特表 2024-518626 組織内在性ｕＰＡＲ＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-01

(54)【発明の名称】組織内在性ｕＰＡＲ＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/074 20100101AFI20240423BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240423BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20240423BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20240423BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240423BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240423BHJP

   A61K 38/14 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240423BHJP

【ＦＩ】

C12N5/074

A61P17/02

A61P29/00

A61P37/02

A61P43/00 107

A61L27/54

A61L27/38

A61L27/36 100

A61K35/12

A61K35/28

A61K38/14

A61K38/17

A61K47/64

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571790

(86)(22)【出願日】2022-06-03

(85)【翻訳文提出日】2023-11-17

(86)【国際出願番号】 KR2022007910

(87)【国際公開番号】W WO2022255836

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】10-2021-0072137

(32)【優先日】2021-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0067722

(32)【優先日】2022-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523435831

【氏名又は名称】イノステム バイオ

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＯＳＴＥＭ ＢＩＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181847

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 かおり

(72)【発明者】

【氏名】クワク ミョン ジン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C081

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AC17

4B065BB19

4B065BB40

4B065BC46

4B065BC50

4B065CA44

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF32

4C076FF34

4C081AB00

4C081BA12

4C081CD34

4C084AA02

4C084BA34

4C084BA44

4C084CA17

4C084CA56

4C084MA01

4C084NA14

4C084ZA89

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB22

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB44

4C087BB64

4C087MA01

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB22

(57)【要約】

本発明は、組織内在性ｕＰＡＲ＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法及びその用途に関するものであって、固形性組織内に存在する組織内在性幹細胞のｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度に基づいて分離する方法を提供する。幹細胞のｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度は、幹細胞の成長、移動能力、生理活性度、そして、分化能と密接な関係が提示されて高力価の幹細胞を分離する方法として活用することができる。本発明の固形性組織から分離したｕＰＡＲ＋幹細胞は、細胞治療剤、組織工学治療剤、エクソソームを含む分泌物を利用したバイオ新薬の生産に適用可能であって、産業的可能性が大きい。また、本発明において、組織内在性幹細胞の細胞分裂、移動、成長、そして、分化に関係する細胞生物学的、分子生物学的基礎研究と新薬開発研究とに適用可能である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）創傷修復基質模倣ハイドロゲルを製造する段階と、
（２）分離された組織切片を前記創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に陥入させる段階と、
（３）前記組織切片が陥入された創傷修復基質模倣ハイドロゲルをプラスミノーゲン活性阻害剤（ＰＡＩ）が添加された培養液で３次元培養する段階と、
を含む、組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法。

【請求項2】

前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルは、０．２５～２．５％濃度のフィブリノーゲン溶液及び０．５～５Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビン溶液が混合されたフィブリンハイドロゲル、前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のコラーゲン溶液が混合されたフィブリン／コラーゲン混合ハイドロゲルまたは前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のゼラチン溶液が混合されたフィブリン／ゼラチン混合ハイドロゲルであることを特徴とする請求項１に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法。

【請求項3】

前記組織は、脂肪組織、骨髄組織、心筋組織、末梢神経組織、骨格筋組織または滑液膜組織であることを特徴とする請求項１に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法。

【請求項4】

前記ＰＡＩは、トラネキサム酸またはアミノメチル安息香酸であることを特徴とする請求項１に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法。

【請求項5】

前記方法は、組織内細胞のインテグリン－ＦＡＫ細胞信号伝達を活性化させて、組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の細胞分裂及び細胞成長を誘導することを特徴とする請求項１に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法。

【請求項6】

前記方法は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に細胞移動及び細胞成長を誘導することを特徴とする請求項１に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法。

【請求項7】

（１）創傷修復基質模倣ハイドロゲルを製造する段階と、
（２）分離された組織切片を前記創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に陥入させる段階と、
（３）前記組織切片が陥入された創傷修復基質模倣ハイドロゲルをＰＡＩが添加された培養液で３次元培養する段階と、
（４）前記３次元培養液を除去し、洗浄してＰＡＩを除去する段階と、
（５）前記ＰＡＩが除去された培養物をＰＡＩが含有されていない培養液で再培養して、前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルを分解させる段階と、
（６）前記再培養液内に遊離された幹細胞を分離する段階と、
を含む、組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法。

【請求項8】

前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルは、０．２５～２．５％濃度のフィブリノーゲン溶液及び０．５～５Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビン溶液が混合されたフィブリンハイドロゲル、前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のコラーゲン溶液が混合されたフィブリン／コラーゲン混合ハイドロゲルまたは前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のゼラチン溶液が混合されたフィブリン／ゼラチン混合ハイドロゲルであることを特徴とする請求項７に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法。

【請求項9】

前記組織は、脂肪組織、骨髄組織、心筋組織、末梢神経組織、骨格筋組織または滑液膜組織であることを特徴とする請求項７に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法。

【請求項10】

前記ＰＡＩは、トラネキサム酸またはアミノメチル安息香酸であることを特徴とする請求項７に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法。

【請求項11】

前記（５）段階は、前記組織内のｕＰＡＲ発現の増加を誘導し、プラスミン活性度の増加を通じて、前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルを分解させることを特徴とする請求項７に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法。

【請求項12】

前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞は、自己複製能、体外成長能、分化能または組織再生誘導能が増進したことを特徴とする請求項７に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法。

【請求項13】

前記（５）段階の再培養液から回収された組織切片は、前記（２）段階ないし（５）段階を１～１０回繰り返す過程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法。

【請求項14】

請求項７から請求項１３のうち何れか一項に記載の方法によって分離培養された組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液。

【請求項15】

請求項１４に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項16】

請求項１４に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む、自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項17】

請求項１４に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む、創傷治療用薬学組成物。

【請求項18】

請求項１４に記載の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む、血管再生促進用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、固形性組織内の組織再生及び組織恒常性に核心的な役割を担当するｕＰＡＲ＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋組織内在性幹細胞を分離培養する方法及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

固形性組織内に存在する幹細胞を分離培養するための通常の方法は、組織分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）処理を通じて組織を分解し、組織を構成する細胞を１つ１つ取り外す組織解離（ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）後、単一細胞浮遊液（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を製造する工程が要求される。組織解離過程は、使用した組織分解酵素の種類、力価、反応時間、反応温度、使用した組織の種類によって得られる単一細胞収率は大きな偏差を示し、また、組織解離過程中、細胞損傷は避けることができない問題として提起された。その結果、組織解離過程は、組織類型によって細胞収率と損傷程度は大きな差を示し、標準化しにくい短所が提示された。特に、固形性組織内の幹細胞の頻度は、０．１％未満であって、組織分解酵素を通じて有効な数量の幹細胞を分離することができる収率が極めて低調な限界点は広く知られている。

【0003】

組織から解離された単一細胞浮遊液から組織内在性幹細胞を分離精製する後続工程が要求される。幹細胞を分離精製する過程は、ｃ－ＫｉｔないしＳｃａ－１のような標識子を用いて当該標識子が陽性あるいは陰性である細胞を分離する。しかし、これらの標識子は、組織内在性幹細胞だけではなく、造血系細胞でも発現される標識子であって、所望しない細胞が混在されて分離され、また、これらの標識子が陰性である幹細胞が厳然と存在するので、特定の標識子を利用した組織内在性幹細胞を分離精製する方法は限界がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、脂肪組織、骨髄組織、心筋組織、末梢神経組織、骨格筋組織または滑液膜組織などの固形性組織内に位置する組織内在性ｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞を活性化し、移動成長を誘導し、分離する方法を提供することである。

【0005】

また、本発明の他の目的は、前記方法によって分離培養された組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を提供することである。

【0006】

また、本発明のさらに他の目的は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む炎症疾患または自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することである。

【0007】

また、本発明のさらに他の目的は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む創傷治療または血管再生促進用薬学組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記目的を果たすために、本発明は、（１）創傷修復基質模倣ハイドロゲルを製造する段階；（２）分離された組織切片を前記創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に陥入させる段階；及び（３）前記組織切片が陥入された創傷修復基質模倣ハイドロゲルをプラスミノーゲン活性阻害剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＡＩ）が添加された培養液で３次元培養する段階；を含む組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法を提供する。

【0009】

また、本発明は、（１）創傷修復基質模倣ハイドロゲルを製造する段階；（２）分離された組織切片を前記創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に陥入させる段階；（３）前記組織切片が陥入された創傷修復基質模倣ハイドロゲルをＰＡＩが添加された培養液で３次元培養する段階；（４）前記３次元培養液を除去し、洗浄してＰＡＩを除去する段階；（５）前記ＰＡＩが除去された培養物をＰＡＩが含有されていない培養液で再培養して、前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルを分解させる段階；及び（６）前記再培養液内に遊離された幹細胞を分離する段階；を含む組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法を提供する。

【0010】

また、本発明は、前記方法によって分離培養された組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を提供する。

【0011】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む炎症疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0012】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0013】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む創傷治療用薬学組成物を提供する。

【0014】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む血管再生促進用薬学組成物を提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明は、組織内在性ｕＰＡＲ＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法及びその用途に関するものであって、固形性組織内に存在する組織内在性幹細胞のｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度に基づいて分離する方法を提供する。幹細胞のｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度は、幹細胞の成長、移動能力、生理活性度、そして、分化能と密接な関係が提示されて高力価の幹細胞を分離する方法として活用することができる。本発明の固形性組織から分離したｕＰＡＲ＋幹細胞は、細胞治療剤、組織工学治療剤、エクソソームを含む分泌物を利用したバイオ新薬の生産に適用可能であって、産業的可能性が大きい。また、本発明において、組織内在性幹細胞の細胞分裂、移動、成長、そして、分化に関係する細胞生物学的、分子生物学的基礎研究と新薬開発研究とに適用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】体外臓器培養後、臓器内の構成細胞のｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ、ｎｅｓｔｉｎ、Ｋｉ－６７発現率を示す。２Ｄ、単層臓器培養；３Ｄ、３Ｄ臓器培養；ＡＴ、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）；ＢＭ、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）；Ｍｙｏｃａｒ、心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）；ＰＮ、末梢神経（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ）；ＳＭ、骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）；Ｓｙｎ、滑液膜（Ｓｙｎｏｖｉｕｍ）。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、２Ｄ。

【図2】３Ｄ心筋臓器培養による心筋内ｐＦＡＫ＋、ｕＰＡＲ＋及びＮｅｓｔｉｎ＋発現細胞が増加する特性を示す。

【図3】３Ｄ臓器培養による心筋内細胞分裂中であるｋｉ－６７陽性細胞が増加する特性を示す。

【図4】３Ｄ心筋臓器培養期間によって心筋内ｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ、ｎｅｓｔｉｎ、ｋｉ－６７陽性細胞数が比例して増加することを示す。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、０ｄ（培養前）。

【図5】３Ｄ心筋臓器培養後、ハイドロゲルに移動成長した細胞のｕＰＡＲ、ｎｅｓｔｉｎ及びＢｒｄＵ発現を示す。

【図6】３Ｄ臓器培養２週後、ハイドロゲルに移動成長した細胞のｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現率を示す。ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。

【図7】臓器培養前及び培養３日後、臓器内ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ（Ａ）及びｐｌａｓｍｉｎ活性度（Ｂ）を示す。ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ（培養前）；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ（培養前）。

【図8】臓器培養後、培養液内のＰＡＩ除去及び培養物洗浄を通じてハイドロゲルが分解され、ハイドロゲル内に移動成長した細胞が培養液内に遊離されることを示す。

【図9】培養液内のＰＡＩ除去及び培養物洗浄を通じてハイドロゲル内に移動成長した細胞がハイドロゲルから離れて出て遊離された細胞が収縮され、及び凝集されることを示す（位相差顕微鏡写真）。

【図10】ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、ハイドロゲル内のｕＰＡＲ＋細胞が遊離される分離を示す（パラフィン組織切片ＨＥ染色及びｕＰＡＲ免疫組織化学染色）。

【図11】ＰＡＩ除去及び培養物洗浄（ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗｎ）と外因性Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ添加後、ハイドロゲルから分離後、回収した細胞収率と分離回収した細胞のｕＰＡＲ発現率とを示す。ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ。

【図12】ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、回収した組織切片は、反復的臓器培養を通じてハイドロゲルから繰り返して分離後、回収した細胞収率を示す。ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。

【図13】ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、回収した細胞を培養容器に播種後、単層培養環境で細胞の付着と成長とを示す。Ａ、ＰＡＩ除去及び水洗後、ハイドロゲルから遊離された細胞の凝集体。Ｂ、ハイドロゲルから回収した細胞凝集体。Ｃ－Ｅ、回収した細胞を培養容器に播種後、３０分（Ｃ）、１時間（Ｄ）及び２時間（Ｄ）目の細胞の付着及び成長（位相差顕微鏡写真）。

【図14】脂肪組織、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜臓器培養後、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、ハイドロゲルに遊離した細胞（上）と回収した細胞とを播種後、培養容器に付着し、成長する形状を見た後、付着し、成長（下）する結果を示す（位相差顕微鏡写真）。

【図15】神経及び心筋臓器培養後、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、ハイドロゲルから遊離された細胞の単層培養環境で付着と成長とを示す。

【図16】ハイドロゲルから回収した細胞の免疫表現の特性を示す。Ａ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、ハイドロゲルからｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、遊離された細胞の免疫表現の特性。Ｂ、外因性Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、ハイドロゲルから遊離された細胞の免疫表現の特性。ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（Ｂ）。

【図17】ハイドロゲルから回収した細胞の造血細胞及び血管内皮細胞標識子の発現率を示す。Ａ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞の発現率。Ｂ、外因性Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞の発現率。ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（Ｂ）。

【図18】ハイドロゲルから分離回収した細胞の自己複製能を示す。Ａ；Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ（ＣＦＵ）の代表的写真。Ｂ；組織起源によるハイドロゲルから分離回収した細胞のＣＦＵ頻度。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ。

【図19】ハイドロゲルから分離回収した細胞の体外成長能を示す。Ａ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ（ＰＤＴ、細胞倍加時間）。Ｂ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ（ＰＤＬ、細胞倍加レベル）。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ。

【図20】ハイドロゲルから分離回収した細胞のＫｉ－６７発現率を示す。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ。

【図21】ハイドロゲルから分離回収した細胞の骨芽細胞（ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ）及び脂肪細胞（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）への分化能を示す。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞。

【図22】ハイドロゲルから分離回収した細胞の骨芽細胞（ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ）及び脂肪細胞（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）への分化能の比較を示す。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ。

【図23】ハイドロゲルから分離回収した細胞の組織再生ｍＲＮＡ発現特性を示す。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＣＢ－ＭＳＣ、ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ。

【図24】ハイドロゲルから分離回収した細胞のｐｌａｓｍｉｎ活性度及びｎｅｓｔｉｎ発現率を示す。ｕＰＡＲ－、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ陰性細胞；ｕＰＡＲ＋、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ＋細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。

【図25】ハイドロゲルから分離回収した細胞の自己複製（ＣＦＵ）及び体外成長（Ｋｉ－６７）能を示す。ｕＰＡＲ－、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ陰性細胞；ｕＰＡＲ＋、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ＋細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。

【図26】ハイドロゲルから分離回収した細胞の抗炎症能を示す。条件培地のＬＰＳで減作したＲＡＷ ２６４．７細胞のＴＮＦα及びＩＬ－１βの分泌抑制効力。ｕＰＡＲ－、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ陰性細胞；ｕＰＡＲ＋、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ＋細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。

【図27】ハイドロゲルから分離回収した細胞の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び線維芽細胞（ＤＦ）の成長誘導の効力を示す。ｕＰＡＲ－、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ陰性細胞；ｕＰＡＲ＋、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ＋細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。

【図28】ハイドロゲルから分離回収した細胞の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び線維芽細胞（ＤＦ）の細胞保護の効力を示す。ｕＰＡＲ－、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ陰性細胞；ｕＰＡＲ＋、外因性ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離精製したｕＰＡＲ＋細胞；ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＰＡＩ除去及び培養物洗浄後、分離回収した細胞；ＡＴ、脂肪組織；ＢＭ、骨髄；Ｍｙｏｃａｒ、心筋；ＰＮ、末梢神経；ＳＭ、骨格筋；Ｓｙｎ、滑液膜。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。^＊、ｐ＜０．０５に比べて、ｕＰＡＲ－；^＊＊、ｐ＜０．０１に比べて、ｕＰＡＲ－。

【図29】既存の技術に比べて、本発明の模式図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、（１）創傷修復基質模倣ハイドロゲルを製造する段階；（２）分離された組織切片を前記創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に陥入させる段階；及び（３）前記組織切片が陥入された創傷修復基質模倣ハイドロゲルをプラスミノーゲン活性阻害剤（ＰＡＩ）が添加された培養液で３次元培養する段階；を含む組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の活性化方法を提供する。

【0018】

望ましくは、前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルは、０．２５～２．５％濃度のフィブリノーゲン溶液及び０．５～５Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビン溶液が混合されたフィブリンハイドロゲル、前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のコラーゲン溶液が混合されたフィブリン／コラーゲン混合ハイドロゲルまたは前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のゼラチン溶液が混合されたフィブリン／ゼラチン混合ハイドロゲルであるが、これらに限定されるものではない。

【0019】

望ましくは、前記組織は、脂肪組織、骨髄組織、心筋組織、末梢神経組織、骨格筋組織または滑液膜組織であるが、これらに限定されるものではない。

【0020】

望ましくは、前記ＰＡＩは、トラネキサム酸（ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）またはアミノメチル安息香酸（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）であるが、これらに限定されるものではない。

【0021】

望ましくは、前記方法は、組織内細胞のインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）－ＦＡＫ細胞信号伝達を活性化させて、組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の細胞分裂及び細胞成長を誘導することができるが、これに限定されるものではない。

【0022】

望ましくは、前記方法は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に細胞移動及び細胞成長を誘導することができるが、これに限定されるものではない。

【0023】

本発明のｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋組織内在性幹細胞を創傷修復基質への移動を誘導するために、組織合わせ創傷修復基質が要求される。組織損傷後、血管から遊離された血漿が凝固されて形成される創傷修復基質成分を模倣して生体高分子を用いて製造することができる。本発明の創傷修復基質は、フィブリン、コラーゲン、ゼラチンを単独あるいは混合して製造することができる。工学的創傷修復基質は、臓器によってｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度は差が出て、ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性に抵抗性を有した創傷修復基質を製造して使用することができる。創傷修復基質は、生体高分子の含量あるいは組成を調節して製造することができる。すなわち、フィブリン－コラーゲン、フィブリン－ゼラチン、コラーゲン－ゼラチンなど２種以上の成分で混合した創傷修復基質を使用することができる。本発明の創傷修復基質は、構成高分子であるフィブリノーゲン、コラーゲン、ゼラチン構成高分子は１．０から２０．０ｍｇ／ｍｌの含量で構成することができる。創傷修復基質の構造的特性を強化するために、架橋度を調節することができ、Ｃａ＋＋あるいはＦａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａのような架橋剤を用いて創傷修復基質の架橋程度を調節して構造的物性を調節することができる。

【0024】

体外培養を通じて組織内幹細胞の細胞分裂と成長とを誘導するために、細胞信号伝達経路の活性化が要求される。細胞のｉｎｔｅｇｒｉｎ ｌｉｇａｎｄと結合して細胞の成長と移動とを誘導することができる信号を創傷修復基質を通じて伝達し、活性化することができる。細胞のｉｎｔｅｇｒｉｎｓと直接結合して細胞内に信号を伝達することができる創傷修復基質で組織を支持するにつれて、組織内幹細胞の細胞分裂、成長と移動とを誘導することができる。ｉｎｔｅｇｒｉｎ－β１－ＦＡＫ信号伝達経路は、創傷修復基質の支持によってインテグリンを通じて組織内在性幹細胞に信号を伝達し、活性化を誘導し、組織内在性幹細胞は、伝達された信号によってｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現が増加し、組織内再生幹細胞の分裂、成長と移動とを誘導することができる。本発明は、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫ細胞信号伝達経路を活性化することができる創傷修復基質はフィブリン、コラーゲン、ゼラチンのようなＲＧＤ ｍｏｔｉｆを有した高分子で構成された創傷修復基質模倣ハイドロゲルを製造して、前記目的を果たしうる。

【0025】

本発明は、組織内在性幹細胞の細胞分裂、成長と移動はｉｎｔｅｇｒｉｎ－β１－ＦＡＫ－ｕＰＡＲ信号伝達経路を活性化して誘導する方法を提供する。組織内幹細胞への信号伝達の効率は、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｌｉｇａｎｄと結合することができる受容体の密度と比例する。ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｌｉｇａｎｄと結合することができる受容体の密度は、組織と接触面を高めることで果たしうる。２次元よりも３次元環境を提供して、結果として細胞と接合することができる面積を増加することにより、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｌｉｇａｎｄと収容体結合を増加させることができる。その結果、組織内幹細胞に信号伝達の効率を高めうる。本発明は、人工的創傷修復基質を３次元的支持を組織に提供してｉｎｔｅｇｒｉｎ－β１－ＦＡＫ－ｕＰＡＲ信号伝達経路を活性化する方法を提供する。このために、ｓｏｌ－ｇｅｌ相転移できるハイドロゲルを創傷修復基質で組織切片に３次元的結合を提供して信号伝達経路を強化する方法を提供する。

【0026】

ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度は、組織、損傷程度と原因とによって変わりうる。脂肪、胎盤、臍帯と比較して神経系組織は、ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度が高く、その結果、創傷修復基質の分解程度は、神経系組織が高い。創傷修復基質の分解は、創傷修復基質を構成する構成成分の含量、高分子分子量、架橋程度を調節して制御することができる。本発明は、創傷修復基質構成高分子の含量、分子量、そして、架橋程度を高めて増加させるｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度に対する抵抗度を調節する方法を提供する。また、ＰＡＩ添加を通じてｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度を調節して持続的に創傷修復基質で組織内幹細胞の活性、成長と移動とを誘導する方法を提供する。本発明に適用することができるＰＡＩは、アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｄ ａｃｉｄ）、トラネキサム酸、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）及びアミノメチル安息香酸からなる群から選択することができる。本発明に適用されるＰＡＩは、ハイドロゲル容量ｍｌ当たり１０μｇ～１０ｍｇの濃度を添加して使用することができる。その結果、本発明は、ＰＡＩ添加と創傷修復基質の構造的安定性を保持して組織内在性幹細胞の成長と移動は臓器培養期間中、誘導支持する方法を提供する。

【0027】

過度な幹細胞のｕＰＡＲ－ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎの活性度は、体外培養過程中、創傷修復基質模倣ハイドロゲルの急激な分解結果、組織切片及び細胞周囲の創傷修復基質が分解消失され、その結果、幹細胞が付着し、移動することができる創傷修復基質が消失される結果がもたらされて、組織からハイドロゲル内に細胞移動が消失あるいは減少あるいは消失される結果をもたらしうる。本発明は、過度な創傷修復基質模倣ハイドロゲルの分解及び消失を制御するために、ＰＡＩを添加して幹細胞及び組織切片の過度なｐｌａｓｍｉｎ活性度を制御して創傷修復基質模倣ハイドロゲルが臓器培養期間中、組織切片を物理的に支持基質として役割を保持し、同時に活性化された組織内在性幹細胞が移動成長することができる基質としての構造機能的役割を保持持続する方法を提供する。

【0028】

また、本発明は、（１）創傷修復基質模倣ハイドロゲルを製造する段階；（２）分離された組織切片を前記創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に陥入させる段階；（３）前記組織切片が陥入された創傷修復基質模倣ハイドロゲルをＰＡＩが添加された培養液で３次元培養する段階；（４）前記３次元培養液を除去し、洗浄してＰＡＩを除去する段階；（５）前記ＰＡＩが除去された培養物をＰＡＩが含有されていない培養液で再培養して、前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルを分解させる段階；及び（６）前記再培養液内に遊離された幹細胞を分離する段階；を含む組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の分離培養方法を提供する。

【0029】

望ましくは、前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルは、０．２５～２．５％濃度のフィブリノーゲン溶液及び０．５～５Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビン溶液が混合されたフィブリンハイドロゲル、前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のコラーゲン溶液が混合されたフィブリン／コラーゲン混合ハイドロゲルまたは前記フィブリンハイドロゲルに０．１～０．５％濃度のゼラチン溶液が混合されたフィブリン／ゼラチン混合ハイドロゲルであるが、これらに限定されるものではない。

【0030】

望ましくは、前記組織は、脂肪組織、骨髄組織、心筋組織、末梢神経組織、骨格筋組織または滑液膜組織であるが、これらに限定されるものではない。

【0031】

望ましくは、前記ＰＡＩは、トラネキサム酸またはアミノメチル安息香酸であるが、これらに限定されるものではない。

【0032】

望ましくは、前記（５）段階は、前記組織内のｕＰＡＲ発現の増加を誘導し、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）活性度の増加を通じて、前記創傷修復基質模倣ハイドロゲルを分解させることができるが、これらに限定されるものではない。

【0033】

望ましくは、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞は、自己複製能、体外成長能、分化能または組織再生誘導能が増進したものであるが、これらに限定されるものではない。

【0034】

望ましくは、前記（５）段階の再培養液から回収された組織切片は、前記（２）段階ないし（５）段階を１～１０回繰り返す過程をさらに含みうるが、これらに限定されるものではない。

【0035】

本発明は、創傷修復基質内に移動と成長したｕＰＡＲ＋幹細胞を選択的に分離する方法を提供する。ＰＡＩ添加を通じて過度なｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎ活性によって創傷修復基質が分解されることを制御することができるが、目標とした幹細胞の移動と成長とが達成された後、創傷修復基質から細胞を回収する方法を提供する。ＰＡＩを洗浄後、除去するにつれて、幹細胞内在ｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎ活性特性を用いて創傷修復基質が分解されて基質内移動成長した幹細胞が遊離されて回収する方法を提供する。本発明は、ｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎによって幹細胞でｕＰＡＲ発現率及びｐｌａｓｍｉｎ活性度によって創傷修復基質が分解され、所定の外因性ｐｒｏｔｅａｓｅ使用なしに、そして、後続精製過程なしに固形性組織からｕＰＡＲ＋幹細胞を分離する方法を提供する。

【0036】

本発明は、所定の外因性組織分解酵素を使用しないことにより、臓器培養に使用した組織切片の構造と機能とが保存された状態で回収する方法を提供する。臓器培養後、回収した組織切片は、その構造が保存されて反復的臓器培養を通じてｕＰＡＲ＋組織内在性幹細胞を創傷修復基質内に移動を誘導して回収する方法を提供する。

【0037】

本発明は、組織によって組織内在性幹細胞のｕＰＡＲ－ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度が差が出て、組織によるｕＰＡＲ－ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度に分解されて消失されない創傷修復基質の組成を提供し、過度な分解を制御することができる組織によるＰＡＩ類型と濃度とを提供する。

【0038】

最終創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に移動成長したｕＰＡＲ＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋組織内在性幹細胞をＰＡＩ水洗及び除去（ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）することにより、後続な精製過程なしに高純度の幹細胞を分離する方法を提供する。ｕＰＡＲ＋／Ｎｅｓｔｉｎ＋組織内在性幹細胞は、高い自己複製、体外成長、分化能、組織再生誘導遺伝子発現、血管再生及び創傷修復効力を有した幹細胞治療剤及び幹細胞由来のバイオ医薬品の製造に使われる。

【0039】

また、本発明は、前記方法によって分離培養された組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を提供する。

【0040】

本発明において、「培養液」は、生体外で幹細胞の成長及び生存を支持可能にする培地、前記培地に含まれた培養された幹細胞の分泌物などを含む。培養に使われる培地は、幹細胞の培養に適切な当該分野で使われる通常の培地をいずれも含む。細胞の種類によって培地と培養条件とを選択することができる。培養に使われる培地は、望ましくは、細胞培養最小培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ：ＣＣＭＭ）であって、一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、αＭＥＭ（α Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍなどがあるが、これらに制限されるものではない。

【0041】

一方、本発明は、前記幹細胞、その分泌物、培地成分をいずれも含む形態、分泌物及び培地成分のみを含む形態、分泌物のみを分離して単独で、または幹細胞と共に使用する形態、または幹細胞のみを投与して体内で分泌物を生成する形態で使用することもいずれも可能である。

【0042】

前記幹細胞は、通常の当業者に公知の所定の方法を用いて獲得することができる。

【0043】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む炎症疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0044】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0045】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む創傷治療用薬学組成物を提供する。

【0046】

また、本発明は、前記組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞またはその培養液を有効成分として含む血管再生促進用薬学組成物を提供する。

【0047】

本発明の組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞は、特定疾患の治療のための細胞治療剤として用いられ、前記処理は、前記分子の直接的な処理または前処理である。

【0048】

前記「細胞治療剤」とは、細胞と組織の機能を復元するために、生きている自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を体外で増殖、選別するか、その他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなど一連の行為を通じて治療、診断、予防目的として使われる医薬品を意味する。

【0049】

前記細胞治療剤は、目的組織に到逹することができる限り、所定の一般的な経路を通じて人体に投与される。

【0050】

本発明の薬学組成物は、有効成分の以外に薬剤学的に適し、生理学的に許容される補助剤を使用して製造可能であり、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤を使用することができる。本発明の薬学組成物は、投与のために、有効成分の以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで医薬組成物として望ましく製剤化することができる。液状溶液で製剤化される組成物において、許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち、１成分以上を混合して使用し、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。

【0051】

本発明の薬学組成物の薬剤の製剤形態は、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、坐剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤、点滴剤または注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤などになりうる。本発明の医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で投与することができる。本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防または治療に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使われる薬物を含めた多様な因子によって調節される。

【0052】

本発明は、固形性組織内在性幹細胞を分離する過程中、所定の外因性組織分解酵素の使用なしに、そして、組織解離過程なしに幹細胞を分離する方法を提供する。外因性組織分解酵素を使用しないので、幹細胞を分離した後、組織は、その機能と構造とを保存することができて繰り返して組織から幹細胞を分離することができる組織源として使用することができる方法を提供する。

【0053】

組織内在性幹細胞は、組織を構成する細胞のうち、占める比率が極少数であり、通常０．０１％未満であると知られている。組織損傷後、体細胞数は減少し、これらの細胞を代替あるいは再生するための幹細胞は、活性化されて幹細胞の頻度は損傷前と比較して増加する。損傷後、組織内幹細胞は、細胞分裂を通じて自己複製後、子孫幹細胞（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を生産し、ｄａｕｇｈｔｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓは、損傷部位に移動する。本特許は、体外培養を通じて生体内組織恒常性機転を活性化して組織切片内幹細胞を自己複製及び細胞分裂を誘導し、体外で自己複製及び分裂した幹細胞を損傷部位に動員する方法を提供する。

【0054】

組織損傷後、損傷した組織周囲に創傷修復基質（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘ）が形成され、これらの基質を通じてｍａｔｒｉｘ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｐａｔｈｗａｙが活性化され、その結果、組織損傷に作用する幹細胞は、細胞分裂後、損傷部位に移住して組織再生機転が始まる。本発明は、創傷修復基質模倣ハイドロゲルを組織切片周囲に３次元的支持を通じてｍａｔｒｉｘ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎ相互作用を極大化して組織内幹細胞を活性化し、細胞分裂、成長と創傷修復基質模倣ハイドロゲルへの移住を誘導し、ハイドロゲル内に移住した幹細胞を分離する方法を提供する。

【0055】

組織損傷の反応で組織内在性幹細胞は、活性化され、該活性化された幹細胞は、ｕＰＡＲあるいはｎｅｓｔｉｎ発現が増加する特性が報告された。ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現は、幹細胞の成長と移住とに重要な役割を担当することが明かになり、ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞は、組織再生に中枢的任務を行うと知られた。ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎは、ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ幹細胞で発現が増加するので、ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎは、幹細胞の分離において主要標的標識子として適用することができる。本発明は、体外培養を通じてｍａｔｒｉｘ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｐａｔｈｗａｙ活性化の結果、組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞の細胞分裂、成長及び移住を誘導してｕＰＡＲ＋幹細胞を選択的に分離回収する方法を提供する。

【0056】

また、本発明は、幹細胞の活性化及び刺激に対する生理的反応の結果、ｕＰＡＲ－ｐｌａｓｍｉｎ－ＭＭＰ活性度によって３次元培養時に、提供した創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に移動と成長とを誘導した後、ハイドロゲル内に移動成長した幹細胞のｕＰＡＲ発現及びｐｌａｓｍｉｎ活性度の特性によって外因性組織分解酵素なしにハイドロゲルから細胞を分離回収する方法を提供する。

【0057】

本発明は、脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋、滑液膜など代表的固形性組織から組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞を分離する共通の方法を提供する。組織内在性ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋幹細胞は、自己複製、高い体外成長、多分化特性、高い組織再生能を有して再生医療治療剤として使用することができる。

【0058】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されないということは当業者にとって自明である。

【0059】

＜実施例１＞創傷修復基質模倣ハイドロゲルの製造
創傷修復模倣ハイドロゲルは、フィブリノーゲン、コラーゲン、ゼラチンあるいはこれらの高分子を混合して製造する。血漿由来のフィブリノーゲンは、２．５から１０ｍｇ／ｍｌ濃度で１０から５０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶かしてフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）溶液を製造する。トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）は、１から１０ｕｎｉｔ／ｍｌ濃度でＰＢＳに溶かしてトロンビン溶液を製造する。

【0060】

真皮由来のコラーゲン（Ｍａｔｒｉｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）あるいはゼラチン（ｂｅｆＭａｔｒｉｘ Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ、Ｊａｐａｎ）は、０．１％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）に溶かして１．０～２０．０ｍｇ／ｍｌ濃度のコラーゲン溶液を利用する。中性ゼラチンあるいはコラーゲン溶液を製造するための１０Ｘ緩衝溶液（Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）は、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１Ｎ ＮａＯＨで製造してコラーゲンあるいはゼラチン溶液と９：１の容量で混合して中性コラーゲンあるいはゼラチン溶液を製造する。

【0061】

創傷修復基質模倣ハイドロゲルは、０．２５～２．５％濃度のフィブリノーゲン溶液と０．５～５Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビン溶液とでフィブリンハイドロゲルを製造し、０．１～０．５％濃度範囲のコラーゲンあるいはゼラチン溶液をフィブリンハイドロゲルの製造時に、混合してフィブリン／コラーゲンあるいはフィブリン／ゼラチン混合ハイドロゲルを製造する。

【0062】

＜実施例２＞単層（２－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ、２Ｄ）及び３次元（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ、３Ｄ）臓器培養
培養に使用した臓器は、脂肪（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ、ＡＴ）、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ、ＢＭ）、心筋（Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ、Ｍｙｏｃａｒ）、神経（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ、ＰＮ）、筋肉（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ、ＳＭ）、滑液膜（ｓｙｎｏｖｉｕｍ、Ｓｙｎ）を使用した。機関倫理審査委員から脳死者由来の組織を利用した研究に対する承認を獲得し、脳死者から寄贈されて組織を使用した。組織周辺に貼り付いている血腫、線維性組織ははさみで除去した後、供与された組織は、手術用ｓｃａｌｐｅｌを用いて０．２～２ｍｍ^３サイズに細かく切片を出す。以後、組織切片は、ＰＢＳで懸濁し、１，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を除去する洗浄過程を３回繰り返す。

【0063】

洗浄後、組織切片は、培養液に懸濁した後、２種の臓器培養法で培養する。第１の方法は、培養液に懸濁した組織切片を培養容器に播種して培養容器の表面で培養する場合を単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ、２Ｄ）臓器培養法と定義した。

【0064】

第２の方法は、フィブリン、フィブリン／コラーゲンあるいはフィブリン／ゼラチン創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に組織切片を陥入した後、３次元（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ、３Ｄ）環境で培養する方法を３Ｄ臓器培養法と定義した。３次元臓器培養法は、組織切片は０．２５～２．５％フィブリノーゲン溶液と混合した後、同量の０．５～５ｕｎｉｔ／ｍＬトロンビン溶液と１：１の容量で混合した後、３７℃で１時間重合過程を経た後、フィブリンハイドロゲル内に組織切片を陥入した。脂肪、骨髄、心臓、筋肉は、最終０．２５～１．２５％フィブリノーゲン溶液と０．２５～２．５ｕｎｉｔ／ｍＬトロンビン溶液とで創傷修復基質模倣フィブリンハイドロゲル内に組織切片を陥入した。神経及び滑液膜の組織切片は、０．２５～２．５％フィブリノーゲンと０．１～０．５％コラーゲンあるいはゼラチン中性溶液、０．２５～２．５ｕｎｉｔ／ｍＬトロンビン溶液で構成された創傷修復基質模倣フィブリン／コラーゲンあるいはゼラチンハイドロゲル内に組織切片を陥入した。

【0065】

創傷修復基質模倣ハイドロゲル溶液と混合した組織切片は、１００～１５０ｍｍの培養容器に移した後、３７℃インキュベーターで１時間据え置きして重合過程後、ゲルに転換した。臓器培養液は、４５％ ｖ／ｖ ＤＭＥＭ、４５％ ｖ／ｖ Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、２ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成した。培養液は、ゲル容量の２倍に該当する容量を添加し、培養液を添加した後、培養容器は、ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ上に置いた後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１４日間培養した。培養液は、１週間に２回培養液を取り替えた。

【0066】

ハイドロゲル分解を抑制するために、ＰＡＩであるトラネキサム酸あるいはアミノメチル安息香酸を１０～５００μｇ／ｍＬ濃度で培養する期間中、毎日培養液に添加した。脂肪、骨髄、心臓及び骨格筋臓器培養は、１００～２５０μｇ／ｍＬ濃度のトラネキサム酸あるいはアミノメチル安息香酸を培養液に添加して創傷修復基質模倣ハイドロゲル分解を抑制した。末梢神経及び滑液膜の場合、２５０～５００μｇ／ｍＬ濃度のトラネキサム酸あるいはアミノメチル安息香酸を培養液内に添加して培養した。

【0067】

＜実施例３＞臓器培養による臓器内ｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ、ｎｅｓｔｉｎ、Ｋｉ－６７発現
２Ｄ及び３Ｄ臓器培養７日後、培養した脂肪組織、骨髄、心筋、神経、骨格筋、滑液膜の組織切片を培養容器あるいはハイドロゲルから回収した。４％中性ホルマリン溶液を用いて２時間固定した後、パラフィンブロックを製造した。パラフィンブロックから４μｍ厚さの切片を薄切した後、免疫化学染色を施行した。

【0068】

培養組織内ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫ細胞信号伝達経路の活性程度を評価するために、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫ（３２８３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ；ｐＦＡＫ）、ａｎｔｉ－ｕＰＡＲ（ＭＡＢ８０７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）及びＫｉ－６７（Ｍ７２４０、ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）などの一次抗体を用いて発現を評価した。一次抗体と反応後、３回水洗を経て、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ２次抗体（ＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と反応した後、ＤＡＢを基質として使用して発色した後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｈ－３４０１－５００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対照染色後、発現率及び陽性細胞の位置を評価した。

【0069】

体外臓器培養によって組織切片内の構成細胞は、活性され、該活性された細胞は、細胞分裂後、増殖して損傷あるいは消失された細胞を代替あるいは再生する組織恒常性機転が作動する。ｉｎｔｅｇｒｉｎ細胞信号伝達経路は、組織再生を誘導する主要機転の１つであり、ｉｎｔｅｇｒｉｎ細胞信号伝達は、細胞リガンドと細胞外基質と受容体の結合によって活性される。本実施例は、組織切片を培養容器に直接播種した後、培養容器の表面で培養した単層培養（２－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ、２Ｄ）とハイドロゲル内に陥入後、３Ｄ（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ、３Ｄ）環境で培養した組織切片内部構成細胞でｉｎｔｅｇｒｉｎ細胞信号の結果、活性化される標的因子であるｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎタンパク質発現を分析した。

【0070】

３Ｄ臓器培養後、組織切片内ｐＦＡＫ発現率は、２Ｄ臓器培養に比べて、有意に高いことを確認することができた。組織類型による臓器培養後、ｐＦＡＫ発現率は、差は確認され、心筋、神経及び骨格筋で３Ｄ臓器培養後、ｐＦＡＫ発現が有意に高く発現された（図１Ａ）。

【0071】

ｉｎｔｅｇｒｉｎ信号伝達経路の下位標的因子であるｕＰＡＲ発現も、ｐＦＡＫと類似した傾向で３Ｄ臓器培養環境で有意に高く発現され、心筋、神経及び骨格筋で高い発現を確認することができた（図１Ｂ）。

【0072】

ｉｎｔｅｇｒｉｎ信号伝達を通じて臓器内の構成細胞の細胞分裂と成長とを誘導することができる。再生あるいは細胞分裂中である細胞で特徴的に発現されるｎｅｓｔｉｎ及びＫｉ－６７発現を通じて細胞再生能と細胞成長能とを評価した。３Ｄ臓器培養後、組織切片内の構成細胞のｎｅｓｔｉｎ発現は、２Ｄ臓器培養後、組織内ｎｅｓｔｉｎ発現と比較する時、有意にその発現率が高かった（図１Ｃ）。細胞分裂標識子であるＫｉ－６７発現率も、３Ｄ臓器培養後、組織切片で有意に高かった（図１Ｄ）。

【0073】

体外臓器培養を通じて臓器を構成する細胞の細胞分裂及び成長を誘導することができ、インテグリンと結合することができるリガンドを３Ｄ培養環境を通じてインテグリン信号伝達を最大化することができ、ダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）標的因子であるｐＦＡＫ及びｕＰＡＲ発現を強化することができ、その結果、３Ｄ臓器培養は、２Ｄ臓器培養と比較して有効に高い組織切片内の構成細胞の細胞分裂と細胞成長とを誘導することを確認した。

【0074】

創傷修復基質模倣ハイドロゲルの３Ｄ物理的刺激は、臓器内の構成細胞の信号伝達経路を活性化して細胞の分裂と成長とを有意味に増加させる方法を提供することができる。

【0075】

＜実施例４＞３Ｄ臓器培養後、組織内ｐＦＡＫ＋、ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞の位置及び特性
３Ｄ臓器培養前（０ｄ）あるいは培養３、５、７及び１４日後、培養した心筋組織切片をハイドロゲルから回収した。４％中性ホルマリン溶液を用いて２時間固定した後、パラフィンブロックを製造した。パラフィンブロックから４μｍ厚さの切片を薄切した後、免疫化学染色を施行した。培養後、組織内ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫ細胞信号伝達経路の活性程度を評価するために、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫ（３２８３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ；ｐＦＡＫ）、ａｎｔｉ－ｕＰＡＲ（ＭＡＢ８０７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、ｎｅｓｔｉｎ（ＭＡＢ５３２６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）及びＫｉ－６７（Ｍ７２４０、ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）などの一次抗体を用いて発現を評価した。一次抗体と反応後、３回水洗を経て、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ２次抗体（ＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と反応した後、ＤＡＢを基質として使用して発色した後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｈ－３４０１－５００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対照染色後、発現率及び陽性細胞の位置を評価した。

【0076】

心筋を創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に陥入後、３Ｄ臓器培養を施行した後、心筋内ｐＦＡＫ＋、ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞特性を究明した。培養前、ｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現率は、６％未満であった。しかし、３Ｄ臓器培養後、培養期間と比例してｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ陽性細胞の数は、有意に増加した。培養２週後、組織切片内ｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現率は、３０％以上であった（図２及び図３）。ｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎは、成熟した体細胞の間の癲癇にある細胞から発現され、毛細血管の血管内皮細胞よりも毛細血管周囲の血管周囲細胞でｐＦＡＫ、ｕＰＡＲ、ｎｅｓｔｉｎが発現された。

【0077】

細胞分裂標識子であるＫｉ－６７は、成熟した体細胞で発現されず、培養前、１％未満で発現された。しかし、体外３Ｄ臓器培養後、Ｋｉ－６７発現率は、培養期間と比例して増加し、臓器培養２週後、心筋内Ｋｉ－６７発現率は、４５．７％であって、３Ｄ臓器培養を通じて心筋内細胞の分裂と成長とを誘導することができるという結果を確認することができ、Ｋｉ－６７も、血管周囲細胞で主に発現された（図４）。

【0078】

本実施例は、３Ｄ創傷修復基質模倣ハイドロゲルを通じて心筋内細胞分裂と成長とを誘導することができ、臓器培養を通じてｐＦＡＫ＋、ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋血管周囲細胞の分裂と成長とを誘導することができることを確認した。

【0079】

＜実施例５＞３Ｄ臓器培養を通じた組織内ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞の創傷修復基質模倣ハイドロゲル内に移動及び成長誘導
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、３Ｄ臓器培養を施行した。臓器培養液は、ハイドロゲル容量の２倍を添加し、培養容器は、ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ上に置いた後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１４日間培養した。ハイドロゲル分解を抑制するために、ＰＡＩを培養液に添加した。体外培養中、細胞分裂した細胞をラベルするために、５μＭ ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（Ｂ５００２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を培養液に７日間毎日添加した。培養液は、１週間に２回培養液を取り替えて２週間培養した。

【0080】

３Ｄ臓器培養３、７及び１４日後、培養した組織及びハイドロゲルを同時に回収した。４％中性ホルマリン溶液を用いて２時間固定した後、パラフィンブロックを製造した。パラフィンブロックから４μｍ厚さの切片を薄切した後、免疫化学染色を施行した。

【0081】

ハイドロゲル内に移動成長した細胞のｕＰＡＲ、ｎｅｓｔｉｎ及びＢｒｄＵ発現を評価するために、ａｎｔｉ－ｕＰＡＲ（ＭＡＢ８０７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、－ｎｅｓｔｉｎ（ＭＡＢ５３２６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）及び－ＢｒｄＵ（３４７５８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）１次抗体を使用した。一次抗体と反応後、３回水洗過程を経て、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ２次抗体（ＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と反応した後、ＤＡＢを基質として使用して発色し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｈ－３４０１－５００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対照染色後、発現率を評価した。

【0082】

創傷修復基質模倣ハイドロゲルは、細胞の移動と成長とを支持することができる細胞外基質への役割を担当しており、細胞移動に必須的な細胞付着因子であるｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ｆｉｂｒｉｎなどの提供を通じて、これを果たしうる。３Ｄ創傷修復基質ハイドロゲルを通じて収容体－リガンド結合を通じてｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｐＦＡＫ細胞信号伝達経路を活性化して、臓器内ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞の細胞分裂と成長とを誘導し、ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞を創傷修復基質模倣ハイドロゲルに動員、移動と成長とを誘導することができる。

【0083】

３Ｄ心筋臓器培養期間と比例してハイドロゲル内に移動成長する細胞が増加することを確認することができた（図５）。ハイドロゲル内に移動成長した細胞は、紡錘状にハイドロゲルと結合して細胞質が拡張されることを確認することができる。

【0084】

心筋からハイドロゲル内に移動成長した細胞は、ｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現率が８８．５％及び９５．４％以上であって、組織内臓器培養後、細胞分裂及び成長した細胞と同じｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋特性を示したことを確認することができる。ハイドロゲル内に移動した細胞８９．４％以上でＢｒｄＵ陽性であって、これは、臓器培養中、添加したＢｒｄＵをｕｐｔａｋｅしてＤＮＡを合成した細胞であるということを意味するので、ハイドロゲル内の細胞ほとんどは、臓器培養後、組織内細胞が分裂及び成長後、移動した細胞であるということを証明する。臓器培養前、心筋では、ＢｒｄＵ＋細胞は検出されず、ｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞は、２％未満であった。

【0085】

脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片の３Ｄ臓器培養２週後、創傷修復基質模倣ハイドロゲル内の細胞は、９０％前後ｕＰＡＲ陽性であり、９０％以上ＢｒｄＵ陽性であって、臓器培養を通じて組織内在性細胞は、細胞分裂及び成長し、ハイドロゲルに移動した細胞であるということを確認することができ、組織による有意な差は観察されていない（図６）。

【0086】

＜実施例６＞３Ｄ臓器培養後、ハイドロゲル内に移動成長した細胞の分離
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、３Ｄ臓器培養を施行した。臓器培養液は、ハイドロゲル容量の２倍を添加し、培養容器は、ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ上に置いた後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１４日間培養した。ハイドロゲル分解を抑制するために、ＰＡＩを培養期間中、毎日添加してハイドロゲル内に移動成長した細胞のＰＡ活性によって創傷修復基質模倣ハイドロゲル分解を抑制した。

【0087】

３Ｄ臓器培養後、回収した組織切片のｕＰＡＲ ｍＲＮＡ及びｐｌａｓｍｉｎ活性度を評価した。１０ｍｇ組織切片からｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓａｔｅを製造した後、ｐｌａｓｍｉｎ活性度は、Ｐｌａｓｍｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ａｂ２０４７２８、ａｂｃａｍ）を用いて分析した。Ｔｉｓｓｕｅ ｌｙａｔｅにｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加した後、３７℃で２０分間反応後、蛍光強度を測定してｐｌａｓｍｉｎ活性度を測定した。Ｐｌａｓｍｉｎ活性度は、次の数式（△ＲＦＵ３６０／４５０ｎｍ＝（ＲＦＵ_２－ＲＦＵ_２ＢＧ）－（ＲＦＵ_１－ＲＦＵ_１ＢＧ））で算定した。組織切片内のｕＰＡＲ ｍＲＮＡ発現率は、１０ｍｇ組織切片からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、逆転写酵素反応後、ｃＤＮＡを生成し、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑＰＣＲを通じて分析した。

【0088】

３Ｄ臓器培養１４日後、培養液を除去した。ＤＭＥＭを添加した後、３０ｒｐｍ速度で３０分間撹拌しながら洗浄し、洗浄液は除去した。この洗浄過程を３回繰り返した。洗浄後、ハイドロゲル内に移動成長した細胞は、次のような２種の方法で分離回収した。第１の方法は、培養液に１，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ ｕｒｏｋｉｎａｓｅを添加した後、培養容器に添加した後、２時間ハイドロゲルを分解し、該分解されたハイドロゲルから遊離された細胞及び組織切片は、ｔｕｂｅに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去し、回収した細胞及び組織切片ｐｅｌｌｅｔは、培養液で懸濁した。

【0089】

ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから細胞を分離及び回収することができる。１４日間臓器培養後、培養液を除去した後、ＤＭＥＭを用いて３回洗浄して培養液及びハイドロゲル内に残っているＰＡＩを除去した。新鮮な培養液を添加した後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１時間培養し、培養液内ＰＡＩは添加しない。ハイドロゲルから分離されて遊離される細胞は、ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅを用いて回収した後、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去し、回収した細胞及び組織切片ｐｅｌｌｅｔは、培養液で懸濁した。

【0090】

ハイドロゲルから分離回収した細胞は、培養液で懸濁した後、ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒを総細胞数を算定し、回収した細胞は、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いてｕＰＡＲ発現率を分析した。

【0091】

３Ｄ臓器培養後、組織内細胞分裂後、成長したｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋細胞は、ハイドロゲル内に移動及び成長を誘導し、ハイドロゲル内に移動成長した細胞を外因性ｐｒｏｔｅａｓｅなしにｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋細胞自体のｐｌａｓｍｉｎ活性度によってハイドロゲルを分解して、ｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋細胞を選択的に分離し、回収する方法を本実施例を通じて提供しようとする。

【0092】

臓器培養前後、組織切片内のｕＰＡＲ ｍＲＮＡ発現及びｐｌａｓｍｉｎ活性度を評価した。体外培養前にも、臓器によってｕＰＡＲ ｍＲＮＡ発現及びｐｌａｓｍｉｎ活性度は差があり、心筋、神経及び骨格筋でｕＰＡＲ ｍＲＮＡ発現及びｐｌａｓｍｉｎ活性度が他の組織よりも高かった（図７）。臓器培養後、評価したあらゆる組織切片で培養前と比較してｕＰＡＲ ｍＲＮＡ発現及びｐｌａｓｍｉｎ活性度が有意に増加した。特に、心筋、神経及び骨格筋でｍＲＮＡ発現とｐｌａｓｍｉｎ活性度が最も高く測定された。Ｐｌａｓｍｉｎ活性度は、ｕＰＡＲ発現と比例的関係なので、臓器培養を通じて組織内のｕＰＡＲ発現の増加を誘導することができ、臓器培養後、ｕＰＡＲ増加を通じて組織内のｐｌａｓｍｉｎ活性度を増加させる方法を提供する。

【0093】

３Ｄ臓器培養中、培養液内Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＡＩ）を添加し、該添加したＰＡＩは、臓器及び細胞の過度なｐｌａｓｍｉｎ及びｐｒｏｔｅａｓｅ活性を調節してハイドロゲル分解を抑制することができる。臓器培養を通じて組織内細胞分裂及び成長した細胞をハイドロゲル内に移動と成長とを誘導した後、ＰＡＩを培養液及びハイドロゲルから水洗及び洗浄過程を通じて除去（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）すれば、臓器及び細胞内在性ｐｌａｓｍｉｎ及びｐｒｏｔｅａｓｅ活性のみでもハイドロゲル分解を誘導することができ、その結果、ハイドロゲル内に移動成長した細胞が遊離され、該遊離された細胞を分離及び回収が可能である。

【0094】

ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌは、ＰＡＩを含有した培養液を除去した後、ＤＭＥＭで３回洗浄を通じてハイドロゲル及び臓器内に残存するＰＡＩを洗浄過程を通じて除去し、ＰＡＩが含まれていない培養液をハイドロゲル容量２倍を添加して培養した。培養３０分後、ハイドロゲルは、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ結果、分解され始め、ハイドロゲルが分解されながらハイドロゲル内に移動成長した細胞は、ハイドロゲルから遊離されて細胞－細胞間凝集し、培養２時間後、組織切片及び移動成長した細胞周囲のハイドロゲルは、完全に分解され、その結果、ハイドロゲル内の細胞が解離される結果がもたらされる（図８）。本実施例を通じて、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌのみで細胞内在性ｐｌａｓｍｉｎ及びｐｒｏｔｅａｓｅ活性で創傷修復基質模倣ハイドロゲルが消失され、ハイドロゲル内の細胞は、培養液内に遊離され、その結果、培養液内に遊離された細胞は、細胞質が収縮され、凝集された形態で分離回収することができる。

【0095】

臓器培養中、ＰＡＩ添加を通じてハイドロゲル分解を抑制することができ、ハイドロゲル内の細胞は、細胞質拡張の結果、紡錘状を示す。しかし、培養液内のＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて細胞周辺のハイドロゲルから分解され始め、その結果、細胞は、細胞質が収縮し、細胞－細胞間接合の結果、細胞は凝集体が形成され、凝集された細胞は、培養液内に遊離される（図９）。

【0096】

組織学的方法でＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ前、ハイドロゲル内の細胞は、細胞質が拡張された形状を確認することができるが、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、ハイドロゲルが分解される始まれば、細胞が付着することができるハイドロゲルが消失されて、細胞－細胞間接合の結果、細胞は凝集され、ハイドロゲルから分離されて遊離されることを検証することができる（図１０）。ハイドロゲルから遊離されて凝集した細胞いずれもｕＰＡＲを発現する特性を示して、ｕＰＡＲ発現が高いほどｐｌａｓｍｉｎ活性度が増加し、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌのみでもハイドロゲル内のｕＰＡＲ＋細胞を分離することができる根拠を確認することができた（図１０）。

【0097】

ハイドロゲル内に移動成長した細胞は、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌあるいはｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離して回収することができる。本発明は、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理なしにＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌでもハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離する方法の有用性を比較評価した。

【0098】

実施例を通じて、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でも、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理を通じて細胞数と同等な細胞を分離し、回収することができる結果を確認することができた（図１１Ａ）。組織１００ｍｇ当たり２週間臓器培養後、２百万個以上の細胞を分離回収することができ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、回収した細胞数よりも低かったが、有意な差はなかった。

【0099】

しかし、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、回収した細胞のｕＰＡＲ発現率は、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、回収した細胞よりも有意に高かった（図１１Ｂ）。特に、ｕＰＡＲ発現率及びｐｌａｓｍｉｎ活性度が高い組織でｕＰＡＲ＋細胞を選択的に分離する収率が高かった。これは、ｕＰＡＲ＋細胞でハイドロゲル分解活性度が高く、その結果、ＰＡＩ除去及び洗浄でｕＰＡＲ＋細胞を選択的に分離効率が高い方法であるということを検証することができた。

【0100】

＜実施例７＞３Ｄ臓器培養後、回収した組織切片の反復的臓器培養及び細胞分離
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、３Ｄ臓器培養を施行した。臓器培養液は、ハイドロゲル容量の２倍を添加し、培養容器は、ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ上に置いた後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１４日間培養した。ハイドロゲル分解を抑制するために、ＰＡＩを培養期間中、毎日添加してハイドロゲル内に移動成長した細胞のｐｌａｓｍｉｎ活性によって創傷修復基質模倣ハイドロゲル分解を抑制した。

【0101】

３Ｄ臓器培養１４日後、培養液を除去した。ＤＭＥＭを添加した後、３０ｒｐｍ速度で３０分間撹拌しながら洗浄し、洗浄液を除去した。３回洗浄過程を繰り返して培養液及びハイドロゲル内に残っているＰＡＩを除去した。新鮮な培養液を添加した後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら２時間培養し、培養液内ＰＡＩは添加しない。ハイドロゲルから分離されて遊離される細胞及び組織切片をｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅを用いて回収した後、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去した。組織切片が高い比重の結果、細胞よりも早く沈殿されるので、細胞及び組織切片ｐｅｌｌｅｔをＤＭＥＭで分散させた後、３０秒間据え置きしながら組織切片の沈殿を誘導し、上澄み液のみを新たなｔｕｂｅに移し、この過程を３回繰り返して回収した細胞及び組織切片を分離した。

【0102】

ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離した組織切片は、再びハイドロゲル内に陥入させた後、実施例２で記述した方法で３Ｄ臓器培養を行い、２週後、実施例７で記述した方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞及び組織切片を分離回収した。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、回収した組織切片は、３回さらに連続した３Ｄ臓器培養を通じて過程を繰り返して組織内細胞を移動成長を誘導してハイドロゲル内の細胞を分離回収し、分離回収した総細胞数をｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。

【0103】

本実施例は、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、構造が保存された組織切片を回収し、該回収した組織切片を反復的な臓器培養を施行して、臓器培養後、ハイドロゲル内に移動後、成長した細胞を分離し、回収する方法を提供する。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅのような外因性ｐｒｏｔｅａｓｅ処理は、ハイドロゲルと共に陥入された組織切片が分解され、その結果、組織切片の構造機能的微細環境が消失される。

【0104】

本実施例は、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて外因性ｐｒｏｔｅａｓｅ処理なしに組織内成長後、移動した細胞及び組織切片を分離し、回収し、同時に回収した組織切片も、反復的な臓器培養を施行した。臓器培養後、回収した組織切片を使用して３回の連続した臓器培養を施行し、最初の臓器培養と類似した収率で細胞を回収することができる結果を確認した（図１２）。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法は、３Ｄ臓器培養後、ハイドロゲル内に移動成長した細胞と共に陥入した組織切片の構造機能的微細環境を保存することができる方法であるということを確認することができ、反復的な臓器培養を通じて組織内在性細胞を高効率、そして、安定して分離する方法であるということを確認することができる。

【0105】

＜実施例８＞ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ及びｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、ハイドロゲルから分離した細胞の培養
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、３Ｄ臓器培養を施行した。臓器培養液は、ハイドロゲル容量の２倍を添加し、培養容器は、ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ上に置いた後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１４日間培養した。ハイドロゲル分解を抑制するために、ＰＡＩであるトラネキサム酸を培養液に毎日添加した。

【0106】

３Ｄ臓器培養１４日後、培養液を除去した。ＤＭＥＭを添加した後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら３０分間洗浄し、この洗浄過程を３回繰り返した。洗浄後、ハイドロゲル内に移動成長した細胞は、実施例６で提示したＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌあるいはｕｒｏｋｉｎａｓｅ方法で細胞を分離後、回収した。１４日間臓器培養後、培養液を除去した後、ＤＭＥＭを用いて３回洗浄して培養液及びハイドロゲル内に残っているＰＡＩを除去した。新鮮な培養液を添加した後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１時間培養し、培養液内ＰＡＩは添加しない。ハイドロゲルから分離されて遊離される細胞は、ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅを用いて回収した後、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去し、回収した細胞及び組織切片ｐｅｌｌｅｔは、培養液で懸濁した。

【0107】

Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理は、３回洗浄後、培養液に１，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ ｕｒｏｋｉｎａｓｅを添加した後、２時間ハイドロゲルを分解し、該分解されたハイドロゲルから遊離された細胞及び組織切片は回収してｔｕｂｅに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去し、回収した細胞及び組織切片ｐｅｌｌｅｔは、培養液で懸濁した。

【0108】

ハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ培養容器ｃｍ^２当たり５，０００個の細胞を播種した後、培養液を添加した。単層培養環境でハイドロゲルから分離回収した細胞の付着と成長特性とを顕微鏡を用いて評価した。

【0109】

ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、ハイドロゲルから遊離されて細胞凝集体が形成されることを確認することができ（図１３Ａ）、回収した細胞は、培養液で懸濁した後、小さな円状の凝集体で構成され（図１３Ｂ）、ＰＳ培養容器に播種して単層環境で培養した。細胞間凝集された状態で回収した細胞は、播種３０分後、培養容器に付着し（図１３Ｃ）、播種１時間後、播種した細胞の細胞質は拡張され（図１３Ｄ）、培養２時間後、細胞は安定して付着し、細胞凝集体周辺の細胞が成長することを確認することができた（図１３Ｅ）。

【0110】

脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋、滑液膜などあらゆる組織切片の臓器培養後、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて細胞を安定して分離回収することができ、回収した細胞は、培養液と混合後、培養容器に播種すれば、３０分以内に回収した細胞いずれも培養容器に付着し、細胞質が安定して拡張することを確認することができ、組織による有意な差はなかった（図１４）。

【0111】

単層環境で播種培養する細胞は、高い成長率を示し、培養２日後、播種された細胞周辺に成長して周辺に拡大され、単層培養環境でも、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて分離回収した細胞は、単層環境で培養時にも、高い成長率が保持されることを確認することができた（図１５）。

【0112】

＜実施例９＞ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、分離した細胞の免疫表現の特性
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、３Ｄ臓器培養を施行した。臓器培養液は、ハイドロゲル容量の２倍を添加し、培養容器は、ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ上に置いた後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１４日間培養した。ハイドロゲル分解を抑制するために、ＰＡＩであるトラネキサム酸を濃度で培養液に添加し、培養した。

【0113】

３Ｄ臓器培養１４日後、培養液を除去した。ＤＭＥＭを添加した後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら３０分間洗浄し、この洗浄過程を３回繰り返した。洗浄後、ハイドロゲル内に移動成長した細胞は、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法で細胞を分離後、回収した。１４日間臓器培養後、培養液を除去した後、ＤＭＥＭを用いて３回洗浄して培養液及びハイドロゲル内に残っているＰＡＩを除去した。新鮮な培養液を添加した後、３０ｒｐｍ速度で撹拌しながら１時間培養し、培養液内ＰＡＩは添加しない。ハイドロゲルから分離されて遊離される細胞は、ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅを用いて回収した後、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去し、回収した細胞及び組織切片ｐｅｌｌｅｔは、培養液で懸濁した。

【0114】

ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法あるいはｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞は、ＰＢＳに懸濁した後、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて免疫表現の特性を分析した。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）標識子であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４０ｂと共にｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現率を評価した。造血細胞標識子としてＣＤ３４及びＣＤ４５、血管内皮細胞標識子としてＣＤ３１を用いて当該標識子の発現率を評価した。

【0115】

Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理あるいはＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌの結果、ハイドロゲルから移動成長した細胞を分離後、回収することができる。細胞を回収する方法と関係なく培養したあらゆる組織からハイドロゲル内に移動成長した細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ１４０ｂ発現率が９０％以上であって、間葉系幹細胞と同じ免疫表現の特性を示した（図１６Ａ）。ハイドロゲルから分離回収した細胞の間葉系幹細胞標識子の発現率は、分離方法による差はなかった。

【0116】

しかし、本実施例において、あらゆる組織切片の臓器培養後、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ処理で分離回収した細胞でｕＰＡＲ及びｎｅｓｔｉｎ発現率は、９０％以上の発現率を示した。一方、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、回収した細胞の場合、３０～６７％範囲の発現率を示した。ハイドロゲル内のｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞の高いｐｌａｓｍｉｎ活性度の特性によってＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて選択的に分離し、回収することができる結果を確認することができた。一方、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理は、ハイドロゲル内の多様な免疫表現の特性を有した細胞が混合されて回収されることを確認することができた（図１６Ｂ）。

【0117】

組織内に存在する造血細胞及び血管内皮細胞は、組織から細胞を分離する過程中に混合され、ＣＤ３１＋、ＣＤ３４＋及びＣＤ４５＋細胞を確認して、これらの細胞の混合程度を確認することができる。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離回収した細胞の場合、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５発現率は、１％未満であるが、Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞は、２．８～７．０％であって、造血細胞及び血管内皮細胞の混合が高いことを確認することができた（図１７）。

【0118】

本実施例を通じて、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて組織からハイドロゲル内に移動したｕＰＡＲ＋及びｎｅｓｔｉｎ＋細胞を選択的に分離し、回収する方法であるということを確認することができ、同時に分離過程中、造血細胞及び血管内皮細胞の混合は最小化することができた。

【0119】

＜実施例１０＞ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、分離回収したｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋細胞の自己複製能
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ及びｕｒｏｋｉｎａｗｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。

【0120】

ハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去した。細胞沈殿物は、培養液で浮遊した後、ｍＬ当たり１．０Ｅ＋０６細胞密度に合わせた。ハイドロゲルから分離回収した細胞の自己複製能を検証するために、ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＣＦＵ）を通じて評価した。１００ｍｍの培養容器に６，０００個の細胞を播種した後、２週間培養し、培養後、１％ ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔで染色した。洗浄後、２ｍｍ以上直径のｃｏｌｏｎｙ数を測定した。

【0121】

組織類型によるＣＦＵ形成頻度は、差はあったが、あらゆる組織切片でＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じてハイドロゲルから分離回収した細胞でｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、回収した細胞と比較して有意に高かった（図１８）。特に、心筋、神経及び骨格筋から由来した細胞は、他の組織から由来した細胞と比較して高いｃｏｌｏｎｙ形成能を示した。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離した細胞の場合、ＣＦＵ頻度は、３．１～８．４％であったが、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法で分離した細胞は、８．８～３７．９％であって、高いＣＦＵ頻度を有したと確認された。

【0122】

自己複製能は、幹細胞の主要特性の１つであり、３Ｄ臓器培養は、組織内幹細胞を活性化してハイドロゲル内に移動成長を誘導することができ、ハイドロゲル内幹細胞は、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法を通じて自己複製力価が高い幹細胞を選択的に分離回収することができ、これは、ｐｌａｓｍｉｎ活性度が高いｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋細胞が高い力価の幹細胞であるということを証明する結果である（図１８）。

【0123】

＜実施例１１＞ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、分離した細胞の体外成長能
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ及びｕｒｏｋｉｎａｓｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。

【0124】

ハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去した。細胞沈殿物は、培養液で浮遊した後、ｍＬ当たり１．０Ｅ＋０６細胞密度に合わせた。ハイドロゲルから分離回収した細胞の体外成長能を検証するために、細胞倍加時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ、ＰＤＴ）及び細胞倍加レベル（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ、ＰＤＬ）を分析して評価した。Ｔ７５ ｆｌａｓｋにｃｍ^２当たり３，０００個の細胞を播種した後、７日間培養した後、ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理後、細胞を収集し、ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒを通じて総細胞数を計算した。播種細胞数、回収総細胞数、培養期間を通じてＰＤＴ及びＰＤＬを計算して比較した。ＰＤＴは、次の公式によって算定した。ＰＤＴ＝［（培養時間）／（（ｌｏｇＮ２－ｌｏｇＮ１）／ｌｏｇ２）］数式を用いて算定し、Ｎ１は、播種時の細胞数であり、Ｎ２は、培養後の回収した細胞数である。ＰＤＬは、次の拱式によって計算した。ＰＤＬ＝［ＰＤＬ０＋３．３２２（ｌｏｇＮ２－ｌｏｇＮ１）］数式を用い、Ｎ１は、播種時の細胞数であり、Ｎ２は、細胞培養後の回収した細胞数である。

【0125】

体外成長能が高いほど培養中である細胞で細胞周期標識子であるＫｉ－６７発現率が高い。体外細胞成長能は、ａｎｔｉ－Ｋｉ６７発現率をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙで分析して比較分析した。

【0126】

ＵｒｏｋｉｎａｓｅあるいはＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ処理後、ハイドロゲルから移動成長した細胞を分離し、回収した細胞の体外成長能を比較分析した。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて分離回収した細胞でｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、確保した細胞と比較してＰＤＴは有意に低く、ＰＤＬは有意に高かった。自己複製能と同じ傾向でＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて分離回収した細胞の低いＰＤＴ及び高いＰＤＬで優れた体外成長能を有した細胞であるということを確認することができた（図１９）。

【0127】

ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ処理後、ハイドロゲルから分離回収した細胞の高い成長能を検証するために、Ｋｉ－６７発現率をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを通じて分析した。Ｋｉ－６７標識子は、細胞周期中である細胞を意味するので、Ｋｉ－６７発現率が高いほど細胞成長能が高いということを意味する指標である。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌを通じて確保した細胞は、５８．５～７５．４％の高いＫｉ－６７発現率を示し、これは、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、確保した細胞での３３．６～４８．７％と比較して有意に高かった（図２０）。

【0128】

以上の結果、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌは、高い体外成長能を有した細胞を選択的に分離する方法であるということを確認することができ、これは、ｐｌａｓｍｉｎ活性度が高いｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋細胞が高い成長能を有した細胞であるということを支持する結果である。

【0129】

＜実施例１２＞ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、分離した細胞の分化能
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ及びｕｒｏｋｉｎａｗｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。

【0130】

ハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去した。細胞沈殿物は、培養液で浮遊した後、ｍＬ当たり１．０Ｅ＋０６細胞密度に合わせた。ハイドロゲル内の細胞の脂肪細胞及び骨芽細胞への分化能を評価した。２．０Ｅ＋０５細胞を２４－ｗｅｌｌ培養容器に播種した後、９０％ ＤＭＥＭに１０％ ＣＳ、０．５ｍＭ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）、８０μＭ ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、１μＭ ＤＥＸ、５μｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎが添加された分化培地を添加した後、１４日間培養した。幹細胞の脂肪細胞への分化程度は、分化誘導２週後に細胞質内の脂肪蓄積の指標である０．５％ Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｓｉｇｍａ）溶液を常温で１時間染色して細胞質内のｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ含量をＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ－Ｇｌｏ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。骨芽細胞への分化能を評価するために、２．０Ｅ＋０５個の細胞を２４－ｗｅｌｌ培養容器に播種した後、１μＭ ＤＥＸ、５０μＭ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、１０ｍＭ β－ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０％ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍを含有したα－ＭＥＭを添加した後、２週間培養して分化を誘導した。骨芽細胞への分化有無は、分化誘導２週後、Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）を添加した後、染色し、ミネラルの沈着程度は、５２０ｎｍで吸光度を測定してｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙで比較分析した。

【0131】

図２１は、骨髄から分離回収した細胞を骨芽細胞（左）及び脂肪細胞（右）に分化を誘導した後、ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｒｙｔａｌ蓄積と沈着とをａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ染色を通じて確認することができ、脂肪細胞に分化を誘導した細胞は、細胞質内の脂肪質の蓄積をｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色を通じて確認することができる。あらゆる組織切片から由来した細胞いずれもで骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能を有したことを確認することができた。

【0132】

沈着あるいは蓄積されたｍｉｎｅｒａｌ ｃｒｙｏｓｔａｌ及びｆａｔ ｖａｃｕｏｌｅを溶解後、測定したＯＤ数値を通じて骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能を比較評価した。あらゆる組織切片でＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌでハイドロゲルから分離回収した細胞で骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能がｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞よりも有意に高いことを確認することができた（図２２）。骨芽細胞への分化は、骨髄、心筋、骨格筋由来の細胞で高い能力を示し、脂肪細胞への分化は、脂肪、骨格筋及び滑液膜で高い能力を示した。しかし、組織切片由来と関係なくＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離回収した細胞に有意に高い骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能を確認するにつれて、ｐｌａｓｍｉｎ活性度が高いｕＰＡＲ＋／ｎｅｓｔｉｎ＋細胞で多分化能が高い幹細胞であるということを確認することができた。

【0133】

＜実施例１３＞ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、分離した細胞の組織再生の誘導能
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ及びｕｒｏｋｉｎａｗｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。

【0134】

ハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｔｕｂｅｓに移した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液を除去した。細胞沈殿物は、培養液で浮遊した後、ｍＬ当たり１．０Ｅ＋０６細胞密度に合わせた。Ｔ１７５ ｆｌａｓｋに５．０Ｅ＋０６細胞を播種した後、３日間培養した後、ＴＲＩｚｏｌ １ｍＬを添加した後、ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを回収し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離する前まで－２０℃冷凍保管した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製し、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてｃＤＮＡを合成した。組織保護及び再生に主な役割を担当するｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＳＤＦ－１ ｍＲＮＡ発現は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｄｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＣＢ－ＭＳＣ）に比べて、発現率で計算して比較評価した。Ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡ特異始発体とＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｋｉｔを用いてリアルタイム遺伝子増幅を通じてＴａｒｇｅｔ ｍＲＮＡ遺伝子を増幅し、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＣＢ－ＭＳＣ）に比べて、ｍＲＮＡ発現率を２－ΔΔＣｔ方法で評価した。

【0135】

ＵｒｏｋｉｎａｓｅあるいはＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ処理後、ハイドロゲルから移動成長した細胞を分離し、回収した細胞の組織再生の誘導能は、関連ｍＲＮＡ発現を通じて比較分析した。起源した組織によって組織再生を誘導する遺伝子発現が異なり、心筋、神経、そして、骨格筋由来の細胞でこれらの遺伝子発現が高く、ＨＧＦ及びＳＤＦ－１ ｍＲＮＡは、心筋由来の細胞が高かったが、神経由来の細胞では、ＩＧＦ ｍＲＮＡ発現が高かった（図２３）。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌで分離回収した細胞でｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離回収した細胞に比べて、あらゆる組織再生遺伝子発現が有意に高かった。このような結果は、ｕＰＡＲ発現は高い組織再生調節遺伝子発現と比例的関連性を確認することができる。

【0136】

＜実施例１４＞ｕＰＡＲ＋細胞のｐｌａｓｍｉｎ活性度及びｎｅｓｔｉｎ発現率
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたｕｒｏｋｉｎａｓｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。以後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を通じてｕＰＡＲ＋（ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋）とｕＰＡＲ－（ＵＫ＋ｕＰＡＲ－）細胞を分離して７日間単層環境で培養した後、ｐｌａｓｍｉｎ活性度とｎｅｓｔｉｎ発現率とを評価した。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｕＰＡＲ発現率が９０％以上なので、二次的なｕＰＡＲ＋細胞を分離しなかった。Ｐｌａｓｍｉｎ活性度は、実施例６で記述した方法によって施行し、ｎｅｓｔｉｎ発現率は、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて評価した。

【0137】

ｕＰＡＲ＋細胞で有意に高いｐｌａｓｍｉｎ活性度を確認することができた（図２４、左）。Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ処理後、分離培養したＵＫ＋ｕＰＡＲ＋細胞とＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、分離培養した細胞でＵＫ＋ｕＰＡＲ－細胞と比較して有意に高いｐｌａｓｍｉｎ活性度を示した。起源した組織によって細胞のｐｌａｓｍｉｎ活性度は、差があり、心筋、神経及び骨格筋で高く、組織内在性細胞の起源した組織によってｐｌａｓｍｉｎ活性度が決定される特性を示した。

【0138】

以上の結果は、ｕＰＡＲ＋細胞でｐｌａｓｍｉｎ活性度とｎｅｓｔｉｎ発現率と密接な関連性を確認することができた。

【0139】

＜実施例１５＞ｕＰＡＲ＋細胞の自己複製及び体外成長能
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたｕｒｏｋｉｎａｓｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。以後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を通じてｕＰＡＲ＋（ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋）とｕＰＡＲ－（ＵＫ＋ｕＰＡＲ－）細胞を分離して７日間単層環境で培養した後、自己複製及び成長能を評価した。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｕＰＡＲ発現率が９０％以上なので、二次的なｕＰＡＲ＋細胞を分離しなかった。自己複製能は、実施例１０に記述した方法によって施行し、成長能は、Ｋｉ－６７発現率をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて評価した。

【0140】

ｕＰＡＲ＋細胞で有意に高い自己複製能を確認することができた。ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋細胞及びＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ細胞でＣＦＵ頻度は、１２．５～３７．５％であったが、ＵＫ＋ｕＰＡＲ－細胞では、３．１～８．８％頻度であり、ｕＰＡＲ＋細胞で有意に高い自己複製能を保有したことを確認することができた（図２５、左）。

【0141】

自己複製能と体外成長能は、密接な関連性を有し、ｕＰＡＲ＋細胞にＫｉ－６７発現率が４０．８～８２．４％であって、ｕＰＡＲ－細胞でＫｉ－６７発現率２８．１～４５．７％よりも有意に高い成長能を保有したことを確認することができた（図２５、右）。心筋、神経及び骨格筋由来のｕＰＡＲ＋細胞で他起源組織と比較してＣＦＵ形成能とＫｉ－６７発現率とが高かった。

【0142】

＜実施例１６＞ｕＰＡＲ＋細胞の抗炎症能
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたｕｒｏｋｉｎａｓｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。以後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を通じてｕＰＡＲ＋（ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋）とｕＰＡＲ－（ＵＫ＋ｕＰＡＲ－）細胞を分離して７日間単層環境で培養した後、抗炎症能を評価した。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｕＰＡＲ発現率が９０％以上なので、二次的なｕＰＡＲ＋細胞を分離しなかった。

【0143】

抗炎症能は、細胞から分泌された因子を含む条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を用いて評価した。条件培地を製造するために、ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋、ＵＫ＋ｕＰＡＲ－及びＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ細胞は、Ｔ１７５ ｆｌａｓｋにｃｍ^２当たり４０，０００個の細胞を播種したＤＭＥＭ／Ｆ１２無血清培地を添加した後、１週間培養した。

【0144】

ＲＡＷ ２６４．７細胞は、９０％ ＲＰＭｉ １６４０／１０％ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍに懸濁した後、ｃｍ^２当たり１００，０００個の細胞を１２－ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種して１日間培養した。１００μｇ／ｍＬ ＬＰＳを培養液に添加してＲＡＷ ２６４．７細胞を減作させた。ＬＰＳ減作時に、条件培地を培養液と１：１０の比率で添加して抗炎症能を評価した。抗炎症評価指標は、ＲＡＷ ２６４．７細胞から分泌されるＴＮＦα及びＩＬ－１β分離レベルをＥＬＩＳＡ方法で測定して比較評価した。

【0145】

ＲＡＷ ２６４．７細胞は、ＬＰＳ刺激後、ＴＮＦα及びＩＬ－１β分泌レベルが５倍増加した。ハイドロゲルから分離回収した組織内在性幹細胞から分泌する物質は、ＲＡＷ ２６４．７細胞の炎症性サイトカイン分離を３０～７０％抑制する能力を確認することができた（図２６）。ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋細胞及びＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ細胞で製造した条件培地は、ＵＫ＋ｕＰＡＲ－細胞に比べて、有意に高いＴＮＦα及びＩＬ－１β分泌抑制能を示した。起源した組織と無関係にｕＰＡＲ＋細胞は、ｕＰＡＲ－細胞と比較して高い抗炎症の効力を確認することができた。

【0146】

＜実施例１７＞ｕＰＡＲ＋細胞の血管内皮細胞及び線維芽細胞の成長誘導の効力
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたｕｒｏｋｉｎａｓｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。以後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を通じてｕＰＡＲ＋（ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋）とｕＰＡＲ－（ＵＫ＋ｕＰＡＲ－）細胞を分離して７日間単層環境で培養した後、抗炎症能を評価した。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｕＰＡＲ発現率が９０％以上なので、二次的なｕＰＡＲ＋細胞を分離しなかった。

【0147】

血管内皮細胞は、ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（ＨＵＶＥＣ）を使用し、ヒト真皮由来の線維芽細胞（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＤＦ）を使用した。条件培地の当該細胞の成長誘導の効力を試験した。実施例１６で記述された方法で製造した条件培地を製造して効力を試験した。ＨＵＶＥＣ細胞及びＤＦは、９９％ ＤＭＥＭ／１％ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ培養液に懸濁した後、ｃｍ^２当たり４，０００個の細胞を２４－ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。条件培地は、培養液と１：９の比率で添加した後、３日間培養し、培養後、細胞数は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。細胞成長の効力は、最初播種した細胞数に比べて、増加する比率（ｆｏｌｄ）を計算して比較分析した。

【0148】

ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋及びＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ細胞で製造した条件培地は、ＨＵＶＥＣ及びＤＦ成長を促進する効力が確認され、ＵＫ＋ｕＰＡＲ－細胞で製造した条件培地に比べて、３０％以上有意に高い効力を示したが、ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋とＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ細胞間の効力は、差がなかった（図２７）。特に、心筋、神経及び骨格筋由来の筋細胞から得られた条件培地は、他の組織由来の幹細胞と比較して高い成長誘導の効力を確認することができた。

【0149】

＜実施例１８＞ｕＰＡＲ＋細胞の血管内皮細胞及び線維芽細胞の保護効力
フィブリンあるいはフィブリン／コラーゲンハイドロゲル内に脂肪、骨髄、心筋、神経、骨格筋及び滑液膜の組織切片を陥入した後、２週間３Ｄ臓器培養を施行した後、実施例６に記述されたｕｒｏｋｉｎａｓｅ方法でハイドロゲル内に移動成長した細胞を分離回収した。以後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を通じてｕＰＡＲ＋（ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋）とｕＰＡＲ－（ＵＫ＋ｕＰＡＲ－）細胞を分離して７日間単層環境で培養した後、抗炎症能を評価した。ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ方法でハイドロゲルから分離回収した細胞は、ｕＰＡＲ発現率が９０％以上なので、二次的なｕＰＡＲ＋細胞を分離しなかった。

【0150】

ＵＫ＋ｕＰＡＲ－細胞、ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋細胞及びＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ後、分離回収した細胞でそれぞれ製造した条件培地を使用して細胞保護の効力を試験した。ＨＵＶＥＣ及びＤＦを９９％ ＤＭＥＭ／１％ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ培養液に懸濁した後、ｃｍ^２当たり５，０００個の細胞を２４－ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。Ｈ_２Ｏ_２媒介細胞損傷誘導１時間前、条件培地は、培養液と１：９の比率で添加した。０．０１％ Ｈ_２Ｏ_２を添加して細胞損傷を誘導し、損傷誘導６時間後、培養液を除去した後、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞損傷程度は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ発現率で評価し、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を細胞と反応させた後、死滅化された細胞をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙで分析した。

【0151】

ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋細胞及びＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ処理後、回収細胞で製造した条件培地は、ＵＫ＋ｕＰＡＲ－細胞由来の条件培地と比較してＨ_２Ｏ_２媒介ＨＵＶＥＣ及びＤＦ細胞死を有意に保護することができる結果を確認した（図２８）。起源した組織によって細胞保護の効力の差は観察され、心筋、神経及び骨格筋由来の細胞でＨＵＶＥＣ及びＤＦ細胞保護の効力が高かった。ＵＫ＋ｕＰＡＲ＋細胞条件培地で処理したＨＵＶＥＣ及びＤＦでａｎｎｅｘｉｎ Ｖ発現率は、２８．７～４５．１％であって、ＵＫ＋ｕＰＡＲ－細胞条件培地で処理した細胞の場合、４２．１～７１．３％よりも有意に高い細胞保護の効力を示したが、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ細胞由来の条件培地とは有意な差は確認することができなかった。このような結果は、ｕＰＡＲ発現は高い細胞保護の効力と関連性を確認することができ、ＰＡＩ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌのみでも、細胞保護の効力が高い細胞を分離培養することができる根拠を確認した。

【0152】

本発明は、人工創傷修復基質（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘ）支持臓器培養を通じて行われる。組織切片を人工ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘ内に陥入し、ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘを通じてｉｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫ細胞信号伝達経路を活性化して組織内在性幹細胞の細胞分裂と成長とを誘導する。臓器培養過程を通じて組織内幹細胞がｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘに移動成長は、ｕＰＡＲ－ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性度と比例して増加する。過度なｕＰＡＲ－ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ活性によってｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘが分解消失されて幹細胞の移動が阻害中断される結果を制御するために、ＰＡＩ添加を通じて過度なｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘ分解を調節することができる。Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘ内に幹細胞の移動と成長とが目標としたレベルに到達された後、ＰＡＩ添加を中断することにより、ｕＰＡＲ＋幹細胞を分離することができる技術を提供する。ＰＡＩ添加中断によってｕＰＡＲ－ｕＰＡ－ｐｌａｓｍｉｎ及びＭＭＰ活性化によってｕＰＡＲ＋幹細胞がｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘから解離されて培養液内に遊離される結果が導出される。本発明は、ｕＰＡＲ発現によるｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｘの移動と分解特性とを用いて所定の組織分解タンパク質の使用と標識子を利用した幹細胞精製過程なしにｕＰＡＲ＋幹細胞を分離培養することができる技術を提供する。

【0153】

本発明は、骨髄、脂肪、骨格筋、心臓、末梢神経、脊髄、脳、肺、肝、関節膜、臍帯、胎盤、歯周などの固形性組織内に存在するｕＰＡＲ＋幹細胞の分離培養に適用することができる。本発明は、所定の組織分解酵素処理なしに幹細胞を分離することにより、臓器培養に使用した組織切片は、その構造が完全に保存することができて反復的臓器培養を通じて幹細胞を分離培養することができる方法を提供する。

【0154】

本発明は、ｕＰＡＲ陽性組織内在性幹細胞中、ｕＰＡＲと共に通常の幹細胞標識子が陽性で発現する特性を示す。骨髄、脂肪、筋肉、心臓、関節膜、臍帯、胎盤の場合、間葉系幹細胞標識子であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５が陽性で発現されるが、造血母細胞あるいは血管内皮細胞標識子は、陰性である特性を有する。本発明は、末梢神経、脊髄、脳組織から由来したｕＰＡＲ陽性幹細胞は、ｎｅｓｔｉｎ、ｐ７５、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ２などの標識子が同時に発現される特性を示す。

【0155】

本発明のｕＰＡＲ陽性幹細胞は、移動、成長因子、抗炎症因子、幹細胞動員因子など組織再生に作用する生理活性因子の分泌能が高い生物学的特性を示す。

【0156】

本発明のｕＰＡＲ陽性幹細胞は、組織構成細胞への分化能が高い多分化能を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【国際調査報告】