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特表2024-518397三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む血管新生促進用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む血管新生促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20240423BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240423BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20240423BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240423BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240423BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20240423BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240423BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240423BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20240423BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
C12N5/0775
C12N5/0735
A23L33/10
A61K31/7105
A61K38/18
A61P9/10
A61P17/02
A61P17/14
A61P43/00 105
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023568155
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-11-10
(86)【国際出願番号】 KR2022006423
(87)【国際公開番号】W WO2022235085
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】10-2021-0058172
(32)【優先日】2021-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523170644
【氏名又は名称】エスアンドイー、バイオ、カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｓ＆Ｅ ＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】キム、ウンヒ
(72)【発明者】
【氏名】スン、ジヒ
(72)【発明者】
【氏名】シン、ウンキョン
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018ME14
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AC14
4B065BC15
4B065CA44
4C084AA02
4C084BA44
4C084CA56
4C084DB54
4C084DB57
4C084NA20
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA451
4C084ZA452
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZA921
4C084ZA922
4C084ZB211
4C084ZB212
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA20
4C086ZA36
4C086ZA45
4C086ZA89
4C086ZA92
4C086ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA20
4C087ZA36
4C087ZA45
4C087ZA89
4C087ZA92
4C087ZB21
(57)【要約】
本発明は、新規な製造方法により製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む血管新生促進用組成物および血管新生促進方法に関するものである。本発明の新規な方法により製造された細胞外小胞は、血管新生を促進することができる様々な因子を高発現させ、血管の再生を誘導することができるので、血管再生を必要とする様々な疾患の治療に有用に活用されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む、血管新生促進用医薬組成物。
【請求項2】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、万能幹細胞、誘導万能幹細胞および胚幹細胞からなる群から選択されたいずれか一つ以上である、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項3】
前記（ａ）段階の三次元培養は、静的（ｓｔａｔｉｃ）培養をするものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項4】
前記（ａ）段階の三次元培養は、マイクロウェルに間葉系幹細胞を２００～６００細胞／ウェルの密度に分注し、培養するものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項5】
前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞および二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１８４、およびｍｉＲ－２１０からなる群から選択された1種以上を高発現するものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項6】
前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞および二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べてＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｉｆ－１ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）およびＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択された１種以上を高発現するものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項7】
前記血管新生促進用組成物は、火傷、潰瘍、虚血、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、心血管系疾患、脳血管性疾患および脱毛症からなる群から選択される１以上の予防または治療用である、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項8】
前記血管新生促進用組成物は、脳血管新生促進用である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項9】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用食品組成物。
【請求項10】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。
【請求項11】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を含む、三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む血管新生促進用組成物の、製造方法。
【請求項12】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階を通じて三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する段階；および
（ｃ）前記（ｂ）段階を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を必要とするオブジェクトに処理する段階；
を含む血管新生促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な製造方法により製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む血管新生促進用組成物および血管新生促進方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
多様な疾患において、幹細胞、特に間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）を用いた治療法と肯定的な臨床結果が報告されてきた。ただし、幹細胞治療剤には、副作用として血管閉塞、腫よう形成、凝固障害などの細胞関連副作用のリスクがあり、臨床試験による効能検証が依然として必要なのが実情である。幹細胞の傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果により、周辺皮膚細胞の再生と血管再生能力の増進が誘導されることが知られており、特に、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）が主な傍分泌効果の有効性因子として知られている。
【0003】
細胞外小胞とは、大きさによってエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）に分類されるが、エクソソームは直径３０～１５０ｎｍであり、微小小胞体は１００～１，０００ｎｍの大きさを有する。細胞外小胞は、細胞膜の一部が血中に放出されたものであり、タンパク質と核成分の両方を含有しており、細胞間コミュニケーションを媒介することが知られている。幹細胞の代わりに細胞外小胞を使用することは、幹細胞の使用による副作用を最小限に抑え、安全性を高めるだけでなく、生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、生産工程の面でも有利である。
【0004】
しかし、未だ幹細胞に由来する細胞外小胞を使用するための大量生産および取得方法などが確立されておらず、幹細胞－由来の細胞外小胞の特性を維持しながら、細胞外小胞が持っている効能をさらに増進させることができる方法については研究があまり行われていない。
【0005】
したがって、効能がさらに増進された細胞外小胞およびそれを用いた新規な治療剤が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、本発明者らは、三次元スフェロイド型細胞凝集体またはこれより由来する細胞外小胞を製造するため、大量生産が可能であり、且つ、培養時間を短縮できる方法を研究し、その結果、マイクロウェルを用いた静的培養により三次元スフェロイド型細胞凝集体（３Ｄ－静的－スフェロイド）を製造し、これを用いて細胞外小胞を製造すると、血管新生促進能が向上された細胞外小胞が製造されることを確認することによって本発明を完成するに至った。
【0007】
したがって、本発明の目的は、血管新生促進能が向上された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を製造し、これを含む血管新生促進用組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用医薬組成物を提供する。
【0009】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用食品組成物を提供する。
【0010】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階； を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物を提供する。
【0011】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む、三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用組成物の製造方法を提供する。
【0012】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階を通じて三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する段階；および（ｃ）前記（ｂ）段階を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を必要とするオブジェクトに処理する段階；を含む血管新生促進方法を提供する。
【発明の効果】
【0013】
本発明の新規な方法によって製造された細胞外小胞は、血管新生を促進することができる様々な因子を高発現させ、血管の再生を誘導することができるので、血管再生を必要とする様々な疾患の治療に有用に活用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】３Ｄスフェロイド型細胞凝集体を製造し、これより細胞外小胞を分離する過程を図式化して示す図である。
【図2】Ａは３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイド培養液が入ったマイクロウェルを観察した図である。Ｂは３Ｄ－静的－スフェロイド培養液が入ったマイクロウェルを観察した図である。Ｃは３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドとマイクロウェルを用いて製造した３Ｄ－静的－スフェロイドの培養期間による凝集体の面積変化を示す図である。
【図3】３Ｄ－静的－スフェロイドと３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を比較した図である。
【図4】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの形態を電子顕微鏡で観察した図である。
【図5】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの濃度およびサイズ分布を確認するためのＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）の結果を示す図である。
【図6】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの発現マーカーを確認するため、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図7】由来細胞当たり３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび２Ｄ－ＥＶの生産量を比較した図である。
【図8】２Ｄ－ＥＶに比べて３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を示す図である。
【図9】３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶに比べて３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高発現する血管新生関連ｍｉＲＮＡを示す図である。
【図10】２Ｄ－ＥＶおよび３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶにおける血管新生関連ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２１０の発現を比較した結果、２Ｄ－ＥＶおよび３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理によるＨＵＶＥＣ細胞におけるＧＡＰＤＨを確認した結果、およびＥｐｈｒｉｎ Ａ３発現抑制に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図11a】２Ｄ－ＥＶおよび３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ（ＷＪ－３Ｄ ＥＶ）におけるｄｏｎｏｒによるＥＶ生産量、ＥＶの大きさ、ＥＶを含むタンパク質量の差を確認した結果を示す図である。
【図11b】２Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣ、３Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣ、２Ｄ－ＥＶ及び３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶにおけるｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ及び血管新生関連ｍｉＲＮＡ発現量の差を確認した結果を示す図である。
【図12】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に処理した後、血管新生関連因子であるＶＥＧＦ、Ｈｉｆ－１ａ、ＦＧＦの発現変化を確認した結果を示す図である。
【図13】血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）にＰＢＳ（ｃｏｎ）、ＶＥＧＦ、２Ｄ－ＥＶ及び３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理し、チューブ形成効果を比較した結果を示す図である。
【図14】脳梗塞動物モデルに対照群としてＰＢＳまたは実験群として３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理した後、脳梗塞病変および脳室の容積変化の程度を確認した結果を示す図である。
【図15】脳梗塞動物モデルに対照群としてＰＢＳまたは実験群として３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理した後、神経血管生成の効果を確認した結果を示す図である。
【図16】脳梗塞動物モデルに３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入した後、運動機能喪失回復効果を確認した結果を示す図である。
【図17】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ製造において、マイクロウェルの直径、深さとウェル当たりの細胞数を異にした後、製造される３Ｄスフェロイドのサイズ、Ｒｏｕｎｄｎｅｓｓ、Ｓｏｌｉｄｉｔｙを確認した結果を示す図である。
【図18】様々な条件で製造された３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと２Ｄ－ＥＶで発現されるｍｉＲＮＡ－１３２及びｍｉＲＮＡ－２１０の発現量を比較した結果を示す図である。
【図19】様々な条件で製造された３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと２Ｄ－ＥＶの血管生成能をｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ実験により確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0015】
本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用医薬組成物を提供する。
【0016】
本発明における前記細胞は、細胞外小胞を分離できる細胞であれば、制限なく使用することができ、自然界生物のオブジェクトから分離された細胞であることができる。また、前記細胞は、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む任意の類型の動物、植物に由来するものであってもよく、多様な種類の免疫細胞、腫瘍細胞、幹細胞であってもよく、好ましくは、前記幹細胞は、間葉系幹細胞、万能幹細胞、誘導万能幹細胞または胚幹細胞であってもよい。
【0017】
本発明における前記三次元培養は、試験管内で立体配置の状態で培養されることを意味し、二次元培養とは異なり、三次元培養時、細胞成長は細胞をして生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）であらゆる方向に成長できるようにし、それは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での細胞環境とより類似するものであることができる。
【0018】
本発明において、前記（ａ）段階の三次元培養は、本発明が属する技術分野に知られた全ての三次元細胞培養技術によって行うことができ、例えば、マイクロウェルアレイ培養、多孔性微粒子培養、ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ培養、ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｌａｔｅ培養、ｍｅｍｂｒａｎｅベースｃｅｌｌ－ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ培養、ｔｈｅｒｍａｌ ｌｉｆｔｉｎｇ培養、遠心分離培養、ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉｕｍ培養などを用いた細胞培養であってもよい。好ましくは、前記三次元培養は、動的（ｄｙｎａｍｉｃ）培養または静的（ｓｔａｔｉｃ）培養であってもよく、より好ましくは、静的（ｓｔａｔｉｃ）培養であってもよい。本発明において、（ａ）段階の三次元培養を静的（ｓｔａｔｉｃ）培養する場合、振とう培養に必要な装置を必要としないため、培養をさらに容易にすることができ、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準）製造所で大量培養を可能にする長所がある。
【0019】
本発明において、前記（ａ）段階における三次元（３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養は、１～１０日間培養するものであってもよく、好ましくは、２～４日間培養するものであってもよい。本発明において、前記（ａ）段階における培養を２～４日間培養する場合、三次元スフェロイド型細胞凝集体内に存在する細胞の生存率が高いレベルで維持され、既存の三次元スフェロイド型細胞凝集体の製造過程に比べて培養時間が相対的に短く、迅速に三次元スフェロイド型細胞凝集体およびこれより由来する細胞外小胞を製造することができる。
【0020】
本発明において、前記（ａ）段階における三次元培養は、マイクロウェルに間葉系幹細胞を１００～１０００細胞／ウェルの密度に分注し、培養するものであってもよく、好ましくは、１００～６００細胞／ウェルの密度に分注し、培養するものであってもよく、より好ましくは、１００～５００細胞／ウェルの密度に分注し、培養するものであってもよい。
【0021】
本発明において、前記（ｂ）段階の細胞外小胞を分離する段階は、細胞または細胞凝集体を含む試料の押出し、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍－解凍、電気穿孔、化学物質処理、機械的分解および外部的に細胞に力を加えた物理的刺激の処理からなる群から選択された方法を用いて製造することができ、好ましくは、タンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）方法により分離するものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0022】
本発明において、ＭｉｃｒｏＲＮＡは、「ｍｉｒ」を前につけて、後ろに「－」と数字を付して命名される。このとき、数字はしばしば命名された順番を表したりすることもあるが、例えば、ｍｉｒ－１２３は、ｍｉｒ－１５６よりも先に命名されたもので、より先に発見されたものと予想される。「ｍｉｒ－」は、ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡを示し、大文字が含まれた「ｍｉＲ」は、ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡを意味する。１つまたは２つの配列を除き、ほぼ同一配列のｍｉｃｒｏＲＮＡは、小文字を加えて命名する。例えば、ｍｉＲ－１２１ａとｍｉＲ－１２１ｂは、それぞれのｐｒｅｃｕｒｓｏｒであるｍｉｒ－１２１ａとｍｉｒ－１２１ｂで生成され、配列も非常に類似する。Ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡは同じであるが、ゲノム上の別の部位に位置するｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡは、さらに「－」と数字を付して命名する。一例として、ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡであるｍｉｒ－１２１－１とｍｉｒ－１２１－２は、同じｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ－１２１）になるが、ゲノム上の別の部位に位置する。種によってｍｉｃｒｏＲＮＡの命名は前方に表記する。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｏａｒ－ｍｉＲ－１２３は、羊（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）ｍｉｃｒｏＲＮＡである。「ｖ」は、ｖｉｒａｌ（ｍｉＲＮＡ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ａ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）、「ｄ」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｉｃｒｏＲＮＡを意味する。２つのｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡが同一のｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡの互いに異なるａｒｍｓ（３’ａｒｍまたは５’ａｒｍ）に由来する場合、「－３ｐ」または「－５ｐ」を後方に追加して命名する。ｍｉＲ－１４２－３ｐは、３’ａｒｍに由来するものであり、ｍｉＲ－１４２－５ｐは、５’ａｒｍに由来するものである。ＭｉｃｒｏＲＮＡの命名法は一般的に前記のような基準に基づくが、例外の場合もある。
【0023】
本発明において、前記細胞外小胞は、臨床的に有意な物質を公知の細胞外小胞と比較して高発現するものであることができ、前記臨床的に有意な物質は、血管新生効果を示す物質であることができる。例えば、好ましくは、本発明の細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞および二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べて血管新生と関連したｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１８４、およびｍｉＲ－２１０からなる群から選択された１種以上を高発現するものであってもよく、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｉｆ－１ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）およびＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択された１種以上を高発現するものであってもよい。より好ましくは、本発明の細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞および二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べて血管新生と関連したｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１８４、およびｍｉＲ－２１０、ＶＥＧＦ、Ｈｉｆ－１ａおよびＦＧＦを高発現するものであってもよい。
【0024】
また、前記細胞外小胞は、細胞に処理時、細胞内に混入して内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）するものであることができ、細胞内に混入して内在化する場合、細胞外小胞で高発現する臨床的に有意な物質を細胞に効果的に送達し、細胞内で高発現するものであることができる。
【0025】
本発明において、血管新生促進効果を示す三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、「３Ｄ－静的－スフェロイド－ＥＶ」と相互交換的に使用されることができる。また、これと比較して三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、「３Ｄ－動的－ＰＥＧ－スフェロイド－ＥＶ」と相互交換的に使用されることができる。
【0026】
本発明における「間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞」は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体から分離した細胞外小胞であれば、制限なく含むものであってもよく、好ましくは、韓国登録特許（出願番号１０－２０１６－００５３０２６、幹細胞に由来の細胞外小胞体の生産方法）に開示された細胞外小胞であってもよい。
【0027】
本発明における「二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞」は、幹細胞を通常の二次元培養方法に従って培養し、通常の細胞外小胞の分離方法によって分離された細胞外小胞であれば、制限なく含むことができる。本発明の一実施例では、前記通常の二次元培養方法をセルスタック（Ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）で３日間培養した幹細胞をＰＢＳ洗浄し、無血清培地に交換し、さらに２日間培養する方法で実施した。
【0028】
本発明における前記三次元スフェロイド型細胞凝集体は、平均直径が７４．４３±７．７５６μｍであってもよく、好ましくは、大きさ５５～９５．０μｍの範囲を有し、１５５個の前記三次元スフェロイド型細胞凝集体のサイズ分布を測定した結果、平均直径が７４．４３μｍ、変動係数（ＣＶ）が９．５９％であってもよい。本発明における三次元スフェロイド型細胞凝集体は、サイズ分布の尖度が「間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体」に比べて高いものであることができる。したがって、前記三次元スフェロイド型細胞凝集体の大きさは、「間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体」と比較して大きさが小さく、相対的に均一なサイズ分布を有するものであることができる。
【0029】
本発明において、前記マイクロウェルは、ＴＭＳＰＭＡ（３－（Ｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌｙ）ｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＥＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、ＧＭＡ（Ｇｌｙｃｉｄｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＥＧＤＭＡ（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＴＨＦＡ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｆｕｒｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＭＡＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｕｌ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ＰＥＡ（Ｐｈｅｎｙｌ ｅｐｏｘｙａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＯＦＨＡ（６－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２，２，３，３，４，４，５，５－ｏｃｔａｆｌｕｏｒｏ）、ＥＯＰＴ（Ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ（４）ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌｔｅｔｒａａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＰＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、ＢＭＡ（Ｂｕｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｌａｔｅ）、ＰＥＴＩＡ（Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｔｒｉａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＤＤＡ（Ｈｅｘａｎ ｄｉｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ）、ＥＧＰＥＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒａｃｒｙｌａｔｅ）、ＢＭ（Ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＰＰＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、ＢＨＰＥＡ（２－（４－Ｂｅｎｚｏｙｌ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＥＭＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＨＰＭＡ（Ｎ－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）およびＭＰＣ（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ）からなる群から選択されたいずれかでコーティングされたものであってもよく、好ましくは、ＭＰＣ（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ）でコーティングされたものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0030】
本発明における前記マイクロウェルは、直径が２００～８００μｍであることができ、好ましくは３００～８００μｍ、より好ましくは４００～８００μｍの直径を有するものであることができる。
【0031】
また、前記マイクロウェルは、深さのない平坦な構造のマイクロウェルである、または深さを形成するマイクロウェルの場合、１００～１０００μｍ、好ましくは１００～９００μｍ、より好ましくは２００～９００μｍである構造を有するものであることができる。
【0032】
前記構造により培養される間葉系幹細胞が培養時間経過後にも高い水準で生存率を維持するものであることができる。好ましくは、前記マイクロウェルを１，０００個～１００，０００個含むマイクロアレイを作製し、細胞凝集体の生産収率を増加させることができる。
【0033】
本発明における前記「三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法」により細胞外小胞を製造すれば、静的培養による製造上の利点に加え、臨床適用性、特に血管新生能が向上された細胞外小胞を迅速かつ効率的に大量生産することができる。特に、「間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞」の製造方法または「二次元培養した間葉幹系幹細胞に由来の細胞外小胞」の製造方法のような、従来の細胞外小胞の製造方法がＧＭＰに不適切であるのとは異なり、本発明の細胞外小胞の製造方法は、ＧＭＰ適用に適しているという特徴があるので、血管新生のための医薬組成物の製造に特に適合し得る。
【0034】
本発明において、血管新生とは、新生血管（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を形成すること意味し、血管内皮細胞の移動を誘導または増加させ、血管内皮細胞でチューブ形成を促進させ、既存の血管から新たな血管が形成される過程を意味する。
【0035】
本発明の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、血管新生を促進することができる多様な因子を高発現し、血管の再生を誘導することができるため、血管再生が必要な多様な疾患の治療に有用に使用されることができる。
【0036】
本発明の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞が適用され得る血管新生が必要な疾患の種類は、これらに限定されるものではないが、火傷、潰瘍、虚血、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、心血管系疾患、脳血管性疾患および脱毛症からなる群から選択される１種以上であることができ、特に心血管系疾患または脳血管性疾患であることができる。
【0037】
また、本発明の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、特に脳血管新生の促進に有用なため、血管新生促進用組成物は、脳血管新生促進用であることができる。
【0038】
脳組織は、普段は大量の血流の供給を受けているが、外部または内部からの刺激によって脳血管が詰まることがあり、脳へ供給される血液量が減少すると脳組織が正常に機能しなくなる。脳血流の減少が一定時間以上持続すると脳組織が壊死するが、脳組織が壊死してしまい回復不可能な状態に至ることを脳梗塞（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）といい、これには脳血栓症と脳塞栓症が含まれる。血栓症とは、血管の局所で血液が固まって血管が詰まることをいい、血栓ができるとその血管の領域は血流が滞り、他の場所からの側副路よる補いが不十分になると、その部分の脳組織は死滅する。
【0039】
塞栓症とは、心臓内にできた血栓が血流によって末梢に運ばれ、末梢の血管が閉塞することをいい、塞栓によって血管が閉塞されると、その箇所の脳組織は死滅する。本発明の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、脳血管の新生を促進することができるため、脳梗塞による脳血流の減少を回復させるのに有用であり得る。
【0040】
本発明の医薬組成物は、前記有効成分の他に、医薬組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含み得る。本発明の医薬組成物は、その他に医薬活性成分や活性混合物をさらに含み得る。
【0041】
本発明の医薬組成物は、それぞれ常法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射用溶液の形態に剤形化して使用され得る。組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、前記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン等を混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。
【0042】
経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射用エステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。
【0043】
本発明の医薬組成物の好ましい投与量は、患者の病態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択され得る。投与は１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記の投与量は、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものではない。
【0044】
本発明の医薬組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与のすべての方式は予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳室内（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与され得る。
【0045】
本発明の前記賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、着香料等の用語の定義は、当業界に公知の文献に記載されたものであって、その機能等が同一ないし類似するものを含む。
【0046】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を３次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、３次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階を通じて、三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する段階；および（ｃ）前記（ｂ）段階により製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を必要とするオブジェクトに処理する段階；を含む血管新生促進方法を提供する。
【0047】
前記オブジェクトは、ヒトを含む哺乳類であることが好ましく、血管新生を必要とする患者であって治療中の患者、治療を受けたことのある患者、疾患の治療を受ける必要のある患者を全て含み、血管新生のために外科的手術を受けた患者も含まれることができる。
【0048】
また、本発明は、血管新生のための薬物または治療方法と併用して処理することができる。本発明を併用処理する場合、これは血管新生のための他の薬物または治療方法と同時にまたは順次処理することができる。
【0049】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を３次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、３次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用食品組成物を提供する。
【0050】
前記食品組成物は、医薬組成物に関する説明をすべて同様に引用することができる。前記食品は、特に健康機能食品を含む。本発明で定義される「健康機能食品」とは、人体に有用な機能性を有する原料や成分を用いて、製造し加工した食品を意味し、「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節又は生理学的作用等のような健康用途に有用な効果を得る目的で摂取することを意味する。前記健康機能食品は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤のいずれかの形態を有することができる。
【0051】
また、本発明の食品組成物は、各種食品や飲料等に機能性成分を添加した形態の食品組成物であってもよい。前記食品は、例えば、飲料、粉末飲料、固形物、チューインガム、茶、ビタミン複合体、食品添加剤のいずれかの形態を有することができる。
【0052】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を３次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、３次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物に関するものである。
【0053】
本発明の血管新生促進用ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物は、実験目的で用いられることができ、血管新生を必要とする単離された細胞、組織に処理するための目的の組成物であることができる。本発明の血管新生促進用ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物は、三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む培地組成物であることができ、前記培地は当分野における通常の技術者に公知の培地を制限なく含むことができ、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清、ウマ血清およびヒト血清）が含有された培地である。本発明で用いられ得る培地は、例えば、ＲＰＭＩシリーズ、ＥＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ、１９９培地、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ１２、Ｆ１０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物、Ｗａｙ－ｍｏ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、または血管新生を必要とする細胞を培養するのに適した当技術分野に公知の培地を含み得る。
【0054】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を３次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、３次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む、三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む血管新生促進用組成物の製造方法を提供する。
【0055】
前記製造方法によれば、血管新生促進効果に優れた３次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞をＧＭＰ基準に合わせて、迅速に大量生産することができる。
【0056】
重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略するものとし、本明細書において特に断りのない用語は、本発明が属する技術分野で通常使用される意味を有するものである。
【0057】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【0058】
ウェスタンブロット
細胞および細胞外小胞を放射線免疫沈降アッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、ＲＩＰＡ）緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のＮａ－ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）およびタンパク質分解酵素阻害剤）に溶解させた。計２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移した。その次に、ニトロセルロース膜をヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、フロチリン－１（１：１，０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）またはカルレティキュリン（１：１，０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に対する一次抗体と共に４℃で一晩培養した。Ｔｒｉｓ－緩衝生理食塩水－Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、ニトロセルロース膜を西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）－結合二次抗体（１：１，０００、抗－ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）と共に２時間培養した。タンパク質をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の化学発光基質を用いて検出した。標識タンパク質をＸ－線フィルム（Ａｇｆａ、Ｍｏｒｔｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を通じて視覚化した。
細胞および細胞外小胞を放射線免疫沈降アッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、ＲＩＰＡ）緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のＮａ－ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）およびタンパク質分解酵素阻害剤）に溶解させた。計２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移した。その次に、ニトロセルロース膜をヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、フロチリン－１（１：１，０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）またはカルレティキュリン（１：１，０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に対する一次抗体と共に４℃で一晩培養した。Ｔｒｉｓ－緩衝生理食塩水－Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、ニトロセルロース膜を西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）－結合二次抗体（１：１，０００、抗－ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）と共に２時間培養した。タンパク質をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の化学発光基質を用いて検出した。標識タンパク質をＸ－線フィルム（Ａｇｆａ、Ｍｏｒｔｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を通じて視覚化した。
【0059】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、個々のメーカーのマニュアルに従って商用キットで行った。次のようなＥＬＩＳＡキットを使用した：ゲンタマイシン（５１１１ＧＥＮ、ＥｕｒｏＰｒｏｘｉｍａ、Ａｒｎｈｅｍ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）、ウシアルブミン（８１００、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）、Ｈｓｐ７０（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ．（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、カルレティキュリン（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）およびシトクロムＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）。全てのキットには、標準タンパク質が含まれている；したがって、タンパク質および細胞外小胞の量は、各キットの標準曲線に基づいて決定される。
ＥＬＩＳＡは、個々のメーカーのマニュアルに従って商用キットで行った。次のようなＥＬＩＳＡキットを使用した：ゲンタマイシン（５１１１ＧＥＮ、ＥｕｒｏＰｒｏｘｉｍａ、Ａｒｎｈｅｍ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）、ウシアルブミン（８１００、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）、Ｈｓｐ７０（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ．（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、カルレティキュリン（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）およびシトクロムＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）。全てのキットには、標準タンパク質が含まれている；したがって、タンパク質および細胞外小胞の量は、各キットの標準曲線に基づいて決定される。
【0060】
ｑＰＣＲ
ＥＶでＴｒｉｚｏｌＴＭを用いてメーカーの指針に従ってＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）でＲＮＡを定量した。ＲＮＡは、逆転写反応 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）過程を経て、ｃＤＮＡで作り、それぞれのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに適したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いてメーカーのマニュアルに従ってＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを進めた。
ＥＶでＴｒｉｚｏｌＴＭを用いてメーカーの指針に従ってＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）でＲＮＡを定量した。ＲＮＡは、逆転写反応 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）過程を経て、ｃＤＮＡで作り、それぞれのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに適したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いてメーカーのマニュアルに従ってＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを進めた。
【0061】
ＥＶラベリングおよび細胞による吸収
精製されたＥＶをメーカーの指針に従って、ＣＦＳＥ（５－（ａｎｄ－６）－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｄｉａｃｅｔａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ）ラベリング染料（ｃ－１１５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。１時間１００．０００ｇの条件で超遠心分離し、過剰な染料を除去した。標識されたＥＶ（０．４μｇ／ｍｌ）をヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ(商標登録)）に処理し、２４時間培養した。処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、通常の免疫細胞化学プロトコルを用いて染色した。細胞をマウス抗－ＳＭＡ（１：１００、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）抗体と共に４℃で一晩培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体であるＤｙＬｉｇｈｔ標識された抗マウスＩｇＧ（１：２００、５９４ｎｍ、Ａｂｃａｍ）抗体と共に培養した。１．５μｇ／ｍＬ４’－６’ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＴＭを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞をイメージ化した。
精製されたＥＶをメーカーの指針に従って、ＣＦＳＥ（５－（ａｎｄ－６）－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｄｉａｃｅｔａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ）ラベリング染料（ｃ－１１５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。１時間１００．０００ｇの条件で超遠心分離し、過剰な染料を除去した。標識されたＥＶ（０．４μｇ／ｍｌ）をヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ(商標登録)）に処理し、２４時間培養した。処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、通常の免疫細胞化学プロトコルを用いて染色した。細胞をマウス抗－ＳＭＡ（１：１００、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）抗体と共に４℃で一晩培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体であるＤｙＬｉｇｈｔ標識された抗マウスＩｇＧ（１：２００、５９４ｎｍ、Ａｂｃａｍ）抗体と共に培養した。１．５μｇ／ｍＬ４’－６’ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＴＭを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞をイメージ化した。
【0062】
実施例１．間葉系幹細胞の三次元培養を通じた細胞外小胞の分離
１．１ 間葉系幹細胞の準備
５継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ５）段階のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞（以下、ＷＪ－ＭＳＣ、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ、ソウル、韓国）を分譲を受け、３７℃、５％のＣＯ２培養器で培養した。成長培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含有するα－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（α－ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した。６継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ６）段階のＷＪ－ＭＳＣを３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の作製に使用した。
１．１ 間葉系幹細胞の準備
５継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ５）段階のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞（以下、ＷＪ－ＭＳＣ、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ、ソウル、韓国）を分譲を受け、３７℃、５％のＣＯ２培養器で培養した。成長培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含有するα－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（α－ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した。６継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ６）段階のＷＪ－ＭＳＣを３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の作製に使用した。
【0063】
１．２ ３Ｄスフェロイド型細胞凝集体培養液の作製
前記実施例１．１にて作製した６継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ６）段階のＷＪ－ＭＳＣをＰＢＳに洗浄し、トリプシン（ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）処理し、ＣＯ２培養器で５分間反応させた。その後、新たな無血清培地を入れ、トリプシンを中和させ、細胞を回収し、遠心分離機を用いて細胞ペレットを取得した。その次に、新しい無血清培地を入れ、細胞懸濁液を製造し、細胞を計数した。細胞計数後、ＭＰＣ（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ）でコーティングされた直径と深さがそれぞれ５００μｍ×２００μｍのマイクロウェルを約６９，０００個余り含むマイクロアレイに６０ｍｌの細胞懸濁液を４００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度になるように、均一に分注し、静的な状態を維持し、自発的スフェロイド型細胞凝集体の形成を誘導し、計４日間３７℃のＣＯ２培養器で培養し、３Ｄスフェロイド型細胞凝集体培養液（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液）を製造した。
前記実施例１．１にて作製した６継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ６）段階のＷＪ－ＭＳＣをＰＢＳに洗浄し、トリプシン（ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）処理し、ＣＯ２培養器で５分間反応させた。その後、新たな無血清培地を入れ、トリプシンを中和させ、細胞を回収し、遠心分離機を用いて細胞ペレットを取得した。その次に、新しい無血清培地を入れ、細胞懸濁液を製造し、細胞を計数した。細胞計数後、ＭＰＣ（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ）でコーティングされた直径と深さがそれぞれ５００μｍ×２００μｍのマイクロウェルを約６９，０００個余り含むマイクロアレイに６０ｍｌの細胞懸濁液を４００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度になるように、均一に分注し、静的な状態を維持し、自発的スフェロイド型細胞凝集体の形成を誘導し、計４日間３７℃のＣＯ２培養器で培養し、３Ｄスフェロイド型細胞凝集体培養液（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液）を製造した。
【0064】
１．３ ３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の分離
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を回収し、細胞 残屑を除去するため、２，５００ｇで１０分間遠心分離し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。その後、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液をタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）システムを用いて３００ｋＤａのｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ、ＮＹ、ＵＳＡ）を経て、タンパク質を除去し、細胞外小胞を１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドに由来の細胞外小胞（以下、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ）が得られた。
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を回収し、細胞 残屑を除去するため、２，５００ｇで１０分間遠心分離し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。その後、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液をタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）システムを用いて３００ｋＤａのｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ、ＮＹ、ＵＳＡ）を経て、タンパク質を除去し、細胞外小胞を１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドに由来の細胞外小胞（以下、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ）が得られた。
【0065】
前記実施例１．１～１．３の過程を図式化して図１に示した。
【0066】
実施例２．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の特性の分析
前記実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液内に存在する３Ｄスフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド）の特性を分析した。実験群として、実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を用いており、比較群として、韓国登録特許（出願番号１０－２０１６－００５３０２６、幹細胞由来の細胞外小胞体の生産方法）に開示された動的３Ｄ細胞培養方法に従って、５日間間葉系幹細胞を培養し、製造した３Ｄ間葉系幹細胞スフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイド）培養液を使用した。光学顕微鏡で、それぞれの培養液が入ったマイクロウェルを観察し、これを図２Ａ、Ｂに示し、培養初期と比較して培養後、スフェロイド型細胞凝集体の面積変化を図２Ｃに示した。
前記実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液内に存在する３Ｄスフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド）の特性を分析した。実験群として、実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を用いており、比較群として、韓国登録特許（出願番号１０－２０１６－００５３０２６、幹細胞由来の細胞外小胞体の生産方法）に開示された動的３Ｄ細胞培養方法に従って、５日間間葉系幹細胞を培養し、製造した３Ｄ間葉系幹細胞スフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイド）培養液を使用した。光学顕微鏡で、それぞれの培養液が入ったマイクロウェルを観察し、これを図２Ａ、Ｂに示し、培養初期と比較して培養後、スフェロイド型細胞凝集体の面積変化を図２Ｃに示した。
【0067】
図２に示すように、実験群である３Ｄ－静的－スフェロイドと比較群である３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドの面積を比較した結果、細胞が緻密に凝縮され、スフェロイドを形成する特性に応じて３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドに比べて３Ｄ－静的－スフェロイドは、培養初期のスフェロイド対面積が統計的に有意に減少する結果が示された（ｐ＝０．００１１）。
【0068】
実施例３．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の大きさの分析
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイドと実施例2て製造した３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を測定し、測定されたサイズ分布のデータを土台に、変動係数、歪度（ｓｋｅｗｎｅｓｓ）、尖度（ｋｕｒｔｏｓｉｓ）を分析した。
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイドと実施例2て製造した３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を測定し、測定されたサイズ分布のデータを土台に、変動係数、歪度（ｓｋｅｗｎｅｓｓ）、尖度（ｋｕｒｔｏｓｉｓ）を分析した。
【0069】
歪度は、中央値の推移から分布が傾いた方向と程度を知ることができるパラメータであり、１に近いほど右側に長く裾をひく分布を示し、－１に近いほど左側に長く裾を引いた分布を示す。正規分布の場合の歪度は、０である。
【0070】
尖度は、資料分布の尖り具合を示すパラメータであって、値が正の数の場合、中央部分に相対的に多数のデータポイントが集積していることを意味し、負の数の場合、中央部分に相対的に少数のデータポイントが集積していることを意味する。正規分布の場合、尖度は０である。
【0071】
測定したサイズ分布データを図３に示し、これを分析した結果を表１に示した。
【0072】
【表1】
【0073】
図３および表１に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドの平均の大きさが７４．４３ｕｍ、変動係数（ＣＶ）が９．５９％であることが確認された。これとは対照的に、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドは、平均サイズが１４８．６６ｕｍ、変動係数（ＣＶ）が１４．１％であることが確認された。
【0074】
測定した変動係数を比較検定するため、Ｆｅｌｔｚ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ’ｓ（１９９６）ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ ｔｅｓｔを実施した結果、ｐ ｖａｌｕｅ値が０．０１７６５６０４として算出され、Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ ａｎｄ Ｌｅｅ’ｓ（２０１４）ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｇｎｅｄ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｒａｔｉｏ ｔｅｓｔを実施した結果、ｐ ｖａｌｕｅ値が０．０１８５３９６９として算出された。したがって、二つのテスト全部において３Ｄ－静的－スフェロイドと３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布が統計的に有意な程度に相異する様相を示すことが確認された。
【0075】
３Ｄ－静的－スフェロイドと３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布を比較した結果、３Ｄ－静的－スフェロイドのサイズ分布の尖度値が相対的に大きいことが確認され、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドのサイズ分布は、中央値に多く集中した様相を示すことが確認された。このような結果から、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドの製造方法により３Ｄスフェロイドを製造すると、大きさが相対的に一定した３Ｄスフェロイドの製造が可能であることが確認された。
【0076】
実施例４．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞形態の分析
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの形態を観察するため、電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＥＭ）を用いて撮影した。具体的に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを０．１Ｍホスフェート緩衝液（ＰＢ）に溶解された１％のＯｓＯ４で２時間固定させた。ＥＭグリッドを細胞外小胞の液滴上にフォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）側面を下に向けて１分間吸着させた。その後、濾紙でブロッティングし、１５秒間２％のウラニルアセテートと反応させた。過量のウラニルアセテートを除去し、ＥＭグリッドをＴＥＭ（ＪＥＭ－１０１１、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いて観察し、観察画像を図４に示した。
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの形態を観察するため、電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＥＭ）を用いて撮影した。具体的に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを０．１Ｍホスフェート緩衝液（ＰＢ）に溶解された１％のＯｓＯ４で２時間固定させた。ＥＭグリッドを細胞外小胞の液滴上にフォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）側面を下に向けて１分間吸着させた。その後、濾紙でブロッティングし、１５秒間２％のウラニルアセテートと反応させた。過量のウラニルアセテートを除去し、ＥＭグリッドをＴＥＭ（ＪＥＭ－１０１１、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いて観察し、観察画像を図４に示した。
【0077】
図４に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、典型的な細胞外小胞の形態である丸い形状であることが確認された。
【0078】
実施例５．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の濃度および大きさの分析
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの濃度およびサイズ分布を確認するため、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いたＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。最適な分析のため、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）のないホスフェート緩衝液（ＰＢＳ）に予め希釈した。平均サイズおよび濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ）は、３個の記録を統合して計算し、結果を図５に示した。
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの濃度およびサイズ分布を確認するため、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いたＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。最適な分析のため、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）のないホスフェート緩衝液（ＰＢＳ）に予め希釈した。平均サイズおよび濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ）は、３個の記録を統合して計算し、結果を図５に示した。
【0079】
図５に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの平均粒子径は、１８２．５ｎｍであり、モード径は、１０６．１ｎｍであることが確認された。
【0080】
実施例６．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の発現マーカーの分析
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの発現マーカーを確認するための実験を行った。対照群として細胞ライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）と分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を使用した。細胞ライセートは、３Ｄ－静的－スフェロイドをＰＢＳ洗浄し、トリプシンを処理した後、細胞を回収し、回収された細胞を遠心分離機を用いて細胞ペレットが得られる方法により準備した。分泌物は、前記細胞ペレットを得た後、上澄み液である培養培地で実施例１．３の工程を通じてＥＶを分離し、残った培養分泌物を得る方式により用意した。マーカー分析は、ＥＬＩＳＡを用いて細胞外小胞特異的な陽性マーカーＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨＳＰ７０を定量し、特定汚染タンパク質マーカーであるカルレティキュリン、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、シトクロムＣ、アルブミン、抗生剤を定量した。また、ウェスタンブロットを用いて細胞外小胞の特定汚染タンパク質マーカーであるヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、カルレティキュリンを定量し、細胞外小胞陽性マーカーであるフロチリン－１を定量した。ＥＬＩＳＡ分析の結果およびウェスタンブロットの結果を図６に示した。
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの発現マーカーを確認するための実験を行った。対照群として細胞ライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）と分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を使用した。細胞ライセートは、３Ｄ－静的－スフェロイドをＰＢＳ洗浄し、トリプシンを処理した後、細胞を回収し、回収された細胞を遠心分離機を用いて細胞ペレットが得られる方法により準備した。分泌物は、前記細胞ペレットを得た後、上澄み液である培養培地で実施例１．３の工程を通じてＥＶを分離し、残った培養分泌物を得る方式により用意した。マーカー分析は、ＥＬＩＳＡを用いて細胞外小胞特異的な陽性マーカーＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨＳＰ７０を定量し、特定汚染タンパク質マーカーであるカルレティキュリン、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、シトクロムＣ、アルブミン、抗生剤を定量した。また、ウェスタンブロットを用いて細胞外小胞の特定汚染タンパク質マーカーであるヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、カルレティキュリンを定量し、細胞外小胞陽性マーカーであるフロチリン－１を定量した。ＥＬＩＳＡ分析の結果およびウェスタンブロットの結果を図６に示した。
【0081】
図６に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、細胞外小胞特異的陽性マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨＳＰ７０が全部発現され、細胞ライセートおよび分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）から高く発現される汚染タンパク質マーカーであるカルレティキュリン、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、シトクロムＣ、アルブミン（ＢＳＡ、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、ラミンＡ／Ｃおよび抗生剤がほぼ発現されないことが確認された。特に、細胞ライセートから非常に低く発現される細胞外小胞陽性マーカーフロチリン－１（Ｆｌｏｔｉｌｉｎ－１）が３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで相対的に高く発現されることが確認された。
【0082】
実施例７．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の生産量の分析
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞（３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶ）および通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞（２Ｄ－ＥＶ）の生産量を比較するための実験を実施した。２Ｄ－ＥＶは、次のような工程により用意した。セルスタック（Ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）において３日間培養した幹細胞をＰＢＳ洗浄し、無血清培地に交換し、さらに２日間培養する。培養培地を回収し、遠心分離および０．２μｍフィルターを用いて細胞残屑を連続して除去する。その後、培養培地をＴＦＦシステムを用いてｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅを経て、タンパク質を除去し、ＥＶを１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い２Ｄ－ＥＶを得た。用意した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび２Ｄ－ＥＶに由来の細胞当たりの生産量を比較し、これを表２および図７に示した。
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞（３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶ）および通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞（２Ｄ－ＥＶ）の生産量を比較するための実験を実施した。２Ｄ－ＥＶは、次のような工程により用意した。セルスタック（Ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）において３日間培養した幹細胞をＰＢＳ洗浄し、無血清培地に交換し、さらに２日間培養する。培養培地を回収し、遠心分離および０．２μｍフィルターを用いて細胞残屑を連続して除去する。その後、培養培地をＴＦＦシステムを用いてｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅを経て、タンパク質を除去し、ＥＶを１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い２Ｄ－ＥＶを得た。用意した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび２Ｄ－ＥＶに由来の細胞当たりの生産量を比較し、これを表２および図７に示した。
【0083】
【表2】
【0084】
実施例８．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の発現マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の分析
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞である３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶ、および実施例７にて製造した２Ｄ－ＥＶの特性の差異を確認するため、ｍｉＲＮＡｓの発現およびタンパク質発現をｑＰＣＲを通じて測定した。２Ｄ－ＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図８に示し、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現する血管新生関連ｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図９に示した。
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞である３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶ、および実施例７にて製造した２Ｄ－ＥＶの特性の差異を確認するため、ｍｉＲＮＡｓの発現およびタンパク質発現をｑＰＣＲを通じて測定した。２Ｄ－ＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図８に示し、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現する血管新生関連ｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図９に示した。
【0085】
図８に示すように、２Ｄ－ＥＶと比較して、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）および免疫調節に効能を示すｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４６ｂを高く発現し、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）に効能を示すタンパク質であるインテグリン１／２およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／Ｒ２）を高く発現することが確認された。
【0086】
図９に示すように、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較し、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、血管新生に効能を示すｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４およびｍｉＲ－２１０を高く発現することが確認された。
【0087】
このような結果から実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、２Ｄ－ＥＶまたは３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較し、ｍｉＲＮＡとタンパク質発現が相異する新たな細胞外小胞であり、特に、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、免疫調節、若返り（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）または抗腫瘍に関連したｍｉＲＮＡを高く発現し、臨床的に有用に使用され得る細胞外小胞であることが確認された。
【0088】
実施例９．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の血管新生促進効果の確認
９．１．血管新生関連ｍｉＲＮＡおよびＥｐｈｒｉｎ Ａ３発現の比較
実施例８を通じて、実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが、既存の２Ｄ－ＥＶまたは３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶとｍｉＲＮＡとタンパク質発現パターンが相異する新たな細胞外小胞であることが確認された。これにより、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの血管新生促進に対する有用性を確認するため、これを標的細胞であるＨＵＶＥＣ細胞に処理した後、血管新生効果と関連したｍｉＲＮＡとＥｐｈｒｉｎ Ａ３（ｅｐｈ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｇａｎｄ ３）の発現変化をｑＰＣＲおよびウェスタンブロットによって確認し、その結果を図１０に示した。
９．１．血管新生関連ｍｉＲＮＡおよびＥｐｈｒｉｎ Ａ３発現の比較
実施例８を通じて、実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが、既存の２Ｄ－ＥＶまたは３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶとｍｉＲＮＡとタンパク質発現パターンが相異する新たな細胞外小胞であることが確認された。これにより、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの血管新生促進に対する有用性を確認するため、これを標的細胞であるＨＵＶＥＣ細胞に処理した後、血管新生効果と関連したｍｉＲＮＡとＥｐｈｒｉｎ Ａ３（ｅｐｈ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｇａｎｄ ３）の発現変化をｑＰＣＲおよびウェスタンブロットによって確認し、その結果を図１０に示した。
【0089】
図１０に示すように、ｑＰＣＲの結果、既存の２Ｄ－ＥＶと比較して本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶでｍｉＲ－２１０の発現が著しく増加したことが確認された。また、ＨＵＶＥＣで３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理した後、Ｅｐｈｒｉｎ Ａ３のタンパク質発現が２Ｄ－ＥＶ処理群と比較して著しく阻害されることが確認された。ｍｉＲ－２１０は、血管内皮細胞の移動を促進し、毛細血管様構造を形成することが知られており、Ｅｐｈｒｉｎ Ａ３をターゲットとする。すなわち、このような結果は、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが効果的な血管新生を誘導することができることを再び示す結果である。
【0090】
９．２．ドナーによるｍｉＲＮＡ発現差の分析
幹細胞治療剤は、ドナーによって成分が異に示されるドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題があることが知られている。本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題なくより一貫性のあるｍｉＲＮＡプロファイルを示すかを確認するための実験を行った。各ドナーの試料は、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ（ソウル、韓国）から分譲を受けて使用した。実施例１．１の２Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣと３Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣ、実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶのドナー別に生産されるＥＶの数、ＥＶタンパク質の量とｍｉＲＮＡプロファイルを比較した。ｍｉＲＮＡは、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法でｍｉＲＮＡプロファイリングし、その結果を図１１ａ～図１１ｂに示した。
幹細胞治療剤は、ドナーによって成分が異に示されるドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題があることが知られている。本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題なくより一貫性のあるｍｉＲＮＡプロファイルを示すかを確認するための実験を行った。各ドナーの試料は、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ（ソウル、韓国）から分譲を受けて使用した。実施例１．１の２Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣと３Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣ、実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶのドナー別に生産されるＥＶの数、ＥＶタンパク質の量とｍｉＲＮＡプロファイルを比較した。ｍｉＲＮＡは、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法でｍｉＲＮＡプロファイリングし、その結果を図１１ａ～図１１ｂに示した。
【0091】
図１１ａに示すように、２Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣに由来の２Ｄ－ＥＶは、生産されるＥＶの量、大きさ、ＥＶ生産タンパク質の量が各ドナーによってばらつきがみられたが、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、ドナーによる大きなばらつきなく、一貫性のある結果を示した。
【0092】
また、図１１ｂに示すように、２Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣ、２Ｄ－ＥＶはドナーによって産生されるｍｉＲＮＡ組成の差が大きいのに対し、３Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣ、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶはドナーによる差が減少することが確認された。特に３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、ドナーによる差がなく、一貫性のあるｍｉＲＮＡプロファイルを示すとともに、２Ｄ－ＥＶと比較して血管新生効果を示すことができるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－３ｐ（１．５倍）、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ（２．３倍）、ｍｉＲ－２１０（２．６倍）、ｍｉＲ－１３２（２．６倍）がより多く均一に含まれていることが確認された。また、その他の血管新生関連ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１９９ａ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－２６ａ、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－９２ａも、各ドナー間で均一な程度の発現を示すことが確認された。
【0093】
このような結果は、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶがドナーによる治療有効成分の差を減らし、より優れた治療効果を示すことができることを示す結果である。
【0094】
上記の結果を全て総合した結果、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、ＷＪ－２Ｄ－ＥＶや、３Ｄ－動的－スフェロイドＥＶと比較し、血管新生に関連するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－２１０が顕著に増加しており、Ｅｐｈｒｉｎ Ａ３タンパク質発現を阻害させるところ、既存の報告されたＥＶと比較して血管新生により優れた効果を示すことが期待され得、ドナーによる差を減少させ、優れた治療物質になり得ることが確認された。
【0095】
実施例１０．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の処理による血管新生関連因子発現変化の確認
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞である２Ｄ－ＥＶを血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に処理した後、血管新生関連因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｉｆ－１ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現変化を確認し、その結果を図１２に示した。
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞である２Ｄ－ＥＶを血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に処理した後、血管新生関連因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｉｆ－１ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現変化を確認し、その結果を図１２に示した。
【0096】
図１２に示すように、２Ｄ－ＥＶを処理した細胞に比べて３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理した血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）は、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｉｆ－１ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現が増加したことが確認された。
【0097】
ＶＥＧＦおよびＨｉｆ－１ａは、血管新生関連タンパク質であり、ＦＧＦは、細胞の増殖、生存、分化に関連した生物学的機能を調節するタンパク質に該当する因子であって、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが血管新生において、臨床的に適用するに優れた細胞外小胞であることを示す。
【0098】
実施例１1．３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理による神経血管生成効果の確認
３次元幹細胞培養により得られた細胞外小胞による新生血管増殖効果を示すため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に付着したＨＵＶＥＣにＷＪ－２Ｄ－ＥＶと本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理し、チューブ形成効果を確認した。具体的には、ＨＵＶＥＣを、２０％のＦＢＳ、５Ｕ／ｍＬのヘパリンおよび３ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが補充されたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を１．７×１０４細胞の密度でμ－Ｓｌｉｄｅｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ｉｂｉｄｉ、Ｇｒａｅｆｅｌｆｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で増殖因子の減少Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に接種し、３７℃、５％のＣＯ２環境加湿チャンバーで４時間チューブを形成するようにした。位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で画像を撮影し、チューブ状構造の数をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて顕微鏡フィールド（４倍倍率）で定量化し、その結果を図１３に示した。
３次元幹細胞培養により得られた細胞外小胞による新生血管増殖効果を示すため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に付着したＨＵＶＥＣにＷＪ－２Ｄ－ＥＶと本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理し、チューブ形成効果を確認した。具体的には、ＨＵＶＥＣを、２０％のＦＢＳ、５Ｕ／ｍＬのヘパリンおよび３ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが補充されたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を１．７×１０４細胞の密度でμ－Ｓｌｉｄｅｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ｉｂｉｄｉ、Ｇｒａｅｆｅｌｆｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で増殖因子の減少Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に接種し、３７℃、５％のＣＯ２環境加湿チャンバーで４時間チューブを形成するようにした。位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で画像を撮影し、チューブ状構造の数をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて顕微鏡フィールド（４倍倍率）で定量化し、その結果を図１３に示した。
【0099】
図１３から確認できるように、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理した実験群では、血管新生関連タンパク質であるＶＥＧＦ処理群と比較してチューブ形成が著しく増加し、ＷＪ－２Ｄ－ＥＶ処理群と比較しても優れたチューブ形成効果を示すことが確認された。
【0100】
実施例１２．脳卒中動物モデルに対する３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの効果
１２．１ 脳卒中モデルの作製
脳卒中動物モデルを作製するために、光血栓性（Ｐｈｏｔｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ、ＰＴ）脳梗塞モデルを作製した。２０～２５ｇ（８～１２週齢）の成人雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，大韓民国の城南）を用いて、ＰＴ脳卒中をマウス右手の感覚運動皮質から誘導した。要するに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、有限洋行、大韓民国ソウル）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｒｏｍｐｏｎ(商標登録) ｉｎｊ．，ドイツベルリンバイエル）の混合物を腹腔内投与し、マウスを麻酔し、定位固定装置（ＫＯＰＦ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に配置させた。メスを用いて目から首まで頭皮に沿って中線切開を行い、骨膜を除去した後、頭蓋骨を露出させた。ローズベンガル溶液（３０ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を頸静脈を通じて静脈内投与し、５分後、直径３ｍｍの照明を提供する１００ｍＷ、５３２ｎｍ ｄｉｏｄｅ－ｐｕｍｐｅｄ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｇｒｅｅｎ ｌａｓｅｒ（Ｄｏｎｇｗｏｏ Ｏｐｔｒｏｎ（株）、光州）をｂｒｅｇｍａより側面２．５ｍｍに位置させた。レーザーは関心領域（ＲＯＩ）で１５分間活性化され、切開部位を６－０モノフィラメント縫合糸を用いて縫合した。手術中のラットは、３７．０～３７．５℃の体温を維持するようにした。
１２．１ 脳卒中モデルの作製
脳卒中動物モデルを作製するために、光血栓性（Ｐｈｏｔｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ、ＰＴ）脳梗塞モデルを作製した。２０～２５ｇ（８～１２週齢）の成人雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，大韓民国の城南）を用いて、ＰＴ脳卒中をマウス右手の感覚運動皮質から誘導した。要するに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、有限洋行、大韓民国ソウル）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｒｏｍｐｏｎ(商標登録) ｉｎｊ．，ドイツベルリンバイエル）の混合物を腹腔内投与し、マウスを麻酔し、定位固定装置（ＫＯＰＦ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に配置させた。メスを用いて目から首まで頭皮に沿って中線切開を行い、骨膜を除去した後、頭蓋骨を露出させた。ローズベンガル溶液（３０ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を頸静脈を通じて静脈内投与し、５分後、直径３ｍｍの照明を提供する１００ｍＷ、５３２ｎｍ ｄｉｏｄｅ－ｐｕｍｐｅｄ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｇｒｅｅｎ ｌａｓｅｒ（Ｄｏｎｇｗｏｏ Ｏｐｔｒｏｎ（株）、光州）をｂｒｅｇｍａより側面２．５ｍｍに位置させた。レーザーは関心領域（ＲＯＩ）で１５分間活性化され、切開部位を６－０モノフィラメント縫合糸を用いて縫合した。手術中のラットは、３７．０～３７．５℃の体温を維持するようにした。
【0101】
１２．２ 脳卒中モデル病変改善効果の確認
実施例１２．１にて製造した脳卒中動物モデルを対象群としてＰＢＳを、または実験群として３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを、６ｘ１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅで血管注入した後、３日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝２０；ＥＶ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝２３）、１４日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；ＥＶ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝１０）、２８日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；ＥＶ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝６）後、ＭＲＩ Ｔ２－ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｉｍａｇｅ（Ｔ２ＷＩ）画像を撮影し、実験群と対照群の脳梗塞病変および脳室の容積変化程度を比較した。その結果を表３および図１４に示す。
実施例１２．１にて製造した脳卒中動物モデルを対象群としてＰＢＳを、または実験群として３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを、６ｘ１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅで血管注入した後、３日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝２０；ＥＶ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝２３）、１４日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；ＥＶ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝１０）、２８日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；ＥＶ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝６）後、ＭＲＩ Ｔ２－ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｉｍａｇｅ（Ｔ２ＷＩ）画像を撮影し、実験群と対照群の脳梗塞病変および脳室の容積変化程度を比較した。その結果を表３および図１４に示す。
【0102】
【表3】
【0103】
前記表３および図１４から確認できるように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入した実験群において、脳梗塞の病変および脳室の容積がＰＢＳ処理対照群と比較して著しく減少したことが確認された。
【0104】
１２．３ 免疫組織化学分析を通じた血管新生効果の確認
脳卒中動物モデルに本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入すると、神経血管が効果的に生成され得るかどうかを確認するための免疫組織化学分析が行われた。実施例１２．１にて製造された脳卒中動物モデルに対照群としてＰＢＳまたは実験群として３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを０．３×１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅ～３０×１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅで静脈を通じて注入し、脳卒中から４週間後、脳組織において血管陽性マーカーであるコラーゲンＩＶを用いて免疫蛍光分析を行い、血管の数を確認した。その結果を図１５に示す。
脳卒中動物モデルに本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入すると、神経血管が効果的に生成され得るかどうかを確認するための免疫組織化学分析が行われた。実施例１２．１にて製造された脳卒中動物モデルに対照群としてＰＢＳまたは実験群として３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを０．３×１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅ～３０×１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅで静脈を通じて注入し、脳卒中から４週間後、脳組織において血管陽性マーカーであるコラーゲンＩＶを用いて免疫蛍光分析を行い、血管の数を確認した。その結果を図１５に示す。
【0105】
図１５に示すように、ＰＢＳ処理対照群と比較し、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入した脳卒中動物モデルにて血管新生が確認され、これは注入されたＥＶの数に依存的であることが確認された。
【0106】
１２．４ 行動分析を通じた血管新生効果の確認
脳梗塞動物モデルに本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入すると、血管新生が効果的に誘導されることが確認された。このような血管新生により脳梗塞動物モデルにて誘発される運動機能喪失が回復するかどうかを確認するための前肢非対称試験（シリンダー試験）と肢欠損テスト（グリッド歩行テスト）を行った。より具体的に製造された光血栓性脳梗塞モデルに３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ（６ｘ１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅ）をラットの血管に注入し、１４日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理群、ｎ＝１０）、２８日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理群、ｎ＝６）目に分析を行い、その結果を図１６に示した。
脳梗塞動物モデルに本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入すると、血管新生が効果的に誘導されることが確認された。このような血管新生により脳梗塞動物モデルにて誘発される運動機能喪失が回復するかどうかを確認するための前肢非対称試験（シリンダー試験）と肢欠損テスト（グリッド歩行テスト）を行った。より具体的に製造された光血栓性脳梗塞モデルに３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ（６ｘ１０８ＥＶ／ｍｏｕｓｅ）をラットの血管に注入し、１４日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理群、ｎ＝１０）、２８日（ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ、ｎ＝８；３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理群、ｎ＝６）目に分析を行い、その結果を図１６に示した。
【0107】
図１６に示すように、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを注入すると、シリンダー試験指標およびグリッド歩行試験指標の全部が改善されたことが確認された。これらの結果は、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理が脳卒中動物モデルにて血管新生を誘導し、その結果、損傷した運動機能障害を改善できることを示す結果である。
【0108】
実施例１３ 製造条件による３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ効果の検証
１３．１ 実験方法および条件
前記の実施例により、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの優れた効果を確認した。実施例１の製造方法と同様に行い、マイクロウェル規格及び細胞数の条件を異にし、製造されたＥＶにおいても同様の効果が見られるかどうかを確認するために、マイクロウェル当たりの細胞数の規格を４００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌから２００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌに変更させたり、マイクロウェルの規格を直径と深さをそれぞれ５００μｍ×２００μｍの条件で５００μｍ×６００μｍ、または直径８００μｍの深さのない平坦なウェルに変化させて細胞を培養した。
１３．１ 実験方法および条件
前記の実施例により、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの優れた効果を確認した。実施例１の製造方法と同様に行い、マイクロウェル規格及び細胞数の条件を異にし、製造されたＥＶにおいても同様の効果が見られるかどうかを確認するために、マイクロウェル当たりの細胞数の規格を４００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌから２００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌに変更させたり、マイクロウェルの規格を直径と深さをそれぞれ５００μｍ×２００μｍの条件で５００μｍ×６００μｍ、または直径８００μｍの深さのない平坦なウェルに変化させて細胞を培養した。
【0109】
実施例１の製造方法により変更された実験条件を下記表４に示す。
【0110】
【表4】
【0111】
実施例１．１にて作製した６継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ６）段階のＷＪ－ＭＳＣをＰＢＳで洗浄し、トリプシン（ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）処理し、ＣＯ２培養器で５分間反応させた。その後、新しい無血清培地を入れ、トリプシンを中和させて細胞を回収し、遠心分離機を用いて細胞ペレットを得た。次いで、新しい無血清培地を入れ、細胞懸濁液を製造し、細胞を計数した。細胞計数後、前記表４と同様の条件でマイクロウェルに均一に分注し、静的な状態を維持し、自発的スフェロイド型細胞凝集体形成を誘導し、計４日間３７℃のＣＯ２培養器で培養し、３Ｄスフェロイド型細胞凝集体培養液を製造した。
【0112】
１３．２ ３Ｄスフェロイド型細胞凝集体形態の確認
前記実験例１～３の条件で実施例１と同様にスフェロイドが均一に形成されることが確認され、３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の培養液を回収し、実施例１．３の方法でスフェロイドに由来の細胞外小胞を得た。得られた細胞外小胞のサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を測定し、さらにスフェロイドのＲｏｕｎｄｎｅｓｓおよびＳｏｌｉｄｉｔｙを確認し、その結果を図１７に示した。
前記実験例１～３の条件で実施例１と同様にスフェロイドが均一に形成されることが確認され、３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の培養液を回収し、実施例１．３の方法でスフェロイドに由来の細胞外小胞を得た。得られた細胞外小胞のサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を測定し、さらにスフェロイドのＲｏｕｎｄｎｅｓｓおよびＳｏｌｉｄｉｔｙを確認し、その結果を図１７に示した。
【0113】
図１７に示すように、実験例１～３の全部製造された３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の大きさが、実施例１にて製造された細胞凝集体の大きさの範囲である５５～１３１μｍ範囲内の大きさで形成されることが確認され、サイズ分布の平均値が７０．３４～９９．５１μｍで示されることが確認された。また、ＲｏｕｎｄｎｅｓｓおよびＳｏｌｉｄｉｔｙを確認した結果、実施例１における３Ｄスフェロイド型細胞凝集体のＲｏｕｎｄｎｅｓｓ平均値である０．８６９７（ＣＶ２．６４％）と同様に実験例１～３におけるスフェロイド型細胞凝集体もまたそれぞれ平均０．８７５１、０．８６６９、０．８６０１のＲｏｕｎｄｎｅｓｓ値を示し、実施例１における３Ｄスフェロイド型細胞凝集体のＳｏｌｉｄｉｔｙの平均値である０．９４８８（ＣＶ２．６４％）と同様に実験例１～３におけるスフェロイド型細胞凝集体もまたそれぞれ平均０．９７４４、１、０．９７５２値を示すことが確認された。
【0114】
このような結果は、マイクロウェル当たりの細胞数が２００、４００に変化し、マイクロウェルの直径が４００～８００に変化しても、実施例１の方法により同様の形態を有する３Ｄスフェロイド型細胞凝集体が効果的に形成され得ることを示す結果である。
【0115】
１３．３ ３Ｄスフェロイド型に由来のＥＶのｍｉＲＮＡ発現パターンの比較
実験例１～３の条件においても実施例１と同様の形態を有するスフェロイド型細胞凝集体が製造し得ることが確認されたので、さらにこれらから実施例１．３の方法で細胞外小胞を分離取得し、分離取得されたＥＶも同様のｍｉＲＮＡ発現パターンを示すかどうかを確認した。ｍｉＲＮＡ発現パターン比較は、マイクロウェルの条件を異にした実験例１および２の方法で製造されたスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を用いて確認した。発現ｍｉＲＮＡ分析は、実施例８と同様のｑＰＣＲ法により確認した。その結果を図１８に示す。実施例７にて製造された２Ｄ－ＥＶとｍｉＲＮＡ発現パターンを比較した。
実験例１～３の条件においても実施例１と同様の形態を有するスフェロイド型細胞凝集体が製造し得ることが確認されたので、さらにこれらから実施例１．３の方法で細胞外小胞を分離取得し、分離取得されたＥＶも同様のｍｉＲＮＡ発現パターンを示すかどうかを確認した。ｍｉＲＮＡ発現パターン比較は、マイクロウェルの条件を異にした実験例１および２の方法で製造されたスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を用いて確認した。発現ｍｉＲＮＡ分析は、実施例８と同様のｑＰＣＲ法により確認した。その結果を図１８に示す。実施例７にて製造された２Ｄ－ＥＶとｍｉＲＮＡ発現パターンを比較した。
【0116】
図１８に示すように、マイクロウェルの条件を直径５００、８００μｍに変化させても、実施例１で製造されたＥＶと同様に血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び免疫調節に効能を示すｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－２１０が既存の２Ｄ－ＥＶと比較して顕著な発現増加を示すことが確認された。このような結果は、直径２００～８００μｍのマイクロウェルを用いて本発明の方法によって得られる三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来のＥＶが、ｍｉＲＮＡマーカー発現特性を共通して示すことができることを表す結果である。したがって、これらはいずれも３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと称する場合がある。
【0117】
１３．４ ３Ｄスフェロイド型に由来のＥＶの血管新生効果の確認
直径２００～８００μｍのマイクロウェルを用いて、本発明の方法によって得られる３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの血管新生効果を確認するための実験を行った。実験群として実験例１及び２、実施例１の条件で製造された３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと、実施例７で製造された２Ｄ－ＥＶを用い、実施例１１と同様の方法でチューブ形成効果を確認した。その結果を図１９に示す。
直径２００～８００μｍのマイクロウェルを用いて、本発明の方法によって得られる３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの血管新生効果を確認するための実験を行った。実験群として実験例１及び２、実施例１の条件で製造された３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと、実施例７で製造された２Ｄ－ＥＶを用い、実施例１１と同様の方法でチューブ形成効果を確認した。その結果を図１９に示す。
【0118】
図１９に示すように、実験例１及び２、実施例１の条件で製造された３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ全部対照群及び２Ｄ－ＥＶに比べて著しく優れたチューブ形成の効果を示した。
【0119】
前記のような内容を総合すると、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは血管新生に関連するｍｉＲＮＡ、血管生成因子が高く発現され、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏに優れた血管生成能およびこれに伴う脳卒中改善効果が確認されるところ、血管の損傷および血管新生が必要な様々な疾患を予防または治療するのに優れた効果を示すことが予想される。
【0120】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ単に好ましい実施形態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことは自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む、血管新生促進用医薬組成物。
【請求項2】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、万能幹細胞、誘導万能幹細胞および胚幹細胞からなる群から選択されたいずれか一つ以上である、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項3】
前記（ａ）段階の三次元培養は、静的（ｓｔａｔｉｃ）培養をするものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項4】
前記（ａ）段階の三次元培養は、マイクロウェルに間葉系幹細胞を２００～６００細胞／ウェルの密度に分注し、培養するものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項5】
前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞および二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１８４、およびｍｉＲ－２１０からなる群から選択された1種以上を高発現するものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項6】
前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞および二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べてＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｉｆ－１ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）およびＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択された１種以上を高発現するものである、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項7】
前記血管新生促進用組成物は、火傷、潰瘍、虚血、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、心血管系疾患、脳血管性疾患および脱毛症からなる群から選択される１以上の予防または治療用である、請求項１に記載の血管新生促進用医薬組成物。
【請求項8】
前記血管新生促進用組成物は、脳血管新生促進用である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項9】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用食品組成物。
【請求項10】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を通じて製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む、血管新生促進用ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。
【請求項11】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍのマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；
を含む、三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞を含む血管新生促進用組成物の、製造方法。
【国際調査報告】