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特表2024-518541補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体の結合を判定するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体の結合を判定するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240423BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20240423BHJP
G01N 33/542 20060101ALI20240423BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
G01N33/53 U
G01N33/536 D
G01N33/542 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023570131
(86)(22)【出願日】2022-05-11
(85)【翻訳文提出日】2024-01-15
(86)【国際出願番号】 EP2022062793
(87)【国際公開番号】W WO2022238486
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】21305617.9
(32)【優先日】2021-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514064671
【氏名又は名称】シスビオ バイオアッセイズ
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】ドゥエリー， ナジム
(72)【発明者】
【氏名】マンサット， パトリック
(72)【発明者】
【氏名】ルー， トマ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァラゲ， ジュリー
(72)【発明者】
【氏名】トリンケ， エリック
(57)【要約】
本発明は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体の結合を判定するための新規な方法に関する。本発明によるプロセスは、ホモジニアスプロキシミティアッセイ（ＨＡＳ）においてＣ１ｑに対する抗体の結合を測定することを可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法であって、ａ）測定媒体に、
被験抗体、
ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、上記被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）上記測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在が上記Ｃ１ｑに対する上記被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法。
【請求項2】
上記ＨＰＡが、（ｉ）化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）などの化学増幅型発光酸素チャネリングイムノアッセイ（ＬＯＣＩ）、（ｉｉ）共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、及び（ｉｉｉ）空間近接分析試薬捕捉ルミネッセンス（ＳＰＡＲＣＬ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
上記被験抗体が、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２である、請求項１及び２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
上記ビオチン化抗Ｆａｂリガンドが、ビオチン化抗Ｆａｂ抗体又は抗体断片、例えばビオチン化抗Ｆａｂマウス抗体又は抗体断片、例えばビオチン化抗Ｆａｂマウス抗体又は抗体断片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
上記ビオチン化抗Ｆａｂリガンドが、ビオチン化抗原又は抗原断片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
上記ストレプトアビジンが、ＲＥＴパートナーのペアの第１のメンバー又はＬＯＣＩパートナーのペアの第１のメンバーなどのＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
上記Ｃ１ｑが、ＲＥＴパートナーのペアの第２のメンバー又はＬＯＣＩパートナーのペアの第２のメンバーなどのＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで標識された抗Ｃ１ｑリガンドで間接的に標識されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
（ｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがアクセプターであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがドナーであるか、又は（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがドナーであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがアクセプターである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
上記ＨＰＡがＲＥＴであり、上記ドナーが、ユーロピウムクリプテート、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、及びニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動）ドナー、又は
ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、及びホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）ドナー
などの発光ドナー化合物又は蛍光ドナー化合物から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
上記ＨＰＡがＲＥＴであり、上記アクセプターが、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、及びｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、及びＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴアクセプター、又は
アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、及びｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、及びＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴアクセプター
などの蛍光アクセプター化合物又は非蛍光アクセプター化合物（クエンチャー）から選択される、請求項８及び９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
上記ＨＰＡがＬＯＣＩであり、上記ドナーがフタロシアニンである、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
上記ＨＰＡがＬＯＣＩであり、上記アクセプターが（ｉ）チオキセン、アントラセン、及びルブレン、又は（ｉｉ）チオキセン及びユーロピウムキレートを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
工程（ａ）及び工程（ｂ）が各種の濃度の上記被験抗体を用いて繰り返され、好ましくは、上記方法が、上記Ｃ１ｑに対する上記被験抗体の結合の解離定数（Ｋｄ）及び／又はＥＣ５０を決定する追加工程（ｃ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
上記測定媒体のオスモル濃度が、２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～５００ｍＯｓｍ／Ｌである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法を実施するための試薬キットであって、（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂリガンドと、
（ｉｉ）ストレプトアビジン、又はＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑ、又はＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されたＣ１ｑと、
（ｉｖ）上記ストレプトアビジンがＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識された抗ストレプトアビジンリガンドと、
（ｖ）上記Ｃ１ｑがＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識された抗Ｃ１ｑリガンドと
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体の結合を判定するための新規な方法に関する。本発明によるプロセスは、ホモジニアスプロキシミティアッセイ（ＨＡＳ）においてＣ１ｑに対する抗体の結合を測定することを可能にする。
【背景技術】
【0002】
抗体は、特定の抗原に結合する免疫タンパク質である。ヒトやマウスなどのほとんどの哺乳動物では、抗体は、ペアになったポリペプチド重鎖及び軽鎖から構築される。各鎖は、可変（Ｆｖ）領域及び定常（Ｆｃ）領域と呼ばれる２つの別個の領域から構成される。軽鎖Ｆｖ領域及び重鎖Ｆｖ領域は、分子の抗原結合決定基を含み、標的抗原の結合に関与する。Ｆｃ領域は、抗体（例えばＩｇＧ）のクラス（又はアイソタイプ）を規定する。
【0003】
Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体又は補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）などのいくつかの天然タンパク質と相互作用して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの重要な生化学的事象を誘発する。Ｃ１ｑに結合するＦｃは、免疫系の補体カスケードを活性化し、これにより抗体がＣＤＣを媒介する能力が反映される。
【0004】
ＩｇＧ上のＣ１ｑ結合部位は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインである。ＣＨ２ドメイン上の３つの荷電残基Ｇｌｕ－３１８、Ｌｙｓ－３２０、及びＬｙｓ－３２２は、ＩｇＧに対するＣ１ｑの結合に極めて重要である。ＩｇＭ上のＣ１ｑ結合部位は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインである。
【0005】
Ｃ１ｑは、各々が（そのＦｃ領域を介して）単一のＩｇＧ分子に結合することができる６つの球状頭部を有する。したがって、Ｃ１ｑは６つの抗体に結合することができるが、２つの抗体（例えば、２つのＩｇＧ）に対する結合は補体経路を活性化するのに十分である。Ｃ１ｑは、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓセリンプロテアーゼと複合体を形成して、補体経路のＣ１複合体を形成する。
【0006】
補体経路を活性化するためには、Ｃ１ｑが少なくとも２つの抗体（例えば、２つのＩｇＧ）に結合することが必要である。したがって、先行技術においては、ＩｇＧを高い親和性でＣ１ｑに結合することができる適切なクラスターへと集合させ、その結果、抗体がＣ１ｑに結合する能力を測定するために固相が常に使用されている。Ｃ１ｑに対する抗体の結合を評価するために先行技術において一般的に使用される固相法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が挙げられる。ＥＬＩＳＡプレート又はＳＰＲ表面のいずれかの固体表面上でＩｇＧをクラスター化する方法には、（ｉ）抗体を表面にランダムに固定化する（受動的コーティング）［参考文献１］、（ｉｉ）抗体をプロテインＬを使用して表面に間接的に固定化する［参考文献２］、又は（ｉｉｉ）抗原を表面にコーティングし、次いで抗体を添加する［参考文献３］の３つがある（図２６、図２７、及び図２８）。
【0007】
しかしながら、既存の固相法は、六量体ＩｇＧ／Ｃ１ｑ結合モデルには幾何学的制約があり、Ｃ１ｑに高い親和性で結合するための正しいＩｇＧクラスター化を予測することが困難であるため、十分に満足できるものではない［参考文献４］。したがって、結果は常に再現可能であるとは限らず、各データを正規化する必要があることが多い。
【0008】
したがって、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するための効率的で容易に実施可能で再現性のある方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するための新規なインビトロ方法、すなわち、抗体（被験抗体）がＣＤＣを媒介する能力を評価するためのインビトロ方法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
第１の態様によれば、本発明は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法であって、
ａ）測定媒体に、
被験抗体、
ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、上記被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ、
を接触させる工程と、
ｂ）上記測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在が上記Ｃ１ｑに対する上記被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
ａ）測定媒体に、
被験抗体、
ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、上記被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ、
を接触させる工程と、
ｂ）上記測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在が上記Ｃ１ｑに対する上記被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
【0011】
第２の態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施するための試薬キットであって、
（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂリガンドと、
（ｉｉ）ストレプトアビジン、又はＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑ、又はＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されたＣ１ｑと、
（ｉｖ）上記ストレプトアビジンがＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識された抗ストレプトアビジンリガンドと、
（ｖ）上記Ｃ１ｑがＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識された抗Ｃ１ｑリガンドと
を含むキットに関する。
（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂリガンドと、
（ｉｉ）ストレプトアビジン、又はＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑ、又はＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されたＣ１ｑと、
（ｉｖ）上記ストレプトアビジンがＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識された抗ストレプトアビジンリガンドと、
（ｖ）上記Ｃ１ｑがＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識された抗Ｃ１ｑリガンドと
を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１は、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体、及びドナーで間接的に標識されたＣ１ｑを使用してヒトＣ１ｑタンパク質に対するＩｇＧの結合を判定するために実施されたＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術に基づいており、Ｅｕ３＋クリプテート（ドナー）にコンジュゲートされた抗Ｃ１ｑ抗体、及びｄ２（アクセプター）で標識されたストレプトアビジンを使用する。被験抗体がヒトＣ１ｑに結合すると、それはドナーをアクセプターに近接させる。光源（ＵＶ領域）によるドナーの励起は、アクセプターに向かうエネルギー移動を引き起こし、次いで特異的蛍光（ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル）が放出される。
【図2】図２は、図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、ヒトＣ１ｑに対する各種のアイソタイプのＩｇＧ抗体の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。Ａ）組換えヒトＩｇＧアイソタイプ対照（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）で得られた結果。Ｂ）治療用抗体リツキシマブ（ＩｇＧ１）並びにそのアイソタイプ変異体ＩｇＧ２及びＩｇＧ４で得られた結果。Ｃ）治療用抗体セツキシマブ（ＩｇＧ１）及びそのアイソタイプ変異体ＩｇＧ２で得られた結果。Ｄ）治療用抗体イピリムマブ（ＩｇＧ１）及びそのアイソタイプ変異体ＩｇＧ２で得られた結果。
【図3】図３は、図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、ヒトＣ１ｑに対する治療用抗体及びそれらの非グリコシル化又は非フコシル化変異体の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。Ａ）リツキシマブ（グリコシル化抗体）並びにその非フコシル化及び非グリコシル化変異体で得られた結果。Ｂ）セツキシマブ（グリコシル化抗体）及びその非グリコシル化変異体で得られた結果。
【図4】図４は、ヒトＣ１ｑに対する治療用Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ及びオビヌツズマブ（ＧＡ１０１）の結合プロファイルを示す。Ａ）図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法を使用して得られた結果。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。Ｂ）ＥＬＩＳＡアッセイを使用して得られた文献からのデータ（［参考文献５］から適合させたもの）。結合曲線は、［抗体］（μｇ／ｍＬ）対ＥＬＩＳＡシグナル（４０５ｎｍでのＯＤ）を表す。
【図5】図５は、図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、ヒトＣ１ｑに対する治療用抗体アテゾリズマブ（ＩｇＧ１）及びスパルタリズマブ（ＩｇＧ４）の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。
【図6】図６は、図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、ヒトＣ１ｑに対する治療用抗ＴＮＦ－α抗体アダリムマブ（１５０ｎＭのヒトＴＮＦ－αと予め複合体化されているか、又は複合体化されていない）の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。
【図7】図７は、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体、及びドナーで直接的に標識されたＣ１ｑを使用してヒトＣ１ｑタンパク質に対するＩｇＧの結合を判定するために実施されたＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術に基づいており、Ｔｂ３＋クリプテート（ドナー）にコンジュゲートされたヒトＣ１ｑ、及びｄ２（アクセプター）で標識されたストレプトアビジンを使用する。被験抗体がヒトＣ１ｑに結合すると、それはドナーをアクセプターに近接させる。光源（ＵＶ領域）によるドナーの励起は、アクセプターに向かうエネルギー移動を引き起こし、次いで特異的蛍光（ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル）が放出される。
【図8】図８は、図７に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、ヒトＣ１ｑに対する各種のアイソタイプのＩｇＧ抗体の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。被験抗体は、治療用抗体リツキシマブ（ＩｇＧ１）、並びに組換えヒトＩｇＧアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４である。
【図9】図９は、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体、及びアクセプターで間接的に標識されたＣ１ｑを使用してヒトＣ１ｑタンパク質へのＩｇＧの結合を判定するために実施されたＡＬＰＨＡサンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｒ）技術に基づいており、Ａｌｐｈａストレプトアビジン被覆ドナービーズ（ドナー）、及びＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（アクセプター）にコンジュゲートされた抗Ｃ１ｑ抗体を使用する。被験抗体がヒトＣ１ｑに結合すると、それはドナーをアクセプターに近接させる。６８０ｎｍのレーザーによるドナーの励起は、一重項酸素の生成及びアクセプターへの拡散を引き起こし、次いで特異的蛍光（ＡＬＰＨＡシグナル）が生成される。
【図10】図１０は、図９に記載のＡＬＰＨＡ法に基づく、ヒトＣ１ｑに対する各種のアイソタイプのＩｇＧ抗体の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対ＡＬＰＨＡシグナルを表す。被験抗体は、治療用抗体リツキシマブ（ＩｇＧ１）、並びに組換えヒトＩｇＧアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４である。
【図11】図１１は、ビオチン化抗原、及びドナーで間接的に標識されたＣ１ｑを使用してヒトＣ１ｑタンパク質に対するＩｇＧの結合を判定するために実施されたＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術に基づいており、Ｅｕ３＋クリプテート（ドナー）にコンジュゲートされた抗Ｃ１ｑ抗体、及びｄ２（アクセプター）で標識されたストレプトアビジンを使用する。被験抗体がヒトＣ１ｑに結合すると、それはドナーをアクセプターに近接させる。光源（ＵＶ領域）によるドナーの励起は、アクセプターに向かうエネルギー移動を引き起こし、次いで特異的蛍光（ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル）が放出される。
【図12】図１２は、ビオチン化組換えヒトＴＮＦ－αを使用し、図１１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、ヒトＣ１ｑに対する治療用抗ＴＮＦ－α抗体アダリムマブの結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。
【図13】図１３は、ドナーで間接的に標識されたＣ１ｑと、ビオチン化され、アクセプター標識ストレプトアビジンに複合体化されるか、又はアクセプターに直接コンジュゲートされた抗ヒトＦａｂ抗体とを使用してヒトＣ１ｑタンパク質に対するＩｇＧの結合を判定するために実施されたＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを示す。これらのアッセイは、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術に基づき、Ｅｕ３＋クリプテート（ドナー）にコンジュゲートされた抗Ｃ１ｑ抗体、及びＡ）ストレプトアビジン－ｄ２（アクセプター）に複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体、又はＢ）ｄ２で直接的に標識された同じ抗ヒトＦａｂ抗体を使用する。被験抗体がヒトＣ１ｑに結合すると、それはドナーをアクセプターに近接させる。光源（ＵＶ領域）によるドナーの励起は、アクセプターに向かうエネルギー移動を引き起こし、次いで特異的蛍光（ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル）が放出される。
【図14】図１４は、図１３に記載される２つの異なるＴＲ－ＦＲＥＴアッセイフォーマットを使用した、ヒトＣ１ｑに対する治療用抗体リツキシマブの結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対正規化ＨＴＲＦシグナル（デルタＦ％）を表す。
【図15】図１５は、飽和結合実験を実施し、ドナーで標識された各種のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）のヒトＩｇＧに対する抗ヒトＦａｂ抗体の親和性（Ｋｄ）を決定するために使用されたＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを示す。これらのアッセイは、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術に基づいており、Ｅｕ３＋クリプテート（ドナー）で標識されたヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４）、及びＡ）ｄ２（アクセプター）で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ抗体、又はＢ）ビオチンにコンジュゲートされ、ストレプトアビジン－ｄ２に複合体化された同じ抗ヒトＦａｂを使用する。ヒトＩｇＧに対する抗ヒトＦａｂ抗体の結合により、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの放出が引き起こされ、プラトー（飽和）に達するまで被験抗ヒトＦａｂ抗体の濃度に比例して増加する。
【図16】図１６は、図１５に記載される２つの異なるＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを使用した、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ１に対する３つの異なる抗ヒトＦａｂ抗体（１、２、及び３）の結合の結果を示す。飽和結合曲線は、［抗ヒトＦａｂ抗体］（ｎＭ）対ＨＴＲＦシグナル（ＨＴＲＦ比）を表す。総シグナルは、非標識ヒトＩｇＧ１の非存在下で得られたシグナルに対応する。非特異的シグナルは、過剰の非標識ＩｇＧ１の存在下で得られたシグナルに対応する。総シグナルに対して非特異的シグナルを差し引くことにより、特異的シグナルを計算した。Ａ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ１で得られた結果。Ｂ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１で得られた結果。Ｃ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ２で得られた結果。Ｄ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ２で得られた結果。Ｅ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ３で得られた結果。Ｆ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ３で得られた結果。
【図17】図１７は、図１５に記載される２つの異なるＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを使用した、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ２に対する３つの異なる抗ヒトＦａｂ抗体（１、２、及び３）の結合の結果を示す。飽和結合曲線は、［抗ヒトＦａｂ抗体］（ｎＭ）対ＨＴＲＦシグナル（ＨＴＲＦ比）を表す。総シグナルは、非標識ヒトＩｇＧ２の非存在下で得られたシグナルに対応する。非特異的シグナルは、過剰の非標識ＩｇＧ２の存在下で得られたシグナルに対応する。総シグナルに対して非特異的シグナルを差し引くことにより、特異的シグナルを計算した。Ａ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１で得られた結果。Ｂ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ２で得られた結果。Ｃ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ３で得られた結果。
【図18】図１８は、図１５に記載される２つの異なるＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを使用した、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ４に対する３つの異なる抗ヒトＦａｂ抗体（１、２、及び３）の結合の結果を示す。飽和結合曲線は、［抗ヒトＦａｂ抗体］（ｎＭ）対ＨＴＲＦシグナル（ＨＴＲＦ比）を表す。総シグナルは、非標識ヒトＩｇＧ４の非存在下で得られたシグナルに対応する。非特異的シグナルは、過剰の非標識ＩｇＧ４の存在下で得られたシグナルに対応する。総シグナルに対して非特異的シグナルを差し引くことにより、特異的シグナルを計算した。Ａ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ１で得られた結果。Ｂ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１で得られた結果。Ｃ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ２で得られた結果。Ｄ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ２で得られた結果。Ｅ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ３で得られた結果。Ｆ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ３で得られた結果。
【図19】図１９は、競合結合実験を実施し、各種のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）の完全ヒトＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧ、又はキメラＩｇＧに対する抗ヒトＦａｂ抗体の親和性（Ｋｉ）を決定するために使用されたＴＲ－ＦＲＥＴ競合アッセイを示す。これらのアッセイは、図１５に示される２つの異なるＨＴＲＦ（Ｒ）サンドイッチアッセイフォーマットに基づく。競合剤（非標識ＩｇＧ）の非存在下では、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧはアクセプター－抗ヒトＦａｂに結合し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの放出が引き起こされる。抗ヒトＦａｂ抗体と相互作用し、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧと競合することができる非標識ＩｇＧの存在下では、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは被験ＩｇＧの濃度に比例して減少する。
【図20】図２０は、図１９に記載される２つのＴＲ－ＦＲＥＴ競合アッセイの一方を使用し、３つの異なる抗ヒトＦａｂ抗体（１、２、及び３）を用いた、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ１と各種の非標識ＩｇＧ１抗体との間の競合の結果を示す。シグモイド用量反応阻害曲線は、ｌｏｇ［非標識ＩｇＧ１］（Ｍ）対正規化ＨＴＲＦシグナル最大値の％（＝デルタＦ％非標識ＩｇＧ１抗体／デルタＦ％最大値×１００）を表す。Ａ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１で得られた結果。Ｂ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ２で得られた結果。Ｃ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ３で得られた結果。
【図21】図２１は、図１９に記載されるように、ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１を用いた、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ２と各種の非標識ＩｇＧ２抗体との間の競合の結果を示す。シグモイド用量反応阻害曲線は、ｌｏｇ［非標識ＩｇＧ２］（Ｍ）対正規化ＨＴＲＦシグナル最大値の％（＝デルタＦ％非標識ＩｇＧ１抗体／デルタＦ％最大値×１００）を表す。
【図22】図２２は、図１９に記載される２つのＴＲ－ＦＲＥＴ競合アッセイの一方を使用し、３つの異なる抗ヒトＦａｂ抗体（１、２、及び３）を用いた、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ４と各種の非標識ＩｇＧ４抗体との間の競合の結果を示す。シグモイド用量反応阻害曲線は、ｌｏｇ［非標識ＩｇＧ４］（Ｍ）対正規化ＨＴＲＦシグナル最大値の％（＝デルタＦ％非標識ＩｇＧ１抗体／デルタＦ％最大値×１００）を表す。Ａ）ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１で得られた結果。Ｂ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ２で得られた結果。Ｃ）ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ３で得られた結果。
【図23】図２３は、図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化（比１／１）されたビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体を各種の濃度で使用した、ヒトＣ１ｑに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対正規化ＨＴＲＦシグナル（デルタＦ％）を表す。Ａ）治療用抗体アテゾリズマブ（ＩｇＧ１）で得られた結果。Ｂ）組換えヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照で得られた結果。
【図24】図２４は、図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、各種の濃度のＮａＣｌの存在下での、ヒトＣ１ｑに対する治療用Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ及びオビヌツズマブの結合の結果を示す。ヒストグラムは、各種の濃度のＮａＣｌの存在下で５０ｎＭの各被験抗体で得られた特異的ＨＴＲＦシグナル（デルタ比）を表す。
【図25】図２５は、図１に記載のＴＲ－ＦＲＥＴ法に基づく、各種の濃度のＮａＣｌの存在下での、ヒトＣ１ｑに対する各種のＩｇＧ抗体の結合の結果を示す。シグモイド用量反応曲線は、ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対正規化ＨＴＲＦシグナル（デルタＦ％）を表す。Ａ）１５５ｍＭのＮａＣｌの存在下で得られた結果。Ｂ）１３５ｍＭのＮａＣｌの存在下で得られた結果。
【図29】図２９は、アクセプター標識ストレプトアビジンに複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体（図２９Ａ）、又はアクセプター標識ストレプトアビジンに複合体化されたビオチン化プロテインＬ（図２９Ｂ）、及びドナーで間接的に標識されたＣ１ｑを使用してヒトＣ１ｑタンパク質に対するＩｇＧの結合を判定するために実施されたＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術に基づいており、Ｅｕ３＋クリプテート（ドナー）にコンジュゲートされた抗Ｃ１ｑ抗体、及びｄ２（アクセプター）で標識されたストレプトアビジンを使用する。被験抗体がヒトＣ１ｑに結合すると、それはドナーをアクセプターに近接させる。光源（ＵＶ領域）によるドナーの励起は、アクセプターに向かうエネルギー移動を引き起こし、次いで特異的蛍光（ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル）が放出される。
【発明を実施するための形態】
【0013】
定義
「Ｃ１ｑ」という用語は、補体成分１ｑを意味する。Ｃ１ｑは、自然免疫系の一部である補体系に関与するタンパク質である。Ｃ１ｑは、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓと共にＣ１複合体を形成する。抗体のＦｃ部分は、補体系の補体経路を活性化するためにＣ１ｑに結合することができる。本発明によれば、Ｃ１ｑは、好ましくは、被験抗体のＦｃ部分の種に由来する。例えば、被験抗体がキメラ（すなわち、ヒトＦｃ部分を有する）、ヒト化、又はヒト被験抗体である場合、Ｃ１ｑは好ましくはヒトＣ１ｑである。
「Ｃ１ｑ」という用語は、補体成分１ｑを意味する。Ｃ１ｑは、自然免疫系の一部である補体系に関与するタンパク質である。Ｃ１ｑは、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓと共にＣ１複合体を形成する。抗体のＦｃ部分は、補体系の補体経路を活性化するためにＣ１ｑに結合することができる。本発明によれば、Ｃ１ｑは、好ましくは、被験抗体のＦｃ部分の種に由来する。例えば、被験抗体がキメラ（すなわち、ヒトＦｃ部分を有する）、ヒト化、又はヒト被験抗体である場合、Ｃ１ｑは好ましくはヒトＣ１ｑである。
【0014】
本発明の意味において、「リガンド」という用語は、標的分子に特異的かつ可逆的に結合することができる分子を指す。本発明の文脈において、標的分子は、Ｆａｂ、ストレプトアビジン、又はＣ１ｑである。したがって、本記載は、それぞれ「抗Ｆａｂリガンド」、「抗ストレプトアビジンリガンド」、又は「抗Ｃ１ｑリガンド」を指す。リガンドは、タンパク質性（例えば、タンパク質又はペプチド）又はヌクレオチド性（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であり得る。本発明の文脈において、リガンドは、有利には、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド、又はアプタマーから選択され、好ましくは抗体又は抗体断片から選択される。本発明の方法で使用されるリガンドは、リガンドがＣ１ｑを標的化する際の診断剤として有用であるように、十分な親和性でそれらの標的分子に結合することができる。
【0015】
一般に「免疫グロブリン」とも呼ばれる「抗体」は、それぞれ約５０～７０ｋＤａの２つの重鎖（重鎖はＨ鎖と呼ばれる）及びそれぞれ約２５ｋＤａの２つの軽鎖（軽鎖はＬ鎖と呼ばれる）によって構成され、鎖内及び鎖間ジスルフィド架橋によって互いに連結したヘテロ四量体を含む。各鎖は、Ｎ末端位置では、軽鎖はＶＬと、重鎖はＶＨと呼ばれる可変領域又はドメインによって構成され、Ｃ末端位置では、軽鎖はＣＬと呼ばれる単一のドメイン、重鎖はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４と呼ばれる３つ又は４つのドメインで構成される定常領域によって構成される。本発明による抗体は、哺乳動物起源（例えば、ヒト又はマウス、又はラクダ科）、ヒト化、キメラ、組換えであり得る。好ましくは、当業者に広く知られている技術を使用して遺伝子改変細胞によって組換え産生されたモノクローナル抗体である。抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ、及び任意のサブタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であり得る。
【0016】
「抗体断片」という用語は、酵素消化によって得られた、又は少なくとも１つのジスルフィド架橋を含む生物工学によって得られた免疫グロブリンの任意の部分であって、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ又はナノボディとしても知られる）、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）などの全抗体によって認識される抗原に結合することができる免疫グロブリンの任意の部分を意味する。ペプシンによる免疫グロブリンの酵素消化は、いくつかのペプチドに分割されたＦ（ａｂ’）２断片及びＦｃ断片を生成する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、鎖間ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片から形成される。Ｆａｂ断片は、可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）、ＣＨ１ドメイン、及びＣＬドメインによって形成される。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ領域及びヒンジ領域によって形成される。Ｆａｂ’－ＳＨは、ヒンジ領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片を指す。
【0017】
「抗原」という用語は、抗体又は抗体断片の抗原結合部位によって結合される分子又は分子構造、例えばタンパク質を意味する。したがって、本発明によれば、本発明の方法において使用され得る「ビオチン化抗原」は、被験抗体の抗原結合部位によって結合される分子又は分子構造、例えばタンパク質である。
【0018】
本発明による「ビオチン化」という用語は、ビオチン分子と直接コンジュゲートしていることを意味する。本発明によれば、抗Ｆａｂリガンドは、リジンの側方ＮＨ２基、又は抗Ｆａｂ抗体、抗体断片、若しくは抗原のＮ末端のＮＨ２基と反応するビオチン分子とコンジュゲートされ得る。ビオチン化試薬及びキットは、当技術分野で一般的に使用されている。
【0019】
ストレプトアビジンは、細菌ストレプトマイセス・アビジン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）から精製された５２．８ｋＤａのタンパク質（四量体）である。ストレプトアビジンホモ四量体は、ビオチンに対して非常に高い親和性を有する。約１０－１４ｍｏｌ／Ｌ程度の解離定数（Ｋｄ）の場合、ストレプトアビジンに対するビオチンの結合は、自然界で知られている最も強い非共有結合性相互作用の１つである。ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン－ビオチン複合体のために分子生物学で広く使用されている。
【0020】
「ホモジニアスアッセイ」という用語は、ヘテロジニアスアッセイとは異なり、分離によって試料を処理することを必要としないで、例えば、洗浄工程なしで且つ／又は遠心分離工程なしで、混合及び測定手順によってアッセイ－測定を行うことを可能にするアッセイフォーマットを指す。
【0021】
「ＨＰＡ」という用語は、「ホモジニアスプロキシミティアッセイ」を指す。ＨＰＡは当技術分野で周知であり、ドナー（以下、「ドナー化合物」とも呼ばれる）とアクセプター（以下、「アクセプター化合物」とも呼ばれる）との近接に起因するシグナルを測定するホモジニアスアッセイとして定義することができる。
【0022】
「ＨＰＡパートナーペア」という用語は、ドナー（以下、「ドナー化合物」ともいう）及びアクセプター（以下、「アクセプター化合物」ともいう）からなるペアを指し、それらが互いに近接して、ドナーが励起されると、これらの化合物はＨＰＡシグナルを放出する。
【0023】
「ＨＰＡシグナル」という用語は、ドナー化合物とアクセプター化合物との間のＨＰＡを表す任意の測定可能なシグナルを指す。
【0024】
「ＲＥＴ」という用語は、「共鳴エネルギー移動」を指す。ＲＥＴは、ＦＲＥＴ又はＢＲＥＴであり得る。
【0025】
「ＦＲＥＴ」という用語は、「蛍光共鳴エネルギー移動」を指す。ＦＲＥＴは、ドナーとエネルギーアクセプターとの間の双極子－双極子相互作用から生じる非放射エネルギー移動として定義される。この物理的現象は、これらの分子間のエネルギー的適合性を必要とする。これは、ドナーの発光スペクトルが少なくとも部分的にアクセプターの吸収スペクトルをカバーしなければならないことを意味する。フェルスターの理論によれば、ＦＲＥＴは、２つの分子、すなわちドナーとアクセプターとの間の距離に依存するプロセスであり、これらの分子が互いに近接している場合、ＦＲＥＴシグナルが放出される。ＦＲＥＴは、ＴＲ－ＦＲＥＴ（時間分解ＦＲＥＴ）であり得る。
【0026】
「ＢＲＥＴ」という用語は、「生物発光共鳴エネルギー移動」を指す。
【0027】
本発明の意味において、ストレプトアビジン及びＣ１ｑは、ＲＥＴパートナーペアのメンバーで標識される。ストレプトアビジン及びＣ１ｑは、例えば以下に記載されるように、当業者に周知の方法によって直接的又は間接的に標識され得る。
【0028】
特定の実施形態では、ストレプトアビジンは、ＲＥＴパートナーペアのメンバーとの共有結合によって直接的に標識される。
【0029】
別の特定の実施形態では、Ｃ１ｑは、ＲＥＴパートナーペアのメンバーで標識された抗Ｃ１ｑ抗体で間接的に標識される。本発明のこの実施形態によれば、当業者は、工程ａ）のビオチン化抗Ｆａｂリガンドが抗Ｃ１ｑ抗体のＦａｂに結合すべきでないことを理解する。例えば、被験抗体のＦａｂの種は、抗Ｃ１ｑ抗体のＦａｂの種とは異なり、例えば、被験抗体のＦａｂはヒトであり、抗Ｃ１ｑ抗体のＦａｂはマウスである。
【0030】
「ＲＥＴパートナーペア」という用語は、エネルギードナー化合物（以下、「ドナー化合物」という）及びエネルギーアクセプター化合物（以下、「アクセプター化合物」という）からなるペアを指し、それらが互いに近接して、ドナー化合物の励起波長で励起されると、これらの化合物はＲＥＴシグナルを放出する。２つの化合物がＲＥＴパートナーであるためには、ドナー化合物の発光スペクトルがアクセプター化合物の励起スペクトルを部分的にカバーしなければならないことが知られている。例えば、蛍光ドナー化合物とアクセプター化合物を用いる場合には「ＦＲＥＴパートナーペア」が用いられ、ドナー生物発光化合物とアクセプター化合物を用いる場合には「ＢＲＥＴパートナーペア」が用いられる。
【0031】
「ＲＥＴシグナル」という用語は、ドナー化合物とアクセプター化合物との間のＲＥＴを表す任意の測定可能なシグナルを指す。したがって、例えば、ＦＲＥＴシグナルは、蛍光ドナー化合物又はアクセプター化合物（後者が蛍光性である場合）の蛍光の強度又は寿命の変動量であり得る。
【0032】
「ＬＯＣＩ」という用語は、「発光酸素チャネリングアッセイ」を意味する。ＬＯＣＩは、米国特許第５，３４０，７１６号明細書（その全内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載されている誘導発光イムノアッセイである。ＬＯＣＩ技術は、高感度を有するホモジニアスアッセイ（すなわち、分離工程は含まれない）を含み、このアッセイはいくつかの試薬を使用し、シグナルを得るために、他のイムノアッセイ試薬によって保持されるこれらの試薬のうちの２つ（「ドナービーズ」及び「アクセプタービーズ」と呼ばれる）が近接していることを必要とする。特定の波長の光に曝露されると、ドナービーズは一重項酸素を放出し、２つのビーズが近接している場合、一重項酸素はアクセプタービーズに移動し、これが化学反応を引き起こす結果、アクセプタービーズが、異なる波長で測定することができる光を発する。
【0033】
「ＬＯＣＩパートナーペア」という用語は、一重項酸素ドナー化合物（以下、「ドナービーズ」という）及び一重項酸素アクセプター化合物（以下、「アクセプタービーズ」という）からなるペアを指し、それらが互いに近接して、ドナービーズの励起波長で励起されると、これらの化合物はＬＯＣＩシグナルを放出する。「ＬＯＣＩシグナル」という用語は、ドナービーズとアクセプタービーズとの間の一重項酸素移動を表す任意の測定可能なシグナルを指す。したがって、例えば、ＬＯＣＩシグナルは、アクセプタービーズによって放出される光の強度の変動量であり得る。
【0034】
「容器」という用語は、膜調製物を本発明による方法の実施に必要な試薬と混合するためのプレートのウェル、試験管、又は他の好適な容器を指す。
【0035】
Ｃ１ｑに対する抗体の結合を判定するための方法
第１の態様によれば、本発明は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法、すなわち、抗体（被験抗体）がＣＤＣを媒介する能力を評価するためのインビトロ方法に関する。
第１の態様によれば、本発明は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法、すなわち、抗体（被験抗体）がＣＤＣを媒介する能力を評価するためのインビトロ方法に関する。
【0036】
第１の態様によれば、本発明は、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法であって、
ａ）測定媒体に、
・被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
・ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
ａ）測定媒体に、
・被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
・ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
【0037】
工程ａ）
本発明によれば、工程ａ）は、測定媒体に以下の４つの要素：
・被験抗体、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭである被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
・ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程からなる。
本発明によれば、工程ａ）は、測定媒体に以下の４つの要素：
・被験抗体、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭである被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
・ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程からなる。
【0038】
測定媒体は、容器に収容されていてもよい。各種の要素は、任意の順序で連続的に、又は同時に若しくはほぼ同時に測定媒体に導入することができる。例えば、ビオチン化抗Ｆａｂリガンド、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、被験抗体、及びＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑの順に各種の要素を測定媒体に導入する。
【0039】
要素の混合は、ＨＰＡの実施に適合した反応溶液を得ることを可能にする。したがって、溶液をＨＰＡの実施に適合させるために、他の要素を測定媒体に加えることができる。例えば、測定媒体は、緩衝液、被験抗体の抗原（抗原がビオチン化されるべきでないと仮定する）、及び／又は本発明の方法を実施するのに適した任意の化合物、例えば、アルブミン、界面活性剤、防腐剤も含み得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、測定媒体は、ＨＰＡシグナルを検出するように適合されたオスモル濃度を有する。好ましくは、測定媒体は、２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～５００ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～３５０ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば、２７５ｍＯｓｍ／Ｌ～３２５ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば、２７５ｍＯｓｍ／Ｌ～３１０ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～３００ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば約２８２ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有する。
【0041】
いくつかの実施形態では、測定媒体は、ＨＰＡシグナルを検出するのに十分な量で、ナトリウム緩衝液、例えばＮａＣｌ、及び／又はリン酸緩衝液、例えばＮａ２ＨＰＯ４及び／又はＫＨ２ＰＯ４を含む。有利には、測定媒体は、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、例えば、１００ｍＭ～２００ｍＭ、例えば１２５ｍＭ～１５０ｍＭ、例えば１３５ｍＭのナトリウム緩衝液（例えばＮａＣｌ）を含み得る。本発明の方法を実施するのに適したＮａＣｌ濃度は、例えば実施例９で説明されるように、当業者によって容易に決定することができる。
【0042】
好ましい実施形態では、測定媒体のｐＨは、ＨＰＡシグナルを検出するのに適している。有利には、ｐＨは、ｐＨ６．０～ｐＨ８．０、例えばｐＨ７．０～ｐＨ８．０、例えばｐＨ７．２～ｐＨ７．６、例えばｐＨ７．４である。当業者は、本発明の方法を実施するのに適したｐＨを容易に決定することができる。
【0043】
好ましい実施形態では、測定媒体は、（ｉｉ）リン酸緩衝液、例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４及び／又はＫＨ２ＰＯ４、（ｉｉ）ナトリウム緩衝液、例えばＮａＣｌ、及び最終的には（ｉｉｉ）アルブミンを含む。
【0044】
測定媒体はまた、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－２０、及び／又は防腐剤、例えばＰｒｏＣｌｉｎ－３００を含んでいてもよい。
【0045】
極めて具体的な実施形態では、測定媒体は、Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ、ＮａＣｌ １３５ｍＭ、ＢＳＡ（好ましくはプロテアーゼ不含及びＩｇＧ不含）０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ－３００ ０．０１％、ｐＨ７．４を含む。
【0046】
本発明によれば、被験抗体はＩｇＧ又はＩｇＭであり得る。ＩｇＧ及びＩｇＭは、Ｃ１ｑに結合することが知られている。好ましくは、被験抗体はＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４である。いくつかの実施形態では、被験抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ２である。
【0047】
被験抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であり得る。
【0048】
本発明によれば、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドは、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができる。先に説明したように、抗Ｆａｂリガンドは、有利には、抗Ｆａｂ抗体、抗Ｆａｂ抗体断片、抗Ｆａｂペプチド、抗Ｆａｂアプタマー、又は抗原から選択される。抗Ｆａｂ抗体が抗Ｆａｂポリクローナル抗体であり得るとしても、抗Ｆａｂ抗体は抗Ｆａｂモノクローナル抗体であることが好ましい。
【0049】
一実施形態では、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドは、被験抗体のＣＬ領域及び／又はＣＨ１領域に結合する。この実施形態では、抗Ｆａｂリガンドは、抗Ｆａｂ抗体又は抗Ｆａｂ抗体断片であることが好ましい。
【0050】
別の実施形態では、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドは、被験抗体の可変領域、例えばＶＨ及び／又はＶＬに結合する。この実施形態では、抗Ｆａｂリガンドは、好ましくは抗原である。
【0051】
被験抗体に応じて好適なビオチン化抗Ｆａｂリガンドを選択することは当業者にとって難しくないであろう。例えば、被験抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である場合、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドは、被験抗体のＣＬ領域及び／又はＣＨ１領域に結合し得る。したがって、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドは、ビオチン化抗ヒトＦａｂリガンド、例えば、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体断片、ビオチン化抗ヒトＦａｂペプチド、ビオチン化抗ヒトＦａｂアプタマー、又はビオチン化抗原であり得る。
【0052】
被験抗体のＣＬ領域及び／又はＣＨ１に結合する抗Ｆａｂリガンド、例えば、被験抗体のＣＬ領域及び／又はＣＨ１に結合する抗Ｆａｂ抗体を得るための標準的な方法は、先行技術、例えば［参考文献８］に広く開示されている。
【0053】
ビオチン化又は非ビオチン化抗Ｆａｂリガンド、例えばビオチン化又は非ビオチン化抗Ｆａｂ抗体はいずれも市販されている。ビオチン化及び非ビオチン化抗Ｆａｂリガンドの例は、Ａｂｃａｍ製のビオチン化組換えヒトＴＮＦ－αタンパク質（＃ａｂ１６７７４７）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製の組換えヒトＴＮＦ－αタンパク質（＃１０２９１－ＴＡ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（マウスＩｇＧ２ｂ、モノクローナル抗体、クローン４Ａ１１）（＃ＳＡ１－１９２５５）、ＧｅｎｅＴｅｘ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（マウスＩｇＧ２ｂ、モノクローナル抗体、クローン２Ａ１１）（＃ＧＴＸ２７４９７）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（ヤギＩｇＧ、ポリクローナル抗体）（＃Ｉ５２６０）、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ製のビオチン化抗ヒトＩｇ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ）Ｆａｂ（ヤギＩｇＧ、ポリクローナル抗体）（＃２０８５－０８）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製のビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（ヤギＩｇＧ、ポリクローナル抗体）（＃ＳＡＢ３７０１２５１）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．製のビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（ヤギＩｇＧ、ポリクローナル抗体）（＃１０９－０６５－００６）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（ニワトリＩｇＹ、ポリクローナル抗体）（＃ＳＡ１－７２０４４）である。抗Ｆａｂリガンドがビオチン化されていない場合、当技術分野で公知の標準的な手順でそれをビオチン化すること、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（マウスＩｇＧ２ｂ、モノクローナル抗体、クローン４Ａ１１）（＃ＳＡ１－１９２５５）、ＧｅｎｅＴｅｘ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（マウスＩｇＧ２ｂ、モノクローナル抗体、クローン２Ａ１１）（＃ＧＴＸ２７４９７）、又はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（ヤギＩｇＧ、ポリクローナル抗体）（＃Ｉ５２６０）のビオチン化は当業者にとって難しくないであろう。このように、ありとあらゆる被験抗体についてビオチン化抗Ｆａｂリガンドを得ることは当業者にとって難しくないであろう。
【0054】
特定の実施形態では、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドは、マウスビオチン化抗Ｆａｂ抗体又は抗体断片、例えばマウスビオチン化抗Ｆａｂ抗体又は抗体断片である。本発明の方法は、マウスビオチン化抗Ｆａｂ抗体又は抗体断片を用いて実施し得ることが本出願人によって示されている。実際、マウスビオチン化抗Ｆａｂ抗体又は抗体断片は、被験抗体とＣ１ｑの結合を妨害せず、したがって工程ｂ）においてＲＥＴシグナルを変化させないことが本出願人によって示されている。
【0055】
好ましくは、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドは、被験抗体と比較して過剰である。例えば実施例８で説明されるように、本発明の方法の実施に適したビオチン化抗Ｆａｂリガンドの濃度を特定することは当業者にとって難しくないであろう。いくつかの実施形態では、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドの濃度は、被験抗体に対する当該ビオチン化抗ＦａｂリガンドのｎＭ単位の解離定数（Ｋｄ）の１０倍～２００倍、例えば５０倍～１５０倍、例えば１００倍であり得る。例えば、Ｋｄが０．５ｎＭである場合、ビオチン化抗Ｆａｂリガンドの濃度は５０ｎＭである。例えば実施例７で説明されるように、被験抗体に対するビオチン化抗ＦａｂリガンドのＫｄを決定することは当業者にとって難しくないであろう。
【0056】
ストレプトアビジン及びＣ１ｑは、直接的又は間接的に標識することができる。
【0057】
ストレプトアビジン及びＣ１ｑをＨＰＡパートナーのペアのメンバー、例えば、ＨＰＡがＦＲＥＴである場合には蛍光化合物で直接的に標識することは、ストレプトアビジン及びＣ１ｑ上の反応基の存在に基づいて、当業者に公知の従来の方法によって実施することができる。例えば、以下の反応基：末端アミノ基、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシレート基、リジンのアミノ基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、ヒスチジンのイミダゾール基を使用することができる。ストレプトアビジン及びＣ１ｑは、それ自体がアクセプター／ドナー化合物に共有結合している抗体又は抗体断片を測定媒体に導入することなどによって間接的に標識することもでき、この第２の抗体又は抗体断片は、ストレプトアビジン又はＣ１ｑを特異的に認識する。明らかに、ストレプトアビジン又はＣ１ｑをＨＰＡパートナーのペアのメンバーで間接的に標識することは、ストレプトアビジン、Ｃ１ｑ、又はＨＰＡパートナーのペアのメンバーのビオチン化を伴わないことが重要である。
【0058】
有利には、ストレプトアビジンは、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されており、Ｃ１ｑは、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで標識された抗Ｃ１ｑリガンド、例えば抗Ｃ１ｑ抗体又は抗体断片で間接的に標識されている。
【0059】
いくつかの実施形態では、（ｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがアクセプターであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがドナーであるか、又は（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがドナーであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがアクセプターである。
【0060】
本発明の方法の実施に適した濃度比［ストレプトアビジン］：［ビオチン化抗Ｆａｂリガンド］を特定することは当業者にとって難しくないであろう。例えば、濃度比［ストレプトアビジン］：［ビオチン化抗Ｆａｂリガンド］は、約１：１であり得る。
【0061】
工程ｂ）
工程ｂ）は、測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程からなる。
工程ｂ）は、測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程からなる。
【0062】
本明細書では、工程ｂ）における「存在」という用語は、「強度」という用語に置き換えることができる。当業者は、Ｃ１ｑに対する被験抗体の結合が増加すると、ＨＰＡシグナルの強度が増加することを理解している。
【0063】
測定されたシグナルは、被験抗体の存在下で測定媒体中で得られたシグナルに対応する。測定は、当業者に広く知られている従来の方法で行うことができ、特に問題はない。ＨＰＡシグナルを検出及び測定するために、ＴＲ－ＦＲＥＴを用いたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）、又はＡＬＰＨＡを用いたＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）などのデバイスが通常使用される。
【0064】
特定の実施形態では、被験抗体のＨＰＡシグナルを、標準抗体又は参照抗体などの別の抗体で得られたＨＰＡシグナルと比較する。この特定の実施形態では、他の抗体のＨＰＡシグナルは、他の抗体を使用して、すなわち被験抗体を他の抗体で置き換えて本発明の方法を実施することによって得られる。他の抗体は、ＨＰＡシグナルのレベルが既に知られている標準抗体であってもよく、又は被験抗体が比較される参照抗体であってもよい。被験抗体がバイオシミラー抗体であり、参照抗体がプリンセプス抗体である場合、比較は特に興味深い。この特定の実施形態では、被験抗体を含む測定媒体中のＨＰＡシグナルは、第１の容器中で行うことができ、他の抗体を含む測定媒体中のＨＰＡシグナルは、第２の容器中で行うことができ、次いで、２つの容器の各々で得られたＨＰＡシグナルを比較する。
【0065】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は、各種の濃度の被験抗体を用いて繰り返され、好ましくは、当該方法は、
・Ｃ１ｑに対する被験抗体（又は他の抗体）の結合の解離定数（Ｋｄ）、及び／又は
・Ｃ１ｑに対する被験抗体（又は他の抗体）の結合のＥＣ５０
を決定する追加工程（ｃ）を含む。
・Ｃ１ｑに対する被験抗体（又は他の抗体）の結合の解離定数（Ｋｄ）、及び／又は
・Ｃ１ｑに対する被験抗体（又は他の抗体）の結合のＥＣ５０
を決定する追加工程（ｃ）を含む。
【0066】
本発明によれば、ＨＰＡは、（ｉ）化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）などの化学増幅型発光酸素チャネリングイムノアッセイ（ＬＯＣＩ）、（ｉｉ）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、及び（ｉｉｉ）空間近接分析試薬捕捉ルミネッセンス（ＳＰＡＲＣＬ）から選択することができる。したがって、本明細書において、「ＨＡＳ」という用語は、「ＲＥＴ」、「ＬＯＣＩ」、又は「ＳＰＡＲＣＬ」に置き換えることができる。「ＲＥＴ」、「ＬＯＣＩ」、及び「ＳＰＡＲＣＬ」の具体的な実施形態を以下に詳述する。
【0067】
ＳＰＡＲＣＬ法
ＳＰＡＲＣＬ技術は、近接依存性非分離化学発光検出法である。ＳＰＡＲＣＬアッセイでは、化学発光基質（アクリダン）を特異的抗原／抗体相互作用によって酸化酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）に近接させる。Ｈ２Ｏ２及びパラヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）を含有するトリガー溶液を添加すると、試料中に存在する分析物の量に比例する閃光が発生する。
ＳＰＡＲＣＬ技術は、近接依存性非分離化学発光検出法である。ＳＰＡＲＣＬアッセイでは、化学発光基質（アクリダン）を特異的抗原／抗体相互作用によって酸化酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）に近接させる。Ｈ２Ｏ２及びパラヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）を含有するトリガー溶液を添加すると、試料中に存在する分析物の量に比例する閃光が発生する。
【0068】
ＲＥＴ法
ＨＰＡがＲＥＴである場合、本発明は、したがって、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合のための又は該結合を判定するためのインビトロ方法であって、
ａ）測定媒体に、
・被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＲＥＴ（共鳴エネルギー移動）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
・ＲＥＴパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）測定媒体中のＲＥＴシグナルを測定する工程であって、ＲＥＴシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
ＨＰＡがＲＥＴである場合、本発明は、したがって、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合のための又は該結合を判定するためのインビトロ方法であって、
ａ）測定媒体に、
・被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＲＥＴ（共鳴エネルギー移動）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
・ＲＥＴパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）測定媒体中のＲＥＴシグナルを測定する工程であって、ＲＥＴシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
【0069】
溶液をＲＥＴの実施に適合させるために、他の要素を測定媒体に加えることができる。例えば、セレンテラジンｈ（ベンジル－セレンテラジン）又はビスデオキシセレンテラジン（ＤｅｅｐＢｌｕｅＣＴＭ）又はジヒドロセレンテラジン（セレンテラジン－４００ａ）又はＤ－ルシフェリンを加えることができる。
【0070】
●ＲＥＴパートナーのペアのメンバーによるストレプトアビジン及びＣ１ｑの標識
反応基は、ＲＥＴパートナーペアのメンバーが有する反応基と共有結合を形成することができる。ＲＥＴパートナーのペアのメンバーが有する適切な反応基は、当業者に周知であり、例えば、マレイミド基で官能化されたドナー化合物又はアクセプター化合物は、例えば、タンパク質又はペプチド、例えば、ストレプトアビジン又はＣ１ｑが有するシステインが有するチオール基と共有結合することができるであろう。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを有するドナー／アクセプター化合物は、タンパク質又はペプチドを含むアミンに共有結合することができるであろう。
反応基は、ＲＥＴパートナーペアのメンバーが有する反応基と共有結合を形成することができる。ＲＥＴパートナーのペアのメンバーが有する適切な反応基は、当業者に周知であり、例えば、マレイミド基で官能化されたドナー化合物又はアクセプター化合物は、例えば、タンパク質又はペプチド、例えば、ストレプトアビジン又はＣ１ｑが有するシステインが有するチオール基と共有結合することができるであろう。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを有するドナー／アクセプター化合物は、タンパク質又はペプチドを含むアミンに共有結合することができるであろう。
【0071】
本発明の文脈において、ストレプトアビジン及びＣ１ｑはそれぞれ、ＲＥＴパートナーのペアのメンバーで標識されてもよく、このペアのメンバーの一方は蛍光ドナー又は発光ドナー化合物であり、このペアの他方のメンバーは蛍光アクセプター化合物又は非蛍光アクセプター化合物（クエンチャー）である。
【0072】
●ＦＲＥＴの実施のための標識
特定の実施形態では、ＲＥＴはＦＲＥＴである。したがって、ストレプトアビジン及びＣ１ｑはそれぞれ、ＦＲＥＴパートナーペアのメンバー、すなわち蛍光ドナー化合物又は蛍光エネルギー受容性化合物で標識される。
特定の実施形態では、ＲＥＴはＦＲＥＴである。したがって、ストレプトアビジン及びＣ１ｑはそれぞれ、ＦＲＥＴパートナーペアのメンバー、すなわち蛍光ドナー化合物又は蛍光エネルギー受容性化合物で標識される。
【0073】
ＦＲＥＴシグナルを得るためのＦＲＥＴパートナーペアの選択は、当業者の知る範囲内である。例えば、ＦＲＥＴ現象を研究するために使用することができるドナー－アクセプターペアは、当業者が参照することができるＪｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚによる研究（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、第２版３３８）に記載されている。
【0074】
蛍光ドナー化合物
長寿命のエネルギー供与性蛍光化合物（０．１ｍ超、好ましくは０．５～６ｍｓの範囲）、特に希土類キレート又はクリプテートは、測定媒体によって放出されるバックグラウンドノイズの大部分を処理する必要なく、時間分解ＦＲＥＴを可能にするので、有利である。このため、それらは一般に、本発明によるプロセスの実施に好ましい。有利には、これらの化合物はランタニド錯体である。これらの錯体（キレート又はクリプテートなど）は、エネルギー供与性ＦＲＥＴペアのメンバーとして特に適している。
長寿命のエネルギー供与性蛍光化合物（０．１ｍ超、好ましくは０．５～６ｍｓの範囲）、特に希土類キレート又はクリプテートは、測定媒体によって放出されるバックグラウンドノイズの大部分を処理する必要なく、時間分解ＦＲＥＴを可能にするので、有利である。このため、それらは一般に、本発明によるプロセスの実施に好ましい。有利には、これらの化合物はランタニド錯体である。これらの錯体（キレート又はクリプテートなど）は、エネルギー供与性ＦＲＥＴペアのメンバーとして特に適している。
【0075】
ユーロピウム（Ｅｕ３＋）、テルビウム（Ｔｂ３＋）、又はサマリウム（Ｓｍ３＋）の錯体も本発明に適した希土類錯体であり、ユーロピウム（Ｅｕ３＋）及びテルビウム（Ｔｂ３＋）錯体が特に好ましい。
【0076】
一実施形態では、ランタニド錯体Ｌｎ３＋は、以下の錯体のうちの１つから選択される。
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【化34】
【化35】
【化36】
【0077】
ｐＨに応じて、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯ２Ｈ、及び－ＰＯ（ＯＨ）２基は脱プロトン化形態であるか、又は脱プロトン化形態ではない。したがって、これらの基は、－ＳＯ３
－、－ＣＯ２
－、及び－ＰＯ（ＯＨ）Ｏ－も表す。
【0078】
ランタニド錯体Ｃ１～Ｃ９０は、以下の刊行物又は特許に記載されている。これらの錯体は市販されているか、又は国際公開第２０２０／１５７４３９号（Ａ１）などの先行技術に記載されているように合成経路によって得ることができる。
【0079】
有利には、蛍光ドナー化合物は、ユーロピウムクリプテート、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、及びニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴパートナーである。
【0080】
特に有利には、蛍光ドナー化合物は、ユーロピウムクリプテート、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、及び量子ドットから選択されるＦＲＥＴパートナーであり、ユーロピウム及びテルビウムのキレート及びクリプテートが特に好ましい。
【0081】
蛍光アクセプター化合物
蛍光アクセプター化合物は、以下の群：アロフィコシアニン、特に商品名ＸＬ６６５で知られるもの、発光有機分子、例えば、ローダミン、シアニン（Ｃｙ５など）、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体（「Ｂｏｄｉｐｙ」として市販されている）、「Ａｔｔｏ」として知られているフルオロフォア、「ＤＹ」として知られているフルオロフォア、「Ａｌｅｘａ」として知られている化合物、ニトロベンゾオキサジアゾールから選択することができる。有利には、蛍光アクセプター化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾールから選択される。
蛍光アクセプター化合物は、以下の群：アロフィコシアニン、特に商品名ＸＬ６６５で知られるもの、発光有機分子、例えば、ローダミン、シアニン（Ｃｙ５など）、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体（「Ｂｏｄｉｐｙ」として市販されている）、「Ａｔｔｏ」として知られているフルオロフォア、「ＤＹ」として知られているフルオロフォア、「Ａｌｅｘａ」として知られている化合物、ニトロベンゾオキサジアゾールから選択することができる。有利には、蛍光アクセプター化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾールから選択される。
【0082】
「シアニン」及び「ローダミン」という用語は、それぞれ「シアニン誘導体」及び「ローダミン誘導体」として理解されたい。当業者は、市場で入手可能なこれらの異なるフルオロフォアに精通している。
【0083】
「Ａｌｅｘａ」化合物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって市販され、「Ａｔｔｏ」化合物は、Ａｔｔｏｔｅｃによって市販され、「ＤＹ」化合物は、Ｄｙｏｍｉｃｓによって市販され、「Ｃｙ」化合物はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販されており、他の化合物は、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、又はＡｃｒｏｓなどの様々な化学試薬供給業者によって市販されている。
【0084】
以下の蛍光タンパク質：シアン蛍光タンパク質（ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ）、オレンジ色及び赤色蛍光タンパク質（Ｏｒａｎｇｅ ｋｕｓｉｂａｒｉ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄｔｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｉｍ、ＡＱ１４３）、遠赤色の蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｔｄＫａｔｕｓｈｋａ２）も蛍光アクセプター化合物として使用することができる。
【0085】
有利には、蛍光アクセプター化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、及び量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、及びｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、及びＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴパートナーである。
【0086】
●ＢＲＥＴを実施するための標識
特定の実施形態では、ストレプトアビジン及びＣ１ｑはそれぞれ、ＢＲＥＴパートナーペアのメンバー、すなわち発光ドナー化合物又は蛍光エネルギー受容性化合物で標識される。
特定の実施形態では、ストレプトアビジン及びＣ１ｑはそれぞれ、ＢＲＥＴパートナーペアのメンバー、すなわち発光ドナー化合物又は蛍光エネルギー受容性化合物で標識される。
【0087】
ＢＲＥＴパートナーペアのメンバーである発光ドナー化合物又はタンパク質型蛍光アクセプター化合物によるストレプトアビジン及びＣ１ｑの直接的な標識は、当業者に公知の古典的な方法、特に、当業者が参照することができるＴａｒｉｋ Ｉｓｓａｄ及びＲａｌｆ Ｊｏｃｋｅｒｓによる論文（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｐｐ １９５－２０９，Ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＴＭブックシリーズＭＩＭＢ,第３３２巻）に記載されている古典的な方法によって行うことができる。
【0088】
ＢＲＥＴパートナーペアのメンバーである有機分子型蛍光アクセプター化合物によるストレプトアビジン及びＣ１ｑの直接的な標識は、前述したリガンド上の反応基の存在に基づいて、当業者に公知の古典的な方法によって行うことができる。例えば、以下の反応基:末端アミノ基、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシレート基、リジンのアミノ基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、ヒスチジンのイミダゾール基を使用することができる。
【0089】
反応基は、ＢＲＥＴパートナーペアのメンバーが有する反応基と共有結合を形成することができる。ＢＲＥＴパートナーペアのメンバーが有する適切な反応基は当業者に周知であり、例えば、マレイミド基で官能化されたアクセプター化合物は、タンパク質又はペプチド、例えばＣ１ｑが有するシステインが有するチオール基と共有結合することができるであろう。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを有するアクセプター化合物は、タンパク質又はペプチドを含むアミンに共有結合することができるであろう。
【0090】
ＢＲＥＴシグナルを得るためのＢＲＥＴパートナーペアの選択は、当業者の知る範囲内である。例えば、ＢＲＥＴ現象を調べるために使用することができるドナー－アクセプターペアは、特に、当業者が参照することができるＤａｓｉｅｌ Ｏ．Ｂｏｒｒｏｔｏ－Ｅｓｃｕｅｌａによる論文（ＢＩＯＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＥＮＥＲＧＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（ＢＲＥＴ）ＭＥＴＨＯＤＳ ＴＯ ＳＴＵＤＹ Ｇ ＰＲＯＴＥＩＮ－ＣＯＵＰＬＥＤ ＲＥＣＥＰＴＯＲ－ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＴＹＲＯＳＩＮＥ ＫＩＮＡＳＥ ＨＥＴＥＲＯＲＥＣＥＰＴＯＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３；１１７：１４１－１６４）に記載されている。
【0091】
発光ドナー化合物
特定の実施形態では、発光ドナー化合物は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、及びホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
特定の実施形態では、発光ドナー化合物は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、及びホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
【0092】
蛍光アクセプター化合物
特定の実施形態では、蛍光アクセプター化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ変異体（ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、ｅＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＹＦＰ変異体（ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
特定の実施形態では、蛍光アクセプター化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ変異体（ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、ｅＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＹＦＰ変異体（ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴパートナーである。
【0093】
先に説明したように、ストレプトアビジン及び／又はＣ１ｑはまた、それ自体がアクセプター／ドナー化合物に共有結合している抗体又は抗体断片を測定媒体に導入することなどによって、ＲＥＴパートナーのペアのメンバーで間接的に標識されてもよく、この抗体又は抗体断片はストレプトアビジン又はＣ１ｑを特異的に認識する。
【0094】
ＬＯＣＩ法
ＨＰＡがＬＯＣＩである場合、本発明は、したがって、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法であって、
ａ）測定媒体に、
・被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＬＯＣＩ（発光酸素チャネリングイムノアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、
・ＬＯＣＩパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）測定媒体中のＬＯＣＩシグナルを測定する工程であって、ＬＯＣＩシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
ＨＰＡがＬＯＣＩである場合、本発明は、したがって、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法であって、
ａ）測定媒体に、
・被験抗体、
・ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
・ＬＯＣＩ（発光酸素チャネリングイムノアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、
・ＬＯＣＩパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）測定媒体中のＬＯＣＩシグナルを測定する工程であって、ＬＯＣＩシグナルの存在がＣ１ｑに対する被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法に関する。
【0095】
マイクロプレートフォーマットにおける生体分子相互作用を調べるために使用されるいくつかのＬＯＣＩ技術、例えば、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）がある。例えば、ＡＬＰＨＡキットは、マサチューセッツ州ウォルサムのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによって製造され、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｒ）及びＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｒ）の商標で市販されている。これらの技術は、非放射性のホモジニアスプロキシミティアッセイである。ビーズ上に捕捉された分子の結合は、一方のビーズから他方のビーズへの一重項酸素拡散をもたらし、最終的に検出可能な発光／蛍光シグナルを生じさせ、試料中の１つ以上の分析物に関する定性的及び定量的情報を提供する。
【0096】
ＬＯＣＩパートナーのペアは、以下の２つのビーズタイプ：ドナービーズ及びアクセプタービーズを含む。ドナービーズは、光増感剤、例えばフタロシアニンを含み、これは、６８０ｎｍの照射時に雰囲気酸素を励起された反応性形態の酸素である一重項酸素に変換する。一重項酸素はラジカルではなく、単一の励起電子を有する酸素分子である。他の励起分子と同様に、一重項酸素は、基底状態に戻る前の寿命が限られている。その４μ秒の半減期内で、一重項酸素は、溶液中で約２００ｎｍ拡散することができ、これと比較して、ＴＲ－ＦＲＥＴは約１０ｎｍの最大移動距離を有する。アクセプタービーズがその近傍にある場合、エネルギーは一重項酸素からアクセプタービーズ内のチオキセン誘導体に移され、その後、波長範囲内、例えば５２０～６２０ｎｍ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｒ））又は特定の波長、例えば６１５ｎｍ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｒ））の光生成に至る。アクセプタービーズが存在しない場合、一重項酸素は基底状態に低下し、シグナルは生じない。この近接依存性化学エネルギー移動は、ＬＯＣＩのホモジニアス性の基礎であるため、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気化学発光、及びフローサイトメトリーアッセイとは異なり、洗浄工程は必要とされず、それによって著しい利点をもたらす。
【0097】
アクセプタービーズには、チオキセン、アントラセン、及びルブレンの３つの色素が埋め込まれている。最終蛍光であるルブレンは、５２０～６２０ｎｍの間で検出可能な光を放出する（例えばＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｒ））。
【0098】
アントラセン及びルブレンは、ユーロピウムキレート（例えばＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｒ））で置換されていてもよい。ユーロピウム（Ｅｕ）キレートは、一重項酸素との反応後のチオキセンのジケトン誘導体への変換から生じる３４０ｎｍの光によって直接励起される。励起されたユーロピウムキレートは、約６１５ｎｍを中心とするはるかに狭い波長帯域内で検出可能な強い光を生じる。したがって、ユーロピウムキレートで置換されていないアクセプタービーズとは対照的に、ユーロピウムキレート発光で置換されたアクセプタービーズは、５００～６００ｎｍの間の光を吸収する人工又は天然化合物（ヘモグロビンなど）による干渉を受けにくい。
【0099】
●ＬＯＣＩパートナーのペアのメンバーによるストレプトアビジン及びＣ１ｑの標識
ＬＯＣＩパートナーのペアのメンバーでストレプトアビジン及びＣ１ｑを直接的に標識することは、ストレプトアビジン及びＣ１ｑ上の反応基の存在に基づいて、当業者に公知の従来の方法によって行うことができる。例えば、以下の反応基：Ｎ末端アミノ基、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシレート基、リジンのアミノ基、システインのチオール基を使用することができる。
ＬＯＣＩパートナーのペアのメンバーでストレプトアビジン及びＣ１ｑを直接的に標識することは、ストレプトアビジン及びＣ１ｑ上の反応基の存在に基づいて、当業者に公知の従来の方法によって行うことができる。例えば、以下の反応基：Ｎ末端アミノ基、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシレート基、リジンのアミノ基、システインのチオール基を使用することができる。
【0100】
反応基は、ＬＯＣＩパートナーのペアのメンバーが有する反応基と共有結合を形成することができる。ＬＯＣＩパートナーのペアのメンバーが有する適切な反応基は、当業者に周知であり、例えば、マレイミド基で官能化されたドナー化合物又はアクセプター化合物は、例えば、タンパク質又はペプチド、例えばストレプトアビジン又はＣ１ｑが有するシステインが有するチオール基と共有結合することができるであろう。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを有するドナー／アクセプター化合物は、タンパク質又はペプチドを含むアミンに共有結合することができるであろう。
【0101】
ＡＬＰＨＡビーズ（ドナー又はアクセプター）は、ペプチド、タンパク質（例えば、ストレプトアビジン又はＣ１ｑ）、又は抗体（例えば抗Ｃ１ｑ抗体）に直接コンジュゲートすることができる。このコンジュゲーションは、ＡＬＰＨＡビーズの表面に存在する反応性アルデヒド基と目的の分子の（リジン及びＮ末端の）遊離アミン基との間の還元的アミノ化反応に基づく。この反応は、形成された結合を安定化させるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）の存在下で行われ、次いで、ＡＬＰＨＡビーズ上の残りの遊離アルデヒド基をブロックするカルボキシメチルアミン（ＣＭＯ）の添加によって停止される。
【0102】
先に説明したように、ストレプトアビジン及び／又はＣ１ｑはまた、それ自体がアクセプター／ドナー化合物に共有結合している抗体又は抗体断片を測定媒体に導入することなどによって、ＬＯＣＩパートナーのペアのメンバーで間接的に標識されてもよく、この抗体又は抗体断片はストレプトアビジン又はＣ１ｑを特異的に認識する。
【0103】
本発明の方法を実施するための試薬キット
第２の態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施するための試薬キットであって、
（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂリガンドと、
（ｉｉ）ストレプトアビジン、又はＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑ、又はＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されたＣ１ｑと、
（ｉｖ）ストレプトアビジンがＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識された抗ストレプトアビジンリガンドと、
（ｖ）Ｃ１ｑがＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識された抗Ｃ１ｑリガンドと
を含むキットに関する。
第２の態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施するための試薬キットであって、
（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂリガンドと、
（ｉｉ）ストレプトアビジン、又はＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑ、又はＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されたＣ１ｑと、
（ｉｖ）ストレプトアビジンがＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識された抗ストレプトアビジンリガンドと、
（ｖ）Ｃ１ｑがＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識された抗Ｃ１ｑリガンドと
を含むキットに関する。
【0104】
本発明のキットの各種の構成要素の特定の実施形態は、先の説明で詳述したように、本発明のキットにも適用される。
【0105】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法を実施するための試薬キットは、
（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂ抗体と、
（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバー、好ましくはＴＲ－ＦＲＥＴパートナーのペアの第１のメンバー、例えばｄ２で直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑと、
（ｉｖ）ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバー、好ましくはＴＲ－ＦＲＥＴパートナーのペアの第２のメンバー、例えばユーロピウムクリプテートで直接的に標識された抗Ｃ１ｑ抗体と
を含む。
（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂ抗体と、
（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバー、好ましくはＴＲ－ＦＲＥＴパートナーのペアの第１のメンバー、例えばｄ２で直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑと、
（ｉｖ）ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバー、好ましくはＴＲ－ＦＲＥＴパートナーのペアの第２のメンバー、例えばユーロピウムクリプテートで直接的に標識された抗Ｃ１ｑ抗体と
を含む。
【0106】
好ましい実施形態では、本キットはまた、本明細書で先に開示されるように、緩衝液、被験抗体の抗原（抗原がビオチン化されるべきでないと仮定する）、及び／又は本発明の方法を実施するのに適した任意の化合物、例えば、アルブミン、界面活性剤、及び／又は防腐剤を含む。
【0107】
本キットの試薬は、１つ又は複数の容器、好ましくは複数の容器に収容される。
【実施例】
【0108】
実施例１：ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体、及びドナーで間接的に標識されたＣ１ｑを使用して、Ｃ１ｑに対する被験抗体の結合を判定するための方法（ＴＲ－ＦＲＥＴ）
【0109】
Ｃ１ｑに対する被験抗体の結合を判定するために、ＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイを図１に示すように行った。
【0110】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づいた。ＨＴＲＦ（Ｒ）技術は、蛍光ドナー色素（ドナー）であるＥｕ３＋クリプテート又はＴｂ３＋クリプテートと、蛍光アクセプター色素（アクセプター）であるｄ２との間の蛍光共鳴エネルギー移動に対応する。各色素は、分子（抗体又はタンパク質）に共有結合的に標識される。
【0111】
本明細書に記載の方法は、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、被験抗体を溶液中で捕捉し凝集させるために使用したビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＡ１－１９２５５）との複合体の使用に基づいていた（図１）。被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）を、Ｅｕ３＋クリプテートにコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗Ｃ１ｑ抗体（ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＭ２３８２）で検出した。
【0112】
抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体のビオチン化
ビオチンＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｂ２６４３）の５ｍＭストック溶液を無水ＤＭＳＯで調製した。抗体を０．１Ｍ、ｐＨ９の炭酸塩緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で入れ、ビオチンをビオチン／抗体のモル比６で添加した。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、予め充填したゲル濾過重力流カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＮＡＰ－１０カラム、Ｃｙｔｉｖａ、＃１７０８５４０１）を製造者の説明書に従って使用して、０．１Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液中で抗体を精製して過剰のコンジュゲートされていないビオチンを除去した。ビオチン化抗体のストック溶液に０．１％ＢＳＡを補充し、使用するまで－２０℃で保存した。
ビオチンＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｂ２６４３）の５ｍＭストック溶液を無水ＤＭＳＯで調製した。抗体を０．１Ｍ、ｐＨ９の炭酸塩緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で入れ、ビオチンをビオチン／抗体のモル比６で添加した。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、予め充填したゲル濾過重力流カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＮＡＰ－１０カラム、Ｃｙｔｉｖａ、＃１７０８５４０１）を製造者の説明書に従って使用して、０．１Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液中で抗体を精製して過剰のコンジュゲートされていないビオチンを除去した。ビオチン化抗体のストック溶液に０．１％ＢＳＡを補充し、使用するまで－２０℃で保存した。
【0113】
Ｅｕ３＋クリプテートに対する抗Ｃ１ｑ抗体のコンジュゲーション
Ｅｕ３＋クリプテートＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）の５ｍＭストック溶液を無水ＤＭＳＯで調製した。抗体を５０ｍＭ、ｐＨ８のリン酸緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で入れ、Ｅｕ３＋クリプテートをＥｕ３＋クリプテート／抗体のモル比１５で添加した。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、予め充填したゲル濾過重力流カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＮＡＰ－５カラム、Ｃｙｔｉｖａ、＃１７０８５３０１）を製造者の説明書に従って使用して、０．１Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液中で抗体を精製して過剰のコンジュゲートされていないＥｕ３＋クリプテートを除去した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗体のストック溶液に０．１％ＢＳＡを補充し、使用するまで－２０℃で保存した。
Ｅｕ３＋クリプテートＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）の５ｍＭストック溶液を無水ＤＭＳＯで調製した。抗体を５０ｍＭ、ｐＨ８のリン酸緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で入れ、Ｅｕ３＋クリプテートをＥｕ３＋クリプテート／抗体のモル比１５で添加した。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、予め充填したゲル濾過重力流カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＮＡＰ－５カラム、Ｃｙｔｉｖａ、＃１７０８５３０１）を製造者の説明書に従って使用して、０．１Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液中で抗体を精製して過剰のコンジュゲートされていないＥｕ３＋クリプテートを除去した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗体のストック溶液に０．１％ＢＳＡを補充し、使用するまで－２０℃で保存した。
【0114】
被験抗体の説明
アッセイで試験した抗体の特徴を表１に詳述する。それらはすべて、既知の濃度の精製抗体である。
アッセイで試験した抗体の特徴を表１に詳述する。それらはすべて、既知の濃度の精製抗体である。
【0115】
【表1】
【0116】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、実験に応じて、緩衝液１（Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ、ＮａＣｌ １３５ｍＭ、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ－３００ ０．０１％、ｐＨ７．４）（図２、図３、図４Ａ、及び図５）又は緩衝液２（Ｎａ２ＨＰＯ４ ４２．１３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ７．８６ｍＭ、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％、ｐＨ７．４）（図６）のいずれかで希釈した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、実験に応じて、緩衝液１（Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ、ＮａＣｌ １３５ｍＭ、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ－３００ ０．０１％、ｐＨ７．４）（図２、図３、図４Ａ、及び図５）又は緩衝液２（Ｎａ２ＨＰＯ４ ４２．１３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ７．８６ｍＭ、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％、ｐＨ７．４）（図６）のいずれかで希釈した。
【0117】
１～２００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を４×で調製した。アダリムマブも、その抗原であるヒトＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１０２９１－ＴＡ）の存在下で試験した。その場合、１５０ｎＭのＴＮＦ－αを補充した緩衝液で段階希釈物を調製した。
【0118】
プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。実験に応じて、０．６ｎＭ（図６）又は２．４ｎＭ（図２、図３、図４Ａ、及び図５）の最終濃度を目指して、Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を４×で調製した。
【0119】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
【0120】
プレートをシーラーで覆い、実験に応じて、室温で３時間（図２、図３、図４Ａ、及び図５）又は一晩（図６）インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0121】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
「ＨＴＲＦ比」は、以下の式：シグナル６６５ｎｍ／シグナル６２０ｎｍ×１０，０００を使用して計算した。次いで、特異的シグナル「デルタ比」を以下のように計算した。デルタ比＝ＨＴＲＦ比抗体－ＨＴＲＦ比陰性対照。ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対デルタ比をプロットすることによって結合曲線を表し、図２、図３、図４Ａ、図５、及び図６に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。各結合曲線について、バックグラウンドに対するシグナル（Ｓ／Ｂ）を以下のように計算することによってシグナル強度を求めた。Ｓ／Ｂ＝ＨＴＲＦ比最大値抗体／ＨＴＲＦ比陰性対照。ＥＣ５０値も求めた。各被験抗体で得られた結果を表２に示す。
「ＨＴＲＦ比」は、以下の式：シグナル６６５ｎｍ／シグナル６２０ｎｍ×１０，０００を使用して計算した。次いで、特異的シグナル「デルタ比」を以下のように計算した。デルタ比＝ＨＴＲＦ比抗体－ＨＴＲＦ比陰性対照。ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対デルタ比をプロットすることによって結合曲線を表し、図２、図３、図４Ａ、図５、及び図６に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。各結合曲線について、バックグラウンドに対するシグナル（Ｓ／Ｂ）を以下のように計算することによってシグナル強度を求めた。Ｓ／Ｂ＝ＨＴＲＦ比最大値抗体／ＨＴＲＦ比陰性対照。ＥＣ５０値も求めた。各被験抗体で得られた結果を表２に示す。
【0122】
【表2】
【0123】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイによって、各種のアイソタイプ１、２、及び４のＩｇＧ抗体のＣ１ｑ結合能を識別することができた（図２）。
【0124】
図２Ａに示すように、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照で最良のＳ／Ｂ及びＥＣ５０が得られ、このアイソタイプがヒトＣ１ｑに最も効率的に結合することが示された。ヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照で得られたより低いＳ／Ｂ及び増加したＥＣ５０は、ヒトＩｇＧ２がヒトＣ１ｑと弱く相互作用することを示す。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照では顕著なシグナルが測定されず、このアイソタイプがヒトＣ１ｑに結合しないことが示された。これらの結果は［参考文献６］と一致している。治療用ＩｇＧ１抗体リツキシマブをそのＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプ変異体と比較した場合（図２Ｂ）、並びに治療用ＩｇＧ１抗体セツキシマブ及びイピリムマブをそれらの対応するＩｇＧ２アイソタイプ変異体と比較した場合（図２Ｃ及び２Ｄ）、同様の結果が得られた。
【0125】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイによって、ヒトＣ１ｑに対するグリコシル化抗体対非グリコシル化抗体の相互作用の能力を区別することができた（図３）。
【0126】
治療用ＩｇＧ１抗体リツキシマブを、非フコシル化変異体（ここでは無関係な対照として使用）及び非グリコシル化変異体と並行して試験した（図３Ａ）。Ｆｃドメイン上にフコース残基が存在しないことによって、ＡＤＣＣ活性のみが調節され、Ｃ１ｑ結合は調節されないことが知られている。予想通り、リツキシマブと比較して、非フコシル化抗体を用いたアッセイでは、Ｃ１ｑ結合の検出可能な変化は得られなかった。
【0127】
逆に、非グリコシル化変異体の相互作用能力は変化し（Ｓ／Ｂが減少、ＥＣ５０が増加）、これは抗体Ｆｃグリコシル化がＣ１ｑ結合に重要であるという事実と一致する。同様に、このアッセイから、治療用ＩｇＧ１抗体セツキシマブと比較して、非グリコシル化バージョンのセツキシマブがヒトＣ１ｑに結合する能力の重大な減少が示された（図３Ｂ）。
【0128】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイにより、治療用Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体のＣ１ｑ結合能を識別することができた（図４）。
【0129】
リツキシマブ（Ｉ型抗ＣＤ２０）と比較してオビヌツズマブ（ＩＩ型抗ＣＤ２０）で得られた低下したシグナル強度は、オビヌツズマブがヒトＣ１ｑに結合する効率が低いことを示している（図４Ａ）。これらの結果は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して得られた文献からのデータに従っている（図４Ｂは、［参考文献５］から適合させた）。
【0130】
治療用抗体アテゾリズマブ及びスパルタリズマブもＴＲ－ＦＲＥＴアッセイで試験した（図５）。
【0131】
予想通り、抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１アテゾリズマブはヒトＣ１ｑと効率的に相互作用したが、抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４スパルタリズマブはタンパク質に結合する能力を示さなかった。
【0132】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイによって、ヒトＣ１ｑと、抗原ヒトＴＮＦ－αと予め複合体化された又は複合体化されていない治療用抗ＴＮＦ－α ＩｇＧ１抗体アダリムマブとの間の相互作用を検出することができた（図６）。
【0133】
更に、このアッセイによって、抗体のＣ１ｑ結合能をその抗原の非存在下又は存在下で、抗原の存在下でのＥＣ５０値の改善に基づいて、識別することができた。これらの結果は［参考文献７］と一致している。
【0134】
実施例２：ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体、及びドナーで直接的に標識されたＣ１ｑを使用して、Ｃ１ｑに対する抗体の結合を判定するための方法（ＴＲ－ＦＲＥＴ）
【0135】
別の方法は、図７に示されるように、ドナーに直接コンジュゲートされたヒトＣ１ｑタンパク質を用いてＴＲ－ＦＲＥＴアッセイを実施することからなる。
【0136】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づく。
【0137】
本明細書に記載の方法は、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、被験抗体を溶液中で捕捉し凝集させるために使用したビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＡ１－１９２５５）との複合体の使用に基づいている（図７）。被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）をＴｂ３＋クリプテートに直接コンジュゲートした。
【0138】
抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体は、実施例１に記載されるようにビオチン化した。テルビウムクリプテート標識キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６２ＴＢＳＰＥＡ）を製造者の説明書に従って使用して、ヒトＣ１ｑタンパク質をＬｕｍｉ４（Ｒ）－テルビウムクリプテートにコンジュゲートした。
【0139】
被験抗体の説明
ヒトアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４、並びに治療用ＩｇＧ１抗体リツキシマブをアッセイで試験した。それらの特徴を表１に詳述する。それらはすべて、既知の濃度の精製抗体である。
ヒトアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４、並びに治療用ＩｇＧ１抗体リツキシマブをアッセイで試験した。それらの特徴を表１に詳述する。それらはすべて、既知の濃度の精製抗体である。
【0140】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。１～２００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。Ｔｂ３＋クリプテート－ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように２×で調製した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。１～２００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。Ｔｂ３＋クリプテート－ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように２×で調製した。
【0141】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］
・１０μＬのＴｂ３＋クリプテート－ヒトＣ１ｑタンパク質
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］
・１０μＬのＴｂ３＋クリプテート－ヒトＣ１ｑタンパク質
【0142】
プレートをシーラーで覆い、室温で一晩インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0143】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
ＨＴＲＦデータを分析し、実施例１に記載されるように表した。各被験抗体について得られた結合曲線を図８に示す。各結合曲線について、実施例１に詳述したようにＳ／Ｂを計算し、ＥＣ５０値も求めた。各被験抗体で得られた結果を表３に示す。
ＨＴＲＦデータを分析し、実施例１に記載されるように表した。各被験抗体について得られた結合曲線を図８に示す。各結合曲線について、実施例１に詳述したようにＳ／Ｂを計算し、ＥＣ５０値も求めた。各被験抗体で得られた結果を表３に示す。
【0144】
【表3】
【0145】
実施例１に示される方法と同様に、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイによって、各種のアイソタイプ１、２、及び４のヒトＩｇＧ抗体のＣ１ｑ結合能を識別することができた。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照で最良のＳ／Ｂ及びＥＣ５０が得られ、このアイソタイプがヒトＣ１ｑに最も効率的に結合することが示された。ヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照で得られたより低いＳ／Ｂ及び増加したＥＣ５０は、ヒトＩｇＧ２がヒトＣ１ｑと弱く相互作用することを示す。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照では顕著なシグナルが測定されず、このアイソタイプがヒトＣ１ｑに結合しないことが示された。これらの結果は［参考文献６］と一致している。
【0146】
治療用ＩｇＧ１キメラ抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの結合プロファイルは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照で得られたものに近く、同様のＳ／Ｂ及びＥＣ５０値を有していた。
【0147】
実施例３：ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体を使用して、Ｃ１ｑに対する被験抗体の結合を判定するための方法（ＡＬＰＨＡ）
【0148】
Ｃ１ｑに対する被験抗体の結合を判定するために、ＡＬＰＨＡサンドイッチアッセイを図９に示すように行った。
【0149】
ＡＬＰＨＡ検出は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に基づいた。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｒ）技術は、Ａｌｐｈａドナービーズ（ドナー）とＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（アクセプター）との間の一重項酸素の拡散に対応する。各ビーズは、分子（抗体又はタンパク質）に共有結合的にコンジュゲートされる。
【0150】
本明細書に記載の方法は、Ａｌｐｈａストレプトアビジン被覆ドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６７６０００２）と、被験抗体を溶液で捕捉し凝集させるために使用したビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＡ１－１９２５５）との複合体の使用に基づいている（図９）。被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６７７２００２）にコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗Ｃ１ｑ抗体（ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＭ２３８２）で検出した。
【0151】
抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体は、実施例１に記載されるようにビオチン化した。
【0152】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズに対する抗Ｃ１ｑ抗体のコンジュゲーション
このコンジュゲーションは、２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）（ＳＩＧＭＡ、＃１５６１５９）及び０．０６％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃８５１１３）の存在下、５ｍｇのＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ／１００μｇの抗Ｃ１ｑ抗体の比で、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１００１００２３）中で実施した。３７℃で一晩インキュベートした後、３．１ｍｇ／ｍＬのカルボキシ－メトキシルアミン（ＣＭＯ）（Ｓｉｇｍａ、＃Ｃ１３４０８）を添加することによって反応を停止させた。ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中のいくつかの洗浄／遠心分離工程によってビーズを精製して過剰のコンジュゲートされていない抗体を除去した。
このコンジュゲーションは、２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）（ＳＩＧＭＡ、＃１５６１５９）及び０．０６％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃８５１１３）の存在下、５ｍｇのＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ／１００μｇの抗Ｃ１ｑ抗体の比で、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１００１００２３）中で実施した。３７℃で一晩インキュベートした後、３．１ｍｇ／ｍＬのカルボキシ－メトキシルアミン（ＣＭＯ）（Ｓｉｇｍａ、＃Ｃ１３４０８）を添加することによって反応を停止させた。ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中のいくつかの洗浄／遠心分離工程によってビーズを精製して過剰のコンジュゲートされていない抗体を除去した。
【0153】
被験抗体の説明
ヒトアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４、並びに治療用ＩｇＧ１抗体リツキシマブをアッセイで試験した。それらの特徴を表１に詳述する。それらはすべて、既知の濃度の精製抗体である。
ヒトアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４、並びに治療用ＩｇＧ１抗体リツキシマブをアッセイで試験した。それらの特徴を表１に詳述する。それらはすべて、既知の濃度の精製抗体である。
【0154】
ＡＬＰＨＡアッセイ成分の調製
Ａｌｐｈａストレプトアビジン被覆ドナービーズは光感受性である。この試薬を使用するすべての工程（調製、分注、プレート読み取り）は、抑えた実験室照明下で実施した。使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液１で希釈した。
Ａｌｐｈａストレプトアビジン被覆ドナービーズは光感受性である。この試薬を使用するすべての工程（調製、分注、プレート読み取り）は、抑えた実験室照明下で実施した。使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液１で希釈した。
【0155】
１～２００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を８×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／Ａｌｐｈａストレプトアビジン被覆ドナービーズ］を、５０ｎＭのビオチン抗体／６７μｇ／ｍＬのビーズの最終濃度が得られるように２．６７×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。抗Ｃ１ｑ抗体にコンジュゲートされたＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズを、２０μｇ／ｍＬの最終濃度を目指して４×で調製した。
【0156】
ＡＬＰＨＡアッセイプロトコル
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル薄灰色マイクロプレート（ＡｌｐｈａＰｌａｔｅ－３８４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００５３５０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・１５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／Ａｌｐｈａストレプトアビジン被覆ドナービーズ］
・１０μＬのヒトＣ１ｑタンパク質。プレートをシーラーで覆い、暗所で２３℃にて３０分間プレインキュベートした。
・１０μＬの抗Ｃ１ｑ抗体にコンジュゲートされたＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ。プレートをシーラーで覆い、暗所で２３℃で更に３０分間インキュベートした。
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル薄灰色マイクロプレート（ＡｌｐｈａＰｌａｔｅ－３８４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００５３５０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・１５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体／Ａｌｐｈａストレプトアビジン被覆ドナービーズ］
・１０μＬのヒトＣ１ｑタンパク質。プレートをシーラーで覆い、暗所で２３℃にて３０分間プレインキュベートした。
・１０μＬの抗Ｃ１ｑ抗体にコンジュゲートされたＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ。プレートをシーラーで覆い、暗所で２３℃で更に３０分間インキュベートした。
【0157】
標準的なＡｌｐｈａ設定（６８０ｎｍで励起、５２０～６２０ｎｍで放出を読み取る）を使用して、ＶＩＣＴＯＲ（Ｒ）ＮｉｖｏＴＭリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＡＬＰＨＡシグナルを記録した。
【0158】
ＡＬＰＨＡシグナル解析及びデータ処理
ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対ＡＬＰＨＡシグナルをプロットすることによって結合曲線を表し、図１０に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。各結合曲線について、Ｓ／Ｂ：Ｓ／Ｂ＝ＡＬＰＨＡシグナル最大値抗体／ＡＬＰＨＡシグナル陰性対照を計算することによってシグナル強度を求めた。ＥＣ５０値も求めた。各被験抗体で得られた結果を表４に示す。
ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対ＡＬＰＨＡシグナルをプロットすることによって結合曲線を表し、図１０に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。各結合曲線について、Ｓ／Ｂ：Ｓ／Ｂ＝ＡＬＰＨＡシグナル最大値抗体／ＡＬＰＨＡシグナル陰性対照を計算することによってシグナル強度を求めた。ＥＣ５０値も求めた。各被験抗体で得られた結果を表４に示す。
【0159】
【表4】
【0160】
実施例１に示されるＴＲ－ＦＲＥＴに基づく方法と同様に、ＡＬＰＨＡアッセイによって、各種のアイソタイプ１、２、及び４のヒトＩｇＧ抗体のＣ１ｑ結合能を識別することができた。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照で最良のＳ／Ｂ及びＥＣ５０が得られ、このアイソタイプがヒトＣ１ｑに最も効率的に結合することが示された。ヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照で得られたより低いＳ／Ｂ及び増加したＥＣ５０は、ヒトＩｇＧ２がヒトＣ１ｑと弱く相互作用することを示す。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照では顕著なシグナルが測定されず、このアイソタイプがヒトＣ１ｑに結合しないことが示された。これらの結果は［参考文献６］と一致している。
【0161】
治療用ＩｇＧ１キメラ抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの結合プロファイルは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照で得られたものに近く、同様のＳ／Ｂ及びＥＣ５０値を有していた。
【0162】
実施例４：ビオチン化抗原を使用してＣ１ｑに対する抗体の結合を判定するための方法（ＴＲ－ＦＲＥＴ）
【0163】
別の方法は、図１１に示すように、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体の代わりにビオチン化抗原を用いてＴＲ－ＦＲＥＴアッセイを行うことからなる。
【0164】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づく。
【0165】
本明細書に記載される方法は、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、被験抗体を溶液中で捕捉し凝集させるために使用したビオチン化抗原（ビオチン化組換えヒトＴＮＦ－αタンパク質、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１６７７４７）との複合体の使用に基づいている（図１１）。被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）を、実施例１に記載したようにＥｕ３＋クリプテートにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗Ｃ１ｑ抗体（ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＭ２３８２）で検出した。このアッセイで試験した抗体は、特徴が表１に詳述されている治療用抗ＴＮＦ－α抗体アダリムマブである。これは、既知の濃度の精製抗体である。
【0166】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。１～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、アダリムマブの段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化ヒトＴＮＦ－α／ストレプトアビジン－ｄ２］を、１００ｎＭ／１００ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。１～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、アダリムマブの段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化ヒトＴＮＦ－α／ストレプトアビジン－ｄ２］を、１００ｎＭ／１００ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
【0167】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬのアダリムマブの段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化ヒトＴＮＦ－α／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬのアダリムマブの段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化ヒトＴＮＦ－α／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
【0168】
プレートをシーラーで覆い、室温で一晩インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0169】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
ＨＴＲＦデータを分析し、実施例１に記載されるように表した。アダリムマブで得られた結合曲線を図１２に示す。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。得られた結果を表５に示す。
ＨＴＲＦデータを分析し、実施例１に記載されるように表した。アダリムマブで得られた結合曲線を図１２に示す。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。得られた結果を表５に示す。
【0170】
【表5】
【0171】
ビオチン化ヒトＴＮＦ－αを使用するＴＲ－ＦＲＥＴアッセイにより、ヒトＣ１ｑと治療用抗ＴＮＦ－α ＩｇＧ１抗体アダリムマブとの間の相互作用を検出することができた（図１２）。この方法で得られたＳ／Ｂ及びＥＣ５０値（表５）は、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体を用いたＴＲ－ＦＲＥＴアッセイで得られたもの（表２）と同様である。
【0172】
実施例５：試験フォーマット［抗ヒトＦａｂ－ビオチン／ストレプトアビジン－ｄ２］対抗ヒトＦａｂ－ｄ２（ＴＲ－ＦＲＥＴ）
【0173】
【0174】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づく。
【0175】
図１３Ａに示すアッセイフォーマットは、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、被験抗体を溶液中で捕捉し凝集させるために使用したビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、＃ＧＴＸ２７４９７）との複合体の使用に基づいている。抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体は、実施例１に記載されるようにビオチン化した。
【0176】
図１３Ｂに示すアッセイフォーマットは、ｄ２標識キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６２Ｄ２ＤＰＥＡ）を製造者の説明書に従って使用してｄ２で直接的に標識された同じマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、＃ＧＴＸ２７４９７）の使用に基づいている。
【0177】
両方のアッセイフォーマットにおいて、被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）を、実施例１に記載したように、Ｅｕ３＋クリプテートにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗Ｃ１ｑ抗体（ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＭ２３８２）で検出した。
【0178】
このアッセイで試験した抗体は、特徴が表１に詳述されている治療用抗体リツキシマブであった。リツキシマブは、既知の濃度の精製抗体であった。
【0179】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。１～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、リツキシマブの段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２を、５０ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。１～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、リツキシマブの段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２を、５０ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
【0180】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬのリツキシマブの連続希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］又は５μＬの抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬのリツキシマブの連続希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］又は５μＬの抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
【0181】
プレートをシーラーで覆い、室温で一晩インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0182】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
「ＨＴＲＦ比」及び「デルタ比」の値を実施例１に詳述されるように計算した。次いで、以下の式を使用して正規化シグナル「デルタＦ％」を計算した。デルタＦ％＝デルタ比抗体／ＨＴＲＦ陰性対照。ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対デルタＦ％をプロットすることによって結合曲線を表し、図１４に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。得られた結果を表６に示す。
「ＨＴＲＦ比」及び「デルタ比」の値を実施例１に詳述されるように計算した。次いで、以下の式を使用して正規化シグナル「デルタＦ％」を計算した。デルタＦ％＝デルタ比抗体／ＨＴＲＦ陰性対照。ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対デルタＦ％をプロットすることによって結合曲線を表し、図１４に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。得られた結果を表６に示す。
【0183】
【表6】
【0184】
ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂを用いてリツキシマブ結合曲線で得られたＳ／Ｂは、複合体［抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ビオチン／ストレプトアビジン－ｄ２］を用いて得られたものの１／３倍であった。更に、複合体［ビオチン－抗体／ストレプトアビジン－ｄ２］をｄ２－抗体で置換すると、リツキシマブのＥＣ５０値は２．１倍増加した。これらのデータは、抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２単独（ストレプトアビジンと複合体化していない）ではリツキシマブの凝集を適切に誘導できず、その結果、ヒトＣ１ｑに対するその適切な結合を適切に誘導できないことを示唆している。
【0185】
実施例６：各種のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）のヒトＩｇＧに対する抗ヒトＦａｂ抗体の親和性を判定するためのサンドイッチ法（ＴＲ－ＦＲＥＴ）
【0186】
図１５に示すように、ＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイをセットアップして、飽和結合実験を行い、各種のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）のヒトＩｇＧに対する抗ヒトＦａｂ抗体の親和性を判定した。
【0187】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づく。
【0188】
２つの異なる結合アッセイフォーマットを試験した（図１５Ａ及びＢ）。両方のアッセイフォーマットは、ユーロピウムクリプテート標識キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６２ＥＵＳＵＥＡ）を製造者の説明書に従って使用してＥｕ３＋クリプテートで標識されたヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４）抗体の使用に基づいている。アッセイで使用したヒトＩｇＧ抗体を表７に記載する。
【0189】
【表7】
【0190】
図１５Ａに示す結合アッセイフォーマットは、ｄ２標識キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６２Ｄ２ＤＰＥＡ）を製造者の説明書に従って使用してｄ２で直接的に標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体を濃度を漸増させて使用する。図１５Ｂに示す結合アッセイフォーマットは、ストレプトアビジン－ｄ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）に複合体化されたビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体を濃度を漸増させて使用する。抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体は、実施例１に記載されるようにビオチン化した。
【0191】
アッセイで試験した３つの異なる抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体の特徴を表８に示す。
【0192】
【表8】
【0193】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を緩衝液３（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ、０．１％ＢＳＡ、１００ｍＭ ＫＦ、ｐＨ７．４）で希釈した。Ｅｕ３＋クリプテートで標識されたヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４）抗体を、０．３ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。対応する非標識ヒトＩｇＧの２×溶液を、３００ｎＭの最終濃度が得られるように調製した（標識ヒトＩｇＧと競合するように大過剰で使用した）。０．０２～５０ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、０．０２ｎＭ／０．０２ｎＭ～５０ｎＭ／５０ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度が得られるように４×で調製し、比１／１を維持しながら段階希釈した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を緩衝液３（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ、０．１％ＢＳＡ、１００ｍＭ ＫＦ、ｐＨ７．４）で希釈した。Ｅｕ３＋クリプテートで標識されたヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４）抗体を、０．３ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。対応する非標識ヒトＩｇＧの２×溶液を、３００ｎＭの最終濃度が得られるように調製した（標識ヒトＩｇＧと競合するように大過剰で使用した）。０．０２～５０ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、０．０２ｎＭ／０．０２ｎＭ～５０ｎＭ／５０ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度が得られるように４×で調製し、比１／１を維持しながら段階希釈した。
【0194】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・１０μＬの緩衝液３（又は非特異的シグナルを判定するために１０μＬの非標識ヒトＩｇＧ）
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ
・５μＬの抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２の連続希釈物、又は５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］の連続希釈物
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・１０μＬの緩衝液３（又は非特異的シグナルを判定するために１０μＬの非標識ヒトＩｇＧ）
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ
・５μＬの抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２の連続希釈物、又は５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］の連続希釈物
【0195】
プレートをシーラーで覆い、室温で一晩インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0196】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
「ＨＴＲＦ比」を実施例１に詳述されるように計算した。総シグナルは、非標識ヒトＩｇＧの非存在下で得られたＨＴＲＦ比に対応する。非特異的シグナルは、非標識ＩｇＧの存在下で得られたＨＴＲＦ比に対応する。特異的シグナルを以下のように計算した。特異的シグナル＝ＨＴＲＦ比総シグナルＨＴＲＦ比非特異的シグナル。［抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体］（ｎＭ）対ＨＴＲＦ比をプロットすることによって（総シグナル及び特異的シグナルの）飽和結合曲線を表し、「結合－飽和（１つの部位）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。「単純線形回帰」モデルを用いて非特異的シグナルをフィッティングした。Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ１、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ２、及びＥｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ４で得られた結果を、それぞれ図１６、図１７、及び図１８に示す。Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ２を用いた飽和結合実験は、ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂに基づくアッセイフォーマットのみで行った（図１７）。特異的結合飽和曲線から求めたＫｄ値を表９に示す（ｎｄ＝未測定）。
「ＨＴＲＦ比」を実施例１に詳述されるように計算した。総シグナルは、非標識ヒトＩｇＧの非存在下で得られたＨＴＲＦ比に対応する。非特異的シグナルは、非標識ＩｇＧの存在下で得られたＨＴＲＦ比に対応する。特異的シグナルを以下のように計算した。特異的シグナル＝ＨＴＲＦ比総シグナルＨＴＲＦ比非特異的シグナル。［抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体］（ｎＭ）対ＨＴＲＦ比をプロットすることによって（総シグナル及び特異的シグナルの）飽和結合曲線を表し、「結合－飽和（１つの部位）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。「単純線形回帰」モデルを用いて非特異的シグナルをフィッティングした。Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ１、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ２、及びＥｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ４で得られた結果を、それぞれ図１６、図１７、及び図１８に示す。Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ２を用いた飽和結合実験は、ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂに基づくアッセイフォーマットのみで行った（図１７）。特異的結合飽和曲線から求めたＫｄ値を表９に示す（ｎｄ＝未測定）。
【0197】
【表9】
【0198】
各アッセイフォーマット（抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２、又はストレプトアビジン－ｄ２に複合体化されたビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ）で求めたＫｄ値は比較的近く、最大で２．３倍の差があった。抗ヒトＦａｂ１及び２は、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４抗体について、０．１６ｎＭ～０．４７ｎＭの範囲の同様のＫｄ値を与えた。これは、これらのマウスモノクローナル抗体が異なるヒトＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）を同様に認識し、サブナノモル範囲で良好な親和性を有することを示している。逆に、抗ヒトＦａｂ３は、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ１で得られた親和性（Ｋｄ値約０．６～１ｎＭ）と比較して、Ｅｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４に対してより低い親和性（Ｋｄ値は３．３～９．６ｎＭの間に含まれる）を示した。これは、このヤギポリクローナル抗体が異なるヒトＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）を同様に認識することはなく、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ２に対して約１／６倍の親和性を有し、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ４に対して約１／９倍～１／７倍の親和性を有することを示す。
【0199】
実施例７：各種のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）の完全ヒト、ヒト化、及びキメラＩｇＧに対する抗ヒトＦａｂ抗体の親和性を判定するための競合法（ＴＲ－ＦＲＥＴ）
【0200】
実施例６で示されるＴＲ－ＦＲＥＴサンドイッチアッセイに基づいて、競合結合アッセイを実施して、図１９に示すように、各種のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）の完全ヒトＩｇＧ抗体、ヒト化ＩｇＧ抗体、及びキメラＩｇＧ抗体に対する抗ヒトＦａｂ抗体の親和性を判定した。
【0201】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づく。
【0202】
実施例６に記載の２つの結合アッセイフォーマット（図１５Ａ及びＢ、表７、表８）に基づいて、２つの異なる競合結合アッセイフォーマットを試験した（図１９）。抗ヒトＦａｂ（ｄ２で標識されているか、又はビオチン化され、ストレプトアビジン－ｄ２と複合体化されている）の濃度は、実施例６で求めたＫｄ値に基づいて決定した。各種のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）及び各種のフォーマット（完全ヒト、ヒト化、及びキメラ）の非標識ＩｇＧ抗体を濃度を漸増させて添加することによって、競合結合実験を行った。アッセイで試験したＩｇＧ抗体の特徴を表１０に記載する。それらはすべて、既知の濃度の精製抗体である。
【0203】
【表10】
【0204】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例６に記載されている緩衝液３で希釈した。Ｅｕ３＋クリプテートで標識されたヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４）抗体を、０．３ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。実施例６で求めたＫｄ値（表９）×２に相当する最終濃度を目指して、抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（ｄ２で標識されているか、又はビオチン化され、ストレプトアビジン－ｄ２と比１／１で複合体化されている）を４×で調製した。０．０３～１５０ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、非標識ＩｇＧ抗体の段階希釈物を２×で調製した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例６に記載されている緩衝液３で希釈した。Ｅｕ３＋クリプテートで標識されたヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４）抗体を、０．３ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。実施例６で求めたＫｄ値（表９）×２に相当する最終濃度を目指して、抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（ｄ２で標識されているか、又はビオチン化され、ストレプトアビジン－ｄ２と比１／１で複合体化されている）を４×で調製した。０．０３～１５０ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、非標識ＩｇＧ抗体の段階希釈物を２×で調製した。
【0205】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・１０μＬの非標識ＩｇＧ抗体の段階希釈物（又はシグナル最大値を決定するための１０μＬの緩衝液３）
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ
・５μＬの抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２、又は５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］
アッセイ成分の作業溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・１０μＬの非標識ＩｇＧ抗体の段階希釈物（又はシグナル最大値を決定するための１０μＬの緩衝液３）
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－ヒトＩｇＧ
・５μＬの抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ｄ２、又は５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］
【0206】
プレートをシーラーで覆い、室温で一晩インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0207】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
「デルタＦ％」値を実施例５に詳述されるように計算した。デルタＦ％最大値は、非標識ＩｇＧ抗体の非存在下で得られたデルタＦ％に対応する。以下のように非標識ＩｇＧ抗体の各濃度についてシグナル最大値の％を計算した。シグナル最大値の％＝デルタＦ％非標識ＩｇＧ抗体／デルタＦ％最大値×１００。ｌｏｇ［非標識ＩｇＧ抗体］（Ｍ）対シグナル最大値の％をプロットすることによって競合結合曲線を表し、「用量反応－阻害（可変勾配－４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。非標識ＩｇＧ１抗体、非標識ＩｇＧ２抗体、及び非標識ＩｇＧ４抗体で得られた競合結合曲線をそれぞれ図２０、図２１、及び図２２に示す。競合結合曲線から求めたＩＣ５０値により、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［標識ヒトＩｇＧ］／Ｋｄ））を使用してＫｉ値を計算した。非標識ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４で得られたＩＣ５０及びＫｉ値をそれぞれ表１１、表１２、及び表１３に示す（ｎｄ＝未測定）。
「デルタＦ％」値を実施例５に詳述されるように計算した。デルタＦ％最大値は、非標識ＩｇＧ抗体の非存在下で得られたデルタＦ％に対応する。以下のように非標識ＩｇＧ抗体の各濃度についてシグナル最大値の％を計算した。シグナル最大値の％＝デルタＦ％非標識ＩｇＧ抗体／デルタＦ％最大値×１００。ｌｏｇ［非標識ＩｇＧ抗体］（Ｍ）対シグナル最大値の％をプロットすることによって競合結合曲線を表し、「用量反応－阻害（可変勾配－４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。非標識ＩｇＧ１抗体、非標識ＩｇＧ２抗体、及び非標識ＩｇＧ４抗体で得られた競合結合曲線をそれぞれ図２０、図２１、及び図２２に示す。競合結合曲線から求めたＩＣ５０値により、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［標識ヒトＩｇＧ］／Ｋｄ））を使用してＫｉ値を計算した。非標識ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４で得られたＩＣ５０及びＫｉ値をそれぞれ表１１、表１２、及び表１３に示す（ｎｄ＝未測定）。
【0208】
完全ヒト、ヒト化、及びキメラＩｇＧ１抗体を用いた競合結合実験を、ストレプトアビジン－ｄ２に複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１を用いて（図２０Ａ）、また、ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ２及び３を用いて（図２０Ｂ及びＣ）行った。抗ヒトＦａｂ３－ｄ２は、すべてのＩｇＧ１抗体では試験しなかった。
【0209】
【表11】
【0210】
使用した抗ヒトＦａｂが何であれ、すべての被験ＩｇＧ１抗体で得られた競合曲線を重ね合わせた。各被験ＩｇＧ１抗体に対する各抗ヒトＦａｂの親和性に対応するＫｉ値は、使用した抗ヒトＦａｂが何であれ、非常に近く、平均が約０．２ｎＭであった（表１１）。これは、抗ヒトＦａｂ１、２、及び３が、サブナノモル範囲の親和性で、完全ヒト、ヒト化、及びキメラＩｇＧ１抗体を同様に認識することを示している。
【0211】
【表12】
【0212】
完全ヒトＩｇＧ２抗体及びキメラＩｇＧ２抗体を用いた競合結合実験を、ストレプトアビジン－ｄ２に複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１のみを用いて行った（図２１）。すべての被験ＩｇＧ２抗体で得られた競合曲線のプロファイルは類似しており、Ｋｉ値は０．２７～０．７２ｎＭの範囲であった（表１２）。これは、抗ヒトＦａｂ１が、０．５ｎＭの平均親和性で、完全ヒトＩｇＧ２抗体及びキメラＩｇＧ２抗体を同様に認識することを示している。
【0213】
【表13】
【0214】
完全ヒト、ヒト化、及びキメラＩｇＧ４抗体を用いた競合結合実験を、ストレプトアビジン－ｄ２に複合体化されたビオチン化抗ヒトＦａｂ１を用いて（図２２Ａ）、また、ｄ２で直接的に標識された抗ヒトＦａｂ２及び３を用いて（図２２Ｂ及びＣ）行った。抗ヒトＦａｂ３－ｄ２は、すべてのＩｇＧ４抗体では試験しなかった。
【0215】
すべての被験ＩｇＧ４抗体で得られた競合曲線のプロファイルは、抗ヒトＦａｂ１又は抗ヒトＦａｂ２のいずれを用いても類似していた（図２２Ａ及びＢ）。２つの抗ヒトＦａｂのそれぞれで求められたＫｉ値は非常に近く、抗ヒトＦａｂ１については平均が０．１ｎＭ、抗ヒトＦａｂ２については平均が０．４ｎＭであった（表１３）。これは、これらのマウスモノクローナル抗ヒトＦａｂ抗体が、サブナノモル範囲の親和性で、完全ヒト、ヒト化、及びキメラＩｇＧ４抗体に同じように結合することを示している。抗ヒトＦａｂ３で得られた競合結合曲線は、試験した抗体の性質に応じて異なるプロファイルを示した（図２２Ｃ）。実際、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体は、シグナルの全阻害を誘導し、Ｋｉ値は０．１３ｎＭであった。逆に、治療用抗体ペンブロリズマブ（ヒト化ＩｇＧ４）及びニボルマブ（完全ヒトＩｇＧ４）との競合は部分的であり、わずか３１～３２％のシグナル阻害であった。これらの結果は、ヤギポリクローナル抗ヒトＦａｂ３抗体が治療用ＩｇＧ４抗体を適切に認識しないことを示唆している。
【0216】
実施例８：ビオチン化抗Ｆａｂリガンドの濃度の最適化
【0217】
ビオチン化抗Ｆａｂリガンドの濃度を最適化するために、実施例１に記載したＴＲ－ＦＲＥＴアッセイを、各種の濃度の抗Ｆａｂリガンドを使用して行った。
【0218】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づく。
【0219】
アッセイフォーマットは、実施例１に記載されるように、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、ビオチンにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＡ１－１９２５５）との複合体を使用する。被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）を、実施例１に記載されるように、Ｅｕ３＋クリプテートにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗Ｃ１ｑ抗体（ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＭ２３８２）で検出した。
【0220】
アッセイで試験した抗体は、特徴が表１に詳述されている治療用抗体アテゾリズマブ及びヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照であった。両方とも既知の濃度の精製抗体である。
【0221】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。０．５～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］の３つの異なる溶液を、３０ｎＭ／３０ｎＭ、４０ｎＭ／４０ｎＭ、又は５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液２で希釈した。０．５～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］の３つの異なる溶液を、３０ｎＭ／３０ｎＭ、４０ｎＭ／４０ｎＭ、又は５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
【0222】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・３つの各種の濃度で試験した５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・３つの各種の濃度で試験した５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
【0223】
プレートをシーラーで覆い、室温で一晩インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0224】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
「デルタＦ％」値を計算し、用量反応結合曲線を実施例５に記載されるようにフィッティングした。各種の濃度のビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂと共にアテゾリズマブ（ＩｇＧ１）及びＩｇＧ２アイソタイプ対照を使用した結合プロファイルを、それぞれ図２３Ａ及び図２３Ｂに示す。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。結果を表１４に示す。
「デルタＦ％」値を計算し、用量反応結合曲線を実施例５に記載されるようにフィッティングした。各種の濃度のビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂと共にアテゾリズマブ（ＩｇＧ１）及びＩｇＧ２アイソタイプ対照を使用した結合プロファイルを、それぞれ図２３Ａ及び図２３Ｂに示す。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。結果を表１４に示す。
【0225】
【表14】
【0226】
ＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２抗体の両方で、３０ｎＭのビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂを用いて得られた結合曲線は、５０ｎＭのビオチン化抗Ｆａｂリガンドを用いて得られた結合曲線と比較して、左にシフトしたＥＣ５０値を示した。４０又は５０ｎＭのビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂを用いて得られた結合曲線はほぼ重ね合わせられ、５０ｎＭのビオチン化抗Ｆａｂリガンドを用いた場合のシグナル強度（Ｓ／Ｂ）がわずかにより良好であった。
【0227】
これらの結果は、確実に飽和用量で機能するには使用されるビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂの最適濃度が５０ｎＭであることを示している。この濃度は、実施例７で以前に求めた親和性（ＩｇＧ１について約０．２ｎＭ、ＩｇＧ２について約０．５ｎＭ）よりも約１００倍高く、大過剰であることが確認される。
【0228】
実施例９：塩濃度の最適化
【0229】
アッセイにおける塩の濃度を最適化するために、実施例１に記載したＴＲ－ＦＲＥＴアッセイを、各種の濃度のＮａＣｌを補充した４ｍＭのＰＯ４緩衝液中で行った。
【0230】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づく。
【0231】
アッセイフォーマットは、実施例１に記載されるように、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、ビオチンにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＡ１－１９２５５）との複合体を使用する。被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）を、実施例１に記載されるように、Ｅｕ３＋クリプテートにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗Ｃ１ｑ抗体（ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＭ２３８２）で検出した。
【0232】
このアッセイで試験した抗体は、治療用抗体リツキシマブ及びオビヌツズマブ、並びにリツキシマブＩｇＧ２アイソタイプ変異体であった。それらの特徴は表１に詳述されている。すべてが既知の濃度の精製抗体である。
【0233】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
４ｍＭのＰＯ４緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ－３００ ０．０１％、ｐＨ７．４）を調製し、１２５～１５５ｍＭの範囲の各種の濃度のＮａＣｌを補充した。使用直前に、すべてのアッセイ成分を、異なる濃度のＮａＣｌを含有する各緩衝液で希釈した。１～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、１．２ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
４ｍＭのＰＯ４緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ－３００ ０．０１％、ｐＨ７．４）を調製し、１２５～１５５ｍＭの範囲の各種の濃度のＮａＣｌを補充した。使用直前に、すべてのアッセイ成分を、異なる濃度のＮａＣｌを含有する各緩衝液で希釈した。１～１００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、被験抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、１．２ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
【0234】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
各緩衝液で調製したアッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
各緩衝液で調製したアッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
【0235】
プレートをシーラーで覆い、室温で一晩インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0236】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
「デルタ比」及び「デルタＦ％」値を、それぞれ実施例１及び実施例５に記載されるように計算した。結合曲線を実施例５に記載されるようにフィッティングした。
「デルタ比」及び「デルタＦ％」値を、それぞれ実施例１及び実施例５に記載されるように計算した。結合曲線を実施例５に記載されるようにフィッティングした。
【0237】
各種の濃度のＮａＣｌを補充した緩衝液中の５０ｎＭのリツキシマブ及び５０ｎＭのオビヌツズマブについて得られた最大デルタ比の値を図２４に示す。各濃度のＮａＣｌについて、緩衝液の対応するオスモル濃度を計算し、さらに、２つの抗ＣＤ２０抗体のＣ１ｑ結合能を識別するためのアッセイの能力を評価するのに使用したシグナル最大値リツキシマブ／シグナル最大値オビヌツズマブの比を計算した（表１５）。
【0238】
【表15】
【0239】
１３５～１５５ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ（２８２ｍＯｓｍ／Ｌ～３２２ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度に対応する）の存在下では、比は３超であり、このアッセイが、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体オビヌツズマブがヒトＣ１ｑと相互作用する能力を適切に識別することを示している。このＮａＣｌ濃度未満（オスモル濃度２８２ｍＯｓｍ／Ｌ未満）では、比は３未満であり、識別があまり良好でないことを示している。
【0240】
１５５ｍＭ及び１３５ｍＭのＮａＣｌの存在下で得られたリツキシマブ、オビヌツズマブ、及びリツキシマブＩｇＧ２アイソタイプ変異体の結合曲線（デルタＦ％で表される）を、それぞれ図２５Ａ及びＢに示す。各曲線について、実施例１に詳述されるようにＳ／Ｂを計算し、ＥＣ５０値も求めた。これらの値を表１６に示す。
【0241】
【表16】
【0242】
これらの結果は、ＮａＣｌ濃度もまたアッセイ感度に影響を及ぼすことを示した。１５５ｍＭのＮａＣｌでは、オビヌツズマブ及びリツキシマブＩｇＧ２アイソタイプ変異体を用いて得られたＳ／Ｂは非常に低かった（１．２～１．６の間に含まれる）。１３５ｍＭのＮａＣｌを使用した場合、異なる抗体間の識別は依然として良好であり、Ｓ／Ｂはより堅牢であった（１．７以上）。したがって、この濃度のＮａＣｌは、ヒトＣ１ｑに対する抗体の結合を調べるのに最適であった。
【0243】
実施例１０：試験フォーマット［抗ヒトＦａｂ－ビオチン／ストレプトアビジン－ｄ２］対［プロテインＬ－ビオチン／ストレプトアビジン－ｄ２］（ＴＲ－ＦＲＥＴ）
【0244】
【0245】
ＴＲ－ＦＲＥＴ検出は、実施例１に記載されるように、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づいていた。
【0246】
図２９Ａに示すアッセイフォーマットは、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、被験抗体を溶液中で捕捉し凝集させるために使用したビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、＃ＧＴＸ２７４９７）との複合体の使用に基づいていた。抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体は、実施例１に記載されるようにビオチン化した。
【0247】
図２９Ｂに示すアッセイフォーマットは、ｄ２標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、＃６１０ＳＡＤＬＦ）と、被験抗体を溶液中で捕捉し凝集させるために使用したビオチン化組換えプロテインＬ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２１１８９）との複合体に基づいていた。組換えプロテインＬは、実施例１に記載した抗ヒトＦａｂ抗体に用いたプロトコルと同じプロトコルを用いてビオチン化した。
【0248】
両方のアッセイフォーマットにおいて、被験抗体に結合したヒトＣ１ｑタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１７４０）を、実施例１に記載されるように、Ｅｕ３＋クリプテートにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗Ｃ１ｑ抗体（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＭ２３８２）で検出した。
【0249】
このアッセイで試験した抗体は、治療用モノクローナル抗体アダリムマブ及びトラスツズマブであった。アダリムマブの特徴を表１に詳述する。トラスツズマブは、ＨＥＲ２受容体を標的化するヒト化ＩｇＧ１抗体である。両方とも既知濃度の精製抗体であった。
【0250】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ成分の調製
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液１で希釈した。１～４００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、各抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］又は［ビオチン化プロテインＬ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
使用直前に、すべてのアッセイ成分を、配合が実施例１に詳述されている緩衝液１で希釈した。１～４００ｎＭの間に含まれるアッセイの最終濃度を目指して、各抗体の段階希釈物を４×で調製した。プレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］又は［ビオチン化プロテインＬ／ストレプトアビジン－ｄ２］を、５０ｎＭ／５０ｎＭの最終濃度が得られるように比１／１で４×で調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質を、５ｎＭの最終濃度に達するように４×で調製した。Ｅｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体を、０．６ｎＭの最終濃度を目指して４×で調製した。
【0251】
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイプロトコル
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］又は［ビオチン化プロテインＬ／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
アッセイ成分の４×溶液を、以下のように３８４ウェル低容量白色マイクロプレート（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ Ｐｌｕｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に順次分注した。
・５μＬの被験抗体の段階希釈物（又は陰性対照用の５μＬの緩衝液）
・５μＬのプレミックス［ビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ／ストレプトアビジン－ｄ２］又は［ビオチン化プロテインＬ／ストレプトアビジン－ｄ２］
・５μＬのヒトＣ１ｑタンパク質
・５μＬのＥｕ３＋クリプテート－抗Ｃ１ｑ抗体
【0252】
プレートをシーラーで覆い、室温で３時間インキュベートした。ＨＴＲＦ検出モジュール（３３７ｎｍのフラッシュランプによる励起、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのシグナル放出の記録）を使用して、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）でＨＴＲＦシグナルを記録した。
【0253】
ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル解析及びデータ処理
「ＨＴＲＦ比」及び「デルタ比」値を実施例１に詳述されるように計算した。次いで、正規化シグナル「デルタＦ％」を実施例５に詳述されるように計算した。ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対デルタＦ％をプロットすることによって結合曲線を表し、図３０に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。得られた結果を表１７に示す。
「ＨＴＲＦ比」及び「デルタ比」値を実施例１に詳述されるように計算した。次いで、正規化シグナル「デルタＦ％」を実施例５に詳述されるように計算した。ｌｏｇ［抗体］（Ｍ）対デルタＦ％をプロットすることによって結合曲線を表し、図３０に示すように、「シグモイド用量反応曲線－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９でフィッティングした。Ｓ／Ｂを実施例１に詳述されるように計算し、ＥＣ５０値も求めた。得られた結果を表１７に示す。
【0254】
【表17】
【0255】
複合体［プロテインＬ－ビオチン／ストレプトアビジン－ｄ２］を使用してアダリムマブ及びトラスツズマブ結合曲線で得られたＳ／Ｂは、複合体［抗ヒトＦａｂ－ビオチン／ストレプトアビジン－ｄ２］を使用して得られたＳ／Ｂの１／３．４倍であった（表１７）。更に、抗ヒトＦａｂ抗体を組換えプロテインＬで置換した場合、両抗体のＥＣ５０値は９倍増加した（表１７）。
【0256】
これらのデータは、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体が、ビオチン化プロテインＬとは異なり、適切なシグナルを誘導することを示している。
【0257】
参考文献
［参考文献１］Ｋａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ１ｑ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＩｇＧ，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，１９９７
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［参考文献５］Ｈｅｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＤ２０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＧＡ１０１（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３
［参考文献６］Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８
［参考文献７］Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｃ１ｑ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８
［参考文献８］Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ａｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒｉｃ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｓａｍｐｌｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２０１３
［参考文献１］Ｋａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ１ｑ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＩｇＧ，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，１９９７
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［参考文献３］Ｌｉｌｉｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ ＩｇＧ１ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｃγ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８
［参考文献４］Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＩｇＧ Ｈｅｘａｍｅｒｓ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４
［参考文献５］Ｈｅｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＤ２０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＧＡ１０１（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３
［参考文献６］Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８
［参考文献７］Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｃ１ｑ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８
［参考文献８］Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ａｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒｉｃ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｓａｍｐｌｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２０１３
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する抗体（被験抗体）の結合を判定するためのインビトロ方法であって、ａ）測定媒体に、
被験抗体、
ビオチン化抗Ｆａｂリガンドであって、上記被験抗体のＦａｂ領域に結合することができるビオチン化抗Ｆａｂリガンド、
ＨＰＡ（ホモジニアスプロキシミティアッセイ）パートナーのペアの第１のメンバーで直接的又は間接的に標識されたストレプトアビジン、及び
ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的又は間接的に標識されたＣ１ｑ
を接触させる工程と、
ｂ）上記測定媒体中のＨＰＡシグナルを測定する工程であって、ＨＰＡシグナルの存在が上記Ｃ１ｑに対する上記被験抗体の結合を表す、工程と
を含む方法。
【請求項2】
上記ＨＰＡが、（ｉ）化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）などの化学増幅型発光酸素チャネリングイムノアッセイ（ＬＯＣＩ）、（ｉｉ）共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、及び（ｉｉｉ）空間近接分析試薬捕捉ルミネッセンス（ＳＰＡＲＣＬ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
上記被験抗体が、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２である、請求項１及び２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
上記ビオチン化抗Ｆａｂリガンドが、ビオチン化抗Ｆａｂ抗体又は抗体断片、例えばビオチン化抗Ｆａｂマウス抗体又は抗体断片、例えばビオチン化抗Ｆａｂマウス抗体又は抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
上記ビオチン化抗Ｆａｂリガンドが、ビオチン化抗原又は抗原断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
上記ストレプトアビジンが、ＲＥＴパートナーのペアの第１のメンバー又はＬＯＣＩパートナーのペアの第１のメンバーなどのＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
上記Ｃ１ｑが、ＲＥＴパートナーのペアの第２のメンバー又はＬＯＣＩパートナーのペアの第２のメンバーなどのＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで標識された抗Ｃ１ｑリガンドで間接的に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
（ｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがアクセプターであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがドナーであるか、又は（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがドナーであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがアクセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
（ｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがアクセプターであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがドナーであるか、又は
（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがドナーであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがアクセプターであり、
上記ＨＰＡがＲＥＴであり、上記ドナーが、
ユーロピウムクリプテート、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、及びニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動）ドナー、又は
ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、及びホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）ドナー
などの発光ドナー化合物又は蛍光ドナー化合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
（ｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがアクセプターであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがドナーであるか、又は
（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがドナーであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがアクセプターであり、
上記ＨＰＡがＲＥＴであり、上記アクセプターが、
アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、及びｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、及びＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴアクセプター、又は
アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、及びｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、及びＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴアクセプター
などの蛍光アクセプター化合物又は非蛍光アクセプター化合物（クエンチャー）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
（ｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがアクセプターであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがドナーであるか、又は
（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがドナーであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがアクセプターであり、
上記ＨＰＡがＬＯＣＩであり、上記ドナーがフタロシアニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
（ｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがアクセプターであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがドナーであるか、又は
（ｉｉ）ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーがドナーであり、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーがアクセプターであり、
上記ＨＰＡがＬＯＣＩであり、上記ドナーがフタロシアニンであり、
上記アクセプターが（ｉ）チオキセン、アントラセン、及びルブレン、又は（ｉｉ）チオキセン及びユーロピウムキレートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
工程（ａ）及び工程（ｂ）が各種の濃度の上記被験抗体を用いて繰り返され、好ましくは、上記方法が、上記Ｃ１ｑに対する上記被験抗体の結合の解離定数（Ｋｄ）及び／又はＥＣ５０を決定する追加工程（ｃ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
上記測定媒体のオスモル濃度が、２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～５００ｍＯｓｍ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
請求項１に記載の方法を実施するための試薬キットであって、（ｉ）ビオチン化抗Ｆａｂリガンドと、
（ｉｉ）ストレプトアビジン、又はＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されたストレプトアビジンと、
（ｉｉｉ）Ｃ１ｑ、又はＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されたＣ１ｑと、
（ｉｖ）上記ストレプトアビジンがＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第１のメンバーで直接的に標識された抗ストレプトアビジンリガンドと、
（ｖ）上記Ｃ１ｑがＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識されていない場合には、ＨＰＡパートナーのペアの第２のメンバーで直接的に標識された抗Ｃ１ｑリガンドと
を含むキット。
【国際調査報告】