特表 2024-518577 植物生長促進効能を有する微細藻類菌株およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-01

(54)【発明の名称】植物生長促進効能を有する微細藻類菌株およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/12 20060101AFI20240423BHJP

【ＦＩ】

C12N1/12 C ZNA

C12N1/12 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023570310

(86)(22)【出願日】2022-08-09

(85)【翻訳文提出日】2023-11-13

(86)【国際出願番号】 KR2022011885

(87)【国際公開番号】W WO2023043063

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】10-2021-0125207

(32)【優先日】2021-09-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507406611

【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】シン，ウォン・ソプ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ジョン‐ウン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ソンフン

(72)【発明者】

【氏名】カン，ユナ

(72)【発明者】

【氏名】カン，ヘ‐ウォン

(72)【発明者】

【氏名】オ，ヨンジュ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ギュリ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジ・ヨン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA84X

4B065BC07

4B065BD15

4B065CA49

(57)【要約】

本出願は植物生長促進効能を有する新規な微細藻類菌株およびその用途に関するものであって、一様相による新規なクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２菌株は発酵排気ガスの存在下で培養時成長速度が速く光合成効率が高くて微生物発酵による排気ガスを効率的に低減させることができ、菌株の培養物または培養上清液などを植物に処理すれば植物の生長を促進する効能があって植物用肥料として使用できるため、環境に優しく産業的活用度が高い新たな炭素低減技術として有用に活用できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２菌株。

【請求項2】

受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、植物生長促進用組成物。

【請求項3】

請求項２に記載の植物生長促進用組成物を含む植物用肥料。

【請求項4】

受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２菌株を発酵排気ガスの存在下で培養する段階を含む、クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を培養する方法。

【請求項5】

前記発酵排気ガスは、０．５～２０％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素を含むものである、請求項４に記載のクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を培養する方法。

【請求項6】

前記発酵排気ガスは、微生物発酵によって発生したものである、請求項４に記載のクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を培養する方法。

【請求項7】

前記培養する段階は、２０～４０℃で行うことである、請求項４に記載のクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を培養する方法。

【請求項8】

前記培養する段階は、３０日以下で行うことである、請求項４に記載のクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を培養する方法。

【請求項9】

受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む植物生長促進用組成物を製造する段階；および
前記植物生長促進用組成物を植物に接触させる段階を含む、植物生長を促進する方法。

【請求項10】

前記接触させる段階は、前記植物生長促進用組成物を土壌、植物、または植物の種子に処理する方法によって行われることである、請求項９に記載の植物生長を促進する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互引用
本出願は２０２１年９月１７日付韓国特許出願第１０－２０２１－０１２５２０７号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。

【0002】

本出願は、植物生長促進効能を有する新規な微細藻類菌株およびその用途に関するものである。

【背景技術】

【0003】

バイオ産業の規模が拡大するにつれて微生物の発酵技術を基盤にして多様な産物を作り出すことができるようになり、特に、最近、ホワイトバイオ（Ｗｈｉｔｅ Ｂｉｏ）分野の成長に伴い、微生物発酵分野の産業も大きく成長している。但し、発酵は基本的に二酸化炭素を排出する工程であるため、微生物発酵分野の産業が発達するにつれて発酵によって発生する温室ガスの排出量が大きく増大するという問題点が随伴されている。これと共に全世界的に気候変動問題が台頭するにつれて、気候変動の主要原因として指目される温室ガスを低減するための努力が多角的に行われているところ、微生物発酵によって発生する温室ガスを低減することも主要課題になっている。

【0004】

現在まで主に温室ガスの排出自体を抑制して炭素低減に寄与することができる技術が商用化されているが、微生物発酵工程上で二酸化炭素の排出量を減少させることは非常に難しいことと思われている。また、まだ温室ガスを直接捕集して低減することができる技術の開発は微小な水準であり、特に、二酸化炭素は大気中に非常に低濃度で存在し反応性も非常に低い安定な物質であるため、既に排出された二酸化炭素を低減する技術の開発に困難がある。これと関連して、生物学的炭素低減技術の一種として光合成の可能な生物を用いる方法が考慮されるが、炭素低減目的以外に収益構造が不明で実際産業に適用しにくいという問題がある。よって、環境親和的な方法で微生物発酵によって発生する二酸化炭素を減少させることができながらも産業的に適用可能な炭素低減技術の開発が必要であるのが実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本出願の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２菌株を提供することである。

【0006】

本出願の他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、植物生長促進用組成物を提供することである。

【0007】

本出願の他の目的は、前記植物生長促進用組成物を含む植物用肥料を提供することである。

【0008】

本出願の他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を発酵排気ガスの存在下で培養する段階を含む、クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を培養する方法を提供することである。

【0009】

本出願の他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む植物生長促進用組成物を製造する段階；および前記植物生長促進用組成物を植物に接触させる段階を含む、植物生長を促進する方法を提供することである。

【0010】

本出願の他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の植物用肥料製造のための用途、または植物生長促進のための用途を提供することである。

【0011】

本出願の他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、組成物の植物生長促進のための植物用肥料製造のための用途、または植物生長促進のための用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本出願で開示されるそれぞれの説明および実施形態はそれぞれの他の説明および実施形態にも適用できる。即ち、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本出願の範疇に属する。また、下記記述された具体的な叙述によって本出願の範疇が制限されると見られない。また、当該技術分野の通常の知識を有する者は通常の実験のみを使用して本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知するか確認することができる。また、このような等価物は本出願に含まれることと意図される。

【0013】

一様相は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２菌株を提供する。

【0014】

前記植物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属の植物であってもよい。例えば、前記シロイヌナズナ属植物はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）であってもよいが、これに制限されない。

【0015】

本明細書で使用された用語、“植物生長”は植物の種が発芽して根、幹、葉を出すかまたはその後次第に大きさと重さを増していく過程を意味し、用語、“植物生長促進”は植物の種の発芽または発芽した植物の大きさおよび／または重量の増加を促進することを意味する。

【0016】

前記クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株は配列番号１の１８Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列を有するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。例えば、前記クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株は配列番号１の塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を示す塩基配列から構成される１８Ｓ ｒＲＮＡを有するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。

【0017】

他の様相は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、植物生長促進用組成物を提供する。

【0018】

前記クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株は前記の通りである。

【0019】

前記菌株の“培養物”は前記菌株を培養して生成された産物を指すものであって、具体的に、菌株を含む培養液であってもよく、前記“培養上清液”は前記菌株の培養物または培養液から菌株が除去された培養濾液であってもよい。前記“濃縮物”は、前記培養物または培養上清液を濃縮したものを意味することができる。前記“乾燥物”は前記菌株の培養物、培養上清液またはその濃縮物から水分が除去されたものであって、例えば、前記菌株の乾燥菌体形態であってもよいが、これに制限されるわけではない。また、前記乾燥物の“破砕物”は前記水分が除去された乾燥物を破砕した結果物を総称するものであって、例えば、前記菌株の乾燥菌体粉末であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記菌株の培養物は培養培地に前記菌株を接種し、当業界に公知された培養方法によって製造することができ、または前記菌株を発酵排気ガスの存在下で培養する段階を含む方法で製造することができる。前記濃縮物、その乾燥物またはその破砕物は、当業界に公知された微細藻類またはその培養物の処理または乾燥方法によって製造することができる。

【0020】

前記植物はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属の植物のことであってもよい。例えば、前記シロイヌナズナ属植物はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）であってもよいが、これに制限されない。

【0021】

前記植物生長促進用組成物は、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、凍結保護剤、または賦形剤などを含有することができる。

【0022】

前記保存剤、安定化剤、または賦形剤は前記組成物の品質低下（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）を減少させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものであってもよい。

【0023】

本明細書で使用される用語、“品質低下”は、組成物などに含まれるクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の数減少、活性減少、またはこれらの組み合わせを含むことであってもよい。

【0024】

例えば、前記組成物は組成物の品質低下を減少させるのに十分な有効量の保存剤、安定化剤、または賦形剤を含むことによって、自然状態に存在するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株と異なり、組成物内でクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株がより長い期間生存するか活性が維持されるのであり得る。

【0025】

前記保存剤、安定化剤、または賦形剤は、前記組成物の品質低下を減少させることができるものであれば、当業界で通常使用されるものが制限なく使用できる。例えば、前記安定化剤は、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）、カゼイン、カゼインナトリウム、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ペクチン、ゼラチン、アラビアガム、キサンタンガム、デキストラン、シクロデキストリンおよびデンプンから構成される群より選択されるいずれか一つ以上であってもよい。

【0026】

前記凍結保護剤は、前記組成物が凍結乾燥された状態の時、組成物の品質低下を減少させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものであってもよい。例えば、自然状態に存在するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株と異なり、前記組成物は凍結乾燥された状態で組成物の品質低下を減少させるのに十分な有効量の凍結保護剤を含むことによって、凍結乾燥された組成物内でクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株がより長い期間生存するか活性が維持されるのであり得る。

【0027】

前記凍結保護剤は、凍結乾燥された状態の組成物の品質低下を減少させるためのものであれば、当業界で通常使用されるものが制限なく使用できる。例えば、前記凍結保護剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）、グルコース、トレハロース、マルトデキストリン、デキストリン、スキムミルク、およびデンプンから構成される群より選択されるいずれか一つ以上であってもよい。

【0028】

前記組成物は、浸漬、噴霧または混合して植物の肥料に添加できる。

【0029】

また他の様相は、前記植物生長促進用組成物を含む植物用肥料を提供する。

【0030】

前記植物生長促進用組成物は前記の通りである。
前記植物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属の植物のことであってもよい。例えば、前記シロイヌナズナ属植物はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）であってもよいが、これに制限されない。

【0031】

前記植物用肥料は、当業界で通常使用される製造方法によって製造することができる。例えば、前記植物用肥料は当業界で通常使用される賦形剤または担体をさらに含むことができ、当業界に公知された通常の植物用肥料の剤形に製造することができる。

【0032】

前記植物用肥料は、化学肥料を代替することができる環境に優しい肥料であってもよい。

【0033】

前記植物用肥料は、植物の生長を促進するために使用できる。

【0034】

また他の様相は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を発酵排気ガスの存在下で培養する段階を含む、クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を培養する方法を提供する。

【0035】

前記クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株は前記の通りである。

【0036】

前記発酵排気ガスは、０．５～２０％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素を含むものであってもよい。例えば、前記発酵排気ガスは、０．５～１８％（ｖ／ｖ）、０．５～１６％（ｖ／ｖ）、０．５～１４％（ｖ／ｖ）、０．５～１２％（ｖ／ｖ）、０．８～１８％（ｖ／ｖ）、０．８～１６％（ｖ／ｖ）、０．８～１４％（ｖ／ｖ）、または０．８～１２％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素を含むものであってもよい。

【0037】

前記発酵排気ガスは、微生物発酵によって発生されたものであってもよい。例えば、前記発酵排気ガスは、微生物発酵によって発生された二酸化炭素を含むものであってもよい。前記微生物は、発酵または培養過程中に二酸化炭素を発生させる全ての微生物を制限なく含むことができる。

【0038】

前記培養する段階は、発酵排気ガスを発酵槽に供給しながら行うことであってもよい。例えば、前記発酵排気ガスは微生物発酵によって発生されたガスをろ過して発酵槽に供給することであってもよい。前記発酵排気ガスは発酵槽に０．００１～１ｖｖｍの速度で供給されるのであってもよい。例えば、前記発酵排気ガスは発酵槽に０．００１～１ｖｖｍ、０．００１～０．７ｖｖｍ、０．００１～０．５ｖｖｍ、０．００１～０．３ｖｖｍ、０．００１～０．２ｖｖｍ、０．００５～１ｖｖｍ、０．００５～０．７ｖｖｍ、０．００５～０．５ｖｖｍ、０．００５～０．３ｖｖｍ、０．００５～０．２ｖｖｍ、０．０１～１ｖｖｍ、０．０１～０．７ｖｖｍ、０．０１～０．５ｖｖｍ、０．０１～０．３ｖｖｍ、または０．０１～０．２ｖｖｍの速度で供給されるのであってもよい。

【0039】

前記培養する段階は２０～４０℃で行うことであってもよい。例えば、前記培養する段階は２０～３０℃で行うことであってもよい。

【0040】

前記培養する段階は光の存在下で行うことであってもよい。例えば、前記培養する段階は、クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株が成長するのに十分な量の光源を照射しながら行うことであってもよい。前記光源は例えばＬＥＤ光源であってもよいが、これに制限されない。

【0041】

前記培養する段階は３０日以下に行うことであってもよい。例えば、前記培養する段階は、３～３０日、３～２０日、３～１５日、３～１２日、または３～１０日間行うことであってもよい。

【0042】

前記培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知された回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行うことができる。本出願のクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の培養に使用される培地およびその他の培養条件は通常のクロレラ・ブルガリス菌株の培養に使用される培地であれば特別な制限なくいずれも使用することができ、例えば、ＢＧ－１１培地を使用することができる。具体的に、本出願のクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸および／またはビタミンなどを含有した通常の培地内で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。具体的に、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨを調節することができるが、これに制限されるわけではない。

【0043】

また他の様相は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む植物生長促進用組成物を製造する段階；および前記植物生長促進用組成物を植物に接触させる段階を含む、植物生長を促進する方法を提供する。

【0044】

前記クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株、および前記植物生長促進用組成物は前記の通りである。

【0045】

前記クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の培養物または培養上清液は、当業界に公知された適した方法を用いて回収するものであってもよい。また、前記植物生長促進用組成物を製造する段階は当業界に公知された適した方法を用いることであってもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣなどを使用することができ、精製工程をさらに含むことであってもよく、当業界に公知された微細藻類またはその培養物の濃縮、乾燥などの方法を含むことができる。

【0046】

前記接触させる段階は、前記植物生長促進用組成物を土壌、植物、または植物の種子に処理する方法によって行われることであってもよい。例えば、前記接触させる段階は前記植物生長促進用組成物を植物の葉に噴霧する方法で行われることであってもよいが、これに制限されない。

【0047】

また他の様相は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の植物用肥料製造のための用途、または植物生長促進のための用途を提供する。

【0048】

また他の様相は、受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰで寄託され、植物生長促進効能を有するクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株；前記菌株の培養物または培養上清液；前記培養物または培養上清液の濃縮物；前記培養物、培養上清液または濃縮物の乾燥物；および前記乾燥物の破砕物からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、組成物の植物生長促進のための植物用肥料製造のための用途、または植物生長促進のための用途を提供する。

【発明の効果】

【0049】

一様相による新規なクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２菌株は発酵排気ガスの存在下で培養時成長速度が速く光合成効率が高くて微生物発酵による排気ガスを効率的に低減させることができ、前記菌株の培養物または培養上清液などを植物に処理すれば植物の生長を促進する効能があって植物用肥料として使用できるため、環境に優しく産業的活用度が高い新たな炭素低減技術として有用に活用できる。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】クロレラ・ブルガリス菌株各４種の培養後、乾燥細胞重量（ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ：ＤＣＷ）を測定した結果グラフである。

【図2】ＤＷ、ＢＧ－１１液体培地、Ａｃａｄｉａｎ ２９、またはクロレラ・ブルガリス菌株各４種の培養上清液の希釈液をそれぞれ処理した後、シロイヌナズナの地上部重量を測定した結果グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0051】

以下、本発明を、実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるのではない。

【実施例】

【0052】

実施例１．新規な野生型緑藻類の分離
大韓民国京畿道水原市の河川の計５箇所の地域から試料を採取し、ダイレクトプレーティング（ｄｉｒｅｃｔ ｐｌａｔｉｎｇ）技法を用いて緑藻類（ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ）に属する微細藻類を分離した。

【0053】

具体的に、試料を採取後、２～３日以内にこれから微細藻類を分離し、顕微鏡観察を通じて緑色を帯び球形の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を含む試料を微生物分離用ＢＧ－１１固体培地（１．５ｇ／Ｌ ＮａＮＯ_３、４０ｍｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、７５ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３６ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、６ｍｇ／Ｌ クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）・Ｈ_２Ｏ、６ｍｇ／Ｌ クエン酸鉄アンモニウム（ｆｅｒｒｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、１ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２ＣＯ_３、２．８６ｍｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、１．８１ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、０．２２ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３９ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．０７９ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０４９ｍｇ／Ｌ Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ、１５ｇ／Ｌ アガー（ａｇａｒ））に塗抹した。得られたコロニーは抗生剤カクテルミックス（ｃｏｃｋｔａｉｌ ｍｉｘ）溶液（０～５００ｍｇ／Ｌ 硫酸ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、０～５００ｍｇ／Ｌ アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、０～５００ｍｇ／Ｌ 硫酸カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ））の濃度を調節して投入したＢＧ－１１固体培地で継代培養を通じて純粋分離した。

【0054】

実施例２．分離した微細藻類のＤＮＡ配列同定
前記実施例１から分離した微細藻類の分子生物学的同定のために１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を分析した。

【0055】

具体的に、純粋分離されたコロニーからＤＮＡを抽出した後、１８Ｓ ｒＲＮＡ部分の遺伝子増幅用プライマー（表１）を用いてＰＣＲを行った。

【0056】

【表1】

【0057】

ＰＣＲ反応は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で２分間重合を３５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。増幅された反応液を活用して塩基配列を分析した結果、約１，５６５ｂｐ大きさの塩基配列を確保した（配列番号１）。これをＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）でＢＬＡＳＴ検索した結果、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＫＭＭＣＣ ＦＣ－４２菌株と９９．６８％の相同性を有することを確認して、前記分離された菌株をクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＣＤ０２－３００２と命名し、２０２１年８月２３日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＫＣＴＣ）に寄託して受託番号ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰの付与を受けた。

【0058】

実施例３．発酵排気ガス基盤の光培養条件下でクロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の成長能確認
分離された新規菌株クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２が発酵排気ガス基盤の光培養条件下で成長可能な菌株なのか確認するために、様々な種のクロレラ・ブルガリス菌株と成長能を比較評価した。

【0059】

対照群菌株としてＵＴＥＸ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｔ ＵＴ－Ａｕｓｔｉｎ機関から分譲を受けたクロレラ・ブルガリスＵＴＥＸ２６５菌株を使用し、比較群として前記実施例１に記載されたものと同様な方法で分離したクロレラ・ブルガリスＣＤ１１－２００１およびＣＤ１１－２００３菌株を使用した。それぞれの菌株は滅菌されたＢＧ－１１液体培地（１．５ｇ／Ｌ ＮａＮＯ_３、４０ｍｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、７５ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３６ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、６ｍｇ／Ｌ クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）・Ｈ_２Ｏ、６ｍｇ／Ｌ クエン酸鉄アンモニウム（ｆｅｒｒｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、１ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２ＣＯ_３、２．８６ｍｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、１．８１ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、０．２２ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３９ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．０７９ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０４９ｍｇ／Ｌ Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ）１００ｍＬに接種した後、ＬＥＤ光源で光を持続的に照射し、１～１０％（ｖ／ｖ）濃度のＣＯ_２を０．０１～０．１ｖｖｍで供給しながら４～７日間培養した。その後、培養液を滅菌された新しいＢＧ－１１液体培地９００ｍＬに接種し、ＬＥＤ光源で光を持続的に照射しながら３～５日間培養し、前記培養期間の間に発酵排気ガスを空気ろ過器（ａｉｒ ｆｉｌｔｅｒ）を経て前記培養液に０．０１～０．５ｖｖｍで直接供給した。発酵排気ガスは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ １０９０２）菌株（米国公開特許ＵＳ２００８／０２９９６４４ Ａ１）を５Ｌ発酵槽で培養温度３０℃、培養ｐＨ６．９～７．１（アンモニア水でｐＨ調整）、通気量０．５～１．０ｖｖｍおよび攪拌速度５００～７００ｒｐｍを維持しながら流加式で培養する間に発生するガスを使用した。

【0060】

培養終了後、それぞれの菌株培養液１０ｍＬを０．４５μｍフィルターでろ過した後、６０℃オーブンで２４時間乾燥した後、ろ過前フィルターの重量と、ろ過および乾燥以後乾燥された細胞を含むフィルターの重量差を計算して乾燥細胞重量（ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ：ＤＣＷ）値を算出した。

【0061】

その結果、図１に示したように、クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株が分譲を受けたクロレラ・ブルガリス菌株（ＵＴＥＸ２６５）や新規分離した他のクロレラ・ブルガリス菌株（ＣＤ１１－２００１およびＣＤ１１－２００３）に比べて顕著に高い乾燥細胞重量を有することを確認した。これによって、クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株が他のクロレラ・ブルガリス菌株に比べて発酵排気ガス基盤の光培養条件下で成長速度が最も優れた菌株であることが分かった。

【0062】

実施例４．クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の培養上清液の植物生長促進効能確認
クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株の培養上清液の植物生長促進効能を確認するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を対象にして生長促進有無を評価した。

【0063】

具体的に、野生型シロイヌナズナ種子を７０％エタノールで１分、１％ＮａＯＣｌ溶液で３分間表面殺菌後、滅菌された蒸留水で洗浄して準備した。シロイヌナズナは２日間冷蔵保管（４℃）後、床土（（株）東部ファーム韓農）に植えた後、２１℃恒温器で１２時間は光を照射し、１２時間は光を照射しない暗い状態で１週間程度栽培した。

【0064】

クロレラ・ブルガリスＵＴＥＸ２６５、ＣＤ１１－２００１、ＣＤ０２－３００２、およびＣＤ１１－２００３の計４種の菌株を滅菌されたＢＧ－１１液体培地２００ｍＬに接種後、ＬＥＤ光源を照射し１～１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２を０．１ｖｖｍで持続的に供給しながら２５℃で５～７日間培養した。培養された種培養物（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）を滅菌されたＢＧ－１１液体培地１．８Ｌに接種し同一な条件で最大１０日間培養した。培養終了後、培養物を遠心分離して各菌株の培養上清液を得た。

【0065】

植物生長促進効能を評価するために、栽培したシロイヌナズナに各菌株培養上清液の１０～１０００倍希釈液を１ｍＬ／ｐｌａｎｔ水準で処理し、４日間隔で３回葉面施肥した。対照群として蒸留水（ＤＷ）を同一に処理した群に設定し、比較群として微細藻類光培養に使用した培地（ＢＧ－１１液体培地）または商用化されている海藻抽出物液体肥料（Ａｃａｄｉａｎ ２９）を同一に処理した群を追加した。シロイヌナズナの生長測定指標として地上部生体重（地上部重量）を測定した。各試験群別シロイヌナズナの８個体で反復実験を行って地上部生体重の平均値および標準偏差を計算して示した。

【0066】

その結果、図２に示したように、他のクロレラ・ブルガリス菌株は対照群に比べて生長促進効能が微小であるか殆どないことと示された反面、クロレラ・ブルガリスＣＤ０２－３００２菌株は顕著に優れた生長促進効能を示し、これは商用化肥料であるＡｃａｄｉａｎ２９よりも顕著に優れた効能であることが分かった。

【0067】

以上の説明から、本出願の属する技術分野における通常の知識を有する者は本出願がその技術的思想や必須的特徴を変更せず他の具体的な形態に実施することができるのが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり限定的なものではないと理解しなければならない。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは後述の特許請求範囲の意味および範囲そしてその等価概念から導出される全ての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれると解釈されなければならない。

【0068】

［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）
受託番号：ＫＣＴＣ１４６５９ＢＰ
受託日付：２０２１０８２３

【図1】

【図2】

【配列表】

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【国際調査報告】