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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】ポリペプチドの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/00 20060101AFI20240423BHJP
C12N 15/16 20060101ALN20240423BHJP
C07K 14/575 20060101ALN20240423BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
C12P21/00 C
C12N15/16
C07K14/575
C07K19/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571760
(86)(22)【出願日】2021-05-31
(85)【翻訳文提出日】2023-11-17
(86)【国際出願番号】 CN2021097429
(87)【国際公開番号】W WO2022241831
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】202110554938.8
(32)【優先日】2021-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516336828
【氏名又は名称】凱菜英医藥集團（天津）股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＹＭＣＨＥＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＴＩＡＮＪＩＮ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100158920
【弁理士】
【氏名又は名称】上野 英樹
(72)【発明者】
【氏名】洪 浩
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，ゲイジ
(72)【発明者】
【氏名】肖 毅
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 娜
(72)【発明者】
【氏名】焦 学成
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ ▲軍▼旗
(72)【発明者】
【氏名】王 磊
(72)【発明者】
【氏名】孟 翔宇
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 慕キョウ
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG15
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB01
4B064CC06
4B064CC10
4B064CC12
4B064CC15
4B064CC24
4B064CE02
4B064CE03
4B064CE06
4B064CE11
4B064CE12
4B064DA01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA30
4H045DA32
4H045EA01
4H045FA70
4H045FA74
4H045GA01
4H045GA10
4H045GA15
4H045GA23
4H045GA26
(57)【要約】
ポリペプチドの製造方法である。当該製造方法は、Ｓｕｍｏタグでポリペプチド遺伝子を融合発現するエンジニアリング菌株を構築し、且つエンジニアリング菌株がポリペプチドを可溶性発現するように誘導するステップと、エンジニアリング菌株から精製してポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を得るステップと、Ｕｌｐ１プロテアーゼを用いてポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を酵素切断し、Ｓｕｍｏタグを切除するステップと、アセトニトリルと加熱沈殿とを組み合わせる方法を用いるか、又はヘキサフルオロイソプロパノールによる沈殿の方法を用いて、Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物を精製し、ポリペプチドを得るステップと、を含む。可溶性組換えに基づいて薬用ポリペプチド又はその前駆体を発現する高効率な技術を確立し、ワンステップ沈殿精製に基づく簡単な精製プロセスを確立し、さらにＨＰＬＣ精製を合わせると、９７％以上のポリペプチド純度を達成することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓｕｍｏタグでポリペプチド遺伝子を融合発現するエンジニアリング菌株を構築し、且つ前記エンジニアリング菌株が前記ポリペプチドを可溶性発現するように誘導するステップと、前記エンジニアリング菌株から精製してポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を得るステップと、
Ｕｌｐ１プロテアーゼを用いて前記ポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を酵素切断し、前記Ｓｕｍｏタグを切除するステップと、
アセトニトリルと加熱沈殿とを組み合わせる方法を用いるか、又はヘキサフルオロイソプロパノールによる沈殿の方法を用いて、前記Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物を精製し、前記ポリペプチドを得るステップと、を含む、ことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項2】
前記ポリペプチドは、リラグルチド前駆体、ネシリタイド又はテリパラチドである、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記Ｕｌｐ１プロテアーゼは、Ｕｌｐ１プロテアーゼ発現菌株を構築して、発現を誘導することにより得られるものであり、ここで、前記Ｕｌｐ１プロテアーゼはシャペロンと共発現する、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項4】
前記シャペロンはＧｒｏＥＬ／Ｓシャペロンである、ことを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項5】
前記アセトニトリルと加熱沈殿とを組み合わせる方法は、前記Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物のｐＨを５．６に調整し、続いて、アセトニトリルを加え、均一に混合した後、６０～８０℃で０．５～３ｈ熱処理し、その後、上清と沈殿とを遠心分離する、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項6】
前記アセトニトリルは、質量百分率が２０～７０％のアセトニトリル水溶液である、ことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項7】
前記エンジニアリング菌株から精製してポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を得るステップは、前記エンジニアリング菌株に対して超音波破砕、遠心分離、膜でのろ過を行った後、粗酵素液を得、続いて、アフィニティークロマトグラフィー又はアニオンカラムを用いて精製し、前記粗タンパク質を得るステップを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項8】
前記ヘキサフルオロイソプロパノールによる沈殿の方法は、前記Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物のｐＨを５．６に調整し、続いて、ヘキサフルオロイソプロパノールを加え、均一に混合した後、室温で１ｈ沈殿させ、その後、上清と沈殿とを遠心分離する、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項9】
前記ヘキサフルオロイソプロパノールは、質量百分率が２０～７０％のヘキサフルオロイソプロパノール水溶液である、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項10】
前記ヘキサフルオロイソプロパノールは、質量百分率が５０％のヘキサフルオロイソプロパノール水溶液である、ことを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項11】
前記製造方法は、さらに、ＨＰＬＣを用いてターゲットポリペプチドを精製するステップを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医薬技術分野に関し、具体的に言えば、ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリペプチド系薬物は、アルブミノイドと小分子薬物の二重特性を有することから注目を浴びており、ポリペプチド薬物の販売は、２０１５年だけで、薬物市場の５％を占め、５００億ドルに達し、且つ、毎年９～１０％の速度で増加しているため、高効率で低コストのポリペプチド合成及び精製技術の確立が急務になっている。ポリペプチド合成には、主に、化学方法、化学／酵素方法及び生物学的方法が含まれる。ここで、化学方法は、複雑な保護と脱保護過程を必要とし、大量の有毒試薬を使用する必要があり、且つ、ラセミ体が生成する可能性があり、化学／生物学の方法は、一般に、化学方法でポリペプチドを合成し、さらに特定のペプチドリガーゼにより複数のペプチドセグメントを連結することであり、プロセスが比較的複雑であり、連結効率及び特異性がポリペプチド配列の影響を受けており、生物学的方法には、加水分解酵素を用いて植物タンパク質又は動物タンパク質を加水分解してから、特定の機能性ポリペプチドを抽出することが含まれるが、一般に、収量が低く、周期が長く、汚染が厳しいため、工業化生産の実現が難い。もう１つの比較的一般的な方法は、組換え発現であり、即ち、遺伝子工学の技術的手段を用いて、原核生物又は真核生物にターゲット遺伝子発現エレメントを導入し、微生物発酵によりターゲットポリペプチドの高効率合成を実現するが、ポリペプチド自体が短いため、特定の空間構造を形成し難いことにより、それが非常に発現宿主のプロテアーゼによって分解されやすく、また、複雑な精製プロセスにより生成物の収率も低下し、コストが増加する。
【0003】
現在、組換え法で生産したポリペプチドには、ポリペプチド系抗生物質、インターフェロン、リラグルチド前駆体（ＧＬＰ－１）及びインスリンなどが含まれ、そのうち、ＧＬＰ－１は、ノボ・ノルディスク・ファーマ株式会社（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｐｈａｒｍａ Ｌｔｄ．）から開発された、ＩＩ型糖尿病を治療するためのポリペプチド薬物であり、毎年の売上げが数十億ドルに達し、その最初の合成方式は、サッカロマイセス・セレヴィシエの分泌発現に基づくエンジニアリング菌株であるが、その細胞外プロテアーゼの作用により生成物が分解されやすいため、収量が低く、プロテアーゼをノックアウトした後に発現する最高レベルは５９ｍｇ／Ｌしかない。ピキア酵母にＧＬＰ－１を融合して発現させ、５日間発酵した後の発現量は２６ｍｇ／Ｌしかない。大腸菌は、よく使われる宿主として、すでにポリペプチドの生物合成に広く使用されているが、プロテアーゼ分解の恐れが同様に存在し、融合発現により、このような問題を解決することができる。現在、ＧＬＰ－１は、主に、封入体の融合発現を用い、例えばＫＳＩタグ、インテインペプチドｉｎｔｅｉｎ及びシグナルペプチド－エンテロキナーゼ酵素切断部位－ＧＬＰ－１などであり、封入体は、発現量が高く、プロテアーゼによる分解を回避できるが、複雑な変性及び再生の過程に尿素又は塩酸グアニジンなどの変性剤を大量使用する必要があり、精製プロセスの複雑さにより最終の収率が非常に低い。同時に、融合タグを完全に除去するために、通常、エンテロキナーゼを使用する必要があるが、当該酵素は、発現しにくいだけでなく、非特異的切断にもつながる。最近、ＭＦＨ融合タグで構築した封入体発現を用い、ギ酸による切断及び変性条件下で精製するプロセスを合わせ、再生過程を回避したが、尿素を使用する必要があり、さらに、Ｔｅｖプロテアーゼ切断によりＮ端に１つのＧｌｙを含有するＧＬＰ－１を取得し、且つＴｅｖ酵素は、生物活性が低く、非特異的切断が発生し、生産ステップが煩雑であり、コストが高い。例えばＧＳＴ、ＭＢＰ、ＴｒｘＡなどの他の融合タグは、可溶性発現タグとして使用されるものが多く、且つ、一部のペプチドは、これらのタグを介して可溶性発現を得たが、これらのタグの分子量は、一部のターゲットペプチドに対して大きいため、タグを除去した後のターゲットペプチドの収率が低いことになる。さらに、ＧＬＰ－１及びその誘導体は、ポリマー状態を呈するものが多く、精製は、変性条件で行う必要があり、現在の精製ステップは複雑で、収率が低い。
【0004】
まとめると、従来技術には、主に、以下の問題が存在する。１）化学合成において、プロセスが複雑であり、化学試薬が有毒であり、ラセミ体を生成する可能性があり、周期が長く、製品の品質制御が難しい。２）封入体発現において、変性と再生の精製プロセスが複雑で、尿素を大量使用し、切断過程に使用されるエンテロキナーゼ又はＴｅｖは高価であり、非特異性切断が発生しやすく、複雑な変性と再生プロセスにより精製過程が非常に複雑になり、収率が低下する。３）可溶性発現において、現在使用されている可溶性発現タグには、主に、ＴｒｘＡ、ＧＳＴ、ＭＢＰが含まれ、ターゲットペプチドセグメント及びタグに酵素切断部位を加える必要があり、よく使われる酵素は、一般的に発現しにくく、且つ非特異的切断につながり、Ｓｕｍｏタグをリラグルチド前駆体の融合発現に使用した研究がない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、ポリペプチドの精製ステップが複雑で、収率が低いという従来技術における技術的問題を解決するための、ポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記の目的を実現するために、本発明の一態様によれば、ポリペプチドの製造方法を提供する。当該製造方法は、Ｓｕｍｏタグでポリペプチド遺伝子を融合発現するエンジニアリング菌株を構築し、且つエンジニアリング菌株がポリペプチドを可溶性発現するように誘導するステップと、エンジニアリング菌株から精製してポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を得るステップと、Ｕｌｐ１プロテアーゼを用いてポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を酵素切断し、Ｓｕｍｏタグを切除するステップと、アセトニトリルと加熱沈殿とを組み合わせる方法を用いるか、又はヘキサフルオロイソプロパノールによる沈殿の方法を用いて、Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物を精製し、ポリペプチドを得るステップと、を含む。
【0007】
さらに、ポリペプチドは、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）前駆体、ネシリタイド（Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）又はテリパラチド（ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ）である。
【0008】
さらに、Ｕｌｐ１プロテアーゼは、Ｕｌｐ１プロテアーゼ発現菌株を構築して、発現を誘導することにより得られるものであり、ここで、Ｕｌｐ１プロテアーゼはシャペロンと共発現する。
【0009】
さらに、シャペロンはＧｒｏＥＬ／Ｓシャペロンである。
【0010】
さらに、アセトニトリルと加熱沈殿とを組み合わせる方法は、Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物のｐＨを５．６に調整し、続いて、アセトニトリルを加え、均一に混合した後、６０～８０℃で０．５～３ｈ熱処理し（好ましくは、７０℃で２ｈ熱処理し）、その後、上清と沈殿とを遠心分離するステップを含む。
【0011】
さらに、アセトニトリルは、質量百分率が２０～７０％のアセトニトリル水溶液である。
【0012】
さらに、エンジニアリング菌株から精製してポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を得るステップは、エンジニアリング菌株に対して超音波破砕、遠心分離、膜でのろ過を行った後、粗酵素液を得、続いて、アフィニティークロマトグラフィー又はアニオンカラムを用いて精製し、粗タンパク質を得るステップを含む。
【0013】
さらに、ヘキサフルオロイソプロパノールによる沈殿の方法は、Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物のｐＨを５．６に調整し、続いて、ヘキサフルオロイソプロパノールを加え、均一に混合した後、室温で１ｈ沈殿させ、その後、上清と沈殿とを遠心分離するステップを含む。
【0014】
さらに、ヘキサフルオロイソプロパノールは、質量百分率が２０～７０％のヘキサフルオロイソプロパノール水溶液であり、好ましくは、ヘキサフルオロイソプロパノールは、質量百分率が５０％のヘキサフルオロイソプロパノール水溶液である。
【0015】
さらに、製造方法は、ＨＰＬＣを用いてターゲットポリペプチドを精製するステップを含む。
【発明の効果】
【0016】
本発明は、可溶性組換えに基づいて薬用ポリペプチド又はその前駆体を発現する高効率な技術を確立し、ワンステップ沈殿精製に基づく簡単な精製プロセスを確立し、さらにＨＰＬＣ精製を合わせると、９７％以上のポリペプチド純度に達することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
本願の一部を構成する明細書と図面は、本発明の更なる理解を提供するために用いられ、本発明の模式的な実施例及びその説明は、本発明を解釈するために用いられ、本発明を不当に限定するものではない。
【図1】実施例１及び５における、Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａ融合タンパク質の発現、アフィニティークロマトグラフィーでの精製によるターゲットタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ２はＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ可溶性発現部分であり、Ｌａｎｅ３はフロースルー試料であり、Ｌａｎｅ４は６０ｍＭイミダゾール溶出製品であり、Ｌａｎｅ５は３００ｍＭのイミダゾール溶出製品である。
【図2】実施例２及び３における、Ｓｕｍｏ－Ｎｅｓｉ及びＳｕｍｏ－Ｔｅｒｉの融合発現によるターゲットタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ２、３はＳｕｍｏ－Ｔｅｒｉ可溶性発現部分であり、Ｌａｎｅ４はＳｕｍｏ－Ｔｅｒｉ沈殿部分であり、Ｌａｎｅ５はＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉ可溶性発現部分であり、Ｌａｎｅ６はＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉ沈殿部分である。
【図3】実施例４における、Ｕｌｐ１の発現最適化中のターゲットタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１はＩＰＴＧ誘導Ｕｌｐ１、３７℃、６ｈ、可溶性発現部分であり、Ｌａｎｅ２はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ３はＩＰＴＧ誘導Ｕｌｐ１、３７℃、６ｈ、沈殿部分であり、Ｌａｎｅ４はＩＰＴＧで誘導されたＵｌｐ１とＧｒｏＥＬ／Ｓとを共発現させる菌株、３７℃、６ｈ、可溶性発現部分であり、Ｌａｎｅ５はＩＰＴＧで誘導されたＵｌｐ１とＧｒｏＥＬ／Ｓとを共発現させる菌株、３７℃、６ｈ、沈殿部分である。
【図4】実施例５における、アニオンカラムクロマトグラフィーでＳｕｍｏ－Ｌｉｒａターゲットタンパク質を精製するＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ２はＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ破砕液の上清であり、Ｌａｎｅ３はフロースルー試料であり、Ｌａｎｅ４は５０ｍＭのＮａＣｌ溶出であり、Ｌａｎｅ５は１００ｍＭのＮａＣｌ溶出であり、Ｌａｎｅ６は５００ｍＭのＮａＣｌ溶出であり、Ｌａｎｅ７は７００ｍＭのＮａＣｌ溶出である。
【図5】実施例７における、Ｕｌｐ１アフィニティークロマトグラフィーでターゲットタンパク質を精製するＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ２はＵｌｐ１可溶性発現部分であり、Ｌａｎｅ３はフロースルー試料であり、Ｌａｎｅ４は５００ｍＭのイミダゾール溶出である。
【図6】実施例９における、アセトニトリルでリラグルチド前駆体ターゲットタンパク質を沈殿させたＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１は、２０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の上清部分であり、Ｌａｎｅ２は、２０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の沈殿部分であり、Ｌａｎｅ３は、３０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の上清部分であり、Ｌａｎｅ４は、３０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の沈殿部分であり、Ｌａｎｅ５はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ６は、４０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の上清部分であり、Ｌａｎｅ７は、４０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の沈殿部分であり、Ｌａｎｅ８はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ９は、５０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の上清部分であり、Ｌａｎｅ１０は、５０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の沈殿部分であり、Ｌａｎｅ１１は、６０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の上清部分であり、Ｌａｎｅ１２は、６０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の沈殿部分であり、Ｌａｎｅ１３は、７０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の上清部分であり、Ｌａｎｅ１４は、７０％アセトニトリル、ｐＨ５．６、７０℃で処理した後の沈殿部分である。
【図7】実施例９における、アセトニトリルでＮｅｓｉ及びＴｅｒｉターゲットタンパク質を沈殿させたＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１はタンパク質分子量基準であり、Ｌａｎｅ２はＵｌｐ１によるＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉの切断であり、Ｌａｎｅ３はＳｕｍｏ－ＮｅｓｉのＵｌｐ１酵素切断体系を沈殿法で処理した上清部分であり、Ｌａｎｅ４はＳｕｍｏ－ＮｅｓｉのＵｌｐ１酵素切断体系を沈殿法で処理した沈殿部分であり、Ｌａｎｅ５はＵｌｐ１によるＳｕｍｏ－Ｔｅｒｉの切断であり、Ｌａｎｅ６はＳｕｍｏ－ＴｅｒｉのＵｌｐ１酵素切断体系を沈殿法で処理した上清部分であり、Ｌａｎｅ７はＳｕｍｏ－ＴｅｒｉのＵｌｐ１酵素切断体系を沈殿法で処理した沈殿部分である。
【図8】実施例９における、ＨＦＩＰ沈殿法でリラグルチド前駆体を精製したＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、ここで、Ｌａｎｅ１は、１８％ＨＦＩＰで選択的に沈殿させた上清液であり、Ｌａｎｅ２は、１８％ＨＦＩＰで選択的に沈殿させた沈殿部分であり、Ｌａｎｅ３は、５０％ＨＦＩＰで選択的に沈殿させた上清液であり、Ｌａｎｅ４は、５０％ＨＦＩＰで選択的に沈殿させた沈殿部分であり、Ｌａｎｅ５は、７０％ＨＦＩＰで選択的に沈殿させた上清液であり、Ｌａｎｅ６は、７０％ＨＦＩＰで選択的に沈殿させた沈殿部分である。
【図9】実施例９及び１０における、リラグルチド前駆体製造のＨＰＬＣ精製クロマトグラムを示す。
【図10】実施例１０における、リラグルチド前駆体純度分析クロマトグラムを示す。
【図11】実施例１０における、Ｎｅｓｉ製造のＨＰＬＣ精製クロマトグラムを示す。
【図12】実施例１０における、Ｎｅｓｉ純度分析クロマトグラムを示す。
【図13】実施例１０における、Ｔｅｒｉ製造のＨＰＬＣ精製クロマトグラムを示す。
【図14】実施例１０における、Ｔｅｒｉ純度分析クロマトグラムを示す。
【図15】実施例１１における、質量分析のＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ分子量を示す。
【図16】実施例１１における、質量分析のＮｅｓｉｒｉｔｉｄｅ分子量を示す。
【図17】実施例１１における、質量分析のＴｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ分子量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
なお、本願における実施例及び実施例の特徴は、矛盾しない限り、互いに組み合わせることができる。以下、図面を参照しながら、実施例と合わせて本発明を詳細に説明する。
【0019】
名詞の解釈
ポリペプチド、英語名はｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅであり、１０～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。
ポリペプチド、英語名はｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅであり、１０～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。
【0020】
リラグルチドは、ヒトグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）類似体であり、英語名はＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅで、Ｌｉｒａと略称する。
【0021】
ネシリタイドは、英語名はＮｅｓｉｒｉｔｉｄｅで、Ｎｅｓｉと略称する。
【0022】
テリパラチドは、英語名はＴｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅで、Ｔｅｒｉと略称する。
【0023】
ポリペプチド前駆体は、本発明ではＳｕｍｏタグを有するポリペプチドを言う。
【0024】
本発明の典型的な実施形態によれば、ポリペプチドの製造方法を提供する。当該製造方法は、Ｓｕｍｏタグでポリペプチド遺伝子を融合発現するエンジニアリング菌株を構築し、且つエンジニアリング菌株がポリペプチドを可溶性発現するように誘導するステップと、エンジニアリング菌株から精製してポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を得るステップと、Ｕｌｐ１プロテアーゼを用いてポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を酵素切断し、Ｓｕｍｏタグを切除するステップと、アセトニトリルと加熱沈殿とを組み合わせる方法を用いるか、又はヘキサフルオロイソプロパノールによる沈殿の方法を用いて、Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物を精製し、ポリペプチドを得るステップと、を含む。
【0025】
本発明は、Ｓｕｍｏタグに基づいてタンパク質の可溶性発現を促進することができ、且つ、Ｓｕｍｏタグは、融合タグとして三段構造を特異的に認識するＵｌｐ１プロテアーゼ（ＳＵＭＯプロテアーゼ）によって効率よく切除されることができ、そして、非特異的切断の方法によるターゲットポリペプチドの取得につながらないため、封入体変性の問題を回避し、Ｓｕｍｏタグがポリペプチド遺伝子を融合発現するエンジニアリング菌株を構築した。
【0026】
典型的に、本発明におけるポリペプチドは、リラグルチド前駆体、ネシリタイド又はテリパラチドであってもよい。
【0027】
また、融合発現タグによる必要なプロテアーゼの除去が高価であり、且つ、非特異的切断を起こすという問題について、Ｕｌｐ１でＳｕｍｏタグを特異的に切断する策略を用い、Ｕｌｐ１が識別するのは、Ｓｕｍｏタグの空間構造であり、特異的部位のみで切断を行い、高効率のＵｌｐ１エンジニアリング菌株の取得及びＵｌｐ１の容易な精製のために、Ｕｌｐ１とシャペロンとが共発現させる菌株を構築し、好ましくは、シャペロンはＧｒｏＥＬ／Ｓシャペロンであり、Ｕｌｐ１の発現レベルを大幅に向上させた。
【0028】
本発明の典型的な実施形態によれば、アセトニトリルと加熱沈殿とを組み合わせる方法は、Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物のｐＨを５．６（等電点のデータを組み合わせて取得）に調整し、続いて、アセトニトリルを加え、均一に混合した後、６０～８０℃で０．５～３ｈ熱処理し（好ましくは、７０℃で２ｈ熱処理し）、その後、上清と沈殿とを遠心分離するステップを含む。好ましくは、アセトニトリルは、質量百分率が２０～７０％のアセトニトリル水溶液であり、２０～７０％の濃度のアセトニトリルは、いずれも良好な予備精製効果を有する。
【0029】
本発明の一典型的な実施形態において、エンジニアリング菌株から精製してポリペプチド前駆体を含有する粗タンパク質を得るステップは、エンジニアリング菌株に対して超音波破砕、遠心分離、膜でのろ過を行った後、粗酵素液を得、続いて、アフィニティークロマトグラフィー又はアニオンカラムを用いて精製し、粗タンパク質を得るステップを含む。
【0030】
本発明の典型的な実施形態によれば、ヘキサフルオロイソプロパノールによる沈殿の方法は、Ｕｌｐ１プロテアーゼの酵素切断による生成物のｐＨを５．６に調整し、続いて、ヘキサフルオロイソプロパノールを加え、均一に混合した後、室温で１ｈ沈殿させ、その後、上清と沈殿とを遠心分離するステップを含み、好ましくは、ヘキサフルオロイソプロパノールは、質量百分率が２０～７０％のヘキサフルオロイソプロパノール水溶液であり、好ましくは、５０％のヘキサフルオロイソプロパノールを使用して選択的に沈殿させた後、上清液におけるリラグルチド前駆体の濃度は約９０％である。
【0031】
好ましくは、製造方法は、さらに、ＨＰＬＣを用いてターゲットポリペプチドを精製するステップを含む。リラグルチド前駆体は、凝集しやすく、本発明では、有機溶媒処理及び逆相精製の方法を用い、凝集効果による精製の問題を回避することができる。
【0032】
以下、実施例と合わせて、本発明の有益な効果についてさらに説明する。
【0033】
実施例１
Ｓｕｍｏタグでリラグルチド前駆体（Ｌｉｒａと略称）を融合発現する遺伝子エンジニアリング菌株の構築
ポリペプチドの可溶性発現に基づく策略の構築とは、具体的には、Ｓｕｍｏタグを用いてターゲットポリペプチド配列と融合させ、ｐＥＴ－２８ａ（＋）又はｐＥＴ－２２ｂ（＋）発現ベクターに構築することである。ＧＥＮＥＷＩＺによって全遺伝子合成が行われ、コドン最適化を経たＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ配列は、配列５’端にＮｄｅＩ酵素切断部位が導入され、配列３’端にＸｈｏＩ酵素切断部位が導入され、ｐＵＣ５７クローンベクターに構築され、配列は、下記のとおりである。
配列番号１は、ＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＧＡＧである。ここで、下線を付した部分がＳｕｍｏタグであり、後ろに続くのがリラグルチド前駆体配列である。
Ｓｕｍｏタグでリラグルチド前駆体（Ｌｉｒａと略称）を融合発現する遺伝子エンジニアリング菌株の構築
ポリペプチドの可溶性発現に基づく策略の構築とは、具体的には、Ｓｕｍｏタグを用いてターゲットポリペプチド配列と融合させ、ｐＥＴ－２８ａ（＋）又はｐＥＴ－２２ｂ（＋）発現ベクターに構築することである。ＧＥＮＥＷＩＺによって全遺伝子合成が行われ、コドン最適化を経たＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ配列は、配列５’端にＮｄｅＩ酵素切断部位が導入され、配列３’端にＸｈｏＩ酵素切断部位が導入され、ｐＵＣ５７クローンベクターに構築され、配列は、下記のとおりである。
配列番号１は、ＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＣＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＧＡＧである。ここで、下線を付した部分がＳｕｍｏタグであり、後ろに続くのがリラグルチド前駆体配列である。
【0034】
合成された遺伝子断片をｐＵＣ５７－Ｓｕｍｏ－ＬｉｒａからＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで酵素切断し、ゲルで切断して回収した後、同様に酵素切断したｐＥＴ－２８ａ（＋）又はｐＥＴ－２２ｂ（＋）と１６℃で一晩連結し、その後、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換し、モノクローンのシークエンシング分析を行って、正確なクローン発現ベクターｐＥＴ－２８ａ－Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａ又はｐＥＴ－２２ｂ－Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａを取得し、形質転換毎に３つの正確なクローンを選択して活性化した後、種として２５０ｍＬのフラスコで予備スクリーニングし、それらから最適なものを選択して最終の発現菌株とした。組換えプラスミド含有のＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を４ｍＬ取って、ＬＢ培地を６００ｍＬ含有する２Ｌ三角フラスコに接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００が１．０になるまで振とう培養したとき、最終濃度が１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃で６ｈ誘導して、誘導が終了すると、４℃で遠心分離して菌体を採集した。超音波破砕により、上清を採集し、１２％分離ゲルＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から分かるように、ターゲットタンパク質が主に可溶性発現を呈した（図１）。
【0035】
実施例２
ＳｕｍｏタグでＮｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（ネシリタイド、Ｎｅｓｉと略称）を融合発現する遺伝子エンジニアリング菌株の構築
同様に、Ｓｕｍｏタグで融合発現する策略を用い、ベクターの構築策略は、実施例１と同じであり、合成遺伝子の配列は、下記のとおりである。
配列番号２は、ＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＣＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧである。ここで、下線を付した部分がＳｕｍｏタグであり、後ろに続くのがネシリタイド配列である。
ＳｕｍｏタグでＮｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（ネシリタイド、Ｎｅｓｉと略称）を融合発現する遺伝子エンジニアリング菌株の構築
同様に、Ｓｕｍｏタグで融合発現する策略を用い、ベクターの構築策略は、実施例１と同じであり、合成遺伝子の配列は、下記のとおりである。
配列番号２は、ＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＣＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧである。ここで、下線を付した部分がＳｕｍｏタグであり、後ろに続くのがネシリタイド配列である。
【0036】
遺伝子は、酵素切断と連結を経て、ｐＥＴ－２８ａ（＋）に構築され、シークエンシングにより正確な発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ－Ｓｕｍｏ－Ｎｅｓｉ及び当該発現を含有する組換えＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を取得し、Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａと同様な方法を用い、ＩＰＴＧ誘導後の融合タンパク質は可溶性発現を呈した（図２）。
【0037】
実施例３
ＳｕｍｏタグでＴｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ（テリパラチド、Ｔｅｒｉと略称）を融合発現する遺伝子エンジニアリング菌株の構築
同様に、Ｓｕｍｏタグで融合発現する策略を用い、ベクターの構築策略は、実施例１と同じであり、合成遺伝子の配列は、下記のとおりである。
配列番号３は、ＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＴＴＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧである。ここで、下線を付した部分がＳｕｍｏタグであり、後ろに続くのがテリパラチド配列である。
ＳｕｍｏタグでＴｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ（テリパラチド、Ｔｅｒｉと略称）を融合発現する遺伝子エンジニアリング菌株の構築
同様に、Ｓｕｍｏタグで融合発現する策略を用い、ベクターの構築策略は、実施例１と同じであり、合成遺伝子の配列は、下記のとおりである。
配列番号３は、ＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＴＴＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧである。ここで、下線を付した部分がＳｕｍｏタグであり、後ろに続くのがテリパラチド配列である。
【0038】
遺伝子は、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの酵素切断と連結を経て、ｐＥＴ－２８ａ（＋）に構築され、シークエンシングにより正確な発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ－Ｓｕｍｏ－Ｔｅｒｉ及び当該発現を含有する組換えＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を取得し、Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａと同様な発現条件を用い、ＩＰＴＧ誘導後の融合タンパク質は可溶性発現を呈した（図２）。
【0039】
実施例４
Ｕｌｐ１プロテアーゼ発現菌株の構築
Ｕｌｐ１プロテアーゼのＣ端部分（Ｄ３９０～Ｋ６２１）をＰＣＲ方法によりサッカロマイセス・セレヴィシエＳ２８８Ｃゲノムから直接増幅し、使用されるプライマーは、Ｕｌｐ１－Ｆ（配列番号４）：ｇｇｇｃａｔａｔｇＧＡＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧ及びＵｌｐ１－Ｒ（配列番号５）：Ｇｇｇｃｔｃｇａｇｇｔａｔｔｔｔａａａｇｃｇｔｃｇｇｔｔａａａａｔｃａａａｔｇｇｇｃであり、遺伝子配列は、下記のとおりである（又は配列に従って人工的に合成してもよい）。
Ｕｌｐ１プロテアーゼ発現菌株の構築
Ｕｌｐ１プロテアーゼのＣ端部分（Ｄ３９０～Ｋ６２１）をＰＣＲ方法によりサッカロマイセス・セレヴィシエＳ２８８Ｃゲノムから直接増幅し、使用されるプライマーは、Ｕｌｐ１－Ｆ（配列番号４）：ｇｇｇｃａｔａｔｇＧＡＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧ及びＵｌｐ１－Ｒ（配列番号５）：Ｇｇｇｃｔｃｇａｇｇｔａｔｔｔｔａａａｇｃｇｔｃｇｇｔｔａａａａｔｃａａａｔｇｇｇｃであり、遺伝子配列は、下記のとおりである（又は配列に従って人工的に合成してもよい）。
【化1】
【0040】
増幅された遺伝子断片は、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩによる酵素切断の後にｐＥＴ－２８ａ（＋）に連結され、発現ベクターｐＥＴ－２８ａ－Ｕｌｐ１を取得し、ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体に対してシークエンシングを行った。シークエンシングが正確なクローンを３つ選択して種とし、２５０ｍＬのフラスコで予備スクリーニングを行い、その中から最適なものを選択して最終の発現菌株とした。組換えプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を４ｍＬ取って、６００ｍＬのＬＢ培地を含有する２Ｌの三角フラスコに接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００が１．０になるまで振とう培養したとき、最終濃度が１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃で６ｈ誘導し、誘導が終了すると、４℃で遠心分離して菌体を採取した。超音波破砕により、上清を採集し、１２％分離ゲルＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から分かるように、ターゲットタンパク質部分が可溶性発現を呈した。Ｕｌｐ１の発現レベルをさらに向上させるために、発現ベクターｐＥＴ－２８ａ－Ｕｌｐ１とシャペロンＧｒｏＥＬ／Ｓの発現プラスミドｐＧＲＯ７とを共発現させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から分かるように、Ｕｌｐ１の発現レベルが一層向上した（図３）。
【0041】
実施例５
Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａの精製
発現したＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ細菌スラッジを２０％の細菌濃度で再懸濁し、超音波で破砕し（５ｓ超音波、６ｓの間隔、３５％パワー）、遠心分離し、０．４５μｍのフィルター膜を通過させると、粗酵素液を取得し、続いて、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製（ＡＫＴＡシステムに５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰを搭載）を行った。具体的な流れは、次のとおりである。フィルター膜で試料をろ過し、５ｍＬ／ｍｉｎの流速でローディングし、続いて、結合バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、未結合タンパク質が完全に溶出するまで洗浄し、次に、６０ｍＭのイミダゾールを用いて４カラム体積のタンパク質不純物を溶出し、続いて、５００ｍＭでターゲットタンパク質を溶出した（図１）。当該試料は、脱塩及びイミダゾール除去を必要とせずに、直接Ｕｌｐ１酵素切断することができる。１ｇの細菌スラッジから、精製されたＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ融合タンパク質を３５～４０ｍｇ得ることができ、１ｇの細菌スラッジから、精製されたＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉを１５．２ｍｇを得ることができ、１ｇの細菌スラッジから、精製されたＳｕｍｏ－Ｔｅｒｉを１８．３ｍｇを得ることができる（条件を最適化して一層向上させることができる）。
Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａの精製
発現したＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ細菌スラッジを２０％の細菌濃度で再懸濁し、超音波で破砕し（５ｓ超音波、６ｓの間隔、３５％パワー）、遠心分離し、０．４５μｍのフィルター膜を通過させると、粗酵素液を取得し、続いて、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製（ＡＫＴＡシステムに５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰを搭載）を行った。具体的な流れは、次のとおりである。フィルター膜で試料をろ過し、５ｍＬ／ｍｉｎの流速でローディングし、続いて、結合バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、未結合タンパク質が完全に溶出するまで洗浄し、次に、６０ｍＭのイミダゾールを用いて４カラム体積のタンパク質不純物を溶出し、続いて、５００ｍＭでターゲットタンパク質を溶出した（図１）。当該試料は、脱塩及びイミダゾール除去を必要とせずに、直接Ｕｌｐ１酵素切断することができる。１ｇの細菌スラッジから、精製されたＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ融合タンパク質を３５～４０ｍｇ得ることができ、１ｇの細菌スラッジから、精製されたＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉを１５．２ｍｇを得ることができ、１ｇの細菌スラッジから、精製されたＳｕｍｏ－Ｔｅｒｉを１８．３ｍｇを得ることができる（条件を最適化して一層向上させることができる）。
【0042】
コストを低減するために、発現Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａをアニオンカラムで精製することを試み、粗タンパク質の取得方式はアフィニティークロマトグラフィーと同じであり、アニオンカラムが搭載されているＡＫＴＡシステム（Ｑ ＦＦ、５ｍＬ）を用い、流速は５ｍＬ／ｍｉｎであり、結合バッファーは、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで、ローディングした後、結合バッファーを用いて未結合タンパク質が完全に溶出するまで洗浄し、続いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを用い、ｐＨ８．０の１ＭのＮａＣｌで勾配溶出し、５００ｍＭ勾配でターゲットタンパク質を取得し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から分かるように、ターゲットタンパク質は、８０％以上の純度を達成でき（図４）、試験によると、当該ステップで精製された試料も、同様に、脱塩を必要とせずに、Ｕｌｐ１で直接酵素切断することができた。
【0043】
実施例６
Ｓｕｍｏ－Ｔｅｒｉ及びＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉの精製
菌株を組換えて発現を誘導して取得した細菌スラッジから、Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａ試料と同様の方式により粗タンパク質を取得し、さらに、同様に、同じアフィニティークロマトグラフィー方式を用いて精製して、ターゲット融合タンパク質を取得した。
Ｓｕｍｏ－Ｔｅｒｉ及びＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉの精製
菌株を組換えて発現を誘導して取得した細菌スラッジから、Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａ試料と同様の方式により粗タンパク質を取得し、さらに、同様に、同じアフィニティークロマトグラフィー方式を用いて精製して、ターゲット融合タンパク質を取得した。
【0044】
実施例７
Ｕｌｐ１の精製
発現したＵｌｐ１細菌スラッジを１０％の細菌濃度で再懸濁し、超音波で破砕し（５ｓ超音波、６ｓの間隔、３５％パワー）、遠心分離し、０．４５μｍのフィルター膜を通過させた後、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製（ＡＫＴＡシステムに５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰを搭載）を行った。具体的な流れは、次のとおりである。フィルター膜で試料をろ過し、４ｍＬ／ｍｉｎの流速でローディングし、続いて、結合バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、未結合タンパク質が完全に溶出するまで洗浄し、次に、６０ｍＭのイミダゾールを用いて４カラム体積のタンパク質不純物を溶出し、続いて、５００ｍＭでターゲットタンパク質を溶出し、結果は、図５のＳＤＳ－ＰＡＧＥに示すように、ターゲットタンパク質純度は約７０％に達し、取得したターゲットタンパク質は、脱塩を必要とせずに、よく接融合タンパク質Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａ、Ｓｕｍｏ－Ｔｅｒｉ及びＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉの酵素切断（実施例５及び６の生成物）に使用した。
Ｕｌｐ１の精製
発現したＵｌｐ１細菌スラッジを１０％の細菌濃度で再懸濁し、超音波で破砕し（５ｓ超音波、６ｓの間隔、３５％パワー）、遠心分離し、０．４５μｍのフィルター膜を通過させた後、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製（ＡＫＴＡシステムに５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰを搭載）を行った。具体的な流れは、次のとおりである。フィルター膜で試料をろ過し、４ｍＬ／ｍｉｎの流速でローディングし、続いて、結合バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、未結合タンパク質が完全に溶出するまで洗浄し、次に、６０ｍＭのイミダゾールを用いて４カラム体積のタンパク質不純物を溶出し、続いて、５００ｍＭでターゲットタンパク質を溶出し、結果は、図５のＳＤＳ－ＰＡＧＥに示すように、ターゲットタンパク質純度は約７０％に達し、取得したターゲットタンパク質は、脱塩を必要とせずに、よく接融合タンパク質Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａ、Ｓｕｍｏ－Ｔｅｒｉ及びＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉの酵素切断（実施例５及び６の生成物）に使用した。
【0045】
実施例８
酵素切断
Ｕｌｐ１酵素切断反応は３０℃で行われ、具体的な過程は、次のとおりである。５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０で精製したＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ（実施例５の生成物）とＵｌｐ１との質量比は１０：１～１：１（ｍｇ／ｍｇ）であり、異なる時間でサンプリングし、Ｔｒｉｃｉｎｅを用いてその切断効率を検出し、ターゲットポリペプチドが生成したか否かを検出し、２４ｈで切断効率が８０％以上に達することができた。Ｓｕｍｏ－Ｔｅｒｉ及びＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉの酵素切断条件は、Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａと同じである。
酵素切断
Ｕｌｐ１酵素切断反応は３０℃で行われ、具体的な過程は、次のとおりである。５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０で精製したＳｕｍｏ－Ｌｉｒａ（実施例５の生成物）とＵｌｐ１との質量比は１０：１～１：１（ｍｇ／ｍｇ）であり、異なる時間でサンプリングし、Ｔｒｉｃｉｎｅを用いてその切断効率を検出し、ターゲットポリペプチドが生成したか否かを検出し、２４ｈで切断効率が８０％以上に達することができた。Ｓｕｍｏ－Ｔｅｒｉ及びＳｕｍｏ－Ｎｅｓｉの酵素切断条件は、Ｓｕｍｏ－Ｌｉｒａと同じである。
【0046】
実施例９
アセトニトリル／加熱沈殿法でのターゲットポリペプチドの精製
実施例８の酵素切断が完了した後、ｐＨを５．６に調整し、続いて、反応体系に異なる最終濃度のアセトニトリル（２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％）を加え、均一に混合した後、７０度で２ｈ熱処理し、その後、１２０００ｒｐｍで上清と沈殿とを遠心分離し、Ｔｒｉｃｉｎｅでポリペプチドの分布状況を検出し、結果から、組み合わせた条件で、２０～７０％濃度範囲のアセトニトリルは、いずれも良好な予備精製効果を有し、処理後のリラグルチド前駆体粗製品の純度は９０％以上に達することができ（図６）、Ｎｅｓｉの純度は８０％に達することができ、Ｔｅｒｉの純度は５０％に達することができる（図７）ことを見出した。さらに、回転蒸発又は凍結乾燥法を用いてポリペプチド粗製品におけるアセトニトリルを除去し、続いて、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌに再溶解させ、製造レベルのＨＰＬＣ精製を行った。
アセトニトリル／加熱沈殿法でのターゲットポリペプチドの精製
実施例８の酵素切断が完了した後、ｐＨを５．６に調整し、続いて、反応体系に異なる最終濃度のアセトニトリル（２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％）を加え、均一に混合した後、７０度で２ｈ熱処理し、その後、１２０００ｒｐｍで上清と沈殿とを遠心分離し、Ｔｒｉｃｉｎｅでポリペプチドの分布状況を検出し、結果から、組み合わせた条件で、２０～７０％濃度範囲のアセトニトリルは、いずれも良好な予備精製効果を有し、処理後のリラグルチド前駆体粗製品の純度は９０％以上に達することができ（図６）、Ｎｅｓｉの純度は８０％に達することができ、Ｔｅｒｉの純度は５０％に達することができる（図７）ことを見出した。さらに、回転蒸発又は凍結乾燥法を用いてポリペプチド粗製品におけるアセトニトリルを除去し、続いて、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌに再溶解させ、製造レベルのＨＰＬＣ精製を行った。
【0047】
ヘキサフルオロイソプロパノール（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ、ＨＦＩＰ）によるリラグルチド前駆体の沈殿
実施例８の酵素切断が完了した後、ｐＨを５．６に調整し、反応体系にそれぞれ１０％～７０％（ｖ／ｖ）のヘキサフルオロイソプロパノールを加え、室温で１ｈ沈殿させ、遠心分離し、上清及び沈殿を採集し、Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、異なる濃度のヘキサフルオロイソプロパノールのリラグルチド前駆体に対する選択的な沈殿効果を検出し、結果は、図９に示すように、５０％のヘキサフルオロイソプロパノールを使用して選択的に沈殿させた後、上清液におけるリラグルチド前駆体の濃度は約９０％であった（図８）。さらに、回転蒸発又は凍結乾燥を用いてポリペプチド粗製品におけるヘキサフルオロイソプロパノールを除去し、続いて、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌに再溶解させ、且つ製造レベルのＨＰＬＣ精製を行った。
実施例８の酵素切断が完了した後、ｐＨを５．６に調整し、反応体系にそれぞれ１０％～７０％（ｖ／ｖ）のヘキサフルオロイソプロパノールを加え、室温で１ｈ沈殿させ、遠心分離し、上清及び沈殿を採集し、Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、異なる濃度のヘキサフルオロイソプロパノールのリラグルチド前駆体に対する選択的な沈殿効果を検出し、結果は、図９に示すように、５０％のヘキサフルオロイソプロパノールを使用して選択的に沈殿させた後、上清液におけるリラグルチド前駆体の濃度は約９０％であった（図８）。さらに、回転蒸発又は凍結乾燥を用いてポリペプチド粗製品におけるヘキサフルオロイソプロパノールを除去し、続いて、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌに再溶解させ、且つ製造レベルのＨＰＬＣ精製を行った。
【0048】
実施例１０
ＨＰＬＣを製造してターゲットポリペプチドを精製
実施例９の生成物は、ＵｎｉＳｉｌ ＡＱ Ｃ１８ １０μｍ ２１．５＊２５０ｍｍを用い、使用されるバッファーは、バッファーＡが０．１％ＴＦＡで、バッファーＢがアセトニトリルである。Ｌｉｒａに用いられる勾配溶出方式は、０ｍｉｎに５％Ｂで、５ｍｉｎに５％Ｂで、２５ｍｉｎに５０％Ｂで、２７ｍｉｎに９５％Ｂで、３３ｍｉｎに９５％Ｂで、３８ｍｉｎに５％Ｂであり、紫外線検出器が２１０ｎｍであり、流速が２５ｍＬ／ｍｉｎであり、温度が２５℃であることである。結果は、図９に示すように、Ｌｉｒａは、２４ｍｉｎ付近で溶出され、その後、試料を採集して回転蒸発させ、大部分の溶媒を除去した後に凍結乾燥し、純度をＨＰＬＣ方法で検出し、結果から分かるように、Ｌｉｒａの純度は９８％以上に達した（図１０）。
ＨＰＬＣを製造してターゲットポリペプチドを精製
実施例９の生成物は、ＵｎｉＳｉｌ ＡＱ Ｃ１８ １０μｍ ２１．５＊２５０ｍｍを用い、使用されるバッファーは、バッファーＡが０．１％ＴＦＡで、バッファーＢがアセトニトリルである。Ｌｉｒａに用いられる勾配溶出方式は、０ｍｉｎに５％Ｂで、５ｍｉｎに５％Ｂで、２５ｍｉｎに５０％Ｂで、２７ｍｉｎに９５％Ｂで、３３ｍｉｎに９５％Ｂで、３８ｍｉｎに５％Ｂであり、紫外線検出器が２１０ｎｍであり、流速が２５ｍＬ／ｍｉｎであり、温度が２５℃であることである。結果は、図９に示すように、Ｌｉｒａは、２４ｍｉｎ付近で溶出され、その後、試料を採集して回転蒸発させ、大部分の溶媒を除去した後に凍結乾燥し、純度をＨＰＬＣ方法で検出し、結果から分かるように、Ｌｉｒａの純度は９８％以上に達した（図１０）。
【0049】
Ｎｅｓｉに用いられる勾配溶出方式は、５ｍｉｎに５％Ｂで、３５ｍｉｎに３０％Ｂで、４０ｍｉｎに９５％Ｂであり、紫外線検出器が２１０ｎｍであり、流速が２５ｍＬ／ｍｉｎであり、温度が２５℃であることである。結果は、図１１に示すように、Ｎｅｓｉは、３０ｍｉｎで溶出され、その後、試料を採集して回転蒸発させ、大部分の溶媒を除去した後、凍結乾燥し、純度をＨＰＬＣ方法で検出し、結果から分かるように、Ｎｅｓｉ純度は９８％以上に達した（図１２）。
【0050】
Ｔｅｒｉに用いられる勾配溶出方式は、５ｍｉｎに５％Ｂで、３５ｍｉｎに３０％Ｂで、４７．８ｍｉｎに４２．８％Ｂで、５０．５ｍｉｎに４２．８％Ｂで、５７．７ｍｉｎに５０％Ｂで、６７．７ｍｉｎに９５％Ｂで、４０ｍｉｎに９５％Ｂであり、紫外線検出器が２１０ｎｍであり、流速が２５ｍＬ／ｍｉｎであり、温度が２５℃であることである。結果は、図１３に示すように、Ｔｅｒｉは、約４３ｍｉｎに溶出され、その後、試料を採集して回転蒸発させ、大部分の溶媒を除去した後に凍結乾燥し、純度をＨＰＬＣ方法で検出し、分析カラムは、Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８ ４．６×１００ｍｍ ３．５μｍであり、２１０ｎｍで検出し、ｆｌｏｗ＝１．５ｍｌ／ｍｉｎであり、溶出勾配は、０ｍｉｎに１０％Ｂで、９ｍｉｎに９５％Ｂで、１２ｍｉｎに１００％で、１２．１ｍｉｎに１０％Ｂで、１５ｍｉｎに１０％Ｂであった。結果から分かるように、Ｔｅｒｉ純度は～７８％に達した（図１４）。
【0051】
この方法を用いてリラグルチド前駆体を製造し、１ｇのフラスコ発酵細菌スラッジから純度が９８％のリラグルチド前駆体を３～４ｍｇ取得でき、この方法により１ｇの細菌スラッジを製造し、純度が９８％のＮｅｓｉを１．２６ｍｇ取得でき、この方法により１ｇの細菌スラッジを製造し、純度が７８％のＴｅｒｉを１．５５ｍｇ取得でき、更なる発酵と最適化により融合タンパク質の発現レベルを向上させ、ターゲットポリペプチドの収率を一層向上させることが見込まれる。
【0052】
実施例１１
質量スペクトルによるポリペプチド分子量の検出
製造したポリペプチド（実施例１０の生成物）の分子量を、ＬＣ－ＭＳを用いて分析した。具体的には、試料を、先にＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｄｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８、４．６＊１００ｍｍ、３．５μｍによって分離し、移動相Ａが０．１％トリフルオロ酢酸であり、移動相Ｂが０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液であり、用いられる勾配溶出方式は、０ｍｉｎに１０％Ｂで、９ｍｉｎに９５％Ｂで、１２ｍｉｎに１００％Ｂで、１２．１ｍｉｎに１０％Ｂで、１５ｍｉｎに１０％Ｂであり、カラム温度は４０℃であり、紫外線検出器は２１０ｎｍであり、流速が１．５ｍＬ／ｍｉｎであることである）によって分離し、アジレント６２００シリーズ飛行時間液体クロマトグラフ質量分析計を使用して、ＨＰＬＣ分離後の成分の構造を同定し、エレクトロスプレーイオン源（Ｄｕａｌ ＡＪＳ ＥＳＩ）を用いてポジティブイオンモードを検出し、スプレー圧力は３５ｐｓｉｇで、イオン源温度は３００℃で、乾燥ガス（Ｎ２）の流速は１０Ｌ／ｍｉｎで、スキャン範囲は１００～２０００ｍ／ｚで、フラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧は７０Ｖであり、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアにより質量スペクトルデータを採集及び処理する。Ｌｉｒａは、理論的分子量が３３８３．７Ｄａで、質量分析の分子量が３３８２．７であり（図１５）、Ｎｅｓｉは、理論的分子量が３４６４．８で、質量分析分子量が３４６３．７であり（図１６）、Ｔｅｒｉは、理論的分子量が４１１７．７で、質量分析の分子量が４１１８．７である（図１７）。
質量スペクトルによるポリペプチド分子量の検出
製造したポリペプチド（実施例１０の生成物）の分子量を、ＬＣ－ＭＳを用いて分析した。具体的には、試料を、先にＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｄｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８、４．６＊１００ｍｍ、３．５μｍによって分離し、移動相Ａが０．１％トリフルオロ酢酸であり、移動相Ｂが０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液であり、用いられる勾配溶出方式は、０ｍｉｎに１０％Ｂで、９ｍｉｎに９５％Ｂで、１２ｍｉｎに１００％Ｂで、１２．１ｍｉｎに１０％Ｂで、１５ｍｉｎに１０％Ｂであり、カラム温度は４０℃であり、紫外線検出器は２１０ｎｍであり、流速が１．５ｍＬ／ｍｉｎであることである）によって分離し、アジレント６２００シリーズ飛行時間液体クロマトグラフ質量分析計を使用して、ＨＰＬＣ分離後の成分の構造を同定し、エレクトロスプレーイオン源（Ｄｕａｌ ＡＪＳ ＥＳＩ）を用いてポジティブイオンモードを検出し、スプレー圧力は３５ｐｓｉｇで、イオン源温度は３００℃で、乾燥ガス（Ｎ２）の流速は１０Ｌ／ｍｉｎで、スキャン範囲は１００～２０００ｍ／ｚで、フラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧は７０Ｖであり、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアにより質量スペクトルデータを採集及び処理する。Ｌｉｒａは、理論的分子量が３３８３．７Ｄａで、質量分析の分子量が３３８２．７であり（図１５）、Ｎｅｓｉは、理論的分子量が３４６４．８で、質量分析分子量が３４６３．７であり（図１６）、Ｔｅｒｉは、理論的分子量が４１１７．７で、質量分析の分子量が４１１８．７である（図１７）。
【0053】
以上は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとって、本発明の種々の変更及び変形が可能である。本発明の趣旨及び原理を逸脱しない範囲で行われた任意の修正、等価置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】