▶ エコール ポリテクニーク フェデラル デ ローザンヌ （イーピーエフエル）の特許一覧
特表2024-518615ペプチドのライブラリーまたはペプチドを調製するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】ペプチドのライブラリーまたはペプチドを調製するための方法
(51)【国際特許分類】
C07K 5/12 20060101AFI20240423BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20240423BHJP
C07K 5/08 20060101ALI20240423BHJP
C07K 5/10 20060101ALI20240423BHJP
C07K 1/04 20060101ALI20240423BHJP
C40B 10/00 20060101ALI20240423BHJP
【ＦＩ】
C07K5/12
C07K1/14 ZNA
C07K5/08
C07K5/10
C07K1/04
C40B10/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571576
(86)(22)【出願日】2022-04-27
(85)【翻訳文提出日】2024-01-12
(86)【国際出願番号】 EP2022061138
(87)【国際公開番号】W WO2022242993
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】21174036.0
(32)【優先日】2021-05-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512008613
【氏名又は名称】エコール ポリテクニーク フェデラル デ ローザンヌ （イーピーエフエル）
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ハイニス，クリスチャン
(72)【発明者】
【氏名】ハベシアン，セヴァン
(72)【発明者】
【氏名】モツクリ，ガネシュ・クマール
(72)【発明者】
【氏名】シュッテル，ミッシャ
(72)【発明者】
【氏名】メルツ，マヌエル
(72)【発明者】
【氏名】サングアール，ゴントラン
(72)【発明者】
【氏名】ボグナール，ゾルト
(72)【発明者】
【氏名】ニールセン，アレクサンダー・ランド
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA32
4H045EA34
4H045EA60
4H045FA10
(57)【要約】
本発明は、ペプチドのライブラリーまたは単離されたペプチドを調製するための方法であって、（ａ）１つまたは複数のペプチドのＮ末端領域にスルフヒドリル基を有し、１つまたは複数のペプチドのＣ末端領域にジスルフィド架橋を介して固相に固定化されている１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを、（ｉ）ジスルフィド架橋を還元し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを固相から遊離する薬剤であって、揮発性であり、蒸発により除去可能である薬剤、または（ｉｉ）１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドのＮ末端領域のスルフヒドリル基を脱プロトン化し、それにより分子内ジスルフィド交換を誘導し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを１つもしくは複数の環状ペプチドの形態で固相から遊離する塩基によって固相から遊離させるステップを含む、方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチドのライブラリーまたは単離されたペプチドを調製するための方法であって、（ａ）１つまたは複数のペプチドのＮ末端領域にスルフヒドリル基を有し、１つまたは複数のペプチドのＣ末端領域にジスルフィド架橋を介して固相に固定化されている１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを、
（ｉ）ジスルフィド架橋を還元し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを固相から遊離する薬剤であって、揮発性であり、蒸発により除去可能である薬剤、または
（ｉｉ）１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドのＮ末端領域のスルフヒドリル基を脱プロトン化し、それにより分子内ジスルフィド交換を誘導し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを１つもしくは複数の環状ペプチドの形態で固相から遊離する塩基
によって固相から遊離させるステップを含む、方法。
【請求項2】
ステップ（ａ）の後に、蒸発によって薬剤を除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
薬剤によって遊離される１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを環化するステップ（ｂ）をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
１つまたは複数のジチオールペプチドが、少なくとも１つのビス求電子試薬によって、またはジスルフィド酸化によって環化される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
項目（ｉｉ）の１つまたは複数の環状ペプチドのジスルフィド結合が還元され、ペプチドがビス求電子試薬によって再環化される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
薬剤が、１，３－プロパンジチオール、１，４－ブタンジチオール、２，４－ペンタンジチオール、エタン－１－チオール、プロパン－１－チオール、ブタン－１－チオール、プロパン－２－チオール、２－メチル－１－プロパンチオール、ブタン－２－チオール、２－メチルプロパン－２－チオール、２－ヒドロキシ－１－エタンチオール、１，２－エタンジチオール、２－プロペン－１－チオール、３－メチル－１－ブタンチオール、チオフェノール、ベンジルチオール、２－ブテン－１－チオール、３－ブテン－１－チオール、２－メチル－２－プロペン－１－チオールおよび３－メチル－２－ブテン－１－チオールから選択され、好ましくは１，３－プロパンジチオール、１，４－ブタンジチオールもしくは２，４－ペンタンジチオールであり、最も好ましくは１，４－ブタンジチオール（ＢＤＴ）であり、ならびに／あるいは塩基が、第三級アミン、第二級アミンまたは第一級アミン、ホウ素、アルミニウムまたは水素化ケイ素（ｓｉｌｉｃｏｎ ｈｙｂｒｉｄｅ）、および酸素アニオン、窒素アニオンまたは炭素アニオンを持つ塩基から選択され、好ましくは第三級アミン、第二級アミンまたは第一級アミンであり、より好ましくは第三級アミンであり、さらにより好ましくはトリ－アルキルアミンであり、最も好ましくはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（ａ）の前に、固相上で直鎖状ジチオールペプチドを合成するステップ（ａ’）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
直鎖状ジチオールペプチドのアミノ酸の側鎖が保護基によって保護され、方法が、ステップ（ａ）の前に、また存在する場合にはステップ（ａ’）の後に、直鎖状ジチオールペプチドが固相に固定化されている間に保護基を除去するステップをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
直鎖状ジチオールペプチドの少なくとも一部が第一級アミンまたは第二級アミンを含み、方法が、第一級または第二級アミンをカルボン酸で修飾するステップをさらに含み、第一級アミンまたは第二級アミンおよびカルボン酸を含む環状ペプチドが、好ましくはアコースティック分注によって移送される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
（ｃ）好ましくはペプチドライブラリーを事前精製することなく、ペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップと、（ｄ）標的分子に結合し、好ましくは標的分子を阻害するペプチドについてペプチドライブラリーをスクリーニングするステップと
をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）が、第一級アミンまたは第二級アミンがカルボン酸で修飾されている同一のウェル内で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
標的分子が、タンパク質、ペプチド、核酸分子、炭水化物、または脂肪酸であり、好ましくはタンパク質またはペプチドである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
固相が樹脂を含み、好ましくは無極性樹脂、より好ましくはポリスチレン樹脂を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
直鎖状ジチオールペプチドが、１０００Ｄａ未満、好ましくは６００Ｄａ未満の分子量を有する直鎖状ジチオールペプチド、および／または
３もしくは４アミノ酸、好ましくは３アミノ酸を含む直鎖状ジチオールペプチド
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
大環状化合物ライブラリー、好ましくは環状ペプチドライブラリーを多様化するための方法であって、少なくともいくつかの大環状化合物、好ましくは環状ペプチドが第一級アミンまたは第二級アミンを含み、方法が第一級アミンまたは第二級アミンをカルボン酸で修飾するステップを含む、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチドのライブラリーまたは単離されたペプチドを調製するための方法であって、（ａ）１つまたは複数のペプチドのＮ末端領域にスルフヒドリル基を有し、１つまたは複数のペプチドのＣ末端領域にジスルフィド架橋を介して固相に固定化されている１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを、（ｉ）ジスルフィド架橋を還元し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを固相から遊離する薬剤であって、揮発性であり、蒸発により除去可能である薬剤、または（ｉｉ）１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドのＮ末端領域のスルフヒドリル基を脱プロトン化し、それにより分子内ジスルフィド交換を誘導し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを１つもしくは複数の環状ペプチドの形態で固相から遊離する塩基によって固相から遊離させるステップを含む、方法に関する。
【背景技術】
【0002】
本明細書では、特許出願および製造業者のマニュアルを含む多数の文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より詳しくは、参照されたすべての文書は、それぞれの個々の文書が参照により組み込まれることが詳しくかつ個別に示されている場合と同程度に、参照により組み込まれる。
【0003】
ペプチドライブラリー、特に環状ペプチド（大環状分子の一種）のライブラリーは、製薬業界から大きな関心を集めているが、それは、古典的な低分子をベースとしたリガンドの生成ではこれまで困難または不可能であった、難度の高い標的に結合する能力を有するペプチドをスクリーニングすることができるからである。
【0004】
現在、４０種を超える環状ペプチドが薬物として承認されており、１００種を超える環状ペプチドが臨床試験の様々な段階で評価されている（Ａ．Ｚｏｒｚｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２０１７、３８、２４～２９頁）。タンパク質エピトープをベースとした環状ペプチドリガンドを設計する、または遺伝子コード化ペプチドの大規模なコンビナトリアルなライブラリーから標的特異的環状ペプチドを単離する革新的な方策は、この分野の発展にさらなる拍車をかけてきた（Ａ．Ｌｕｔｈｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２０１７、３８、４５～５１頁；Ｃ．Ｓｏｈｒａｂｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｈｅｍ．、２０２０、４、９０～１０１頁）。
【0005】
特に関心が持たれるのは、理想的には１キロダルトン（ｋＤＡ）をかなり下回る十分に小さいサイズと、小さな極性表面積を有し、細胞内標的を届く範囲に置く大環状分子である。関心の高い大環状分子には、小環状ペプチド、ペプチドをベースとしない大環状構造、またはペプチド成分および非ペプチド成分を含有する大環状構造が含まれる。しかし、目的の標的に結合し、細胞内標的に到達するように膜透過性である大環状リガンドの開発は、商業的に提供されているコレクションに大環状化合物の数が比較的少ないことから、または新しい大環状ライブラリーを効率的に合成する方法がないことから困難である。
【0006】
大環状化合物の合成における困難なステップは、直鎖状分子を環状分子に変換することである。ほとんどの反応は、大環状化収率が９０％をはるかに下回り、様々な前駆体（例えば、様々な直鎖状ペプチド配列）に対する収率に大きなばらつきを示し、これがライブラリーの合成において問題となる。Ａｓｉｎｅｘ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ、Ｐｏｌｙｐｈｏｒなどの主要プロバイダーが提供する大環状化合物ライブラリーは、すべて大環状化ステップ後に個別に精製された分子をベースとしているが、これは、精製なしの生成物はほとんどの化合物にとって十分な純度が得られないからである。精製が必要なことから、並行して生成され得る大環状分子の数が制限されるため、ライブラリーのサイズも制限され、市販で提供されるライブラリーでは３０，０００分子未満である。
【0007】
一般的に幅広い基質範囲に対して、典型的には９０％を超える高い環化収率を示す大環状化反応は、ビス求電子試薬、例えば、ビス－（ブロモメチル）ベンゼン（ＳＮ２反応）、ビス－（ブロモアセトアミド）ベンゼン（ＳＮ２反応）、ハロアセトン（ＳＮ２反応）、ビニルスルホキシド（Ｍｉｃｈａｅｌ付加）またはヘキサフルオロベンゼン（ＳＮＡｒ反応）などによるペプチド内の遠位の末端に配置された２個のチオール基を介したペプチドの環化である（Ｈ．Ｊｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１２、１３４、１７７０４～１７７１３頁；Ｐ．Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５、６、８２１～８２４頁；Ｎ．Ａｓｓｅｍら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１５、５４、８６６５～８６６８頁；Ｓ．Ｓ．Ｋａｌｅら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．、２０１８、１０、７１５～７２３頁）。このような反応は、直鎖状または非直鎖状エピトープを模倣する（二）環状ペプチドを開発するため（Ｐ．Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５、６、８２１～８２４頁）、ファージディスプレイ（Ｃ．Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００９、５、５０２～５０７頁）もしくは他のディスプレイにより（二）環状ペプチドを展開するため、α－ヘリックスペプチドをらせん構造で安定化させるため（Ｈ．Ｊｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１２、１３４、１７７０４～１７７１３頁）、または他の目的のために、ペプチドを環化するのに使用された。
【0008】
最近、約２０種類の異なるビス求電子試薬で多数の直鎖状ジチオールペプチドをコンビナトリアルに環化することによって、１キロダルトン未満の分子量を有する環状ペプチドの大規模ライブラリーが合成された（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＥＰＦＬ、Ｇｒｏｕｐ Ｈｅｉｎｉｓの未発表の結果）。ジチオールペプチドと環化試薬の様々な組合せが、３８４マイクロウェルプレートの別々のウェルで混合された。高環化収率により、本発明者らは、事前精製を行うことなく、タンパク質標的結合用の環状ペプチドをスクリーニングすることができた。スループットを制限する精製ステップを省くことにより、大規模ライブラリーのスクリーニングが可能になった。
【0009】
ビス求電子試薬を使用するコンビナトリアルなペプチドの環化の方策は、異なる配列を有する多数のジチオールペプチドを必要とする。
リードペプチドの同定に使用される方法に関係なく、ペプチドライブラリーおよびペプチド薬の開発には、典型的には、結合親和性、特異性、安定性、薬物動態学的特性などの重要な特性を改善するために、数十から数百のペプチドバリアントを合成する複数の反復サイクルが含まれ、それにより多数のペプチドが調製される。
リードペプチドの同定に使用される方法に関係なく、ペプチドライブラリーおよびペプチド薬の開発には、典型的には、結合親和性、特異性、安定性、薬物動態学的特性などの重要な特性を改善するために、数十から数百のペプチドバリアントを合成する複数の反復サイクルが含まれ、それにより多数のペプチドが調製される。
【0010】
環状ペプチド治療薬の開発におけるさらなる大きな障害は、合成後のペプチドのクロマトグラフィー精製であり、これは、自動化および最適化されていたとしても、各ペプチドの逐次処理と試薬消費量（溶媒）が多いためにコストがかかる。精製を必要とする主な理由は、典型的に環状ペプチド合成において最も困難なステップである大環状化反応である（Ｃ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．、２０１１、３、５０９～５２４頁）。ほとんどの大環状化反応は９０％未満の収率を示し、その効率はペプチドの配列および長さによって激しく変動することが多い。クロマトグラフィー精製はまた、ペプチドを遊離するために添加された試薬およびスカベンジャー、ならびに全体的な脱保護の際に生成された側鎖保護基副生成物を除去するために必要である。
【発明の概要】
【0011】
新規な方法、特に、大規模ペプチドライブラリー、またはペプチドライブラリーに追加することができる１つもしくは複数のペプチドを生成するための、複雑化された調製ステップを必要としない方法であって、そのペプチドライブラリーが、その後、ペプチド治療薬についてスクリーニングすることができる方法が直ちに必要とされていることは上記のことから明らかである。この必要性が本発明によって解決される。
【0012】
本発明は、第１の態様において、ペプチドのライブラリーまたは単離されたペプチドを調製するための方法であって、（ａ）１つまたは複数のペプチドのＮ末端領域にスルフヒドリル基を有し、１つまたは複数のペプチドのＣ末端領域にジスルフィド架橋を介して固相に固定化されている１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを、（ｉ）ジスルフィド架橋を還元し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを固相から遊離する薬剤であって、揮発性であり、蒸発により除去可能である薬剤、または（ｉｉ）１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドのＮ末端領域のスルフヒドリル基を脱プロトン化し、それにより分子内ジスルフィド交換を誘導し、それにより１つもしくは複数の直鎖状ジチオールペプチドを１つもしくは複数の環状ペプチドの形態で固相から遊離する塩基によって固相から遊離させるステップを含む、方法に関する。
【0013】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）／含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）／包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）という意味で、すなわち、１つまたは複数の特徴または構成要素の存在を許容するという意味で一般的に使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語はまた、より限定された用語の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
【0014】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の明示がない限り、複数の言及を包含する。
本明細書で使用される場合の「ペプチド」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸および少なくとも１つのペプチド結合を含むポリマーを指す。ペプチドは、好ましくは、複数の、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のアミノ酸を含む。ペプチドはまた、非アミノ酸ビルディングブロックおよび非ペプチド結合も含み得る。添付の実施例に記載のペプチドの多くは、メルカプトプロパン酸（ＭＰＡ）およびシステアミン（ＭＥＡ）などのそれらの末端にビルディングブロックを含有し、それらは、アミノ基（ＭＰＡの場合）を含まない、またはカルボン酸（ＭＥＡの場合）を含まないのでアミノ酸ではない。
本明細書で使用される場合の「ペプチド」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸および少なくとも１つのペプチド結合を含むポリマーを指す。ペプチドは、好ましくは、複数の、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のアミノ酸を含む。ペプチドはまた、非アミノ酸ビルディングブロックおよび非ペプチド結合も含み得る。添付の実施例に記載のペプチドの多くは、メルカプトプロパン酸（ＭＰＡ）およびシステアミン（ＭＥＡ）などのそれらの末端にビルディングブロックを含有し、それらは、アミノ基（ＭＰＡの場合）を含まない、またはカルボン酸（ＭＥＡの場合）を含まないのでアミノ酸ではない。
【0015】
チオール基を含有し、特にＣ末端のペプチドに（ＭＥＡとして）組み込むのに適した非アミノ酸ビルディングブロックのさらなる例は、３－アミノプロパン－１－チオール、３－（メチルアミノ）プロパン－１－チオール、（Ｚ）－４－アミノブタ－２－エン－１－チオール、ピペリジン－４－チオール、４－（メルカプトメチル）ピペリジン、および３－（メルカプトメチル）アゼチジンである。以下の表および式を参照されたい。これらの非アミノ酸ビルディングブロックのうち、第二級アミンを有するものは、第二級アミンと（隣接するアミノ酸の）カルボン酸とのカップリングにより、水素結合供与基を持たないアミド結合が得られることから、膜透過性大環状化合物の開発において特に好ましい。
【表A】
【0016】
【化1】
【0017】
チオール基を含有し、特にＮ末端のペプチドに（ＭＰＡとして）組み込むのに適した非アミノ酸ビルディングブロックのさらなる例は、２－メルカプト酢酸、（Ｒ）－２－メルカプトプロパン酸、５－（メルカプトメチル）フラン－２－カルボン酸、および３－（メルカプトメチル）安息香酸である。以下の表および式を参照されたい。
【表B】
【0018】
【化2】
【0019】
様々な他の非アミノ酸ビルディングブロックが、特に内部位置のジチオールペプチドに組み込むのに適している。例えば、ビルディングブロックＡ－ＣＯＯＨを固相上の前の残基のアミノ基に結合させ、次にビルディングブロックＢ－ＮＦｈを付加することができ、この場合、ＡおよびＢの官能基は相互に反応して共有結合を形成する。この後者の反応は、ペプチド結合ではない連結が生じることがある。このような反応の例は、確立された、いわゆる「サブモノマー」方策であり、この方策では、ハロ酢酸、典型的には、（例えば、ジイソプロピルカルボジイミドによって）活性化されたブロモ酢酸が、最初に固相上で成長するペプチドのアミノ基に結合される（ハロ酢酸はビルディングブロックＡ－ＣＯＯＨを表す）。第２のステップおよび化学反応では、アミン（Ｂ－ＮＨ２を表す）がハロゲン化物を置換して、（古典的なＳＮ２反応により）Ｎ－置換グリシン残基を形成する。サブモノマーアプローチでは、市販のアミンまたは合成的に入手可能なアミンを使用することができ、これは、多くのアミンを並行して使用でき、大規模なペプチド多様性をもたらし得るので非常に有利である。ハロ酢酸の代わりに、好ましい例として、４－（ブロモメチル）安息香酸、３－（ブロモメチル）安息香酸、２－（クロロメチル）オキサゾール－４－カルボン酸、２－（クロロメチル）チアゾール－４－カルボン酸、５－（ブロモメチル）イソオキサゾール－３－カルボン酸、５－（ブロモメチル）ピラジン－２－カルボン酸、２－（ブロモメチル）フラン－３－カルボン酸、（Ｒ，Ｅ）－５－クロロ－２，４－ジメチルペンタ－３－エン酸、および（Ｓ，Ｅ）－５－クロロ－２，４－ジメチルペンタ－３－エン酸を含む、他の多くの試薬を使用することができる。以下の表および式を参照されたい。
【表C】
【0020】
【化3】
【0021】
「ペプチド」という用語は、好ましくは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短鎖を指す。また、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短鎖は、その末端にＭＰＡおよびシステアミンＭＥＡなどの非アミノ酸ビルディングブロックを含有し得る。ペプチドは、サイズに基づいてタンパク質またはポリペプチドと区別され、好ましくは５０アミノ酸未満、好ましくは４０アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、１０アミノ酸未満、および５アミノ酸未満を含む。
【0022】
本明細書で使用される場合の「単離されたペプチド」という用語は、ペプチドが固相に結合されておらず、固相から遊離されていることを示す。単離されたペプチドは、一般的に、例えば、溶液中で遊離ペプチドの形態である。溶液中には、単離されたペプチドの１つまたは複数のコピーが存在し得る。したがって、固相上にもまた、単離されるペプチドの１つまたは複数のコピーが、そのペプチドが単離される前に存在し得る。
【0023】
本明細書で使用される場合の「アミノ酸」という用語は、一般的に各アミノ酸に特有の側鎖を伴う、アミン（－ＮＨ２または－ＮＨ）官能基およびカルボン酸（－ＣＯＯＨ）官能基から構成される有機化合物を指す。最もシンプルなアミノ酸のグリシンには側鎖がない（式はＨ２ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）。α－炭素に炭素鎖が結合しているアミノ酸（リジンなど）では、炭素はα、β、γ、δなどの順序で標識される。一部のアミノ酸では、アミン基が、例えば、α－炭素、β－炭素、またはγ－炭素に結合されていてもよく、したがって、これらはそれぞれ、α－アミノ酸、β－アミノ酸、またはγ－アミノ酸と呼ばれる。「アミノ酸」という用語は、好ましくは、一般式Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨ（式中、Ｒは「側鎖」と呼ばれる有機置換基である）を一般的に有するα－アミノ酸（２－アミノ酸またはα－アミノ酸とも呼ばれる）を表し、またアミンとカルボン酸の間に複数の炭素原子を含有するβ－アミノ酸、γ－アミノ酸およびδ－アミノ酸も表す。最もシンプルなα－アミノ酸のアラニン（式：Ｈ２ＮＣＨＣＨ３ＣＯＯＨ）では、側鎖はメチル基である。本発明によるアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸である。
【0024】
アミノ酸は、いわゆる標準または正準のアミノ酸を含む。これら２１種のα－アミノ酸は、普遍的遺伝コードのコドンによって直接コードされている。それらは、真核生物において確認されるタンパク質原性αアミノ酸である。これらのアミノ酸は、本明細書においていわゆる１文字コードで呼ばれる：
【表D】
【0025】
前述のように、アミノ酸の側鎖は有機置換基であり、α－アミノ酸の場合にはα－炭素原子に連結されている。したがって、側鎖は、アミノ酸の親構造からの分岐である。アミノ酸は、通常、それらの側鎖の特性によって分類される。例えば、側鎖はアミノ酸を弱酸性（例えば、アミノ酸Ｄおよびアミノ酸Ｅ）または弱塩基性（例えば、アミノ酸Ｋおよびアミノ酸Ｒ）にすることができ、側鎖が極性である場合には親水性（例えば、アミノ酸Ｌおよびアミノ酸Ｉ）、または非極性である場合には疎水性（例えば、アミノ酸Ｓおよびアミノ酸Ｃ）にすることができる。脂肪族アミノ酸は、脂肪族基である側鎖を有する。脂肪族基は、アミノ酸を非極性および疎水性にする。脂肪族基は、好ましくは、非置換の分岐鎖状アルキルまたは直鎖状アルキルである。脂肪族アミノ酸の非限定的な例は、Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩである。環状アミノ酸では、側鎖中の１つまたは複数の一連の原子が連結して環を形成する。環状アミノ酸の非限定的な例は、Ｐ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＨである。前記環は、本明細書で以下にさらに詳述するように、環状ペプチドの場合に形成される環とは区別して保持されなければならないことを理解されたい。環状アミノ酸の前者の環は単一アミノ酸の側鎖の一部であるが、後者の環はジチオールペプチドの２つのチオール基の間に形成される。芳香族アミノ酸は、環状アミノ酸の好ましい形態である。芳香族アミノ酸では、環は芳香環である。分子の電子的性質の観点から、芳香族性は、不飽和結合の共役環、電子の単独対、または空の分子軌道が、共役の安定化のみによって予想されるものよりも強い安定化を示す方向性を示す。芳香族性は、環状非局在化と共鳴の現れであると考えることができる。疎水性アミノ酸には、アミノ酸を疎水性にする非極性側鎖を有する。疎水性アミノ酸の非限定的な例は、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩである。極性の非荷電アミノ酸は、荷電残基を持たない非極性側鎖を有する。極性の非荷電アミノ酸の限定的な例は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、ＵおよびＹである。極性の荷電アミノ酸は、少なくとも１つの荷電残基を持つ非極性側鎖を有する。極性の荷電アミノ酸の非限定的な例は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＲである。
【0026】
「ジチオールペプチド」は、２つ以上のチオール基、好ましくは２つのみのチオール基を含むペプチドである。チオール基は、ペプチドのアミノ酸ビルディングブロックまたは非アミノ酸ビルディングブロックのいずれかの一部である。チオール基を有するアミノ酸ビルディングブロックまたは非アミノ酸ビルディングブロックは、以下のうちのいずれかであり得る：
・システインまたはシステイン類似体、例えば、ホモシステイン、ペニシラミン、Ｄ－システインなど、
・チオール基とカルボン酸を含有するビルディングブロック、例えばメルカプトプロパン酸（ＭＰＡ）など、
・チオール基とアミンを含有するビルディングブロック、例えばシステアミン（ＭＥＡ）など。
・システインまたはシステイン類似体、例えば、ホモシステイン、ペニシラミン、Ｄ－システインなど、
・チオール基とカルボン酸を含有するビルディングブロック、例えばメルカプトプロパン酸（ＭＰＡ）など、
・チオール基とアミンを含有するビルディングブロック、例えばシステアミン（ＭＥＡ）など。
【0027】
直鎖状ジチオールペプチドが固相に固定化される場合、１つのチオール基は「遊離」され、まずは保護されたスルフヒドリル基（Ｒ－Ｓ－ＰＧ；ＰＧ＝保護基）、チオール保護基の除去後はスルフヒドリル基（Ｒ－ＳＨ）となるが、他のチオール基はペプチドを固相に連結するジスルフィド結合（Ｒ１－Ｓ－Ｓ－Ｒ２）に関与する。ジスルフィド架橋は、（固相に連結されている）１つのチオール含有ビルディングブロックの硫黄原子が、ペプチドのＣ末端領域にあるチオール含有ビルディングブロックの硫黄原子と単共有結合を形成する場合に形成される。固相へのジスルフィド結合を介してペプチドを合成するための手段および方法は、当技術分野において公知であり、本明細書で以下にさらに詳述し、添付の実施例により説明する。
【0028】
「直鎖状ペプチド」という用語は、本発明による「ペプチド」と関連して本明細書で上述した非アミノ酸および非ペプチド結合も含み得る、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の直鎖状短鎖を指す。直鎖状ペプチドでは、ペプチド内の一連の原子が結合して大環状のリングまたは環を形成することはない。
【0029】
「環状ペプチド」という用語は、ペプチド内の一連の１２個以上の原子が連結して大環状のリングまたは環を形成していることを意味する。環状ペプチドは、好ましくは単環状ペプチドであり、これはペプチド内の２つの部位のみが連結してリングまたは環を形成していることを意味する。リングまたは環は、ジチオールペプチドの２つのチオール基が関与することにより、本発明に従って形成される。２つのチオール基が直接結合している場合、リングまたは環はジスルフィド架橋によって形成される。ジチオールペプチドの２つのチオール基はまた、本明細書で以下により詳細に説明するように、ビス求電子試薬によって連結され得る。
【0030】
ペプチドのライブラリーとは、複数の異なるペプチドを含む組成物または製造品を指す。
ライブラリーが組成物である場合、組成物は異なるペプチドの混合物を含む。組成物は、好ましくは溶液であり、より好ましくはＤＭＳＯまたは水溶液である。溶液は、例えば、凍結乾燥または遠心真空蒸発（例えば、ＳｐｅｅｄＶａｃシステムの使用）によって乾燥させることができる。この場合、組成物は、望ましい溶媒によって溶解させることができる乾燥粉末の形態であり得る。このような組成物の場合、ライブラリー中の異なるペプチドの数は、固体支持体上に固定化されている異なるペプチドの数によって、および／または１つもしくは２つ以上の異なるペプチドが合成された固体支持体を混合することによって決定することができる。
ライブラリーが組成物である場合、組成物は異なるペプチドの混合物を含む。組成物は、好ましくは溶液であり、より好ましくはＤＭＳＯまたは水溶液である。溶液は、例えば、凍結乾燥または遠心真空蒸発（例えば、ＳｐｅｅｄＶａｃシステムの使用）によって乾燥させることができる。この場合、組成物は、望ましい溶媒によって溶解させることができる乾燥粉末の形態であり得る。このような組成物の場合、ライブラリー中の異なるペプチドの数は、固体支持体上に固定化されている異なるペプチドの数によって、および／または１つもしくは２つ以上の異なるペプチドが合成された固体支持体を混合することによって決定することができる。
【0031】
製造品は異なるウェルを含み、好ましくはマイクロタイタープレートであり、より好ましくは９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレートまたは３４５６ウェルプレートである。異なるペプチドは、好ましくは、異なるウェル内で並行して（一般的に固体支持体上で）合成され、その結果、１種類のペプチドが（多数のコピー中で）１ウェルにつき確認され得る。製造品の複数のウェルは、一緒になってペプチドのライブラリーを形成する。製造品のフォーマットのライブラリーが好ましいが、その理由は、そのようなライブラリーが（本明細書で後述する）特定の標的分子に対する結合剤または阻害剤についてスクリーニングされる場合、所望のライブラリーメンバーがどのウェルで確認され得るかがすぐにわかり、所望のライブラリーメンバーについてのさらに複雑な単離または同定を必要としないからである。
【0032】
ウェル当たり１種類のペプチドが好ましいが、ウェル当たり２種類以上のペプチド、例えば、２、３、４または５種類の異なるペプチドを（一般的に固体支持体上で）各ウェルで並行して合成することも可能であり、それによって、ウェル当たり２、３、４、または５種類の異なるペプチドを有するウェルを得ることができる。ウェル当たりの異なるペプチドの数は、例えば、固体支持体上に固定化される異なるペプチドの数によって、および／または１つもしくは２つ以上の異なるペプチドが合成された固体支持体を混合することによって、必要に応じて調整することができる。
【0033】
異なるペプチドのライブラリーは、好ましくは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも９６、少なくとも１００、少なくとも３８４、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５３６、少なくとも３４５６、少なくとも１００００、および少なくとも１０００００種類の異なるペプチドを含む。
【0034】
Ｎ末端領域は、好ましくは、１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドの最高３つのＮ末端アミノ酸またはビルディングブロックのうちの１つ、より好ましくは、最高２つのＮ末端アミノ酸またはビルディングブロックのうちの１つ、最も好ましくは、最高１つのＮ末端アミノ酸またはビルディングブロックを意味する。最も好ましい場合では、スルフヒドリル基は、１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドのＮ末端位置のアミノ酸またはビルディングブロックの一部である。
【0035】
同様に、Ｃ末端領域は、好ましくは、１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドの最高３つのＣ末端アミノ酸またはビルディングブロックのうちの１つ、より好ましくは、最高２つのＣ末端アミノ酸またはビルディングブロックのうちの１つ、最も好ましくは、最高１つのＣ末端アミノ酸またはビルディングブロックを意味する。最も好ましい場合では、１つまたは複数のペプチドは、Ｃ末端のジスルフィド架橋を介して固相に固定化される。
【0036】
「固相」という用語は、ジスルフィド結合を介して、例えば固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を介して、ペプチドを合成することができる任意の固体材料または支持体を意味する。
【0037】
本明細書で使用される場合の「薬剤」という用語は、ジスルフィド架橋を還元し、それによって１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを固相から遊離させることができる任意の分子を意味する。この薬剤は、したがって還元剤または遊離剤と呼ばれ得る。様々な還元剤が従来技術において公知である。生化学では、β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオールが還元剤として機能する。本発明によれば、薬剤は揮発性であり、蒸発により、好ましくは真空下での蒸発により、最も好ましくは遠心真空蒸発により除去可能である。揮発性物質は、蒸発によって容易に気体に変化する。蒸発は、液体が気相に変化する際に液体の表面で起こる蒸発の一種である。液体の分子が蒸発する能力は、主として個々の粒子が持つ運動エネルギーの量に基づく。蒸発速度は温度が高くなると増すが、低温でも、液体の個々の分子が蒸発に必要な最小量を超える運動エネルギーを有していれば蒸発することができる。揮発性であり、蒸発により除去可能である薬剤を使用することは、本発明の方法によって生成されるペプチドのライブラリーまたは単離ペプチドを含む組成物から薬剤を除去することができるので技術的に有利である。薬剤による固体支持体からの１つまたは複数のペプチドの除去は、本明細書では「還元的遊離」とも呼ばれ、図１ｂに示されている。図１ｂから明らかなように、１つまたは複数のペプチドは１つまたは複数の直鎖状ペプチドの形態で薬剤により遊離され、ここで２つのチオール基は「遊離」スルフヒドリル基である。
【0038】
塩基は、プロトンを受容することができる物質（ブレンステッド塩基など）、電子を供与することができる物質（ルイス塩基など）、または水溶液中で水酸化物イオン（ＯＨ－）を生成する任意の化学化合物である。本発明に従って使用される塩基は、１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチド（Ｒ－Ｓ－）のＮ末端領域のスルフヒドリル基を脱プロトン化することができる。脱プロトン化されたスルフヒドリル基は分子内ジスルフィド交換を誘導し、それにより１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドが１つまたは複数の環状ペプチドの形態で固相から遊離される。脱プロトン化されたスルフヒドリル基は、ジスルフィド結合でチオール－ジスルフィド交換反応を誘導する求核剤として作用する反応性Ｓを含む。塩基による固体支持体からの１つまたは複数のペプチドの除去は、本明細書では「環化的遊離」とも呼ばれ、図１ａにより示されている。図１ａから明らかなように、１つまたは複数のペプチドは環状ペプチドの形態で塩基によって遊離され、ジチオールペプチドの２つのチオール基はジスルフィド結合によって連結される。
【0039】
上で論じたように、請求項１の項目（ｉ）の方法は、直鎖状ジチオールペプチドをもたらす「還元的遊離」アプローチであるが、請求項１の項目（ｉｉ）の方法は、環状ジチオールペプチドをもたらす「環化的遊離」アプローチである。以下から明らかになるように、両選択肢は、ペプチドのライブラリーまたは単離されたペプチドを調製するための従来技術の方法を著しく進歩させる。
【0040】
固体支持体上のジスルフィド架橋を介して固定化されているジチオールペプチドが、樹脂からのジスルフィド還元によって固相から遊離される「還元的遊離」方策を図１ｂに模式的に示した。環化的遊離とは対照的に、還元的遊離の効率は、ペプチドの長さおよびアミノ酸組成に依存しない。特に、このアプローチは、ジスルフィド形成を介して効率的に環化することができない短いペプチドにも効率的に作用する（しかし、この環化は、追加の原子がリンカーによって大環状骨格に付加されるため立体的に要求されることが少ないので、ビス求電子リンカーを介して環化することができる）。還元的ペプチド遊離における課題は、還元剤をペプチドに添加する必要があり、この試薬がその後のビス求電子試薬による環化的反応（すなわち、求電子基との反応）を妨げることであった。この欠点は、例えば真空下で比較的簡単なステップで蒸発させることによってペプチドから除去可能である揮発性還元剤を使用することによって克服される。例えば、揮発性還元剤は、９６ウェルプレート内でペプチドを遠心真空蒸発させることによって除去することができる。
【0041】
ジスルフィド架橋を還元的に切断することによって固相からペプチドを遊離することを記述しているのは、ほんのわずかの研究だけであり、それらすべては、単一のチオール基を有するペプチドを遊離し、ペプチド・タンパク質コンジュゲートの生成などの他の用途を念頭に置いているもの（Ｊ．Ｍｅｒｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９９３、４２、４４～５２頁）、ペプチドヘテロダイマーの合成（Ａ．Ｔａｇｕｃｈｉら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１５、１３、３１８６～３１８９頁）、チオールハンドルを含有するヘッドからテイルまで環化されたペプチドの生成（Ｗ．Ｔｅｇｇｅら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．、２００７、１３、６９３～６９９頁）、１個のチオール基を介したペプチドの環化（Ａ．Ａ．Ｖｉｒｇｉｌｉｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９６、３７、６９６１～６９６４頁）、質量分析による遊離されたペプチドの同定（Ｏ．Ｌａｃｋら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、２００２、８５、４９５～５０１頁）、およびペプチド合成中の一時的な固定化（Ｄ．Ｓ．Ｋｅｍｐら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、５１、１８２１～１８２９頁）である。これらのアプローチのほとんどは、還元剤であるトリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｊ．Ｍｅｒｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９９３、４２、４４～５２頁；Ａ．Ａ．Ｖｉｒｇｉｌｉｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９６、３７、６９６１～６９６４頁）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｊ．Ｍｅｒｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９９３、４２、４４～５２頁；Ｗ．Ｔｅｇｇｅら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．、２００７、１３、６９３～６９９頁）およびトリ－ｎ－ブチルホスフィン（Ｐ（ｎ－Ｂｕ）３）（Ｄ．Ｓ．Ｋｅｍｐら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、５１、１８２１～１８２９頁）を使用しており、したがって、試薬を蒸発によって除去することができず、精製ステップを必要とする。これらの研究のうち、ただ１つの研究で、揮発性還元剤であるβ－メルカプトエタノール（β－Ｍｅ）が固体支持体からジスルフィド結合されたペプチドを遊離するのに使用された（Ｏ．Ｌａｃｋら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、２００２、８５、４９５～５０１頁）。しかし、この用途では、ペプチドは単一ビーズから遊離されたが、極性（ＰＥＧＡ）で、充填が少なく（０．２ｍｍｏｌ／グラム）、高膨潤体積を有する樹脂からの遊離は少量であり、これは現在想定している用途には適していなかった。ジチオールペプチドの合成および還元的遊離を報告した研究はなく、環状ペプチドライブラリーの生成にこのアプローチを適用した研究もない。
【0042】
本発明者らの知る限り、環状ジスルフィド遊離の方策は全く新しいものであり、環状ペプチドの生成には使用されたことはない。環化的遊離に最も近い方策は、チオエーテル固定化ペプチドの酸化的遊離である（Ｂ．Ｈ．Ｒｉｅｔｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９９４、４４、１９９～２０６頁；Ｔ．Ｚｏｌｌｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２０００、４１、９９８９～９９９２頁）。しかし、これらのアプローチは、収率が低く、二量体の副生成物があり、精製による除去が必要な酸化剤が溶出生成物中に存在するため、ライブラリー生成には適していない。ここで、環化的遊離は、Ｎ末端スルフヒドリル基を脱プロトン化する塩基によって引き起こされる。揮発性塩基を使用する場合、揮発性塩基は蒸発によって除去され得るが、それにより反応チューブまたはマイクロタイタープレートのウェル内の唯一の生成物が１つまたは複数の純粋な環状ペプチドになる。不揮発性塩基を使用する場合は、それはまた酸によって中和され得る。環化的方策にとって重要な要件は、ジスルフィド架橋を介して固定化された固相上でペプチドを合成できることであり、ジスルフィド架橋はペプチド合成中、特にピペリジンによるＦｍｏｃ脱保護中、十分に安定である必要があることである。いくつかの研究は、ペプチド・タンパク質コンジュゲートの生成から、質量分析同定のためのペプチドの還元的遊離までの範囲の用途に関するジスルフィド架橋固定化ペプチドの固相合成を報告している（Ｊ．Ｍｅｒｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９９３、４２、４４～５２頁；Ａ．Ｔａｇｕｃｈｉら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１５、１３、３１８６～３１８９頁；Ｗ．Ｔｅｇｇｅら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．、２００７、１３、６９３～６９９頁；Ａ．Ａ．Ｖｉｒｇｉｌｉｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９６、３７、６９６１～６９６４頁；Ｏ．Ｌａｃｋら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、２００２、８５、４９５～５０１頁；Ｄ．Ｓ．Ｋｅｍｐら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、５１、１８２１～１８２９頁）。Ｍｅｒｙ，Ｊ．および共同研究者は、ジスルフィド架橋の安定性は、硫黄に隣接する炭素原子上の置換基と、嵩高いメチル基を持つリンカーＮＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－Ｃ（ＣＨ３）２－ＣＯＯＨに依存し、これはＦｍｏｃペプチド合成にとって十分に安定的であったことを報告した（Ｊ．Ｍｅｒｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９９３、４２、４４～５２頁；Ｗ．Ｔｅｇｇｅら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．、２００７、１３、６９３～６９９頁；Ｊ．Ｍｅｒｙら、Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．、１９９２、５、２３３～２４０頁）。以前、ジスルフィドリンカーＮＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２－Ｃ（ＮＨ２）Ｈ－ＣＯＯＨを介してジスルフィド固定化されたペプチドが合成されたが、短いペプチドの場合、どちらかと言えばリンカーが妨げられていないにもかかわらず、おそらくはビーズがピペリジンに曝露される回数が制限されるために、相当量のペプチドが存在しないことが確認された（Ｙ．Ｗｕら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０２０、５６、２９１７～２９２０頁）。
【0043】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、方法は、ステップ（ａ）の後に、蒸発によって薬剤を除去するステップを含む。
上述のように、請求項で使用される薬剤は揮発性であり、蒸発により除去可能である。この好ましい実施形態によれば、蒸発によって薬剤を除去するステップは、本方法の一部を形成する。蒸発は、好ましくは、真空下で行われる（例えば、ＳｐｅｅｄＶａｃシステムの使用）。この薬剤は、最も好ましくは、遠心真空蒸発によって除去される。
上述のように、請求項で使用される薬剤は揮発性であり、蒸発により除去可能である。この好ましい実施形態によれば、蒸発によって薬剤を除去するステップは、本方法の一部を形成する。蒸発は、好ましくは、真空下で行われる（例えば、ＳｐｅｅｄＶａｃシステムの使用）。この薬剤は、最も好ましくは、遠心真空蒸発によって除去される。
【0044】
また、本発明による塩基は、好ましくは揮発性であり、蒸発により除去可能である。この場合、本発明の第１の態様の方法は、好ましくは、ステップ（ａ）の後に、蒸発によって塩基を除去するステップを含む。
【0045】
蒸発によって薬剤を除去する代わりに、薬剤は凍結乾燥によっても除去され得る。
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、方法は、薬剤によって遊離される１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを環化するステップ（ｂ）をさらに含む。
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、方法は、薬剤によって遊離される１つまたは複数の直鎖状ジチオールペプチドを環化するステップ（ｂ）をさらに含む。
【0046】
上述のように、薬剤による「還元的遊離」の場合、１つまたは複数のペプチドは、薬剤によって直鎖状ペプチドの形態で遊離され、ここで２つのチオール基は「遊離」スルフヒドリル基である。２つのスルフヒドリル基を使用してペプチドを環化することができる。
【0047】
本発明の第１の態様のより好ましい実施形態によれば、１つまたは複数のジチオールペプチドは、少なくとも１つのビス求電子試薬によって、またはジスルフィド酸化によって環化される。
【0048】
２つのスルフヒドリル基は、直接結合してジスルフィド結合を形成することができるか（ジスルフィド酸化）、または連結分子を介して、特にビス求電子試薬を介して結合することもできる。様々なビス求電子試薬は市販されているか、または日常的な化学反応によって容易に合成することができる。異なるビス求電子試薬を並行反応で使用し、１つのジチオールペプチドから多くの異なる環状ペプチドを生成することができる。
【0049】
求電子試薬は、新しい結合の形成において電子対アクセプターとして作用する。求核置換の場合、脱離基は負に帯電した種として脱離する。ビス求電子試薬は、２つのスルフヒドリル基と反応することができる少なくとも２つの官能基を含む化合物であり、それによりスルフヒドリル基はビス求電子試薬を介して連結される。
【0050】
ジスルフィド酸化により、ジチオールペプチドの２つのスルフヒドリル基が直接ジスルフィド結合で連結される。
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、項目（ｉｉ）の１つまたは複数の環状ペプチドのジスルフィド結合は還元され、ペプチドはビス求電子試薬によって再環化される。
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、項目（ｉｉ）の１つまたは複数の環状ペプチドのジスルフィド結合は還元され、ペプチドはビス求電子試薬によって再環化される。
【0051】
本明細書で上述したように、本発明の第１の態様の項目（ｉｉ）によれば、１つまたは複数のペプチドは、環状ペプチドの形態で塩基によって遊離され、ジチオールペプチドの２つのチオール基はジスルフィド結合によって連結される。
【0052】
これらのジスルフィド結合は、好ましくは、本発明の第１の態様の項目（ｉ）に関連して記載した薬剤によって還元され、その結果、２つの「遊離」スルフヒドリル基を持つ直鎖状ペプチドが得られる。次いで、これらの直鎖状ペプチドは、本明細書の上記で説明したビス求電子試薬によって再環化することができる。
【0053】
本発明の第１の態様のさらに好ましい実施形態によれば、この薬剤は、１，３－プロパンジチオール、１，４－ブタンジチオール、２，４－ペンタンジチオール、エタン－１－チオール、プロパン－１－チオール、ブタン－１－チオール、プロパン－２－チオール、２－メチル－１－プロパンチオール、ブタン－２－チオール、２－メチルプロパン－２－チオール、２－ヒドロキシ－１－エタンチオール、１，２－エタンジチオール、２－プロペン－１－チオール、３－メチル－１－ブタンチオール、チオフェノール、ベンジルチオール、２－ブテン－１－チオール、３－ブテン－１－チオール、２－メチル－２－プロペン－１－チオールおよび３－メチル－２－ブテン－１－チオールから選択され、好ましくは１，３－プロパンジチオール、１，４－ブタンジチオールまたは２，４－ペンタンジチオールであり、最も好ましくは１，４－ブタンジチオール（ＢＤＴ）であり、ならびに／あるいは塩基は、第三級アミン、第二級アミンまたは第一級アミン、ホウ素、アルミニウムまたは水素化ケイ素、および酸素アニオン、窒素アニオンもしくは炭素アニオンを持つ塩基から選択され、好ましくは第三級アミン、第二級アミンもしくは第一級アミンであり、より好ましくは第三級アミンであり、さらにより好ましくはトリ－アルキルアミンであり、最も好ましくはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である。
【0054】
蒸発により除去可能である還元剤の好ましい例を表１に示す。
【0055】
【表1】
【0056】
【化4】
【0057】
１，４－ブタンジチオール（ＢＤＴ）は、添付の実施例で薬剤として使用されており、したがって、最も好ましい薬剤である。
スルフヒドリル基を脱プロトン化してジスルフィド交換および環化ペプチド遊離を誘導するための塩基の好ましい例を表２に示す。
スルフヒドリル基を脱プロトン化してジスルフィド交換および環化ペプチド遊離を誘導するための塩基の好ましい例を表２に示す。
【0058】
【表2-1】
【0059】
【表2-2】
【0060】
表２のリストは完全なものではないが、各タイプ／サブタイプの有用な試薬の例を示している。好ましいのは、トリアルキル第三級アミンであり、特にその具体例である。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、添付の実施例で塩基として使用されており、したがって、最も好ましい塩基である。
【0061】
本発明の第１の態様のさらに好ましい実施形態によれば、方法は、ステップ（ａ）の前に、固相上で直鎖状ジチオールペプチドを合成するステップ（ａ’）を含む。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、ペプチド合成の慣用の技術である。通常、ペプチドは、ＳＰＰＳ法ではアミノ酸鎖のカルボニル基側（Ｃ末端）からアミノ基側（Ｎ末端）に向けて合成されるが、細胞内ではペプチドは生物学的に逆方向に合成される。ペプチド合成では、アミノ保護されたアミノ酸は固相材料に結合され、カルボニル基と固相材料の間に共有結合を形成する。次いで、アミノ基が脱保護され、次のＮ－保護されたアミノ酸のカルボニル基と反応する。固相にはその時ジペプチドが担持されている。このサイクルが繰り返され、所望のペプチド鎖が形成される。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、ペプチド合成の慣用の技術である。通常、ペプチドは、ＳＰＰＳ法ではアミノ酸鎖のカルボニル基側（Ｃ末端）からアミノ基側（Ｎ末端）に向けて合成されるが、細胞内ではペプチドは生物学的に逆方向に合成される。ペプチド合成では、アミノ保護されたアミノ酸は固相材料に結合され、カルボニル基と固相材料の間に共有結合を形成する。次いで、アミノ基が脱保護され、次のＮ－保護されたアミノ酸のカルボニル基と反応する。固相にはその時ジペプチドが担持されている。このサイクルが繰り返され、所望のペプチド鎖が形成される。
【0062】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、直鎖状ジチオールペプチドのアミノ酸の側鎖は保護基によって保護されており、方法は、ステップ（ａ）の前に、また存在する場合にはステップ（ａ’）の後に、直鎖状ジチオールペプチドが固相に固定化されている間に保護基を除去するステップをさらに含む。
【0063】
アミノ酸には複数の反応性基があるので、ペプチド合成は、ペプチド鎖の長さを短くし、分岐を引き起こし得る副反応を回避するために、慎重に実施しなければならない。副反応を最小限に抑えてペプチド形成を促進するため、アミノ酸反応性基に結合し、官能基を非特異的反応から遮断または保護する化学基が開発されてきた。
【0064】
一般に、ペプチドの合成に使用される精製された個々のアミノ酸は、合成前にこれらの保護基と反応させられ、次いで、特定の保護基が、カップリング直後に新たに付加されたアミノ酸から除去され（脱保護と呼ばれるステップ）、次に来るアミノ酸が適切な方向で成長するペプチド鎖に結合することができるようになる。ペプチド合成が完了すると、残りのすべての保護基は新生ペプチドから除去される。
【0065】
３種類の保護基が当技術分野ではペプチド合成の方法に応じて一般的に使用されており、以下に説明されている。
アミノ酸のＮ末端は「一時的」保護基と呼ばれる基によって保護されるが、その理由はこれがペプチド結合の形成を可能にするために比較的容易に除去されるからである。２つの一般的なＮ末端保護基は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）および９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であり、各基はそれらの用途を決定する明確な特徴を有する。Ｂｏｃは、新しく付加されたアミノ酸から除去するためにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの中程度に強い酸を必要とするが、Ｆｍｏｃは塩基に不安定な保護基であり、ピペリジンなどの弱塩基で除去される。Ｂｏｃ化学は脱保護のために酸性条件を必要とし、一方、Ｆｍｏｃは、さらに２０年間報告されていなかったが、穏やかな塩基性条件下で切断される。穏やかな脱保護条件のため、Ｆｍｏｃ化学は、より高品質で収率が高いことから商業的状況でより一般的に使用されているが、Ｂｏｃは、複雑なペプチド合成にとって、または塩基感受性の非天然ペプチドもしくは類似体が必要な場合に好ましい。
アミノ酸のＮ末端は「一時的」保護基と呼ばれる基によって保護されるが、その理由はこれがペプチド結合の形成を可能にするために比較的容易に除去されるからである。２つの一般的なＮ末端保護基は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）および９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であり、各基はそれらの用途を決定する明確な特徴を有する。Ｂｏｃは、新しく付加されたアミノ酸から除去するためにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの中程度に強い酸を必要とするが、Ｆｍｏｃは塩基に不安定な保護基であり、ピペリジンなどの弱塩基で除去される。Ｂｏｃ化学は脱保護のために酸性条件を必要とし、一方、Ｆｍｏｃは、さらに２０年間報告されていなかったが、穏やかな塩基性条件下で切断される。穏やかな脱保護条件のため、Ｆｍｏｃ化学は、より高品質で収率が高いことから商業的状況でより一般的に使用されているが、Ｂｏｃは、複雑なペプチド合成にとって、または塩基感受性の非天然ペプチドもしくは類似体が必要な場合に好ましい。
【0066】
Ｃ末端保護基の使用は、使用されるペプチド合成の種類に依存する。液相ペプチド合成では、最初のアミノ酸（Ｃ末端アミノ酸）のＣ末端の保護が必要であるが、固相ペプチド合成では、固体支持体（例えば樹脂）がその必要はなく、それは保護が必要な唯一のＣ末端アミノ酸の保護基として機能するからである。
【0067】
アミノ酸側鎖は広範囲の官能基を表し、そのため、ペプチド合成中に側鎖反応性が著しい部位である。このため、多くの異なる保護基が必要であるが、それらは、通常、ベンジル（Ｂｚｌ）基またはｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）基に基づいている。所与のペプチドの合成中に使用することができる特定の保護基は、ペプチド配列と使用されるＮ末端保護の種類に応じて異なる。側鎖保護基は永久保護基として知られているが、その理由は、これらが合成段階中で複数サイクルの化学的処理に耐えることができ、合成完了後の強酸による処理中にのみ除去されるからである。
【0068】
本発明の第１の態様のさらに好ましい実施形態によれば、直鎖状ジチオールペプチドの少なくとも一部は第一級アミンまたは第二級アミンを含み、方法は、第一級アミンまたは第二級アミンをカルボン酸で修飾するステップをさらに含み、第一級アミンまたは第二級アミンおよびカルボン酸を含む環状ペプチドは、好ましくは、アコースティック分注（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）によって移送される。
【0069】
第一級アミンまたは第二級アミンをカルボン酸で修飾することにより、ペプチドライブラリーの複雑性をさらに高めることができる。すなわち、ライブラリー内の異なるペプチドの数を大幅に増やすことができる。これにより、次に、ペプチドライブラリーが特定の標的分子に対する結合剤または阻害剤についてスクリーニングする場合、理想的な阻害剤または結合分子を同定する可能性が高まる。このことは、本明細書で以下に本発明の第２の態様に関連してさらに詳細に説明する。
【0070】
アコースティック分注は、非常に少量の容量で、実施例３に示されているようにわずか８０ナノリットルの容量で反応を行うことができる、液体移送技術である。アコースティック分注は、アコースティック超音波エネルギーを使用して液体を移送することによる、非接触、高精度、高速能力での液体取扱いを可能にする。
【0071】
環状ペプチドが第一級アミンまたは第二級アミンおよびカルボン酸を含む、第一級アミンまたは第二級アミンのカルボン酸による修飾もまた、以下の本明細書に記載する本発明の第２の態様の主題である。本発明の第２の態様の好ましい実施形態および定義は、本発明の第１の態様の上記のさらに好ましい実施形態に対して必要な変更を施して適用される。
【0072】
本発明の第１の態様のさらに好ましい実施形態によれば、方法は、（ｃ）好ましくはペプチドライブラリーを事前精製することなく、ペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップと、（ｄ）標的分子に結合し、好ましくは標的分子を阻害するペプチドについてペプチドライブラリーをスクリーニングするステップとをさらに含む。
【0073】
標的分子に結合し、標的分子をモジュレートし、好ましくは標的分子を阻害するペプチドについてペプチドライブラリーをスクリーニングするための手段および方法は、当技術分野において公知である。好ましい実施形態では、標的は、タンパク質などのアミノ酸ベースの標的である。一般的に、標的はまた、非アミノ酸ベースの化合物、例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【0074】
この関連において、「標的分子を阻害する」という用語は、生物学的活性が阻害され、好ましくは、完全に消失されることを意味する。生物学的活性は、特定の分子実体が標的に対して規定の生物学的効果を達成する能力である。それは、効果を得るのに必要な分子実体の効力または濃度の観点から測定される。生物学的活性は、生物学的アッセイによって測定される。
【0075】
本発明の第１の態様のより好ましい実施形態によれば、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、第一級アミンまたは第二級アミンがカルボン酸で修飾されている同一のウェル内で実施される。
【0076】
このアプローチは、材料および時間を節約する。ウェルは、例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのフォーマットであり得る。
【0077】
本発明の第１の態様のさらにより好ましい実施形態によれば、標的分子はタンパク質または核酸分子であり、好ましくはタンパク質である。
これらの選択肢のうち、標的は、好ましくは、タンパク質などのアミノ酸ベースの標的である。
これらの選択肢のうち、標的は、好ましくは、タンパク質などのアミノ酸ベースの標的である。
【0078】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、固相は樹脂を含み、好ましくは無極性樹脂、より好ましくはポリスチレン樹脂を含む。
ペプチド合成用のいくつかの樹脂は公知であり、市販されている。非限定的な例は、２－アクリルアミドプロパ－１－イル－（２－アミノプロパ－１－イル）ポリエチレングリコール８００からなるＰＥＧＡ樹脂、セバシン酸と架橋されたポリ－ε－リジンの樹脂、架橋されたヒドロキシエチルポリスチレンとポリエチレングリコールの樹脂、およびポリエチレングリコールベースの樹脂である。上述の樹脂マトリックスはいずれも、限定するものではないが、塩化アミノメチル、塩化チオメチル、塩化チオエチル、塩化クロロアルキル、塩化トリチル、ＨＭＢＡ、およびＲｉｎｋアミドを含む反応基で官能基化することができる。ポリスチレン樹脂は、本願の実施例において使用されているので好ましい。
ペプチド合成用のいくつかの樹脂は公知であり、市販されている。非限定的な例は、２－アクリルアミドプロパ－１－イル－（２－アミノプロパ－１－イル）ポリエチレングリコール８００からなるＰＥＧＡ樹脂、セバシン酸と架橋されたポリ－ε－リジンの樹脂、架橋されたヒドロキシエチルポリスチレンとポリエチレングリコールの樹脂、およびポリエチレングリコールベースの樹脂である。上述の樹脂マトリックスはいずれも、限定するものではないが、塩化アミノメチル、塩化チオメチル、塩化チオエチル、塩化クロロアルキル、塩化トリチル、ＨＭＢＡ、およびＲｉｎｋアミドを含む反応基で官能基化することができる。ポリスチレン樹脂は、本願の実施例において使用されているので好ましい。
【0079】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、直鎖状ジチオールペプチドは、１０００Ｄａ未満、好ましくは６００Ｄａ未満の分子量を有する直鎖状ジチオールペプチド、および／または３つもしくは４つのアミノ酸もしくはビルディングブロック、好ましくは３つのアミノ酸もしくはビルディングブロックを含む直鎖状ジチオールペプチドを含む。
【0080】
この好ましい実施形態のジチオールペプチドは、請求項に記載の方法の項目（ｉ）による「還元的遊離」に特に適している。これは、このようなペプチドではジチオールペプチド内の２つのチオール基が相互に接近しているため、構造上の制約から環化的遊離によって効果的に遊離させることができないという理由による。
【0081】
図１ａに示す環化的遊離方策では、ペプチドは、ジスルフィドリンカーを介して固相上で合成され、環化的ジスルフィド交換反応を介して遊離される。環化的遊離の主な制限は、特に短いジチオールペプチドが、構造的に制約されるジスルフィド環化ペプチドを介した経路のため効率的に生成され得ないということである。図１ａに示すように、１つのアミノ酸と各側のチオール含有ビルディングブロックから構成されるペプチド（合計３つのビルディングブロック／アミノ酸）は、効率的に遊離されない。チオール含有ビルディングブロックの間に２つのアミノ酸を含有するペプチド（合計４つのビルディングブロック／アミノ酸）の一部であっても、ペプチドの構造的柔軟性が（例えば、Ｐｈｉ角とＰｓｉ角に制約を有するアミノ酸によって）制限される場合、効率的に遊離されなかった。３つまたは４つのビルディングブロックよりも長いジチオールペプチドのみを送達するという環状遊離アプローチの制限により、分子量が約６００Ｄａ未満の大環状化合物の生成は妨げられ、したがって、経口薬または細胞透過性薬の開発において特に注目される大環状化合物の生成が妨げられる。
【0082】
したがって、請求項に記載の方法の項目（ｉｉ）による「環化的遊離」において使用されるジチオールペプチドは、好ましくは６００Ｄａを超える分子量を有し、および／または３アミノ酸より多くを含み、より好ましくはより多くのアミノ酸を含む。
【0083】
本発明は、第２の態様において、大環状化合物ライブラリー、好ましくは環状ペプチドライブラリーを多様化するための方法であって、少なくともいくつかの大環状化合物、好ましくは環状ペプチドが第一級アミンまたは第二級アミンを含み、方法が第一級アミンまたは第二級アミンを１つまたは複数のカルボン酸で修飾するステップを含む、方法に関する。
【0084】
本発明の第１の態様の定義および好ましい実施形態は、修正可能な限り、本発明の第２の態様に必要な変更を施して適用される。
「大環状分子」という用語は、一連の１２個以上の原子が連結して大環状のリングまたは環を形成している分子を指す。大環状分子は、好ましくは、本発明の第１の態様に関連して定義した環状ペプチドであるが、大環状分子は必ずしもペプチドをベースとしたものではなく、大環状分子はペプチド成分と非ペプチド成分を含有する構造も有し得る。非ペプチド成分の例としては、炭化水素、エーテル、エステル、アミド、アリール、糖、ケトン、エポキシドおよびアミンが挙げられる。非ペプチド大環状分子の例としては、ラパマイシン、マクロライド系抗生物質、ロルラチニブ、およびシメプレビルが挙げられる。
「大環状分子」という用語は、一連の１２個以上の原子が連結して大環状のリングまたは環を形成している分子を指す。大環状分子は、好ましくは、本発明の第１の態様に関連して定義した環状ペプチドであるが、大環状分子は必ずしもペプチドをベースとしたものではなく、大環状分子はペプチド成分と非ペプチド成分を含有する構造も有し得る。非ペプチド成分の例としては、炭化水素、エーテル、エステル、アミド、アリール、糖、ケトン、エポキシドおよびアミンが挙げられる。非ペプチド大環状分子の例としては、ラパマイシン、マクロライド系抗生物質、ロルラチニブ、およびシメプレビルが挙げられる。
【0085】
【0086】
修飾される環状ペプチドまたは大環状化合物は、好ましくは２倍から２０倍、好ましくは３倍から１５倍、最も好ましくは４倍から１２倍過剰のカルボン酸と接触されるが、それは、この過剰が反応効率を高めるという理由による。
【0087】
カルボン酸は、好ましくは、活性化カルボン酸である。活性化カルボン酸は、遊離カルボキシル基よりも求核攻撃を受けやすいカルボキシル基の誘導体であり、例えば、酸無水物、塩化アシル、チオエステル、およびエステルである。
【0088】
カルボン酸を活性化するため、酸活性化剤を使用することができる。本発明の第２の態様の方法は、好ましくは、１つまたは複数のカルボン酸を活性化することができる酸活性化剤を含むということになる。
【0089】
酸活性化剤は、好ましくは、実施例で使用される、ＨＢＴＵ（（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウラニウム）である。使用することができる他の適切な酸活性化剤は、ＨＡＴＵ（（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート）、ＨＳＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＳＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート）、ＴＰＴＵ（Ｏ－（２－オキソ－１（２Ｈ）ピリジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、およびＤＭＴＭＭ ＢＦ４（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムテトラフルオロボレート）である。
【0090】
本発明の第２の態様の方法は、好ましくは、塩基を含む。塩基は、カルボン酸の活性化およびカップリングを促進する。その好ましい例を本明細書の以下で説明する。
環状ペプチドまたは大環状化合物は、好ましくは、周辺基として第一級アミンもしくは第二級アミンを含むか（図８に図示）、または骨格内に第二級アミンを含む。環状ペプチドの場合、アミノ基は、アミノ酸の側鎖を通じて、またはＮ末端アミノ酸を通じて導入され得る。
環状ペプチドまたは大環状化合物は、好ましくは、周辺基として第一級アミンもしくは第二級アミンを含むか（図８に図示）、または骨格内に第二級アミンを含む。環状ペプチドの場合、アミノ基は、アミノ酸の側鎖を通じて、またはＮ末端アミノ酸を通じて導入され得る。
【0091】
大環状分子ベースのリガンドの生成は、現在、大環状分子の大規模ライブラリーが欠如していることが妨げとなっており、選択された標的に高親和性で結合する大環状分子ベースのリガンドをライブラリーから単離できる可能性が、ライブラリーに異なる潜在的な結合パートナーの数が多くなるほど高くなることが指摘されている。大環状分子の大規模ライブラリーを得る際の制限は、本発明の第２の態様の方法によって克服される。この方法のアプローチは、化学的に異なるフラグメントを、コンビナトリアルな方式で構造的に異なる大環状分子足場の周辺基に繋ぐことに基づいている。概念実証として、１０４個を超えるカルボン酸フラグメントを１９２個の大環状分子足場にコンジュゲートさせることによる１９，９６８個の大環状分子ライブラリーの生成について実施例３に示す。アシル化反応の高反応効率と少ない副生成物により、事前精製することなくライブラリーのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が可能になった。実施例３はまた、低ナノモルのトロンビン阻害剤（Ｋｉ＝４４ｎＭ）と高ナノモルのＭＤＭ２／ｐ５３タンパク質間相互作用阻害剤（Ｋｉ＝３９０ｎＭ）のライブラリーから単離が成功したことを示す。
【0092】
本発明の第２の態様のアプローチは、大環状化合物を合成およびスクリーニングすることができ、またいずれの標的にも一般的に適用可能である割合の飛躍的な増大を提供する。
【0093】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態によれば、ライブラリーは、本発明の第１の態様に関連して説明した製造品のフォーマットである。
第１の態様に関連して説明した製造品の好ましい実施形態は、第２の態様に必要な変更を施して適用される。本発明の第２の態様のこの好ましい実施形態によれば、第一級アミンまたは第二級アミンを含む環状ペプチドまたは大環状化合物を、製造品のウェル内でカルボン酸と反応させる。
第１の態様に関連して説明した製造品の好ましい実施形態は、第２の態様に必要な変更を施して適用される。本発明の第２の態様のこの好ましい実施形態によれば、第一級アミンまたは第二級アミンを含む環状ペプチドまたは大環状化合物を、製造品のウェル内でカルボン酸と反応させる。
【0094】
本発明の第２の態様のより好ましい実施形態によれば、１つまたは複数の環状ペプチド、１つもしくは複数のカルボン酸、酸活性化剤、および／または塩基は、アコースティック分注によって製造品に移送される。
【0095】
アコースティック分注に関するさらなる詳細は、第１の態様に関連して本明細書で上述されている。アコースティック分注の使用は、以下の本明細書の実施例３．２で示している。
【0096】
アコースティック分注は音波を使用し、好ましくはアコースティック液滴放出技術である。アコースティック分注は、特にナノモル量の試薬を非接触で移すことができるという大きな利点を有しており、これによりピペッティングチップが不要で、分注スピードが速くなり、廃棄物およびコストが削減される。
【0097】
本発明の第２の態様のさらに好ましい実施形態によれば、大環状化合物、好ましくは、環状ペプチドは、事前精製することなく、多様化後にスクリーニングされる。
本スクリーニングは、好ましくは、（ａ）大環状化合物、好ましくは環状ペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップと、（ｂ）本発明の第１の態様に関連して本明細書の上記で説明したような標的分子に結合し、好ましくは標的分子を阻害する化合物、好ましくはペプチドについて、大環状化合物、好ましくは環状ペプチドライブラリーをスクリーニングするステップを含む。
本スクリーニングは、好ましくは、（ａ）大環状化合物、好ましくは環状ペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップと、（ｂ）本発明の第１の態様に関連して本明細書の上記で説明したような標的分子に結合し、好ましくは標的分子を阻害する化合物、好ましくはペプチドについて、大環状化合物、好ましくは環状ペプチドライブラリーをスクリーニングするステップを含む。
【0098】
本発明の第２の態様、特に事前精製を行わない上記の好ましい実施形態に関連して、環状ペプチドライブラリーが本発明の第１の態様の環化的遊離によって生成されていること、または第２の態様の方法が、環状ペプチドライブラリーの多様化の前に、本発明の第１の態様に従って環状ペプチドライブラリーを生成するステップを含むことが好ましい。
【0099】
また、本発明の第１の態様の環化的遊離によって生成された環状ペプチドライブラリーは、事前精製することなくスクリーニングすることができる。したがって、環状ペプチドライブラリーが本発明の第１の態様の環化的遊離によって生成された場合、または第２の態様の方法が、環状ペプチドライブラリーの多様化の前に、本発明の第１の態様に従って環状ペプチドライブラリーを生成するステップを含む場合、環状ペプチドライブラリーは、スクリーニングの前に精製ステップを必要とすることなく生成され、多様化され得る。
【0100】
本発明の第２の態様のより好ましい実施形態によれば、大環状化合物、好ましくは、環状ペプチドは、したがって、１つ以上のカルボン酸で修飾され、それらが合成された製造品の同一ウェル内でスクリーニングされる。
【0101】
これは、ウェルに標的分子（例えばタンパク質）および必要に応じて他の必要とされるスクリーニングアッセイ試薬を分注し、例えばプレートリーダーによって結合を測定することにより達成することができる。この文脈における環化は、再度好ましくは、本発明の第１の態様の環化的遊離に従って実施される。
【0102】
本発明の第２の態様のさらに好ましい実施形態によれば、塩基は、ＤＡＢＣＯ、ＨＥＰＥＳのナトリウム塩、またはＮＭＭであり、最も好ましくはＤＡＢＣＯである。
またＤＩＰＥＡなどの揮発性塩基も使用することができるが、揮発性塩基は、特に２．５ｎｌの液滴中に音波により分注される場合に蒸発され得る。したがって、ＤＡＢＣＯ（１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）、またはＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）のナトリウム塩などの不揮発性塩基の使用が本明細書では好ましい。揮発性塩基のうち、ＮＭＭ（Ｎ－メチルモルホリン）は、より過剰に適用される場合に適していることが確認された。最良の結果は、ＤＡＢＣＯの使用により得られた。実施例３を参照されたい。
またＤＩＰＥＡなどの揮発性塩基も使用することができるが、揮発性塩基は、特に２．５ｎｌの液滴中に音波により分注される場合に蒸発され得る。したがって、ＤＡＢＣＯ（１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）、またはＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）のナトリウム塩などの不揮発性塩基の使用が本明細書では好ましい。揮発性塩基のうち、ＮＭＭ（Ｎ－メチルモルホリン）は、より過剰に適用される場合に適していることが確認された。最良の結果は、ＤＡＢＣＯの使用により得られた。実施例３を参照されたい。
【0103】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含む本特許明細書が優先される。
【0104】
本明細書、特に特許請求の範囲において特徴づけられる実施形態に関して、従属請求項で言及される各実施形態は、前記従属請求項が従属する各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わされることが意図される。例えば、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを列挙する独立請求項１、３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦを列挙する従属請求項２、ならびに請求項１および２に従属し、３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩを列挙する請求項３の場合、本明細書は、特に記載のない限り、Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉの組合せに対応する実施形態を明確に開示していることを理解されたい。
【0105】
同様に、独立請求項および／または従属請求項が代替案を記載していない場合においても、従属請求項が複数の先行する請求項に言及している場合、それによって網羅される主題の任意の組合せが明示的に開示されているとみなされることを理解されたい。例えば、独立請求項１、請求項１に言及する従属請求項２、ならびに請求項２および１の両方に言及する従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組合せは、請求項３、２および１の主題の組合せと同様に、明確かつ明瞭に開示されていることになる。請求項１から３のいずれか一項に言及するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１の主題、請求項４、２および１の主題、請求項４、３および１の主題、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せが明確かつ明瞭に開示されていることになる。
【0106】
上記の考察は、添付のすべての特許請求の範囲に準用して適用される。
図を示す。
図を示す。
【図面の簡単な説明】
【0107】
【図1】ジスルフィド架橋を介して固相上で合成されたペプチドの還元的遊離のための方策を示す図である。（ａ）最近開発された「環化的ジスルフィド遊離」反応。短いペプチド、例えば２つの隣接するチオール含有構造（３つのビルディングブロック）の間に１個のみのアミノ酸を含有するペプチドは、立体構造上の制約により効率的に遊離されない（破線で示す）。（ｂ）ジスルフィド架橋の還元による短いジチオールペプチドの遊離。
【図2】固相にジスルフィド架橋を介して連結したペプチドの還元的遊離を示す図である。（ａ）固相からのペプチドの還元的遊離の試験に使用した４種のペプチドの化学構造。（ｂ）塩基ＴＥＡ（１００ｍＭ ＴＥＡ）を含有するＤＭＦ中でＢＤＴ（１００ｍＭ）を使用してジスルフィド架橋の還元によって遊離された４種のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラム（左）。同じ固定化ペプチドを、環化的遊離を介してジチオールペプチドを切り離すために以前使用した条件であるＤＭＳＯ中のＴＥＡ（１００ｍＭ）に曝露した際、少量のジスルフィド二量体化ペプチドのみが溶出された（右）。所望のペプチドのピークが赤色で強調されている。観察された唯一の副生成物は、ジスルフィド架橋を介して二量体化されたペプチド（二量体）である。
【図3】ジスルフィド架橋を介して固相に結合したジチオールペプチドの還元的遊離を示す図である。（ａ）固相上のジチオールペプチドの構造。（ｂ）塩基ＴＥＡ（１００ｍＭ）を含有するＤＭＦ中のＢＤＴ（１００ｍＭ）を使用するジスルフィド架橋の還元によって遊離された８種のジチオールペプチドのＨＰＬＣクロマトグラム。所望のペプチドは赤色で強調されている。ＢＤＴおよび副生成物が示されている。
【図4-1】ビス求電子試薬によるジチオールペプチドの環化を示す図である。（ａ）Ｍｐａ－Ｔｒｐ－Ｍｅａおよび試薬２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジンの使用を示した環化反応（１）。（ｂ）ビス求電子試薬２～１０。所望の環状生成物は赤色で強調されている。副生成物ｓ１～ｓ７を補足図７に示す。Ｌ＝ビス求電子環化試薬。Ｌ＊は加水分解されたＬである。
【図5】環化的ジスルフィド遊離の方策を示す図である。（ａ）方策の概略図。短いペプチドが固相上でジスルフィド架橋を介して合成される。固相上の保護基（赤色）を除去することにより効率的な除去が可能になる。塩基による処理により、Ｎ末端チオールが脱プロトン化され、分子内ジスルフィド交換が誘導され、環状生成物が得られる。（ｂ）固体支持体にジスルフィド結合した試験ペプチドＭｐａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｍｅａの化学構造および使用した市販樹脂。（ｃ）樹脂４および樹脂５上で合成され、ＤＭＳＯ中の１５０ｍＭ ＤＩＰＥＡで遊離されたジスルフィド環化ペプチドＭｐａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｍｅａの回収。濃度は２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。反応は３連で実施した。（ｄ）パネルｄのジスルフィド環化ペプチドの純度。純度は、２２０ｎｍのＵＶ吸光度ですべての種のＡＵＣを測定するＬＣＭＳにより決定した。
【図6-1】可変配列を持つペプチドの環化的遊離を示す図である。（ａ）所望の４種の環状ペプチドの化学構造。ペプチドは、直鎖状配列Ｍｐａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｍｅａをベースとしており、Ｘａａは骨格内の可変性構造的フレキシビリティを持つアミノ酸である。（ｂ）環化的遊離後の粗ペプチドの分析用ＨＰＬＣクロマトグラム。右側のクロマトグラムは、ＴＣＥＰによるジスルフィド結合還元後のペプチドを示す。同定されなかった不純物については、質量が示されている（その種が単一荷電していると仮定）。
【図7】環状ペプチドライブラリーのライブラリー設計、吸収によるペプチド回収定量、およびトロンビン阻害を示す図である。（ａ）９６種の異なるペプチドを含むライブラリーの設計およびライブラリーに使用される非天然アミノ酸の構造。（ｂ）２８０ｎｍでの吸収によって定量した９６種の合成環状ペプチドについての環状ペプチド濃度（ＤＭＳＯ中のｍＭ）の散布図。平均回収率と、この値の１．５ｘおよび０．６７ｘをグラフに示す。（ｃ）平均環状ペプチド濃度１１μＭで測定したトロンビン阻害。ペプチドは、最初のスクリーニングにおけるトロンビン阻害活性に従って並べられている（黒色の点；最も高い活性から最も低い活性へ）。緑色の点は、同じ条件を使用して２回目のスクリーニングで測定された同じ環状ペプチドのトロンビン阻害を示す。最も活性のある阻害剤の化学構造を示す（Ｋｉ＝１３±１μＭ）。
【図8】周辺基にフラグメントをコンビナトリアルに付加することによる大環状化合物の多様化。ａ、アプローチの一般原則。ｂ、周辺の第一級アミンを含有するモデル大環状化合物はアシル化により修飾される。ｃ、モデル大環状化合物と表示した酸との反応。上の数字はピペッティングによる４μＬ容量での変換を示し、下の数字は８０ｎｌとアコースティック液体移送での変換を示し、最初の数字はＤＩＰＥＡで、２番目の数字はＤＡＢＣＯである。スケールの違いを示すために、９６ウェルプレート内の２つの液滴の画像を示す。液滴はフルオレセインを含有しており、可視化のためにＵＶ光に曝露される。
【図9-1】周辺アミノ基を含有する大環状分子の調製を示す図である。ａ、側鎖脱保護ペプチドの環化的ジスルフィド遊離。ｂ、ライブラリー１の足場のフォーマット。
【図10-1】トロンビンに対する大環状化合物ライブラリーのスクリーニングおよびヒットの同定を示す図である。ａ、足場ライブラリー１ａ～ｆ（図２に示す）を多様化するために酸１～３とともに使用されたカルボン酸９～１６。ｂ、アコースティック液体移送による大環状ライブラリー合成の概略手順。反応条件を示す。ｃ、各大環状分子のトロンビン阻害を示すヒートマップ。すべての大環状分子のアミノ酸組成を補足表１に示す。
【図10-2】図１０の続き。ｄ、酸１４を含有するすべての化合物のレプリカ反応およびスクリーニング。ｅ、上位３つのヒットＭ１からＭ３の化学構造および活性。３つの独立した測定の平均値とＳＤを示す。ｆ、Ｍ１が得られるクロマトグラフィー分離アシル化反応およびトロンビン阻害種の分画の分析。
【図11-1】トロンビンに対するスクリーニングを示す図である。３８４種の大環状分子は、前述の手順に従って合成した（利用したＦｍｏｃアミノ酸およびそれらの対応する１文字コードは、補足図１ｂに示す）。各大環状分子は１２種のカルボン酸と反応した。反応およびクエンチの後、トロンビンおよび蛍光発生基質をウェルに添加し、蛍光の増加を３０分間にわたり測定した。最終の大環状分子濃度は１０μＭであった。残存トロンビン活性は、各ウェルの経時的な蛍光強度の傾きを、大環状分子を含まない対照ウェルの傾きで割ることにより決定した。
【図12-1】ＭＤＭ２結合剤を示す図である。ａ、Ｍ６からＭ８が得られるクロマトグラフィー分離アシル化反応およびトロンビン阻害種の分画の分析。ｂ、蛍光偏光を使用して蛍光ＭＤＭ２プローブ（直鎖状ペプチド）の置換を試験することにより測定された、精製大環状分子のＭＤＭ２への結合。３つの独立した測定の平均値およびＳＤを示す。
【図13】周辺基にフラグメントをコンビナトリアルに付加することによる大環状化合物の多様化を示す図である。ａ、すべてアミノ基を含有する大環状化合物の化学構造。ｂ、大環状化合物の多様化に使用したカルボン酸。ｃ、反応の収率。
【図14】Ｒｏ５のエッジで大環状ライブラリーを合成するための方策を示す図である。（ａ）以前の大環状分子の方策と本明細書で報告した改良型の方策。円形は、ビルディングブロックの３つの群：アミノ酸（灰色）、システアミンおよび類似体（赤色）、ならびにビス求電子リンカー（白色）を表す。（ｂ）末端チオール基をビス電気泳動試薬で反応させることにより直鎖状ペプチドを環化する方策の模式図。直鎖状前駆体のＣ末端ビルディングブロックとして使用される、新しく開発されたシステアミン類似体の化学構造を示す。（ｃ）ジスルフィド架橋を介して連結したシステアミン類似体を担持するポリスチレン樹脂を合成する方策。システアミン類似体は、活性化したチオスルホネート・ビルディングブロックとして樹脂に充填される。
【図15】フェニルスルホンにより活性化されたシステアミン・ビルディングブロックの合成およびクロマトグラフィーステップなしの精製を示す図である。（ａ）ジチオール樹脂を合成する概略図。Ｘ＝ＢｒまたはＣｌ。（ｂ）ジチオールペプチドの精製なしの合成の簡略図。（ｃ）７種の異なる樹脂ビルディングブロックを用いて合成したモデルペプチド（ＭＰＡ－Ｔｒｐ－Ａｌａ）の粗ペプチド品質の積み重ねたＨＰＬＣクロマトグラム（ＵＶ２２０）。
【図16-1】トリプシン様セリンプロテアーゼの阻害剤を生成するために調整した大環状ライブラリーの設計を示す図である。（ａ）設計した環状ペプチドライブラリーのフォーマット。ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒ（ｖｅｒｓ．５．５．０）を使用して算出された大環状ライブラリーの予測される物理化学的特性。（ｂ）ライブラリー合成に使用したアミノ酸およびリンカー。（ｃ）生成された大環状ライブラリーの選択された特性のヒストグラム。緑色でマークされているのは、ｒｏ５に準拠した領域、および／または細胞透過性大環状分子が可能であると予測される範囲内にある領域である。
【図17】ライブラリー生成の実験ステップを示す図である。マイクロタイタープレートにおける大環状ライブラリーを合成するためのワークフロー。
【図18-1】ＭＤＭ２：ｐ５３阻害剤の親和性最適化を示す図である。ａ、ライブラリー３の足場はＭ８をベースとし、青色で示したアミノ酸が多様化されている。アミノ酸ビルディングブロックを３つのフレーム内に示す。
【図18-2】図１８の続き。ｂ、３０ｐｍｏｌスケールで１５種のカルボン酸によりコンビナトリアルにアシル化された６３種の足場に結合するＭＤＭ２のヒートマップ。ＭＤＭ２への結合は、７５０ｎＭの濃度の大環状分子による蛍光ペプチドプローブの置換アッセイによって測定した。
【図18-4】図１８の続き。ｄ、ＦＰにより測定した、フルオレセイン標識し、ＨＰＬＣ精製した大環状分子Ｍ１０（Ｆ－Ｍ１０）のＭＤＭ２への結合。３つの独立した測定の平均値およびＳＤを示す。ｅ、ＳＰＲにより測定した、非標識大環状分子Ｍ８およびＭ１０のＭＤＭ２への結合。
【図19-1】塩基としてＤＩＰＥＡを使用するピペッティング（４μｌ容量）およびアコースティック移送（８０ｎｌ容量）によるアシル化反応の比較を示す図である。反応物を水で１００倍希釈し、５μｌのサンプルを、ＲＰカラムと５分間かけた０～６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２０勾配を使用するＬＣ－ＭＳによって分析した。８０ｎｌ反応容量の場合、２つのサンプルをプールした。
【図20-1】アコースティック分注および異なる塩基を使用する８０ｎｌ容量でのアシル化反応を示す図である。８０ｍＭ濃度の２つの不揮発性塩基（ＤＡＢＣＯおよびＨＥＰＥＳナトリウム塩）ならびに５００ｍＭ濃度の揮発性塩基（ＮＭＭ）を、３種のカルボン酸によるモデル足場のアシル化のために、８０ｍＭ ＤＩＰＥＡの代替品として試験した。反応物を水で１００倍希釈し、５μｌのサンプルを、ＲＰカラムおよび５分間かけた０～６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２０勾配を使用するＬＣ－ＭＳにより分析した（２つのプールした反応物）。ＤＩＰＥＡとの反応は完了しなかったが、他のすべての塩基は生成物に定量的に変換された。
【図21】アコースティック分注および塩基としてのＤＡＢＣＯを使用する８０ｎＬ容量でのアシル化反応の比較を示す図である。モデル足場１を、塩基としてＤＡＢＣＯ（８０ｍＭ）を使用して、８０ｎｌ容量のカルボン酸１～８と反応させた。反応物を水で１００倍希釈し、分析した５μｌのサンプル（２つのプールした反応物）を、ＲＰカラムおよび５分間かけた０～６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２０勾配を使用するＬＣ－ＭＳによって分析した。
【図22-1】８０ｎｌ容量でのモデル足場２～５のアシル化およびアコースティック分注を示す図である。ａ、モデル足場のＬＣ－ＭＳ分析。反応物を水で１００倍希釈し、５μｌのサンプルを分析した。溶媒Ｂの勾配：モデル足場２の場合、０～６０％のＭｅＣＮ、５分。モデル足場３～５の場合、１０～１００％のＭｅＣＮ、５分。ｂ、酸のＬＣ－ＭＳ分析。反応物を水で１００倍希釈し、５μｌのサンプルを分析した。溶媒Ｂの勾配：０～６０％のＭｅＣＮ、５分。ＴＭＵ＝テトラメチル尿素。
【図22-3】図２２の続き。ｃ～ｆ、モデル足場２（ｃ）、３（ｄ）、５（ｅ）および５（ｆ）のアシル化反応のＵＨＰＬＣ分析。反応物を水で１００倍希釈し、５μＬのサンプルを分析した。溶媒Ｂの勾配：モデル足場２の場合、０～６０％のＭｅＣＮ、５分。モデル足場３～５の場合、１０～１００％のＭｅＣＮ、５分。
【図23】Ｎ末端アミノ基を含有する環状ペプチド足場の調製を示す図である。ａ、６つの異なる足場フォーマット。ｂ、足場合成に使用したアミノ酸。
【図24】ライブラリー１（トロンビンスクリーニング）およびライブラリー２（ＭＤＭ２スクリーニング）の物理化学的特性を示す図である。特性は、ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒソフトウェアを使用して算出した。キールバーグの透過性規則（Ｐ．Ｍａｔｓｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１６、１０１、４２～６１頁；Ｂ．Ｄｏａｋら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４、２１、１１１５～１１４２頁）に準拠した領域は、緑色に着色されている。両ライブラリーの大部分は、細胞透過性であると予測される空間にある。ＭＷ＝分子量、ｃＬｏｇＰ＝算出したｎ－オクタノール／水分配係数、ＨＢＤ＝水素結合供与体、ＨＢＡ＝水素結合受容体、ＰＳＡ＝極性表面積、ＮＲｏｔＢ＝回転可能な結合の数。ａ、ライブラリー１（トロンビンスクリーニング用）。ｂ、ライブラリー２（ＭＤＭ２スクリーニング用）。
【図25-1】トロンビン阻害剤Ｍ１～Ｍ５を示す図である。ａ、化学構造および１５分間かけた０～１００％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配を使用して得られた分析用ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図25-2】図２５の続き。ｂ、すべての大環状分子について、１８点の２倍連続希釈を５０μｌ容量で行った。トロンビンを添加し（５０μｌ、最終濃度２ｎＭ）、続いて１０分後に蛍光発生基質Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（５０μｌ、最終濃度５０μＭ）を添加した。蛍光の増加を３０分間にわたり測定した。残存トロンビン活性は、各ウェルの経時的な蛍光強度の傾きを、大環状分子を含まない対照ウェルの傾きで割ることにより決定した。３つの独立した測定の平均値およびＳＤを示す。
【図26-1】トロンビンに結合したＭ１の構造を示す図である。ａ、トロンビンに結合したＭ１のＸ線構造。Ｍ１は拡大され、Ｈ結合相互作用が示されている。
【図27】ライブラリー２（ＭＤＭ２スクリーニング）用に合成された足場を示す図である。ａ、ライブラリー２の足場のフォーマット。ｂ、足場ライブラリーの合成に使用したアミノ酸。４種のジアミノ酸、４種の骨格アミノ酸、２種の側鎖アミノ酸、および６種のサブライブラリーフォーマットのすべての組合せを合成した。ｃ、環化的遊離後のトリプトファン含有足場の収率。ナノドロップ吸光度により測定した場合の足場の平均濃度は１２．９ｍＭであった。ＬＣ－ＭＳで測定した平均純度は、約９０％であった。
【図28-1】環状ペプチド足場の周辺アミンをアシル化するために使用したカルボン酸の概要を示す図である。
【図29】競合結合実験によるＭ１０の結合部位の研究を示す図である。ａ、蛍光偏光で測定したＭ１０およびｎｕｔｌｉｎ－３ａによるＦＰ５３直鎖状ペプチドプローブの置換。ｂ、Ｍ１０およびｎｕｔｌｉｎ－３ａによるＦ－Ｍ１０大環状ペプチドプローブの置換。
【図30-1】ＳＰＲにより測定した大環状分子のＭＤＭ２への結合を示す図である。ａ、フルオレセイン標識大環状分子、陽性対照ｎｕｔｌｉｎ－３ａ（フルオレセイン標識なし）、および陰性対照（トロンビン阻害剤；フルオレセイン標識なし）のシングルサイクルＳＰＲセンサーグラム。ＲＵ、応答ユニット。
【発明を実施するための形態】
【0108】
実施例により本発明を説明する。
【実施例1】
【0109】
実施例１－還元的遊離
１．１．固相からのジスルフィド固定化ペプチドの還元的遊離
最初に、固体支持体上にジスルフィド架橋を介して固定化されたペプチドが揮発性還元剤により定量的に遊離され得るかどうかを評価した。この目的のため、図２ａに示す４種類のペプチド、Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｍｅａ、Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｍｅａ、Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｍｅａ、およびＴｙｒ－Ａｌａ－Ｍｅａ（Ｍｅａ＝２－メルカプト－エチルアミン、システアミンとも呼ばれる）を合成した。このペプチドにはトリプトファン残基またはチロシン残基が含有されており、２２０ｎｍまたは２８０ｎｍでの吸光度測定によって、遊離されたペプチドの量を正確に測定することができる。本発明者らは、環化的ジスルフィド交換などの他のいかなるメカニズムも介さずに、ジスルフィド架橋の還元によって遊離されたペプチドを定量するために、ジチオールペプチドで確認されるＮ末端チオール基を省いた。ペプチドは、高充填容量（約１ｍｍｏｌ／グラム）を有し、ペプチド合成に一般的に使用されるポリスチレン（ＰＳ）樹脂上で合成した。まず、ＰＳチオール樹脂を過剰のピリジルジチオエチルアミンとインキュベートすることによってジスルフィド架橋を確立し、標準的なＦｍｏｃ化学によってペプチドを合成した。すべてのペプチドは、９６ウェルプレートのウェル内で、５μｍｏｌスケールで合成し、後にハイスループットでジチオールペプチドライブラリーを合成することが予定されている条件を試験した。
１．１．固相からのジスルフィド固定化ペプチドの還元的遊離
最初に、固体支持体上にジスルフィド架橋を介して固定化されたペプチドが揮発性還元剤により定量的に遊離され得るかどうかを評価した。この目的のため、図２ａに示す４種類のペプチド、Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｍｅａ、Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｍｅａ、Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｍｅａ、およびＴｙｒ－Ａｌａ－Ｍｅａ（Ｍｅａ＝２－メルカプト－エチルアミン、システアミンとも呼ばれる）を合成した。このペプチドにはトリプトファン残基またはチロシン残基が含有されており、２２０ｎｍまたは２８０ｎｍでの吸光度測定によって、遊離されたペプチドの量を正確に測定することができる。本発明者らは、環化的ジスルフィド交換などの他のいかなるメカニズムも介さずに、ジスルフィド架橋の還元によって遊離されたペプチドを定量するために、ジチオールペプチドで確認されるＮ末端チオール基を省いた。ペプチドは、高充填容量（約１ｍｍｏｌ／グラム）を有し、ペプチド合成に一般的に使用されるポリスチレン（ＰＳ）樹脂上で合成した。まず、ＰＳチオール樹脂を過剰のピリジルジチオエチルアミンとインキュベートすることによってジスルフィド架橋を確立し、標準的なＦｍｏｃ化学によってペプチドを合成した。すべてのペプチドは、９６ウェルプレートのウェル内で、５μｍｏｌスケールで合成し、後にハイスループットでジチオールペプチドライブラリーを合成することが予定されている条件を試験した。
【0110】
ＰＳ樹脂からのジスルフィド固定化ペプチドの遊離は、２０当量のβ－Ｍｅ（０．５Ｍ）および２０当量のトリメチルアミン（ＴＥＡ；０．５Ｍ）を含有する２００μＬのＤＭＦでビーズを一晩インキュベートすることにより試験した。ペプチドのＬＣ－ＭＳ分析は、効率的な遊離を示したが、生成物の約４０％がβ－Ｍｅとのジスルフィド付加物として生じたことも示した。付加物の程度は、より多量のモル過剰β－Ｍｅを使用すること、および／または還元を繰り返すことによって低減することができる可能性があると推論されたが、これは追加の作業ステップを必要とするため、最も関心が寄せられる経路ではなかった。樹脂からペプチドを遊離させ、ジスルフィド付加物を単一のステップで除去するために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤を使用することが提案されたが、これは、環状ＤＴＴを形成することで自らを除去するので、ジスルフィド付加物を形成しない。ペプチドＡｌａ－Ｔｒｐ－ＭｅａまたはＴｙｒ－Ａｌａ－Ｍｅａのいずれかを担持する樹脂を４当量のＤＴＴでインキュベートすることにより、ペプチド還元剤付加物を形成することなくペプチドが効率的に遊離されたが、ＤＴＴは標準的なスピードバックでの真空蒸発では除去できなかった。１９５℃で蒸発し、したがってより低い沸点を有する関連の還元剤は、１，４－ブタンジチオール（ＢＤＴ）である（ＰｕｂＣｈｅｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｍｐｏｕｎｄ／１＿４－Ｂｕｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ）、２０．０４．２１にアクセス）。５μｍｏｌの樹脂結合ペプチドを、４当量のＢＤＴ（１００ｍＭ）および４当量のＴＥＡ（１００ｍＭ）を含有する２００μｌのＤＭＦとインキュベートした。対照として、４つの樹脂結合ペプチドをＤＭＳＯ中２５０ｍＭ ＴＥＡである環化的遊離の条件で処理する、並行反応を実施した。ペプチドをＬＣ－ＭＳにより分析したところ、ＢＤＴによって効率的に遊離された。４つのペプチドすべてについて、所望の生成物に対応する主要なピークが観察された（図２ｂ）。２つのペプチドで確認された唯一の副生成物はペプチド二量体であり、これは３％未満の少量で生じた。所望の生成物の収率は、それぞれ３．４μｍｏｌ、１．３μｍｏｌ、４．２μｍｏｌおよび４．３μｍｏｌであり、これは６８％、２５％、８４％および８６％の収率に相当した（ビーズ上で合成されたペプチドの量を５μｍｏｌと仮定）。
【0111】
１．２．固相からの短いジチオールペプチドの還元的遊離
次に、フォーマットＭｐａ－Ｘａａ－Ｍｅａ（Ｍｐａ＝メルカプトプロパン酸）の８つの短いジチオールペプチドのパネルを合成したが、式中、Ｘａａアミノ酸はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、およびＡｌａであった。これらのペプチドに関しては、ジスルフィド架橋の還元によって遊離されるが、ジスルフィド環化メカニズムを介した効率的な遊離はないことが予想された。対照として、ジスルフィド環化を介して効率的に遊離されることが予想される、より長いペプチドＭｐａ－Ｌｙｓ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－βＡｌａ－Ｍｅａも合成した。樹脂を還元剤ＢＤＴとインキュベートすると、すべてのペプチドが効率的に遊離された（図３）。主な生成物は、所望のジチオールペプチドであった。副生成物は少量しか確認されず、トリチル保護基およびｔｅｒｔ－ブチル保護基を持つジチオールペプチドであった（図３）。環化的遊離のために樹脂をＤＭＳＯ中のＴＥＡとインキュベートすることにより、約１０～１００分の１の量の短いペプチドが得られ、多くの副生成物が生じた。予想したように、より長いペプチドのＭｐａ－Ｌｙｓ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－βＡｌａ－Ｍｅａは、おそらくは構造上の制約が小さいことから、環化的遊離メカニズムを介して効率的に遊離された。２８０ｎｍでの吸光度測定によって定量され得るペプチドＭｐａ－Ｔｒｐ－ＭｅａおよびＭｐａ－Ｔｒｐ－Ｍｅａの収量は、それぞれ３．６μｍｏｌおよび４．３μｍｏｌであり、これはそれぞれ、ペプチドが５μｍｏｌの量で樹脂上に存在することを仮定した際、７１％および８５％の収率に相当する。
次に、フォーマットＭｐａ－Ｘａａ－Ｍｅａ（Ｍｐａ＝メルカプトプロパン酸）の８つの短いジチオールペプチドのパネルを合成したが、式中、Ｘａａアミノ酸はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、およびＡｌａであった。これらのペプチドに関しては、ジスルフィド架橋の還元によって遊離されるが、ジスルフィド環化メカニズムを介した効率的な遊離はないことが予想された。対照として、ジスルフィド環化を介して効率的に遊離されることが予想される、より長いペプチドＭｐａ－Ｌｙｓ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－βＡｌａ－Ｍｅａも合成した。樹脂を還元剤ＢＤＴとインキュベートすると、すべてのペプチドが効率的に遊離された（図３）。主な生成物は、所望のジチオールペプチドであった。副生成物は少量しか確認されず、トリチル保護基およびｔｅｒｔ－ブチル保護基を持つジチオールペプチドであった（図３）。環化的遊離のために樹脂をＤＭＳＯ中のＴＥＡとインキュベートすることにより、約１０～１００分の１の量の短いペプチドが得られ、多くの副生成物が生じた。予想したように、より長いペプチドのＭｐａ－Ｌｙｓ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－βＡｌａ－Ｍｅａは、おそらくは構造上の制約が小さいことから、環化的遊離メカニズムを介して効率的に遊離された。２８０ｎｍでの吸光度測定によって定量され得るペプチドＭｐａ－Ｔｒｐ－ＭｅａおよびＭｐａ－Ｔｒｐ－Ｍｅａの収量は、それぞれ３．６μｍｏｌおよび４．３μｍｏｌであり、これはそれぞれ、ペプチドが５μｍｏｌの量で樹脂上に存在することを仮定した際、７１％および８５％の収率に相当する。
【0112】
１．３．真空下での溶媒および還元剤の蒸発
次に、還元剤ＢＤＴが真空下での遠心分離によって除去され得るかどうかを試験した。５μｍｏｌのスケールで合成され、１００ｍＭのＢＤＴおよび１００ｍＭのＴＥＡを含有する２００ｍＬのＤＭＦ中に遊離されたペプチドを、９６ウェルプレートのウェル内で０．１ｍｂａｒ、３０℃および４００×ｇにて遠心分離を行った。溶媒は、マイクロウェルプレートのすべてのウェルが充填されていた場合、１時間で効率的に除去された。ペプチドのＬＣ－ＭＳ分析からは、すべてのＢＤＴが除去されたことが明らかであった。しかし、一部のペプチドについては、最大１０％の生成物の一部が逆酸化されていることも確認された。酸化は高ｐＨによって起こり得ることが推測されたため、ＴＥＡに対して２当量のＴＦＡ（２００ｍＭ ＴＦＡ）を遠心真空蒸発の前に各ウェルに加えた。この手順により、酸化ペプチドの分画を効率的に抑制することができた。
次に、還元剤ＢＤＴが真空下での遠心分離によって除去され得るかどうかを試験した。５μｍｏｌのスケールで合成され、１００ｍＭのＢＤＴおよび１００ｍＭのＴＥＡを含有する２００ｍＬのＤＭＦ中に遊離されたペプチドを、９６ウェルプレートのウェル内で０．１ｍｂａｒ、３０℃および４００×ｇにて遠心分離を行った。溶媒は、マイクロウェルプレートのすべてのウェルが充填されていた場合、１時間で効率的に除去された。ペプチドのＬＣ－ＭＳ分析からは、すべてのＢＤＴが除去されたことが明らかであった。しかし、一部のペプチドについては、最大１０％の生成物の一部が逆酸化されていることも確認された。酸化は高ｐＨによって起こり得ることが推測されたため、ＴＥＡに対して２当量のＴＦＡ（２００ｍＭ ＴＦＡ）を遠心真空蒸発の前に各ウェルに加えた。この手順により、酸化ペプチドの分画を効率的に抑制することができた。
【0113】
１．４．ビス求電子試薬によるジチオールペプチドの環化
図４ａに示したように、短いジチオールペプチドのＭｐａ－Ｔｒｐ－ＭｅａおよびＭｐａ－Ｔｙｒ－Ｍｅａをビス求電子試薬によって環化することができるかどうかについて試験した。求電子リンカー試薬による２つまたは３つのシステインを介したペプチドの環化は、ペプチドを約１ｍＭ（またはそれ未満）の希釈濃度で実施し、環化試薬を少し過剰で適用した場合、非常に効率的でありクリーンである（Ｐ．Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５、６、８２１～８２４頁；Ｓ．Ｓ．Ｋａｌｅら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．、２０１８、１０、７１５～７２３頁）。ペプチドを１：１のアセトニトリル：水１ｍｌに溶解し、３ｍｌの９０％ＮＨ４ＨＣＯ３バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）、１０％アセトニトリルを添加し、アセトニトリル（１０ｍＭ）中の１ｍｌビス求電子試薬を直ちに添加した。図４ｂに示した合計１０種のビス求電子試薬を試験した。ペプチドおよび環化試薬の最終濃度は、それぞれ、約１ｍＭおよび２ｍＭであった。ペプチドＭｐａ－Ｔｒｐ－Ｍｅａによる環化反応のＨＰＬＣクロマトグラムを図４ｃに示す。ほとんどの反応において、ジチオールペプチドはほぼ定量的に環化され、収率は９０％を超えていた。少量の副生成物は、チオール基の１つがトリチルで保護されていたので、主として１つのチオール基だけと反応したペプチドであった。過剰のビス求電子試薬をクエンチするために、これらの試薬とは反応するが、大環状分子には影響しない６当量（ペプチドに対して）のβ－Ｍｅを添加した。
図４ａに示したように、短いジチオールペプチドのＭｐａ－Ｔｒｐ－ＭｅａおよびＭｐａ－Ｔｙｒ－Ｍｅａをビス求電子試薬によって環化することができるかどうかについて試験した。求電子リンカー試薬による２つまたは３つのシステインを介したペプチドの環化は、ペプチドを約１ｍＭ（またはそれ未満）の希釈濃度で実施し、環化試薬を少し過剰で適用した場合、非常に効率的でありクリーンである（Ｐ．Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５、６、８２１～８２４頁；Ｓ．Ｓ．Ｋａｌｅら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．、２０１８、１０、７１５～７２３頁）。ペプチドを１：１のアセトニトリル：水１ｍｌに溶解し、３ｍｌの９０％ＮＨ４ＨＣＯ３バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）、１０％アセトニトリルを添加し、アセトニトリル（１０ｍＭ）中の１ｍｌビス求電子試薬を直ちに添加した。図４ｂに示した合計１０種のビス求電子試薬を試験した。ペプチドおよび環化試薬の最終濃度は、それぞれ、約１ｍＭおよび２ｍＭであった。ペプチドＭｐａ－Ｔｒｐ－Ｍｅａによる環化反応のＨＰＬＣクロマトグラムを図４ｃに示す。ほとんどの反応において、ジチオールペプチドはほぼ定量的に環化され、収率は９０％を超えていた。少量の副生成物は、チオール基の１つがトリチルで保護されていたので、主として１つのチオール基だけと反応したペプチドであった。過剰のビス求電子試薬をクエンチするために、これらの試薬とは反応するが、大環状分子には影響しない６当量（ペプチドに対して）のβ－Ｍｅを添加した。
【0114】
１．５．考察
本明細書では、ジチオールペプチドを高純度かつ高濃度で供給することにより、ビス求電子試薬で容易に環化して大環状化合物およびライブラリーを合成することができるという固相ペプチド合成および溶出の方策が確立された。この方策における重要な要素は、ｉ）ジスルフィドリンカーを介したペプチドの合成、ｉｉ）固相での側鎖の脱保護、ｉｉｉ）ジスルフィド還元によるペプチドの遊離、およびｉｖ）蒸発によって除去することができ、その結果、ビス求電子試薬による環化を可能にする揮発性還元剤の使用、である。ジチオールペプチドを合成した後の精製ステップの省略とビス求電子試薬による環化により、多数の大環状化合物へのアクセスと、ハイスループットスクリーニングへのそれらの適用が可能になる。
本明細書では、ジチオールペプチドを高純度かつ高濃度で供給することにより、ビス求電子試薬で容易に環化して大環状化合物およびライブラリーを合成することができるという固相ペプチド合成および溶出の方策が確立された。この方策における重要な要素は、ｉ）ジスルフィドリンカーを介したペプチドの合成、ｉｉ）固相での側鎖の脱保護、ｉｉｉ）ジスルフィド還元によるペプチドの遊離、およびｉｖ）蒸発によって除去することができ、その結果、ビス求電子試薬による環化を可能にする揮発性還元剤の使用、である。ジチオールペプチドを合成した後の精製ステップの省略とビス求電子試薬による環化により、多数の大環状化合物へのアクセスと、ハイスループットスクリーニングへのそれらの適用が可能になる。
【0115】
１．６．材料および方法
２－（２－ピリジルジチオ）エチルアミン塩酸塩の合成
２，２’－ジピリジルジスルフィド（４．４１ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２％［ｖ／ｖ］ＡｃＯＨを含む１６ｍｌ）中の撹拌溶液に、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ、２％（ｖ／ｖ）ＡｃＯＨを含む）に溶解したシステアミン塩酸塩（１．１４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を滴下添加し、これを２％（ｖ／ｖ）ＡｃＯＨを含む１０ｍｌのＭｅＯＨに１５分間かけて溶解させる。反応混合物を室温（ＲＴ）で一晩撹拌し、減圧下で濃縮し、黄色のグリース状油を得た。残渣をＭｅＯＨ（１６ｍｌ）に溶解し、８本の５０ｍｌファルコンチューブに分注し、氷冷ジエチルエーテル（各チューブに４８ｍｌ）を添加することにより沈殿させた。このチューブを、－２０℃で３０分間インキュベートし、３４００ｘｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ ７５００６４４５ローターを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機で４０００ｒｐｍ、半径＝１９．２ｃｍ、防爆性）で、３０分間４℃にて遠心分離を行った。沈殿を８回繰り返した後に、生成物が無色生成物として得られた（収率＝９０％）。
２－（２－ピリジルジチオ）エチルアミン塩酸塩の合成
２，２’－ジピリジルジスルフィド（４．４１ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２％［ｖ／ｖ］ＡｃＯＨを含む１６ｍｌ）中の撹拌溶液に、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ、２％（ｖ／ｖ）ＡｃＯＨを含む）に溶解したシステアミン塩酸塩（１．１４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を滴下添加し、これを２％（ｖ／ｖ）ＡｃＯＨを含む１０ｍｌのＭｅＯＨに１５分間かけて溶解させる。反応混合物を室温（ＲＴ）で一晩撹拌し、減圧下で濃縮し、黄色のグリース状油を得た。残渣をＭｅＯＨ（１６ｍｌ）に溶解し、８本の５０ｍｌファルコンチューブに分注し、氷冷ジエチルエーテル（各チューブに４８ｍｌ）を添加することにより沈殿させた。このチューブを、－２０℃で３０分間インキュベートし、３４００ｘｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ ７５００６４４５ローターを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機で４０００ｒｐｍ、半径＝１９．２ｃｍ、防爆性）で、３０分間４℃にて遠心分離を行った。沈殿を８回繰り返した後に、生成物が無色生成物として得られた（収率＝９０％）。
【0116】
システアミン－ポリスチレン樹脂の調製
以下の手順では、ジスルフィドリンカーを介して固定化された約２ｍｍｏｌのシステアミンを有するポリスチレン樹脂の調製について説明するが、これは、５μｍｏｌスケールでの４×９６ペプチドの合成に十分である。４本の２０ｍｌプラスチックシリンジにそれぞれ５６３ｍｇの樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ポリスチレンＡ ＳＨ樹脂、２００～４００メッシュ、０．９５ｍｍｏｌ／グラム充填）を加えた。樹脂をＤＣＭ（１５ｍｌ）で洗浄し、次いでＭｅＯＨ／ＤＣＭ（７：３；１５ｍｌ）中で２０分間膨潤させた。ピリジル－システアミンジスルフィド（２．１０グラム、９．４２ｍｍｏｌ、４．４当量）をＭｅＯＨ（２３ｍｌ）に溶解し、次いでＤＣＭ（５３ｍｌ）に溶解した。その後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；４１０μｌ）を添加した。この溶液の１９ｍｌ容量をそれぞれのシリンジに注入し、次いでシリンジをＲＴで３時間振盪した。ピリジル－システアミン溶液を廃棄し、樹脂をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（７：３；２×２０ｍｌ）で洗浄し、次いでＤＭＦ（２×２０ｍｌ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ中の懸濁液として単一シリンジに合わせ、１．２ＭのＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液（１１．８ｍｌ）で５分間洗浄し、すべてのアミンを確実に中和させた。この溶液を廃棄し、樹脂をＤＭＦ（２×２０ｍｌ）で洗浄し、次いでＤＣＭ（４×２０ｍｌ）で洗浄し、真空下に一晩保持し、流動性粉末を得た。
以下の手順では、ジスルフィドリンカーを介して固定化された約２ｍｍｏｌのシステアミンを有するポリスチレン樹脂の調製について説明するが、これは、５μｍｏｌスケールでの４×９６ペプチドの合成に十分である。４本の２０ｍｌプラスチックシリンジにそれぞれ５６３ｍｇの樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ポリスチレンＡ ＳＨ樹脂、２００～４００メッシュ、０．９５ｍｍｏｌ／グラム充填）を加えた。樹脂をＤＣＭ（１５ｍｌ）で洗浄し、次いでＭｅＯＨ／ＤＣＭ（７：３；１５ｍｌ）中で２０分間膨潤させた。ピリジル－システアミンジスルフィド（２．１０グラム、９．４２ｍｍｏｌ、４．４当量）をＭｅＯＨ（２３ｍｌ）に溶解し、次いでＤＣＭ（５３ｍｌ）に溶解した。その後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；４１０μｌ）を添加した。この溶液の１９ｍｌ容量をそれぞれのシリンジに注入し、次いでシリンジをＲＴで３時間振盪した。ピリジル－システアミン溶液を廃棄し、樹脂をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（７：３；２×２０ｍｌ）で洗浄し、次いでＤＭＦ（２×２０ｍｌ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ中の懸濁液として単一シリンジに合わせ、１．２ＭのＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液（１１．８ｍｌ）で５分間洗浄し、すべてのアミンを確実に中和させた。この溶液を廃棄し、樹脂をＤＭＦ（２×２０ｍｌ）で洗浄し、次いでＤＣＭ（４×２０ｍｌ）で洗浄し、真空下に一晩保持し、流動性粉末を得た。
【0117】
９６ウェルプレートにおけるＦｍｏｃペプチド合成
ペプチドを、自動ペプチド合成装置（Ｉｎｔａｖｉｓ ＭｕｌｔｉＰｅｐ ＲＳｉ）を使用して、９６ウェルペプチド合成フィルタープレート（Ｏｒｏｃｈｅｍ、ｃａｔ．＃ ＯＦ１１００）で５μｍｏｌスケールにて合成した。システアミン－ＰＳ樹脂（約５ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ／ｇ、５μｍｏｌスケール）をプレートの各ウェルに粉末として分配した。樹脂をＤＭＦ（３×２２５μｌ）で洗浄した。この洗浄ステップと後のすべての洗浄ステップにおいて、樹脂を１分間インキュベートした。以下の試薬を指示した順序でチューブに移し、混合し、１分間インキュベートし、マイクロウェルプレート内の樹脂に移し、振盪することなく４５分間インキュベートした。試薬：５０μｌのＨＡＴＵ（ＤＭＦ中５００ｍＭ、５当量）、５μｌのＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、１２．５μｌのＮ－メチルモルホリン（ＤＭＦ中ＮＭＭ、４Ｍ、１０当量）および５３μｌのアミノ酸（ＤＭＦ中５００ｍＭ、５．３当量）。カップリング反応の最終容量は１２０．５μｌであり、試薬の最終濃度は、２０８ｍＭ ＨＡＴＵ、４１５ｍＭ ＮＭＭおよび２２０ｍＭ アミノ酸であった。カップリングは２回実施した。樹脂は、ＤＭＦ（１×２２５μｌ）を用いて洗浄した。未反応アミノ基は、５％無水酢酸および６％の２，６－ルチジンのＤＭＦ（１００μｌ）と、振盪することなく５分間インキュベートすることによってキャップ付加した。樹脂をＤＭＦ（８×２２５μｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを含有するＤＭＦ（１２０μＬ）で２回、それぞれ振盪することなく５分間インキュベートすることにより除去した。より長いペプチド配列の合成については、塩基への曝露を低減するため、インキュベーション時間を５分から２分に短縮した。樹脂をＤＭＦ（８×２２５μｌ）で洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂をＤＣＭ（２×２００μｌ）で洗浄した。
ペプチドを、自動ペプチド合成装置（Ｉｎｔａｖｉｓ ＭｕｌｔｉＰｅｐ ＲＳｉ）を使用して、９６ウェルペプチド合成フィルタープレート（Ｏｒｏｃｈｅｍ、ｃａｔ．＃ ＯＦ１１００）で５μｍｏｌスケールにて合成した。システアミン－ＰＳ樹脂（約５ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ／ｇ、５μｍｏｌスケール）をプレートの各ウェルに粉末として分配した。樹脂をＤＭＦ（３×２２５μｌ）で洗浄した。この洗浄ステップと後のすべての洗浄ステップにおいて、樹脂を１分間インキュベートした。以下の試薬を指示した順序でチューブに移し、混合し、１分間インキュベートし、マイクロウェルプレート内の樹脂に移し、振盪することなく４５分間インキュベートした。試薬：５０μｌのＨＡＴＵ（ＤＭＦ中５００ｍＭ、５当量）、５μｌのＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、１２．５μｌのＮ－メチルモルホリン（ＤＭＦ中ＮＭＭ、４Ｍ、１０当量）および５３μｌのアミノ酸（ＤＭＦ中５００ｍＭ、５．３当量）。カップリング反応の最終容量は１２０．５μｌであり、試薬の最終濃度は、２０８ｍＭ ＨＡＴＵ、４１５ｍＭ ＮＭＭおよび２２０ｍＭ アミノ酸であった。カップリングは２回実施した。樹脂は、ＤＭＦ（１×２２５μｌ）を用いて洗浄した。未反応アミノ基は、５％無水酢酸および６％の２，６－ルチジンのＤＭＦ（１００μｌ）と、振盪することなく５分間インキュベートすることによってキャップ付加した。樹脂をＤＭＦ（８×２２５μｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを含有するＤＭＦ（１２０μＬ）で２回、それぞれ振盪することなく５分間インキュベートすることにより除去した。より長いペプチド配列の合成については、塩基への曝露を低減するため、インキュベーション時間を５分から２分に短縮した。樹脂をＤＭＦ（８×２２５μｌ）で洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂をＤＣＭ（２×２００μｌ）で洗浄した。
【0118】
９６ウェルプレートにおけるペプチド側鎖脱保護
アミノ酸側鎖から、ならびにＭｅａから保護基を除去するために、９６ウェル合成プレートの底を、厚さ６ｍｍの柔らかいエチレン－酢酸ビニルパッドにプレートを押し付けて密閉し、各ウェル内の樹脂をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２０（９５：２．５：２．５［ｖ／ｖ／ｖ］、約３００μｌ）の溶液とインキュベートした。プレートを粘着シールフィルム（ｉＳＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕｉｃｋＳｅａｌ Ｍｉｃｒｏ、ｃａｔ．＃ ＩＳＴ－１２５－０８０－ＬＳ）で覆い、漏れを防ぐために重り（１ｋｇ）を上部に置いて重くした。１時間インキュベーションした後、合成プレートを２ｍｌディープウェルプレート上に置き、ＴＦＡ混合物を排出させた。合成プレートを再度密閉し、脱保護の手順を繰り返した。重力流によってウェルに流すＤＣＭ（３×５００μｌ；シリンジにより添加）でウェルを洗浄した。合成プレートを真空マニホールドに５分間置くことにより、樹脂を乾燥させた。
アミノ酸側鎖から、ならびにＭｅａから保護基を除去するために、９６ウェル合成プレートの底を、厚さ６ｍｍの柔らかいエチレン－酢酸ビニルパッドにプレートを押し付けて密閉し、各ウェル内の樹脂をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２０（９５：２．５：２．５［ｖ／ｖ／ｖ］、約３００μｌ）の溶液とインキュベートした。プレートを粘着シールフィルム（ｉＳＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕｉｃｋＳｅａｌ Ｍｉｃｒｏ、ｃａｔ．＃ ＩＳＴ－１２５－０８０－ＬＳ）で覆い、漏れを防ぐために重り（１ｋｇ）を上部に置いて重くした。１時間インキュベーションした後、合成プレートを２ｍｌディープウェルプレート上に置き、ＴＦＡ混合物を排出させた。合成プレートを再度密閉し、脱保護の手順を繰り返した。重力流によってウェルに流すＤＣＭ（３×５００μｌ；シリンジにより添加）でウェルを洗浄した。合成プレートを真空マニホールドに５分間置くことにより、樹脂を乾燥させた。
【0119】
β－Ｍｅ、ＤＴＴ、またはＢＤＴによる還化的ペプチド遊離
ペプチドを樹脂から遊離させるため、９６ウェル合成プレートの底を、厚さ６ｍｍの柔らかいエチレン－酢酸ビニルパッドにプレートを押し付けて密閉し、各ウェル内の樹脂を、５００ｍＭのβ－Ｍｅ、または１００ｍＭのＤＴＴ、または１００ｍＭのＢＤＴ、および１００ｍＭのＴＥＡを含有する２００ｍｌのＤＭＦ溶液で４時間ＲＴにてインキュベートした。この後、２５０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ ７５００６４４５ローターを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心機で１１００ｒｐｍ、半径＝１９．２ｃｍローター）で、２時間ＲＴにて遠心分離を行うことにより、サンプルを９６ディープウェルプレート内で回収した。
ペプチドを樹脂から遊離させるため、９６ウェル合成プレートの底を、厚さ６ｍｍの柔らかいエチレン－酢酸ビニルパッドにプレートを押し付けて密閉し、各ウェル内の樹脂を、５００ｍＭのβ－Ｍｅ、または１００ｍＭのＤＴＴ、または１００ｍＭのＢＤＴ、および１００ｍＭのＴＥＡを含有する２００ｍｌのＤＭＦ溶液で４時間ＲＴにてインキュベートした。この後、２５０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ ７５００６４４５ローターを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心機で１１００ｒｐｍ、半径＝１９．２ｃｍローター）で、２時間ＲＴにて遠心分離を行うことにより、サンプルを９６ディープウェルプレート内で回収した。
【0120】
ペプチドの環化的遊離
９６ウェル合成プレートを上記のようにして密閉し、２５０ｍＭのＴＥＡ（１０当量）を含有する２００μｌのＤＭＳＯ溶液で一晩ＲＴにてインキュベートすることにより、ペプチドを樹脂から遊離させた。この後、２５０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ ７５００６４４５ローターを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心機で１１００ｒｐｍ、半径＝１９．２ｃｍローター）で、２時間ＲＴにて遠心分離を行うことにより、サンプルを９６ディープウェルプレート内で回収した。
９６ウェル合成プレートを上記のようにして密閉し、２５０ｍＭのＴＥＡ（１０当量）を含有する２００μｌのＤＭＳＯ溶液で一晩ＲＴにてインキュベートすることにより、ペプチドを樹脂から遊離させた。この後、２５０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ ７５００６４４５ローターを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心機で１１００ｒｐｍ、半径＝１９．２ｃｍローター）で、２時間ＲＴにて遠心分離を行うことにより、サンプルを９６ディープウェルプレート内で回収した。
【0121】
固相遊離または環化後のペプチドのＬＣ－ＭＳ分析
固相から遊離されたペプチド（ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中の濃度は最大２５ｍＭ）については、１μｌのペプチドを、０．０５％ギ酸を含有する６０μｌのｍｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで希釈した。環化反応からのペプチド（濃度は約１ｍＭ）については、１０μｌの反応混合物を、０．０５％ギ酸を含有する１０μｌのｍｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏと混合した。サンプル（１０μｌ注入）は、逆相Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）、２．６μｍ、１００Å、５０×２．１ｍｍ）と、溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ、０．０５％ギ酸））の溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ、０．０５％ギ酸）に対する直線勾配を使用し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ２０２０シングル四重極ＬＣ－ＭＳシステムで、１ｍｌ／分の流速で５分間０から６０％まで分析した。吸光度を２２０ｎｍで記録し、質量はポジティブモードで分析した。
固相から遊離されたペプチド（ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中の濃度は最大２５ｍＭ）については、１μｌのペプチドを、０．０５％ギ酸を含有する６０μｌのｍｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで希釈した。環化反応からのペプチド（濃度は約１ｍＭ）については、１０μｌの反応混合物を、０．０５％ギ酸を含有する１０μｌのｍｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏと混合した。サンプル（１０μｌ注入）は、逆相Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）、２．６μｍ、１００Å、５０×２．１ｍｍ）と、溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ、０．０５％ギ酸））の溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ、０．０５％ギ酸）に対する直線勾配を使用し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ２０２０シングル四重極ＬＣ－ＭＳシステムで、１ｍｌ／分の流速で５分間０から６０％まで分析した。吸光度を２２０ｎｍで記録し、質量はポジティブモードで分析した。
【0122】
還元剤および溶媒の真空遠心蒸発
以下の例では、還元的遊離の後に２０ｍＭの濃度を有していたペプチドについて説明する。還元によって固相から遊離された２００μｌのペプチド（１００ｍＭのＢＤＴおよび１００ｍＭのＴＥＡを含有するＤＭＦ中）のうち、５μｌ（０．１μｍｏｌ）をＶ底９６ウェルプレート（Ｒａｔｉｏｌａｂ、６０１８３２１、ＰＰ、未滅菌）のウェルに移した。７μｌ容量の１％ＴＦＡ水溶液（ｖ／ｖ）を各ウェルに添加し、ＴＥＡに対してＴＦＡが２当量になるようにした。このサンプルを、Ｃｈｒｉｓｔ ＲＶＣ ２－３３ ＣＤｐｌｕｓ ＩＲ装置を使用して真空遠心蒸発に供し、溶媒（ＤＭＦ）および還元剤（ＢＤＴ）を除去した。サンプルを、０．１ｍｂａｒ、３０℃、４００×ｇ（１２４７０８プレートホルダーインサートを備えたＣｈｒｉｓｔ １２４７００ローターで１７５０ｒｐｍ、半径＝１０．５ｃｍ）で遠心分離を行った。ペプチドは、このステップの後に見えなくなった。
以下の例では、還元的遊離の後に２０ｍＭの濃度を有していたペプチドについて説明する。還元によって固相から遊離された２００μｌのペプチド（１００ｍＭのＢＤＴおよび１００ｍＭのＴＥＡを含有するＤＭＦ中）のうち、５μｌ（０．１μｍｏｌ）をＶ底９６ウェルプレート（Ｒａｔｉｏｌａｂ、６０１８３２１、ＰＰ、未滅菌）のウェルに移した。７μｌ容量の１％ＴＦＡ水溶液（ｖ／ｖ）を各ウェルに添加し、ＴＥＡに対してＴＦＡが２当量になるようにした。このサンプルを、Ｃｈｒｉｓｔ ＲＶＣ ２－３３ ＣＤｐｌｕｓ ＩＲ装置を使用して真空遠心蒸発に供し、溶媒（ＤＭＦ）および還元剤（ＢＤＴ）を除去した。サンプルを、０．１ｍｂａｒ、３０℃、４００×ｇ（１２４７０８プレートホルダーインサートを備えたＣｈｒｉｓｔ １２４７００ローターで１７５０ｒｐｍ、半径＝１０．５ｃｍ）で遠心分離を行った。ペプチドは、このステップの後に見えなくなった。
【0123】
ペプチドの環化
還元し乾燥したペプチド（０．１μｍｏｌ）を２０μｌの５０％アセトニトリル、５０％Ｈ２Ｏに溶解し、濃度を５ｍＭとした。この溶液に、６０μｌの反応バッファー（１０％アセトニトリル［ｖ／ｖ］を含有する１００ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０）を添加し、続いてアセトニトリル中の１０ｍＭ環化リンカー２０μｌ（２当量）を添加した。反応液の最終濃度は、１ｍＭのペプチド、２ｍＭの環化リンカー、６０ｍＭの重炭酸アンモニウムバッファー、および３５％のアセトニトリルであった。プレートをホイルシールで覆い、反応物をＲＴで２時間インキュベートした。
還元し乾燥したペプチド（０．１μｍｏｌ）を２０μｌの５０％アセトニトリル、５０％Ｈ２Ｏに溶解し、濃度を５ｍＭとした。この溶液に、６０μｌの反応バッファー（１０％アセトニトリル［ｖ／ｖ］を含有する１００ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０）を添加し、続いてアセトニトリル中の１０ｍＭ環化リンカー２０μｌ（２当量）を添加した。反応液の最終濃度は、１ｍＭのペプチド、２ｍＭの環化リンカー、６０ｍＭの重炭酸アンモニウムバッファー、および３５％のアセトニトリルであった。プレートをホイルシールで覆い、反応物をＲＴで２時間インキュベートした。
【0124】
環化反応におけるリンカー試薬のクエンチング
環化反応の完了後、アセトニトリル中の１５０ｍＭ β－Ｍｅ（０．６μｍｏｌ、ペプチドに対して６当量）の４μｌを反応混合物に添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。溶媒（ＭｅＣＮ）、バッファー（重炭酸塩）および過剰のβ－Ｍｅを、Ｃｈｒｉｓｔ ＲＶＣ ２－３３ ＣＤｐｌｕｓ ＩＲ装置を使用して真空遠心蒸発により除去した。サンプルを、０．１ｍｂａｒ、３０℃、４００×ｇ（１２４７０８プレートホルダーインサートを備えたＣｈｒｉｓｔ １２４７００ローターで１７５０ｒｐｍ、半径＝１０．５ｃｍ）で遠心分離した。ペプチドは、このステップの後に見えなくなった。
環化反応の完了後、アセトニトリル中の１５０ｍＭ β－Ｍｅ（０．６μｍｏｌ、ペプチドに対して６当量）の４μｌを反応混合物に添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。溶媒（ＭｅＣＮ）、バッファー（重炭酸塩）および過剰のβ－Ｍｅを、Ｃｈｒｉｓｔ ＲＶＣ ２－３３ ＣＤｐｌｕｓ ＩＲ装置を使用して真空遠心蒸発により除去した。サンプルを、０．１ｍｂａｒ、３０℃、４００×ｇ（１２４７０８プレートホルダーインサートを備えたＣｈｒｉｓｔ １２４７００ローターで１７５０ｒｐｍ、半径＝１０．５ｃｍ）で遠心分離した。ペプチドは、このステップの後に見えなくなった。
【実施例2】
【0125】
実施例２－環化的遊離
２．１．結果および考察
最初の実験で、ジスルフィド架橋を介して固相に繋がれた短いペプチドの合成について、様々な樹脂を試験した。ペプチドＭｐａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｍｅａが５種類の異なる樹脂上で合成されたが、式中、Ｍｐａはメルカプトプロパン酸（アミノ基を持たないシステイン）、Ｍｅａは２－メルカプト－エチルアミン（システアミン；カルボン酸を持たないシステイン）である（図５ｂ）。極性である２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）樹脂（１、２）、同じく極性である１つのＰＥＧ修飾ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、および無極性である２つのＰＳ樹脂（４および５）を使用した。樹脂５は既にチオール基を含んでおり、樹脂１～４に関しては、アミド化によりトリチル保護されたＭｐａを付加することでチオール基が導入された。ジスルフィド結合したＭｅａは、過剰の２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミンと樹脂をインキュベートすることによって導入された。ジスルフィド交換反応は、メタノール（ＭｅＯＨ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）混合物中で、およびＤＭＦ中で、塩基または酸の存在下で試験され、３０％のＭｅＯＨ、７０％のＤＣＭおよび１当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミンに対して）の条件が最適であることが確認された。３つのアミノ酸Ｔｒｐ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ、およびＭｐａを、標準的なＦｍｏｃ化学を使用して付加し、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、および２．５％の水と樹脂を１時間インキュベートすることによって側鎖保護基を除去した。
２．１．結果および考察
最初の実験で、ジスルフィド架橋を介して固相に繋がれた短いペプチドの合成について、様々な樹脂を試験した。ペプチドＭｐａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｍｅａが５種類の異なる樹脂上で合成されたが、式中、Ｍｐａはメルカプトプロパン酸（アミノ基を持たないシステイン）、Ｍｅａは２－メルカプト－エチルアミン（システアミン；カルボン酸を持たないシステイン）である（図５ｂ）。極性である２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）樹脂（１、２）、同じく極性である１つのＰＥＧ修飾ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、および無極性である２つのＰＳ樹脂（４および５）を使用した。樹脂５は既にチオール基を含んでおり、樹脂１～４に関しては、アミド化によりトリチル保護されたＭｐａを付加することでチオール基が導入された。ジスルフィド結合したＭｅａは、過剰の２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミンと樹脂をインキュベートすることによって導入された。ジスルフィド交換反応は、メタノール（ＭｅＯＨ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）混合物中で、およびＤＭＦ中で、塩基または酸の存在下で試験され、３０％のＭｅＯＨ、７０％のＤＣＭおよび１当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミンに対して）の条件が最適であることが確認された。３つのアミノ酸Ｔｒｐ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ、およびＭｐａを、標準的なＦｍｏｃ化学を使用して付加し、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、および２．５％の水と樹脂を１時間インキュベートすることによって側鎖保護基を除去した。
【0126】
次に、ＤＩＰＥＡを塩基として使用して、ペプチドのＮ末端のスルフヒドリル基を脱プロトン化することにより、環化ジスルフィド遊離を試験した。１５０ｍＭのＤＩＰＥＡを含むＤＭＳＯ中で樹脂をインキュベーションすることにより、無極性樹脂４および５の場合、非常に効率的な遊離がもたらされた（図５ｃ）。溶出液中のペプチドの濃度は、それぞれ、５．１ｍＭ（樹脂４）および１１．６ｍＭ（樹脂５）であった。遊離されたペプチドの量は、樹脂の充填量に基づいて合成されると予想される量の２１±５％（樹脂４）および４４±４％（樹脂５）であった。ジスルフィドリンカーの導入が定量的ではなかった可能性が高いことを考えると、既にチオール基を持った樹脂（樹脂５）であっても、環化的遊離メカニズムによって回収されたペプチドのパーセンテージは、４４％より高かったと思われる。生成物のＬＣ－ＭＳ分析から、ジスルフィド環化ペプチドについては、９５±４％（樹脂４）および９３±１％（樹脂５）の高純度であることが示された（図５ｄ）。唯一の副生成物は環状ペプチド二量体であり、平均６％と少量しか確認されなかった。この二量体環状生成物は、ジスルフィド交換を介した樹脂上の１つのペプチドの隣接するペプチドへの転移と、それに続く環状二量体の環化的遊離によって形成された可能性が最も高い。
【0127】
環化的ジスルフィド遊離方策の基質範囲を評価するため、フォーマットＭｐａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｍｅａの４つのペプチドを２５μｍｏｌスケールで合成した（図６ａ）。４つのペプチドのうち３つの「Ｘａａ」の位置に、ペプチドの骨格に剛性を与えるアミノ酸ビルディングブロックが挿入された。塩基誘導性の環化的遊離によって得られた生成物のＨＰＬＣ分析では、４つのペプチドのそれぞれに主要なピークが見られ、ＭＳ分析によって、これらの主な生成物が所望の環状ペプチドであることが確認された。吸光度測定により、４つのペプチドはすべて２桁のミリモル濃度で得られたことが明らかであった。過度の凍結乾燥後の重量測定による生成物の定量により、１３．５～２６μｍｏｌの範囲の収率であることが明らかとなったが、これは樹脂充填量に基づいて予想される収率の５４％～１００％に相当する。４つのペプチドすべてについて、数の限られた副生成物しか確認されず、それらは少量であった（図６ｂおよび図６ｃ）。主な副生成物は環状二量体であり、今回は２つの近接したピークとして溶出したが、これは、２つの可能性のある二量体、１つはヘッド・トゥー・ヘッド／テール・トゥー・テールに連結したもの、もう１つはヘッド・トゥー・テールに連結したものに対応している可能性が高いと考えられる。ＴＣＥＰによる生成物の直鎖化およびＨＰＬＣ分析により、ペプチド１～４について、それぞれ９６％、９６％、１００％および９２％の純度を持つ直鎖状ペプチド生成物が示された（図６ｂ、右のクロマトグラム）。ＴＣＥＰ直鎖化実験からは、二量体環状ペプチドが、分子内環化に有利な濃度で還元とそれに続く酸化的再環化によって除去できることが示唆された。環化的遊離方策に従ってさらに短いペプチドが生成できるかどうかを試験するため、フォーマットＭｐａ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｍｅａで、したがって１アミノ酸短い４つのペプチドで実験を繰り返した。４つのペプチドもまた効率的に遊離され、ＨＰＬＣプロファイルのメインピークは所望の環状ペプチドであった。環状二量体の割合は全体的にわずかに高かったが、おそらくは、短い骨格によって妨げられた環状化の効率が低いことと、その結果生じる立体構造上の制約による可能性が高いと思われる。
【0128】
環化的ジスルフィド遊離方策がライブラリーの合成およびスクリーニングに適用され得るかどうかを評価するため、環状ペプチドを設計し、９６ウェルプレート内で、５μｍｏｌスケールで合成した。３つのフォーマットの９６個のランダムなジスルフィド環化ペプチドが、図７ａに示すように調製された。このペプチドは、ＭｐａとＭｅａに隣接された３つのランダムなアミノ酸Ｘａａを含有する。各ペプチド内のランダムアミノ酸のうち２つは、高度に多様な環状ペプチド骨格をもたらす構造的に多様な４つのアミノ酸から選択された。ランダムアミノ酸の１つはＴｒｐまたはＴｙｒであり、２８０ｎｍでの吸収測定によるペプチド収率の定量化が可能になった。２００μｌのＤＭＳＯ中の１５０ｍＭのＤＩＰＥＡを添加することによるペプチドの環化的遊離と、それに続く吸収測定によって、１３．３ｍＭの高い平均ペプチド濃度と、９０個のペプチドに関して８．９ｍＭ（平均より１．５倍低い）から２０ｍＭ（平均より１．５倍高い）の間の狭い濃度分布が示された。ペプチドのうち３つは、合成されず、まったく遊離されなかった。１２のランダムに選択した環状ペプチドをＬＣ－ＭＳにより分析することにより、平均８４％の高純度が示された。
【0129】
環状ペプチドの数がわずか９６個と比較的少なく、したがって活性化合物を発見する可能性が低いにもかかわらず、本発明者らは、抗凝固治療薬開発の重要な標的であるトロンビンに対して、約１０μＭの化合物濃度を使用してスクリーニングを実施した。最も活性のあるペプチドはトロンビン活性を５２％低下させたが、これは、ペプチドがトロンビン特異性ポケットＳ１に結合するアミノ酸ＡｒｇおよびＬｙｓを含有しないことを考慮すると注目すべきことであった（図７ｃ）。スクリーニングの繰返しにより、同じ環状ペプチドが最も活性の高いヒットとして同定された（図７ｃの緑色の点）。ＨＰＬＣ精製されたジスルフィド環化ペプチドＭｐａ－Ｔｙｒ－ＩＩ－Ｐｒｏ－Ｍｅａは、１３±１μＭのＫｉでトロンビンを阻害した。小規模スクリーニングでは、ほとんどの環状ペプチドがトロンビン活性に影響を及ぼさないことが明らかになったが、このことは、環化的遊離後のペプチドストック中に存在するＤＭＳＯおよびＤＩＰＥＡを含め、ペプチドとともに溶出された、生物学的アッセイを妨げる成分が存在しなかったことを示唆している。生物学的スクリーニングは、典型的には、約１０μＭの化合物濃度で実施され、これは、約１０ｍＭのペプチドストック中の１００％ＤＭＳＯおよび１５０ｍＭのＤＩＰＥＡが１０００倍希釈されて、それぞれ０．１％および１５０μＭの濃度に達するが、ほとんどの生物学的アッセイに影響を及ぼすことはまずないことを意味する。
【0130】
２．２．結論
要約すると、固体支持体から直接的に高純度のジスルフィド環化ペプチドを得るという、ジスルフィド交換反応に基づいた環化的ペプチド遊離方策が本明細書で開発された。本発明者らの知る限り、これは、環状ペプチドライブラリーが高純度で、しかも蒸発により除去され得る切断試薬を用いて遊離される初めてのアプローチであり、その結果、ペプチドは、事前精製することなく、バイオアッセイを使用して容易にスクリーニングされ得る。重要なのは、異なる配列を持つペプチドの収率が狭い分布を示したことであり、濃度を決定または調整しなくとも環状ペプチドのスクリーニングが可能になったことである。このアプローチは、数百のペプチドを含むライブラリーの生成に適用可能であることを示している。
要約すると、固体支持体から直接的に高純度のジスルフィド環化ペプチドを得るという、ジスルフィド交換反応に基づいた環化的ペプチド遊離方策が本明細書で開発された。本発明者らの知る限り、これは、環状ペプチドライブラリーが高純度で、しかも蒸発により除去され得る切断試薬を用いて遊離される初めてのアプローチであり、その結果、ペプチドは、事前精製することなく、バイオアッセイを使用して容易にスクリーニングされ得る。重要なのは、異なる配列を持つペプチドの収率が狭い分布を示したことであり、濃度を決定または調整しなくとも環状ペプチドのスクリーニングが可能になったことである。このアプローチは、数百のペプチドを含むライブラリーの生成に適用可能であることを示している。
【実施例3】
【0131】
実施例３－環状ペプチドライブラリーのサイズの大規模な拡張
３．１．周辺アミンを介した環状ペプチド足場のアシル化
図８ａに示したコンビナトリアルで多様化する大環状ライブラリーについては、周辺基として機能するアミンと、カルボン酸であるフラグメントを修飾することを選択した。Ｎ－アセチル化反応は効率的かつ選択的であり、ＤＮＡコード化の化学ライブラリーの合成に広く適用されている（Ｐ．Ｒ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２０２０）。Ｎ－アセチル化は、溶液中のカルボン酸のパネルによって、続いて粗反応の活性スクリーニングによって（Ａ．Ｂｒｉｋら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００２、９、８９１～８９６頁）、またはＸ線結晶学的分析によって（Ｍ．Ｒ．Ｂｅｎｔｌｅｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０２０、６３、６８６３～６８７５頁）、リード構造の多様化にも使用された。この反応は、周辺基として第一級アミンを持つモデル足場シクロ（Ｍｅａ－Ｌｙｓ－Ｘａａ－Ｍｐａ）（図８ｂ）と、８つの構造的に多様なカルボン酸（図８ｃ）を用いて試験した。足場を所望の生成物に効率的に変換するため、足場を４倍モル過剰のカルボン酸と反応させることを選択した。足場の生成物へのほぼ定量的な変換が望まれていたが、それは、非修飾足場がアシル化足場よりも豊富であった場合、結合が弱くスクリーニングの妨げになる可能性があるからである。カルボン酸の過剰は、スクリーニングの際に存在し得る非反応性カルボン酸につながるが、ほとんどのカルボン酸はそのサイズが小さいため、それ自体では標的に結合しないと推察された。予想されるアシル化反応の唯一の副生成物は、過剰のカルボン酸、ＨＯＢｔ、およびテトラメチル尿素であり、いずれも生化学的アッセイには適合しないはずである。環状ペプチド足場（最終濃度１０ｍＭ）を、活性化剤としてＨＢＴＵを、塩基としてＤＩＰＥＡを使用し、４μｌの容量で４倍モル過剰の８つの酸と３時間インキュベートしたところ、ほぼすべての酸で足場の完全な変換が確認された（図８ｃの上の数字）。
３．１．周辺アミンを介した環状ペプチド足場のアシル化
図８ａに示したコンビナトリアルで多様化する大環状ライブラリーについては、周辺基として機能するアミンと、カルボン酸であるフラグメントを修飾することを選択した。Ｎ－アセチル化反応は効率的かつ選択的であり、ＤＮＡコード化の化学ライブラリーの合成に広く適用されている（Ｐ．Ｒ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２０２０）。Ｎ－アセチル化は、溶液中のカルボン酸のパネルによって、続いて粗反応の活性スクリーニングによって（Ａ．Ｂｒｉｋら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００２、９、８９１～８９６頁）、またはＸ線結晶学的分析によって（Ｍ．Ｒ．Ｂｅｎｔｌｅｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０２０、６３、６８６３～６８７５頁）、リード構造の多様化にも使用された。この反応は、周辺基として第一級アミンを持つモデル足場シクロ（Ｍｅａ－Ｌｙｓ－Ｘａａ－Ｍｐａ）（図８ｂ）と、８つの構造的に多様なカルボン酸（図８ｃ）を用いて試験した。足場を所望の生成物に効率的に変換するため、足場を４倍モル過剰のカルボン酸と反応させることを選択した。足場の生成物へのほぼ定量的な変換が望まれていたが、それは、非修飾足場がアシル化足場よりも豊富であった場合、結合が弱くスクリーニングの妨げになる可能性があるからである。カルボン酸の過剰は、スクリーニングの際に存在し得る非反応性カルボン酸につながるが、ほとんどのカルボン酸はそのサイズが小さいため、それ自体では標的に結合しないと推察された。予想されるアシル化反応の唯一の副生成物は、過剰のカルボン酸、ＨＯＢｔ、およびテトラメチル尿素であり、いずれも生化学的アッセイには適合しないはずである。環状ペプチド足場（最終濃度１０ｍＭ）を、活性化剤としてＨＢＴＵを、塩基としてＤＩＰＥＡを使用し、４μｌの容量で４倍モル過剰の８つの酸と３時間インキュベートしたところ、ほぼすべての酸で足場の完全な変換が確認された（図８ｃの上の数字）。
【0132】
３．２．ナノリットル容量での大環状ライブラリー合成
同じ環状ペプチド足場のコンビナトリアル多様化を、８０ｎｌ、したがって５０分の１の容量で続いて試験した。このステップは、少量のナノモルスケールでライブラリーを生成することを計画したので不可欠であったが、その結果、９６ウェルプレートのウェル（５μｍｏｌスケール）で容易に合成することができるマイクロモル量の足場は、１つの足場から１００を超える大環状分子を合成するのに十分であった。さらに、試薬を移すのにアコースティック分注技術を適用することを目指したが、これはナノリットル容量を移すのに適しているものの、マイクロリットル容量を移すのには適していない。アコースティック分注には、試薬を非接触で移すことができるという大きな利点があり、ピペッティングチップは必要なく、分注のスピードが速く、廃棄物およびコストが削減される。同じ反応条件の適用により、収率が大幅に低下し（図８ｃの２つの下の数値のうちの最初の数値）、アシル化反応の最適化が求められた。低収率はＤＩＰＥＡの使用に関連していると仮説を立てたが、それは、塩基が比較的揮発性であり、音波によって２．５ｎｌの液滴として分注された場合に部分的に失われるからである。試験は、不揮発性塩基のＤＡＢＣＯとＨＥＰＥＳのナトリウム塩、および使用される溶媒系への溶解度が高く、より高濃度で適用され得る揮発性ＮＭＭを用いて実施した。３つの塩基すべてで、大環状分子は、試験した３つの酸で定量的にアシル化され、さらなる酸にＤＡＢＣＯを適用すると、その条件が環状ペプチドの周辺アミンの効率的な修飾に適していることが示された（図８ｃの２つの下の数字のうち２番目）。
同じ環状ペプチド足場のコンビナトリアル多様化を、８０ｎｌ、したがって５０分の１の容量で続いて試験した。このステップは、少量のナノモルスケールでライブラリーを生成することを計画したので不可欠であったが、その結果、９６ウェルプレートのウェル（５μｍｏｌスケール）で容易に合成することができるマイクロモル量の足場は、１つの足場から１００を超える大環状分子を合成するのに十分であった。さらに、試薬を移すのにアコースティック分注技術を適用することを目指したが、これはナノリットル容量を移すのに適しているものの、マイクロリットル容量を移すのには適していない。アコースティック分注には、試薬を非接触で移すことができるという大きな利点があり、ピペッティングチップは必要なく、分注のスピードが速く、廃棄物およびコストが削減される。同じ反応条件の適用により、収率が大幅に低下し（図８ｃの２つの下の数値のうちの最初の数値）、アシル化反応の最適化が求められた。低収率はＤＩＰＥＡの使用に関連していると仮説を立てたが、それは、塩基が比較的揮発性であり、音波によって２．５ｎｌの液滴として分注された場合に部分的に失われるからである。試験は、不揮発性塩基のＤＡＢＣＯとＨＥＰＥＳのナトリウム塩、および使用される溶媒系への溶解度が高く、より高濃度で適用され得る揮発性ＮＭＭを用いて実施した。３つの塩基すべてで、大環状分子は、試験した３つの酸で定量的にアシル化され、さらなる酸にＤＡＢＣＯを適用すると、その条件が環状ペプチドの周辺アミンの効率的な修飾に適していることが示された（図８ｃの２つの下の数字のうち２番目）。
【0133】
次のステップにおいて、アシル化反応を他の大環状化合物を使用して試験した。詳しくは、モデル足場のシクロ（Ｍｐａ－Ｌｙｓ－Ｘａａ－Ｍｅａ）の１つよりもアミノ基の露出が少ない大環状骨格を選択した。この目的のために、Ｅｎａｍｉｎｅ社により提供される４つの大環状化合物をオーダーした（１３ａ）。これらのすべての化合物は、アミノ酸以外のビルディングブロックを含有する、非ペプチド大環状化合物である。同じ反応条件および酸を使用したアシル化反応（図１３ｂ）は、大環状足場からカルボン酸を持つ大環状分子への効率的な変換を示した（図１３ｃ）。
【0134】
３．３．アミン基を持つ環状ペプチド足場の合成
次に、９６ウェルプレートで多数の小さな環状ペプチドを効率的に生成するために最近開発されたアプローチを使用して、ランダム構造と１つの周辺アミノ基を有する環状ペプチド足場を合成した。簡単に説明すると、短いペプチドを固相上で合成し、ジスルフィド環化反応によって遊離させて、さらなる精製の必要のない本質的に純粋な足場を得る（図９ａ）。変化した次の３つのアミノ酸、１つは側鎖に第一級アミンを持つアミノ酸（７個のａａから選択）、１つはランダムな側鎖を持つα－アミノ酸（１５個のａａから選択）、および１つはランダムな骨格構造を有するもの（６個のａａから選択）を含有する環状ペプチド足場の第１のライブラリーを生成した（図９ｂおよび図９ｃ；サブライブラリー１ａ～ｆ）。また、第一級アミノ基がシステイン残基を介して導入された第２のライブラリーを合成した。示したアミノ酸を使用してコンビナトリアルな方法で理論的に組み立てることができる３，２４０種（ライブラリー１）および５４０種（ライブラリー２）の異なる足場のうち、３８４種をランダムに選択し、それらを４つの９６ウェルプレートで合成した。Ｔｒｐ残基を含有する４５個の環状ペプチドを吸収により定量したところ、ほとんどの分子が十分な量で得られたことが示された（平均濃度＝８．１ｍＭ；図９ｄ）。収率の分布が比較的狭い状況から、さらなる使用のために濃度は正規化しなかった。
次に、９６ウェルプレートで多数の小さな環状ペプチドを効率的に生成するために最近開発されたアプローチを使用して、ランダム構造と１つの周辺アミノ基を有する環状ペプチド足場を合成した。簡単に説明すると、短いペプチドを固相上で合成し、ジスルフィド環化反応によって遊離させて、さらなる精製の必要のない本質的に純粋な足場を得る（図９ａ）。変化した次の３つのアミノ酸、１つは側鎖に第一級アミンを持つアミノ酸（７個のａａから選択）、１つはランダムな側鎖を持つα－アミノ酸（１５個のａａから選択）、および１つはランダムな骨格構造を有するもの（６個のａａから選択）を含有する環状ペプチド足場の第１のライブラリーを生成した（図９ｂおよび図９ｃ；サブライブラリー１ａ～ｆ）。また、第一級アミノ基がシステイン残基を介して導入された第２のライブラリーを合成した。示したアミノ酸を使用してコンビナトリアルな方法で理論的に組み立てることができる３，２４０種（ライブラリー１）および５４０種（ライブラリー２）の異なる足場のうち、３８４種をランダムに選択し、それらを４つの９６ウェルプレートで合成した。Ｔｒｐ残基を含有する４５個の環状ペプチドを吸収により定量したところ、ほとんどの分子が十分な量で得られたことが示された（平均濃度＝８．１ｍＭ；図９ｄ）。収率の分布が比較的狭い状況から、さらなる使用のために濃度は正規化しなかった。
【0135】
３．４．コンビナトリアル大環状ライブラリーの合成およびトロンビンスクリーニング
３８４個の足場を１２個のカルボン酸とコンビナトリアルに反応させ（図１０ａ）、４，６０８種の異なる大環状分子を得て、このライブラリーを凝固プロテアーゼおよび治療標的トロンビンに対してスクリーニングした。トロンビン阻害剤は、抗血栓症薬として既に臨床において使用されているが、経口での利用可能性が低いという問題がある。カルボン酸として、トロンビンのＳ１（Ｈ結合）およびＳ２（疎水性相互作用）特異性ポケットに結合する可能性のあるいくつかのフラグメントを含む、構造的に多様な分子を選択した（図１０ａ）。グアニジンなどの正電荷を含有する基は、Ｓ１サブサイトに特に良好に結合することが知られているが、経口的に適用される可能性がある、極性表面が限定され、電荷を持たない大環状分子の開発に関心があったため、それらは省いた。実際、承認されたトロンビン阻害剤の活性型は、そのような正電荷を帯びた基を含有しており、プロドラッグとして適用する必要があり、これが経口的な利用可能性を制限する根拠であり得る。アコースティック分注を使用して、２０ｎｌの足場（平均８．１ｍＭ）および２０ｎｌの事前に活性化した酸（８０ｍＭ）を組み合わせて、最終濃度を約４ｍＭの足場および４０ｍＭのカルボン酸に到達させた（図１０ｂ）。１０倍モル過剰のカルボン酸（以前の４倍に対して）を適用することを選択したが、それは、足場内のアミノ基の一部が、上記のモデルペプチドのα－アミノ基よりもアクセスしにくいためである。５時間後、一晩の反応を５μｌの１００ｍＭトリスバッファーを添加することによりクエンチし、５μｌ容量のトロンビン（最終濃度２ｎＭ）を添加し、蛍光発生基質（５μｌ）を使用して残りのトロンビン活性を測定した。スクリーニングにおける大環状化合物の濃度は約１０μＭであった。反応の０．２％の分画（９／４２７７）が５０％を超えてトロンビンを阻害し、それらのすべてがクロロチオフェン酸（１４）を含有する大環状分子であった（図１０ｃ）。クロロチオフェン酸（３８４足場×１４）およびトロンビンを含むすべての大環状合成反応の繰返しを独立した実験で行うことにより、本質的に同じトップヒットが同定され、したがって、多様化反応と活性スクリーニングの両方において高い再現性が確認された（図１０ｄ）。
３８４個の足場を１２個のカルボン酸とコンビナトリアルに反応させ（図１０ａ）、４，６０８種の異なる大環状分子を得て、このライブラリーを凝固プロテアーゼおよび治療標的トロンビンに対してスクリーニングした。トロンビン阻害剤は、抗血栓症薬として既に臨床において使用されているが、経口での利用可能性が低いという問題がある。カルボン酸として、トロンビンのＳ１（Ｈ結合）およびＳ２（疎水性相互作用）特異性ポケットに結合する可能性のあるいくつかのフラグメントを含む、構造的に多様な分子を選択した（図１０ａ）。グアニジンなどの正電荷を含有する基は、Ｓ１サブサイトに特に良好に結合することが知られているが、経口的に適用される可能性がある、極性表面が限定され、電荷を持たない大環状分子の開発に関心があったため、それらは省いた。実際、承認されたトロンビン阻害剤の活性型は、そのような正電荷を帯びた基を含有しており、プロドラッグとして適用する必要があり、これが経口的な利用可能性を制限する根拠であり得る。アコースティック分注を使用して、２０ｎｌの足場（平均８．１ｍＭ）および２０ｎｌの事前に活性化した酸（８０ｍＭ）を組み合わせて、最終濃度を約４ｍＭの足場および４０ｍＭのカルボン酸に到達させた（図１０ｂ）。１０倍モル過剰のカルボン酸（以前の４倍に対して）を適用することを選択したが、それは、足場内のアミノ基の一部が、上記のモデルペプチドのα－アミノ基よりもアクセスしにくいためである。５時間後、一晩の反応を５μｌの１００ｍＭトリスバッファーを添加することによりクエンチし、５μｌ容量のトロンビン（最終濃度２ｎＭ）を添加し、蛍光発生基質（５μｌ）を使用して残りのトロンビン活性を測定した。スクリーニングにおける大環状化合物の濃度は約１０μＭであった。反応の０．２％の分画（９／４２７７）が５０％を超えてトロンビンを阻害し、それらのすべてがクロロチオフェン酸（１４）を含有する大環状分子であった（図１０ｃ）。クロロチオフェン酸（３８４足場×１４）およびトロンビンを含むすべての大環状合成反応の繰返しを独立した実験で行うことにより、本質的に同じトップヒットが同定され、したがって、多様化反応と活性スクリーニングの両方において高い再現性が確認された（図１０ｄ）。
【0136】
ほとんどのヒットを与えたクロロチオフェン酸（１４）は、トリプシン様セリンプロテアーゼＦＸａのＳ１サブサイト結合基として機能することが既に報告されており（Ｐ．Ｍ．Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１８、６１、３７９９～３８２２頁）、したがって、ヒットはクロロチオフェン基をＳ１ポケットに向ける大環状分子であることが予想された。酸１４で修飾されたすべての大環状分子がトロンビンを阻害したわけではなく、このことは大環状分子が結合に実質的に寄与していることを示唆している。アシル化反応に使用したカルボン酸が１０倍過剰であったという状況から、未反応の１４は、トロンビンスクリーニングのすべてのウェルで約１００μＭの濃度で存在した。この濃度では、１４は添加したが大環状足場は添加しなかった対照反応と、１４および足場は含有したがトロンビン阻害を示さなかった３８４ウェルの多数で明らかなように、トロンビンを阻害しなかった（図１０ｃ）。１４はアミノ基と反応した後にカルボキサミドとして生じるので、トロンビンの阻害をクロロチオフェンアミドによって試験したところ、Ｋｉ＝３８０μＭであることが確認された。阻害が弱いことにより、大環状足場が、同定された大環状化合物の活性に実質的に寄与していることが確認された。最良の３つのヒットであるＭ１、Ｍ２、およびＭ３は、構造において高度に関連し、すべてフォーマットシクロ（Ｍｐａ－Ｄ３－Ｂ５－Ｘａａ－Ｍｅａ）の足場をベースにしており、式中、アミノ酸Ｘａａはすべて疎水性側鎖を持つα－アミノ酸であった（Ｄ－Ｖａｌ、Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｖａｌ；図１０ｅ）。
【0137】
３．５．アシル化された足場は活性種である
次に、スクリーニングで観察された活性が、予想された大環状化合物に由来するか、または、例えばカルボン酸もしくは大環状二量体の付加物などの副生成物に由来するかどうかを評価した。この目的のために、足場とカルボン酸１４の反応を、２つのトップヒットＭ１およびＭ２について、２５０倍のラージスケール（濃度は同じだが容量は大きい）で繰り返し、反応をＲＰ－ＨＰＬＣカラムにかけ、１分以内に溶出した生成物をそれぞれ組み合わせた２０分画を単離し、その分画を凍結乾燥し、トロンビン阻害活性を測定した（図１０ｆ）。どちらの反応においても、所望の大環状生成物を含有する分画が極めて最も高い活性を示し、ヒットが大環状分子のＭ１およびＭ２の活性に基づいて同定されたことが示された。
次に、スクリーニングで観察された活性が、予想された大環状化合物に由来するか、または、例えばカルボン酸もしくは大環状二量体の付加物などの副生成物に由来するかどうかを評価した。この目的のために、足場とカルボン酸１４の反応を、２つのトップヒットＭ１およびＭ２について、２５０倍のラージスケール（濃度は同じだが容量は大きい）で繰り返し、反応をＲＰ－ＨＰＬＣカラムにかけ、１分以内に溶出した生成物をそれぞれ組み合わせた２０分画を単離し、その分画を凍結乾燥し、トロンビン阻害活性を測定した（図１０ｆ）。どちらの反応においても、所望の大環状生成物を含有する分画が極めて最も高い活性を示し、ヒットが大環状分子のＭ１およびＭ２の活性に基づいて同定されたことが示された。
【0138】
精製した大環状分子のＭ１、Ｍ２、およびＭ３は、それぞれ、４４ｎＭ、１６５ｎＭ、および１２５ｎＭのＫｉでトロンビンを阻害した（図１０ｅ）。治療用途によっては、本明細書でスクリーニングしたすべての足場に存在する還元可能なジスルフィド結合は望ましくないため、より安定な結合で置き換えることができるかどうかについて試験した。ジチオアセタールリンカーまたはチオエーテルリンカーを含有するＭ４およびＭ５を合成した。Ｍ４およびＭ５は、８３±８ｎＭおよび１３５±１６ｎＭのＫｉでトロンビンを阻害し、したがって、親和性はわずかに２倍および３倍で弱かった。
【0139】
３．６．タンパク質間相互作用阻害剤の開発
大環状分子は、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）の阻害剤として多くの関心を集めており、ＭＤＭ２：ｐ５３であるＰＰＩ疾患の標的のプロトタイプについて、阻害剤を開発する多くの試みがなされてきた（Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０２０、３４、２８５８～２８７４頁；Ｌ．Ｓｋａｌｎｉａｋら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．、２０１９、２９、１５１～１７０頁）。ＭＤＭ２の過剰発現は腫瘍抑制因子ｐ５３の活性を阻害し、ＭＤＭ２－Ｐ５３相互作用を遮断するＭＤＭ２結合剤は、新たな抗がん療法の開発において注目されている（Ｐ．Ｃｈｅｎｅ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、２００３、３、１０２～１０９頁）。この難易度の高いＰＰＩ標的を用いて新しいアプローチを試験するため、１９２種の構造的に多様な環状ペプチド足場が合成したところ、これらはすべて３つのランダムなアミノ酸をベースにしており、そのうちの１つは側面方向多様化のアミノ基を含有していた。結合剤を同定する可能性を高めるために、すべての足場には、ＭＤＭ２に結合し、ＭＤＭ２：ｐ５３相互作用を阻害するステープルペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の重要な相互作用を形成する２つのアミノ酸、トリプトファンまたはフェニルアラニンのいずれかが含まれていた。環状ペプチド足場は、上記のライブラリー１について記載したように９６ウェルプレートで合成し、平均濃度１２．９ｍＭ、平均純度９０％で得た。前と同様に、今回は１０４種のカルボン酸を使用し、足場をコンビナトリアルな方式でフラグメントによるアシル化によって修飾した。したがって、足場ライブラリーのサイズは、１９２個の構造から１９，９６８個の大環状化合物に拡張され、したがって１００倍を超えて拡張された。
大環状分子は、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）の阻害剤として多くの関心を集めており、ＭＤＭ２：ｐ５３であるＰＰＩ疾患の標的のプロトタイプについて、阻害剤を開発する多くの試みがなされてきた（Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０２０、３４、２８５８～２８７４頁；Ｌ．Ｓｋａｌｎｉａｋら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．、２０１９、２９、１５１～１７０頁）。ＭＤＭ２の過剰発現は腫瘍抑制因子ｐ５３の活性を阻害し、ＭＤＭ２－Ｐ５３相互作用を遮断するＭＤＭ２結合剤は、新たな抗がん療法の開発において注目されている（Ｐ．Ｃｈｅｎｅ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、２００３、３、１０２～１０９頁）。この難易度の高いＰＰＩ標的を用いて新しいアプローチを試験するため、１９２種の構造的に多様な環状ペプチド足場が合成したところ、これらはすべて３つのランダムなアミノ酸をベースにしており、そのうちの１つは側面方向多様化のアミノ基を含有していた。結合剤を同定する可能性を高めるために、すべての足場には、ＭＤＭ２に結合し、ＭＤＭ２：ｐ５３相互作用を阻害するステープルペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の重要な相互作用を形成する２つのアミノ酸、トリプトファンまたはフェニルアラニンのいずれかが含まれていた。環状ペプチド足場は、上記のライブラリー１について記載したように９６ウェルプレートで合成し、平均濃度１２．９ｍＭ、平均純度９０％で得た。前と同様に、今回は１０４種のカルボン酸を使用し、足場をコンビナトリアルな方式でフラグメントによるアシル化によって修飾した。したがって、足場ライブラリーのサイズは、１９２個の構造から１９，９６８個の大環状化合物に拡張され、したがって１００倍を超えて拡張された。
【0140】
ライブラリーは、３８４マイクロウェルプレート内の反応に標的タンパク質ＭＤＭ２および大環状分子の結合を測定するレポーターペプチドを分注することによってスクリーニングした。蛍光レポーターペプチドは、ＭＤＭ２上のＰＰＩインターフェースに結合し（Ｋｄ＝０．５μＭ）、大環状分子によるその置換は蛍光偏光を測定することにより追跡することができる。スクリーニング結果は、足場（垂直）とフラグメント（水平）の組合せのアレイで再度表示され、色はＭＤＭ２からのレポーターペプチド置換の程度を示した（図１１）。２つのヒットグループが最も興味深く、１つは水平方向で確認されたものであるため、同じ足場であるシクロ（Ｍｐａ－Ｔｒｐ－Ｄ３－Ｂ４－Ｍｅａ）を共有する大環状分子であり、もう１つは垂直線上で確認されたものであるため、同じカルボン酸（９）を共有する大環状分子である。１９２個すべての足場と最良のヒットを与えた４つのカルボン酸（９、１４、２５、９１）を使用して、アシル化反応とスクリーニングを繰り返し、最初のスクリーニングの結果を確認した。２つのヒットグループそれぞれの３つの反応における活性種を分析したところ、第１のグループ（ヒットＭ６、Ｍ７、およびＭ８）では、活性種は予想された大環状構造であったが、第２のグループではそうではなかったことが判明した（図１２ａ）。
【0141】
３．７．ナノモルＭＤＭ２結合剤の同定
精製した大環状分子のＭ６、Ｍ７およびＭ８は、効率的にＭＤＭ２から蛍光ペプチドプローブを置き換え、約１μＭの同様のＩＣ５０値を示したが（図１２ｂ）、競合アッセイは、アッセイに必要とされるＭＤＭ２濃度が高いことから（１．２μＭ）、低マイクロモルまたはナノモル領域での結合定数を決定するのには適していなかった。したがって、３つの大環状分子を、ペプチド足場のＮ末端領域に連結したフルオレセインとのコンジュゲートとして合成し、直接蛍光偏光アッセイで結合親和性を測定した（図１２ｃ）。コンジュゲートは、６５０±５０ｎＭ（Ｆ－Ｍ６）、７９０±８０ｎＭ（Ｆ－Ｍ７）、および３４０±４０ｎＭ（Ｆ－Ｍ８）のＫｄ値を示した。
精製した大環状分子のＭ６、Ｍ７およびＭ８は、効率的にＭＤＭ２から蛍光ペプチドプローブを置き換え、約１μＭの同様のＩＣ５０値を示したが（図１２ｂ）、競合アッセイは、アッセイに必要とされるＭＤＭ２濃度が高いことから（１．２μＭ）、低マイクロモルまたはナノモル領域での結合定数を決定するのには適していなかった。したがって、３つの大環状分子を、ペプチド足場のＮ末端領域に連結したフルオレセインとのコンジュゲートとして合成し、直接蛍光偏光アッセイで結合親和性を測定した（図１２ｃ）。コンジュゲートは、６５０±５０ｎＭ（Ｆ－Ｍ６）、７９０±８０ｎＭ（Ｆ－Ｍ７）、および３４０±４０ｎＭ（Ｆ－Ｍ８）のＫｄ値を示した。
【0142】
３．８ ピコモルスケールの繰返し合成およびスクリーニング
大環状化合物の容易な合成により、結合親和性を改善することができるヒット化合物に基づいたサブライブラリーを繰り返し合成することができる。最初のスクリーニングで本発明者らが同定した大環状分子Ｍ８の効力を増強するため、本発明者らは、Ｍ８のアミノ酸と同様のアミノ酸を使用して６３個の足場（図１８ａ）を合成したが、これらは、ニペコチン酸（Ｎｉｐ）の３つの類似体、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）の３つの類似体）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）の７つの類似体であった（３×３×７＝６３）。次いで、本発明者らは、６３個の足場を１４個のカルボン酸で多様化したが、それには、最初のライブラリーヒット（カルボン酸１４、２５、９１）からの繰返し、ならびに大環状ヒットＭ８のカルボン酸である桂皮酸９１の類似体である関連構造が含まれていた（１０５～１１５；図２８）。ナノモル親和性を持つ結合剤を同定するため、本発明者らは最初のスクリーニングよりも１３倍低い濃度（７５０ｎＭ）で８８２個の大環状分子（６３×１４）をスクリーニングしたが、それは３０ｐｍｏｌスケールに相当した（図１８ｂ）。最も活性のある大環状分子はオリジナルの足場に基づいていたが、本発明者らは、このスクリーニングにおいて、より強力な大環状分子、すなわち、Ｍ８では２１％であったの比べて（酸９１；図１８ｂ）、７５０ｎＭでレポーターペプチドを６８％まで置き換えた１０９（大環状分子Ｍ９）をもたらすカルボン酸を同定した。本発明者らは、この足場を改良することはしなかったが、６３個の足場を使用してスクリーニングから大環状環に関する意味のある構造活性相関データを得て、すべてのビルディングブロックが必須であることを示した。
大環状化合物の容易な合成により、結合親和性を改善することができるヒット化合物に基づいたサブライブラリーを繰り返し合成することができる。最初のスクリーニングで本発明者らが同定した大環状分子Ｍ８の効力を増強するため、本発明者らは、Ｍ８のアミノ酸と同様のアミノ酸を使用して６３個の足場（図１８ａ）を合成したが、これらは、ニペコチン酸（Ｎｉｐ）の３つの類似体、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）の３つの類似体）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）の７つの類似体であった（３×３×７＝６３）。次いで、本発明者らは、６３個の足場を１４個のカルボン酸で多様化したが、それには、最初のライブラリーヒット（カルボン酸１４、２５、９１）からの繰返し、ならびに大環状ヒットＭ８のカルボン酸である桂皮酸９１の類似体である関連構造が含まれていた（１０５～１１５；図２８）。ナノモル親和性を持つ結合剤を同定するため、本発明者らは最初のスクリーニングよりも１３倍低い濃度（７５０ｎＭ）で８８２個の大環状分子（６３×１４）をスクリーニングしたが、それは３０ｐｍｏｌスケールに相当した（図１８ｂ）。最も活性のある大環状分子はオリジナルの足場に基づいていたが、本発明者らは、このスクリーニングにおいて、より強力な大環状分子、すなわち、Ｍ８では２１％であったの比べて（酸９１；図１８ｂ）、７５０ｎＭでレポーターペプチドを６８％まで置き換えた１０９（大環状分子Ｍ９）をもたらすカルボン酸を同定した。本発明者らは、この足場を改良することはしなかったが、６３個の足場を使用してスクリーニングから大環状環に関する意味のある構造活性相関データを得て、すべてのビルディングブロックが必須であることを示した。
【0143】
続いて、本発明者らは、ライブラリー合成とスクリーニングの第３サイクルを実施し、前回のスクリーニングで最も有望な９個の足場を１５個の追加のカルボン酸でアシル化し、そのほとんどは、より大きな置換基を持つ桂皮酸誘導体であった。続いて、本発明者らは、オリジナルの足場をベースとし、酸１２０でアシル化された大環状分子であるＭ１０を同定したが、これは、使用した蛍光プローブのＦ－Ｍ８を７５０ｎＭでＭＤＭ２から８４％置き換え、親化合物のＭ８およびＭ９よりも効率よく置き換えた（図１８ｃ）。本発明者らは、大環状分子Ｍ１０をフルオレセインに結合させ、ＦＰを使用してＭＤＭ２への結合を４３±１８ｎＭのＫｄと測定した（図１８ｄ）。フルオレセインコンジュゲートを用いて、本発明者らはまた、ＭＤＭ２の定義された疎水性ポケット（Ｂ．Ａｎｉｌら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０１３、６９、１３５８～１３６６頁）に結合し、ｎｕｔｌｉｎベースの臨床候補の前駆体であるＮｕｔｌｉｎ－３ａとの競合実験も実施した。２つのリガンドは競合しなかったが、このことは、大環状分子が異なる部位に結合し、新たな阻害メカニズムを有する可能性があることを示唆している（図２９）。直交法としての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による大環状分子の結合測定を繰り返したところ、Ｋｄは６００±３００ｎＭ（Ｍ６）、５５０±１９０ｎＭ（Ｍ７）、１６９±９３ｎＭ（Ｍ８）、および２９±１４ｎＭ（Ｍ１０）であることが示され、ＦＰアッセイで確認された親和性範囲を確認した（図１８ｅおよび図３０）。
【0144】
３．９ 結論
本明細書には、活性化カルボン酸のアコースティック分注を使用した、ピコモルスケールで大環状骨格を多様化するための方法が記載されている。ＳＰＰＳから出発して、わずか４日間で、粗反応混合物としての数千もの多様な大環状分子が得られた。次いで、これらの混合物は、タンパク質標的に対して直接スクリーニングされ、阻害剤が首尾よく同定された。ナノリットル容量のアシル化反応は頑強であり、多くの異なるカルボン酸および大環状分子において生成物への高い変換率を生じた。予期せぬ副生成物は観察されなかった。本発明者らの自動化されたプラットフォームにより、この最終多様化ステップを１時間以内に実施できるようになった。これは、手間のかかる精製が必要な従来の大環状ライブラリーの合成とは対照的である。アコースティック分注はこれまで合成に使用されてきたが、スクリーニング化合物の直接合成というよりはむしろ、合成反応範囲の精緻化に限られてきた。本発明者らのスモールスケールの反応は、それらの比較的高い純度から、同じマイクロタイタープレート内でタンパク質標的に対する大環状分子の直接スクリーニングが可能となった。これらのスクリーニングから阻害剤を同定できること、および観察された活性が不純物ではなく所望の生成物によるものであることが証明された。粗混合物のスクリーニングは、文献では依然として限られている。本発明者らは、同じスケールの、または特に大環状分子に関連した既存のいかなる取り組みについても知らない。本発明者らの方法の手軽な性質を考えると、多くのタンパク質標的のスクリーニングに適用できるはずである。さらに、多くの様々な化学反応はＡＤＥに基づく多様化に利用され得る。アミド結合形成は、その簡易さと、粗スクリーニングの反応としてのこれまでの使用から、最初の例として選択された。本発明者らによって合成された最大のライブラリーは２０，０００個の大環状分子であったが、数十万個まで比較的容易に拡張することができた。今後より多くのリード様化合物を生成するために、この方法は、非還元性結合を介して環化された骨格構造に適用され得る。ライブラリーの薬物様特性をさらに高めるため、ビルディングブロックセットをアミノ酸以外にも拡張することができる。この方法を使用して、臨床候補を開発することが望まれる、より治療に関連した標的をスクリーニングすることができる。
本明細書には、活性化カルボン酸のアコースティック分注を使用した、ピコモルスケールで大環状骨格を多様化するための方法が記載されている。ＳＰＰＳから出発して、わずか４日間で、粗反応混合物としての数千もの多様な大環状分子が得られた。次いで、これらの混合物は、タンパク質標的に対して直接スクリーニングされ、阻害剤が首尾よく同定された。ナノリットル容量のアシル化反応は頑強であり、多くの異なるカルボン酸および大環状分子において生成物への高い変換率を生じた。予期せぬ副生成物は観察されなかった。本発明者らの自動化されたプラットフォームにより、この最終多様化ステップを１時間以内に実施できるようになった。これは、手間のかかる精製が必要な従来の大環状ライブラリーの合成とは対照的である。アコースティック分注はこれまで合成に使用されてきたが、スクリーニング化合物の直接合成というよりはむしろ、合成反応範囲の精緻化に限られてきた。本発明者らのスモールスケールの反応は、それらの比較的高い純度から、同じマイクロタイタープレート内でタンパク質標的に対する大環状分子の直接スクリーニングが可能となった。これらのスクリーニングから阻害剤を同定できること、および観察された活性が不純物ではなく所望の生成物によるものであることが証明された。粗混合物のスクリーニングは、文献では依然として限られている。本発明者らは、同じスケールの、または特に大環状分子に関連した既存のいかなる取り組みについても知らない。本発明者らの方法の手軽な性質を考えると、多くのタンパク質標的のスクリーニングに適用できるはずである。さらに、多くの様々な化学反応はＡＤＥに基づく多様化に利用され得る。アミド結合形成は、その簡易さと、粗スクリーニングの反応としてのこれまでの使用から、最初の例として選択された。本発明者らによって合成された最大のライブラリーは２０，０００個の大環状分子であったが、数十万個まで比較的容易に拡張することができた。今後より多くのリード様化合物を生成するために、この方法は、非還元性結合を介して環化された骨格構造に適用され得る。ライブラリーの薬物様特性をさらに高めるため、ビルディングブロックセットをアミノ酸以外にも拡張することができる。この方法を使用して、臨床候補を開発することが望まれる、より治療に関連した標的をスクリーニングすることができる。
【0145】
３．１０ 補足結果
Ｍ１との複合体化したヒトα－トロンビンの全体構造
ヒトα－トロンビンは、ジスルフィド架橋（Ｈ鎖のＣｙｓ１２２とＬ鎖のＣｙｓ１）を介して共有結合した３６アミノ酸残基（軽鎖）と２５９アミノ酸残基（重鎖）の２本のポリペプチド鎖から構成される。α－トロンビン（軽鎖および重鎖）および大環状分子Ｍ１によって形成された結晶のＸ線構造解析では、ヒトα－トロンビンの重鎖および軽鎖のほぼ同一の４つのコピーが非対称ユニットにあることが示された。α－トロンビンの４つの軽鎖／重鎖は、Ａ／Ｂ、Ｃ／Ｄ、Ｅ／Ｆ、およびＨ／Ｌと称する。Ｈ／Ｌの構造がすべての計算と構造図の作成に使用された。ヒトα－トロンビンの軽鎖は、Ｇｌｕ１ＣからＩｌｅ１４Ｋまで明確に追跡され得る。アミノ末端残基（Ｔｈｒ１ＨからＧｌｙ１Ｄ）およびカルボキシル末端残基Ａｓｐ１４Ｌ（軽鎖ＣおよびＥを除く）、Ｇｌｙ１４ＭおよびＡｒｇ１５は明確でなく、フーリエマップでは見えない。重鎖の電子密度は、表面のフレキシブルな自己分解ループの一部である数個のアミノ酸を除き（Ｔｒｐ１４８からＶａｌ１４９Ｃ）、すべての残基ではっきりと見ることができる。カルボキシル末端残基Ｇｌｕ２４７は、適切な電子密度が欠如している。わずかな違いは、フレキシブルで、あまり明確でないループのレベルで、または露出した周辺側鎖の方向で生じる。大環状分子に結合したヒトα－トロンビンの全体構造は、アポ型であっても阻害剤との複合体であっても、他のヒトα－トロンビン構造と比較した場合に主骨格の顕著な再配列はいずれも見られない。
Ｍ１との複合体化したヒトα－トロンビンの全体構造
ヒトα－トロンビンは、ジスルフィド架橋（Ｈ鎖のＣｙｓ１２２とＬ鎖のＣｙｓ１）を介して共有結合した３６アミノ酸残基（軽鎖）と２５９アミノ酸残基（重鎖）の２本のポリペプチド鎖から構成される。α－トロンビン（軽鎖および重鎖）および大環状分子Ｍ１によって形成された結晶のＸ線構造解析では、ヒトα－トロンビンの重鎖および軽鎖のほぼ同一の４つのコピーが非対称ユニットにあることが示された。α－トロンビンの４つの軽鎖／重鎖は、Ａ／Ｂ、Ｃ／Ｄ、Ｅ／Ｆ、およびＨ／Ｌと称する。Ｈ／Ｌの構造がすべての計算と構造図の作成に使用された。ヒトα－トロンビンの軽鎖は、Ｇｌｕ１ＣからＩｌｅ１４Ｋまで明確に追跡され得る。アミノ末端残基（Ｔｈｒ１ＨからＧｌｙ１Ｄ）およびカルボキシル末端残基Ａｓｐ１４Ｌ（軽鎖ＣおよびＥを除く）、Ｇｌｙ１４ＭおよびＡｒｇ１５は明確でなく、フーリエマップでは見えない。重鎖の電子密度は、表面のフレキシブルな自己分解ループの一部である数個のアミノ酸を除き（Ｔｒｐ１４８からＶａｌ１４９Ｃ）、すべての残基ではっきりと見ることができる。カルボキシル末端残基Ｇｌｕ２４７は、適切な電子密度が欠如している。わずかな違いは、フレキシブルで、あまり明確でないループのレベルで、または露出した周辺側鎖の方向で生じる。大環状分子に結合したヒトα－トロンビンの全体構造は、アポ型であっても阻害剤との複合体であっても、他のヒトα－トロンビン構造と比較した場合に主骨格の顕著な再配列はいずれも見られない。
【0146】
大環状分子Ｍ１の全体構造
大環状分子Ｍ１の電子密度は十分に定義されており、非対称ユニットに存在する４つのタンパク質複合体すべてについて基の配向を明確に割り当てることができる。Ｍ１の原子の番号付与を図２６ｂに示す。古典的な二次構造要素および非共有結合性分子内相互作用は、大環状分子には確認されない。この分子は、触媒ポケットの形状によく適合するイスのような立体構造をとっているように思われる。
大環状分子Ｍ１の電子密度は十分に定義されており、非対称ユニットに存在する４つのタンパク質複合体すべてについて基の配向を明確に割り当てることができる。Ｍ１の原子の番号付与を図２６ｂに示す。古典的な二次構造要素および非共有結合性分子内相互作用は、大環状分子には確認されない。この分子は、触媒ポケットの形状によく適合するイスのような立体構造をとっているように思われる。
【0147】
ヒトαトロンビンとＭ１の相互作用
Ｍ１大環状分子は、活性部位と４００．５Å２のタンパク質表面を覆うその周囲の基質ポケットによって形成された間隙に良好に適合する（Ｎ．Ｖｏｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０、３８、Ｗ５５５～Ｗ５６２頁）。大環状分子の立体構造と相互作用は、非対称ユニットに存在する４つのトロンビン分子の４つの活性部位において同等である。Ｍ１とヒトα－トロンビンの相互作用の大部分は、一次特異性Ｓ１ポケットに収まる５－クロロチオフェン－２－カルボキサミド官能基によって媒介される。この基は、Ｇｌｙ２１９の主鎖（Ｍ１ Ｎ７とＧｌｙ２１９ Ｏ）と、Ｍ１の酸素０９とＧｌｙ１９３ Ｎの主鎖窒素およびＳｅｒ１９５の主鎖窒素を架橋するＨ２Ｏ分子との水素結合によってポケットに捕捉される。５－クロロチオフェン－２－カルボキサミドは、Ｃｙｓ１９１（Ｍ１ ０９とＣｙｓ１９１ Ｏ）、Ｇｌｕ１９２（Ｍ１ ０９とＧｌｕ１９２ Ｎ）、Ｇｌｙ２１６（Ｍ１ Ｎ７とＧｌｙ２１６ ＯおよびＭ１ Ｓ１５とＧｌｙ２１６ Ｎ）、Ｔｒｐ２１５（Ｍ１ Ｓ１５とＴｒｐ２１５ Ｎ）近傍の主鎖、ならびにＣｙｓ２２０の側鎖（Ｍ１ Ｎ７とＣｙｓ２２０ Ｓ）との極性接触のネットワークにさらに関与している。塩素原子５－クロロチオフェン－２－カルボキサミド官能基は、Ｓ１ポケットの底部を向いており、そこでＴｙｒ２２８の芳香環とのハロゲン芳香族π相互作用（４．０Å）を形成しているようである。Ｍ１の主鎖窒素Ｎ４および酸素Ｏ１７は、それぞれ、Ｇｌｙ２１６の主鎖酸素（Ｇｌｙ２１６ Ｏ）およびＧｌｙ２１６の窒素（Ｇｌｙ２１６ Ｎ）と水素結合を形成する。さらに、Ｍ１の主鎖窒素Ｎ４および酸素０１７は、それぞれ、Ｇｌｙ２１９の主鎖窒素（Ｇｌｙ２１９ Ｎ）およびＧｌｙ２１６の酸素（Ｇｌｙ２１６ Ｏ）と極性接触を形成し得る。同様に、Ｍ１の主鎖窒素Ｎ１８は、Ｇｌｕ１９２の側鎖カルボキシル基（Ｇｌｕ１９２ ＯＥ１およびＯＥ２）と２つの極性接触を形成し得る。最後に、Ｈ２Ｏの１分子がＭ１の主鎖窒素Ｎ２７とＧｌｕ９７Ａの主鎖酸素（Ｇｌｕ９７Ａ Ｏ）を架橋する。重要なことは、Ｍ１のヒトα－トロンビンへの結合は、隣接する酵素残基の主鎖および側鎖による複数の疎水性接触によって媒介されることである。ジスルフィド架橋Ｓ２１－Ｓ２２を含む大環状骨格（Ｃ２０－Ｃ２４）は、残基Ｈｉｓ５７、Ｔｙｒ６０Ａ、Ｔｒｐ６０Ｄ（近位Ｓ２ポケット）およびＬｅｕ９９（遠位Ｓ３ポケット）の側鎖によって形成された疎水性ケージに向かって横たわっている。バリン側鎖（Ｃ２８－Ｃ３１）は、Ｉｌｅ１７４とＴｒｐ２１５によって形成された疎水性ポケットに向かって環の反対側を曲げる。最後に、Ｃ３５－Ｃ４０のフェニル環がトロンビンループ（Ｇｌｙ２１６－Ｃｙｓ２２０）の上部にのびる。
Ｍ１大環状分子は、活性部位と４００．５Å２のタンパク質表面を覆うその周囲の基質ポケットによって形成された間隙に良好に適合する（Ｎ．Ｖｏｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０、３８、Ｗ５５５～Ｗ５６２頁）。大環状分子の立体構造と相互作用は、非対称ユニットに存在する４つのトロンビン分子の４つの活性部位において同等である。Ｍ１とヒトα－トロンビンの相互作用の大部分は、一次特異性Ｓ１ポケットに収まる５－クロロチオフェン－２－カルボキサミド官能基によって媒介される。この基は、Ｇｌｙ２１９の主鎖（Ｍ１ Ｎ７とＧｌｙ２１９ Ｏ）と、Ｍ１の酸素０９とＧｌｙ１９３ Ｎの主鎖窒素およびＳｅｒ１９５の主鎖窒素を架橋するＨ２Ｏ分子との水素結合によってポケットに捕捉される。５－クロロチオフェン－２－カルボキサミドは、Ｃｙｓ１９１（Ｍ１ ０９とＣｙｓ１９１ Ｏ）、Ｇｌｕ１９２（Ｍ１ ０９とＧｌｕ１９２ Ｎ）、Ｇｌｙ２１６（Ｍ１ Ｎ７とＧｌｙ２１６ ＯおよびＭ１ Ｓ１５とＧｌｙ２１６ Ｎ）、Ｔｒｐ２１５（Ｍ１ Ｓ１５とＴｒｐ２１５ Ｎ）近傍の主鎖、ならびにＣｙｓ２２０の側鎖（Ｍ１ Ｎ７とＣｙｓ２２０ Ｓ）との極性接触のネットワークにさらに関与している。塩素原子５－クロロチオフェン－２－カルボキサミド官能基は、Ｓ１ポケットの底部を向いており、そこでＴｙｒ２２８の芳香環とのハロゲン芳香族π相互作用（４．０Å）を形成しているようである。Ｍ１の主鎖窒素Ｎ４および酸素Ｏ１７は、それぞれ、Ｇｌｙ２１６の主鎖酸素（Ｇｌｙ２１６ Ｏ）およびＧｌｙ２１６の窒素（Ｇｌｙ２１６ Ｎ）と水素結合を形成する。さらに、Ｍ１の主鎖窒素Ｎ４および酸素０１７は、それぞれ、Ｇｌｙ２１９の主鎖窒素（Ｇｌｙ２１９ Ｎ）およびＧｌｙ２１６の酸素（Ｇｌｙ２１６ Ｏ）と極性接触を形成し得る。同様に、Ｍ１の主鎖窒素Ｎ１８は、Ｇｌｕ１９２の側鎖カルボキシル基（Ｇｌｕ１９２ ＯＥ１およびＯＥ２）と２つの極性接触を形成し得る。最後に、Ｈ２Ｏの１分子がＭ１の主鎖窒素Ｎ２７とＧｌｕ９７Ａの主鎖酸素（Ｇｌｕ９７Ａ Ｏ）を架橋する。重要なことは、Ｍ１のヒトα－トロンビンへの結合は、隣接する酵素残基の主鎖および側鎖による複数の疎水性接触によって媒介されることである。ジスルフィド架橋Ｓ２１－Ｓ２２を含む大環状骨格（Ｃ２０－Ｃ２４）は、残基Ｈｉｓ５７、Ｔｙｒ６０Ａ、Ｔｒｐ６０Ｄ（近位Ｓ２ポケット）およびＬｅｕ９９（遠位Ｓ３ポケット）の側鎖によって形成された疎水性ケージに向かって横たわっている。バリン側鎖（Ｃ２８－Ｃ３１）は、Ｉｌｅ１７４とＴｒｐ２１５によって形成された疎水性ポケットに向かって環の反対側を曲げる。最後に、Ｃ３５－Ｃ４０のフェニル環がトロンビンループ（Ｇｌｙ２１６－Ｃｙｓ２２０）の上部にのびる。
【0148】
３．１１ 補足材料および方法
一般的な検討事項
特に明記のない限り、すべての試薬は市販の供給元から購入し、さらに精製を行うことなく使用した。溶媒は無水ではなく、使用前に乾燥させてもいない。以下の略語を使用する：ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＡＢＣＯ（１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）、ＮＭＭ（４－メチルモルホリン）、ＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－ウロニウム－ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウム－ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）。
一般的な検討事項
特に明記のない限り、すべての試薬は市販の供給元から購入し、さらに精製を行うことなく使用した。溶媒は無水ではなく、使用前に乾燥させてもいない。以下の略語を使用する：ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＡＢＣＯ（１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）、ＮＭＭ（４－メチルモルホリン）、ＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－ウロニウム－ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウム－ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）。
【0149】
モデル足場１の合成
環状ペプチドモデル足場１は、既に記載されている環状ジスルフィド遊離方策（ＣＤＲ）を使用して合成した（Ｓ．Ｈａｂｅｓｈｉａｎら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０２２、１７、１８１～１８６頁）。直鎖状ペプチド前駆体は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＨＡ４０００４．０ ポリスチレンＡ ＳＨ樹脂（２００～４００メッシュ）、０．９５ｍｍｏｌ／グラムの充填樹脂およびＨａｂｅｓｈｉａｎ，Ｓ．ら、２０２２２に記載されている以下の手順を使用して、５ｍｌポリプロピレン合成カラム（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｖ０５１ＰＥ０７６）中、２５μｍｏｌスケールで合成した。ペプチドは以下のようにして遊離した。側鎖を脱保護するため、樹脂を２ｍｌの３８：１：１ ＴＦＡ／ＴＩＳ／ｄｄＨ２Ｏ ｖ／ｖ／ｖと１時間インキュベートし、次いで５×４ｍｌのＤＣＭで洗浄した。環状ペプチドを遊離するため、樹脂を、１５０ｍＭのＤＩＰＥＡ（６当量）を含有する１ｍｌのＤＭＳＯで一晩処理した。樹脂を濾過により除去した。粗混合物を、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステム（２４８９ ＵＶ検出器、２５３５ポンプ、フラクションコレクターＩＩＩ）、１９ｍｍ×２５０ｍｍのＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８カラム（細孔１２５Å、粒子１０μｍ）、溶媒系Ａ（Ｈ２Ｏ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）および溶媒系Ｂ（ＭｅＣＮ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）、および３０分間かけた０～２５％溶媒Ｂの勾配を使用するＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。モデル足場を含有する分画を凍結乾燥し、４０ｍＭの濃度に達するようにＤＭＳＯに溶解した。
環状ペプチドモデル足場１は、既に記載されている環状ジスルフィド遊離方策（ＣＤＲ）を使用して合成した（Ｓ．Ｈａｂｅｓｈｉａｎら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０２２、１７、１８１～１８６頁）。直鎖状ペプチド前駆体は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＨＡ４０００４．０ ポリスチレンＡ ＳＨ樹脂（２００～４００メッシュ）、０．９５ｍｍｏｌ／グラムの充填樹脂およびＨａｂｅｓｈｉａｎ，Ｓ．ら、２０２２２に記載されている以下の手順を使用して、５ｍｌポリプロピレン合成カラム（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｖ０５１ＰＥ０７６）中、２５μｍｏｌスケールで合成した。ペプチドは以下のようにして遊離した。側鎖を脱保護するため、樹脂を２ｍｌの３８：１：１ ＴＦＡ／ＴＩＳ／ｄｄＨ２Ｏ ｖ／ｖ／ｖと１時間インキュベートし、次いで５×４ｍｌのＤＣＭで洗浄した。環状ペプチドを遊離するため、樹脂を、１５０ｍＭのＤＩＰＥＡ（６当量）を含有する１ｍｌのＤＭＳＯで一晩処理した。樹脂を濾過により除去した。粗混合物を、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステム（２４８９ ＵＶ検出器、２５３５ポンプ、フラクションコレクターＩＩＩ）、１９ｍｍ×２５０ｍｍのＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８カラム（細孔１２５Å、粒子１０μｍ）、溶媒系Ａ（Ｈ２Ｏ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）および溶媒系Ｂ（ＭｅＣＮ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）、および３０分間かけた０～２５％溶媒Ｂの勾配を使用するＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。モデル足場を含有する分画を凍結乾燥し、４０ｍＭの濃度に達するようにＤＭＳＯに溶解した。
【0150】
試薬のピペット操作によるモデル足場１のアシル化
モデル足場は、４０ｎｍｏｌスケールで、以下のように４μｌ容量でアシル化した。足場（ＤＭＳＯ中４０ｍＭストックの２０μｌ）に塩基（ＤＭＳＯに溶解した１６０ｍＭのＤＩＰＥＡ ２０μｌ）を補充し、混合物２μｌをＰＣＲプレートのウェルに移した。カルボン酸は、１６０ｍＭのＤＩＰＥＡを含有するＤＭＳＯ中の１６０ｍＭストックとして調製した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中１６０ｍＭ）をそれぞれの酸ストックに添加し、得られた活性エステル（８０ｍＭ）２μｌを同じＰＣＲプレートに加えた。反応を室温で３時間進行させた。この後、反応液１μｌを、９９ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液ｐＨ７．５に移し、６時間インキュベートし、活性化酸をＴｒｉｓでクエンチし、反応液をＬＣ－ＭＳにより分析した。
モデル足場は、４０ｎｍｏｌスケールで、以下のように４μｌ容量でアシル化した。足場（ＤＭＳＯ中４０ｍＭストックの２０μｌ）に塩基（ＤＭＳＯに溶解した１６０ｍＭのＤＩＰＥＡ ２０μｌ）を補充し、混合物２μｌをＰＣＲプレートのウェルに移した。カルボン酸は、１６０ｍＭのＤＩＰＥＡを含有するＤＭＳＯ中の１６０ｍＭストックとして調製した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中１６０ｍＭ）をそれぞれの酸ストックに添加し、得られた活性エステル（８０ｍＭ）２μｌを同じＰＣＲプレートに加えた。反応を室温で３時間進行させた。この後、反応液１μｌを、９９ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液ｐＨ７．５に移し、６時間インキュベートし、活性化酸をＴｒｉｓでクエンチし、反応液をＬＣ－ＭＳにより分析した。
【0151】
アコースティック試薬移送によるモデル足場１のアシル化
モデル足場は、以下のように８０ｎｌの容量で、８００ｐｍｏｌスケールでアシル化した。足場１（ＤＭＳＯ中４０ｍＭストックの２０μＬ）に、塩基（ＤＭＳＯに溶解した、２０μＬの１６０ｍＭ ＤＩＰＥＡ、２０μＬの１６０ｍＭ ＤＡＢＣＯ、２０μＬの１６０ｍＭ ＨＥＰＥＳナトリウム塩、または２０μＬの１Ｍ ＮＭＭ）を補充し、１０μｌの混合物をＥＣＨＯソースプレート（Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ３８４ウェル・ロウデッドボリュームマイクロプレート）に移した。ソースプレート中の濃度は、２０ｍＭのモデル足場および８０ｍＭのＤＩＰＥ（４当量）、または８０ｍＭのＤＡＢＣＯ（４当量）、または８００ｍＭのＮＭＭ（４０当量）であった。カルボン酸は、１６０ｍＭのＤＩＰＥＡ、１６０ｍＭのＤＡＢＣＯ、または１ＭのＮＭＭのいずれかを含有するＤＭＳＯ中の１６０ｍＭストックとして調製した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中１６０ｍＭ）を各酸ストックに添加し、活性エステル（８０ｍＭ）を同じソースプレートに加えた。ソースプレートを３分間９５０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心機で２，０００ｒｐｍ）で遠心分離し、潜在的な気泡を除去した。Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ６５０アコースティックディスペンサーを使用して、４０ｎｌのモデル足場１（８００ｐｍｏｌ）をＮｕｎｃ ３８４ウェル低容量ポリスチレンプレートに移し、続いて４０ｎｌの活性エステル（３．２ｎｍｏｌ、４当量）を移した。ＬＣ－ＭＳ分析に十分な材料を得るため、移送は二連で実施した。プレートを密閉し、反応を６時間室温で進行させた。この後、８μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ７．５）を二連反応物のそれぞれに添加し、二連反応物をプールし、３時間インキュベートし、活性化酸をＴｒｉｓでクエンチし、反応物をＬＣ－ＭＳにより分析した。
モデル足場は、以下のように８０ｎｌの容量で、８００ｐｍｏｌスケールでアシル化した。足場１（ＤＭＳＯ中４０ｍＭストックの２０μＬ）に、塩基（ＤＭＳＯに溶解した、２０μＬの１６０ｍＭ ＤＩＰＥＡ、２０μＬの１６０ｍＭ ＤＡＢＣＯ、２０μＬの１６０ｍＭ ＨＥＰＥＳナトリウム塩、または２０μＬの１Ｍ ＮＭＭ）を補充し、１０μｌの混合物をＥＣＨＯソースプレート（Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ３８４ウェル・ロウデッドボリュームマイクロプレート）に移した。ソースプレート中の濃度は、２０ｍＭのモデル足場および８０ｍＭのＤＩＰＥ（４当量）、または８０ｍＭのＤＡＢＣＯ（４当量）、または８００ｍＭのＮＭＭ（４０当量）であった。カルボン酸は、１６０ｍＭのＤＩＰＥＡ、１６０ｍＭのＤＡＢＣＯ、または１ＭのＮＭＭのいずれかを含有するＤＭＳＯ中の１６０ｍＭストックとして調製した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中１６０ｍＭ）を各酸ストックに添加し、活性エステル（８０ｍＭ）を同じソースプレートに加えた。ソースプレートを３分間９５０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心機で２，０００ｒｐｍ）で遠心分離し、潜在的な気泡を除去した。Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ６５０アコースティックディスペンサーを使用して、４０ｎｌのモデル足場１（８００ｐｍｏｌ）をＮｕｎｃ ３８４ウェル低容量ポリスチレンプレートに移し、続いて４０ｎｌの活性エステル（３．２ｎｍｏｌ、４当量）を移した。ＬＣ－ＭＳ分析に十分な材料を得るため、移送は二連で実施した。プレートを密閉し、反応を６時間室温で進行させた。この後、８μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ７．５）を二連反応物のそれぞれに添加し、二連反応物をプールし、３時間インキュベートし、活性化酸をＴｒｉｓでクエンチし、反応物をＬＣ－ＭＳにより分析した。
【0152】
アコースティック試薬移送によるモデル足場２～５のアシル化
Ｅｎａｍｉｎｅ社から購入したモデル足場２～５は、１．１～１．２ｍｇの粉末として得た。足場を６２～８８μｌのＤＭＳＯに溶解し、４０ｍＭのストックを得た。足場を、上記のモデル足場１について説明したように、ＤＡＢＣＯを塩基として使用してアシル化したが、以下が異なる：反応時間が６時間。ＬＣ－ＭＳ分析の前に、７２０ｎｌのＤＭＳＯを各ウェルに分注し、次いで７．２μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ７．５）を分注した。クエンチングを一晩行った。
Ｅｎａｍｉｎｅ社から購入したモデル足場２～５は、１．１～１．２ｍｇの粉末として得た。足場を６２～８８μｌのＤＭＳＯに溶解し、４０ｍＭのストックを得た。足場を、上記のモデル足場１について説明したように、ＤＡＢＣＯを塩基として使用してアシル化したが、以下が異なる：反応時間が６時間。ＬＣ－ＭＳ分析の前に、７２０ｎｌのＤＭＳＯを各ウェルに分注し、次いで７．２μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ７．５）を分注した。クエンチングを一晩行った。
【0153】
足場とアミノ酸配列の設計
ライブラリー１に使用した環状ペプチドの足場は、アミノ酸配列をランダムに選択することにより調製した。選択した足場フォーマットとアミノ酸ビルディングブロックに基づいて理論的に生成され得る様々な配列の数は、以下に説明するように、ライブラリー１で合成された足場の数（３８４）よりもはるかに多かった。
ライブラリー１に使用した環状ペプチドの足場は、アミノ酸配列をランダムに選択することにより調製した。選択した足場フォーマットとアミノ酸ビルディングブロックに基づいて理論的に生成され得る様々な配列の数は、以下に説明するように、ライブラリー１で合成された足場の数（３８４）よりもはるかに多かった。
【0154】
ライブラリー１の理論上の足場の数：
・ジアミノ酸を含有する足場：３，２４０
足場フォーマットの数（６）×ジアミノ酸の数（６）×骨格アミノ酸の数（６）×側鎖アミノ酸の数（１５）
・システインを含有する足場：５４０
足場フォーマットの数（６）×骨格アミノ酸の数（６）×側鎖アミノ酸の数（１５）。
・ジアミノ酸を含有する足場：３，２４０
足場フォーマットの数（６）×ジアミノ酸の数（６）×骨格アミノ酸の数（６）×側鎖アミノ酸の数（１５）
・システインを含有する足場：５４０
足場フォーマットの数（６）×骨格アミノ酸の数（６）×側鎖アミノ酸の数（１５）。
【0155】
３８４個のアミノ酸配列をランダムに選択するために、すべてのビルディングブロックに英数字の識別子を割り当て、可能なすべての順列を手作業で列挙した。ペプチドには１～３，７８０の番号が割り当てられた。次いで、ランダムシーケンスジェネレーター（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）を使用し、番号を並べ替え、最初の３８４個を合成用に選択した。
【0156】
ライブラリー合成用のポリスチレン－Ｓ－Ｓ－システアミン樹脂の調製
以下の手順を適用して、ライブラリー１（トロンビンスクリーニング）の足場の合成に必要な、４×９６ペプチドを４枚の９６ウェルプレートにおいて５μｍｏｌスケールで合成するためのポリスチレン－Ｓ－Ｓ－システアミン樹脂を調製した。４本のそれぞれの２０ｍｌプラスチックシリンジ（ＣＥＭ、９９．２７８）に、５８９ｍｇの樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＨＡ４０００４．０ ポリスチレンＡ ＳＨ樹脂、２００～４００メッシュ）を、０．５ｍｍｏｌスケールに相当する０．８５ｍｍｏｌ／グラムの充填で加えた。樹脂を１５ｍＬのＤＣＭで洗浄し、次いで１５ｍｌの３：７ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中で２０分間膨潤させた。２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミン塩酸塩（１．９６グラム、８．８ミリモル、４．４当量）を２１．１２ｍｌのＭｅＯＨに溶解し、次いで４９．２８ｍｌのＤＣＭおよび１．５３ｍｌのＤＩＰＥＡを添加した。１７．７ｍｌのこの溶液を各シリンジに入れ、次いでこれを室温で３時間振盪した。この後、２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミン溶液を廃棄し、樹脂を２×２０ｍｌの３：７ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで洗浄し、次いで２×２０ｍｌのＤＭＦで洗浄した。樹脂をＤＭＦ中の懸濁液として単一シリンジにまとめ、次いでＤＭＦ中の１．２Ｍ ＤＩＰＥＡ溶液１１．８ｍｌで５分間洗浄し、すべてのアミンが確実に中性であるようにした。この溶液を廃棄し、樹脂を２×２０ｍｌのＤＭＦで洗浄し、４×２０ｍｌのＤＣＭで洗浄した後、真空下で一晩保持し、流動性粉末を得た。ライブラリー用足場（ＭＤＭ２スクリーニング）の合成においては、樹脂の装填量は０．９５ミリモル／グラムであり、したがって５２６ｍｇの樹脂を２本のそれぞれのシリンジに加えた。
以下の手順を適用して、ライブラリー１（トロンビンスクリーニング）の足場の合成に必要な、４×９６ペプチドを４枚の９６ウェルプレートにおいて５μｍｏｌスケールで合成するためのポリスチレン－Ｓ－Ｓ－システアミン樹脂を調製した。４本のそれぞれの２０ｍｌプラスチックシリンジ（ＣＥＭ、９９．２７８）に、５８９ｍｇの樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＨＡ４０００４．０ ポリスチレンＡ ＳＨ樹脂、２００～４００メッシュ）を、０．５ｍｍｏｌスケールに相当する０．８５ｍｍｏｌ／グラムの充填で加えた。樹脂を１５ｍＬのＤＣＭで洗浄し、次いで１５ｍｌの３：７ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖ中で２０分間膨潤させた。２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミン塩酸塩（１．９６グラム、８．８ミリモル、４．４当量）を２１．１２ｍｌのＭｅＯＨに溶解し、次いで４９．２８ｍｌのＤＣＭおよび１．５３ｍｌのＤＩＰＥＡを添加した。１７．７ｍｌのこの溶液を各シリンジに入れ、次いでこれを室温で３時間振盪した。この後、２－（２－ピリジニルジチオ）－エタンアミン溶液を廃棄し、樹脂を２×２０ｍｌの３：７ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ ｖ／ｖで洗浄し、次いで２×２０ｍｌのＤＭＦで洗浄した。樹脂をＤＭＦ中の懸濁液として単一シリンジにまとめ、次いでＤＭＦ中の１．２Ｍ ＤＩＰＥＡ溶液１１．８ｍｌで５分間洗浄し、すべてのアミンが確実に中性であるようにした。この溶液を廃棄し、樹脂を２×２０ｍｌのＤＭＦで洗浄し、４×２０ｍｌのＤＣＭで洗浄した後、真空下で一晩保持し、流動性粉末を得た。ライブラリー用足場（ＭＤＭ２スクリーニング）の合成においては、樹脂の装填量は０．９５ミリモル／グラムであり、したがって５２６ｍｇの樹脂を２本のそれぞれのシリンジに加えた。
【0157】
９６ウェルプレートにおけるペプチドライブラリー合成
自動固相ペプチド合成をＩｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ ＲＳｉ合成装置で実施した。トロンビンライブラリーについては、５０ｍｌチューブに、５６５ｍｇのポリスチレン－Ｓ－Ｓ－システアミン樹脂（チオール基がシステアミンで定量的に修飾されたと仮定した０．４８ｍｍｏｌのシステアミン）および２０ｍｌのＤＭＦを加えた。ＭＤＭ２ライブラリーについては、５０５ｍｇの官能基化樹脂を代わりに加えた。樹脂が確実に均一に懸濁するようにチューブを振盪し、２００μｌ（５．８８ｍｇ樹脂、５μｍｏｌ）を９６ウェル固相合成プレート（Ｏｒｏｃｈｅｍ ＯＦ １１００）の各ウェルに移した。樹脂を６×１５０μｌのＤＭＦで洗浄した。カップリングは、５３μｌのアミノ酸（５００ｍＭ、５．３当量）、５０μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、５当量）、１２．５μｌのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、１０当量）、および５μｌのＮ－メチルピロリドンで実施した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に加えた（１時間反応、振盪なし）。カップリング反応の最終容量は１２０．５μｌであり、試薬の最終濃度は２２０ｍＭのアミノ酸、２０８ｍＭのＨＡＴＵおよび４１５のＮ－メチルモルホリンであった。カップリングを２回実施し、次いで樹脂を６×２２５μｌのＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護は、１２０μｌの１：５ピペリジン／ＤＭＦ ｖ／ｖを使用して５分間実施し、２回実施した。樹脂を８×２２５μｌのＤＭＦで洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂を２×２００μｌのＤＣＭで洗浄した。
自動固相ペプチド合成をＩｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ ＲＳｉ合成装置で実施した。トロンビンライブラリーについては、５０ｍｌチューブに、５６５ｍｇのポリスチレン－Ｓ－Ｓ－システアミン樹脂（チオール基がシステアミンで定量的に修飾されたと仮定した０．４８ｍｍｏｌのシステアミン）および２０ｍｌのＤＭＦを加えた。ＭＤＭ２ライブラリーについては、５０５ｍｇの官能基化樹脂を代わりに加えた。樹脂が確実に均一に懸濁するようにチューブを振盪し、２００μｌ（５．８８ｍｇ樹脂、５μｍｏｌ）を９６ウェル固相合成プレート（Ｏｒｏｃｈｅｍ ＯＦ １１００）の各ウェルに移した。樹脂を６×１５０μｌのＤＭＦで洗浄した。カップリングは、５３μｌのアミノ酸（５００ｍＭ、５．３当量）、５０μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、５当量）、１２．５μｌのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、１０当量）、および５μｌのＮ－メチルピロリドンで実施した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に加えた（１時間反応、振盪なし）。カップリング反応の最終容量は１２０．５μｌであり、試薬の最終濃度は２２０ｍＭのアミノ酸、２０８ｍＭのＨＡＴＵおよび４１５のＮ－メチルモルホリンであった。カップリングを２回実施し、次いで樹脂を６×２２５μｌのＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護は、１２０μｌの１：５ピペリジン／ＤＭＦ ｖ／ｖを使用して５分間実施し、２回実施した。樹脂を８×２２５μｌのＤＭＦで洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂を２×２００μｌのＤＣＭで洗浄した。
【0158】
ライブラリー側鎖保護基の除去
側鎖保護基を除去するため、９６ウェル合成プレートの底を、柔らかい厚さ６ｍｍのエチレン－酢酸ビニル発泡パッド（Ｒａｙｈｅｒ Ｈｏｂｂｙ ＧｍｂＨ、７８ ２６３ ０１）上にプレートを押し付けることにより密閉し、各ウェルの樹脂を約５００μｌの３８：１：１ ＴＦＡ／ＴＩＳ／ｄｄＨ２Ｏ ｖ／ｖ／ｖと１時間インキュベートした。プレートをポリプロピレン粘着シールで覆い、次いで重り（１ｋｇ）を上に載せることにより加重し、漏れが生じないようにした。１．５時間後、合成プレートを２ｍｌのディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２７８７５２）上に置き、ＴＦＡ混合物を排出させた。ウェルを３×５００μｌのＤＣＭ（シリンジで添加）で洗浄し、次いで３時間風乾させた。
側鎖保護基を除去するため、９６ウェル合成プレートの底を、柔らかい厚さ６ｍｍのエチレン－酢酸ビニル発泡パッド（Ｒａｙｈｅｒ Ｈｏｂｂｙ ＧｍｂＨ、７８ ２６３ ０１）上にプレートを押し付けることにより密閉し、各ウェルの樹脂を約５００μｌの３８：１：１ ＴＦＡ／ＴＩＳ／ｄｄＨ２Ｏ ｖ／ｖ／ｖと１時間インキュベートした。プレートをポリプロピレン粘着シールで覆い、次いで重り（１ｋｇ）を上に載せることにより加重し、漏れが生じないようにした。１．５時間後、合成プレートを２ｍｌのディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２７８７５２）上に置き、ＴＦＡ混合物を排出させた。ウェルを３×５００μｌのＤＣＭ（シリンジで添加）で洗浄し、次いで３時間風乾させた。
【0159】
９６ウェルプレートにおけるライブラリーペプチドのライブラリー環化的遊離
プレートを上記のように発泡パッドに押し付けて開口部を塞ぎ、ＤＭＳＯ中の１５０ｍＭ ＤＡＢＣＯ（６当量）の２００μｌを各ウェルに添加した。プレートを接着ホイルで密封し、加重し（１ｋｇ）、一晩置いた。翌日、合成プレートを２ｍｌのディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２７８７５２）上に置き、約２００ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機で１，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離を行い、ＤＭＳＯ中の切断された大環状分子を回収した。
プレートを上記のように発泡パッドに押し付けて開口部を塞ぎ、ＤＭＳＯ中の１５０ｍＭ ＤＡＢＣＯ（６当量）の２００μｌを各ウェルに添加した。プレートを接着ホイルで密封し、加重し（１ｋｇ）、一晩置いた。翌日、合成プレートを２ｍｌのディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２７８７５２）上に置き、約２００ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機で１，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離を行い、ＤＭＳＯ中の切断された大環状分子を回収した。
【0160】
吸収によるライブラリーペプチドの定量
吸光度測定は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用し、１０ｍｍの光路長を使用し、２８０ｎｍの波長で実施した。ＴｒｐおよびＤ－Ｔｒｐを含有する切断されたペプチドを、トロンビンライブラリーについては、水で２５０倍希釈し、ＭＤＭ２ライブラリーについては、水で１２５倍希釈した。Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則を使用してペプチドの濃度を算出した。吸光係数Ｔｒｐ ε２８０＝５，５００Ｍ－１ｃｍ－１を使用した。
吸光度測定は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用し、１０ｍｍの光路長を使用し、２８０ｎｍの波長で実施した。ＴｒｐおよびＤ－Ｔｒｐを含有する切断されたペプチドを、トロンビンライブラリーについては、水で２５０倍希釈し、ＭＤＭ２ライブラリーについては、水で１２５倍希釈した。Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則を使用してペプチドの濃度を算出した。吸光係数Ｔｒｐ ε２８０＝５，５００Ｍ－１ｃｍ－１を使用した。
【0161】
ＬＣ－ＭＳ分析
ペプチドは、Ｃ１８逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．１ｍｍ×５０ｍｍ Ｃ１８カラム、１００Å細孔、２．６μｍ粒子）および溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ、０．０５％ギ酸）に対する溶媒Ｂ（アセトニトリル、０．０５％ギ酸）の線形勾配を用いて１ｍｌ／分の流速で行うＵＨＰＬＣおよびシングル四重極ＭＳシステム（Ｓｈｉｍａｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０）でＬＣ－ＭＳ分析により分析した。質量分析は陽イオンモードで実施した。
ペプチドは、Ｃ１８逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．１ｍｍ×５０ｍｍ Ｃ１８カラム、１００Å細孔、２．６μｍ粒子）および溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ、０．０５％ギ酸）に対する溶媒Ｂ（アセトニトリル、０．０５％ギ酸）の線形勾配を用いて１ｍｌ／分の流速で行うＵＨＰＬＣおよびシングル四重極ＭＳシステム（Ｓｈｉｍａｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０）でＬＣ－ＭＳ分析により分析した。質量分析は陽イオンモードで実施した。
【0162】
ＬＣ－ＭＳ分析のために、様々な実験のサンプルを以下のように調製した。アシル化の概念実証反応を分析するために、１６０ｎｌの反応混合物を１６μｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーｐＨ７．５で希釈して、ペプチド濃度１００μＭを得た。ライブラリー１用に合成された足場を分析するために、１μｌのＤＭＳＯ／ＤＡＢＣＯ溶出液を８０μｌの水で希釈して、約１２０μＭの環状ペプチド濃度を得た。ライブラリー２用に合成された足場を分析するために、１μｌのＤＭＳＯ／ＤＡＢＣＯ溶出液を１２８μｌの水で希釈して、約１２０μＭの環状ペプチド濃度を得た。すべての分析において、５μｌのサンプルは、典型的には、５分かけて溶媒Ｂの０～６０％勾配を使用し、注入した。
【0163】
大環状分子の物理化学的特性の計算
物理化学的特性の分子量、計算した水／ｎ－オクタノール分配係数（ｃＬｏｇＰ）、水素結合供与体（ＨＢＤ）の数、水素結合受容体（ＨＢＡ）の数、極性表面積（ＰＳＡ）、および回転可能な結合の数（ＮＲｏｔＢ）は、ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｏｐｅｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ｏｒｇ）を使用して計算した。足場とカルボン酸の構造はＣｈｅｍＤｒａｗで描画され、１つは足場用、もう１つは酸用として、ＳＭＩＬＥＳ文字列としてＳＤファイルに保存した。ＳＤファイルは両方とも、ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒで開く。「コンビナトリアルライブラリーを列挙する」機能を使用して、大環状骨格とカルボン酸の間の所望のアミド結合形成反応を定義した。以下の定義を行った：アミドは「除外基」として定義した。窒素原子は、芳香環の一部ではなく、０より大きい水素原子数を有するものとして定義した。アミンの隣の炭素原子は芳香族ではなく、パイ電子を含まないものとして定義した。次いで、出発物質と生成物の原子をマッピングした。コンビナトリアル列挙後に、構造から所望の特性を計算した。
物理化学的特性の分子量、計算した水／ｎ－オクタノール分配係数（ｃＬｏｇＰ）、水素結合供与体（ＨＢＤ）の数、水素結合受容体（ＨＢＡ）の数、極性表面積（ＰＳＡ）、および回転可能な結合の数（ＮＲｏｔＢ）は、ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｏｐｅｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ｏｒｇ）を使用して計算した。足場とカルボン酸の構造はＣｈｅｍＤｒａｗで描画され、１つは足場用、もう１つは酸用として、ＳＭＩＬＥＳ文字列としてＳＤファイルに保存した。ＳＤファイルは両方とも、ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒで開く。「コンビナトリアルライブラリーを列挙する」機能を使用して、大環状骨格とカルボン酸の間の所望のアミド結合形成反応を定義した。以下の定義を行った：アミドは「除外基」として定義した。窒素原子は、芳香環の一部ではなく、０より大きい水素原子数を有するものとして定義した。アミンの隣の炭素原子は芳香族ではなく、パイ電子を含まないものとして定義した。次いで、出発物質と生成物の原子をマッピングした。コンビナトリアル列挙後に、構造から所望の特性を計算した。
【0164】
ライブラリー１を生成するための足場のアシル化
ペプチドを樹脂から遊離させるために使用した溶媒（１５０ｍＭのＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯ）中の環状ペプチド足場を、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ３８４ウェル・ロウ・デッド・ボリューム・マイクロプレート（１ウェルにつき１０μｌ）に移した。環状ペプチド足場の濃度は、平均で約８．１ｍＭであった。カルボン酸を、１６０ｍＭのＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯに１６０ｍＭまで溶解した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中に１６０ｍＭ）を各酸のストックに添加した。活性エステル（８０ｍＭ）を別のロウ・デッド・ボリュームソースプレートに加えた。このソースプレートを８５０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機による２，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離を行い、潜在的な気泡を除去した。Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ６５０アコースティックディスペンサーを使用して、２０ｎｌの足場（１６０ｐｍｏｌ）を３８４ウェル低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）に移し、続いて２０ｎｌの活性エステル（１．６ｎｍｏｌ、１０当量）を移した。プレートを密閉し、反応を６時間、室温で進行させた。この後、５μｌのＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）を各ウェルにＢｉｏＴｅｋ ＭｕｌｔｉＦｌｏ社のマイクロプレートディスペンサーを使用して分注した。反応を室温で一晩クエンチした。
ペプチドを樹脂から遊離させるために使用した溶媒（１５０ｍＭのＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯ）中の環状ペプチド足場を、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ３８４ウェル・ロウ・デッド・ボリューム・マイクロプレート（１ウェルにつき１０μｌ）に移した。環状ペプチド足場の濃度は、平均で約８．１ｍＭであった。カルボン酸を、１６０ｍＭのＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯに１６０ｍＭまで溶解した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中に１６０ｍＭ）を各酸のストックに添加した。活性エステル（８０ｍＭ）を別のロウ・デッド・ボリュームソースプレートに加えた。このソースプレートを８５０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機による２，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離を行い、潜在的な気泡を除去した。Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ６５０アコースティックディスペンサーを使用して、２０ｎｌの足場（１６０ｐｍｏｌ）を３８４ウェル低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）に移し、続いて２０ｎｌの活性エステル（１．６ｎｍｏｌ、１０当量）を移した。プレートを密閉し、反応を６時間、室温で進行させた。この後、５μｌのＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）を各ウェルにＢｉｏＴｅｋ ＭｕｌｔｉＦｌｏ社のマイクロプレートディスペンサーを使用して分注した。反応を室温で一晩クエンチした。
【0165】
トロンビン阻害スクリーニング
ライブラリー１の大環状分子によるトロンビン阻害は、平均最終濃度１１μＭの環状ペプチドの存在下でのトロンビンの残存活性を測定することにより評価した。アッセイは、３８４ウェルプレートで、ｐＨ７．４のＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、および０．６％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ）を使用し、最終濃度２ｎＭのトロンビンおよび最終濃度５０μＭの蛍光発生基質Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣを用いて実施した。上記のＴｒｉｓ－Ｃｌバッファー中のトロンビン（５μｌ、６ｎＭ）は、ＢｉｏＴｅｋ ＭｕｌｔｉＦｌｏ社マイクロプレートディスペンサーを使用して各ペプチドに添加し、室温で１０分間インキュベートした。同じバッファー中の蛍光基質（５μＬ、１５０μＭ）を、ＢｉｏＴｅｋ ＭｕｌｔｉＦｌｏ社マイクロプレートディスペンサーを使用して添加し、蛍光強度をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ社のＭ２００ Ｐｒｏ蛍光プレートリーダー（３６０ｎｍで励起、４６５ｎｍで発光）を用いて、２５℃で３０分間、３分ごとに読み取ることにより測定した。各活性測定曲線の傾きは、Ｅｘｃｅｌで計算した。陰性対照（ＤＭＳＯを含有するが大環状分子は含有しない２０ウェル）については、平均傾きを算出した。トロンビン阻害のパーセントは、傾きを割って、１００を乗じることにより算出した。
ライブラリー１の大環状分子によるトロンビン阻害は、平均最終濃度１１μＭの環状ペプチドの存在下でのトロンビンの残存活性を測定することにより評価した。アッセイは、３８４ウェルプレートで、ｐＨ７．４のＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、および０．６％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ）を使用し、最終濃度２ｎＭのトロンビンおよび最終濃度５０μＭの蛍光発生基質Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣを用いて実施した。上記のＴｒｉｓ－Ｃｌバッファー中のトロンビン（５μｌ、６ｎＭ）は、ＢｉｏＴｅｋ ＭｕｌｔｉＦｌｏ社マイクロプレートディスペンサーを使用して各ペプチドに添加し、室温で１０分間インキュベートした。同じバッファー中の蛍光基質（５μＬ、１５０μＭ）を、ＢｉｏＴｅｋ ＭｕｌｔｉＦｌｏ社マイクロプレートディスペンサーを使用して添加し、蛍光強度をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ社のＭ２００ Ｐｒｏ蛍光プレートリーダー（３６０ｎｍで励起、４６５ｎｍで発光）を用いて、２５℃で３０分間、３分ごとに読み取ることにより測定した。各活性測定曲線の傾きは、Ｅｘｃｅｌで計算した。陰性対照（ＤＭＳＯを含有するが大環状分子は含有しない２０ウェル）については、平均傾きを算出した。トロンビン阻害のパーセントは、傾きを割って、１００を乗じることにより算出した。
【0166】
ライブラリー２を生成するための足場のアシル化
ペプチドを樹脂から遊離させるために使用した溶媒（１５０ｍＭ ＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯ）中の環状ペプチド足場を、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ認定３８４ウェル・ポリプロピレンマイクロプレート（１ウェル当たり４０μＬ）に移した。環状ペプチド足場の濃度は、平均で約１２．９ｍＭであった。カルボン酸をＤＡＢＣＯの１８４ｍＭ ＤＭＳＯ溶液に１８４ｍＭまで溶解した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中に１８４ｍＭ）を各酸のストックに添加した。活性エステル（９２ｍＭ）を同じポリプロピレンソースプレートに添加した。このソースプレートを、９５０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機で２，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離を行い、潜在的な気泡を除去した。Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ６５０アコースティックディスペンサーを使用して、１２．５ｎｌの大環状分子（１６１ｐｍｏｌ）を、３８４ウェル低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）に移し、続いて１７．５ｎｌの活性エステル（１．６１ｎｍｏｌ、１０当量）を移した。プレートを密閉し、反応を６時間、室温で進行させた。この後、５μｍｌのＴｒｉｓバッファーを、Ｇｙｇｅｒ Ｃｅｒｔｕｓ Ｆｌｅｘ液体ディスペンサーを使用して各ウェルに分注し、反応を一晩、室温でクエンチした。
ペプチドを樹脂から遊離させるために使用した溶媒（１５０ｍＭ ＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯ）中の環状ペプチド足場を、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ認定３８４ウェル・ポリプロピレンマイクロプレート（１ウェル当たり４０μＬ）に移した。環状ペプチド足場の濃度は、平均で約１２．９ｍＭであった。カルボン酸をＤＡＢＣＯの１８４ｍＭ ＤＭＳＯ溶液に１８４ｍＭまで溶解した。等量のＨＢＴＵ（ＤＭＳＯ中に１８４ｍＭ）を各酸のストックに添加した。活性エステル（９２ｍＭ）を同じポリプロピレンソースプレートに添加した。このソースプレートを、９５０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機で２，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離を行い、潜在的な気泡を除去した。Ｌａｂｃｙｔｅ Ｅｃｈｏ ６５０アコースティックディスペンサーを使用して、１２．５ｎｌの大環状分子（１６１ｐｍｏｌ）を、３８４ウェル低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）に移し、続いて１７．５ｎｌの活性エステル（１．６１ｎｍｏｌ、１０当量）を移した。プレートを密閉し、反応を６時間、室温で進行させた。この後、５μｍｌのＴｒｉｓバッファーを、Ｇｙｇｅｒ Ｃｅｒｔｕｓ Ｆｌｅｘ液体ディスペンサーを使用して各ウェルに分注し、反応を一晩、室温でクエンチした。
【0167】
ＭＤＭ２結合スクリーニング
環状ペプチドによるＭＤＭ２結合は、平均最終濃度１１μＭの環状ペプチドの存在下での蛍光ｐ５３ペプチドプローブの置換を測定することによって評価した。アッセイは、３８４ウェルプレートで、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０、および３％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ）、最終濃度１．２μＭのＭＤＭ２、および最終濃度２５ｎＭの蛍光ｐ５３ペプチドプローブ（ＦＰ５３、配列＝５（６）－ＦＡＭ－ＧＳＧＳＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ）を使用して実施した。上述のＰＢＳバッファー中で事前混合したＭＤＭ２およびＦＰ５３（１０μｌ、１．８ｍＭ ＭＤＭ２、３７．５ｎＭ ＦＰ５３）を、Ｇｙｇｅｒ Ｃｅｒｔｕｓ Ｆｌｅｘ液体バルクディスペンサーを使用して各ペプチドに添加し、３０分間、暗所で室温にてインキュベートした。蛍光異方性の１回の読み取りは、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ Ｐｒｏ蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍで励起、５３５ｎｍで発光）を使用して２５℃で行った。プローブ置換のパーセンテージは、次式
環状ペプチドによるＭＤＭ２結合は、平均最終濃度１１μＭの環状ペプチドの存在下での蛍光ｐ５３ペプチドプローブの置換を測定することによって評価した。アッセイは、３８４ウェルプレートで、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０、および３％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ）、最終濃度１．２μＭのＭＤＭ２、および最終濃度２５ｎＭの蛍光ｐ５３ペプチドプローブ（ＦＰ５３、配列＝５（６）－ＦＡＭ－ＧＳＧＳＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ）を使用して実施した。上述のＰＢＳバッファー中で事前混合したＭＤＭ２およびＦＰ５３（１０μｌ、１．８ｍＭ ＭＤＭ２、３７．５ｎＭ ＦＰ５３）を、Ｇｙｇｅｒ Ｃｅｒｔｕｓ Ｆｌｅｘ液体バルクディスペンサーを使用して各ペプチドに添加し、３０分間、暗所で室温にてインキュベートした。蛍光異方性の１回の読み取りは、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ Ｐｒｏ蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍで励起、５３５ｎｍで発光）を使用して２５℃で行った。プローブ置換のパーセンテージは、次式
【0168】
【数1】
【0169】
（式中、Ｎは陰性対照（阻害なし）の平均異方性であり、Ｘは各ウェルについて得られた値であり、Ｐはプローブのみの平均異方性である）を使用して算出した。
ヒットからの反応における活性種の特定
トロンビンスクリーニングにおいてヒットとして同定された大環状分子は、１５０ｍＭのＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯ中の８ｍＭ環状ペプチド足場５μｌを、８０ｍＭのカルボン酸、８０ｍＭのＨＢＴＵおよび８０ｍＭのＤＡＢＣＯの５μｌと５時間、室温で反応させることにより、４０ｎｍｏｌスケールで再合成した。残存する活性化エステルを、１．２５ｍｌのＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２）を添加し、一晩インキュベートすることによりクエンチした。翌日、２４０μｌのＭｅＣＮおよび１ｍｌの水を添加し、反応は、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）および溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）の１０～８０％勾配を２０分間使用するＴｈｅｒｍｏ Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ上のＣ１８カラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＮｏｖａＰａｋ Ｃ－１８カラム、６０Å細孔、６μｍ粒子）上で実施し、分画を毎分回収した。分画を凍結乾燥し、２％のＤＭＳＯ水溶液１２０μｌに溶解した。分画中の生成物の活性は、９６ウェルプレート以外は、上記と同じアッセイを使用して測定した。各分画の５０μｌを９６ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５１０１）に移し、続いて５０μｌのトロンビン（バッファー中６ｎＭ）を移した。１０分間インキュベーションした後、５０μｌの蛍光発生トロンビン基質（Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、バッファー１％ＤＭＳＯ中１５０μＭ）を添加し、プレートを読み取り、データを上記のように処理した。活性分画中の化合物は、質量分析により同定した。
ヒットからの反応における活性種の特定
トロンビンスクリーニングにおいてヒットとして同定された大環状分子は、１５０ｍＭのＤＡＢＣＯを含有するＤＭＳＯ中の８ｍＭ環状ペプチド足場５μｌを、８０ｍＭのカルボン酸、８０ｍＭのＨＢＴＵおよび８０ｍＭのＤＡＢＣＯの５μｌと５時間、室温で反応させることにより、４０ｎｍｏｌスケールで再合成した。残存する活性化エステルを、１．２５ｍｌのＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２）を添加し、一晩インキュベートすることによりクエンチした。翌日、２４０μｌのＭｅＣＮおよび１ｍｌの水を添加し、反応は、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）および溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）の１０～８０％勾配を２０分間使用するＴｈｅｒｍｏ Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ上のＣ１８カラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＮｏｖａＰａｋ Ｃ－１８カラム、６０Å細孔、６μｍ粒子）上で実施し、分画を毎分回収した。分画を凍結乾燥し、２％のＤＭＳＯ水溶液１２０μｌに溶解した。分画中の生成物の活性は、９６ウェルプレート以外は、上記と同じアッセイを使用して測定した。各分画の５０μｌを９６ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５１０１）に移し、続いて５０μｌのトロンビン（バッファー中６ｎＭ）を移した。１０分間インキュベーションした後、５０μｌの蛍光発生トロンビン基質（Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、バッファー１％ＤＭＳＯ中１５０μＭ）を添加し、プレートを読み取り、データを上記のように処理した。活性分画中の化合物は、質量分析により同定した。
【0170】
ＭＤＭ２スクリーニングからのヒットについては、５０ｎｍｏｌスケール以外は同じ方法で反応を実施し、溶媒Ｂの１０～８０％勾配および２２分間かけること以外は同じ方法で精製した。分画を凍結乾燥し、４０μｌのＤＭＳＯに溶解し、１６０μｌの水を添加し、５μｌの各分画を３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）に移し、１５μｌの事前混合したＭＤＭ２／ＦＰ５３ペプチドを加えた（最終濃度：１．２μＭ ＭＤＭ２、５０ｎＭ ＦＰ５３、５％ＤＭＳＯ）。
【0171】
Ｍ１によるトロンビンの結晶化
ヒトα－トロンビンは、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した（カタログ番号：ＨＣＴ－００２０）。タンパク質安定化剤は、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、および溶媒としての同じバッファーで平衡化したＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して除去した。バッファー交換したヒトα－トロンビンを、大環状分子Ｍ１とモル比１：３でインキュベートし、続いて３，０００ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社）を使用して、７．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。さらに、Ｍ１大環状化合物を濃縮中に添加し、確実に３倍モル過剰が保持されるようにした。複合体の結晶化試験は、９６ウェル２滴ＭＲＣプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ＣＡ、米国）において２９３Ｋで、シッティング・ドロップ蒸気拡散法とＭｏｒｐｈｅｕｓおよびＬＭＢ結晶化スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｌｔｄ社、サフォーク、英国）を使用して実施した。６００ｎｌ容量の液滴（１：１のタンパク質：沈殿剤比で）は、Ｏｒｙｘ ８結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ社、バークシャー、英国）を使用して設定し、８０μｌのリザーバー溶液に対して平衡化した。最良の結晶は、沈殿剤として以下の混合物を使用し、２～３日間平衡化させた新鮮な液滴にマイクロシーディングを適用することによって得た：２０ｍＭのギ酸ナトリウム、２０ｍＭの酢酸アンモニウム、２０ｍＭのクエン酸三塩基性二水和物、２０ｍＭの酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、２０ｍＭのオキサム酸ナトリウム、１００ｍＭのＭＯＰＳ／ＨＥＰＥＳナトリウム ｐＨ７．５、１２．５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ １０００、１２．５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ３３５０、１２．５％ ｖ／ｖ ＭＰＤ。
ヒトα－トロンビンは、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した（カタログ番号：ＨＣＴ－００２０）。タンパク質安定化剤は、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、および溶媒としての同じバッファーで平衡化したＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して除去した。バッファー交換したヒトα－トロンビンを、大環状分子Ｍ１とモル比１：３でインキュベートし、続いて３，０００ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社）を使用して、７．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。さらに、Ｍ１大環状化合物を濃縮中に添加し、確実に３倍モル過剰が保持されるようにした。複合体の結晶化試験は、９６ウェル２滴ＭＲＣプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ＣＡ、米国）において２９３Ｋで、シッティング・ドロップ蒸気拡散法とＭｏｒｐｈｅｕｓおよびＬＭＢ結晶化スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｌｔｄ社、サフォーク、英国）を使用して実施した。６００ｎｌ容量の液滴（１：１のタンパク質：沈殿剤比で）は、Ｏｒｙｘ ８結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ社、バークシャー、英国）を使用して設定し、８０μｌのリザーバー溶液に対して平衡化した。最良の結晶は、沈殿剤として以下の混合物を使用し、２～３日間平衡化させた新鮮な液滴にマイクロシーディングを適用することによって得た：２０ｍＭのギ酸ナトリウム、２０ｍＭの酢酸アンモニウム、２０ｍＭのクエン酸三塩基性二水和物、２０ｍＭの酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、２０ｍＭのオキサム酸ナトリウム、１００ｍＭのＭＯＰＳ／ＨＥＰＥＳナトリウム ｐＨ７．５、１２．５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ １０００、１２．５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ３３５０、１２．５％ ｖ／ｖ ＭＰＤ。
【0172】
結晶化、データ収集および構造決定
Ｘ線データを収集するため、結晶をＬｉｔｈｏＬｏｏｐｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｌｔｄ社、サフォーク、英国）にマウントし、液体窒素で瞬間冷却した。Ｍ１と複合体化したヒトα－トロンビンのＸ線回折データは、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ Ｌｔｄ社（ＤＬＳ、オックスフォードシャー、英国）のｉ０４ビームラインで収集した。最良の結晶は、最大解像度２．２７Åまで回折した。結晶はＰ２１空間群に属し、単位格子の寸法は、ａ＝５６．２５Å、ｂ＝１００．５７Å、ｃ＝１０８．９０Å、α＝９０°、β＝９０．１１°、γ＝９０°である。非対称ユニットは４つの分子を含有し、２．７８Å３／ＤａのＭａｔｔｈｅｗｓ係数と結晶体積の約４８％の溶媒含量に相当する。フレームは、ソフトウェアＸＩＡ２でインデックス付けと統合が行われ、ＡＩＭＬＥＳＳ（ＣＣＰ４ｉ２結晶学パッケージ）でマージとスケーリングを行った（Ｍ．Ｗｉｎｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２０１１、６７、２３５～２４２頁）。構造は、モデル６ＧＷＥ（Ｓ．Ｋａｌｅら、Ｓｃｉ．Ａｄｖ．２０１９、５、ｅａａｗ２８５１）をテンプレートとして使用して、ソフトウェアＰＨＡＳＥＲ（Ａ．ＭｃＣｏｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００７、４０、６５８～６７４頁）を用いた分子置換により解明した。精密化は、ＲＥＦＭＡＣ（Ａ．Ｖａｇｉｎら Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２００４、６０、２１８４～２１９５頁）およびＰＨＥＮＩＸ（Ｐ．Ａｄａｍｓら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２０１０、６６、２１３～２２１頁）を使用して行った。精密化の最初のサイクルから、結合したリガンドに対応する幅広い電子密度が電子密度マップで明確に認識された。大環状分子のビルディングはＭｏｌｖｉｅｗによって実施され、拘束ファイルはＰｈｅｎｉｘ ｅＬＢＯＷによって生成および最適化された。大環状分子は、グラフィックソフトウェアＣＯＯＴにより手動でフィッティングした（Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２０１０、６６、４８６～５０１頁）。最終モデルには、９，０９８個のタンパク質原子、１６０個の大環状原子、４個のＮａ＋原子、および３９９個の水分子が含まれている。最終的な結晶学的Ｒファクターは、０．１８９（Ｒｆｒｅｅ０．２４３）に達した。モデルの幾何学的パラメーターは、この解像度で予想通りであるか、より良好である。溶媒排除容積および対応する埋没表面は、ＰＩＳＡソフトウェアおよび半径１．４Åの球状プローブを使用して算出した。分子内および分子間の水素結合相互作用は、ＰＲＯＦＵＮＣ（Ｒ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５、３３、Ｗ８９～Ｗ９３頁）、ＬＩＧＰＬＯＴ＋（Ｒ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．２０１１、５、２７７８～２７８６頁）、およびＰＹＭＯＬソフトウェアにより解析した。
Ｘ線データを収集するため、結晶をＬｉｔｈｏＬｏｏｐｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｌｔｄ社、サフォーク、英国）にマウントし、液体窒素で瞬間冷却した。Ｍ１と複合体化したヒトα－トロンビンのＸ線回折データは、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ Ｌｔｄ社（ＤＬＳ、オックスフォードシャー、英国）のｉ０４ビームラインで収集した。最良の結晶は、最大解像度２．２７Åまで回折した。結晶はＰ２１空間群に属し、単位格子の寸法は、ａ＝５６．２５Å、ｂ＝１００．５７Å、ｃ＝１０８．９０Å、α＝９０°、β＝９０．１１°、γ＝９０°である。非対称ユニットは４つの分子を含有し、２．７８Å３／ＤａのＭａｔｔｈｅｗｓ係数と結晶体積の約４８％の溶媒含量に相当する。フレームは、ソフトウェアＸＩＡ２でインデックス付けと統合が行われ、ＡＩＭＬＥＳＳ（ＣＣＰ４ｉ２結晶学パッケージ）でマージとスケーリングを行った（Ｍ．Ｗｉｎｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２０１１、６７、２３５～２４２頁）。構造は、モデル６ＧＷＥ（Ｓ．Ｋａｌｅら、Ｓｃｉ．Ａｄｖ．２０１９、５、ｅａａｗ２８５１）をテンプレートとして使用して、ソフトウェアＰＨＡＳＥＲ（Ａ．ＭｃＣｏｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００７、４０、６５８～６７４頁）を用いた分子置換により解明した。精密化は、ＲＥＦＭＡＣ（Ａ．Ｖａｇｉｎら Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２００４、６０、２１８４～２１９５頁）およびＰＨＥＮＩＸ（Ｐ．Ａｄａｍｓら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２０１０、６６、２１３～２２１頁）を使用して行った。精密化の最初のサイクルから、結合したリガンドに対応する幅広い電子密度が電子密度マップで明確に認識された。大環状分子のビルディングはＭｏｌｖｉｅｗによって実施され、拘束ファイルはＰｈｅｎｉｘ ｅＬＢＯＷによって生成および最適化された。大環状分子は、グラフィックソフトウェアＣＯＯＴにより手動でフィッティングした（Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２０１０、６６、４８６～５０１頁）。最終モデルには、９，０９８個のタンパク質原子、１６０個の大環状原子、４個のＮａ＋原子、および３９９個の水分子が含まれている。最終的な結晶学的Ｒファクターは、０．１８９（Ｒｆｒｅｅ０．２４３）に達した。モデルの幾何学的パラメーターは、この解像度で予想通りであるか、より良好である。溶媒排除容積および対応する埋没表面は、ＰＩＳＡソフトウェアおよび半径１．４Åの球状プローブを使用して算出した。分子内および分子間の水素結合相互作用は、ＰＲＯＦＵＮＣ（Ｒ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５、３３、Ｗ８９～Ｗ９３頁）、ＬＩＧＰＬＯＴ＋（Ｒ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．２０１１、５、２７７８～２７８６頁）、およびＰＹＭＯＬソフトウェアにより解析した。
【0173】
ライブラリー３および４を生成するための足場のアシル化
ライブラリー３および４に必要な環状ペプチド足場は、ライブラリー２において使用したものについて説明したように合成した。カップリングがより困難なＮ－メチル化アミノ酸が多く存在するため、２００ｍＭのＨＯＡｔをＨＡＴＵと一緒に適用した。足場をＤＭＳＯで２ｍＭに希釈し、アコースティック分注を使用して１５ｎＬを移し、続いてカルボン酸（４０ｍＭ、２０当量）、ＨＢＴＵ（４０ｍＭ）およびＤＡＢＣＯ（４０ｍＭ）を含有する１５ｎｌのＤＭＳＯを移した。室温で６時間反応させた後、３７０ｎｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、続いて０．０１％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含有する５μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４を添加して一晩クエンチした。ＭＤＭ２結合スクリーニングについては、ＭＤＭ２に対する親和性が高いことから、Ｆ－Ｍ８を蛍光プローブとして使用し、標的タンパク質を低濃度（７２０ｎＭ、約５５％の結合プローブ）で使用することができるようにした。３５μｌ容量のｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２８．６ｎＭのＦ－Ｍ８と８２３ｎＭ ＭＤＭ２を含有する０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０）をそれぞれのウェルに添加し、レポータープローブの置換を上記のようにして決定した。大環状分子の濃度は、７５０ｎＭであった。
ライブラリー３および４に必要な環状ペプチド足場は、ライブラリー２において使用したものについて説明したように合成した。カップリングがより困難なＮ－メチル化アミノ酸が多く存在するため、２００ｍＭのＨＯＡｔをＨＡＴＵと一緒に適用した。足場をＤＭＳＯで２ｍＭに希釈し、アコースティック分注を使用して１５ｎＬを移し、続いてカルボン酸（４０ｍＭ、２０当量）、ＨＢＴＵ（４０ｍＭ）およびＤＡＢＣＯ（４０ｍＭ）を含有する１５ｎｌのＤＭＳＯを移した。室温で６時間反応させた後、３７０ｎｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、続いて０．０１％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含有する５μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４を添加して一晩クエンチした。ＭＤＭ２結合スクリーニングについては、ＭＤＭ２に対する親和性が高いことから、Ｆ－Ｍ８を蛍光プローブとして使用し、標的タンパク質を低濃度（７２０ｎＭ、約５５％の結合プローブ）で使用することができるようにした。３５μｌ容量のｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２８．６ｎＭのＦ－Ｍ８と８２３ｎＭ ＭＤＭ２を含有する０．０１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０）をそれぞれのウェルに添加し、レポータープローブの置換を上記のようにして決定した。大環状分子の濃度は、７５０ｎＭであった。
【0174】
ｍｇスケールでの大環状分子の合成
自動固相ペプチド合成は、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ ＲＳｉ合成装置で実施した。５ｍｌシリンジ（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｖ０５１ ＰＥ０７６）に２５μｍｏｌのポリスチレン－Ｓ－Ｓ－システアミン樹脂を加えた。樹脂を６×１５０μｌのＤＭＦで洗浄した。カップリングは、２１０μＬのアミノ酸（５００ｍＭ、４．２当量）、２００μＬのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、４当量）、５０μＬのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、８当量）、および５μＬのＮ－メチルピロリドンを用いて実施した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に添加した（１時間反応、振盪なし）。カップリング反応の最終容量は４６５μｌであり、試薬の最終濃度は２２６ｍＭのアミノ酸、２１５ｍＭのＨＡＴＵおよび４３０のＮ－メチルモルホリンであった。カップリングを２回実施し、次いで樹脂を２×６００μｌのＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護は、４５０μｌの１：５ ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）を使用して５分間実施し、これを２回実施した。樹脂を７×６００μｌのＤＭＦで洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂を２×６００μｌのＤＣＭで洗浄した。
自動固相ペプチド合成は、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ ＲＳｉ合成装置で実施した。５ｍｌシリンジ（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｖ０５１ ＰＥ０７６）に２５μｍｏｌのポリスチレン－Ｓ－Ｓ－システアミン樹脂を加えた。樹脂を６×１５０μｌのＤＭＦで洗浄した。カップリングは、２１０μＬのアミノ酸（５００ｍＭ、４．２当量）、２００μＬのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、４当量）、５０μＬのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、８当量）、および５μＬのＮ－メチルピロリドンを用いて実施した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に添加した（１時間反応、振盪なし）。カップリング反応の最終容量は４６５μｌであり、試薬の最終濃度は２２６ｍＭのアミノ酸、２１５ｍＭのＨＡＴＵおよび４３０のＮ－メチルモルホリンであった。カップリングを２回実施し、次いで樹脂を２×６００μｌのＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護は、４５０μｌの１：５ ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）を使用して５分間実施し、これを２回実施した。樹脂を７×６００μｌのＤＭＦで洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂を２×６００μｌのＤＣＭで洗浄した。
【0175】
ＳＰＰＳの後、樹脂を２ｍｌの３８：１：１ ＴＦＡ／ＴＩＳ／ｄｄＨ２Ｏ ｖ／ｖ／ｖと１時間インキュベートした。ＴＦＡ溶液を廃棄し、樹脂を５×４ｍｌのＤＣＭで洗浄した。３時間風乾した後、ＤＭＳＯ中の１５０ｍＭ ＤＩＰＥＡの１ｍｌを吸引し、シリンジを室温で一晩振盪した。翌日、ＤＭＳＯ溶液を５０ｍＬのコニカルチューブに押し入れた。
【0176】
カルボン酸を、典型的には、ＤＭＳＯ中の事前混合した酸（１００ｍＭ、２当量）、ＨＢＴＵ（１００ｍＭ）およびＤＡＢＣＯ（１００ｍＭ）の５００μｌを添加することによりカップリングした。室温で３時間後、水８ｍｌを添加し、チューブを凍結し、次いで２日間凍結乾燥してＤＭＳＯを除去した。チューブの内容物を３ｍｌのＭｅＣＮに溶解し、続いて７ｍｌの水を添加した。
【0177】
粗混合物は、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステム（２４８９ ＵＶ検出器、２５３５ポンプ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ ＩＩＩ）、１９ｍｍ×２５０ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐカラム（１２５Ａ細孔、１０μｍ粒子）、溶媒系Ａ（Ｈ２Ｏ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）およびＢ（ＭｅＣＮ、０．１％ ｖ／ｖ ＴＦＡ）、典型的には３０分かけた３０～７０％溶媒Ｂの勾配を使用するＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。
【0178】
トロンビン阻害剤のＫｉの決定
精製トロンビン阻害剤（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、０．１％ ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００および０．２％のＤＭＳＯを含有する１２５μｌのＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２）で８０ｍＭに希釈した。大環状分子を、バッファー中に０．１％ ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００および１％のＤＭＳＯを含有するＴｒｉｓバッファーで２倍に希釈した。トロンビン活性を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５１０１）で測定し、スクリーニングヒットのＨＰＬＣ分離分画の活性を測定するために使用されるアッセイで上記のようにして残存活性を算出した。残存活性は対応する大環状分子濃度のＬｏｇに対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で以下の４パラメーター式を使用してシグモイド曲線をフィッティングした：
精製トロンビン阻害剤（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、０．１％ ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００および０．２％のＤＭＳＯを含有する１２５μｌのＴｒｉｓバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２）で８０ｍＭに希釈した。大環状分子を、バッファー中に０．１％ ｗ／ｖのＢＳＡ、０．０１％ ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００および１％のＤＭＳＯを含有するＴｒｉｓバッファーで２倍に希釈した。トロンビン活性を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５１０１）で測定し、スクリーニングヒットのＨＰＬＣ分離分画の活性を測定するために使用されるアッセイで上記のようにして残存活性を算出した。残存活性は対応する大環状分子濃度のＬｏｇに対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で以下の４パラメーター式を使用してシグモイド曲線をフィッティングした：
【0179】
【数2】
【0180】
Ｋｉ値は、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆの式を使用してＩＣ５０値から決定した（トロンビンおよび適用した基質の場合Ｋｍ＝１６８μＭ）：
【0181】
【数3】
【0182】
ＭＤＭ２結合性大環状分子のＩＣ５０の決定
ＭＤＭ２大環状分子がタンパク質の５０％についてレポーターペプチドを置換する濃度（ＩＣ５０）を、上記の蛍光偏光競合アッセイで決定した。５μＬ容量の精製大環状分子（ＤＭＳＯ中２０ｍＭ）を、低デッドボリュームＥＣＨＯソースプレート内で、１００％ＤＭＳＯで２倍に段階希釈した。アコースティック液滴移送を使用して、各希釈液１５０ｎｌを３８４ウェルの低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）に移送した。１％ ｖ／ｖのＤＭＳＯを含有するＰＢＳバッファーｐＨ７．４（１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．０１％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０）中のＭＤＭ２／ＦＰ５３プローブプレミックス（１．２μＭ ＭＤＭ２、２５ｎＭ ＦＰ５３プローブ）の１５μＬ容量を各ウェルに添加し、暗所で３０分間インキュベートした。蛍光異方性は、上記のようにして測定した。結合した阻害剤のパーセンテージは、以下の式を使用して算出した。
ＭＤＭ２大環状分子がタンパク質の５０％についてレポーターペプチドを置換する濃度（ＩＣ５０）を、上記の蛍光偏光競合アッセイで決定した。５μＬ容量の精製大環状分子（ＤＭＳＯ中２０ｍＭ）を、低デッドボリュームＥＣＨＯソースプレート内で、１００％ＤＭＳＯで２倍に段階希釈した。アコースティック液滴移送を使用して、各希釈液１５０ｎｌを３８４ウェルの低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）に移送した。１％ ｖ／ｖのＤＭＳＯを含有するＰＢＳバッファーｐＨ７．４（１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．０１％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０）中のＭＤＭ２／ＦＰ５３プローブプレミックス（１．２μＭ ＭＤＭ２、２５ｎＭ ＦＰ５３プローブ）の１５μＬ容量を各ウェルに添加し、暗所で３０分間インキュベートした。蛍光異方性は、上記のようにして測定した。結合した阻害剤のパーセンテージは、以下の式を使用して算出した。
【0183】
【数4】
【0184】
式中、ＮはＤＭＳＯ対照の平均異方性であり、Ｘは各ウェルで得られた異方性の値であり、Ｐは未結合プローブの平均異方性である。ＩＣ５０は、対応する大環状分子濃度の対数に対して結合阻害剤のパーセントをプロットすることによって決定され、曲線を上記のようにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６でフィッティングした。
【0185】
フルオレセイン標識大環状分子の合成
フルオレセイン標識大環状分子は、本質的には、ｍｇスケールの大環状分子の合成手順に記載されているようにして合成した。５（６）－ＦＡＭについては、手動カップリングを、すべてＤＭＦ中の４当量の酸（１８０ｍＭ、５５６μｌ）、４当量のＨＡＴＵ（５００ｍＭ、２００μｌ）、１０当量のＮＭＭ（４Ｍ、６２．５μｌ）を使用して実施した。カップリングを１×２時間実施し、次いで、前述のように洗浄した。
フルオレセイン標識大環状分子は、本質的には、ｍｇスケールの大環状分子の合成手順に記載されているようにして合成した。５（６）－ＦＡＭについては、手動カップリングを、すべてＤＭＦ中の４当量の酸（１８０ｍＭ、５５６μｌ）、４当量のＨＡＴＵ（５００ｍＭ、２００μｌ）、１０当量のＮＭＭ（４Ｍ、６２．５μｌ）を使用して実施した。カップリングを１×２時間実施し、次いで、前述のように洗浄した。
【0186】
ＦＰによるフルオレセイン標識ＭＤＭ２結合剤のＫｄの決定
フルオレセイン標識した大環状分子ストック（ＤＭＳＯ中２０ｍＭ）は、０．５μｌを９９９．５ｍｌのＰＢＳに添加することによって１０μＭの濃度に希釈した。これらの希釈液は、１０μｌを９９０μｌのＰＢＳに移すことにより１００ｎＭの濃度にさらに希釈し、７．５μｌを３８４ウェル低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）のウェルに移した。ＰＢＳ中のＭＤＭ２の２倍希釈液７．５μＬ容量をウェルにピペットで加えた。蛍光大環状分子の最終濃度は５０ｎＭであった。プレートを室温の暗所で３０分間インキュベートした後、蛍光異方性を、２５℃でＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ Ｐｒｏ蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍで励起、５３５ｎｍで発光）で測定した。異方性を、対応するＭＤＭ２濃度の対数に対してプロットし、シグモイド曲線を上記のようにしてフィッティングした。
フルオレセイン標識した大環状分子ストック（ＤＭＳＯ中２０ｍＭ）は、０．５μｌを９９９．５ｍｌのＰＢＳに添加することによって１０μＭの濃度に希釈した。これらの希釈液は、１０μｌを９９０μｌのＰＢＳに移すことにより１００ｎＭの濃度にさらに希釈し、７．５μｌを３８４ウェル低容量ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、２６４７０５）のウェルに移した。ＰＢＳ中のＭＤＭ２の２倍希釈液７．５μＬ容量をウェルにピペットで加えた。蛍光大環状分子の最終濃度は５０ｎＭであった。プレートを室温の暗所で３０分間インキュベートした後、蛍光異方性を、２５℃でＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ Ｐｒｏ蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍで励起、５３５ｎｍで発光）で測定した。異方性を、対応するＭＤＭ２濃度の対数に対してプロットし、シグモイド曲線を上記のようにしてフィッティングした。
【0187】
チオエーテル結合を含むトロンビン阻害剤の合成
３つのアミノ酸およびＣ末端システアミンを含有する直鎖ペプチドを、５０μｍｏｌスケールで、システアミン４－メトキシトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ８５６０８７、２００～４００メッシュ、１％ ＤＶＢ、０．９２ｍｍｏｌ／グラム）を使用すること以外、ｍｇスケールの環状ペプチドの合成について上述したようにして、自動化ＳＰＰＳにより合成した。まだ樹脂上のこのペプチドに、４－ブロモ酪酸（５００μＬ、５００ｍＭ、１０当量）を、活性化試薬としてのＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、５００μＬ、５００ｍＭ、１０当量）と溶媒としてのＤＭＦを使用して、手動でカップリングさせた。酸およびカップリング試薬を１分間事前混合し、次いで樹脂に添加した（１時間反応、振盪あり）。カップリング反応の最終容量は１ｍｌであり、試薬の最終濃度は２５０ｍＭのアミノ酸、２５０ｍＭのＤＩＣであった。カップリングを２回実施し、次いで樹脂を４×４ｍｌのＤＭＦで洗浄し、次いで２×４ｍｌのＤＣＭで洗浄した。
３つのアミノ酸およびＣ末端システアミンを含有する直鎖ペプチドを、５０μｍｏｌスケールで、システアミン４－メトキシトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ８５６０８７、２００～４００メッシュ、１％ ＤＶＢ、０．９２ｍｍｏｌ／グラム）を使用すること以外、ｍｇスケールの環状ペプチドの合成について上述したようにして、自動化ＳＰＰＳにより合成した。まだ樹脂上のこのペプチドに、４－ブロモ酪酸（５００μＬ、５００ｍＭ、１０当量）を、活性化試薬としてのＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、５００μＬ、５００ｍＭ、１０当量）と溶媒としてのＤＭＦを使用して、手動でカップリングさせた。酸およびカップリング試薬を１分間事前混合し、次いで樹脂に添加した（１時間反応、振盪あり）。カップリング反応の最終容量は１ｍｌであり、試薬の最終濃度は２５０ｍＭのアミノ酸、２５０ｍＭのＤＩＣであった。カップリングを２回実施し、次いで樹脂を４×４ｍｌのＤＭＦで洗浄し、次いで２×４ｍｌのＤＣＭで洗浄した。
【0188】
側鎖保護基の除去および切断は、２ｍｌの３８：１：１ ＴＦＡ／ＴＩＳ／ｄｄＨ２Ｏ ｖ／ｖ／ｖと樹脂を振盪しながら１時間インキュベートすることにより実施した。この後、５０ｍｌの冷ジエチルエーテルを溶液に加え、ペプチドを沈殿させた。混合物を－２０℃で３０分間保存し、次いで３，８００ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３Ｌ－Ｒ遠心分離機で４，０００ｒｐｍ）で３０分間、４℃で遠心分離を行った。エーテルをデカントし、ペプチドペレットを１５分間風乾させた。
【0189】
ペプチドを５０ｍｌの新たに脱気した１：４の水／アセトニトリルに溶解し、２００μｌ（１．１５ｍｍｏｌ、２３当量）の純ＤＩＰＥＡを加えた。環化反応を室温で９０分間進行させ、次いで凍結し、凍結乾燥した。
【0190】
カルボン酸１４を以下のようにして結合した。大環状分子を、１００ｍＭのＤＡＢＣＯを含有する１ｍｌのＤＭＳＯに再溶解させた。カルボン酸は、典型的には、ＤＭＳＯ中の事前混合した酸（１００ｍＭ、２当量）、ＨＢＴＵ（１００ｍＭ）およびＤＡＢＣＯ（１００ｍＭ）を５００μＬ添加することによってカップリングした。室温で３時間後、８ｍｌの水を添加し、チューブを凍結し、２日間凍結乾燥してＤＭＳＯを除去した。チューブの内容物を３ｍｌのＭｅＣＮに溶解し、続いて７ｍｌの水を添加した。粗混合物をＲＰ－ＨＰＬＣにより上記のようにして精製した。
【0191】
ＳＰＲによるＭＤＭ２結合剤のＫｄの決定
実験は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置を使用して実施した。ＭＤＭ２（１０μｇ／ｍＬ）を１０ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）に溶解し、ランニングバッファー（１０ｍＭのＰＢＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、および０．００５％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０）中でＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング条件を使用して、ＣＭ５シリーズＳチップ（Ｃｙｔｉｖａ、２９１０４９８８）の３つのチャネルに固定化した。典型的には、固定化レベルは、６，０００～７，０００共鳴単位（ＲＵ）であった。参照セルは、ＭＤＭ２を用いることなく同じ方法で処理した。結合動態および解離定数の測定については、大環状分子の５連続希釈液（３倍）とＤＭＳＯブランクをランニングバッファー（１０ｍＭのＰＢＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、および０．００５％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、および０．５％ ｖ／ｖのＤＭＳＯ）で調製し、接触時間と解離時間がそれぞれ１２０秒と６０秒であるシングルサイクル・カイネティクスモードで分析した。
実験は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置を使用して実施した。ＭＤＭ２（１０μｇ／ｍＬ）を１０ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）に溶解し、ランニングバッファー（１０ｍＭのＰＢＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、および０．００５％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０）中でＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング条件を使用して、ＣＭ５シリーズＳチップ（Ｃｙｔｉｖａ、２９１０４９８８）の３つのチャネルに固定化した。典型的には、固定化レベルは、６，０００～７，０００共鳴単位（ＲＵ）であった。参照セルは、ＭＤＭ２を用いることなく同じ方法で処理した。結合動態および解離定数の測定については、大環状分子の５連続希釈液（３倍）とＤＭＳＯブランクをランニングバッファー（１０ｍＭのＰＢＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、および０．００５％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、および０．５％ ｖ／ｖのＤＭＳＯ）で調製し、接触時間と解離時間がそれぞれ１２０秒と６０秒であるシングルサイクル・カイネティクスモードで分析した。
【実施例4】
【0192】
実施例４－ルール・オブ・ファイブのエッジにある大規模大環状化合物ライブラリーの合成およびスクリーニング
４．１． 結果
実施例１では、１（図１４ｂ；システアミンとも呼ばれる）を、過剰のピリジルジチオエチルアミンとのジチオール交換反応によってチオール官能基化樹脂上に結合させた。ここでは、クロマトグラフィーによる精製ステップなしで合成することができ、より簡易に大量に合成できることから、活性化チオスルホネートを代わりに使用した。この目的のため、Ｎ－Ｂｏｃアルキルハロゲンを得ることができるビルディングブロックを市販の業者を探し、ベンゼンチオノスルホン酸ナトリウムとの置換反応を行い、グラムスケールでＢｏｃ保護前駆体を優れた収率で得ることができた（８７％定量、合成については材料および方法のセクションを参照されたい）。アミノハロゲンの市販品の入手が限られているにもかかわらず、シリカカラム精製を必要とすることなく、６つの新しい多様化ビルディングブロックが合成された。これらはさらに進展させることができ、高充填ＳＨ ＰＳ樹脂に直接充填して、樹脂上にジチオール架橋により固定化された２～７を得ることができた（図１５ａ）。
４．１． 結果
実施例１では、１（図１４ｂ；システアミンとも呼ばれる）を、過剰のピリジルジチオエチルアミンとのジチオール交換反応によってチオール官能基化樹脂上に結合させた。ここでは、クロマトグラフィーによる精製ステップなしで合成することができ、より簡易に大量に合成できることから、活性化チオスルホネートを代わりに使用した。この目的のため、Ｎ－Ｂｏｃアルキルハロゲンを得ることができるビルディングブロックを市販の業者を探し、ベンゼンチオノスルホン酸ナトリウムとの置換反応を行い、グラムスケールでＢｏｃ保護前駆体を優れた収率で得ることができた（８７％定量、合成については材料および方法のセクションを参照されたい）。アミノハロゲンの市販品の入手が限られているにもかかわらず、シリカカラム精製を必要とすることなく、６つの新しい多様化ビルディングブロックが合成された。これらはさらに進展させることができ、高充填ＳＨ ＰＳ樹脂に直接充填して、樹脂上にジチオール架橋により固定化された２～７を得ることができた（図１５ａ）。
【0193】
ビルディングブロックが、自動ＦｍｏｃベースＳＰＰＳに適合し得るかどうかを試験するため、モデルのジチオールペプチド：ＭＰＡ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－（１～７）（ＭＰＡ＝３－メルカプトプロピオン酸）を９６ウェルプレートフォーマットで合成した（図１５ｂ）。合成およびＴＦＡ処理による保護基の除去の後、樹脂結合ペプチドを２×２００μｌの還元的遊離切断カクテル（１，４－ブタンジチオール（ＢＤＴ）およびＮＥｔ３、両方ともＤＭＦ中１００ｍＭ）とインキュベートした。ペプチドを樹脂から遊離させ、回転真空濃縮（ＲＶＣ）によりＤＭＦおよび揮発性ＢＤＴを除去した後にＨＰＬＣ－ＭＳで分析した。ペプチドは効率的に遊離され、ＬＣ－ＭＳにより分析した。すべてのペプチドについて、所望の生成物が優れた品質で確認された（図１５ｃ）。
【0194】
検討中の樹脂に結合した多様化要素を用いて、これらのフラグメントを大環状ライブラリーの合成に利用し、血液凝固経路に関与するトリプシン様セリンプロテアーゼに対する結合剤を追求した。トリプシン様セリンプロテアーゼの剪断量と様々な疾患におけるその役割から、これらのプロテアーゼは、このクラスのプロテアーゼに対する強力で特異的な阻害剤の開発に向けた重要な標的として機能する。この課題の複雑性は、正に荷電した残基を認識して切断するその能力と、Ｓ１ポケットの深くに埋め込まれた保存型アスパラギン酸塩により、このグループの多くのメンバーに共有される構造的同一性から生じる。したがって、このモデル系を強力で選択的な大環状阻害剤を開発することに使用することが期待されたが、それはこの結果が今後、環状ペプチド研究の他の部分に応用され得るからである。
【0195】
したがって、３８４個のジチオールペプチドを、９６ウェル・フィルタープレートで自動ＳＰＰＳにより５μｍｏｌスケールで調製した。ペプチドは、７つの異なる多様化要素（１～７）のうちの１つ、ランダムなアミノ酸（２７の異なるα、β、γ、およびＮ－メチル化アミノ酸から）と、文献から公知であるＳ１ポケット結合モチーフからなるランダムに選択された配列を含有する３つの異なる足場（１ａ～ｃ、図１６ａ）で合成された。
【0196】
ペプチドを固体支持体上で合成し、付随する保護基をＴＦＡによる酸性処理によって除去した。続いて、ペプチドを還元的遊離によって樹脂から遊離させ、直鎖状ジチオールペプチドを得た。酸性化し、ＲＶＣによって揮発性還元剤を除去した後、ペプチドの濃度を、エルマン試薬を使用して測定した（平均濃度＝２４．９ｍＭ、ペプチドを均等に分散させる樹脂充填からの２０％平均は７つの異なる誘導体すべてによる）。
【0197】
研究室での本発明者らの最新のアプローチは、アッセイの準備が整ったマイクロタイタープレートで直接使用するためのピコモルスケールでのライブラリーの調製に重点を置いた。化合物ライブラリーの調製は、複数の標的を一度にスクリーニングするために使用できるように構想したため、煩雑で手間のかかるピペット移送を必要とすることなく、大規模な化合物の調製を可能にしながら、なおも複数のリンカーで大規模な化合物の多様化を可能にするアプローチが必要であった。そのため、注目したのはアコースティック液滴放出（ＡＤＥ）技術の分注の使用である。この技術は、主にｎｌ容量の移送に利用されるが、さらに大きなμｌ容量をこのシステムの使用により移送することができるため、ピペット操作が不要になることが既に明らかにされている。したがって、４０ｎｍｏｌの直鎖状ペプチドを、複数のＥｃｈｏ（登録商標）ＡＤＥ対応３８４ポリプロピレン（ＰＰ）プレートに分注した（図１７）。還元されたジチオールペプチドは、ＤＭＳＯ中で溶解する際、ゆっくりと酸化を受けるので、ＤＭＦ：ＢＤＴ溶液をウェルに添加することによってペプチドを速やかに再還元し、酸性化とＲＶＣの後、これをＭｅＣＮ／ＮＨ４ＨＣＯ３バッファー中で、７つの多様なリンカーを用いて直ちに環化した（選択については図１６Ｂを参照）。これは、直鎖状種を最初に可溶化し、続いてリンカー溶液を添加するという従来使用されている方法とは対照的である。新しい方法論は、発生する再酸化の量を最小限に抑え、より純粋な反応混合物をもたらす。最後に、過剰なリンカーをβ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）でクエンチした。
【0198】
４．２． 材料および方法
すべての試薬および溶媒は分析グレードのものであり、市販の供給業者から入手したものをさらに精製することなく使用した。反応は、シリカゲル被覆プレート（分析用ＳｉＯ２－６０、Ｆ－２５４）を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、および／またはＨＰＬＣ－ＭＳ分析によりモニターした。ＴＬＣプレートをＵＶ光下で可視化するか、または過マンガン酸カリウム溶液（１０ｇ／Ｌ）に浸漬し、続いてヒートガンで可視化した。溶媒のロータリーエバポレーションは、減圧下で、４０℃未満の温度で実施した。ＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、Ｃ１８逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．１×５０ｍｍ Ｃ１８カラム、１００Å細孔、２．６μｍ粒子）を使用するＵＨＰＬＣおよびシングル四重極ＭＳシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０）で実施した。ｔ＝１．００～６．００分の間に０％から６０％まで直線的に上昇する溶媒Ａ（水中０．０５％ＨＣＯＯＨ）に対する溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ中０．０５％ＨＣＯＯＨ）の直線勾配を、流速１．００ｍｌ／分で適用した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、極低温冷却プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ社のＡｖａｎｃｅ ＩＩＩで記録した（１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲをそれぞれ４００ＭＨｚおよび１０１ＭＨｚで記録した）。すべてのスペクトルは２９８Ｋで記録した。化学シフトは、内部標準として重水素化溶媒に対するｐｐｍで報告されている（δＨ ＤＭＳＯ－ｄ６ ２．５０ｐｐｍ；δＣ ＤＭＳＯ ３９．５２ｐｐｍ；δＨ ＣＤＣｌ３ ７．２６ｐｐｍ；δＣ ＣＤＣｌ３ ７７．１６ｐｐｍ）。
すべての試薬および溶媒は分析グレードのものであり、市販の供給業者から入手したものをさらに精製することなく使用した。反応は、シリカゲル被覆プレート（分析用ＳｉＯ２－６０、Ｆ－２５４）を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、および／またはＨＰＬＣ－ＭＳ分析によりモニターした。ＴＬＣプレートをＵＶ光下で可視化するか、または過マンガン酸カリウム溶液（１０ｇ／Ｌ）に浸漬し、続いてヒートガンで可視化した。溶媒のロータリーエバポレーションは、減圧下で、４０℃未満の温度で実施した。ＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、Ｃ１８逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ２．１×５０ｍｍ Ｃ１８カラム、１００Å細孔、２．６μｍ粒子）を使用するＵＨＰＬＣおよびシングル四重極ＭＳシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０）で実施した。ｔ＝１．００～６．００分の間に０％から６０％まで直線的に上昇する溶媒Ａ（水中０．０５％ＨＣＯＯＨ）に対する溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ中０．０５％ＨＣＯＯＨ）の直線勾配を、流速１．００ｍｌ／分で適用した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、極低温冷却プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ社のＡｖａｎｃｅ ＩＩＩで記録した（１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲをそれぞれ４００ＭＨｚおよび１０１ＭＨｚで記録した）。すべてのスペクトルは２９８Ｋで記録した。化学シフトは、内部標準として重水素化溶媒に対するｐｐｍで報告されている（δＨ ＤＭＳＯ－ｄ６ ２．５０ｐｐｍ；δＣ ＤＭＳＯ ３９．５２ｐｐｍ；δＨ ＣＤＣｌ３ ７．２６ｐｐｍ；δＣ ＣＤＣｌ３ ７７．１６ｐｐｍ）。
【0199】
高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）測定は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたｍａＸｉｓ Ｇ３四重極飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社、ブレーメン、ドイツ）で記録した。
【0200】
ビルディングブロックおよびアミノ酸の化学合成
Ｓ－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）ベンゼンスルホノチオエート（Ｓ１、ＡＬＮ－１－３１）
Ｓ－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）ベンゼンスルホノチオエート（Ｓ１、ＡＬＮ－１－３１）
【0201】
【化5】
【0202】
ＤＭＦ（１２０ｍｌ）中の３－（Ｂｏｃ－アミノ）プロピルブロミド（６．０２ｇ、２５．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ベンジルチオスルホン酸ナトリウム（７．４８ｇ、３８．０ｍｍｏｌ、１．５当量；ｔｅｃｈ．８５％）を加え、溶液を８０℃で一晩撹拌した。冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（１００ｍｌ）に再懸濁し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２×１５０ｍｌ、１０：１、ｖ／ｖ）で抽出した。合わせた有機層を水（３×１５０ｍｌ）およびブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮し、粗Ｓ１（８．２１ｇ、２４．８ｍｍｏｌ、９８％）を黄色がかった油として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．２５（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.98-7.90 (m, 2H), 7.70-7.61 (m, 1H), 7.60-7.52 (m, 2H), 3.16 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.02 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.83 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H).
ｔｅｒｔ－ブチル（３－クロロプロピル）（メチル）カルバメート（Ｓ２、ＶＣ－１－１）
ｔｅｒｔ－ブチル（３－クロロプロピル）（メチル）カルバメート（Ｓ２、ＶＣ－１－１）
【0203】
【化6】
【0204】
ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍｌ）中の３－クロロプロピル－Ｎ－メチルアミン塩酸塩（４．３２ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（６．５８ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液を、アルゴン雰囲気下で０℃に冷却した。ＮＥｔ３（４．１６ｍｌ、３０．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を５分間かけて滴下し、溶液を室温に向けて一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１２０ｍｌ）に再懸濁した。溶液をＨＣｌ水溶液（１Ｍ、２×１２０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１２０ｍｌ）およびブライン（１２０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗Ｓ２（６．２２ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を無色の結晶性固体として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．４５（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.55 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.87 (s, 3H), 2.06-1.91 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).ＣＡＳ ＲＮ：１１４３２６－１４－６。
【0205】
Ｓ－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）プロピル）ベンゼンスルホノチオエート（Ｓ３、ＶＣ－１－３）
【0206】
【化7】
【0207】
ＤＭＦ（２５ｍｌ）中のＶＣ－１－１（３．５１ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ベンジルチオスルホン酸ナトリウム（５．５０ｇ、２７．９ｍｍｏｌ、１．６５当量；ｔｅｃｈ．８５％）を加え、溶液を８０℃で一晩撹拌した。冷却した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（１００ｍｌ）に再懸濁し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２×７５ｍｌ、１０：１、ｖ／ｖ）で抽出した。合わせた有機層を水（３×７５ｍｌ）およびブライン（７５ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗Ｓ３（５．０７ｇ、１６．２ｍｍｏｌ、９５％）を黄色がかった油として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中１２．５％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．３０（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01-7.88 (m, 2H), 7.69-7.50 (m, 3H), 3.24 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.77 (s, 3H), 1.85 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.42 (s, 9H).
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｚ）－（４－クロロブタ－２－エン－１－イル）カルバメート（Ｓ４、Ｐ１＿Ｎ２＿Ｅ２９／Ｅ４６）
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｚ）－（４－クロロブタ－２－エン－１－イル）カルバメート（Ｓ４、Ｐ１＿Ｎ２＿Ｅ２９／Ｅ４６）
【0208】
【化8】
【0209】
ＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）中のｃｉｓ－４－クロロ－２－ブテニルアミン塩酸塩（２．５０ｇ、１７．６ｍｍｏｌ、１．０当量）およびジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート（３．８４ｇ、１７．６ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液をアルゴン雰囲気下で０℃に冷却した。ＮＥｔ３（２．４５ｍｌ、１７．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を５分間かけて滴下し、溶液を室温に向けて一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）に再懸濁した。溶液をＨＣｌ水溶液（１Ｍ、２×１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌ）およびブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗Ｓ４（３．５５ｇ、１７．３ｍｍｏｌ、９８％）を淡褐色の固体として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．３０（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.82-5.70 (m, 1H), 5.70-5.56 (m, 1H), 4.59 (br s, 1H), 4.12 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.83 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H).ＣＡＳ ＲＮ：１２３６４２－２８－４。ＮＭＲスペクトルは文献と一致。
【0210】
（Ｚ）－Ｓ－（４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブタ－２－エン－１－イル）ベンゼンスルホノチオエート（Ｓ５、Ｐ１＿Ｎ２＿Ｅ３０）
【0211】
【化9】
【0212】
ＤＭＦ（７０ｍｌ）中のＳ４（３．５５ｇ、１７．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ベンジルチオスルホン酸ナトリウム（６．８１ｇ、３４．５ｍｍｏｌ、２．０当量；ｔｅｃｈ．８５％）を添加し、溶液を８０℃で一晩撹拌した。冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（４００ｍＬ）に再懸濁し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（３×２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗Ｓ５（５．０３ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、８５％＊）を褐色油として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．２０（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.94-7.87 (m, 2H), 7.68-7.60 (m, 1H), 7.60-7.49 (m, 2H), 5.67-5.57 (m, 1H), 5.51-5.40 (m, 1H), 4.43 (br s, 1H), 3.67 (dq, J = 7.0, 1.1 Hz, 2H), 3.60 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H).＊粗化合物の純度は他のチオスルホネート・ビルディングブロックよりも低いが、その後の樹脂充填ステップで優れた樹脂品質を提供する。
【0213】
ｔｅｒｔ－ブチル３－（（（フェニルスルホニル）チオ）メチル）アゼチジン－１－カルボキシレート（Ｓ６、ＡＬＮ－１－５７）
【0214】
【化10】
【0215】
ＤＭＦ（２５ｍｌ）中の１－Ｂｏｃ－３－ブロモメチルアゼチジン（１．９３ｇ、７．７１ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ベンジルチオスルホン酸ナトリウム（２．４３ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、１．６当量；ｔｅｃｈ．８５％）を添加し、溶液を８０℃で一晩撹拌した。冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（１００ｍｌ）に再懸濁し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２×７５ｍｌ；１０：１、ｖ／ｖ）で抽出した。合わせた有機層を水（２×７５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（７５ｍｌ）およびブライン（７５ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗Ｓ６（２．６５ｇ、７．７１ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を黄色がかった油として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．３０（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.93 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.66 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.96 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 3.52 (dd, J = 9.0, 5.3 Hz, 2H), 3.23 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 2.85-2.70 (m, 1H), 1.41 (s, 9H).
ｔｅｒｔ－ブチル４－（（フェニルスルホニル）チオ）ピペリジン－１－カルボキシレート（Ｓ７、ＡＬＮ－１－４１）
ｔｅｒｔ－ブチル４－（（フェニルスルホニル）チオ）ピペリジン－１－カルボキシレート（Ｓ７、ＡＬＮ－１－４１）
【0216】
【化11】
【0217】
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の１－Ｎ－Ｂｏｃ－４－ブロモピペリジン（２．２５ｇ、８．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ベンジルチオスルホン酸ナトリウム（２．７７ｇ、１４．０ｍｍｏｌ、１．６５当量；ｔｅｃｈ．８５％）を加え、溶液を８０℃で一晩撹拌した。一晩の反応が不完全であったため（ＴＬＣでモニター）、追加のベンジルチオスルホン酸ナトリウム（１．３８ｇ、７．００ｍｍｏｌ；ｔｅｃｈ．８５％）を加え、反応物を８０℃でさらに２４時間撹拌した。冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（１００ｍＬ）に再懸濁し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２×７５ｍＬ；１０：１、ｖ／ｖ）で抽出した。合わせた有機層を水（２×７５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（７５ｍｌ）およびブライン（７５ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮して、粗Ｓ７（２．６５ｇ、７．４３ｍｍｏｌ、８７％＊）を黄色がかった油として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．４４（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01-7.89 (m, 2H), 7.71-7.61 (m, 1H), 7.60-7.50 (m, 2H), 3.89-3.63 (m, 2H), 3.55-3.39 (m, 1H), 3.11-2.91 (m, 2H), 1.96-1.86 (m, 2H), 1.64-1.51 (m, 2H), 1.42 (s, 9H).＊置換反応は、他のチオスルホネート・ビルディングブロックの調製に比べて著しく遅く進行する。さらに、粗純度は低いが、その後の樹脂充填ステップで優れた樹脂品質が得られる。
【0218】
ｔｅｒｔ－ブチル４－（（（フェニルスルホニル）チオ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（Ｓ８、ＡＬＮ－１－３８）
【0219】
【化12】
【0220】
ＤＭＦ（５０ｍｌ）中の１－Ｎ－Ｂｏｃ－４－（ブロモメチル）ピペリジン（２．１６ｇ、７．７６ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ベンジルチオスルホン酸ナトリウム（２．５２ｇ、１２．８ミリモル、１．６５当量；ｔｅｃｈ．８５％）を加え、溶液を８０℃で一晩撹拌した。冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（１００ｍｌ）に再懸濁し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２×７５ｍｌ；１０：１、ｖ／ｖ）で抽出した。合わせた有機層を水（２×７５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（７５ｍｌ）およびブライン（７５ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮して、粗Ｓ８（２．７６ｇ、７．７６ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を透明な油として得た。ＴＬＣ（ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃ）：Ｒｆ＝０．３０（ＫＭｎＯ４染色）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01-7.87 (m, 2H), 7.70-7.61 (m, 1H), 7.61-7.51 (m, 2H), 4.20-3.94 (m, 2H), 2.91 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 12.8 Hz, 2H), 1.73-1.57 (m, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.14-0.98 (m, 2H).
（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（５－クロロフラン－２－カルボキサミド）プロパン酸（Ｔｈｉｏ、ＡＬＮ－１－７７）。
（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（５－クロロフラン－２－カルボキサミド）プロパン酸（Ｔｈｉｏ、ＡＬＮ－１－７７）。
【0221】
【化13】
【0222】
この合成は、類似のアミノ酸の以前の手順を適用した：５－クロロチオフェン－２－カルボン酸（２．４４ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１．６１ｇ、１４．０ｍｍｏｌ、１．４当量）をＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌した。この溶液を０℃に冷却し、その後、ＴＨＦ（３０ｍｌ）に溶解したＤＣＣ（２．８９ｇ、１４．０ｍｍｏｌ、１．４当量）の溶液をこの反応混合物にゆっくりと添加した。溶液は徐々に混濁し、室温に向けて一晩撹拌し、その後、溶液を濾過した。一方、Ｆｍｏｃ－Ｄａｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（４．２６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ；混濁溶液）中で撹拌し、ＴＦＡ（２０ｍｌ）をその溶液にゆっくりと添加した。溶液はすぐに黄色がかった透明になり、泡が発生した。泡発生が停止した後、溶液を室温でさらに３０分間撹拌し、その後、溶媒を窒素流下で除去した。過剰のＴＦＡをＣＨ２Ｃｌ２：トルエン（５０ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）との共蒸発により除去した。残渣をＴＨＦ（４０ｍｌ）に再懸濁し、続いてｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ（５．７５ｍｌ、６０．０ｍｍｏｌ、６．０当量）を添加した。次いでこの溶液を、ＮＨＳ活性化チオフェンを含有する母液に注ぎ、室温で一晩撹拌した。完了後、この溶液を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（３００ｍｌ、１０：１、ｖ／ｖ）に再溶解し、水（１００ｍｌ）およびブライン（１００ｍｌ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーで精製し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸ビルディングブロック（４．０６ｇ、８．６２ｍｍｏｌ、８６％）をオフホワイトの固体＊として得た。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨおよび０．５％ＡｃＯＨ）：Ｒｆ＝０．２（ＵＶ）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.74 (br s, 1H), 8.68 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.30 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.43-4.11 (m, 4H), 3.68-3.50 (m, 2H, 残存水と重なっている). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 171.9, 160.5, 156.0, 143.80, 143.77, 140.7, 138.7, 133.1, 128.2, 128.1, 127.6, 127.1, 125.24, 125.21, 120.1, 65.7, 53.5, 46.6, 40.3 (溶媒ピークと重なっている).Ｃ２３Ｈ２ＯＣｌＮ２０５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋のＨＲＭＳ ｍ／ｚの計算値、４７１．０７７６；実測値４７１．０７８６。
【0223】
ジチオール樹脂の合成
高充填チオール樹脂の調製
高充填チオール樹脂の調製
【0224】
【化14】
【0225】
事前洗浄：各２５ｍｌフリットシリンジに、約０．８ｇ（１．１１ｍｍｏｌ）のアミノメチルポリスチレン樹脂（ＡＭ ＰＳ樹脂；１．３９ｍｍｏｌ／ｇ、１００～２００メッシュ；Ａａｐｐｔｅｃ、ｃａｔ．＃ＲＡＺ００１）を充填し、ＭｅＯＨ（２×１０ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２中の１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（２×１０ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２中のｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ（１．２Ｍ；２×１０ｍｌ、５分間）、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍｌ）およびＤＭＦ（２×１０ｍｌ）を使用して事前洗浄した。カップリング：ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の３－（トリチルチオ）プロピオン酸（１．１６ｇ、３．３３ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＨＢＴＵ（１．２７ｇ、３．３３ｍｍｏｌ、３．０当量）の溶液を、ｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ（１．１０ｍｌ、６．６６ｍｍｏｌ、６．０当量）で活性化し、フリットシリンジに加え、室温で３時間撹拌した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍｌ）で洗浄し、続いてビーズを乾燥させた（最初は吸引下で、次いで減圧下で一晩（＜０．５ｍｂａｒ））。ＭＰＡ（Ｔｒｔ）樹脂の充填は、約１．２０ｍｍｏｌ／ｇ＊（重量ベース）決定された。キャップ付加：５％のＡｃ２Ｏおよび６％のルチジンのＤＭＦ（１２ｍｌ；ｖ／ｖ／ｖ）中溶液を樹脂に添加し、室温で５分間インキュベートした。樹脂を排出し、ＤＭＦ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍｌ）で洗浄した。脱保護：１０％ＴＦＡおよび１％ＴＩＰＳのＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ、ｖ／ｖ／ｖ）中溶液を樹脂に加え、１時間室温で撹拌した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍｌ）で洗浄し、この手順を１回繰り返し、ポリスチレンの高充填チオール樹脂（ＳＨ ＰＳ樹脂）が得られ、これはその後のジスルフィド交換およびシステアミン誘導体の充填に利用することができた。
【0226】
樹脂１（ｒｅｓ１）の調製
【0227】
【化15】
【0228】
ジチオール交換：各２５ミリフリットシリンジに約０．４ｇ（０．４８ミリモル）のＳＨ ＰＳ樹脂を充填し、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）中で膨潤させ、次いで排水した。２－ピリジルチオシステアミン塩酸塩（０．４８ｇ、０．９６ｍｍｏｌ、２．０当量）をＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（１９ｍｌ、３：７、ｖ／ｖ）に溶解し、続いてｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ（１６７μｌ、０．９６ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加した。溶液を樹脂に添加し、室温で３時間撹拌した。樹脂を排水し、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍｌ、３：７、ｖ／ｖ）、ＤＭＦ（２×１０ｍｌ）、ＤＭＦ中のｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ（１．２Ｍ；１０ｍｌで５分間）、ＤＭＦ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍｌ）で洗浄し、続いてビーズを乾燥させた（最初は吸引下で、次に減圧下で一晩（＜０．５ｍｂａｒ））。定性的コントロール：（１）Ｋａｉｓｅｒテスト；ビーズの完全な紫／青の着色。（２）ビーズ上のエルマン試薬；着色なし。
【0229】
樹脂２～７（ｒｅｓ２～７）の調製
【0230】
【化16】
【0231】
脱保護：Ｎ－Ｂｏｃ保護チオスルホネート中間体（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７またはＳ８；約７．０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）に溶解し、続いて、激しいＣＯ２の泡発生が観察されるまでＴＦＡを滴下した（約１０ｍｌ）。溶液を室温でさらに１時間撹拌し、その後、溶媒を窒素流下で除去した。過剰のＴＦＡを、減圧下でＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ溶液（１：１、ｖ／ｖ）との共蒸発により除去し、樹脂に取り付けるためのチオスルホン酸塩を得た。ジチオール交換：２５ｍｌフリットシリンジのそれぞれに約０．８ｇ（０．９６ｍｍｏｌ）のＳＨ ＰＳ樹脂を充填し、ＴＨＦ（１５ｍｌ）で膨潤させた後、排水した。所望のチオスルホン酸ＴＦＡ塩（２．４０～２．８８ミリモル、２．５～３．０当量）をＴＨＦ（１５ｍｌ）に溶解し、ＮＥｔ３（８０３μｌ、５．７６ｍｍｏｌ、６．０当量）を加えた。この溶液を樹脂に加え、室温で一晩撹拌した。樹脂を排水し、ＴＨＦ（３×１５ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（２×１５ｍｌ）で洗浄し、続いてビーズを乾燥した（最初は吸引下で、次に減圧下で一晩（＜０．５ｍｂａｒ））。定性的コントロール：（１）Ｋａｉｓｅｒテスト；ビーズの完全な紫／青の着色。（２）ビーズ上のエルマン試薬；着色なし。
【0232】
プレートを使用する方法
ポリプロピレン（ＰＰ）９６ウェルフィルタープレートに５μｍｏｌ／ウェルのポリスチレンジチオール樹脂（ｒｅｓ１～ｒｅｓ７；推定充填約１．２０ｍｍｏｌ／ｇ）を装備し、ＤＭＦ（６×２２５μｌ）で洗浄した。カップリングは、５３μｌのアミノ酸（５００ｍＭ、５．３当量）、５０μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、５．０当量）、１３μｌのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、１０当量）、および５μｌのＮ－メチルピロリドンを用いて実施した。Ｔｈｉｏ、ｔ－ａｃｈａ、４ａｍＰｉｐおよび２ａｍのカップリングの場合、７５μｌのアミノ酸（１７０ｍＭ、２．５５当量）、２５μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、２．５当量）、７μｌのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、５．６当量）、および５μｌのＮ－メチルピロリドンを使用した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に加えた（２時間反応、振盪なし）。カップリングを２回実施し、樹脂をＤＭＦ（６×２２５μｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（１２０μｌ、２×２分）を使用して実施し、樹脂をＤＭＦ（６×２２５μｌ）で洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×２００μｌ）で洗浄し、樹脂ビーズを吸引下で乾燥させた。
ポリプロピレン（ＰＰ）９６ウェルフィルタープレートに５μｍｏｌ／ウェルのポリスチレンジチオール樹脂（ｒｅｓ１～ｒｅｓ７；推定充填約１．２０ｍｍｏｌ／ｇ）を装備し、ＤＭＦ（６×２２５μｌ）で洗浄した。カップリングは、５３μｌのアミノ酸（５００ｍＭ、５．３当量）、５０μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、５．０当量）、１３μｌのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、１０当量）、および５μｌのＮ－メチルピロリドンを用いて実施した。Ｔｈｉｏ、ｔ－ａｃｈａ、４ａｍＰｉｐおよび２ａｍのカップリングの場合、７５μｌのアミノ酸（１７０ｍＭ、２．５５当量）、２５μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、２．５当量）、７μｌのＮ－メチルモルホリン（４Ｍ、５．６当量）、および５μｌのＮ－メチルピロリドンを使用した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に加えた（２時間反応、振盪なし）。カップリングを２回実施し、樹脂をＤＭＦ（６×２２５μｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（１２０μｌ、２×２分）を使用して実施し、樹脂をＤＭＦ（６×２２５μｌ）で洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×２００μｌ）で洗浄し、樹脂ビーズを吸引下で乾燥させた。
【0233】
シリンジを使用する方法
５ｍｌシリンジリアクターにポリスチレンジチオール樹脂（ｒｅｓ１～ｒｅｓ７；推定装填約１．２０ｍｍｏｌ／ｇ）を加え、樹脂をＤＭＦ（６×１５０μｌ）で洗浄した。カップリングは、２１０μｌのアミノ酸（５００ｍＭ、４．２当量）、２００μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、４．０当量）、５０μｌのＮ－メチルモルホリン（４．０Ｍ、８．０当量）および５μｌのＮ－メチルピロリドンを用いて実施した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に加えた（２時間反応、振盪あり）。カップリングを２回実施し、次いで樹脂をＤＭＦ（２×６００μｌ）で洗浄した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（４５０μｌ、２×２分）を使用してＦｍｏｃ脱保護を実施し、樹脂をＤＭＦ（７×６００μｌ）で洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×６００μｌ）で洗浄し、樹脂ビーズを吸引下で乾燥させた。
５ｍｌシリンジリアクターにポリスチレンジチオール樹脂（ｒｅｓ１～ｒｅｓ７；推定装填約１．２０ｍｍｏｌ／ｇ）を加え、樹脂をＤＭＦ（６×１５０μｌ）で洗浄した。カップリングは、２１０μｌのアミノ酸（５００ｍＭ、４．２当量）、２００μｌのＨＡＴＵ（５００ｍＭ、４．０当量）、５０μｌのＮ－メチルモルホリン（４．０Ｍ、８．０当量）および５μｌのＮ－メチルピロリドンを用いて実施した。すべての成分を１分間事前混合し、次いで樹脂に加えた（２時間反応、振盪あり）。カップリングを２回実施し、次いで樹脂をＤＭＦ（２×６００μｌ）で洗浄した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（４５０μｌ、２×２分）を使用してＦｍｏｃ脱保護を実施し、樹脂をＤＭＦ（７×６００μｌ）で洗浄した。ペプチド合成の最後に、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×６００μｌ）で洗浄し、樹脂ビーズを吸引下で乾燥させた。
【0234】
還元的遊離手順
側鎖保護基の除去：自動化ＳＰＰＳ（５μｍｏｌ／ウェルスケール）後、９６ウェル合成プレートの底を、６ｍｍ厚さの柔らかいエチレン酢酸ビニルパッドに押し付けることにより密閉した。この樹脂をＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ（３００μｌ、９５：２．５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ）と１時間インキュベートし、接着性ＰＰプレートの蓋で覆った。ＴＦＡ溶液を廃棄し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（３×３００μｌ）で洗浄し、この手順を１回繰り返した。還元的遊離：少なくとも１時間風乾した後、１，４－ブタンジチオール（ＢＤＴ）およびＮＥｔ３のＤＭＦ中溶液（両方とも１００ｍＭ、２００μｌ、樹脂充填に対して４当量）を樹脂に加え、プレートを室温で一晩撹拌した。翌日、ＤＭＦ溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ）により９６ウェルのディープウェルプレートに押し込み、還元的遊離手順を５時間で１回繰り返し、同じ９６ウェルのディープウェルプレートにまとめた。濃縮：ＴＦＡのｍｉｌｌｉＱ水溶液（１０％（ｖ／ｖ）、６２μｌ、ＮＥｔ３に対して２当量）をウェルに添加し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置を使用してペプチドを乾燥させた（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）。再可溶化および移送：乾燥ペプチドペレットをＤＭＳＯ（４０μｌ）に溶解し、Ｅｃｈｏ認定３８４ウェルＰＰソースプレートに移した。濃度測定：エルマンアッセイを実施して、ジチオールペプチドストックの濃度を決定した。エルマン試薬５（ＤＴＮＢ）をアッセイバッファー（水中の１５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３：ＭｅＣＮ（９０：１０、ｖ／ｖ）、ｐＨ８）に１０ｍＭの濃度まで溶解させた。底が透明な３８４ウェルの黒色マイクロプレートに、アコースティック液滴放出（ＡＤＥ）を使用するＥｃｈｏによりＤＭＳＯ中のジチオールペプチド１３５ｎｌ）を移した。ＣＥＲＴＵＳを使用してアッセイバッファー（２４μｌ）を分注した後、ＤＴＮＢ溶液（６μｌ）を添加した。プレートを遠心分離にかけ（４００ｇ、２分）、吸光度（４１２ｎｍ）をＴＥＣＡＮ Ｍ２００プレートリーダーで測定した。ジチオールペプチドの濃度は、以前に記録した検量線を使用して算出した：
側鎖保護基の除去：自動化ＳＰＰＳ（５μｍｏｌ／ウェルスケール）後、９６ウェル合成プレートの底を、６ｍｍ厚さの柔らかいエチレン酢酸ビニルパッドに押し付けることにより密閉した。この樹脂をＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ（３００μｌ、９５：２．５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ）と１時間インキュベートし、接着性ＰＰプレートの蓋で覆った。ＴＦＡ溶液を廃棄し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（３×３００μｌ）で洗浄し、この手順を１回繰り返した。還元的遊離：少なくとも１時間風乾した後、１，４－ブタンジチオール（ＢＤＴ）およびＮＥｔ３のＤＭＦ中溶液（両方とも１００ｍＭ、２００μｌ、樹脂充填に対して４当量）を樹脂に加え、プレートを室温で一晩撹拌した。翌日、ＤＭＦ溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ）により９６ウェルのディープウェルプレートに押し込み、還元的遊離手順を５時間で１回繰り返し、同じ９６ウェルのディープウェルプレートにまとめた。濃縮：ＴＦＡのｍｉｌｌｉＱ水溶液（１０％（ｖ／ｖ）、６２μｌ、ＮＥｔ３に対して２当量）をウェルに添加し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置を使用してペプチドを乾燥させた（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）。再可溶化および移送：乾燥ペプチドペレットをＤＭＳＯ（４０μｌ）に溶解し、Ｅｃｈｏ認定３８４ウェルＰＰソースプレートに移した。濃度測定：エルマンアッセイを実施して、ジチオールペプチドストックの濃度を決定した。エルマン試薬５（ＤＴＮＢ）をアッセイバッファー（水中の１５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３：ＭｅＣＮ（９０：１０、ｖ／ｖ）、ｐＨ８）に１０ｍＭの濃度まで溶解させた。底が透明な３８４ウェルの黒色マイクロプレートに、アコースティック液滴放出（ＡＤＥ）を使用するＥｃｈｏによりＤＭＳＯ中のジチオールペプチド１３５ｎｌ）を移した。ＣＥＲＴＵＳを使用してアッセイバッファー（２４μｌ）を分注した後、ＤＴＮＢ溶液（６μｌ）を添加した。プレートを遠心分離にかけ（４００ｇ、２分）、吸光度（４１２ｎｍ）をＴＥＣＡＮ Ｍ２００プレートリーダーで測定した。ジチオールペプチドの濃度は、以前に記録した検量線を使用して算出した：
【0235】
【数5】
【0236】
シリンジを使用する方法
側鎖保護基の除去：自動化ＳＰＰＳ（２５μｍｏｌスケール）の後、樹脂を含有するフリットシリンジをＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ（４ｍｌ、９５：２．５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ）と２時間室温でインキュベートした。ＴＦＡ溶液を廃棄し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５×４ｍｌ）およびＤＭＦ（４ｍｌ）で洗浄した。還元的遊離：少なくとも１時間風乾した後、ＢＤＴおよびＮＥｔ３のＤＭＦ中溶液（両方とも１００ｍＭ、２．０ｍｌ、樹脂充填に対して４当量）をシリンジに加え、室温で一晩撹拌した。翌日、ＤＭＦ溶液を５０ｍｌコニカルファルコンチューブに押し込んだ。濃縮：ＴＦＡのｍｉｌｌｉＱ水溶液（１０％（ｖ／ｖ）、３１２μｌ、ＮＥｔ３に対して２当量）をペプチド溶液に添加し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置を使用してこれを乾燥し（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）、次のステップですぐに環化できる粗直鎖状ジチオールペプチドを得た。
側鎖保護基の除去：自動化ＳＰＰＳ（２５μｍｏｌスケール）の後、樹脂を含有するフリットシリンジをＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ（４ｍｌ、９５：２．５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ）と２時間室温でインキュベートした。ＴＦＡ溶液を廃棄し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５×４ｍｌ）およびＤＭＦ（４ｍｌ）で洗浄した。還元的遊離：少なくとも１時間風乾した後、ＢＤＴおよびＮＥｔ３のＤＭＦ中溶液（両方とも１００ｍＭ、２．０ｍｌ、樹脂充填に対して４当量）をシリンジに加え、室温で一晩撹拌した。翌日、ＤＭＦ溶液を５０ｍｌコニカルファルコンチューブに押し込んだ。濃縮：ＴＦＡのｍｉｌｌｉＱ水溶液（１０％（ｖ／ｖ）、３１２μｌ、ＮＥｔ３に対して２当量）をペプチド溶液に添加し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置を使用してこれを乾燥し（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）、次のステップですぐに環化できる粗直鎖状ジチオールペプチドを得た。
【0237】
大環状化手順
プレートを使用する方法
マイクロタイタープレートへの移送：ＤＭＳＯ中の個々のジチオールペプチドの決定された濃度に基づき、ＤＭＳＯ中の４０ｎｍｏｌのジチオールペプチドを３８４ＰＰプレート（リンカー当たり１プレート）にＡＤＥを使用して移した。ペプチド還元：ジチオールペプチドはＤＭＳＯ中で時間とともに酸化するので、ＢＤＴおよびＮＥｔ３のＤＭＦ中溶液（両方とも１００ｍＭ、２０μｌ）を各ウェルに添加し、その後３０分間室温でインキュベートすることによって、ペプチドが完全に還元されたことを確認した。ＴＦＡのｍｉｌｌｉＱ水溶液（１０％（ｖ／ｖ）、６μｌ、ＮＥｔ３に対して２当量）を各ウェルに添加し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置を使用してペプチドを乾燥させ（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）、完全に還元されたジチオールペプチドペレットを得た。環化：ビス求電子リンカー（Ｌ１～Ｌ７）を、ＮＨ４ＨＣＯ３のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ８）中の脱気した６０ｍＭ溶液に、最終濃度４ｍＭまで溶解した。調製したリンカー溶液（４０μＬ、ジチオールペプチドに対して４当量）を３８４ＰＰプレートに液体ディスペンサーを使用して添加し、これを粘着性ＰＰ蓋で密封し、２時間室温で撹拌した。リンカーのクエンチング：β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）を、調製した環化バッファーで最終濃度が３２ｍＭとなるように溶解した。調製した溶液（２０μｌ、リンカーに対して４当量）を各ウェルに添加し、プレートに蓋をすることなく、室温で１時間インキュベートした。濃縮および再可溶化：溶媒を、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置（４０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）を使用して除去し、ペプチド大環状分子をペレットとして得て、これをＤＭＳＯ（１０μｌ）に溶解し、３８４ＬＤＶプレートに移し、その後のプロテアーゼスクリーニングアッセイですぐに適用することができる４ｍＭの大環状ペプチドライブラリーを得た。
プレートを使用する方法
マイクロタイタープレートへの移送：ＤＭＳＯ中の個々のジチオールペプチドの決定された濃度に基づき、ＤＭＳＯ中の４０ｎｍｏｌのジチオールペプチドを３８４ＰＰプレート（リンカー当たり１プレート）にＡＤＥを使用して移した。ペプチド還元：ジチオールペプチドはＤＭＳＯ中で時間とともに酸化するので、ＢＤＴおよびＮＥｔ３のＤＭＦ中溶液（両方とも１００ｍＭ、２０μｌ）を各ウェルに添加し、その後３０分間室温でインキュベートすることによって、ペプチドが完全に還元されたことを確認した。ＴＦＡのｍｉｌｌｉＱ水溶液（１０％（ｖ／ｖ）、６μｌ、ＮＥｔ３に対して２当量）を各ウェルに添加し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置を使用してペプチドを乾燥させ（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）、完全に還元されたジチオールペプチドペレットを得た。環化：ビス求電子リンカー（Ｌ１～Ｌ７）を、ＮＨ４ＨＣＯ３のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ８）中の脱気した６０ｍＭ溶液に、最終濃度４ｍＭまで溶解した。調製したリンカー溶液（４０μＬ、ジチオールペプチドに対して４当量）を３８４ＰＰプレートに液体ディスペンサーを使用して添加し、これを粘着性ＰＰ蓋で密封し、２時間室温で撹拌した。リンカーのクエンチング：β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）を、調製した環化バッファーで最終濃度が３２ｍＭとなるように溶解した。調製した溶液（２０μｌ、リンカーに対して４当量）を各ウェルに添加し、プレートに蓋をすることなく、室温で１時間インキュベートした。濃縮および再可溶化：溶媒を、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置（４０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）を使用して除去し、ペプチド大環状分子をペレットとして得て、これをＤＭＳＯ（１０μｌ）に溶解し、３８４ＬＤＶプレートに移し、その後のプロテアーゼスクリーニングアッセイですぐに適用することができる４ｍＭの大環状ペプチドライブラリーを得た。
【0238】
コニカルチューブでの方法：
環化：二求電子リンカーを、ＮＨ４ＨＣＯ３のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ８）中の脱気した６０ｍＭ溶液で、最終濃度が４ｍＭになるように溶解した。調製したリンカー溶液（１２．５ｍｌ、ジチオールペプチドに対して２当量）を、所望のジチオールペプチドペレットを含むコニカルチューブに加え、溶液を室温で２時間撹拌した。リンカーのクエンチング：反応完了後（ＬＣＭＳにより決定）、過剰なリンカーを、β－ＭＥ（１４μｌ、２００μｍｏｌ、リンカーに対して４当量）を添加することによりクエンチし、コニカルフラスコに加え、少なくとも１時間撹拌し、続いて精製した。大環状分子の精製：サンプルは、Ｃ１８ ＲＰ Ｗａｔｅｒｓ ＯＢＤカラムを装備した分取ＨＰＬＣで精製した。溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ）の溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）に対する直線勾配は、ｔ＝２．００～３２．００分間に１５％から６０％まで直線的に上昇し、１４．０ｍｌ／分の流速で適用された。所望の生成物を含有する純粋な分画を統合し、凍結乾燥し、生成物を無色の綿毛状物質として得た。ＤＭＳＯストック：精製した大環状分子をエッペンドルフチューブに移し、ＤＭＳＯを添加し、５ｍＭまたは２０ｍＭの化合物ストックを得た。
環化：二求電子リンカーを、ＮＨ４ＨＣＯ３のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ８）中の脱気した６０ｍＭ溶液で、最終濃度が４ｍＭになるように溶解した。調製したリンカー溶液（１２．５ｍｌ、ジチオールペプチドに対して２当量）を、所望のジチオールペプチドペレットを含むコニカルチューブに加え、溶液を室温で２時間撹拌した。リンカーのクエンチング：反応完了後（ＬＣＭＳにより決定）、過剰なリンカーを、β－ＭＥ（１４μｌ、２００μｍｏｌ、リンカーに対して４当量）を添加することによりクエンチし、コニカルフラスコに加え、少なくとも１時間撹拌し、続いて精製した。大環状分子の精製：サンプルは、Ｃ１８ ＲＰ Ｗａｔｅｒｓ ＯＢＤカラムを装備した分取ＨＰＬＣで精製した。溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ）の溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）に対する直線勾配は、ｔ＝２．００～３２．００分間に１５％から６０％まで直線的に上昇し、１４．０ｍｌ／分の流速で適用された。所望の生成物を含有する純粋な分画を統合し、凍結乾燥し、生成物を無色の綿毛状物質として得た。ＤＭＳＯストック：精製した大環状分子をエッペンドルフチューブに移し、ＤＭＳＯを添加し、５ｍＭまたは２０ｍＭの化合物ストックを得た。
【0239】
生化学的アッセイ
大環状ライブラリーのプロテアーゼスクリーニング
化合物ライブラリーの酵素阻害は、１％最終ＤＭＳＯ濃度の環状ペプチド（トロンビンについては平均濃度１０μＭ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＫＬＫ５およびＰＫａｌについては平均濃度２０μＭ）の存在下で、残存酵素活性を測定することにより評価した。粗大環状ライブラリー（３８４ウェルＬＤＶプレート内に４ｍＭのＤＭＳＯストック）を、ＡＤＥを介して１５３６ウェルマイクロタイターＯｐｔｉＰｌａｔｅに移した。適用したバッファー溶液をＰＴＦＥシリンジフィルター（０．２２μｍ）で濾過することにより調製し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；０．１％ ｗ／ｖ）を補充した適切なバッファー（以下のリストを参照）中のプロテアーゼ（４．４１μｍ／ウェル）を添加することによってアッセイを開始し、ＣＥＲＴＵＳ自動化リキッドハンドラーを使用して分注した。プレートを室温で１０分間インキュベートした後、ＣＥＲＴＵＳ自動化リキッドハンドラーを使用して、適切なバッファー中の蛍光発生基質（４．５μｌ）を添加した。プレートを遠心分離し（８００ｇ、２分）、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（励起３８４ｎｍ、発光４４０ｎｍ）を使用して蛍光強度を１５分間にわたり１５０秒の時間増分で測定した。蛍光増加の傾き（ｍ）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（ｖｅｒｓ．１６．５６）で算出した。陰性対照は、大環状分子なしで調製した。１２個の陰性対照の平均値を使用し、以下の式Ｉを使用して残存活性を算出した：
大環状ライブラリーのプロテアーゼスクリーニング
化合物ライブラリーの酵素阻害は、１％最終ＤＭＳＯ濃度の環状ペプチド（トロンビンについては平均濃度１０μＭ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＫＬＫ５およびＰＫａｌについては平均濃度２０μＭ）の存在下で、残存酵素活性を測定することにより評価した。粗大環状ライブラリー（３８４ウェルＬＤＶプレート内に４ｍＭのＤＭＳＯストック）を、ＡＤＥを介して１５３６ウェルマイクロタイターＯｐｔｉＰｌａｔｅに移した。適用したバッファー溶液をＰＴＦＥシリンジフィルター（０．２２μｍ）で濾過することにより調製し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；０．１％ ｗ／ｖ）を補充した適切なバッファー（以下のリストを参照）中のプロテアーゼ（４．４１μｍ／ウェル）を添加することによってアッセイを開始し、ＣＥＲＴＵＳ自動化リキッドハンドラーを使用して分注した。プレートを室温で１０分間インキュベートした後、ＣＥＲＴＵＳ自動化リキッドハンドラーを使用して、適切なバッファー中の蛍光発生基質（４．５μｌ）を添加した。プレートを遠心分離し（８００ｇ、２分）、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（励起３８４ｎｍ、発光４４０ｎｍ）を使用して蛍光強度を１５分間にわたり１５０秒の時間増分で測定した。蛍光増加の傾き（ｍ）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（ｖｅｒｓ．１６．５６）で算出した。陰性対照は、大環状分子なしで調製した。１２個の陰性対照の平均値を使用し、以下の式Ｉを使用して残存活性を算出した：
【0240】
【数6】
【0241】
【表7】
【0242】
ヒットからの粗大環状生成物の活性種の同定
ライブラリースクリーニングから選択したヒット（化合物 １９５＿Ｌ６、２３７＿Ｌ６および２９３Ｌ６）を再合成し、環化した（４０ｎｍｏｌスケール）。乾燥した大環状生成物をＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（１．５ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）に溶解し、Ｃ１８ ＮｏｖａＰａｋ逆相カラム（１０×１５０ｍｍ、１２５Å細孔、５μｍ粒子）を使用してＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００システムで分画した。溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ）の溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）に対する直線勾配は、ｔ＝２．００～２２．０分の間に０％から８０％（トロンビンヒットの場合）または０％から９５％（ＰＫａｌヒットの場合）に直線的に上昇し、流速４．００ｍＬ／分でアプライした。分画（１分画／分）を回収チューブに回収し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）を使用して溶媒を除去した。乾燥内容物をＤＭＳＯ（５０μｌ）に再溶解し、３８４ウェルＰＰソースプレートに移し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）を使用して乾燥させた。分画をＤＭＳＯ（トロンビンについては５μｌ、ＰＫａｌについては２μｌ）に再溶解させ、続いてアッセイを底が透明な黒色３８４ウェルポリスチレンプレート中で実施した。ＤＭＳＯ分画溶液（０．５μｌ）をマイクロタイタープレートにピペットで移し、適切な酵素バッファー（４９．５μｌ；前のページに記載したものと同様の組成、厳密には２ｎＭのトロンビンを使用）を加え、室温で１０分間インキュベートした。バッファー中の基質（２５μｌ、前のページに記載したものと同様の組成）を加え、プレートを遠心分離にかけ（８００ｇ、２分間）、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（励起３８４ｎｍ、発光４４０ｎｍ）を使用し、１５分間にわたり１５０秒の時間増分で蛍光強度を測定した。蛍光増加の傾き（ｍ）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（ｖｅｒｓ．１６．５６）で算出した。陰性対照は、分画サンプルの代わりにＤＭＳＯ（０．５μｌ）を含まずに調製した。６個の陰性対照の平均を使用し、式Ｉを使用して残効性を算出した。
ライブラリースクリーニングから選択したヒット（化合物 １９５＿Ｌ６、２３７＿Ｌ６および２９３Ｌ６）を再合成し、環化した（４０ｎｍｏｌスケール）。乾燥した大環状生成物をＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（１．５ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）に溶解し、Ｃ１８ ＮｏｖａＰａｋ逆相カラム（１０×１５０ｍｍ、１２５Å細孔、５μｍ粒子）を使用してＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００システムで分画した。溶媒Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ）の溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）に対する直線勾配は、ｔ＝２．００～２２．０分の間に０％から８０％（トロンビンヒットの場合）または０％から９５％（ＰＫａｌヒットの場合）に直線的に上昇し、流速４．００ｍＬ／分でアプライした。分画（１分画／分）を回収チューブに回収し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）を使用して溶媒を除去した。乾燥内容物をＤＭＳＯ（５０μｌ）に再溶解し、３８４ウェルＰＰソースプレートに移し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置（３０℃、１７５０ｒｐｍ、０．１ｍｂａｒ）を使用して乾燥させた。分画をＤＭＳＯ（トロンビンについては５μｌ、ＰＫａｌについては２μｌ）に再溶解させ、続いてアッセイを底が透明な黒色３８４ウェルポリスチレンプレート中で実施した。ＤＭＳＯ分画溶液（０．５μｌ）をマイクロタイタープレートにピペットで移し、適切な酵素バッファー（４９．５μｌ；前のページに記載したものと同様の組成、厳密には２ｎＭのトロンビンを使用）を加え、室温で１０分間インキュベートした。バッファー中の基質（２５μｌ、前のページに記載したものと同様の組成）を加え、プレートを遠心分離にかけ（８００ｇ、２分間）、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（励起３８４ｎｍ、発光４４０ｎｍ）を使用し、１５分間にわたり１５０秒の時間増分で蛍光強度を測定した。蛍光増加の傾き（ｍ）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（ｖｅｒｓ．１６．５６）で算出した。陰性対照は、分画サンプルの代わりにＤＭＳＯ（０．５μｌ）を含まずに調製した。６個の陰性対照の平均を使用し、式Ｉを使用して残効性を算出した。
【0243】
ＩＣ５０の決定
最大半阻害濃度（ＩＣ５０）値は、ライブラリースクリーニングを行ったのと同様のアッセイにおいてプロテアーゼ阻害から決定した。精製した大環状化合物の倍希釈系列を３８４ウェルのＬＤＶソースプレートで調製し、ＡＤＥを使用して１５３６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅに移した（最終容量：４５ｎｌ大環状化合物／ＤＭＳＯ）。Ｃｅｒｔｕｓを使用してバッファー中の酵素溶液（４．５μｌ）を添加し、１０分間インキュベートした。続いて、バッファー中の基質（４．５μｌ）を添加し、プレートを遠心分離にかけ（７００ｇ、２分間）、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（励起３８４ｎｍ、発光４４０ｎｍ）を使用し、１５分間にわたって１５０秒の時間増分で蛍光強度を測定した。蛍光増加の傾き（ｍ）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（ｖｅｒｓ．１６．５６）で算出した。陰性対照は、大環状分子なしで調製した。１２個の陰性対照の平均を使用し、式Ｉを使用して残効性を算出した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０．１）を使用し、得られたデータを濃度反応式［制約数？］に当てはめることにより得て、ｋｉ値は、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ式１１を用いてＩＣ５０に基づいて算出した：
最大半阻害濃度（ＩＣ５０）値は、ライブラリースクリーニングを行ったのと同様のアッセイにおいてプロテアーゼ阻害から決定した。精製した大環状化合物の倍希釈系列を３８４ウェルのＬＤＶソースプレートで調製し、ＡＤＥを使用して１５３６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅに移した（最終容量：４５ｎｌ大環状化合物／ＤＭＳＯ）。Ｃｅｒｔｕｓを使用してバッファー中の酵素溶液（４．５μｌ）を添加し、１０分間インキュベートした。続いて、バッファー中の基質（４．５μｌ）を添加し、プレートを遠心分離にかけ（７００ｇ、２分間）、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（励起３８４ｎｍ、発光４４０ｎｍ）を使用し、１５分間にわたって１５０秒の時間増分で蛍光強度を測定した。蛍光増加の傾き（ｍ）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（ｖｅｒｓ．１６．５６）で算出した。陰性対照は、大環状分子なしで調製した。１２個の陰性対照の平均を使用し、式Ｉを使用して残効性を算出した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０．１）を使用し、得られたデータを濃度反応式［制約数？］に当てはめることにより得て、ｋｉ値は、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ式１１を用いてＩＣ５０に基づいて算出した：
【0244】
【数7】
【0245】
式中、［Ｓ］０は、初期基質濃度であり、ＫＭは、酵素と基質のミカエリス・メンテン定数１２である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図18-4】
【図19-1】
【図19-2】
【図19-3】
【図19-4】
【図19-5】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図22-3】
【図22-4】
【図22-5】
【図22-6】
【図23】
【図24】
【図25-1】
【図25-2】
【図26-1】
【図26-2】
【図27】
【図28-1】
【図28-2】
【図28-3】
【図28-4】
【図28-5】
【図28-6】
【図29】
【図30-1】
【図30-2】
【図30-3】
【図30-4】
【配列表】
【国際調査報告】