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特表2024-518475アミロイド原線維および生分解性ポリマーをベースとするバイオプラスチック
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】アミロイド原線維および生分解性ポリマーをベースとするバイオプラスチック
(51)【国際特許分類】
C08J 3/00 20060101AFI20240423BHJP
C08L 89/02 20060101ALI20240423BHJP
C08L 101/16 20060101ALI20240423BHJP
C08L 29/04 20060101ALI20240423BHJP
【ＦＩ】
C08J3/00
C08L89/02 ZBP
C08L101/16
C08L29/04 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023569625
(86)(22)【出願日】2022-05-05
(85)【翻訳文提出日】2023-11-20
(86)【国際出願番号】 EP2022062215
(87)【国際公開番号】W WO2022238244
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】21173061.9
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508092576
【氏名又は名称】エーテーハー チューリヒ
(74)【代理人】
【識別番号】110002664
【氏名又は名称】弁理士法人相原国際知財事務所
(72)【発明者】
【氏名】バニャーニ， マッシモ
(72)【発明者】
【氏名】ペイダイェシュ， モハマド
(72)【発明者】
【氏名】メツェンガ， ラファエレ
【テーマコード（参考）】
4F070
4J002
4J200
【Ｆターム（参考）】
4F070AA02
4F070AA03
4F070AA26
4F070AA62
4F070AB11
4F070BA02
4F070BB08
4F070FA05
4F070FA17
4F070FC03
4J002AB01X
4J002AB04X
4J002AB05X
4J002AD02W
4J002BE02X
4J002CF18X
4J002FD20W
4J002FD20X
4J002GF00
4J002GG00
4J002GH00
4J002HA07
4J200AA27
4J200BA07
4J200BA25
(57)【要約】
本発明は、アミロイド原線維と生分解性ポリマーとを含む複合材料を製造するための新規な方法に関する。 本明細書に記載される方法は、環境に優しいことが証明されており、低品質/低純度の出発物質の使用を可能にする。具体的には、アミロイド原線維は、食品廃棄物から得ることができる。 本発明はさらに、特定のアミロイド原線維および生分解性ポリマーを含む新規な複合材料、そのような複合材料を含む物品、ならびにそのような複合材料の使用を提供する。本明細書に記載される複合材料は、個々の成分と比較した場合、予想外の有益な特性を示す。これらの有益な特性には、改善された機械的特性、改善された生分解性、改善された酸化防止特性、および有益な光学的特性が含まれる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複合材料の製造方法であって前記複合材料は、（ｉ）アミロイド原線維、および（ｉｉ）生分解性ポリマー、および任意に（ｉｉｉ）添加剤を含み、前記アミロイド原線維は、前記ポリマー内に分布しており；
前記方法は次の工程を含む：
－水溶性生分解性ポリマーのための方法（Ａ）－
（ａ）アミロイド形成タンパク質、生分解性ポリマー、水、ならびに任意選択で酸および任意選択で添加剤を合わせて、水性分散液を得るステップと、次いで
（ｂ）前記アミロイド形成タンパク質を、熱を加えることによってアミロイド原線維に変換し、それによって酸性溶液を得る工程；および
（ｃ）溶媒を除去することによって前記溶液を処理し、それによって固体複合材料を形成することと、任意選択で
（ｄ）こうして得られた複合材料をさらに処理して成形品を得る工程；
または
－非水溶性生分解性ポリマーのための方法（Ｂ）－
（ａ）アミロイド形成タンパク質、水、および任意に酸、および任意に添加剤を混合して、水性分散液（a－１）を得る工程、有機溶媒および非水溶性生分解性ポリマーを混合して、有機溶液（a－２）を得る工程；次いで
（ｂ）前記アミロイド形成タンパク質を加熱によりアミロイド原線維に変換してアミロイド原線維水溶液（b－１）を得、得られた溶液（b－１）と前記有機溶液（a－２）とを混合して混合液を得る工程と；および
（ｃ）溶媒を除去することによって前記混合溶液を処理し、それによって固体複合材料を形成することと；任意選択で
（ｄ）このようにして得られた複合材料をさらに処理して造形品を得る工程。
【請求項2】
前記アミロイド形成タンパク質が食品廃棄物からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
－工程（ａ）において、ｐＨを０．５～４、好ましくは２に調整し；及び／又は－工程（ａ）において、前記アミロイド形成タンパク質が、植物ベースのタンパク質から、好ましくはエンバク、エンドウマメ、ダイズ、ゼイン、ジャガイモ、イネ、ナタネから選択されるか、または前記デンプン産生タンパク質が、動物ベースのタンパク質から、好ましくは乳清、β-ラクトグロブリン、リゾチーム、ＢＳＡから選択され；
－前記工程（ｂ）において、反応混合物を５０－９５℃に１－１０時間、好ましくは９０℃／５時間加熱し、及び／又は
－前記工程（ｂ）において、反応混合物を撹拌し；
－前記工程（ｃ）において、反応混合物を急冷し、キャストし、水を蒸発させる；
－前記工程（ｄ）において、得られた複合材料をアルコール溶液中で架橋剤で化学的に処理する、
請求項１に記載の方法。
【請求項4】
１つ以上のさらなる工程（ｄ）をさらに含み、好ましくは、前記工程（ｄ）において、得られた複合材料が架橋剤で化学的に処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、または得られる複合材料。
【請求項6】
（ｉ）アミロイド原線維、（ｉｉ）生分解性ポリマー、および任意選択で（ｉｉｉ）添加剤を含む複合材料であって、前記アミロイド原線維が前記生分解性ポリマー内に分布しており、
－前記アミロイド原線維（ｉ）が、植物ベースのタンパク質の群から得られるか、または乳清から得られ；および／または
－前記生分解性ポリマー（ｉｉ）が、天然ポリマーおよび修飾天然ポリマーの群から選択され；ならびに／または
－前記添加剤（ｉｉｉ）は、可塑剤の群から選択され、他の添加剤（ｉｉｉ）は存在しない。
【請求項7】
－ポリマーの量は、１０～＜６６重量％、好ましくは２０～＜５０重量％の範囲である；－アミロイド原線維の量は３３～９０重量％以上、好ましくは５０～８０重量％以上である；
－添加剤の量は、０～４０重量％、好ましくは５～３５重量％の範囲であり、
それぞれ乾燥重量％に基づく、
請求項６に記載の複合材料。
【請求項8】
前記ポリマー（Ａ）が、次の通りである、－以下の規格：ＩＳＯ１４８５５、ＩＳＯ１４８５１、ＩＳＯ１４８５２、ＩＳＯ１７５５６、もしくはＩＳＯ１９６７９の1つもしくは複数に従って生分解性であるか；または
－以下の基準／規制：ＥＵ １３４３２ ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ、ＥＵ １４９９５ ＮＯＮ－ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ、ＵＳ ＡＳＴＭ Ｄ６４００またはＩＳＯ１７０８８の１つ以上に従って堆肥化可能である、
請求項６に記載の複合材料。
【請求項9】
前記生分解性ポリマーが、次の群から選択される、－合成ポリマー、好ましくは水溶性合成ポリマー、特に好ましくはＰＶＡまたは水不溶性合成ポリマー、特に好ましくはＰＬＡの群；または
－天然ポリマーおよび変性天然ポリマー、好ましくは水溶性ポリマー、特に好ましくはＭＣまたは水不溶性ポリマー、特に好ましくはデンプン、グルテン、セルロースの群、
請求項６に記載の複合材料。
【請求項10】
前記アミロイド原線維が、次の通りである、－植物ベースのタンパク質、好ましくは大豆、イネ、ナタネ、ヒマワリ、トウモロコシ、およびピーナッツの群から得られ、かつ／または
－乳清から得られ；および
－高いアスペクト比、好ましくは直径≦１０ｎｍおよび長さ≧１００ｎｍを有する、および／または
－高度に荷電した表面、好ましくはｐＨ４で２μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓのオーダーの電気泳動移動度を有する；および／または
－前記ポリマー内に均一に分布している
請求項６に記載の複合材料。
【請求項11】
前記添加剤が、可塑剤、架橋剤、酸、抗菌化合物、および疎水性剤から選択され、好ましくは可塑剤のみである、請求項６に記載の複合材料。
【請求項12】
以下の特徴の１つ以上を満たす、請求項６に記載の複合材料：－前記ポリマーと前記アミロイド原線維とが、均質なネットワークマトリックスを形成し；
－前記複合材料の水接触角は２０～１５０度、好ましくは５０～１２０度である
－前記複合材料は、可視領域（例えば６６０ｎｍ）において少なくとも５０～９９．９％の透過率を有する
－前記複合材料は、０．０１～４ＧＰａの範囲のヤング率を有する。
【請求項13】
次の形態である、請求項６に記載の複合材料－自立フィルムと；
－基材上もしくは物品上のコーティング；または
－顆粒またはペレットまたはブロック。
【請求項14】
特に箔、積層体、バッグ、容器、およびチューブからなる群から選択される、請求項６～１３のいずれか一項に記載の複合材料を含むか、またはそれからなる物品。
【請求項15】
生分解性複合材料の製造におけるアミロイド原線維の使用であって、以下から前記アミロイド原線維が得られる、使用。・植物ベースのタンパク質の群、好ましくはエンバク、エンドウ、ダイズ、ゼイン、ジャガイモ、イネ、ナタネから；または
・乳清から。
【請求項16】
請求項６～１３のいずれか一項に記載の複合材料の、包装材料、特に次の包装材料としての使用。－生鮮食品の包装材料として；
－熱い飲料および冷たい飲料を含む飲料のための包装材料として；
－加工食品／調理済み製品の包装材料として；
－スナック製品のための包装材料として；
－エレクトロニクスおよび衣服を含む非食品用の包装材料として。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミロイド原線維と生分解性ポリマーとを含む複合材料を製造するための新規な方法に関する。本明細書に記載される方法は、環境に優しいことが証明されており、低品質／低純度の出発物質の使用を可能にする。
具体的には、アミロイド原線維は、食品廃棄物から得ることができる。
具体的には、アミロイド原線維は、食品廃棄物から得ることができる。
【0002】
本発明はさらに、特定のアミロイド原線維および生分解性ポリマーを含む新規な複合材料、そのような複合材料を含む物品、ならびにそのような複合材料の使用を提供する。 本明細書に記載される複合材料は、個々の成分と比較した場合、予想外の有益な特性を示す。
【0003】
これらの有益な特性としては、改善された機械的特性（例えば、可撓性）、改善された生分解性、改善された酸化防止特性、および有益な光学的特性（例えば、ＵＶ遮断特性と組み合わされた、可視スペクトルにおける高い透明性）が挙げられる。
【背景技術】
【0004】
プラスチックは、最も豊富な人工材料の１つであり、その広範な使用は７０年前に始まったに過ぎないが、現在までに推定８３億メートルトン（Ｍｔ）のプラスチックが製造されている。プラスチックの生産は、使い捨て容器の集中的な利用によって劇的に加速され、包装は、現在、プラスチックの最大の市場である。毎年の世界生産の半分に相当する約１５０Ｍｔの固体プラスチックが、毎年世界中に捨てられている。
【0005】
プラスチックを製造するために使用されるほとんどのポリマーは、化石炭化水素から誘導され、化石燃料源に脅威をもたらす。さらに、最も一般的なプラスチックは生分解性ではなく、適切な熱処理によって永久的に破壊されない場合、自然環境または埋立地に蓄積し、地球の生態系に壊滅的な影響を及ぼす。
【0006】
世界的なプラスチック廃棄物の８０％までが環境を汚染することになり、プラスチック破片は環境中に非常に豊富であるため、人類新生（Anthropocene）時代の地質学的指標として使用することができる。
【0007】
これらの問題のいくつかに対する可能な解決策としてリサイクルが示唆されているが、このプロセスは、費用がかかり、時間がかかり、多くのポリマー材料に適用することができないので、世界的なプラスチック廃棄物の９％未満に限定されたままである。さらに、リサイクルによって得られるポリマーの品質は低い。
【0008】
これらの問題のいくつかに対する可能な解決策として、プラスチックをバイオプラスチックに置き換えることも提案されている。バイオプラスチックは、生分解性プラスチックおよびバイオベースプラスチックを含む。
【0009】
バイオベースプラスチックは、化石燃料の代わりに再生可能資源(例えば、セルロース、デンプン、ポリラクチドまたはポリヒドロキシアルカノエート)を用いて製造される。例えば、特許文献１には、多糖類を含む天然材料から、塩基性水溶液を用いて生分解性プラスチックを製造する方法が開示されている。得られた材料の物理的特性は、適切ではあるが、多くの用途には不十分であると考えられる。
【0010】
タンパク質ベースの生分解性プラスチックは、その広範な入手可能性、速い生分解速度、およびその食品グレードの性質のために注目を集めており、食用として分類され得るフィルムを生じる。タンパク質ベースのバイオプラスチックの主な欠点は、典型的には球状であり、親水性であり、水溶性である天然タンパク質モノマーの固有の性質に由来する。
これらの特性は、従来の製造プロセスを使用することを困難にし、それらは、不十分な機械的特性およびバリア特性を示し、水および湿度に敏感である。
特定のアミロイド原線維およびポリマーを含む複合材料、ならびにそれらの製造は、文献に記載されているが、それらは全て、本発明とは根本的に異なる。
これらの特性は、従来の製造プロセスを使用することを困難にし、それらは、不十分な機械的特性およびバリア特性を示し、水および湿度に敏感である。
特定のアミロイド原線維およびポリマーを含む複合材料、ならびにそれらの製造は、文献に記載されているが、それらは全て、本発明とは根本的に異なる。
【0011】
非特許文献１は、酵素固定化のためのナノ足場としてアミロイド原線維を考察している。この文献は、(i)ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）と、(ii)グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）で架橋されたウシインスリンからの予め変性されたアミロイド原線維とを含む複合フィルムを開示している。表２に示される結果は、ＧＯＤがアミロイド原線維上の架橋のためにその活性複合体を保持することを示す。
結果は、ＧＯＤへの架橋を伴わない複合材料が不利であることをさらに示す。さらに、非特許文献１は、アミロイド原線維が最初に水溶液中で得られ、次いでポリマーが添加される複合材料の調製を開示していることに留意されたい。このプロトコルは、商業的製造には不利であると考えられ、以下に記載される本発明の方法とは異なる。
結果は、ＧＯＤへの架橋を伴わない複合材料が不利であることをさらに示す。さらに、非特許文献１は、アミロイド原線維が最初に水溶液中で得られ、次いでポリマーが添加される複合材料の調製を開示していることに留意されたい。このプロトコルは、商業的製造には不利であると考えられ、以下に記載される本発明の方法とは異なる。
【0012】
非特許文献２は、ナノ複合材料の機能化可能な成分としてのアミロイド原線維を考察している。著者らは、アミロイド原線維をポリマー材料に組み込むことにより、フィルムの機械的特性および形態的（morphologal）特性に有用な変化を与えることができるという原理を証明しているが、複合材料の特性を最適化するためにはより多くの作業が必要であることも認識している。
具体的には、この文献は、０．６重量％のウシインスリン由来の予め変性されたアミロイド原線維と、ＰＶＡとを含む複合フィルムを開示している。さらに、非特許文献２は、アミロイド原線維が最初に水溶液中で得られ、次いでポリマーが添加される、複合材料の調製を開示することが注目される。このプロトコールもまた、商業的製造には不利であると考えられ、以下に記載する本発明の方法とは異なる。
具体的には、この文献は、０．６重量％のウシインスリン由来の予め変性されたアミロイド原線維と、ＰＶＡとを含む複合フィルムを開示している。さらに、非特許文献２は、アミロイド原線維が最初に水溶液中で得られ、次いでポリマーが添加される、複合材料の調製を開示することが注目される。このプロトコールもまた、商業的製造には不利であると考えられ、以下に記載する本発明の方法とは異なる。
【0013】
非特許文献３は、ＰＬＡおよびタンパク質線維を使用した新規なナノ充填ポリマー複合材料の調製を考察している。この文献は、天然のニワトリ卵白リゾチームおよびＰＬＡからの１～５重量％の前変性アミロイド原線維を含む複合フィルムを開示している。
【0014】
これらの刊行物の全てにおいて、複合材料を得るための出発材料は高純度であり、これらの方法を商業的用途には不適切なものにしている。さらに、このようにして得られた複合材料は、機械的および/または光学的特性の観点から、市場の期待には合致しない。さらに、非特許文献３は、アミロイド原線維が最初に水溶液中で得られ、次いでポリマーが添加される複合材料の調製を開示していることに留意されたい。このプロトコールもまた、商業的製造には不利であると考えられ、以下に記載する本発明の方法とは異なる。
【0015】
特許文献２は、マトリックス成分と補剛成分とを含む複合材料を考察している。マトリックス成分としてシリコーンポリマーが記載されており、硬化剤としてアミロイド原線維が記載されている。
この文献に記載されているポリマーは生分解性を欠いていることに留意されたい。さらに、特許文献２は、乾燥アミロイドをモノマー溶液に添加し、続いてモノマーをポリマーに重合し、それによって複合材料を得ることによる複合材料の調製を開示していることに留意されたい。また、このプロトコルは、商業的製造には不利であると考えられ、以下に記載される本発明の方法とは異なる。
この文献に記載されているポリマーは生分解性を欠いていることに留意されたい。さらに、特許文献２は、乾燥アミロイドをモノマー溶液に添加し、続いてモノマーをポリマーに重合し、それによって複合材料を得ることによる複合材料の調製を開示していることに留意されたい。また、このプロトコルは、商業的製造には不利であると考えられ、以下に記載される本発明の方法とは異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0016】
【特許文献1】米国特許出願公開第２００４／０２４９０６５号明細書
【特許文献2】国際公開第２０１０／０４１００９号（Ｋｎｏｗｌｅｓら）
【非特許文献】
【0017】
【非特許文献1】Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１０，２６（１），９３－１００
【非特許文献2】Ｒａｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１２，２８（１），２４８－２５６
【非特許文献3】Ｂｙｒｎｅら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，４７（２０１０）１２７９－１２８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
したがって、人間のニーズに対処し、我々の環境を考慮した高度な材料を提供する必要がある。現在使用されているプラスチックをより持続可能な材料に置き換えるさらなる必要性がある。 これらの先端材料が容易に入手可能であり、既知の技術を用いて加工することができるならば、有益であると考えられる。
さらに、環境に優しく、商業規模での適用に適した複合材料の製造方法を提供する必要がある。
さらに、環境に優しく、商業規模での適用に適した複合材料の製造方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0019】
上記目的の１つ以上は、請求項１に記載の複合材料および請求項９に記載の製造方法によって達成される。本発明のさらなる態様は、明細書および独立請求項に開示され、好ましい実施形態は、明細書および従属請求項に開示される。
【0020】
本発明の複合材料（「バイオプラスチック」）は、フィルムなどの成形品を製造するための最適な候補である。特に、アミロイド原線維は、バイオポリマーなどの異なる機能性添加剤と、フィルムなどの得られる市販製品の性能を改善するための添加剤とをブレンドすることによって調整された標的特性を有する新規バイオプラスチックを設計するためのビルディングブロックとして使用され得る。さらに、水安定性、疎水性および抗酸化活性などの他の重要な特性は、添加剤、化学処理またはコーティングによって調整することができる。
【0021】
これらの新規なバイオプラスチックは、非生分解性または毒性化合物を回避するために達成および調整することができる広範囲の特性によって特徴付けられる。さらに、これらのバイオプラスチックは、例えば食品産業の廃棄物によって主に得られる、使用されるタンパク質の非常に低いコストのおかげで、経済的な実行可能性を有する商業化のための大きな可能性を示す。さらに、新規な複合材料の製造は、安価で、規模を拡大でき、環境に優しく、特にフィルム形成に適していると考えられる。
究極的には、食物廃棄物を用いてバイオプラスチックを製造することは、２つの主な理由で食物産業を助ける：それは、持続可能性、廃棄物管理および価値化の点でそれらの生産を改善するだけでなく、それらの循環経済も直接改善する。
究極的には、食物廃棄物を用いてバイオプラスチックを製造することは、２つの主な理由で食物産業を助ける：それは、持続可能性、廃棄物管理および価値化の点でそれらの生産を改善するだけでなく、それらの循環経済も直接改善する。
【0022】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0023】
本明細書に提供/開示される様々な実施形態、選好および範囲は、任意に組み合わされ得ることが理解される。さらに、特定の実施形態に応じて、選択された定義、実施形態、または範囲が適用されない場合がある。
【0024】
本明細書で使用される場合、本発明の文脈(特に特許請求の範囲の文脈)で使用される用語「a」、「an」、「the」および類似の用語は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。
用語「含有する」は、「含む」、「本質的に～からなる」および「～からなる」を包含するものとする。
用語「含有する」は、「含む」、「本質的に～からなる」および「～からなる」を包含するものとする。
【0025】
本発明は、図面を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１は、本発明の第２の態様である本発明の複合材料および物品を製造するためのプロトコルの概略図である。例示的な例として、乳清タンパク質単離物、グリセロールおよびＰＶＡを水中に分散させ、溶液を酸性条件下で９０℃で５時間加熱して、乳清モノマーをアミロイド原線維に自己組織化させる。溶液をキャストして、溶媒蒸発を介してバイオプラスチックフィルムを得、続いて自立フィルムに形成する。
【図2】アミロイド原線維およびフィルム表面の特徴付けを示す。a）アミロイド原線維のＡＦＭ、ｂ）アミロイド原線維、グリセロールおよびＰＶＡの混合物のＡＦＭ、ｃ）ハイブリッドアミロイドフィルム上面のＳＥＭ、およびｄ）ハイブリッドモノマーフィルム上面のＳＥＭは、ＡＦＭ顕微鏡写真を示す。パネルａ）では、ｐＨ２のＭｉｌｌｉ－Ｑ水に分散させた純粋なβ－ラクトグロブリンから得られたアミロイド原線維。比較として、パネルｂ）は、ＷＰＩから、ＰＶＡおよびグリセロールの存在下で形成されたアミロイド原線維を示し、他の化合物が、溶液中でのβ－ラクトグロブリンのアミロイド原線維への自己集合を阻害しないことを確認する。
【図3】実施例で説明されるような異なる架橋処理後のフィルムの水接触角を示す。ヒストグラムは、ｙ軸上に、複合体（本発明、未処理）、天然ＷＰＩモノマーで作製されたフィルム（比較）、ＦＡＳで処理された複合体（本発明）、及びＣＡで処理された複合体（本発明）について測定された平均接触角（度（°））を示す。ｙ軸は水接触角（°）であり、ｘ軸はハイブリッドバイオプラスチックタイプ（黒色バー：アミロイド、白色の棒：単量体、水平方向にまばらな棒：アミロイドＦＡＳ、および垂直方向に疎なバー：アミロイドＣＡ）である。
【図4】図４は、複合材料の水相互作用を示し、ａ）時間（時間）に対する質量変化（％）、およびｂ）吸水率（％）を示す。ａ）ｙ軸は質量変化（％）であり、ｘ軸は時間（ｈ）である（実線：アミロイド、破線：単量体、点線：アミロイドＦＡＳおよび一点鎖線：アミロイドＣＡ）。ｂ）ｙ軸は吸水率（％）であり、ｘ軸はハイブリッドバイオプラスチックタイプである（黒いバー：アミロイド、白色の棒:単量体、水平方向にまばらな棒：アミロイドＦＡＳおよび垂直方向に疎なバー：アミロイドＣＡ）である。
【図5】図５は、複合材料の機械的特性を示す。ａ）応力-歪みプロット、ｂ）最大応力、ｃ）最大歪み、及びｄ）ヤング率を示す。ａ）ｙ軸は応力（ＭＰａ）であり、ｘ軸は歪み（％）である（実線：アミロイド、破線：モノマー、点線：アミロイドＦＡＳおよび一点鎖線：アミロイドＣＡ）。ｂ）ｙ軸は最大応力（Ｍｐａ）であり、ｘ軸はハイブリッドバイオプラスチックタイプ（黒いバー：アミロイド、白色の棒：単量体、水平方向にまばらな棒：アミロイドＦＡＳおよび垂直方向に疎なバー：アミロイドＣＡ）である。ｃ）ｙ軸は最大歪み（％）であり、ｘ軸はハイブリッドバイオプラスチックタイプ（黒いバー：アミロイド、白色の棒：単量体、水平方向に疎らな棒：アミロイドＦＡＳおよび垂直方向に疎なバー：アミロイドＣＡ）である。ｄ）ｙ軸はヤング率（ＧＰａ）であり、ｘ軸はハイブリッドバイオプラスチックタイプ（黒いバー：アミロイド、白色の棒:単量体、水平方向に疎らな棒：アミロイドＦＡＳおよび垂直方向に疎なバー：アミロイドＣＡ）である。
【図6】一般性、スケーラビリティ、および比較を示す。a）実施例による本発明の複合アミロイド原線維－ＭＣの外観を示す。ｂ）本発明の複合材料のスケーラビリティの例である。ｃ）本発明の複合材料および市販のプラスチックの機械的特性を示す。ｙ軸はヤング率（ＧＰａ）であり、ｘ軸は破断点伸び（％）である（ＥＰＯＸＹ：黒い左の三角形、ＰＨＢ：黒い六角形、ＰＥＥＫ：黒い菱形、ポリエステル：白直角三角形、ＰＥＴ：黒直角三角形、ＰＳ：黒三角、ＰＬＡ：白六角形、ＰＢＴ：白菱形、ＰＶＣ：白丸、ＨＩＰＳ：黒丸、ＰＰ：白三角、ＨＤＰＥ：黒三角、ＰＴＦＥ：白三角、ＰＢＳ：黒五角形、ＰＣＬ：白五角形、ＨＤＰＥ：黒三角、ＬＤＰＥ：白三角、ＥＰＤＭ：黒四角、ＨＡｍ－ＭＣ（♯２、本発明）：白星印、ＨＡｍ－ＰＶＡ（♯１、本発明）：黒星印）。
【図7】液体乳清および菜種ケーキ廃棄物からのアミロイド原線維バイオプラスチックを示す。ａ）液体乳清およびＰＶＡから作製されたハイブリッドアミロイドバイオプラスチックの写真である。ｂ）液体乳清から得られたアミロイド原線維の原子間力顕微鏡である。ｃ）菜種ケークおよびＰＶＡから作製されたハイブリッドアミロイドバイオプラスチックの写真である。ｄ）菜種ケークから得られたアミロイド原線維の原子間力顕微鏡である。さらなる詳細は実施例３に提供される。
【図8】乳清アミロイド原線維は、異なる純度グレードの乳清から作製されたハイブリッド化バイオプラスチックである。ａ）乳清タンパク質単離物から作製されたハイブリッドアミロイドバイオプラスチックの写真である。ｂ）乳清タンパク質単離物から得られたアミロイド原線維の原子間力顕微鏡写真である。ｃ）乳清タンパク質濃縮物から作製されたハイブリッドアミロイドバイオプラスチックの写真である。ｄ）乳清タンパク質濃縮物から得られたアミロイド原線維の原子間力顕微鏡法写真である。ｅ）液体スイート乳清から作製されたハイブリッドアミロイドバイオプラスチックの写真である。ｆ）液体スイート乳清から得られたアミロイド原線維の原子間力顕微鏡写真である。さらなる詳細は実施例４に提供される。
【0027】
図に関するさらなる詳細は、以下の実験において提供される。
【発明を実施するための形態】
【0028】
発明の詳細な説明
第１の態様において、本発明は、アミロイド原線維、生分解性ポリマーおよび任意選択的に添加剤を含有する（すなわち、「含む」または「からなる」）複合材料（「バイオプラスチック」、「複合材料」）に関する。
第１の態様において、本発明は、アミロイド原線維、生分解性ポリマーおよび任意選択的に添加剤を含有する（すなわち、「含む」または「からなる」）複合材料（「バイオプラスチック」、「複合材料」）に関する。
【0029】
以下にさらに概説するように、これらの本発明の複合材料は、例えば、乳業（a dairy industry）の副産物である乳清などの食品廃棄物タンパク質を価値付けすることによって、循環経済に価値を加える。本明細書に提示される結果は、世界的なプラスチック生産および汚染問題を軽減するための効率的で持続可能な安価な解決策としての、アミロイド原線維（例えば、乳清に基づく）および生分解性ポリマーを含む複合材料の可能性を実証する。
【0030】
さらに、本発明の複合材料は、個々の成分単独よりも優れた弾性および靭性などの物理的特性を有することが特に有利であると考えられる。驚くべきことに、乳清アミロイド原線維とＰＶＡとを混合することによって製造された複合材料は、乳清アミロイドまたはＰＶＡのいずれか単独によって製造されたフィルムと比較して、著しく良好な特性を示すことが見出された。複合フィルム（アミロイド原線維およびポリマーの両方を含む）は、従来のフィルム（ＰＶＡまたはアミロイドのみを含む）と比較して、有意により可撓性であり、より良好に折り畳みに耐える。同時に、純粋なアミロイドフィルムは、機械的安定性が低いことを特徴とし、その結果、極めて脆く、断片化され、水安定性が低いフィルムが生じ、純粋な形態での現実世界での用途が制限される。
【0031】
さらに、タンパク質アミロイド原線維をポリマーと組み合わせることによって、得られる複合材料の生分解性が著しく向上する。
【0032】
さらに、本発明の複合材料は、生分解性ポリマー単独では有していない抗酸化活性を示す。理論に拘束されることなく、アミロイド原線維の表面に露出した多数のアミノ酸がこの特徴を支持すると考えられる。
【0033】
さらに、複合フィルムは、ＵＶ遮断性と組み合わされた、可視領域における高い透明性を示す。アミロイド原線維は、その高い官能性のために、ポリマーとより効率的に相互作用し、タンパク質モノマーと比較して、より安定で、頑強で、かつ均一なブレンドをもたらす。
【0034】
したがって、本発明の複合材料の特性は、個々の成分の特性よりもはるかに優れており、タンパク質モノマーおよびポリマーを含む複合材料も上回る。
【0035】
本発明のこの態様は、以下にさらに詳細に説明される。
【0036】
アミロイド原線維：「アミロイド原線維」という用語は、当該分野で一般に知られており、特に、交差βシート二次構造で広く見出されるタンパク質またはペプチドによって作られる原線維を表す。したがって、アミロイド原線維という用語は、天然タンパク質および他のタイプの非アミロイドタンパク質凝集体を除外する。
【0037】
アミロイド原線維は、いくつかの異なるタンパク質源、植物ベースのタンパク質および動物ベースのタンパク質などの、集合的にアミロイド形成性タンパク質から得ることができる。
【0038】
実施形態において、アミロイド原線維は、植物ベースのタンパク質の群から得られ、好ましくは
・ ゼイン（例えば、トウモロコシから得られる）
・ ・・・（例えば、エンバク、エンドウ、ダイズ、ジャガイモから得られる）
・ 米タンパク質（例えば、米ぬかから得られる）
・ クルシフェリン、およびナピン（例えば、菜種から得られる）
・ ヘリアンチン（例えばヒマワリミールから得られる）
・ グリシニン、およびβ－コングリシニン（例えば、大豆カード／おからから得られる）、ならびに
・ ヘリアンチン（例えば、ヒマワリミールから得られる）。
・ ゼイン（例えば、トウモロコシから得られる）
・ ・・・（例えば、エンバク、エンドウ、ダイズ、ジャガイモから得られる）
・ 米タンパク質（例えば、米ぬかから得られる）
・ クルシフェリン、およびナピン（例えば、菜種から得られる）
・ ヘリアンチン（例えばヒマワリミールから得られる）
・ グリシニン、およびβ－コングリシニン（例えば、大豆カード／おからから得られる）、ならびに
・ ヘリアンチン（例えば、ヒマワリミールから得られる）。
【0039】
実施形態において、アミロイド原線維は、動物ベースのタンパク質の群から得られ、好ましくは
・ β－ラクトグロブリン（例えば、乳清から得られる）
・ ケラチン（例えば、羽毛から得られる）
・ リゾチーム（例えば、・・・から得られる）、および
・ ＢＳＡ（例えば、・・・から得られる）。
・ β－ラクトグロブリン（例えば、乳清から得られる）
・ ケラチン（例えば、羽毛から得られる）
・ リゾチーム（例えば、・・・から得られる）、および
・ ＢＳＡ（例えば、・・・から得られる）。
【0040】
好ましい実施形態において、アミロイド原線維は、動物ベースのタンパク質、好ましくはβ－ラクトグロブリン、およびＢＳＡの群から得られる。
特に好ましい実施形態において、アミロイド原線維は、動物ベースのタンパク質の群から、好ましくは乳清から得られる。
特に好ましい実施形態において、アミロイド原線維は、動物ベースのタンパク質の群から、好ましくは乳清から得られる。
【0041】
一例として、アミロイド原線維は乳清から得られる。乳清は、タンパク質の豊富な供給源であり、その最も豊富なものは、アミロイド原線維に容易に自己集合することができる球状タンパク質であるベータ-ラクトグロブリンである。 したがって、アミロイド原線維は、有利には乳清から得られる。理論に束縛されるものではないが、広範囲の機能性が、これらの食品タンパク質から得られる原線維を特徴付けると考えられ、単一モノマーの特性よりもはるかに優れたそれらの顕著な特性(高い剛性及びアスペクト比を含む)のおかげで、それらは、本明細書に記載される本発明の複合体を調製するのに特に好適であることが見出された。
【0042】
有利には、アミロイド原線維は、高いアスペクト比を有し、好ましくは直径≦１０ ｎｍおよび長さ≧１００ｎｍ、特に好ましくは直径≦１０ ｎｍおよび長さ≧２００ｎｍを有する。
有利には、アミロイド原線維は、高度に荷電した表面を有する。 高荷電表面という用語は、当該分野において一般的に知られており、特に、ｐＨ４で２μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓのオーダーの電気泳動移動度を示す表面を表す。
有利には、アミロイド原線維は、高度に荷電した表面を有する。 高荷電表面という用語は、当該分野において一般的に知られており、特に、ｐＨ４で２μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓのオーダーの電気泳動移動度を示す表面を表す。
【0043】
ポリマー：本発明によれば、ポリマーは生分解性である。
用語「生分解性ポリマー」は、当該分野で公知である。それは、天然に存在する細菌、真菌および藻類などの微生物の作用のおかげで分解するプラスチックを指す。
用語「生分解性ポリマー」は、当該分野で公知である。それは、天然に存在する細菌、真菌および藻類などの微生物の作用のおかげで分解するプラスチックを指す。
【0044】
さらに、ポリマーが生物学的プロセスによってバイオマス、二酸化炭素、水および無機化合物に分解しても毒性残渣が残らない場合、「堆肥化可能なポリマー」と定義される。したがって、全ての堆肥化可能なプラスチックは、生分解性ポリマーの群に属するが、全ての生分解性ポリマーが堆肥化可能なポリマーであるわけではない。
【0045】
さらに、生分解性ポリマーは、「バイオベースプラスチック」とは区別される。バイオベースプラスチックは、化石燃料ではなく再生可能資源を用いて製造されるが、再生可能資源をＰＥＴ用の構成要素に変換するものなど、すべてのバイオベースプラスチックが生分解性であるわけではない。したがって、生分解性ポリマーは、バイオプラスチックが必ずしも生分解性ではないという点で、バイオプラスチックとは区別される。
【0046】
実施形態において、ポリマーは、ｆｏｌｌｏｗｉｎｇＳＴＡＮＤＡＲＤＳ：ＩＳＯ１４８５５またはＩＳＯ１４８５１またはＩＳＯ１４８５２またはＩＳＯ１７５５６またはＩＳＯ１９６７９の１つ以上に従って生分解性である。
【0047】
実施形態において、ポリマーは、以下の基準／規制：ＥＵ１３４３２（ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ）またはＥＵ１４９９５（ＮＯＮ－ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ）またはＵＳＡＳＴＭ Ｄ６４００またはＩＳＯ１７０８８の１つ以上に従って堆肥化可能である。
【0048】
上記を考慮して、広範囲の生分解性ポリマーを使用することができる。有利には、それらは、上記の生分解性の要件を満たす。製造方法を考慮すると、可溶性ポリマーが特に有用である。このようなポリマーには、水溶性ポリマーおよび非水溶性ポリマーが含まれる。
【0049】
実施形態において、ポリマーは、以下を含む水溶性ポリマーの群から選択される。
・ ＰＶＡおよび
・ メチルセルロース（ＭＣ）などの水溶性多糖類。
・ ＰＶＡおよび
・ メチルセルロース（ＭＣ）などの水溶性多糖類。
【0050】
代替の実施形態において、ポリマーは、以下を含む非水溶性ポリマーの群から選択される。
・ ポリ乳酸（ＰＬＡ）、
・ ポリグリコリド（ＰＧＡ）、
・ ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）及び
・ ポリ－３－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）；
・ セルロース、デンプンなどの水不溶性多糖類；および
・ グルテンなどのタンパク質ベースポリマー。
・ ポリ乳酸（ＰＬＡ）、
・ ポリグリコリド（ＰＧＡ）、
・ ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）及び
・ ポリ－３－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）；
・ セルロース、デンプンなどの水不溶性多糖類；および
・ グルテンなどのタンパク質ベースポリマー。
【0051】
それらをアミロイド原線維と組み合わせて、本明細書に記載される複合材料を得ることによって、加工が困難であること、機械的特性が乏しいこと、バリア特性が乏しいこと、および水/湿気に対する感受性などの、タンパク質ベースの材料の欠点が軽減される。
【0052】
実施形態において、ポリマーは、合成ポリマーの群から選択される。合成の生分解性ポリマーは公知であり、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、例えば完全に加水分解されたＰＶＡ、またはポリ乳酸（ＰＬＡ、天然モノマーからの合成ポリマー）が挙げられる。市販されているような広範囲の分子量を、本発明の文脈において使用することができる。例えば、１００，０００≦Ｍｗ≦５００，０００、例えばＭｗ約２００，０００のＰＶＡが好適である。そのような合成ポリマーを含む複合材料は、容易に製造され、加工されることが見出された。それらの機械的および光学的特性は有利である。
【0053】
実施形態において、ポリマーは、天然ポリマーおよび修飾天然ポリマー、例えば、多糖類、例えば、メチルセルロース（ＭＣ）の群から選択される。市販されているような広範囲の粘度を本発明の文脈において使用することができる。例えば、１００ｃＰ≦粘度≦１，０００ｃＰ、例えば約４００ｃＰのＭＣが好適である。このようなポリマーを含む複合材料は、容易に製造および加工されることが見出された。それらの機械的および光学的特性は有利である。
【0054】
添加剤：製造を容易にするために、または材料の特性に有益な影響を与えるために、添加剤を含むことは、この分野では一般的である。このような添加剤は市販品であり、その種類および量は、意図される効果に合わせて当業者によって選択され得る。実施形態において、添加剤は、生分解性材料から選択される。添加剤には、可塑剤（グリセロールおよびソルビトールなど）；架橋剤（グルタルアルデヒド、ＧＡなど）；酸（特にクエン酸、ホウ酸、ＨＣｌなど）；抗菌化合物（銀、アジ化ナトリウムなど）および疎水性剤（ワックス、ＦＡＳなど）が含まれる。
【0055】
実施形態において、本発明の複合材料は添加剤を含まない。したがって、複合材料は、アミロイド原線維および生分解性ポリマーからなってもよい。
【0056】
実施形態において、本発明の複合材料は、唯一の添加剤として可塑剤を含む。従って、複合材料は、アミロイド原線維、生分解性ポリマーおよび可塑剤からなり得る。好ましい可塑剤はグリセロールである。
【0057】
複合材料：複合材料という用語は、当該分野において公知である。本発明によれば、それは、少なくとも２つの成分、生分解性ポリマーおよびアミロイド原線維を含む材料を指す。１種以上の添加剤が存在してもしなくてもよい。本発明によれば、本明細書で議論される各生分解性ポリマーは、本明細書で議論されるタンパク質原線維の各供給源と組み合わせることができる。
【0058】
好ましい実施形態において、複合材料は、生分解性ポリマーと、以下のリスト♯１～♯８（アミロイド原線維を形成するタンパク、すなわち、アミロイド形成タンパクが特定されている）に特定されるアミロイド原線維とを含む。
【0059】
【表1】
【0060】
実施形態において、生分解性ポリマーおよびアミロイド原線維は、均質なネットワークマトリックスを形成し、添加剤は、存在する場合、前記マトリックス内に分布している。好ましい実施形態において、生分解性ポリマーおよびアミロイド原線維は、均一な二重ネットワークマトリックスを形成し、添加剤は、存在する場合、前記マトリックス内に分布している。
実施形態では、アミロイド原線維は、前記ポリマー内にランダムに分布している。
実施形態では、アミロイド原線維は、前記ポリマー内にランダムに分布している。
【0061】
実施形態において、ポリマーの量は、１０から＜６６重量％の範囲であり、好ましくは２０から＜５０重量％の範囲である。実施形態において、アミロイド原線維の量は、≧３３～９０重量％の範囲、好ましくは≧５０～８０重量％の範囲である。 実施形態において、添加剤の量は、０～４０重量％、好ましくは５～３５重量％の範囲である。
【0062】
一実施形態において、本発明は、生分解性複合材料の製造におけるアミロイド原線維の使用、特に食品廃棄物から得られるアミロイド原線維の使用に関する。
【0063】
化学組成に加えて、本発明の複合材料は、物理的パラメータによって特徴付けられ得る。
有利には、複合材料は、２０～１５０°、好ましくは５０～１２０°の範囲の水接触角を有する広範囲の表面疎水性を有する。実施形態において、水接触角は５０°を超える。
有利には、複合材料は、目的とする用途および製造プロセスに応じて、０．０１～４ＧＰａの範囲のヤング率を有する。
有利には、複合材料は、５０～９９．９％の可視光透過率の範囲の高い透明度を有する。
有利には、複合材料は、２０～１５０°、好ましくは５０～１２０°の範囲の水接触角を有する広範囲の表面疎水性を有する。実施形態において、水接触角は５０°を超える。
有利には、複合材料は、目的とする用途および製造プロセスに応じて、０．０１～４ＧＰａの範囲のヤング率を有する。
有利には、複合材料は、５０～９９．９％の可視光透過率の範囲の高い透明度を有する。
【0064】
本発明の複合材料は、一般に固体成形品と呼ばれる様々な形態で得ることができる。これは、特に、以下に概説されるプロセスにおける工程（ｃ）に依存し、自立性薄膜、基材上のコーティング、顆粒、ペレットまたは鋳造ブロックを含む。多くの商業的に関連する用途を考慮すると、好ましい形態はフィルムである。本発明のフィルムは、溶液流延法もしくは押出法を含む当該分野で周知の方法によって、またはホットプレス法によって得ることができることが有利であると考えられる。
【0065】
プロセスによる製品：さらなる実施形態において、本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得ることができる、または本明細書に記載の方法に従って得られる複合材料を提供する。
【0066】
第２の態様において、本発明は、本発明の複合材料を製造する方法に関する。簡単に述べると、アミロイド形成タンパク質、例えば、β－ラクトグロブリンタンパク質、生分解性ポリマーおよび任意選択で添加剤を含む組成物を溶液中で合わせて、初期分散液を得る。加熱およびｐＨ調整の際に、アミロイド原線維へのタンパク質モノマーの自己集合が起こり、全ての成分が可溶化される。このようにして得られた溶液は、溶媒蒸発後に成形、例えばキャストして成形品、例えばフィルムを形成することができる。この製造方法は、単純で、拡張可能で、環境に優しいと考えられる。
本発明のこの態様は図１に示されており、以下にさらに詳細に説明され、方法Ａは水溶性ポリマーに適合され、方法Ｂは非水溶性ポリマーに適合される。
本発明のこの態様は図１に示されており、以下にさらに詳細に説明され、方法Ａは水溶性ポリマーに適合され、方法Ｂは非水溶性ポリマーに適合される。
【0067】
明らかになるように、本発明の方法によれば、溶解したポリマーをアミロドゲンタンパク質と接触させる。アミロイド原線維は、溶解したポリマーが存在する間に、アミロイド形成タンパク質から調製される。これは、アミロイド原線維が、ポリマーまたはプレポリマーと接触させる前に、アミロイド形成タンパク質から調製される、以前に記載された方法とは、明確に対照的である。従って、本発明の方法は、アミロイド原線維の別個の調製工程を回避し、従って、複合材料を得るための手順全体を単純化する。
第１の態様に開示された選択および実施形態、具体的にはアミロイド原線維、およびアミロイド形成タンパク質、および生分解性ポリマーが同様に適用されることが理解される。
第１の態様に開示された選択および実施形態、具体的にはアミロイド原線維、およびアミロイド形成タンパク質、および生分解性ポリマーが同様に適用されることが理解される。
【0068】
方法ａ：有利には、本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）天然のデンプン産生タンパク質（「タンパク質モノマー」、例えばベータ－ラクトグロブリン）（ｉ）、生分解性水溶性ポリマー（ｉｉ）、水（ｉｉｉ）および任意に酸（ｉｖ）および任意に添加剤（ｖ）を組み合わせて、水性分散液（ａ）を得る工程；
（ｂ）熱を加え、任意選択でｐＨを調整することによって、タンパク質モノマー（ｉ）をアミロイド原線維（ｖｉ）に変換し、それによって酸性溶液を得るステップと
（ｃ）前記溶媒を除去することによって前記酸性溶液を処理し、それによって複合材料を形成することと、任意選択で
（ｄ）このようにして得られた複合材料をさらに処理して造形品を得る工程
（ａ）天然のデンプン産生タンパク質（「タンパク質モノマー」、例えばベータ－ラクトグロブリン）（ｉ）、生分解性水溶性ポリマー（ｉｉ）、水（ｉｉｉ）および任意に酸（ｉｖ）および任意に添加剤（ｖ）を組み合わせて、水性分散液（ａ）を得る工程；
（ｂ）熱を加え、任意選択でｐＨを調整することによって、タンパク質モノマー（ｉ）をアミロイド原線維（ｖｉ）に変換し、それによって酸性溶液を得るステップと
（ｃ）前記溶媒を除去することによって前記酸性溶液を処理し、それによって複合材料を形成することと、任意選択で
（ｄ）このようにして得られた複合材料をさらに処理して造形品を得る工程
【0069】
個々のプロセス工程はそれ自体公知であるが、特定の出発物質にはまだ適用されておらず、図１に示されている。得られた複合材料は、十分に確立された方法に従ってさらに処理され得る（以下の工程（ｄ）を参照のこと）。製造全体が環境に優しく、環境に優しいことは、特に有利であると考えられる。
【0070】
方法Ｂ：有利には、本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）天然アミロドジェニックタンパク質（「タンパク質モノマー」、例えばベータ-ラクトグロブリン）（ｉ）、水（ｉｉ）および任意に酸（ｉｖ）および任意に添加剤（ｖ）を混合して水性分散液（a－１）を得、有機溶媒（vii）および生分解性非水溶性ポリマー（ｉｉ’）を混合して有機溶液（ａ－２）を得、次いで
（ｂ）熱を加え、任意にｐＨを調整することによって、タンパク質モノマー（ｉ）をアミロイド原線維（ｖｉ）に変換し、それによってアミロイド原線維（ｂ－１）の水溶液を得、このようにして得られた溶液（ｂ－１）を有機溶液（ａ－２）と合わせ、それによって合わせた溶液を得る工程；および
（ｃ）前記溶媒を除去することによって前記混合溶液を処理し、それによって複合材料を形成することと、任意選択で
（ｄ）このようにして得られた複合材料をさらに処理して造形品を得る工程
（ａ）天然アミロドジェニックタンパク質（「タンパク質モノマー」、例えばベータ-ラクトグロブリン）（ｉ）、水（ｉｉ）および任意に酸（ｉｖ）および任意に添加剤（ｖ）を混合して水性分散液（a－１）を得、有機溶媒（vii）および生分解性非水溶性ポリマー（ｉｉ’）を混合して有機溶液（ａ－２）を得、次いで
（ｂ）熱を加え、任意にｐＨを調整することによって、タンパク質モノマー（ｉ）をアミロイド原線維（ｖｉ）に変換し、それによってアミロイド原線維（ｂ－１）の水溶液を得、このようにして得られた溶液（ｂ－１）を有機溶液（ａ－２）と合わせ、それによって合わせた溶液を得る工程；および
（ｃ）前記溶媒を除去することによって前記混合溶液を処理し、それによって複合材料を形成することと、任意選択で
（ｄ）このようにして得られた複合材料をさらに処理して造形品を得る工程
【0071】
個々のプロセス工程は、それ自体公知であるが、特定の出発物質にはまだ適用されていない。上記有機溶媒と水が混和性相を形成する場合に有利である。
【0072】
密度、剛性および色を含む本発明の複合材料の重要な特性は、個々のプロセス工程を調整することによって簡単な方法で調整され得ることが特に有利であると考えられる。
【0073】
この方法は、十分に組織化された構造および前例のない特性を有する複合材料を提供することが特に有利であると考えられる。
さらに、得られた材料が、高い透明性などの独特の光学的特性を有することが特に有利であると考えられる。
さらに、得られた材料が、高い透明性などの独特の光学的特性を有することが特に有利であると考えられる。
【0074】
実施形態において、本発明は、本明細書に記載される複合材料をフィルムの形態で製造する方法に関する。この方法は、拡張可能であり、（既存の装置に適しているので）簡単であり、（水ベースであるので）環境に優しいと考えられる。具体的には、ＷＰＩ（乳清タンパク質分離物）を、グリセロールおよびＰＶＡまたは他の可溶性ポリマーから選択される水溶性ポリマーと共にｐＨ２の水に分散させる。次いで、溶液を加熱し、それによって全ての成分を均一に可溶化し、β－ラクトグロブリンタンパク質を自己集合アミロイド線維に変換する（例えば、９０℃で５時間）。この溶液を基板上にキャストし、続いて溶液を蒸発させ、それによって、個々の成分の特性よりも優れた特性を有する、本発明の複合材料を含有する自立した均一で透明なフィルムを得る。
【0075】
工程（ａ）、
水溶性ポリマー：ポリマーが水溶性である場合、水が溶媒として使用される。これらの出発物質はそれ自体公知である。それらを組み合わせ、ｐＨを０．５～４、例えばｐＨ＝２に調整することは、全く従来通りである。
非水溶性ポリマー：ポリマーが非水溶性である場合、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＤＭＦまたはエタノールなどのポリマー用の有機溶媒が、単独でまたは組み合わせて使用される。この実施形態において、アミロイド水溶液は、（ａ）および（ｂ）に従って別々に調製され；次いで、これは、極性溶媒中に別々に溶解されたバイオポリマーと混合され、そして得られた混合物は、工程（ｃ）に供される。
水溶性ポリマー：ポリマーが水溶性である場合、水が溶媒として使用される。これらの出発物質はそれ自体公知である。それらを組み合わせ、ｐＨを０．５～４、例えばｐＨ＝２に調整することは、全く従来通りである。
非水溶性ポリマー：ポリマーが非水溶性である場合、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＤＭＦまたはエタノールなどのポリマー用の有機溶媒が、単独でまたは組み合わせて使用される。この実施形態において、アミロイド水溶液は、（ａ）および（ｂ）に従って別々に調製され；次いで、これは、極性溶媒中に別々に溶解されたバイオポリマーと混合され、そして得られた混合物は、工程（ｃ）に供される。
【0076】
工程（ｂ）
熱を加えることによってアミロイド形成タンパク質モノマーをアミロイド原線維に変換し、それによって溶液を得ることは、当該分野で公知のプロセスである。有利には、反応混合物を撹拌する。有利には、反応混合物を７０～９５℃に１～１０時間、好ましくは９０℃／５時間加熱する。この工程は、急冷（quenching）によって終了され得る。
熱を加えることによってアミロイド形成タンパク質モノマーをアミロイド原線維に変換し、それによって溶液を得ることは、当該分野で公知のプロセスである。有利には、反応混合物を撹拌する。有利には、反応混合物を７０～９５℃に１～１０時間、好ましくは９０℃／５時間加熱する。この工程は、急冷（quenching）によって終了され得る。
【0077】
工程（ｃ）
この場合も、溶解したポリマーを含む溶液を固体に加工することは、当該技術分野において既知である。ポリマーおよびアミロイド原線維の特性のために、一般的なキャスティングおよび押出し技術が適用され得る。適切には、薄膜は、周囲条件下または制御された条件下で、例えば、適度な熱および／または減圧の適用によって、キャストされ、乾燥される。
この場合も、溶解したポリマーを含む溶液を固体に加工することは、当該技術分野において既知である。ポリマーおよびアミロイド原線維の特性のために、一般的なキャスティングおよび押出し技術が適用され得る。適切には、薄膜は、周囲条件下または制御された条件下で、例えば、適度な熱および／または減圧の適用によって、キャストされ、乾燥される。
【0078】
工程（ｄ）
本発明の方法は、さらなる工程、例えば、工程（a）の前または工程（c）の後に、精製、さらなる処理、組み立ておよび当業者に公知の他の工程を含む工程によって達成され得る。実施形態において、本発明の方法は、化学処理、例えばアルコール溶液中の架橋剤を含む、１つ以上の仕上げステップ（d）を含む。
本発明の方法は、さらなる工程、例えば、工程（a）の前または工程（c）の後に、精製、さらなる処理、組み立ておよび当業者に公知の他の工程を含む工程によって達成され得る。実施形態において、本発明の方法は、化学処理、例えばアルコール溶液中の架橋剤を含む、１つ以上の仕上げステップ（d）を含む。
【0079】
上記のように、製造は非常に柔軟である。得られた複合材料の化学的、機械的および光学的特性は、前駆体の濃度、乾燥温度および基材の種類および質感などの調製条件を変更することによって調整することができる。例えば、本発明の複合材料の疎水性および機械的安定性は、原線維（fibrils）およびポリマードメイン内の架橋を誘導する化学的処理によって都合よく調整することができる。
【0080】
第３の態様において、本発明はまた、本発明の複合材料の様々な使用、および本明細書に記載される複合材料を含むかまたはそれからなる物品に関する。他のバイオプラスチックと比較して、本発明の複合材料は、顕著な水安定性および疎水性挙動を示し、これらの材料が多くの用途に適し、それによって従来のプラスチックに取って代わることを可能にする。
【0081】
したがって、本発明は、箔、積層体、バッグ、容器、およびチューブからなる群から選択される物品を提供する。
【0082】
本発明の実施形態において、本発明の複合材料は、半完成品などの造形品として存在する。これは、典型的には、製造が完了した後の場合である。この形態において、本発明の複合材料は、典型的には、箔または押出物の形態である。
【0083】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の複合材料は、基材上のコーティングとして存在する。本発明の複合材料の意図される用途に応じて、広範囲の基材をコーティングすることができる。コーティングは、トップコーティングであってもよい。したがって、本発明はまた、基材とコーティングとを含む物品を提供し、前記コーティングは、本明細書に記載される本発明の複合材料からなる。このような物品には、包装材料が含まれる。
【0084】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の複合材料は、包装材料として、特に生鮮食品用の包装材料として;温かい飲料および冷たい飲料を含む飲料用の包装材料として;加工食品/調理済み製品用の包装材料として；スナック製品用の包装材料として、非食品、例えば電子機器または衣服用の包装材料として存在する。
【実施例】
【0085】
本発明をさらに説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定する意図なく提供される。
【0086】
出発物質、市販
乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）は、Fonterra(ニュージーランド)から供給された。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、完全に加水分解された、Ｍｗ約２０００００）および塩酸（３６％）は、Merckから購入した。メチルセルロース（ＭＣ）（粘度：４００ｃＰ）、グリセロール（≧９９．５％）、クエン酸（≧９９．５％）、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－パーフルオロオクチルトリエトキシシラン（ＦＡＳ）、２，２’－アジノビス（エチル－２,３－ジヒドロベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、及びTenax(登録商標)多孔質ポリマー吸着剤（６０～８０メッシュ）は、Sigma Aldrichから提供された。
乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）は、Fonterra(ニュージーランド)から供給された。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、完全に加水分解された、Ｍｗ約２０００００）および塩酸（３６％）は、Merckから購入した。メチルセルロース（ＭＣ）（粘度：４００ｃＰ）、グリセロール（≧９９．５％）、クエン酸（≧９９．５％）、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－パーフルオロオクチルトリエトキシシラン（ＦＡＳ）、２，２’－アジノビス（エチル－２,３－ジヒドロベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、及びTenax(登録商標)多孔質ポリマー吸着剤（６０～８０メッシュ）は、Sigma Aldrichから提供された。
【0087】
フィルム状複合材料
実施例１、ＨＡｍ－ＰＶＡ：ハイブリッドアミロイド（ＨＡｍ）原線維フィルムを製造するために、４ｇのＷＰＩを最初に１００ｍｌの水に溶解した。次いで、溶液のｐＨを２に調整し、可塑剤としてのグリセロール２ｇを溶液中に分散させた。ＰＶＡおよびＭＣを有するハイブリッドアミロイド原線維フィルムについては、２ｇの各化合物を溶液に添加した。ＷＰＩモノマーをアミロイド原線維に変換し、生分解性ポリマーを溶解するために、溶液を撹拌し、９０℃で５時間加熱した。インキュベーション後、溶液を直ちにペトリディッシュ上にキャストし、室温で乾燥させた。
実施例１、ＨＡｍ－ＰＶＡ：ハイブリッドアミロイド（ＨＡｍ）原線維フィルムを製造するために、４ｇのＷＰＩを最初に１００ｍｌの水に溶解した。次いで、溶液のｐＨを２に調整し、可塑剤としてのグリセロール２ｇを溶液中に分散させた。ＰＶＡおよびＭＣを有するハイブリッドアミロイド原線維フィルムについては、２ｇの各化合物を溶液に添加した。ＷＰＩモノマーをアミロイド原線維に変換し、生分解性ポリマーを溶解するために、溶液を撹拌し、９０℃で５時間加熱した。インキュベーション後、溶液を直ちにペトリディッシュ上にキャストし、室温で乾燥させた。
【0088】
実施例１．１、ＣＡで処理したＨＡｍ－ＰＶＡ：フィルム特性におけるＣＡの効果を研究するために、原線維化プロセスの前に、１．５ｇのＣＡを溶液に添加した。
【0089】
実施例１．２、ＦＡＳでコーティングしたＨＡｍ－ＰＶＡ：さらに、より疎水性のフィルムを製造するために、それらをＦＡＳ（０．５重量％）を含有するエタノール溶液中に１時間置いた。その後、室温下で乾燥し、ＦＡＳで被覆されたハイブリッドアミロイドフィルムを得た。
【0090】
実施例２：ＨＡｍ－ＭＣ：異なる複合材料を製造するためのアプローチの一般性、ＰＶＡはメチルセルロース（ＭＣ、セルロースのメチルエーテル）によって置き換えられる、図６を参照されたい。
パネルａ：このパネルに示されるように、得られたＨＡｍ－ＭＣフィルムは、平滑で、可撓性で、透明である。ＰＶＡおよびＭＣは両方とも生分解性ポリマーであるが、ＭＣは、生物源からのものであり、より持続可能であるという利点を有する。しかしながら、天然のＭＣハイブリッドアミロイド原線維フィルムの水安定性は、ＰＶＡを有するものよりも低い。
パネルｂ：より大規模なその産生によるハイブリッド乳清アミロイド原線維バイオプラスチックのスケーラビリティを示す。このパネルは、簡単な溶液キャスティング法によって首尾よく製造される、１．５ｍ×１．５ｍのサイズを有するバイオプラスチックフィルムの形態の本発明の複合材料を示す。
パネルc：ＰＶＡおよびＭＣに基づく本発明のフィルムの機械的特性を、異なるエンジニアリング、熱硬化性樹脂、ゴム、および生分解性プラスチックと比較する。観察されるように、この研究における両方のバイオプラスチックは、類似の弾性率を有するが、ＨＡｍ－ＰＶＡは、ＨＡｍ－ＭＣと比較してより高い伸長値を有し、７５０％の値に達する。この優れた歪み値は、ＨＡｍ－ＰＶＡフィルムを最も強靭なプラスチックの中に置く。一方、本発明のフィルムのヤング率は、ＰＴＦＥ、ＰＢＳ、ＰＣＬ、ＬＤＰＥ、およびＥＰＤＭの範囲内である。
パネルａ：このパネルに示されるように、得られたＨＡｍ－ＭＣフィルムは、平滑で、可撓性で、透明である。ＰＶＡおよびＭＣは両方とも生分解性ポリマーであるが、ＭＣは、生物源からのものであり、より持続可能であるという利点を有する。しかしながら、天然のＭＣハイブリッドアミロイド原線維フィルムの水安定性は、ＰＶＡを有するものよりも低い。
パネルｂ：より大規模なその産生によるハイブリッド乳清アミロイド原線維バイオプラスチックのスケーラビリティを示す。このパネルは、簡単な溶液キャスティング法によって首尾よく製造される、１．５ｍ×１．５ｍのサイズを有するバイオプラスチックフィルムの形態の本発明の複合材料を示す。
パネルc：ＰＶＡおよびＭＣに基づく本発明のフィルムの機械的特性を、異なるエンジニアリング、熱硬化性樹脂、ゴム、および生分解性プラスチックと比較する。観察されるように、この研究における両方のバイオプラスチックは、類似の弾性率を有するが、ＨＡｍ－ＰＶＡは、ＨＡｍ－ＭＣと比較してより高い伸長値を有し、７５０％の値に達する。この優れた歪み値は、ＨＡｍ－ＰＶＡフィルムを最も強靭なプラスチックの中に置く。一方、本発明のフィルムのヤング率は、ＰＴＦＥ、ＰＢＳ、ＰＣＬ、ＬＤＰＥ、およびＥＰＤＭの範囲内である。
【0091】
組成物および処理の詳細を表１に列挙する。
【表2】
【0092】
特性決定
アミロイド原線維およびフィルムの形態のそれらの複合材料の形態を特徴付けるために、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用した。ＡＦＭのために、溶液を劈開雲母上で乾燥させ、タッピングモードを適用することによって分析した。Hitachi SU5000走査型電子顕微鏡により、ハイブリッドバイオプラスチックフィルムの構造および特性を特徴付けた。フィルムの小片をペーストでスタブに取り付け、画像化前に惑星の自転運動下で５ｎｍの白金／パラジウムでスパッタコーティングした（Safematic、ＣＣＵ－１０、スイス）。
アミロイド原線維およびフィルムの形態のそれらの複合材料の形態を特徴付けるために、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用した。ＡＦＭのために、溶液を劈開雲母上で乾燥させ、タッピングモードを適用することによって分析した。Hitachi SU5000走査型電子顕微鏡により、ハイブリッドバイオプラスチックフィルムの構造および特性を特徴付けた。フィルムの小片をペーストでスタブに取り付け、画像化前に惑星の自転運動下で５ｎｍの白金／パラジウムでスパッタコーティングした（Safematic、ＣＣＵ－１０、スイス）。
【0093】
図２は、アミロイド原線維の自己集合が溶液中の他の化合物（グリセロールおよびＰＶＡおよびＷＰＩ中に含有される他の化合物）によって阻害されないことを実証し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して、熱処理後に得られた溶液を画像化した。
パネルＡ：ｐＨ２のＭｉｌｌｉ－Ｑ水中に分散された純粋なβ－ラクトグロブリンから得られたアミロイド原線維である。
パネルＢ：ＰＶＡおよびグリセロールの存在下でＷＰＩから形成されたアミロイド原線維、溶液中の他の化合物がアミロイド原線維への乳清モノマーの自己集合を阻害しないことを確認する。得られた原線維間の主な違いは、他の化合物の存在下でアミロイドが産生される場合に減少するそれらの輪郭長分布にある。
パネルＣおよびＤ：本発明の複合体およびタンパク質モノマーの複合体の表面のＳＥＭ画像を示す。図に示されるように、アミロイドベースのフィルムの表面は、平滑で、均質であり、そしてクラックを有さない。しかしながら、ＷＰＩモノマーを用いて得られたフィルムの表面は、数マイクロメートルに及ぶ複数の亀裂を示す。これらの亀裂は、フィルムを通る酸素および蒸気の輸送を増加させ、食品包装に適さない可能性のあるフィルムをもたらす。
パネルＡ：ｐＨ２のＭｉｌｌｉ－Ｑ水中に分散された純粋なβ－ラクトグロブリンから得られたアミロイド原線維である。
パネルＢ：ＰＶＡおよびグリセロールの存在下でＷＰＩから形成されたアミロイド原線維、溶液中の他の化合物がアミロイド原線維への乳清モノマーの自己集合を阻害しないことを確認する。得られた原線維間の主な違いは、他の化合物の存在下でアミロイドが産生される場合に減少するそれらの輪郭長分布にある。
パネルＣおよびＤ：本発明の複合体およびタンパク質モノマーの複合体の表面のＳＥＭ画像を示す。図に示されるように、アミロイドベースのフィルムの表面は、平滑で、均質であり、そしてクラックを有さない。しかしながら、ＷＰＩモノマーを用いて得られたフィルムの表面は、数マイクロメートルに及ぶ複数の亀裂を示す。これらの亀裂は、フィルムを通る酸素および蒸気の輸送を増加させ、食品包装に適さない可能性のあるフィルムをもたらす。
【0094】
これに対して、本発明の複合材料のフィルムは、非常に均一な表面を特徴とする。理論に束縛されるものではないが、これは、アミロイド原線維、可塑剤（グリセロール）、及びポリマー鎖（ＰＶＡ）の間の高度の相互作用に起因し得、それらの表面上の多数の官能基と組み合わされたアミロイド原線維の非常に高いアスペクト比によって支持される。驚くべきことに、ハイブリッド複合材料の特性のほとんどは、アミロイドまたはポリマー成分のいずれか単独によって生成されたフィルムよりも優れていることが見出された。第一に、個々の成分と比較して、柔軟性、安定性および加工性の点で機械的特性が改善される。さらに、ハイブリッドフィルムは、酸化防止活性および改善された表面特性などの高度の機能性を示した。
【0095】
フィルムの機械的特性は、１００Ｎのロードセルを備えたＺ０１０（Ｚｗｉｃｋ）を使用して、引張強度および伸びを測定することによって評価した。ストレス（σ）－歪み（ε）曲線は、室温で得られた。ヤング率は、応力‐歪み曲線から計算した。図５は、ハイブリッド乳清アミロイド、ＷＰＩモノマー（比較）、アミロイドＦＡＳ被覆フィルムおよびＣＡ含有フィルムの機械的特性を示す。
パネルａ：応力-歪み曲線で観察されるように、原線維化、組み合わせ、およびコーティングは、フィルムの機械的特性に直接影響を及ぼす。
パネルｂ～ｄ：破断点最大応力、極限伸び、及びヤング率の値を示す。純粋なアミロイドハイブリッドフィルムの最大応力は１７ＭＰａであり、モノマーハイブリッドフィルムの値と同様である。しかしながら、パネルｃに示されるように、ハイブリッドアミロイドフィルム（本発明）の伸長は、ハイブリッドモノマーフィルム(比較)と比較して少なくとも２桁改善される。
パネルａ：応力-歪み曲線で観察されるように、原線維化、組み合わせ、およびコーティングは、フィルムの機械的特性に直接影響を及ぼす。
パネルｂ～ｄ：破断点最大応力、極限伸び、及びヤング率の値を示す。純粋なアミロイドハイブリッドフィルムの最大応力は１７ＭＰａであり、モノマーハイブリッドフィルムの値と同様である。しかしながら、パネルｃに示されるように、ハイブリッドアミロイドフィルム（本発明）の伸長は、ハイブリッドモノマーフィルム(比較)と比較して少なくとも２桁改善される。
【0096】
理論に束縛されるものではないが、アミロイドハイブリッドフィルムのより良好な伸長は、ナノフィブリル（原線維）鎖の良好な整列に起因し、原線維間の滑りおよび分子の再配列をより容易にすると推測される。ハイブリッドフィルムの優れた伸びは、食品包装用途に魅力的な特性である。しかしながら、この特性は、アミロイド原線維ハイブリッドフィルムについて、モノマーハイブリッドフィルムよりも低いヤング率値をもたらす（パネルｄ）。さらに、ＦＡＳおよびＣＡでそれぞれフィルムをコーティングおよびハイブリッド形成することは、最大応力およびヤング率を改善するが、それらはフィルム歪みを減少させ、剛性で可撓性の低いフィルムをもたらすようであった。この現象は、ＣＡの添加またはＦＡＳによるコーティング後の乳清アミロイド原線維鎖の架橋効果および限定された移動性によるものと考えられる。
【0097】
フィルムの水接触角を、２５℃及び相対湿度５０％で、ＮｉｋｏｎＤ３００デジタルカメラによって記録した。フィルムと水との相互作用を明らかにするために、フィルムの重量損失、および水に浸漬した後の吸水率を異なる時間間隔で測定した。
【0098】
図３：アミロイドベースのフィルムの疎水性を決定するために、静的水接触角分析を行った。接触角は、組成物および化学処理に大きく依存して変化する。特に、天然ＷＰＩモノマーによって形成されるフィルムの接触角は、最も小さいものであり、この種の親水性を確認する。しかしながら、アミロイド原線維ベースのフィルム上で測定された接触角は、モノマーベースのものと比較して、より疎水性の性質をもたらした。ＦＡＳを使用する化学的架橋処理は、超疎水性の性質によって特徴付けられる表面を有し、９０°を超える接触角を有するフィルムを生じた。ＣＡを含有するフィルムは、タンパク質モノマーと比較しても、測定された最も低い接触角を示した。
【0099】
水との相互作用をさらに調べ、結果を図４にまとめる。
パネルａ：全てのサンプルについて、２時間の水浸漬後に、約５０％の実質的な質量放出が全てのフィルムについて測定された。しかしながら、この最初の水浸漬後、アミロイド原線維を含有する全てのフィルムにおいて測定された質量損失は、最初の３時間以内に劇的に減少し、一方、その後、２４時間まで実質的な質量損失は観察されなかった。フィルムによって水中に放出される主要成分は、この化合物の高い水溶性のために、主に可塑剤であると推測される。このことは、フィルムが、水に浸漬する前の同じフィルムと比較して、はるかに脆いように見えたという事実によってさらに確認される。同時に、ＷＰＩ天然モノマーによって構成されたフィルムは、完全なフィルム溶解まで、試験された全ての時間の間、連続的な質量損失を示した（図には示されていない）。
パネルｂ：水吸着測定は、処理とは無関係にアミロイド原線維に基づくフィルムにおいて非常に類似した挙動をもたらし、全てのフィルムは、２４時間の浸漬後に約２２５％の水を吸収した。しかしながら、ＷＰＩモノマーによって得られたフィルムでは膨潤が著しく増加し、約３２５％の水吸着値に達した。モノマーベースのフィルムの低い性能は、タンパク質の天然状態の親水性に関連すると考えられるが、既に上述したように（図２および３も参照）、天然モノマーと比較してアミロイド原線維の最高の性能を確認する親水性の不均一な破砕表面によって特徴付けられるこれらのフィルムの表面特性にも関連すると考えられる。
パネルａ：全てのサンプルについて、２時間の水浸漬後に、約５０％の実質的な質量放出が全てのフィルムについて測定された。しかしながら、この最初の水浸漬後、アミロイド原線維を含有する全てのフィルムにおいて測定された質量損失は、最初の３時間以内に劇的に減少し、一方、その後、２４時間まで実質的な質量損失は観察されなかった。フィルムによって水中に放出される主要成分は、この化合物の高い水溶性のために、主に可塑剤であると推測される。このことは、フィルムが、水に浸漬する前の同じフィルムと比較して、はるかに脆いように見えたという事実によってさらに確認される。同時に、ＷＰＩ天然モノマーによって構成されたフィルムは、完全なフィルム溶解まで、試験された全ての時間の間、連続的な質量損失を示した（図には示されていない）。
パネルｂ：水吸着測定は、処理とは無関係にアミロイド原線維に基づくフィルムにおいて非常に類似した挙動をもたらし、全てのフィルムは、２４時間の浸漬後に約２２５％の水を吸収した。しかしながら、ＷＰＩモノマーによって得られたフィルムでは膨潤が著しく増加し、約３２５％の水吸着値に達した。モノマーベースのフィルムの低い性能は、タンパク質の天然状態の親水性に関連すると考えられるが、既に上述したように（図２および３も参照）、天然モノマーと比較してアミロイド原線維の最高の性能を確認する親水性の不均一な破砕表面によって特徴付けられるこれらのフィルムの表面特性にも関連すると考えられる。
【0100】
フィルムの抗酸化活性は、クシニエレビッチらによって記載された分光光度法によって測定した。簡単に説明すると、７ｍＭの濃度のＡＢＴＳのストック溶液を水で希釈して、７３４ｎｍで０．７の吸光度を示した。次いで、４．５ｍＬのＡＢＴＳ溶液をフィルム片（１０ｍｇ）と合わせた。２０分間の反応時間後、フィルムを除去し、溶液をキュベットに移し、ＵＶ－ｖｉｓ分光光度計（Ｃａｒｙ１００、Agilent Technology）を使用して７３４ｎｍでその吸収を測定した。
【0101】
最後に、フィルム１ｇによって捕捉されたＡＢＴＳラジカルの量を、ベール・ランバート・ブーゲーの法則に基づいて計算した。
【数1】
【0102】
ここで、ＳｃＡＢＴＳは捕捉されたＡＢＴＳの量（μｍｏｌ）であり、ＶＡＢＴＳはフィルムに添加されたＡＢＴＳのストック溶液の容量（ｍＬ）であり、Ａ０は初期ＡＢＴＳ溶液の吸収である。Ａｆは反応時間後のラジカル溶液の吸収であり、εはＡＢＴＳモル吸光係数（７３４ｎｍで１６，０００Ｍ－１ｃｍ－１）であり、ｌはキュベットの光路（１ｃｍ）であり、ｍはフィルム重量（ｇ）である。
【0103】
本発明のハイブリッドアミロイド原線維フィルムは、１５０～３００μｍｏｌＡＢＴＳ／ｇを捕捉することによって優れた抗酸化活性を示した。
【0104】
バイオプラスチックフィルムの食品接触移動特性を、プラスチックＦＣＭ規則（ＥＵ）第１０／２０１１３４号の枠組みにおけるコンプライアンス試験のためのＥＵ技術ガイドラインに基づいて評価した。フィルムから食品への分子の移動の可能性を評価するために、Tenax（登録商標）を乾燥食品模擬物として使用した。清浄なガラスペトリ皿中で、２ｃｍの寸法を有する正方形のフィルムを、Tenax（登録商標）粉末の２つの層（試料の下に４０ｍｇおよび上に４０ｍｇ）の間に置き、オーブン中で７０℃で２時間保存した。全体的な食物移動を、ＥＵ限界未満の移動値をもたらす処理の前後のTenax（登録商標）の質量差によって計算した。
【0105】
フィルムの形態のさらなる複合材料
実施例３．１、β－ラクトグロブリン／ＰＶＡ：ハイブリッド乳清バイオプラスチックを、乳業の副産物からの液体乳清を生分解性ポリマーＰＶＡと直接混合することによって調製した。次いで、タンパク質アミロイド原線維の集合を誘導するために、ｐＨを２に調整し、混合物を９０℃で５時間加熱した。
実施例３．１、β－ラクトグロブリン／ＰＶＡ：ハイブリッド乳清バイオプラスチックを、乳業の副産物からの液体乳清を生分解性ポリマーＰＶＡと直接混合することによって調製した。次いで、タンパク質アミロイド原線維の集合を誘導するために、ｐＨを２に調整し、混合物を９０℃で５時間加熱した。
【0106】
実施例３．２、菜種ケーク／ＰＶＡ：菜種ケークからのハイブリッドバイオプラスチックのために、まず、ケークの不純物を濾過工程によって除去した。次いで、タンパク質に富む上清をＰＶＡと混合した。菜種タンパク質の原線維化は、乳清の場合と同じ条件で達成した（実施例３．１）。
【0107】
【0108】
異なる純度グレードのデンプン生成タンパク質を使用するフィルムの形態のさらなる複合材料
実施例４．１～４．３：実施例３と同様に、異なる純度の乳清タンパク質分離物（ＷＰＩ、高純度）、乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ、加工済み）、及び液体乳清（スイート乳清、未加工）を使用して、フィルムの形態の以下の複合材料を得た。結果を図８ａおよびｂ；８ｃおよびｄ；ならびに８ｅおよびｆにまとめる。
実施例４．１～４．３：実施例３と同様に、異なる純度の乳清タンパク質分離物（ＷＰＩ、高純度）、乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ、加工済み）、及び液体乳清（スイート乳清、未加工）を使用して、フィルムの形態の以下の複合材料を得た。結果を図８ａおよびｂ；８ｃおよびｄ；ならびに８ｅおよびｆにまとめる。
【0109】
結論
提供される実施例およびデータによって明確に示されるように、アミロイド原線維は、生分解性ポリマーと一緒に複合材料を開発するための適切なビルディングブロックである。 そのために、タンパク質モノマー、例えば乳清のin situ原線維化を、可塑剤および生分解性プラスチック、例えばPVAおよびMCの存在下で行った。 得られたフィルムは透明で、可撓性であり、個々の成分よりも優れた機械的および水安定性を示した。 フィルムは、安価なバイオベースの生分解性供給源から調製することができ、広範囲の用途のためのそれらの手ごろな価格および環境への優しさを示す。
提供される実施例およびデータによって明確に示されるように、アミロイド原線維は、生分解性ポリマーと一緒に複合材料を開発するための適切なビルディングブロックである。 そのために、タンパク質モノマー、例えば乳清のin situ原線維化を、可塑剤および生分解性プラスチック、例えばPVAおよびMCの存在下で行った。 得られたフィルムは透明で、可撓性であり、個々の成分よりも優れた機械的および水安定性を示した。 フィルムは、安価なバイオベースの生分解性供給源から調製することができ、広範囲の用途のためのそれらの手ごろな価格および環境への優しさを示す。
【0110】
さらに、実施例３で驚くべきことに見出されたように、廃棄物または副流からアミロイド原線維ベースのバイオプラスチックを生成するためのプロトコルは、純粋なタンパク質源から生成されたものに匹敵する品質および特性を有するフィルムをもたらす。さらに、未精製乳清を有することにより、可塑剤を使用せずに可撓性フィルムを製造することが可能になる（理論に束縛されるものではないが、これは、この副生成物に含有されるラクトースの可塑化特性に関連し得る）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】