▶ イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】ＰＲＡＭＥに特異的に結合する抗原結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240423BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240423BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240423BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240423BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240423BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240423BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240423BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240423BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240423BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240423BHJP
A61K 36/06 20060101ALI20240423BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240423BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 T
A61K48/00
A61K35/12
A61K35/17
A61K36/06
A61P35/00
A61P35/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023567906
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-12-22
(86)【国際出願番号】 EP2022062017
(87)【国際公開番号】W WO2022233956
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】21172351.5
(32)【優先日】2021-05-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】63/184,689
(32)【優先日】2021-05-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506258073
【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】プスツォラ，ガブリエーレ
(72)【発明者】
【氏名】ホフマン，マルティン
(72)【発明者】
【氏名】フット，マイケ
(72)【発明者】
【氏名】ブンク，ゼバスティアン
(72)【発明者】
【氏名】ウンフェルドルベン，フェリックス
(72)【発明者】
【氏名】シュヴェーベル ，フランク
(72)【発明者】
【氏名】マウラー，ドミニク
(72)【発明者】
【氏名】ヤヴォルスキ，マイケ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァークナー，クラウディア
(72)【発明者】
【氏名】シュヴェーラー．フロリアン
(72)【発明者】
【氏名】シュスター，ハイコ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA91X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB57
4C087BB65
4C087BC11
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA11
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、ＰＲＡＭＥタンパク質由来抗原に対する抗原結合タンパク質に関する。本発明は、特に、腫瘍発現抗原ＰＲＡＭＥに特異的な抗原結合タンパク質を提供し、この腫瘍抗原は、配列番号５０を含むか、またはからなり、かつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在している。本発明の抗原結合タンパク質は、特に、前記ＰＲＡＭＥペプチドに特異的に結合する新規の操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ発現がん性疾患の診断、処置、および予防に使用される。本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記抗原結合タンパク質を発現する組み換え細胞、および本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物がさらに提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなりかつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在しているＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡを含む第１のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）、または１、２、もしくは３個（好ましくは１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
適宜、前記ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列ＦＧＰＹＧＫＥ（配列番号３２）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第１のポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢを含む第２のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）、または１もしくは２個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡである）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
適宜、前記ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列ＦＱＮＴＡＶ（配列番号３６）、または１、２、３、４、５、もしくは６個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３６と異なるＣＤＲｂ２アミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第２のポリペプチドと
を含む抗原結合タンパク質。
【請求項2】
前記抗原結合タンパク質は、配列番号５０の３、５、６、７、および８位（特に３、５、および７位）からなる群から選択される少なくとも３、４、もしくは５箇所のアミノ酸位置を含むかもしくはからなる機能エピトープに特定的に結合し、好ましくは、配列番号５０のアミノ酸３、５、および７位、もしくは３、５、６、および７位、もしくは３、５、７、および８位、もしくは３、５、６、７、および８位からなるが好ましくは配列番号５０のアミノ酸１および４位からならない機能エピトープに特異的に結合するか、または
配列番号５０の１、３、４、５、６、７、および８位からなる群から選択される少なくとも６もしくは７箇所のアミノ酸位置を含むかもしくはからなる機能エピトープに特異的に結合する、
請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項3】
前記抗原結合タンパク質は、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＴＭＥＤ９－００１（配列番号５１）、ＣＡＴ－００１（配列番号５２）、ＤＤＸ６０Ｌ－００１（配列番号５３）、ＬＲＲＣ７０－００１（配列番号５４）、ＰＴＰＬＢ－００１（配列番号５５）、ＨＤＡＣ５－００１（配列番号５６）、ＶＰＳ１３Ｂ－００２（配列番号５７）、ＺＮＦ３１８－００１（配列番号５８）、ＣＣＤＣ５１－００１（配列番号５９）、ＩＦＴ１７－００３（配列番号６０）、ＤＩＡＰＨ１－００４（配列番号６２）、ＦＡＤＳ２－００１（配列番号６３）、ＦＲＹＬ－００３（配列番号６４）、ＧＩＭＡＰ８－００１（配列番号６５）、ＨＳＦ１－００１（配列番号６６）、ＫＮＴ－００１（配列番号６７）、ＭＡＵ－００１（配列番号６８）、ＭＣＭ４－００１（配列番号６９）、ＭＰＰＥ１－００１（配列番号７１）、ＭＹＯ１Ｂ－００２（配列番号７２）、ＰＲＲ１２－００１（配列番号７３）、ＰＴＲＦ－００３（配列番号７４）、ＲＡＳＧＲＰ１－００１（配列番号７５）、ＳＭＡＲＣＤ１－００１（配列番号７６）、ＴＧＭ２－００１（配列番号７７）、ＶＡＶ１－００１（配列番号７８）、ＶＩＭ－００９（配列番号３１７）、ＦＡＲＳＡ－００１（配列番号３０６）、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３（配列番号３０４）、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２（配列番号３０５）、ＧＰＲ５６－００２（配列番号３０７）、ＩＧＨＤ－００２（配列番号３０８）、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２（配列番号３０９）、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５（配列番号３１０）、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８（配列番号３１１）、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７（配列番号３１２）、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８（配列番号３１３）、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５（配列番号３１４）、ＰＤＣＤ１０－００４（配列番号３１５）、ＴＳＮ－００１（配列番号３１６）、ＡＲＭＣ９－００２（配列番号１８７）、ＣＬＩ－００１（配列番号１８８）、ＣＯＰＧ１－００１（配列番号１９０）、ＣＯＰＳ７Ａ－００１（配列番号１９２）、ＥＩＦ－００９（配列番号１９４）、ＥＸＴ２－００６（配列番号１９６）、ＬＭＮＡ－００１（配列番号１９８）、ＰＫＭ－００５（配列番号２００）、ＰＳＭＢ３－００２（配列番号２０２）、ＲＰＬ－００７（配列番号２０４）、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３（配列番号２０６）、ＳＹＮＥ１－００２（配列番号２０８）、ＴＧＭ２－００２（配列番号２１０）、およびＴＰＲ－００４（配列番号２１２）からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０個、または全ての類似ペプチドに有意に結合せず、好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＩＦＴ１７－００３（配列番号６０）に有意に結合しない、請求項１または２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項4】
前記抗原結合タンパク質は、多重特異性であり、例えば、四重特異性、三重特異性、または二重特異性であり、好ましくは二重特異性であり、特に、前記抗原結合タンパク質は、二重特異性ＴＣＲ、二重特異性抗体、または二重特異性ＴＣＲ抗体分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項5】
－ 前記第１および前記第２のポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖もしくは２つのポリペプチド鎖に含まれており、好ましくは、ＶＡは、第１のポリペプチド鎖に含まれており、かつＶＢは、第２のポリペプチド鎖に含まれており；ならびに／または－ 前記可変ドメインＶＡは、ＶαドメインもしくはＶγドメインであり、かつ前記可変ドメインＶＢは、ＶβドメインもしくはＶδドメインである、
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項6】
ＶＡは、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、－ ＦＲ１－ａは、配列番号３４５もしくは配列番号３４６のアミノ酸配列、または配列番号３４５と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、２０位でＫもしくはＮを含み、より好ましくはＫを含み、および／または２位でＬもしくはＭを含み、より好ましくはＬを含み；
－ ＦＲ２－ａは、配列番号３４７もしくは配列番号３４８のアミノ酸配列、または配列番号３４７と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、３９位でＬ、Ｉ、もしくはＭを含み、より好ましくはＬもしくはＩを含み、４７位でＡもしくはＤを含み、より好ましくはＡを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、および／または５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み；
－ ＦＲ３－ａは、配列番号３４９のアミノ酸配列、または配列番号３４９と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、９２位でＴもしくはＫを含み、より好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ａは、配列番号３５０のアミノ酸配列、または配列番号３５０と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり；
ＶＢは、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、
－ ＦＲ１－ｂは、配列番号３５１もしくは配列番号３５２のアミノ酸配列、または配列番号３５１と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、１０位でＨもしくはＮを含み、より好ましくはＨを含み、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、および／または２２位でＲもしくはＨを含み；
－ ＦＲ２－ｂは、配列番号３５３のアミノ酸配列、または配列番号３５３と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、４３位でＲもしくはＫを含み、より好ましくはＲを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＭもしくはＰを含み、より好ましくはＰを含み、および／または４８位でＲもしくはＱを含み、より好ましくはＱを含み；
－ ＦＲ３－ｂは、配列番号３５４もしくは配列番号３５５のアミノ酸配列、または配列番号３５４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、８４位で、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤまたはＡを含み、さらにより好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ｂは、配列番号３５６のアミノ酸配列、または配列番号３５６と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項7】
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列、または配列番号１３２と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３３、配列番号３４、または配列番号９のＣＤＲａ３を含み、さらに、２０位でＫもしくはＮを含み、好ましくはＫを含み、３９位でＬ、Ｍ、もしくはＩを含み、好ましくはＬもしくはＩを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み、９２位でＴもしくはＫを含み、好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み、特に、ＶＡは、配列番号１３２、配列番号１２９、配列番号１３７、または配列番号１４２のアミノ酸を含むか、またはからなり；－ ＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号３６のＣＤＲｂ２、および配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３を含み、さらに、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、２２位でＲもしくはＨを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＰもしくはＭを含み、好ましくはＰを含み、４８位でＱもしくはＲを含み、好ましくはＱを含み、および／または８４位でＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含み、好ましくはＤもしくはＡを含み、特に、ＶＢは、配列番号１３４、配列番号１３０、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、または配列番号１４８のアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項8】
抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をさらに含み、好ましくはＶＬおよびＶＨは、ＣＤ２、ＣＤ３、特に、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および／もしくはＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲ１、ＴＣＲα／βおよびＴＣＲγ／δ、ＨＬＡ－ＤＲ、ならびに４－１ ＢＢ、またはこれらの組合せからなる群から選択される抗原に結合し、ならびに／またはエフェクター細胞に結合し、特に、Ｔ細胞もしくはナチュラルキラー細胞に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項9】
前記抗原結合タンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、前記第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉａ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｄ１－Ｌ２－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉａ］
により表され、
前記第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩａ］
Ｖ３－Ｌ４－Ｄ３－Ｌ５－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩａ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、可変ドメインであり、Ｖ１～Ｖ４の内の１つは、ＶＡであり、１つは、ＶＢであり、１つはＶＬであり、かつ１つはＶＨであり；
－ Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４は、二量体化ドメインであり、かつ存在してもよいし存在していなくてもよく、Ｄ１およびＤ３、ならびにＤ２およびＤ４は、互いに特異的に結合し、Ｄ１およびＤ３またはＤ２およびＤ４の内の少なくとも１対は、存在しており、
－ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ１およびＬ４は、存在しており、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ６は、存在してもよいし存在していなくてもよい、
請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項10】
－ 配列番号１００、１０３、１０５、１０６、１１１、１２２、１２６、１２８、１５１、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６６、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８３、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２８５、２９１、２９５、２９９、および３０３から選択される第１のポリペプチド鎖、ならびに－ 配列番号１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１９、１２１、１３１、１３３、１４３、１５２、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１８２、１８４、１８５、１８６、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８２、２８４、２９６、または３００から選択される第２のポリペプチド鎖
を含む請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードする配列を含む単離核酸。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、または請求項１１に記載の核酸、または請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、リンパ球であり、好ましくは、Ｔリンパ球もしくはＴリンパ球前駆細胞、または組み換え発現用の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくは酵母細胞である、宿主細胞。
【請求項14】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項１１に記載の核酸、請求項１２に記載のベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を製造する方法であって、ａ．宿主細胞を準備すること、
ｂ．請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含む遺伝子コンストラクトを準備すること、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記宿主細胞に導入すること、および
ｄ．前記宿主細胞により前記遺伝子コンストラクトを発現させること
を含み、
ｅ．適宜、前記宿主細胞からの前記抗原結合タンパク質の単離および精製、ならびに適宜、Ｔ細胞中での前記抗原結合タンパク質の再構築
をさらに含む方法。
【請求項16】
医薬での使用のための、特に、増殖性疾患、例えば、がんの診断、予防、および／または処置での使用のためのものであり、前記がんは、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮および子宮内膜がん、骨肉腫、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、ならびに滑膜肉腫からなるがんの群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項１１に記載の核酸、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、または請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＰＲＡＭＥタンパク質由来抗原に対する抗原結合タンパク質に関する。本発明は、特に、腫瘍により発現された抗原ＰＲＡＭＥに特異的な抗原結合タンパク質を提供し、この腫瘍抗原は、配列番号５０を含むか、またはからなり、かつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在している。本発明の抗原結合タンパク質は、特に、前記ＰＲＡＭＥペプチドに特異的に結合する新規の操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ発現がん性疾患の診断、処置、および予防で使用される。本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、抗原結合タンパク質を発現する組み換え細胞、および本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物がさらに提供される。
【背景技術】
【0002】
ＰＲＡＭＥは、「黒色腫中において優先的に発現された抗原（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ）」を指しており、がん精巣抗原として既知の生殖細胞系列によりコードされた抗原のファミリーに属する。がん精巣抗原は、免疫療法介入の標的である。ＰＲＡＭＥは、多くの固形腫瘍、ならびに白血病およびリンパ腫で発現されている。ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）は、ＰＲＡＭＥ－００４とも称され、完全長ＰＲＡＭＥタンパク質（配列番号３２８）のアミノ酸４２５～４３３に対応しており、前記ペプチドは、ＭＨＣ分子（特に、ＨＬＡ－Ａ＊０２）との複合体で細胞表面上に提示される（Kessler et al., J Exp Med. 2001 Jan 1 ;193(1 ):73-88）。ＭＨＣ分子により提示されるペプチドエピトープに、ＴＣＲが結合し得る。
【0003】
がん治療のための分子標的薬の開発が進歩しているが、当該技術分野では、依然として、がん細胞に対して非常に特異的であるが正常な組織細胞には特異的ではない分子を特異的に標的とする新規の抗癌剤を開発することが必要とされている。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドは、腫瘍上で特異的に発現されることから、Ｔ細胞ベースの免疫療法の標的である。
【0004】
国際公開第２０１８／１７２５３３号パンフレットでは、ＭＨＣタンパク質複合体との複合体中のＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに結合するＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３）、ならびにＰＲＡＭＥを（過剰に）発現するがん性疾患の診断、処置、および予防での前記ＴＣＲの使用が開示されている。しかしながら、このＴＣＲは、高い親和性で標的抗原に結合するようにＣＤＲ領域が設計されていない。
【0005】
ネイティブＴＣＲは、典型的には低い親和性（ＫＤ＝３００μＭ～１μＭ）で、ＭＨＣ提示抗原に結合し、そのため、ＴＣＲ結合親和性が１～１０μＭの範囲で十分に確立されているウイルス外来抗原とは対照的に、１０μＭを超える親和性でＭＴＨＣ提示がん自己抗原への結合が観察されることは稀である（Aleksic et al. 2012, Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9）。この現象の説明の一部は、下記である：胸腺で発達するＴ細胞が自己ペプチド－ＭＨＣリガンド上で負に選択され、そのため、そのような自己ペプチド－ＭＨＣに対する親和性が過剰に高いＴ細胞が除去される（寛容誘導）。がん自己抗原に対するＴＣＲのこの低い親和性は、腫瘍免疫回避に関する１つの可能性のある説明であり得る（Aleksic et al. 2012, Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9）。従って、養子細胞療法（ＡＣＴ）における抗原認識コンストラクトとしての使用のために、がん自己抗原に、より高い親和性で結合するＴＣＲ変異体を設計することは望ましい戦略であると思われる。さらに、可溶性タンパク質として発現され得る高親和性ＴＣＲ変異体の設計は、可溶性治療薬により（即ち、二重特異性分子を使用して）がん自己抗原を標的とするために望まれているだろう（Hickman et al. 2016, J Biomol Screen. 2016 Sep;21(8):769-85）。
【0006】
しかしながら、ＴＣＲの親和性の増加により、副作用のリスクも増加する場合がある。上述したように、自然界では、自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する高親和性ＴＣＲは、交差反応性による、正常組織上に存在する自己ペプチドの認識を回避するために、胸腺選択により排除されている。従って、ＴＣＲの標的配列に対する親和性を単に増加させるだけでは、がん特異的ではない類似ペプチドに対する親和性も増加する可能性があり、従って、交差反応性、および健康な組織に対する望ましくない細胞傷害効果のリスクが増加する。これは単なる理論上のリスクではないことが、ＭＡＧＥ－Ａ３を標的とする操作されたＴＣＲに関して痛切に見出されている。特に、既に公開された結果では、２例の患者において致死性毒性が示されており、これらの患者には、前臨床試験では交差反応性が予測されていなかったにもかかわらず、筋肉タンパク質タイチン由来のペプチドと交差反応する、ＭＡＧＥ－Ａ３を標的とするＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞が注入されていた（Linette GP et al. Blood 2013; 122:863-71, Cameron BJ, et al. Sci. Transl. Med. 2013; 5: 197-103）。これらの患者は、ＴＣＲ操作Ｔ細胞が重篤で予測不可能なオフターゲットのおよび臓器特異的な毒性を有する可能性があることを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
従って、より高い親和性で標的に特異的に結合し、そのため標的抗原ペプチドの発現が低下している腫瘍細胞または細胞株であっても標的とし得、同時に、潜在的なオフターゲットペプチド（「類似ペプチド」または「ＳｉｍＰｅｐｓ」とも称される）との低いまたは低下した交差反応性に起因して、高い安全性プロファルが維持されている、抗原結合タンパク質を開発して提供するという未だ対処されていない医療ニーズが存在している。そのような抗原結合タンパク質はまた、理想的には、良好な代謝および／または薬物動態プロファイルも有しているべきであり、かつ工業的実施に適合した大規模での製造に適しているべきである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
従って、本発明者らは、親ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３に由来するＣＤＲ変異体を含むＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに特異的な抗原結合タンパク質を設計した。本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合親和性が増加しており、安定性が増加しており（例えば、発現および／もしくは精製中の凝集が低下しており）、ならびに／または溶解性が増加しており、そのため、医療用途により適している。
【0009】
さらに、本発明の抗原結合タンパク質（特に、二重特異性Ｔ細胞エンゲージング受容体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＣＥＲ（登録商標））は、ＰＲＡＭＥ－００４陽性腫瘍細胞（例えば、細胞株Ｈｓ６９５ＴおよびＵ２ＯＳ細胞）に対して高い細胞傷害性を発揮し、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、１～１０００ｐＭである。ＥＣ５０は、ＰＲＡＭＥ－００４陰性腫瘍細胞（例えば、細胞株Ｔ９８Ｇ）の場合と比べて１００倍高く、好ましくは１０００倍超高く、このことは、本発明の抗原結合タンパク質の安定性の増加を示している。
【0010】
さらに、本発明者らは、本発明の抗原結合タンパク質の治療用インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）マウスモデルにおいて、低用量で有意な腫瘍増殖阻害を示した。
【0011】
要約すると、本発明者らの驚くべき発見は、特に当該技術分野を超える下記の利点を提供する：（ｉ）高い腫瘍選択性を維持しつつ標的ペプチドに対する親和性の増加；（ｉｉ）オフターゲットおよびオフ腫瘍の細胞傷害性の減少ならびに安全性プロファイルの全体的な改善をもたらす特異性の増加／交差反応性の減少；（ｉｉｉ）安定性の増加；（ｉｖ）大規模製造に好適な発現収量および溶解性の改善；ならびに（ｖ）免疫原性の減少を有する抗原結合分子の提供。
【0012】
第１の態様では、本発明は、配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなりかつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在しているＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡを含む第１のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）、または１、２、もしくは３個（好ましくは１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第１のポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢを含む第２のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）、または１もしくは２個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡである）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第２のポリペプチドと
を含む抗原結合タンパク質に関する。
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡを含む第１のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）、または１、２、もしくは３個（好ましくは１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第１のポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢを含む第２のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）、または１もしくは２個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡである）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第２のポリペプチドと
を含む抗原結合タンパク質に関する。
【0013】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質をコードする配列を含む単離核酸に関する。
【0014】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の核酸を含むベクターに関する。
【0015】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質、第２の態様の核酸、または第３の態様のベクターを含む宿主細胞に関する。
【0016】
第５の態様では、本発明は、第１の態様の抗原結合タンパク質、第２の態様の核酸、第３の態様のベクター、または第４の態様の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【0017】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）宿主細胞を準備すること、
（ｂ）本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含む遺伝子コンストラクトを準備すること、
（ｃ）前記遺伝子コンストラクトを前記宿主細胞に導入すること、および
（ｄ）前記宿主細胞により前記遺伝子コンストラクトを発現させること
を含む方法に関する。
（ａ）宿主細胞を準備すること、
（ｂ）本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含む遺伝子コンストラクトを準備すること、
（ｃ）前記遺伝子コンストラクトを前記宿主細胞に導入すること、および
（ｄ）前記宿主細胞により前記遺伝子コンストラクトを発現させること
を含む方法に関する。
【0018】
第７の態様では、本発明は、医薬での使用（特に、増殖性疾患の診断、予防、および／または処置での使用）のための第１の態様の抗原結合タンパク質、第２の態様の核酸、第３の態様のベクター、第４の態様の宿主細胞、または第５の態様の医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】酵母表面提示によるＴＣＲの安定化ｓｃＴＣＲへの変換。形質転換されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００の表面上で提示されたｓｃＴＣＲ分子を、抗Ｍｙｃ－ＦＩＴＣ抗体で染色して発現レベルを決定し、ＰＥ標識されたＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４四量体で染色して機能的結合を調べた。非改変ｓｃＴＣＲ Ｐ１１Ｐ３Ｄ３（左側のパネル、配列番号５）を、ｓｃＴＣＲライブラリの選択から得られた、ＣＤＲ中に９つの安定化フレームワーク突然変異および３つの単一点突然変異を保有するＲ１１Ｐ１Ｄ３＿安定化ｓｃＴＣＲ変異体（右側のパネル、配列番号６）と比較する。
【図2】酵母表面提示によるｓｃＴＣＲ ＣＤＲ１アルファの親和性突然変異。非改変および成熟ＣＤＲ１アルファを含む安定化ｓｃＴＣＲを、１０ｎＭの濃度にてＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体で染色した。ＰＲＡＭＥ－００４（配列番号５０）に対する配列類似性が高いペプチド（配列番号５１～５９）を含むＨＬＡ－Ａ＊０２／ＳｉｍＰｅｐ四量体の混合物（それぞれ、１０ｎＭの濃度で適用される）によるカウンター染色。非改変アルファ鎖ＣＤＲ１配列ＳＳＮＦＹＮ（配列番号１３；右下のパネル）を有する安定化ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤ（配列番号６）を、親和性成熟アルファ鎖ＣＤＲ１配列ＶＫＥＦＱＤ、ＮＫＥＦＱＤ、ＴＲＥＦＱＤ、ＮＲＥＦＱＤ、ＴＳＥＦＱＤ、ＴＫＥＦＱＤ、ＶＲＥＦＱＤ、ＴＡＥＦＱＤ、ＶＳＥＦＱＤ、ＶＡＥＦＱＤ、ＩＫＥＦＱＮ、ＶＲＥＦＱＮ、およびＴＡＥＦＱＮ（配列番号１６～２８）それぞれを含むｓｃＴＣＲ変異体と比較する。ＳＳＮＦＹＮ（配列番号１３）は、安定化ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤの対応するＣＤＲａ１配列である。
【図3】類似ペプチドへの高親和性ｓｃＴＣＲ酵母クローンの結合。成熟ＣＤＲを有する安定化ｓｃＴＣＲ（配列番号７９～８７および８９～９２）を保有する酵母クローンを、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドまたは７種の類似ペプチド（配列番号５２～５６および５８～５９）の内の１つを含む１００ｎＭ ＨＬＡ－Ａ＊０２単量体で染色した。
【図4】類似ペプチドへの高親和性ｓｃＴＣＲ酵母クローンの結合。成熟ＣＤＲを有する安定化ｓｃＴＣＲ（配列番号７９～８７および８９～９２）を保有する酵母クローンを、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドまたは１９種の類似ペプチド（配列番号５１、５７、６０、６２～６９、および７１～７８）の内の１つを含む１００ｎＭ ＨＬＡ－Ａ＊０２単量体で染色した。参照としてＲ１６Ｐ１Ｃ１０＿ＣＤＲ６＿ｓｃＴＣＲ（配列番号３５７）を加えたが、このクローンに関しては、ＰＲＡＭＥ－００４およびＩＦＴ１７－００３（配列番号６０）への結合のみを評価した。
【図5-1】高親和性ｓｃＴＣＲ酵母クローンによる結合モチーフの決定。成熟ＣＤＲを有する安定化ｓｃＴＣＲ（配列番号７９、８０、８２、８３、および８５～８７）を保有する酵母クローンを、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、および０．３ｎＭの濃度でのＨＬＡ－Ａ＊０２の適用下で、ＰＲＡＭＥ－００４、およびアラニン置換を含むＰＲＡＭＥ－００４ペプチド変異体（配列番号３１８～３２４）で染色した。
【図5-2】高親和性ｓｃＴＣＲ酵母クローンによる結合モチーフの決定。成熟ＣＤＲを有する安定化ｓｃＴＣＲ（配列番号７９、８０、８２、８３、および８５～８７）を保有する酵母クローンを、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、および０．３ｎＭの濃度でのＨＬＡ－Ａ＊０２の適用下で、ＰＲＡＭＥ－００４、およびアラニン置換を含むＰＲＡＭＥ－００４ペプチド変異体（配列番号３１８～３２４）で染色した。
【図6-1】可溶性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子に関する類似ペプチドのスクリーニング。ＨＬＡ－Ａ＊０２に関連する１４種の類似ペプチド（配列番号１８７、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、および２１２）への結合を、生体層干渉法を使用して、１μＭ ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂの濃度で分析した。各グラフでの上部の曲線は、標的ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体へのｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ結合を表す。
【図6-2】可溶性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子に関する類似ペプチドのスクリーニング。ＨＬＡ－Ａ＊０２に関連する１４種の類似ペプチド（配列番号１８７、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、および２１２）への結合を、生体層干渉法を使用して、１μＭ ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂの濃度で分析した。各グラフでの上部の曲線は、標的ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体へのｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ結合を表す。
【図7】標的陽性腫瘍細胞株および標的陰性腫瘍細胞株に対するＴＣＥＲ（登録商標）分子のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞傷害性。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナー由来のＰＢＭＣを、標的陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ（●）、または標的陰性であるがＨＬＡ－Ａ＊０２陽性の腫瘍細胞株Ｔ９８Ｇ（○）それぞれと共に、ＴＣＥＲ（登録商標）の濃度を増加させつつ１：１０の比でインキュベートした。ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された細胞傷害性を、放出されたＬＤＨの測定により、共培養の４８時間後に定量した。ＴＰＰ－９３およびＴＰＰ－７９を評価する実験の結果を、それぞれ、下部および上部のパネルに示す。
【図8】標的陽性腫瘍細胞株および標的陰性腫瘍細胞株に対するＴＣＥＲ（登録商標）分子ＴＰＰ－１０５のインビトロ細胞傷害性。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナー由来のＰＢＭＣを、標的陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ（●）、または標的陰性であるがＨＬＡ－Ａ＊０２陽性の腫瘍細胞株Ｔ９８Ｇ（○）それぞれと共に、ＴＰＰ－１０５の濃度を増加させつつ１：１０の比でインキュベートした。ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された細胞傷害性を、放出されたＬＤＨの測定により、共培養の４８時間後に定量した。
【図9】ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ分子の細胞傷害性データの概要。ＬＤＨ放出アッセイで得られる用量反応曲線のＥＣ５０値を、非線形４点曲線フィッティングを利用して算出した。それぞれ評価されたＴＣＥＲ（登録商標）分子に関して、標的陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ（●）、Ｕ２０Ｓ（○）、および標的陰性であるがＨＬＡ－Ａ＊０２陽性の腫瘍細胞株Ｔ９８Ｇ（＊）に対して算出されたＥＣ５０値が描かれている。従って、各記号は、様々なＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナーに由来するＰＢＭＣを利用する１つのアッセイを表す。ＴＰＰ－８７１／Ｔ９８Ｇに関しては、Ｔ９８ＧがＴＰＰ－８７１により認識されなかったことから、ＥＣ５０は推定値である。
【図10-1】様々な濃度の標的ペプチドが負荷されたＴ２細胞に対するＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体のインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、上清中に放出されたＬＤＨを定量することにより決定した。エフェクター細胞として、ヒトＰＢＭＣを５：１のＥ：Ｔ比で使用した。読み取りを、４８時間後に実施した。
【図10-2】様々な濃度の標的ペプチドが負荷されたＴ２細胞に対するＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体のインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、上清中に放出されたＬＤＨを定量することにより決定した。エフェクター細胞として、ヒトＰＢＭＣを５：１のＥ：Ｔ比で使用した。読み取りを、４８時間後に実施した。
【図10-3】様々な濃度の標的ペプチドが負荷されたＴ２細胞に対するＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体のインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、上清中に放出されたＬＤＨを定量することにより決定した。エフェクター細胞として、ヒトＰＢＭＣを５：１のＥ：Ｔ比で使用した。読み取りを、４８時間後に実施した。
【図11-1】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している５つの異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（４、１０ａ、または１３ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図11-2】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している５つの異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（４、１０ａ、または１３ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図11-3】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している５つの異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（４、１０ａ、または１３ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図12-1】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している１０個の異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（３、４、８ａ、１０ａ、１３ａ、または１６ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図12-2】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している１０個の異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（３、４、８ａ、１０ａ、１３ａ、または１６ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図12-3】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している１０個の異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（３、４、８ａ、１０ａ、１３ａ、または１６ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図12-4】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している１０個の異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（３、４、８ａ、１０ａ、１３ａ、または１６ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図12-5】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している１０個の異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（３、４、８ａ、１０ａ、１３ａ、または１６ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養したか、またはＴ細胞培地のみ中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図13-1】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している６つの異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（１０ａ、１３ａ、または１６ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【図13-2】選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体に関する正常組織細胞安全性分析。ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現している６つの異なる正常組織細胞タイプに対するＴＣＥＲ（登録商標）媒介性細胞傷害性を、ＰＲＡＭＥ－００４陽性Ｈｓ６９５Ｔ腫瘍細胞に対する細胞傷害性と比較して評価した。健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣを、正常組織細胞またはＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞（３重）と１０：１の比で、それぞれの正常組織細胞培地（１０ａ、１３ａ、または１６ａ）およびＴ細胞培地（ＬＤＨ－ＡＭ）の１：１混合物中で共培養した。４８時間後、正常組織細胞およびＨｓ６９５Ｔ細胞の溶解を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した（ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【発明を実施するための形態】
【0020】
定義
「ＰＲＡＭＥ」または（黒色腫中において優先的に発現された抗原」は、最初は、黒色腫中において過剰発現されている抗原として同定された［Ikeda et al Immunity. 1997 Feb;6(2): 199-208］；これは、ＣＴ１３０、ＭＡＰＥ、ＯＩＰ－４としても既知であり、かつＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ７８３９５（２０１９年１月１１日時に利用可能）を有する。このタンパク質は、レチノイン酸受容体シグナル伝達の受容体として機能する［Epping et al., Cell. 2005 Sep 23; 122(6):835-47］。ＰＲＡＭＥは、がん精巣抗原として既知の生殖細胞系によりコードされる抗原のファミリーに属する。がん精巣抗原は、典型的には正常な成人組織では発現が限定されているかまたは発現されていないことから、免疫療法介入の魅力的な標的である。ＰＲＡＭＥは、多くの固形腫瘍、ならびに白血病およびリンパ腫で発現されている［Doolan et al., Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65；Epping et al., Cancer Res. 2006 Nov 15;66(22): 10639-42；Ercolak et al., Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65；Matsushita et al., Leuk Lymphoma. 2003 Mar;44(3):439-44；Mitsuhashi et al., Int. J Hematol. 2014; 100(1 ):88-95；Proto-Sequeire et al., Leuk Res. 2006 Nov;30(11): 1333-9；Szczepanski et al., Oral Oncol. 2013 Feb;49(2): 144-51；Van Baren et al., Br J Haematol. 1998 Sep; 102(5): 1376-9］。本発明のＰＲＡＭＥ標的化療法は、下記が挙げられるがこれらに限定されないがんの処置に特に好適であり得る：急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、神経膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮がんおよび子宮内膜がん、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、骨肉腫および滑膜肉腫、好ましくは、乳がん、胆管細胞癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞がん、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮がんおよび子宮内膜がん、ならびに滑膜肉腫。
「ＰＲＡＭＥ」または（黒色腫中において優先的に発現された抗原」は、最初は、黒色腫中において過剰発現されている抗原として同定された［Ikeda et al Immunity. 1997 Feb;6(2): 199-208］；これは、ＣＴ１３０、ＭＡＰＥ、ＯＩＰ－４としても既知であり、かつＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ７８３９５（２０１９年１月１１日時に利用可能）を有する。このタンパク質は、レチノイン酸受容体シグナル伝達の受容体として機能する［Epping et al., Cell. 2005 Sep 23; 122(6):835-47］。ＰＲＡＭＥは、がん精巣抗原として既知の生殖細胞系によりコードされる抗原のファミリーに属する。がん精巣抗原は、典型的には正常な成人組織では発現が限定されているかまたは発現されていないことから、免疫療法介入の魅力的な標的である。ＰＲＡＭＥは、多くの固形腫瘍、ならびに白血病およびリンパ腫で発現されている［Doolan et al., Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65；Epping et al., Cancer Res. 2006 Nov 15;66(22): 10639-42；Ercolak et al., Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65；Matsushita et al., Leuk Lymphoma. 2003 Mar;44(3):439-44；Mitsuhashi et al., Int. J Hematol. 2014; 100(1 ):88-95；Proto-Sequeire et al., Leuk Res. 2006 Nov;30(11): 1333-9；Szczepanski et al., Oral Oncol. 2013 Feb;49(2): 144-51；Van Baren et al., Br J Haematol. 1998 Sep; 102(5): 1376-9］。本発明のＰＲＡＭＥ標的化療法は、下記が挙げられるがこれらに限定されないがんの処置に特に好適であり得る：急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、神経膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮がんおよび子宮内膜がん、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、骨肉腫および滑膜肉腫、好ましくは、乳がん、胆管細胞癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞がん、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮がんおよび子宮内膜がん、ならびに滑膜肉腫。
【0021】
「ＰＲＡＭＥ抗原ペプチド」は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ７８３９５（２０１９年１月１１日時に利用可能）下でアクセス可能な配列番号３２８のアミノ酸配列の完全長ＰＲＡＭＥタンパク質のアミノ酸４２５～４３３に対応するアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）を含むか、またはからなる。アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）を含むかまたはからなるＰＲＡＭＥ由来のペプチドはまた、本明細書では、ＰＲＡＭＥ－００４とも称される。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドは、腫瘍関連タンパク質または腫瘍特異的タンパク質に由来するペプチドエピトープであり、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子により細胞表面上に提示される。より具体的には、ＰＲＡＭＥ－００４由来のペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体にて細胞表面上に提示される。Med. 2001 Jan 1; 193(1):73-88。本発明に関連して、「ＰＲＡＭＥ抗原ペプチド」、「ＰＲＡＭＥペプチド」、または「ＰＲＡＭＥ－００４」という用語は、互換的に使用され、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）を含むかまたはからなるペプチドを指す。好ましくは、ＰＲＡＭＥペプチドは、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬからなる。ＰＲＡＭＥペプチドが、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬに加えてさらなるアミノ酸を含む場合には、ＰＲＡＭＥペプチドの全長は１２個のアミノ酸を超えないことが好ましい。
【0022】
「抗原」または「標的抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合部位が結合可能な分子または分子もしくは複合体の部分を指しており、前記抗原結合部位は、例えば、本発明の抗体、ＴＣＲ、および／または他の抗原結合タンパク質中に存在している。本発明に関連する抗原は、配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなるＰＲＡＭＥペプチドであり、より具体的には、ＭＨＣタンパク質（例えば、ＨＬＡタンパク質、例えばＨＬＡ－Ａ＊０２）との複合体中の配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなるＰＲＡＭＥペプチドである。
【0023】
「ドメイン」は、タンパク質の任意の領域であり得、一般に、配列相同性に基づいて定義されており、特定の構造的なまたは機能的な実体と関連していることが多い。
【0024】
本発明に関連する「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」という用語は、Ｇｒｅｅｋキートポロジー（Ｇｒｅｅｋ ｋｅｙ ｔｏｐｏｌｏｇｙ）を有する２つのβ－シート中に配置された７～９個の逆並行βストランドの２層サンドイッチからなるタンパク質ドメインを指す。Ｉｇドメインは、おそらく、天然に存在するタンパク質中で最も頻繁に使用される「構築ブロック」である。Ｉｇドメインを含むタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および細胞接着分子を含む）に組み込まれる。Ｉｇドメインの例は、抗体およびＴＣＲの可変ドメインおよび定常ドメインである。
【0025】
本発明に関連するＶαは、ＴＣＲ α鎖の可変ドメインを指す。
【0026】
本発明に関連するＶβは、ＴＣＲ β鎖の可変ドメインを指す。
【0027】
本発明に関連するＶγは、ＴＣＲ γ鎖の可変ドメインを指す。
【0028】
本発明に関連するＶδは、ＴＣＲ δ鎖の可変ドメインを指す。
【0029】
本発明に関連するＶＡは、ＴＣＲ由来のＣＤＲ、具体的には、α鎖由来のＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ３ａ、および適宜ＣＤＲ２ａを含む可変ドメインを指す。ＣＤＲを囲む配列（即ち、フレームワーク配列）は、ＴＣＲの可変ドメインに由来し得、即ち、ＴＣＲ α鎖、β鎖、γ鎖、もしくはδ鎖の可変ドメイン、または抗体の可変ドメインに由来し得、好ましくは、ＴＣＲ α鎖の可変ドメインに由来し得る。
【0030】
本発明に関連するＶＢは、ＴＣＲ由来のＣＤＲ、具体的には、β鎖由来のＣＤＲ１ｂ、ＣＤＲ３ｂ、および適宜ＣＤＲ２ｂを含む可変ドメインを指す。ＣＤＲを囲む配列（即ち、フレームワーク配列）は、ＴＣＲの可変ドメインに由来し得、即ち、ＴＣＲ α鎖、β鎖、γ鎖、もしくはδ鎖の可変ドメイン、または抗体の可変ドメインに由来し得、好ましくは、ＴＣＲ β鎖の可変ドメインに由来し得る。
【0031】
本発明に関連するＶＬは、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
【0032】
本発明に関連するＶＨは、抗体重鎖の可変ドメインを指す。
【0033】
本発明に関連するＣＬは、抗体軽鎖の定常ドメインを指す。
【0034】
本発明に関連するＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３は、抗体重鎖（具体的にはＩｇＧ重鎖）の定常ドメインを指す。
【0035】
抗原決定基としても既知である「エピトープ」という用語は、免疫系により認識される抗原の部分のことである。本明細書で使用される場合、エピトープという用語は「構造エピトープ」および「機能エピトープ」という用語を含む。「構造エピトープ」は、抗原に結合した場合に抗原結合タンパク質によりカバーされる抗原（例えば、ペプチド－ＭＨＣ複合体）のアミノ酸である。典型的には、抗原結合タンパク質のアミノ酸の任意の原子から５Å以内に存在する抗原の全てのアミノ酸がカバーされるとみなされる。抗原の構造エピトープは、Ｘ線結晶解析またはＮＭＲ解析を含む当該技術分野で既知の方法により決定され得る。抗体の構造エピトープは、典型的には、２０～３０個のアミノ酸を含む。ＴＣＲの構造エピトープは、典型的には、２０～３０個のアミノ酸を含む。「機能エピトープ」は、構造エピトープを形成するアミノ酸のサブセットであり、非共有結合的相互作用（例えば、Ｈ－結合、塩橋、芳香族スタッキング、もしくは疎水性相互作用）を直接形成することにより、または抗原の結合立体構造を間接的に安定化させることにより、本発明の抗原結合タンパク質またはその機能的断片と界面を形成するのに重要な抗原のアミノ酸を含み、例えば、突然変異スキャニングにより決定される。本発明に関連して、機能エピトープはまた、「結合モチーフ」とも称される。典型的には、抗体が結合した抗原の機能エピトープは、４～６個のアミノ酸を含む。典型的には、ペプチド－ＭＨＣ複合体の機能エピトープは、ペプチドの２～６または７個のアミノ酸と、ＭＨＣ分子の２～７個のアミノ酸とを含む。ＭＨＣ Ｉにより提示されたペプチドは、典型的には８～１０個のアミノ酸を有することから、それぞれの所与のペプチドのアミノ酸のサブセットのみが、ペプチド－ＭＨＣ複合体の機能エピトープの一部である。エピトープ（特に、本発明の抗原結合タンパク質が結合する機能エピトープ）は、結合界面の形成に必要とされる抗原のアミノ酸を含むか、またはからなる。本発明に関連して、機能エピトープ（即ち、結合モチーフ）は、配列番号５０のＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドの少なくともアミノ酸３、５、および７を含み、好ましくはアミノ酸１および４を含まない。
【0036】
「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）は、脊椎動物において獲得免疫系が外来分子を認識するのに必須の細胞表面タンパク質のセットであり、これにより組織適合性が決定される。ＭＨＣ分子の主な機能は、病原体由来の抗原に結合し、それを細胞表面に提示して適切なＴ細胞に認識させることである。ヒトＭＨＣはまた、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体（または単にＨＬＡ）とも呼ばれる。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ペプチドとＭＨＣクラスＩとの複合体は、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つＣＤ８陽性Ｔ細胞により認識され、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体は、適切なＴＣＲを持つＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞により認識される。ＣＤ８依存性反応およびＣＤ４依存性反応は両方とも、共同して相乗的に抗腫瘍効果に寄与することから、腫瘍関連抗原および対応するＴ細胞受容体の同定およびキャラクタリゼーションは、ワクチンおよび細胞療法等のがん免疫療法の開発において重要である。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、６番染色体の短いアーム上に位置しており、ＨＬＡ－Ａの成分である大きなα鎖をコードしている。ＨＬＡ－Ａ α鎖の変異は、ＨＬＡの機能にとって重要である。この変異により、集団での遺伝子多様性が促進される。それぞれのＨＬＡは、ある特定の構造のペプチドに対する親和性が異なることから、ＨＬＡの種類が多いということは、細胞表面に「提示」される抗原の種類が多いということを意味する。本開示に関連するＭＨＣクラスＩ ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ－Ａタンパク質、ＨＬＡ－Ｂタンパク質、またはＨＬＡ－Ｃタンパク質であり得、好適にはＨＬＡ－Ａタンパク質であり得、例えばＨＬＡ－Ａ＊０２であり得る。ＭＨＣクラスＩ依存性免疫反応では、ペプチドは、腫瘍細胞により発現されるある特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合可能でなければならないだけでなく、その後に特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つＴ細胞により認識されなければならない。
【0037】
「ＭＨＣタンパク質との複合体中の抗原ペプチド」は、本明細書では、ＭＨＣ分子に非共有結合的に結合している抗原ペプチドを指す。具体的には、抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子により形成された「ペプチド結合溝」に位置している。ＭＨＣ分子と抗原ペプチドとの複合体は、本明細書では、「ペプチド－ＭＨＣ複合体」または「ｐＭＨＣ複合体」とも称される。ＰＲＡＭＥ抗原ペプチドの場合には、この複合体はまた、「ＰＲＡＭＥ抗原ペプチド－ＭＨＣ複合体」または「ＰＲＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体」とも称される。
【0038】
「ＨＬＡ－Ａ＊０２」は、特定のＨＬＡ対立遺伝子を示しており、文字Ａは、対立遺伝子を示しており、接頭辞「＊０２接頭辞」は、Ａ２血清型を示す。
【0039】
「抗原結合タンパク質」という用語は、本明細書では、抗原に特異的に結合可能な抗原結合部位を含むポリペプチドを指す。本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＣＲ由来のＣＤＲを含み、具体的には、ＴＣＲ由来のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、および適宜ＣＤＲａ２を含む可変ドメインＶＡと、ＴＣＲ由来のＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ３、および適宜ＣＤＲｂ２を含む可変ドメインＶＢとを含む。特定の実施形態では、ＶＡドメイン全体および／またはＶＢドメイン全体がＴＣＲ由来であり、そのため、ＶαドメインおよびＶβドメイン、またはＶγドメインおよびＶδドメインである。本明細書での文脈では、抗原結合タンパク質という用語は、下記で定義する複数のＴＣＲおよび抗体フォーマットを含む。ある例では、抗原結合タンパク質は、抗体の重鎖および軽鎖に移植されたＴＣＲ由来のＣＤＲ（具体的には、特許請求の範囲で定義されているＴＣＲ由来のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ３、ならびに適宜ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２）を含む。別の例では、ＴＣＲ由来のＶαドメイン全体および／またはＴＣＲ由来のＶβドメイン全体は、抗体の重鎖および軽鎖に移植されている。当業者は、そのようなコンストラクトがハイブリッド抗原結合タンパク質を表しており、このタンパク質は、ＣＤＲまたは可変ドメインが由来するＴＣＲの抗原特異性を有するが、抗体の全体構造を有しており、そのため「抗体」と称され得ることを認識している。抗原結合タンパク質という用語は、二重特異性抗原結合タンパク質または多重特異性抗原結合タンパク質をさらに含む。特許請求の範囲で定義されているＴＣＲ由来のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ３、ならびに適宜ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２を含むＶＡおよびＶＢに加えて、そのような二重特異性抗原結合タンパク質または多重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの可変ドメインおよび適宜定常ドメインをさらに含み、可変ドメインおよび／または定常ドメインは、抗体またはＴＣＲに由来し得る。繰り返しになるが、当業者は、抗体およびＴＣＲの両方の要素を含むそのようなコンストラクトがハイブリッドフォーマットを表し、抗原結合タンパク質の組成に応じて「二重特異性ＴＣＲ」、「二重特異性抗体」、または「二重特異性ＴＣＲ抗体分子」と称され得るが、当業者の観点および／または焦点によっても称され得ることを認識している。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、特許請求の範囲で定義されているＴＣＲ由来のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ３、ならびに適宜ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２を含むＶＡおよびＶＢを含み、ＶＡまたはＶＢに直接的にまたは間接的に融合した追加のドメインをさらに含む。そのような抗原結合タンパク質は、「ＴＣＲ融合タンパク質」と称され得る。「ＴＣＲ融合タンパク質」に含まれる追加のドメインの例を、下記に列挙する。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、下記で定義する二重特異性ＴＣＲ－抗体分子であり、より好ましくは、下記で定義する二重特異性Ｔ細胞エンゲージング受容体［ＴＣＥＲ（登録商標）］である。そのような実施形態では、抗原結合タンパク質は、２つの異なる抗原結合部位を含み、例えば二重特異性抗体で既知であるように、同時に２つの異なる抗原に特異的に結合可能である。
【0040】
一実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなりかつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在しているＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに特異的に結合し、この抗原結合タンパク質は、
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡを含む第１のポリペプチドであって、
ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）、または最大１個、最大２個、もしくは最大３個のアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）、または最大１個、最大２個、もしくは最大３個のアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列ＦＧＰＹＧＫＥ（配列番号３２）、または最大１個、最大２個、もしくは少なくとも３個のアミノ酸置換により配列番号３２と異なるアミノ酸配列を含む、
第１のポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢを含む第２のポリペプチドであって、
ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）、または最大１個もしくは最大２個のアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡである）、または最大１個、最大２個、もしくは最大３個のアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列ＦＱＮＴＡＶ（配列番号３６）、または最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、もしくは最大６個のアミノ酸置換により配列番号３６と異なるＣＤＲｂ２アミノ酸配列を含む、
第２のポリペプチドと
を含む。
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡを含む第１のポリペプチドであって、
ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）、または最大１個、最大２個、もしくは最大３個のアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）、または最大１個、最大２個、もしくは最大３個のアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列ＦＧＰＹＧＫＥ（配列番号３２）、または最大１個、最大２個、もしくは少なくとも３個のアミノ酸置換により配列番号３２と異なるアミノ酸配列を含む、
第１のポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢを含む第２のポリペプチドであって、
ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）、または最大１個もしくは最大２個のアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡである）、または最大１個、最大２個、もしくは最大３個のアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列ＦＱＮＴＡＶ（配列番号３６）、または最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、もしくは最大６個のアミノ酸置換により配列番号３６と異なるＣＤＲｂ２アミノ酸配列を含む、
第２のポリペプチドと
を含む。
【0041】
一実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、
配列番号１６を含むＣＤＲａ１、
配列番号３２を含むＣＤＲａ２、
配列番号３３を含むＣＤＲａ３、
配列番号１０を含むＣＤＲｂ１、
配列番号３６を含むＣＤＲｂ２、および
配列番号３２７を含むＣＤＲｂ３
を含む。
配列番号１６を含むＣＤＲａ１、
配列番号３２を含むＣＤＲａ２、
配列番号３３を含むＣＤＲａ３、
配列番号１０を含むＣＤＲｂ１、
配列番号３６を含むＣＤＲｂ２、および
配列番号３２７を含むＣＤＲｂ３
を含む。
【0042】
一実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、
配列番号１６を含むＣＤＲａ１、
配列番号３２を含むＣＤＲａ２、
配列番号３４を含むＣＤＲａ３、
配列番号１０を含むＣＤＲｂ１、
配列番号３６を含むＣＤＲｂ２、および
配列番号３２７を含むＣＤＲｂ３
を含む。
配列番号１６を含むＣＤＲａ１、
配列番号３２を含むＣＤＲａ２、
配列番号３４を含むＣＤＲａ３、
配列番号１０を含むＣＤＲｂ１、
配列番号３６を含むＣＤＲｂ２、および
配列番号３２７を含むＣＤＲｂ３
を含む。
【0043】
ある実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【0044】
「少なくとも１」は、本明細書では、１つまたは複数の指定の対象を指しており、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６、またはより多くの指定の対象を指す。例えば、少なくとも１個の結合部位は、本明細書では、１、２、３、４、５、もしくは６個、またはより多くの結合部位を指す。
【0045】
本発明に関連する「二重特異性」という用語は、２つの異なる抗原に対して少なくとも２種の価数および結合特異性を有する抗原結合タンパク質を指しており、そのため少なくとも２つの抗原結合部位を含む。「価数」という用語は、抗原結合タンパク質の結合部位の数を指しており、例えば、２価抗原結合タンパク質は、２つの結合部位を有する抗原結合タンパク質に関する。結合部位は、同一のまたは異なる標的に結合し得、即ち、２価抗原結合タンパク質は、単一特異性（即ち、１つの標的に結合する）であってもよいし、二重特異性（即ち、２つの異なる標的に結合する）であってもよい。本発明の抗原結合分子は、ＴＣＲ由来のＣＤＲを含む少なくとも１つの抗原結合部位を含む。好ましい実施形態では、本発明の抗原結合分子は、少なくとも１つのＴＣＲ由来の抗原結合部位を含む。
【0046】
「ＴＣＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、従来型／ネイティブＴＣＲ、および操作されたＴＣＲ、特に、機能的ＴＣＲ断片、一本鎖ＴＣＲ、および二重特異性または多重特異性ＴＣＲを含むことを意味する。
【0047】
「ネイティブＴＣＲ」は、自然界から単離され得る野生型ＴＣＲを指す。ネイティブＴＣＲと同種のドメインおよびドメイン配置を有しており、かつＴＣＲ由来のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むＴＣＲは、「従来型ＴＣＲ」とも称され得る。ネイティブ／従来型ＴＣＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質であり、このタンパク質は、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変のタンパク質と会合している。ネイティブヘテロ二量体ＴＣＲは、αβ型およびγδ型で存在しており、これらは、構造的に類似しているが、位置およびおそらく機能も異なる。ネイティブヘテロ二量体αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの細胞外部分は、２つのポリペプチドを含み、これらのそれぞれは、膜近位の定常ドメイン（定常領域とも称される）と、膜遠位の可変ドメイン（可変領域とも称される）とを有する。本発明に関連して、そのようなＴＣＲはまた、完全長ＴＣＲとも称される。ネイティブαβヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。α鎖は、可変（Ｖ）領域、結合（Ｊ）領域、および定常（Ｃ）領域を含み、β鎖は、Ｖ領域、Ｊ領域、およびＣ領域を含み、通常は、可変領域と結合領域との間に短い多様性（Ｄ）領域をさらに含むが、この多様性領域は、結合領域の一部とみなされることが多い。ＴＣＲ α鎖およびβ鎖の定常領域は、それぞれ、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣと称される（Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10）。本発明に関連して、ＴＣＲ α鎖およびβ鎖（ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ）の定常領域は、膜貫通（ＴＭ）領域を含む。定常および可変領域（またはドメイン）のそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似する高度に多型のループを含む。
【0048】
それぞれのＴＣＲ可変ドメインは、フレームワーク配列に埋め込まれた３つの「ＴＣＲ相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含み、１つは、ＣＤＲ３と命名された超可変領域である。本発明に関連して、ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３は、α鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３は、β鎖ＣＤＲを示す。α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインには、フレームワーク、ＣＤＲ１、およびＣＤＲ２配列、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列により区別されるいくつかのタイプが存在している。α鎖可変ドメインタイプは、ＩＭＧＴ命名法において固有のＴＲＡＶ番号で言及され、β鎖可変ドメインタイプは、ＩＭＧＴ命名法において固有のＴＲＢＶ番号で言及されている（Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press）。抗体およびＴＣＲ遺伝子に関するさらなる情報を、国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）、Lefranc M-P et al., (Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D413-22；およびhttp://www.imgt.org/）に見出し得る。ＴＣＲでは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３アミノ酸残基は、抗原ペプチドと接触し、ＣＤＲ２アミノ酸残基は、ＨＬＡ分子と主に接触する（Stadinski et al., J Immunol. 2014 June 15; 192(12): 6071-6082; Cole et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):628-38）。そのため、ＴＣＲの抗原特異性は、ＣＤＲ３およびＣＤＲ１配列により定義される。ＣＤＲ２配列は、抗原特異性の決定には必要ないが、ペプチド：ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの全体的な親和性で役割を果たし得る。
【0049】
「ＴＣＲフレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挟まれたアミノ酸配列を指しており、即ち、異なるＴＣＲ間である程度保存されている可変ドメインの部分を指す。α鎖、β鎖、γ鎖、およびδ鎖可変ドメインは、それぞれ、本明細書ではそれぞれＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、ＦＲ４－ａ（α鎖またはγ鎖の場合）、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、ＦＲ４－ｂ（β鎖またはδ鎖の場合）と呼ばれる４つのＦＲを有する。従って、α鎖またはγ鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－ａ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－ａ）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－ａ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－ａ）と説明され得、β鎖またはδ鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－ｂ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－ｂ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－ｂ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－ｂ）と説明され得る。本発明に関連して、α、β、γ、またはδ鎖可変ドメイン中のＣＤＲ／ＦＲ配列は、ＩＭＧＴ定義に基づいて決定される（Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org）。従って、ＴＣＲまたはＴＣＲ由来のドメインに関連する場合のＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置は、前記ＩＭＧＴ定義に従って示される。好ましくは、可変ドメインＶαのＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置のＩＭＧＴ位置は、ＴＲＡＶ２４＊０１のＩＭＧＴナンバリングに類似して付与され、および／または可変ドメインＶβのＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置のＩＭＧＴ位置は、ＴＲＢＶ１２－３＊０１のＩＭＧＴナンバリングに類似して付与される。
【0050】
「α／β ＴＣＲ／ＣＤ３複合体」という用語は、本発明に関連して、Ｔ細胞の表面上に存在するようなＴ細胞受容体複合体を指す。ほとんどのＴ細胞は、ジスルフィド結合したα鎖およびβ鎖で構成されたα／β ＴＣＲを発現し、このα／β ＴＣＲは、典型的には、ＭＨＣにより提示された抗原ペプチドの複合表面に結合する。ＴＣＲは、自己ではシグナルを生じないが、Ｔ細胞共受容体と呼ばれておりかつ細胞内シグナル伝達モチーフを含むタンパク質複合体であるＣＤ３と構成的に会合している（Birnbaum et al.; PNAS vol. 11, no. 49; 17576-17581, 2014）。α／β ＴＣＲは、ＣＤ３εγ、ＣＤ３εδ、およびＣＤ３ζζ二量体（これらは、合わせてα／β ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を形成する）を含むこの保存されたマルチサブユニットシグナル伝達装置と非共有結合的に共役している。
【0051】
「ＣＤ３」は、タンパク質複合体であり、４つの異なる鎖で構成されている。哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、ＴＣＲおよびζ鎖と会合しており、Ｔリンパ球中において活性化シグナルを生じる。
【0052】
操作されたＴＣＲ（そのため、本発明に関連して使用される場合には、「ＴＣＲ」という用語」）は、特に、機能的ＴＣＲ断片、安定性成熟ＴＣＲ、親和性成熟ＴＣＲ、一本鎖ＴＣＲ、キメラ、ヒト化、二重特異性および多重特異性ＴＣＲ）を含む。「機能的ＴＣＲ断片」は、（ａ）標的抗原に結合するＴＣＲ由来の能力を保持するネイティブまたは従来型ＴＣＲの断片、ならびに（ｂ）ＴＣＲ由来のＣＤＲ配列、特に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ３、および適宜ＣＤＲ２の配列を含む組換え／操作された抗原結合タンパク質を含む。標的抗原への結合は、これらのＣＤＲ配列により定義されることから、これらのＣＤＲ配列を含む抗原結合タンパク質は、ＣＤＲが由来するＴＣＲの標的抗原に結合する能力を保持する。ＣＤＲにはフレームワーク領域（ＦＲ）が散在していなければならないが、その特定のアミノ酸配列は標的抗原の特異性にとって重要でないことを、当業者は認識している。そのため、ＴＣＲ由来のＣＤＲおよび抗体由来のＦＲを含む可変ドメインは、「機能的ＴＣＲ断片」とみなされ得る。機能的ＴＣＲ断片のさらなる例として、単一可変ドメイン、例えば、Ｖα、Ｖβ、Ｖδ、Ｖγ、またはα、β、δ、γ鎖の断片、例えば、「Ｖα－Ｃα」もしくは「Ｖβ－Ｃβ」、またはこれらの一部が挙げられる。そのような断片はまた、対応するヒンジ領域もさらに含む可能性がある。「一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲの可変ドメインが単一ポリペプチド上に位置しているＴＣＲを示す。典型的には、ｓｃＴＣＲ中の可変ドメインは、リンカーにより分離されており、前記リンカーは、典型的には、１０～３０個のアミノ酸、例えば、２５個のアミノ酸を含む。
【0053】
「キメラＴＣＲ」は、本明細書では、ＴＣＲ鎖が複数の種由来の配列を含むＴＣＲを指す。好ましくは、本発明に関連するＴＣＲは、α鎖のヒト可変領域を含むα鎖（例えば、マウスＴＣＲ α鎖のマウス定常領域）を含み得る。「二重特異性ＴＣＲ」は、二重特異性ＴＣＲ－抗体分子、特に、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ、または下記で定義するＴ細胞エンゲージング受容体［ＴＣＥＲ（登録商標）］を含む。
【0054】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、従来型／ネイティブ抗体および操作された抗体、特に、機能的抗体断片、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異性または多重特異性抗体を含むことを意味する。
【0055】
「ネイティブ抗体」は、自然界から単離され得る野生型抗体を指す。ネイティブ抗体と同種のドメインおよびドメイン配置を有しており、かつ抗体由来のＣＤＲおよびＦＲの配列を含む抗体も、「従来型抗体」と称され得る。ネイティブ／従来型抗体では、２本の重鎖は、ジスルフィド結合により互いに連結されており、それぞれの重鎖は、ジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。軽鎖には、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種が存在している。抗体分子の機能的活性を決定する下記の５種の主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が存在している：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩＧＥ。それぞれの鎖は、異なるドメイン（領域とも称される）を含む。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）という２つのドメインを含む。重鎖は、抗体アイソタイプに応じて、下記の４または５つのドメインを含む：可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに３または４つの定常ドメイン（まとめてＣＨと称されるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、適宜ＣＨ４）。軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖の両方の可変ドメインは、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽（ＣＬ）鎖および重（ＣＨ）鎖の定常ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、胎盤通過性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合等の重要な生物学的特性を付与する。
【0056】
抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に「抗体相補性決定領域」（ＣＤＲ）または超可変領域に由来する残基で構成されている。時には、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、ドメイン全体の構造、ひいては結合部位に影響を及ぼす。ＣＤＲは、ネイティブ抗体結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列を指す。抗体の軽鎖および重鎖は、それぞれ、それぞれＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌ、およびＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈと呼ばれる３つのＣＤＲを有する。従って、抗体の抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のそれぞれ由来のＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。「抗体フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在しているアミノ酸配列を指しており、即ち、抗体軽鎖および重鎖の可変領域の、単一種において異なる抗体間で比較的保存されている部分を指す。抗体の軽鎖および重鎖は、それぞれ、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ、およびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる４つのＦＲを有する。従って、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と説明され得、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と説明され得る。本明細書で使用される場合、「ヒトフレームワーク領域」とは、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、特に、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％）であるフレームワーク領域のことである。本発明に関連して、抗体軽鎖または重鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ／ＦＲ定義は、ＩＭＧＴ定義に基づいて決定される（Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org）。従って、所与の可変鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、前記ＩＭＧＴ定義に従って示される。
【0057】
操作された抗体フォーマットは、機能的抗体断片、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、およびキメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体を含む。操作された抗体フォーマットは、ＴＣＲ由来のＣＤＲ（場合によってはさらなる３、２、もしくは１個のＮおよび／もしくはＣ末端フレームワーク残基を含む）またはＴＣＲ由来の可変ドメイン全体が、抗体重鎖または軽鎖上に移植されているコンストラクトをさらに含む。より具体的には、ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、および適宜ＣＤＲａ２は、可変重鎖アミノ酸配列に移植され得、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ３、および適宜ＣＤＲｂ２は、可変軽鎖アミノ酸配列に移植され得、逆もまた同様である。別の例として、抗体の軽鎖可変ドメインは、ＴＣＲのα鎖可変ドメインに置き換えられ得、重鎖可変ドメインは、ＴＣＲのβ鎖可変ドメインに置き換えられ得、逆もまた同様である。「機能的抗体断片」は、標的抗原に結合する能力を保持する完全長抗体の部分を指しており、特に、完全長抗体の抗原結合領域または可変領域を指す。機能的抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディが挙げられる。機能的抗体断片はまた、重鎖抗体等の単一ドメイン抗体でもあり得る。「Ｆａｂ」という用語は、ＩｇＧをプロテアーゼ（例えば、パパイン）で処理して得られる断片の内、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合を介して互いに結合している、分子量が約５０，０００ダルトンであり抗原結合活性を有する抗体断片を示す。Ｆｖ断片は、抗体のＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖および１本の重鎖の可変部分からなる。
【0058】
本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質の「フォーマット」は、ドメイン（特に、可変ドメインおよび適宜定常ドメイン）の定義された空間的配置を指定する。そのような抗原結合タンパク質フォーマットの重要な特徴は、下記である：ポリペプチド鎖の数（一本鎖、二本鎖、または多重鎖）、異なるドメインを連結するリンカーのタイプおよび長さ、可変ドメインの数（従って、価数の数）、異なる可変ドメインの数（従って、異なる抗原に対する特異性の数、例えば、二重特異性、多重特異性）、ならびに可変ドメインの順序および方向（例えば、クロスオーバー、パラレル）。
【0059】
多くの異なる二重特異性フォーマットおよび多重特異性フォーマットが、抗体に関連して当該技術分野で説明されており、当業者に理解されるように、そのような二重特異性フォーマットおよび多重特異性フォーマットを、これらのフォーマットの抗体ドメインを、本発明に関連して説明されている可変ドメインに置き換えることにより、本発明に関連して使用し得る。そのようなフォーマットとして、例えば、ダイアボディ、クロスオーバー二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）、および二重可変ドメイン（ＤＶ）タンパク質が挙げられる。様々な二重特異性抗体フォーマットおよびその製造方法の概要が、例えば、Brinkmann U. and Kontermann E.E. MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212で開示されている。ＤＶＤフォーマットが、例えば、下記の科学文献（Wu C et al. Nat Biotechnol 2007; 25:1290-7; PMID:17934452；Wu C. et al. MAbs 2009; 1:339-47；Lacy SE et al. MAbs 2015; 7:605-19; PMID:25764208；Craig RB et al. PLoS One 2012; 7:e46778; PMID:23056448；Piccione EC et al. MAbs 2015）で開示されている。ＣＯＤＶが、例えば、Onuoha SC et al. Arthritis Rheumatol. 2015 Oct; 67(10):2661-72または例えば国際公開第２０１２／１３５３４５号パンフレット、同第２０１６／１１６６２６号パンフレットで開示されている。ダイアボディが、例えば、Holliger P et al. Protein Eng 1996; 9:299-305; PMID:8736497；Atwell JL et al. Mol Immunol 1996; 33:1301-12; PMID:9171890；Kontermann RE, Nat Biotechnol 1997; 15:629-31; PMID:9219263；Kontermann RE et al. Immunotechnology 1997; 3:137-44; PMID:9237098；Cochlovius B et al. Cancer Res 2000; 60:4336-41; PMID:10969772；およびDeNardo DG et al. Cancer Biother Radiopharm 2001; 16:525-35; PMID:11789029で説明されている。
【0060】
「ダイアボディ」は、同一の抗体由来であるかまたは異なる抗体由来である２つの可変ドメインをそれぞれ含む２本の鎖で構成されている２価分子を指す。抗体が異なる場合には、典型的には、一方の抗体（ＶＬＸおよびＶＨＸを含む抗体Ｘ）の可変ドメインは、２本の異なるポリペプチド鎖上に位置しており、他方の抗体（ＶＬＹおよびＶＨＹを含む抗体Ｙ）の可変ドメインもまた、２本の異なるポリペプチド鎖上に位置している。これらのドメインは、頭から尾への向きに二量体化する。２本の鎖は、下記の構造を有し得る：ＶＨＸ－ＬＤｂ１－ＶＬＹおよびＶＨＹ－ＬＤｂ２－ＶＬＸ、またはＶＬＸ－ＬＤｂ１－ＶＨＹおよびＶＬＹ－ＬＤｂ２－ＶＨＸ、またはＶＨＸ－ＬＤｂ１－ＶＨＹおよびＶＬＹ－ＬＤｂ２－ＶＬＸ、またはＶＬＸ－ＬＤｂ１－ＶＬＹおよびＶＨＹ－ＬＤｂ２－ＶＨＸ。ドメインの頭から尾への二量体化を可能にするために、２本の鎖は、可変ドメインを分離しかつ同一であり得るかまたは異なり得るリンカー（即ち、ＬＤｂ１およびＬＤｂ２）を含む。このリンカーは、好ましくは、短いリンカーである。短いリンカーは、典型的には、２～１２個、３～１３個、例えば、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸の長さであり、例えば、４、５［Brinkmann U. and Kontermann E.E. (MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212］、または８個のアミノ酸の長さであり、例えば、配列番号２９０の「ＧＧＧＳ」、配列番号２８６の「ＧＧＧＧＳ」、または配列番号２１４の「ＧＧＧＳＧＧＧＧ」である。
【0061】
「二重可変ドメイン免疫グロブリン」［ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）］フォーマットでは、モノクローナル抗体Ｙの標的結合可変ドメイン（ドメインＶＬＹおよびＶＨＹ）は、典型的には、従来の抗体Ｘ（ドメインＶＬＸおよびＶＨＸを含む）に融合しており、そのため、この従来の抗体Ｘの軽鎖は、追加の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＹ）を含み、従来の抗体Ｘの重鎖は、追加の重鎖可変ドメイン（ＶＨＹ）を含む。当該技術分野で説明されているＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、典型的には、下記の２本のポリペプチド鎖：ＶＨＹ－Ｌ１－ＶＨＸ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む１本の重鎖、およびＶＬＹ－Ｌ３－ＶＬＸ－Ｌ４－ＣＬを含む１本の軽鎖、またはＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨＹ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む１本の重鎖、およびＶＬＸ－Ｌ３－ＶＬＹ－Ｌ４－ＣＬを含む１本の軽鎖で構成されている。そのため、ドメインＶＨＹ／ＶＬＹおよびＶＨＸ／ＶＬＸは、並行して対を形成している。連結しているリンカーＬ１およびＬ３は、好ましくは５～２０個のアミノ酸であり、例えば５～１５個のアミノ酸であり、および／または連結しているリンカーＬ２およびＬ４は、存在していてもよいし存在していなくてもよい。
【0062】
当該技術分野で説明されている「クロスオーバー二重可変ドメイン」（ＣＯＤＶ）フォーマットは、抗体Ｘの可変ドメイン（ＶＬＸおよびＶＨＸ）および抗体Ｙの可変ドメイン（ＶＬＹおよびＶＨＹ）が、これらの可変ドメインのクロスオーバー対形成を可能にする方法で連結されているフォーマットを表す。
【0063】
本発明に関連するＣＯＤＶ－Ｉｇフォーマットでは、ポリペプチド鎖は、例えば、下記の構造：ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨＹ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３およびＶＬＹ－Ｌ３－ＶＬＸ－Ｌ４－ＣＬ、またはＶＨＹ－Ｌ１－ＶＨＸ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３およびＶＬＸ－Ｌ３－ＶＬＹ－Ｌ４－ＣＬ、またはＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨＹ－Ｌ４－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３およびＶＬＹ－Ｌ１－ＶＬＸ－Ｌ２－ＣＬ、またはＶＨＹ－Ｌ３－ＶＨＸ－Ｌ４－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３およびＶＬＸ－Ｌ１－ＶＬＹ－Ｌ２－ＣＬを有する。連結しているリンカー（Ｌ１～Ｌ４）（全グリシンリンカーまたはセリン－グリシンリンカーとも称され得る）は、典型的には、長さが異なる。クロスオーバー対形成を可能にするために、１本の鎖（重鎖または軽鎖）は、典型的には、他の鎖と比べて長いリンカーを含む。例えば、上記で列挙されているＣＯＤＶ構造では、Ｌ１は、３～１２個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、３～１４個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１～８個のアミノ酸残基の長さであり、かつＬ４は、１～３個のアミノ酸残基の長さであるか、またはＬ１は、５～１０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、５～８個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１～５個のアミノ酸残基の長さであり、かつＬ４は、１～２個のアミノ酸残基の長さであるか、またはＬ１は、７個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、５個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１個のアミノ酸残基の長さであり、かつＬ４は、２個のアミノ酸残基の長さである。
【0064】
「ヒト化抗体」という用語は、完全にまたは部分的に非ヒト起源であり、かつヒトにおける免疫反応を回避するかまたは最小限に抑えるために、ある特定のアミノ酸（特に、重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中）を置き換えることにより改変されている抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、主にヒトのＣＨドメインおよびＣＬドメインである。抗体配列のヒト化のための多数の方法が、当該技術分野で既知であり；例えば、Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633による概説を参照されたい。
【0065】
当業者に理解されるように、抗体の構造、特に、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの構造は、ＴＣＲ α鎖、β鎖、γ鎖、またはδ鎖の可変ドメインの構造に類似しており、本発明に関連して定義されているＣＤＲの抗体（例えば、従来の抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体）への移植が促進される。
【0066】
本発明の抗体、ＴＣＲ、または抗原結合タンパク質のＣＤＲのアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、フレームワーク領域（例えば、ＴＣＲフレームワーク領域または抗体フレームワーク領域）を容易に決定し得る。ＣＤＲが示されていない場合には、当業者は、最初に、ＴＣＲに関するＩＭＧＴ定義または抗体に関するＩＭＧＴ定義に基づいてＣＤＲアミノ酸配列を決定し得、次いで、フレームワーク領域のアミノ酸配列を決定し得る。
【0067】
二重特異性ＴＣＲ－抗体フォーマット
好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、二重特異性分子であり、特に、二重特異性ＴＣＲ－抗体分子であり、即ち、一方が抗体に由来しており、他方がＴＣＲに由来しているかまたはＴＣＲに由来するＣＤＲ（特に、ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ３ａ、ＣＤＲ１ｂ、ＣＤＲ３ｂ、ならびに適宜ＣＤＲ２ａおよびＣＤＲ２ｂ）を少なくとも含む少なくとも２つの抗原結合部位を含む抗原結合タンパク質である。抗体に由来する抗原結合部位は、可変ドメインＶＬおよびＶＨを含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、二重特異性分子であり、特に、二重特異性ＴＣＲ－抗体分子であり、即ち、一方が抗体に由来しており、他方がＴＣＲに由来しているかまたはＴＣＲに由来するＣＤＲ（特に、ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ３ａ、ＣＤＲ１ｂ、ＣＤＲ３ｂ、ならびに適宜ＣＤＲ２ａおよびＣＤＲ２ｂ）を少なくとも含む少なくとも２つの抗原結合部位を含む抗原結合タンパク質である。抗体に由来する抗原結合部位は、可変ドメインＶＬおよびＶＨを含む。
【0068】
そのような二重特異性ＴＣＲ－抗体分子では、可変ドメインは、例えば、上述された様々な二重特異性抗体フォーマットに関して説明されているように配置され得る。そのような二重特異性抗体を作製する技術も、上記で引用された先行技術で開示されており、そのため、当業者は、本明細書で定義されているＣＤＲまたは可変ドメインを使用して、本明細書で開示されているフォーマットで本発明の抗原結合タンパク質を容易に生成して作製し得る。加えて、さらなるフォーマット、例えば、各鎖上で、可変ドメインが、二量体化を媒介する定常ドメインにより分離されており、その結果、最終分子では、２つの抗原結合部位が二量体化定常ドメインの両側に位置しているようなフォーマットも可能である。当業者は、所望の立体構造で確実に折り畳まれるように適切なリンカーを選択することが完全に可能である。
【0069】
最も好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＣＲ抗原結合部位および抗体抗原結合部位を含む可溶性Ｆｃ含有二重特異性抗原結合分子である二重特異性Ｔ細胞エンゲージング受容体［ＴＣＥＲ（登録商標）］である。抗体抗原結合部位は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成されており、エフェクター細胞（例えばＴ細胞）に結合して腫瘍へと動員することから「リクルーター」とも称される。ＴＣＥＲ（登録商標）は、２本のポリペプチド鎖を含み、抗原結合部位は、クロスオーバー配向で異なるポリペプチド鎖上に位置する可変ドメインにより形成されている。
【0070】
本出願の文脈において、「参照配列と少なくとも８５％同一」である配列とは、参照配列の全長との８５％以上、特に、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を全長にわたり有する配列のことである。参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一」のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して突然変異（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。置換の場合には、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは別の種に由来する相同配列に対応し得る。
【0071】
本出願の文脈において、「同一性の割合」は、グローバルペアワイズアラインメントを使用して算出され得る（即ち、２つの配列が、その全長にわたり比較される）。２つ以上の配列の同一性を比較する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用して、２つの配列の全長を考慮した場合の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見出す「ニードル」プログラムを使用し得る。ニードルプログラムは、例えば、ebi.ac.uk World Wide Webサイトで入手可能であり、下記の刊行物でさらに説明されている［EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp. 276-277］。本発明に従う２つのポリペプチド間の同一性の割合は、“Ｇａｐ Ｏｐｅｎ”パラメータ １０．０、“Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ”パラメータ ０．５、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスでＥＭＢＯＳＳ：ニードル（グローバル）プログラムを使用して算出される。
【0072】
「アミノ酸置換」は、保存的であってもよいし被保存的であってもよい。好ましくは、置換は、保存的置換であり、この保存的置換では、１つのアミノ酸が、構造および／または化学的特性が類似する別のアミノ酸に置換される。
【0073】
ある実施形態では、保存的置換として、Dayhoff in "The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5", Natl. Biomedical Research（この内容は、その全体が参照により組み込まれる）により説明されいてるものが挙げられ得る。例えば、ある態様では、下記の群の内の１つに属するアミノ酸が、互いに交換され得、そのため保存的交換を構成する：群１：アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；群２：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）；群３：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）；群４：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；群５：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）；および群６：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。ある態様では、保存的アミノ酸置換は、Ｔ→Ａ、Ｇ→Ａ、Ａ→Ｉ、Ｔ→Ｖ、Ａ→Ｍ、Ｔ→Ｉ、Ａ→Ｖ、Ｔ→Ｇ、および／またはＴ→Ｓから選択され得る。
【0074】
さらなる実施形態では、保存的アミノ酸置換として、アミノ酸の同クラスの別のアミノ酸［例えば、（１）非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；および（４）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ］による置換も挙げられ得る。他の保存的アミノ酸置換をまた、下記のように行ない得る：（１）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ；（２）プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ；および（３）プロトン受容体：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ（例えば、内容全体が参照により組み込まれる米国特許第１０，１０６，８０５号明細書を参照されたい）。
【0075】
別の実施形態では、保存的置換を、表１に従って行ない得る。タンパク質改変に対する耐性を予測する方法を、例えば、Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101(25):9205-9210 (2004)（この内容は、その全体が参照により組み込まれる）で見出し得る。
【0076】
【表1】
【0077】
別の実施形態では、保存的置換は、「保存的置換」という標題で表２に示されているものであり得る。そのような置換により生物学的活性が変化する場合には、表２において「例示的な置換」と表示されているより実質的な変化を導入して、必要に応じて生成物をスクリーニングし得る。
【0078】
【表2】
【0079】
本発明の抗原結合タンパク質は、任意の長さのものであり得、即ち、生物学的活性（例えば、標的抗原に特異的に結合する能力、宿主中の疾患細胞を検出する能力、または宿主の疾患を処置するかもしくは予防する能力等）を保持する限り、任意の数のアミノ酸を含み得る。
【0080】
本発明の抗原結合タンパク質は、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は、当該技術分野で既知であり、例えば下記が挙げられる：アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノ ｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、α－アミノシクロペンタン カルボン酸、α－アミノシクロヘキサン カルボン酸、α－アミノシクロヘプタン カルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシン。
【0081】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、グリコシル化され得るか、アミド化され得るか、カルボキシル化され得るか、リン酸化され得るか、エステル化され得るか、Ｎ－アシル化され得るか、例えばジスルフィド架橋を介して環化され得るか、もしくは酸付加塩に変換され得、および／または二量体化され得るかもしくは重合され得るか、またはコンジュゲートされてもよい。
【0082】
さらなる実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、塩の形態であり、例えば、薬学的に許容される塩の形態である。好適な薬学的に許容される酸付加塩として、鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸）に由来するもの、ならびに有機酸（例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸、例えばｐ－トルエンスルホン酸）に由来するものが挙げられ得る。
【0083】
「共有結合的連結」は、本明細書では、例えば、ジスルフィド架橋、またはポリペプチドリンカー等のリンカーもしくはリンカー配列を介したペプチド連結もしくは共有結合的連結を指す。
【0084】
「リンカー」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、抗原結合タンパク質のクロスオーバー対形成（ＣＯＤＶフォーマットもしくはダイアボディフォーマットの内のいくつかにおける）またはパラレル対形成構成（例えば、ＤＶＤフォーマットにおける）で抗原結合部位を形成するために正しく折り畳むのに十分なドメインまたは要素（例えば、本発明の抗原結合タンパク質の可変ドメイン）の可動性を提供するためにドメイン間またはドメインと薬剤との間に挿入される１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。
【0085】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカーが存在していないことを意味する０個のアミノ酸からなる。リンカーは、アミノ酸配列レベルで、可変ドメイン間または可変ドメインと定常ドメインとの間（または二量体化ドメイン間）それぞれの転移で挿入される。抗体ドメインおよびＴＣＲドメインのおおよそのサイズがよく理解されていることから、ドメイン間の転移を特定し得る。実験データにより実証されているように、またはモデリングもしくは二次構造予測の技術により想定され得るように、β－シートまたはα－ヘリックス等の二次構造要素を形成しないペプチドストレッチを位置付けることにより、ドメイン転移の正確な位置を決定し得る。本発明に関連して使用されるリンカーという用語は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６と称されるリンカーを含むが、これらに限定されない。
【0086】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６等のリンカーは、それぞれの文脈において別途指定されない限り、少なくとも１～３０個のアミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６等のリンカーは、２～２５個、２～２０個、または３～１８個のアミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６等のリンカーは、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個以下のアミノ酸の長さのペプチドであり得る。他の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６等のリンカーは、５～２５個、５～１５個、４～１１個、１０～２０個、または２０～３０個のアミノ酸の長さであり得る。他の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６等のリンカーは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸の長さであり得る。特定の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６等のリンカーは、２４個未満、２０個未満、１６個未満のアミノ酸残基の長さであり得、１２個未満、１０個未満、例えば、５～２４個未満、１０～２４個未満、または５～１０個未満のアミノ酸残基の長さである。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、１個以上のアミノ酸残基の長さであり、例えば、１個超、２個超、５個超、１０個超、２０個超のアミノ酸残基の長さであり、２２個超のアミノ酸残基の長さである。
【0087】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６等の例示的なリンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２９０）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２８６）、ＧＧＧＡＳ（配列番号２８７）、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８０）、ＧＧＧＧＳＡＡＡ（配列番号３５８）、特に、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0088】
「Ｆｃドメイン」という用語は、本発明に関連して使用される場合、ネイティブＦｃおよびＦｃ変異体を包含しており、全抗体から消化されているか他の手段により生成されているかにかかわらず、単量体二量体および多量体Ｆｃドメインの両方を含む。
【0089】
「ネイティブＦｃ」という用語は、本明細書で使用される場合、単量体か、二量体か、または多量体の形態かにかかわらず、抗体の消化によって生じるかまたは他の手段により生成される非抗原結合断片の配列を含む分子を指しており、かつヒンジ領域を含み得る。ネイティブＦｃの元の抗体源は、特にヒト起源であり、いずれかの抗体クラスであり得るが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。ネイティブＦｃ分子は、共有結合（即ち、ジスルフィド結合）的会合および非共有結合的会合により二量体形態または多量体形態へと連結され得る単量体ポリペプチドで構成されている。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１～４の範囲である。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化により生じるジスルフィド結合二量体である。ネイティブＦｃアミノ酸配列の一例は、配列番号３２９である。
【0090】
「Ｆｃ変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、ネイティブＦｃから改変されているがサルベージ受容体ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）の結合部位を依然として含む分子または配列を指す。例示的なＦｃ変異体、およびこれとサルベージ受容体との相互作用は、当該技術分野で既知である。そのため、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒトネイティブＦｃからヒト化されている分子または配列を含み得る。さらに、ネイティブＦｃは、除去され得る領域を含んでおり、なぜならば、この領域は、本発明の抗原結合タンパク質に必要とされない構造的特徴または生物学的活性を付与するからである。そのため、「Ｆｃ変異体」という用語は、１つもしくは複数のネイティブＦｃ部位もしくは残基を欠いているかまたは１つもしくは複数のＦｃ部位もしくは残基が改変されている分子または配列を含み、この部位もしくは残基は、下記に影響を及ぼすかまたは関与する：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞中での発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）。
【0091】
一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインであり、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来しており、好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２に由来しており、より好ましくは、ＩｇＧ１に由来している。
【0092】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質が２つのＦｃドメイン（Ｆｃ１およびＦｃ２）を含む場合には、例えば、実施例で使用されるＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットでは、これら２つのＦｃドメインは、同一の抗体アイソタイプまたはアイソタイプサブクラスのものである。従って、いくつかの実施形態では、Ｆｃ１およびＦｃ２の両方は、ＩｇＧ１サブクラス、またはＩｇＧ２サブクラス、またはＩｇＧ３サブクラス、またはＩｇＧ４サブクラスのものである。好ましい実施形態では、Ｆｃ１およびＦｃ２の両方は、ＩｇＧ１サブクラスまたはＩｇＧ２サブクラスのものであり、より好ましくは、ＩｇＧ１サブクラスのものである。
【0093】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、本明細書の下記で定義するＲＦおよび／または「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異をさらに含む。
【0094】
「ＲＦ突然変異」は、一般に、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおけるＲＦへのアミノ酸ＨＹの突然変異、例えば、Jendeberg, L. et al., (1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34)で説明されているＣＨ３ドメイン中の突然変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを指しており、かつプロテインＡの結合を消失させることから精製目的に有利であると説明されている。抗原結合タンパク質が２つのＦｃドメインを含む場合には、ＲＦ突然変異は、一方または両方のＦｃドメイン中に存在し得、好ましくは一方のＦｃドメイン中に存在し得る。
【0095】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、米国特許第５７３１１６８号明細書および同第８２１６８０５号明細書（特に、参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているヘテロ多量体形成を促進するための、ＣＨ３－ＣＨ３界面における突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ、特にＴ３６６Ｓ（ホール）およびＴ３６６Ｗ（ノブ）の両方を指す。このノブ・イントゥ・ホール突然変異は、さらなるシステインアミノ酸置換Ｙ３４９ＣおよびＳ３５４Ｃの導入により、さらに安定化され得る。
【0096】
「ノブ」突然変異は、例えば、配列番号１４９のＦｃアミノ酸配列中に存在しており、「ホール」突然変異は、例えば、配列番号１５０のＦｃアミノ酸配列中に存在している。
【0097】
いくつかの実施形態では、一方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ１）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（ノブ）を含んでおり、他方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ２）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）を含んでおり、逆もまた同様である。
【0098】
いくつかの実施形態では、一方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ１）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含むか、またはさらに含んでおり、他方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ２）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含んでいるか、またはさらに含んでおり、逆もまた同様である。
【0099】
従って、いくつかの実施形態では、一方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ１）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ノブ）を含んでおり、他方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ２）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）を含んでおり、逆もまた同様である。
【0100】
このアミノ酸置換のセットは、Wei et al. (Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, Oncotarget. 2017)により説明されているように、一方のポリペプチドでのアミノ酸置換Ｋ４０９Ａの含有、および他方ポリペプチドでのＦ４０５Ｋの含有により、さらに拡張され得る。従って、いくつかの実施形態では、一方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ１）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｋ４０９Ａを含むか、またはさらに含んでおり、他方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ２）は、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｆ４０５Ｋを含むか、またはさらに含んでおり、逆もまた同様である。
【0101】
場合によっては、人工的に導入されたシステイン架橋により、最適には抗原結合タンパク質の結合特性を妨げることなく、抗原結合タンパク質の安定性が改善され得る。そのようなシステイン架橋により、ヘテロ二量体化がさらに改善され得る。
【0102】
得られたタンパク質のヘテロ二量体化を改善するためのさらなるアミノ酸置換（例えば、荷電対置換）は、当該技術分野（例えば、欧州特許第２９７０４８４号明細書）で説明されている。
【0103】
従って、一実施形態では、一方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ１）は、荷電対置換Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｒ、またはＤ３５６Ｋ、およびＤ３９９Ｋ、またはＤ３９９Ｒを含むか、またはさらに含んでおり、他方のポリペプチドのＦｃドメイン（例えば、Ｆｃ２）は、荷電対置換Ｒ４０９Ｄ、Ｒ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、またはＫ４０９Ｄ、およびＮ３９２Ｄ、Ｎ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、またはＫ３９２Ｄを含むか、またはさらに含んでおり、逆もまた同様である。
【0104】
さらなる実施形態では、一方または両方の、好ましくは両方のポリペプチド鎖上のＦｃドメインは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃｙＲ）結合を阻害する１つまたは複数の変更を含み得る。そのような変更は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを含み得る。
【0105】
さらなる実施形態では、一方または両方の、好ましくは両方のポリペプチド鎖上のＦｃドメインは、Ｆｃ部分内のＮ－グリコシル化部位を除去するためにＮ２９７Ｑ突然変異を含み得、そのような突然変異は、Ｆｃガンマ受容体相互作用を無効にする。
【0106】
「ヒンジ」、「ヒンジ領域」、または「ヒンジドメイン」は、典型的には、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する重鎖の柔軟な部分を指す。これは、約２５個のアミノ酸の長さであり、かつ「上部ヒンジ」、「中間ヒンジ」または「コアヒンジ」、および「下部ヒンジ」に分けられている。「ヒンジサブドメイン」は、上部ヒンジ、中間（もしくはコア）ヒンジ、または下部ヒンジを指す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４分子のヒンジのアミノ酸配列を、本明細書の下記に示す：
ＩｇＧ１：Ｅ２１６ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３３０）
ＩｇＧ２：Ｅ２１６ＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰ（配列番号３３１）
ＩｇＧ３：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥ２１６ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３３２）
ＩｇＧ４：Ｅ２１６ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号３３３）。
ＩｇＧ１：Ｅ２１６ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３３０）
ＩｇＧ２：Ｅ２１６ＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰ（配列番号３３１）
ＩｇＧ３：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥ２１６ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３３２）
ＩｇＧ４：Ｅ２１６ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号３３３）。
【0107】
本発明に関連して、Ｆｃドメイン中のアミノ酸位置に言及されており、これらのアミノ酸の位置または残基は、例えば、Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)で説明されているようようなＥＵナンバリングシステムに従って示されている。
【0108】
ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインからなるＦｃ部分、またはこの一部の抗原結合タンパク質（特に、二重特異性抗原結合タンパク質）への組み込みにより、Ｆｃ：Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）相互作用により誘発されるこれらの分子の非特異的固定化の問題が生じた。ＦｃγＲは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分により提示されるエピトープに対して様々な親和性で結合する様々な細胞表面分子（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ）で構成されている。そのような非特異的な（即ち、二重特異性分子の２つの結合ドメインのいずれによっても誘発されない）固定化は、ｉ）分子の薬物動態への影響、およびｉｉ）免疫エフェクター細胞のオフターゲット活性化に起因して好ましくないことから、ＦｃγＲ結合を取り除くための様々なＦｃ変異体および突然変異が同定されている。これに関連して、Morgan et al. 1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding)は、ＦｃγＲＩ結合の消失、Ｃ１ｑ結合の消失、およびＦｃγＲＩＩＩ結合の減少をもたらす、ヒトＩｇＧ２に由来する対応する配列によるヒトＩｇＧ１の残基２３３～２３６の交換（即ち、残基２３３Ｐ、２３４Ｖ、および２３５Ａ、ならびに２３６位にはアミノ酸が存在していない）を開示している。欧州特許第１０７５４９６号明細書は、Ｆｃ領域での多様性（例えば、２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、および２３６位での存在していない残基またはＧ、および３２７Ｇ、３３０Ｓ、および３３１Ｓの内の１つまたは複数）を有する抗体および他のＦｃ含有分子を開示しており、ここで、組換え抗体は、標的の顕著な補体依存性溶解または細胞媒介性破壊を始動させることなく、標的分子に結合可能である。
【0109】
従って、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）またはＧ、３２７Ｇ、３３０Ｓ、３３１Ｓからなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸または欠失を含むか、またはさらに含んでおり、好ましくは、Ｆｃ領域は、アミノ酸２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）またはＧ、および３２７Ｇ、３３０Ｓ、３３１Ｓからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むか、またはさらに含んでおり、最も好ましくは、Ｆｃ領域は、アミノ酸２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）、および３３１Ｓを含むか、またはさらに含んでいる。
【0110】
さらなる一実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、またはＮ２９７Ａ、好ましくはＮ２９７Ｑを含むか、またはさらに含む。
【0111】
アミノ酸置換「Ｎ２９７Ｑ」、「Ｎ２９７Ｇ」、または「Ｎ２９７Ａ」は、Ｆｃドメイン内のネイティブＮ－グリコシル化部位を無効にする２９７位でのアミノ酸置換を指す。このアミノ酸置換は、例えばTao, MH and Morrison, SL (J Immunol. 1989 Oct 15;143(8):2595-601.)で説明されているように、糖残基に起因して、Ｆｃガンマ受容体相互作用をさらに防止し、かつ最終タンパク質生成物（即ち、本発明の抗原結合タンパク質）の多様性を減少させる。
【0112】
さらなる一実施形態では、特に軽鎖がない場合には、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｓを含むか、またはさらに含む。アミノ酸置換「Ｃ２２０Ｓ」により、ＣＨ１－ＣＬジスルフィド結合を形成するシステインが欠失する。
【0113】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、少なくとも２つのさらなるシステイン残基を含むか、またはさらに含み（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＹ３４９Ｃ、またはＬ２４２ＣおよびＫ３３４Ｃ）、ここで、ヘテロ二量体を形成するために、Ｓ３５４Ｃは、Ｆｃ１等の一方のポリペプチドのＦｃドメイン中に存在しており、Ｙ３４９Ｃは、Ｆｃ２等の他方のポリペプチドのＦｃドメイン中に存在しており、ならびに／またはドメイン内Ｃ－Ｃ結合を形成するために、Ｌ２４２ＣおよびＫ３３４Ｃは、一方または両方のポリペプチドのＦｃ１またはＦｃ２のいずれか中の同一のＦｃドメイン中に位置している。
【0114】
本開示の抗原結合タンパク質は、合成であり得、組換えであり得、単離され得、操作され得、および／または精製され得る。
【0115】
「精製された」は、ポリペプチド（例えば、本発明の抗原結合タンパク質）またはヌクレオチド配列（例えば、本明細書で説明されている抗原結合タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列）に言及する場合には、示されている分子が、同一タイプの他の生物学的高分子の実質的非存在下で存在していることを意味する。「精製された」という用語は、特に本明細書で使用される場合、同一タイプの生物学的高分子の少なくとも７５重量％、８５重量％、９５重量％、または９８重量％が存在していることを意味する。
【0116】
特定のポリペプチドをコードする精製された核酸分子は、主題のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指しており、しかしながら、この分子は、組成の基本特性に悪影響を及ぼさないいくつかのさらなる塩基または部分を含み得る。
【0117】
「単離された」という用語は、天然状態から変化したかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離され」てはいないが、天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同一の核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞等の非天然環境中で存在し得る。単離された抗原結合タンパク質は、異なる抗原特異性を有する他の抗原結合タンパク質を実質的に含まない（例えば、ＰＲＡＭＥに特異的に結合する抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ以外の抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を実質的に含まない）。さらに、単離された抗原結合タンパク質は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【0118】
「組換え」分子とは、組換え手段により調製されているか、発現されているか、作製されているか、または単離されている分子のことである。組換え分子は、天然には存在していない。
【0119】
「遺伝子」という用語は、１種または複数種のタンパク質または酵素の全てまたは一部を構成するアミノ酸の特定の配列をコードするかまたはそれに対応するＤＮＡ配列を意味しており、例えばこの遺伝子が発現される条件を決定する制御ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列）を含んでもよいし、含まなくてもよい。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され得るが、アミノ酸配列へとは翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子のレギュレーターとして機能し得るか、またはＤＮＡ転写のレギュレーターとして機能し得る。特に、遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列（即ち、レギュレーター、プロモーター、イントロン、およびエクソンの配列を含む配列）を対象とし得る。
【0120】
「親和性」は、本発明に関連して、抗原結合タンパク質とその抗原（即ち、ＭＨＣタンパク質との複合体中の配列番号５０に係るＰＲＡＭＥ－００４ペプチド）との間の平衡結合により定義される。親和性は、例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）または並行解離定数（ＫＤ）で表され得る。本発明に関連して、高親和性は、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、または≦５ｎＭのＫＤでの結合を指す。
【0121】
「ＫＤ」は、抗原結合タンパク質とその抗原との間の平衡解離定数（ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比）である。ＫＤおよび親和性は、逆相関している。ＫＤ値は、抗原結合タンパク質の濃度に関係しており、ＫＤ値が低いほど、抗原結合タンパク質の親和性が高くなる。親和性（即ち、ＫＤ値）は、本明細書の下記の「抗原結合タンパク質」セクションでより詳細に説明するように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または生体層干渉法（ＢＬＩ）による会合速度および解離速度の測定等の様々な既知の方法により実験的に評価し得る。ＫＤは、好ましくは、生体層干渉法（ＢＬＩ）により測定される。より好ましくは、ＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、ＢＬＩにより、２０℃～３５℃、好ましくは２５℃～３２℃、より好ましくは約３０℃の温度、および６．５～８．０、好ましくは７．０～７．６のｐＨで決定される。さらにより好ましくは、ＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、ＢＬＩにより、２０℃～３５℃、好ましくは２５℃～３２℃、より好ましくは約３０℃の温度、６．５～８．０、好ましくは７．０～７．６のｐＨ、および１００～２００ｍＭ、好ましくは１２０～１７５ｍＭ、より好ましくは約１４０ｍＭの塩濃度で決定される。最も好ましくは、ＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、ＢＬＩにより、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．１％ ＢＳＡを含むからまたはからなる緩衝液中において、３０℃で決定される。そのような測定では、抗原結合タンパク質の濃度は、典型的には、測定される相互作用の親和性に応じて１．５６～５００ｎＭである。２種の異なるペプチド（例えば、標的ペプチド、および潜在的なオフターゲットペプチド／類似ペプチド）に関する抗原結合タンパク質のＫＤを比較する場合には、２種のペプチドが類似のＨＬＡ結合強度を有する場合にペプチド－ＨＬＡのローディング条件は両方の測定に関して同一であり、抗原結合タンパク質濃度の範囲は、予想される親和性を考慮して選択される。
【0122】
「ＥＣ５０」とも呼ばれる「最大半量有効濃度」は、典型的には、特定の暴露時間後にベースラインと最大値との中間の反応を誘発する分子の濃度を指す。ＥＣ５０および親和性は逆相関しており、ＥＣ５０値が低いほど、分子の親和性は高くなる。一例では、「ＥＣ５０」は、特定の暴露時間後にベースラインと最大値との中間の反応を誘発する本発明の抗原結合タンパク質の濃度を指しており、特に、特定の暴露時間後にベースラインと最大値との中間の反応を誘発する本発明の抗原結合タンパク質の濃度を指している。ＥＣ５０値を、例えば、ＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリー等の結合アッセイ、またはＩＦＮ－ガンマ放出アッセイもしくは乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ等の機能アッセイを使用して、様々な既知の方法により実験的に評価し得る。
【0123】
抗原結合タンパク質
本発明の抗原結合タンパク質は、多くの突然変異が導入されている足場配列から設計されている。本発明の抗原結合タンパク質は、治療用途に特に適したプロファイルを有する。一般に、そのような抗原結合タンパク質の特定は簡単ではなく、典型的には、高い脱落率（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を有する。
本発明の抗原結合タンパク質は、多くの突然変異が導入されている足場配列から設計されている。本発明の抗原結合タンパク質は、治療用途に特に適したプロファイルを有する。一般に、そのような抗原結合タンパク質の特定は簡単ではなく、典型的には、高い脱落率（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を有する。
【0124】
まず第一に、当業者は、適切な出発（即ち、足場）配列を特定する必要がある。本発明の場合には、これは、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体に対する良好な親和性（例えば、２００μＭ以上）有しており；高レベルの標的特異性、例えば、代替ペプチド－ＨＬＡ複合体に比較的弱く結合するか、または結合せず；高収量でリフォールディングされて精製され得るＴＣＲである。ＴＣＲ認識の縮退特性を前提として、特定の足場であるＴＣＲ配列が、このＴＣＲ配列が治療用途のための設計に適格となるであろう特異性プロファイルを有するかどうかを決定することは、当業者にとっても非常に困難である（Wooldridge, et al., J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1 168-77）。
【0125】
特に重要な工程は、このＴＣＲを、安定的に発現され得る可溶性フォーマットへと変換することである。天然に存在するＴＣＲは、膜結合型であり、ＣＤ３との複合体でのみ発現される。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）分子として日常的に発現される抗体以外に、対応する一本鎖Ｔ細胞受容体可変ドメイン（ｓｃＴｖ）コンストラクトは、凝集およびミスフォールディングを起こしやすい（Richman, et al. Mol Immunol. 2009 Feb;46(5):902-16. doi: 10.1016/j.molimm.2008.09.021. Epub 2008 Oct 29）。この工程は、活性な生物学的物質の生成に必須であるが、下記で説明するさらなる操作工程にとっても欠かせないだろう。ｓｃＴｖ変換、および安定的で可溶性の分子の生成のプロセスは、典型的には、ｓｃＴｖの発現および安定性を増加させるために、ＴＣＲ出発配列への、フレームワーク領域および／またはＣＤＲでの１つまたは複数の特定の突然変異（例えば、限定されないが、置換、挿入、および／または欠失）の設計を伴う。それぞれのＴＣＲは、可変ドメインの組合せおよびＣＤＲ３の構成に応じて、突然変異のセットが異なる。溶解性および安定性の有意な増加をもたらす特定の突然変異および／または突然変異の組合せは、予測不可能であり、脱落率が高い。多くの場合では、所与のＴＣＲ出発配列では溶解性および安定性の有意な増加を達成することは不可能な場合がある。
【0126】
次の課題は、特異性および収量等の望ましい特性を保持しつつ標的抗原に対してより高い親和性を有するようにＴＣＲを設計することである。ＴＣＲは、自然界に存在する場合には、抗体と比較して標的抗原に対する親和性が弱く（低マイクロモル範囲）、がん抗原に対するＴＣＲは、典型的には、ウイルス特異的ＴＣＲと比べて抗原認識が弱い（Aleksic, et al. Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9）。この弱い親和性は、がん細胞でのＨＬＡ下方制御と相まって、がん免疫療法のための治療用ＴＣＲが、典型的には、標的抗原に対する親和性を増加させ、そのためより強力な反応を生じるための設計を必要とすることを意味する。そのような親和性の増加は、可溶性ＴＣＲベースの試薬には必須である。そのような場合には、ナノモルからピコモルの範囲の抗原結合親和性が、数時間の結合半減期と共に望ましい。親和性成熟プロセスは、典型的には、抗原認識の強度を増加させるために、出発ＴＣＲ配列への、ＣＤＲ中での特定の突然変異および／またはＣＤＲ中での突然変異の組合せ（例えば、限定されないが、置換、挿入、および／または欠失）の設計を含む。所与の標的に対する所与のＴＣＲの親和性を有意に増加させるために、当業者は、可能な選択肢の大きなプールからＣＤＲ中での突然変異の組合せを設計しなければならない場合がある。親和性を有意に増加させる特定の突然変異および／または突然変異の組合せは、予測不可能であり、脱落率が高い。多くの場合では、所与のＴＣＲ出発配列では、親和性の有意な増加を達成することは不可能かもしれない。
【0127】
親和性成熟プロセスはまた、ＴＣＲ抗原特異性を維持する必要性も考慮しなければならい。ＴＣＲのその標的抗原に対する親和性の増加により、ＴＣＲ抗原認識の固有の縮退の結果として、意図されない他の標的との交差反応が明らかになるという相当なリスクが生じる（Wooldridge, et al., J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1 168-77；Wilson, et al., Mol lmmunol.2004 Feb;40(14-15): 1047-55；Zhao ef al., J Immunol. 2007 Nov 1 ;179(9):5845-54）。自然レベルの親和性では、交差反応性抗原の認識が過剰に低くて反応が生じない場合がある。交差反応性抗原が正常な健康細胞上で示される場合には、臨床毒性として現れる場合があるインビボでのオフターゲット結合が起こる可能性が高い。そのため、抗原結合強度の増加に加えて、当業者はまた、ＴＣＲが標的抗原に対する高い特異性を保持し、そのため前臨床試験において良好な安全性プロファイルを示すことを可能にする、ＣＤＲ中での突然変異および／またはＣＤＲ中での突然変異の組合せも設計しなければならない。この場合もやはり、適切な突然変異および／または突然変異の組合せは、予測不可能である。この段階の脱落率は、さらに高く、多くの場合では、所与のＴＣＲ出発配列から全く達成されないかもしれない。上述した困難にもかかわらず、本発明者らは、特に高い親和性（低ナノモル範囲）および高い抗原特異度を有するＣＤＲ由来のＴＣＲを含む抗原結合タンパク質を特定している。
【0128】
出発点として、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／１７２５３３号パンフレットで開示されているＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３を使用して、本発明者らは、Ｆａｂフラグメントと結合していてもよい一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）フォーマットおよびＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットのＲ１１Ｐ３Ｄ３の可変アルファドメインおよび可変ベータドメインの変異体を設計し、製造し、かつ試験している。このようにして、本発明者らは、本発明の抗原結合タンパク質のその標的（即ち、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＲＡＭＥ－００４ペプチド）への高親和性および高特異性での結合に関連する様々なＣＤＲ（特に、ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、ＣＤＲｂ１、およびＣＤＲ３、ならびに適宜、ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２）を特定した。
【0129】
本発明者らは、二重特異性ＴＣＥＲ（登録商標）分子、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＲＣＲ）、および二重特異性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子を設計した。全てのコンストラクトは、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドを含むペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的に結合する。実施例で開示されている二重特異性コンストラクトは、抗体由来「リクルーター」を介して、エフェクター細胞（特に、Ｔ細胞）にさらに結合する。そのため、本発明者らは、ＣＤＲが一本鎖ＴＣＲコンストラクトおよび二重特性ＴＣＲ－抗体分子に使用され得ることを実証しており、そのため、特定されたＣＤＲを使用して、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに対する高い親和性および高い特異性を有する様々な抗原結合タンパク質を製造し得ることも実証した。
【0130】
従って、第１の態様では、本発明は、配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなりかつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在しているＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、
相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡであり、
－ ＣＤＲａ１は、ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＣＤＲａ３は、ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
可変ドメインＶＡと、
ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢであり、
－ ＣＤＲｂ１は、ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＣＤＲｂ３は、ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、好ましくは、Ｐであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであり、好ましくは、ＫもしくはＡであり、より好ましくは、Ｋである）（配列番号３２７）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
可変ドメインＶＢと
を含む抗原結合タンパク質に関する。
相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡであり、
－ ＣＤＲａ１は、ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＣＤＲａ３は、ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
可変ドメインＶＡと、
ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢであり、
－ ＣＤＲｂ１は、ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＣＤＲｂ３は、ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、好ましくは、Ｐであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであり、好ましくは、ＫもしくはＡであり、より好ましくは、Ｋである）（配列番号３２７）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
可変ドメインＶＢと
を含む抗原結合タンパク質に関する。
【0131】
抗原結合タンパク質の特異性は、アミノ酸配列ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、ＣＤＲｂ１、およびＣＤＲｂ３により決定され、ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２のアミノ酸配列には依存しない。
【0132】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲａ２は、配列番号３２のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、および／またはＣＤＲｂ２は、配列番号３６のアミノ酸配列、または１、２、３、４、５、もしくは６個（好ましくは、５個以下、より好ましくは、４個以下、さらにより好ましくは、３個以下）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0133】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記で定義されているＣＤＲａ１、ＣＤＲｂ１、ならびに適宜、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲｂ２を含み、ＣＤＲａ３は、配列番号３３のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＣＤＲｂ３は、ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、好ましくは、Ｐであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであり、好ましくは、ＫもしくはＡであり、より好ましくは、Ｋである）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0134】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記で定義されているＣＤＲａ１、ＣＤＲｂ１、ならびに適宜、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲｂ２を含み、ＣＤＲａ３は、配列番号３４のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＣＤＲｂ３は、ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、好ましくは、Ｐであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであり、より好ましくは、ＫもしくはＡであり、好ましくは、Ｋである）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0135】
好ましい実施形態では、ＣＤＲｂ３は、ＡＳＳＰＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３６４）（式中、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであり、好ましくは、ＫもしくはＡであり、より好ましくは、Ｋである）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３６４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0136】
好ましい実施形態では、ＣＤＲｂ３は、ＡＳＳＰＧＸ２ＴＤＸ４ＱＹ（配列番号３６３）（式中、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであり、好ましくは、ＫもしくはＡであり、より好ましくは、Ｋである）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３６３と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0137】
他の好ましい実施形態では、ＣＤＲｂ３は、ＡＳＳＰＧＡＸ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３６５）（式中、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、好ましくは、Ｉであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡであり、好ましくは、Ｋである）のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３６５と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0138】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記で定義されているＣＤＲａ１、ＣＤＲｂ１、ならびに適宜、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲｂ２を含み、ＣＤＲａ３は、配列番号３３のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＣＤＲｂ３は、配列番号４８のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくは４個（好ましくは、１、２、もしくは３個、より好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号４８と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0139】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記で定義されているＣＤＲａ１、ＣＤＲｂ１、ならびに適宜、ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２を含み、ＣＤＲａ３は、配列番号３３のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＣＤＲｂ３は、配列番号４８、もしくは配列番号２８３、もしくは配列番号２８１、もしくは配列番号２９７のアミノ酸配列、または１、２、もしくは３個（好ましくは、１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号４８、配列番号２９７、配列番号２８１、もしくは配列番号２８３と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0140】
好ましい実施形態では、ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ３、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ３、ならびに適宜、ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２は、それぞれ、２個以下（好ましくは１個以下）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により、配列番号１６、配列番号３３または３４、配列番号１０、配列番号３２７、配列番号３２、および配列番号３６と異なる。好ましい実施形態では、ＣＤＲ中のアミノ酸置換は、保存的置換である。
【0141】
可変ドメインＶＡおよび可変ドメインＶＢは、共に、ＭＨＣタンパク質と複合体化されたＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドに結合する抗原結合部位を形成する。以下、この抗原結合部位をまた、「第１の抗原結合部位」と称する場合もある。
【0142】
ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３は、ＴＣＲ α鎖可変ドメインに由来しており、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３は、ＴＣＲ β鎖可変ドメインに由来している。
【0143】
ＣＤＲに加えて、ＶＡおよびＶＢは、フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。ＦＲ配列は、ＴＣＲ由来であってもよく、即ち、ＴＣＲ α鎖、β鎖、γ鎖、またはδ鎖の可変ドメインに由来してもよいし、抗体可変ドメインに由来してもよい。一例では、ＶＡは、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ配列を含み、そのため、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－Ｌ）と説明され得、ＶＢは、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ配列を含み、そのため、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－Ｈ）と説明され得る。ＶＡは、αまたはγ（好ましくはα）鎖可変ドメインのＦＲ配列を含み、そのため、（ＦＲ１－ａ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－ａ）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－ａ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－ａ）と説明され得、ＶＢは、βまたはδ（好ましくはβ）鎖可変ドメインのＦＲ配列を含み、そのため、（ＦＲ１－ｂ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－ｂ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－ｂ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－ｂ）と説明され得ることが好ましい。ＶＡドメイン全体がＴＣＲ α鎖に由来している場合には、ＶＡはまた、Ｖαとも称され得る。ＶＢドメイン全体がＴＣＲ β鎖に由来している場合には、Ｖｂはまた、Ｖβとも称され得る。
【0144】
いくつかの実施形態では、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２７位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、およびＳから選択される（特に、Ｔ、Ｎ、Ｓ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２８位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、およびＴから選択される（特に、Ｒ、Ａ、およびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の３８位は、Ｄであるか、またはＥ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＲ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ２の６４位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＦから選択される（特に、Ｒ、Ｔ、およびＶから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ３の１１４位は、ＬもしくはＹであるか、またはＭ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択される（特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択され、より特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５６位は、Ｆであるか、またはＹ、Ｍ、Ｌ、Ｗ、Ｈ、Ｖ、Ｉ、およびＡから選択される（特に、Ｙ、Ｍ、およびＬから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５７位は、Ｑであるか、またはＮ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＫ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、６３位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、５７位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５８位は、Ｎであるか、またはＱ、Ｈ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴ（特にＳ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６３位は、Ｔであるか、またはＳ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｑ、およびＥから選択される（特に、ＳおよびＥから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、５７位のアミノ酸がＮである場合には、６３位でのアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６４位は、Ａであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、およびＴ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６５位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ａ、Ｔ、Ｆ、およびＳから選択される（特に、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１０８位は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、およびＱから選択される（特に、ＲおよびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、１１０位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、１０８位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１０位は、ＡもしくはＳであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｔ、およびＣ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、１０８位のアミノ酸がＮである場合には、１１０位のアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１３位は、ＴもしくはＩであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、およびＴから選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１５位は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであるか、またはＧ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択される（特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択され、より特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＲから選択される）アミノ酸により置換されている。
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２７位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、およびＳから選択される（特に、Ｔ、Ｎ、Ｓ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２８位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、およびＴから選択される（特に、Ｒ、Ａ、およびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の３８位は、Ｄであるか、またはＥ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＲ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ２の６４位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＦから選択される（特に、Ｒ、Ｔ、およびＶから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ３の１１４位は、ＬもしくはＹであるか、またはＭ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択される（特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択され、より特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５６位は、Ｆであるか、またはＹ、Ｍ、Ｌ、Ｗ、Ｈ、Ｖ、Ｉ、およびＡから選択される（特に、Ｙ、Ｍ、およびＬから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５７位は、Ｑであるか、またはＮ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＫ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、６３位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、５７位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５８位は、Ｎであるか、またはＱ、Ｈ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴ（特にＳ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６３位は、Ｔであるか、またはＳ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｑ、およびＥから選択される（特に、ＳおよびＥから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、５７位のアミノ酸がＮである場合には、６３位でのアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６４位は、Ａであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、およびＴ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６５位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ａ、Ｔ、Ｆ、およびＳから選択される（特に、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１０８位は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、およびＱから選択される（特に、ＲおよびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、１１０位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、１０８位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１０位は、ＡもしくはＳであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｔ、およびＣ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、１０８位のアミノ酸がＮである場合には、１１０位のアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１３位は、ＴもしくはＩであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、およびＴから選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１５位は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであるか、またはＧ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択される（特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択され、より特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＲから選択される）アミノ酸により置換されている。
【0145】
いくつかの実施形態では、
－ ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＥＦＱＸ３（配列番号３３４）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｖ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、またはＳであり、好ましくは、Ｖ、Ｔ、またはＮであり、最も好ましくは、Ｖであり、Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、またはＡであり、より好ましくは、ＫまたはＲであり、最も好ましくは、Ｋであり、Ｘ３は、ＤまたはＮであり、好ましくは、Ｄであり、
－ ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列ＦＧＰＹＧＸ１Ｅ（配列番号３３５）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、またはＶであり、好ましくは、ＫまたはＲであり、最も好ましくは、Ｋであり、
－ ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＸ１ＤＭＲ（配列番号３３６）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＮであり、好ましくは、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、またはＲであり、より好ましくは、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、またはＡであり、最も好ましくは、ＬまたはＹであり、
－ ＣＤＲｂ１は、好ましくは、アミノ酸配列配列番号１０を含むか、またはからなり、
－ ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｍ、またはＬであり、好ましくは、ＦまたはＹであり、最も好ましくは、Ｆであり、Ｘ２は、ＱまたはＮであり、好ましくは、Ｑであり（Ｘ２がＮである場合には、Ｘ３もまた、Ｎである）、Ｘ３は、ＮまたはＳであり、好ましくは、Ｎであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、またはＥであり、好ましくは、ＴまたはＳであり、最も好ましくは、Ｔであり（Ｘ４がＳである場合には、Ｘ２は、Ｑである）、Ｘ５は、ＡまたはＴであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ６は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＴであり、好ましくは、ＶまたはＩであり、最も好ましくは、Ｖ（配列番号３３７）であり、より好ましくは、ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列Ｘ１ＱＸ３ＴＸ５Ｘ６（配列番号３５９）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｍ、またはＬであり、好ましくは、ＦまたはＹであり、最も好ましくは、Ｆであり、Ｘ３は、ＮまたはＳであり、好ましくは、Ｎであり、Ｘ５は、ＡまたはＴであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ６は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＴであり、好ましくは、ＶまたはＩであり、最も好ましくは、Ｖであり、
－ ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３３８）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｔ、またはＳであり、好ましくは、Ｐ、Ｔ、またはＡであり、最も好ましくは、Ｐであり、Ｘ２は、ＡまたはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ３は、ＴまたはＩであり、好ましくは、Ｔであり、Ｘ４は、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｅ、またはＦであり、好ましくは、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、またはＹであり、より好ましくは、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＲであり、最も好ましくは、ＫまたはＡである。
－ ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＥＦＱＸ３（配列番号３３４）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｖ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、またはＳであり、好ましくは、Ｖ、Ｔ、またはＮであり、最も好ましくは、Ｖであり、Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、またはＡであり、より好ましくは、ＫまたはＲであり、最も好ましくは、Ｋであり、Ｘ３は、ＤまたはＮであり、好ましくは、Ｄであり、
－ ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列ＦＧＰＹＧＸ１Ｅ（配列番号３３５）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、またはＶであり、好ましくは、ＫまたはＲであり、最も好ましくは、Ｋであり、
－ ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＸ１ＤＭＲ（配列番号３３６）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＮであり、好ましくは、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、またはＲであり、より好ましくは、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、またはＡであり、最も好ましくは、ＬまたはＹであり、
－ ＣＤＲｂ１は、好ましくは、アミノ酸配列配列番号１０を含むか、またはからなり、
－ ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｍ、またはＬであり、好ましくは、ＦまたはＹであり、最も好ましくは、Ｆであり、Ｘ２は、ＱまたはＮであり、好ましくは、Ｑであり（Ｘ２がＮである場合には、Ｘ３もまた、Ｎである）、Ｘ３は、ＮまたはＳであり、好ましくは、Ｎであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、またはＥであり、好ましくは、ＴまたはＳであり、最も好ましくは、Ｔであり（Ｘ４がＳである場合には、Ｘ２は、Ｑである）、Ｘ５は、ＡまたはＴであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ６は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＴであり、好ましくは、ＶまたはＩであり、最も好ましくは、Ｖ（配列番号３３７）であり、より好ましくは、ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列Ｘ１ＱＸ３ＴＸ５Ｘ６（配列番号３５９）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｍ、またはＬであり、好ましくは、ＦまたはＹであり、最も好ましくは、Ｆであり、Ｘ３は、ＮまたはＳであり、好ましくは、Ｎであり、Ｘ５は、ＡまたはＴであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ６は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＴであり、好ましくは、ＶまたはＩであり、最も好ましくは、Ｖであり、
－ ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３３８）を含むか、またはからなり、式中、Ｘ１は、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｔ、またはＳであり、好ましくは、Ｐ、Ｔ、またはＡであり、最も好ましくは、Ｐであり、Ｘ２は、ＡまたはＳであり、好ましくは、Ａであり、Ｘ３は、ＴまたはＩであり、好ましくは、Ｔであり、Ｘ４は、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｅ、またはＦであり、好ましくは、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、またはＹであり、より好ましくは、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＲであり、最も好ましくは、ＫまたはＡである。
【0146】
いくつかの実施形態では、
－ ＣＤＲａ１は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲａ２は、配列番号３２、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号２９の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲａ３は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号２２７、配列番号２３３、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲｂ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲｂ２は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、ならびに／または
－ ＣＤＲｂ３は、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、配列番号３０２および配列番号２７１、および配列番号２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなる。
－ ＣＤＲａ１は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲａ２は、配列番号３２、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号２９の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲａ３は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号２２７、配列番号２３３、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲｂ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、
－ ＣＤＲｂ２は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、ならびに／または
－ ＣＤＲｂ３は、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、配列番号３０２および配列番号２７１、および配列番号２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはからなる。
【0147】
好ましくは、抗原結合タンパク質は、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３４のＣＤＲａ３、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号４８または２９２のＣＤＲｂ３、ならびに適宜、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３６のＣＤＲｂ２を含む。
【0148】
好ましい例では、抗原結合タンパク質は、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３４のＣＤＲａ３、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号４８のＣＤＲｂ３、ならびに適宜、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３６のＣＤＲｂ２を含む。そのため、抗原結合タンパク質は、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３４のＣＤＲａ３、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号４８のＣＤＲｂ３、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３６のＣＤＲｂ２を含み得る。
【0149】
別の好ましい例では、抗原結合タンパク質は、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３４のＣＤＲａ３、配列番号１０のＣＤＲｂ１、および配列番号２９２のＣＤＲｂ３、ならびに適宜、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３６のＣＤＲｂ２を含む。そのため、抗原結合タンパク質は、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３４のＣＤＲａ３、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号２９２のＣＤＲｂ３、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３６のＣＤＲｂ２を含み得る。
【0150】
抗原結合タンパク質が、改変されることなく、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３３、配列番号３４、または配列番号９のＣＤＲａ３、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３、および適宜、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３６のＣＤＲｂ２を含むことが好ましい。
【0151】
いくつかの実施形態では、ＰＲＡＭＥ抗原ペプチドは、配列番号５０からなる。
【0152】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＭＨＣタンパク質との複合体の配列番号５０のアミノ酸配列に特異的に結合する。
【0153】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ）であり、好ましくはＨＬＡ－Ａであり、より好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２である。
【0154】
好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０のＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドの構造エピトープに特異的に結合する。より好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０のＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドの機能エピトープに特異的に結合する。
【0155】
本発明者らは、本発明の抗原結合タンパク質による結合に関連するＰＲＡＭＥ－００４の残基を特定するために、実験を実施した（図５、表４、１０、１２、１６）。結果として、本発明者らは、配列番号５０のアミノ酸３、５、６、７、および８位が結合に関連することを特定し得た。３位のアミノ酸は、本発明の抗原結合タンパク質により強く認識される。５位のアミノ酸も、強く認識される。最も強く認識されるのは、７位のアミノ酸である。６および８位のアミノ酸は、寄与が小さい。配列番号５０の３、５、および７位、ならびに適宜、６および８位はまた、本明細書では、ＰＲＡＭＥ－００４の「結合モチーフ」とも称される。正確なエピトープまたは機能エピトープの決定が、使用される方法および選択されるカットオフ値に応じてわずかに異なる可能性があることを、当業者は認識している。
【0156】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０の３、５、６、７、および８位、特に３、５、および７位からなる群から選択される３、４、または５箇所のアミノ酸位を含むかまたはからなる機能エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０のアミノ酸３、５、および７位を含む機能エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０のアミノ酸３、５、および７位、または３、５、６、および７位、または３、５、７、および８位、または３、５、６、７、および８位（好ましくは、配列番号５０のアミノ酸１および４位ではない）からなる機能エピトープに特異的に結合する。換言すると、抗原結合タンパク質は、好ましくは、ＭＨＣタンパク質（特に、ＨＬＡタンパク質、より特に、ＨＬＡ－Ａ、さらにより特に、ＨＬＡ－Ａ＊０２）との複合体の配列番号５０のアミノ酸３、５、および７位、ならびに適宜、６および／または８位（好ましくは、１または４位ではない）に特異的に結合する。一実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、配列番号５０の３、５、６、７、および８位からなる群から選択される少なくとも３箇所のアミン酸位を含む機能エピトープに特異的に結合し、但し、この抗原結合タンパク質は、配列番号５０のアミノ酸１および４位には結合しない。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０の１、３、４、５、６、７、および８位からなる群から選択される少なくとも６または７箇所のアミノ酸位を含むかまたはからなる機能エピトープに特異的に結合する。
【0157】
少なくとも１箇所の位置が置換されている配列番号５０に係るアミノ酸配列は、本明細書の文脈では、「ＰＲＡＭＥ変異体配列」と称される。特に、１箇所の位置は、アラニンに置換されている（配列番号３１８～３２４）。ＰＲＡＭＥ変異体配列を有するペプチドはまた、本明細書では、ＰＲＡＭＥ変異体ペプチドとも称される。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、低い親和性で、特に、配列番号５０のＰＲＡＭＥ抗原ペプチドへの結合に関するＫＤと比較して≧２、≧５、≧１０、≧２０、または≧３０倍高いＫＤで、ＭＨＣタンパク質との複合体中の、１、３、４、５、６、７、および８位の内の少なくとも１つ、特に、３、５、６、７、および８位の内の１つ、より特に、３、５、および７位の内の１つがアラニンに置換されているＰＲＡＭＥ変異体ペプチドに結合する。好ましくは、このＫＤは、上記の定義セクションで規定された通りに決定される。
【0158】
本発明の抗原結合タンパク質で使用され、特に、二重特異性抗原結合タンパク質で使用され、より特に、ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットで使用される場合には、本発明者らにより同定されたＣＤＲアミノ酸配列は、特に参照タンパク質と比較して、抗原結合タンパク質の結合親和性、安定性、および特異性が増加する。
【0159】
「参照タンパク質」は、本明細書では、本発明の抗原結合タンパク質が比較されるタンパク質を指す。本発明の抗原結合タンパク質と参照タンパク質との比較は、好ましくは並行して、同様の（好ましくは同一の）実験条件下で行なわれる。そのような参照タンパク質は、国際公開第２０１８／１７２５３３号パンフレットで開示されている親／野生型ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３のＣＤＲを含む抗原結合タンパク質であり得る。参照タンパク質は、好ましくは、比較される抗原結合タンパク質と同じフォーマットである。抗原結合タンパク質がｓｃＴＣＲである場合には、好適な参照タンパク質は、安定化突然変異を含むＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３の可変ドメインを含むｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤ（配列番号６）である。例えば、参照タンパク質は、ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３のＣＤＲを含む、本明細書で説明されているＴＣＥＲ（登録商標）であり得る。あるいは、参照タンパク質は、「ＣＤＲ６」のＣＤＲを含む抗原結合タンパク質［例えばＴＣＤＲ（登録商標）］である。「ＣＤＲ６」のＣＤＲは、アミノ酸配列ＤＲＧＳＱＳ（配列番号３３９）のＣＤＲａ１、アミノ酸配列ＩＹＳＮＧＤ（配列番号３４０）のＣＤＲａ２、アミノ酸配列ＡＡＶＩＤＮＤＱＧＧＩＬＴ（配列番号３４１）のＣＤＲａ３、アミノ酸配列ＰＧＨＲＡ（配列番号３４２）のＣＤＲｂ１、アミノ酸配列ＹＶＨＧＥＥ（配列番号３４３）のＣＤＲｂ２、およびアミノ酸配列ＡＳＳＰＷＤＳＰＮＶＱＹ（配列番号３４４）のＣＤＲｂ３である。参照タンパク質は、配列番号１５３を含むかまたはからなる第１のポリペプチド鎖と、配列番号１５４を含むかまたはからなる第２のポリペプチド鎖とを含むＣＤＲ６ ＴＣＥＲ（登録商標）（ＴＰＰ－１１０９）であり得る。ＴＰＰ－１１０９は、配列番号１０８および１０９に対応するＵＣＨＴ１（Ｖ１７）リクルーターを含む。さらに、参照タンパク質は、配列番号３５７を含むかまたはからなるポリペプチド鎖を有するＣＤＲ６ ｓｃＴＣＲであり得る。本発明者らは、実施例において、ＣＤＲ６のＣＤＲを含む抗原結合タンパク質［特にＴＣＥＲ（登録商標）ＴＰＰ－１１０９］が、ＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドの５、６、７、および８位のアミノ酸に結合するが、２および３位のアミノ酸には結合しないことを示す（表１６）。そのため、ＣＤＲ６のＣＤＲを含む抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドのアミノ酸３には結合せず、このアミノ酸３は、対照的に、本発明の抗原結合タンパク質による強い結合／認識を受ける。
【0160】
親和性
本発明の抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体に対する親和性を高めるように選択されたＣＤＲ配列を含む（図２、表３）。実施例（表４、８、１０、１２、１５、および１６）から分かるように、本発明の抗原結合タンパク質は、高い親和性（特に、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、または≦３ｎＭのＫＤ）でＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体に結合する。
本発明の抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体に対する親和性を高めるように選択されたＣＤＲ配列を含む（図２、表３）。実施例（表４、８、１０、１２、１５、および１６）から分かるように、本発明の抗原結合タンパク質は、高い親和性（特に、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、または≦３ｎＭのＫＤ）でＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体に結合する。
【0161】
従って、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、親和性が増加しており、特に、参照タンパク質と比較して親和性が増加している。
【0162】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、好ましくは≦５ｎＭ、より好ましくは≦３ｎＭ、例えば１０ｐＭ～１００ｎＭ、１０ｐＭ～５０ｎＭ、１０ｐＭ～１０ｎＭ、１０ｐＭ～５ｎＭ、１０ｐＭ～３ｎＭのＫＤで、配列番号５０のアミノ酸配列およびＨＬＡ分子（好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２）を含むかまたはからなるＰＲＡＭＥペプチドの複合体に結合する。
【0163】
一例では、本発明の抗原結合タンパク質は、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂであり、かつ≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、好ましくは≦１５ｎＭ、例えば１０ｐＭ～１００ｎＭ、１０ｐＭ～５０ｎＭ、１０ｐＭ～２０ｎＭ、５ｎＭ～２０ｎＭのＫＤで、配列番号５０のアミノ酸配列およびＨＬＡ分子（好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２）を含むかまたはからなるＰＲＡＭＥペプチドの複合体に結合する。
【0164】
さらなる一例では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＣＥＲであり、かつ≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、好ましくは≦５ｎＭ、より好ましくは≦３ｎＭ、例えば１０ｐＭ～１００ｎＭ、１０ｐＭ～５０ｎＭ、１０ｐＭ～１０ｎＭ、１０ｐＭ～５ｎＭ、１０ｐＭ～３ｎＭのＫＤで、配列番号５０のアミノ酸配列およびＨＬＡ分子（好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２）を含むかまたはからなるＰＲＡＭＥペプチドの複合体に結合する。
【0165】
ＫＤ等の親和性を測定する方法は、当業者に既知であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および生体層干渉法が挙げられる。ＫＤを決定する例示的な方法はまた、実施例セクションでも説明されている。当業者に既知であるように、これら実験に使用される実験条件（例えば、使用される緩衝液、タンパク質の濃度）は、結果に強い影響を及ぼす可能性がある。
【0166】
従って、一例では、本発明の抗原結合タンパク質は、例えばＴＣＥＲ（登録商標）として発現され、ＨＬＡ－Ａ＊０２：ＰＲＡＭＥ－００４単量体に対する結合親和性に関して分析される。典型的には、測定を、例えば、典型的には製造業者により推奨される設定を使用するＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで実施する。簡潔に説明すると、結合反応速度を、典型的には、３０℃で、かつ例えば、緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して１０００ｒｐｍの浸透速度で、測定した。ペプチド－ＨＬＡ複合体（特に、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４複合体）を、ＴＣＥＲ（登録商標）の連続希釈液を分析する前に、ＨＩＳ１Ｋ等のバイオセンサー上にロードした。
【0167】
本明細書で開示されているように、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＰＲＡＭＥ抗原ペプチドと、ＨＬＡ分子（好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２）との複合体に、特異的に結合する。この抗原結合タンパク質が、Ｔ細胞上で発現されるＴＣＲの場合には、この抗原結合タンパク質の前記複合体への結合により、結合時に免疫反応が誘発され得る。従って、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、免疫反応を誘導し、好ましくは、この免疫反応は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）レベルの増加を特徴とする。
【0168】
収量
本発明者らは、本抗原結合タンパク質が高い最終生成物収量を有しており、特に、≧１ｍｇ／ｌ、≧１．５ｍｇ／ｌ、≧２ｍｇ／ｌ、≧５ｍｇ／ｌ、≧１０ｍｇ／ｌ、≧１５ｍｇ／ｌ、≧２０ｍｇ／ｌ、≧３０ｍｇ／ｌ、≧４０ｍｇ／ｌ、≧５０ｍｇ／ｌ、≧６０ｍｇ／ｌの収量を有していることを、実施例で実証している（表５、６、７、９、１１、および１４）。
本発明者らは、本抗原結合タンパク質が高い最終生成物収量を有しており、特に、≧１ｍｇ／ｌ、≧１．５ｍｇ／ｌ、≧２ｍｇ／ｌ、≧５ｍｇ／ｌ、≧１０ｍｇ／ｌ、≧１５ｍｇ／ｌ、≧２０ｍｇ／ｌ、≧３０ｍｇ／ｌ、≧４０ｍｇ／ｌ、≧５０ｍｇ／ｌ、≧６０ｍｇ／ｌの収量を有していることを、実施例で実証している（表５、６、７、９、１１、および１４）。
【0169】
本発明者らは、本抗原結合タンパク質が、高い最終生成物収量を有しており、特に、参照タンパク質と比較して増加している収量を有しており、より特に、同一条件下で発現された「ＣＤＲ６」のＣＤＲを含む抗原結合タンパク質と比較して増加した収量を有していることを、実施例で実証している（表５、６、７、９、１１、および１４）。
【0170】
一例では、本抗原結合タンパク質は、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ（実施例２で説明されている）であり、かつ≧８ｍｇ／ｌ、≧１０ｍｇ／ｌ、≧１５ｍｇ／ｌ、≧２０ｍｇ／ｌ、≧３０ｍｇ／ｌ、≧４０ｍｇ／ｌ、≧５０ｍｇ／ｌ、≧６０ｍｇ／ｌ、≧７０ｍｇ／ｌ、例えば、８ｍｇ／ｌ～８５ｍｇ／ｌ、１０ｍｇ／ｌ～８５ｍｇ／ｌ、１４ｍｇ／ｌ～８５ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ～８５ｍｇ／ｌの生成物収量を有している。
【0171】
別では、本抗原結合タンパク質は、Ｒｅｃｒｕｉｔｅｒ ＵＣＨＴ１Ｖ１７のＶＬおよびＶＨを含むＴＣＥＲであり、かつ≧１０ｍｇ／ｌ、≧１２ｍｇ／ｌ、≧１５ｍｇ／ｌ、≧１６ｍｇ／ｌ、≧１７ｍｇ／ｌ、≧１８ｍｇ／ｌ、好ましくは≧１５ｍｇ／ｌ、例えば１０ｍｇ／ｌ～３０ｍｇ／ｌ、１５ｍｇ／ｌ～２５ｍｇ／ｌ、１５ｍｇ／ｌ～３０ｍｇ／ｌ、好ましくは１５ｍｇ／ｌ～３０ｍｇ／ｌの生成物収量を有する。
【0172】
最終生成物収量は、典型的には、トランスフェクション後１０～１１日で決定される。生成物収量を測定する方法は、当業者に既知である。例示的な手順は、実施例セクションで説明されている。
【0173】
従って、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、同一条件下で発現された場合に、特に参照タンパク質と比較して、収量が改善されている。
【0174】
安定性
本発明者らは、本抗原結合タンパク質が高い安定性を有することを、実施例で実証している（表５、６、７、９、１１、および１４）。
本発明者らは、本抗原結合タンパク質が高い安定性を有することを、実施例で実証している（表５、６、７、９、１１、および１４）。
【0175】
本発明に関連する「安定性」という用語は、物理的安定性を指しており、かつ当該技術分野で説明されており、例えば、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)およびJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)で概説されている様々な分析技術を使用して、定性的におよび／または定量的に評価し得る。安定性を測定するために、本発明の抗原結合タンパク質を含むサンプルを、安定性試験で試験し得、この試験では、サンプルを、ストレス条件に、選択された期間にわたり暴露し、続いて、適切な分析技術を使用して、化学的安定性および物理的安定性の定量的分析および適宜定性的分析を行なう。本発明に関連して、この方法は、特に、濁度を測定することによる［例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）もしくは光遮蔽（ＬＯ）］、および／または目視検査による（例えば、色および透明度の決定による）、凝集体形成の評価［例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する］を指す。サンプルは、下記で定義するようにわずかな凝集だけがある場合に、安定とみなされる。
【0176】
本発明に関連して、安定性の改善は、例えば、熱ストレスに暴露された場合での物理的安定性の増加を指す。そのため、新たに開発された本発明の抗原結合タンパク質は、参照タンパク質と比べて、ストレス条件（特に、熱ストレス）によく耐え得る。
【0177】
「低凝集」は、例えば、本抗原結合タンパク質を含むサンプルは、典型的には、ＰＢＳ等の緩衝液中でＳＥＣ－ＨＰＬＣ等のＳＥＣにより測定した場合に、ストレス条件（例えば、ＰＢＳ等の緩衝液中での１４日にわたる４０℃の温度）に暴露された後に、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％の単量体含有量（例えば、９４％～９９％、９５％～９９％、９６％～９９％、９７％～９９％の単量体含有量）を有していることを意味する。ＳＥＣの場合、単量体含有量の１％、２％、３％、４％、好ましくは１または２％、より好ましくは１％の差違は、使用されるカラム、操作圧力、および緩衝液の速度に依存する試験条件下で、本発明に関連して有意な差違とみなされる。換言すると、参照抗原結合タンパク質が、９６％の単量体含有量を有しており、かつ本発明の抗原結合タンパク質が、９７％の単量体含有量を有している場合には、本発明の抗原結合タンパク質の単量体含有量は、同一条件下で測定された場合に、参照抗原結合タンパク質と比較して有意に異なっており、そのため有意に増加している。
【0178】
本発明者らは、本抗原結合タンパク質が安定であり、特に、ＰＢＳ等の緩衝液中における４０℃での１４日間後に、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９５％、≧９７％の単量体含有量を有することを実証している（表５、６、７、９、１１、および１４）。
【0179】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ある特定の期間にわたりストレス条件に暴露された場合（例えば、４０℃の温度に１４日間暴露された場合）に、特に参照タンパク質と比較して、安定であるか、または安定性が改善されている。
【0180】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ある特定の期間にわたりストレス条件に暴露された場合（例えば、４０℃の温度に１４日間暴露された場合）に、特に参照タンパク質と比較して、凝集を示さないかもしくはわずかしか示さず、または凝集の減少を示す。
【0181】
特異性
本発明者らは、実施例（図３～６、表３、４、８、１３、１５）において、本発明の抗原結合タンパク質が、標的抗原、即ち、ＭＨＣタンパク質との複合体（好ましくは、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体）中における配列番号５０を含むＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに、高い特異性で結合することを実証している。
本発明者らは、実施例（図３～６、表３、４、８、１３、１５）において、本発明の抗原結合タンパク質が、標的抗原、即ち、ＭＨＣタンパク質との複合体（好ましくは、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体）中における配列番号５０を含むＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに、高い特異性で結合することを実証している。
【0182】
上記で説明したように、本発明者らは、ＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチド（即ち、ＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドの「結合モチーフ」）への本発明の抗原結合タンパク質の結合に関連する配列番号５０のアミノ酸３、５、６、７、および８位、特に３、５、および７位を同定した。本発明者らは、例えば、ＰＲＡＭＥ－００４の配列および／またはモチーフに類似しており、そのため、ＰＲＡＭＥ－００４に抗原結合タンパク質が結合するリスクが増加する、潜在的なオフターゲットペプチドを同定した。
【0183】
本発明に関連して、「類似ペプチド」は、本明細書では、潜在的なオフターゲットペプチドを指しており、即ち、生化学的／生物物理学的特性に基づいて本発明の抗原結合分子が結合する可能性があり得るペプチド（例えば、限定されないが、相同配列または類似モチーフ）を指す。類似ペプチドは、典型的には、８～１１個のアミノ酸の長さである。本発明に関連する類似ペプチドは、典型的には、ＭＨＣにより提示されている。さらに、本発明に関連する類似ペプチドとして、ＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドのアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含むかまたはからなるペプチドが挙げられ、より特に、ＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチドのエピトープと比較して、一部または全てのアミノ酸が、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドのエピトープを構成するアミノ酸と同一および／または類似の生化学的／生物物理学的特性を有するエピトープを含むペプチドが挙げられる。いくつかの実施例では、本発明に関連して調査する類似ペプチドを、ＰＲＡＭＥ－００４の結合関連位置内での類似性スコアリング、および正常組織での少なくとも１つの検出の要件を使用して、腫瘍および正常組織により提示されたＨＬＡ－Ａ＊０２結合ペプチドのデータベース（ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）データベース）から選択した。ＭＨＣタンパク質により提示される類似ペプチドへの抗原結合タンパク質の結合は、有害反応を引き起こす場合がある。そのような有害反応は、Lowdell et al., Cytotherapy, published on December 4, 2018で報告されている特定のＴＣＲと健康組織中の類似ペプチドとの交差反応性等の「オフ腫瘍（ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）」副作用の場合がある。
【0184】
特に、下記のペプチドは、本発明に関連する類似ペプチドである：ＴＭＥＤ９－００１（配列番号５１）、ＣＡＴ－００１（配列番号５２）、ＤＤＸ６０Ｌ－００１（配列番号５３）、ＬＲＲＣ７０－００１（配列番号５４）、ＰＴＰＬＢ－００１（配列番号５５）、ＨＤＡＣ５－００１（配列番号５６）、ＶＰＳ１３Ｂ－００２（配列番号５７）、ＺＮＦ３１８－００１（配列番号５８）、ＣＣＤＣ５１－００１（配列番号５９）、ＩＦＴ１７－００３（配列番号６０）、ＤＩＡＰＨ１－００４（配列番号６２）、ＦＡＤＳ２－００１（配列番号６３）、ＦＲＹＬ－００３（配列番号６４）、ＧＩＭＡＰ８－００１（配列番号６５）、ＨＳＦ１－００１（配列番号６６）、ＫＮＴ－００１（配列番号６７）、ＭＡＵ－００１（配列番号６８）、ＭＣＭ４－００１（配列番号６９）、ＭＰＰＥ１－００１（配列番号７１）、ＭＹＯ１Ｂ－００２（配列番号７２）、ＰＲＲ１２－００１（配列番号７３）、ＰＴＲＦ－００３（配列番号７４）、ＲＡＳＧＲＰ１－００１（配列番号７５）、ＳＭＡＲＣＤ１－００１（配列番号７６）、ＴＧＭ２－００１（配列番号７７）、ＶＡＶ１－００１（配列番号７８）、ＶＩＭ－００９（配列番号３１７） ＦＡＲＳＡ－００１（配列番号３０６）、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３（配列番号３０４）、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２（配列番号３０５）、ＧＰＲ５６－００２（配列番号３０７）、ＩＧＨＤ－００２（配列番号３０８）、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２（配列番号３０９）、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５（配列番号３１０）、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８（配列番号３１１）、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７（配列番号３１２）、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８（配列番号３１３）、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５（配列番号３１４）、ＰＤＣＤ１０－００４（配列番号３１５）、ＴＳＮ－００１（配列番号３１６）、ＡＲＭＣ９－００２（配列番号１８７）、ＣＬＩ－００１（配列番号１８８）、ＣＯＰＧ１－００１（配列番号１９０）、ＣＯＰＳ７Ａ－００１（配列番号１９２）、ＥＩＦ－００９（配列番号１９４）、ＥＸＴ２－００６（配列番号１９６）、ＬＭＮＡ－００１（配列番号１９８）、ＰＫＭ－００５（配列番号２００）、ＰＳＭＢ３－００２（配列番号２０２）、ＲＰＬ－００７（配列番号２０４）、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３（配列番号２０６）、ＳＹＮＥ１－００２（配列番号２０８）、ＴＧＭ２－００２（配列番号２１０）およびＴＰＲ－００４（配列番号２１２）。
【0185】
「特異性」という用語は、一般に、抗原結合タンパク質の、上記で定義された類似ペプチドから標的ペプチドを識別する能力を示す。換言すると、抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体に、高い親和性で結合し、特に、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、好ましくは５ｎＭ未満のＫＤで結合するが、類似ペプチド：ＭＨＣ複合体には有意に結合しない。
【0186】
当業者は、類似ペプチドの中には、検出可能な程度まで本発明の抗原結合タンパク質が結合しないもの（例えば、バックグラウンドレベルを超える結合シグナルまたは機能的反応が検出不能であるペプチド）が存在するであろうことを認識しており、「バックグラウンドレベル」は、非相同の「非類似」ペプチドの場合に観察されるかまたはペプチドの非存在下で観察される結合シグナルまたは機能的反応を指す。
【0187】
他の類似ペプチドの場合には、非常に低いが有意ではない結合が検出可能である。この後者の類似ペプチドはまた、「潜在的に関連する」類似ペプチドとも説明され得る。「有意ではない結合」、「有意に結合しない」という表現は、抗原結合タンパク質が、
１）ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤと比較して、≧２５、≧３０、≧４０、≧５０、≧７５、もしくは≧１００倍増加したＫＤで結合する（例えば、類似ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する）こと；
２）ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体に対する機能的反応と比較して有意に低下した「機能的反応」（例えば、類似ペプチド：ＭＨＣ複合体に対する機能的反応）を示すこと；または
３）ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ多量体による検出と比較して、標識された類似ペプチド：ＭＨＣ多量体による有意に減少した検出を示すこと
を示す。
１）ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤと比較して、≧２５、≧３０、≧４０、≧５０、≧７５、もしくは≧１００倍増加したＫＤで結合する（例えば、類似ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する）こと；
２）ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体に対する機能的反応と比較して有意に低下した「機能的反応」（例えば、類似ペプチド：ＭＨＣ複合体に対する機能的反応）を示すこと；または
３）ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ多量体による検出と比較して、標識された類似ペプチド：ＭＨＣ多量体による有意に減少した検出を示すこと
を示す。
【0188】
親和性（特に、ＫＤ）を、好ましくは、実施例セクションで説明する生体層干渉法（ＢＬＩ）を使用して測定する。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤと比較した類似ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤの増加をまた、２つのＫＤの比としても表し得る。例えば、類似ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤが、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤと比較して１００倍増加している場合には、ＫＤ比「類似ペプチド／ＰＲＡＭＥ－００４」は、１００である。当業者は、類似ペプチド：ＭＨＣ複合体に対する親和性は、結合が弱すぎる場合に測定できない場合があることを認識している。
【0189】
「機能的反応」は、機能的アッセイ（例えば、ＩＦＮ－ガンマ放出アッセイ等の活性化アッセイ）または本明細書の下記の実験セクションで説明されているＬＤＨ放出アッセイ等の細胞傷害性アッセイで測定される反応を指す。ＩＦＮ－ガンマ放出アッセイは、特定のペプチド：ＭＨＣ複合体に暴露されたＴ細胞により放出されたＩＦＮ－ガンマを測定する。ＬＤＨ放出アッセイは、ペプチド：ＭＨＣ複合体を表面上で発現する標的細胞から放出され、このペプチド：ＭＨＣ複合体に特異的に結合するＴ細胞により殺滅されるＬＤＨを測定する。この結合は、Ｔ細胞上で発現されるＴＣＲを介して直接的であってもよいし、ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合しかつＴ細胞にも結合する（即ち、Ｔ細胞をリクルートする）可溶性二重特異性分子を介して間接的であってもよい。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＥＣ５０と比較して、ＥＣ５０が≧２５、≧３０、≧４０、≧５０、≧７５、または≧１００倍増加しており、好ましくは、≧２００、≧３００、≧５００、または≧１０００倍増加している場合には、ＩＦＮ－ガンマ放出アッセイでの機能的反応は、有意に低下したとみなされる。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＥＣ５０と比較して、ＥＣ５０が≧２５、≧３０、≧４０、≧５０、≧７５、または≧１００倍増加しており、好ましくは、≧２００、≧３００、≧５００、または≧１０００倍増加している場合には、ＬＤＨ放出アッセイでの機能的反応は、有意に低下したとみなされる。
【0190】
標識された類似ペプチド：ＭＨＣ多量体による検出は、特に、類似ペプチド：ＭＨＣ四量体による染色を指しており、抗原結合タンパク質は、細胞（好ましくは、酵母細胞）の表面上で発現される（実施例１．１および１．２）。陽性（即ち、染色された）細胞の数が、細胞の総数の≦５％、≦３％、もしくは≦１％である場合には、または陽性細胞の数が、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ四量体で染色された陽性細胞の≦１０％、≦５％、もしくは≦２．５％である場合には、またはＥＣ５０が、５０分の１以下、７５分の１以下、１００分の１以下、１５０分の１以下、２００分の１以下に減少した場合には、検出は、有意に減少したとみなされる。
【0191】
本発明の抗原結合タンパク質は、標的ペプチドに対して高い親和性を有するように設計されており、さらに類似ペプチドへの結合が回避されている。これは、本発明の抗原結合タンパク質の重要な利点であり、なぜならば、類似ペプチドへの結合は、正常な組織に存在する場合に副作用のリスクを増加させるからである。従って、本発明の抗原結合タンパク質が類似ペプチドに低親和性でのみ結合するという事実から、この抗原結合タンパク質は、安全性に関して有望な抗がん処置となる。
【0192】
本発明者らは、抗原結合タンパク質（特に、ＴＣＥＲ（登録商標）分子）が、ＬＤＨ放出アッセイにより、標的ペプチドＰＲＡＭＥ－００４が負荷されたＴ２細胞において細胞溶解を引き起こすことを実証している（表１７）。本発明者らは、抗原結合タンパク質（特に、ＴＣＥＲ（登録商標）分子）が、ＬＤＨ放出アッセイにより、ＰＲＡＭＥ－陽性腫瘍細胞株において細胞溶解を引き起こすが、ＰＲＡＭＥ陰性腫瘍細胞株が、ＴＣＥＲ（登録商標）分子との共培養により影響を受けなかったことをさらに実証している（図７～９）。これらのインビトロ実験により、さらに、本発明の抗原結合タンパク質の安全性が証明され、細胞傷害効果が、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍組織に対して高度に選択的であることが立証される。従って、本発明の分子は、有益な安全性プロファイルを示す。
【0193】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＭＨＣとの複合体中のＴＭＥＤ９－００１、ＣＡＴ－００１、ＤＤＸ６０Ｌ－００１、ＬＲＲＣ７０－００１、ＰＴＰＬＢ－００１、ＨＤＡＣ５－００１、ＶＰＳ１３Ｂ－００２、ＺＮＦ３１８－００１、ＣＣＤＣ５１－００１、ＩＦＴ１７－００３、ＤＩＡＰＨ１－００４、ＦＡＤＳ２－００１、ＦＲＹＬ－００３、ＧＩＭＡＰ８－００１、ＨＳＦ１－００１、ＫＮＴ－００１、ＭＡＵ－００１、ＭＣＭ４－００１、ＭＰＰＥ１－００１、ＭＹＯ１Ｂ－００２、ＰＲＲ１２－００１、ＰＴＲＦ－００３、ＲＡＳＧＲＰ１－００１、ＳＭＡＲＣＤ１－００１、ＴＧＭ２－００１、ＶＡＶ１－００１、ＶＩＭ－００９、ＦＡＲＳＡ－００１、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２、ＧＰＲ５６－００２、ＩＧＨＤ－００２、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５、ＰＤＣＤ１０－００４、ＴＳＮ－００１、ＡＲＭＣ９－００２、ＣＬＩ－００１、ＣＯＰＧ１－００１、ＣＯＰＳ７Ａ－００１、ＥＩＦ－００９、ＥＸＴ２－００６、ＬＭＮＡ－００１、ＰＫＭ－００５、ＰＳＭＢ３－００２、ＲＰＬ－００７、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３、ＳＹＮＥ１－００２、ＴＧＭ２－００２、およびＴＰＲ－００４からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０個、または全ての類似ペプチドに有意に結合しない。
【0194】
好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＭＨＣとの複合体中のＩＦＴ１７－００３に有意に結合しない。
【0195】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体に対する機能的反応と比較して、ＭＨＣとの複合体中のＴＭＥＤ９－００１、ＣＡＴ－００１、ＤＤＸ６０Ｌ－００１、ＬＲＲＣ７０－００１、ＰＴＰＬＢ－００１、ＨＤＡＣ５－００１、ＶＰＳ１３Ｂ－００２、ＺＮＦ３１８－００１、ＣＣＤＣ５１－００１、ＩＦＴ１７－００３、ＤＩＡＰＨ１－００４、ＦＡＤＳ２－００１、ＦＲＹＬ－００３、ＧＩＭＡＰ８－００１、ＨＳＦ１－００１、ＫＮＴ－００１、ＭＡＵ－００１、ＭＣＭ４－００１、ＭＰＰＥ１－００１、ＭＹＯ１Ｂ－００２、ＰＲＲ１２－００１、ＰＴＲＦ－００３、ＲＡＳＧＲＰ１－００１、ＳＭＡＲＣＤ１－００１、ＴＧＭ２－００１、ＶＡＶ１－００１、ＶＩＭ－００９、ＦＡＲＳＡ－００１、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２、ＧＰＲ５６－００２、ＩＧＨＤ－００２、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５、ＰＤＣＤ１０－００４、ＴＳＮ－００１、ＡＲＭＣ９－００２、ＣＬＩ－００１、ＣＯＰＧ１－００１、ＣＯＰＳ７Ａ－００１、ＥＩＦ－００９、ＥＸＴ２－００６、ＬＭＮＡ－００１、ＰＫＭ－００５、ＰＳＭＢ３－００２、ＲＰＬ－００７、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３、ＳＹＮＥ１－００２、ＴＧＭ２－００２、およびＴＰＲ－００４からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０個、または全ての類似ペプチドに対して有意に低い機能的反応を示す。好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体に対する機能的反応と比較して、ＭＨＣとの複合体中のＩＦＴ１７－００３に対する有意に低い機能的反応を示す。
【0196】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質（特に、可溶性二重特異性抗原結合タンパク質、より特に、ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットの抗原結合タンパク質）は、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤと比較して≧２５、≧３０、≧４０、≧５０、≧７５、または≧１００倍増加しているＫＤで、ＭＨＣとの複合体中のＴＭＥＤ９－００１、ＣＡＴ－００１、ＤＤＸ６０Ｌ－００１、ＬＲＲＣ７０－００１、ＰＴＰＬＢ－００１、ＨＤＡＣ５－００１、ＶＰＳ１３Ｂ－００２、ＺＮＦ３１８－００１、ＣＣＤＣ５１－００１、ＩＦＴ１７－００３、ＤＩＡＰＨ１－００４、ＦＡＤＳ２－００１、ＦＲＹＬ－００３、ＧＩＭＡＰ８－００１、ＨＳＦ１－００１、ＫＮＴ－００１、ＭＡＵ－００１、ＭＣＭ４－００１、ＭＰＰＥ１－００１、ＭＹＯ１Ｂ－００２、ＰＲＲ１２－００１、ＰＴＲＦ－００３、ＲＡＳＧＲＰ１－００１、ＳＭＡＲＣＤ１－００１、ＴＧＭ２－００１、ＶＡＶ１－００１、ＶＩＭ－００９、ＦＡＲＳＡ－００１、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２、ＧＰＲ５６－００２、ＩＧＨＤ－００２、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５、ＰＤＣＤ１０－００４、ＴＳＮ－００１、ＡＲＭＣ９－００２、ＣＬＩ－００１、ＣＯＰＧ１－００１、ＣＯＰＳ７Ａ－００１、ＥＩＦ－００９、ＥＸＴ２－００６、ＬＭＮＡ－００１、ＰＫＭ－００５、ＰＳＭＢ３－００２、ＲＰＬ－００７、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３、ＳＹＮＥ１－００２、ＴＧＭ２－００２、およびＴＰＲ－００４からなる群から選択され、特に、ＧＩＭＡＰ８－００１、ＭＹＯ１Ｂ－００２、ＳＭＡＲＣＤ１－００１、ＶＩＭ－００９、ＦＡＲＳＡ－００１、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２、ＧＰＲ５６－００２、ＩＧＨＤ－００２、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５、ＰＤＣＤ１０－００４、ＴＳＮ－００１からなる群、ならびに／またはＡＲＭＣ９－００２、ＣＬＩ－００１、ＣＯＰＧ１－００１、ＣＯＰＳ７Ａ－００１、ＥＩＦ－００９、ＥＸＴ２－００６、ＬＭＮＡ－００１、ＰＫＭ－００５、ＰＳＭＢ３－００２、ＲＰＬ－００７、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３、ＳＹＮＥ１－００２、ＴＧＭ２－００２、およびＴＰＲ－００４からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５個、または全ての類似ペプチドに結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質（特に、可溶性二重特異性抗原結合タンパク質、より特に、ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットの抗原結合タンパク質）は、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合に関するＫＤと比較して≧２５、≧３０、≧４０、≧５０、≧７５、または≧１００倍増加しているＫＤで、ＭＨＣとの複合体中のＩＦＴ１７－００３に結合する。
【0197】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、特に、細胞表面上で発現された場合に、より特に、酵母細胞表面上で発現された場合に、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ多量体による検出と比較して、ＭＨＣとの複合体の、ＴＭＥＤ９－００１、ＣＡＴ－００１、ＤＤＸ６０Ｌ－００１、ＬＲＲＣ７０－００１、ＰＴＰＬＢ－００１、ＨＤＡＣ５－００１、ＶＰＳ１３Ｂ－００２、ＺＮＦ３１８－００１、ＣＣＤＣ５１－００１、ＩＦＴ１７－００３、ＤＩＡＰＨ１－００４、ＦＡＤＳ２－００１、ＦＲＹＬ－００３、ＧＩＭＡＰ８－００１、ＨＳＦ１－００１、ＫＮＴ－００１、ＭＡＵ－００１、ＭＣＭ４－００１、ＭＰＰＥ１－００１、ＭＹＯ１Ｂ－００２、ＰＲＲ１２－００１、ＰＴＲＦ－００３、ＲＡＳＧＲＰ１－００１、ＳＭＡＲＣＤ１－００１、ＴＧＭ２－００１、ＶＡＶ１－００１、ＶＩＭ－００９、ＦＡＲＳＡ－００１、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２、ＧＰＲ５６－００２、ＩＧＨＤ－００２、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５、ＰＤＣＤ１０－００４、ＴＳＮ－００１、ＡＲＭＣ９－００２、ＣＬＩ－００１、ＣＯＰＧ１－００１、ＣＯＰＳ７Ａ－００１、ＥＩＦ－００９、ＥＸＴ２－００６、ＬＭＮＡ－００１、ＰＫＭ－００５、ＰＳＭＢ３－００２、ＲＰＬ－００７、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３、ＳＹＮＥ１－００２、ＴＧＭ２－００２、およびＴＰＲ－００４からなる群から選択される類似ペプチドを含み、特に、ＴＭＥＤ９－００１、ＣＡＴ－００１、ＤＤＸ６０Ｌ－００１、ＬＲＲＣ７０－００１、ＰＴＰＬＢ－００１、ＨＤＡＣ５－００１、ＶＰＳ１３Ｂ－００２、ＺＮＦ３１８－００１、ＣＣＤＣ５１－００１、ＩＦＴ１７－００３、ＤＩＡＰＨ１－００４、ＦＡＤＳ２－００１、ＦＲＹＬ－００３、ＧＩＭＡＰ８－００１、ＨＳＦ１－００１、ＫＮＴ－００１、ＭＡＵ－００１、ＭＣＭ４－００１、ＭＰＰＥ１－００１、ＭＹＯ１Ｂ－００２、ＰＲＲ１２－００１、ＰＴＲＦ－００３、ＲＡＳＧＲＰ１－００１、ＳＭＡＲＣＤ１－００１、ＴＧＭ２－００１、およびＶＡＶ１－００１からなる群から選択される類似ペプチドを含み、より特に、ＩＦＴ１７－００３を含む標識された類似ペプチド：ＭＨＣ多量体による有意に低い検出を示す。
【0198】
本発明の抗原結合性タンパク質は、高い安全性プロファイルを有する。
【0199】
「安全性プロファイル」は、本明細書では、腫瘍細胞（特に、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示腫瘍細胞）と健康な細胞とを区別する能力を指す。この能力は、安全性ウィンドウの表示で表されることが多い。
【0200】
「安全性ウィンドウ」または「治療ウィンドウ」は、本明細書では、腫瘍細胞（特に、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示腫瘍細胞）に対して、ある程度の細胞傷害性（例えば、１０％、５０％、９０％、または１００％の細胞傷害性）を誘導するのに必要な化合物の濃度と、健康な細胞に対して細胞傷害性（好ましくは、同程度の程度の細胞傷害性、より好ましくは、同程度の細胞傷害性）を誘導するのに必要な濃度とを比較するパラメータを指す。例えば、腫瘍細胞株に対して９０％の細胞傷害性を誘導するのに必要な抗原タンパク質の濃度が１ｐＭであり、例えば健康な細胞に対して９０％の細胞傷害性を誘導するのに必要な濃度が１０００ｐＭである場合には、安全性ウィンドウは、１０００であり、なぜならば、腫瘍細胞株に必要な細胞傷害性濃度は、健康な細胞に必要な濃度と比べて１０００分の１であるからである。
【0201】
いくつかの実施形態では、安全性ウィンドウは、腫瘍細胞に対して最大半量（５０％）細胞傷害性（ＥＣ５０）を誘導するのに必要な化合物の濃度と、健康な細胞に対して最大半量（５０％）細胞傷害性（ＥＣ５０）を誘導するのに必要な化合物の濃度とを比較する。その結果、抗原結合タンパク質に関して、腫瘍細胞株に対するＥＣ５０が１ｐＭであり、例えば健康な細胞に対するＥＣ５０が１０００ｐＭである場合には、安全性ウィンドウは、１０００であり、なぜならば、腫瘍細胞株に対するＥＣ５０は、健康な細胞の場合と比べて１０００分の１であるからである。
【0202】
好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≧１００、≧５００、≧１０００、≧２０００、≧３０００、≧４０００、≧５０００、≧６０００、≧８０００、≧１００００、例えば、５００～１００００、好ましくは、１０００～１００００の安全性ウィンドウを特徴とする。
【0203】
「ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示細胞」は、本明細書では、ＰＲＡＭＥ抗原ペプチドを、ＭＨＣ分子との複合体で、表面上にて提示する細胞を指しており、前記ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体のコピー数を、当業者に既知の方法で決定し得る。好ましい実施形態では、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示細胞は、腫瘍細胞であり、この腫瘍は、好ましくは、本明細書の下記の「治療法および使用」セクションで定義されるがんである。本発明に関連して、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体は、正常な（健康な）組織中の細胞（「健康な細胞」とも称される）の表面上の前記複合体のレベルと比較して、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示細胞の細胞表面上に過剰に提示されている。「過剰に提示されている」は、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体が、健康な組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで存在しており、好ましくは、健康な組織または細胞に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは５倍～１０倍のレベルで存在していることを意味する。
【0204】
一実施形態では、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示細胞は、５０超、８０超、１００超、１２０超、１５０超、３００超、４００超、６００超、８００超、１０００超、１５００超、２０００超のＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体コピー数を有しており、好ましくは、５０～２０００、例えば、８０～２０００、例えば、１００～２０００、例えば、１２０～２０００のＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣコピー数を有する。
【0205】
「コピー数」は、本明細書では、細胞（例えば、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ提示細胞、例えば、がん細胞、または健康な細胞）の細胞表面上に存在している、本発明に関連して定義されるＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体の数を指す。タンパク質のコピー数を、蛍光標識された抗原結合タンパク質による疾患細胞のＦＡＣＳ分析を含む様々な当該技術分野で既知の方法により決定し得る。
【0206】
「健康な細胞」または「正常な組織細胞」は、本明細書では、腫瘍細胞ではない細胞を指しており、好ましくは、健康な細胞は、本明細書では、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ提示細胞を取り囲む組織の細胞を指しており、特に、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示腫瘍細胞を取り囲む組織の細胞を指す。しかしながら、場合によっては、健康な細胞も、その表面上にＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体を発現および提示するかもしれない。典型的には、本発明に関連する健康な細胞では、当業者に理解されるように、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体は、腫瘍細胞中と比べて少ない量（コピー数）で存在する。従って、一実施形態では、健康な細胞は、５０未満、２０未満、１０未満のＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体コピー数を有しており、好ましくは、１０未満のＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体コピー数を有しており、好ましくは、０～１０のＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体コピー数を有する。
【0207】
健康な細胞は、好ましくは、下記からなる群から選択される：アストロサイト、ＧＡＢＡニューロン、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、真皮微小血管内皮細胞、間葉系幹細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞、肺線維芽細胞、表皮ケラチノサイト、腎皮質上皮細胞および気管平滑筋細胞、好ましくは、アストロサイト、特に、ｉＰＳＣ由来のアストロサイト、心筋細胞、特に、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞、大動脈内皮細胞、間葉系幹細胞、および気管平滑筋細胞。
【0208】
好ましい一実施形態では、腫瘍細胞（特に、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体提示腫瘍細胞）において少なくとも９０％、好ましくは１００％の細胞傷害性を達成するのに必要な本発明の抗原結合タンパク質の濃度は、アストロサイト、ＧＡＢＡニューロン、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞、真皮微小血管内皮細胞、間葉系幹細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞、肺線維芽細胞、表皮ケラチノサイト、腎皮質上皮細胞および気管平滑筋細胞、好ましくは、アストロサイト、特に、ｉＰＳＣ由来のアストロサイト、心筋細胞、特に、ｉＰＳＣ由来のアストロサイト、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞、大動脈内皮細胞、間葉系幹細胞、および気管平滑筋細胞からなる群から選択される健康な細胞において少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも９０％、または１００％の細胞傷害性を達成するのに必要な濃度と比べて、１００分の１以下、５００分の１以下、１０００分の１以下、５０００分の１以下、または１００００分の１以下である。
【0209】
本発明者らは、本特許請求の範囲で定義されたＣＤＲが、様々なフォーマットを有する抗原結合タンパク質で使用され得ることを実証した。例えば、実験セクションにおいて、本発明者らは、これらのＣＤＲを、ＴＣＥＲ（登録商標）分子、およびＦａｂ断片と融合したｓｃＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ）を含む二重特異性ＴＣＲ等の一本鎖ＴＣＲコンストラクトで使用した。
【0210】
従って、当業者は、これらの実験から、本明細書で説明されているＣＤＲが本発明の様々な抗原結合タンパク質で使用される得ることを実際に理解する。
【0211】
一実施形態では、抗原結合タンパク質のフォーマットが変更されても、エピトープおよび結合特性は保存される。
【0212】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲまたは抗体である。当業者は、抗原結合タンパク質が抗体である場合、この「抗体」は、本特許請求の範囲で定義されたＴＣＲ由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ３、および適宜ＣＤＲ２の配列を少なくとも含み、そのため、ネイティブ抗体でも従来の抗体でもないことを認識する。しかしながら、例えばＴＣＲ由来のＣＤＲ、および抗体由来のフレームワーク領域、および抗体由来の定常ドメインを含む抗原結合タンパク質は、従来の抗体の全体構造を有することとなり、「抗体」と称され得る。
【0213】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、二重特異性であり、特に、二重特異性ＴＣＲ、二重特異性抗体、または二重特異性ＴＣＲ抗体分子である。当業者は、抗原結合タンパク質が二重特異性「抗体」である場合にも、抗原結合部位の内の１つは、本特許請求の範囲で定義されたＴＣＲ由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ３、および適宜ＣＤＲ２の配列を含み、他の抗原結合部位は、完全に抗体由来であり得ることを認識する。
【0214】
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト起源のものであり、これは、ヒト抗原遺伝子座から生成されており、従ってヒト配列（特に、ヒトＴＣＲまたは抗体配列）を含むと理解される。
【0215】
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、親和性成熟抗原結合タンパク質と特徴付けられており、これは、ＰＲＡＭＥ－００４抗原ペプチド（特に、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体）を、親分子（特に、ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３）と比べて高い親和性で特異的に結合可能である。
【0216】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＶＡを含む第１のポリペプチド鎖と、ＶＢを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
【0217】
いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド、そのためＶＡおよびＶＢは、単一のポリペプチド鎖上に位置している。そのような一本鎖コンストラクトは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）、一本鎖抗体、または一本鎖二重特異性抗原結合タンパク質であり得、特に、一本鎖二重特異性抗体、一本鎖二重特異性ＴＣＲ、または一本鎖二重特異性ＴＣＲ抗体分子であり得る。一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）の例は、実施例１で使用されるコンストラクトであり、これは、一本鎖ＴＣＲ可変ドメイン（「ｓｃＴｖ」）分子とも称され得る。一本鎖「抗体」の例は、ＣＤＲがＴＣＲ由来のＣＤＲに置き換えられているｓｃＦｖであるだろう。一本鎖二重特異性抗体の例は、一方の結合部位が抗体由来であり、他方の結合部位がＴＣＲ由来であるかまたはＴＣＲ由来のＣＤＲを少なくとも含む抗体であるだろう。上記で論じたように、そのようなハイブリッド抗原結合タンパク質は、あるいは、一本鎖二重特異性ＴＣＲまたは一本鎖二重特異性ＴＣＲ抗体分子と称され得る。
【0218】
フレームワーク領域
本発明の発明者らは、親ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３と比較して、抗原結合タンパク質のフレームワーク領域中での特異的突然変異が有利な効果を有することを、さらに発見した。
本発明の発明者らは、親ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３と比較して、抗原結合タンパク質のフレームワーク領域中での特異的突然変異が有利な効果を有することを、さらに発見した。
【0219】
ＶＡでは、有利な突然変異は、下記である：
－ Ｎ２０Ｋ（天然に存在する可能なＮグリコシル化部位を除去する）、
－ Ｗ４４Ｋ（ＶＢでのＱ４４Ｅとの組合せで、可変ドメインの対合、親和性、および安定性を改善する）、ならびに
－ Ａ５２Ｆ、Ｖ５５Ｙ、Ｋ９２Ｔ、およびＧ９３Ｄ（抗原結合タンパク質の安定性を増加させる）。
－ Ｎ２０Ｋ（天然に存在する可能なＮグリコシル化部位を除去する）、
－ Ｗ４４Ｋ（ＶＢでのＱ４４Ｅとの組合せで、可変ドメインの対合、親和性、および安定性を改善する）、ならびに
－ Ａ５２Ｆ、Ｖ５５Ｙ、Ｋ９２Ｔ、およびＧ９３Ｄ（抗原結合タンパク質の安定性を増加させる）。
【0220】
ＶＢでは、有利な突然変異は、下記である：
－ Ａ８４Ｄ、Ａ８４Ｅ、Ａ８４Ｑ、Ａ８４Ｎ、Ａ８４Ｓ、好ましくはＡ８４Ｄ（ペプチド－ＭＣ複合体に対する親和性を増加させる）
－ Ｑ４４Ｅ（ＶＡでのＷ４４Ｋとの組合せで、可変ドメインの対合、親和性、および安定性を改善する）
－ Ｍ４６ＰおよびＲ４８Ｑ（抗原結合タンパク質の安定性を増加させる）。
－ Ａ８４Ｄ、Ａ８４Ｅ、Ａ８４Ｑ、Ａ８４Ｎ、Ａ８４Ｓ、好ましくはＡ８４Ｄ（ペプチド－ＭＣ複合体に対する親和性を増加させる）
－ Ｑ４４Ｅ（ＶＡでのＷ４４Ｋとの組合せで、可変ドメインの対合、親和性、および安定性を改善する）
－ Ｍ４６ＰおよびＲ４８Ｑ（抗原結合タンパク質の安定性を増加させる）。
【0221】
突然変異は、ＩＭＧＴ命名法に従って示される。
【0222】
従って、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、ＶＡ（Ｒ１１Ｐ３Ｄ３のＶαとの比較）中にＮ２０Ｋ、Ｗ４４Ｋ、Ａ５２Ｆ、Ｖ５５Ｙ、Ｋ９２Ｔ、およびＧ９３Ｄの内の１つまたは複数（好ましくは全て）を含み、かつＶＢ（Ｒ１１Ｐ３Ｄ３のＶβとの比較）中にＡ８４Ｄ、Ｑ４４Ｅ、Ｍ４６Ｐ、およびＲ４８Ｑの内の１つまたは複数（好ましくは全て）を含む。
【0223】
本発明の抗原結合タンパク質は、ＶＡ（Ｒ１１Ｐ３Ｄ３のＶαとの比較）中にＬ２Ｍ、Ｌ３９Ｉ、およびＱ１４Ｋの内の１つまたは複数をさらに含み得、かつＶＢ（Ｒ１１Ｐ３Ｄ３のＶβとの比較）中にＥ１１Ｌ、Ｅ１１Ｋ、およびＲ２２Ｈの内の１つまたは複数をさらに含み得る。
【0224】
従って、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、ＶＡ中に下記のアミノ酸２０Ｋ、４４Ｋ、５２Ｆ、５５Ｙ、９２Ｔ、および９３Ｄの内の１つまたは複数（好ましくは全て）を含み、かつＶＢ中に８４Ｄ、４４Ｅ、４６Ｐ、および４８Ｑの内の１つまたは複数（好ましくは全て）を含む。
【0225】
本発明の抗原結合タンパク質は、ＶＡ中に下記のアミノ酸２Ｍ、３９Ｉ、および１４Ｋの内の１つまたは複数をさらに含み得、かつＶＢ中に１１Ｌまたは１１Ｋおよび２２Ｈの内の１つまたは複数をさらに含み得る。
【0226】
一実施形態では、ＶＡは、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、
－ ＦＲ１－ａは、配列番号３４５もしくは配列番号３４６のアミノ酸配列、または配列番号３４５と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、２０位でＫもしくはＮを含み、より好ましくはＫを含み、および／または２位でＬもしくはＭを含み；
－ ＦＲ２－ａは、配列番号３４７もしくは配列番号３４８のアミノ酸配列、または配列番号３４７と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、３９位でＬ、Ｉ、もしくはＭを含み、より好ましくはＬもしくはＩを含み、４７位でＡもしくはＤを含み、より好ましくはＡを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、および／または５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み；
－ ＦＲ３－ａは、配列番号３４９のアミノ酸配列、または配列番号３４９と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、９２位でＴもしくはＫを含み、好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ａは、配列番号３５０のアミノ酸配列、または配列番号３５０と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり；
ＶＢは、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、
－ ＦＲ１－ｂは、配列番号３５１もしくは配列番号３５２のアミノ酸配列、または配列番号３５１と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、１０位でＨもしくはＮを含み、より好ましくはＨを含み、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、および／または２２位でＲもしくはＨを含み；
－ ＦＲ２－ｂは、配列番号３５３のアミノ酸配列、または配列番号３５３と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、４３位でＲもしくはＫを含み、より好ましくはＲを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＭもしくはＰを含み、より好ましくはＰを含み、および／または４８位でＲもしくはＱを含み、より好ましくはＱを含み；
－ ＦＲ３－ｂは、配列番号３５４もしくは配列番号３５５のアミノ酸配列、または配列番号３５４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、８４位で、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤまたはＡを含み、さらにより好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ｂは、配列番号３５６のアミノ酸配列、または配列番号３５６と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
－ ＦＲ１－ａは、配列番号３４５もしくは配列番号３４６のアミノ酸配列、または配列番号３４５と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、２０位でＫもしくはＮを含み、より好ましくはＫを含み、および／または２位でＬもしくはＭを含み；
－ ＦＲ２－ａは、配列番号３４７もしくは配列番号３４８のアミノ酸配列、または配列番号３４７と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、３９位でＬ、Ｉ、もしくはＭを含み、より好ましくはＬもしくはＩを含み、４７位でＡもしくはＤを含み、より好ましくはＡを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、および／または５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み；
－ ＦＲ３－ａは、配列番号３４９のアミノ酸配列、または配列番号３４９と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、９２位でＴもしくはＫを含み、好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ａは、配列番号３５０のアミノ酸配列、または配列番号３５０と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり；
ＶＢは、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、
－ ＦＲ１－ｂは、配列番号３５１もしくは配列番号３５２のアミノ酸配列、または配列番号３５１と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、１０位でＨもしくはＮを含み、より好ましくはＨを含み、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、および／または２２位でＲもしくはＨを含み；
－ ＦＲ２－ｂは、配列番号３５３のアミノ酸配列、または配列番号３５３と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、４３位でＲもしくはＫを含み、より好ましくはＲを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＭもしくはＰを含み、より好ましくはＰを含み、および／または４８位でＲもしくはＱを含み、より好ましくはＱを含み；
－ ＦＲ３－ｂは、配列番号３５４もしくは配列番号３５５のアミノ酸配列、または配列番号３５４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、８４位で、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤまたはＡを含み、さらにより好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ｂは、配列番号３５６のアミノ酸配列、または配列番号３５６と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0227】
本明細書で説明されている抗原結合タンパク質の変異体は、本明細書の上記の「定義」セクションで定義されている「参照配列と少なくとも８５％同一」という表現を使用することが企図されており、かつ明示的に言及されている。例として、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、ＦＲ４－ａ、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂのアミノ酸配列は、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸置換により、特に、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換および／またはカノニカル残基との置換により、参照配列である配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、または配列番号３５６と異なり得る。特に、ＶＡおよびＶＢの配列ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａ、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂは、必要に応じて、保存的アミノ酸置換のみにより、参照配列である配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、または配列番号３５６と異なり得る。
【0228】
本発明の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列中、および対応するＤＮＡ配列中それぞれに、改変および変更を行ない得、望ましい特性を有する機能的抗原結合タンパク質またはポリペプチドが依然として得られる。ＶＡおよび／またはＶＢ（特に、フレームワーク領域またはＣＤＲ）中で、改変を行ない得る。
【0229】
ＶＡおよびＶＢは、好ましくは、ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３と比較して、ＩＭＧＴナンバリングに従う４４位でアミノ酸置換を含む。抗原結合タンパク質がＴＣＲである実施形態では、これらの置換により、鎖の対合（即ち、α鎖およびβ鎖の対合、またはγおよびδの対合）が改善される。ＶＡまたはＶＢ中において４４位に存在するアミノ酸は、Ｑ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸により置換されてもよい。好ましいのは、配列番号３４７、配列番号３４８（ＦＲ２－ａ）、および配列番号３５３（ＦＲ２－ｂ）それぞれ中に存在しており、かつアミノ酸対ＶＡ４４Ｋ／ＶＡ４４Ｅを生じる、ＶＡ中での置換Ｗ４４ＫおよびＶＢ中での置換Ｑ４４Ｅである。他の適切な組合せは、ＶＡ４４Ｑ／ＶＢ４４Ｑ、ＶＡ４４Ｄ／ＶＢ４４Ｒ、ＶＡ４４Ｒ／ＶＢ４４Ｄ、ＶＡ４４Ｅ／ＶＢ４４Ｋ、ＶＡ４４Ｄ／ＶＢ４４Ｋ、ＶＡ４４Ｋ／ＶＢ４４Ｄ、ＶＡ４４Ｒ／ＶＢ４４Ｅ；ＶＡ４４Ｅ／ＶＢ４４Ｒ、ＶＡ４４Ｌ／ＶＢ４４Ｗ、ＶＡ４４Ｗ／ＶＢ４４Ｌ、ＶＡ４４Ｖ／ＶＢ４４Ｗ、およびＶＡ４４Ｗ／ＶＢ４４Ｖである。
【0230】
追加の置換および説明は、米国特許出願公開第２０１８－０１６２９２２号明細書で見出され得、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0231】
可変ドメイン
一実施形態では、ＶＡは、配列番号１００、１０３、１０５、１０６、１１１、１２２、１２４、１２６、１２８、１５１、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６６、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８３、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２８５、２９１、２９５、２９９、または３０３のポリペプチドに含まれるＴＣＲ由来可変ドメインのアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＶＢは、配列番号１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１９、１２１、１３１、１３３、１４３、１５２、１５３、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１８２、１８４、１８５、１８６、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８２、２８４、２９６、または３００のポリペプチドに含まれるＴＣＲ由来可変ドメインのアミノ酸配列を含むか、またはからなる。当業者は、上述した配列番号のポリペプチド鎖内のＴＣＲ由来可変ドメインのアミノ酸配列を区別することが完全に可能である。
一実施形態では、ＶＡは、配列番号１００、１０３、１０５、１０６、１１１、１２２、１２４、１２６、１２８、１５１、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６６、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８３、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２８５、２９１、２９５、２９９、または３０３のポリペプチドに含まれるＴＣＲ由来可変ドメインのアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＶＢは、配列番号１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１９、１２１、１３１、１３３、１４３、１５２、１５３、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１８２、１８４、１８５、１８６、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８２、２８４、２９６、または３００のポリペプチドに含まれるＴＣＲ由来可変ドメインのアミノ酸配列を含むか、またはからなる。当業者は、上述した配列番号のポリペプチド鎖内のＴＣＲ由来可変ドメインのアミノ酸配列を区別することが完全に可能である。
【0232】
一実施形態では、
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列、または配列番号１３２と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３３、配列番号３４、または配列番号９のＣＤＲａ３を含み、さらに、２０位でＫもしくはＮを含んでもよく、好ましくはＫを含んでもよく、３９位でＬ、Ｍ、もしくはＩを含んでもよく、好ましくはＬもしくはＩを含んでもよく、４４位でＫもしくはＷを含んでもよく、好ましくはＫを含んでもよく、５２位でＦもしくはＡを含んでもよく、好ましくはＦを含んでもよく、５５位でＹもしくはＶを含んでもよく、好ましくはＹを含んでもよく、９２位でＴもしくはＫを含んでもよく、好ましくはＴを含んでもよく、および／または９３位でＤもしくはＧを含んでもよく、好ましくはＤを含んでもよく；
－ ＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号３６のＣＤＲｂ２、および配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３を含み、さらに、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、２２位でＲもしくはＨを含んでもよく、４４位でＥもしくはＱを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、４６位でＰもしくはＭを含んでもよく、好ましくはＰを含んでもよく、４８位でＱもしくはＲを含んでもよく、好ましくはＱを含んでもよく、および／または８４位でＤ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、好ましくはＤもしくはＡを含んでもよい。
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列、または配列番号１３２と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３３、配列番号３４、または配列番号９のＣＤＲａ３を含み、さらに、２０位でＫもしくはＮを含んでもよく、好ましくはＫを含んでもよく、３９位でＬ、Ｍ、もしくはＩを含んでもよく、好ましくはＬもしくはＩを含んでもよく、４４位でＫもしくはＷを含んでもよく、好ましくはＫを含んでもよく、５２位でＦもしくはＡを含んでもよく、好ましくはＦを含んでもよく、５５位でＹもしくはＶを含んでもよく、好ましくはＹを含んでもよく、９２位でＴもしくはＫを含んでもよく、好ましくはＴを含んでもよく、および／または９３位でＤもしくはＧを含んでもよく、好ましくはＤを含んでもよく；
－ ＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号３６のＣＤＲｂ２、および配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３を含み、さらに、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、２２位でＲもしくはＨを含んでもよく、４４位でＥもしくはＱを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、４６位でＰもしくはＭを含んでもよく、好ましくはＰを含んでもよく、４８位でＱもしくはＲを含んでもよく、好ましくはＱを含んでもよく、および／または８４位でＤ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、好ましくはＤもしくはＡを含んでもよい。
【0233】
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列、または配列番号１３２と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３３、配列番号３４、または配列番号９のＣＤＲａ３を含み、さらに、２０位でＫもしくはＮを含んでもよく、好ましくはＫを含んでもよく、３９位でＬ、Ｍ、もしくはＩを含んでもよく、好ましくはＬもしくはＩを含んでもよく、４４位でＫもしくはＷを含んでもよく、好ましくはＫを含んでもよく、５２位でＦもしくはＡを含んでもよく、好ましくはＦを含んでもよく、５５位でＹもしくはＶを含んでもよく、好ましくはＹを含んでもよく、９２位でＴもしくはＫを含んでもよく、好ましくはＴを含んでもよく、および／または９３位でＤもしくはＧを含んでもよく、好ましくはＤを含んでもよく；
－ ＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号３６のＣＤＲｂ２、および配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３を含み、さらに、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、２２位でＲもしくはＨを含んでもよく、４４位でＥもしくはＱを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、４６位でＰもしくはＭを含んでもよく、好ましくはＰを含んでもよく、４８位でＱもしくはＲを含んでもよく、好ましくはＱを含んでもよく、および／または８４位でＤ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、好ましくはＤもしくはＡを含んでもよい
ことが好ましい。
－ ＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号３６のＣＤＲｂ２、および配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３を含み、さらに、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、２２位でＲもしくはＨを含んでもよく、４４位でＥもしくはＱを含んでもよく、好ましくはＥを含んでもよく、４６位でＰもしくはＭを含んでもよく、好ましくはＰを含んでもよく、４８位でＱもしくはＲを含んでもよく、好ましくはＱを含んでもよく、および／または８４位でＤ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含んでもよく、好ましくはＤもしくはＡを含んでもよい
ことが好ましい。
【0234】
好ましい実施形態では、
－ ＶＡは、配列番号１３２、配列番号１２９、配列番号１３７、または配列番号１４２のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＶＢは、配列番号１３４、配列番号１３０、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、または配列番号１４８のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
－ ＶＡは、配列番号１３２、配列番号１２９、配列番号１３７、または配列番号１４２のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＶＢは、配列番号１３４、配列番号１３０、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、または配列番号１４８のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0235】
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；または
－ ＶＡは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなる
ことが特に好ましい。
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；
－ ＶＡは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなるか；または
－ ＶＡは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなり、かつＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むか、もしくはからなる
ことが特に好ましい。
【0236】
最も好ましくは、ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＶＢは、配列番号１３４、１３５、または１４０（特に、配列番号１３５）のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。そのため、ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含み得るか、またはからなり得、ＶＢは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み得るか、またはからなり得る。あるいは、ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含み得るか、またはからなり得、ＶＢは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み得るか、またはからなり得る。
【0237】
本明細書で説明されている抗原結合タンパク質の変異体は、本明細書での上記定義セクションにて定義されている「参照配列と少なくとも８５％同一」という表現を使用して企図されており、かつ明確に言及される。例えば、ＶＡおよびＶＢの配列は、それぞれ配列番号１３２および配列番号１３４の参照配列と、少なくとも１つのアミノ酸置換により異なり得、特に、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換、および／またはカノニカル残基との置換により異なり得る。特に、ＶＡおよびＶＢの配列は、保存的アミノ酸置換のみにより、それぞれ配列番号１３２および配列番号１３４の参照配列と異なり得る。
【0238】
本発明の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列、および対応するＤＮＡ配列において、それぞれ改変および変更を行ない得、それでも尚、望ましい特性を有する機能的な抗原結合タンパク質またはポリペプチドを得ることができる。
【0239】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、下記：
（ｉ）１つもしくは複数のさらなる抗原結合部位：
（ｉｉ）細胞質シグナル伝達領域を含んでもよい膜貫通領域；
（ｉｉｉ）診断薬；
（ｉｖ）治療薬；または
（ｖ）ＰＫ改変部分
の内の１つまたは複数をさらに含む。
（ｉ）１つもしくは複数のさらなる抗原結合部位：
（ｉｉ）細胞質シグナル伝達領域を含んでもよい膜貫通領域；
（ｉｉｉ）診断薬；
（ｉｖ）治療薬；または
（ｖ）ＰＫ改変部分
の内の１つまたは複数をさらに含む。
【0240】
上記に列挙された成分（ｉ）～（ｖ）が、本発明の抗原結合タンパク質に融合したポリペプチドである場合には、この抗原結合タンパク質は、「ＴＣＲ融合タンパク質」とも称され得る。
【0241】
さらなる抗原結合部位は、好ましくは、抗体由来である。
【0242】
本発明に関連する「膜貫通領域」は、例えば、ＴＣＲアルファまたはベータ膜貫通ドメインであり得る。
【0243】
「細胞質シグナル伝達領域」は、例えば、ＴＣＲアルファまたはベータ細胞内ドメインであり得る。
【0244】
「診断薬」は、本明細書では、検出可能な分子または物質（例えば、蛍光分子、放射性分子、またはシグナルを生じる（直接的または間接的）ことが当該技術分野で既知のあらゆる他の標識を指す。
【0245】
当該技術分野で既知の「蛍光分子」として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、青色レーザーで使用されるフルオロフォア（例えば、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＰＥ－Ｃｙ５、ＦＬ３、およびＡＰＣまたはＣｙ５、ＦＬ４）、赤色、紫色、またはＵＶレーザーで使用されるフルオロフォア（例えば、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ）が挙げられる。
【0246】
「放射性分子」として、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｔｃ９９等のシンチグラフィ研究用の放射性原子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗原結合タンパク質はまた、核磁気共鳴（ＮＭＲ）撮像（磁気共鳴撮像、ＭＲＩとしても既知である）用のスピン標識（例えば、ヨウ素－１２３、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄）も含み得る。
【0247】
そのような診断薬は、抗原結合タンパク質に直接結合（即ち、物理的に連結）されていてもよいし、間接的に連結されていてもよい。
【0248】
「治療薬」は、本明細書では、治療効果を有する薬剤を指す。治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）および治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ）という用語は、本明細書では互換的に使用される。一実施形態では、治療薬は、細胞傷害剤または放射性同位体等の成長阻害剤であり得る。
【0249】
「成長阻害剤」または「抗増殖剤」（これらは無関係に使用される得る）は、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞（特に腫瘍細胞）の成長を阻害する化合物または組成物を指す。
【0250】
「細胞傷害剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害するかもしくは予防するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。「細胞傷害剤」という用語は、化学療法剤、酵素、抗生物質、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の低分子毒素または酵素活性毒素）（これらの断片および／または変異体を含む）、ならびに下記で開示する様々な抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことが意図されている。いくつかの実施形態では、細胞毒製剤は、タキソイド、ビンカ、タキサン、メイタンシノイドもしくはメイタンシノイド類似体（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）、小薬、トマイマイシンもしくはピロロベンゾジアゼピン誘導体、クリプトフィシン誘導体、レプトマイシン誘導体、オーリスタチンもしくはドラスタチン類似体、プロドラッグ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、抗チューブリン剤、ＣＣ－１０６５、またはＣＣ－１０６５類似体である。
【0251】
「放射性同位体」という用語は、癌の処置に適した放射性同位体を含むことが意図されており、例えば、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、およびＬｕの放射性同位体を含むことが意図されている。そのような放射性同位体は、一般には、主にベータ線を放射する。一実施形態では、放射性同位体は、アルファ放射体同位体であり、より正確には、アルファ線を放射するトリウム２２７である。
【0252】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、直接的に、または切断可能なもしくは切断不可能なリンカーを介して、少なくとも１種の成長阻害剤に共有結合している。そのような少なくとも１種の成長阻害剤が結合している抗原結合タンパク質はまた、コンジュゲートとも称され得る。切断可能なリンカーは、細胞内での抗原結合タンパク質からの細胞毒製剤または成長阻害剤の放出を促進する。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、エステラーゼ不安定性リンカー、光不安定性リンカー、またはジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）を使用し得る。このリンカーはまた、場合によっては、より良好な耐性をもたらす可能性がある「切断不可能なリンカー」（例えば、ＳＭＣＣリンカー）でもあり得る。
【0253】
そのようなコンジュゲート（例えば、免疫コンジュゲート）の調製は、国際公開第２００４／０９１６６８号パンフレット、またはHudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) and Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されており、当業者は、そのような少なくとも１種の成長阻害剤が結合している本発明の抗原結合タンパク質の調製に転用し得る。
【0254】
あるいは、本発明の抗原結合タンパク質と、細胞傷害性ポリペプチドまたは増殖阻害性ポリペプチドとを含む融合タンパク質を、組み換え技術またはペプチド合成により作製し得る。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでもよいし、コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離された、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでもよい。
【0255】
本発明の抗原結合タンパク質をまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号パンフレットを参照されたい）を活性抗癌剤（例えば、国際公開第８８／０７３７８号パンフレットおよび米国特許第４，９７５，２７８号明細書を参照されたい）に変換するプロドラッグ活性化酵素にポリペプチドをコンジュゲートさせることにより、依存性酵素媒介プロドラッグ療法でも使用し得る。
【0256】
「ＰＫ改変部分」は、本明細書では、本発明の抗原結合タンパク質の薬物動態を改変する部位を指す。従って、この部分は、特に、本発明の抗原結合タンパク質のインビボでの半減期および分布を改変する。好ましい実施形態では、ＰＫ改変部分は、抗原結合タンパク質の半減期を増加させる。ＰＫ改変部分の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＥＧ［Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64、およびJevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28］、ＰＡＳ化［Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501］、アルブミン［Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43)］、抗体および／または非構造化ポリペプチドのＦｃ部分［Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec; 27(12):1186-90］。
【0257】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、酵素、サイトカイン（例えば、ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７、もしくはＩＬ－１５）、ナノキャリア、または核酸の内の１つまたは複数をさらに含む。
【0258】
第２の抗原結合部位
好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とをさらに含む。可変ドメインＶＬおよび可変ドメインＶＨは、共に、抗原結合部位を形成する。これ以降、この抗原結合部位は、「第２の抗原結合部位」とも称されることがある。ＶＬおよびＶＨにより形成された抗原結合部位は、好ましくは、エフェクター細胞の抗原に結合し、エフェクター細胞を腫瘍へとリクルートすることから「リクルーター」とも称され得る。本発明に関連して、「エフェクター細胞」は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を指す。
好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とをさらに含む。可変ドメインＶＬおよび可変ドメインＶＨは、共に、抗原結合部位を形成する。これ以降、この抗原結合部位は、「第２の抗原結合部位」とも称されることがある。ＶＬおよびＶＨにより形成された抗原結合部位は、好ましくは、エフェクター細胞の抗原に結合し、エフェクター細胞を腫瘍へとリクルートすることから「リクルーター」とも称され得る。本発明に関連して、「エフェクター細胞」は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を指す。
【0259】
好ましい実施形態では、ＶＨおよびＶＨは、ＣＤ２、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、ＨＬＡ－ＤＲ、および４－１ ＢＢ、もしくはこれらの組合せからなる群から選択される抗原に結合し、ならびに／またはＶＨおよびＶＬは、エフェクター細胞に結合する。「この組合せ」は、前記抗原の内の２つ以上の複合体（例えば、ＴＣＲα／β ＣＤ３複合体）を指す。好ましくは、抗原は、ＣＤ３、ＴＣＲα／β ＣＤ３複合体、またはＣＤ２８であり、より好ましくは、ＣＤ３、またはＴＣＲα／β ＣＤ３複合体である。
【0260】
ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の標的化の場合には、ＣＤ３特異的ヒト化抗体ｈＵＣＨＴ１(Zhu et al., Identification of heavy chain residues in a humanized anti-CD3 antibody important for efficient antigen binding and T cell activation. J Immunol, 1995, 155, 1903-1910)に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用し得、特に、ＵＣＨＴ１変異体ＵＣＨＴ１－Ｖ１７、ＵＣＨＴ１－Ｖ１７ｏｐｔ、ＵＣＨＴ１－Ｖ２１、またはＵＣＨＴ１－Ｖ２３に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用し得、好ましくは、ＵＣＨＴ１－Ｖ１７に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用し得、より好ましくは、配列番号１０９を含むかまたはからなるＶＨおよび配列番号１０８を含むかまたはからなるＶＬを使用し得る。あるいは、ＴＣＲα／β ＣＤ３複合体を標的とする抗体ＢＭＡ０３１およびそのヒト化バージョン（Shearman et al., Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alpha/beta T cell receptor, J Immunol, 1991, 147, 4366-73）に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用し得、特に、ＢＭＡ０３１変異体ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）またはＢＭＡ０３１（Ｖ１０）に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用し得、好ましくは、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用し得、配列番号１１２、または配列番号１１４（Ａ０２）、または配列番号１１５（Ｄ０１）、または配列番号１１６（Ａ０２＿Ｈ９０Ｙ）、または配列番号１１７（Ｄ０１＿Ｈ９０Ｙ）を含むかまたはからなるＶＨおよび配列番号１１３を含むかまたはからなるＶＬを使用し得る。別の選択肢として、ＣＤ３ε特異的抗体Ｈ２Ｃ（欧州特許第２１５５７８３号明細書で説明されている）に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用し得、特に、配列番号１１８、または配列番号１２３（Ｎ１００Ｄ）、または配列番号１２５（Ｎ１００Ｅ）、または配列番号１２７（Ｓ１０１Ａ）を含むかまたはからなるＶＨおよび配列番号１２０を含むかまたはからなるＶＬを使用し得る。全ての位置およびＣＤＲ定義は、Ｋａｂａｔナンバリングスキームに従う。
【0261】
いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、共に、ＴＣＲα／β ＣＤ３複合体に結合し、ＶＨは、
－ 配列番号３８１（ＳＹＶＭＨ）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
－ ＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＸ１Ｘ２ＫＦＸ３Ｇ（配列番号３８２）（式中、Ｘ１は、ＡもしくはＮであり；Ｘ２は、ＥもしくはＱであり；および／またはＸ３は、ＱもしくはＫである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
－ ＨＣＤＲ３、ならびに
－ 重鎖フレームワーク領域（ＨＦＲ）１～４
を含み、
ＶＬは、
－ 配列番号３８３（ＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨ）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）
－ 配列番号３８４（ＤＴＳＫＬＡＳ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および
－ ＬＣＤＲ３
を含み、
－ 正に荷電していない配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１の少なくとも１つのアミノ酸および／もしくは配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２の少なくとも１つのアミンは、正に荷電しているアミノ酸により置換されており；ならびに／または
－ 正に荷電していない配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１の少なくとも１つのアミノ酸および／もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２の少なくとも１つのアミンは、正に荷電しているアミノ酸により置換されており；ならびに／または
－ ＨＦＲ３は、Ｋａｂａｔナンバリングに従う９０位でチロシン（Ｙ）残基を含む。
－ 配列番号３８１（ＳＹＶＭＨ）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
－ ＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＸ１Ｘ２ＫＦＸ３Ｇ（配列番号３８２）（式中、Ｘ１は、ＡもしくはＮであり；Ｘ２は、ＥもしくはＱであり；および／またはＸ３は、ＱもしくはＫである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
－ ＨＣＤＲ３、ならびに
－ 重鎖フレームワーク領域（ＨＦＲ）１～４
を含み、
ＶＬは、
－ 配列番号３８３（ＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨ）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）
－ 配列番号３８４（ＤＴＳＫＬＡＳ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および
－ ＬＣＤＲ３
を含み、
－ 正に荷電していない配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１の少なくとも１つのアミノ酸および／もしくは配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２の少なくとも１つのアミンは、正に荷電しているアミノ酸により置換されており；ならびに／または
－ 正に荷電していない配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１の少なくとも１つのアミノ酸および／もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２の少なくとも１つのアミンは、正に荷電しているアミノ酸により置換されており；ならびに／または
－ ＨＦＲ３は、Ｋａｂａｔナンバリングに従う９０位でチロシン（Ｙ）残基を含む。
【0262】
好ましくは、抗原結合ポリペプチドは、
重鎖中において、
－ ３１位での正に荷電したアミノ酸は、Ｒ、Ｋ、もしくはＨであり；
－ ５３位での正に荷電したアミノ酸は、Ｒ、Ｋ、もしくはＨであり；および／または
－ ５４位での正に荷電したアミノ酸は、ＲもしくはＫであり；ならびに／または
軽鎖中において、
－ ３１位での正に荷電したアミノ酸は、ＲもしくはＫであり；および／または
－ ５６位での正に荷電したアミノ酸は、ＲもしくはＫである。
重鎖中において、
－ ３１位での正に荷電したアミノ酸は、Ｒ、Ｋ、もしくはＨであり；
－ ５３位での正に荷電したアミノ酸は、Ｒ、Ｋ、もしくはＨであり；および／または
－ ５４位での正に荷電したアミノ酸は、ＲもしくはＫであり；ならびに／または
軽鎖中において、
－ ３１位での正に荷電したアミノ酸は、ＲもしくはＫであり；および／または
－ ５６位での正に荷電したアミノ酸は、ＲもしくはＫである。
【0263】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１１２、１１４～１１７、および３６６～３７６からなる群から選択される配列を含み、ＶＬは、配列番号１１３、および３７７～３８０からなる群から選択される配列を含む。好ましくは、ＶＨは、配列番号１１２、または１１４～１１７のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、ＶＬは、配列番号１１３または３７８（好ましくは、１１３）のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【0264】
「ＣＤ２８」は、Ｔ細胞上で発現され、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを生じ得る。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の増殖および生存、サイトカインの産生、ならびにＴヘルパー２型の発生で重要な役割を果たす。
【0265】
「ＣＤ１３４」はまた、Ｏｘ４０とも呼ばれる。ＣＤ１３４／ＯＸ４０は、活性化後２４～７２時間で発現され、二次共刺激分子を定義するために利用され得る。
【0266】
「４－１ＢＢ」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の４－１ ＢＢリガンドと結合可能であり、それにより、Ｔ細胞に対する共刺激シグナルが生じる。
【0267】
「ＣＤ５」は、Ｔ細胞上で主に見出される受容体の別の例であり、ＣＤ５はまた、低レベルにてＢ細胞上でも見出される。
【0268】
「ＣＤ９５」は、Ｔ細胞の機能を改変する受容体のさらなる例であり、他の細胞の表面上で発現されるＦａｓリガンドによるアポトーシスシグナル伝達を媒介するＦａｃ受容体としても知られている。ＣＤ９５は、静止Ｔリンパ球でのＴＣＲ／ＣＤ３駆動シグナル伝達経路を調節することが報告されている。
【0269】
「ＮＫ細胞特異的受容体分子」は、例えば、ＣＤ１６、低親和性Ｆｃ受容体、およびＮＫＧ２Ｄである。
【0270】
Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方の表面上に存在している受容体分子の例は、ＣＤ２、およびＣＤ２スーパーファミリーのさらなるメンバーである。ＣＤ２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上の共刺激分子として機能し得る。
【0271】
二重特異性抗原結合タンパク質および多重特性抗原結合タンパク質
従って、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体に特異的な第１の抗原結合部位を形成するＶＡおよびＶＢ、ならびにエフェクター細胞（好ましくは、Ｔ細胞）に結合可能な第２の抗原結合部位を形成するＶＬおよびＶＨを含む。ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨは、単一のポリペプチド鎖上に位置していてもよいし、いくつかのポリペプチド鎖（好ましくは、２つのポリペプチド鎖）上に位置していてもよい。ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨに加えて、本発明の抗原結合タンパク質は、二量体化ドメイン（好ましくは、定常免疫グロブリンドメイン）を含んでもよいし含まなくてもよい。
従って、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、ＰＲＡＭＥ－００４：ＭＨＣ複合体に特異的な第１の抗原結合部位を形成するＶＡおよびＶＢ、ならびにエフェクター細胞（好ましくは、Ｔ細胞）に結合可能な第２の抗原結合部位を形成するＶＬおよびＶＨを含む。ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨは、単一のポリペプチド鎖上に位置していてもよいし、いくつかのポリペプチド鎖（好ましくは、２つのポリペプチド鎖）上に位置していてもよい。ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨに加えて、本発明の抗原結合タンパク質は、二量体化ドメイン（好ましくは、定常免疫グロブリンドメイン）を含んでもよいし含まなくてもよい。
【0272】
いくつかの実施形態では、ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨは、２つのポリペプチド鎖上に位置している。好ましくは、それぞれのポリペプチド鎖は、２つの可変ドメインを含む。一方のポリペプチド鎖はＶＡを含み、他方のポリペプチド鎖はＶＢを含むことが好ましい。好ましくは、ＶＡを含むポリペプチド鎖は、ＶＬおよびＶＨの内の一方を含み、ＶＢを含むポリペプチド鎖は、ＶＬおよびＶＨの内の他方を含む。ＶＡを含むポリペプチド鎖は、ＶＬおよびＶＨの両方を含み、ＶＢを含むポリペプチド鎖は、ＶＬもＶＨも含まないことも可能であり、逆もまた同様である。別の可能性は、１つのポリペプチド鎖がＶＡを含み、１つのポリペプチド鎖がＶＢを含み、第３のポリペプチド鎖がＶＬおよびＶＨを含むことである。
【0273】
好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、
第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉａ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｄ１－Ｌ２－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉａ］
により表され、
第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩａ］
Ｖ３－Ｌ４－Ｄ３－Ｌ５－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩａ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、可変ドメインであり、１つは、ＶＡであり、Ｖ１～Ｖ４の内の１つは、ＶＢであり、１つはＶＬであり、かつ１つはＶＨであり；
－ Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４は、二量体化ドメインであり、かつ存在してもよいし存在していなくてもよく、Ｄ１およびＤ３、ならびにＤ２およびＤ４は、互いに特異的に結合し、Ｄ１およびＤ３またはＤ２およびＤ４の内の少なくとも１対は、存在しており、
－ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ１およびＬ４は、存在しており、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ６は、存在してもよいし存在していなくてもよい。
第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉａ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｄ１－Ｌ２－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉａ］
により表され、
第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩａ］
Ｖ３－Ｌ４－Ｄ３－Ｌ５－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩａ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、可変ドメインであり、１つは、ＶＡであり、Ｖ１～Ｖ４の内の１つは、ＶＢであり、１つはＶＬであり、かつ１つはＶＨであり；
－ Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４は、二量体化ドメインであり、かつ存在してもよいし存在していなくてもよく、Ｄ１およびＤ３、ならびにＤ２およびＤ４は、互いに特異的に結合し、Ｄ１およびＤ３またはＤ２およびＤ４の内の少なくとも１対は、存在しており、
－ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ１およびＬ４は、存在しており、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ６は、存在してもよいし存在していなくてもよい。
【0274】
Ｖ１およびＶ２の内の一方はＶＡであり、Ｖ３およびＶ４の内の一方はＶＢであり、残り２つの可変ドメインの内、一方はＶＬであり、他方はＶＨであることが好ましく、換言すると、ＶＡおよびＶＢは、異なるポリペプチド鎖上に位置しており、ＶＬおよびＶＨは、異なるポリペプチド鎖上に位置している。
【0275】
二量体化ドメインは、好ましくは、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を媒介するが、２つの第１のポリペプチド鎖または２つの第２のポリペプチド鎖のホモ二量体化は媒介しないヘテロ二量体化ドメインである。好ましい実施形態では、１対の二量体化ドメイン（例えば、Ｄ１およびＤ３、ならびに／またはＤ２およびＤ４）は、免疫グロブリン定常ドメイン、例えば、抗体由来のＣＬおよびＣＨ１、またはＣＬ－ＦｃおよびＣＨ１－Ｆｃ、またはＴＣＲ由来のＣαおよびＣβ、または１対のＣＨ３ドメイン、または１対のＦｃドメインを含み、ＣＨ３ドメインおよびＦｃドメインは、好ましくは、ノブ・イントゥ・ホール等のヘテロ二量体化を強制する導入された突然変異を含む。
【0276】
さらにより好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、
第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉｂ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉｂ］
により表され、
第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩｂ］：
Ｖ３－Ｌ４－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩｂ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４は、可変ドメインであり、１つは、ＶＡであり、１つは、ＶＢであり、１つは、ＶＬであり、１つは、ＶＨであり；
－ Ｄ２およびＤ４は、互いに特異的に結合する二量体化ドメインであり、好ましくはＦｃドメインであり；
－ Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ３およびＬ６は、存在してもよいし存在しなくてもよい。
第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉｂ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉｂ］
により表され、
第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩｂ］：
Ｖ３－Ｌ４－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩｂ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４は、可変ドメインであり、１つは、ＶＡであり、１つは、ＶＢであり、１つは、ＶＬであり、１つは、ＶＨであり；
－ Ｄ２およびＤ４は、互いに特異的に結合する二量体化ドメインであり、好ましくはＦｃドメインであり；
－ Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ３およびＬ６は、存在してもよいし存在しなくてもよい。
【0277】
式ＩａおよびＩＩＡに関して説明したように、ＶＡおよびＶＢは、異なるポリペプチド鎖上に位置しており、ＶＬおよびＶＨは、異なるポリペプチド鎖上に位置していること、ならびに二量体化ドメインはヘテロ二量体化ドメインであることが好ましい。
【0278】
好ましい実施形態では、Ｄ２およびＤ４は、１対のＦｃドメインＦｃ１およびＦｃ２であり、特に、Ｄ２は、Ｆｃ１であり、Ｄ４はＦｃ２であり、ここで、Ｆｃ１およびＦｃ２は、同一であるか、または異なっており、好ましくは異なっており、好ましくは、ヘテロ二量体化を強制する突然変異を含む。一実施形態では、Ｆｃ１は、配列番号１５０のアミノ酸配列（ホール）を含むか、またはからなり、Ｆｃ２は、配列番号１４９のアミノ酸配列（ノブ）を含むか、またはからなり、逆もまた同様である。特に、Ｆｃ１が、ＶＬを含むポリペプチド鎖上に位置しており、Ｆｃ２が、ＶＨを含むポリペプチド鎖上に位置している場合には、Ｆｃ１は、配列番号１４９のアミノ酸配列（ノブ）を含むか、またはからなり、Ｆｃ２は、配列番号１５０のアミノ酸配列（ホール）を含むか、またはからなり、Ｆｃ１が、ＶＨを含むポリペプチド鎖上に位置しており、Ｆｃ２が、ＶＬを含むポリペプチド鎖上に位置している場合には、Ｆｃ１は、配列番号１５０のアミノ酸配列（ホール）を含むか、またはからなり、Ｆｃ２は、配列番号１４９のアミノ酸配列（ノブ）を含むか、またはからなる。
【0279】
それぞれ式ＩａおよびＩＩａまたはＩｂおよびＩＩｂにより表される第１および第２のポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質では、ＶＡおよびＶＢ、ならびにＶＬおよびＶＨは、ＤＶＤフォーマットのように並行配向であってもよいし、ＣＯＤＶフォーマットのように交差配向であってもよいことが、当業者により理解される。
【0280】
式ＩａおよびＩＩａ、またはＩｂおよびＩＩｂでは、ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨは、下記の配向を有し得る：
（１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（２）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（３）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（４）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（５）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（６）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（７）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（８）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（９）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１０）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；または
（１２）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡである。
（１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（２）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（３）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（４）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（５）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（６）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（７）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（８）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（９）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１０）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；または
（１２）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡである。
【0281】
ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨは、（１）～（８）で説明されている配向を有していることが好ましく、即ち、ＶＡおよびＶＢは、異なるポリペプチド鎖上に位置しており、ＶＬおよびＶＨは、異なるポリペプチド鎖上に位置していることが好ましい。より好ましくは、ＶＡ、ＶＢ、ＶＬ、およびＶＨは、（１）～（４）で説明されている配向を有しており、即ち、ＶＡおよびＶＢ、ならびにＶＬおよびＶＨは、交差配向を有している。
【0282】
リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５は、本明細書の上記の「定義」セクションで定義されている。いくつかの実施形態では、特定のフォーマットでは、ある特定のリンカー長が好ましい可能性がある。しかしながら、リンカーの長さおよびアミノ酸配列に関する知識は、当該技術分野の一般的な知識に属しており、リンカー、および様々なフォーマットに関するリンカーアミノ酸配列は、当該技術分野の一部であり、かつ上記で引用されている開示において開示されている。
【0283】
本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットであることが特に好ましい。ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットの実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記で定義された式［ＩＩａ］および［ＩＩｂ］により表される第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、式中、
－ Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；または
Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであり；
－ Ｌ３およびＬ６は、存在せず；
－ Ｌ１およびＬ４は、好ましくは、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むか、またはからなり；
－ Ｄ２およびＤ４は、１対のＦｃドメインＦｃ１およびＦｃ２であり、Ｆｃ１およびＦｃ２は、異なっており、かつヘテロ二量体化を強制する突然変異（好ましくは、「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異）を含む。
－ Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；または
Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであり；
－ Ｌ３およびＬ６は、存在せず；
－ Ｌ１およびＬ４は、好ましくは、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むか、またはからなり；
－ Ｄ２およびＤ４は、１対のＦｃドメインＦｃ１およびＦｃ２であり、Ｆｃ１およびＦｃ２は、異なっており、かつヘテロ二量体化を強制する突然変異（好ましくは、「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異）を含む。
【0284】
好ましい実施形態では、
－ ＶＬは、配列番号１０８のアミノ酸を含むか、もしくはからなり、かつＶＨは、配列番号１０９のアミノ酸を含むか、もしくはからなるか、または
－ ＶＬは、配列番号１１３のアミノ酸を含むか、もしくはからなり、かつＶＨは、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、もしくは配列番号１１７のアミノ酸を含むか、もしくはからなるか、または
－ ＶＬは、配列番号１２０のアミノ酸を含むか、もしくはからなり、かつＶＨは、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２５、もしくは配列番号１２７のアミノ酸を含むか、もしくはからなる。
－ ＶＬは、配列番号１０８のアミノ酸を含むか、もしくはからなり、かつＶＨは、配列番号１０９のアミノ酸を含むか、もしくはからなるか、または
－ ＶＬは、配列番号１１３のアミノ酸を含むか、もしくはからなり、かつＶＨは、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、もしくは配列番号１１７のアミノ酸を含むか、もしくはからなるか、または
－ ＶＬは、配列番号１２０のアミノ酸を含むか、もしくはからなり、かつＶＨは、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２５、もしくは配列番号１２７のアミノ酸を含むか、もしくはからなる。
【0285】
特に好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１００、１０３、１０５、１０６、１１１、１２２、１２６、１２８、１５１、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６６、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８３、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２８５、２９１、２９５、２９９、および３０３から選択される第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１９、１２１、１３１、１３３、１４３、１５２、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１８２、１８４、１８５、１８６、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８２、２８４、２９６、または３００から選択される第２のポリペプチド鎖とを含む。
【0286】
さらにより好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１００、１０３、１０５、１５１、１５６、１５８、１６６、１６７、１７５、１７８、１８０、１８３、１９３、２８５、２９１、２９５、２９９、および３０３から選択され、より好ましくは配列番号１００、１０３、１０５、１６７、１８３、１９３、２８５、２９１、２９５、２９９、および３０３から選択される第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０１、１０２、１０４、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１７２、１７４、１７６、１８２、１８５、１８６、２８４、２９６、または３００から選択され、より好ましくは配列番号１０１、１０２、１０４、１６０、１６２、１７６、１８６、２８４、２９６、または３００から選択される第２のポリペプチド鎖とを含む。
【0287】
最も好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、下記を含む：
－ 配列番号１００の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０１の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６７の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１８３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１９３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２９６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９９の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６１の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６３の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８５の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１７５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１７８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１８０の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、
特に、
－ 配列番号１００の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０１の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６７の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１８３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１９３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２９６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９９の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、
さらにより特に、
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６４の第２のポリペプチド鎖。
－ 配列番号１００の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０１の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６７の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１８３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１９３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２９６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９９の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６１の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６３の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６６の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８５の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１７５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１７８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１８０の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、
特に、
－ 配列番号１００の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０１の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１０５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１０４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１６７の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６０の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１８３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１７６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号１９３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２８４の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１８６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号２９６の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９９の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２８５の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号３０３の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６２の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、
さらにより特に、
－ 配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖、または
－ 配列番号２９１の第１のポリペプチド鎖、および配列番号１６４の第２のポリペプチド鎖。
【0288】
そのため、最も好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１５８の第１のポリペプチド鎖、および配列番号３００の第２のポリペプチド鎖を含み得る。
【0289】
ｓｃＴＣＲ
いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド、そのためＶＡおよびＶＢは、単一のポリペプチド鎖上に位置している。そのような実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、一本鎖ＴＣＲとして説明され得る。しかしながら、これは、抗原結合タンパク質に含まれるＦＲ配列および定常ドメインに応じて、上述したように、一本鎖抗体または一本鎖ＴＣＲ抗体分子とも称され得る。
いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド、そのためＶＡおよびＶＢは、単一のポリペプチド鎖上に位置している。そのような実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、一本鎖ＴＣＲとして説明され得る。しかしながら、これは、抗原結合タンパク質に含まれるＦＲ配列および定常ドメインに応じて、上述したように、一本鎖抗体または一本鎖ＴＣＲ抗体分子とも称され得る。
【0290】
ｓｃＴＣＲは、第１のＴＣＲに由来するかまたは第１のＴＣＲに由来するＣＤＲを少なくとも含む可変ドメイン、第２のＴＣＲに由来するかまたは第２のＴＣＲに由来するＣＤＲを少なくとも含む可変ドメイン、および第１または第２のＴＣＲの定常ドメインを含み得、換言すると、一本鎖ＴＣＲは、１つのＴＣＲ（例えば、αまたはγ鎖）に由来する可変ドメイン、および別のＴＣＲの鎖全体（例えば、βまたはδ鎖）、またはその逆を含む。さらに、ｓｃＲＣＲは、ドメインを互いに連結する１つまたは複数のリンカー（好ましくは、ペプチドリンカー）を含むでもよい。本発明のそのようなｓｃＴＣＲも提供され、これは、ヒトサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはＩＬ－１５）に融合している。
【0291】
一実施形態では、前記一本鎖ＴＣＲは、ＶＡ－Ｌｔ－ＶＢ、ＶＢ－Ｌｔ－ＶＡ、ＶＡ－Ｃα－Ｌｔ－ＶＢ、ＶＡ－Ｃβ－Ｌｔ－ＶＢ、ＶＡ－Ｌｔ－ＶＢ－Ｃβ、ＶＡ－Ｌｔ－ＶＢ－Ｃα、ＶＡ－Ｃα－Ｌｔ－ＶＢ－Ｃβ、ＶＡ－Ｃｂ－Ｌｔ－ＶＢ－Ｃα（好ましくは、ＶＡ－Ｌｔ－ＶＢ、ＶＢ－Ｌｔ－ＶＡ）からなる群から選択される一本鎖フォーマットの内の１つで存在しており、ここで、ＶＡは、本明細書の上記で定義されている第１の可変ドメインであり、ＶＢは、本明細書の上記で定義されている第２の可変ドメインであり、ＣαおよびＣβは、それぞれ、存在しているかまたは存在していないＴＣＲアルファ定常ドメインおよびＴＣＲベータ定常ドメインであり、Ｌｔは、存在しているかまたは存在していない、本明細書の上記定義セクションで定義されているリンカーである。
【0292】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号７９～８７もしくは８９～９２の内のいずれかのアミノ酸配列、または配列番号７９～８７もしくは８９～９２と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号８７のアミノ酸配列を含むｓｃＴＣＲである。
【0293】
ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ
一本鎖ＴＣＲは、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかに連結されているさらなる可変ドメイン、特に、上記で説明されているＶＬおよび／またはＶＨを含み得る。
一本鎖ＴＣＲは、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかに連結されているさらなる可変ドメイン、特に、上記で説明されているＶＬおよび／またはＶＨを含み得る。
【0294】
一実施形態では、そのようなさらなる可変ドメインは、リンカーＬｋを介して連結され得る。好ましい一実施形態では、リンカーＬｋは、本明細書の上記で定義されたリンカーであるか、または配列番号３６０のアミノ酸配列のヒンジ－ＣＨ１配列である。
【0295】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＶＡ、ＶＢ、およびＶＬまたはＶＨ（好ましくは、ＶＨ）を含む第１のポリペプチド鎖と、ＶＬおよびＶＨの他方（好ましくは、ＶＬ）を含む第２のポリペプチド鎖とを含むｓｃＴＣＲ－Ｆａｂである。好ましくは、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂは、配列番号９４～９８のいずれかのアミノ酸配列、または配列番号９４～９８と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むかまたはからなる第１のポリペプチド鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列、または配列番号９３と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むかまたはからなる第２のポリペプチド鎖とを含む。
【0296】
完全長ＴＣＲ
別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、ＶＡは、（完全長）ＴＣＲαまたはγ鎖に含まれており；ＶＢは、（完全長）ＴＣＲβまたはδ鎖に含まれている。そのような実施形態では、抗原結合タンパク質は、好ましくは、上記で説明されている従来のαβ ＴＣＲまたはγδ ＴＣＲの構造を有する。一実施形態では、ＴＣＲは、αβＴＣＲであり、配列番号３６１に従うα鎖定常ドメイン（ＴＲＡＣ）配列と、配列番号３６２に従うβ鎖定常ドメイン（ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２）配列とを含む。
別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、ＶＡは、（完全長）ＴＣＲαまたはγ鎖に含まれており；ＶＢは、（完全長）ＴＣＲβまたはδ鎖に含まれている。そのような実施形態では、抗原結合タンパク質は、好ましくは、上記で説明されている従来のαβ ＴＣＲまたはγδ ＴＣＲの構造を有する。一実施形態では、ＴＣＲは、αβＴＣＲであり、配列番号３６１に従うα鎖定常ドメイン（ＴＲＡＣ）配列と、配列番号３６２に従うβ鎖定常ドメイン（ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２）配列とを含む。
【0297】
一実施形態では、ＴＣＲ定常ドメイン配列は、任意の好適な種（例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、ラット、サル、ウサギ、ロバ、またはマウス、好ましくはヒト）に由来し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＴＣＲ定常ドメイン配列は、例えば、ＴＣＲの発現および安定性を増加させ得る異種配列（好ましくはマウス配列）の導入により、わずかに改変され得る。同様に、当該技術分野で既知のさらなる安定化突然変異（例えば、国際公開第２０１８／１０４４０７号パンフレット、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６９１５１、国際公開第２０１１／０４４１８６号パンフレット、同第２０１４／０１８８６３号パンフレット、例えば、可変領域における望ましくないアミノ酸の置き換え、ならびに／またはＴＣＲ Ｃドメイン間のジスルフィド架橋の導入、および不対システインの除去）を導入し得る。
【0298】
特に、ＴＣＲ定常ドメイン配列を切断または置換により改変して、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間のネイティブなジスルフィド結合を欠失させ得る。アルファ鎖および／またはデルタ鎖の定常ドメイン配列をまた、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７のシステイン残基の置換によっても改変し得、前記システインは、ＴＣＲのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間にジスルフィド結合を形成する。ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２は、定常ドメインの７５位でのシステインからアラニンへの突然変異、および定常ドメインの８９位でのアスパラギンからアスパラギン酸への突然変異をさらに含み得る。定常ドメインは、さらにまたはあるいは、ネイティブＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ１／２配列に対するさらなる突然変異、置換、または欠失を含み得る。ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ１／２という用語は、天然の多型変異体（例えば、ＴＲＡＣの４位でのＮからＫへ）を包含する（Bragado et al Int Immunol. 1994 Feb;6(2):223-30）。
【0299】
本発明はまた、抗原結合タンパク質（特に、ＴＣＲ）を提示する粒子、および粒子のライブラリ内の前記粒子の包含も含む。そのような粒子として、ファージ、酵母、リボソーム、または哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。そのような粒子およびライブラリを製造する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、国際公開第２００４／０４４００４号パンフレット；同第０１／４８１４５号パンフレット，Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184を参照されたい）。
【0300】
核酸、ベクター、および組換え宿主細胞
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質をコードする配列を含むかまたはからなる単離核酸に関する。
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質をコードする配列を含むかまたはからなる単離核酸に関する。
【0301】
「核酸」という用語は、本発明に関連して、デオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチド塩基、または両方の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを指す。ヌクレオチド単量体は、核酸塩基、五炭糖（例えば、限定されないが、リボースまたは２’－デオキシリボース）、および１～３個のリン酸基で構成されている。典型的には、核酸は、個々のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合により形成されている。本発明に関連して、核酸という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含むがこれらに限定されず、他の結合を含む核酸の合成形態も含む［例えば、Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)で説明されているペプチド核酸］。典型的には、核酸は、一本鎖分子または二本鎖分子であり、天然に存在するヌクレオチドで構成されている。核酸の一本鎖の描写は、相補鎖の配列も（少なくとも部分的に）定義する。核酸は、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよいか、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の一部を含んでもよい。例示されている二本鎖核酸分子は、３’または５’オーバーハングを有し得、そのため、その全長にわたり完全な二本鎖である必要はないが、そうであると思われる。核酸という用語は、染色体または染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、プライマー、プローブ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であり得、任意の特定の長さに限定されない。別途示されない限り、特定の核酸配列は、明示的に示されている任意の配列に加えて、相補配列を含むか、またはコードする。
【0302】
核酸は、細胞全体中に存在し得、細胞溶解物中に存在し得、または部分的に精製されているかもしくは実質的に純粋な形態の核酸であり得る。核酸は、標準的な技術により、他の細胞成分または他の夾雑物（例えば、他の細胞核酸またはタンパク質）から精製されている場合に、「単離されている」か、または「実質的に純粋になっている」。
【0303】
本開示の核酸分子を、増幅およびＲＮＡの逆転写の方法が挙げられるがこれらに限定されない標準的な分子生物学的技術を使用し得ることができる。例えば可変鎖をコードするＤＡＮ断片が得られると、このＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技術によりさらに操作して、例えば可変領域遺伝子を完全長鎖遺伝子へと変換させ得る。この操作では、変異体をコードするＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子、または別のタンパク質（例えば、定常領域またはフレキシブルリンカー）をコードする断片に、作動可能に連結されている。「作動可能に連結されている」という用語は、この文脈で使用される場合、例えば、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、またはタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、これら２つのＤＮＡ断片が機能的に連結されていることを意味することが意図されている。可変コードＤＮＡを、定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより、可変領域（例えば、可変アルファ領域および／または可変ベータ領域）をコードする単離ＤＮＡを完全長鎖遺伝子へと変換させ得る。例えばＴＣＲまたは抗体に関するヒト定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり、この領域を包含するＤＮＡ断片を、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。
【0304】
典型的には、前記核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、これらは、好適なベクターに含まれ得る。
【0305】
本明細書で説明されている第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、１つの核酸分子または２つの別々の核酸分子によりコードされ得る。
【0306】
従って、本明細書で説明されている抗原結合タンパク質またはその機能的断片を製造するための発現ベクターおよび宿主細胞も本明細書で提供される。
【0307】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の核酸を含むベクターに関する。
【0308】
「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入して、この宿主を形質転換して、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進し得る媒体を指す。
【0309】
様々な発現ベクターを採用して、抗原結合タンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを発現させ得る。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルスベースの発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞中において、本明細書で説明されている抗原結合タンパク質またはその機能的断片を産生させ得る。非ウイルス性のベクターおよびシステムとして、複数のプラスミド、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、またはウイルスベクターが挙げられる。
【0310】
そのようなベクターは、対象への投与時に前記ポリペプチドの発現を引き起こすかまたは誘導するために、調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、および同類のもの）を含み得る。動物細胞用の発現ベクターで使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例として、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、抗体重鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）およびエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）、ならびに同類のものが挙げられる。
【0311】
例えば、哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞中における、本明細書で説明されているポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとして、タンパク質の発現用に当該技術分野で既知の全ての好適なベクターが挙げられる。プラスミドの他の例として、複製起点を含む複製プラスミド、または組込みプラスミド（例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ、および同類のもの）が挙げられる。
【0312】
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子へとパッケージされる能力を有しており、かつ少なくとも外来性核酸をコードする核酸ベクターコンストラクトを指す。ベクターおよび／または粒子を、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞に目的の核酸を導入する目的に利用し得る。多数の形態のウイルスベクターが、当該技術分野で既知である。有用なウイルスベクターとして、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ（ＳＦＶ）に基づくベクターが挙げられる。組換えウイルスを、当該技術分野で既知の技術により製造し得、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることにより製造し得るか、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性トランスフェクションにより製造し得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等が挙げられる。そのような複製欠損組換えウイルスを製造するための詳細なプロトコルを、例えば、国際公開第９５／１４７８５号パンフレット、同第９６／２２３７８号パンフレット、米国特許第５，８８２，８７７号明細書、同第６，０１３，５１６号明細書、同第４，８６１，７１９号明細書、同第５，２７８，０５６号明細書、および国際公開第９４／１９４７８号パンフレットで見出し得る。
【0313】
本明細書で説明されている第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードする核酸は、同一のベクター中または別々のベクター中に存在し得る。本明細書で説明されている第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、同一のベクター中または別々のベクター中に存在し得る。
【0314】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質、第２の態様の核酸、または第３の態様のベクターを含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は、本発明に係る核酸および／またはベクターでトランスフェクトされていてもよいし、感染されていてもよいし、形質転換されていてもよい。
【0315】
「形質転換」という用語は、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質（典型的には、本明細書で説明されている抗原結合タンパク質またはその機能的断片）を産生するような、宿主細胞への「外来」（即ち外因性）遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されたＤＡＮまたはＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「形質転換されている」。
【0316】
本発明の核酸を使用して、好適な発現系で本発明の組換え抗原結合タンパク質を産生し得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターにより運ばれて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための、好適な条件下での宿主細胞および適合するベクターを意味する。
【0317】
一般的な発現系として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例として、原核細胞（例えば細菌）、および真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）が挙げられるが、これらに限定されない。具体例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞等）、ならびに初代または確立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生されたもの）が挙げられる。例としてまた、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ ｅｔ ａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）、および同類のものも挙げられる。いくつかの実施形態では、ＹＢ２／０細胞が好ましい場合があり、なぜならば、この細胞中で発現された場合には、キメラ抗体またはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が増強されるからである。
【0318】
上記によれは、一実施形態では、本発明は、本明細書の上記で定義されている本発明の抗原結合タンパク質、または本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸、または本発明の抗原結合タンパク質をコードするベクターに言及しており、前記宿主細胞は、好ましくは、ａ）リンパ球、例えば、Ｔリンパ球もしくはＴリンパ球前駆細胞、例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８陽性Ｔ細胞、またはｂ）組換え発現用の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0319】
特に、本発明の抗原結合タンパク質（特に、連結されていない２つのポリペプチドを含む抗原結合タンパク質）の一部の発現のために、発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子とが別々のベクターに存在するタイプ、または両方の遺伝子が同一のベクターに存在するタイプ（タンデム型）のいずれかであり得る。抗原結合タンパク質発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、ならびに動物細胞中での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現レベル間のバランスに関する限りでは、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい（Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan. 3; 167(1-2):271-8）。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターの例として、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号パンフレット）、ｐＥＥ１８、および同類のものが挙げられる。
【0320】
一実施形態では、そのような組換え宿主細胞を、本発明の少なくとも１種の抗原結合タンパク質の製造に使用し得る。
【0321】
医薬組成物
第５の態様では、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
第５の態様では、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【0322】
本発明の抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性をもたらし得ることが示されている。そのため、本発明の抗原結合タンパク質は、患者の腫瘍細胞を破壊するのに有用である。患者における免疫反応を、理想的には、免疫原性を増強する薬剤（即ち、アジュバント）と組み合わされた、説明されている抗原結合タンパク質の患者への直接投与により誘発し得る。そのような治療用ワクチン接種により生じる免疫反応は、腫瘍細胞に対して非常に特異的であることが予想され得、なぜならば、ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）は、正常組織上では、同程度のコピー数で提示されないかまたは過剰に提示されないからであり、患者の正常組織細胞に対する望ましくない自己免疫反応のリスクが予防される。
【0323】
本発明はまた、医薬品としての使用のための、本発明に係る抗原結合タンパク質にも関する。本発明はまた、医薬品としての使用のための、本発明の医薬組成物にも関する。
【0324】
「医薬組成物」または「治療用組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、対象に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘発可能な化合物または組成物を指す。
【0325】
いくつかの実施形態では、対象はまた、患者とも称され得る。
【0326】
そのような治療用組成物または医薬組成物は、投与様式に適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に許容される製剤との混合物で、本発明の抗原結合タンパク質、または治療薬をさらに含む抗原結合タンパク質の治療上有効な量を含み得る。
【0327】
本発明の抗原結合タンパク質は、通常、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容される担体希釈剤を通常は含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。
【0328】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、必要に応じて、哺乳動物（特に、ヒト）に投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の有害な反応を生じない分子実態および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの非毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または製剤化補助剤を指す。
【0329】
「薬学的に許容される担体または賦形剤」はまた、「薬学的に許容される希釈剤」または「薬学的に許容される媒体」とも称され得、生理学的に適合する溶媒、増量剤、安定化剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、および同類のものを含み得る。従って、一実施形態では、担体は、水性担体である。
【0330】
別の態様では、水性担体は、本明細書で説明されている抗原結合タンパク質と組み合わされた場合に、改善された特性（例えば、改善された溶解性、有効性、および／または改善された免疫療法）を付与することが可能である。
【0331】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量、およびレジメンは、当然のことながら、処置する状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重、および性別等に依存する。この医薬組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の好適な形態であり得る。この医薬組成物は、単位剤形で提供され得、一般に、密封容器で提供され得、かつキットの一部として提供され得る。そのようなキットは、通常は（必ずしもではないが）使用説明書を含むだろう。そのようなキットはまた、複数の前記単位剤形を含み得る。
【0332】
生物学的半減期等の経験による考察は、一般に、投与量の決定に寄与する。投与頻度は、決定されて治療期間中に調整され得、かつがん細胞の数の減少、がん細胞の減少の維持、がん細胞の増殖の減少、またはがん細胞の殺滅に基づいている。あるいは、抗原結合タンパク質の持続的連続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが、当該技術分野で既知である。
【0333】
一実施形態では、抗原結合分子の投与量を、１回または複数回の投与を受けている個体において、経験的に決定し得る。個体に、抗原結合タンパク質の漸増投与量を投与する。抗原結合タンパク質の有効性を評価するために、がん細胞の状態のマーカーを追跡し得る。これには、ＦＡＣＳ、他の撮像技術によるがん細胞の増殖および細胞死の直接測定、そのような測定により評価される場合の健康状態の改善、または受け入れられている検査により測定した場合の生活の質の向上、もしくは生存期間の延長が含まれる。投与量が、個体、疾患の段階、ならびに使用されている過去および同時の処置に応じて異なることは、当業者に明らかであるだろう。
【0334】
特に、本医薬組成物は、注射可能な製剤に薬学的に許容される媒体を含む。これは、特に、等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウム、および同類のもの、またはそのような塩の混合物）、または乾燥（特に凍結乾燥された）組成物であり得、これらは、場合によっては、滅菌水または生理食塩水の添加により注射液を構成し得る。
【0335】
投与に使用される用量を、様々なパラメータの関数として適合させ得、特に、使用される投与様式の関数として適合させ得るか、関連する病理の関数として適合させ得るか、あるいは所望の処置期間の関数として適合させ得る。
【0336】
医薬組成物を調製するために、本発明の抗原結合タンパク質の有効量を、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解させ得るか、または分散させ得る。
【0337】
注射用途に好適な医薬形態として、無菌の水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌の注射用の溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合で、製剤は、無菌でなければならず、かつ容易にシリンジで注入可能になる程度まで流体でなければならない。この製剤は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保たれていなければならない。
【0338】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水中で調製し得る。分散液をまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中でも調製し得、油中でも調製し得る。通常の保存および使用の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【0339】
本発明の抗原結合タンパク質を、中性または塩の形態で組成物に配合し得る。薬学的に許容される塩として、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられ、この酸付加塩は、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸等）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、および同類のもの）と共に形成されている。遊離カルボキシル基と共に形成されている塩はまた、例えば、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）、ならびに有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、グリシン、ヒスチジン、プロカイン、および同類のもの）からも誘導され得る。
【0340】
必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上記で列挙されている様々な他の成分と共に、適切な溶媒に組込み、続いてろ過滅菌することにより、滅菌注射液を調製する。一般に、基本的な分散媒と、上記で列挙されたものからの必要な他の成分とを含む滅菌媒体に、様々な滅菌有効成分を組み込むことにより、分散液を調製する。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過した溶液から、有効成分および任意の追加の所望の成分の粉末を得る真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【0341】
直接注射用のより多くのまたはより高濃度の溶液の調製も企図されており、溶媒としてのＤＭＳＯの使用により、非常に迅速な浸透がもたらされ、高濃度の活性剤が小さい腫瘍領域に送達されることが想定される。
【0342】
製剤では、溶液を、投与製剤と適合する方法で、および治療上有効な量で投与する。この製剤は、上述の注射液の種類等の様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルおよび同類のものも採用し得る。
【0343】
抗原結合タンパク質を製造する方法
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）宿主細胞を準備すること、
（ｂ）この抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含む遺伝子コンストラクトを準備すること、
（ｃ）前記遺伝子コンストラクトを前記宿主細胞に導入すること、ならびに
（ｄ）前記宿主細胞により前記遺伝子コンストラクトを発現させること、ならびに適宜
（ｅ）前記抗原結合タンパク質を発現するおよび／または分泌する細胞を選択すること
を含む方法に関する。
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）宿主細胞を準備すること、
（ｂ）この抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含む遺伝子コンストラクトを準備すること、
（ｃ）前記遺伝子コンストラクトを前記宿主細胞に導入すること、ならびに
（ｄ）前記宿主細胞により前記遺伝子コンストラクトを発現させること、ならびに適宜
（ｅ）前記抗原結合タンパク質を発現するおよび／または分泌する細胞を選択すること
を含む方法に関する。
【0344】
一実施形態では、この方法は、宿主細胞からの抗原結合タンパク質の単離および精製、ならびに適宜、Ｔ細胞中での抗原結合タンパク質の再構成をさらに含む。当業者は、抗原結合タンパク質を発現させるのに好適な宿主細胞を選択することが完全に可能である。
【0345】
本発明の抗原結合タンパク質を、当該技術分野で既知の任意の技術（例えば、限定されないが、任意の化学的技術、生物学的技術、遺伝学的技術、または酵素的技術の単独または組合せ）により製造し得る。
【0346】
本発明の抗原結合タンパク質は、抗体精製手順（例えば、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー）により、培養培地から好適に分離される。
【0347】
一実施形態では、発現された抗原結合タンパク質またはポリペプチドを回収することは、本明細書では、プロテインＡクロマトグラフィー、カッパセレクトクロマトグラフィー、および／またはサイズ排除クロマトグラフィー、好ましくはプロテインＡクロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィー、より好ましくはプロテインＡクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを実施することを指す。
【0348】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、ポリペプチドの製造のための標準的な技術により、本発明の抗原結合タンパク質を製造し得る。例えば、このタンパク質を、公知の固相法を使用して、特に、市販のペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製のもの）を使用して、かつ製造業者の指示に従って、合成し得る。あるいは、本発明の抗体および抗原結合タンパク質を、当該技術分野で公知の組換えＤＮＡおよび遺伝性トランスフェクション技術により製造し得る［Morrison SL. et al. (1984) and patent documents US5,202,238; and US5,204, 244を参照されたい］。例えば、断片を、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、そのようなベクターを、所望のポリペプチドを発現する好適な真核生物または原核生物の宿主に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、その後、この断片を、公知の技術を使用して単離し得る。
【0349】
一例［即ち、ＴＣＥＲ（登録商標）の場合］では、ＶＨおよびＶＬ、ならびに可変アルファ（Ｖアルファ）および可変ベータ（Ｖベータ）の様々な組合せをコードするＤＮＡ配列、ならびにリンカーをコードするＤＮＡ配列を、例えば遺伝子合成により得ることができる。得られたＤＮＡ配列を、例えば、それぞれヒトＩｇＧ４［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：Ｋ０１３１６］およびＩｇＧ１［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：Ｐ０１８５７］に由来するヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインをコードする発現ベクターに、インフレームでクローニングし得、さらに操作し得る。Reiter et al. (Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions. Biochemistry, 1994, 33, 5451 - 5459)により説明されている方法に従って、操作を実施して、追加の鎖間ジスルフィド結合安定化の有無にかかわらず、ＣＨ３ドメインにノブ・イントゥ・ホール突然変異を組み込み得；ＣＨ２中のＮ－グリコシル化部位を除去し得（例えばＮ２９７Ｑ突然変異）；それぞれＶＬおよびＶＨにＦｃサイレンシング突然変異を導入するかまたは追加のジスルフィド結合安定化を導入し得る。
【0350】
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子のトランスフェクション技術に基づいてヒト化抗体を製造する方法は、当該技術分野で公知であり（例えば、Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985を参照されたい）、抗原結合タンパク質の製造に容易に適用し得る。
【0351】
一例では、本発明の組換え抗原結合タンパク質の発現用のベクターを、例えば、ＨＣＭＶ由来のプロモーターエレメント、ｐＵＣ１９誘導体により制御されるモノシストロニックとして設計した。プラスミドＤＮＡを、例えば、標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増殖させ、その後に市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。精製されたプラスミドＤＮＡを、例えば、製造業者の指示に従って、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性トランスフェクションに使用した（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）システム；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、例えば３２℃～３７℃で６～１４日にわたり培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ溶液の１～２回の餌を与えた。
【0352】
条件付け細胞上清を、例えば、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を利用するろ過（０．２２μｍ）により清澄化した。二重特異性抗原結合タンパク質を、例えば、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実施するように装備されたＡｅｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。親和性クロマトグラフィーを、例えば、標準的な親和性クロマトグラフィープロトコルに従ってプロテインＡまたはＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを、例えば、標準プロトコルに従ってＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、親和性カラムからの溶出（ｐＨ２．８）直後に実施して、高純度の単量体タンパク質を得た。タンパク質濃度を、例えば、予測されるタンパク質配列に従って算出された減衰係数を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。濃度を、必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して調整した。最後に、精製された分子を、例えば、２～８℃の温度で約１ｍｇ／ｍＬの濃度にて、リン酸緩衝生理食塩水中で保存した。
【0353】
精製された二重特異性抗原結合タンパク質の品質を、例えば、Ｖａｎｑｕｉｓｈ ＵＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍ内で、３００ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で動作するＭａｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラム（５μｍ、７．８×３００ｍｍ）によるＨＰＬＣ－ＳＥＣにより決定した。
【0354】
治療方法および治療用途
第７の態様では、本発明は、医薬での使用のための、特に、増殖性疾患の診断、予防、および／または処置での使用のための、第１の態様の抗原結合タンパク質、第２の態様の核酸、第３の態様のベクター、第４の態様の宿主細胞、または第５の態様の医薬組成物を提供する。治療用途（即ち、予防および／または処置）のために、本抗原結合タンパク質は、ＭＨＣとの複合体中のＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに結合する第１の抗原結合部位（即ち、ＶＡおよびＶＢにより形成された抗原結合部位）と、エフェクター細胞の抗原に結合する第２の抗原結合部位（即ち、ＶＬおよびＶＨにより形成された抗原結合部位）とを含むことが好ましい。本発明者らは、本発明のいくつかの二重特異性化合物に関して、Ｈｓ６９５ＴおよびＵ２０Ｓ等のＰＲＡＭＥ陽性がん細胞株に対するコンストラクトの細胞傷害活性を、インビトロでの実験セクションで示している。本発明者らは、ペプチドＰＲＡＭＥ－００４を提示しない細胞株では、二重特異性抗原結合タンパク質により誘発された溶解はわずかであったのみであったことから、前記細胞傷害活性は、高度に特異的であり、かつＰＲＡＭＥ陽性細胞に限定されることをさらに実証している。
第７の態様では、本発明は、医薬での使用のための、特に、増殖性疾患の診断、予防、および／または処置での使用のための、第１の態様の抗原結合タンパク質、第２の態様の核酸、第３の態様のベクター、第４の態様の宿主細胞、または第５の態様の医薬組成物を提供する。治療用途（即ち、予防および／または処置）のために、本抗原結合タンパク質は、ＭＨＣとの複合体中のＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに結合する第１の抗原結合部位（即ち、ＶＡおよびＶＢにより形成された抗原結合部位）と、エフェクター細胞の抗原に結合する第２の抗原結合部位（即ち、ＶＬおよびＶＨにより形成された抗原結合部位）とを含むことが好ましい。本発明者らは、本発明のいくつかの二重特異性化合物に関して、Ｈｓ６９５ＴおよびＵ２０Ｓ等のＰＲＡＭＥ陽性がん細胞株に対するコンストラクトの細胞傷害活性を、インビトロでの実験セクションで示している。本発明者らは、ペプチドＰＲＡＭＥ－００４を提示しない細胞株では、二重特異性抗原結合タンパク質により誘発された溶解はわずかであったのみであったことから、前記細胞傷害活性は、高度に特異的であり、かつＰＲＡＭＥ陽性細胞に限定されることをさらに実証している。
【0355】
従って、本発明の抗原結合タンパク質［特に、ＴＣＥＲ（登録商標）等の二重特異性抗原結合タンパク質］を使用して、がんを処置し得る。本発明の抗原結合タンパク質を、ヒトおよび／または非ヒト哺乳動物での治療目的に使用し得る。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞に結合して、細胞表面上でペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）：ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞の増殖を減少させ得、および／または殺滅し得る。この抗原結合タンパク質を、生理学的（例えば、インビボ）条件で結合を促進する濃度にて投与することが理解される。別の実施形態では、抗原結合タンパク質を、肺、乳房、卵巣、または腎臓等の様々な組織の腫瘍細胞に対する免疫療法に使用し得る。別の実施形態では、この抗原結合タンパク質は、単独で腫瘍細胞に結合して、この腫瘍細胞の増殖を減少させ得、および／または殺滅し得る。
【0356】
従って、本発明は、増殖性疾患または障害を処置するかまたは予防する方法であって、本明細書の上記「抗原結合タンパク質」、「核酸」、または「医薬組成物」セクションで定義されている本発明に係る抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の治療上有効な量を、必要な対象に投与することを含む方法に関する。
【0357】
特定の実施形態では、本発明は、増殖性疾患を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、細胞表面上で本発明の抗原結合タンパク質を発現するＴ細胞を投与することを含む方法に関する。
【0358】
さらなる実施形態では、本発明は、増殖性疾患を有する対象において免疫反応を誘発する方法であって、前記対象に、細胞表面上で本発明のコンストラクトを認識する抗原を発現するＴ細胞を含む組成物を投与することを含む方法に言及する。
【0359】
一実施形態では、前記方法で言及されている免疫反応は、細胞傷害性Ｔ細胞反応である。
【0360】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物は、増殖性疾患の診断、予防、および／または処置での使用のためのものである。
【0361】
本発明は、対象の増殖性疾患または障害を処置するかまたは予防するための医薬品の調製のための、本発明に係る抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の使用にさらに言及する。
【0362】
一実施形態では、本発明は、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むかまたはからなるペプチドを提示するがんを有する患者において免疫反応を誘発する方法であって、この患者に、本開示の抗原結合タンパク質を投与することを含み、前記がんは、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮および子宮内膜がん、骨肉腫、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、ならびに滑膜肉腫からなるがんの群から選択される、方法に言及する。
【0363】
一実施形態では、本発明は、対象の疾患または障害を処置するかまたは予防するための、本発明に係る抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の使用を指す。
【0364】
「対象」または「個体」という用語は、互換的に使用され、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得、好ましくはヒトであり得る。
【0365】
本発明に関連して、「処置する」または「処置」という用語は、治療的使用（即ち、所与の疾患を有する対象に対する）を指しており、そのような障害または状態の１つまたは複数の症状の反転、緩和、進行の阻害を意味する。従って、処置は、疾患が完全に治癒される処置を指すだけでなく、疾患の進行を遅延させるおよび／または対象の生存期間を延ばす処置も指す。
【0366】
「予防する」は、予防的使用（即ち、所与の疾患を発症しやすい対象に対する）を意味する。
【0367】
一実施形態では、「疾患」または「障害」とは、本発明の抗原結合タンパク質による処置から利益を得るであろうあらゆる状態のことである。一実施形態では、これには、対象を問題の障害にかかりやすくさせる病理学的状態を含む慢性および急性の障害または疾患が含まれている。「処置が必要な」という用語は、障害を既に有する対象、および障害を予防すべきである対象を指す。
【0368】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、二重特異性であり、より具体的には、本明細書で説明されているＴＣＥＲ（登録商標）である。
【0369】
がん等の「増殖性疾患」は、細胞の無秩序なおよび／または不適当な増殖を伴う。
【0370】
従って、一実施形態では、増殖性障害は、がんである。
【0371】
さらなる実施形態では、がんは、ＰＲＡＭＥ抗原が、過剰発現されている、突然変異している、および／またはＭＨＣと関連するＰＲＡＭＥ由来の腫瘍関連抗原が提示されるがんである。
【0372】
従って、特に好ましいがんは、ＰＲＡＭＥ陽性がんである。
【0373】
本発明に関連して、関連するペプチド（例えば、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド）が、ＮＣＩによるガイドラインに従って全がんの９８％超で提示されている場合には、がんは、「ＰＲＡＭＥ陽性」とみなされる。ここで挙げられた全ての他の適応症では、生検を、これらの癌の処置で標準的であることから実施し得、ペプチドを、ＸＰｒｅｓｉｄｅｎｔ（登録商標）および関連する方法に従って［国際公開第０３／１００４３２号パンフレット；同第２００５／０７６００９号パンフレット；同第２０１１／１２８４４８号パンフレット；同第２０１６／１０７７４０号パンフレット、米国特許第７，８１１，８２８号明細書、同第９，７９１，４４４号明細書、および米国特許出願公開第２０１６／０１８７３５１号明細書（それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に従って］同定し得る。一実施形態では、例えば、本発明の抗原結合タンパク質を使用することにより、がんを容易にアッセイする（即ち、診断する）。抗原結合タンパク質を使用して、抗原を発現するがんを同定する方法は、当業者に既知である。癌腫は、身体の臓器を補強するかまたは覆う皮膚または組織で出現する特定のタイプのがんであることから、「がん」および「癌腫」という用語は、本明細書では互換的に使用されないことを理解しなければならない。
【0374】
一実施形態では、ＰＲＡＭＥ「陽性」である（即ち、標的ペプチドを提示する）がんは、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮および子宮内膜がん、骨肉腫、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、ならびに滑膜肉腫からなる群から選択され、好ましくは、乳がん、胆管細胞癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮および子宮内膜がん、ならびに滑膜肉腫からなる群から選択される。
【0375】
一実施形態では、がんが、ＰＲＡＭＥ抗原が過剰発現されている、突然変異している、および／またはＭＨＣに関連するＰＲＡＥＭ由来の腫瘍関連抗原が提示されているがんである場合には、例えば本発明の抗原結合タンパク質を使用することにより、容易にアッセイされる。抗原結合タンパク質を使用して、抗原を発現するがんを同定する方法は、当業者に既知である。
【0376】
がん治療のガイドラインを示すテキストは、Cancer, Principles and Practice of Oncology, 4th Edition, DeVita et al, Eds. J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa. (1993)である。関連分野で認識されているように、特定のタイプのがん、および他の因子（例えば、患者の全身状態）に従って、適切な治療アプローチが選択される。本発明の抗原結合タンパク質を、それ自体で使用し得るか、またはがん患者の処置で他の抗新生物剤を使用する治療レジメンに加え得る。
【0377】
従って、いくつかの実施形態では、例えば、抗原結合タンパク質を、化学療法剤、非化学療法剤、抗新生物剤、および／または放射線等のがん処置で広く採用されている様々な薬物および処置と同時に、その前に、またはその後に投与し得る。
【0378】
一実施形態では、本発明は、ＭＨＣタンパク質との複合体でＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むかまたはからなるペプチドを提示するがんを有する患者を処置する方法であって、この患者に、本開示の抗原結合タンパク質を投与することを含み、前記がんは、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮および子宮内膜がん、骨肉腫、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、ならびに滑膜肉腫からなるがんの群から選択される、方法に関する。
【0379】
「診断」は、本明細書では、医学的診断を指しており、どの疾患または状態がヒトの症状および徴候を説明するかを決定することを指す。
【0380】
抗原結合タンパク質またはその医薬組成物の「治療上有効な量」は、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で前記増殖性疾患を処置するのに十分な量の抗原結合タンパク質を意味する。しかしながら、本発明の抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の１日当たりの総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者に関する具体的な治療上有効な用量は、様々な因子に依存しており、この因子として下記が挙げられる：処置される障害および障害の重症度；採用される具体的な抗原結合タンパク質の活性；採用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事；採用される具体的なポリペプチドの投与時間、投与経路、および排出速度；処置の継続期間；採用される具体的なポリペプチドと併用されるかまたは同時に使用される薬物；ならびに医学技術分野で公知の同類の因子。例えば、所望の治療効果を得るのに必要なレベルと比べて低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加させることが当業者に公知である。
【0381】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質による処置の有効性を、例えば、がんのマウスモデルにおいて、例えば、処置群とコントロール群との間の腫瘍体積の変化を測定することにより、インビボでアッセイする。
【0382】
本発明の医薬組成物、ベクター、核酸、および細胞は、実質的に純粋な形態で提供され得、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋な形態で提供され得る。
【0383】
本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物を、任意の実現可能な方法により投与し得る。
【0384】
本明細書で開示されているように、いくつかの実施形態では、本明細書の上記で定義されている宿主細胞を、本明細書で説明されている医療用途または処置方法で使用する。同じ実施形態では、宿主細胞は、好ましくは、ａ）リンパ球、例えば、Ｔリンパ球またはＴリンパ球前駆細胞であり、例えば、ＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞であり、最も好ましくはＴ細胞である。
【0385】
従って、本発明の宿主細胞（好ましくは、Ｔ細胞）を、治療用組成物の有効成分として使用し得る。そのため、本発明はまた、ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）を含むポリペプチドを標的細胞が異常発現する患者において標的細胞を殺滅する方法であって、患者に、宿主細胞（好ましくはＴ細胞）の有効数を投与することを含む方法も提供する。この方法に関連して、宿主細胞は、対象に投与されると、好ましくは免疫反応を誘発する。
【0386】
ある態様では、ＴＣＲにより誘発された反応、またはＴ細胞反応は、インビトロまたはインビボにおける、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）等のペプチドにより誘発されるエフェクター機能の増大および活性化を指し得る。ＭＨＣクラスＩにより制限された細胞傷害性Ｔ細胞の場合には、例えば、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、もしくは天然にペプチドを提示する標的細胞の溶解、ペプチドにより誘発されるサイトカイン（好ましくは、インターフェロン－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、もしくはＩＬ－２）の分泌、ペプチドにより誘発されるエフェクター分子（例えば、グランザイムもしくはパーフォリン）の分泌、または脱顆粒であり得る。
【0387】
従って、本明細書の上記で定義されている宿主細胞は、対象由来であってもよいし（自己）、別の個体であってもよく、好ましくは、前記他の個体は、健康である。
【0388】
「健康」は、対象が、一般に良好な健康状態であり、好ましくは、適格性の免疫系を有しており、より好ましくは、容易に検査されて検出され得る任意の疾患に罹患していないことを意味する。
【0389】
具体例では、宿主細胞は、Ｔ細胞である。従って、本発明に関連して、本明細書の上記で定義されているＴ細胞を医薬品として使用する場合には、通常、Ｔ細胞を、アフェレーシスにより細胞から採取する。次いで、Ｔ細胞を、その細胞表面上で本発明の抗原結合タンパク質を発現するように遺伝子操作し、次いで、遺伝子操作されたＴ細胞を増殖させて、次いで対象に再注入する。この例では、抗原結合タンパク質は、好ましくはＴＣＲである。
【0390】
別のアプローチでは、宿主細胞は、間葉系幹細胞等の幹細胞であり得、本発明の抗原結合タンパク質を発現するように操作されている。この例では、抗原結合タンパク質は、本明細書の上記で定義されている抗体、ｓｃＴＣＲ、またはダイアボディ等の可溶性タンパク質である。
【0391】
従って、宿主細胞は、本明細書の上記「核酸、ベクター、および組換え宿主細胞」セクションで説明されているように、本発明に係る核酸および／またはベクターでトランスフェクトされているか、感染されているか、または形質転換されている。
【0392】
本発明の抗原結合タンパク質を発現させるために宿主細胞をトランスフェクトした場合には、好ましくは、細胞は、抗原結合タンパク質を発現可能な発現ベクターを含む。次いで、宿主細胞は、活性化宿主細胞と称され得る。
【0393】
このいわゆるＴ細胞の養子移入のプロトコルは、当該技術分野で公知である。概説を、Gattioni et al.およびMorgan et al.［Gattinoni, L. et al., Nat.Rev.Immunol. 6 (2006): 383-393；Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129］で見出し得る。
【0394】
多くの他の方法を使用して、インビトロでＴ細胞を生成し得る。例えば、自己腫瘍浸潤リンパ球を、ＣＴＬの生成で使用し得る。Plebanski et al. (Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787)は、Ｔ細胞の調製において自己末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を使用した。同様に、Ｂ細胞を、自己Ｔ細胞の製造で使用し得る。
【0395】
Ｔ細胞の調製では同種細胞も使用し得、方法が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６８０５８６１号明細書で詳細に説明されている。
【0396】
ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）に対して本発明の抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞は、治療に有用である。そのため、本発明のさらなる態様は、本発明の上述の方法により得られる活性化宿主細胞を提供する。
【0397】
上記方法により製造される活性化宿主細胞は、ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）を含むポリペプチドを異常発現する細胞を特異的に認識し得る。
【0398】
「異常発現される」により、本発明者らはまた、ポリペプチドが、正常な（健康な）組織の発現レベルと比較して過剰発現されていること、または腫瘍が由来する組織では遺伝子がサイレントであるが腫瘍内では遺伝子が発現されることも意味する。「過剰発現される」により、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織中に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで存在することを意味しており、好ましくは、正常組織中に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味している。
【0399】
ある態様では、宿主細胞（特に、Ｔ細胞）は、その抗原結合タンパク質（特に、そのＴＣＲ）を介してＰＲＡＭＥ－００４複合体と相互作用する（例えば結合する）ことにより、細胞を認識する。宿主細胞は、ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）を含むポリペプチドを標的細胞が異常発現する患者の標的細胞を殺滅する方法で有用であり、この患者に、活性化宿主細胞の有効数を投与する。患者に投与されるＴ細胞は、患者に由来し得、上述したように活性化され得る（即ち，自己Ｔ細胞である）。あるいは、Ｔ細胞は、患者由来ではないが、別の個体由来である。当然のことならが、これは、個体が健康な個体である場合に好ましい。「健康な個体」により、本発明者らは、個体が、一般に良好な健康状態であり、好ましくは、適格性の免疫系を有しており、より好ましくは、容易に検査されて検出され得る任意の疾患に罹患していないことを意味する。
【0400】
インビボでは、本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、腫瘍の細胞（ＭＨＣクラスＩＩを発現することがある）および／または腫瘍（腫瘍細胞）を取り囲む間質細胞（ＭＨＣクラスＩＩも発現することがある）であり得る［Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170］。
【0401】
診断用途
ＰＲＡＭＥは、本明細書の上記で定義されたＰＲＡＭＥ発現がんの表面上で発現される。抗原ＰＲＡＭＥは、がんマーカーを構成し、従って、抗がん治療の有効性を示すために使用される可能性を有するか、または疾患の再発の検出のために使用される可能性を有する。
ＰＲＡＭＥは、本明細書の上記で定義されたＰＲＡＭＥ発現がんの表面上で発現される。抗原ＰＲＡＭＥは、がんマーカーを構成し、従って、抗がん治療の有効性を示すために使用される可能性を有するか、または疾患の再発の検出のために使用される可能性を有する。
【0402】
そのため、別の態様では、本発明は、診断薬としての使用のための、特に、インビボ診断薬としての使用のための、第１の態様の抗原結合タンパク質、第２の態様の核酸、第３の態様のベクター、第４の態様の宿主細胞、または第５の態様の医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、この診断薬は、増殖性疾患の診断用である。より好ましい実施形態では、この診断薬は、ＭＨＣタンパク質との複合体でＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むかまたはからなるペプチドを提示するがんの診断用であり、好ましくは、前記がんは、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮および子宮内膜がん、骨肉腫、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、ならびに滑膜肉腫からなるがんの群から選択される。
【0403】
当業者は、診断目的では、本抗原結合タンパク質は、ＶＡおよびＶＢを含むが、好ましくはＶＬおよびＶＨを含まないことを認識している。
【0404】
ある実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、治療薬に対する患者の感受性を決定するために、抗がん治療の有効性をモニタリングするために、または処置後の疾患の再発を検出するために、ＰＲＡＭＥを発現する腫瘍を標的とする治療に関連するアッセイの構成要素として使用される。特に、本明細書で定義されるＶＡドメインおよびＶＢドメインを含む抗原結合タンパク質が、診断アッセイの構成要素として使用され、二重特異性抗原結合タンパク質が、治療薬の構成要素として使用される。
【0405】
そのため、本発明のさらなる目的は、対象中でのＰＲＡＭＥ発現をインビボで検出するための使用のための、または対象の生物学的サンプル中でのＰＲＡＭＥ発現をエクスビボもしくはインビトロで検出するための使用のための、本発明に係る抗原結合タンパク質に関する。前記検出は、特に、下記が意図され得る：
ａ）対象におけるがんの存在を診断すること、または
ｂ）ＰＲＡＭＥを標的とする治療薬に対する、がんを有する患者の感受性を決定すること、または
ｃ）腫瘍細胞上の表面タンパク質ＰＲＡＭＥの発現を検出することにより、特に、本発明に係る二重特異性による治療に関して、抗ＰＲＡＭＥがん治療の有効性をモニタリングすること、または抗ＰＲＡＭＥがん治療後にがん再発を検出すること。
ａ）対象におけるがんの存在を診断すること、または
ｂ）ＰＲＡＭＥを標的とする治療薬に対する、がんを有する患者の感受性を決定すること、または
ｃ）腫瘍細胞上の表面タンパク質ＰＲＡＭＥの発現を検出することにより、特に、本発明に係る二重特異性による治療に関して、抗ＰＲＡＭＥがん治療の有効性をモニタリングすること、または抗ＰＲＡＭＥがん治療後にがん再発を検出すること。
【0406】
ある実施形態では、本抗原結合タンパク質は、インビトロまたはエクスビボでの使用が意図されている。
【0407】
キット
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１種の抗原結合タンパク質を含むキットも提供する。
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１種の抗原結合タンパク質を含むキットも提供する。
【0408】
一実施形態では、キットは、
ａ）本明細書の上記「抗原結合タンパク質」セクションで定義されている本発明の少なくとも１種の抗原結合タンパク質、
ｂ）適宜パッケージング材料、および
ｃ）適宜前記抗原結合タンパク質ががんの処置に有効であるかまたはがんの処置のための使用に有効であることを示す、前記パッケージング材料に含まれるラベルまたはパッケージング挿入物
を含む。
ａ）本明細書の上記「抗原結合タンパク質」セクションで定義されている本発明の少なくとも１種の抗原結合タンパク質、
ｂ）適宜パッケージング材料、および
ｃ）適宜前記抗原結合タンパク質ががんの処置に有効であるかまたはがんの処置のための使用に有効であることを示す、前記パッケージング材料に含まれるラベルまたはパッケージング挿入物
を含む。
【0409】
関連する実施形態では、本発明の少なくとも１種の抗原結合タンパク質は、単室および／または多室のプレ充填シリンジ［例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ）］に入っている。
【0410】
一実施形態では、本発明は、単回容量投与単位を製造するためのキットを包含する。
【0411】
従って、一実施形態では、本発明のキットのａ）で言及されている本発明の少なくとも１種の抗原結合タンパク質は、第１の容器に入っている本発明の乾燥抗原結合タンパク質である。次いで、このキットは、水性製剤が入っている第２の容器をさらに含む。
【0412】
従って、一実施形態では、キットは、
ａ）本明細書の上記「抗原結合タンパク質」セクションで定義されている本発明の少なくとも１種の乾燥抗原結合タンパク質が入っている第１の容器、
ｂ）水性製剤が入っている第２の容器、
ｃ）適宜パッケージング材料、および
ｄ）適宜前記抗原結合タンパク質ががんの処置に有効であるかまたはがんの処置のための使用に有効であることを示す、前記パッケージング材料に含まれるラベルまたはパッケージング挿入物
を含む。
ａ）本明細書の上記「抗原結合タンパク質」セクションで定義されている本発明の少なくとも１種の乾燥抗原結合タンパク質が入っている第１の容器、
ｂ）水性製剤が入っている第２の容器、
ｃ）適宜パッケージング材料、および
ｄ）適宜前記抗原結合タンパク質ががんの処置に有効であるかまたはがんの処置のための使用に有効であることを示す、前記パッケージング材料に含まれるラベルまたはパッケージング挿入物
を含む。
【0413】
水性製剤は、典型的には、本明細書の上記「医薬組成物」セクションで定義されている薬学的に許容される担体を含む水溶液である。
【0414】
関連する実施形態では、「第１の容器」および「第２の」容器は、多室のプレ充填シリンジ（例えば、凍結乾燥シリンジ）のチャンバーを指す。
【0415】
本願全体を通して、「および／または」という用語は、これが接続する場合の内の１つまたは複数が起こり得ることを包含すると解釈されるべき文法上の接続詞である。例えば、「そのような天然配列タンパク質を、標準的な組換え方法および／または合成方法を使用して調製し得る」という文言は、天然配列タンパク質を、標準的な組換え方法および合成方法を使用して調製し得ること、または天然配列タンパク質を、標準的な組換え方法を使用して調製し得ること、または天然配列タンパク質を、合成方法を使用して調製し得ることを示す。
【0416】
さらに、本願全体を通して、「含む」という用語は、具体的に言及された全ての特徴だけでなく、任意の、追加の、不特定のものも包含すると解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む」という用語の使用はまた、具体的に言及された特徴以外の特徴が存在していない（即ち、「からなる」）実施形態も開示する
【0417】
さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を除外しない。ある特定の手段が相互に異なる従属請求項で列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せが有利に使用され得ないことを示すものではない。
【0418】
これより、本発明を、下記の図面および実施例を参照してより詳細に説明する。本明細書で引用されている全ての文献および特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明を、下記の説明において詳細に示して説明しているが、実施例は例示的なものであり限定的ではないと考えられるべきである。
【実施例】
【0419】
［実施例１］
【0420】
一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲフォーマット）
［実施例１．１］
安定したｓｃＴＣＲの生成
本発明では、可変アルファ（配列番号３）およびベータ（配列番号４）ドメイン、ならびに適切なグリシン－セリンリンカー配列（配列番号６１）を使用して、ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３（配列番号１および２、完全長）を、一本鎖ＴＣＲコンストラクト（ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３、配列番号５）へと変換した。酵母表面提示によるＴＣＲ成熟のために、対応する配列のＤＮＡを合成し、ｐＣＴ３０２をベースとする酵母提示ベクター（ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｖｅｃｔｏｒ）と共に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００（ＭＡＴａ ＡＧＡ１：：ＧＡＬ１－ＡＧＡ１：：ＵＲＡ３ ｕｒａ３－５２ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２－ｄｅｌｔａ２００ ｈｉｓ３－ｄｅｌｔａ２００ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｐｒｂｄ１．６Ｒ ｃａｎ１ ＧＡＬ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＭＹＡ－４９４１（商標））に形質転換した（Boder and Wittrup, Methods Enzymol. 2000;328:430-44;）。酵母中での相同組換え後に得られた融合タンパク質（配列番号３２５）は、Ａｇａ２ｐタンパク質（配列番号８８）のＮ末端でのリーダーペプチド（Boder and Wittrup, Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7）と、目的のタンパク質（即ち、ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３（配列番号５）またはその変異体と、融合タンパク質の発現レベルを決定するための追加のペプチドタグ［ＦＬＡＧおよびＭｙｃ（配列番号９９および２８８）］とを含む。ｓｃＴＣＲ変異体のライブラリを、縮重プライマーを使用するＰＣＲにより作製し、国際公開第２０１８／０９１３９６号パンフレットで説明されているように酵母細胞の形質転換を実施し、１つのライブラリ当たり１０９個の酵母クローンを得た。
［実施例１．１］
安定したｓｃＴＣＲの生成
本発明では、可変アルファ（配列番号３）およびベータ（配列番号４）ドメイン、ならびに適切なグリシン－セリンリンカー配列（配列番号６１）を使用して、ＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３（配列番号１および２、完全長）を、一本鎖ＴＣＲコンストラクト（ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３、配列番号５）へと変換した。酵母表面提示によるＴＣＲ成熟のために、対応する配列のＤＮＡを合成し、ｐＣＴ３０２をベースとする酵母提示ベクター（ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｖｅｃｔｏｒ）と共に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００（ＭＡＴａ ＡＧＡ１：：ＧＡＬ１－ＡＧＡ１：：ＵＲＡ３ ｕｒａ３－５２ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２－ｄｅｌｔａ２００ ｈｉｓ３－ｄｅｌｔａ２００ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｐｒｂｄ１．６Ｒ ｃａｎ１ ＧＡＬ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＭＹＡ－４９４１（商標））に形質転換した（Boder and Wittrup, Methods Enzymol. 2000;328:430-44;）。酵母中での相同組換え後に得られた融合タンパク質（配列番号３２５）は、Ａｇａ２ｐタンパク質（配列番号８８）のＮ末端でのリーダーペプチド（Boder and Wittrup, Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7）と、目的のタンパク質（即ち、ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３（配列番号５）またはその変異体と、融合タンパク質の発現レベルを決定するための追加のペプチドタグ［ＦＬＡＧおよびＭｙｃ（配列番号９９および２８８）］とを含む。ｓｃＴＣＲ変異体のライブラリを、縮重プライマーを使用するＰＣＲにより作製し、国際公開第２０１８／０９１３９６号パンフレットで説明されているように酵母細胞の形質転換を実施し、１つのライブラリ当たり１０９個の酵母クローンを得た。
【0421】
ＨＬＡ－Ａ＊０２に関連してＰＲＡＭＥ－００４への結合が改善された突然変異体ｓｃＴＣＲ変異体を持つ酵母クローンの選択プロセスを、本質的には、Smith et al.（Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141）で説明されているように実施した。Ｍｙｃタグ－ＦＩＴＣ染色により決定された発現、特に、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４四量体染色による機能的結合を、最も有望な候補を選択するために適用した（図１）。酵母表面提示によるｓｃＴＣＲ変換により、３つの単一点ＣＤＲ突然変異と組み合わされた９つのフレームワーク突然変異が明らかとなり、その結果、安定化ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤ（配列番号６）が、改善された発現およびＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４四量体結合を示した。
［実施例１．２］
［実施例１．２］
【0422】
安定化ｓｃＴＣＲの親和性成熟、結合モチーフおよび特異性の評価
ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４に対する結合親和性がより高いｓｃＴＣＲ分子を生成するために、既に同定されている安定化ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤ（配列番号６）を使用して、全てのＣＤＲを個々に成熟させた。ＣＤＲ残基を、本質的には既に説明されている（Smith et al., Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141）縮退ＤＮＡオリゴプライマーを使用して無作為化した。得られたＤＮＡライブラリを、実施例１で説明されているように形質転換した。
ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４に対する結合親和性がより高いｓｃＴＣＲ分子を生成するために、既に同定されている安定化ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤ（配列番号６）を使用して、全てのＣＤＲを個々に成熟させた。ＣＤＲ残基を、本質的には既に説明されている（Smith et al., Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141）縮退ＤＮＡオリゴプライマーを使用して無作為化した。得られたＤＮＡライブラリを、実施例１で説明されているように形質転換した。
【0423】
親和性が増強されている特異的なＲ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤ ｓｃＴＣＲ変異体を選択するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４四量体または単量体の濃度を減少させつつ、各選択ラウンドに使用した。４回の選択ラウンド後、単一ｓｃＴＣＲクローンを単離して配列決定し、多くの親和性成熟ＣＤＲ配列を得た。成熟ＣＤＲａ１配列を有するｓｃＴＣＲ（配列番号１６～２８、図２）に関して例示的に示されるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体の結合における強力な改善を、成熟ＣＤＲａ２およびＣＤＲｂ２を有するｓｃＴＣＲ（配列番号２９～３２および３５～４５、表３）に関しても実証し得た。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド（配列番号５０）に対する配列類似性の程度が高いペプチド（類似ペプチドまたはＳｉｍＰｅｐ）を含むＨＬＡ－Ａ＊０２四量体のミックスへのｓｃＴＣＲの低い結合により裏付けられるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４結合の選択性は成熟中に保持されていた。全ての選択されたｓｃＴＣＲ突然変異変異体は、１０ｎＭの濃度でＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体による実質的な染色を示したが、参照としての非成熟の安定化ｓｃＴＣＲ Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤは、染色を示さなかった（図２および表３）。さらに、１０ｎＭの濃度でのＨＬＡ－Ａ＊０２四量体の高結合活性フォーマットで適用された類似ペプチドのミックスへの成熟ｓｃＴＣＲの結合は、検出され得なかったか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体結合と比較して低いシグナルしか示さず、このことから、高度に特異的にＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドに結合するｓｃＴＣＲ成熟変異体の能力が裏付けられる。
【0424】
【表3】
【0425】
ｓｃＴＣＲクローンの親和性をさらに増加させるために、上述されたＣＤＲライブラリで同定された成熟ＣＤＲを、１つのＤＮＡライブラリに系統的に組み合わせ、実施例１．１で説明されているように、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００に形質転換した。このライブラリを、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体を使用して選択し、単一酵母クローン由来のｓｃＴＣＲを配列決定し、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチド、またはＰＲＡＭＥ－００４との配列類似性を共有する２６種のペプチド（類似ペプチド）（配列番号５１～６０、６２～６９、および７１～７８）の群に由来する１つのペプチドのいずれかを含むＨＬＡ－Ａ＊０２単量体に対する結合に関して分析した。選択された全ての高親和性ｓｃＴＣＲ変異体（配列番号７９～８７、および８９～９２）は、非線形４点曲線フィッティングにより算出した場合に、低ナノモルまたはサブナノモル範囲の結合ＥＣ５０値で、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体に強く結合した（表４）。バックグラウンドをわずかに上回る結合シグナルを誘発したＳＭＡＲＣＤ１－００１（配列番号７６）を除いて（図４）、ｓｃＴＣＲ変異体（配列番号７９～８７および８９～９２）はいずれも、１００ｎＭの濃度で適用されたＨＬＡ－Ａ＊０２単量体に関連して類似ペプチド（配列番号５１～６０、６２～６９、および７１～７８）のいずれに対してもバックグラウンドレベルを上回る結合を示さなかった（図３、図４、表４）。提示されたデータは、ＣＤＲ突然変異と組み合わされたｓｃＴＣＲ変異体の高い結合特異性を裏付けており、この結合特性は、ＰＲＡＭＥ－００４結合と区別できないレベルでＩＦＴ１７－００３（配列番号６０）への強い結合を示す参照ｓｃＴＣＲ（Ｒ１６Ｐ１Ｃ１０＿ＣＤＲ６＿ｓｃＴＣＲ、配列番号３５７）よりも優れていた（図４）。
【0426】
酵母表面提示から選択された高親和性ｓｃＴＣＲのセットを、結合モチーフと呼ばれるＨＬＡ－Ａ＊０２提示に関連する標的ペプチド上の機能エピトープに関してさらに検討した。このことを、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチド（配列番号３１８～３２４）の１、３、４、５、６、７、および８位の単一アラニン置換、およびＨＬＡ－Ａ＊０２に関連するそれぞれのＰＲＡＭＥ－００４ペプチド変異体に対するｓｃＴＣＲ保有酵母細胞の結合の評価により対処した。４種の濃度（１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ）のＨＬＡ－Ａ＊０２単量体およびＰＲＡＭＥ－００４またはそれぞれのアラニン置換ペプチドを使用して、高親和性ｓｃＴＣＲ保有酵母細胞を染色し、試験した全ての単量体濃度での染色シグナルの欠如により裏付けられるように、３、５、および７位で強く認識される全てのｓｃＴＣＲ変異体に関して広範な結合モチーフが明らかになった。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドの６および８位に関しては、結合モチーフへの寄与が想定され得、なぜならば、これらの位置でのアラニン置き換えが、たとえ３、５、および７位と比べて低いストリンジェンシーで観察されても、染色シグナルを有意に減少させたからである。ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドの１および４位に関しては、結合モチーフへの寄与はわずかであるかまたはないことを決定し得、なぜならば、アラニン置換により、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドで観察されたものとほぼ同等の染色強度が得られたからである（図５および表４）。
【0427】
さらなる分析のために、５種のｓｃＴＣＲクローンＲ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤＡ７＿Ａ０２＿ｓｃＴＣＲ（配列番号７９）、Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤＡ７＿Ａ０９＿ｓｃＴＣＲ（配列番号８２）、Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤＡ７＿Ａ１０＿ｓｃＴＣＲ（配列番号８３）、Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤＡ７＿Ｂ０３＿ｓｃＴＣＲ（配列番号８５）、およびＲ１１Ｐ３Ｄ３ＳＤＡ７＿Ｂ０６＿ｓｃＴＣＲ（配列番号８７）を、さらなるタンパク質の特徴を決定するために、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ二重特異性フォーマットへ変換した（下記の実施例を参照されたい）。
【0428】
【表4】
【0429】
可溶性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子の製造およびキャラクタリゼーション
ＶアルファドメインおよびＶベータドメインからなるＴＣＲを設計し、ヒト化ＵＣＨＴ１抗体のＦａｂ断片と共役した一本鎖（ｓｃＴＣＲ）フォーマットで製造して試験した（表５および表１８）。組換えタンパク質の発現用のベクターを、ＨＣＭＶ由来プロモーターエレメントｐＵＣ１９誘導体により制御されるモノシストロニックとして設計した。プラスミドＤＮＡを、標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅させ、その後に市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。精製されたプラスミドＤＮＡを、ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、３２℃～３７℃で１０～１１日にわたり培養した。
ＶアルファドメインおよびＶベータドメインからなるＴＣＲを設計し、ヒト化ＵＣＨＴ１抗体のＦａｂ断片と共役した一本鎖（ｓｃＴＣＲ）フォーマットで製造して試験した（表５および表１８）。組換えタンパク質の発現用のベクターを、ＨＣＭＶ由来プロモーターエレメントｐＵＣ１９誘導体により制御されるモノシストロニックとして設計した。プラスミドＤＮＡを、標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅させ、その後に市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。精製されたプラスミドＤＮＡを、ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、３２℃～３７℃で１０～１１日にわたり培養した。
【0430】
条件付け細胞上清を、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を利用するろ過（０．２２μｍ）により清澄化した。二重特異性分子を、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実施するように装備されたＡｅｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。親和性クロマトグラフィーを、標準的な親和性クロマトグラフィープロトコルに従ってプロテインＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。サイズ排除クロマトグラフィーを、標準プロトコルに従ってＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ １６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、親和性カラムからの溶出（ｐＨ２．８）直後に実施して、高純度の単量体タンパク質を得た。タンパク質濃度を、予測されるタンパク質配列に従って算出された減衰係数を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。濃度を、必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して調整した。最後に、精製された分子を、２～８℃の温度で約１ｍｇ／ｍＬの濃度にて、リン酸緩衝生理食塩水中で保存した。最終生成物の収量を、精製および製剤化の完了後に算出した。
【0431】
精製された二重特異性分子の品質を、Ｖａｎｑｕｉｓｈ ｕＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍ内で、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で動作するＭａｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラム（５μｍ、４×３００ｍｍ）によるＨＰＬＣ－ＳＥＣにより決定した。
【0432】
ストレス安定性試験を、４０℃で最大２週間にわたり、ＰＢＳで製剤化された分子のインキュベーションにより実施した。完全性、凝集体含有量、および単量体回収量を、上述したようにＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析により分析した。
【0433】
【表5】
【0434】
ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子ＴＰＰ－７０～ＴＰＰ－７４を、生体層干渉法により、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドを含むＨＬＡ－Ａ＊０２単量体に対する結合親和性に関して分析した。測定を、製造業者により推奨される設定を使用してＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで実施した。アッセイを、センサーオフセット３ｍｍ、および取得速度５Ｈｚで行った。結合反応速度を、緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して、３０℃および１０００ｒｐｍ振盪速度で測定した。Ｈｉｓタグ付きＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４単量体をＨＩＳ１Ｋバイオセンサーにロードした後に、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子の連続希釈液を分析した。データの評価を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して行なった。強い結合親和性を、４ｎＭ～１２ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子に関して決定した（表４）。さらに、ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ変異体を、１４種の類似ペプチド（配列番号１８７、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、および２１２）への結合に関してスクリーニングした。類似ペプチドによるスクリーニングを、弱い結合シグナルの検出を可能にするために１μＭという高濃度のｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ分子を分析することで、本質的に上述した生物層干渉法により実施した。成熟ｓｃＴＣＲ変異体はいずれも、試験した類似ペプチドのいずれとも結合しなかった（図６）。ＴＰＰ－７４からのｓｃＴＣＲを、ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマット等の代替フォーマットによる二重特異性分子の生成に使用した。
［実施例３］
［実施例３］
【0435】
Ｔ細胞エンゲージング受容体［ＴＣＥＲ（登録商標）］フォーマット
［実施例３．１］
二重特異性ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットでの可溶性ｓｃＴＣＲの製造およびキャラクタリゼーション
ＴＣＥＲ（登録商標）分子の構築のために、抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１の新規のヒト化バージョンであるｈＵＣＨＴ１（Ｖａｒ１７）、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合するヒト化抗体であるＢＭＡ０３１（Ｖ３６）、または抗ＣＤ３抗体ＩＤ４のいずれかに由来するＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ配列、ならびにＶアルファおよびＶベータおよびそれぞれのリンカーをコードする配列を、遺伝子合成により得た。得られたＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ１［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：Ｐ０１８５７］由来のヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする発現ベクターに、インフレームでクローニングした。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを、Ｆｃガンマ受容体および補体との結合を阻害するために、および鎖間ジスルフィド結合がさらに安定化されているＣＨ３ドメインにノブ・イントゥ・ホール構造を組み込むために、様々な突然変異（Ｎ２９７Ｑ突然変異を含む）を含むように操作した。ＴＣＥＲ（登録商標）分子（表６、表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例２で概説したように実施した。
［実施例３．１］
二重特異性ＴＣＥＲ（登録商標）フォーマットでの可溶性ｓｃＴＣＲの製造およびキャラクタリゼーション
ＴＣＥＲ（登録商標）分子の構築のために、抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１の新規のヒト化バージョンであるｈＵＣＨＴ１（Ｖａｒ１７）、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合するヒト化抗体であるＢＭＡ０３１（Ｖ３６）、または抗ＣＤ３抗体ＩＤ４のいずれかに由来するＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ配列、ならびにＶアルファおよびＶベータおよびそれぞれのリンカーをコードする配列を、遺伝子合成により得た。得られたＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ１［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：Ｐ０１８５７］由来のヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする発現ベクターに、インフレームでクローニングした。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを、Ｆｃガンマ受容体および補体との結合を阻害するために、および鎖間ジスルフィド結合がさらに安定化されているＣＨ３ドメインにノブ・イントゥ・ホール構造を組み込むために、様々な突然変異（Ｎ２９７Ｑ突然変異を含む）を含むように操作した。ＴＣＥＲ（登録商標）分子（表６、表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例２で概説したように実施した。
【0436】
【表6】
【0437】
ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドを細胞表面に提示するＨＬＡ－Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株（例えばＨｓ６９５Ｔ）の殺滅に関するＴＣＥＲ（登録商標）分子の機能性を、ＬＤＨ放出アッセイで評価した。加えて、ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性であるがＰＲＡＭＥ－００４陰性の腫瘍細胞株（例えばＴ９８Ｇ）を評価して、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の非特異的なまたはオフターゲットの活性をキャラクタライズした。腫瘍細胞株を、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を増加させつつ、１：１０の比で、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナー由来のＰＢＭＣと共培養した。ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された細胞傷害性を、放出されたＬＤＨの測定により、４８時間の共培養後に定量した。用量反応曲線のＥＣ５０値を、非線形４点曲線フィッティングを利用して算出した。３種のＴＣＥＲ（登録商標）分子を代表する結果（表６、表１８）を、図７および図８に示す。この結果から、様々な動員抗体ドメインを利用する３種全てのＴＣＥＲ（登録商標）分子が機能的であり、ＰＲＡＭＥ－００４に厳密に依存した方法で、Ｔ細胞により媒介される細胞傷害性を誘発することが実証される。
［実施例３．２］
［実施例３．２］
【0438】
Ｓｌｏｔ Ｉ
ＴＣＥＲ（登録商標）分子を、ｈＵＣＨＴ１（Ｖａｒ１７）またはＢＭＡ０３１（Ｖ３６）由来のＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに上述したＶアルファおよびＶベータを利用して構築した（実施例３．１）。ＴＣＥＲ（登録商標）分子（表７、表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例２に概説したように実施した。
ＴＣＥＲ（登録商標）分子を、ｈＵＣＨＴ１（Ｖａｒ１７）またはＢＭＡ０３１（Ｖ３６）由来のＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに上述したＶアルファおよびＶベータを利用して構築した（実施例３．１）。ＴＣＥＲ（登録商標）分子（表７、表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例２に概説したように実施した。
【0439】
【表7】
【0440】
ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ Ｉ変異体ＴＰＰ－１０６、ＴＰＰ－１０８～ＴＰＰ－１２９を、生体層干渉法により、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４）に対する結合親和性に関して分析した。測定を、上述したようにＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで実施した。強い結合親和性を、３ｎＭ～１０ｎＭの範囲のＫＤ値で決定した（表８）。これらのデータは、ＴＣＲ突然変異ｂＡ８４ＤおよびａＮ１１４Ｙのさらなる親和性改善効果を示すが、突然変異ｂＴ１１５Ｌ／Ｋ、ｂＬ１１Ｅ、ｂＰ４６Ｍ、ｂＱ４８Ｒ、ａＮ２０Ｋは、結合親和性に影響を及ぼさないように見える。さらに、ＨＬＡ－Ａ＊０２に関連する潜在的なオフターゲットペプチドとして機能する３種の選択された類似ペプチドに関して、結合親和性を決定し、標的ペプチド－ＨＬＡの結合と比較してＫＤウィンドウを算出した。類似ペプチドに対する最も強いＴＣＥＲ（登録商標）結合は、ＧＩＭＡＰ８－００１で観察され、ＫＤウィンドウは、２６倍から１６８倍の範囲であった。２５倍超のＫＤウィンドウは、良好な治療ウィンドウを既に提供する。
【0441】
【表8】
【0442】
Ｓｌｏｔ ＩＩ
さらなるＴＣＥＲ（登録商標）分子を、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）またはＩＤ４由来のＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに上述したＶアルファおよびＶベータを利用して構築した（実施例３．１）。それぞれのＴＣＥＲ（登録商標）分子（表９、表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例２に概説したように実施し、それにより、全てのＩＤ４ベースの分子を、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。
さらなるＴＣＥＲ（登録商標）分子を、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）またはＩＤ４由来のＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに上述したＶアルファおよびＶベータを利用して構築した（実施例３．１）。それぞれのＴＣＥＲ（登録商標）分子（表９、表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例２に概説したように実施し、それにより、全てのＩＤ４ベースの分子を、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。
【0443】
【表9】
【0444】
ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩ変異体ＴＰＰ－２０７～ＴＰＰ－２２２およびＴＰＰ－２２７～ＴＰＰ－２３０を、生体層干渉法により、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４）に対する結合親和性に関して分析した。測定を、上述したＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで実施した。強い結合親和性を、１ｎＭ～７ｎＭの範囲のＫＤ値で決定した（表１０）。ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）リクルーター（ＴＰＰ－２１９～ＴＰＰ－２２２対ＴＰＰ－２１１～ＴＰＰ－２１４）と比較した場合に、ＩＤ４リクルーターと組み合わされた同一のＴＣＲ変異体（即ち、同一のＶＡおよびＶＢ）に関して、より高い結合親和性を観察した。スロットＩのＴＣＥＲ（登録商標）分子（実施例３．２）で観察されたように、ＴＣＲ突然変異ｂＡ８４ＤおよびａＮ１１４Ｙの親和性改善効果は、スロットＩＩで生成されたＴＣＥＲ（登録商標）変異体でも確認され得たが、突然変異ｂＴ１１５Ｌ／Ｋ、ｂＰ４６Ｍ、ｂＱ４８Ｒ、ａＮ２０Ｋでも、親和性への効果が見出されなかった。
【0445】
ＴＣＲ結合モチーフを、選択されたＴＣＥＲ（登録商標）分子に関して評価した。結合モチーフを決定するために、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４）、およびペプチド１、３、４、５、６、７、または８位でアラニン置換を保有するＰＲＡＭＥ－００４変異体との複合体に関して、親和性を測定した。親和性測定を、上述したＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４またはＨＴＸシステムで実施した。アラニン置換ペプチド変異体に関して結合親和性またはシグナル（分析した最高濃度で測定）の、２分の１以下への減少が検出された場合には、ＰＲＡＭＥ－００４の位置を、ＴＣＲ結合モチーフの一部であるとみなした。全てのＴＣＥＲ（登録商標）変異体は、少なくとも４箇所のペプチドＰＲＡＭＥ－００４の位置を認識する幅広い結合モチーフを示した（表１０）。
【0446】
【表10】
【0447】
Ｓｌｏｔ ＩＩａ
先のＴＣＥＲ（登録商標）変異体（実施例３．３）に関して作成されたデータに基づいて、タンパク質の特性または結合特性へのプラスの効果が先の実験で検出され得た、選択されたＴＣＲアミノ酸の位置が系統的に置換された新規の変異体を生成した。それぞれのＴＣＥＲ（登録商標）分子（表１１および表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例３．３に概説したように実施した。生産性およびストレス安定性のデータの概要を、表１１にまとめる。
先のＴＣＥＲ（登録商標）変異体（実施例３．３）に関して作成されたデータに基づいて、タンパク質の特性または結合特性へのプラスの効果が先の実験で検出され得た、選択されたＴＣＲアミノ酸の位置が系統的に置換された新規の変異体を生成した。それぞれのＴＣＥＲ（登録商標）分子（表１１および表１８）の製造、精製、およびキャラクタリゼーションを、実施例３．３に概説したように実施した。生産性およびストレス安定性のデータの概要を、表１１にまとめる。
【0448】
【表11】
【0449】
ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩａ変異体ＴＰＰ－２３５～－２５０、－２５２～－２６８、－２７０、－２７７、－２７９を、生体層干渉法により、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４）に対する結合親和性に関して分析した。測定を、上述したＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４またはＨＴＸシステムで実施した。強い結合親和性を、２ｎＭ～１５ｎＭの範囲のＫＤ値で見出した（表１２）。ｂＡ８４位では、アミノ酸置換から、ｂＡ８４Ｄが最も好ましい置換であることが分かった。ａＮ１１４位では、親和性がａＮ１１４Ｙに相当する代替アミノ酸置換（例えば、Ａ、Ｈ、Ｉ、およびＬ）を見出した。同等の親和性を有するｂＴ１１５Ｋ／の代替を特定し、Ｒ、Ａ、Ｉ、およびＶが挙げられた。突然変異ｂＡ１１０Ｓを導入することにより、それぞれの変異体の親和性がわずかに低下した。
【0450】
結合モチーフを、選択されたＴＣＥＲ（登録商標）変異体に関して評価した。結合モチーフを決定するために、上述したように、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４）、およびペプチド１、３、４、５、６、７、または８位でアラニン置換を保有するＰＲＡＭＥ－００４変異体との複合体に関して、親和性を測定した。アラニン置換ペプチド変異体に関して結合親和性またはシグナル（分析した最高濃度で測定）の、２分の１以下への減少が検出された場合には、ＰＲＡＭＥ－００４の位置を、ＴＣＲ結合モチーフの一部であるとみなした。試験した全てのＴＣＥＲ（登録商標）変異体は、少なくとも３箇所のペプチド位置を認識する幅広い結合モチーフを示した（表１２）。
【0451】
結合モチーフに加えて、選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩおよびＩＩａ変異体の結合特異性を、オフターゲットペプチドとして潜在的に機能する１６種の類似ペプチドのセットへの結合に関して、生物層干渉法によりさらに分析した。測定を、基本的には上述したＯｃｔｅｔ ＨＴＸシステムで実施した。分析するために、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチド、類似ペプチドのセットの内の個々のペプチド、またはコントロールペプチドを含むペプチド－ＨＬＡ複合体を、ＨＩＳ１Ｋバイオセンサー上にロードし、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の結合を、１μＭという高いＴＣＥＲ（登録商標）濃度で分析した。５分間の会合段階の終了時の反応シグナルを使用して、選択されたＴＣＥＲ（登録商標）変異体に対するＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドと比較した類似ペプチドの相対結合シグナルを算出した（表１３）。この条件下では、有意ではないと説明され得る非常に低い親和性での結合事象（例えば、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ複合体への結合の場合のＫＤと比較して、ＫＤが２５倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、７５倍以上、または１００倍以上増加する結合）であっても、検出されることとなる。１６種の分析された類似ペプチドの内、１１種のペプチドは、選択されたＴＣＥＲ（登録商標）変異体のいずれに対してもいかなる結合も示さなかった。１６種の類似ペプチドの内の５種に関しては、ＰＲＡＭＥ－００４と比較してシグナルが低い結合が検出され、これらのペプチドの内の４種を、ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体に関してより詳細に分析した（例えば、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドと比較してＫＤウィンドウを測定した）。
【0452】
【表12】
【0453】
【表13】
【0454】
Ｓｌｏｔ ＩＩＩ
上述したように（実施例３．１）、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）もしくはその変異体（Ａ０２およびＤ０１）、またはＩＤ４に由来するＶＨドメインとＶＬドメイン、ならびにＶアルファおよびＶベータを利用して、さらなるＴＣＥＲ（登録商標）を構築した。ＵＣＨＴ１－Ｖ１７動員抗体（ＴＰＰ－１１０９）に基づくさらなるＴＣＥＲ（登録商標）分子を、参照として生成した。それぞれの分子をコードするＤＮＡコンストラクトを、上記で概説したように生成した。得られたプラスミドを、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の一過性発現および産生のために、エレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ）によるＣＨＯ－Ｓ細胞のトランスフェクションに使用した（表１４および表１８）。分子の精製、製剤化、および初期キャラクタリゼーションを、上記実施例３．３で概説したように実施した。
上述したように（実施例３．１）、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）もしくはその変異体（Ａ０２およびＤ０１）、またはＩＤ４に由来するＶＨドメインとＶＬドメイン、ならびにＶアルファおよびＶベータを利用して、さらなるＴＣＥＲ（登録商標）を構築した。ＵＣＨＴ１－Ｖ１７動員抗体（ＴＰＰ－１１０９）に基づくさらなるＴＣＥＲ（登録商標）分子を、参照として生成した。それぞれの分子をコードするＤＮＡコンストラクトを、上記で概説したように生成した。得られたプラスミドを、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の一過性発現および産生のために、エレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ）によるＣＨＯ－Ｓ細胞のトランスフェクションに使用した（表１４および表１８）。分子の精製、製剤化、および初期キャラクタリゼーションを、上記実施例３．３で概説したように実施した。
【0455】
【表14】
【0456】
細胞表面上で様々なレベルのＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドを提示するＨＬＡ－Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株の殺滅に関するＴＣＥＲ（登録商標）分子の能力を、ＬＤＨ放出アッセイで評価した。加えて、ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性であるがＰＲＡＭＥ－００４陰性の腫瘍細胞株（例えばＴ９８Ｇ）を評価して、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の非特異的なまたはオフターゲットの活性をキャラクタライズした。腫瘍細胞株を、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を増加させつつ、１：１０の比で、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナー由来のＰＢＭＣエフェクターと共培養した。ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された細胞傷害性を、放出されたＬＤＨの測定により、４８時間の共培養後に定量した。用量反応曲線のＥＣ５０値を、非線形４点曲線フィッティングを利用して算出した。２種のＰＲＡＭＥ－００４陽性腫瘍細胞株（Ｈｓ６９５ＴおよびＵ２０Ｓ）ならびにＰＲＡＭＥ－００４陰性腫瘍細胞株（Ｔ９８Ｇ）に関するＥＣ５０値を、ＰＢＭＣドナーが異なる様々な実験で決定し、概要を図９にグラフでまとめる。
【0457】
ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体ＴＰＰ－２１４、－２２２、－２３０、－６６６、－６６９、－８７１、－８７２、－８７６、－８７９、－８９１、－８９４を、生体層干渉法により、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４）に対する結合親和性に関して分析した。測定を、３０℃にてＯｃｔｅｔ ＨＴＸシステムで実施した。アッセイを、アッセイ緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して、１６チャネルモードのＨＩＳ１Ｋバイオセンサーで、センサーオフセット３ｍｍ、および取得速度５Ｈｚにて行った。下記のアッセイ工程シーケンスを繰り返して、全ての結合親和性を測定した：再生（５秒、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５）／中和（５秒、アッセイ緩衝液；１再生サイクルは、再生／中和の４回の反復からなる）、ベースライン（６０秒、アッセイ緩衝液）、ローディング（１２０秒、１０μｇ／ｍｌ ペプチド－ＨＬＡ）、ベースライン（１２０秒、アッセイ緩衝液）、会合（３００秒、１００ｎＭ～１．５６ｎＭまたは５０ｎＭ～０．７８ｎＭの範囲のＴＣＥＲ（登録商標）の２倍連続希釈液、参照としてアッセイ緩衝液）、解離（３００秒、アッセイ緩衝液）。データの評価を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実行した。参照センサーの減算を実施して、バイオセンサー上にロードされたペプチド－ＨＬＡの潜在的解離（緩衝液中で測定されたペプチド－ＨＬＡをロードしたバイオセンサーを介する）を減算した。データ追跡を、ベースライン（最後の５秒の平均）に合わせ、解離工程に対して工程間補正を行ない、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用し、１：１結合モデル（Ｒｍａｘは、センサーによりリンクされていない）を使用して、曲線を全体的にフィットさせた。強い結合親和性を、２ｎＭ～５ｎＭの範囲のＫＤ値で見出した（表１５）。さらに、結合親和性を、４種の既に同定された潜在的なオフターゲットペプチドに関して決定し、標的ペプチド－ＨＬＡの結合と比較してＫＤウィンドウを算出した。測定を、３０℃にてＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４またはＨＴＸシステムで実施した。アッセイを、アッセイ緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して、１６チャネルモードのＨＩＳ１Ｋバイオセンサーで、センサーオフセット３ｍｍ、および取得速度５Ｈｚにて行った。下記のアッセイ工程シーケンスを繰り返して、全ての結合親和性を測定した：再生（５秒、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５）／中和（５秒、アッセイ緩衝液；１再生サイクルは、再生／中和の４回の反復からなる）、ベースライン（６０秒、アッセイ緩衝液）、ローディング（１２０秒、１０μｇ／ｍｌ ペプチド－ＨＬＡ）、ベースライン（１２０秒、アッセイ緩衝液）、会合（３００秒、５００ｎＭ～７．８１ｎＭの範囲のＴＣＥＲ（登録商標）の２倍連続希釈液、参照としてアッセイ緩衝液）、解離（３００秒、アッセイ緩衝液）。データの評価を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実行した。参照センサーの減算を実施して、バイオセンサー上にロードされたペプチド－ＨＬＡの潜在的解離（緩衝液中で測定されたそれぞれのペプチド－ＨＬＡをロードしたバイオセンサーを介する）を減算した。データ追跡を、ベースライン（最後の５秒の平均）に合わせ、解離工程に対して工程間補正を行ない、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用し、１：１結合モデル（Ｒｍａｘは、センサーによりリンクされていない）を使用して、曲線を全体的にフィットさせた。全体として、標的ペプチドと比較して潜在的なオフターゲットペプチドへのかなり弱い結合を、全ての変異体において見出し、少なくとも６０倍～完全に結合なしのウィンドウが示された。ＮＯＭＡＰ－３－１４０８を、ＶＩＭ－００９に相当する相対的結合シグナルを示したにもかかわらず、ＫＤ決定には選択しなかった（表１３）。ＶＩＭ－００９に関しては、測定された最小のＫＤウィンドウは、１００倍超であった（表１５）。そのため、ＶＩＭ－００９への結合は無関係であり、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８の結合の親和性決定は、ＶＩＭ－００９と同等の結合シグナルに基づいて不必要であるとみなした。１つの相互作用に関して、５０倍のＫＤウィンドウを算出した。しかしながら、この相互作用および他のいくつかの相互作用に関して、フィッティングアルゴリズムにより算出されたＲｍａｘ値が過剰に低いことから、相互作用は、算出と比べて弱いと想定され、そのためウィンドウが大きくなる。それぞれの相互作用を、表１５に示す。異なる変異体の特異性をさらに分析するために、結合モチーフを、１、３、４、５、６、７、８位に対する標的ペプチド－ＨＬＡ複合体およびアラニン置換変異体の親和性を測定することにより決定した。測定を、３０℃にてＯｃｔｅｔ ＨＴＸシステムで実施した。アッセイを、アッセイ緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して、１６または８チャネルモードのＨＩＳ１Ｋバイオセンサーで、センサーオフセット３ｍｍ、および取得速度５Ｈｚにて行った。下記のアッセイ工程シーケンスを繰り返して、全ての結合親和性を測定した：再生（５秒、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５）／中和（５秒、アッセイ緩衝液；１再生サイクルは、再生／中和の４回の反復からなる）、ベースライン（６０秒、アッセイ緩衝液）、ローディング（１２０秒、１０μｇ／ｍｌ ペプチド－ＨＬＡ）、ベースライン（１２０秒、アッセイ緩衝液）、会合（１５０秒、４００ｎＭ～６．２５ｎＭの範囲のＴＣＥＲ（登録商標）の２倍連続希釈液、参照としてアッセイ緩衝液）、解離（３００秒、アッセイ緩衝液）。データの評価を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実行した。参照センサーの減算を実施して、バイオセンサー上にロードされたペプチド－ＨＬＡの潜在的解離（緩衝液中で測定された各ペプチド－ＨＬＡをロードしたバイオセンサーを介する）を減算した。データ追跡を、ベースライン（最後の５秒の平均）に合わせ、解離工程に対して工程間補正を行ない、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用し、１：１結合モデル（Ｒｍａｘは、センサーによりリンクされていない）を使用して、曲線を全体的にフィットさせた。ある位置を、親和性または結合シグナルが２分の１以下に減少した場合には、結合モチーフの一部とみなした（分析された最高濃度で測定）。試験した全てのＴＣＥＲ（登録商標）変異体は、少なくとも４箇所および最大で全箇所の分析されたペプチド位置を認識する幅広い結合モチーフを示した（表１６）。ｂＡ８４、ａＮ１１４Ｌ、およびｂＡ１１０Ｓ／ｂＴ１１５Ａに関しては、結合モチーフにプラスの効果が観察され、このことは、過去のデータと一致している。比較のために、代替ＰＲＡＭＥ－００４標的化ＴＣＥＲ（登録商標）参照分子（ＴＰＰ－１１０９）の結合モチーフを分析した。このＴＣＥＲ（登録商標）は、ペプチドの５～８位を認識し、そのため、結合は、このペプチドストレッチに限定されるが、ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ変異体により認識される位置は、ペプチド全体を通してより均一に分布している。
【0458】
ＴＣＥＲ（登録商標）スロットＩＩＩ変異体ＴＰＰ－２１４、－２２２、－２３０、－６６６、－６６９、－８７１、－８７２、－８７６、－８７９、－８９１、－８９４を、様々なレベルの標的ペプチドを負荷したＴ２細胞を殺滅する能力に関してさらにキャラクタライズした。２時間にわたる各濃度のＰＲＡＭＥ－００４とのＴ２細胞の負荷後、ペプチド負荷Ｔ２細胞を、４８時間にわたりＴＣＥＲ（登録商標）変異体の濃度を増加させつつ、５：１のＥ：Ｔ比でヒトＰＢＭＣと共培養した。上清中に放出されたＬＤＨのレベルを、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量した。全てのＴＣＥＲ（登録商標）変異体は、１０ｎＭのペプチド負荷濃度にて、サブピコモルＥＣ５０値でのＰＲＡＭＥ－００４負荷Ｔ２細胞の強力な殺滅を示した（図１０、表１７）。ＥＣ５０値は、ＰＲＡＭＥ－００４負荷レベルの低下に伴い増加した。しかしながら、ＰＲＡＭＥ－００４負荷濃度が１０ｐＭと非常に低い場合であっても、ＴＰＰ－２１４を除く全てのＴＣＥＲ（登録商標）変異体により殺滅が誘発された。
【0459】
【表15】
【0460】
【表16】
【0461】
【表17】
【0462】
【表18】
【0463】
表１８では、ＴＰＰ－７０、ＴＰＰ－７１、ＴＰＰ－７２、ＴＰＰ－７３、およびＴＰＰ７４を除いて、「α鎖」という用語は、Ｖα（即ち、ＴＣＲα鎖由来の可変ドメイン）を含むポリペプチド鎖を指す。「β鎖」という用語は、Ｖβ（即ち、ＴＣＲβ鎖由来の可変ドメイン）を含むポリペプチド鎖を指す。ＴＰＰ－７０、ＴＰＰ－７１、ＴＰＰ－７２、ＴＰＰ－７３、およびＴＰＰ７４の場合には、「α鎖」は、いかなるＴＣＲ由来の可変ドメインも含まないが、「β鎖」は、２つのＴＣＲ由来の可変ドメイン（１つはＴＣＲα鎖由来、１つはＴＣＲβ鎖由来）を含む。
［実施例３．６］
［実施例３．６］
【0464】
選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＩＩ候補の安全性評価
ＴＣＥＲ（登録商標）分子ＴＰＰ－２３０、ＴＰＰ－６６６、ＴＰＰ－８７１、およびＴＰＰ－８９１の安全性プロファイル（表１４～１８）を、星状細胞および心筋細胞（人工多能性幹細胞由来）、ならびに大動脈内皮細胞、間葉系幹細胞、および気管平滑筋細胞による殺滅実験で評価した。図１１は、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を増加させつつ、１：１０（標的細胞：エフェクター細胞）の比で、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣエフェクター細胞との上記の正常細胞タイプ（全てＨＬＡ－Ａ＊０２を発現する）の共培養の結果を示す。細胞を、それぞれの正常組織細胞培地とＴ細胞培地の１：１混合物中、またはＴ細胞培地単独（ＬＤＨ－ＡＭ）中で共培養した。４８時間の共培養後、上清を回収し、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＬＤＨ放出を測定することにより、ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された正常組織細胞溶解を評価した。安全性ウィンドウを決定するために、ＴＣＥＲ（登録商標）分子を、正常組織細胞培地とＴ細胞培地とのそれぞれ１：１混合物中のＰＲＡＭＥ－００４陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔとの同一設定で共培養し、続いてＬＤＨ放出を評価した。
ＴＣＥＲ（登録商標）分子ＴＰＰ－２３０、ＴＰＰ－６６６、ＴＰＰ－８７１、およびＴＰＰ－８９１の安全性プロファイル（表１４～１８）を、星状細胞および心筋細胞（人工多能性幹細胞由来）、ならびに大動脈内皮細胞、間葉系幹細胞、および気管平滑筋細胞による殺滅実験で評価した。図１１は、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を増加させつつ、１：１０（標的細胞：エフェクター細胞）の比で、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣエフェクター細胞との上記の正常細胞タイプ（全てＨＬＡ－Ａ＊０２を発現する）の共培養の結果を示す。細胞を、それぞれの正常組織細胞培地とＴ細胞培地の１：１混合物中、またはＴ細胞培地単独（ＬＤＨ－ＡＭ）中で共培養した。４８時間の共培養後、上清を回収し、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＬＤＨ放出を測定することにより、ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された正常組織細胞溶解を評価した。安全性ウィンドウを決定するために、ＴＣＥＲ（登録商標）分子を、正常組織細胞培地とＴ細胞培地とのそれぞれ１：１混合物中のＰＲＡＭＥ－００４陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔとの同一設定で共培養し、続いてＬＤＨ放出を評価した。
【0465】
図１１に示すように、ＴＰＰ－２３０およびＴＰＰ－８７１では、１００ｎＭという最高ＴＣＥＲ（登録商標）濃度であっても、正常組織細胞に対する細胞傷害性を観察しなかった。ＴＰＰ－６６６およびＴＰＰ－８９１の場合には、１００ｎＭ ＴＣＥＲ（登録商標）濃度ではある程度の正常組織細胞の溶解を観察したが、１０ｎＭでは溶解を検出しなかった。試験した全てのＴＣＥＲ（登録商標）分子に関して１００ｐＭで顕著な溶解を示し、いくつかの分子に関しては１０ｐＭ濃度でさえ溶解を示したＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞と比較して、１００ｎＭ濃度での正常組織細胞の溶解は、１，０００倍（ＴＰＰ－６６６およびＴＰＰ－８９１）またはより大きな（ＴＰＰ－２３０およびＴＰＰ－８７１）安全性ウィンドウを示す。
［実施例３．７］
［実施例３．７］
【0466】
Ｓｌｏｔ ＩＶ
さらなるＴＣＥＲ（登録商標）を、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）またはその改変変異体（Ａ０２およびＤ０１）、もしくはＩＤ４由来のＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに上述したＶアルファおよびＶベータを利用して構築した（実施例３．１）。それぞれの分子をコードするＤＮＡコンストラクトを、上記で概説したように生成した。得られたプラスミドを、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の一過性発現および産生のために、エレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ）によるＣＨＯ－Ｓ細胞のトランスフェクションに使用した（表２０および表１８）。分子の精製、製剤化、および初期キャラクタリゼーションを、上記実施例３．３で概説したように実施した。
さらなるＴＣＥＲ（登録商標）を、ＢＭＡ０３１（Ｖ３６）またはその改変変異体（Ａ０２およびＤ０１）、もしくはＩＤ４由来のＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに上述したＶアルファおよびＶベータを利用して構築した（実施例３．１）。それぞれの分子をコードするＤＮＡコンストラクトを、上記で概説したように生成した。得られたプラスミドを、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の一過性発現および産生のために、エレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ）によるＣＨＯ－Ｓ細胞のトランスフェクションに使用した（表２０および表１８）。分子の精製、製剤化、および初期キャラクタリゼーションを、上記実施例３．３で概説したように実施した。
【0467】
【表19】
【0468】
表２０では、「α鎖」という用語は、Ｖα（即ち、ＴＣＲα鎖由来の可変ドメイン）を含むポリペプチド鎖を指す。「β鎖」という用語は、Ｖβ（即ち、ＴＣＲβ鎖由来の可変ドメイン）を含むポリペプチド鎖を指す。
【0469】
細胞表面上で様々なレベルのＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチドを提示するＨＬＡ－Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株の殺滅に関するＴＣＥＲ（登録商標）分子の能力を、ＬＤＨ放出アッセイで評価した。加えて、ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性であるがＰＲＡＭＥ－００４陰性の腫瘍細胞株（例えばＴ９８Ｇ）を評価して、ＴＣＥＲ（登録商標）変異体の非特異的なまたはオフターゲットの活性をキャラクタライズした。腫瘍細胞株を、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を増加させつつ、１：１０の比で、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ドナー由来のＰＢＭＣエフェクターと共培養した。ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された細胞傷害性を、放出されたＬＤＨの測定により、４８時間の共培養後に定量した。用量反応曲線のＥＣ５０値を、非線形４点曲線フィッティングを利用して算出した。ＰＲＡＭＥ－００４陽性腫瘍細胞株Ｕ２０ＳおよびＰＲＡＭＥ－００４陰性腫瘍細胞株（Ｔ９８Ｇ）に関するＥＣ５０値を、ＰＢＭＣドナーが異なる様々な実験で決定し、概要を図２１にまとめる。
【0470】
【表20】
【0471】
ＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ変異体ＴＰＰ－１２９２、－１２９４～－１２９８、－１３００～－１３０９、－１３３３、－１３３４を、生体層干渉法により、標的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ－００４）に対する結合親和性に関して分析した。測定を、３０℃にてＯｃｔｅｔ ＨＴＸシステムで実施した。アッセイを、アッセイ緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して、１６チャネルモードのＨＩＳ１Ｋバイオセンサーで、センサーオフセット３ｍｍ、および取得速度５Ｈｚにて行った。下記のアッセイ工程シーケンスを繰り返して、全ての結合親和性を測定した：再生（５秒、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５）／中和（５秒、アッセイ緩衝液；１再生サイクルは、再生／中和の４回の反復からなる）、ベースライン（６０秒、アッセイ緩衝液）、ローディング（１２０秒、１０μｇ／ｍｌ ペプチド－ＨＬＡ）、ベースライン（１２０秒、アッセイ緩衝液）、会合（３００秒、１００ｎＭ～１．５６ｎＭまたは５０ｎＭ～０．７８ｎＭの範囲のＴＣＥＲ（登録商標）の２倍連続希釈液、参照としてアッセイ緩衝液）、解離（３００秒、アッセイ緩衝液）。データの評価を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実行した。参照センサーの減算を実施して、バイオセンサー上にロードされたペプチド－ＨＬＡの潜在的解離（緩衝液中で測定されたペプチド－ＨＬＡをロードしたバイオセンサーを介する）を減算した。データ追跡を、ベースライン（最後の５秒の平均）に合わせ、解離工程に対して工程間補正を行ない、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用し、１：１結合モデル（Ｒｍａｘは、センサーによりリンクされていない）を使用して、曲線を全体的にフィットさせた。強い結合親和性を、２ｎＭ～１５ｎＭの範囲のＫＤ値で見出した（表２２）。さらに、結合親和性を、２種の既に同定された潜在的なオフターゲットペプチドに関して決定し、標的ペプチド－ＨＬＡの結合と比較してＫＤウィンドウを算出した。測定を、３０℃にてＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４またはＨＴＸシステムで実施した。アッセイを、アッセイ緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して、１６チャネルモードのＨＩＳ１Ｋバイオセンサーで、センサーオフセット３ｍｍ、および取得速度５Ｈｚにて行った。下記のアッセイ工程シーケンスを繰り返して、全ての結合親和性を測定した：再生（５秒、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５）／中和（５秒、アッセイ緩衝液；１再生サイクルは、再生／中和の４回の反復からなる）、ベースライン（６０秒、アッセイ緩衝液）、ローディング（１２０秒、１０μｇ／ｍｌ ペプチド－ＨＬＡ）、ベースライン（１２０秒、アッセイ緩衝液）、会合（３００秒、５００ｎＭ～７．８１ｎＭの範囲のＴＣＥＲ（登録商標）の２倍連続希釈液、参照としてアッセイ緩衝液）、解離（３００秒、アッセイ緩衝液）。データの評価を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実行した。参照センサーの減算を実施して、バイオセンサー上にロードされたペプチド－ＨＬＡの潜在的解離（緩衝液中で測定されたそれぞれのペプチド－ＨＬＡをロードしたバイオセンサーを介する）を減算した。データ追跡を、ベースライン（最後の５秒の平均）に合わせ、解離工程に対して工程間補正を行ない、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用し、１：１結合モデル（Ｒｍａｘは、センサーによりリンクされていない）を使用して、曲線を全体的にフィットさせた。全体として、標的ペプチドと比較して潜在的なオフターゲットペプチドへのかなり弱い結合を全ての変異体に関して見出し、少なくとも１０倍～完全に結合なしのウィンドウが示された。それぞれの相互作用を、表２２に示す。変異体ＴＰＰ－１２９４、－１２９５、－１２９８、－１３３３、－１３３４の特異性をさらに分析するために、結合モチーフを、１、３、４、５、６、７、８位に対する標的ペプチド－ＨＬＡ複合体およびアラニン置換変異体の親和性を測定することにより決定した。測定を、３０℃にてＯｃｔｅｔ ＨＴＸシステムで実施した。アッセイを、アッセイ緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを使用して、１６または８チャネルモードのＨＩＳ１Ｋバイオセンサーで、センサーオフセット３ｍｍ、および取得速度５Ｈｚにて行った。下記のアッセイ工程シーケンスを繰り返して、全ての結合親和性を測定した：再生（５秒、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５）／中和（５秒、アッセイ緩衝液；１再生サイクルは、再生／中和の４回の反復からなる）、ベースライン（６０秒、アッセイ緩衝液）、ローディング（１２０秒、１０μｇ／ｍｌ ペプチド－ＨＬＡ）、ベースライン（１２０秒、アッセイ緩衝液）、会合（１５０秒、４００ｎＭ～６．２５ｎＭの範囲のＴＣＥＲ（登録商標）の２倍連続希釈液、参照としてアッセイ緩衝液）、解離（３００秒、アッセイ緩衝液）。データの評価を、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実行した。参照センサーの減算を実施して、バイオセンサー上にロードされたペプチド－ＨＬＡの潜在的解離（緩衝液中で測定された各ペプチド－ＨＬＡをロードしたバイオセンサーを介する）を減算した。データ追跡を、ベースライン（最後の５秒の平均）に合わせ、解離工程に対して工程間補正を行ない、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用し、１：１結合モデル（Ｒｍａｘは、センサーによりリンクされていない）を使用して、曲線を全体的にフィットさせた。ある位置を、親和性または結合シグナルが２分の１以下に減少した場合には、結合モチーフの一部とみなした（分析された最高濃度で測定）。試験した全てのＴＣＥＲ（登録商標）変異体は、少なくとも５箇所および最大で全箇所の分析されたペプチド位置を認識する幅広い結合モチーフを示した（表２３）。
【0472】
【表21】
【0473】
【表22】
【0474】
選択されたＴＣＥＲ（登録商標）Ｓｌｏｔ ＩＶ候補の安全性評価
ＴＣＥＲ（登録商標）分子ＴＰＰ－１２９４、ＴＰＰ－１２９５、ＴＰＰ－１２９８、ＴＰＰ－１３３３、およびＴＰＰ－１３３４の安全性プロファイル（表１８および２０～２３）を、星状細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、および心筋細胞（人工多能性幹細胞由来；それぞれ、ｉＨＡ、ｉＨＮ、およびｉＨＣＭ）、ならびに肺線維芽細胞（ＨＰＦ）、心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）、皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）、大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）、冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）、腎皮質上皮細胞（ＨＲＣＥｐＣ）、および気管平滑筋細胞（ＨＴＳＭＣ）による殺滅実験で評価した。さらに、架橋分子ＴＰＰ－８９１を、以前のスロットからの他の分子ＴＰＰ－２１４およびＴＰＰ－６６９と共に試験した。図１２および１３は、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を増加させつつ、１：１０（標的細胞：エフェクター細胞）の比で、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣエフェクター細胞との上記の正常細胞タイプ（全てＨＬＡ－Ａ＊０２を発現する）の共培養の結果を示す。細胞を、それぞれの正常組織細胞培地とＴ細胞培地の１：１混合物中、またはＴ細胞培地単独（ＬＤＨ－ＡＭ）中で共培養した。４８時間の共培養後、上清を回収し、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＬＤＨ放出を測定することにより、ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された正常組織細胞溶解を評価した。安全性ウィンドウを決定するために、ＴＣＥＲ（登録商標）分子を、正常組織細胞培地とＴ細胞培地とのそれぞれ１：１混合物中のＰＲＡＭＥ－００４陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔとの同一設定で共培養し、続いてＬＤＨ放出を評価した。
ＴＣＥＲ（登録商標）分子ＴＰＰ－１２９４、ＴＰＰ－１２９５、ＴＰＰ－１２９８、ＴＰＰ－１３３３、およびＴＰＰ－１３３４の安全性プロファイル（表１８および２０～２３）を、星状細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、および心筋細胞（人工多能性幹細胞由来；それぞれ、ｉＨＡ、ｉＨＮ、およびｉＨＣＭ）、ならびに肺線維芽細胞（ＨＰＦ）、心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）、皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）、大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）、冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）、腎皮質上皮細胞（ＨＲＣＥｐＣ）、および気管平滑筋細胞（ＨＴＳＭＣ）による殺滅実験で評価した。さらに、架橋分子ＴＰＰ－８９１を、以前のスロットからの他の分子ＴＰＰ－２１４およびＴＰＰ－６６９と共に試験した。図１２および１３は、ＴＣＥＲ（登録商標）濃度を増加させつつ、１：１０（標的細胞：エフェクター細胞）の比で、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のＰＢＭＣエフェクター細胞との上記の正常細胞タイプ（全てＨＬＡ－Ａ＊０２を発現する）の共培養の結果を示す。細胞を、それぞれの正常組織細胞培地とＴ細胞培地の１：１混合物中、またはＴ細胞培地単独（ＬＤＨ－ＡＭ）中で共培養した。４８時間の共培養後、上清を回収し、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＬＤＨ放出を測定することにより、ＴＣＥＲ（登録商標）により誘発された正常組織細胞溶解を評価した。安全性ウィンドウを決定するために、ＴＣＥＲ（登録商標）分子を、正常組織細胞培地とＴ細胞培地とのそれぞれ１：１混合物中のＰＲＡＭＥ－００４陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔとの同一設定で共培養し、続いてＬＤＨ放出を評価した。
【0475】
図１２および１３に示すように、１０ｎＭ ＴＣＥＲ（登録商標）の濃度まで、いずれの試験した分子に関しても、正常組織細胞に対する細胞傷害性を観察しなかった。１００ｎＭの濃度では、架橋分子および参照分子ＴＰＰ－８９１、ＴＰＰ－６６９、およびＴＰＰ－２１４のみが、バックグラウンドを超える細胞傷害性レベルのいくらかの上昇を示す。唯一の例外は、ｉＰＳＣ由来星状細胞中のＴＰＰ－１２９４であり、１００ｎＭでのみ細胞傷害性が上昇する。試験した全てのＴＣＥＲ（登録商標）分子に関して１００ｐＭで顕著な溶解を示し、いくつかの分子に関しては１０ｐＭ濃度でさえ溶解を示したＨｓ６９５Ｔ腫瘍細胞と比較して、１００ｎＭ濃度での正常組織細胞の溶解は、１，０００倍（ＴＰＰ－１２９４）またはより大きな（ＴＰＰ－１２９５、ＴＰＰ－１２９８、ＴＰＰ－１３３４、およびＴＰＰ－１３３５）の安全性ウィンドウを示す。
［実施例４］
［実施例４］
【0476】
質量分析による原発性組織上でのＰＲＡＭＥペプチドの検出
質量分析によるＨＬＡリガンドの同定および相対的定量のために、ショック凍結組織サンプルからのＨＬＡ分子を精製し、ＨＬＡ関連ペプチドを単離した。この単離ペプチドを分離し、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）実験により配列を特定した。このペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして直接同定されたことから、この結果は、原発性がん組織上の同定されたペプチドの自然なプロセシングおよび提示の直接的な証拠となる。その後、取得したＬＣ－ＭＳデータを、配列特定、スペクトルクラスタリング、イオン計数、保持時間アラインメント、電荷状態のデコンボリューション、および正規化のためのアルゴリズムを組み合わせた専用ラベルフリー定量データ解析パイプラインを使用して、処理して定量する。得られた標的検出頻度を、本明細書の下記の表１９に示す。
質量分析によるＨＬＡリガンドの同定および相対的定量のために、ショック凍結組織サンプルからのＨＬＡ分子を精製し、ＨＬＡ関連ペプチドを単離した。この単離ペプチドを分離し、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）実験により配列を特定した。このペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして直接同定されたことから、この結果は、原発性がん組織上の同定されたペプチドの自然なプロセシングおよび提示の直接的な証拠となる。その後、取得したＬＣ－ＭＳデータを、配列特定、スペクトルクラスタリング、イオン計数、保持時間アラインメント、電荷状態のデコンボリューション、および正規化のためのアルゴリズムを組み合わせた専用ラベルフリー定量データ解析パイプラインを使用して、処理して定量する。得られた標的検出頻度を、本明細書の下記の表１９に示す。
【0477】
【表23】
【0478】
項目
１．配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなりかつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在しているＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡを含む第１のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）、または１、２、もしくは３個（好ましくは１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第１のポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢを含む第２のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）、または１もしくは２個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡである）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第２のポリペプチドと
を含む抗原結合タンパク質。
１．配列番号５０のアミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むかまたはからなりかつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体で存在しているＰＲＡＭＥ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含む可変ドメインＶＡを含む第１のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列ＶＫＥＦＱＤ（配列番号１６）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１６と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列ＡＬＹＮＮＬＤＭＲ（配列番号３３）もしくはＡＬＹＮＮＹＤＭＲ（配列番号３４）、または１、２、もしくは３個（好ましくは１もしくは２個）のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３３もしくは配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第１のポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含む可変ドメインＶＢを含む第２のポリペプチドであって、
前記ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列ＳＧＨＮＳ（配列番号１０）、または１もしくは２個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
前記ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列ＡＳＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＤＸ４ＱＹ（配列番号３２７）（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであり、Ｘ２は、ＡもしくはＳであり、Ｘ３は、ＴもしくはＩであり、Ｘ４は、ＫもしくはＡである）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２７と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
第２のポリペプチドと
を含む抗原結合タンパク質。
【0479】
２．
（ａ）前記ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列ＦＧＰＹＧＫＥ（配列番号３２）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、および／または
（ｂ）前記ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列ＦＱＮＴＡＶ（配列番号３６）、または１、２、３、４、５、もしくは６個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３６と異なるＣＤＲｂ２アミノ酸配列を含むか、またはからなる
項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（ａ）前記ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列ＦＧＰＹＧＫＥ（配列番号３２）、または１、２、もしくは３個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３２と異なるアミノ酸配列を含むか、またはからなり、および／または
（ｂ）前記ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列ＦＱＮＴＡＶ（配列番号３６）、または１、２、３、４、５、もしくは６個のアミノ酸突然変異、好ましくはアミノ酸置換により配列番号３６と異なるＣＤＲｂ２アミノ酸配列を含むか、またはからなる
項目１に記載の抗原結合タンパク質。
【0480】
３．
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２７位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、およびＳから選択される（特に、Ｔ、Ｎ、Ｓ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２８位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、およびＴから選択される（特に、Ｒ、Ａ、およびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の３８位は、Ｄであるか、またはＥ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＲ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ２の６４位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＦから選択される（特に、Ｒ、Ｔ、およびＶから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ３の１１４位は、ＬもしくはＹであるか、またはＭ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択される（特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択され、より特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５６位は、Ｆであるか、またはＹ、Ｍ、Ｌ、Ｗ、Ｈ、Ｖ、Ｉ、およびＡから選択される（特に、Ｙ、Ｍ、およびＬから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５７位は、Ｑであるか、またはＮ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＫ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、６３位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、５７位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５８位は、Ｎであるか、またはＱ、Ｈ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴ（特にＳ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６３位は、Ｔであるか、またはＳ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｑ、およびＥから選択される（特に、ＳおよびＥから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、５７位のアミノ酸がＮである場合には、６３位のアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６４位は、Ａであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、およびＴ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６５位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ａ、Ｔ、Ｆ、およびＳから選択される（特に、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１０８位は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、およびＱから選択される（特に、ＲおよびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、１１０位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、１０８位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１０位は、ＡもしくはＳであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｔ、およびＣ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、１０８位のアミノ酸がＮである場合には、１１０位のアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１３位は、ＴもしくはＩであるか、またはＶ、Ｌ、およびＧから選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１５位は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであるか、またはＧ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択される（特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択され、より特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＲから選択される）アミノ酸により置換されている、
項目１または２に記載の抗原結合タンパク質。
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２７位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、およびＳから選択される（特に、Ｔ、Ｎ、Ｓ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の２８位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、およびＴから選択される（特に、Ｒ、Ａ、およびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ１の３８位は、Ｄであるか、またはＥ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＲ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ２の６４位は、Ｋであるか、またはＲ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＦから選択される（特に、Ｒ、Ｔ、およびＶから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲａ３の１１４位は、ＬもしくはＹであるか、またはＭ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択される（特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＮから選択され、より特に、Ｈ、Ｑ、Ａ、およびＩから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５６位は、Ｆであるか、またはＹ、Ｍ、Ｌ、Ｗ、Ｈ、Ｖ、Ｉ、およびＡから選択される（特に、Ｙ、Ｍ、およびＬから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５７位は、Ｑであるか、またはＮ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、およびＫ（特にＮ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、６３位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、５７位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の５８位は、Ｎであるか、またはＱ、Ｈ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴ（特にＳ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６３位は、Ｔであるか、またはＳ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｑ、およびＥから選択される（特に、ＳおよびＥから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、５７位のアミノ酸がＮである場合には、６３位のアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６４位は、Ａであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、およびＴ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ２の６５位は、Ｖであるか、またはＬ、Ｉ、Ｍ、Ａ、Ｔ、Ｆ、およびＳから選択される（特に、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される）アミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１０８位は、Ｐ、Ａ、もしくはＴであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、およびＱから選択される（特に、ＲおよびＳから選択される）アミノ酸により置換されており、但し、１１０位のアミノ酸がＴまたはＳである場合には、１０８位のアミノ酸は、Ｎではなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１０位は、ＡもしくはＳであるか、またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｔ、およびＣ（特にＴ）から選択されるアミノ酸により置換されており、但し、１０８位のアミノ酸がＮである場合には、１１０位のアミノ酸は、ＴでもＳでもなく、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１３位は、ＴもしくはＩであるか、またはＶ、Ｌ、およびＧから選択されるアミノ酸により置換されており、
－ ＩＭＧＴに従うＣＤＲｂ３の１１５位は、Ｔ、Ｋ、もしくはＡであるか、またはＧ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択される（特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、Ｈ、Ｅ、およびＦから選択され、より特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＲから選択される）アミノ酸により置換されている、
項目１または２に記載の抗原結合タンパク質。
【0481】
４．前記抗原結合タンパク質は、ＭＨＣタンパク質（特に、ＨＬＡタンパク質、より特に、ＨＬＡ－Ａ、さらにより特に、ＨＬＡ－Ａ＊０２）との複合体の配列番号５０のアミノ酸配列に特異的に結合する、項目１～３のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0482】
５．前記抗原結合タンパク質は、配列番号５０の３、５、６、７、および８位、特に３、５、および７位からなる群から選択される少なくとも３、４、または５箇所のアミノ酸位置を含むかまたはからなる機能エピトープに特異的に結合し、好ましくは、配列番号５０のアミノ酸３、５、および７位、または３、５、６、および７位、または３、５、７、および８位、または３、５、６、７、および８位からなるが、好ましくは配列番号５０のアミノ酸１および４位ではない機能エピトープに結合する、項目１～４のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0483】
６．前記抗原結合タンパク質は、配列番号５０の１、３、４、５、６、７、および８位からなる群から選択される少なくとも６または７箇所のアミノ酸位置を含むかまたはからなる機能エピトープに特異的に結合する、項目１～４のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0484】
７．前記抗原結合タンパク質は、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、好ましくは≦５ｎＭのＫＤで、前記ＰＲＡＭＥ抗原ペプチドとＭＨＣタンパク質（特に、ＨＬＡタンパク質、より特に、ＨＬＡ－Ａ、さらにより特に、ＨＬＡ－Ａ＊０２）との複合体に結合する、項目１～６のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0485】
８．前記抗原結合タンパク質は、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＴＭＥＤ９－００１（配列番号５１）、ＣＡＴ－００１（配列番号５２）、ＤＤＸ６０Ｌ－００１（配列番号５３）、ＬＲＲＣ７０－００１（配列番号５４）、ＰＴＰＬＢ－００１（配列番号５５）、ＨＤＡＣ５－００１（配列番号５６）、ＶＰＳ１３Ｂ－００２（配列番号５７）、ＺＮＦ３１８－００１（配列番号５８）、ＣＣＤＣ５１－００１（配列番号５９）、ＩＦＴ１７－００３（配列番号６０）、ＤＩＡＰＨ１－００４（配列番号６２）、ＦＡＤＳ２－００１（配列番号６３）、ＦＲＹＬ－００３（配列番号６４）、ＧＩＭＡＰ８－００１（配列番号６５）、ＨＳＦ１－００１（配列番号６６）、ＫＮＴ－００１（配列番号６７）、ＭＡＵ－００１（配列番号６８）、ＭＣＭ４－００１（配列番号６９）、ＭＰＰＥ１－００１（配列番号７１）、ＭＹＯ１Ｂ－００２（配列番号７２）、ＰＲＲ１２－００１（配列番号７３）、ＰＴＲＦ－００３（配列番号７４）、ＲＡＳＧＲＰ１－００１（配列番号７５）、ＳＭＡＲＣＤ１－００１（配列番号７６）、ＴＧＭ２－００１（配列番号７７）、ＶＡＶ１－００１（配列番号７８）、ＶＩＭ－００９（配列番号３１７）、ＦＡＲＳＡ－００１（配列番号３０６）、ＡＬＯＸ１５Ｂ－００３（配列番号３０４）、ＦＡＭ１１４Ａ２－００２（配列番号３０５）、ＧＰＲ５６－００２（配列番号３０７）、ＩＧＨＤ－００２（配列番号３０８）、ＮＯＭＡＰ－３－０９７２（配列番号３０９）、ＮＯＭＡＰ－３－１２６５（配列番号３１０）、ＮＯＭＡＰ－３－１４０８（配列番号３１１）、ＮＯＭＡＰ－３－１５８７（配列番号３１２）、ＮＯＭＡＰ－３－１７６８（配列番号３１３）、ＮＯＭＡＰ－５－０７６５（配列番号３１４）、ＰＤＣＤ１０－００４（配列番号３１５）、ＴＳＮ－００１（配列番号３１６）、ＡＲＭＣ９－００２（配列番号１８７）、ＣＬＩ－００１（配列番号１８８）、ＣＯＰＧ１－００１（配列番号１９０）、ＣＯＰＳ７Ａ－００１（配列番号１９２）、ＥＩＦ－００９（配列番号１９４）、ＥＸＴ２－００６（配列番号１９６）、ＬＭＮＡ－００１（配列番号１９８）、ＰＫＭ－００５（配列番号２００）、ＰＳＭＢ３－００２（配列番号２０２）、ＲＰＬ－００７（配列番号２０４）、ＳＰＡＴＳ２Ｌ－００３（配列番号２０６）、ＳＹＮＥ１－００２（配列番号２０８）、ＴＧＭ２－００２（配列番号２１０）、およびＴＰＲ－００４（配列番号２１２）からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０個、または全ての類似ペプチドに有意に結合せず、好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＩＦＴ１７－００３（配列番号６０）に有意に結合しない、項目１～７のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0486】
９．前記抗原結合タンパク質は、多重特異性であり、例えば、四重特異性、三重特異性、または二重特異性であり、好ましくは二重特異性であり、特に、前記抗原結合タンパク質は、二重特異性ＴＣＲ、二重特異性抗体、または二重特異性ＴＣＲ抗体分子である、項目１～８のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0487】
１０．前記第１および前記第２のポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖もしくは２つのポリペプチド鎖に含まれており、好ましくは、ＶＡは、第１のポリペプチド鎖に含まれており、かつＶＢは、第２のポリペプチド鎖に含まれている、項目１～９のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0488】
１１．ＶＡは、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、
－ ＦＲ１－ａは、配列番号３４５もしくは配列番号３４６のアミノ酸配列、または配列番号３４５と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、２０位でＫもしくはＮを含み、より好ましくはＫを含み、および／または２位でＬもしくはＭを含み、より好ましくはＬを含み；
－ ＦＲ２－ａは、配列番号３４７もしくは配列番号３４８のアミノ酸配列、または配列番号３４７と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、３９位でＬ、Ｉ、もしくはＭを含み、より好ましくはＬもしくはＩを含み、４７位でＡもしくはＤを含み、より好ましくはＡを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、および／または５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み；
－ ＦＲ３－ａは、配列番号３４９のアミノ酸配列、または配列番号３４９と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、９２位でＴもしくはＫを含み、より好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ａは、配列番号３５０のアミノ酸配列、または配列番号３５０と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり；
ＶＢは、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、
－ ＦＲ１－ｂは、配列番号３５１もしくは配列番号３５２のアミノ酸配列、または配列番号３５１と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、１０位でＨもしくはＮを含み、より好ましくはＨを含み、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、および／または２２位でＲもしくはＨを含み；
－ ＦＲ２－ｂは、配列番号３５３のアミノ酸配列、または配列番号３５３と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、４３位でＲもしくはＫを含み、より好ましくはＲを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＭもしくはＰを含み、より好ましくはＰを含み、および／または４８位でＲもしくはＱを含み、より好ましくはＱを含み；
－ ＦＲ３－ｂは、配列番号３５４もしくは配列番号３５５のアミノ酸配列、または配列番号３５４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、８４位で、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤまたはＡを含み、さらにより好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ｂは、配列番号３５６のアミノ酸配列、または配列番号３５６と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
項目１～１０のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
－ ＦＲ１－ａは、配列番号３４５もしくは配列番号３４６のアミノ酸配列、または配列番号３４５と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、２０位でＫもしくはＮを含み、より好ましくはＫを含み、および／または２位でＬもしくはＭを含み、より好ましくはＬを含み；
－ ＦＲ２－ａは、配列番号３４７もしくは配列番号３４８のアミノ酸配列、または配列番号３４７と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、３９位でＬ、Ｉ、もしくはＭを含み、より好ましくはＬもしくはＩを含み、４７位でＡもしくはＤを含み、より好ましくはＡを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、および／または５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み；
－ ＦＲ３－ａは、配列番号３４９のアミノ酸配列、または配列番号３４９と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、９２位でＴもしくはＫを含み、より好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ａは、配列番号３５０のアミノ酸配列、または配列番号３５０と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり；
ＶＢは、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは全てのフレームワーク領域をさらに含み、
－ ＦＲ１－ｂは、配列番号３５１もしくは配列番号３５２のアミノ酸配列、または配列番号３５１と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、１０位でＨもしくはＮを含み、より好ましくはＨを含み、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、および／または２２位でＲもしくはＨを含み；
－ ＦＲ２－ｂは、配列番号３５３のアミノ酸配列、または配列番号３５３と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、４３位でＲもしくはＫを含み、より好ましくはＲを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＭもしくはＰを含み、より好ましくはＰを含み、および／または４８位でＲもしくはＱを含み、より好ましくはＱを含み；
－ ＦＲ３－ｂは、配列番号３５４もしくは配列番号３５５のアミノ酸配列、または配列番号３５４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、８４位で、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、またはＳを含み、より好ましくはＤまたはＡを含み、さらにより好ましくはＤを含み；
－ ＦＲ４－ｂは、配列番号３５６のアミノ酸配列、または配列番号３５６と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
項目１～１０のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0489】
１２．
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列、または配列番号１３２と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３３、配列番号３４、または配列番号９のＣＤＲａ３を含み、さらに、２０位でＫもしくはＮを含み、好ましくはＫを含み、３９位でＬ、Ｍ、もしくはＩを含み、好ましくはＬもしくはＩを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み、９２位でＴもしくはＫを含み、好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み；
－ ＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号３６のＣＤＲｂ２、および配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３を含み、さらに、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、２２位でＲもしくはＨを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＰもしくはＭを含み、好ましくはＰを含み、４８位でＱもしくはＲを含み、好ましくはＱを含み、および／または８４位でＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含み、好ましくはＤもしくはＡを含む
項目１～１１のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
－ ＶＡは、配列番号１３２のアミノ酸配列、または配列番号１３２と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１６のＣＤＲａ１、配列番号３２のＣＤＲａ２、および配列番号３３、配列番号３４、または配列番号９のＣＤＲａ３を含み、さらに、２０位でＫもしくはＮを含み、好ましくはＫを含み、３９位でＬ、Ｍ、もしくはＩを含み、好ましくはＬもしくはＩを含み、４４位でＫもしくはＷを含み、好ましくはＫを含み、５２位でＦもしくはＡを含み、好ましくはＦを含み、５５位でＹもしくはＶを含み、好ましくはＹを含み、９２位でＴもしくはＫを含み、好ましくはＴを含み、および／または９３位でＤもしくはＧを含み、好ましくはＤを含み；
－ ＶＢは、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４と少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、好ましくは、配列番号１０のＣＤＲｂ１、配列番号３６のＣＤＲｂ２、および配列番号４８、配列番号４９、配列番号４７、配列番号２８１、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０１、または配列番号２８３のＣＤＲｂ３を含み、さらに、１１位でＥ、Ｌ、もしくはＫを含み、好ましくはＥを含み、２２位でＲもしくはＨを含み、４４位でＥもしくはＱを含み、好ましくはＥを含み、４６位でＰもしくはＭを含み、好ましくはＰを含み、４８位でＱもしくはＲを含み、好ましくはＱを含み、および／または８４位でＤ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、もしくはＳを含み、好ましくはＤもしくはＡを含む
項目１～１１のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0490】
１３．
－ ＶＡは、配列番号１３２、配列番号１２９、配列番号１３７、または配列番号１４２のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＶＢは、配列番号１３４、配列番号１３０、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、または配列番号１４８のアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
項目１～１２のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
－ ＶＡは、配列番号１３２、配列番号１２９、配列番号１３７、または配列番号１４２のアミノ酸配列を含むか、またはからなり、
－ ＶＢは、配列番号１３４、配列番号１３０、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、または配列番号１４８のアミノ酸配列を含むか、またはからなる、
項目１～１２のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0491】
１４．下記：
（ｉ）１箇所または複数箇所のさらなる抗原結合部位；
（ｉｉ）細胞質シグナル伝達領域を含んでもよい膜貫通領域；
（ｉｉｉ）診断薬；
（ｉｖ）治療薬；および
（ｖ）ＰＫ改変部分
の内の１つまたは複数をさらに含む項目１～１３のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
（ｉ）１箇所または複数箇所のさらなる抗原結合部位；
（ｉｉ）細胞質シグナル伝達領域を含んでもよい膜貫通領域；
（ｉｉｉ）診断薬；
（ｉｖ）治療薬；および
（ｖ）ＰＫ改変部分
の内の１つまたは複数をさらに含む項目１～１３のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
【0492】
１５．抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をさらに含む項目１～１４のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0493】
１６．ＶＬおよびＶＨは、ＣＤ２、ＣＤ３、特に、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および／もしくはＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／βおよびＴＣＲγ／δ、ＨＬＡ－ＤＲ、ならびに４－１ ＢＢ、またはこれらの組合せからなる群から選択される抗原に結合し、ならびに／またはエフェクター細胞に結合し、特に、Ｔ細胞もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に結合する、
項目１５に記載の抗原結合タンパク質。
項目１５に記載の抗原結合タンパク質。
【0494】
１７．前記抗原結合タンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、
前記第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉａ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｄ１－Ｌ２－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉａ］
により表され、
前記第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩａ］
Ｖ３－Ｌ４－Ｄ３－Ｌ５－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩａ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、可変ドメインであり、Ｖ１～Ｖ４の内の１つは、ＶＡであり、１つは、ＶＢであり、１つはＶＬであり、かつ１つはＶＨであり；
－ Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４は、二量体化ドメインであり、かつ存在してもよいし存在していなくてもよく、Ｄ１およびＤ３、ならびにＤ２およびＤ４は、互いに特異的に結合し、Ｄ１およびＤ３またはＤ２およびＤ４の内の少なくとも１対は、存在しており、
－ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ１およびＬ４は、存在しており、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ６は、存在してもよいし存在していなくてもよい、
項目１５または１６に記載の抗原結合タンパク質。
前記第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉａ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｄ１－Ｌ２－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉａ］
により表され、
前記第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩａ］
Ｖ３－Ｌ４－Ｄ３－Ｌ５－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩａ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、可変ドメインであり、Ｖ１～Ｖ４の内の１つは、ＶＡであり、１つは、ＶＢであり、１つはＶＬであり、かつ１つはＶＨであり；
－ Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４は、二量体化ドメインであり、かつ存在してもよいし存在していなくてもよく、Ｄ１およびＤ３、ならびにＤ２およびＤ４は、互いに特異的に結合し、Ｄ１およびＤ３またはＤ２およびＤ４の内の少なくとも１対は、存在しており、
－ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ１およびＬ４は、存在しており、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ６は、存在してもよいし存在していなくてもよい、
項目１５または１６に記載の抗原結合タンパク質。
【0495】
１８．前記抗原結合タンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、
前記第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉｂ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉｂ］
により表され、
前記第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩｂ］：
Ｖ３－Ｌ４－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩｂ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４は、可変ドメインであり、好ましくは、Ｖ１およびＶ２の内の一方は、ＶＡであり、Ｖ３およびＶ４の内の一方は、ＶＢであり、残りの２つの可変ドメインの内の一方は、ＶＬであり、他方はＶＨであり；
－ Ｄ２およびＤ４は、二量体化ドメインであり、好ましくはＦｃドメインであり；
－ Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ３およびＬ６は、存在してもよいし存在しなくてもよい、
項目１５～１７のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
前記第１のポリペプチド鎖は、式［Ｉｂ］：
Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ３－Ｄ２ ［Ｉｂ］
により表され、
前記第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩｂ］：
Ｖ３－Ｌ４－Ｖ４－Ｌ６－Ｄ４ ［ＩＩｂ］
により表され、
式中、
－ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４は、可変ドメインであり、好ましくは、Ｖ１およびＶ２の内の一方は、ＶＡであり、Ｖ３およびＶ４の内の一方は、ＶＢであり、残りの２つの可変ドメインの内の一方は、ＶＬであり、他方はＶＨであり；
－ Ｄ２およびＤ４は、二量体化ドメインであり、好ましくはＦｃドメインであり；
－ Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ６は、リンカーであり、Ｌ３およびＬ６は、存在してもよいし存在しなくてもよい、
項目１５～１７のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
【0496】
１９．
（１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（２）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（３）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（４）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（５）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（６）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（７）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（８）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（９）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１０）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；または
（１２）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡである、
項目１７または１８に記載の抗原結合タンパク質。
（１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（２）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（３）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（４）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（５）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＬであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（６）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＬであるか；
（７）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＢであり、Ｖ３は、ＶＨであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；
（８）Ｖ１は、ＶＢであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＨであるか；
（９）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１０）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＡであり、かつＶ４は、ＶＢであるか；
（１１）Ｖ１は、ＶＨであり、Ｖ２は、ＶＬであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡであるか；または
（１２）Ｖ１は、ＶＬであり、Ｖ２は、ＶＨであり、Ｖ３は、ＶＢであり、かつＶ４は、ＶＡである、
項目１７または１８に記載の抗原結合タンパク質。
【0497】
２０．
－ 配列番号１００、１０３、１０５、１０６、１１１、１２２、１２６、１２８、１５１、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６６、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８３、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２８５、２９１、２９５、２９９、および３０３から選択される第１のポリペプチド鎖、ならびに
－ 配列番号１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１９、１２１、１３１、１３３、１４３、１５２、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１８２、１８４、１８５、１８６、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８２、２８４、２９６、または３００から選択される第２のポリペプチド鎖
を含む項目１～１９のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
－ 配列番号１００、１０３、１０５、１０６、１１１、１２２、１２６、１２８、１５１、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６６、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８３、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２８５、２９１、２９５、２９９、および３０３から選択される第１のポリペプチド鎖、ならびに
－ 配列番号１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１９、１２１、１３１、１３３、１４３、１５２、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１８２、１８４、１８５、１８６、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８２、２８４、２９６、または３００から選択される第２のポリペプチド鎖
を含む項目１～１９のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0498】
２１．ＶＡは、ＴＣＲ α鎖もしくはγ鎖に含まれており；および／またはＶＢは、ＴＣＲ β鎖もしくはδ鎖に含まれている、項目１～１３のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質。
【0499】
２２．項目１～２１のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質をコードする配列を含む単離核酸。
【0500】
２３．項目２２に記載の核酸を含むベクター。
【0501】
２４．項目１～２１のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質、または項目２２に記載の核酸、または項目２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【0502】
２５．前記宿主細胞は、
－リンパ球、好ましくはＴリンパ球もしくはＴリンパ球前駆細胞、例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞もしくはＣＤ８陽性Ｔ細胞、または
－ 組換え発現用の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくは酵母細胞
である、項目２４に記載の宿主細胞。
－リンパ球、好ましくはＴリンパ球もしくはＴリンパ球前駆細胞、例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞もしくはＣＤ８陽性Ｔ細胞、または
－ 組換え発現用の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくは酵母細胞
である、項目２４に記載の宿主細胞。
【0503】
２６．項目１～２１のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質、項目２２に記載の核酸、項目２３に記載のベクター、または項目２４もしくは２５に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【0504】
２７．項目１～２１のいずれか１つに係る抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
ａ．宿主細胞を準備すること、
ｂ．項目１～２１のいずれかに記載の抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含む遺伝子コンストラクトを準備すること、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記宿主細胞に導入すること、および
ｄ．前記宿主細胞により前記遺伝子コンストラクトを発現させること
を含む方法。
ａ．宿主細胞を準備すること、
ｂ．項目１～２１のいずれかに記載の抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含む遺伝子コンストラクトを準備すること、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記宿主細胞に導入すること、および
ｄ．前記宿主細胞により前記遺伝子コンストラクトを発現させること
を含む方法。
【0505】
２８．前記宿主細胞からの前記抗原結合タンパク質の単離および精製、ならびに適宜、Ｔ細胞中での前記抗原結合タンパク質の再構築をさらに含む項目２７に記載の方法。
【0506】
２９．医薬での使用のための、項目１～２１のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質、項目２２に記載の核酸、項目２３に記載のベクター、項目２４もしくは２５に記載の宿主細胞、または項目２６に記載の医薬組成物。
【0507】
２９．増殖性疾患、例えば、がんの診断、予防、および／または処置での使用のためのものあり、前記がんは、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管細胞癌、胆嚢がん、膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、無色素性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん腺癌、非小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、腎細胞癌、小細胞肺がん、膀胱癌、子宮および子宮内膜がん、骨肉腫、慢性リンパ性白血病、結腸直腸癌、ならびに滑膜肉腫からなるがんの群から選択される、項目１～２１のいずれか１つに記載の抗原結合タンパク質、項目２２に記載の核酸もしくは項目２３に記載のベクター、項目２４もしくは２５に記載の宿主細胞、または項目２６に記載の医薬組成物。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図12-5】
【図13-1】
【図13-2】
【配列表】
【国際調査報告】