▶ ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイションの特許一覧
特表2024-518422アレルギーおよび炎症状態を治療するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】アレルギーおよび炎症状態を治療するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240423BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240423BHJP
A61K 31/64 20060101ALI20240423BHJP
A61K 31/10 20060101ALI20240423BHJP
A61K 31/355 20060101ALI20240423BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20240423BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240423BHJP
C07K 14/33 20060101ALN20240423BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20240423BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61K38/08
A61K31/64
A61K31/10
A61K31/355
A61K38/48
A61P37/08
C07K14/33
C07K14/54
C07K14/47
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023568451
(86)(22)【出願日】2022-05-06
(85)【翻訳文提出日】2024-01-09
(86)【国際出願番号】 US2022028151
(87)【国際公開番号】W WO2022236107
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】63/185,912
(32)【優先日】2021-05-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501102988
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション
【住所又は居所原語表記】１ｓｔ Ｆｌｏｏｒ Ｇａｒｄｎｅｒ Ｓｔｅｅｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，１３０ Ｔｈａｃｋｅｒａｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ １５２６０，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ファロ ジュニア．，ルイーズ ディー．
(72)【発明者】
【氏名】コルクマズ，エムルラー
(72)【発明者】
【氏名】サンプター，ティナ エル．
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C206
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA17
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA23
4C084CA17
4C084DC09
4C084MA63
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA341
4C084ZA342
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZB131
4C084ZB132
4C086AA01
4C086BA09
4C086DA21
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA63
4C086NA14
4C086ZB13
4C206AA01
4C206JA32
4C206KA01
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA83
4C206NA14
4C206ZB13
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA02
4H045EA20
(57)【要約】
本明細書では、対象に薬学的有効量の肥満細胞脱感作組成物を投与することを含む、対象の炎症を軽減する組成物および方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の炎症を治療する方法であって、前記対象に、薬学的有効量の肥満細胞脱感作組成物を投与することを含む、方法。
【請求項2】
対象におけるＩ型過敏症反応を治療する方法であって、前記対象に、薬学的有効量の肥満細胞脱感作組成物を投与することを含む、方法。
【請求項3】
前記Ｉ型過敏症反応が、喘息、鼻炎、結膜炎および皮膚炎からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記皮膚炎が乾癬、湿疹または脂漏性皮膚炎である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記湿疹がアトピー性皮膚炎である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記Ｉ型過敏症反応が、アナフィラキシー、蕁麻疹および血管浮腫からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記対象に１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原を投与することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原が、前記肥満細胞脱感作組成物と同じ皮膚微小環境に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｉ型過敏症反応が食物アレルギーまたは薬物アレルギーである、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｉ型過敏症反応がピーナッツアレルギーであり、前記Ｉ型過敏症反応抗原がピーナッツ抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記肥満細胞が結合組織肥満細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記肥満細胞が粘膜肥満細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記肥満細胞脱感作組成物がＡＢＣＡ１阻害剤を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＡＢＣＡ１阻害剤が、グリブリド、プロブコール、トコフェルソランおよびビタミンＥの群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＡＢＣＡ１阻害剤がグリブリドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記肥満細胞脱感作組成物がニューロキニンＡを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記ニューロキニンＡが、ＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（配列番号２）の配列またはその機能的断片を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記肥満細胞脱感作組成物がボツリヌス毒素Ａである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記対象にＩＬ－１０を投与することをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記投与が皮内または経皮である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
投与が１つまたは複数のマイクロニードルを介して行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記１つまたは複数のマイクロニードルが溶解可能である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年５月７日に出願された米国仮出願第６３／１８５，９１２号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月７日に出願された米国仮出願第６３／１８５，９１２号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0002】
連邦政府支援の研究または開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所により支援される、助成金番号ＡＲ０６８２４９；ＡＲ０７１２７７およびＡＲ０６７２５０に基づく政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所により支援される、助成金番号ＡＲ０６８２４９；ＡＲ０７１２７７およびＡＲ０６７２５０に基づく政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
【0003】
本開示は、アレルギーおよび炎症性疾患を処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
肥満細胞（ＭＣ）は、皮膚を含む脈管組織において免疫応答を開始および増幅する。皮膚常在ＭＣは、定常状態ではＦｃεＲＩ結合ＩｇＥでプライミングされており、多価性の抗原（Ａｇ）に応答する用意ができている。Ａｇに暴露されると、ＦｃεＲＩによって開始されたシグナル伝達が、エキソサイトーシス依存的および非依存的な機構を介して、あらかじめ形成された、顆粒化プロテアーゼおよびサイトカイン、ならびに脂質メディエータの即時放出を誘導する。下流のＳＴＡＴ５およびＮＦκＢの活性化は、ＴＮＦおよびＩＬ－１３を含む炎症性サイトカインおよびＴｈ２促進サイトカインの合成を促進する。累積的に、この応答は抗蠕虫および抗細菌免疫応答を開始し、アレルギー性炎症を持続させる。
【0005】
皮膚ＭＣはＣＧＲＰ＋またはＰＧＰ－５＋感覚神経線維に近接して存在する。ＭＣ－神経シナプス内では双方向の情報伝達があり、局所的なＩｇＥ誘発免疫応答の結果を歪めている。この点に関して、感覚神経線維はサブスタンスＰ（ＳＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、およびニューロキニンＡ（ＮＫＡ）を含む神経ペプチドを放出する。ＳＰおよびＣＧＲＰはＭＣおよび皮膚で広く研究されているが、ＮＫＡの免疫機能についてはほとんど知られていない。
【0006】
ニューロキニンＡはＴａｃ１遺伝子から転写され、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であるＮＫ２Ｒと相互作用する。ＮＫＡおよびＮＫ２Ｒは炎症促進作用および抗炎症作用を有することが報告されている。粘膜組織では、ＮＫ２Ｒシグナル伝達は炎症と関連している。しかし、皮膚では、ＮＫ２Ｒ拮抗作用はアレルギー性接触過敏症（ＣＨＳ）を増強し、ＮＫＡ投与はＣＨＳを遮断する。ＭＣに特異的に、ＮＫＡは肺の粘膜ＭＣからのヒスタミン放出を誘導するが、皮膚、心臓、または腹膜ＭＣの結合組織ＭＣからはヒスタミン放出を誘導しないことから、ＭＣ活性化におけるＮＫＡ／ＮＫ２Ｒの組織特異的役割が示唆される。
【0007】
必要なのは、肥満細胞および／または肥満細胞成分を標的とする、または調節する炎症反応および／またはＩ型過敏症反応の効果的な治療法である。
【発明の概要】
【0008】
本明細書では、ＮＫＡがマウス受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）モデルおよび骨髄（ＢＭ）ＭＣおよび腹膜（Ｐ）ＭＣを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、皮膚におけるＩｇＥ誘導性ＭＣ機能に影響を及ぼすという仮説を検証している。そのデータから、ＰＣＡ誘導前にＮＫＡを投与することによって、ＩＬ－１０依存的にｉｎ ｖｉｖｏでの脱顆粒関連性浮腫および炎症性サイトカインレベルが低減することが示された。同様に、ＮＫＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＩＬ－１０依存的にＭＣの活性化を阻害した。本明細書では、ＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方が、グリブリド感受性ＡＢＣＡ１を介してＩＬ－１０分解プロテアーゼであるカルパインを放出し、この経路がＮＫＡによって阻害されることが示された。その結果、ＮＫＡはＩＬ－１０の分解を阻害し、それによって微小環境におけるＩＬ－１０の利用可能性を延長させた。重要なことに、本明細書において、ＮＫＡをバイパスしてＡＢＣＡ１を直接標的とすることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＭＣ活性化を阻害するのに十分であることが実証された。
【0009】
したがって、本明細書において提供されるのは、対象における炎症を治療する方法、および対象に薬学的有効量の肥満細胞脱感作組成物を投与することを含む、対象におけるＩ型過敏症反応を治療する方法である。
【0010】
いくつかの実施形態において、Ｉ型過敏症反応は、喘息、鼻炎、結膜炎、および皮膚炎からなる群から選択される。
【0011】
いくつかの実施形態において、皮膚炎は乾癬、湿疹または脂漏性皮膚炎である。
【0012】
いくつかの実施形態において、湿疹はアトピー性皮膚炎である。
【0013】
いくつかの実施形態において、Ｉ型過敏症反応は、アナフィラキシー、蕁麻疹、および血管浮腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本方法は、対象に１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原を投与することをさらに含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原は、肥満細胞脱感作組成物と同じ皮膚微小環境に投与される。
【0015】
いくつかの実施形態において、Ｉ型過敏症反応は、食物アレルギーまたは薬物アレルギーである。
【0016】
いくつかの実施形態において、Ｉ型過敏症反応は食物アレルギーであり、本方法は、対象に食物の抗原を投与することをさらに含む。
【0017】
いくつかの実施形態において、食物はピーナッツである。
【0018】
いくつかの実施形態において、肥満細胞は結合組織肥満細胞である。
【0019】
いくつかの実施形態において、肥満細胞は粘膜肥満細胞である。
【0020】
いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、ＡＢＣＡ１阻害剤を含む。
【0021】
いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１阻害剤は、グリブリド、プロブコール、トコフェルソラン、およびビタミンＥの群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１阻害剤は、グリブリドである。
【0022】
いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、ニューロキニンＡを含む。
【0023】
いくつかの実施形態において、ニューロキニンＡは、ＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（配列番号２）の配列またはその機能的断片を有する。いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、ボツリヌス毒素Ａである。
【0024】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象にＩＬ－１０を投与することをさらに含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、投与は、皮内または経皮である。
【0026】
いくつかの実施形態において、投与は、１つまたは複数のマイクロニードルを介して行われる。
【0027】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のマイクロニードルは溶解可能である。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1-1】図１（Ａ－Ｇ）は、ＮＫＡがＰＣＡの初期段階および後期段階を阻害することを示す。ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスの耳に、ｄ０にビヒクルまたはＩｇＥを注射した。ｄ１にマウスに架橋Ａｇを注射（ｉ．ｖ．）した。（Ａ）Ａｇ投与２４時間後にマウスを安楽死させ、Ａｇ投与２４時間後の組織でＮＫＡを検出した。データはそれぞれ２～４匹のマウスによる２回の独立した実験からの平均±１ ＳＥＭを示す。（Ｂ）皮膚切片におけるＮＫ２Ｒの発現を免疫蛍光顕微鏡で評価した。（Ｃ－Ｇ）マウスを、架橋Ａｇ投与の３時間前にビヒクル（ＰＢＳ）またはＮＫＡ（１０ｍｇ、ｉ．ｄ．）で前処理した。（Ｃ）ｄ０と比較したＡｇ投与後の指示された時間における耳厚の変化。データはそれぞれ４～６匹のマウスを用いた２～３回の独立した実験による１２～１５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。（Ｄ、Ｆ）ＰＣＡ誘導後２時間および２４時間の皮膚切片からの顕微鏡像。画像は各群３匹のマウスの代表的なものである。Ｈ＆Ｅ、２００倍（Ｅ）架橋Ａｇ投与の９０分後に組織から抽出したエバンスブルー色素、各群３匹のマウスによる３回の独立した実験。（Ｇ）皮膚ホモジネートにおけるサイトカインの半定量的発現。ヒートマップは、３回の独立した実験からの、ビヒクル対照に対して正規化したタンパク質の相対発現を示す。表は、ＩｇＥで処理した皮膚とＮＫＡで前処理した皮膚（ＩｇＥ＋ＮＫＡ）とを比較した統計的有意性を示す。ｐ値は、２元配置分散分析（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニ事後分析、または対応ありｔ検定によって決定した。
【図2-1】図２（Ａ－Ｆ）は、ＮＫＡがＳＴＡＴ５転写サイトカインの放出を阻害することを示す。ＢＭＭＣにＩｇＥ（１．０ｍｇ／ｍＬ）を負荷した後、架橋Ａｇ（ＤＮＰ－ＨＳＡ １００ｎｇ／ｍＬ）を用いて、ＮＫＡ（指示通りまたは１０００ｎＭ）の併用または非併用で活性化した。（Ａ）活性化の２２～２４時間後に回収した細胞非含有上清中のＩＬ－１３およびＴＮＦレベル。（Ｂ）６０分間活性化した細胞からのＩＬ１３またはＴＮＦ ＲＮＡ。データは３回の独立した実験からの平均発現を示す。（Ｃ－Ｄ）ｐＴｙｒ６９４－ＳＴＡＴ５は、Ａｇ（上のパネル）を用いた、ＮＫＡ（下のパネル）併用または非併用で示された時間活性化した後、フローサイトメトリーで検出した。（Ｃ）は代表的なフロープロットを示し、数字は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、網掛けヒストグラムは未刺激細胞からのｐＴｒｙ６９４－ＳＴＡＴ５を示す。（Ｄ）は３回の独立した実験からのｐＴｙｒ６９４－ＳＴＡＴ５のＭＦＩを要約する。（Ｅ－Ｆ）ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで評価したＳＴＡＴ５Ｂの核局在。（Ｅ）ＮＫＡの存在下または非存在下で６０分間活性化した後の５細胞からの代表的解析。（Ｆ）３回の独立した実験からの類似性スコア（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）の平均値±１ ＳＥＭ。ｐ値は、２ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析、または対応ありｔ－検定によって決定した。
【図3-1】図３（Ａ－Ｉ）は、ＩＬ－１０がＮＫＡがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＦｃｅＲＩ誘導性ＭＣ活性化を抑制するのに必要であることを示している。（Ａ－Ｄ）ＭＣを図２と同様に活性化した。（Ａ）２０～２４時間後に回収した上清からのＥＬＩＳＡによるＩＬ－１０。（Ｂ）６０分間活性化した細胞からのＩＬ１０ ＲＮＡ。（Ｃ－Ｄ）活性化から２０～２４時間後に回収した（Ｃ）ＢＭＭＣまたは（Ｄ）ＰＭＣからの上清で検出されたサイトカイン。（Ｅ）ビヒクル対照またはＮＫＡを、ＭＣ欠損マウス（Ｍｃｐｔ５ Ｃｒｅ＋ｘ Ｒｏｓａ２６ ＤＴＡ＋）またはＭＣ充足マウス（Ｍｃｐｔ５ Ｃｒｅ－ ｘ Ｒｏｓａ２６ ＤＴＡ＋）のいずれかに注射し、３時間後にＩＬ１０発現を評価した。データは各群２～３匹のマウスを用いた２回の実験を示す。（Ｆ－Ｈ） Ｍｃｐｔ５ Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ＷＴおよびＭｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ｆｌ／ｆｌマウスにおいてＰＣＡを誘導した。（Ｆ）は２時間後と２４時間後の耳の測定値を示し、（Ｈ）は２４時間後にＥＬＩＳＡによって皮膚で検出されたサイトカインを示す。（Ｉ） ＷＴ Ｂ６皮膚、ＩＬ－１０ ＫＯマウス、またはＩｇＥ注射時にＩＬ－１０（１．０ ｎｇ／耳）で処理したＢ６マウスの皮膚ホモジネート中のニューロキニンＡをＰＣＡ後２４時間のＥＬＩＳＡで検出した。データは各群２～３匹のマウスを用いた２回の独立した実験による平均±ＳＥＭである。２回の独立した実験での、ＮＫＡ ＥＬＩＳＡについては、１実験当たり２～３匹のマウス、Ｂ６およびＩＬ１０ ＫＯについては、Ｂ６＋ＩＬ１０については１つの実験から３匹のマウスの平均±ＳＥＭ。ｐ値は、２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析、または対応ありｔ検定によって決定した。
【図4-1】図４（Ａ－Ｈ）は、ＮＫＡがＭＣセクレトームを変化させることを示している。（Ａ－Ｄ）ＩｇＥを負荷したＭＣを、架橋Ａｇ（ＩｇＥ＋Ａｇ）で活性化するか、またはビヒクル（対照）と共に３０分間培養した。（Ａ）ＢＭＭＣおよび（Ｂ）ＰＭＣについて、ＬＡＭＰ－１およびアビジン染色を示す代表的なフロープロットが図示されている。（Ｃ、Ｆ）３回の独立した実験からの平均陽性率±１ ＳＥＭを要約した。（Ｅ－Ｈ）ＢＭＭＣを６０分間活性化した。上清をＭＳ／ＭＳで分析した。ベン図は、検出された特有のペプチドおよび重複ペプチドの数を示す。（Ｆ）Ｐａｔｈｗａｙ解析はＰａｎｔｈｅｒで行った。（Ｇ）３回の独立したランからのカバレッジエリアの半定量的表現。（Ｈ）３回の独立した実験からの定量。ｐ値は、２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析によって決定した。
【図5-1】図５（Ａ－Ｈ）は、ＮＫＡがＩＬ－１０分解酵素であるカルパインの放出を阻害することを示している。（Ａ－Ｂ）ＩｇＥ＋Ａｇを用いて、ＮＫＡの併用または非併用で６０分間活性化した（Ａ）ＢＭＭＣまたは（Ｂ）ＰＭＣにおいてカルパイン活性を評価した。（Ｃ－Ｄ）組換え（ｒ）カルパインは、ｒＩＬ－１０と共に６０分間インキュベートした。ＩＬ－１０はウェスタンブロットで検出した。（Ｃ）は代表的なブロットを示し、（Ｄ）は３回の独立した実験から、ＩＬ－１０＋カルパインのデンシトメトリーをＩＬ－１０単独に対して正規化することにより算出したＩＬ－１０分解の比率を要約したものである。（Ｅ）ＩｇＥで活性化したＢＭＭＣの細胞非含有上清を指示した時間に回収し、ＩＬ－１０およびカルパイン活性をアッセイした。（Ｆ）活性化１０分後に上清を回収した後、ＥＬＩＳＡでＩＬ－１０をアッセイする前にＡｃ－ｃａｌ（２０ｍｇ／ｍＬ）で３０分間パルスした。２～３回の実験から回収したＩＬ－１０の量を示す。（Ｇ）３回の独立した実験からＢＭＭＣを活性化してから６０分後に回収されたＩＬ－１０。（Ｈ）活性化３０分後に上清を回収した後、ｒＩＬ－１０で３０分間パルスした。ＥＬＩＳＡで回収したＩＬ－１０の量を、ＩＬ－１０でパルスした培地から回収したＩＬ－１０の量に対して正規化した。データは３回の独立した実験の、指示した点における平均±ＳＥＭを示す。ｐ値は、２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローに事後分析により決定した。
【図6-1】図６（Ａ－Ｈ）は、ＡＢＣＡ１排出チャネルの阻害が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫＡの効果と重複することを示している。（Ａ－Ｂ）ビヒクル対照（ＰＢＳ）またはＮＫＡ（１０００ｎＭ）の存在下でのＩｇＥ誘導性活性化から３０分後のＢＭＭＣまたはＰＭＣ表面上のＡＢＣＡ１の発現。（Ａ）は代表的なフロープロットを示し、数値はＡＢＣＡ１＋細胞の割合を示し、（Ｂ）は３回の独立した実験からのＩｇＥ誘導性活性化後のＡＢＣＡ１＋細胞の割合の平均±ＳＥＭを要約する。（Ｃ）ＢＭＭＣは、活性化前にビヒクル対照（「０」、０．０１２５％ＤＭＳＯ）またはグリブリドで１０分間処理した。活性化３０分後に上清を回収し、カルパイン活性およびＩＬ－１０についてアッセイした。（Ｄ）ＢＭＭＣまたはＰＭＣをビヒクルまたはグリブリド（５０ｍＭ）で前処理した後、ＩｇＥで３０分間活性化し、抗ＬＡＭＰ－１またはアビジンで染色した。グラフは陽性細胞の割合の平均±ＳＥＭを示す。（Ｅ）ＢＭＭＣまたはＰＭＣをＩｇＥ活性化し、ビヒクル対照（０．０１２５％ＤＭＳＯ）またはグリブリド（ＢＭＭＣについては示す通り、ＰＭＣについては５０ｍＭ）およびＮＫＡ（１０００ｎＭ）の存在下で２０～２４時間培養した。上清はＥＬＩＳＡでアッセイした。（Ｆ－Ｈ）誘導の３時間前にグリブリド（２．５ ｍｇ／ｋｇ）で前処理したマウスにおいてＰＣＡを誘導した。グリブリドの効果は、（Ｆ）耳厚、（Ｇ）エバンスブルー色素の血管外漏出、または（Ｈ）ＰＣＡ誘導後２４時間の皮膚で検出されたサイトカインの関数として測定した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータは、３回の独立した平均±ＳＥＭを要約したものである。Ｉｎ ｖｉｖｏのデータは、それぞれ１群につき２－３匹のマウスを用いた２回の独立した実験を示す。ｐ値は、２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析または対応ありｔ検定により決定した。
【図7-1】図７（Ａ－Ｄ）は、ＭＣがｉｎ ｖｉｖｏでニューロキニンＡに応答する態勢を整えていることを示している。（Ａ）フローサイトメトリーにより検出されたナイーブ皮膚ＭＣ上のＮＫ２Ｒの発現。ヒストグラム上の値は、６匹のマウス（２匹ずつ３回の独立した実験）の平均陽性率＋１ＳＤである。（Ｂ）皮膚ホモジネート中のミエロペルオキシダーゼ活性をＰＣＡ誘導２４時間後に検出した。データは各群２～３匹のマウスを用いた３回の実験から得られた。（Ｃ）サイトカインアレイは、ＮＫＡの存在下または非存在下の、ＰＣＡ誘導２４時間後にマウスの皮膚から単離したタンパク質で行った。陽性対照スポットは四角形内である。（Ｄ）は代表的なアレイのセットを示す。バーは、３回の独立した実験から得られた、陽性対照に対して正規化した示されたサイトカインの相対的デンシトメトリーの平均＋１ ＳＥＭを示す。＊は対応ありｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図8-1】図８（Ａ－Ｃ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＭＣがＮＫ２Ｒを発現することを示す。（Ａ）ＢＭＭＣ（左）およびＰＭＣ（右）の純度およびＮＫ２Ｒ発現を示す。割合は最低３回の実験からの平均±ＳＤである。（Ｂ－Ｃ）ＮＫＡ（１０００ｎＭ）存在下、ＩｇＥおよびＡｇ（１００ｎｇ／ｍＬ ＤＮＰ－ＨＡＳまたは示す通り）で活性化したＢＭＭＣ（Ｂ）またはＰＭＣ（Ｃ）からのβ－ヘキソサミニダーゼ放出。バーは、３回の独立した実験からの平均放出割合±１ ＳＥＭを示す。
【図9-1】図９（Ａ－Ｃ）は、ニューロキニンＡが肥満細胞においてＩＬ－１０－ＧＦＰ発現を誘導することを示す。ＩＬ－１０－ＧＦＰの誘導を、ＰＣＡの誘導の前にＮＫＡまたはビヒクル対照で前処理したＶＥＲＴ－Ｘマウスにおいて評価した。（Ａ）は、皮膚ホモジネート中のＭＣを同定するために使用したゲーティング戦略を示す。上部パネルはＶＥＲＴ－Ｘマウス、下部パネルはＭＣ欠損Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ Ｘ Ｒｏｓａ２６ＤＴＡ＋マウスを示す。（Ｂ）ＩＬ－１０－ＧＦＰ＋ＭＣを示す代表的プロット。数字は陽性率を示す。（Ｃ）１群につき１～２匹のマウスを用いた、３回の独立した実験から得られたＩＬ－１０－ＧＦＰ＋ＭＣの割合を要約したものである。ナイーブ対照は各実験に含まれた。
【図10-1】図１０（Ａ－Ｃ）は、グリブリドがアトピー性皮膚炎のマウスモデルにおいて皮膚炎症を軽減することを示す。アトピー性皮膚炎は、耳をＭＣ９０３（４ｎｍｏｌ／耳、毎日）で処理することにより誘導した。対側の耳はＭＣ９０３のビヒクルによって処理した。マウスはグリブリド（２．５ ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎日）またはビヒクル対照のいずれかで処理した。（Ａ）耳厚を毎日測定した。（Ｂ－Ｃ）１１日目にマウスを安楽死させ、耳組織を包埋切片化し、細胞浸潤を評価するために（Ｂ）Ｈ ＆ Ｅで、または肥満細胞を評価するために（Ｃ）アビジン（ＡｖＲｈｏ）で染色した。（Ａ）は１群３～４匹のマウスを用いた２回の実験による平均±ＳＥＭを示す。（Ｂ－Ｃ）は２回の実験で３～７匹のマウスから得られた代表的な画像を示す。
【図11-1】図１１（Ａ－Ｃ）は、マイクロニードルアレイによって皮膚微小環境に送達されたグリブリドおよびピーナッツ抗原が、ピーナッツアレルギーに対するアレルギーを減感作することを示している。マウスは、完全ピーナッツ抽出物（ＣＰＥ、マウス１匹当たり１００ ｍｇ、毎週、６週間）で表皮感作された。感作はＣＰＥ（ｉ．ｐ， １０ ｍｇ／マウス）によるチャレンジで確認した。感作マウスを精製ピーナッツ抽出物（ＰＥ）またはＰＥと共にグリブリドを負荷したマイクロニードルアレイによって１週間間隔で２回処理した。１週間後、マウスをＣＰＥでチャレンジした。（Ａ）アナフィラキシーは、チャレンジの４０分後に２人の独立した研究者が標準尺度を用いてスコア化した。（Ｂ）温度の変化は、チャレンジ６０分後のＴｍからチャレンジ直前のＴｍを差し引いて計算した。（Ｃ）総血清ＩｇＥをＥＬＩＳＡで評価した。データは、１回の実験から得られた１群当たり３～４匹のマウスを示す。
【図12-1】図１２（Ａ－Ｄ）は、マイクロニードルアレイによってピーナッツ抗原と共に送達されたボツリヌス毒素Ａ（ＢＯＴＯＸ）が、ＩＬ－３３発現を減少させ、ピーナッツアレルゲンに対するアレルギーを減感作することを示す。（Ａ）ピーナッツ抽出物またはピーナッツ抽出物とＢＯＴＯＸを負荷したＭＮＡをマウスの皮膚に塗布した。１２時間後、マウスを安楽死させ、ＲＮＡを抽出し、ＩＬ３３の発現をｑＲＴ－ＰＣＲで決定した。（Ｂ－Ｄ）マウスを完全ピーナッツ抽出物で表皮感作した（１週間間隔で６回）。感作はＣＰＥチャレンジにより確認した。１週間後にＭＮＡを塗布した。ＭＮＡ塗布の１週間後、マウスをＣＰＥでチャレンジした。（Ｂ）はチャレンジ６０分後の温度変化を示す。（Ｃ－Ｄ）ＥＬＩＳＡにより血清中にピーナッツ特異的抗体を検出した。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本明細書において開示されるのは、治療有効量の肥満細胞脱感作組成物を対象に投与することを含む、対象における炎症を予防または軽減するための組成物および方法である。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるＩ型過敏症反応を治療する。
【0030】
本出願を通じて使用される用語は、当技術分野の当業者にとって通常および典型的な意味で解釈される。しかしながら、本出願人は、以下の用語が以下に提供されるような特定の定義を与えられることを望む。
【0031】
用語
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数形の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数形の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【0032】
本明細書において、量、割合などの測定可能な値に言及する際に使用される「約」という用語は、測定可能な値から±２０％、±１０％、±５％、または±１％の変動を包含することを意味する。
【0033】
「活性化すること」、「活性化すること」、および「活性化」は、活性、反応、状態、または他の生物学的パラメータを増加させることを意味する。これは、例えば、活性、応答、または状態が、天然または対照レベルと比較して１０％増加することも含む。したがって、増加は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量であり得る。
【0034】
対象への「投与」には、薬剤（例えば、肥満細胞脱感作組成物）を対象に導入または送達する任意の経路が含まれる。投与は、経口、局所、静脈内、皮膚、皮下、経皮、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻内、直腸内、膣内投与、吸入による投与、植込みリザーバーを介する投与、または経皮パッチを介する投与など、任意の適切な経路によって実施することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、皮内または経皮投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイを介して皮内または経皮投与される。いくつかの実施形態において、マイクロニードル（複数可）は溶解可能である。いくつかの実施形態において、本発明で使用されるマイクロニードル（複数可）は、米国特許第８，８３４，４２３号明細書、国際公開第２０１７／１２０３２２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１８／０３０４０６２号明細書、米国特許出願公開第２０２０／０３５３２３５号明細書、および国際公開第２０２１／１７８８７９号パンフレットのうちの１つまたは複数に記載されているものから選択される。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法が言及された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図する。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、組合せにとって本質的な意義を有する他のいかなる要素を除外することを意味する。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離精製法および薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、保存剤などからの微量汚染物を除外するものではない。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、本発明の組成物を投与するための他の成分および実質的な方法工程の微量要素を超えるものを除外することを意味するものとする。これらの各移行用語で定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【0036】
「対照」は、比較目的で実験に使用される代替的な対象または試料である。対照は「陽性」または「陰性」であり得る。
【0037】
「断片」は、他の配列に結合しているか否かに関わらず、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含むことができるが、ただし、断片の活性は非修飾ペプチドまたはタンパク質と比較して有意に変化または損なわれないことを条件とする。これらの修飾は、例えば、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去または付加する、生物学的寿命を増加させる、分泌特性を変化させるなど、何らかの付加的な特性を提供することができる。いずれの場合においても、断片は、肥満細胞脱感作性のような、それが由来する配列の生物活性特性を有していなければならない。
【0038】
「同一性」、「と同一である」、および「相同性」という用語は、配列を整列させ、配列全体について最大同一性比率を達成するために必要であればギャップを導入した後の、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、比較される対応する配列の塩基または残基と同一である候補配列中のヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基の割合を意味すると解釈されるものとする。Ｎ末端およびＣ末端の延長も挿入も、同一性または相同性を低下させるものと解釈してはならない。他の配列に対して一定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、その全長にわたって整列した場合に、２つの配列を比較して、その割合の塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。一実施形態では、デフォルトのパラメータが整列に使用される。一実施形態において、ＢＬＡＳＴプログラムが、デフォルトパラメータと共に使用される。一実施形態において、ＢＬＡＳＴプログラムＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータ： 遺伝子コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート順＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲで使用される。
【0039】
本明細書で使用する「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」という用語は、一般的に、静的に有意な量の増加を意味し；あらゆる疑念を回避するために、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」は、参照レベルと比較した少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較した少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の増加、または少なくとも約９０％、または１００％までの増加、または１０～１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍以上の任意の増加を意味する。
【0040】
本明細書で使用される場合、「炎症」は、対象の領域における免疫細胞の浸潤、白血球の浸潤、毛細血管の拡張、発赤、熱感および疼痛のうちの１つまたは複数を指す。
【0041】
「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」は、活性、反応、状態、疾患、または他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、活性、反応、状態、または疾患の完全な消失が含まれ得るが、これらに限定されない。また、例えば、活性、反応、状態、または疾患が、天然または対照レベルと比較して１０％減少することも含まれ得る。したがって、減少は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の減少であり得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、「肥満細胞脱感作組成物」は、ＦｃεＲ１によって開始される肥満細胞の活性化を減少させ、および／または肥満細胞によるメディエータ組成物の産生もしくは放出を減少させる組成物を指す。肥満細胞メディエータ組成物としては、カルパイン、ヒスタミン、β－ヘキソサミニダーゼ、キマーゼ、トリプターゼ、カルボキシペプチダーゼＡおよびサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、肥満細胞によるカルパイン１の産生または放出を減少させる。いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、肥満細胞ＡＢＡＣ１ポリペプチドの活性または機能性を減少させる。いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、ニューロキニンＡを含む。いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、グリブリドを含む。いくつかの実施形態において、肥満細胞減感作性組成物は、ボツリヌス毒素を含む。
【0043】
「薬学的に許容される」成分は、生物学的または他の点で望ましくない成分ではない成分を指していてもよく、すなわち、成分は、重大な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる製剤の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、本発明の薬学的製剤に組み込まれ、本明細書に記載されるように対象に投与され得る。ヒトへの投与に関して使用される場合、本用語は一般的に、その成分が毒物学的および製造試験の必要な基準を満たしていること、または米国食品医薬品局によって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれていることを意味する。
【0044】
「薬学的に許容される担体」（「担体」と称することもある）とは、一般的に安全で無毒な医薬組成物または治療組成物の調製に有用な担体または賦形剤を意味し、動物用および／またはヒト用の医薬用途または治療用途に許容される担体を含む。「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（油／水または水／油エマルジョンなど）および／または様々な種類の湿潤剤を含み得るが、これらに限定されない。
【0045】
本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、医薬製剤に使用するための当技術分野で周知の任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、脂質、安定化剤、または他の材料を包含する。組成物中で使用するための担体の選択は、組成物の意図される投与経路に依存する。薬学的に許容される担体およびこれらの材料を含む製剤の調製は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 21st Edition, ed. University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005に記載されている。生理学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、グリセロール、ＤＭＳＯ、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、および他の有機酸を有する緩衝剤などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー； グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ． Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。所望の治療処置のためのこのような投与量の投与を提供するために、本明細書に開示される組成物は、好都合には、担体または希釈剤を含む全組成物の重量に基づいて、１つまたは複数の対象化合物の合計の約０．１重量％～９９重量％を含み得る。
【0046】
「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマーから構成される一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。
【0047】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合したＤ－もしくはＬ－アミノ酸の一本鎖、またはＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物から構成される化合物を指す。
【0048】
「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、１つのアミノ酸のカルボキシル基が他のアミノ酸のαアミノ基に結合した２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成分子を指すために互換的に使用される。
【0049】
本明細書で使用される場合、用語「減少すること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、および他の文法的変形は、一般的に、統計的に有意な量の減少を意味する。しかしながら、疑いを避けるために、「減少すること」、「減少する」、または「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の減少、または少なくとも約９０％、または１００％までの減少（すなわち、基準サンプルと比較して不在のレベル）、または１０～１００％の間の任意の減少を意味する。
【0050】
「対象」という用語は、本明細書において、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むがこれらに限定されない哺乳類などの動物を含むように定義される。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【0051】
組成物（例えば、肥満細胞脱感作組成物を含む組成物）の「治療有効量」または「治療有効用量」は、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象における炎症の予防または軽減である。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象におけるＩ型過敏症反応の予防または軽減である。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原に対する全身性寛容である。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象における喘息、鼻炎、結膜炎、または皮膚炎の予防または軽減である。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象におけるアナフィラキシー、蕁麻疹、血管浮腫、食物アレルギー、または薬物アレルギーの予防または軽減である。肥満細胞脱感作組成物を含む組成物の治療有効量は、典型的には、治療される障害または疾患の種類および重症度、ならびに対象の年齢、性別、および体重などの要因に関して変化する。この用語はまた、癌の軽減などの所望の治療効果を促進するのに有効な、治療剤の量、または治療剤の送達速度（例えば、経時的な量）を指す場合もある。 正確な所望の治療効果は、治療される状態、対象の寛容、投与される薬剤および／または薬剤製剤（例えば、治療剤の効力、製剤中の薬剤濃度など）、および当技術分野の当業者に理解される様々な他の要因によって変化する。いくつかの例において、所望の生物学的または医学的応答は、数日、数週間、または数年にわたる複数用量の組成物の対象への投与後に達成される。
【0052】
本明細書で使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、およびその文法的変形は、障害または状態の１つまたは複数の随伴症状の強度を部分的にまたは完全に遅延させる、緩和する、軽減する、または低減すること、および／または障害または状態の１つまたは複数の原因を緩和する、軽減する、または妨げることを含む。本発明による治療は、防止的、予防的、緩和的または治療的に適用され得る。予防的治療は、発症前（例えば、Ｉ型過敏症反応の明らかな徴候の前）、発症初期（例えば、Ｉ型過敏症反応の初期徴候および症状の発現時）、またはＩ型過敏症反応の確立された発症後に対象に投与される。予防的投与は、疾患（例えば、Ｉ型過敏症反応）の症状発現の数日から数年前に起こり得る。
【0053】
「Ｉ型過敏症反応」は、本明細書において、肥満細胞上のＩｇＥ受容体に結合したＩｇＥが関与するか、またはＩｇＥによって媒介される免疫反応を指す。結合したＩｇＥへの抗原の結合は、肥満細胞表面上のＩｇＥの架橋をもたらし、細胞脱顆粒および肥満細胞メディエータ組成物の放出を引き起こす。ＩｇＥに結合し、Ｉ型過敏症反応を開始または引き起こす抗原を、本明細書では「Ｉ型過敏症反応抗原」と称する。
【0054】
組成物および方法
本明細書において開示されるのは、治療有効量の肥満細胞脱感作組成物を対象に投与することを含む、対象における炎症を予防または軽減するための組成物および方法である。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるＩ型過敏症反応を治療する。Ｉ型過敏症反応は、肥満細胞上のＩｇＥ受容体に結合したＩｇＥが関与するか、またはＩｇＥによって媒介される免疫反応である。肥満細胞には、結合組織肥満細胞および粘膜肥満細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、肥満細胞は結合組織肥満細胞である。他の実施形態では、肥満細胞は粘膜肥満細胞である。いくつかの実施形態において、ＩｇＥに結合し、Ｉ型過敏症反応を開始または引き起こす抗原は、本明細書において「Ｉ型過敏症反応抗原」と称し、肥満細胞脱感作組成物に加えて対象に投与される。いくつかの実施形態では、２つ以上のＩ型過敏症反応抗原、言い換えれば、異なるＩ型過敏症反応抗原が対象に投与される。１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原は、肥満細胞脱感作組成物の前、同時または後に投与することができる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原は、肥満細胞脱感作組成物と同じ皮膚微小環境に投与される。本明細書で使用される場合、「同じ皮膚微小環境」とは、第１の投与部位内の領域の約１２インチ未満、約１１インチ未満、約１０インチ未満、約９インチ未満、約８インチ未満、約７インチ未満、約６インチ未満、約５インチ未満、約４インチ未満、約３インチ未満、約２インチ未満、約１インチ未満、約０．５インチ未満、約０．２５インチ未満、約０．１インチ未満、または約０．００１インチ未満内にある対象上の領域を指す。
本明細書において開示されるのは、治療有効量の肥満細胞脱感作組成物を対象に投与することを含む、対象における炎症を予防または軽減するための組成物および方法である。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるＩ型過敏症反応を治療する。Ｉ型過敏症反応は、肥満細胞上のＩｇＥ受容体に結合したＩｇＥが関与するか、またはＩｇＥによって媒介される免疫反応である。肥満細胞には、結合組織肥満細胞および粘膜肥満細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、肥満細胞は結合組織肥満細胞である。他の実施形態では、肥満細胞は粘膜肥満細胞である。いくつかの実施形態において、ＩｇＥに結合し、Ｉ型過敏症反応を開始または引き起こす抗原は、本明細書において「Ｉ型過敏症反応抗原」と称し、肥満細胞脱感作組成物に加えて対象に投与される。いくつかの実施形態では、２つ以上のＩ型過敏症反応抗原、言い換えれば、異なるＩ型過敏症反応抗原が対象に投与される。１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原は、肥満細胞脱感作組成物の前、同時または後に投与することができる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原は、肥満細胞脱感作組成物と同じ皮膚微小環境に投与される。本明細書で使用される場合、「同じ皮膚微小環境」とは、第１の投与部位内の領域の約１２インチ未満、約１１インチ未満、約１０インチ未満、約９インチ未満、約８インチ未満、約７インチ未満、約６インチ未満、約５インチ未満、約４インチ未満、約３インチ未満、約２インチ未満、約１インチ未満、約０．５インチ未満、約０．２５インチ未満、約０．１インチ未満、または約０．００１インチ未満内にある対象上の領域を指す。
【0055】
いくつかの態様において、Ｉ型過敏症反応は、喘息、鼻炎、結膜炎、および皮膚炎からなる群から選択される。したがって、本明細書に含まれるのは、治療有効量の肥満細胞脱感作組成物を対象に投与することを含む、対象における喘息の治療法である。
【0056】
また、治療有効量の肥満細胞脱感作組成物を対象に投与することを含む、対象における皮膚炎の治療法も含まれる。いくつかの実施形態において、皮膚炎は乾癬または湿疹である。いくつかの実施形態において、湿疹はアトピー性皮膚炎である。いくつかの実施形態において、皮膚炎は、接触皮膚炎、おむつ皮膚炎、異汗性皮膚炎、神経皮膚炎、貨幣状皮膚炎、口腔周囲皮膚炎または脂漏性皮膚炎である。
【0057】
さらに、治療有効量の肥満細胞脱感作組成物を対象に投与することを含む、対象における鼻炎の治療法が含まれる。治療有効量の肥満細胞脱感作組成物を対象に投与することを含む、対象における結膜炎の治療法がさらに含まれる。
【0058】
他のまたはさらなる実施形態において、Ｉ型過敏症反応は、アナフィラキシー、蕁麻疹、および血管浮腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｉ型過敏症反応は食物アレルギーである。食物アレルギーとしては、セロリアレルギー、小麦アレルギー、甲殻類アレルギー、卵アレルギー、魚アレルギー、ルピナスアレルギー、牛乳および乳製品アレルギー、軟体動物（ムール貝および牡蠣など）アレルギー、マスタードアレルギー、ピーナッツアレルギー、木の実アレルギー、ゴマアレルギー、および大豆アレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、食物アレルギーはピーナッツアレルギーである。いくつかの実施形態において、Ｉ型過敏症反応は薬物アレルギーである。本発明は、Ｉ型過敏症反応が食物アレルギーであり、方法が対象に食物の抗原を投与することをさらに含む態様を含む。食物抗原は、肥満細胞脱感作組成物の前、同時または後に投与することができる。
【0059】
本方法に従って対象に投与される肥満細胞減感作性組成物は、ＦｃεＲ１によって開始される肥満細胞の活性化を減少させ、および／または肥満細胞によるメディエータ組成物の産生もしくは放出を減少させる組成物である。いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、ＡＢＣＡ１阻害剤を含む。用語「ＡＢＣＡ１」は、本明細書において、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１とも呼ばれ、ヒトではＡＢＣＡ１遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１ポリペプチドは、以下の１つまたは複数の公に利用可能なデータベース：ＨＧＮＣ：２９、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１９、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６５０２９、ＯＭＩＭ：６０００４６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ９５４７７において同定されるものである。いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１ポリペプチドは、配列番号１の配列、または配列番号１と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号１の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号１のＡＢＣＡ１ポリペプチドは、成熟ＡＢＣＡ１ポリペプチドの未成熟形態または前処理形態を表していてもよく、したがって、本明細書中に含まれるのは、配列番号１のＡＢＣＡ１ポリペプチドの成熟部分または処理部分である。
【0060】
本明細書中で使用される場合、「ＡＢＡＣ１阻害剤」は、肥満細胞ＡＢＡＣ１ポリペプチドの活性または機能性を低下させる組成物を指す。いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１阻害剤は、グリブリド、プロブコール、トコフェソラン、およびビタミンＥからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１阻害剤は、グリブリド（グリベンクラミドとしても知られる）またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、グリブリドは、以下の構造：
【0061】
【化1】
【0062】
いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１阻害剤は、プロブコールまたはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、プロブコールは、以下の構造：
【0063】
【化2】
【0064】
いくつかの実施形態において、ＡＢＣＡ１阻害剤は、トコフェソランまたはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、トコフェルソランは、以下の構造：
【0065】
【化3】
【0066】
いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、ニューロキニンＡを含む。いくつかの態様において、ニューロキニンＡは、ＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド、その機能的断片、または配列番号２と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するペプチドである。いくつかの実施形態において、ニューロキニンＡは、ＨＫＴＤＳＦＶＧＬＭ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【0067】
いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、ボツリヌス毒素Ａを含む。ボツリヌス毒素Ａは、米国特許出願公開第２００７／００２６０１９号明細書、米国特許出願公開第２０２１／００２４９１３号明細書、米国特許第８，５０１，１９６号明細書、米国特許第９，６２９，９０４号明細書、または米国特許第１０，０６４，９２１号明細書、およびそれらに引用された特許文献および雑誌文献において「Ａ型ボツリヌス毒素」または「ボツリヌス毒素Ａ型」と称されるものを含む。これらの材料は、そこに記載された用量範囲を含め、参照により本明細書に組み込まれる。
【0068】
いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物は、肥満細胞カルパイン１阻害剤を含む。用語「カルパイン」は、本明細書において、カルシウム活性化中性プロテイナーゼ１とも呼ばれ、ヒトではＣＡＰＮ１遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、カルパイン１ポリペプチドは、以下の１つまたは複数の公に利用可能なデータベース：ＨＧＮＣ：１４７６、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８２３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４２１６、ＯＭＩＭ：１１４２２０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７３８４において同定されるものである。いくつかの実施形態において、カルパイン１ポリペプチドは、配列番号３の配列、または配列番号３と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号３の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号３のカルパイン１ポリペプチドは、成熟カルパイン１ポリペプチドの未成熟または前処理形態を表していてもよく、したがって、本明細書に含まれるのは、配列番号３のカルパイン１ポリペプチドの成熟または処理部分である。本明細書で使用される場合、「カルパイン１阻害剤」は、肥満細胞カルパイン１ポリペプチドの活性または機能性を低下させる組成物を指す。
【0069】
炎症性反応またはＩ型過敏症反応の時期はしばしば予測できないため、本明細書に記載の疾患または障害を治療、予防、軽減、および／または阻害する開示された方法は、疾患または障害またはその症状を治療、予防、阻害、および／または軽減するために、疾患または障害の発症前または発症後に使用できることを理解されたい。一態様において、開示された方法は、疾患または障害の発症の３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２年前、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２カ月前、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３日前、６０、４８、３６、３０、２４、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２時間前、６０、４５、３０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１分前；または疾患または障害の発症の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、９０、１０５、１２０分後、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０時間後、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、 １８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０年またはそれ以上の後に使用し得る。
【0070】
先行するいずれかの局面の組成物の投与頻度としては、少なくとも１年毎に１回、２年毎に１回、３年毎に１回、４年毎に１回、５年毎に１回、６年毎に１回、７年毎に１回、８年毎に１回、９年毎に１回、１０年毎に１回、少なくとも２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、４カ月毎に１回、５カ月毎に１回、６カ月毎に１回、７カ月毎に１回、８カ月毎に１回、９カ月毎に１回、１０カ月毎に１回、１１カ月毎に１回、少なくとも１カ月毎に１回、３週間毎に１回、２週間毎に１回、１週間毎に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、１日１２回、１２時間毎に１回、１０時間毎に１回、８時間毎に１回、６時間毎に１回、５時間毎に１回、４時間毎に１回、３時間毎に１回、２時間毎に１回、１時間毎に１回、４０分毎に１回、３０分毎に１回、２０分毎に１回、または１０分毎に１回が挙げられるが、これらに限定されない。投与はまた、連続的であり得、化合物のレベルを任意の所望の指定された範囲内に維持するように調整され得る。
【0071】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のサイトカインが、肥満細胞脱感作組成物の前、同時、または後に対象に投与される。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ－１０である。「ＩＬ－１０」という用語は、本明細書では、サイトカイン合成阻害因子またはＣＳＩＦとも呼ばれ、ヒトではＩＬ１０遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０ポリペプチドは、以下の１つまたは複数の公に利用可能なデータベース：ＨＧＮＣ：５９６２、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３５８６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３６６３４、ＯＭＩＭ：１２４０９２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２２３０１において同定されるものである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０ポリペプチドは、配列番号４の配列、または配列番号４と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号４の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号４のＩＬ－１０ポリペプチドは、成熟ＩＬ－１０ポリペプチドの未成熟または前処理形態を表していてもよく、したがって、配列番号４のＩＬ－１０ポリペプチドの成熟または処理部分が本明細書中に含まれる。また、肥満細胞脱感作組成物およびＩＬ－１０を含むキットが本明細書中に含まれる。
【0072】
上述したように、肥満細胞脱感作組成物の「治療有効量」または「治療有効用量」は、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象における炎症の予防または軽減である。炎症の軽減は、参照または対照レベルと比較して少なくとも１０％の軽減、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の軽減、または少なくとも約９０％、または１００％までの軽減であり得る。いくつかの実施形態において、参照または対照レベルは、未治療の対象または集団から得られるレベルである。
【0073】
いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象におけるＩ型過敏症反応の予防または軽減である。Ｉ型過敏症反応の軽減は、参照または対照レベルと比較して少なくとも１０％の軽減、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の軽減、または少なくとも約９０％、または１００％までの軽減であり得る。いくつかの実施形態において、参照または対照レベルは、未治療の対象または集団から得られるレベルである。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原に対する全身性寛容である。
【0074】
いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象における喘息、鼻炎、結膜炎、または皮膚炎の予防または軽減である。喘息、鼻炎、結膜炎、または皮膚炎の軽減は、参照または対照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の軽減、または少なくとも約９０％、または１００％までの軽減であり得る。いくつかの実施形態において、参照または対照レベルは、未治療の対象または集団から得られるレベルである。
【0075】
いくつかの実施形態において、所望の治療結果は、対象におけるアナフィラキシー、蕁麻疹、血管浮腫、食物アレルギー、または薬物アレルギーの予防または軽減である。アナフィラキシー、蕁麻疹、血管浮腫、食物アレルギー、または薬物アレルギーの軽減は、参照または対照レベルと比較して少なくとも１０％の軽減、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の軽減、または少なくとも約９０％、または１００％までの軽減であり得る。いくつかの実施形態において、参照または対照レベルは、未治療の対象または集団から得られるレベルである。
【0076】
本明細書に記載される肥満細胞脱感作組成物および／またはサイトカイン組成物の治療有効量は、当技術分野の当業者によって決定されてもよく、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約０．５～約２００ｍｇの哺乳動物に対する例示的な投与量を含み、これは、単回投与で、または１日当たり１～４回などの個々の分割投与の形態で投与され得る。あるいは、投与量は、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約０．５～約１５０ｍｇ、１日当たりの活性化合物が体重１ｋｇ当たり約０．５～約１００ｍｇ、１日当たりの活性化合物が体重１ｋｇ当たり約０．５～約７５ｍｇ、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約０．５～約５０ｍｇ、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約０．５～約２５ｍｇ、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約１～約２０ｍｇ、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約１～約１０ｍｇ、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇ、１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、または１日当たりの活性組成物が体重１ｋｇ当たり約５ｍｇである。
【0077】
いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原、および／または１つまたは複数のサイトカインは、皮内または経皮投与される。いくつかの実施形態において、肥満細胞減感作性組成物、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原、および／または１つまたは複数のサイトカインは、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイを介して皮内または経皮投与される。いくつかの実施形態において、マイクロニードル（複数可）は溶解可能である。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるマイクロニードル（複数可）は、米国特許第８，８３４，４２３号明細書、国際公開第２０１７／１２０３２２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１８／０３０４０６２号明細書、米国特許出願公開第２０２０／０３５３２３５号明細書、および国際公開第２０２１／１７８８７９号パンフレットのうちの１つまたは複数に記載されているものから選択される。
【0078】
肥満細胞脱感作組成物、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原、および１つまたは複数のサイトカインのうちの２つ以上を同時または連続して投与することができることは理解されたい。肥満細胞脱感作組成物、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原、および／または１つまたは複数のサイトカインのそれぞれは、異なる投与経路または同じ投与経路を介して投与することができる。連続投与において、肥満細胞脱感作組成物、１つ以上のＩ型過敏症反応抗原、および／または１つ以上のサイトカインは、任意の順序で投与することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原の第１の投与と、肥満細胞脱感作組成物を含む組成物の第２の投与とを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原が最初に投与され、続いて肥満細胞脱感作組成物および１つまたは複数のサイトカインが投与される。いくつかの実施形態において、肥満細胞脱感作組成物、１つまたは複数のＩ型過敏症反応抗原、および／または１つまたは複数のサイトカインは、対象の同じ皮膚微小環境に投与される。
【0079】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
【実施例】
【0080】
以下の実施例は、開示された主題による組成物、方法、および結果を例示するために以下に記載される。これらの実施例は、本明細書に開示される主題の全ての態様を包含することを意図するものではなく、むしろ代表的な方法および結果を例示することを意図する。これらの実施例は、当技術分野の当業者に明らかな本発明の等価物および変形物を除外することを意図していない。
【0081】
[実施例１]
方法
マウス
雌Ｃ５７ＢＬ／６ 、Ｂ６．１２９Ｐ２－ＩＬ１０ｔｍ１Ｃｇｎ（ＩＬ１０ ＫＯ）（６～８週齢）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６－Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ Ｒｏｓａ２６ ＤＴＡ＋マウス（Ａｘｅｌ Ｒｏｅｒｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｅｓｄｅｎ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｃａｒｌ－Ｇｕｓｔａｖ Ｃａｒｕｓ， Ｄｒｅｓｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）提供）はピッツバーグ大学で飼育した。Ｍｃｐ５ｔＣｒｅ＋マウスをＩＬ１０ ｆｌ／ｆｌマウス（Ｌｏｕｉｓｅ Ｄ’Ｃｒｕｚ、ピッツバーグ大学より供与）と自家交配し、Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ ｆｌ／ｆｌマウスを得た。
方法
マウス
雌Ｃ５７ＢＬ／６ 、Ｂ６．１２９Ｐ２－ＩＬ１０ｔｍ１Ｃｇｎ（ＩＬ１０ ＫＯ）（６～８週齢）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６－Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ Ｒｏｓａ２６ ＤＴＡ＋マウス（Ａｘｅｌ Ｒｏｅｒｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｅｓｄｅｎ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｃａｒｌ－Ｇｕｓｔａｖ Ｃａｒｕｓ， Ｄｒｅｓｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）提供）はピッツバーグ大学で飼育した。Ｍｃｐ５ｔＣｒｅ＋マウスをＩＬ１０ ｆｌ／ｆｌマウス（Ｌｏｕｉｓｅ Ｄ’Ｃｒｕｚ、ピッツバーグ大学より供与）と自家交配し、Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ ｆｌ／ｆｌマウスを得た。
【0082】
Ｃ６（Ｃｇ）－ＩＬ１０ｔｍ１．１．Ｋａｒｐ／Ｊ （ＶＥＲＴ－Ｘ） マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をピッツバーグ大学で飼育した。ｄ０に、マウスは片耳をビヒクル、対側の耳をＩｇＥで処理された。１日目に、マウスは両耳をＮＫＡ（１０ｍｇ／５０ｍＬ）または両耳をビヒクルで処理した。３時間後、ＰＣＡを誘導した。２日目にマウスを安楽死させた。摘出した耳組織は、コラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ、１．０ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮＡａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ、１．０ｍｇ／ｍＬ）を含むＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃で４５分間消化した。単一細胞ホモジネートをＦｃＢｌｏｃｋでブロッキングし、染色した。いくつかの実験では、アビジンＡｌｅｘａＦｌｕｒｏ４８８を皮内注射し、ｉｎ ｖｉｖｏで皮膚肥満細胞を標識した。マウスは注射の７日後に安楽死させた。
【0083】
全てのｉｎ ｖｉｖｏ試験には、年齢および性別を一致させたマウスを使用した。全ての実験はＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに準拠し、ピッツバーグ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得た。
【0084】
マウスＭＣの培養および活性化
肥満細胞は記載されているようにマウス骨髄から分化させた。簡単に言えば、雌マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を摘出した。培養物は、使用前に組換えマウスＩＬ－３（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む完全ＭＣ／９培地で４～６週間維持した。腹膜ＭＣ（ＰＭＣ）は、ＩＬ－３（２５ｎｇ／ｍＬ）およびＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＭＣ／９培地で２１日間、腹膜洗浄物から増殖させた。ＢＭＭＣおよびＰＭＣの純度は９５％超であることが確認された（図８Ａ）。
肥満細胞は記載されているようにマウス骨髄から分化させた。簡単に言えば、雌マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を摘出した。培養物は、使用前に組換えマウスＩＬ－３（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む完全ＭＣ／９培地で４～６週間維持した。腹膜ＭＣ（ＰＭＣ）は、ＩＬ－３（２５ｎｇ／ｍＬ）およびＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＭＣ／９培地で２１日間、腹膜洗浄物から増殖させた。ＢＭＭＣおよびＰＭＣの純度は９５％超であることが確認された（図８Ａ）。
【0085】
ＦｃεＲＩを介したシグナル伝達を開始するために、ＭＣにＩｇＥ（１．０μｇ／ｍｌ、クローンＳＰＥ－７、Ｓｉｇｍａ）を１時間以上負荷した後、ジニトロフェニル－ヒト血清アルブミン（ＤＮＰ－ＨＡＳ、１００ ｎｇ／ｍＬまたは示す通り）を用いて架橋した。ＮＫＡ（ＬｉｆｅＴｅｉｎ （Ｓｕｍｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ）またはＰｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，ＣＡ）のいずれか）のストック溶液を組織培養グレードの水で調製し（１００μＭ）、－２０℃で最長３０日間保存した。グリブリド（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）はＤＭＳＯで調製した後、ＰＢＳで希釈した。
【0086】
フローサイトメトリーおよびＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ
ＭＣを回収し、０．５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄した。非特異的結合はＦｃＢｌｏｃｋ（２．０％ヤギ血清および０．２５ ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ１６／３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳ）を用いて阻害した。表面染色は、抗ＣＤ１１７ ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローン２Ｂ８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗ＦｃεＲＩ ＦＩＴＣ（クローンＭＡＲ－１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および抗ＡＢＣＡ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（クローン５Ａ１－１４２２、ＢｉｏＲａｄ）で行った。細胞はＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。細胞表面の顆粒化タンパク質の違いを検出するため、ＩｇＥを負荷したＭＣを、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝剤中で、ＮＫＡを含むまたは含まないＤＮＰ－ＨＳＡで３０分間活性化し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、Ａｖｉｄｉｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｖ４８８、０．８μｇ／５ ｘ１０５細胞）および抗ＬＡＭＰ－１ ＰＥ（クローンｅＢｉｏ １Ｄ４８， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。データはＬＳＲＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかで取得した。解析はＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
ＭＣを回収し、０．５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄した。非特異的結合はＦｃＢｌｏｃｋ（２．０％ヤギ血清および０．２５ ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ１６／３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳ）を用いて阻害した。表面染色は、抗ＣＤ１１７ ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローン２Ｂ８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗ＦｃεＲＩ ＦＩＴＣ（クローンＭＡＲ－１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および抗ＡＢＣＡ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（クローン５Ａ１－１４２２、ＢｉｏＲａｄ）で行った。細胞はＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。細胞表面の顆粒化タンパク質の違いを検出するため、ＩｇＥを負荷したＭＣを、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝剤中で、ＮＫＡを含むまたは含まないＤＮＰ－ＨＳＡで３０分間活性化し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、Ａｖｉｄｉｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｖ４８８、０．８μｇ／５ ｘ１０５細胞）および抗ＬＡＭＰ－１ ＰＥ（クローンｅＢｉｏ １Ｄ４８， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。データはＬＳＲＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかで取得した。解析はＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
【0087】
ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ５Ｔｙｒ６９４を検出するために、ＭＣを血清およびサイトカイン非含有のＲＰＭＩ中でＩｇＥを負荷した。ニューロキニンＡ（１．０Ｍ）またはビヒクル対象とＤＮＰ－ＨＳＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を同時に添加した。指示された時間に、細胞を２．０％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した後、９０％メタノールを用いて－２０℃で一晩透過処理した。細胞をモノクローナル抗ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ５ Ｔｙｒ６９４ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（クローンＣ７１Ｅ５， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で室温で６０分間染色した。核の共局在はＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（Ａｍｎｉｓ）を用いて評価した。活性化ＢＭＭＣを２．０％パラホルムアルデヒドで固定し、３％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで透過処理し、抗ＳＴＡＴ５Ｂ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（クローンＥＰＲ１６６７１、Ａｂｃａｍ）およびＤＡＰＩで染色した。データはＩＤＥＡＳ（ｖ６．２）のＣｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄを用いて解析した。ＳＴＡＴ５ＢおよびＤＡＰＩを発現する単一細胞の共局在は、対応する画像の画素強度を対数変換したピアソンの相関係数である類似性スコア（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）として定量化した。
【0088】
他の方法では、５～７週間（ＢＭＭＣ）または３～４週間（ＰＭＣ）分化させた肥満細胞を回収し、ＦｃＢｌｏｃｋでブロッキングし、抗ＦｃｅＲＩ ＰＥ（クローンＭＡＲ－１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１１７ ｅＦｌｕｏｒ ４５０クローン２Ｂ８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、抗ＮＫ２Ｒ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７またはウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７アイソタイプ対照（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色した。皮膚からの単一細胞ホモジネートを抗ＣＤ４５ ＢＵＶ ３９５（クローン ３０－Ｆ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＦｃｅＲＩ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（クローン ＭＡＲ－１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１１７ ｅＦｌｕｏｒ ４５０およびＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で４℃で２０分間染色し、洗浄後、２．０％パラホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＬＳＲ ＩＩサイトメーターのいずれかで取得した。
【0089】
ＢＭＭＣ放出物のＭＳ／ＭＳ
ＢＭＭＣ（４×１０６）をＢＳＡ（５００μｌ）無添加のＴｙｒｏｄｅ緩衝剤中で１時間活性化した。Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡを含む）を細胞遊離上清に添加した。上清はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ－３Ｋ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量化した。トリプシンペプチドをフィルタ補助サンプル調製法で生成し、Ｃ１８スピンカラムで脱塩し、ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた。ペプチドを９６：４水：アセトニトリル中の０．５％ギ酸で再構成し、Ｗａｔｅｒｓ ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣとＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でインラインで構成されるシステムを使用して液体クロマトグラフィータンデム質量分析計で分離した。移動相として溶媒Ａ（水中０．１％ギ酸、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用した。次いでキャピラリーカラム（内径１００μｍ×長さ１００ｍｍ； ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｍ－Ｃｌａｓｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ、１．７μｍ 粒子サイズ、３００Å（Ｗａｔｅｒｓ））からペプチドを溶出し、０．９μＬ／分の流速で１００分間の勾配（４～３３％Ｂで９０分間、３３～８０％Ｂで２分間、８０％Ｂで６分間一定、その後８０～０％Ｂで２分間によりカラムを平衡化）を用いて分離した。データは陽イオン化モードで収集した。ＰＥＡＫＳＸソフトウェアを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔマウスデータベースを用いた偽発見率１．０％のデコイサーチを使用して、各サンプル中のペプチドの配列決定および同定を行った。ラベルフリー定量化は、ＰＥＡＫＳＸソフトウェアの定量モジュールを用いて行った。ＭＳプロテオミクスデータはＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにデータセット識別子ＰＸＤ０２１３７７で寄託された。発現タンパク質の経路（Ｐａｔｈｗａｙ）解析は、Ｐａｎｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
ＢＭＭＣ（４×１０６）をＢＳＡ（５００μｌ）無添加のＴｙｒｏｄｅ緩衝剤中で１時間活性化した。Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、ペプスタチンＡを含む）を細胞遊離上清に添加した。上清はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ－３Ｋ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量化した。トリプシンペプチドをフィルタ補助サンプル調製法で生成し、Ｃ１８スピンカラムで脱塩し、ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた。ペプチドを９６：４水：アセトニトリル中の０．５％ギ酸で再構成し、Ｗａｔｅｒｓ ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣとＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でインラインで構成されるシステムを使用して液体クロマトグラフィータンデム質量分析計で分離した。移動相として溶媒Ａ（水中０．１％ギ酸、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用した。次いでキャピラリーカラム（内径１００μｍ×長さ１００ｍｍ； ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｍ－Ｃｌａｓｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ、１．７μｍ 粒子サイズ、３００Å（Ｗａｔｅｒｓ））からペプチドを溶出し、０．９μＬ／分の流速で１００分間の勾配（４～３３％Ｂで９０分間、３３～８０％Ｂで２分間、８０％Ｂで６分間一定、その後８０～０％Ｂで２分間によりカラムを平衡化）を用いて分離した。データは陽イオン化モードで収集した。ＰＥＡＫＳＸソフトウェアを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔマウスデータベースを用いた偽発見率１．０％のデコイサーチを使用して、各サンプル中のペプチドの配列決定および同定を行った。ラベルフリー定量化は、ＰＥＡＫＳＸソフトウェアの定量モジュールを用いて行った。ＭＳプロテオミクスデータはＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにデータセット識別子ＰＸＤ０２１３７７で寄託された。発現タンパク質の経路（Ｐａｔｈｗａｙ）解析は、Ｐａｎｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
【0090】
カルパインアッセイおよびＥＬＩＳＡ
カルパイン活性は、Ｃａｌｐａｉｎ－Ｇｌｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞非含有上清から検出した。上清は発光検出の前に基質と共に１０分間インキュベートした。いくつかの実験では、Ａｇの１０分前にグリブリドまたはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）を細胞に添加した。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＬ－１３）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（ＴＮＦおよびＩＬ－１０）またはＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（ＮＫＡ）のＥＬＩＳＡキットを製造者の推奨に従って使用した。データは１×１０６細胞当たりのｐｇ／ｍＬを示す。
カルパイン活性は、Ｃａｌｐａｉｎ－Ｇｌｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞非含有上清から検出した。上清は発光検出の前に基質と共に１０分間インキュベートした。いくつかの実験では、Ａｇの１０分前にグリブリドまたはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）を細胞に添加した。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＬ－１３）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（ＴＮＦおよびＩＬ－１０）またはＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（ＮＫＡ）のＥＬＩＳＡキットを製造者の推奨に従って使用した。データは１×１０６細胞当たりのｐｇ／ｍＬを示す。
【0091】
ＩＬ－１０分解アッセイ
初期のＩＬ－１０放出を検出するため、ＩｇＥを負荷しＤＮＰ－ＨＳＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）で活性化する前に、４ ｘ １０６細胞を血清非含有ＲＰＭＩ中で最低３時間インキュベートした。上清を回収し、１．０％のＢＳＡでブロッキングし、２５０ ｐｇ／ｍＬのトップスタンダードを用いて、製造者の推奨に従ってＩＬ－１０を検出した。検出下限は７．８ ｐｇ／ｍＬであった。カルパインとＩＬ－１０の関係の役割を評価するために、活性化後１０分後に細胞非含有上清を回収し、Ａｃ－カルパスタチン（Ａｃ－Ｃａｌ； ２０μｇ／ｍＬ， Ｃａｙｍａｎ）またはビヒクル対照と共にインキュベートした。Ａｃ－Ｃａｌを含む上清は、ＥＬＩＳＡによるＩＬ－１０の定量化前にさらに３０分間インキュベートした。ＩＬ－１０のタンパク質分解を直接試験するために、ＭＣを４５分間活性化し、細胞非含有上清を回収し、組換えＩＬ－１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、２５０ ｐｇ／ｍＬ）でパルスした。
初期のＩＬ－１０放出を検出するため、ＩｇＥを負荷しＤＮＰ－ＨＳＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）で活性化する前に、４ ｘ １０６細胞を血清非含有ＲＰＭＩ中で最低３時間インキュベートした。上清を回収し、１．０％のＢＳＡでブロッキングし、２５０ ｐｇ／ｍＬのトップスタンダードを用いて、製造者の推奨に従ってＩＬ－１０を検出した。検出下限は７．８ ｐｇ／ｍＬであった。カルパインとＩＬ－１０の関係の役割を評価するために、活性化後１０分後に細胞非含有上清を回収し、Ａｃ－カルパスタチン（Ａｃ－Ｃａｌ； ２０μｇ／ｍＬ， Ｃａｙｍａｎ）またはビヒクル対照と共にインキュベートした。Ａｃ－Ｃａｌを含む上清は、ＥＬＩＳＡによるＩＬ－１０の定量化前にさらに３０分間インキュベートした。ＩＬ－１０のタンパク質分解を直接試験するために、ＭＣを４５分間活性化し、細胞非含有上清を回収し、組換えＩＬ－１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、２５０ ｐｇ／ｍＬ）でパルスした。
【0092】
カルパインのＩＬ－１０分解能、組換えマウスＩＬ－１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をヒトカルパインＩ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と３７℃で６０分間インキュベートした後、Ｌａｅｍｅｌｌｉ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で変性させ、１０％Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）で分離させた。タンパク質を４０μｍ ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ）で１時間ブロッキングし、ヤギ抗マウスＩＬ－１０抗体（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩プローブした。抗ＩＬ１０抗体はロバ抗ヤギ ８００ＣＷ （ＬＩ－ＣＯＲ）で検出し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ で可視化した。デンシトメトリーはＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＬｉｔｅ ｖ５．２．５ （Ｌｉｃｏｒ）を用いて計算した。値は（ｒＩＬ－１０ ＋カルパイン）／ ｒＩＬ－１０ 単独）＊１００で表示する。
【0093】
ＲＴ－ＰＣＲ
ＮＫＡ注射の３時間後に、ＭＣまたはマウス耳組織のいずれかから全ＲＮＡを単離した。組織はＮａｖｙ ＲＩＮＯチューブ（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ）内で、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｓｔｏｒｍ（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ）でホモジナイズした。ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標準的な方法で抽出した。ｃＤＮＡはＱｕａｎｔｉｔｅｃｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写した。ＰＣＲ産物は、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）上で、Ｆａｓｔ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（ＡＢＩ）を用いて以下のプライマーを用いて増幅した：ＴＮＦ Ｆ： ＣＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号５）、ＴＮＦ Ｒ：ＣＧＧＡＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＴＣＴＡＡＧ（配列番号６）；ＩＬ１３ Ｆ：ＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴ（配列番号７）、ＩＬ１３ Ｒ：ＧＧＴＣＴＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡ（配列番号８）；ＩＬ１０ Ｆ：ＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＡＡＣＣ（配列番号９）；ＩＬ１０ Ｒ：ＡＴＴＴＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＡ（配列番号１０）；Ｂアクチン Ｆ：ＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧ（配列番号１１）；Ｂアクチン Ｒ：ＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴ（配列番号１２）。データは、β－アクチンをハウスキーピング遺伝子として用い、未処理細胞またはナイーブ対照マウスのいずれかに対して正規化した２－ΔΔＣＴとして示す。
ＮＫＡ注射の３時間後に、ＭＣまたはマウス耳組織のいずれかから全ＲＮＡを単離した。組織はＮａｖｙ ＲＩＮＯチューブ（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ）内で、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｓｔｏｒｍ（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ）でホモジナイズした。ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標準的な方法で抽出した。ｃＤＮＡはＱｕａｎｔｉｔｅｃｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写した。ＰＣＲ産物は、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）上で、Ｆａｓｔ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（ＡＢＩ）を用いて以下のプライマーを用いて増幅した：ＴＮＦ Ｆ： ＣＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号５）、ＴＮＦ Ｒ：ＣＧＧＡＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＴＣＴＡＡＧ（配列番号６）；ＩＬ１３ Ｆ：ＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴ（配列番号７）、ＩＬ１３ Ｒ：ＧＧＴＣＴＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡ（配列番号８）；ＩＬ１０ Ｆ：ＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＡＡＣＣ（配列番号９）；ＩＬ１０ Ｒ：ＡＴＴＴＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＡ（配列番号１０）；Ｂアクチン Ｆ：ＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧ（配列番号１１）；Ｂアクチン Ｒ：ＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴ（配列番号１２）。データは、β－アクチンをハウスキーピング遺伝子として用い、未処理細胞またはナイーブ対照マウスのいずれかに対して正規化した２－ΔΔＣＴとして示す。
【0094】
受動的皮膚アナフィラキシー
マウスの耳をマイクロメーターで測定し、フィルタ滅菌ＰＢＳ中のＩｇＥ（Ｓｉｇｍａ、クローンＳＰＥ－７、２０ ｎｇ／５０μｌ／耳）またはビヒクル対照で感作した。２４時間後、Ａｇ（ＤＮＰ－ＨＳＡ １００ μｇ、２００μｌ、生理食塩水で静脈内）投与の３時間前に、ＮＫＡ（１０μｇ／耳、皮内）またはビヒクル（ＰＢＳ）でマウスを処理した。データはベースラインと指示された時間との間の耳厚の変化として示されている。指示された場合、マウスはＩｇＥ注射時に組換えマウスＩＬ－１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１．０ ｎｇ／耳）で処理されるか、またはＡｇ投与の３時間前にグリブリド（２．５ ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）で処理された。
マウスの耳をマイクロメーターで測定し、フィルタ滅菌ＰＢＳ中のＩｇＥ（Ｓｉｇｍａ、クローンＳＰＥ－７、２０ ｎｇ／５０μｌ／耳）またはビヒクル対照で感作した。２４時間後、Ａｇ（ＤＮＰ－ＨＳＡ １００ μｇ、２００μｌ、生理食塩水で静脈内）投与の３時間前に、ＮＫＡ（１０μｇ／耳、皮内）またはビヒクル（ＰＢＳ）でマウスを処理した。データはベースラインと指示された時間との間の耳厚の変化として示されている。指示された場合、マウスはＩｇＥ注射時に組換えマウスＩＬ－１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１．０ ｎｇ／耳）で処理されるか、またはＡｇ投与の３時間前にグリブリド（２．５ ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）で処理された。
【0095】
浮腫は、組織学的およびエバンスブルー色素の血管外漏出量の関数として評価した。組織学的評価のために、マウスはＰＣＡ誘導の２時間後に安楽死させた。パラホルムアルデヒド（４．０％）で固定した耳をヘマトキシリン・エオジン染色に供した。病理学的評価は、落射蛍光およびデジタルカメラ（ＡｘｉｏＣａｍ；Ｚｅｉｓｓ）を備えたＡｘｉｏｓｔａｒ ｐｌｕｓ顕微鏡を用いて盲検下で行った。色素の血管外漏出については、Ａｇを１．０％エバンスブルー色素中で送達した。９０分後にマウスを安楽死させ、耳を切除した。色素はＤｒｉＳｏｌｖ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で抽出し、ＯＤ６５０ ｎｍでの吸光度として定量化した。データはＯＤ６５０／組織１ｍｇとして示す。
【0096】
ＰＣＡ誘導２４時間後に皮膚におけるサイトカイン発現を調べた。マウスを安楽死させ、耳を切除し、組織をＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ－ＰＥＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中でホモジナイズした。タンパク質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量化した。皮膚ホモジネートのタンパク質プロファイルは、Ｃ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｃ１ （ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を用いて特徴付けた。個々のスポット領域からバックグラウンド中央値を差し引いたデンシトメトリー値は、ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＬｉｔｅ ｖ５．２．５で計算した。各サイトカインスポットのデンシトメトリー値を陽性対照スポットの平均デンシトメトリー値で割り、相対的なタンパク質発現量を求めた。各実験のデータは、（相対的発現［処理］／相対的発現［ビヒクル］）として正規化した。いくつかの実験では、ＥＬＩＳＡを皮膚ホモジネートで行った。
【0097】
ミエロペルオキシダーゼ活性アッセイ
好中球流入をミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の関数として評価した。ＭＰＯ活性を検出するために、５０ｍＭのヘキサデイルトリメチルアンモニウムを含む５０ｍＭのＫＰＯ４中で、Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて組織をホモジナイズした。ホモジネートを、０．００５％ Ｈ２Ｏ２を含むＯＤＰ（Ｓｉｇｍａ）と共に３０分間インキュベートした。酵素反応は１Ｎ塩酸で停止させ、４５０ｎＭで吸光度を読み取った。データはＭＰＯ活性／組織１ｍｇを示す。
好中球流入をミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の関数として評価した。ＭＰＯ活性を検出するために、５０ｍＭのヘキサデイルトリメチルアンモニウムを含む５０ｍＭのＫＰＯ４中で、Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて組織をホモジナイズした。ホモジネートを、０．００５％ Ｈ２Ｏ２を含むＯＤＰ（Ｓｉｇｍａ）と共に３０分間インキュベートした。酵素反応は１Ｎ塩酸で停止させ、４５０ｎＭで吸光度を読み取った。データはＭＰＯ活性／組織１ｍｇを示す。
【0098】
ｂ－ヘキソサミニダーゼアッセイ
肥満細胞（５×１０５～１×１０６）にＩｇＥ（１．０ｍｇ／ｍＬ）をＴｙｒｏｄｅ緩衝剤中で最低３時間負荷した。ニューロキニンＡ（１．０ｍＭ）をＤＮＰ－ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ、示す通りまたは１００ｎｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４０分間添加した。細胞および上清を回収し、凍結融解によって細胞ペレットをＴｙｒｏｄｅ緩衝剤中で溶解した後、クエン酸緩衝剤（０．０４Ｍ、ｐＨ４．５）に溶解したｐ－ニトロフェニル Ｎ－アセチル β－Ｄ－グルコサミニド（ＥＭＢ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５ｍＭ）と共に９０分間インキュベートした。酵素反応はグリシン（０．４Ｍ、ｐＨ１０．７）で停止させた。４５０ ｎＭでの吸光度を読み取った。３つ組値からのｂ－ヘキソサミニダーゼ放出の平均割合は、（ＯＤ上清／ＯＤ上清＋ ＯＤ溶解物）×１００（％）として計算した。
肥満細胞（５×１０５～１×１０６）にＩｇＥ（１．０ｍｇ／ｍＬ）をＴｙｒｏｄｅ緩衝剤中で最低３時間負荷した。ニューロキニンＡ（１．０ｍＭ）をＤＮＰ－ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ、示す通りまたは１００ｎｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４０分間添加した。細胞および上清を回収し、凍結融解によって細胞ペレットをＴｙｒｏｄｅ緩衝剤中で溶解した後、クエン酸緩衝剤（０．０４Ｍ、ｐＨ４．５）に溶解したｐ－ニトロフェニル Ｎ－アセチル β－Ｄ－グルコサミニド（ＥＭＢ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５ｍＭ）と共に９０分間インキュベートした。酵素反応はグリシン（０．４Ｍ、ｐＨ１０．７）で停止させた。４５０ ｎＭでの吸光度を読み取った。３つ組値からのｂ－ヘキソサミニダーゼ放出の平均割合は、（ＯＤ上清／ＯＤ上清＋ ＯＤ溶解物）×１００（％）として計算した。
【0099】
統計
データは、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ （ｖ ８．０）を用いて、ｔ検定または２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析のいずれかによって分析した。
データは、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ （ｖ ８．０）を用いて、ｔ検定または２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析のいずれかによって分析した。
【0100】
[実施例２]
ニューロキニンＡは肥満細胞活性化後の皮膚において増加する
ニューロキニンＡは末梢感覚ニューロンから放出され、ヒトおよびラットの皮膚で検出されているが、マウス皮膚での発現は報告されていない。マウス皮膚における発現を確認し、ＭＣ活性化とＮＫＡ発現の潜在的関係を評価するために、マウス皮膚ホモジネート中のＮＫＡレベルを、定常状態および受動的皮膚アナフィラキシーモデル（ＰＣＡ）を用いたＩｇＥ誘導性肥満細胞活性化後に調べた。ＮＫＡのベーサルレベルは検出不可能に近かった。しかし、ＭＣ活性化の２４時間後、ＮＫＡレベルは上昇した（図１Ａ）。ＭＣ上のＮＫ２Ｒ発現は、免疫蛍光顕微鏡法（図１Ｂ）およびフローサイトメトリー（図７Ａ）により確認された。これらのデータは、ＭＣの活性化により誘導される炎症が局所ＮＫＡレベルを調節すること、およびＭＣが微小環境におけるＮＫＡの変化に応答する能力を備えていることを示唆する。
ニューロキニンＡは肥満細胞活性化後の皮膚において増加する
ニューロキニンＡは末梢感覚ニューロンから放出され、ヒトおよびラットの皮膚で検出されているが、マウス皮膚での発現は報告されていない。マウス皮膚における発現を確認し、ＭＣ活性化とＮＫＡ発現の潜在的関係を評価するために、マウス皮膚ホモジネート中のＮＫＡレベルを、定常状態および受動的皮膚アナフィラキシーモデル（ＰＣＡ）を用いたＩｇＥ誘導性肥満細胞活性化後に調べた。ＮＫＡのベーサルレベルは検出不可能に近かった。しかし、ＭＣ活性化の２４時間後、ＮＫＡレベルは上昇した（図１Ａ）。ＭＣ上のＮＫ２Ｒ発現は、免疫蛍光顕微鏡法（図１Ｂ）およびフローサイトメトリー（図７Ａ）により確認された。これらのデータは、ＭＣの活性化により誘導される炎症が局所ＮＫＡレベルを調節すること、およびＭＣが微小環境におけるＮＫＡの変化に応答する能力を備えていることを示唆する。
【0101】
[実施例３]
外因性ニューロキニンＡはＰＣＡにおけるＭＣ機能を下方制御する
ニューロキニンＡは、ＭＣの浸潤および活性化を特徴とするアレルギー性ＣＨＳのモデルにおいて炎症を阻害する。本明細書において、ＰＣＡにおいてＮＫＡが上方制御されることが実証され、ＮＫＡは当然ＭＣの活性化を阻害し得るという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、ＣＨＳを阻害する濃度でＰＣＡ誘導の３時間前にＮＫＡでマウスを前処理した。ニューロキニンＡ前処理は、耳厚の減少、組織切片の浮腫の減少、およびエバンスブルー色素の血管外漏出の減少として見られるＰＣＡの初期（１～２時間）段階を阻害した（図１Ｃ～Ｅ）。ニューロキニンＡ前処理はまた、耳厚の減少、組織切片に見られる好中球流入の減少、およびミエロペルオキシダーゼ活性の減少に反映されるＰＣＡの後期段階（２４時間）を低減させた（図１Ｂ、１Ｆ、図７Ｂ）。後期ＰＣＡに対するＮＫＡ前処理の効果は、炎症性サイトカインを評価するタンパク質アレイを用いてさらに特徴付けられた。ＩｇＥ処理した皮膚をＰＣＡ誘導２４時間後にビヒクル処理した皮膚と比較すると、ＭＣ生存（ＩＬ－３）、Ｔｈ２免疫（ＩＬ－１３、ＩＬ－４）、走化性（ＭＣＰ１、およびＲＡＮＴＥＳ）および自然炎症（ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６）に関連するサイトカインが有意に増加した（図１Ｇ、図７Ｃ、Ｄ）。ニューロキニンＡ前処理は、ＩｇＥ処理皮膚におけるＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦを有意に減少させた。統計学的に有意ではなかったが、ＩＦＮγレベルは、ＮＫＡ処理皮膚において増加し、これは肺におけるＮＫＡによるＩＦＮγ誘導を示す報告と一致している。
外因性ニューロキニンＡはＰＣＡにおけるＭＣ機能を下方制御する
ニューロキニンＡは、ＭＣの浸潤および活性化を特徴とするアレルギー性ＣＨＳのモデルにおいて炎症を阻害する。本明細書において、ＰＣＡにおいてＮＫＡが上方制御されることが実証され、ＮＫＡは当然ＭＣの活性化を阻害し得るという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、ＣＨＳを阻害する濃度でＰＣＡ誘導の３時間前にＮＫＡでマウスを前処理した。ニューロキニンＡ前処理は、耳厚の減少、組織切片の浮腫の減少、およびエバンスブルー色素の血管外漏出の減少として見られるＰＣＡの初期（１～２時間）段階を阻害した（図１Ｃ～Ｅ）。ニューロキニンＡ前処理はまた、耳厚の減少、組織切片に見られる好中球流入の減少、およびミエロペルオキシダーゼ活性の減少に反映されるＰＣＡの後期段階（２４時間）を低減させた（図１Ｂ、１Ｆ、図７Ｂ）。後期ＰＣＡに対するＮＫＡ前処理の効果は、炎症性サイトカインを評価するタンパク質アレイを用いてさらに特徴付けられた。ＩｇＥ処理した皮膚をＰＣＡ誘導２４時間後にビヒクル処理した皮膚と比較すると、ＭＣ生存（ＩＬ－３）、Ｔｈ２免疫（ＩＬ－１３、ＩＬ－４）、走化性（ＭＣＰ１、およびＲＡＮＴＥＳ）および自然炎症（ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６）に関連するサイトカインが有意に増加した（図１Ｇ、図７Ｃ、Ｄ）。ニューロキニンＡ前処理は、ＩｇＥ処理皮膚におけるＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦを有意に減少させた。統計学的に有意ではなかったが、ＩＦＮγレベルは、ＮＫＡ処理皮膚において増加し、これは肺におけるＮＫＡによるＩＦＮγ誘導を示す報告と一致している。
【0102】
[実施例４]
ニューロキニンＡは、ＢＭＭＣにおけるＳＴＡＴ５の活性化およびそれに続く転写を阻害する
ＰＣＡにおいて、ＮＫＡはＴ細胞によって産生されると考えられるＩＬ－３の放出ならびにＭＣ産生サイトカインのパネル：ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭｃＰ１を阻害した。ＭＣおよび他の細胞では、これらのサイトカインやケモカインの産生はＳＴＡＴ５の活性化と関連している。したがって、ＮＫＡはＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害し、アレルギーおよび炎症に関連する因子の下流の転写を阻害する可能性があるとという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、ＦｃεＲＩで活性化されたＢＭＭＣに対するＮＫＡの効果を直接評価するｉｎ ｖｉｔｒｏアプローチを利用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に増殖するＩｇＥ活性化ＢＭＭＣが利用され、皮膚のＭＣをよりよく反映するが増殖があまり堅固ではない結合組織型ＰＭＣを用いた主要な知見が確認された。ＮＫ２Ｒの発現はＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方で同等であった（図８Ａ）。
ニューロキニンＡは、ＢＭＭＣにおけるＳＴＡＴ５の活性化およびそれに続く転写を阻害する
ＰＣＡにおいて、ＮＫＡはＴ細胞によって産生されると考えられるＩＬ－３の放出ならびにＭＣ産生サイトカインのパネル：ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭｃＰ１を阻害した。ＭＣおよび他の細胞では、これらのサイトカインやケモカインの産生はＳＴＡＴ５の活性化と関連している。したがって、ＮＫＡはＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害し、アレルギーおよび炎症に関連する因子の下流の転写を阻害する可能性があるとという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、ＦｃεＲＩで活性化されたＢＭＭＣに対するＮＫＡの効果を直接評価するｉｎ ｖｉｔｒｏアプローチを利用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に増殖するＩｇＥ活性化ＢＭＭＣが利用され、皮膚のＭＣをよりよく反映するが増殖があまり堅固ではない結合組織型ＰＭＣを用いた主要な知見が確認された。ＮＫ２Ｒの発現はＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方で同等であった（図８Ａ）。
【0103】
最初に、ＮＫＡがＭＣ由来のサイトカインの放出を阻害するというｉｎ ｖｉｖｏ所見が確認された。ＴＮＦおよびＩＬ－１３のレベルは、ＭＣの自然およびアレルギー性炎症機能を代表するものとして注目された。ＮＫＡ存在下、ＩｇＥ＋Ａｇで一晩活性化した後、活性化から６０分後に転写を行った。ＩＬ－１３およびＴＮＦの放出（図２Ａ）ならびに転写（図２Ｂ）は、いずれもＮＫＡによって阻害された。ＦｃεＲＩで活性化されたＭＣでは、ＳＴＡＴ５のリン酸化および核移行がＩＬ１３およびＴＮＦの転写の上流にある。したがって、ＩｇＥをＡｇで架橋した１５分後、フローサイトメトリーで検出されたｐＴｙｒ６９５－ＳＴＡＴ５は、対照のＢＭＭＣでピークに達し、ＮＫＡ存在下でＭＣを活性化させた場合は減少した（図２Ｃ～Ｄ）。ＭＣにおける支配的なＳＴＡＴ５であるＳＴＡＴ５Ｂの核内転位は、イメージングフローサイトメトリーで評価した。ＳＴＡＴ５ＢはＩｇＥ架橋の３０分後および６０分後に増加し、ＮＫＡ存在下で活性化されたＢＭＭＣでは有意に減少した（図２Ｅ～Ｆ）。これらのデータを総合すると、ＮＫＡはＳＴＡＴ５の活性化、転写、および炎症促進性サイトカインでありＴｈ２に傾くサイトカインであるＩＬ－１３およびＴＮＦの放出を阻害することが示唆される。
【0104】
[実施例５]
ＮＫＡはＩＬ－１０依存的機構によりＭＣの活性化を阻害する
ＩＬ－１０のような免疫調節性サイトカインは、ＦｃεＲＩ誘導性のＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害する。ＮＫＡと共に一晩培養した後に活性化したＢＭＭＣの上清中のＩＬ－１０を評価すると、活性化６０分後にＩＬ－１０タンパク質の有意な増加およびＩＬ１０ ＲＮＡの増加が認められた（図３Ａ～Ｂ）。ＮＫＡを介した抑制におけるＩＬ－１０の機能的役割について、ＩＬ－１０ ＫＯ ＢＭＭＣを用いて検討した。ＩｇＥ誘導性の活性化に応答して、ＩＬ－１０ ＫＯ ＢＭＭＣはＷＴ ＢＭＭＣと比較して有意に低いレベルのＩＬ－１３およびＴＮＦを放出し、これは過去の報告と一致している（図３Ｃ）。ＩＬ－１０の自己分泌がない場合、ＮＫＡはＩＬ－１３またはＴＮＦの放出を阻害しなかった（図３Ｄ）。この観察は、Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ＷＴおよびＭＣ特異的ＣｒｅがＩＬ－１０欠失を駆動するＭｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ｆｌ／ｆｌマウスから増殖させたＰＭＣを用いて確認された。ＢＭＭＣで観察されたように、ＮＫＡは対照Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ＷＴのＰＭＣからのＩＬ－１３とＴＮＦ放出を阻害した（図３Ｅ）。ＰＭＣ由来のＩＬ－１０がない場合、ＮＫＡの効果は逆転した。これらのデータを総合すると、自己分泌ＩＬ－１０が、ＮＫＡがＦｃεＲＩ誘導性ＭＣ活性化を阻害するのに必要であることが実証される。
ＮＫＡはＩＬ－１０依存的機構によりＭＣの活性化を阻害する
ＩＬ－１０のような免疫調節性サイトカインは、ＦｃεＲＩ誘導性のＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害する。ＮＫＡと共に一晩培養した後に活性化したＢＭＭＣの上清中のＩＬ－１０を評価すると、活性化６０分後にＩＬ－１０タンパク質の有意な増加およびＩＬ１０ ＲＮＡの増加が認められた（図３Ａ～Ｂ）。ＮＫＡを介した抑制におけるＩＬ－１０の機能的役割について、ＩＬ－１０ ＫＯ ＢＭＭＣを用いて検討した。ＩｇＥ誘導性の活性化に応答して、ＩＬ－１０ ＫＯ ＢＭＭＣはＷＴ ＢＭＭＣと比較して有意に低いレベルのＩＬ－１３およびＴＮＦを放出し、これは過去の報告と一致している（図３Ｃ）。ＩＬ－１０の自己分泌がない場合、ＮＫＡはＩＬ－１３またはＴＮＦの放出を阻害しなかった（図３Ｄ）。この観察は、Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ＷＴおよびＭＣ特異的ＣｒｅがＩＬ－１０欠失を駆動するＭｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ｆｌ／ｆｌマウスから増殖させたＰＭＣを用いて確認された。ＢＭＭＣで観察されたように、ＮＫＡは対照Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ＷＴのＰＭＣからのＩＬ－１３とＴＮＦ放出を阻害した（図３Ｅ）。ＰＭＣ由来のＩＬ－１０がない場合、ＮＫＡの効果は逆転した。これらのデータを総合すると、自己分泌ＩＬ－１０が、ＮＫＡがＦｃεＲＩ誘導性ＭＣ活性化を阻害するのに必要であることが実証される。
【0105】
[実施例６]
ＭＣ由来のＩＬ－１０は、ＮＫＡ誘導性のＰＣＡの阻害に必要である
次に、ＰＣＡにおけるＮＫＡおよびＩＬ－１０の関係を調べた。ＭＣに関するｉｎ ｖｉｔｒｏ観察とは対照的に、全皮膚ホモジネートにおいて、ＩＬ－１０タンパク質は、ＮＫＡ前処理マウスでは増加しなかった（図７Ｅ）。しかし、このような広範なスクリーニングでは、自己分泌のＭＣ由来ＩＬ－１０の寄与は、皮膚の他の細胞によってマスクされた可能性がある。あるいは、ＭＣ由来のＩＬ－１０がより早い時点で重要である可能性もある。ＮＫＡがＭＣ由来のＩＬ－１０を調節する能力をより具体的に評価するために、ＩＬ１０－ｅＧＦＰレポーターマウスを用いた。この系統は転写レポーターであるが、ｅＧＦＰの発現はタンパク質と相関する。この方法で検出されたＩＬ１０－ｅＧＦＰの割合は、ナイーブマウス由来のＭＣでは低く、ＰＣＡ誘導後に増加した。ニューロキニンＡは、ＰＣＡ誘導の有無に関わらず、ＩＬ１０－ｅＧＦＰ＋ ＭＣの割合を２倍に特異的に増加させた（図９Ａ～Ｃ）。この所見を裏付けるために、ビヒクルまたはＮＫＡで処理したＭＣ充足マウス（Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ－ ｘ Ｒｏｓａ２６ＤＴＡ＋）およびＭＣ欠損マウス（Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ Ｒｏｓａ２６ＤＴＡ＋）の皮膚でＩＬ１０ ｍＲＮＡを評価した（図３Ｅ）。 ＮＫＡはＭＣ充足マウスではＩＬ１０ ｍＲＮＡレベルを有意に増加させたが、ＭＣ欠損マウスではＩＬ１０ ｍＲＮＡに差がなかったことから、ＮＫＡはＭＣ依存的に皮膚のＩＬ－１０を増加させることが示唆された。
ＭＣ由来のＩＬ－１０は、ＮＫＡ誘導性のＰＣＡの阻害に必要である
次に、ＰＣＡにおけるＮＫＡおよびＩＬ－１０の関係を調べた。ＭＣに関するｉｎ ｖｉｔｒｏ観察とは対照的に、全皮膚ホモジネートにおいて、ＩＬ－１０タンパク質は、ＮＫＡ前処理マウスでは増加しなかった（図７Ｅ）。しかし、このような広範なスクリーニングでは、自己分泌のＭＣ由来ＩＬ－１０の寄与は、皮膚の他の細胞によってマスクされた可能性がある。あるいは、ＭＣ由来のＩＬ－１０がより早い時点で重要である可能性もある。ＮＫＡがＭＣ由来のＩＬ－１０を調節する能力をより具体的に評価するために、ＩＬ１０－ｅＧＦＰレポーターマウスを用いた。この系統は転写レポーターであるが、ｅＧＦＰの発現はタンパク質と相関する。この方法で検出されたＩＬ１０－ｅＧＦＰの割合は、ナイーブマウス由来のＭＣでは低く、ＰＣＡ誘導後に増加した。ニューロキニンＡは、ＰＣＡ誘導の有無に関わらず、ＩＬ１０－ｅＧＦＰ＋ ＭＣの割合を２倍に特異的に増加させた（図９Ａ～Ｃ）。この所見を裏付けるために、ビヒクルまたはＮＫＡで処理したＭＣ充足マウス（Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ－ ｘ Ｒｏｓａ２６ＤＴＡ＋）およびＭＣ欠損マウス（Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ Ｒｏｓａ２６ＤＴＡ＋）の皮膚でＩＬ１０ ｍＲＮＡを評価した（図３Ｅ）。 ＮＫＡはＭＣ充足マウスではＩＬ１０ ｍＲＮＡレベルを有意に増加させたが、ＭＣ欠損マウスではＩＬ１０ ｍＲＮＡに差がなかったことから、ＮＫＡはＭＣ依存的に皮膚のＩＬ－１０を増加させることが示唆された。
【0106】
ＮＫＡ媒介性のＰＣＡ抑制における自己分泌ＩＬ－１０の機能をＭｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ＷＴおよびＭｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ｆｌ／ｆｌマウスを用いて評価した。Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ＷＴマウスおよびＭｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ｘＩＬ１０ｆｌ／ｆｌマウスのＣＤ４５＋細胞およびＭＣの数は同等であった（示さず）。ＮＫＡの免疫調節能は、ＰＣＡ誘導後２時間および２４時間で消失した（図３Ｆ）。ＮＫＡはＭｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ｘＩＬ１０ＷＴマウスではエバンスブルー色素の血管外漏出を阻害したが、Ｍｃｐｔ５Ｃｒｅ＋ ｘ ＩＬ１０ｆｌ／ｆｌマウスでは血管外漏出に影響を及ぼさなかった（図３Ｇ）。サイトカインアレイにより、ＩＬ－１３およびＴＮＦはＰＣＡ中に上方制御し、ＮＫＡにより下方制御された。Ｍｃｐｔ５ Ｃｒｅ＋ｘＩＬ１０ＷＴマウスにおいて、これらのタンパク質がＮＫＡによって有意に下方制御されることを、ＥＬＩＳＡを用いて確認した（図３Ｈ）。ＭＣ由来のＩＬ－１０の非存在下では、ＮＫＡの投与は皮膚におけるＩＬ－１３およびＴＮＦを増加させた。これらのデータを総合すると、ＭＣ由来のＩＬ－１０がＮＫＡの阻害効果に必要であることが示唆される。
【0107】
[実施例７]
内因性ＮＫＡは皮膚においてＩＬ－１０により調節される
本明細書のデータは、ＮＫＡがＩＬ－１０依存的にＭＣ活性化を阻害することを示している。皮膚におけるＮＫＡの調節についてはほとんど知られていない。そこで次に、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－１０とＮＫＡの間に関係があるかどうかを調べた。これに対処するために、ＷＴマウスおよびＩＬ－１０ ＫＯマウスの定常状態およびＰＣＡ誘導後のＮＫＡレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。ＷＴマウスの皮膚ホモジネートでは、ＮＫＡレベルは定常状態では低く、ＰＣＡ後に有意に増加した（図１Ｂ、図３Ｉ）。ＩＬ－１０ ＫＯマウスの皮膚ホモジネートでは、ＰＣＡ誘導後もＮＫＡは低いままであった。逆に、外因性組換えＩＬ－１０を投与すると、ＰＣＡ誘導なしに定常状態のＮＫＡが有意に増加した（図３Ｉ）。合わせると、このデータは、ＩＬ－１０とＮＫＡとの間の周期的関係を示している。
内因性ＮＫＡは皮膚においてＩＬ－１０により調節される
本明細書のデータは、ＮＫＡがＩＬ－１０依存的にＭＣ活性化を阻害することを示している。皮膚におけるＮＫＡの調節についてはほとんど知られていない。そこで次に、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－１０とＮＫＡの間に関係があるかどうかを調べた。これに対処するために、ＷＴマウスおよびＩＬ－１０ ＫＯマウスの定常状態およびＰＣＡ誘導後のＮＫＡレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。ＷＴマウスの皮膚ホモジネートでは、ＮＫＡレベルは定常状態では低く、ＰＣＡ後に有意に増加した（図１Ｂ、図３Ｉ）。ＩＬ－１０ ＫＯマウスの皮膚ホモジネートでは、ＰＣＡ誘導後もＮＫＡは低いままであった。逆に、外因性組換えＩＬ－１０を投与すると、ＰＣＡ誘導なしに定常状態のＮＫＡが有意に増加した（図３Ｉ）。合わせると、このデータは、ＩＬ－１０とＮＫＡとの間の周期的関係を示している。
【0108】
[実施例８]
ＮＫＡは、ＢＭＭＣおよびＰＭＣにおける顆粒放出に対して異なる効果を有する
ニューロキニンＡは、脱顆粒関連浮腫を含むＰＣＡを完全に阻害した。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩｇＥ誘発脱顆粒に対するＮＫＡの効果を調べた。古典的な研究から、ＮＫＡ単独ではＭＣの細胞内カルシウムフラックス、β－ヘキソサミニダーゼ、またはヒスタミン放出に影響を与えないことが示唆されている。この観察と一致して、ＮＫＡとインキュベートした、またはＮＫＡの存在下でＩｇＥおよび抗原で活性化したＢＭＭＣまたはＰＭＣからのβ－ヘキソサミニダーゼ放出に違いは見られなかった（図８Ｂおよび８Ｃ）。ＮＫＡは、脱顆粒の他の経路に影響するという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、活性化から３０分後に細胞表面から出芽した顆粒状タンパク質をアビジンで標識し、細胞膜と融合したエキソサイトーシス小胞を抗ＬＡＭＰ１で標識した。ＮＫＡの有無に関わらず、活性化されたＢＭＭＣは細胞表面に同量のアビジン＋顆粒およびＬＡＭＰ－１を発現した（図４Ａ～Ｂ）。対照的に、ＮＫＡは、対照と比較して、アビジン＋およびＬＡＭＰ－１＋ＰＭＣの割合を減少させた（図４Ｃ～Ｄ）。
ＮＫＡは、ＢＭＭＣおよびＰＭＣにおける顆粒放出に対して異なる効果を有する
ニューロキニンＡは、脱顆粒関連浮腫を含むＰＣＡを完全に阻害した。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩｇＥ誘発脱顆粒に対するＮＫＡの効果を調べた。古典的な研究から、ＮＫＡ単独ではＭＣの細胞内カルシウムフラックス、β－ヘキソサミニダーゼ、またはヒスタミン放出に影響を与えないことが示唆されている。この観察と一致して、ＮＫＡとインキュベートした、またはＮＫＡの存在下でＩｇＥおよび抗原で活性化したＢＭＭＣまたはＰＭＣからのβ－ヘキソサミニダーゼ放出に違いは見られなかった（図８Ｂおよび８Ｃ）。ＮＫＡは、脱顆粒の他の経路に影響するという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、活性化から３０分後に細胞表面から出芽した顆粒状タンパク質をアビジンで標識し、細胞膜と融合したエキソサイトーシス小胞を抗ＬＡＭＰ１で標識した。ＮＫＡの有無に関わらず、活性化されたＢＭＭＣは細胞表面に同量のアビジン＋顆粒およびＬＡＭＰ－１を発現した（図４Ａ～Ｂ）。対照的に、ＮＫＡは、対照と比較して、アビジン＋およびＬＡＭＰ－１＋ＰＭＣの割合を減少させた（図４Ｃ～Ｄ）。
【0109】
[実施例９]
ショットガンプロテオミクスによってＭＣ活性化中にＮＫＡによって影響を受ける経路を同定した
ニューロキニンＡは、ＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方からＩＬ－１０依存的にサイトカイン放出を阻害したが、エキソサイトーシスに対する作用は異なっていた。ＮＫＡは、従来の脱顆粒の特徴とは独立した、活性化の初期に共有される経路に影響を与えるという仮説が立てられた。ＮＫＡが調節するタンパク質を同定するため、ＦｃεＲＩ－活性化によって開始されるメディエータ放出におけるＮＫＡの役割をより深く理解するためのショットガンプロテオミクスを行った。ＢＭＭＣは、ＰＭＣよりも大量に増殖し、この種のスクリーニングに必要な量のタンパク質を容易に供給することから、このスクリーニングに選択した。この広範なスクリーニングで、ＩｇＥ活性化上清中に２３２個のタンパク質が特異的に放出され、９４個のタンパク質がＮＫＡによって上方制御された（図４Ｅ、各条件で放出されたタンパク質の上位２０個を表１～２に要約）。活性化後に検出されたタンパク質の経路（Ｐａｔｈｗａｙ）解析から、ＮＫＡは２つの経路に関連するタンパク質の放出を阻害することが示唆された：ミトコンドリアタンパク質を含む代謝と、プロテアーゼを含む細胞機能であり、従来はＩｇＥ活性化ＭＣによって放出される（図４Ｆ）。神経ペプチドとミトコンドリアタンパク質の放出の関係は、以前に報告されている。したがって、分析は、活性化上清から同定されたタンパク質のカバー面積を対照に対して正規化し、プロテアーゼについて半定量的分析を行った、タンパク質の後の分類に焦点を当てた（図４Ｇ）。β－ヘキソサミニダーゼ、ＭＣカルボキシペプチダーゼ、カテプシンＤおよびキマーゼを含むＢＭＭＣ活性化に一般的に関連するプロテアーゼの放出は、ＮＫＡによって変化しなかった（図４Ｈ）。しかしながら、システインプロテアーゼの触媒サブユニットであるカルパイン１は、ＩｇＥ＋Ａｇで活性化されたＢＭＭＣから様々なレベルで検出されたが、ＮＫＡ存在下で活性化されたＢＭＭＣからは検出されなかった。
ショットガンプロテオミクスによってＭＣ活性化中にＮＫＡによって影響を受ける経路を同定した
ニューロキニンＡは、ＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方からＩＬ－１０依存的にサイトカイン放出を阻害したが、エキソサイトーシスに対する作用は異なっていた。ＮＫＡは、従来の脱顆粒の特徴とは独立した、活性化の初期に共有される経路に影響を与えるという仮説が立てられた。ＮＫＡが調節するタンパク質を同定するため、ＦｃεＲＩ－活性化によって開始されるメディエータ放出におけるＮＫＡの役割をより深く理解するためのショットガンプロテオミクスを行った。ＢＭＭＣは、ＰＭＣよりも大量に増殖し、この種のスクリーニングに必要な量のタンパク質を容易に供給することから、このスクリーニングに選択した。この広範なスクリーニングで、ＩｇＥ活性化上清中に２３２個のタンパク質が特異的に放出され、９４個のタンパク質がＮＫＡによって上方制御された（図４Ｅ、各条件で放出されたタンパク質の上位２０個を表１～２に要約）。活性化後に検出されたタンパク質の経路（Ｐａｔｈｗａｙ）解析から、ＮＫＡは２つの経路に関連するタンパク質の放出を阻害することが示唆された：ミトコンドリアタンパク質を含む代謝と、プロテアーゼを含む細胞機能であり、従来はＩｇＥ活性化ＭＣによって放出される（図４Ｆ）。神経ペプチドとミトコンドリアタンパク質の放出の関係は、以前に報告されている。したがって、分析は、活性化上清から同定されたタンパク質のカバー面積を対照に対して正規化し、プロテアーゼについて半定量的分析を行った、タンパク質の後の分類に焦点を当てた（図４Ｇ）。β－ヘキソサミニダーゼ、ＭＣカルボキシペプチダーゼ、カテプシンＤおよびキマーゼを含むＢＭＭＣ活性化に一般的に関連するプロテアーゼの放出は、ＮＫＡによって変化しなかった（図４Ｈ）。しかしながら、システインプロテアーゼの触媒サブユニットであるカルパイン１は、ＩｇＥ＋Ａｇで活性化されたＢＭＭＣから様々なレベルで検出されたが、ＮＫＡ存在下で活性化されたＢＭＭＣからは検出されなかった。
【0110】
[実施例１０]
細胞外カルパインはＮＫＡによって調節される
プロテオミクススクリーニングの目的は、ＦｃεＲＩで活性化されたＭＣから放出され、ＮＫＡによって制御される候補分子（複数可）を同定することであった。このワイドスクリーニングは、細胞外カルパインがＮＫＡによって調節されている可能性を示唆した。この観察は、ＩｇＥの活性化後の細胞非含有上清中のカルパイン活性を評価することで確認された。ＭＣを活性化すると、ＢＭＭＣからの細胞外カルパイン活性が増加したが、これはＮＫＡによって有意に下方制御された（図５Ａ）。重要なことに、カルパイン活性はＰＭＣ上清中にも検出され、ＮＫＡによって有意に低下した（図５Ｂ）。ＢＭＭＣおよびＰＭＣで評価した場合、ＮＫＡはエキソサイトーシスの従来のマーカーに異なる効果を示したが、カルパインの放出の下方制御能については同様の効果を示した。
細胞外カルパインはＮＫＡによって調節される
プロテオミクススクリーニングの目的は、ＦｃεＲＩで活性化されたＭＣから放出され、ＮＫＡによって制御される候補分子（複数可）を同定することであった。このワイドスクリーニングは、細胞外カルパインがＮＫＡによって調節されている可能性を示唆した。この観察は、ＩｇＥの活性化後の細胞非含有上清中のカルパイン活性を評価することで確認された。ＭＣを活性化すると、ＢＭＭＣからの細胞外カルパイン活性が増加したが、これはＮＫＡによって有意に下方制御された（図５Ａ）。重要なことに、カルパイン活性はＰＭＣ上清中にも検出され、ＮＫＡによって有意に低下した（図５Ｂ）。ＢＭＭＣおよびＰＭＣで評価した場合、ＮＫＡはエキソサイトーシスの従来のマーカーに異なる効果を示したが、カルパインの放出の下方制御能については同様の効果を示した。
【0111】
[実施例１１]
ニューロキニンＡはＩＬ－１０分解システインプロテアーゼであるカルパインの外在化を調節する
ＭＣでは、細胞内カルパインはＩｇＥ誘導性脱顆粒、ＮＦκＢの活性化、下流のサイトカイン産生に必要である。しかし、ＦｃεＲＩライゲーションに反応するＢＭＭＣとＰＭＣのＭＣセクレトームを評価した同様のプロテオミクス研究では報告されているが、ＭＣの生物学における細胞外カルパインの役割については、まだ検討されていない。
ニューロキニンＡはＩＬ－１０分解システインプロテアーゼであるカルパインの外在化を調節する
ＭＣでは、細胞内カルパインはＩｇＥ誘導性脱顆粒、ＮＦκＢの活性化、下流のサイトカイン産生に必要である。しかし、ＦｃεＲＩライゲーションに反応するＢＭＭＣとＰＭＣのＭＣセクレトームを評価した同様のプロテオミクス研究では報告されているが、ＭＣの生物学における細胞外カルパインの役割については、まだ検討されていない。
【0112】
ＮＫＡがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＩｇＥ誘導性ＭＣ応答を調節する能力には、自己分泌ＩＬ－１０が必要であった。興味深いことに、ＩＬ－１０はカルパインのようなシステインプロテアーゼによって分解され、バイオインフォマティクス解析によってマウスＩＬ－１０のアミノ酸配列におけるカルパインの切断部位が確認された（データは示さず）。カルパインとＩＬ－１０の関係を直接調べるために、組換え（ｒ）ＩＬ－１０を漸増的な濃度の精製カルパインとインキュベートした後、ウェスタンブロットでＩＬ－１０を検出した。バイオインフォマティクスの予測と一致して、ウェスタンブロットで検出されたＩＬ－１０の量はカルパインの濃度に反比例した（図５ＣおよびＤ）。
【0113】
ＩｇＥ活性化ＭＣからのＩＬ－１０放出の初期動態をカルパイン活性との関連で調べた。活性化前に無血清培地で最低３時間休息させたＢＭＭＣｓを用いた。この休息期間により、ＭＣから放出されたＩＬ－１０を蓄積させることができた。活性化後５分以内にＩＬ－１０レベルは減少した。逆にカルパイン活性は上昇した（図５Ｅ）。次に、活性化後のＩＬ－１０の減少が外在化したカルパインに関係しているという仮説を検証した。細胞内カルパイン活性はＭＣの脱顆粒に必要であるため、ＭＣ外在化カルパインとＩＬ－１０分解を直接調べるアプローチは限られている。この制限を克服するために、活性化１０分後にＢＭＭＣから細胞非含有上清を回収し、カルパイン阻害剤Ａｃ－カルパスタチンで３０分間パルスした。Ａｃ－カルパスタチンはカルパイン活性を２０．１±１．７２％阻害した（図示せず、ｎ＝３の平均±ＳＥＭ）。ＩｇＥ活性化ＢＭＭＣの上清をＡｃ－カルパスタチンでパルスすると、ＩＬ－１０レベルが部分的に回復し（図５Ｆ）、これはカルパインが自己分泌ＩＬ－１０を分解することを実証している。これらのデータを総合すると、ＩｇＥ活性化ＭＣはカルパインを放出し、このカルパインが細胞外ＩＬ－１０を分解することが示されている。
【0114】
定常状態では、ＭＣは低レベルのＩＬ－１０を放出するが、これはカルパイン依存的にＩｇＥ活性化後に減少する。ＮＫＡはカルパインの放出を阻害するため、ＮＫＡと初期のＩＬ－１０レベルとの関係を評価した。ＮＫＡで活性化されたＢＭＭＣからの上清は、有意に多くのＩＬ－１０を含んでおり、これは、ＮＫＡがＩＬ－１０の初期のタンパク質分解を阻害したことを示唆している（図５Ｇ）。このことをより具体的に検証するために、ＢＭＭＣｓをＮＫＡあり／なしで活性化し、細胞非含有上清を回収し、次いでｒＩＬ－１０で３０分間パルスし、ＥＬＩＳＡで定量化した。ＩｇＥ＋Ａｇで活性化したＢＭＭＣの細胞非含有上清から回収されたＩＬ－１０は、対照培地のみ、または未処理もしくはＮＫＡ処理ＢＭＭＣのいずれかから回収した「脱顆粒上清」から検出されたＩＬ－１０の量と比較すると、有意に少なかった（図５Ｈ）。このデータは、ＢＭＭＣが初期ＩＬ－１０を分解するカルパインを含むプロテアーゼを放出し、この経路がＮＫＡによって破壊されるという仮説と一致する。
【0115】
[実施例１２]
ＮＫＡはカルパイン放出ＡＢＣＡ１の表面発現を下方制御する
カルパインは分泌シグナルを欠き、グリブリド感受性ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）Ａ１チャネルを含むエキソサイトーシス非依存的な手段でＴ細胞およびメラノーマから外在化される。ＮＫＡの存在下または非存在下で、ＩｇＥ＋Ａｇで活性化されたＭＣの表面ＡＢＣＡ１発現を調べた。ＩｇＥ誘導性活性化後、ＡＢＣＡ１の発現はＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方で上方制御した。ＮＫＡの存在は、細胞表面で検出されたＡＢＣＡ１のレベルを低下させた（図６Ａ、Ｂ）。次に、ＢＭＭＣを漸増的な濃度のグリブリドで処理し、活性化後のカルパイン活性およびＩＬ－１０レベルを測定して、カルパインがＭＣにおいてはＡＢＣＡ１を通じて放出されることを確認した。グリブリドはカルパイン活性を低下させる一方、ＩＬ－１０レベルを上昇させ（図６Ｃ）、このことは、他の細胞で報告されているように、ＭＣにおいてもカルパインはＡＢＣＡ１を介して放出されることを示唆している。これらのデータを総合すると、ＭＣはＡＢＣＡ１チャネルを通してＩＬ－１０分解カルパインを放出し、この経路はＮＫＡによって調節されることが実証された。
ＮＫＡはカルパイン放出ＡＢＣＡ１の表面発現を下方制御する
カルパインは分泌シグナルを欠き、グリブリド感受性ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）Ａ１チャネルを含むエキソサイトーシス非依存的な手段でＴ細胞およびメラノーマから外在化される。ＮＫＡの存在下または非存在下で、ＩｇＥ＋Ａｇで活性化されたＭＣの表面ＡＢＣＡ１発現を調べた。ＩｇＥ誘導性活性化後、ＡＢＣＡ１の発現はＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方で上方制御した。ＮＫＡの存在は、細胞表面で検出されたＡＢＣＡ１のレベルを低下させた（図６Ａ、Ｂ）。次に、ＢＭＭＣを漸増的な濃度のグリブリドで処理し、活性化後のカルパイン活性およびＩＬ－１０レベルを測定して、カルパインがＭＣにおいてはＡＢＣＡ１を通じて放出されることを確認した。グリブリドはカルパイン活性を低下させる一方、ＩＬ－１０レベルを上昇させ（図６Ｃ）、このことは、他の細胞で報告されているように、ＭＣにおいてもカルパインはＡＢＣＡ１を介して放出されることを示唆している。これらのデータを総合すると、ＭＣはＡＢＣＡ１チャネルを通してＩＬ－１０分解カルパインを放出し、この経路はＮＫＡによって調節されることが実証された。
【0116】
[実施例１３]
ＡＢＣＡ１の阻害はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＭＣの活性化を遮断する
ニューロキニンＡは、もっぱらＰＭＣにおけるエキソサイトーシスと顆粒化タンパク質の放出を阻害したが、ＢＭＭＣでは阻害しなかった。ＮＫＡと同様に、グリブリドはＩｇＥ誘導性活性化後、ＬＡＭＰ－１＋およびアビジン＋ＰＭＣの割合を減少させたが、ＢＭＭＣに対する効果はそれほど強くはなかった（図６Ｄ）。ニューロキニンＡは、ＩｇＥ誘導性のＩＬ－１３およびＴＮＦ放出、ならびにＡＢＣＡ１表面発現を遮断した。グリブリドによるＡＢＣＡ１機能の阻害は、ＮＫＡの効果の表現型を模写するという仮説が立てられた。培養２０～２４時間後、グリブリドは、ＢＭＭＣとＰＭＣの両方において、ＮＫＡの効果を模倣して、ＩＬ－１０の検出可能なレベルを増加させ、ＩＬ－１３およびＴＮＦのレベルを減少させた（図６Ｅ）。重要なことに、グリブリドはＮＫＡ媒介性の阻害をそれ以上増加させることはなく、ＮＫＡおよびＡＢＣＡ１の阻害は機能的に冗長であることが示唆された。次いで、ＰＣＡ誘導の前にＡＢＣＡ１の阻害が、ＮＫＡの作用と同様に調節性であるという仮説が立てられた。これを検証するため、ＰＣＡ誘導の３時間前にマウスをグリブリドで処理した。グリブリドは２時間後および２４時間後の耳厚を有意に減少させ、皮膚のＩＬ－１３およびＴＮＦのレベルを減少させた（図６Ｆ～Ｈ）。総合すると、このデータは、ＮＫＡがＡＢＣＡ１の発現を減少させ、ＡＢＣＡ１を遮断することによってＦｃεＲＩ誘導性ＭＣ活性化が阻害されることを示唆する。
ＡＢＣＡ１の阻害はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＭＣの活性化を遮断する
ニューロキニンＡは、もっぱらＰＭＣにおけるエキソサイトーシスと顆粒化タンパク質の放出を阻害したが、ＢＭＭＣでは阻害しなかった。ＮＫＡと同様に、グリブリドはＩｇＥ誘導性活性化後、ＬＡＭＰ－１＋およびアビジン＋ＰＭＣの割合を減少させたが、ＢＭＭＣに対する効果はそれほど強くはなかった（図６Ｄ）。ニューロキニンＡは、ＩｇＥ誘導性のＩＬ－１３およびＴＮＦ放出、ならびにＡＢＣＡ１表面発現を遮断した。グリブリドによるＡＢＣＡ１機能の阻害は、ＮＫＡの効果の表現型を模写するという仮説が立てられた。培養２０～２４時間後、グリブリドは、ＢＭＭＣとＰＭＣの両方において、ＮＫＡの効果を模倣して、ＩＬ－１０の検出可能なレベルを増加させ、ＩＬ－１３およびＴＮＦのレベルを減少させた（図６Ｅ）。重要なことに、グリブリドはＮＫＡ媒介性の阻害をそれ以上増加させることはなく、ＮＫＡおよびＡＢＣＡ１の阻害は機能的に冗長であることが示唆された。次いで、ＰＣＡ誘導の前にＡＢＣＡ１の阻害が、ＮＫＡの作用と同様に調節性であるという仮説が立てられた。これを検証するため、ＰＣＡ誘導の３時間前にマウスをグリブリドで処理した。グリブリドは２時間後および２４時間後の耳厚を有意に減少させ、皮膚のＩＬ－１３およびＴＮＦのレベルを減少させた（図６Ｆ～Ｈ）。総合すると、このデータは、ＮＫＡがＡＢＣＡ１の発現を減少させ、ＡＢＣＡ１を遮断することによってＦｃεＲＩ誘導性ＭＣ活性化が阻害されることを示唆する。
【0117】
[実施例１４]
考察
神経ペプチドは、皮膚炎症を開始および増幅し、またアレルギー性免疫応答を制御することが示されている。したがって、ＮＫＡはＩＬ－１０依存的にＭＣの活性化を阻害し、ＡＢＣＡ１依存性のＩＬ－１０分解酵素カルパインの放出を減少させ、ＩＬ１０の転写を増加させる。多層的なＩＬ－１０の制御を通して、ＮＫＡは微小環境におけるＩＬ－１０の利用可能性を延長し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＭＣの機能を低下させる。
考察
神経ペプチドは、皮膚炎症を開始および増幅し、またアレルギー性免疫応答を制御することが示されている。したがって、ＮＫＡはＩＬ－１０依存的にＭＣの活性化を阻害し、ＡＢＣＡ１依存性のＩＬ－１０分解酵素カルパインの放出を減少させ、ＩＬ１０の転写を増加させる。多層的なＩＬ－１０の制御を通して、ＮＫＡは微小環境におけるＩＬ－１０の利用可能性を延長し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＭＣの機能を低下させる。
【0118】
ＭＣ媒介性の免疫応答におけるＩＬ－１０の役割は、実験モデルによって異なる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、自己分泌ＩＬ－１０はＩｇＥ誘導性ＭＣ活性化を阻害し、ＩＬ－１０の長期処理は、ＩｇＥによって開始されるＦｃεＲＩの発現、ＳＴＡＴ５の活性化およびＴＮＦの放出を阻害するが、ＩＬ－１３の放出は選択的に促進する。これとは対照的に、ＩＬ－１０欠損ＢＭＭＣはＴＮＦとＩＬ－１３の放出が障害されており、ＩＬ－１０の非存在は脱顆粒には影響しない。これらの観察結果に従い、自己分泌ＩＬ－１０を欠損したＰＭＣおよびＢＭＭＣは、ＩｇＥ誘導性反応が障害されることが、２つの異なる系を用いて本明細書で示された。しかし、ＮＫＡがＭＣの機能を抑制する能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＩＬ－１０に依存していた。これらの研究を総合すると、自己分泌ＩＬ－１０はｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫活ＭＣの分化には必要であり得るが、ＦｃεＲＩによる活性化の過程では、自己分泌ＩＬ－１０は抑制的である可能性が示唆される。
【0119】
Ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＭＣ生物学におけるＩＬ－１０の機能もまた異なっている。粘膜組織では、ＩＬ－１０はＩｇＥ誘導性ＭＣ活性化を促進する。しかし、皮膚では、ＭＣ由来のＩＬ－１０は、紫外線誘導性免疫抑制、接触性皮膚炎、およびＣＨＳのモデルにおける炎症の抑制と関連している。本発明者らの研究は、自己分泌ＩＬ－１０の非存在はＰＣＡの初期段階には影響しなかったが、ＴＮＦレベルはＰＣＡの後期段階で上昇した。重要なことに、ＮＫＡがＰＣＡを下方制御する能力にはＩＬ－１０が必要であった。これらのデータを総合すると、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＣとＩＬ－１０の関係は組織に依存する可能性があり、皮膚ではＩＬ－１０はＭＣ機能を調節していることが示唆される。
【0120】
ＮＫＡまたはＮＫＡの天然切断型（ＮＫＡ（４－１０））をＭＣで研究した以前の研究では、その効果は示されていない。これらの研究は、ＭＣ活性化のための読み取りとしてβ－ヘキソサミニダーゼまたはヒスタミン放出に依存していた。これらの研究と一致して、ＢＭＭＣまたはＰＭＣからのβ－ヘキソサミニダーゼ放出に対するＮＫＡの効果は見出されなかった。しかしながら、初期ＭＣ活性化の他の特徴を含めるために研究を拡張したところ、ＮＫＡはアビジン＋顆粒の外在化を遮断することが見出されたが、それはＰＭＣにおいてのみであった。ＢＭＭＣおよびＰＭＣは共に同レベルのＮＫ２Ｒを発現しており、この差の要因として受容体の利用可能性は除外された。ＰＭＣは基本的にＢＭＭＣより成熟しており、成熟に関連したシグナル伝達経路がこの違いを考える上で重要かもしれない。この発見は、活性化の下流の初期事象を評価する際に、複数の種類のＭＣを用いることの重要性を強調している。
【0121】
ＭＣにおいて古典的に評価されているもの以外のＮＫＡによって影響を受ける可能性のあるタンパク質を同定するために、全セクレトームをスクリーニングした。このアプローチによって、カルパインＩを含むＮＫＡの存在下におけるＭＣからの差示的なタンパク質放出が明らかになった。重要なことに、カルパイン活性は、ＩｇＥ活性化ＢＭＭＣおよびＰＭＣの両方の上清から容易に検出可能であり、ＡＢＣＡ１を介したカルパインの放出は、成熟状態に関わらず、異なる種類のＭＣが細胞外環境を調節するために利用する共通の機構であり得る。
【0122】
細胞外環境においてカルパインの基質が利用可能になると、炎症が増大し、免疫応答の結果に広く影響を及ぼす可能性がある。ＭＣ上清中のカルパイン活性とＩＬ－１０の間に逆相関があることが本明細書で実証されている。同様の関係は、ＭＳ患者の末梢血単核球および外傷性脳損傷のげっ歯類モデルでも指摘されている。他の研究では、ＩＬ－１０はカルパインのようなシステインプロテアーゼによる分解を非常に受けやすく、Ｔ細胞上清をカルパインでパルスするとＩＬ－１０レベルが低下することが示されている。これらの知見に基づき、カルパインがＩＬ－１０を分解することが直接証明されている。この研究において、カルパインの活性とそれに続くＩＬ－１０の分解は、ＭＣ活性化後の初期事象と後の炎症性メディエータの放出とを結びつけており、外在化したカルパインが炎症を促進するという仮説を支持するものである。
【0123】
ＮＫＡは、グリブリド感受性ＡＢＣＡ１チャネルを介したＭＣからのプロテアーゼ放出の新しいモードを明らかにするために利用された。ＡＢＣＡ１レベルは、ＩｇＥ誘導性活性化後、ＭＣの細胞表面で増加した。これは、ｃＡＭＰ／ＰＫＡおよびＰＫＣを含む、ＦｃεＲＩの下流にある複数の経路の収束を反映している可能性がある。ＮＫＡおよびＮＫ２Ｒシグナル伝達と細胞表面のＡＢＣＡ１とを結びつける正確な細胞内機構の解明は、本研究の範囲外である。しかし、ＮＫ２ＲのようなＧＰＣＲは、特定のＧαサブユニットを介して相互作用し、ＰＫＡを活性化または調節する。下流のＡＢＣＡ１調節は、ＭＣセクレトームを制御するためにＧＰＣＲによって利用される共通の機構である可能性がある。
【0124】
ＡＢＣＡ１は脂質トランスポーターとして最もよく特徴付けされているが、ＡＢＣＡ１活性に関連した免疫機能も記載されている。グリブリドによるＡＢＣＡ１活性の阻害は、インフラマソーム、ＴＮＦを含む炎症性メディエータの転写を阻害し、敗血症の糖尿病患者において抗炎症作的および保護的である。ＭＣにおけるＡＢＣＡ１活性を評価する研究は限られているが、ＡＢＣＡ１の細胞表面への移行が脱顆粒および初期のサイトカイン放出に重要である可能性が示唆されている。ＡＢＣＡ１の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＮＫＡの効果を反映することがここで実証された。ＡＢＣＡ１活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＩＬ－１０の減少、ＴＮＦおよびＩＬ－１３の増加と関連し、ＰＣＡではＭＣ反応の増加と関連していた。総合すると、ＡＢＣＡ１の活性化は炎症と関連しており、この経路を局所的に操作することが臨床的に重要であることが証明されるかもしれない。
【0125】
ニューロキニンＡはＴＲＰＶ１＋知覚神経線維から放出され、ＩＬ－１０とカルパインの調節を介してＭＣ反応を阻害する。定常状態では、マウスの皮膚におけるＮＫＡレベルは低く、ＩＬ－１０依存的にＭＣの活性化に伴って上方制御される。このフィードバックループは、最終的には炎症を抑制するが、末梢感覚神経線維の反応も抑制する可能性がある。後根神経節（ＤＲＧ）はＩＬ－１０Ｒを発現しており、ＩＬ－１０は神経障害性疼痛を抑制し、熱低感受性を低下させる。さらに、ＤＲＧはシステインプロテアーゼに直接反応する。ＭＣ反応の下方制御に加えて、ＮＫＡ－カルパイン－ＩＬ１０経路は、ＭＣ－ニューロンシナプス内の侵害受容器の活性化を抑制する可能性がある。この経路を利用することで、アレルギー性炎症を軽減するために、ＭＣおよびニューロンの両方を標的とした新たな治療戦略が開けるかもしれない。
【0126】
参考文献
【0127】
【表1-1】
【0128】
【表1-2】
【0129】
【表1-3】
【0130】
【表1-4】
【0131】
【表1-5】
【0132】
【表1-6】
【0133】
【表1-7】
【0134】
【表1-8】
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図3-6】
【図3-7】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図4-7】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図6-6】
【図6-7】
【図6-8】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【配列表】
【国際調査報告】