特表 2024-518411 ＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-01

(54)【発明の名称】ＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240423BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240423BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240423BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12P21/08

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/28

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568334

(86)(22)【出願日】2022-05-06

(85)【翻訳文提出日】2024-01-05

(86)【国際出願番号】 KR2022006521

(87)【国際公開番号】W WO2022235127

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】10-2021-0059596

(32)【優先日】2021-05-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523178145

【氏名又は名称】イミューンオンシア セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム，チョン クク

(72)【発明者】

【氏名】チョン，ア－ラ

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ヒョン ソク

(72)【発明者】

【氏名】パク，ジヒョン

(72)【発明者】

【氏名】パク，ジ ウン

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ジ－ヘ

(72)【発明者】

【氏名】シン，ヒウク

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ジイェ

(72)【発明者】

【氏名】ソン，スン グァン

(72)【発明者】

【氏名】キム，フン テ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ソン ホ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA05

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB41

4C085BB42

4C085BB50

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は二重特異性抗体に関する。本発明の二重特異性抗体はＰＤ－Ｌ１および／またはＣＤ４７を発現する腫瘍細胞に高い結合力を有することによって優秀な抗腫瘍効果を発揮し、最小化された血球凝集副作用を示す。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ４７に特異的に結合する第１抗原結合ドメインおよびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であって、
前記第１抗原結合ドメインは
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
前記第２抗原結合ドメインは
配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体。

【請求項2】

前記第１抗原結合ドメインは配列番号１の重鎖可変領域および配列番号３の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

前記第２抗原結合ドメインは（ｉ）配列番号５の重鎖可変領域および配列番号７の軽鎖可変領域を含むか（ｉｉ）配列番号９の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

前記二重特異性抗体はＦｃドメイン、ＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１抗体フラグメントおよびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

前記第１抗体フラグメントはＦａｂフラグメントであり、前記第２抗体フラグメントは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項４に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

前記第２抗体フラグメントはペプチドリンカーを通じて前記ＦｃドメインのＣ－末端に融合される、請求項４に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

前記二重特異性抗体はＦｃドメイン、ＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２個のＦａｂフラグメントおよびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２個のｓｃＦｖフラグメントを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

前記二重特異性抗体はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項9】

前記二重特異性抗体はＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

前記二重特異性抗体はＩｇＧ１の重鎖不変領域（ＣＨ）から由来したＦｃ領域を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

前記Ｆｃ領域はＩｇＧ１から由来した重鎖不変領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、ＣＨ３は配列番号１１を基準としてＥ２３９ＤおよびＭ２４１Ｌのアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

前記Ｆｃ領域はエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）に作用して免疫活性化効果を示す、請求項１０に記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

前記二重特異性抗体は前記ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントを含み、前記抗体フラグメントはペプチドリンカーを通じて前記ＦｃドメインのＣ－末端に融合される、請求項１０に記載の二重特異性抗体。

【請求項14】

前記単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）は配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。

【請求項15】

前記Ｆｃ領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体。

【請求項16】

前記二重特異性抗体はＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、または両方をすべて発現する癌細胞に特異的に結合する、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫およびＴ－細胞誘導されたリンパ腫からなる群から選択された癌腫の予防または治療に使うための、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項18】

請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載された二重特異性抗体を含む癌の予防または治療のための、薬学組成物。

【請求項19】

前記癌は卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨髄腫、神経母細胞－誘導されたＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ－細胞誘導された白血病、Ｔ－細胞誘導された白血病、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫、および肥満細胞誘導された腫瘍からなる群から選択されるものである、請求項１８に記載の薬学組成物。

【請求項20】

前記癌は乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫およびＴ－細胞誘導されたリンパ腫からなる群から選択される、請求項１８に記載の薬学組成物。

【請求項21】

請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載された二重特異性抗体を含む腫瘍細胞成長の抑制に使うための、薬学組成物。

【請求項22】

前記二重特異性抗体は抗癌化学療法剤、放射線治療および／または他の免疫抗癌剤とともに使用または併用投与される、請求項１８に記載の薬学組成物。

【請求項23】

乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫およびＴ－細胞誘導されたリンパ腫を含む多様な癌腫の予防または治療に使うための、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載された二重特異性抗体の用途。

【請求項24】

請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載された二重特異性抗体の有効量を癌の予防または治療を必要とする対象体に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法。

【請求項25】

請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載された二重特異性抗体の有効量を腫瘍細胞を有する対象体に投与する段階を含む、対象体で腫瘍細胞の成長を抑制する方法。

【請求項26】

請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載された二重特異性抗体を暗号化する、ポリヌクレオチド。

【請求項27】

請求項２６に記載されたポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項28】

請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載された二重特異性抗体を製造する方法であって、
前記二重特異性抗体の発現に適合した条件下で請求項２７に記載された宿主細胞を培養する段階および培養物から前記二重特異性抗体を回収する段階を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は二重特異性抗体に関する。具体的には、本発明はＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体、その用途および製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

体内免疫機能は抗原認知と同時に起こる同時刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）と同時抑制（ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）の信号を通じて調節される。ところで、癌細胞は腫瘍微細環境を変化させるか免疫機能を抑制して免疫攻撃を回避する。このような回避戦略の一つとして、免疫関門機能を変化させて免疫細胞の機能を抑制する。例えば、癌細胞はＰＤ－Ｌ１またはＣＤ４７のような特定細胞表面蛋白質を発現し、これらはＴ細胞または大食細胞のような免疫細胞と結合して免疫細胞の機能を抑制することになる。

【0003】

このようなメカニズムが明らかになったことにより、前記特定細胞表面蛋白質のような免疫関門蛋白質の活性を遮断して免疫細胞を活性化させて癌細胞を攻撃する免疫関門抑制剤の開発が活発になされており、ＰＤ－Ｌ１抑制剤としてテセントリク（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、イミフィンジ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、バベンチオ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）などの多様な抗－ＰＤ－Ｌ１単クローン抗体がＦＤＡ許可を得て市販中にあるか臨床段階にある。また、多くの抗－ＣＤ４７単クローン抗体が研究されているか臨床段階にある。

【0004】

しかし、免疫関門抑制剤は患者反応率が充分でないか副作用と低い生体利用率を示す問題点があり、新しい免疫関門抑制剤の開発が依然として要求されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は前述した問題点をすべて解決することをその目的とする。

【0006】

本発明はＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体を提供することを一目的とする。

【0007】

本発明はＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体の癌予防または治療用の用途を提供することを他の目的とする。

【0008】

本発明はＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体の癌予防または治療用薬剤の製造のための用途を提供することをさらに他の目的とする。

【0009】

本発明はＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体を含む薬学組成物を提供することをさらに他の目的とする。

【0010】

本発明はＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体を対象に投与する段階を含む癌の予防または治療のための方法を提供することをさらに他の目的とする。

【0011】

本発明はＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体を製造するためのポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞または方法を提供することをさらに他の目的とする。

【0012】

本発明の目的は、以上で言及した目的に制限されない。本発明の目的は、以下の説明でより明確となり、特許請求の範囲に記載された手段およびその組み合わせで実現されるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0013】

前記目的を達成するための本発明の代表的な構成は次の通りである。

【0014】

本発明の一態様によると、ＣＤ４７に特異的に結合する第１抗原結合ドメインおよびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であって、前記第１抗原結合ドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記第２抗原結合ドメインは配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体が提供される。

【0015】

特定の態様によると、二重特異性抗体は配列番号１の重鎖可変領域および配列番号３の軽鎖可変領域を含む第１抗原結合ドメイン、および配列番号５の重鎖可変領域および配列番号７の軽鎖可変領域を含む第２抗原結合ドメインを含む。

【0016】

特定の態様によると、二重特異性抗体はＦｃドメイン、ＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント）を含む。

【0017】

特定の態様によると、二重特異性抗体で、第２抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント）はペプチドリンカーを通じてＦｃドメインのＣ－末端に融合される。

【0018】

特定の態様によると、二重特異性抗体はＦｃドメイン、ＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２個のＦａｂフラグメントおよびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２個のｓｃＦｖフラグメントを含む。

【0019】

特定の態様によると、二重特異性抗体はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

【0020】

特定の態様によると、二重特異性抗体はＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントを含む。

【0021】

特定の態様によると、二重特異性抗体はＩｇＧ１の重鎖不変領域（ＣＨ）から由来したＦｃ領域を含む。

【0022】

特定の態様によると、二重特異性抗体のＦｃ領域はＩｇＧ１から由来した重鎖不変領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、ＣＨ３は配列番号１１を基準としてＥ２３９ＤおよびＭ２４１Ｌのアミノ酸置換を含む。前記Ｆｃ領域はエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）に作用して免疫活性化効果、特に増加した免疫活性化効果を示すことができる。

【0023】

特定の態様によると、二重特異性抗体は前記ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントを含み、前記抗体フラグメントはペプチドリンカーを通じて前記ＦｃドメインのＣ－末端に融合される。

【0024】

特定の態様によると、二重特異性抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）は配列番号９のアミノ酸配列を含む。

【0025】

特定の態様によると、二重特異性抗体のＦｃ領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0026】

特定の態様によると、二重特異性抗体はＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、または両方をすべて発現する癌細胞に特異的に結合する。

【0027】

本発明の他の態様によると、本発明の二重特異性抗体の乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫を含む多様な癌腫の予防または治療に使うための用途が提供される。

【0028】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体を含む乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫を含む多様な癌腫の予防または治療のための薬学組成物が提供される。

【0029】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体は抗癌化学療法、放射線治療および／または他の免疫抗癌剤と併用され得る。

【0030】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体の有効量を乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫を含む多様な癌腫の予防または治療を必要とする対象体に投与する段階を含む乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫を含む多様な癌腫の予防または治療方法が提供される。

【0031】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体の有効量を腫瘍細胞を有する対象体に投与する段階を含む対象体で腫瘍細胞の成長を抑制する方法が提供される。

【0032】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体を暗号化するポリヌクレオチドが提供される。

【0033】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。

【0034】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体を製造する方法であって、二重特異性抗体の発現に適合した条件下で二重特異性抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養する段階および培養物から二重特異性抗体を回収する段階を含む方法が提供される。

【発明の効果】

【0035】

本発明によると、ＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体は乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫を含む多様な癌腫の予防または治療に効果的に使われ得る。具体的には、本発明の二重特異性抗体は抗－ＣＤ４７抗体および／または抗－ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して優秀な抗原結合能、特にＣＤ４７抗原に対して遥かに高い結合能を有しつつ、ＲＢＣに対する低い結合能を維持した。これにより、本発明の二重特異性抗体はＣＤ４７および／またはＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に高い結合力を有することによって優秀な抗腫瘍効果を発揮したし、赤血球（ＲＢＣ）結合能は低くて最小化された血球凝集副作用を示すことが確認された。また、本発明の二重特異性抗体はＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性評価を通じてＰＤ－Ｌ１および／またはＣＤ４７を発現する細胞での癌抑制効果とＮＫ細胞およびＴ細胞活性化効果を示す。さらに、本発明の二重特異性抗体は後天性免疫細胞が欠如したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを利用した乳癌細胞株ＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルとＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＳＩＲＰαマウスを利用した大腸癌ＣＴ２６－ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４７細胞株Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃモデルで癌成長抑制効果があり、メモリーＴ細胞の生成による腫瘍再誘発抑制効果も証明された。したがって、本発明に係る二重特異性抗体は癌成長抑制効果と免疫細胞活性化効果を通じて、乳癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫を含む多様な癌腫の予防、改善または治療に効果的に使われ得る。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】本発明に係るＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体の概略的な模式図を示す。

【0037】

【図2】実施例１．２で製造された抗体の４％～２０％変性、還元および非還元、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す。分子量マーカーはキロダルトンで表示されている。

【0038】

【図3】実施例１．２で製造された抗体に対して観察された分析用ゲル－濾過溶離プロファイルを示す（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ；吸収波長：２１４ｎｍ；緩衝液：ホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）；温度（℃）：１９；流量（ｍｌ／ｍｉｎ）：０．７５；使われたＳＯＰ／ＷＩ：ＷＩ ＰＰ ２４．０；ロット番号：１２０５２０）。

【0039】

【図4A-B】それぞれＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体の単一および二重リガンド結合力をＥＬＩＳＡによって分析した結果を示す。

【0040】

【図5】それぞれＰＤ－Ｌ１豊富（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）腫瘍細胞およびＣＤ４７豊富腫瘍細胞に対する二重特異性抗体の結合力を示す。

【0041】

【図6A-D】それぞれＭＤＡ－ＭＢ－２３１のＷＴ、ＰＤ－Ｌ１ノックアウト（ＫＯ）、ＣＤ４７ ＫＯ、およびＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重ＫＯ細胞に対する二重特異性抗体の結合力を示す。

【0042】

【図7】二重特異性抗体に対してＲＢＣ結合検定を遂行した結果を示す。

【0043】

【図8】二重特異性抗体に対して血球凝集（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）検定を遂行した結果を示す。

【0044】

【図9】４種の細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ１９７５、ＲａｊｉおよびＳＲ７８６）に対する二重特異性抗体の食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）結果を示す。

【0045】

【図10A-B】二重特異性抗体に対してそれぞれＲａｊｉ細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞でＡＤＣＣ ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ検定を遂行した結果を示す。

【0046】

【図11】二重特異性抗体に対してＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞でＮＫ細胞のＡＤＣＣ検定を遂行した結果を示す。

【0047】

【図12】二重特異性抗体のＴ細胞活性化効果確認のためにＭＬＲ分析を遂行した結果を示す。

【0048】

【図13】実施例３．１～実施例３．３で言及されたマウスの腫瘍接種部位を示す。

【0049】

【図14】ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を移植したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで二重特異性抗体の癌成長抑制を確認した効能研究結果である。

【0050】

【図15】ＣＴ２６－ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４７腫瘍同種移植ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＳＩＲＰαマウスで二重特異性抗体の癌成長抑制を確認した効能研究結果である。

【0051】

【図16】実施例３．３の再誘発研究に関連した、ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＳＩＲＰαマウスのＣＴ２６－ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４７腫瘍同種移植モデルの処理における腫瘍体積曲線を示す。データは平均±ＳＥＭで提示される。

【発明を実施するための形態】

【0052】

後述する本発明についての詳細な説明は、本発明が実施され得る特定の具現例に関して特定図面を参照して記述されるであろうが、本発明はこれに限定されず、適切に説明されるのであれば、その請求項が主張するのと均等なすべての範囲とともに、添付された請求項によってのみ限定される。本明細書に使われた技術および学術用語は、別途に定義されない限り、本発明が属する分野で一般的に使われるものと同一の意味を有する。本明細書を解釈する目的で下記の定義が適用され、単数で使われた用語は適切な場合には複数型を含み、その反対も同様である。

【0053】

定義

【0054】

本明細書で使われる用語「抗原結合分子」は抗原決定因子に特異的に結合する分子を意味する。抗原結合分子の例には抗体、抗体フラグメントおよびスキャフォールド抗原結合蛋白質を含むがこれに制限されない。

【0055】

用語「抗体」とは、最も広い意味で使われて多様な抗体構造物、例えば非制限的に単クローン抗体、多クローン抗体、単一特異性または多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗原結合活性を有する抗体フラグメントおよび抗体融合体（例えば抗体と（ポリ）ペプチドの融合体または抗体と化合物の融合体）を含む。本明細書で、接頭辞「抗－」は抗原に関連した場合、該当抗体が該当抗原と反応性であることを意味する。特定抗原と反応性である抗体はファージまたは類似するベクターで組換え抗体ライブラリーの選別のような合成および／または組換え方法によって、または抗原または抗原－コード核酸を使った動物の免疫化によって生成され得るが、これに制限されない。代表的なＩｇＧ抗体は二硫化結合によって結合される２個の同一の重鎖および２個の同一の軽鎖で構成される。それぞれの重鎖および軽鎖は不変領域および可変領域を含む。重鎖可変領域（ＨＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＶＲ）はそれぞれ「相補性決定領域「（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と称される３個の切片を含み、これは主に抗原エピトープとの結合に関与する。これらはＮ－末端から順次数字が付けられて通常ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と指称される。ＣＤＲ外部の可変領域の中で、よりよく保存された領域は「骨格領域」（「ＦＲ」）と指称される。本明細書で抗体は、例えば動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。

【0056】

用語「単クローン抗体」は実質的に同種である抗体の集団から収得される抗体を意味する。すなわち、前記集団に含まれる個別的な抗体は、微量で存在する可能な変異体抗体（例えば、単クローン抗体製造時に天然的に発生する突然変異を有する抗体）を除いて、互いに同一であり／同一であるか同一のエピトープに結合する。典型的に異なる決定因子（エピトープ）に対して誘導された異なる抗体を含む多クローン抗体製剤とは対照的に、単クローン抗体製剤の各単クローン抗体は抗原上の単一の決定因子に対して誘導される。

【0057】

用語「単一特異性」抗体は各結合部位が同じ抗原の同じエピトープに結合する一つ以上の結合部位を有する抗体を意味する。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が２個以上の別個の抗原決定因子に特異的に結合できることを意味する。通常、二重特異性抗原結合分子は２個の抗原結合部位を含み、これらはそれぞれ異なる抗原決定因子に特異的である。一部の具現例で、二重特異性抗原結合分子は２個の抗原決定因子、例えば２個の別個の細胞上で発現された２個の抗原決定因子に同時に結合することができる。また、本願に記載された二重特異性抗原結合分子は多重特異性抗体の一部を形成することができる。

【0058】

用語「抗体フラグメント」は抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。抗体フラグメントの例にはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロス－Ｆａｂフラグメント、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体フラグメントと単一ドメイン抗体で形成された多重特異性抗体が含まれるがこれに限定されはしない。

【0059】

用語「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」は免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域が共有結合で連結されてＶＨ－ＶＬ異種二量体を形成した融合蛋白質を指称する。前記重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）は直接連結されるか、ＶＨのＮ－末端とＶＬのＣ－末端を連結するか、ＶＨのＣ－末端とＶＬのＮ－末端を連結するペプチドリンカーによって連結される。

【0060】

用語「抗原結合ドメイン」は抗原決定因子に特異的に結合する抗原結合分子の部分を意味する。抗原結合ドメインは例えば一つ以上の可変領域によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含むことができる。

【0061】

用語「Ｆｃ領域」は免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域を示し、それぞれの鎖でヒンジ領域の一部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる同種二量体を意味する。Ｆｃ領域は酵素パパインを使った消化によって生産された無損傷抗体（例えば、ＩｇＧの一部）を示す。一具現例で、「Ｆｃ領域」は天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。「天然配列Ｆｃ領域」は自然で一般的に発見されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示す。本発明でＦｃ領域は天然型と実質的に同等であるか向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部または全体重鎖不変領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含んだ拡張されたＦｃ領域であり得る。また、ＣＨ２および／またはＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。例えば、本発明でＦｃ領域は、１）ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、２）ＣＨ１およびＣＨ２、３）ＣＨ１およびＣＨ３、４）ＣＨ２およびＣＨ３、５）ＣＨ１～ＣＨ３のうち１個または２個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）の組み合わせ、または６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であり得る。また、本発明でＦｃ領域は天然型アミノ酸配列だけでなく、この配列の変異体を含む。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列のうち一つ以上のアミノ酸残基が結実、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。

【0062】

用語「ＣＤ４７」は癌細胞の表面にある蛋白質として知られており、大食細胞のＳＩＲＰαと結合して「Ｄｏ－ｎｏｔ－ｅａｔ－ｍｅ」信号を送ることによって大食細胞の食菌作用を遮断するものとして知られている蛋白質を指称する。

【0063】

用語「ＰＤ－Ｌ１」は癌細胞の表面にある蛋白質として知られており、Ｔ細胞の表面にある蛋白質であるＰＤ－１と結合してＴ細胞が癌細胞を攻撃できないようにする蛋白質を指称する。

【0064】

用語「リンカー」は１～１００個、具体的には２～５０個、より具体的には５～３０個のアミノ酸の長さのペプチドリンカーを指称し得る。前記リンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｐなどからなる群から選択された１種以上のアミノ酸を含むものであり得るが、これに限定されない。一例として、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎで表現されるものであり得、前記ｎは（ＧＧＧＧＳ）単位体の反復回数であって、二重特異性抗体の効能を考慮して、１～１０、具体的には１～５であり得る。さらに他の例として、前記リンカーは抗体フラグメントドメインを連結できるものとして知られているペプチドフラグメントであり得、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を有することができる。

【0065】

用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は相互に交換可能に使われ、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を利用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体（例えば、ペプチド核酸および非自然発生ヌクレオチド類似体）、およびこれらのハイブリッドを含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。一具現例で、本発明の核酸分子は抗体、またはこのフラグメント、誘導体、ミューテインまたは変異体をエンコードする連続的なオープンリーディングフレームを含む。

【0066】

用語「対象体」は「患者」と相互交換的に使われ、癌の予防または治療を必要とする哺乳動物、例えば、霊長類（例：ヒト）、伴侶動物（例：犬、猫など）、家畜動物（例：ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）および実験室動物（例：ラット、マウス、ギニーピッグなど）であり得る。本発明の一具現例で、対象体はヒトである。

【0067】

用語「治療」は、一般的に目的とする薬理学的効果および／または生理学的効果を収得することを意味する。このような効果は疾病および／またはこのような疾病による副作用を部分的にまたは完全に治癒する点で治療的効果を有する。好ましい治療的効果は疾患の発生または再発防止、症状の好転、疾患の任意の直接または間接的な病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行速度の減少、疾患状態の好転または緩和、および快方または改善された予後を含むがこれに制限されない。好ましくは、「治療」はすでに現れた疾患または障害の医療的介入を意味し得る。

【0068】

用語「予防」は予防的治療、すなわち疾病を治療するよりは予防するための効果を収得することを意味する。「予防」は疾病またはこの症状を部分的にまたは完全に予防するという観点で、目的とする予防的な薬理学的効果および／または生理学的効果を収得することを意味する。

【0069】

用語「投与」は、対象体に予防的または治療的目的を達成するための物質（例えば、本発明の二重特異性抗体）を提供することを意味する。

【0070】

本発明の二重特異性抗体

【0071】

本発明はＣＤ４７に特異的に結合する第１抗原結合ドメインおよびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２抗原結合ドメインを含む新規の二重特異性抗体を提供する。前記抗体はＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、または両方をすべて発現する癌細胞に特異的に結合することができ、結合親和度、生物学的活性、免疫細胞活性化、標的化効能、腫瘍再誘発抑制能および減少した副作用のような特に有利な特徴を有する。

【0072】

本発明の一態様によると、ＣＤ４７に特異的に結合する第１抗原結合ドメインおよびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であって、前記第１抗原結合ドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記第２抗原結合ドメインは配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体が提供される。

【0073】

一部の具現例で、ＣＤ４７に特異的に結合する第１抗原結合ドメインは配列番号１の重鎖可変領域および配列番号３の軽鎖可変領域を含み／含むか、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２抗原結合ドメインは配列番号５の重鎖可変領域および配列番号７の軽鎖可変領域を含むことができる。特に、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第２抗原結合ドメインは配列番号９の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むことができる。

【0074】

一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体はＦｃ領域、前記ＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１抗体フラグメント、および前記ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２抗体フラグメントを含むことができる。

【0075】

一部の具現例で、前記第１抗体フラグメントはＦａｂフラグメントであり得る。

【0076】

一部の具現例で、前記第２抗体フラグメントは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。

【0077】

一部の具現例で、前記Ｆｃ領域はエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）に作用して免疫活性化効果を示すことができる。好ましくは、前記Ｆｃ領域はＩｇＧ１の重鎖不変領域（ＣＨ）から由来し得る。より好ましくは、前記Ｆｃ領域はＩｇＧ１から由来した重鎖不変領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、またはＩｇＧ１から由来した重鎖不変領域ＣＨ２およびＣＨ３を含むことができる。最も好ましくは、前記Ｆｃ領域のＣＨ３は配列番号１１を基準としてＥ２３９ＤおよびＭ２４１Ｌのアミノ酸置換を含むことができる。

【0078】

一部の具現例で、前記Ｆｃ領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。

【0079】

一部の具現例で、前記第２抗体フラグメントは前記Ｆｃ領域のＣ－末端に融合され得る。より具体的には、前記第２抗体フラグメントは重鎖可変領域を通じて（すなわち、第２抗体フラグメントのＮ－末端が）Ｆｃ領域のＣ－末端に融合され得る（図１参照）。この時、第２抗体フラグメントはリンカーを通じてＦｃ領域のＣ－末端に融合され得る。前記リンカーはペプチドリンカーであり得、例えばＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳまたはＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳのアミノ酸配列を有することができる。

【0080】

一部の具現例で、前記第２抗体フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域がリンカーを通じて連結された可変領域（例えば、単鎖可変フラグメントｓｃＦｖ）を含むことができる。一例として、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎで表現されるペプチドリンカーであり得、前記ｎは（ＧＧＧＧＳ）単位体の反復回数であって、二重特異性抗体の効能を考慮して、１～１０、具体的には１～５であり得る。好ましくは、前記第２抗体フラグメントはｓｃＦｖフラグメントであり得る。より好ましくは、前記ｓｃＦｖフラグメントは配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。

【0081】

一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体はＦｃドメイン、ＣＤ４７に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２個のＦａｂフラグメント、およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２個のｓｃＦｖフラグメントを含むことができる。この時、各ｓｃＦｖフラグメントはそのフラグメントの重鎖可変ドメインがペプチドリンカーを通じて（各Ｆａｂフラグメントの重鎖に連結された）ＦｃドメインのＣ末端に融合され得る。

【0082】

一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体はＣＤ４７に特異的に結合し、２個の抗体重鎖および２個の抗体軽鎖を含む全長抗体およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント）を含み、前記抗体フラグメントの重鎖可変領域が前記全長抗体の重鎖のＣ－末端に直接またはペプチドリンカーを通じて融合され得る。

【0083】

一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体は前記ＣＤＲ配列、重鎖可変領域配列および／または軽鎖可変領域配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有する配列を含むことができる。

【0084】

特定の具現例で、本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が考慮される。例えば、抗体の結合親和度および／または他の生物学的特性を改善することが好ましいと言える。抗体のアミノ酸配列変異体は分子をエンコードするヌクレオチド配列内に適切な変形を導入することによって、またはペプチド合成によって製造され得る。そのような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の結実、および／またはそのようなアミノ酸配列内への残基の挿入および／またはそのようなアミノ酸配列内での残基の置換を含む。最終構成物に到達するように、結実、挿入および置換を含む多様な変更の任意の組み合わせが遂行され得るが、最終構成物は所望する特性、例えば、抗原－結合特性を保有しなければならない。置換突然変異誘発のための関心がある部位は重鎖可変領域（ＨＶＲ）および骨格領域（ＦＲ）を含む。保存的置換は表１に「好ましい置換」という項目の下に提供されており、以下にアミノ酸側鎖部類（１）～（６）に関連して追加で記述されている。アミノ酸置換は関心がある分子および所望する活性、例えば、維持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣあるいはＣＤＣに対してスクリーニングされた生成物に導入され得る。

【0085】

【表1】

【0086】

アミノ酸は通常の側鎖の性質により次のようにグループ化され得る：

【0087】

（１）疏水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；

【0088】

（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；

【0089】

（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；

【0090】

（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；

【0091】

（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；

【0092】

（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．

【0093】

非－保存的置換はこのような部類のうち一つの構成員を他の部類に交換することを伴う。

【0094】

本明細書で用語「アミノ酸配列変異体」は、母抗体結合分子（例えば、ヒト化あるいはヒト抗体）の一つ以上の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、追加研究のために選択された生成された変異体は母抗体結合分子に比べて特定の生物学的特性の変形、例えば改善（例えば、増加した親和度、減少した免疫原性）を有し／有するか、母抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に維持するであろう。例示的な置換変異体は親和度成熟抗体であり、これは、例えば、当業界で公知のファージディスプレイ－基盤親和度成熟技法を利用して便利に生成され得る。簡略に言うと、一つ以上のＨＶＲ残基が突然変異され、変異体抗原結合分子がファージ上にディスプレイされて特定生物学的活性（例えば、結合親和度）がスクリーニングされる。特定の具現例で、置換、挿入または結実は、そのような変更が抗原に結合する抗原結合分子の能力を実質的に減少させない限り、一つ以上のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和度を実質的に減少させない保存的変更（例えば、本明細書に提供されたような保存的置換）がＨＶＲでなされ得る。

【0095】

アミノ酸配列挿入は、単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入だけでなく、長さが一つの残基から百個以上の残基を含むポリペプチドに達する範囲であるアミノ－末端および／またはカルボキシル－末端融合を含むことができる。末端挿入の例には、Ｎ－末端メチオニル残基を有する抗体を含む。分子の他の挿入変異体は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドのＮ－末端またはＣ－末端への融合を含むことができる。また、分子の他の挿入変異体は脳血管障壁（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）の通過を容易にするためのポリペプチドのＮ－末端またはＣ－末端への融合を含むことができる。

【0096】

核酸、ベクター、宿主細胞および製造方法

【0097】

本発明の二重特異性抗体は当業界で知られている任意の抗体生成技術によって製造され得る。

【0098】

本発明の他の態様によると、本発明で記述された二重特異性抗体またはそのフラグメントを暗号化する単離された核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が提供される。このような核酸は前記二重特異性抗体の重鎖可変領域または重鎖ＣＤＲ領域が含まれたアミノ酸配列および／または軽鎖可変領域または軽鎖ＣＤＲ領域が含まれたアミノ酸配列を暗号化することができる。

【0099】

一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体は全体抗原結合分子を暗号化する単一ポリヌクレオチドまたは共同－発現される複数のポリヌクレオチドによって発現され得る。複数のポリヌクレオチドによって暗号化されるポリペプチドは、例えば二硫化結合や機能的抗原結合分子を形成する他の手段を通じて結合することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は免疫グロブリンの重鎖部分から分離したポリヌクレオチドによって暗号化され得る。共同－発現される場合、前記重鎖ポリペプチドは免疫グロブリンを形成するための軽鎖ポリペプチドと結合するであろう。

【0100】

一具現例で、前記ポリヌクレオチドは配列番号２の配列および配列番号４の配列を含むことができる。また、前記ポリヌクレオチド配列は配列番号１２の配列を含むことができる。

【0101】

他の具現例で、前記ポリヌクレオチドは配列番号６の配列および配列番号８の配列を含むことができる。また、前記ポリヌクレオチド配列は配列番号１０の配列を含むことができる。

【0102】

さらに他の具現例で、前記ポリヌクレオチドは配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列であり得るかこれらを含むことができる。

【0103】

さらに他の具現例で、前記ポリヌクレオチドは本発明の二重特異性抗体を暗号化するポリヌクレオチドと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または約１００％の同一性を有する核酸配列を含むことができる。

【0104】

他の具現例で、前記ポリヌクレオチドは本発明に係る二重特異性抗体に含まれたポリペプチドを暗号化することができる。

【0105】

本発明のさらに他の態様によると、前記核酸が含まれた一つまたはそれ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。用語「ベクター」は核酸に連結されたさらに他の核酸を細胞に導入させるのに使われ得る核酸である。ベクターの一類型は追加核酸セグメントが結紮され得る線状または円形の二本鎖ＤＮＡ分子を指称する「プラスミド」である。さらに他の類型のベクターはウイルスベクター（例えば、複製不能レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ－関連ウイルス）であり、この場合、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに導入され得る。特定ベクターはこれらが導入される宿主細胞内で自主的に複製することができる（例えば、バクテリア複製原点を含むバクテリアベクターおよびエピゾーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピゾーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞に導入時、宿主細胞のゲノムに統合されて前記宿主ゲノムとともに複製される。「発現ベクター」は選択されたポリヌクレオチドの発現を誘導できるベクターの一類型である。

【0106】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体を暗号化する一つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。前記宿主細胞は原核または真核細胞であり得る。例えば、前記宿主細胞はチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球細胞であり得る。糖化などが必要でない場合、バクテリアで抗体が作られ得る。

【0107】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体の発現に適合した条件下で前記宿主細胞を培養する段階、および培養物から二重特異性抗体を回収する段階を含む本発明の二重特異性抗体を製造する方法が提供される。

【0108】

二重特異性抗体の組換え生産のために、例えば前記に記述された二重特異性抗体を暗号化するポリヌクレオチドを分離し、宿主細胞内で追加クローニングおよび／または宿主細胞内部での発現のために一つまたはそれ以上のベクター内に挿入される。このような核酸は当業界で知られている通常の過程を利用して分離またはシーケンシングすることができる。

【0109】

前記形質転換された細胞を培養する方法は当業界で広く知られている方法を利用して遂行できる。例えば、前記形質転換体を栄養培地で培養することによって二重特異性抗体を大量で生産することができ、培地と培養条件は宿主細胞により慣用のものを適切に選択することができる。培養時、細胞の生育と蛋白質の大量生産に適合するように温度、培地のｐＨおよび培養時間などの条件を適切に調節することができる。

【0110】

前記二重特異性抗体を回収するために、免疫グロブリンの精製のために当業界で公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（イオン交換、親和性（例：ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、大きさ排除など）、遠心分離、差別溶解度または蛋白質精製のための他の標準技術が使われ得る。

【0111】

予防または治療方法

【0112】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体は予防または治療方法で利用され得る。

【0113】

一部の具現例で、治療される疾患は増殖性障害であり、特に癌であり得る。特に、本発明の二重特異性抗体は癌の増殖、生存、転移および再発を抑制するために利用され得る。

【0114】

一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体の有効量を腫瘍細胞を有する対象体に投与する段階を含む対象体で腫瘍細胞の成長を抑制する方法が提供される。一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体の有効量を癌の予防または治療を必要とする対象体に投与する段階を含む癌の予防または治療のための方法が提供される。

【0115】

一部の具現例で、前記癌は固形癌または血液癌であり得る。

【0116】

一部の具現例で、前記癌は卵巣癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、肺癌、骨髄腫、神経母細胞－誘導されたＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ－細胞誘導された白血病、Ｔ－細胞誘導された白血病、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫、および肥満細胞誘導された腫瘍からなる群から選択され得るが、これに制限されない。好ましくは、前記癌は卵巣癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫およびＴ－細胞誘導されたリンパ腫からなる群から選択されたいずれか一つであり得る。

【0117】

本発明に係る二重特異性抗体は局所または全身治療が要望されるかどうかおよび治療される領域により多様な方式で投与され得る。二重特異性抗体を対象体に投与する方法は、投与目的、発病部位、対象体の状態などにより変わり得る。投与経路は非経口、吸入、局所または局部投与（例えば病変内投与）であり得る。例えば非経口投与は静脈内、皮下、腹腔内、肺内、動脈内、筋肉内、直腸、膣内、関節内、前立腺内、鼻内、眼球内、膀胱内、脊椎腔内投与または心室内投与（例えば脳室内投与）を含むことができるがこれに制限されない。また、併用される場合、本発明の二重特異性抗体と追加免疫抗癌剤は同じ経路で投与され得るか互いに異なる経路で投与され得る。

【0118】

前記方法で、本発明に係る二重特異性抗体の有効量は個体（患者）の年齢、性別、体重により変わり得、一般的には体重ｋｇ当り約０．０１ｍｇ～１００ｍｇ、または５ｍｇ～約５０ｍｇが１日１回～数回に分けて投与され得る。しかし、投与経路および期間、疾病の重症度、性別、体重、年齢などによって増減され得るため、本発明の範囲はこれに限定されない。

【0119】

一部の具現例で、本発明の二重特異性抗体は抗癌化学療法剤、放射線治療および／または他の免疫抗癌剤（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４抗体など）とともに使用または併用投与され得る。このような併用治療法は併用投与（２個以上の治療的製剤が同一または別個の組成物に含まれる投与）および個別投与を含み、そのような場合、二重特異性抗体の投与が追加治療剤／治療法の適用／使用以前に、同時に、および／または続けて起こり得る。

【0120】

薬学組成物

【0121】

本発明のさらに他の態様によると、本発明の二重特異性抗体を含む薬学組成物が提供される。前記二重特異性抗体は組成物に予防的または治療的有効量で含まれ得る。

【0122】

一部の具現例で、前記薬学組成物は癌の増殖、生存、転移および再発を抑制するために対象体に投与され得る。したがって、前記薬学組成物は癌の予防または治療のために対象体に投与され得る。この時、前記薬学組成物は抗癌化学療法剤、放射線治療および／または他の免疫抗癌剤（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４抗体など）とともに使用または併用投与され得る。このような併用治療法は併用投与（２個以上の治療的製剤が同一または別個の組成物に含まれる投与）および個別投与を含み、そのような場合、二重特異性抗体の投与が追加治療剤／治療法の適用／使用以前に、同時に、および／または続けて起こり得る。

【0123】

一部の具現例で、前記癌は固形癌または血液癌であり得る。

【0124】

一部の具現例で、前記癌は卵巣癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、肺癌、骨髄腫、神経母細胞－誘導されたＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ－細胞誘導された白血病、Ｔ－細胞誘導された白血病、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫、Ｔ－細胞誘導されたリンパ腫、および肥満細胞誘導された腫瘍からなる群から選択されるが、これに制限されない。好ましくは、前記癌は卵巣癌、肺癌、Ｂ－細胞誘導されたリンパ腫およびＴ－細胞誘導されたリンパ腫からなる群から選択されたいずれか一つであり得る。

【0125】

本発明の薬学組成物を製造するために、本発明の二重特異性抗体は製薬上許容される坦体および／または賦形剤と混合され得る。薬学組成物は凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で製造され得る。例えば、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８４）］を参照する。

【0126】

許容される坦体および／または賦形剤（安定化剤を含む）は使われる容量および濃度で対象体に無毒性であり、バッファー（例えばホスフェート、シトレートまたは他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはメチオニン）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０以下の残基）ポリペプチド；蛋白質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性重合体（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成反対イオン（例えばナトリウム）；金属錯体（例えばＺｎ－蛋白質錯体）；および（または）非イオン系界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むことができ、これに制限されない。

【0127】

本発明の薬学組成物はその投与経路により当業界で公知の適合した形態で製剤化され得る。

【0128】

本明細書で用語「予防的または治療的有効量」または「有効量」は対象体の癌を予防または治療するのに有効な組成物の有効成分の量であって、医学的処置に適用可能な合理的な特典／危険割合で癌を予防または治療するのに充分であり副作用を起こさない程度の量を意味する。前記有効量の水準は患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬品の活性、薬品に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、配合または同時使用される薬品を含んだ要素およびその他医学分野で広く知られている要素により決定され得る。この時、前記の要素をすべて考慮して最小限の副作用または副作用なしに最小限の量で最大の効果を得られる量を投与することが重要であり、これは通常の技術者によって容易に決定され得る。

【0129】

具体的には、本発明の薬学組成物で有効成分の有効量は個体（患者）の年齢、性別、体重により変わり得、一般的には体重ｋｇ当り約０．０００１ｍｇ～１００ｍｇ、０．００１～５０ｍｇ、または５ｍｇ～約５０ｍｇが１日１回～数回に分けて投与され得る。しかし、投与経路および期間、疾病の重症度、性別、体重、年齢などによって増減され得るため、本発明の範囲はこれに限定されない。

【実施例】

【0130】

以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳細に説明する。下記の実施例は本発明の理解を助けるために提示されたもので、いずれの方式であれ、この範囲を制限しようとする意図ではなく、制限しようとするものとして解釈されてはならない。

【0131】

実施例１．ＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体の製造

【0132】

実施例１．１．ＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体の製造に使われた配列およびこれを含有するベクターの作製

【0133】

図１に示したような構造を有する抗体の製造のために、このような抗体の重鎖のヌクレオチド配列（配列番号１５）および軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号１６）をそれぞれ含有するベクターの作製をＦｕｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｌｃ．（北アイランドベルファスト素材）に依頼した。

【0134】

実施例１．２．ＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体の生産および精製

【0135】

実施例１．１で作製されたベクターの一時的トランスフェクションをチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株で遂行した。回分式培養後、発現した抗体を細胞培養上清液から精製した。引き続き、下記の表２に示したような指定された基準を充足するかどうかを確認するために、精製された抗体に対して品質制御（ＱＣ）分析を完了した。

【0136】

【表2】

【0137】

前記トランスフェクション、精製および品質制御分析に対する具体的な手続きは次の通りである。実施例１．１で作製されたベクターを哺乳類一時発現プラスミドであるｐＥＴＥ Ｖ２（Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）にクローニングした。抗体をＣＨＯ基盤一時発現システムを使って発現させ、生成された抗体含有細胞培養上清液を遠心分離および濾過によって精製した。抗体を親和度クロマトグラフィーを通じて細胞培養上清液から精製した（最新ＡＫＴＡクロマトグラフィー装備を使用）。精製された抗体をホスフェート緩衝食塩水溶液内に緩衝液交換した。抗体の純度は還元および変性ソディウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲルによって判断される通り、＞９５％であると確認された（図２）。図２で、それぞれのレーンは下記の表３に示した通りである。

【0138】

【表3】

【0139】

抗体を大きさ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析してクロマトグラムを得た（図３）。クロマトグラムは一つの主要ピークを示した（総面積は９５％を超過する）。図３に示したクロマトグラムに対する積分結果を下記の表４に示した（対照蛋白質の滞留体積（データは提示されない）を基準とする）。単量体分画に相応するピークは＞９８％であった。

【0140】

【表4】

【0141】

バクテリア内毒素水準はＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）－ＰＴＳシステムおよびＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）－ＰＴＳカートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使って決定した。抗体濃度は２８０ｎｍで吸光度を測定したし、１．０ｍｇ／ｍｌ＝１．６３のＡ２８０である理論的吸光係数を利用して計算することによって決定した。提供された精製抗体生成物に関する詳細な事項を表５に要約した。

【0142】

【表5】

【0143】

表５から分かるように、所望する抗体が指定された基準に符合する程度に成功裏に発現し精製されたことが分かる。このように製造されたＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体は、以下「ＩＭＣ－２０１」とも指摘される。

【0144】

このように製造された抗体は次のような重鎖および軽鎖可変およびＣＤＲ配列を有する。Ｆｃ領域は配列番号１１のアミノ酸配列を有する（配列目録参照）。

【0145】

【表6】

【0146】

製造例１．抗－ＰＤ－Ｌ１単クローン抗体および抗－ＣＤ４７単クローン抗体の製造

【0147】

本製造例で製造された単クローン抗体は内在性汚染物質を含まない同種性組換えポリペプチドを指称する。

【0148】

まず、抗－ＰＤ－Ｌ１単クローン抗体の製造のために、アメリカ特許第１０，１１８，９６３号の可変領域配列（配列番号１および配列番号２）を使った。ヒトＩｇＧ１不変領域配列を連結して軽鎖および重鎖抗体配列を完成し、当業界で公知の任意の発現システムを使って前記抗体を製造した。具体的には、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株で抗体をエンコードする核酸を含む組換え発現ベクターを使って一時的発現を通じて宿主細胞から回収した上清液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製して前記抗体を製造した。

【0149】

次に、抗－ＣＤ４７単クローン抗体の製造のために、アメリカ特許第１０，０３５，８５５号の公開された可変領域配列（配列番号２２および配列番号８）を使った。ヒトＩｇＧ４不変領域配列を連結して軽鎖および重鎖抗体配列を完成し、当業界で公知の任意の発現システムを使って前記抗体を製造した。具体的には、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株で抗体をエンコードする核酸を含む組換え発現ベクターを使って一時的発現を通じて宿主細胞から回収した上清液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製して前記抗体を製造した。

【0150】

このように製造された抗－ＰＤ－Ｌ１単クローン抗体および抗－ＣＤ４７単クローン抗体は、以下でそれぞれ「ＩＭＣ－００１」および「ＩＭＣ－００２」と指称される。

【0151】

実施例２．ＩＭＣ－２０１の抗原結合能および活性評価（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）

【0152】

実施例２．１．ＥＬＩＳＡによるリガンド結合能の確認

【0153】

まず、ＩＭＣ－２０１の単一リガンド（ＰＤ－Ｌ１）結合力を、次のようにＥＬＩＳＡで測定した。ＩＭＣ－２０１およびＩＭＣ－００１を連続希釈し（０．０１～６００ｎｇ／ｍｌ、３倍希釈）、７５ｎｇ／ｗｅｌｌでプレートに事前コーティングされた組換えヒトＰＤ－Ｌ１と共にインキュベーションした。ＨＲＰ－接合抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（＃１０９－０３５－０９８）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ Ｌａｂ）をＩＭＣ－２０１およびＩＭＣ－００１の検出に使った。

【0154】

引き続き、ＩＭＣ－２０１の単一リガンド（ＣＤ４７）結合力をＥＬＩＳＡで測定した。ＩＭＣ－２０１およびＩＭＣ－００２を連続希釈し（０．０１～６００ｎｇ／ｍＬ、３倍希釈）、５０ｎｇ／ｗｅｌｌでプレートに事前コーティングされた組換えヒトＣＤ４７と共にインキュベーションした。ＨＲＰ－接合抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的抗体をＩＭＣ－２０１およびＩＭＣ－００２の検出に使った。

【0155】

次に、ＩＭＣ－２０１の二重リガンド（ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７）同時結合力を次のようにＥＬＩＳＡで測定した。ＩＭＣ－２０１、ＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２を連続希釈し（０．０９～１８００ｎｇ／ｍｌ、３倍希釈）、それぞれ１００μＬ当たり５０ｎｇ／ｗｅｌｌでプレートに事前コーティングされた組換えヒトＣＤ４７－ｆｃとともにインキュベーションした。洗浄後５０ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度で組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとともにインキュベーションし、ＨＲＰ－接合抗－ｈｉｓフラグメント特異的抗体をＩＭＣ－２０１、ＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２の検出に使った。

【0156】

その結果、ＰＤ－Ｌ１単クローン抗体であるＩＭＣ－００１のＥＣ_５０値（ｎｇ／ｍｌ）は０．９８９と測定され、ＩＭＣ－２０１は７．２４０と測定された（図４ａの左側の図）。また、ＣＤ４７単クローン抗体であるＩＭＣ－００２のＥＣ_５０値は２．７６９と測定され、ＩＭＣ－２０１は４．０９１と測定された（図４ａの右側の図）。一方、ＩＭＣ－２０１の二重リガンド同時結合力の測定結果、ＩＭＣ－２０１二重抗体のみ特異的にＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１に同時にすべて結合することが確認された（ＥＣ_５０：１７．３８０ｎｇ／ｍｌ、図４ｂ）。結論的に、ＩＭＣ－２０１は単クローン抗体であるＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２と類似する結合能を示すことを確認した。

【0157】

実施例２．２．腫瘍細胞に対する結合能の確認

【0158】

腫瘍細胞に対するＩＭＣ－２０１の細胞結合力を次のように測定した。

【0159】

ＰＤ－Ｌ１発現が高いＨ１９７５細胞株（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－５９０８）およびＣＤ４７発現が高いＪｕｒｋａｔ細胞株（ＡＴＣＣ ＃ＴＩＢ－１５２）を、それぞれ３倍希釈されたＩＭＣ－２０１、ＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２とともに４℃で１時間の間インキュベーションし、これらの結合強度をフローサイトメトリー（ＢＤ ＃ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）で測定した。

【0160】

その結果、ＥＬＩＳＡ結果とは異なって細胞に対する結合力はＩＭＣ－２０１がＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２と比較して優勢であると確認された（図５）。

【0161】

実施例２．３．ノックアウト（ＫＯ）細胞株に対する結合能の確認

【0162】

ノックアウト安定細胞株に対するＩＭＣ－２０１の細胞結合力を次のように測定した。

【0163】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ－２６）とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を利用してノックアウトさせることによって得たＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｇｍａ）ＫＯ、ＣＤ４７（Ｓｉｇｍａ）ＫＯ、およびＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７二重ＫＯ細胞を、それぞれ３倍希釈されたＩＭＣ－２０１、ＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２とともに４℃で１時間の間インキュベーションした。結合強度をフローサイトメトリーで測定した。

【0164】

その結果、ＣＤ４７ ＫＯ細胞ではＩＭＣ－２０１の結合能が母抗体であるＩＭＣ－００１と類似するように測定されたが、ＰＤ－Ｌ１ ＫＯ細胞ではＩＭＣ－２０１の結合能が母抗体であるＩＭＣ－００２に比べて顕著に高く測定された。結論的に、前記実施例２．２で確認されたように、ＩＭＣ－２０１がＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２対比腫瘍細胞に対する結合力が優勢な理由はＩＭＣ－２０１のＣＤ４７に対する結合能がＣＤ４７に対する単クローン抗体より遥かに高い結合力を有するためであることを確認することができた（図６ａ～図６ｄ）。

【0165】

実施例２．４．ＲＢＣ結合能検定

【0166】

ヒト赤血球（ＲＢＣ）に対するＩＭＣ－２０１の細胞表面結合を次のように測定した。この時、抗－ＣＤ４７抗体であるＩＭＣ－００２およびＨｕ５Ｆ９（文献［Ｌｉｕ Ｊ、ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ４７ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（９）：ｅ０１３７３４５］により製造）を比較抗体で使った。

【0167】

健康な供与者（ｎ＝３）から得たヒトＲＢＣ（５×１０^５細胞）を３倍希釈されたＩＭＣ－２０１または他の比較抗体（ＩＭＣ－００２およびＨｕ５Ｆ９）と共にインキュベーションし、これらの結合強度をフローサイトメトリーを利用して抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）２次抗体の幾何学的平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって決定した。アイソタイプ対照群としてｈＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ ＃Ｉ５０２９）およびｈＩｇＧ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０３７０２）を３００μｇ／ｍｌ濃度で処理した。各供与者に対する実験を２重で実行し、３人の供与者からのＭＦＩの平均をエラーバーを使ってグラフで示した。ＥＣ_５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５で非線形回帰を通じて計算した。

【0168】

その結果、比較抗体であるＨｕ５Ｆ９は高いＲＢＣ結合力を示すのに反して、ＩＭＣ－２０１はＲＢＣ結合力を殆ど示さず、これはアイソタイプ対照群および単クローン抗体であるＩＭＣ－００２と差がなかった。したがって、ＩＭＣ－２０１は癌細胞に対する結合力は高いが（図５）、ＲＢＣに対する結合力は低いと確認された（図７）。

【0169】

実施例２．５．血球凝集検定

【0170】

健康な供与者（ｎ＝３）からのヒト赤血球を１Ｘ ＤＰＢＳで１０分の１に希釈し、表示された濃度のＩＭＣ－２０１および他の比較抗体（ＩＭＣ－００２およびＨｕ５Ｆ９）と共に３７℃で一晩中インキュベーションした。

【0171】

その結果、比較抗体であるＨｕ５Ｆ９は高い血球凝集度を示すのに反して、ＩＭＣ－２０１は血球凝集度を殆ど示さなかった。対照群であるブランク、アイソタイプ対照群と比較時にも類似する結果であり、単クローン抗体であるＩＭＣ－００２とも類似する結果であることを確認した。前記実施例２．４で確認されたようなＲＢＣに対する低い結合力を反映しているかのように、ＩＭＣ－２０１は血球凝集度を殆ど示さないと確認された（図８）。

【0172】

実施例２．６．食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）確認

【0173】

単球由来大食細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＭＤＭ）を抗体の存在下で２時間の間、１：１の比でＣＦＳＥ－標識ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ１９７５、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－８６）およびＳＲ７８６（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ３６９）細胞とそれぞれ共同培養した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の場合、ＩＭＣ－００２およびＩＭＣ－２０１は５、１０μｇ／ｍｌ濃度で処理したし、Ｈ１９７５細胞の場合ＩＭＣ－００２およびＩＭＣ－２０１は０．３７、１．１１、３．３３μｇ／ｍｌ濃度で処理した。Ｒａｊｉ細胞の場合にはＩＭＣ－００２およびＩＭＣ－２０１は０．０４、０．１２、０．３７μｇ／ｍｌ濃度で処理し、Ｒ７８６細胞の場合にはＩＭＣ－００２およびＩＭＣ－２０１は０．０１、０．０４、０．１２μｇ／ｍｌ濃度で処理した。

【0174】

腫瘍細胞に対する大食細胞食菌作用を試験抗体の存在下でフローサイトメトリーによって評価した。大食細胞は生きている単一ＣＤ１１ｂ＋細胞と定義される。食菌作用％はＣＦＳＥ＋である大食細胞の百分率で定義される。

【0175】

その結果、４種の細胞においてすべてがＩＭＣ－２０１の食菌作用はＩＭＣ－００２対比同等であるかそれ以上であると確認され、特にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＨ１９７５細胞ではＩＭＣ－２０１の食菌作用が顕著に高く示された（図９）。

【0176】

実施例２．７．腫瘍細胞のＡＤＣＣ活性評価

【0177】

ＡＤＣＣ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ＿Ｇ７０１８）を利用してＡＤＣＣ活性を評価した。標的細胞Ｒａｊｉは試験当日、標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はプレートに一晩中事前コーティングした。ＡＤＣＣ生物検定標的細胞を抗体（ＩＭＣ－２０１、ＩＭＣ－００１、ＩＭＣ－００２またはＡｖｅｌｕｍａｂ）の存在下で１時間の間４℃で共同インキュベーションした。この時、前記抗体を、Ｒａｊｉ細胞は連続４倍、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では連続７倍希釈で処理した。洗浄を通じてターゲット細胞に結合していない抗体はすべて除去後、エフェクター細胞と６時間の間５％ＣＯ_２インキュベーターで共同インキュベーションした。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を使ってルシフェラーゼを定量化した。

【0178】

その結果、ＡＤＣＣはＣＤ４７を発現する細胞（Ｒａｊｉ）ではＩＭＣ－２０１のみが効果を示す驚くべき結果を示した（図１０ａ）。また、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７をすべて発現する細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）ではＩＭＣ－２０１が最も高い効果を示した（図１０ｂ）。

【0179】

実施例２．８．プライマリＮＫ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ＮＫ ｃｅｌｌ）のＡＤＣＣ活性評価

【0180】

ＣＤ１０７ａ脱顆粒評価でプライマリＮＫ細胞のＡＤＣＣを評価した。標的細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に抗体（ＩＭＣ－００１、ＩＭＣ－２０１）を０．１、１、１０μｇ／ｍｌ濃度で３０分の間事前処理し、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞（エフェクター細胞）と１：１比率（標的細胞：エフェクター細胞）で４時間の間３７℃５％ＣＯ_２インキュベーターで共同培養した。共同培養を始めてＣＤ１０７ａを染色し、１時間後ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（モネンシンを含む、購入先：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を処理した。以後、ＮＫ細胞マーカーを染色してフローサイトメトリーで生きているＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）内ＣＤ１０７ａ％でＡＤＣＣを評価した。

【0181】

その結果、ＩＭＣ－２０１によるＮＫ細胞の活性は競争薬物と同等で（データは提示されない）あり、すべての濃度においてＩＭＣ－００１対比顕著に優秀であることを確認した（図１１）。ＮＫ細胞活性の増加はＩＭＣ－２０１による先天的免疫（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）活性が増加することを示す。

【0182】

実施例２．９．抗体によるＴ細胞活性確認（ＭＬＲ分析）

【0183】

樹状細胞とＴ細胞を利用したＭＬＲ（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）分析を通じて抗体によるＴ細胞の活性を確認した。ＣＤ１４＋単球で単細胞誘導樹状細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ｍｏＤＣ）を分化させ、ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）でＣＤ４＋Ｔ細胞を分離用キット（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ＃１７９５２）で分離して確保した。５日間ＩＭＣ－００１またはＩＭＣ－２０１（０．００１～１０μｇ／ｍＬ、１０倍希釈）の存在下で単細胞誘導樹状細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞を１：１０の割合で共に培養して確保された細胞の培養液でＩＦＮ－γ発現をＥＬＩＳＡで確認した。

【0184】

その結果、ＩＭＣ－２０１の濃度に依存的にＩＦＮ－γが増加することを確認した（図１２）。ＩＭＣ－２０１は母抗体であるＩＭＣ－００１と類似する効能を示したし、ＭＬＲ分析でＩＦＮ－γの発現増加は腫瘍微細環境で癌細胞に対する細胞毒性を増加させて癌を抑制する可能性を提示する。

【0185】

実施例３．ＩＭＣ－２０１の効果確認（ｉｎ ｖｉｖｏ）

【0186】

実施例３．１．乳癌細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルで癌成長抑制効果

【0187】

ＩＭＣ－２０１の生体内効能研究のためにＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞株を解凍および培養し、この細胞を４０匹の後天性免疫細胞が欠如されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（入手先：Ｃｈｅｍｏｎ）それぞれに１×１０^７細胞／２００μｌで図１３に示した部位１に皮下接種した。

【0188】

細胞接種後１７日目に、平均腫瘍大きさが９０．８９ｍｍ^３に到達した時、マウスを無作為で下記の表７に示したように５つのグループに割り当てた。各グループには８匹のマウスが含まれた。試験物質の投与をＤ０に開始した。試験物質は一週間に一度（総５回）腹腔内投与した。

【0189】

腫瘍体積と体重をＤ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１、Ｄ２５、Ｄ２８、Ｄ３２、Ｄ３９、Ｄ４６およびＤ５３に測定した。腫瘍体積は下記の式を使ってｍｍ^３で表現した：ＴＶ＝０．５ａ×ｂ^２（ここで、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である）。

【0190】

データは平均±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表現した。二つのグループ間の比較のために、独立標本Ｔ検定（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ－Ｓａｍｐｌｅｓ Ｔ ｔｅｓｔ）を遂行した。すべてのデータはＳＰＳＳバージョン１８．０で分析した。Ｐ＜０．０５が統計的に有意なものと見なされた。

【0191】

乳癌細胞株を移植した効能研究は次のように設計した：

【0192】

【表7】

【0193】

効能研究を遂行した結果に関連して、腫瘍成長曲線を基準とした腫瘍成長抑制を図１４に示した。

【0194】

前記結果から次のような事項が確認された。効能研究終点である６５日目で、アイソタイプ対照群（Ｇ１、ＩｇＧ１ ｋａｐｐａ、２１．４ ｍｐｋ、ＱＷХ５ｗ）と比較して、ＩＭＣ－００１（Ｇ２、２．１ ｍｐｋ、ＱＷ×５ｗ）グループで腫瘍体積（ＴＧＩｔｖ＝４２．７０％）に有意な差がなかった。反面、対照群と比較してＩＭＣ－００２（Ｇ３、２．１ ｍｐｋ、ＱＷ×５ｗ）グループでは腫瘍体積（ＴＧＩｔｖ＝５１．１２％）に有意な差を示した（Ｐ＜０．０５^＊）。また、ＩＭＣ－００１とＩＭＣ－００２の併用－処理グループ（Ｇ４、２．１ ｍｐｋ＋２．１ ｍｐｋ、ＱＷХ５ｗ）およびＩＭＣ－２０１－処理グループ（Ｇ５、３ ｍｐｋ、ＱＷХ５ｗ）でも腫瘍体積に対するＴＧＩ値はそれぞれ６７．１４％、９２．７８％を示して有意な差を示した（Ｐ＜０．０１^＊＊）。特に、ＩＭＣ－２０１－処理グループは腫瘍成長抑制効果が最も顕著に示された。

【0195】

実施例３．２．大腸癌細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルで癌成長抑制効果

【0196】

ＩＭＣ－２０１の生体内効能研究のための大腸癌細胞株はＣＴ２６－ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４７であり、これはＣＴ２６ ＷＴ細胞（Ｋｅｒａｆａｓｔ、Ｃａｔ Ｎｏ：ＥＮＨ２０４）のマウスＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７遺伝子をノックアウトさせ、常時発現するヒトＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７遺伝子を挿入することによって生成されてフローサイトメトリーによって確認されたものである。

【0197】

ＣＴ２６－ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４７細胞を解凍および継代培養し、この細胞を４８匹のＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＳＩＲＰαマウス（購入先：ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）それぞれに２×１０^６細胞／１００μＬで図１３に示した部位３に皮下接種した。

【0198】

細胞接種後７日目に、平均腫瘍大きさが９９．９２ｍｍ^３に到達した時、マウスを無作為で下記の表８に示したように５つのグループに割り当てた。各グループには８匹のマウスが含まれた。グループ化当日は０日目（Ｄ０）で表示された。試験物質の投与をＤ０に始めた。試験物質は一週間に二回（総４回）腹腔内投与した。腫瘍体積と体重をＤ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１、Ｄ２５、Ｄ２８、Ｄ３２、Ｄ３９、Ｄ４６およびＤ５３に測定した。腫瘍体積は下記の式を使ってｍｍ^３で表現した：ＴＶ＝０．５ａ×ｂ^２（ここで、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である）。

【0199】

データは平均±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表現した。二つのグループ間の比較のために、独立標本Ｔ検定（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ－Ｓａｍｐｌｅｓ Ｔ ｔｅｓｔ）を遂行した。すべてのデータはＳＰＳＳバージョン１８．０で分析した。Ｐ＜０．０５が統計的に有意なものと見なされた。

【0200】

大腸癌細胞株を移植した効能研究は次のように設計した：

【0201】

【表8】

【0202】

前記試験物品の中で、アイソタイプ対照群はＩｇＧ１ ｋａｐｐａ（Ｃｒｏｗｎｂｉｏ）である。

【0203】

効能研究を遂行した結果に関連して、腫瘍成長曲線を基準とした腫瘍成長抑制を図１５に示した。

【0204】

前記結果から次のような事項が確認された。効能研究終点で、アイソタイプ対照群Ｇ１（ＩｇＧ１ ｋａｐｐａ、２１．４ ｍｐｋ、ＢＩＷ×２ｗ）と比較して、Ｇ３（ＩＭＣ－００２投与グループ、２．１ ｍｐｋ、ＢＩＷ×２ｗ）の腫瘍体積（ＴＧＩｔｖ Ｄ２８＝２７．０８％）および腫瘍重さ（ＴＧＩｔｗ＝２１．１１％）は有意でない差を示した。また、Ｇ１と比較して、Ｇ４（ＩＭＣ－００１＋ＩＭＣ－００２併用処理グループ、２．１ ｍｐｋ＋２．１ ｍｐｋ、ＢＩＷ×２ｗ）の腫瘍体積（ＴＧＩｔｖ Ｄ２８＝２７．３７％）および腫瘍重さ（ＴＧＩｔｗ＝２６．９３％）も有意でない差を示した。反面、Ｇ１と比較して、ＩＭＣ－００１処理グループ（Ｇ２、２．１ ｍｐｋ、ＢＩＷ×２ｗ）の腫瘍体積（ＴＧＩｔｖ Ｄ２８＝３８．６０％）および腫瘍重さ（ＴＧＩｔｗ＝４１．４３％）は有意な差を示した（Ｐ＜０．０５^＊）。さらにＧ５（ＩＭＣ－２０１、３ ｍｐｋ、ＢＩＷ×２ｗ）の腫瘍体積（ＴＧＩｔｖ Ｄ２８＝８３．５７％）および腫瘍重さ（ＴＧＩｔｗ＝８２．９８％）は統計的に有意性が高く示された（Ｐ＜０．００１＊^＊＊）。すべての治療剤投与群で異常体重変化が観察されず、ＩＭＣ－２０１投与によって有意な水準で癌成長抑制が観察され、母抗体であるＩＭＣ－００１およびＩＭＣ－００２の単独処理群と併用処理群対比高い水準の癌成長抑制効果が確認された。

【0205】

実施例３．３．再誘発研究

【0206】

再誘発研究は、実施例３．２の効能研究グループ化後５３日目にＣＴ２６－ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４７腫瘍細胞を各マウスに２×１０^６細胞／１００μＬで図１３に示した部位４に皮下接種することによって遂行した。再誘発研究終点は８８日目と推定された。再誘発研究終点で、マウスと腫瘍の写真を撮影し、腫瘍の重さを測定した。再誘発研究を遂行した結果に関連して、多様なグループの時間経過にともなう平均腫瘍体積変化を図１６に示した。

【0207】

前記結果から次のような事項が確認された。研究終点である８８日目に、Ｇ１（Ｇ１：ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＳＩＲＰαマウス）、Ｇ５（３ ｍｐｋ（ＢＩＷ×２ｗ）ＩＭＣ－２０１処理された腫瘍退行マウス）の平均腫瘍体積はそれぞれ３２３３．７４ｍｍ^３および０ｍｍ^３であった。対照群グループ（Ｇ１）と比較して、Ｇ５（３ ｍｐｋ（ＢＩＷ×２ｗ）ＩＭＣ－２０１処理された腫瘍退行マウス）グループは有意な腫瘍抑制効果を示した。効能研究グループ化後５３日目にＩＭＣ－２０１抗体を投与していないマウス（Ｇ１）に対しては腫瘍生成が起きた。反面、ＩＭＣ－２０１抗体によって腫瘍が抑制されたマウス（Ｇ５）は、既に移植した部位の反対側に癌細胞を再び移植した後、抗体の再投与がなくても腫瘍が生成されないことを確認したし、６匹で完全寛解（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ、ＣＲ）を観察した。

【0208】

これを通じて、ＩＭＣ－２０１（３ ｍｐｋ）は同一腫瘍再誘発研究でメモリーＴ細胞の生成による腫瘍の再誘発抑制効果があることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】