特表 2024-518616 ワクチン、その使用、及びがんワクチン混合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-01

(54)【発明の名称】ワクチン、その使用、及びがんワクチン混合物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240423BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20240423BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 41/00 20200101ALI20240423BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240423BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240423BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20240423BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/12

C12N15/863 Z

C12N15/864 100Z

A61P35/00

A61P37/04

A61K41/00

A61K45/00

A61K39/39

A61P43/00 111

A61P43/00 121

A61K48/00

A61P43/00 105

A61K35/76

A61K38/21

A61K38/20

A61K38/19

A61K39/395 U

A61K35/17

A61K35/15

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571587

(86)(22)【出願日】2022-05-17

(85)【翻訳文提出日】2024-01-17

(86)【国際出願番号】 CN2022093380

(87)【国際公開番号】W WO2022242652

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】63/189,861

(32)【優先日】2021-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/308,568

(32)【優先日】2022-02-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523231093

【氏名又は名称】ホン，ミェン―チェ

【氏名又は名称原語表記】ＨＵＮＧ，Ｍｉｅｎ―ｃｈｉｅ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．９１，Ｈｓｕｅｈ―Ｓｈｉｈ Ｒｏａｄ，Ｎｏｒｔｈ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｔａｉｃｈｕｎｇ Ｃｉｔｙ ４０４，Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110003971

【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャオ，クン－サン

(72)【発明者】

【氏名】フアン，ケヴィン チー－ヤン

(72)【発明者】

【氏名】チアン，シュー－フェン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA11

4C084AA13

4C084AA22

4C084AA23

4C084DA12

4C084DA19

4C084DA21

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC75

4C085AA03

4C085AA14

4C085AA38

4C085BB01

4C085CC03

4C085DD62

4C085DD86

4C085EE01

4C085EE03

4C085EE06

4C087AA01

4C087BB37

4C087BB65

4C087BC83

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA13

4C087ZB09

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

【課題】
ベクターと導入遺伝子とを備えるワクチンを提供する。
【解決手段】
導入遺伝子は複数のペプチドをコードし、且つベクターに封入され、前記ペプチドは順に、分泌シグナルペプチド、少なくとも１つの腫瘍抗原、少なくとも１つの共阻害ペプチド、及びＴｏｌｌ様受容体９アンタゴニスト配列（ＴＬＲ９）を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ベクターと、
複数のペプチドをコードし、且つ前記ベクターに封入される導入遺伝子と、
を含み、
前記ペプチドは、
分泌シグナルペプチドと、
腫瘍細胞と正常細胞との差分である少なくとも１つの腫瘍抗原と、
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）アンタゴニスト、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）アンタゴニスト、又は細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）アンタゴニストを含む少なくとも１つの共阻害ペプチドと、
Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アンタゴニスト配列と、
を順に含む、ワクチン。

【請求項2】

前記少なくとも一つの共阻害ペプチドと前記ＴＬＲ９アンタゴニスト配列との間に共刺激ペプチドを更に含み、前記共刺激ペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、及びインターフェロン（ＩＦＮｓ）から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

前記ベクターは、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はナノ粒子である、請求項１に記載のワクチン。

【請求項4】

前記分泌シグナルペプチドは、インターロイキン２シグナルペプチド（ＩＬ２ ｓｐ）又はインターロイキン１２シグナルペプチド（ＩＬ１２ ｓｐ）である、請求項１に記載のワクチン。

【請求項5】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項6】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍特異体細胞突然変異を同定するために、前記対象の前記正常細胞及び対応する前記腫瘍細胞の全エクソームシーケンシングを比較することによって選択されるＤＮＡ配列である、請求項１に記載のワクチン。

【請求項7】

前記ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、ＰＬ－Ｌ１トラップ及びＰＤ－１ペプチドを含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項8】

前記ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ－１トラップ及びＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２ペプチドを含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項9】

前記ＣＴＬＡ４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ４トラップ及びＣＴＬＡ４アンタゴニスト抗体を含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項10】

前記ＴＬＲ９アンタゴニスト配列は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＴＬＲ９結合ドメイン、ＴＬＲデコイペプチド、及びＣｐＧ結合配列から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項11】

がん治療を必要とする対象において抗腫瘍免疫応答を誘導するために用いられる、がん治療における使用のための請求項１に記載のワクチン。

【請求項12】

前記ワクチンが放射線と組み合わせて用いられる、請求項１１に記載の使用のためのワクチン。

【請求項13】

がん治療を必要とする対象における前記少なくとも一つの腫瘍抗原に対する免疫反応を誘導するために用いられる請求項１に記載のワクチンと、
前記対象における局所腫瘍制御を増強するために用いられる増強剤と、
前記対象における局所再発及び転移を防止するために用いられる免疫増強剤とを含む、がんワクチン混合物。

【請求項14】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択される、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項15】

前記増強剤は、放射線、化学療法剤、免疫調節剤、標的療法薬、抗体薬、又はそれらの組み合わせである、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項16】

前記免疫増強剤は、前記少なくとも一つの腫瘍抗原を含むがんワクチン又は前記少なくとも一つの腫瘍抗原を含む治療細胞である、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項17】

前記がんワクチンは、樹状細胞に基づくがんワクチン又はウイルスに基づくがんワクチンであり、前記治療細胞は、サイトカイン誘導キラー細胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、樹状細胞結合サイトカイン誘導キラー細胞、又はｎｅｏＡｇ負荷ＤＣ－ＣＩＫである、請求項１６に記載のがんワクチン混合物。

【請求項18】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択される、請求項１６に記載のがんワクチン混合物。

【請求項19】

前記免疫増強剤は、免疫チェックポイントタンパク質、免疫抑制因子、及び／又は免疫刺激因子を含む、治療細胞である、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項20】

前記治療細胞は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体－ナチュラルキラー細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、又は養子Ｔ細胞である、請求項１９に記載のがんワクチン混合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ワクチン、その使用、及びがんワクチン混合物に関し、特に、腫瘍抗原に特異的なワクチン、その使用、及び前記ワクチンを含むがんワクチン混合物に関する。

【背景技術】

【0002】

がん治療は、放射線療法、化学療法、標的療法、及び手術を主として、近年の薬剤や手術技術の進歩にもかかわらず、末期患者の５年間生存率がまだかなり低く、これはがん免疫療法等の新しい治療戦略を開発する重要性を示している。免疫療法は、免疫反応を強化して腫瘍細胞を排除することを主として、免疫チェックポイント阻害剤、細胞療法、がんワクチン等を含む。免疫チェックポイント阻害剤は様々ながんにおいて良好な臨床反応を示しているが、その適用はＤＮＡミスマッチによる修復欠損の状態（がん患者の１０－１５％）と免疫細胞浸潤の程度によって制限され、ほとんどのがん患者は免疫チェックポイント阻害に適用しないことを示している。したがって、ネオ抗原に基づく免疫療法等の新しいタイプの免疫療法戦略を開発することが非常に重要である。

【0003】

ネオ抗原は、がん進行中の体細胞突然変異に由来し、腫瘍特異的免疫反応を誘発することができるため、次世代遺伝子配列決定技術の画期的な進歩により、個別化されたネオ抗原を同定することで腫瘍特異的免疫反応を活性化することによってがんワクチンを開発することが可能となるが、放射線療法（ＲＴ）と化学療法（ＣＴ）は、腫瘍抗原の放出を増加させるだけでなく、腫瘍微小環境を、より許容できる微小環境に変えることもできる。ネオ抗原に基づくがんワクチンを放射線療法及び免疫原性化学療法を組み合わせることで、従来の治療に抵抗性の患者でも持続可能な疾患制御を達成できる可能性があると期待される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

そのうえ、腫瘍ネオ抗原ペプチドワクチンを単独で使用する単一の療法は、腫瘍を除去するのに十分な効果がなく、ほとんどの突然変異は患者によって異なり、ネオ抗原がより個別化され、結果として高コストと長期間がかかる。したがって、頻度の高い共有ネオ抗原（ｓｈａｒｅｄ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）をターゲットにし、ネオ抗原に基づく免疫療法の送達効果を最適化することは、前述の問題を解決するための新しい方向である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示の一態様は、ベクターおよび導入遺伝子を含むワクチンを提供することである。導入遺伝子は、複数のペプチドをコードし、且つベクターに封入されており、前記ペプチドは順に、分泌シグナルペプチド、少なくとも１つの腫瘍抗原、少なくとも１つの共阻害ペプチド、及びＴｏｌｌ様受容体９アンタゴニスト配列（ＴＬＲ９）を含む。前記少なくとも１つの腫瘍抗原は、腫瘍細胞と正常細胞との差分である。前記少なくとも１つの共阻害ペプチドは、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）アンタゴニスト、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）アンタゴニスト、又は細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）アンタゴニストを含む。

【0006】

本開示の別の態様は、がんの治療に用いられ、がん治療を必要とする対象に抗腫瘍免疫応答を誘導するための、前段落に記載のワクチンの使用である。

【0007】

本開示の更なる態様は、前段落に記載のワクチン、増強剤、及び免疫増強剤を含むがんワクチン混合物を提供することである。前記ワクチンは、がん治療を必要とする対象における少なくとも１つの腫瘍抗原に対する免疫反応を誘導するために用いられ、増強剤は、前記対象における局所腫瘍制御を増強するために用いられ、免疫増強剤は、前記対象における局所再発及び転移を防止するために用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

本開示の目的をより明確にするために、以下、図面を参照しながら実施例を詳細に説明する。

【図1】図１は、本開示の一実施形態のワクチンの構築を示す概略図である。

【図2A-2C】図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、本開示のワクチンが対象に導入遺伝子を送達し、コードされたペプチドが対象の体内で相互作用するメカニズムを示す概略図である。

【図3A】図３Ａは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの構築を示す概略図である。

【図3B】図３Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図3C】図３Ｃは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【図4A-4E】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、及び図４Ｅは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果を示す。

【図5A】図５Ａは、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）免疫分析の実験プロセスを示す概略図である。

【図5B-5F】図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの生体外免疫分析の分析結果を示す。

【図6A-6B】図６Ａ及び図６Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果を示す。

【図6C-6D】図６Ｃ及び図６Ｄは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、放射線療法後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に対する影響の分析結果を示す。

【図7A】図７Ａは、実施例４、実施例６及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの構築及び治療戦略を示す概略図である。

【図7B-7F】図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、及び図７Ｆは、実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの結腸直腸がんの治療効果の分析結果を示す。

【図8A】図８Ａは、本開示の実施例１０のワクチンの構築を示す概略図である。

【図8B】図８Ｂは、本開示の実施例１０のワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図8C】図８Ｃは、本開示の実施例１０のワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【図9】図９は、本開示の実施例１０のワクチンで治療した結腸直腸がんマウスの生存曲線を示す。

【図10A】図１０Ａは、本開示の実施例１３のワクチンの構築及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図10B-10G】図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、及び図１０Ｇは、本開示の実施例１３のワクチンを放射線療法と組み合わせて結腸直腸がんを治療した効果の分析結果を示す。

【図11A】図１１Ａは、本開示の実施例１６のワクチンの構築及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図11B-11G】図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、及び図１１Ｇは、本開示の実施例１６のワクチンの乳がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【図12A】図１２Ａは、本開示の一実施形態のがんワクチン混合物のがん治療のための治療戦略を示す概略図である。

【図12B】図１２Ｂは、本開示の一実施形態の一実施例のがんワクチン混合物を示す概略図である。

【図13A】図１３Ａは、本開示の一実施例のがんワクチン混合物の動物治療試験における治療戦略を示す概略図である。

【図13B-13D】図１３Ｂ、図１３Ｃ、及び図１３Ｄは、本開示のがんワクチン混合物の結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

図１を参照されたい。それは本開示の一実施形態のワクチン１００の構築概略図を示す。ワクチン１００は、ベクター１１０と、ベクター１１０に封入された導入遺伝子１２０とを含む。

【0010】

ベクター１１０は、異なる異方性を有する腫瘍抗原の発現を増強するために用いられ、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はナノ粒子であってよい。好ましくは、ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）ベクター又はアデノ随伴ウイルス６（ＡＡＶ６）ベクターであってよい。ナノ粒子は、リポソーム送達システム［例えば、リン酸セチル－テトラエチレンペンタミンに基づくポリカチオン性リポソーム（ＴＥＰＡ－ＰＣＬ）、リポプレックス（例えば、ＤＯＴＭＡ：コレステロール：ＴＰＧＳリポプレックス又はＤＤＡＢ：コレステロール：ＴＰＧＳリポプレックス）、カチオン性リポソーム－ヒアルロン酸（ＬＰＨ）ナノ粒子］、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリエチレンイミン複合体、デンドリマーナノ粒子、ポリアミド（ＰＡＭＡＭ）ナノ粒子、ポリ乳酸及びポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）ナノ粒子、アテロコラーゲンナノ粒子、及びシリカナノ粒子を含むが、それらに限定されない。

【0011】

導入遺伝子１２０は複数のペプチドをコードし、前記ペプチドは順に、分泌シグナルペプチド１２１、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２、共阻害ペプチド１２３、及びＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アンタゴニスト配列１２４を含む。

【0012】

分泌シグナルペプチド１２１は、腫瘍抗原の分泌を補助するために用いられる。好ましくは、分泌シグナルペプチド１２１は、インターロイキン２シグナルペプチド（ＩＬ２ ｓｐ）又はインターロイキン１２シグナルペプチド（ＩＬ１２ ｓｐ）であってよい。

【0013】

少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、がん治療を必要とする対象に抗腫瘍免疫応答を増加させるために用いられ、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、腫瘍細胞と正常細胞との差分である。好ましくは、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択されてよい。また、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、腫瘍特異体細胞突然変異（ネオ抗原）を同定するように、対象からの正常細胞及び対応する腫瘍細胞のＤＮＡ配列を全エクソーム配列によって比較して選別され、そして既存のネオ抗原データベースからネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを選択することができる。ＴＡＡは腫瘍細胞では過剰発現されるが、正常細胞では発現量が低くなる。例えば、乳がんにおけるＴＡＡは、乳がんで過剰発現されるマンマグロビン－Ａ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ１）、メラノサイトタンパク質ＰＭＥＬ、Ｂｃｒ／Ａｂｌチロシンキナーゼ、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＺ２－Ｅ、ＭＡＧＥ－１、及びＭＵＣ－１を含むが、これらに限定されない。一方、ＴＳＡはがん細胞のみで発見され、健康な細胞では発見されない。例えば、ＴＳＡは、ドライバー遺伝子ＫＲＡＳ－Ｇ１２／１３コドン突然変異ホットスポット、ＴＰ５３突然変異ホットスポット、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異ホットスポット、ＢＲＡＦ突然変異、及びフレームシフト突然変異を含むが、これらに限定されない。ａｅＴＳＡは、中枢免疫寛容を調整する胸腺髄質表皮細胞（ｍＴＥＣ）等を含むいずれの正常な体細胞では発現されない、突然変異していない転写産物の異常な発現から由来する。

【0014】

共阻害ペプチド１２３は、樹状細胞（ＤＣ）における共阻害シグナルを遮断してＤＣの抗原提示能力を増加させるためのものである。共阻害ペプチド１２３は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）アンタゴニスト、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）アンタゴニスト、又は細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）アンタゴニストを含む。好ましくは、前記ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、ＰＬ－Ｌ１トラップとＰＤ－１ペプチドを含んでよく、前記ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ－１トラップとＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２ペプチドを含んでよく、前記ＣＴＬＡ４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ４トラップとＣＴＬＡ４アンタゴニスト抗体を含んでよい。

【0015】

ＴＬＲ９アンタゴニスト配列１２４は、自然免疫系によるウイルスクリアランスを弱め、高い抗原負荷を維持するための抗ウイルスクリアランス配列である。好ましくは、ＴＬＲ９アンタゴニスト配列１２４は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＴＬＲ９結合ドメイン、ＴＬＲデコイペプチド、及びＣｐＧ結合配列から選択されてよい。

【0016】

また、本開示のワクチン１００は、ＤＣのリクルート及び活性化を増加させるための共刺激ペプチドを更に含んでよく、ここで共刺激ペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、及びインターフェロン（ＩＦＮｓ）から選択されてよい。

【0017】

一実施形態によれば、がん治療のための方法は、前段落に記載のワクチンを、がん治療を必要とする対象に投与することで、対象における抗腫瘍免疫反応を誘導することを含む。好ましくは、この実施形態におけるがん治療のための方法は更に、放射線療法を対象へ施すことを含むことができる。また、本開示のワクチンは、ペプチドが発現される条件下で、対象の腫瘍特異的免疫反応を相乗的に促進し、対象の生存期間を相乗的に延長することができる。

【0018】

「がん」とは、細胞増殖の無秩序性を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す。「腫瘍」は、１つ又は複数種類のがん細胞を含む。がんの例は、上皮がん、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、又はリンパ悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。より具体的には、乳がん、大腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺腫、肺扁平上皮がんを含む肺がん、扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃がん、膵がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝細胞がん、膀胱がん、子宮内膜がん又は子宮体がん、唾液腺がん、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肛門がん、陰茎がん、頭頸部がん等が挙げられる。

【0019】

「有効量」とは、対象の疾患／障害を「治療」するのに有効な本開示のワクチンの量を意味する。有効量は、投与された組織、システム、動物又はヒトの生物学的又は医学的反応とある程度の相関関係があり、例えば、投与された場合、１つ又は複数の疾患／障害の進行をある程度予防したり、１つ又は複数の治療された疾患／障害の症状を軽減したりするのに十分である。治療有効量は、疾患及びその重篤度、並びに治療される哺乳動物の年齢及び体重等によって異なる。

【0020】

図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃを参照されたい。それらは、本開示のワクチンが対象に導入遺伝子を送達し、コードされたペプチドが対象の体内で相互作用するメカニズムを示す概略図である。本開示のワクチンは、免疫チェックポイントの阻害、腫瘍抗原提示量の増加、腫瘍免疫反応の活性化に有効である。

【0021】

以下、具体的な実施例を挙げて図面を組み合わせて本開示を更に例示的に説明するが、これらの実施例は説明のためのものに過ぎず、本開示はこれらに限定されない。例えば、以下の実施例で使用されるベクターはＡＡＶベクターであるが、前記ベクターは導入遺伝子をターゲット細胞に伝達するためのものであるため、ワクシニアウイルスベクター又はナノ粒子のような他のベクターを使用しても同様の効果が期待できる。

【0022】

実施例と比較例

【0023】

［実施例１－３］

【0024】

まず、われわれは、化学療法及び放射線療法を受けた後に残っている腫瘍には、共有ネオ抗原（以下、「ｎｅｏＡｇ（ｓ）」と略称する）が存在することを発見し、そして難治性及び再発性腫瘍のｎｅｏＡｇｓマップを確立した。これらのｎｅｏＡｇｓは体外診断（ＩＶＤ）テストや、抗体に基づく免疫治療薬の開発に使用できる。また、これらのｎｅｏＡｇｓは、ＤＣワクチン及びＤＣ－ＤＩＫ細胞療法を改善するための腫瘍特異的主要成分とし、放射線療法、化学療法、細胞療法の効果を向上させるためのｎｅｏＡｇｓペプチドに基づくがんワクチン免疫療法を更に開発するために使用できる。表１を参照されたい。それは、マウス大腸がんＣＴ２６細胞株（以下、「ＣＴ２６細胞」と略称する）におけるｎｅｏＡｇｓのリストである。
表１、ＣＴ２６細胞におけるｎｅｏＡｇｓ

【表1】

また、われわれは上記ｎｅｏＡｇｓを含むｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンを開発し、がんに対するその治療効果を確認した。

【0025】

図３Ａを参照されたい。それは実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの構築概略図を示す。図３Ａに示すように、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片をＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する、インターロイキン１２シグナルペプチド（ＩＬ１２ ｓｐ）、ｎｅｏＡｇｓ、及び２つのオボアルブミン配列（ＯＶＡ－ＣＤ４とＯＶＡ－ＣＤ８）を含む。ＩＬ１２ ｓｐは、細胞に分泌されるｎｅｏＡｇｓの量を増加させるために用いられ、ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。ｎｅｏＡｇｓは、表１に示すｎｅｏＡｇｓ １－８を含み、且つＲＥＲＫリンカーを介して融合される。ＯＶＡ－ＣＤ４及びＯＶＡ－ＣＤ８を陽性対照群とし、ＯＶＡ－ＣＤ４及びＯＶＡ－ＣＤ８のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。また、比較例１は、空のｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターであり、ＩＬ１２ ｓｐをコードするヌクレオチド断片を含むが、ｎｅｏＡｇｓをコードするヌクレオチド断片を含まない。

【0026】

図３Ｂ及び表２を参照されたい。図３Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表２は、実施例１－２及び比較例１－２の治療戦略である。
表２、実施例１－２及び比較例１－２の治療戦略

【表2】

【0027】

実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの治療効果を検証するために、実験では、結腸直腸がんのマウスモデルを確立しておく。２×１０^５個のＣＴ２６細胞及び２０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの右下肢に皮下接種する。８日後、結腸直腸がんマウスをランダムに異なる群に分け、実施例１又は比較例１（１×１０^８ ｖｇ）を６日ごとに計３回筋肉内注射し、２５日目に４回目の補強剤を注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を行い、放射線療法の回数は１回である。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、２８日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。採取した腫瘍組織は、後続の免疫分析に用いられる。

【0028】

図３Ｃを参照されたい。それは実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果図である。図３Ｃの結果によると、比較例１と比較して、実施例１でｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンを単独で投与する治療は、腫瘍増殖を顕著に阻害することができ、比較例２（放射線療法を単独で投与する）と同様の効果を達成することができる。実施例２では、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンと放射線療法を同時に投与して、腫瘍増殖阻害効果がより顕著である。上記結果は、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンが放射線療法の治療効果を向上できることを示す。

【0029】

実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響を検証するために、腫瘍浸潤リンパ球を更に単離する。試験では、実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２の結腸直腸がんマウスから新鮮な腫瘍を単離し、室温で腫瘍を５ ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を含む６ ｃｍシャーレに置き、滅菌ナイフで腫瘍を約１－２ ｍｍの大きさの塊に切る。５０ ｍｌの遠心チューブを１個用意し、その頂部に７０ μｍの細胞ストレーナーを置き、滅菌スポイトで全ての腫瘍組織をストレーナーに移し、組織断片が残っていれば、５ ｍＬプラスチックシリンジでＲＰＭＩ １６４０培地を注入し、組織断片をストレーナーに通す。全ての細胞溶液を、底部にＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅが入っている１５ ｍＬコニカルチューブに慎重に移し、２０℃、遠心力１０２５×ｇで２０分間遠心分離しながら、ゆっくり加速して、ブレーキをかけてオフにする。滅菌ピペットで単核細胞層を新しい５０ ｍｌ遠心チューブに慎重に移し、１０ ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を加え、２０℃、遠心力６５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を除去し、１０ ｍｌの完全ＲＰＭＩ １６４０培地に細胞を軽く再懸濁し、２０℃、６５０×ｇで１０分間再度遠心分離する。上清を除去し、１ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を加えて改めて懸濁し、そして得られたものが単離した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）である。

【0030】

図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、及び図４Ｅを参照されたい。それらは実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果図であり、ここで＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表し、データは、一元配置独立分散分析で分析した。図４Ａ－図４Ｅの結果によると、比較例１、比較例２、及び実施例１と比較して、実施例２で実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチン及び放射線療法を同時に投与する治療は、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、ＣＤ４４^＋細胞、Ｔｒｅｇ細胞、及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を顕著に増加させることができ、ここで、ＣＤ４^＋細胞の数はヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）反応を表し、ＣＤ８^＋細胞の数は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を表し、ＣＤ４４^＋細胞の細胞数はエフェクター／メモリーＴ細胞反応を表し、Ｔｒｅｇ細胞及びＭＤＳＣの細胞数は免疫抑制細胞反応を表す。上記結果は、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンが、免疫細胞の浸潤を促進することにより抗腫瘍免疫を得ることを示す。

【0031】

図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆを参照されたい。図５Ａは、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）免疫分析の実験フローの概略図を示し、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの生体外免疫分析の分析結果図である。試験では、マウス脾臓の単一細胞懸濁液をＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ検出キット（Ａｂｃａｍ）で生体外免疫分析を行う。脾臓細胞を、２ ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．５ ｕｇ／ｍＬコンカナバリンＡ、及び２ ｎｇ／ｍＬ ｍ－ＩＬ２の完全ＲＰＭＩ １６４０培地を含む９６ウェルプレートに２．５×１０^５／ウェルの密度で播種し、２日間培養する。付着していない細胞を除去した後、培地を１ μｇ／ｍＬペプチドを添加した培地に交換し、脾臓細胞を２４時間刺激する。陽性対照群は、１ ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡと５００ｎｇ／ｍＬイオノマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した脾臓細胞である。最後に、定性的測定を行い、ＩＦＮγの産生及び分泌の部位を検出する。図５Ｂ－図５Ｆに示すように、結果は、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンがｎｅｏＡｇ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を誘導できることを示す。

【0032】

実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの腫瘍微小環境における作用を検証するために、実験では、腫瘍浸潤リンパ球の単離を実施する。確立された結腸直腸がんマウスをランダムに割り当てた異なる群の結腸直腸がんマウスには、それぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に実施例１、比較例１（１×１０^８ ｖｇ）、及びＰＢＳを計４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目と１８日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を２回行う。２８日目に結腸直腸がんマウスを犠牲にし、収集した腫瘍組織に免疫分析を行う。実施例１及び３、比較例１及び３、並びに対照群１及び３の治療戦略は表３を参照されたい。
表３、実施例１及び３、比較例１及び３、並びに対照群１及び３の治療戦略

【表3】

【0033】

図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び図６Ｄを参照されたい。図６Ａ及び図６Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果図であり、図６Ｃ及び図６Ｄは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、放射線療法投与後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に対する影響の分析結果図である。図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｄにおいて、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは一元配置独立分散分析で分析する。図６Ａ－図６Ｄに示すように、対照群１、対照群３、比較例１、比較例３、及び実施例１と比較して、実施例３で実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチン及び放射線療法を同時に投与して、ＣＤ８^＋Ｔ_ＥＭの細胞数、及びＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬｓとＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ／Ｔｒｅｇの比率を顕著に増加させる。上記結果は、放射線療法が腫瘍浸潤エフェクター／メモリー及び細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増加させ、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンが放射線療法投与後の腫瘍微小環境における免疫抑制状態を逆転できることを示す。

【0034】

［実施例４－９］

【0035】

次に、われわれは、ＴＬＲ９アンタゴニスト配列と様々な腫瘍抗原を含むＡＡＶに基づくがんワクチンを、がんに対する治療効果を確認するために開発した。図７Ａを参照されたい。それは実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの構築及び治療戦略の概略図を示す。

【0036】

図７Ａに示すように、３種類のＡＡＶに基づくがんワクチン（実施例４、実施例６、及び実施例８）は、自然免疫系によるウイルスクリアランスを回避し、且つ腫瘍抗原発現を延長するために、２つの短いＴＬＲ９阻害配列（図７Ａでは「ＴＬＲ９ｉ」として示す）をＩＬ１２ ｓｐを含むｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに挿入するように設計される。実施例４のＡＡＶに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、少なくとも１つの腫瘍抗原としてＴＡＡがん胎児性抗原（ＣＥＡ）を含み、ＣＥＡのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。実施例６のＡＡＶに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、表１に列挙されるｎｅｏＡｇｓ １－８を含み、且つＲＥＲＫリンカーで融合されて少なくとも１つの腫瘍抗原（図７Ａでは「ｎｅｏＡｇ」で示す）とする。実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、少なくとも１つの腫瘍抗原（図７Ａでは「ａｅＴＳＡ」で示す）として表４に列挙される異常発現腫瘍特異抗原１－７を含み、ここでＥＲＥは内因性逆転写因子の略称である。２つの短いＴＬＲ９阻害配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される。また、比較例１は、空のｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターであり、ＩＬ１２ ｓｐをコードするヌクレオチド断片を含むが、腫瘍抗原をコードするヌクレオチド断片を含まない。
表４、ＣＴ２６細胞におけるａｅＴＳＡｓ

【表4】

【0037】

実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。実施例４、実施例６、実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチン、及び比較例１（１×１０^８ ｖｇ）のものをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を１回行う。腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、３０日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。収集した腫瘍組織は、後続の免疫分析に用いられる。実施例４－９及び比較例１－２の治療戦略は、表５を参照されたい。
表５、実施例４－９及び比較例１－２の治療戦略

【表5】

【0038】

図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、及び図７Ｆを参照されたい。それらは、実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの結腸直腸がんの治療効果の分析結果図であり、ここで、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは一元配置独立分散分析で分析する。図７Ｂ－図７Ｅに示すように、実施例４のＡＡＶに基づくがんワクチンを単独で投与すると、腫瘍の進行から結腸直腸がんマウスを保護することができないが、実施例６又は実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンを単独で投与する群では、腫瘍の増殖がわずかに遅延する。しかしながら、ＡＡＶに基づくがんワクチンと放射線療法を同時に投与する群（実施例５、実施例７、及び実施例９）では、腫瘍の増殖を顕著に阻害する効果が見られる。図７Ｆの結果は、実施例７及び実施例９では、増殖細胞マーカーＫｉ６７の発現量も顕著に減少していることを示す。上記結果は、実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンが、放射線療法の治療効果を顕著に向上させ、且つ腫瘍抗原特異的免疫反応を引き起こして腫瘍の増殖を遅延させることを示す。

【0039】

［実施例１０－１２］

【0040】

われわれは、本開示のワクチンを更に構築し、がんに対するその治療効果を確認した。図８Ａを参照されたい。それは本開示の実施例１０のワクチンの構築概略図を示す。図８Ａに示すように、本開示の実施例１０のワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、分泌シグナルペプチドとしてＩＬ１２ ｓｐ、少なくとも１つの腫瘍抗原として表１に列挙されるｎｅｏＡｇｓ １－８、少なくとも１つの共阻害ペプチドとしてＰＤ－１トラップとＣＴＬＡ４トラップ、及びＴＬＲ９アンタゴニスト配列としてＴＬＲ９ｉを含む。上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片をＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する。ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。ＰＤ－１トラップ及びＣＴＬＡ４トラップのアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示される。ＴＬＲ９ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を含む。また、比較例４は、ＩＬ１２ ｓｐ、ＰＤ－１トラップ、ＣＴＬＡ４トラップ、及びＴＬＲ９ｉをコードするヌクレオチド断片を含むｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターである。

【0041】

図８Ｂ及び表６を参照されたい。図８Ｂは、本開示の実施例１０のワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表６は、実施例１０－１２及び比較例４－６の治療戦略である。
表６、実施例１０－１２及び比較例４－６の治療戦略

【表6】

【0042】

本開示の実施例１０のワクチンの治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。本開示の実施例１０のワクチン及び比較例４（１×１０^８ ｖｇ）のものをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を１回行う。又は１１日目と１７日目に同様の方法で放射線療法を計２回投与する。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、２８日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。

【0043】

図８Ｃ、図９、及び表７を参照されたい。図８Ｃは、本開示の実施例１０のワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果図であり、図９は、本開示の実施例１０のワクチンで治療した結腸直腸がんマウスの生存曲線であり、表７は、実施例１０－１２及び比較例４－６の完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＣＲ）率である。
表７、実施例１０－１２及び比較例４－６の完全寛解率

【表7】

【0044】

図８Ｃの結果は、他の群と比較して、実施例１２（本開示の実施例１０のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍体積が顕著に減少し、本開示の実施例１０のワクチンが放射線療法の治療効果を顕著に促進することを示す。図９及び表７の結果は、４０％の結腸直腸がんマウスが、本開示の実施例１０のワクチンを投与した後、完全寛解（２／５）に達し、本開示の実施例１０のワクチンが結腸直腸がんマウスの生存時間を顕著に延長することを示す。

【0045】

［実施例１３－１５］

【0046】

われわれは、本開示の別の実施例のワクチンを更に構築し、がんに対するその効果を確認した。図１０Ａ及び表８を参照されたい。図１０Ａは、本開示の実施例１３のワクチンの構築概略図、及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表８は、実施例１３－１５、比較例７－９、及び対照群１－３の治療戦略である。
表８、実施例１３－１５、比較例７－９、及び対照群１－３の治療戦略

【表8】

【0047】

図１０Ａに示すように、本開示の実施例１３のワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、分泌シグナルペプチドとしてＩＬ１２ ｓｐ、少なくとも１つの腫瘍抗原としてｎｅｏＡｇ／ａｓＴＳＡ、少なくとも１つの共阻害ペプチドとしてＰＤ－１トラップ及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡ（図１０Ａでは「ｍｉＲ」で示す）、及びＴＬＲ９アンタゴニスト配列としてＴＬＲ９ｉを含み、上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片を、ＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する。ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。ｎｅｏＡｇ／ａｓＴＳＡは、表１に列挙されたｎｅｏＡｇｓ １－８及び表４に列挙されたａｓＴＳＡｓ １－７を含む。ＰＤ－１トラップのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示され、ＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示される。ＴＬＲ９ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を含む。また、比較例７は、ＩＬ１２ ｓｐ、ＰＤ－１トラップ及びＴＬＲ９ｉをコードするヌクレオチド断片を含むが、腫瘍抗原をコードするヌクレオチド断片、及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターを含まない。

【0048】

本開示の実施例１３のワクチンの治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。実施例１３のワクチン、比較例７（１×１０^８ ｖｇ）のもの、及びＰＢＳをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を１回行う。又は１１日目と１８日目に分割放射線療法を計２回投与する。また、結腸直腸がんマウスに、第２腫瘍が生成するように、３×１０^５個のＣＴ２６細胞及び２０％マトリゲルを５６日目に皮下接種する。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。試験の３０日目に、フローサイトメトリーで分析する。また、本開示の実施例１３のワクチンと比較例７のワクチンを筋肉内注射によって接種した後、結腸直腸がんマウスの血液中のＧｌｕｄ１^＋ＣＤ８細胞の発現レベルを、Ｇｌｕｄ１／ＭＨＣ－Ｉ特異的四量体アッセイで測定する。

【0049】

図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇ、表９及び表１０を参照されたい。図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇは、本開示の実施例１３のワクチンを放射線療法と組み合わせて結腸直腸がんを治療した効果の分析結果図であり、ここで、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは一元配置独立分散分析で分析する。表９は、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の完全寛解率であり、表１０は、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の生存時間の中央値である。
表９、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の完全寛解率

【表9】

表１０、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の生存時間の中央値

【表10】

【0050】

図１０Ｂ－図１０Ｄの結果は、他の群と比較して、比較例９（比較例７のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍体積及び腫瘍重量は約７０％顕著に減少することを示す。しかしながら、実施例１５（本開示の実施例１３のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍体積及び腫瘍重量は、約９０％顕著に減少する。図１０Ｅ、図１０Ｆ、表９、及び表１０の結果は、４０％の結腸直腸がんマウスが、本開示の実施例１３のワクチンを投与した後、完全寛解（３／７）に達し、その生存時間が顕著に延長することを示す。また、腫瘍のない結腸直腸がんマウスにＣＴ２６細胞を再植してから３７０日後でも第２腫瘍がまったく生成せず、これは本開示の実施例１３のワクチンを投与することにより、放射線療法の治療効果を向上できるだけでなく、腫瘍の再生を阻害できることを示す。図１０Ｇの結果は、本開示の実施例１３のワクチンを接種した結腸直腸がんマウスの単球において、ネオ抗原特異的Ｔ細胞免疫反応が顕著に増加することを示す。したがって、上記結果は、本開示の実施例１３のワクチンを放射線療法と組み合わせることにより、完全応答を達成し、且つ腫瘍再発を阻害できることを示す。

【0051】

［実施例１６－１７］

【0052】

本開示のワクチンが高いネオ抗原免疫原性を引き起こして放射線療法の治療効果を向上させることを更に証明するために、実験では、８つの突然変異型ＴＳＡを含む別のワクチンを更に構築し、４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに接種する。図１１Ａ及び表１１を参照されたい。図１１Ａは、本開示の実施例１６のワクチンの構築概略図、及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表１１は、実施例１６－１７、比較例１０－１１、及び対照群４－５の治療戦略である。
表１１、実施例１６－１７、比較例１０－１１、及び対照群４－５の治療戦略

【表11】

【0053】

図１１Ａに示すように、本開示の実施例１６のワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、分泌シグナルペプチドとしてＩＬ１２ ｓｐ、少なくとも１つの腫瘍抗原としてｎｅｏＡｇ、少なくとも１つの共阻害ペプチドとしてＰＤ－１トラップ及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡ（図１１Ａでは「ｍｉＲ」で示す）、及びＴＬＲ９アンタゴニスト配列としてＴＬＲ９ｉを含み、上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片を、ＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する。ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示され、ｎｅｏＡｇは、表１２に列挙されたｎｅｏＡｇｓ ９－１６を含む。ＰＤ－１トラップのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示され、ＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示され、ＴＬＲ９ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を含む。また、比較例１０は、ＩＬ１２ ｓｐ、ＰＤ－１トラップ及びＴＬＲ９ｉをコードするヌクレオチド断片を含むが、腫瘍抗原をコードするヌクレオチド断片、及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターを含まない。
表１２、マウス乳腺４Ｔ１細胞株（以下、「４Ｔ１細胞」と略称する）におけるｎｅｏＡｇｓ

【表12】

【0054】

本開示の実施例１６のワクチンの治療効果を検証するために、実験では、乳がんマウスモデルを確立しておく。３×１０^５個の４Ｔ１細胞及び２０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下接種し、免疫原性の低い乳がん細胞である４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを得る。８日後、乳がんマウスをランダムに異なる群に分け、本開示の実施例１６のワクチン、比較例１０（１×１０^８ ｖｇ）のもの、及びＰＢＳをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目と１８日目に乳がんマウスを完全に麻酔した後、放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を２回行う。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。試験の３１日目に、フローサイトメトリーで分析する。

【0055】

図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、及び図１１Ｇを参照されたい。それらは、本開示の実施例１６のワクチンの乳がんに対する治療効果の分析結果図であり、ここで＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、データは、一元配置独立分散分析で分析する。図１１Ｂ及び図１１Ｃに示すように、実施例１７（本開示の実施例１６のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍退縮率及び腫瘍重量は、約８０％顕著に減少する。図１１Ｄ－図１１Ｆの結果は、実施例１７における残存腫瘍中の腫瘍浸潤ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、ＣＤ４^＋Ｔ_ＥＭ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ_ＥＭ細胞、及びＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞数が顕著に増加することを示す。図１１Ｇの結果は、実施例１７では、腫瘍浸潤ＤＣｓにおけるＰＤ－Ｌ１発現レベルも顕著に減少することを示す。上記結果は、本開示の実施例１６のワクチンがＤＣｓにおけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害することことができ、その結果、より良好な抗原提示及びＴ細胞媒介免疫反応がもたらされることを示す。これは、本開示の実施例１６のワクチンが、免疫原性の低い乳がん動物モデルにおいて放射線療法の治療効果を向上させることを示す。

【0056】

［実施例１８－２２］

【0057】

図１２Ａ及び図１２Ｂを参照されたい。図１２Ａは、本開示の一実施形態のがんワクチン混合物のがん治療のための治療戦略の概略図を示し、図１２Ｂは、本開示の一実施形態の一実施例のがんワクチン混合物の概略図を示す。

【0058】

本開示の別の実施形態によれば、本開示は、前段落に記載のワクチン、増強剤、及び免疫増強剤を含むがんワクチン混合物を提供する。前記ワクチンは、がん治療を必要とする対象における少なくとも１つの腫瘍抗原に対する免疫反応を誘導するために用いられる。増強剤は、前記対象における局所腫瘍制御を増強するために用いられる。免疫増強剤は、前記対象における局所再発及び転移を防止するために用いられる。

【0059】

前記少なくとも１つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択されてよい。前記増強剤は、放射線、化学療法剤、免疫調節剤、標的療法薬、抗体薬、又はそれらの組み合わせであってよい。前記免疫増強剤は、少なくとも１つの腫瘍抗原を含むがんワクチン又は少なくとも１つの腫瘍抗原を含む治療細胞であってよい。好ましくは、前記がんワクチンは樹状細胞に基づくがんワクチン又はウイルスに基づくがんワクチンであってよく、前記少なくとも１つの腫瘍抗原を含む治療細胞は、サイトカイン誘導キラー細胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、樹状細胞結合サイトカイン誘導キラー細胞（ＤＣ－ＣＩＫ）、又はｎｅｏＡｇ負荷ＤＣ－ＣＩＫ（ｎｅｏＡｇ－ｐｕｌｓｅｄ ＤＣ－ＣＩＫ）であってよい。免疫増強剤は、免疫チェックポイントタンパク質、免疫抑制因子及び／又は免疫刺激因子を含む治療細胞であってよい。好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質を含む前記治療細胞は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体－ナチュラルキラー細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、又は養子Ｔ細胞であってよい。

【0060】

図１３Ａ及び表１３を参照されたい。図１３Ａは、本開示の一実施例のがんワクチン混合物の動物治療試験における治療戦略の概略図を示し、表１３は、実施例１８－２２及び比較例１２の治療戦略である。
表１３、実施例１８－２２及び比較例１２の治療戦略

【表13】

【0061】

本開示のがんワクチン混合物の治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。本開示の実施例１３のワクチン及び比較例７（１×１０^８ ｖｇ）のものをそれぞれ８日目及び１４日目に２回筋肉内注射する。この試験では放射線療法を増強剤とし、増強剤を投与する群では、１１日目、１８日目、及び２５日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を３回行う。この試験ではｎｅｏＡｇ－ＤＣ－ＣＩＫを免疫増強剤とし、免疫増強剤を投与する群では、２１日目及び３１日目にｎｅｏＡｇ－ＤＣ－ＣＩＫを計２回筋肉内注射する。また、αＰＤ－１を免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＢ）として１６日目及び２３日目に計２回投与する。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、４０日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。

【0062】

図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、及び表１４を参照されたい。図１３Ｂ、図１３Ｃ、及び図１３Ｄは、本開示のがんワクチン混合物の結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果図であり、ここで＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは、一元配置独立分散分析で分析する。表１４は、実施例１８－２２及び比較例１２の完全寛解率である。
表１４、実施例１８－２２及び比較例１２の完全寛解率

【表14】

【0063】

図１３Ｂの結果は、他の群と比較して、実施例１９－実施例２２の腫瘍体積はいずれも顕著に縮小することを示す。また、実施例２０では約３３％の結腸直腸がんマウスが完全寛解（２／６）であり、実施例２２では約８３％の結腸直腸がんマウスが完全寛解（５／６）である。図１３Ｃ及び図１３Ｄの結果は、実施例２２の結腸直腸がんマウスの単核細胞では、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答が顕著に増加することを示す。以上の結果は、本開示のがんワクチン混合物が、完全応答を達成でき、且つ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導できることを示す。

【0064】

以上のように、本開示のワクチンは、少なくとも１つの共阻害ペプチドとＴＬＲ９アンタゴニスト配列を共発現して、少なくとも１つの腫瘍抗原の発現を増加させ、且つ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を活性化する。したがって、本開示のワクチンは、十分な導入遺伝子発現を有し、ウイルスクリアランスを減少させ、腫瘍抗原発現量を増加させることができ、臨床的に安全であり、大きな将来性と優位性がある。また、本開示のワクチンは、がんに対する放射線療法の治療効果を向上させ、放射線療法と共阻害ペプチドを含む本開示のワクチンの治療効果を相乗的に増加させることができ、新規、安全且つ効果的な腫瘍抗原に基づく免疫療法を提供する。また、本開示のワクチン、増強剤、及び免疫増強剤を投与することを含む本開示のがんワクチン混合物での療法は、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍再発の阻害に有効である。

【0065】

本開示は、実施形態で以上のように詳細に開示されたが、他の実施形態も可能である。したがって、特許請求の範囲の精神及び範囲は、本明細書の実施形態の説明に限定されるべきではない。

【0066】

当然ながら、当業者にとって、本開示の範囲又は精神から逸脱することなく、本開示の構成に対して様々な変更や修飾を行うことができる。以上の内容に鑑み、本明細書は、添付の特許請求の範囲に入る本開示の修正及び変更を網羅することを意図する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A-3C】

【図4A-4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C-5F】

【図6A-6B】

【図6C-6D】

【図7A】

【図7B-7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A-8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B-C】

【図10D】

【図10E-F】

【図10G】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D-11E】

【図11F-11G】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【配列表】

2024518616000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-01-17

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ベクターと、
複数のペプチドをコードし、且つ前記ベクターに封入される導入遺伝子と、
を含み、
前記ペプチドは、
分泌シグナルペプチドと、
腫瘍細胞と正常細胞との差分である少なくとも１つの腫瘍抗原と、
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）アンタゴニスト、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）アンタゴニスト、又は細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）アンタゴニストを含む少なくとも１つの共阻害ペプチドと、
Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アンタゴニスト配列と、
を順に含む、ワクチン。

【請求項2】

前記少なくとも一つの共阻害ペプチドと前記ＴＬＲ９アンタゴニスト配列との間に共刺激ペプチドを更に含み、前記共刺激ペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、及びインターフェロン（ＩＦＮｓ）から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

前記ベクターは、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はナノ粒子である、請求項１に記載のワクチン。

【請求項4】

前記分泌シグナルペプチドは、インターロイキン２シグナルペプチド（ＩＬ２ ｓｐ）又はインターロイキン１２シグナルペプチド（ＩＬ１２ ｓｐ）である、請求項１に記載のワクチン。

【請求項5】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項6】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍特異体細胞突然変異を同定するために、前記対象の前記正常細胞及び対応する前記腫瘍細胞の全エクソームシーケンシングを比較することによって選択されるＤＮＡ配列である、請求項１に記載のワクチン。

【請求項7】

前記ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１トラップ及びＰＤ－１ペプチドを含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項8】

前記ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ－１トラップ及びＰＤ－Ｌ１ペプチドまたはＰＤ－Ｌ２ペプチドを含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項9】

前記ＣＴＬＡ４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ４トラップ及びＣＴＬＡ４アンタゴニスト抗体を含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項10】

前記ＴＬＲ９アンタゴニスト配列は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＴＬＲ９結合ドメイン、ＴＬＲデコイペプチド、及びＣｐＧ結合配列から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項11】

がん治療を必要とする対象において抗腫瘍免疫応答を誘導するために用いられる、がん治療における使用のための請求項１に記載のワクチン。

【請求項12】

前記ワクチンが放射線と組み合わせて用いられる、請求項１１に記載の使用のためのワクチン。

【請求項13】

がん治療を必要とする対象における前記少なくとも一つの腫瘍抗原に対する免疫反応を誘導するために用いられる請求項１に記載のワクチンと、
前記対象における局所腫瘍制御を増強するために用いられる増強剤と、
前記対象における局所再発及び転移を防止するために用いられる免疫増強剤とを含む、がんワクチン混合物。

【請求項14】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択される、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項15】

前記増強剤は、放射線、化学療法剤、免疫調節剤、標的療法薬、抗体薬、又はそれらの組み合わせである、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項16】

前記免疫増強剤は、前記少なくとも一つの腫瘍抗原を含むがんワクチン又は前記少なくとも一つの腫瘍抗原を含む治療細胞である、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項17】

前記がんワクチンは、樹状細胞に基づくがんワクチン又はウイルスに基づくがんワクチンであり、前記治療細胞は、サイトカイン誘導キラー細胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、樹状細胞結合サイトカイン誘導キラー細胞、又はｎｅｏＡｇ負荷ＤＣ－ＣＩＫである、請求項１６に記載のがんワクチン混合物。

【請求項18】

前記少なくとも一つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択される、請求項１６に記載のがんワクチン混合物。

【請求項19】

前記免疫増強剤は、免疫チェックポイントタンパク質、免疫抑制因子、及び／又は免疫刺激因子を含む、治療細胞である、請求項１３に記載のがんワクチン混合物。

【請求項20】

前記治療細胞は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体－ナチュラルキラー細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、又は養子Ｔ細胞である、請求項１９に記載のがんワクチン混合物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ワクチン、その使用、及びがんワクチン混合物に関し、特に、腫瘍抗原に特異的なワクチン、その使用、及び前記ワクチンを含むがんワクチン混合物に関する。

【背景技術】

【0002】

がん治療は、放射線療法、化学療法、標的療法、及び手術を主として、近年の薬剤や手術技術の進歩にもかかわらず、末期患者の５年間生存率がまだかなり低く、これはがん免疫療法等の新しい治療戦略を開発する重要性を示している。免疫療法は、免疫反応を強化して腫瘍細胞を排除することを主として、免疫チェックポイント阻害剤、細胞療法、がんワクチン等を含む。免疫チェックポイント阻害剤は様々ながんにおいて良好な臨床反応を示しているが、その適用はＤＮＡミスマッチによる修復欠損の状態（がん患者の１０－１５％）と免疫細胞浸潤の程度によって制限され、ほとんどのがん患者は免疫チェックポイント阻害に適用しないことを示している。したがって、ネオ抗原に基づく免疫療法等の新しいタイプの免疫療法戦略を開発することが非常に重要である。

【0003】

ネオ抗原は、がん進行中の体細胞突然変異に由来し、腫瘍特異的免疫反応を誘発することができるため、次世代遺伝子配列決定技術の画期的な進歩により、個別化されたネオ抗原を同定することで腫瘍特異的免疫反応を活性化することによってがんワクチンを開発することが可能となるが、放射線療法（ＲＴ）と化学療法（ＣＴ）は、腫瘍抗原の放出を増加させるだけでなく、腫瘍微小環境を、より許容できる微小環境に変えることもできる。ネオ抗原に基づくがんワクチンを放射線療法及び免疫原性化学療法を組み合わせることで、従来の治療に抵抗性の患者でも持続可能な疾患制御を達成できる可能性があると期待される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

そのうえ、腫瘍ネオ抗原ペプチドワクチンを単独で使用する単一の療法は、腫瘍を除去するのに十分な効果がなく、ほとんどの突然変異は患者によって異なり、ネオ抗原がより個別化され、結果として高コストと長期間がかかる。したがって、頻度の高い共有ネオ抗原（ｓｈａｒｅｄ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）をターゲットにし、ネオ抗原に基づく免疫療法の送達効果を最適化することは、前述の問題を解決するための新しい方向である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示の一態様は、ベクターおよび導入遺伝子を含むワクチンを提供することである。導入遺伝子は、複数のペプチドをコードし、且つベクターに封入されており、前記ペプチドは順に、分泌シグナルペプチド、少なくとも１つの腫瘍抗原、少なくとも１つの共阻害ペプチド、及びＴｏｌｌ様受容体９アンタゴニスト配列（ＴＬＲ９）を含む。前記少なくとも１つの腫瘍抗原は、腫瘍細胞と正常細胞との差分である。前記少なくとも１つの共阻害ペプチドは、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）アンタゴニスト、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）アンタゴニスト、又は細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）アンタゴニストを含む。

【0006】

本開示の別の態様は、がんの治療に用いられ、がん治療を必要とする対象に抗腫瘍免疫応答を誘導するための、前段落に記載のワクチンの使用である。

【0007】

本開示の更なる態様は、前段落に記載のワクチン、増強剤、及び免疫増強剤を含むがんワクチン混合物を提供することである。前記ワクチンは、がん治療を必要とする対象における少なくとも１つの腫瘍抗原に対する免疫反応を誘導するために用いられ、増強剤は、前記対象における局所腫瘍制御を増強するために用いられ、免疫増強剤は、前記対象における局所再発及び転移を防止するために用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

本開示の目的をより明確にするために、以下、図面を参照しながら実施例を詳細に説明する。

【図1】図１は、本開示の一実施形態のワクチンの構築を示す概略図である。

【図2A-2C】図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、本開示のワクチンが対象に導入遺伝子を送達し、コードされたペプチドが対象の体内で相互作用するメカニズムを示す概略図である。

【図3A】図３Ａは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの構築を示す概略図である。

【図3B】図３Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図3C】図３Ｃは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【図4A-4E】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、及び図４Ｅは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果を示す。

【図5A】図５Ａは、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）免疫分析の実験プロセスを示す概略図である。

【図5B-5F】図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの生体外免疫分析の分析結果を示す。

【図6A-6B】図６Ａ及び図６Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果を示す。

【図6C-6D】図６Ｃ及び図６Ｄは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、放射線療法後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に対する影響の分析結果を示す。

【図7A】図７Ａは、実施例４、実施例６及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの構築及び治療戦略を示す概略図である。

【図7B-7F】図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、及び図７Ｆは、実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの結腸直腸がんの治療効果の分析結果を示す。

【図8A】図８Ａは、本開示の実施例１０のワクチンの構築を示す概略図である。

【図8B】図８Ｂは、本開示の実施例１０のワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図8C】図８Ｃは、本開示の実施例１０のワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【図9】図９は、本開示の実施例１０のワクチンで治療した結腸直腸がんマウスの生存曲線を示す。

【図10A】図１０Ａは、本開示の実施例１３のワクチンの構築及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図10B-10G】図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、及び図１０Ｇは、本開示の実施例１３のワクチンを放射線療法と組み合わせて結腸直腸がんを治療した効果の分析結果を示す。

【図11A】図１１Ａは、本開示の実施例１６のワクチンの構築及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略を示す概略図である。

【図11B-11G】図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、及び図１１Ｇは、本開示の実施例１６のワクチンの乳がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【図12A】図１２Ａは、本開示の一実施形態のがんワクチン混合物のがん治療のための治療戦略を示す概略図である。

【図12B】図１２Ｂは、本開示の一実施形態の一実施例のがんワクチン混合物を示す概略図である。

【図13A】図１３Ａは、本開示の一実施例のがんワクチン混合物の動物治療試験における治療戦略を示す概略図である。

【図13B-13D】図１３Ｂ、図１３Ｃ、及び図１３Ｄは、本開示のがんワクチン混合物の結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

図１を参照されたい。それは本開示の一実施形態のワクチン１００の構築概略図を示す。ワクチン１００は、ベクター１１０と、ベクター１１０に封入された導入遺伝子１２０とを含む。

【0010】

ベクター１１０は、異なる異方性を有する腫瘍抗原の発現を増強するために用いられ、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はナノ粒子であってよい。好ましくは、ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）ベクター又はアデノ随伴ウイルス６（ＡＡＶ６）ベクターであってよい。ナノ粒子は、リポソーム送達システム［例えば、リン酸セチル－テトラエチレンペンタミンに基づくポリカチオン性リポソーム（ＴＥＰＡ－ＰＣＬ）、リポプレックス（例えば、ＤＯＴＭＡ：コレステロール：ＴＰＧＳリポプレックス又はＤＤＡＢ：コレステロール：ＴＰＧＳリポプレックス）、カチオン性リポソーム－ヒアルロン酸（ＬＰＨ）ナノ粒子］、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリエチレンイミン複合体、デンドリマーナノ粒子、ポリアミド（ＰＡＭＡＭ）ナノ粒子、ポリ乳酸及びポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）ナノ粒子、アテロコラーゲンナノ粒子、及びシリカナノ粒子を含むが、それらに限定されない。

【0011】

導入遺伝子１２０は複数のペプチドをコードし、前記ペプチドは順に、分泌シグナルペプチド１２１、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２、共阻害ペプチド１２３、及びＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アンタゴニスト配列１２４を含む。

【0012】

分泌シグナルペプチド１２１は、腫瘍抗原の分泌を補助するために用いられる。好ましくは、分泌シグナルペプチド１２１は、インターロイキン２シグナルペプチド（ＩＬ２ ｓｐ）又はインターロイキン１２シグナルペプチド（ＩＬ１２ ｓｐ）であってよい。

【0013】

少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、がん治療を必要とする対象に抗腫瘍免疫応答を増加させるために用いられ、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、腫瘍細胞と正常細胞との差分である。好ましくは、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択されてよい。また、少なくとも１つの腫瘍抗原１２２は、腫瘍特異体細胞突然変異（ネオ抗原）を同定するように、対象からの正常細胞及び対応する腫瘍細胞のＤＮＡ配列を全エクソーム配列によって比較して選別され、そして既存のネオ抗原データベースからネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを選択することができる。ＴＡＡは腫瘍細胞では過剰発現されるが、正常細胞では発現量が低くなる。例えば、乳がんにおけるＴＡＡは、乳がんで過剰発現されるマンマグロビン－Ａ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ１）、メラノサイトタンパク質ＰＭＥＬ、Ｂｃｒ／Ａｂｌチロシンキナーゼ、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＺ２－Ｅ、ＭＡＧＥ－１、及びＭＵＣ－１を含むが、これらに限定されない。一方、ＴＳＡはがん細胞のみで発見され、健康な細胞では発見されない。例えば、ＴＳＡは、ドライバー遺伝子ＫＲＡＳ－Ｇ１２／１３コドン突然変異ホットスポット、ＴＰ５３突然変異ホットスポット、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異ホットスポット、ＢＲＡＦ突然変異、及びフレームシフト突然変異を含むが、これらに限定されない。ａｅＴＳＡは、中枢免疫寛容を調整する胸腺髄質表皮細胞（ｍＴＥＣ）等を含むいずれの正常な体細胞では発現されない、突然変異していない転写産物の異常な発現から由来する。

【0014】

共阻害ペプチド１２３は、樹状細胞（ＤＣ）における共阻害シグナルを遮断してＤＣの抗原提示能力を増加させるためのものである。共阻害ペプチド１２３は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）アンタゴニスト、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）アンタゴニスト、又は細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）アンタゴニストを含む。好ましくは、前記ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１トラップとＰＤ－１ペプチドを含んでよく、前記ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ－１トラップとＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２ペプチドを含んでよく、前記ＣＴＬＡ４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ４トラップとＣＴＬＡ４アンタゴニスト抗体を含んでよい。

【0015】

ＴＬＲ９アンタゴニスト配列１２４は、自然免疫系によるウイルスクリアランスを弱め、高い抗原負荷を維持するための抗ウイルスクリアランス配列である。好ましくは、ＴＬＲ９アンタゴニスト配列１２４は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＴＬＲ９結合ドメイン、ＴＬＲデコイペプチド、及びＣｐＧ結合配列から選択されてよい。

【0016】

また、本開示のワクチン１００は、ＤＣのリクルート及び活性化を増加させるための共刺激ペプチドを更に含んでよく、ここで共刺激ペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、及びインターフェロン（ＩＦＮｓ）から選択されてよい。

【0017】

一実施形態によれば、がん治療のための方法は、前段落に記載のワクチンを、がん治療を必要とする対象に投与することで、対象における抗腫瘍免疫反応を誘導することを含む。好ましくは、この実施形態におけるがん治療のための方法は更に、放射線療法を対象へ施すことを含むことができる。また、本開示のワクチンは、ペプチドが発現される条件下で、対象の腫瘍特異的免疫反応を相乗的に促進し、対象の生存期間を相乗的に延長することができる。

【0018】

「がん」とは、細胞増殖の無秩序性を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す。「腫瘍」は、１つ又は複数種類のがん細胞を含む。がんの例は、上皮がん、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、又はリンパ悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。より具体的には、乳がん、大腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺腫、肺扁平上皮がんを含む肺がん、扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃がん、膵がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝細胞がん、膀胱がん、子宮内膜がん又は子宮体がん、唾液腺がん、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肛門がん、陰茎がん、頭頸部がん等が挙げられる。

【0019】

「有効量」とは、対象の疾患／障害を「治療」するのに有効な本開示のワクチンの量を意味する。有効量は、投与された組織、システム、動物又はヒトの生物学的又は医学的反応とある程度の相関関係があり、例えば、投与された場合、１つ又は複数の疾患／障害の進行をある程度予防したり、１つ又は複数の治療された疾患／障害の症状を軽減したりするのに十分である。治療有効量は、疾患及びその重篤度、並びに治療される哺乳動物の年齢及び体重等によって異なる。

【0020】

図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃを参照されたい。それらは、本開示のワクチンが対象に導入遺伝子を送達し、コードされたペプチドが対象の体内で相互作用するメカニズムを示す概略図である。本開示のワクチンは、免疫チェックポイントの阻害、腫瘍抗原提示量の増加、腫瘍免疫反応の活性化に有効である。

【0021】

以下、具体的な実施例を挙げて図面を組み合わせて本開示を更に例示的に説明するが、これらの実施例は説明のためのものに過ぎず、本開示はこれらに限定されない。例えば、以下の実施例で使用されるベクターはＡＡＶベクターであるが、前記ベクターは導入遺伝子をターゲット細胞に伝達するためのものであるため、ワクシニアウイルスベクター又はナノ粒子のような他のベクターを使用しても同様の効果が期待できる。

【0022】

実施例と比較例

【0023】

［実施例１－３］

【0024】

まず、われわれは、化学療法及び放射線療法を受けた後に残っている腫瘍には、共有ネオ抗原（以下、「ｎｅｏＡｇ（ｓ）」と略称する）が存在することを発見し、そして難治性及び再発性腫瘍のｎｅｏＡｇｓマップを確立した。これらのｎｅｏＡｇｓは体外診断（ＩＶＤ）テストや、抗体に基づく免疫治療薬の開発に使用できる。また、これらのｎｅｏＡｇｓは、ＤＣワクチン及びＤＣ－ＤＩＫ細胞療法を改善するための腫瘍特異的主要成分とし、放射線療法、化学療法、細胞療法の効果を向上させるためのｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチン免疫療法を更に開発するために使用できる。表１を参照されたい。それは、マウス大腸がんＣＴ２６細胞株（以下、「ＣＴ２６細胞」と略称する）におけるｎｅｏＡｇｓのリストである。
表１、ＣＴ２６細胞におけるｎｅｏＡｇｓ

【表1】

また、われわれは上記ｎｅｏＡｇｓを含むｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンを開発し、がんに対するその治療効果を確認した。

【0025】

図３Ａを参照されたい。それは実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの構築概略図を示す。図３Ａに示すように、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片をＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する、インターロイキン１２シグナルペプチド（ＩＬ１２ ｓｐ）、ｎｅｏＡｇｓ、及び２つのオボアルブミン配列（ＯＶＡ－ＣＤ４とＯＶＡ－ＣＤ８）を含む。ＩＬ１２ ｓｐは、細胞に分泌されるｎｅｏＡｇｓの量を増加させるために用いられ、ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。ｎｅｏＡｇｓは、表１に示すｎｅｏＡｇｓ １－８を含み、且つＲＥＲＫリンカーを介して融合される。ＯＶＡ－ＣＤ４及びＯＶＡ－ＣＤ８を陽性対照群とし、ＯＶＡ－ＣＤ４及びＯＶＡ－ＣＤ８のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。また、比較例１は、空のｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターであり、ＩＬ１２ ｓｐをコードするヌクレオチド断片を含むが、ｎｅｏＡｇｓをコードするヌクレオチド断片を含まない。

【0026】

図３Ｂ及び表２を参照されたい。図３Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表２は、実施例１－２及び比較例１－２の治療戦略である。
表２、実施例１－２及び比較例１－２の治療戦略

【表2】

【0027】

実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの治療効果を検証するために、実験では、結腸直腸がんのマウスモデルを確立しておく。２×１０^５個のＣＴ２６細胞及び２０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの右下肢に皮下接種する。８日後、結腸直腸がんマウスをランダムに異なる群に分け、実施例１又は比較例１（１×１０^８ ｖｇ）を６日ごとに計３回筋肉内注射し、２５日目に４回目の補強剤を注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を行い、放射線療法の回数は１回である。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、２８日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。採取した腫瘍組織は、後続の免疫分析に用いられる。

【0028】

図３Ｃを参照されたい。それは実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果図である。図３Ｃの結果によると、比較例１と比較して、実施例１でｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンを単独で投与する治療は、腫瘍増殖を顕著に阻害することができ、比較例２（放射線療法を単独で投与する）と同様の効果を達成することができる。実施例２では、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンと放射線療法を同時に投与して、腫瘍増殖阻害効果がより顕著である。上記結果は、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンが放射線療法の治療効果を向上できることを示す。

【0029】

実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響を検証するために、腫瘍浸潤リンパ球を更に単離する。試験では、実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２の結腸直腸がんマウスから新鮮な腫瘍を単離し、室温で腫瘍を５ ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を含む６ ｃｍシャーレに置き、滅菌ナイフで腫瘍を約１－２ ｍｍの大きさの塊に切る。５０ ｍＬの遠心チューブを１個用意し、その頂部に７０ μｍの細胞ストレーナーを置き、滅菌スポイトで全ての腫瘍組織をストレーナーに移し、組織断片が残っていれば、５ ｍＬプラスチックシリンジでＲＰＭＩ １６４０培地を注入し、組織断片をストレーナーに通す。全ての細胞溶液を、底部にＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅが入っている１５ ｍＬコニカルチューブに慎重に移し、２０℃、遠心力１０２５×ｇで２０分間遠心分離しながら、ゆっくり加速して、ブレーキをかけてオフにする。滅菌ピペットで単核細胞層を新しい５０ ｍＬ遠心チューブに慎重に移し、１０ ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を加え、２０℃、遠心力６５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を除去し、１０ ｍＬの完全ＲＰＭＩ １６４０培地に細胞を軽く再懸濁し、２０℃、６５０×ｇで１０分間再度遠心分離する。上清を除去し、１ ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を加えて改めて懸濁し、そして得られたものが単離した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）である。

【0030】

図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、及び図４Ｅを参照されたい。それらは実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果図であり、ここで＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表し、データは、一元配置独立分散分析で分析した。図４Ａ－図４Ｅの結果によると、比較例１、比較例２、及び実施例１と比較して、実施例２で実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチン及び放射線療法を同時に投与する治療は、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、ＣＤ４４^＋細胞、Ｔｒｅｇ細胞、及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を顕著に増加させることができ、ここで、ＣＤ４^＋細胞の数はヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）反応を表し、ＣＤ８^＋細胞の数は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を表し、ＣＤ４４^＋細胞の細胞数はエフェクター／メモリーＴ細胞反応を表し、Ｔｒｅｇ細胞及びＭＤＳＣの細胞数は免疫抑制細胞反応を表す。上記結果は、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンが、免疫細胞の浸潤を促進することにより抗腫瘍免疫を得ることを示す。

【0031】

図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆを参照されたい。図５Ａは、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）免疫分析の実験フローの概略図を示し、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの生体外免疫分析の分析結果図である。試験では、マウス脾臓の単一細胞懸濁液をＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ検出キット（Ａｂｃａｍ）で生体外免疫分析を行う。脾臓細胞を、２ ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．５ μｇ／ｍＬコンカナバリンＡ、及び２ ｎｇ／ｍＬ ｍ－ＩＬ２の完全ＲＰＭＩ １６４０培地を含む９６ウェルプレートに２．５×１０^５／ウェルの密度で播種し、２日間培養する。付着していない細胞を除去した後、培地を１ μｇ／ｍＬペプチドを添加した培地に交換し、脾臓細胞を２４時間刺激する。陽性対照群は、１ ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡと５００ ｎｇ／ｍＬイオノマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した脾臓細胞である。最後に、定性的測定を行い、ＩＦＮγの産生及び分泌の部位を検出する。図５Ｂ－図５Ｆに示すように、結果は、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンがｎｅｏＡｇ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を誘導できることを示す。

【0032】

実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの腫瘍微小環境における作用を検証するために、実験では、腫瘍浸潤リンパ球の単離を実施する。確立された結腸直腸がんマウスをランダムに割り当てた異なる群の結腸直腸がんマウスには、それぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に実施例１、比較例１（１×１０^８ ｖｇ）、及びＰＢＳを計４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目と１８日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を２回行う。２８日目に結腸直腸がんマウスを犠牲にし、収集した腫瘍組織に免疫分析を行う。実施例１及び３、比較例１及び３、並びに対照群１及び３の治療戦略は表３を参照されたい。
表３、実施例１及び３、比較例１及び３、並びに対照群１及び３の治療戦略

【表3】

【0033】

図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び図６Ｄを参照されたい。図６Ａ及び図６Ｂは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの免疫細胞浸潤による抗腫瘍免疫作用に対する影響の分析結果図であり、図６Ｃ及び図６Ｄは、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンの、放射線療法投与後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に対する影響の分析結果図である。図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｄにおいて、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは一元配置独立分散分析で分析する。図６Ａ－図６Ｄに示すように、対照群１、対照群３、比較例１、比較例３、及び実施例１と比較して、実施例３で実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチン及び放射線療法を同時に投与して、ＣＤ８^＋Ｔ_ＥＭの細胞数、及びＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬｓとＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ／Ｔｒｅｇの比率を顕著に増加させる。上記結果は、放射線療法が腫瘍浸潤エフェクター／メモリー及び細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増加させ、実施例１のｎｅｏＡｇペプチドに基づくがんワクチンが放射線療法投与後の腫瘍微小環境における免疫抑制状態を逆転できることを示す。

【0034】

［実施例４－９］

【0035】

次に、われわれは、ＴＬＲ９アンタゴニスト配列と様々な腫瘍抗原を含むＡＡＶに基づくがんワクチンを、がんに対する治療効果を確認するために開発した。図７Ａを参照されたい。それは実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの構築及び治療戦略の概略図を示す。

【0036】

図７Ａに示すように、３種類のＡＡＶに基づくがんワクチン（実施例４、実施例６、及び実施例８）は、自然免疫系によるウイルスクリアランスを回避し、且つ腫瘍抗原発現を延長するために、２つの短いＴＬＲ９阻害配列（図７Ａでは「ＴＬＲ９ｉ」として示す）をＩＬ１２ ｓｐを含むｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに挿入するように設計される。実施例４のＡＡＶに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、少なくとも１つの腫瘍抗原としてＴＡＡがん胎児性抗原（ＣＥＡ）を含み、ＣＥＡのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。実施例６のＡＡＶに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、表１に列挙されるｎｅｏＡｇｓ １－８を含み、且つＲＥＲＫリンカーで融合されて少なくとも１つの腫瘍抗原（図７Ａでは「ｎｅｏＡｇ」で示す）とする。実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、少なくとも１つの腫瘍抗原（図７Ａでは「ａｅＴＳＡ」で示す）として表４に列挙される異常発現腫瘍特異抗原１－７を含み、ここでＥＲＥは内因性逆転写因子の略称である。２つの短いＴＬＲ９阻害配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される。また、比較例１は、空のｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターであり、ＩＬ１２ ｓｐをコードするヌクレオチド断片を含むが、腫瘍抗原をコードするヌクレオチド断片を含まない。
表４、ＣＴ２６細胞におけるａｅＴＳＡｓ

【表4】

【0037】

実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。実施例４、実施例６、実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチン、及び比較例１（１×１０^８ ｖｇ）のものをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を１回行う。腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、３０日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。収集した腫瘍組織は、後続の免疫分析に用いられる。実施例４－９及び比較例１－２の治療戦略は、表５を参照されたい。
表５、実施例４－９及び比較例１－２の治療戦略

【表5】

【0038】

図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、及び図７Ｆを参照されたい。それらは、実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンの結腸直腸がんの治療効果の分析結果図であり、ここで、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは一元配置独立分散分析で分析する。図７Ｂ－図７Ｅに示すように、実施例４のＡＡＶに基づくがんワクチンを単独で投与すると、腫瘍の進行から結腸直腸がんマウスを保護することができないが、実施例６又は実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンを単独で投与する群では、腫瘍の増殖がわずかに遅延する。しかしながら、ＡＡＶに基づくがんワクチンと放射線療法を同時に投与する群（実施例５、実施例７、及び実施例９）では、腫瘍の増殖を顕著に阻害する効果が見られる。図７Ｆの結果は、実施例７及び実施例９では、増殖細胞マーカーＫｉ６７の発現量も顕著に減少していることを示す。上記結果は、実施例４、実施例６、及び実施例８のＡＡＶに基づくがんワクチンが、放射線療法の治療効果を顕著に向上させ、且つ腫瘍抗原特異的免疫反応を引き起こして腫瘍の増殖を遅延させることを示す。

【0039】

［実施例１０－１２］

【0040】

われわれは、本開示のワクチンを更に構築し、がんに対するその治療効果を確認した。図８Ａを参照されたい。それは本開示の実施例１０のワクチンの構築概略図を示す。図８Ａに示すように、本開示の実施例１０のワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、分泌シグナルペプチドとしてＩＬ１２ ｓｐ、少なくとも１つの腫瘍抗原として表１に列挙されるｎｅｏＡｇｓ １－８、少なくとも１つの共阻害ペプチドとしてＰＤ－１トラップとＣＴＬＡ４トラップ、及びＴＬＲ９アンタゴニスト配列としてＴＬＲ９ｉを含む。上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片をＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する。ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。ＰＤ－１トラップ及びＣＴＬＡ４トラップのアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示される。ＴＬＲ９ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を含む。また、比較例４は、ＩＬ１２ ｓｐ、ＰＤ－１トラップ、ＣＴＬＡ４トラップ、及びＴＬＲ９ｉをコードするヌクレオチド断片を含むｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターである。

【0041】

図８Ｂ及び表６を参照されたい。図８Ｂは、本開示の実施例１０のワクチンの、動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表６は、実施例１０－１２及び比較例４－６の治療戦略である。
表６、実施例１０－１２及び比較例４－６の治療戦略

【表6】

【0042】

本開示の実施例１０のワクチンの治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。本開示の実施例１０のワクチン及び比較例４（１×１０^８ ｖｇ）のものをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を１回行う。又は１１日目と１７日目に同様の方法で放射線療法を計２回投与する。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、２８日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。

【0043】

図８Ｃ、図９、及び表７を参照されたい。図８Ｃは、本開示の実施例１０のワクチンの結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果図であり、図９は、本開示の実施例１０のワクチンで治療した結腸直腸がんマウスの生存曲線であり、表７は、実施例１０－１２及び比較例４－６の完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＣＲ）率である。
表７、実施例１０－１２及び比較例４－６の完全寛解率

【表7】

【0044】

図８Ｃの結果は、他の群と比較して、実施例１２（本開示の実施例１０のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍体積が顕著に減少し、本開示の実施例１０のワクチンが放射線療法の治療効果を顕著に促進することを示す。図９及び表７の結果は、４０％の結腸直腸がんマウスが、本開示の実施例１０のワクチンを投与した後、完全寛解（２／５）に達し、本開示の実施例１０のワクチンが結腸直腸がんマウスの生存時間を顕著に延長することを示す。

【0045】

［実施例１３－１５］

【0046】

われわれは、本開示の別の実施例のワクチンを更に構築し、がんに対するその効果を確認した。図１０Ａ及び表８を参照されたい。図１０Ａは、本開示の実施例１３のワクチンの構築概略図、及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表８は、実施例１３－１５、比較例７－９、及び対照群１－３の治療戦略である。
表８、実施例１３－１５、比較例７－９、及び対照群１－３の治療戦略

【表8】

【0047】

図１０Ａに示すように、本開示の実施例１３のワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、分泌シグナルペプチドとしてＩＬ１２ ｓｐ、少なくとも１つの腫瘍抗原としてｎｅｏＡｇ／ａｅＴＳＡ、少なくとも１つの共阻害ペプチドとしてＰＤ－１トラップ及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡ（図１０Ａでは「ｍｉＲ」で示す）、及びＴＬＲ９アンタゴニスト配列としてＴＬＲ９ｉを含み、上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片を、ＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する。ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。ｎｅｏＡｇ／ａｅＴＳＡは、表１に列挙されたｎｅｏＡｇｓ １－８及び表４に列挙されたａｅＴＳＡｓ １－７を含む。ＰＤ－１トラップのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示され、ＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示される。ＴＬＲ９ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を含む。また、比較例７は、ＩＬ１２ ｓｐ、ＰＤ－１トラップ及びＴＬＲ９ｉをコードするヌクレオチド断片を含むが、腫瘍抗原をコードするヌクレオチド断片、及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターを含まない。

【0048】

本開示の実施例１３のワクチンの治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。実施例１３のワクチン、比較例７（１×１０^８ ｖｇ）のもの、及びＰＢＳをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を１回行う。又は１１日目と１８日目に分割放射線療法を計２回投与する。また、結腸直腸がんマウスに、第２腫瘍が生成するように、３×１０^５個のＣＴ２６細胞及び２０％マトリゲルを５６日目に皮下接種する。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。試験の３０日目に、フローサイトメトリーで分析する。また、本開示の実施例１３のワクチンと比較例７のワクチンを筋肉内注射によって接種した後、結腸直腸がんマウスの血液中のＧｌｕｄ１^＋ＣＤ８細胞の発現レベルを、Ｇｌｕｄ１／ＭＨＣ－Ｉ特異的四量体アッセイで測定する。

【0049】

図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇ、表９及び表１０を参照されたい。図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇは、本開示の実施例１３のワクチンを放射線療法と組み合わせて結腸直腸がんを治療した効果の分析結果図であり、ここで、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは一元配置独立分散分析で分析する。表９は、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の完全寛解率であり、表１０は、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の生存時間の中央値である。
表９、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の完全寛解率

【表9】

表１０、実施例１３及び１５、比較例７及び９、並びに対照群１及び３の生存時間の中央値

【表10】

【0050】

図１０Ｂ－図１０Ｄの結果は、他の群と比較して、比較例９（比較例７のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍体積及び腫瘍重量は約７０％顕著に減少することを示す。しかしながら、実施例１５（本開示の実施例１３のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍体積及び腫瘍重量は、約９０％顕著に減少する。図１０Ｅ、図１０Ｆ、表９、及び表１０の結果は、４０％の結腸直腸がんマウスが、本開示の実施例１３のワクチンを投与した後、完全寛解（３／７）に達し、その生存時間が顕著に延長することを示す。また、腫瘍のない結腸直腸がんマウスにＣＴ２６細胞を再植してから３７０日後でも第２腫瘍がまったく生成せず、これは本開示の実施例１３のワクチンを投与することにより、放射線療法の治療効果を向上できるだけでなく、腫瘍の再生を阻害できることを示す。図１０Ｇの結果は、本開示の実施例１３のワクチンを接種した結腸直腸がんマウスの単球において、ネオ抗原特異的Ｔ細胞免疫反応が顕著に増加することを示す。したがって、上記結果は、本開示の実施例１３のワクチンを放射線療法と組み合わせることにより、完全応答を達成し、且つ腫瘍再発を阻害できることを示す。

【0051】

［実施例１６－１７］

【0052】

本開示のワクチンが高いネオ抗原免疫原性を引き起こして放射線療法の治療効果を向上させることを更に証明するために、実験では、８つの突然変異型ＴＳＡを含む別のワクチンを更に構築し、４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに接種する。図１１Ａ及び表１１を参照されたい。図１１Ａは、本開示の実施例１６のワクチンの構築概略図、及びその動物治療試験における放射線療法と組み合わせた治療戦略の概略図を示し、表１１は、実施例１６－１７、比較例１０－１１、及び対照群４－５の治療戦略である。
表１１、実施例１６－１７、比較例１０－１１、及び対照群４－５の治療戦略

【表11】

【0053】

図１１Ａに示すように、本開示の実施例１６のワクチンにおける導入遺伝子にコードされるペプチドは、分泌シグナルペプチドとしてＩＬ１２ ｓｐ、少なくとも１つの腫瘍抗原としてｎｅｏＡｇ、少なくとも１つの共阻害ペプチドとしてＰＤ－１トラップ及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡ（図１１Ａでは「ｍｉＲ」で示す）、及びＴＬＲ９アンタゴニスト配列としてＴＬＲ９ｉを含み、上記ペプチドに対応するヌクレオチド断片を、ＣＭＶによって開始されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターに構築する。ＩＬ１２ ｓｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示され、ｎｅｏＡｇは、表１２に列挙されたｎｅｏＡｇｓ ９－１６を含む。ＰＤ－１トラップのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示され、ＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示され、ＴＬＲ９ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を含む。また、比較例１０は、ＩＬ１２ ｓｐ、ＰＤ－１トラップ及びＴＬＲ９ｉをコードするヌクレオチド断片を含むが、腫瘍抗原をコードするヌクレオチド断片、及びＰＤ－Ｌ１ ｍｉＲＮＡのｐＡＡＶ－ＣＭＶ発現ベクターを含まない。
表１２、マウス乳腺４Ｔ１細胞株（以下、「４Ｔ１細胞」と略称する）におけるｎｅｏＡｇｓ

【表12】

【0054】

本開示の実施例１６のワクチンの治療効果を検証するために、実験では、乳がんマウスモデルを確立しておく。３×１０^５個の４Ｔ１細胞及び２０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下接種し、免疫原性の低い乳がん細胞である４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを得る。８日後、乳がんマウスをランダムに異なる群に分け、本開示の実施例１６のワクチン、比較例１０（１×１０^８ ｖｇ）のもの、及びＰＢＳをそれぞれ８日目、１４日目、２１日目、及び２５日目に４回筋肉内注射する。放射線療法を投与する群では、１１日目と１８日目に乳がんマウスを完全に麻酔した後、放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を２回行う。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。試験の３１日目に、フローサイトメトリーで分析する。

【0055】

図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、及び図１１Ｇを参照されたい。それらは、本開示の実施例１６のワクチンの乳がんに対する治療効果の分析結果図であり、ここで＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、データは、一元配置独立分散分析で分析する。図１１Ｂ及び図１１Ｃに示すように、実施例１７（本開示の実施例１６のワクチン及び放射線療法を同時に投与する）の腫瘍退縮率及び腫瘍重量は、約８０％顕著に減少する。図１１Ｄ－図１１Ｆの結果は、実施例１７における残存腫瘍中の腫瘍浸潤ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、ＣＤ４^＋Ｔ_ＥＭ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ_ＥＭ細胞、及びＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞数が顕著に増加することを示す。図１１Ｇの結果は、実施例１７では、腫瘍浸潤ＤＣｓにおけるＰＤ－Ｌ１発現レベルも顕著に減少することを示す。上記結果は、本開示の実施例１６のワクチンがＤＣｓにおけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害することができ、その結果、より良好な抗原提示及びＴ細胞媒介免疫反応がもたらされることを示す。これは、本開示の実施例１６のワクチンが、免疫原性の低い乳がん動物モデルにおいて放射線療法の治療効果を向上させることを示す。

【0056】

［実施例１８－２２］

【0057】

図１２Ａ及び図１２Ｂを参照されたい。図１２Ａは、本開示の一実施形態のがんワクチン混合物のがん治療のための治療戦略の概略図を示し、図１２Ｂは、本開示の一実施形態の一実施例のがんワクチン混合物の概略図を示す。

【0058】

本開示の別の実施形態によれば、本開示は、前段落に記載のワクチン、増強剤、及び免疫増強剤を含むがんワクチン混合物を提供する。前記ワクチンは、がん治療を必要とする対象における少なくとも１つの腫瘍抗原に対する免疫反応を誘導するために用いられる。増強剤は、前記対象における局所腫瘍制御を増強するために用いられる。免疫増強剤は、前記対象における局所再発及び転移を防止するために用いられる。

【0059】

前記少なくとも１つの腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）、発がん性突然変異、異常発現腫瘍特異抗原（ａｅＴＳＡ）、及び共有ネオ抗原（ｎｅｏＡｇ）から選択されてよい。前記増強剤は、放射線、化学療法剤、免疫調節剤、標的療法薬、抗体薬、又はそれらの組み合わせであってよい。前記免疫増強剤は、少なくとも１つの腫瘍抗原を含むがんワクチン又は少なくとも１つの腫瘍抗原を含む治療細胞であってよい。好ましくは、前記がんワクチンは樹状細胞に基づくがんワクチン又はウイルスに基づくがんワクチンであってよく、前記少なくとも１つの腫瘍抗原を含む治療細胞は、サイトカイン誘導キラー細胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、樹状細胞結合サイトカイン誘導キラー細胞（ＤＣ－ＣＩＫ）、又はｎｅｏＡｇ負荷ＤＣ－ＣＩＫ（ｎｅｏＡｇ－ｐｕｌｓｅｄ ＤＣ－ＣＩＫ）であってよい。免疫増強剤は、免疫チェックポイントタンパク質、免疫抑制因子及び／又は免疫刺激因子を含む治療細胞であってよい。好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質を含む前記治療細胞は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体－ナチュラルキラー細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、又は養子Ｔ細胞であってよい。

【0060】

図１３Ａ及び表１３を参照されたい。図１３Ａは、本開示の一実施例のがんワクチン混合物の動物治療試験における治療戦略の概略図を示し、表１３は、実施例１８－２２及び比較例１２の治療戦略である。
表１３、実施例１８－２２及び比較例１２の治療戦略

【表13】

【0061】

本開示のがんワクチン混合物の治療効果を検証するために、結腸直腸がんマウスを異なる群にランダムに割り当てる。本開示の実施例１３のワクチン及び比較例７（１×１０^８ ｖｇ）のものをそれぞれ８日目及び１４日目に２回筋肉内注射する。この試験では放射線療法を増強剤とし、増強剤を投与する群では、１１日目、１８日目、及び２５日目に結腸直腸がんマウスを完全に麻酔した後、右肢を放射線照射野に置き、局所腫瘍に５ Ｇｙの分割放射線療法を３回行う。この試験ではｎｅｏＡｇ－ＤＣ－ＣＩＫを免疫増強剤とし、免疫増強剤を投与する群では、２１日目及び３１日目にｎｅｏＡｇ－ＤＣ－ＣＩＫを計２回筋肉内注射する。また、αＰＤ－１を免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＢ）として１６日目及び２３日目に計２回投与する。それと同時に腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、４０日目に犠牲にするまで、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２で腫瘍体積を計算する。

【0062】

図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、及び表１４を参照されたい。図１３Ｂ、図１３Ｃ、及び図１３Ｄは、本開示のがんワクチン混合物の結腸直腸がんに対する治療効果の分析結果図であり、ここで＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、データは、一元配置独立分散分析で分析する。表１４は、実施例１８－２２及び比較例１２の完全寛解率である。
表１４、実施例１８－２２及び比較例１２の完全寛解率

【表14】

【0063】

図１３Ｂの結果は、他の群と比較して、実施例１９－実施例２２の腫瘍体積はいずれも顕著に縮小することを示す。また、実施例２０では約３３％の結腸直腸がんマウスが完全寛解（２／６）であり、実施例２２では約８３％の結腸直腸がんマウスが完全寛解（５／６）である。図１３Ｃ及び図１３Ｄの結果は、実施例２２の結腸直腸がんマウスの単核細胞では、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答が顕著に増加することを示す。以上の結果は、本開示のがんワクチン混合物が、完全応答を達成でき、且つ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導できることを示す。

【0064】

以上のように、本開示のワクチンは、少なくとも１つの共阻害ペプチドとＴＬＲ９アンタゴニスト配列を共発現して、少なくとも１つの腫瘍抗原の発現を増加させ、且つ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を活性化する。したがって、本開示のワクチンは、十分な導入遺伝子発現を有し、ウイルスクリアランスを減少させ、腫瘍抗原発現量を増加させることができ、臨床的に安全であり、大きな将来性と優位性がある。また、本開示のワクチンは、がんに対する放射線療法の治療効果を向上させ、放射線療法と共阻害ペプチドを含む本開示のワクチンの治療効果を相乗的に増加させることができ、新規、安全且つ効果的な腫瘍抗原に基づく免疫療法を提供する。また、また、本開示のワクチン、増強剤、及び免疫増強剤を投与することを含む本開示のがんワクチン混合物での療法は、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍再発の阻害に有効である。

【0065】

本開示は、実施形態で以上のように詳細に開示されたが、他の実施形態も可能である。したがって、特許請求の範囲の精神及び範囲は、本明細書の実施形態の説明に限定されるべきではない。

【0066】

当然ながら、当業者にとって、本開示の範囲又は精神から逸脱することなく、本開示の構成に対して様々な変更や修飾を行うことができる。以上の内容に鑑み、本明細書は、添付の特許請求の範囲に入る本開示の修正及び変更を網羅することを意図する。

【符号の説明】

【0067】

１００ ワクチン
１１０ ベクター
１２０ 導入遺伝子
１２１ 分泌シグナルペプチド
１２２ 腫瘍抗原
１２３ 共阻害ペプチド
１２４ Ｔｏｌｌ様受容体９アンタゴニスト配列

【手続補正3】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０Ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図10A】

【国際調査報告】