８ｍｇ、４．７３６ｍｍｏｌ、１．２０当量、９８％）を０℃において１０分で、いくつかのバッチで添加した。これに、ＥＤＣＩ（９２６．３７ｍｇ、４．７３６ｍｍｏｌ、１．２０当量、９８％）を０℃において１０分で、いくつかのバッチで添加した。混合物に、ＤＭＡＰ（９８．３９ｍｇ、０．７８９ｍｍｏｌ、０．２０当量、９８％）を０℃において１０分で、いくつかのバッチで添加した。得られた溶液を１８℃で１８時間撹拌した。得られた混合物を濃縮した。残渣を、エチルＤＣＭ：ＭｅＯＨ（３０：１）とともにシリカゲルカラム上に適用した。粗生成物を、以下の条件を有するＦｌａｓｈ－Ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ（ＩｎｔｅｌＦｌａｓｈ－１）によって精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、３０以内に２－プロパノール：Ｈ_２Ｏ＝６０：４０から、２－プロパノール：Ｈ_２Ｏ＝８０：２０に増加、検出器、蒸発光。生成物を得た。次いで、生成物をヘプタン（３０ｍＬ、２０Ｖ）中に溶解し、次いで、有機層をＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（３：１）（２０Ｖ）で洗浄した。ヘプタン相を真空下で濃縮した。これにより、１．５ｇ（５０．０２％）の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－（［［４－（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ］メチル）ノナンジオエートを淡黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ３．１９分、ｍ／ｚ（計算値）７５１．６７、（実測値）７５２．５０（Ｍ＋Ｈ）；Ｈ－ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，ｐｐｍ）：４．８４７－４．９０９（ｍ，２Ｈ），４．００１－４．０１５（ｍ，２Ｈ），２．２４１－２．３８０（ｍ，１４Ｈ），１．３９２－１．８４５（ｍ，６９Ｈ）．

【0226】

実施例３．ＡＴＸ－２０１の合成

【化21】

一般スキーム：

【化22】

【0227】

ＡＴＸ－２０１－１の合成

【化23】

【0228】

三つ口丸底フラスコに、ＥｔＯＨ（２５ｍＬ、５Ｖ）及びＡＴＸ－２０１－ＳＭ（５ｇ、１当量）を室温で添加し、撹拌した。６Ｎ ＮａＯＨ（２５ｍＬ、５Ｖ）を０℃で混合物にゆっくり添加した。得られた溶液を６０℃で２時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０１－ＳＭの完全な消費を示した。ブライン（１０重量％、５０ｍＬ、１０Ｖ）及びＤＣＭ（５０ｍＬ、１０Ｖ）を混合物に添加し、１０分間撹拌し、相を切断し、水相を収集し、ｐＨを３Ｎ ＨＣｌで３～４に調整した。混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ、２０Ｖ）で抽出した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。濃縮し、真空下で乾燥させて、ＡＴＸ－２０５－１（３．２ｇ、収率８４．６％）を淡黄色固体として得た。

【0229】

ＡＴＸ－２０１－２の合成

【化24】

【0230】

三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（１００ｍＬ、１０Ｖ）、ＡＴＸ－２０１－１（３．２ｇ、１当量）、及びエタン－１，２－ジチオール（２．１ｇ、１．２当量）を室温で添加した。ＢＦ_３ ^．Ｅｔ_２Ｏ（２．５当量）を０℃で混合物にゆっくり添加した。得られた溶液を２０℃で１６時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０１－１の完全な消費を示した。固体を濾過によって収集した。固体を真空下で乾燥させて、ＡＴＸ－２０１－２（４ｇ、収率８８％）を淡黄色固体として得た。これを、次の反応でそのまま使用した。

【0231】

ＡＴＸ－２０１－３の合成

【化25】

【0232】

三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（８０ｍＬ、２０Ｖ）、ＡＴＸ－２０１－２（４ｇ、１．０当量）、ＡＴＸ－１９３－６（８ｇ、２．２当量）、及びＤＭＡＰ（２ｇ、１当量）を連続的に添加した。ＥＤＣＩ（６．７ｇ、２．２当量）を、０℃で少量ずつ反応混合物に添加した。得られた溶液を２０℃で１６時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０１－２の完全な消費を示した。反応系を、１０％クエン酸溶液（４０ｍＬ、１０Ｖ）でクエンチした。有機相を収集し、有機相を１０％クエン酸溶液（４０ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄し、ブライン（４０ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。粗生成物を２０ｇのシリカゲルに吸着させ、１００：０～９９：１のＰＥ／ＥＡ勾配で溶出する１００ｇのシリカゲルカラム（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ．）で精製した。適格な画分を合わせ、濃縮し、真空下で乾燥させて、ＡＴＸ－２０１－３（８ｇ、収率７５％）を無色油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８６（ｐ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．２６（ｓ，４Ｈ），２．６７－２．５６（ｍ，４Ｈ），２．３０－２．１５（ｍ，４Ｈ），１．５０（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，８Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，４１Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１２Ｈ）．

【0233】

ＡＴＸ－２０１－４の合成

【化26】

【0234】

三つ口丸底フラスコに、アセトン（１６０ｍＬ、２０Ｖ）、ＡＴＸ－２０１－３（８ｇ、１．０当量）を連続的に添加した。ＮＢＳ（４．２５ｇ、２当量）を、０℃で少量ずつ反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で２時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０１－３の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を２０ｇのシリカゲルに吸着させ、Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈシステムを使用して、１００ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ．）カラムで精製した。生成物を、１００：０～９７：３のＰＥ／ＥＡ勾配で溶出した。適格な生成物をプールし、真空下で濃縮して、ＡＴＸ－２０１－４（２．５ｇ、収率３５％）を無色油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８４（ｐ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），１．５０（ｑ，Ｊ＝６．４，６．０Ｈｚ，８Ｈ），１．３１－１．２１（ｍ，４０Ｈ），０．９１－０．８４（ｍ，１２Ｈ）．

【0235】

ＡＴＸ－２０１－５の合成

【化27】

【0236】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した５００ｍＬの四つ口丸底フラスコに、臭化メチルトリフェニルホスファニウム（１．９ｇ、１．６当量）、ＴＨＦ（７５ｍＬ、３０Ｖ）を入れた。これに続いて、ｔ－ＢｕＯＫ（０．７ｇ、１．５当量）を０℃において１０分で、いくつかのバッチで添加した。これに、ＴＨＦ（２５ｍｌ）中のＡＴＸ－２０１－４（２．５ｇ、１当量）を０℃において２０分で添加した。得られた溶液を２５℃で１８時間撹拌した。得られた混合物を濃縮した。生成物を５ｇのシリカゲルに吸着させ、１００：０～９９：１のＰＥ／ＥＡ勾配で溶出することによって、Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈシステム上の２５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ．）カラムで精製した。適格な生成物を合わせ、濃縮し、真空下で乾燥させて、ＡＴＸ－２０１－５（１．９ｇ、収率７６％）を無色油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８８（ｐ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．７８（ｓ，２Ｈ），２．４７（ｄｄｄ，Ｊ＝８．５，６．２，１．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３７（ｄｄ，Ｊ＝８．６，５．９Ｈｚ，４Ｈ），１．５３（ｓ，８Ｈ），１．２７（，４０Ｈ），０．８８（ｍ，１２Ｈ）．

【0237】

ＡＴＸ－２０１－６の合成

【化28】

【0238】

三つ口丸底フラスコに、ＡＴＸ－２０１－５（１．９ｇ、１当量）、ＴＨＦ（３．７０ｍＬ）を連続的に添加した。これに続いて、ＴＨＦ（８ｍＬ、１．２５当量）中の０．５ｍｏｌの９－ＢＢＮを１８℃において２０分で、撹拌しながら滴下した。混合物を１８℃で１８時間撹拌した後、水（０．４７ｍＬ、０．２５Ｖ）及び３Ｎ ＮａＯＨ（２．８ｍＬ、１．５Ｖ）を連続的に添加した。次いで、温度を５０℃未満に維持しながら、３０％Ｈ_２Ｏ_２（４．７５ｍｌ、２．５Ｖ）を滴下した。室温で１８時間撹拌した後、得られた溶液を２×２０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を３×２０ｍＬのブラインで洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。生成物を５ｇのシリカゲルに吸着させ、ＰＥで溶出することによって、Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈシステム上の２５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ．）カラムで精製した。適格な生成物を合わせ、濃縮し、真空下で乾燥させて、ＡＴＸ－２０１－６（１．４ｇ、収率７６％）を無色油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８７（ｐ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．１２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４０－２．２７（ｍ，４Ｈ），１．７５－１．６１（ｍ，３Ｈ），１．５１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，９Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，４０Ｈ），１．２３（ｍ，４０Ｈ），０．８７（ｍ，１２Ｈ）．

【0239】

ＡＴＸ－２０１の合成

【化29】

【0240】

三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（２８ｍＬ、２０Ｖ）、ＡＴＸ－２０１－６（１．４ｇ、１．０当量）、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（３８０ｍｇ、１当量）、及びＤＭＡＰ（１６８ｍｇ、０．６当量）を連続的に添加した。ＥＤＣＩ（５２６ｍｇ、１．２当量）を、０℃で少量ずつ反応混合物に添加した。得られた溶液を２０℃で１６時間撹拌し、ＴＬＣは、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸の完全な消費を示した。反応混合物を、１０％クエン酸溶液（１４ｍＬ、１０Ｖ）でクエンチした。有機相を収集し、１０％クエン酸溶液（１４ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄し、ブライン（１４ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。生成物を５ｇのシリカゲルに吸着させ、１００：０～９５：５のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶出することによって、Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈシステム上の２５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ．）カラムで精製した。適格な生成物を合わせ、濃縮し、真空下で乾燥させて、ＡＴＸ－２０１（１．３ｇ、収率７８％）を淡黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ３．１９分、ｍ／ｚ（計算値）７２３．６、（実測値）７２４．７ ^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８３１（ｐ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０１３（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），３．０００－２．８８１（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｓ，６Ｈ），２．４６４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３１０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），２．１１２（ｄｑ，Ｊ＝１３．７，６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．６５３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５Ｈ），１．４９２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，８Ｈ），１．２４２（ｍ，４０Ｈ），０．９１０－０．７６２（ｍ，１２Ｈ）．

【0241】

実施例４．ＡＴＸ－２０２の合成

【化30】

一般スキーム：

【化31】

【0242】

ＡＴＸ－２０２－５の合成

【化32】

【0243】

２５０ｍＬの四つ口丸型ボトルフラスコに、Ｎ_２下で機械的に撹拌しながら、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の５ｇの１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－ヒドロキシノナンジオエートを０℃で充填した。これに続いて、ＴＥＡ（１．６ｇ、２当量）及びＭｓＣｌ（１．３５ｇ、１．５当量）を０℃で撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温で５時間撹拌した。次いで、１００ｍＬのＨ_２Ｏを添加することによって、反応をクエンチした。相を分離し、水層を１×１００ｍＬのＤＣＭで抽出した。次いで、有機層を合わせた。溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。これにより、４．８ｇ（８５％）のジ（ペンタデカン－８－イル）５－（（メチルスルホニル）オキシ）ノナンジオエートを得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ４．７６分、ｍ／ｚ（計算値）７０３．１２、（実測値）７２５．３（Ｍ＋Ｎａ）。

【0244】

ＡＴＸ－２０２－６の合成

【化33】

【0245】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＭＦ（４８ｍＬ）中の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－オキソノナンジオエート（４．８ｇ、１．００当量）を入れた。これに続いて、ＮａＨＳ（２ｇ、５．００当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で５時間撹拌した。次いで、２００ｍＬの水／氷を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を３×１００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。これにより、２．８ｇ（６４％）のジ（ペンタデカン－８－イル）５－メルカプトノナンジオエートを淡黄色油として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ４．８４分、ｍ／ｚ（計算値）６４０．５、（実測値）６６３．４（Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ）。

【0246】

ＡＴＸ－２０２の合成

【化34】

【0247】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（２８ｍＬ）中のジ（ペンタデカン－８－イル）５－メルカプトノナンジオエート（２．８ｇ、１．００当量）の溶液を入れた。４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．８７ｇ、１．２０当量）、ＤＭＡＰ（０．１ｇ、０．２０当量）を添加し、続いて、ＥＤＣＩ（０．９５ｇ、１．２０当量）を０℃で少量ずつ添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、１００ｍＬのＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を２×１００ｍＬのＤＣＭで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を２×１００ｍＬのブラインで洗浄した。得られた混合物を真空下で濃縮し、６ｇの粗生成物を得た。生成物を３０ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、１０ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）を添加した。混合物を真空下で濃縮した。残渣を、ＤＣＭ／ＭＥ、１／０～３０／１の勾配で、大気圧シリカゲルカラム（８００ｇ、タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）上に適用し、生成物溶出液（５０／１～３０／１）を収集した。収集した生成物相を真空下で濃縮した。次いで、生成物をヘプタン（３０ｍＬ、２０Ｖ）中に溶解し、次いで、有機層をＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（３：１）３０ｍＬ（２０Ｖ）で洗浄した。ヘプタン相を真空下で濃縮した。これにより、１．３ｇ（４５％）の１，９－ビス（ペンタデカン－８－イル）５－［［４－（ジメチルアミノ）ブタノイル］オキシ］ノナンジオエートを無色油として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ２．８３分、ｍ／ｚ（計算値）７５４．２５、（実測値）７５４．４５（Ｍ）；^１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，ｐｐｍ）：δ ４．８３－４．８７（ｍ，２Ｈ），３．５１－３．５４（ｓ，１Ｈ），２．５５－２．６０（ｍ，２Ｈ），２．２１－２．３０（ｍ，１２Ｈ），１．４０－１．９１（ｍ，１９Ｈ），１．１１－１．３０（ｍ，４１Ｈ），１．２８（ｓ，４０Ｈ），０．８２－０．９１（ｍ，１２Ｈ）．

【0248】

実施例５．ＡＴＸ－２０９の合成

【化35】

一般スキーム：

【化36】

【0249】

ＡＴＸ－２０９－１の合成

【化37】

【0250】

三つ口丸底フラスコに、ＤＭＳＯ（３８ｍＬ、１５Ｖ）、ＡＴＸ－２０９－ＳＭ１（２．５ｇ、１当量）、及び１（（イソシアノメチル）スルホニル）－４－メチルベンゼン（１ｇ、０．５当量）を室温で添加した。混合物に、ＮａＨ（０．３０ｇ、１．２当量）及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（０．３７ｇ、０．１当量）を０℃で連続的にゆっくり添加した。得られた溶液を６０℃で２時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０９－ＳＭ１の完全な消費を示した。次いで、２５ｍＬの水を添加することによって、反応をクエンチした。溶液をＤＣＭ（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機相を２×２５ｍＬの飽和ブラインで洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過し、濃縮し、真空下で乾燥させて、ＡＴＸ－２０９－１（３．２ｇ、収率６０％）を無色油として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２．００分、０．７分保持）：ＲＴ ０．８４分、ｍ／ｚ（計算値）５３５．３０、（実測値）５５８．２０（Ｍ＋Ｎａ）。

【0251】

ＡＴＸ－２０９－２の合成

【化38】

【0252】

三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（３０ｍＬ、１０Ｖ）、ＡＴＸ－２０９－１（３ｇ、１当量）を室温で一度に添加した。ＨＣｌ（６ｍｌ、２Ｖ）を０℃で混合物にゆっくり添加し、得られた溶液を０℃で２時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０９－１の完全な消費を示した。次いで、３０ｍＬの重炭酸ナトリウムを添加することによって、反応をクエンチした。有機相を２×３０ｍＬの飽和ブラインで洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。濾液に、５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ）を添加し、温度を３５℃未満に維持しながら、真空下で画分がなくなるまで濃縮した。２５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ）をカラムに充填し、続いて、最終工程で調製された乾燥シリカゲルを充填し、これが反応混合物を吸収した。Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈを使用して、生成物を精製する。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（体積比）で溶出した。（１００：０～２０：１の勾配、１００±５０ｍＬ毎に収集）。ＴＬＣ分析のために試料を採取した。適格な生成物を合わせた。真空下で濃縮乾固して、ＡＴＸ－２０９－２（１．１５ｇ、収率８０％）を白色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ２．３６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），１．４３（，８Ｈ），１．２１－１．１２（ｍ，４Ｈ）．

【0253】

ＡＴＸ－２０９－３の合成

【化39】

【0254】

三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（２０ｍＬ、２０Ｖ）、ＡＴＸ－２０９－２（１ｇ、１．０当量）、ＡＴＸ－２０９－５（１．７１ｇ、２．２当量）、及びＤＭＡＰ（０．４７ｇ、１当量）を連続的に添加した。ＥＤＣＩ（１．６３ｇ、２．２当量）を、０℃で少量ずつ反応混合物に添加した。得られた溶液を２０℃で１６時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０９－２の完全な消費を示した。反応系を、１０％クエン酸溶液（１０ｍＬ、１０Ｖ）でクエンチした。有機相を収集し、有機相を１０％クエン酸溶液（１０ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄し、ブライン（１０ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。濾液に、５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ）を添加し、温度を３５℃未満に維持しながら、真空下で画分がなくなるまで濃縮した。２５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ）をカラムに充填し、続いて、最終工程で調製された乾燥シリカゲルを充填し、これが反応混合物を吸収した。Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈを使用して、生成物を精製する。ＰＥ／ＥＡ（体積比）で溶出した。（１００：０～５０：１の勾配、２０±１０ｍｌ毎に収集）。ＴＬＣ分析のために試料を採取した。適格な生成物を合わせる。真空下で濃縮乾固して、ＡＴＸ－２０９－３（１．６８ｇ、収率７０％）を無色油として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、５．００分、０．７分保持）：ＲＴ ４．８３分、ｍ／ｚ（計算値）６２２．５５、（実測値）６４５．３（Ｍ＋Ｎａ）。

【0255】

ＡＴＸ－２０９－４の合成

【化40】

【0256】

１００ｍｌの三つ口フラスコに、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ、１０Ｖ）、ＡＴＸ－２０９－３（２ｇ、１当量）を室温で添加した。ＮａＢＨ_４（０．１８ｇ、１．５当量）を、０℃で少量ずつ反応混合物に添加した。得られた溶液を０℃で２時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０９－３の完全な消費を示した。次いで、２０ｍＬの水を添加することによって、反応をクエンチした。系を、ＭＥＴＢ（２×１０ｍｌ、１０Ｖ）で再び抽出した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。真空下で濃縮乾固して、ＡＴＸ－２０９－３（１．５ｇ、収率７５％）を無色油として得た。ＬＣＭＳ（Ｓｃｈｉｍａｄｚｕ ２０２０；ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、５．５０分、０．７分保持）：ＲＴ ４．８３分、ｍ／ｚ（計算値）６２４．５７、（実測値）６４７．３５（Ｍ＋Ｎａ）。

【0257】

ＡＴＸ－２０９－５の合成

【化41】

【0258】

１００ｍｌの四つ口丸型ボトルフラスコに、Ｎ_２下で機械的に撹拌しながら、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＡＴＸ－２０９－ＳＭ２（１ｍｏｌ／Ｌ、３１ｍｌ）を２５℃で添加した。ギ酸エチル（１ｇ、１．００当量）を、０℃で撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温で１５時間撹拌した。次いで、ＮＨ_４Ｃｌ溶液（２０ｍＬ、２０Ｖ）を添加することによって、反応をクエンチした。相を分離し、水層を酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。次いで、有機層を合わせた。溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過し、真空下で濃縮した。残渣を６ｍＬのＡＣＮでスラリー化した。固体を濾過によって収集した。これにより、ＡＴＸ－２０９－５（２ｇ、収率７４％）を白色粉末として得た。

【0259】

ＡＴＸ－２０９の合成

【化42】

【0260】

三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（３０ｍＬ、２０Ｖ）、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．４５ｇ、１．１当量）、ＡＴＸ－２０９－４（１．５ｇ、１当量）、及びＤＭＡＰ（０．２９ｇ、１当量）を連続的に添加した。ＥＤＣＩ（０．６０ｇ、１．３当量）を、０℃で少量ずつ反応混合物に添加した。得られた溶液を２０℃で１６時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２０９－４の完全な消費を示した。反応系を、１０％クエン酸溶液（１５ｍＬ、１０Ｖ）でクエンチした。有機相を収集し、有機相を１０％クエン酸溶液（１５ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄し、ブライン（１５ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。濾液に、５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ）を添加し、温度を３５℃未満に維持しながら、真空下で画分がなくなるまで濃縮した。２５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、８．００ｗ／ｗ）をカラムに充填し、続いて、最終工程で調製された乾燥シリカゲルを充填し、これが反応混合物を吸収した。Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈを使用して、生成物を精製する。ＰＥ／ＥＡ（体積比）で溶出する。（１００：０～５０：１の勾配、２０±１０ｍｌ毎に収集）。ＴＬＣ分析のために試料を採取する。適格な生成物を合わせる。真空下で濃縮乾固して、ＡＴＸ－２０９（１．２ｇ、収率７５％）を無色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、５．５０分、０．７分保持）：ＲＴ ４．８３分、ｍ／ｚ（計算値）７３７．５、（実測値）７３８．３（Ｍ＋Ｈ）；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８６０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３７０－２．２０１（ｍ，１４Ｈ），１．８０１（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６１１－１．４７０（ｍ，１６Ｈ），１．２７２（ｍ，４０Ｈ），０．９２０－０．８２１（ｍ，１２Ｈ）．

【0261】

実施例６．ＡＴＸ－２１０の合成

【化43】

一般スキーム：

【化44】

【0262】

ＡＴＸ－２１０－４の合成

【化45】

【0263】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、５－オキソノナン二酸（６ｇ、１．００当量）、ＤＣＭ（９０ｍＬ）を入れた。これに続いて、ペンタデカン－８－オール（６．７７ｇ、．０当量）、ＤＭＡＰ（０．７２ｇ、０．２当量）を添加し、これに、ＥＤＣＩ（６．８４ｇ、１．２当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、７５ｍＬのＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を２×１００ｍｌのＤＣＭで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を２×１００ｍｌのＮａＣｌで洗浄した。有機層を真空下で濃縮した。生成物を６０ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、４０ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）を添加した。混合物を真空下で濃縮した。残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、０／１～１／１０の勾配で、大気圧シリカゲルカラム（４００ｇ、タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）上に適用し、生成物溶出液（１／２０～１／１０）を収集した。収集した生成物相を真空下で濃縮した。これにより、７．２ｇ（５８．８％）のＡＴＸ－２１０－４を黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２分、０．７分保持）：ＲＴ １．６０分、ｍ／ｚ（計算値）４１２．３２、（実測値）４３５．１５（Ｍ＋Ｎａ）。

【0264】

ＡＴＸ－２１０－５の合成

【化46】

【0265】

１Ｌの四つ口丸型ボトルフラスコに、Ｎ_２下で機械的に撹拌しながら、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の５４０ｍＬの臭化ペンチルマグネシウム（１ｍｏｌ／Ｌ）を２５℃で充填した。ギ酸エチル（２０．０ｇ、１．０当量）を０℃で撹拌しながら滴下して充填した。得られた溶液を室温で１５時間撹拌した。次いで、５００ｍＬのＮＨ_４Ｃｌを添加することによって、反応をクエンチした。相を分離し、水層を２×５００ｍＬの酢酸エチルで抽出した。次いで、有機層を合わせた。溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過し、真空下で濃縮した。これにより、３８．９ｇ（８３．６％）のウンデカン－６－オールを黄色油として得た。

【0266】

ＡＴＸ－２１０－６の合成

【化47】

【0267】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、ＡＴＸ－２１０－４（７．２ｇ、１．００当量）、ＤＣＭ（１０８ｍＬ）を入れた。これに続いて、ウンデカン－６－オール（３．０ｇ、１．０当量）、ＤＭＡＰ（０．４３ｇ、０．２当量）を添加し、これに、ＥＤＣＩ（４．１ｇ、１．２当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、７５ｍＬのＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を２×１００ｍｌのＤＣＭで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を２×１００ｍｌのＮａＣｌで洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。これにより、１０ｇ（９９．９％）のＡＴＸ－２１０－６を黄色油として得て、更に精製することなく次の工程に直接使用した。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、５分、０．７分保持）：ＲＴ ３．６２分、ｍ／ｚ（計算値）５６６．４９、（実測値）５８９．４０（Ｍ＋Ｎａ）。

【0268】

ＡＴＸ－２１０－７の合成

【化48】

【0269】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＡＴＸ－２１０－６（１０ｇ、１．０当量）、ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（１０：１、１００ｍＬ）を入れた。これに続いて、ＮａＢＨ_４（１．３４ｇ、２．０当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、１００ｍＬの水／氷を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を３×１００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を２×１００ｍｌのＮａＣｌで洗浄した。次いで、混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機層を真空下で濃縮した。生成物を１０ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、４０ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）を添加した。混合物を真空下で濃縮した。残渣を、１／０～１０／１の勾配のＰＥ／ＥＡで、大気圧シリカゲルカラム（４００ｇ、タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）上に適用し、生成物溶出液（２０／１～１０／１）を収集した。収集した生成物相を真空下で濃縮した。これにより、７．１ｇ（７０．７％）のＡＴＸ－２１０－７を黄色油として得て、更に精製することなく次の工程に直接使用した。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、５分、０．７分保持）：ＲＴ ３．６４分、ｍ／ｚ（計算値）５６８．５０、（実測値）５９１．３５（Ｍ＋Ｎａ）。

【0270】

ＡＴＸ－２１０の合成

【化49】

【0271】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のＡＴＸ－２１０－７（３．３ｇ、１．００当量）の溶液を入れた。４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（１．１６ｇ、１．２０当量）、ＤＭＡＰ（０．１４ｇ、０．２０当量）を添加し、続いて、ＥＤＣＩ（１．３４ｇ、１．２０当量）を０℃で少量ずつ添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、５０ｍＬのＮａＨＣＯ_３（１ｍｏｌ／Ｌ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を３×５０ｍＬのＤＣＭで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を２×５０ｍＬのブラインで洗浄した。有機層を真空下で濃縮した。生成物を５ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、１５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）を添加した。混合物を真空下で濃縮した。残渣を、１／０～１０／１の勾配のＰＥ／ＥＡで、大気圧シリカゲルカラム（１５０ｇ、タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ）上に適用し、生成物溶出液（２０／１～１０／１）を収集した。収集した生成物相を真空下で濃縮した。生成物をヘプタン（６０ｍＬ、２０Ｖ）中に溶解し、ヘプタン相を真空下で濃縮した。これにより、２．３ｇ（６０．０％）のＡＴＸ－２１０を黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２分、０．７分保持）：ＲＴ １．８４分、ｍ／ｚ（計算値）６８１．５９、（実測値）６８２．４０（Ｍ＋Ｈ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２１０－０：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ４．８２１－４．９０４（３Ｈ，ｍ），２．２３５－２．３５７（８Ｈ，ｍ），２．１８７－２．２０４（６Ｈ，ｓ），１．５７１－１．８３１（１６Ｈ，ｍ），１．２６１（３２Ｈ，ｓ），０．８５５－０．８９９（１２Ｈ，ｍ）．

【0272】

実施例７．ＡＴＸ－２３０の合成

【化50】

一般スキーム：

【化51】

【0273】

ＡＴＸ－２３０－１の合成

【化52】

【0274】

１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＴＨＦ（５０ｍＬ、２０Ｖ）中のＡＴＸ－２３０－ＳＭ（２．５ｇ、１．０当量）を添加した。ＮａＨ（５６０ｍｇ、鉱油中６０％、１．２当量）を、０℃で数回にわけて反応混合物に添加し、３０分間撹拌した。臭化ベンジル（２．４ｇ、１．０当量）及びヨウ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ）（１．５ｇ、０．１当量）を、０℃で反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で２時間撹拌し、ＨＰＬＣは、ＡＴＸ－２３０－ＳＭの完全な消費を示した。氷水をこの系に注意深く添加することによって、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。有機溶媒を真空中で蒸発させ、水相をＤＣＭ（２×２５ｍＬ、２０Ｖ）で抽出した。有機溶媒を真空下で濃縮した。残渣をＴＨＦ（２５ｍＬ、１０Ｖ）中に溶解し、６ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ水溶液（２５ｍＬ、１０Ｖ）を室温で添加した。得られた溶液を室温で３０分間撹拌した。溶液のｐＨ値を、ＮａＨＣＯ_３水溶液で７～８に調整した。得られた溶液をエチルエーテル（２×２５ｍＬ、２０Ｖ）で抽出した。有機層を合わせ、無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。濾液に、８ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、３．２０ｗ／ｗ）を充填し、温度を２０℃未満に維持しながら、真空下で画分がなくなるまで濃縮した。４０ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、１６．００ｗ／ｗ．）をカラムに充填し、続いて、最終工程で調製された乾燥シリカゲルを充填し、これが反応混合物を吸収した。Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈを使用して、生成物を精製する。ＰＥ／ＥＡで溶出する。（体積比、１００：０～９５：５の勾配）。生成物画分を真空下で濃縮して、ＡＴＸ－２３０－１（１．５ｇ、収率６０％）を白色固体として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ９５：５～５：９５ Ａ／Ｂ、２分、０．７分保持）：ＲＴ ０．７９分、ｍ／ｚ（計算値）１８２．０９、（実測値）２０５．１０（Ｍ＋Ｎａ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－１：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ７．４０－７．２９（５Ｈ，ｍ），４．６６（２Ｈ，ｓ），３．８３－３．７１（４Ｈ，ｍ），３．６４－３．５８（１Ｈ，ｍ）．

【0275】

ＡＴＸ－２３０－２の合成

【化53】

【0276】

工程１：次いで、Ｎ_２を有する乾燥三つ口フラスコ内のＤＣＭ（３Ｌ、２０Ｖ）中のペンタデカン－８－オール（１５０．０ｇ、１．０当量）の溶液に、ＴＥＡ（２６６．０ｇ、４．０当量）を一度に添加し、続いて、ブロモアセチルブロミド（５２６．０ｇ、４．０当量）を０℃で添加した。反応物を室温で３日間撹拌し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１０Ｌ、６６．７Ｖ）を０℃で添加することによってクエンチした。粗化合物をＤＣＭ（１０Ｌ＊３、２００Ｖ）で抽出した。合わせた有機画分をブライン（１０Ｌ、６６．７Ｖ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過した。濾液に、５００ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、３．３３ｗ／ｗ．）を添加し、温度を３５℃未満に維持しながら、真空下で画分がなくなるまで濃縮する。２．５ｋｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、１６．６７ｗ／ｗ．）をカラムに充填し、続いて、最終工程で調製された乾燥シリカゲルを充填し、これが反応混合物を吸収した。Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈを使用して、生成物を精製する。ＰＥ／ＥＡ（体積比）で溶出する。（１００：０の勾配、３±０．５Ｌ毎に収集）。ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ＝８：１、Ｒｆ＝０．２）分析のために試料を採取する。適格な画分を合わせ、濃縮乾固する。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０ Ａ／Ｂ、３分、０．９８分保持）：ＲＴ ０．９８分、ｍ／ｚ（計算値）３４８．１７、（実測値）３９０．３０（Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ_２Ｏ）、Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－４：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ５．０１－４．８７（１Ｈ，ｍ），３．８１（２Ｈ，ｓ），１．５７（４Ｈ，ｍ），１．３４（２２Ｈ，ｍ），０．８８（６Ｈ，ｔ）．

【0277】

工程２：１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＴＨＦ（３０ｍＬ、２０Ｖ）中のＡＴＸ－２３０－１（１．５ｇ、１．０当量）を添加した。ｔ－ＢｕＯＫ（１．３８ｇ、１．５当量）を０℃で少量ずつ反応混合物に添加し、３０分間撹拌した。ＡＴＸ－２３０－４（４．３ｇ、１．５当量）を、０℃で数回にわけて反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。追加のｔ－ＢｕＯＫ（１．３８ｇ、１．５当量）及びＡＴＸ－２３０－４（４．３ｇ、１．５当量）を、室温で反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、ＡＴＸ－２３０－１の完全な消費を示した。次いで、塩化アンモニウム溶液（１５ｍＬ、１０Ｖ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液をＥｔ_２Ｏ（２＊３０ｍＬ、４０Ｖ）で抽出した。有機層を合わせ、無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。濾液に、３ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ）を充填し、温度を２０℃未満に維持しながら真空下で濃縮して、化合物を吸着させた。この物質を、ＰＥ／ＥＡ（体積比、１００／０～９５：５の勾配）を使用して２０ｇのＣｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈシリカゲルカラムで精製して、生成物を溶出した。画分をプールし、真空下で濃縮して、ＡＴＸ－２３０－２（２．１ｇ、収率３５．５％）を黄色固体として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０ Ａ／Ｂ、３分、２．６分保持）：ＲＴ ２．６２分、ｍ／ｚ（計算値）７１８．５７、（実測値）７４１．５０（Ｍ＋Ｎａ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－２：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ７．３９－７．２７（５Ｈ，ｍ），４．９９－４．９３（２Ｈ，ｍ），４．５２（２Ｈ，ｓ），４．１０（４Ｈ，ｓ），３．９９－３．６８（ｍ，５Ｈ），１．５３（９Ｈ，ｍ），１．４９（４２Ｈ，ｍ），１．２６－１．２４（１２Ｈ，ｔ）．

【0278】

ＡＴＸ－２３０－３の合成

【化54】

【0279】

ＥＡ（２１ｍＬ、１０Ｖ）中のＡＴＸ－２３０－２（２．１ｇ、１．０当量）及び２０％Ｐｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（０．６３ｇ、３０重量％）の溶液を、室温でオートクレーブに充填する。水素雰囲気（５０ａｔｍ）下で、３５℃において１６時間撹拌した。ＴＬＣは、ＡＴＸ－２３０－２が完全に変換されたことを示した。反応混合物を濾過し、真空下、４０℃で濃縮して、ＡＴＸ－２３０－３（１．７ｇ、収率９５％）を白色固体として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０ Ａ／Ｂ、３分、２．６分保持）：ＲＴ １．９０分、ｍ／ｚ（計算値）６２８．５３、（実測値）６５１．５０（Ｍ＋Ｎａ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－３：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ４．９９－４．９１（２Ｈ，ｄｄ），４．０３（４Ｈ，ｓ），３．６７－３．３７（４Ｈ，ｍ），１．５６－１．４９（９Ｈ，ｍ），１．２９－１．２５（４０Ｈ，ｍ），０．９７－０．８５（１２Ｈ，ｔ）．

【0280】

ＡＴＸ－２３０の合成

【化55】

【0281】

１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（３４ｍＬ、２０Ｖ）中のＡＴＸ－２３０－３（１．７ｇ、１．０当量）、４（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（４５０ｍｇ、１．０当量）、及びＤＭＡＰ（１９８ｍｇ、０．６当量）の溶液を添加した。ＥＤＣＩ（６２０ｍｇ、１．２当量）を、０℃で数回にわけて反応混合物に添加した。得られた溶液を２０℃で１６時間撹拌した。反応系を、１０％クエン酸水溶液（１７ｍＬ、１０Ｖ）でクエンチし、有機相を収集した。有機溶液を１０％クエン酸水溶液（１７ｍＬ、１０Ｖ）、続いてブライン（１７ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過した。混合物を５ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．９４ｗ／ｗ）に吸着させ、１００：０～９８：２のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶出することによって、Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈシリカゲルカラム（４０ｇ）で精製した。画分を含有する生成物をプールし、真空下で濃縮して、１．２ｇ（収率６５％）のＡＴＸ－２３０を淡黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０ Ａ／Ｂ、３分、２．６分保持）：ＲＴ ０．９６分、ｍ／ｚ（計算値）７４１．６２、（実測値）７４２．６［Ｍ＋１］^＋；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－ＡＴＸ－２３０－０：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）δ ５．１８１（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９３１（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０８１（ｓ，４Ｈ），３．８３０－３．７００（ｍ，４Ｈ），２．３４１（ｄｔ，Ｊ＝４１．４，７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．２１２（ｓ，６Ｈ），１．８００（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．５３０（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，８Ｈ），１．２５（ｍ，４０Ｈ），０．９００－０．８３０（ｍ，１２Ｈ）。

【0282】

実施例８．ＡＴＸ－２３１の合成

【化56】

一般スキーム：

【化57】

【0283】

ＡＴＸ－２３１－１の合成

【化58】

【0284】

１Ｌの三つ口丸底フラスコに、アセトン（５００ｍＬ、１０Ｖ）中のエチルＡＴＸ－２３１－ＳＭ１（５０．０ｇ、１．０当量）及びヨウ化ナトリウム（１８０ｇ、．４．４当量）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（４００ｍＬ、８Ｖ）で希釈し、ジエチルエーテル（４００ｍＬ、８Ｖ）で抽出した。有機画分を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。ナトリウムエトキシド（１０．８ｇ、２．１当量）を絶対エタノール（９０ｍＬ、２Ｖ）中に溶解した。ジエチルアセトンジカルボキシレート（３６．０ｇ、１．１２当量）を添加し、溶液を加熱還流させた。次いで、６－ヨードカプロン酸エチル（２４．０ｇ、１．０当量）をゆっくり添加し、溶液を１時間還流させた。エタノール（９０ｍＬ、２Ｖ）中のナトリウムエトキシド（１０．８ｇ、２．１当量）の溶液、続いて６－ヨード吉草酸エチル（２４．０ｇ、１．０当量）を添加した。溶液を一晩還流させた。反応混合物を冷却し、水（４００ｍＬ、８Ｖ）で希釈し、ジエチルエーテル（４００ｍＬ、８Ｖ）で抽出した。真空下で濃縮して、４７．５ｇ（粗製）のＡＴＸ－２３１－１を黄色油として得た。

【0285】

ＡＴＸ－２３１－２の合成

【化59】

【0286】

１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、クエン酸（４０ｍＬ、１Ｖ）及びＨＣｌ（８０ｍＬ、２Ｖ、１２ｍｏｌ／Ｌ）中のＡＴＸ－２３１－１（４０．０ｇ、１．０当量）を添加した。反応溶液を一晩還流させた。溶液を冷却し、水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。溶媒を除去し、残渣をアセトンから再結晶させ、真空下で乾燥させて、４ｇ（１４％）のＡＴＸ－２３１－２を白色固体として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ ８０：２０～９０：１０ Ａ／Ｂ、２分）：ＲＴ ０．１６分、ｍ／ｚ（計算値）２５８．１５、（実測値）２５７．３０［Ｍ＋１］^＋；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－ＡＴＸ－２３１－１：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）δ ２．５－２．４９（ｍ，２Ｈ），２．４２－２．３２（ｍ，２Ｈ），２．１９－２．１５（ｍ，４Ｈ），２．００－１．９８（ｍ，８Ｈ），１．５１－１．４７（ｍ，４Ｈ）．

【0287】

ＡＴＸ－２３１－３の合成

【化60】

【0288】

工程１：

【化61】

【0289】

ＤＣＭ（３００ｍｌ、２０Ｖ）、ＡＴＸ－２０９－５（１５ｇ、１当量）、及びクロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ、４０ｇ、２．５当量）を、５００ｍｌの三つ口フラスコに添加した。得られた溶液を室温で５時間撹拌した。ＴＬＣ観察は、ＡＴＸ－２０９－５の完全な変換を示した。溶媒を、真空下で蒸留することによって除去した。粗生成物をシリカゲルカラム上に適用し、生成物を酢酸エチル／石油エーテル（１：１０）勾配で溶出して、ＡＴＸ－２３１－８（１３ｇ、収率８８％）を無色の透明油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ２．３８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），１．５３－１．３６（ｍ，４Ｈ），１．３４－１．１５（ｍ，１２Ｈ），０．８９－０．８０（ｍ，６Ｈ）．

【0290】

工程２：

【化62】

【0291】

ＴＨＦ（２６０ｍｌ、２０Ｖ）及び（メトキシメチ）トリフェニルホスホニウムクロリド（３２ｇ、１．６当量）を、５００ｍｌの三つ口フラスコに添加し、続いてｔ－ＢｕＯＫ（１１．８、１．６当量）を、０℃においてバッチで混合物に添加した。０℃で１時間撹拌した。ＡＴＸ－２３１－８（１３ｇ、１当量）を反応混合物に添加した。室温で１５時間撹拌した。この系に塩化アンモニウム水溶液（１０重量％、２６０ｍｌ、２０Ｖ）を添加して、クエンチした。ＭＴＢＥ（２６０ｍｌ、２０Ｖ）を添加し、反応混合物に抽出し、有機相を収集した。有機相の濃縮後、混合物を、酢酸エチル／石油エーテル（２：９８）とともにシリカゲルカラム上に適用した。ＡＴＸ－２３１－７（１０ｇ、収率７０％）を油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ５．７４（ｓ，１Ｈ），３．５１（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８８－１．８１（ｍ，２Ｈ），１．４２－１．２０（ｍ，１６Ｈ），０．９３－０．８３（ｍ，６Ｈ）．

【0292】

工程３：

【化63】

【0293】

ＴＨＦ（５０ｍｌ、５Ｖ）、ＡＴＸ－２３１－７（１０ｇ、１当量）、及び６Ｎ ＨＣｌ（２０ｍｌ、２Ｖ）を、２５０ｍｌの三つ口フラスコに室温で添加した。５０℃で５時間撹拌した。３Ｎ ＮａＯＨ（４０ｍｌ、４Ｖ）及びＭＴＢＥ（１００ｍｌ、１０Ｖ）を反応混合物に添加し、生成物をエーテル相に抽出した。エーテル相を収集し、真空下で濃縮して、ＡＴＸ－２３１－６（６．５７ｇ、収率７１％）を油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ９．４９（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６２（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｍ，２０Ｈ），０．８８－０．７８（ｍ，６Ｈ）．

【0294】

工程４：

【化64】

【0295】

ＭｅＯＨ（６５ｍｌ、１０Ｖ）及びＡＴＸ－２３１－６（６．５７ｇ、１当量）を、１００ｍｌの三つ口フラスコに室温で添加した。ＮａＢＨ_４（１．７６、１．５当量）を、０℃においてバッチで反応混合物に添加し、０℃で２時間撹拌した。クエン酸溶液（１０重量％、６５．７ｍｌ、１０Ｖ）を、反応混合物に０℃で添加した。生成物を、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、６５ｍｌ、１０Ｖ）中に抽出し、有機相を収集し、真空下で濃縮して、ＡＴＸ－２３１－５（５．２ｇ、収率７９％）を油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ３．５３（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），３．４８（ｓ，１Ｈ），１．２８（ｍ，２０Ｈ），０．９３－０．８３（ｍ，６Ｈ）．

【0296】

工程５：２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（６０ｍＬ、２０Ｖ）中のＡＴＸ－２３１－２（３．０ｇ、１．０当量）、ＡＴＸ－２３１－５（４．９７ｇ、２．０当量）、及びＤＭＡＰ（１．４２ｇ、１．０当量）を添加した。次いで、ＥＤＣＩ（４．９ｇ、２．２当量）を、０℃で数回にわけて反応混合物に添加した。得られた溶液を２０℃で１６時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２３１－２の完全な消費を示した。反応を、１０％クエン酸水溶液（３０ｍＬ、１０Ｖ）でクエンチした。単離有機相を、１０％クエン酸水溶液（３０ｍＬ、１０Ｖ）、続いてブライン（３０ｍＬ、１０Ｖ）でもう一度洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次いで濾過した。粗生成物を、６ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ）に吸着させ、１００：０～９８：２の石油エーテル／酢酸エチル勾配を使用して、３０ｇのシリカゲルカラムで精製した。ＴＬＣ分析後の適格な画分（１０：１ ＰＥ：ＥＡ）をプールし、真空下で濃縮乾固して、４ｇ（収率５３％）のＡＴＸ－２３１－３を無色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０Ａ／Ｂ ３．５分）：ＲＴ ２．８９分、ｍ／ｚ（計算値）６５０．５８、（実測値）６７３．５０（Ｍ＋Ｎａ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－２：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ３．９７－３．９６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，４Ｈ），２．４５－２．４３（ｍ，４Ｈ），２．３８－２．２８（ｍ，４Ｈ），１．６６－１．６０（９Ｈ，ｍ），１．４９（４８Ｈ，ｍ），０．８６－０．８８（１２Ｈ，ｔ）．

【0297】

ＡＴＸ－２３１－４の合成

【化65】

【0298】

１００ｍＬの三つ口フラスコに、ＭｅＯＨ（４０ｍＬ、１０Ｖ）中のＡＴＸ－２３１－３（４．０ｇ、１当量）を室温で添加した。次いで、ＮａＢＨ_４（０．３４ｇ、１．５当量）を、０℃で数回にわけて反応混合物に添加した。得られた溶液を０℃で２時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、ＡＴＸ－２３１－３の完全な消費を示した。水（４０ｍＬ、１０Ｖ）を添加することによって、反応をクエンチした。生成物をＭＴＢＥで２回抽出した（２×２０ｍｌ、１０Ｖ）。有機相を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮乾固して、３．４ｇ（収率８５％）のＡＴＸ－２３１－４を無色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０Ａ／Ｂ ３．５分）：ＲＴ ３．０３分、ｍ／ｚ（計算値）６５２．６０、（実測値）６７５．５０（Ｍ＋Ｎａ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－２：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ４．００－３．９８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），３．５９－３．５１（ｍ，１Ｈ），２．３５－２．３０（ｍ，４Ｈ），１．６８－１．６３（ｍ，６Ｈ），１．５５－１．２９（ｍ，５５Ｈ），０．９２－０．８８（１２Ｈ，ｔ）．

【0299】

ＡＴＸ－２３１の合成

【化66】

【0300】

１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（６０ｍＬ、３０Ｖ）中のＡＴＸ－２３１－４（２．０ｇ、１．０当量）、４－（ジメチル－アミノ）ブタン酸塩酸塩（０．８１ｇ、１．６当量）、及びＤＭＡＰ（０．４ｇ、１．１当量）の溶液を添加した。次いで、ＥＤＣＩ（１．０ｇ、１．７当量）を、０℃で数回にわけて反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌し、ＴＬＣは、ＡＴＸ－２３１－４の完全な消費を示した。反応を、１０％クエン酸水溶液（２０ｍＬ、１０Ｖ）でクエンチし、有機相を単離した。有機相を、１０％の追加のクエン酸水溶液（２０ｍＬ、１０Ｖ）、続いてブライン（２０ｍＬ、１０Ｖ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過した。粗生成物を、６ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、３．００ｗ／ｗ．）に吸着させ、３０ｇのシリカゲルカラムを使用して、Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈシステムで精製した。生成物を、１００：０～９８：２の石油エーテル酢酸エチルの勾配で溶出した。画分を分析し（ＴＬＣ、ＥＡ：ＰＥ＝１：１０）、プールし、真空下で濃縮乾固して、１．５ｇ（収率７５％）のＡＴＸ－２３１を淡黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０Ａ／Ｂ ３．５分）：ＲＴ １．９０分、ｍ／ｚ（計算値）７６６．２５、（実測値）７６７．２３（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－ＡＴＸ－２３１－０：（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）δ ４．８９２－４．８５１（ｍ，１Ｈ），３．９８８－３．９６９（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），２．９５７－２．９０５（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７１３（ｓ，６Ｈ），２．４４５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．３０８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．１１７（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．６５０－１．５２１（ｍ，１０Ｈ），１．２８８（ｂｓ，４８Ｈ），０．９２１－０．９００（ｍ，１２Ｈ）。

【0301】

実施例９．ＡＴＸ－２３２の合成

【化67】

一般スキーム：

【化68】

【0302】

ＡＴＸ－２３２－４の合成：

【0303】

工程１：

【化69】

【0304】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ、１０Ｖ）中のＡＴＸ－２３２－ＳＭ３（１０．０ｇ、１．０当量）を室温で入れた。これに続いて、ＬｉＡｌＨ_４（１．４８ｇ、１．０当量）を０℃で入れた。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、氷水（５０ｍＬ、５Ｖ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液をＥＡ（３＊２００ｍＬ、６０Ｖ）で抽出し、有機層を合わせた。有機層をブライン（２＊１００ｍＬ、２０Ｖ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。これにより、７．０ｇ（収率７５％）のＡＴＸ－２３２－１０を黄色油として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．１８－４．１１（ｍ，１Ｈ），３．５７－３．５５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），１．４４－１．２８（ｍ，２５Ｈ），０．９３－０．８５（ｍ，６Ｈ）．

【0305】

工程２：

【化70】

【0306】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＡＴＸ－２１０－４（５．０ｇ、１．０当量）及びＤＣＭ（７５ｍＬ、１５Ｖ）を室温で入れた。これに続いて、ＡＴＸ－２３２－１０（２．９１ｇ、１．０当量）及びＤＭＡＰ（０．３ｇ、０．２当量）を室温で添加し、次いで、ＥＤＣＩ（２．７４ｇ、１．２当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ水溶液（２５ｍＬ、５Ｖ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液をＤＣＭ（３＊１６５ｍＬ、１００Ｖ）で抽出し、有機層を合わせた。有機層をブライン（２＊１５０ｍＬ、６０Ｖ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗混合物を、１０ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ．）に吸着させ、１００：０～９０：１０のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶出することによって、１００ｇのシリカゲルカラムで精製した。ＴＬＣ分析後に画分をプールした。（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）、減圧下で濃縮して、５．５ｇ（収率７２％）のＡＴＸ－２３２－４を黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０Ａ／Ｂ ３．５分）：ＲＴ ２．８１分、ｍ／ｚ（計算値）６３６．５７、（実測値）６５９．５５（Ｍ＋Ｎａ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－２：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ４．８９－４．８５（ｍ，１Ｈ），３．９９－３．９７（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），２．５０－２．４６（ｍ，４Ｈ），２．３６－２．２９（ｍ，４Ｈ），１．９５－１．８５（ｍ，４Ｈ），１．５２－１．５１（６Ｈ，ｍ），１．２８（４８Ｈ，ｍ），０．９１－０．８４（ｍ，１２Ｈ）．

【0307】

ＡＴＸ－２３２－５の合成

【化71】

【0308】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（１０／１、５５ｍＬ、１０Ｖ）中のＡＴＸ－２３２－４（５．５ｇ、１．０当量）を室温で入れた。これに続いて、ＮａＢＨ_４（０．８８ｇ、２．０当量）を０℃においていくつかのバッチで添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、氷水（２７．５ｍＬ、５Ｖ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液を酢酸エチル（３＊９０ｍＬ、５０Ｖ）で抽出し、有機層を合わせた。有機層をブライン（２＊１１０ｍＬ、４０Ｖ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗混合物を、１１ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ．）に吸着させ、１００：０～９０：１０のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶出することによって、６０ｇのシリカゲルカラムで精製した。ＴＬＣ分析後に画分をプールした。（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）、減圧下で濃縮して、５．１ｇ（収率９３％）のＡＴＸ－２３２－５を黄色油として得た。ＥＬＳＤ Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ ８０：２０～２０：８０Ａ／Ｂ ３．５分）：ＲＴ ２．８１分、ｍ／ｚ（計算値）６３８．５８、（実測値）６６１．５５（Ｍ＋Ｎａ）；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－脂質－２３０－２：（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ ４．９３－４．８３（ｍ，１Ｈ），４．００－３．９８（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），３．６６－３．６２（ｍ，１２Ｈ），２．５０－２．４６（ｍ，４Ｈ），２．６４－２．６９（ｍ，４Ｈ），１．８８－１．８５（ｍ，６Ｈ），１．９５－１．８５（ｍ，４Ｈ），１．５８－１．５２（ｍ，７Ｈ），１．４７－１．４４（ｍ，４４Ｈ），０．９６－０．８８（ｍ，１２Ｈ）．

【0309】

ＡＴＸ－２３２の合成

【化72】

【0310】

不活性窒素雰囲気でパージ及び維持した１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ＤＣＭ（８０ｍＬ、１５Ｖ）中のＡＴＸ－２３２－５（５．１ｇ、１．０当量）を室温で入れた。これに続いて、ＡＴＸ－２３２－７（１．６ｇ、１．２当量）及びＤＭＡＰ（０．２１ｇ、０．２当量）を室温で添加し、次いで、ＥＤＣＩ（１．９２ｇ、１．２当量）を０℃で添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、氷水（２５ｍＬ、５Ｖ）を添加することによって、反応をクエンチした。得られた溶液をＤＣＭ（３＊８０ｍＬ、５０Ｖ）で抽出し、有機層を合わせた。有機層をブライン（２＊１００ｍＬ、４０Ｖ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗混合物を、１１ｇのシリカゲル（タイプ：ＺＣＸ－２、１００～２００メッシュ、２．００ｗ／ｗ．）に吸着させ、１００：０～９０：１０のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶出することによって、６０ｇのシリカゲルカラムで精製した。ＴＬＣ分析後に画分をプールした。（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）、減圧下で濃縮して、１．１ｇ（収率１８．３％）のＡＴＸ－２３２を黄色油として得た。ＬＣ－ＭＳ－ＰＨ－ＡＲＣ－ＡＴＸ－２３２－０：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：７５２［Ｍ＋１］^＋；Ｈ－ＮＭＲ－ＰＨ－ＡＲＣ－ＡＴＸ－２３２－０：（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：δ ４．９９７－４．８５８（ｍ，２Ｈ），３．９８３（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３８６－２．２６１（ｍ，６Ｈ），２．２６１（ｓ，６Ｈ），１．８２３（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７９９－１．５１２（ｍ，１３Ｈ），１．２８９（ｓ，４６Ｈ），０．９２２－０．８８２（ｍ，１２Ｈ）。

【0311】

実施例１０．本発明の化合物の生物学的データ
本開示の脂質の有効性を評価するために、様々なアッセイを実施した。これらのアッセイの説明が後に続く。

【0312】

第ＶＩＩ因子ノックダウン評価のためのプロトコル
以下に更に説明されるＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡを含む脂質製剤を、本実施例のプロトコルを使用してノックダウン活性について評価した。ＦＶＩＩ評価では、７～８週齢のメスのＢａｌｂ／ＣマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。マウスを病原体のない環境で保持し、マウスが関与する全ての手順を、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって確立されたガイドラインに従って行った。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子を、１０ｍＬ／ｋｇの用量体積及び２つの用量レベル（０．０３ｍｇ／ｋｇ及び０．０１ｍｇ／ｋｇ）で静脈内投与した。４８時間後、マウスをイソフルランで麻酔し、０．１０９Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でコーティングされたＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブに後眼窩から採血し、血漿に処理した。血漿標本を、第ＶＩＩ因子レベルについて直ちに試験するか、又は後の分析のために－８０℃で保存した。血漿中のＦＶＩＩタンパク質の測定を、比色分析Ｂｉｏｐｈｅｎ ＶＩＩアッセイキット（Ａｎｉａｒａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ＵＳＡ）を使用して決定した。吸光度を４０５ｎｍで測定し、連続希釈した対照血漿を使用して較正曲線を生成し、生理食塩水で処置した対照動物と比較して、処置した動物からの血漿中の第ＶＩＩ因子のレベルを決定した。

【0313】

ｈＥＰＯ ｍＲＮＡ発現評価のためのプロトコル
以下のｈＥＰＯ ｍＲＮＡを含む脂質製剤を、本実施例のプロトコルに従ってインビボでｈＥＰＯを発現する能力について評価した。全ての動物実験は、機関が承認したプロトコル（ＩＡＣＵＣ）を使用して実施された。このプロトコルでは、少なくとも６～８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスに、ｈＥＰＯ－ＬＮＰを、２つの用量レベルのｈＥＰＯ（０．１及び０．０３ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つを用いて、尾静脈を介して静脈内注射した。６時間後、血清分離チューブで血液を採取し、遠心分離によって血清を単離した。次いで、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＤ）を使用して血清ｈＥＰＯレベルを測定した。

【0314】

マウス血漿安定性
脂質ストック溶液を、５ｍｇ／ｍＬの濃度のイソプロパノール中の脂質の溶解によって調製した。次いで、必要な体積の脂質－イソプロパノール溶液を、５０：５０（ｖ／ｖ）エタノール／水中で１．０ｍＬの総体積において１００μＭの濃度に希釈した。３７℃に予め加温し、磁気撹拌棒で５０ｒｐｍにおいて撹拌した１．０ｍＬのマウス血漿（ＢｉｏＩＶＴ、カタログ番号：ＭＳＥ００ＰＬＮＨＵＮＮ、ＣＤ－１マウス、抗凝固剤：ヘパリンナトリウム、濾過せず）に、この１００μＭ溶液の１０マイクロリットルを添加した。したがって、血漿中の脂質の開始濃度は、１μＭであった。０、１５、３０、４５、６０、及び１２０分の時点で、０．１ｍＬの血漿を反応混合物から取り出し、１μｇ／ｍＬの選択された内部標準脂質を添加した０．９ｍＬの氷冷４：１（ｖ／ｖ）アセトニトリル／メタノールを添加することによって、タンパク質を沈殿させた。０．４５ミクロンの９６ウェル濾過プレートを通して濾過した後、濾液を、ＬＣ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＶａｎｑｕｉｓｈ ＵＨＰＬＣ－ＬＴＱ ＸＬ ｌｉｎｅａｒ ｉｏｎ ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８ ２．５μｍ（２．１×１００ｍｍ）カラムによって、その一致するガードカラムを用いて分析した。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸であり、移動相Ｂは、１：１（ｖ／ｖ）アセトニトリル／メタノール中の０．１％ギ酸であった。流量は、０．５分／分であった。溶出勾配は、時間０～１分：１０％Ｂ、１～６分：１０％～９５％Ｂ、６～８．５分：９５％Ｂ、８．５～９分：９５％～１０％Ｂ、９～１０分：１０％Ｂであった。質量分析は、６００～１１００ｍ／ｚのポジティブスキャンモードであった。脂質の分子イオンのピークを、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して抽出イオンクロマトグラフィー（ＸＩＣ）に組み込んだ。Ｔ＝０と比較した相対ピーク面積を、内部標準のピーク面積による正規化後、各時点で残存する脂質の割合として使用した。Ｔ_１／２値を、一次減衰モデルを使用して計算した。

【0315】

インビボ生分解性アッセイ
インビボ生分解性アッセイを実施して、ＬＮＰ中の脂質の生分解性を評価した。簡潔に述べると、マウスに０．１又は０．０３ｍｇ／Ｋｇの用量のいずれかを注射し、２４又は４８時間後にマウス肝臓を採取した。マウス肝臓中の脂質の濃度を測定するために、肝臓試料を１～１０希釈の適切な緩衝液中で均質化し、同量の安定化血漿と混合した。次いで、試料を、内部標準でスパイクされた有機溶媒と混合して、タンパク質を沈殿させた。遠心分離後、上清を有機溶媒で更に希釈した後、ＬＣ－ＭＳによって試料を分析した。ＬＣ－ＭＳ分析では、正のエレクトロスプレーイオン化を使用し、脂質分析物及び内部標準を特異的に標的化するように、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）パラメータを設定した。較正標準を安定化血漿中で調製し、タンパク質沈殿前に同量の均質化緩衝液と混合した。既知の量の脂質を有する品質管理試料をブランク肝臓ホモジネート中で調製して、アッセイの精度及び正確さを監視した。

【表1】

【表2】

【0316】

化合物－１０１１１は、以下に示され、ＷＯ２０２１／０３０７０１の２４３ページに列挙されている。

【化73】

【0317】

以下の表３は、ＡＴＸ化合物の計算されたＬｏｇＤ（ｃＬｏｇＤ）及び計算されたｐＫａ（ｃｐＫａ）、並びに括弧内の測定されたｐＫａを示す。ｃＬｏｇＤ及びｃｐＫａ値は、ＡＣＤ Ｌａｂｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｖ１２．０によって生成される。

【表3】

【0318】

前述の発明は、理解の明確さの目的で、例示及び実例によってある程度詳細に説明されてきたが、当業者であれば、ある特定の変更及び修正が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを理解するであろう。更に、本明細書に提供される各参考文献は、各参考文献が参照により個別に組み込まれるのと同じ程度まで、その全体が参照により組み込まれる。本出願と本明細書に提供される参考文献との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先するものとする。

【国際調査報告】