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特表2024-518665加齢に伴う疾患を防止および／または処置することにおける使用のためのＳＩＲＴ６のバリアント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-01
(54)【発明の名称】加齢に伴う疾患を防止および／または処置することにおける使用のためのＳＩＲＴ６のバリアント
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240423BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20240423BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240423BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240423BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240423BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240423BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240423BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240423BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240423BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240423BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240423BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240423BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240423BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240423BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20240423BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240423BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240423BHJP
A61P 27/12 20060101ALI20240423BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20240423BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240423BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20240423BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240423BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/47
C12N15/63 Z
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N15/869 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
A61K31/7088
A61K38/17
A61K48/00
A61K35/76
A61P25/00
A61P25/28
A61P35/00
A61P9/00
A61P3/04
A61P3/10
A61P3/06
A61P9/12
A61P27/02
A61P27/06
A61P27/12
A61P19/10
A61P19/02
A61P27/16
A61P43/00 105
C12P21/02 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515284
(86)(22)【出願日】2022-05-13
(85)【翻訳文提出日】2024-01-12
(86)【国際出願番号】 US2022029213
(87)【国際公開番号】W WO2022241228
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】63/188,573
(32)【優先日】2021-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523022295
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ロチェスター
(71)【出願人】
【識別番号】306018457
【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク
(71)【出願人】
【識別番号】515314797
【氏名又は名称】アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ゴルブノワ，ヴェラ
(72)【発明者】
【氏名】セルアノフ，アンドレイ
(72)【発明者】
【氏名】ソ，ヨウシン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE06
4B064CE08
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD14
4B065BD16
4B065BD18
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA02
4C084BA22
4C084CA18
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA341
4C084ZA342
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA421
4C084ZA422
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZA701
4C084ZA702
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZA971
4C084ZA972
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4C084ZB212
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4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC521
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4C086AA02
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4C086ZA97
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4C086ZB26
4C086ZC33
4C086ZC35
4C086ZC52
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087NA14
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4C087ZA16
4C087ZA33
4C087ZA34
4C087ZA36
4C087ZA42
4C087ZA59
4C087ZA96
4C087ZA97
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZC33
4C087ZC35
4C087ZC52
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA01
4H045GA10
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有するサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）のバリアントをコード化する単離核酸分子に関し、バリアントは、配列番号１の配列に関してＮ３０８Ｋ置換およびＡ３１３Ｓ置換を含む、またはそれらからなる群において選択される少なくとも１つの変異を有する。本発明は、個体の加齢、および／または老化、および／または生存期間の調節のための手段を提供する。本発明はさらに、細胞における二本鎖切断の修復のための手段を提供する。最後に本発明は、加齢に伴う疾患の予防および／または処置のための手段も提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有するサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）のバリアントをコード化する単離核酸分子であって、前記バリアントが、配列番号１の配列に関して置換Ｎ３０８Ｋおよび置換Ａ３１３Ｓを含む、またはそれらからなる群において選択される少なくとも１つの変異を有する、単離核酸分子。
【請求項2】
前記核酸分子が、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群において選択される配列の核酸分子である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項3】
請求項１または２に記載の核酸酸分子によりコード化された単離ポリペプチド。
【請求項4】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、またはそれらからなる群において選択される配列のポリペプチドである、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項5】
請求項１または２に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項6】
ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、エクソソーム関連ＡＡＶベクター（ｅｘｏ－ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項7】
請求項５または６に記載のベクターを含む懸濁液。
【請求項8】
前記細胞が、好ましくは請求項１もしくは２に記載の単離核酸分子、または請求項５もしくは６に記載のベクターをトランスフェクトされている、請求項３または４に記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項9】
（ｉ）請求項１もしくは２に記載の単離核酸分子、または請求項３もしくは４に記載の単離ポリペプチド、または請求項５もしくは６に記載のベクターと、（ｉｉ）薬学的に許容できる賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項10】
個体、好ましくは哺乳動物個体、より好ましくはヒト個体における、加齢、および／または老化、および／または生存期間の調節における、請求項１もしくは２に記載の単離核酸分子、または請求項３もしくは４に記載の単離ポリペプチド、または請求項５もしくは６に記載のベクターの使用。
【請求項11】
細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞における、二本鎖切断の修復における、請求項１もしくは２に記載の単離核酸分子、または請求項３もしくは４に記載の単離ポリペプチド、または請求項５もしくは６に記載のベクターの使用。
【請求項12】
加齢に伴う疾患の防止および／または処置における使用のための、請求項１もしくは２に記載の単離核酸分子、または請求項３もしくは４に記載の単離ポリペプチド、または請求項５もしくは６に記載のベクター。
【請求項13】
前記個体が、哺乳動物個体、好ましくはヒト個体である、請求項１２に記載の使用のための単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクター。
【請求項14】
前記加齢に伴う疾患が、早老症、ウェルナー症候群、神経変性疾患、アルツハイマー病、がん、心臓血管疾患、肥満、２型糖尿病、高コレステロール血症、高血圧、眼障害、白内障、緑内障、骨粗しょう症、血栓障害、関節炎、難聴および卒中を含む、またはそれらからなる群において選択される、請求項１２または１３に記載の使用のための単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクター。
【請求項15】
（ｉ）請求項１もしくは２に記載の単離核酸分子、または請求項３もしくは４に記載の単離ポリペプチド、または請求項４もしくは５に記載のベクターと、（ｉｉ）前記単離核酸分子、前記単離ポリペプチド、または前記ベクターを投与するための手段と、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
連邦政府の後援による研究または開発に関する表明。本発明は、米国国立衛生研究所により授与された政府助成金ＡＧ０５６２７８、ＡＧ０２７２３７、ＡＧ０４７２００によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0002】
発明の分野
本発明は、生存期間、長寿、および加齢に伴う疾患に関する。より詳細には本発明は、加齢の調節のための、および加齢に伴う疾患を処置および／または防止するための、サーチュイン６（ＳＩＲＴ６）のバリアント、およびその治療的使用に関する。
本発明は、生存期間、長寿、および加齢に伴う疾患に関する。より詳細には本発明は、加齢の調節のための、および加齢に伴う疾患を処置および／または防止するための、サーチュイン６（ＳＩＲＴ６）のバリアント、およびその治療的使用に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
１００歳まで生きることは、強力な遺伝的要素を有し、依然として極めて稀であり、先進国での発生率は、多くとも６０００人に１人である。ゲノムワイド関連試験からこれまでのところ、おそらく統計力が全体的に欠如しているために、ヒトの長寿に関連する重大なバイオマーカーとして同定されたのはＡＰＯＥのみである。
１００歳まで生きることは、強力な遺伝的要素を有し、依然として極めて稀であり、先進国での発生率は、多くとも６０００人に１人である。ゲノムワイド関連試験からこれまでのところ、おそらく統計力が全体的に欠如しているために、ヒトの長寿に関連する重大なバイオマーカーとして同定されたのはＡＰＯＥのみである。
【0004】
しかし、加齢に伴う疾患と称される数多くの疾患は、個体が高齢になると起こることが多い。
【0005】
そのような加齢に伴う疾患の例としては、例えば心臓血管疾患、卒中、高血圧、がん、２型糖尿病、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の認知症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、変形性関節症、骨粗しょう症、白内障、加齢黄斑変性症、難聴が挙げられる。
【0006】
現在、加齢に伴う疾患は、身体がＤＮＡ損傷を修復する、およびテロメアの完全性を維持する能力が低下した結果であると考えられている。
【0007】
今日まで、サーチュイン（ＳＩＲＴ）と呼ばれるタンパク質ファミリーは、ＤＮＡ損傷修復、テロメア完全性、老化、および長寿に関与する様々なメカニズムに関連している。
【0008】
ＳＩＲＴタンパク質のうち、ＳＩＲＴ６遺伝子によりコード化されるＳＩＲＴ６は、テロメア伸長に必要となるテロメア逆転写酵素に加え、脱アセチル化ヒストン３リジン９（Ｈ３Ｋ９）および脱アセチル化ヒストン３リジン５６（Ｈ３Ｋ５６）の発現を調節して、テロメア完全性の維持をもたらす。加えて、ＳＩＲＴ６遺伝子は、損傷部位に動員されて、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）―１、Ｋｕ７０、ＮＢＳ、およびウェルナー（ＷＲＮ）ヘリカーゼなどの修復タンパク質を脱アセチル化することを通してＤＮＡ修復を促進することが示された。特にＳＩＲＴ６は、転写調節因子として作用して、クロマチン構造を安定化することにより遺伝子発現を抑制する。
【0009】
さらに、ＳＩＲＴ６は、ＦＯＸＯおよびｐ５３などの種々のシグナル伝達分子の脱アセチル化を通して細胞老化を調整する。ＳＩＲＴ６は、細胞老化関連の遺伝子発現を修飾することにより、ＮＦκＢのＲｅｌＡサブユニットを調節する。最後に、ＳＩＲＴ６はまた、細胞障害を低減し、それにより早期老化を引き起こす損傷を減少させる。
【0010】
それゆえＳＩＲＴ６は、加齢に伴う疾患を防止および／または処置するための良好な標的を構成し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
加齢に伴う疾患を防止および／または処置する手段を提供することが、依然として求められている。特に、老化関連の障害、特に早期老化を防止および／または処置することが、求められている。早期老化を含む老化および長寿の短縮に関与するＤＮＡ損傷修復を改善することも、求められている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
概要
本発明の第一の態様は、配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有するサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）のバリアントをコード化する単離核酸分子に関し、該バリアントは、配列番号１の配列に関して置換Ｎ３０８Ｋおよび置換Ａ３１３Ｓを含む、またはそれらからなる群において選択される少なくとも１つの変異を有する。
本発明の第一の態様は、配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有するサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）のバリアントをコード化する単離核酸分子に関し、該バリアントは、配列番号１の配列に関して置換Ｎ３０８Ｋおよび置換Ａ３１３Ｓを含む、またはそれらからなる群において選択される少なくとも１つの変異を有する。
【0013】
幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群において選択される配列の核酸分子である。
【0014】
本発明の別の態様は、本明細書で定義された核酸分子によりコード化された単離ポリペプチドに関係する。
【0015】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、またはそれらからなる群において選択される配列のポリペプチドである。
【0016】
本発明のさらなる態様は、本明細書で定義された単離核酸分子を含むベクターに関する。
【0017】
幾つかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、エクソソーム関連ＡＡＶベクター（ｅｘｏ－ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである。
【0018】
一態様において、本発明は、本明細書で定義されたベクターを含む懸濁液に関する。
【0019】
本発明はまた、本明細書で定義されたポリペプチドを発現する細胞にも関し、該細胞は、好ましくは本明細書で定義された単離核酸分子またはベクターをトランスフェクトされている。
【0020】
本発明の別の態様は、（ｉ）本明細書で定義された単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクターと、（ｉｉ）薬学的に許容できる賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
【0021】
本発明は、個体、好ましくは哺乳動物個体、より好ましくはヒト個体において、加齢、および／または老化、および／または生存期間の調節における、本明細書で定義された単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクターの使用に関する。
【0022】
本発明のさらなる態様は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の二本鎖切断の修復における、本明細書で定義された単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクターの使用に関係する。
【0023】
幾つかの態様において、本発明はまた、加齢に伴う疾患の防止および／または処置における使用のための、本明細書で定義された単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクターに関する。
【0024】
特定の実施形態において、個体は、哺乳動物個体、好ましくはヒト個体である。
【0025】
幾つかの態様において、加齢に伴う疾患は、早老症、ウェルナー症候群、神経変性疾患、アルツハイマー病、がん、心臓血管疾患、肥満、２型糖尿病、高コレステロール血症、高血圧、眼障害、白内障、緑内障、骨粗しょう症、血栓障害、関節炎、難聴および卒中を含む、またはそれらからなる群において選択される。
【0026】
別の態様において、本発明はまた、（ｉ）本明細書で定義された単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクターと、（ｉｉ）単離核酸分子、単離ポリペプチド、またはベクターを投与するための手段と、を含むキットにも関する。
【0027】
定義
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する。
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する。
【0028】
数字の前にある場合の「約」は、前記数字の値の±１０％を意味する。用語「約」が指す値が具体的に、および好ましくは開示される値そのものでもあることが、理解されなければならない。
【0029】
「含む」は、「含有する」、「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」および「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味すると意図される。幾つかの実施形態において、用語「含む」は、用語「からなる」も包含する。
【0030】
「ＳＩＲＴ６」とも称される「サーチュイン６」は、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子番号５１５４８のポリペプチドを指すと意図され、非限定的に、ＮＡＤ依存性タンパク質デアセチラーゼサーチュイン６、調節タンパク質ＳＩＲ２ホモログ６、ＳＩＲ２様タンパク質６、ＳＩＲ２Ｌ６、サーチュイン（Ｓｉｌｅｎｔ Ｍａｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ２、Ｓ．セレビシエ、ホモログ）６、サーチュイン（Ｓｉｌｅｎｔ Ｍａｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ２ホモログ）６、Ｓｉｒ２関連タンパク質６型、サーチュイン６型およびＥＣ．２．３．１．２８６に関する。
【0031】
「単離」は、核酸分子またはポリペプチドを作製することを可能にする初期生物学的環境から取り出されたこの核酸分子またはポリペプチドを指す。実際には生物学的環境は、少なくとも１つの細胞、または１種もしくは複数の酵素（複数可）を含む。
【0032】
「ポリヌクレオチド」とも称される「核酸」は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖であり得る、またはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、１つまたは複数の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性のため、または他の理由で修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡも包含する。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの珍しい塩基が挙げられる。種々の修飾を、ＤＮＡおよびＲＮＡに行ってもよく、したがって「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、典型的には自然界に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態に加え、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと称されることの多い、相対的に短いポリヌクレオチドを包含する。
【0033】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または改変ペプチド結合、即ちペプチドアイソステアにより互いに接続された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、通常ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖と、一般にはタンパク質と称される長鎖と、の両方を指す。ポリペプチドは、２０の遺伝子コード化アミノ酸残基以外のアミノ酸残基を含有してもよい。
【0034】
「加齢に伴う疾患」は、高齢または早期老化の個体と相関し、その有病率が、一般集団で観察される平均有病率を超える生理学的または病理学的状態を指す。加齢に伴う疾患の非限定的例としては、早老症、ウェルナー症候群、神経変性疾患、心臓血管疾患、卒中、高血圧、がん、２型糖尿病、パーキンソン病、認知症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、変形性関節症、骨粗しょう症、白内障、加齢黄斑変性症、難聴、および同様の疾患が挙げられる。
【0035】
「懸濁液」は、本発明による核酸分子、ポリペプチド、またはベクターなどの活性成分が、液体媒体中に浮遊している液体混合物を指す。
【0036】
「処置すること」、「処置」またな「緩和」は、目的が標的病理状態または障害、特に加齢に伴う疾患を防止または緩徐化（減弱）することである、治療的処置と予防的または防止的手段の両方を指す。処置を必要とするものとしては、前記障害を既に有するもの、および障害を発症しやすいもの、または障害が防止されるべきであるもの、が挙げられる。個体が、活性成分、特に本発明による核酸分子、ポリペプチド、またはベクターの治療量を受けた後、加齢に伴う疾患に関連する症状の１つまたは複数の観察可能および／または測定可能な低減または非存在を示す場合；疾病率および死亡率の低減を示す場合、ならびにクオリティオブライフの問題の改善を示す場合、その個体は、加齢に伴う疾患の処置に成功している。疾患において処置および改善の成功を評価するための上記パラメータは、医師または権限を与えられた職員によく知られた日常的手順により即座に測定可能である。
【0037】
「防止すること」は、加齢に伴う疾患、臓器、組織または細胞機能の欠損または非存在に関連する障害または状態の発病の機会、またはその少なくとも１つの有害作用もしくは症状が起こらないようにすること、および／または減少させることを指す。
【0038】
「治療有効量」は、標的に対して重大な負の、または有害な副作用を引き起こすことなく、（１）加齢に伴う疾患、障害もしくは状態の発病を遅延もしくは防止すること；（２）加齢に伴う疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の進行、増悪もしくは悪化を緩徐化もしくは停止させること；（３）加齢に伴う疾患、障害もしくは状態の症状の好転をもたらすこと；（４）加齢に伴う疾患、障害もしくは状態の重症度もしくは発生を低減すること；または（５）加齢に伴う疾患、障害もしくは状態を治癒すること、を目標とする活性成分のレベルまたは量を指す。治療有効量は、予防作用または防止作用のために加齢に伴う疾患、障害または状態の発病前に投与されてもよい。あるいはまたは追加として、治療有効量は、治療作用のために、加齢に伴う疾患、障害または状態の発病後に投与されてもよい。一実施形態において、活性成分の治療有効量は、加齢に伴う疾患、障害または状態の少なくとも１つの症状を低減するために有効な量である。
【0039】
「個体」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。一実施形態において、個体は、雄性である。別の実施形態において、個体は、雌性である。一実施形態において、個体は、医療を受けるために待機している、もしくは受けている、または医学的手順の対象であった／対象である／対象になる、またはがんの発症についてモニタリングされている、「患者」、即ち温血動物、より好ましくはヒトであってもよい。一実施形態において、個体は、成体（例えば、１８歳を超える対象）である。別の実施形態において、個体は、小児（例えば、１８歳未満の対象）である。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図3】図３は、精製ＳＩＲＴ６タンパク質の熱安定性を示すグラフである（ＷＴ：野生型ＳＩＲＴ６ポリペプチド；Ｃｅｎｔ：Ｎ３０８ＫおよびＡ３１３Ｓ変異を有するＳＩＲＴ６バリアントポリペプチド）。データは、各々がＲｏｃおよびＩｃｈｏｒの調製物からのＳＩＲＴ６を用いる２つの技術的反復を含む２つの反復実験を表す。
【図4】図４Ａ～４Ｂは、グラフの組合わせである。図４Ａは、データを方程式１にフィッティングすることによりＦＬＴシグナルから測定された蛍光寿命τを示す（方法を参照）。２種の異なるＳＩＲＴ６バイオセンサーのそれぞれが、ＧＦＰのみの対照と比較して蛍光寿命の減少を示し、高度に有意なＦＲＥＴを示している。Ｃ末端ＧＦＰを有するバイオセンサーと比較して、内部ＧＦＰバイオセンサーは、より大きな寿命変化を示す（ＦＲＥＴが大きいほど、距離Ｒが短く、構造の感度が大きい）。このバイオセンサーのｃｅｎｔＳＩＲＴ６もまた、試験した。それは、野生型ＳＩＲＴ６（１．７５±０．０１ｎｓ）と比較して寿命τの有意な増加を示す（１．９６±０．０２ｎｓ）。エラーバーは、ＳＥＭを示す（ｎ＝３～５）。図４Ｂは、ＦＲＥＴ効率Ｅおよび距離Ｒ（オングストロームÅでの）が寿命データから決定され（方法の方程式２および３）、内部ＧＦＰバイオセンサーの尺度である距離ＲがｃｅｎｔＳＩＲＴ６では有意に３．０±０．４Å大きいことが明らかとなった。
【図5】図５Ａ～５Ｂは、グラフの組合わせである。図５Ａは、異なる濃度のミリストイル化ペプチドを用いたミカエリス・メンテン反応速度パラメータを示す。図５Ｂは、異なる濃度のＮＡＤ＋を用いたミカエリス・メンテン反応速度パラメータを示す。反応を、三重測定で実施した。黒丸：ＷＴ；黒四角：Ｃｅｎｔ。
【図7】図７Ａ～７Ｂは、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルにおいて低減された活性を有する、Ｈ３Ｋ９ａｃ（図７Ａ）およびＨ３Ｋ１８ａｃ（図７Ｂ）残基でのデアセチラーゼ活性を示すプロットの組合わせである（デアセチラーゼ活性は、アセチル化化合物の相対的存在量と反比例する）。対応するアセチル化ヒストン残基で飽和されたデザイナーヒストンを、精製ＳＩＲＴ６および１ｍＭ ＮＡＤ＋と共に１時間インキュベートした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより分解し、アセチル特異的ヒストン抗体で染色した。全ての反応を、ｎ＝３で実行し；エラーバーは、ｓ．ｄ．を示す。統計値を、両側スチューデントｔ検定を用いて計算した。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図8】図８Ａ～８Ｂは、ＳＩＲＴ６バリアントのＨ３Ｋ９ａｃ（図８Ａ）およびＨ３Ｋ１８ａｃ（図８Ｂ）残基での脱アセチル化反応速度を示すプロットの組合わせである。デザイナーヒストンを、精製ＳＩＲＴ６および５ｍＭ ＮＡＤ＋と共に１時間インキュベートし、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分解し、アセチル特異的ヒストン抗体によるイムノブロットにより分析した。全ての反応を、ｎ＝３で実行し；エラーバーは、ｓ．ｄ．を示す。統計値を、両側スチューデントｔ検定を用いて計算した。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図9】図９Ａ～９Ｂは、ＨｅＬａ細胞から精製されたヒストンを有する精製ＳＩＲＴ６タンパク質のＨ３Ｋ９ａｃ（図９Ａ）およびＨ３Ｋ１８ａｃ（図８Ｂ）残基に関するインビトロ脱アセチル化速度を示すプロットの組合わせである。
【図10】図１０は、異なるＳＩＲＴ６アレルを発現するヒト細胞から精製されたヒストンＨ３ペプチドの定量的質量分析を示すプロットであり、アセチル化レベルの差が明らかにならなかった。相対的分画は、同じ領域のペプチド定量値全ての合計と比較した、Ｈ３Ｋ９－１７を包含するペプチドの部分を表す。３つの異なる調製物の平均および標準偏差を、プロットする。
【図11】図１１は、ウェスタンブロットにより評価したクマート誘導型ＳＩＲＴ６ヒト線維芽細胞における全細胞ヒストンＨ３アセチル化レベルを示す写真である。Ｃｕ：クマート；ＰＱ：パラコート。等価のＳＩＲＴ６タンパク質存在量に必要なクマート投与量を、ウェスタンブロットにより決定し、それに応じて各細胞株に投与した。
【図12】図１２は、放射線標識ＮＡＤ＋を用いたＳＩＲＴ６の自己リボシル化を示すプロットである。組換えＳＩＲＴ６を、Ｐ３２標識ＮＡＤ＋と共にインキュベートし、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動した。シグナルを、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒを用いて測定した。全ての実験を、少なくとも３回繰り返し；エラーバーは、ｓ．ｄ．を示す。有意性を、両側スチューデントｔ検定により計算した。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。アスタリスクは、ＨＰＲＴ対照に対する有意性を示す。
【図13】図１３は、ＮＡＤ＋の滴定によるＳＩＲＴ６の自己リボシル化を示すプロットである。ｍＡＤＰｒ特異性抗体を使用して、リボシル化された野生型ＳＩＲＴ６（黒丸）およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６（黒四角）タンパク質を検出した。プロットを、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウエアによってミカエリス・メンテン方程式にフィットした。ＫｍＮＡＤは、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６に関して１４２＋２９、および野生型ＳＩＲＴ６に関して１０６＋４５であり、最大シグナルは、野生型ＳＩＲＴ６と比較してｃｅｎｔＳＩＲＴ６では約２倍大きかった。
【図14】図１４は、ＳＩＲＴ６バリアントによるＰＡＲＰ１の活性化を示すグラフである。ＳＩＲＴ６タンパク質を、ヒトＰＡＲＰ１タンパク質と共にインキュベートした後、ポリＡＤＰｒ抗体によるイムノブロットにより分析した。ＰＡＲＰ１のポリＡＤＰｒ活性は、広範囲の生成物サイズをもたらす。活性を、ポリＡＤＰｒシグナルを各試料について全レーンで定量することにより評価した。全ての実験を、少なくとも３回繰り返し；エラーバーは、ｓ．ｄ．を示す。有意性を、両側スチューデントｔ検定により決定した。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。下のアスタリスクは、ＨＰＲＴ対照に対する有意性を示す。上のアスタリスクは、野生型ＳＩＲＴ６に対する有意性を示した。
【図15】図１５は、クマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞におけるＬＩＮＥ１発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。プライマーは、活性ＬＩＮＥ１レトロトランスポゾンのＬｉＭｄＡ１ファミリーからの５’（ＯＲＦ１：黒いバー）および３’（ＯＲＦ２：斜線のバー）の両方のＬＩＮＥ１配列を評価した。両方の領域の評価を行って、コーディング遺伝子における部分的挿入配列からの寄与を軽減した。全ての実験を、少なくとも３回繰り返した。エラーバーは、ｓ．ｄ．を示す。他に断りがなければ、有意性を、両側スチューデントｔ検定により決定した。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図16】図１６Ａ～１６Ｂは、ＳＩＲＴ６バリアントによるＮＨＥＪ（図１６Ａ）およびＨＲ（図１６Ｂ）の刺激を示すグラフの組合わせである。レポーター細胞株に、ＳＩＲＴ６発現プラスミド、Ｉ－Ｓｃｅ１プラスミド、およびＤｓＲｅｄトランスフェクション対照をコトランスフェクトした。７２時間の回復後に、ＧＦＰレポーターの再活性化を、フローサイトメトリーにより測定した。ＮＨＥＪまたはＨＲの刺激を、ＧＦＰ＋陽性細胞／ＤｓＲｅｄ＋陽性細胞の比率（ｒａｄｉｏ）として計算した。
【図17】図１７は、非誘導（白色バー）または誘導（黒色バー）条件下でのクマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞における基礎γＨ２ＡＸフォーカスを示すグラフである。フォーカスを、条件ごとに少なくとも８０細胞でスコアづけした。
【図18】図１８は、クマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞におけるＤＮＡ修復反応速度を示すプロットである。細胞を、スライド上で成長させ、２Ｇｙガンマ線を照射した後、γＨ２ＡＸに関して免疫染色した。放射線照射は、細胞がスライド上で７５％コンフルエンシーになった時に実行した。細胞を、固定し、フォーカスを、ｔ＝照射後０．５時間、２時間、４時間、６時間、および２４時間でスコアづけした。フォーカスを、各時点で遺伝子型ごとに少なくとも８０個の細胞においてスコアづけした。アスタリスクは、野生型ＳＩＲＴ６からの有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図19】図１９Ａ～１９Ｂは、酸化ストレス抵抗性を示すプロットの組合わせである。クマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞を、ＳＩＲＴ６発現に関して誘導し、パラコートに２４時間曝露した。抵抗性を、曝露後４８時間目のアポトーシス染色により決定した。
【図20】図２０Ａ～２０Ｃは、グラフの組合わせである。図２０Ａは、ＳＩＲＴ６バリアントでのトランスフェクションの後の接着細胞の数を示している。細胞に、異なるＳＩＲＴ６アレルをコード化するＳＩＲＴ６プラスミドをトランスフェクトし、細胞数を、７２時間後に計数した。ＨＣＡ２は、正常なヒト包皮線維芽細胞である。ａ：対照（ＣＴ）；ｂ：ＷＴ；ｃ：Ｎ３０８Ｋ ＳＩＲＴ６バリアント；ｄ：Ａ３１３Ｓ ＳＩＲＴ６バリアント；ｅ：Ｃｅｎｔ（Ｎ３０８Ｋ Ａ３１３Ｓバリアント）。アスタリスクは、野生型ＳＩＲＴ６からの有意差を示す（ｐ＜０．０５）。図２０Ｂ～２０Ｃは、トランスフェクションの４８時間後のＨＴ１０８０（図２０Ｂ）およびＨｅＬａ（図２０Ｃ）がん細胞株のアポトーシス染色を示している。細胞を、アネキシンＶ／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。有意性を、二元配置分散分析により決定した。全ての実験を、少なくとも３回繰り返した。エラーバーは、ｓ．ｄ．を表す。統計値は、他に断りがなければ、両側スチューデントｔ検定により決定された。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図21】図２１は、野生型（ＷＴ）またはｃｅｎｔＳＩＲＴ６（Ｃｅｎｔ）アレルを発現するクマート誘導型線維芽細胞からの溶解物の、ＳＩＲＴ６、ＬＭＮＡ、およびｍＡＤＰｒに対する抗体による免疫沈降（ＩＰ）実験を示す写真である。ＳＩＲＴ６発現を、ＩＰの４８時間前に誘導した。ＩＰ実験を、３回繰り返した。ＩＰの代表的な１セットを示す。
【図22】図２２は、ＳＩＲＴ６ ＩＰの後のＬＭＮＡに対する抗体によるウェスタンブロットを示すグラフであり、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６（Ｃｅｎｔ）は、野生型ＳＩＲＴ６（ＷＴ）と比較して増強されたＬＭＮＡとの相互作用を示す。図２１に示されたＩＰ実験の定量。
【図23】図２３は、クマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞からのＬＭＮＡ ＩＰの後のＳＩＲＴ６への抗体でのウェスタンブロットを示すグラフであり、ＬＭＮＡは、野生型（ＷＴ）と比較して増強された、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６（Ｃｅｎｔ）との相互作用を示す。図２１に示されたＩＰ実験の定量。
【図24】図２４は、図２１に示されたＩＰ実験の定量を示すグラフである。クマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞からのＳＩＲＴ６ ＩＰの後のｍＡＤＰｒ残基に対する抗体によるウェスタンブロットは、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６が増強されたｍＡＤＰｒを呈することが示す。
【図25】図２５は、図２１に示されたＩＰ実験の定量を示すグラフである。クマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞からの抽出物を用いたｍＡＤＰｒ抗体によるＩＰの後のＬＭＮＡに対する抗体によるウェスタンブロットは、ＬＭＮＡが野生型（ＷＴ）と比較してｃｅｎｔＳＩＲＴ６（Ｃｅｎｔ）を発現する細胞において増強されたｍＡＤＰｒシグナルを呈することを示す。
【図26】図２６は、ＳＩＲＴ６およびＬＭＮＡのタンパク質－タンパク質相互作用プロファイルを示すスキームである。ＳＩＲＴ６およびＬＭＮＡは、暗灰色で示し、２つの対立する相互作用ノードの中の中心点として強調する。第三のノード（上の中央）は、ＳＩＲＴ６およびＬＭＮＡにより共有される相互作用パートナーを示す。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルによりその相互作用が増強されたタンパク質を、淡灰色で示す。野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルと等しく相互作用したタンパク質は、無着色である。Ｈ１５は、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６との相互作用の増加と、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルの存在下でのＬＭＮＡとの相互作用の減少を示したため、特別な例である。過去の報告でリボシル化されることが知られるタンパク質を、六角形で示す。
【図27】図２７Ａ～２７Ｂは、ヒストグラムの組合わせである。図２７Ａは、クマート誘導型テロメラーゼ不死化ＨＣＡ２ヒト線維芽細胞株におけるＳＩＲＴ６発現を示す。ＳＩＲＴ６アレルを、ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＳＩＲＴ６ノックアウトＨＣＡ２細胞のゲノムの中に組み込んだ。異なる投与量のクマートおよび得られたＳＩＲＴ６存在量を使用して、各細胞株の均等なＳＩＲＴ６発現を実現するのに必要な用量を決定した。細胞を、計数および総タンパク質により正規化した。クマート誘導型ＳＩＲＴ６線維芽細胞を利用するその後の実験を、これらのデータを用いてＳＩＲＴ６存在量に関して制御した。各細胞株について、枠は、等価の発現のための対応するクマート投与量を示す（ＷＴ＝６０μｇ／ｍｌ、Ｎ３０８Ｋ＝３０μｇ／ｍｌ、Ａ３１３Ｓ＝３０μｇ／ｍｌ、およびＣｅｎｔ＝７．５μｇ／ｍｌ）。これらの濃度を、これらの細胞による実験で用いた。図２７Ｂは、クマートの標準化投与量を利用したＳＩＲＴ６のｑＲＴ－ＰＣＲ発現分析を示す（投与量は、図２７Ａの枠に対応する）。
【図28】図２８は、ビオチン標識ＮＡＤ＋を用いたＳＩＲＴ６の自己リボシル化を示すヒストグラムである。組換えＳＩＲＴ６を、ビオチン残基とコンジュゲートしたＮＡＤ＋と共にインキュベートし、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて泳動させた。各アレルを、０時間の時点と比較して評価し、ＳＩＲＴ６総タンパク質負荷対照に対して正規化した。
【図29】２９Ａ～２９Ｆは、ＣＲＩＳＰＲヒトＭＳＣ細胞株の分析を示す写真、グラフおよびヒストグラムの組合せである。図２９Ａおよび２９Ｂは、野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ＃１」および「Ｃｅｎｔ＃２」）ｈＭＳＣにおけるＤＮＡ二本鎖修復効率を示す。ＤＳＢ修復レポーター構築物を、ｈＭＳＣに組み込んだ。７２時間の回復後に、ＧＦＰレポーターの再活性化を、フローサイトメトリーにより測定した。ＮＨＥＪまたはＨＲの刺激を、ＧＦＰ＋陽性細胞／ＤｓＲｅｄ＋陽性細胞の比率（ｒａｄｉｏ）として計算した。図２９Ｃは、ＭＭＳ処置された野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」）ｈＭＳＣにおける細胞生存率を示す。ｈＭＳＣを、ＭＭＳによって４８時間処置し、細胞生存率を、ＭＴＳアッセイにより評価した。データを、対照群（０ｍＭ）に対して正規化した。ｎ＝６。図２９Ｄは、ＭＭＳ処置を行った野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」）ｈＭＳＣにおける５３ＢＰ１の免疫蛍光染色を示す。ＭＭＳ（０．２５ｍＭ）処置を行った、または行わない野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６ ｈＭＳＣの核における５３ＢＰ１フォーカスの数を、定量した。１０の画像からの６００を超える核を、スコアづけしたされた。図２９Ｅは、野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ＃１」および「Ｃｅｎｔ＃２」）ｈＭＳＣ（Ｐ２）におけるＳＩＲＴ６発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。データを、アクチンに対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表し、ＮＳは、有意でないことを表す。図２９Ｆは、この定量を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．を表す。有意性を、両側スチューデントｔ検定により決定した。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図30】図３０Ａ～３０Ｃは、ヒトウェルナー症候群不死化線維芽細胞におけるＳＩＲＴ６（野生型、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８ＫまたはｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」））の過剰発現を示す写真およびヒストグラムの組合わせである。図３０Ａは、２４時間、４８時間および７２時間のＨｏｅｃｈｓｔ蛍光染色を利用した同じ細胞の増殖アッセイを示す。データを、平均＋ＳＥＭとして示す。図３０Ｂは、トランスフェクトされていない対照細胞と比較した場合の、トランスフェクトされた細胞全てで有意差を示したテロメア長アッセイを示す（＊＝対照と比較して）。図３０Ｃは、テロメラーゼ活性アッセイが、トランスフェクトされていない対照細胞と比較した場合にｃｅｎｔＳＩＲＴ６群（「Ｃｅｎｔ」）における有意な低下を同定したことを示す。
【図31】図３１Ａ～３１Ｂは、ＳＩＲＴ６過剰発現（野生型、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８ＫまたはｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」））がＬＶトランスフェクションの１２日後、およびハイグロマイシン選択の３日後に、肝細胞がん細胞株において細胞死を誘導することを示す写真およびヒストグラムの組合わせである。図３１Ａは、ヒト肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞において、ＳＩＲＴ６ ＷＴ／ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」）過剰発現が、致死性であり、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」）ではより大きな影響が観察されたことを示す。図３１Ｂは、図３１Ａに例示された細胞生存率の定量を表す。
【図32】図３２は、ＳＩＲＴ６過剰発現（野生型、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８ＫまたはｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」））が、３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞の分化を増加させることを示すグラフである（免疫蛍光の定量）。
【図33】図３３Ａ～３３Ｅは、肝星細胞（ＬＸ２）におけるＳＩＲＴ６過剰発現（野生型、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８ＫまたはｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」））の影響を示す写真およびヒストグラムの組合せである。図３３Ａは、ＳＩＲＴ６（ＷＴまたは変異体）のトランスフェクションの２４時間後のＬＸ２細胞の生存率を示す。図３３Ｂ～３３Ｅは、ビメンチン（図３３Ｂ）、ＴＩＭＰ１（図３３Ｃ）、ＣＯＬ１Ａ１（図３３Ｄ）およびαＳＭＡ（図３３Ｅ）についての２４ｈのＴＧＦ－β ２０ｎｇ処置後のＳＩＲＴ６を過剰発現した、または過剰発現していないＬＸ２細胞における遺伝子発現（ｍＲＮＡ）を示す（Ｎ＝４;＊＝各対照と比較してｐ＜０．０５）。
【図34】図３４Ａ～３４Ｃは、不死化ヒト肝細胞（ＩＨＨ）およびヒト肝星細胞（ＬＸ２）からから作製されたスフェロイドでのＳＩＲＴ６過剰発現（ＷＴ、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ、およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」）の影響を示すヒストグラムの組合わせである。スフェロイドは、ＩＨＨ細胞および全細胞塊の５％のＬＸ２から形成される。図３４Ａは、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６（「Ｃｅｎｔ」）を過剰発現する、または過剰発現しないＩＨＨ－ＬＸ２スフェロイドにおけるコラーゲンＩの定量を示す（免疫蛍光の定量）。図３４Ｂ～３４Ｃは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の非存在下（図３４Ｂ）、またはＦＦＡの存在下（図３４Ｃ）、のどちらかでのαＳＭＡ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＩＭＰ１、ビメンチンおよびＭＭＰ２に関してＧＡＰＤＨと比較したＩＨＨ－ＬＸ２スフェロイド遺伝子発現を示す（各対照に対比して＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【0041】
詳細な記載
本発明は、本明細書において、アシュケナージ系ユダヤ人（ＡＪ）百寿者のコホートのゲノムに豊富に存在する希少な長寿遺伝子バリアントを直接同定するための代替の候補機能関連アプローチを使用した。
本発明は、本明細書において、アシュケナージ系ユダヤ人（ＡＪ）百寿者のコホートのゲノムに豊富に存在する希少な長寿遺伝子バリアントを直接同定するための代替の候補機能関連アプローチを使用した。
【0042】
加齢の駆動因子であるＤＮＡ損傷の過去の証拠に基づき、本発明者らは、４９６人のＡＪ百寿者および５７２人の対照において、主要な長寿保証システムであるゲノム維持（ＧＭ）に関与する３０１の遺伝子の標的化シーケンシングを実施した。
【0043】
百寿者のゲノムに豊富に存在する名目上有意なミスセンス遺伝子バリアントを含有する１０種のＧＭ遺伝子のうち、ＳＩＲＴ６、つまりデアシラーゼおよびモノＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ｍＡＤＰｒ）酵素－６は、モデル生物におけるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復および長寿の両方に関与した。
【0044】
本発明者らは、さらなる機能分析のために同じアレルにおける２つの遺伝的に連鎖するバリアント（Ｎ３０８ＫおよびＡ３１３Ｓ）を選択した。このＳＩＲＴ６百寿者アレル（ｃｅｎｔＳＩＲＴ６）の特徴づけから、ＳＩＲＴ６百寿者アレルが野生型アレルと比較してＬＩＮＥ１レトロトランスポゾンのより強力な抑制因子であり、ＤＮＡ ＤＳＢ修復の刺激の増強、およびよりロバストながん細胞殺滅を付与することが実証された。
【0045】
驚くべきことに、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、野生型と比較してより弱いデアセチラーゼ活性を呈した。反対に、そのｍＡＤＰｒ活性は、強力に増強された。ＦＲＥＴに基づく分析から、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がよりオープンなコンフォメーションを有することが実証された。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、ラミンＡ／Ｃ（ＬＭＮＡ）とより強い相互作用を示し、これはＬＭＮＡの増強されたリボシル化と相関した。
【0046】
本発明は、配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有するサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）のバリアントをコード化する単離核酸分子に関し、該バリアントは、配列番号１の配列に関してＮ３０８Ｋ置換およびＡ３１３Ｓ置換およびＡ３１３Ｓ置換を含む、またはそれらからなる群において選択される少なくとも１つの変異を有する。
【0047】
本明細書で用いられる表現「少なくとも７５％の同一性」は、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を包含する。
【0048】
２つのポリペプチドの同一性のレベルは、最先端技術で利用可能な公知のアルゴリズムの任意の１つを用いることにより実施され得る。例示として、アミノ酸同一性のパーセンテージを、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗソフトウエア（バージョン１．８３）を用いて決定してもよく、そのパラメータは、以下のとおり設定される：
－ スロー／正確なアライメントでは：（１）ギャップ開始ペナルティ：１０．００；（２）ギャップ延長ペナルティ：０．１；（３）タンパク質重み行列；ＢＬＯＳＵＭ；
－ ファスト／近似アライメントでは：（４）ギャップペナルティ：３；（５）Ｋタプル（ワード）サイズ：１；（６）最適な対角線の数：５；（７）ウィンドウのサイズ：５；（８）評価方法：パーセント。
－ スロー／正確なアライメントでは：（１）ギャップ開始ペナルティ：１０．００；（２）ギャップ延長ペナルティ：０．１；（３）タンパク質重み行列；ＢＬＯＳＵＭ；
－ ファスト／近似アライメントでは：（４）ギャップペナルティ：３；（５）Ｋタプル（ワード）サイズ：１；（６）最適な対角線の数：５；（７）ウィンドウのサイズ：５；（８）評価方法：パーセント。
【0049】
特定の実施形態において、単離核酸分子は、配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＳＩＲＴ６のバリアントをコード化し、該バリアントは、配列番号１の配列に関してＮ３０８Ｋ置換およびＡ３１３Ｓ置換を含む、またはそれらからなる群において選択される少なくと１つの変異を有する。
【0050】
本発明の範囲内では、配列番号１の配列は、野生型ＳＩＲＴ６ポリペプチドの３６１アミノ酸残基の配列を指す。実際に、置換Ｎ３０８ＫおよびＡ３１３Ｓは、それぞれＳＩＲＴ６ポリペプチド内の３０８位の天然に存在するＡｓｎ（Ｎ）アミノ酸残基、およびＳＩＲＴ６ポリペプチド内の３１３位のＳｅｒ（Ｓ）アミノ酸残基をコード化するコドンの変異を指す。
【0051】
本発明の範囲内で、配列番号５の配列は、野生型ＳＩＲＴ６ポリペプチドの１，０６８ヌクレオチド（ｂｐ）の配列を指す。
【0052】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＴ６ポリペプチド内の３０８位の天然に存在するＡｓｎ（Ｎ）アミノ酸残基は、配列番号５の９２２～９２４位のコドン「ａａｃ」によりコード化される。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＴ６ポリペプチド内の３１３位の天然に存在するＳｅｒ（Ｓ）アミノ酸残基は、配列番号５の９３７～９３９位のコドン「ｇｃｃ」によりコード化される。
【0053】
特定の実施形態において、Ｎ３０８Ｋ置換は、配列番号５の９２２～９２４位のコドン「ａａｃ」の、コドン「ａａｇ」またはコドン「ａａａ」への、好ましくはコドン「ａａｇ」への変異により表される。言い換えれば、Ｎ３０８Ｋ置換は、配列番号５の９２４位のヌクレオチド「ｃ」の、ヌクレオチド「ｇ」またはヌクレオチド「ａ」、好ましくはヌクレオチド「ｇ」への変異により表される。
【0054】
特定の実施形態において、Ａ３１３Ｓ置換は、配列番号５の９３７～９３９位のコドン「ｇｃｃ」の、コドン「ｔｃｃ」、「ｔｃｔ」、「ｔｃａ」および「ｔｃｇ」からなる群において選択されるコドン、好ましくはコドン「ｔｃｃ」への変異により表される。言い換えれば、Ａ３１３Ｓ置換は、配列番号５の９３７位のヌクレオチド「ｇ」の、ヌクレオチド「ｔ」への変異；配列番号５の９３７位のヌクレオチド「ｇ」の、ヌクレオチド「ｔ」への、および配列番号５の９３９位のヌクレオチド「ｃ」の、ヌクレオチド「ｔ」への変異；配列番号５の９３７位のヌクレオチド「ｇ」の、ヌクレオチド「ｔ」への変異、および配列番号５の９３９位のヌクレオチド「ｃ」の、ヌクレオチド「ａ」への変異；ならびに配列番号５の９３７位のヌクレオチド「ｇ」の、ヌクレオチド「ｔ」への、および配列番号５の９３９位のヌクレオチド「ｃ」の、ヌクレオチド「ｇ」への変異、からなる群において選択される１つまたは２つの変異（複数可）により表される。
【0055】
幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群において選択される配列の核酸分子である。
【0056】
本明細書で用いられる配列番号６の配列は、Ｎ３０８Ｋ置換、特に配列番号５の９２２～９２４位のコドン「ａａｃ」の、コドン「ａａｇ」への変異を有するＳＩＲＴ６のバリアントの核酸配列を指す。
【0057】
本明細書で用いられる配列番号７の配列は、Ａ３１３Ｓ置換、特に配列番号５の９２２～９２４位のコドン「ｇｃｃ」の、コドン「ｔｃｃ」への変異を有するＳＩＲＴ６のバリアントの核酸配列を指す。
【0058】
本明細書で用いられる配列番号８の配列は、Ｎ３０８ＫおよびＡ３１３Ｓ置換、特に配列番号５の９２２～９２４位のコドン「ａａｃ」の、コドン「ａａｇ」への変異、および配列番号５の９２２～９２４位のコドン「ｇｃｃ」の、コドン「ｔｃｃ」への変異を有するＳＩＲＴ６のバリアントの核酸配列を指す。
【0059】
幾つかの実施形態において、本明細書に定義された単離核酸分子によりコード化されたＳＩＲＴ６のバリアントは、デアシラーゼおよび／またはモノＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ｍＡＤＰｒ）活性を有する。
【0060】
実際にはデアシラーゼ活性およびモノＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ｍＡＤＰｒ）活性は、最先端技術からいずれか適切な方法、またはそれから適合された方法に従ってアッセイされ得る。例示として、デアシラーゼ活性は、ＮＡＤ＋、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴの存在下でＳＩＲＴ６のバリアントをインビトロでヒストンと接触させること、ならびに抗Ｈ３Ｋ９ａｃおよび抗Ｈ３Ｋ１８ａｃ抗体を用いてウェスタンブロット解析を実施すること、によりアッセイされ得る。例示として、モノＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ｍＡＤＰｒ）活性は、ＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮＡＤ＋、ＤＴＴ、サケ精子ＤＮＡの存在下でＳＩＲＴ６のバリアントをインビトロでＰＡＲＰ１と接触させること、ならびに抗ＰＡＤＰＲ抗体を用いてウェスタンブロット解析を実施することによりアッセイされ得る。
【0061】
特定の実施形態において、ＳＩＲＴ６のバリアントは、野生型ＳＩＲＴ６（配列番号１の配列）と比較して、多くとも約９０％、好ましくは多くとも約５０％、より好ましくは多くとも約２５％のデアシラーゼ活性を有する。本発明の範囲内では、表現「多くとも約９０％」は、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％またはそれ未満を包含する。
【0062】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＴ６のバリアントは、野生型ＳＩＲＴ６（配列番号１の配列）と比較して、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも約２００％、より好ましくは少なくとも約３００％のモノＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（ｍＡＤＰｒ）活性を有する。本発明の範囲内では、表現「少なくとも約１００％」は、約１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、またはより多くを包含する。
【0063】
本発明の別の態様は、本発明による核酸分子によりコード化された単離ポリペプチドに関する。
【0064】
本発明は、配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有するＳＩＲＴ６のバリアントである単離ポリペプチドに関し、該バリアントは、配列番号１の配列に関して置換Ｎ３０８Ｋおよび置換Ａ３１３Ｓを含む、またはそれらからなる群において選択される少なくとも１つの変異を有する。
【0065】
本明細書で用いられる表現「少なくとも７５％の同一性」は、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の同一性を包含する。
【0066】
特定の実施形態において、ＳＩＲＴ６のバリアントである単離ポリペプチドは、配列番号１の配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、バリアントは、配列番号１の配列に関して置換Ｎ３０８Ｋおよび置換Ａ３１３Ｓを含む、またはそれらからなる群において選択される少なくと１つの変異を有する。
【0067】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、またはそれからなる群において選択される配列のポリペプチドである。
【0068】
本明細書で用いられる配列番号２の配列は、Ｎ３０８Ｋ置換を有するＳＩＲＴ６のバリアントのアミノ酸配列を指す。幾つかの実施形態において、配列配列番号２のポリペプチドは、配列番号６の配列の核酸分子によりコード化される。
【0069】
本明細書で用いられる配列番号３の配列は、Ａ３１３Ｓ置換を有するＳＩＲＴ６のバリアントのアミノ酸配列を指す。幾つかの実施形態において、配列番号３の配列のポリペプチドは、配列番号７の配列の核酸分子によりコード化される。
【0070】
本明細書で用いられる配列番号４の配列は、Ｎ３０８ＫおよびＡ３１３Ｓ置換を有するＳＩＲＴ６のバリアントのアミノ酸配列を指す。幾つかの実施形態において、配列番号４の配列のポリペプチドは、配列番号８の配列の核酸分子によりコード化される。
【0071】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。本明細書で用いられる用語「組換えポリペプチド」は、操作された核酸によりコード化されて、前記操作された核酸の微生物への形質転換、または合成の目的の真核細胞内でのトランスフェクションにより合成されるポリペプチドを指す。
【0072】
本発明のさらなる態様は、本発明による単離核酸分子を含むベクターに関する。
【0073】
幾つかの実施形態において、ベクターは、ミニサークル核酸、プラスミド、コスミド、または細菌人工染色体である。
【0074】
本明細書で用いられる用語「ミニサークル核酸」は、単に遺伝子発現カセットを含み、標準プラスミドからのウイルスおよび／または細菌バックボーンＤＮＡエレメントを含まない非ウイルスベクターを包含する。
【0075】
本明細書で用いられる用語「プラスミド」は、最大約１５ｋｂ（即ち、１５，０００塩基対）のＤＮＡフラグメントのコピーを作製および／または改変するために分子生物学におけるクローニングベクターとして用いられ得る環状二本鎖ＤＮＡ分子として最も一般的に見出される小さなゲノム外ＤＮＡ分子を指すことが意図される。プラスミドはまた、プロモーター配列の下流でプラスミド内に見出される核酸配列によりコード化された多量の目的のタンパク質を生成するための発現ベクターとしても用いられ得る。
【0076】
本明細書で用いられる用語「コスミド」は、ラムダファージからのｃｏｓ配列を含有して、ファージヘッドへのコスミドのパッケージング、および続く細菌細胞の感染を可能にするハイブリッドプラスミドを指し、コスミドは、環化され、プラスミドとして複製され得る。コスミドは、典型的には約３２～５２ｋｂのサイズ範囲のＤＮＡフラグメントのためのクローニングベクターとして用いられる。
【0077】
本明細書で用いられる用語「細菌人工染色体」または「ＢＡＣ」は、細菌細胞の分裂後に前記ゲノム外ＤＮＡ分子の均等分割を可能にする機能的稔性プラスミドに基づくゲノム外核酸分子を指す。ＢＡＣは、典型的には約１５０～３５０ｋｂのサイズ範囲のＤＮＡフラグメントのためのクローニングベクターとして用いられる。
【0078】
実際に、ＳＩＲＴ６のバリアントをコード化する核酸分子を含むベクターは、特に核酸ベクターへの目的の核酸のクローニングから得られる、プラスミドの形態であり得る。幾つかの実施形態において、非限定的で適切な核酸ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＥＴベクター、ｐＥＴｄｕｅｔベクター、ｐＧＢＭベクター、ｐＢＡＤベクター、ｐＵＣベクターである。一実施形態において、プラスミドは、低コピー数プラスミドである。一実施形態において、プラスミドは、高コピー数プラスミドである。
【0079】
幾つかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；エクソソーム関連ＡＡＶ（ｅｘｏ－ＡＡＶ）；アルファウイルス；ヘルペスウイルス；例えばレンチウイルスまたは非組み込み型レンチウイスルなどのレトロウイルス；ワクシニアウイルス；バキュロウイルス；または、例えばＢ型肝炎ウイスル、パルボウイルス科；レトロウイルス科；フラビウイルス科；パラミクソウイルス科もしくはバクテリオファージなどレトロウイルスに由来する粒子などのウイルス様粒子を含む、またはそれからなる群において選択される。
【0080】
特定の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、エクソソーム関連ＡＡＶベクター（ｅｘｏ－ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである。
【0081】
幾つかの実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、ＡＡＶ血清型２またはＡＡＶ血清型５である。
【0082】
特定の実施形態において、ベクター、特にウイルスベクターは、ｅｘｏ－ＡＡＶベクターである。本明細書で用いられるｅｘｏ－ＡＡＶは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはその一部が細胞外小胞（エクソソームとも称される）に会合していて、ＡＡＶベクターが、細胞外小胞の中に部分的に融合、埋め込まれるまたは内在化されている、ベクターを指す。細胞外小胞は、例えば標的化目的のために、特異的タンパク質またはマーカーを発現してもよい。
【0083】
特定の実施形態において、ベクター、特にウイルスベクターは、血液脳関門を通過しない。幾つかの代替的実施形態において、ベクター、特にウイルスベクターは、血液脳関門を通過する。実際には、ウイルスベクターの選択は、標的化される臓器または組織に依存し得る。例えば脳がん、神経変性疾患、アルツハイマー病およびプロジェリアの場合、好ましくは血液脳関門を通過するベクターが選択され得る。反対に、肥満、心臓血管疾患、２型糖尿病、高コレステロール血症、眼科疾患の場合、好ましくは血液脳関門を通過しないベクターが選択され得る。
【0084】
実際には、ベクター、特にウイルスベクターが、血液／脳関門を通過するかどうかを評価することは、最先端技術から認識された任意の適切な方法、またはそれから適合させた方法により実施され得る。例示としてこの評価は、血液／脳関門透過性の２種の至適基準の実験的手段、即ち（１）血中濃度で除算した脳内化合物濃度を測定することを意図するＬｏｇＢＢ；および（２）透過性と表面積の積を測定するＬｏｇＰＳ、の一方の手段により実施され得る。
【0085】
幾つかの実施形態において、ベクター、特にウイルスベクターは、哺乳動物個体、好ましくはヒト個体における遺伝子発現に適したプロモーター配列を含む。
【0086】
哺乳動物個体、好ましくはヒト個体における遺伝子発現に適したプロモーター配列の非限定的例としては、ＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）プロモーター、ＥＦ１ａ（ヒト伸長因子１アルファ）プロモーター、ＳＶ４０（サル空胞化ウイルス４０）プロモーター、ＰＧＫ１（フォスフォグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、Ｕｂｃ（ヒトユビキチンＣ）プロモーター、および同様のものが挙げられる。
【0087】
特定の実施形態において、プロモーター配列は、好ましくはＣＭＶプロモーターである。
【0088】
幾つかの実施形態において、ベクター、特にウイルスベクターはさらに、標的レシピエント細胞内への本発明による核酸分子によりコード化されたポリペプチドの核局在化を容易にする核酸配列を含む。実際にはこれらの核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、最先端技術において多く議論されている。
【0089】
特定の実施形態において、ベクター、特にウイルスベクターは、Ｓ／ＭＡＲ（足場／マトリックス付着領域）核酸配列を含んでもよい。本明細書で用いられる、ＳＡＲ（足場付着領域の場合）またはＭＡＲ（マトリックス結合領域の場合）とも称されるＳ／ＭＡＲ核酸配列は、自然界で真核細胞染色体のＤＮＡ内で見出され、核マトリックスへの付着を促進する、核酸配列を指すと意図される。幾つかの実施形態において、Ｓ／ＭＡＲ核酸配列は、複製開始点として役立ち得る。実際には、Ｓ／ＭＡＲ核酸配列を含むベクターは、トランスフェクトされた細胞において染色体外因子として挙動し得て、有利には子孫に伝達され得る。例示として、適切なＳ／ＭＡＲ核酸配列は、Ｎａｒｗａｄｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１９； ４７（１４）：７２４７－７２６１）に記載されたとおり決定され得る。
【0090】
一態様において、本発明は、本発明によるベクターを含む懸濁液に関する。
【0091】
幾つかの実施形態において、懸濁液はさらに、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合わせからなる群から選択される１種または複数の成分を含む流体を含む。
【0092】
特定の実施形態において、懸濁液は、静脈内注入のために製剤化される。実際には、静脈内注入のために製剤化される懸濁液は、生理食塩水（例えば、０．９％ＮａＣｌ）；乳酸リンゲル液；５％デキストロース；例えばアルブミンなどのコロイド；同様のもの；およびそれらの任意の組合わせを含んでもよい。
【0093】
一態様において、本発明は、ポリペプチドを発現する細胞に関係し、細胞は、好ましくは本発明による単離核酸分子またはベクターをトランスフェクトされている。
【0094】
特定の実施形態において、細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞である。本明細書で用いられる「哺乳動物細胞」は、非ヒト哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。
【0095】
幾つかの実施形態において、細胞は、神経細胞、骨細胞、乳房細胞、赤血球、白血球、軟骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、皮膚細胞、筋細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、前立腺細胞、子宮頸部細胞、卵巣細胞、肺細胞、網膜細胞、結膜細胞、角膜細胞、脂肪細胞、および同様のものを含む、またはそれらからなる群において選択される。
【0096】
本発明による細胞は、本発明による単離核酸分子をトランスフェクトされていること、または本発明による単離核酸分子が形質導入されていること、または本発明による核酸分子を含有するベクターもしくは懸濁液と接触していることが、理解されなければならない。それゆえ細胞は、ゲノムに組み込まれた、または組み込まれていない核酸分子を含有する。実際には、ベクターは発現系であるため、ＳＩＲＴ６のバリアントをコード化する核酸分子は、細胞内に、発現を可能にする形態で、その最終的な場所、即ち細胞核および細胞質に存在する。
【0097】
本発明の別の態様は、（ｉ）本発明による単離核酸分子、または単離ポリペプチド、またはベクターと、（ｉｉ）薬学的に許容できる賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
【0098】
幾つかの実施形態において、本発明による適切な薬学的に許容できる担体としては、あらゆる従来の溶媒、分散媒、充填剤、固形担体、水性溶液、コーティング、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤、ならびに同様のものが挙げられる。特定の実施形態において、適切な薬学的に許容できる担体としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの混合物を挙げることができる。幾つかの実施形態において、薬学的に許容できる担体はさらに、細胞の貯蔵寿命または有効性を増大する、湿潤または乳化剤、防腐または緩衝剤などの補助物質の微量を含んでもよい。薬学的に許容できる担体の調製および使用は、当技術分野で周知である。
【0099】
本発明の一態様は、個体、好ましくは哺乳動物個体、より好ましくはヒト個体における加齢、および／または老化、および／または生存期間の調節における、本発明による単離核酸分子または単離ポリペプチドまたはベクターの使用に関する。
【0100】
本明細書で用いられる用語「老化を調節すること」は、老化メカニズム、特に早期老化を低下、低減、または停止させる工程を指すことを意図する。
【0101】
本明細書で用いられる用語「生存期間を調節すること」は、生存期間を増加または改善する工程、言い換えれば一生の期間を増加または改善する工程を指すことを意図する。
【0102】
本発明はさらに、それを必要とする個体、好ましくは哺乳動物個体、より好ましくはヒト個体における加齢、および／または老化、および／または生存期間を調節する方法であって、本発明による単離核酸分子または単離ポリペプチドまたはベクターの治療有効量の投与を含む方法に関する。
【0103】
本発明のさらなる態様は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の二本鎖切断の修復における、本発明による単離核酸分子または単離ポリペプチドまたはベクターの使用に関係する。
【0104】
本発明はまた、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の二本鎖切断を修復する方法であって、本発明による単離核酸分子または単離ポリペプチドまたはベクターの治療有効量の投与を含む方法に関する。
【0105】
本明細書で用いられる「二本鎖切断の修復」は、二本鎖ＤＮＡ核酸の両方の鎖の切断の発生にあるＤＮＡ損傷の修復によりＤＮＡ完全性の回復を可能にする工程を指す。実際には二本鎖切断の修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同修復（ＨＲ）などの修復メカニズムを含む。
【0106】
実際に二本鎖切断修復の効率は、最先端技術からの任意の適切な方法、またはそれから適合された方法により評価され得る。例示として二本鎖切断修復効率は、Ｓｅｌｕａｎｏｖら（Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ， ２０１０； ｄｏｉ：１０．３７９１／２００２）に記載された方法により評価され得る。
【0107】
本発明の範囲内では、本発明による核酸分子、ポリペプチド、ベクター、懸濁液または医薬組成物は、参照レベルとしての任意の処置の非存在下でのＤＳＢ修復の効率と比較して、標的細胞におけるＤＳＢ修復の効率を増加、改善または好転させることを意図する。
【0108】
本明細書で用いられる用語「ＤＳＢ修復の効率を増加、改善または好転させる」は、参照レベルと比較して少なくとも１．２倍の増加を包含する。本発明の範囲内では、用語「少なくとも１．２倍」は、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．２倍、２．４倍、２．６倍、２．８倍、３．０倍、３．２倍、３．４倍、３．６倍、３．８倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、またはより多くを包含する。
【0109】
別の態様において、本発明は、加齢に伴う疾患の防止および／または処置における使用のための、本発明による単離核酸分子または単離ポリペプチドまたはベクターに関する。
【0110】
本発明はまた、加齢に伴う疾患の防止および／または処置のための薬品の調製または製造のための、本発明による単離核酸分子または単離ポリペプチドまたはベクターの使用に関する。
【0111】
幾つかのさらなる態様において、本発明は、それを必要とする個体における加齢に伴う疾患を防止するおよび／または処置する方法であって、本発明による単離核酸分子または単離ポリペプチドまたはベクターの治療有効量の投与を含む方法に関係する。
【0112】
特定の実施形態において、それを必要とする個体は、哺乳動物個体、好ましくはヒト個体である。
【0113】
幾つかの実施形態において、加齢に伴う疾患は、早老症、ウェルナー症候群、神経変性疾患、アルツハイマー病、がん、心臓血管疾患、肥満、２型糖尿病、高コレステロール血症、高血圧、眼障害、白内障、緑内障、骨粗しょう症、血栓障害、関節炎、難聴および卒中を含む、またはそれからなる群において選択される。
【0114】
一実施形態において、加齢に伴う疾患は、早老症またはウェルナー症候群である。
【0115】
幾つかの実施形態において、加齢に伴う疾患は、がんである。特定の実施形態において、がんは、血液がんまたは固形がんである。
【0116】
本明細書で用いられる、「血液のがん」とも称される用語「血液がん」は、血液細胞、特に白血球の非制御的増殖を含む任意のがんを包含する。血液がんとしては、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）および骨髄腫が挙げられる。
【0117】
特定の実施形態において、がんは、血液がんである。幾つかの実施形態において、前記がんは、ホジキン病、免疫芽球性リンパ節症、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性白血病、および同様のものからなる群において選択される血液がんである。
【0118】
本明細書で用いられる用語「固形がん」は、塊を形成せずに組織にびまん性に浸潤するがん（または悪性腫瘍）と反対に、別個の腫瘍塊を形成する任意のがん（悪性腫瘍とも称される）を包含する。
【0119】
特定の実施形態において、がんは、固形がんである。幾つかの実施形態において、固形がんは、線維肉腫、黒色腫、乳癌、結腸癌、腎臓癌、副腎皮質癌、精巣奇形腫、皮膚肉腫、線維肉腫、肺癌、腺癌、肝臓癌（即ち、肝癌）、膠芽腫、前立腺癌、卵巣がんおよび膵臓癌からなる群において選択される。
【0120】
幾つかの実施形態において、加齢に伴う疾患は、ハッチンソン・ギルフォード早老症、ウェルナー症候群、アルツハイマー病およびがんを含む、またはそれらからなる群において選択される。
【0121】
幾つかの実施形態において、加齢に伴う疾患は、ハッチンソン・ギルフォード早老症、ウェルナー症候群、アルツハイマー病および線維肉腫を含む、またはそれらからなる群において選択される。
【0122】
幾つかの実施形態において、加齢に伴う疾患は、ハッチンソン・ギルフォード早老症、ウェルナー症候群、アルツハイマー病および肝癌を含む、またはそれらからなる群において選択される。
【0123】
一実施形態において、加齢に伴う疾患は、肝癌である。一実施形態において、加齢に伴う疾患は、線維肉腫である。
【0124】
特定の実施形態において、早老症は、ハッチンソン・ギルフォード早老症である。
【0125】
一実施形態において、加齢に伴う疾患は、ウェルナー症候群である。
【0126】
幾つかの実施形態において、本発明による核酸分子、ポリペプチド、ベクター、懸濁液、または医薬組成物は、任意の適切な経路、即ち、皮膚投与により、経口投与、局所投与、または非経口投与により、例えば、皮下投与、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、眼内投与および耳介内投与（ｉｎｔｒａ－ａｕｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を含む注射により、それを必要とする個体に投与されなければならない。
【0127】
特定の実施形態において、本発明による核酸分子、ポリペプチド、ベクター、懸濁液、または医薬組成物は、皮膚投与により、それを必要とする個体に投与されなければならない。特定の実施形態において、本発明による核酸分子、ポリペプチド、ベクター、懸濁液、または医薬組成物は、例えば皮膚指向性を上昇させることにより、または皮膚バリア透過性を上昇させることにより、皮膚投与を可能にする、および／または容易にする組成物と会合される。幾つかの実施形態において、皮膚投与は、本発明による核酸分子、ポリペプチド、ベクター、懸濁液、または医薬組成物の長期放出を可能にする
【0128】
特定の実施形態において、本発明による核酸分子、ポリペプチド、ベクター、懸濁液、または医薬組成物は、静脈内投与により、特に静脈内注入または静脈内注射により、それを必要とする個体に投与されなければならない。
【0129】
本発明の範囲内では、投与されるべき本発明による核酸分子、ポリペプチド、ベクター、懸濁液、または医薬組成物の治療有効量は、医師または権限を与えられた当業者により決定されてもよく、処置の時間的経過の中で適宜、適合され得る。
【0130】
特定の実施形態において、投与されるべき治療有効量は、投与のために選択される材料、投与が単回投与であるか、または反復投与であるかを含む種々のパラメータ、ならびに年齢、身体条件、体格、体重、性別、および処置されるべき加齢に伴う疾患の重症度を含む個体のパラメータに依存し得る。
【0131】
特定の実施形態において、本発明による単離ポリペプチドまたは単離ポリペプチド、薬剤を含む医薬組成物の治療有効量は、投与単位あたり約０．００１ｍｇ～約３，０００ｍｇ、好ましくは投与単位あたり約０．０５ｍｇ～約１００ｍｇの範囲内であり得る。
【0132】
本発明の範囲内では、表現「約０．００１ｍｇ～約３，０００ｍｇ」は、投与単位あたり約０．００１ｍｇ、０．００２ｍｇ、０．００３ｍｇ、０．００４ｍｇ、０．００５ｍｇ、０．００６ｍｇ、０．００７ｍｇ、０．００８ｍｇ、０．００９ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、１，０００ｍｇ、１，１００ｍｇ、１，１５０ｍｇ、１，２００ｍｇ、１，２５０ｍｇ、１，３００ｍｇ、１，３５０ｍｇ、１，４００ｍｇ、１，４５０ｍｇ、１，５００ｍｇ、１，５５０ｍｇ、１，６００ｍｇ、１，６５０ｍｇ、１，７００ｍｇ、１，７５０ｍｇ、１，８００ｍｇ、１，８５０ｍｇ、１，９００ｍｇ、１，９５０ｍｇ、２，０００ｍｇ、２，１００ｍｇ、２，１５０ｍｇ、２，２００ｍｇ、２，２５０ｍｇ、２，３００ｍｇ、２，３５０ｍｇ、２，４００ｍｇ、２，４５０ｍｇ、２，５００ｍｇ、２，５５０ｍｇ、２，６００ｍｇ、２，６５０ｍｇ、２，７００ｍｇ、２，７５０ｍｇ、２，８００ｍｇ、２，８５０ｍｇ、２，９００ｍｇ、２，９５０ｍｇおよび３，０００ｍｇを含む。
【0133】
特定の実施形態において、本発明による単離ポリペプチドまたは単離ポリペプチドを含む医薬組成物は、１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ対象体重～約１００ｍｇ／ｋｇ対象体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ対象体重～約５０ｍｇ／ｋｇ対象体重、好ましくは約 ０．１ｍｇ／ｋｇ対象体重～約４０ｍｇ／ｋｇ対象体重、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ対象体重～約３０ｍｇ／ｋｇ対象体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ対象体重～約１０ｍｇ／ｋｇ対象体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ対象体重～約１０ｍｇ／ｋｇ対象体重、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ対象体重～約２５ｍｇ／ｋｇ対象体重を送達するのに充分な投与レベルであり得る。本発明の範囲内では、表現「約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ」は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを含む。
【0134】
幾つかの実施形態において、本発明による単離核酸分子、ベクター、または医薬組成物の治療有効量は、約１０１～約１０１５コピー／ｍｌ範囲内である。実際には治療有効量は、約１０１、５×１０１、１０２、５×１０２、１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８、５×１０８、１０９、５×１０９、１０１０、５×１０１０、１０１１、５×１０１１、１０１２、５×１０１２、１０１３、５×１０１３、１０１４、５×１０１４および１０１５コピー／ｍｌを含む。特定の実施形態において、治療有効量は、約１０１、５×１０１、１０２、５×１０２、１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８、５×１０８、１０９、５×１０９、１０１０、５×１０１０、１０１１、５×１０１１、１０１２、５×１０１２、１０１３、５×１０１３、１０１４、５×１０１４および１０１５コピー／ｃｍ３を含む約１０１～約１０１５コピー／ｃｍ３である。幾つかの実施形態において、治療有効量は、約１０１、５×１０１、１０２、５×１０２、１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８、５×１０８、１０９、５×１０９、１０１０、５×１０１０、１０１１、５×１０１１、１０１２、５×１０１２、１０１３、５×１０１３、１０１４、５×１０１４および１０１５コピー／用量を含む、約１０１～約１０１５コピー／用量である。
【0135】
特定の実施形態において、本発明による単離核酸分子、単離ポリペプチド、ベクター、懸濁液、または医薬組成物は、加齢に伴う疾患、特に早老症、ウェルナー症候群、神経変性疾患、アルツハイマー病、がん、心臓血管疾患、肥満、２型糖尿病、高コレステロール血症、高血圧、眼障害、白内障、緑内障、骨粗しょう症、血栓障害、関節炎、難聴および卒中からなる群において選択される疾患を予防および／または処置するのに適した薬物と共投与または連続投与されなければならない。
【0136】
本明細書で用いられる用語「共投与される」は、活性成分の同時投与を指す。本明細書で用いられる用語「連続投与」は、第二の活性成分の投与前、または投与後の第一の活性成分の投与を指す。
【0137】
本発明の別の態様は、（ｉ）本発明による単離核酸、単離ポリペプチド分子、ベクター、または懸濁液と、（ｉｉ）該単離核酸分子、単離ポリペプチド、ベクター、または懸濁液を投与する手段とを含むキットに関する。
【0138】
幾つかの実施形態において、単離核酸分子、単離ポリペプチド、ベクター、または懸濁液を投与する手段は、シリンジまたはカテーテルを含む。
【0139】
本発明の別の態様は、対象における脂肪生成分化を増加させる方法であって、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、もしくはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらをコード化する核酸分子の有効量を投与することを含む方法に関する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５または１００％の配列同一性を有する。
【0140】
本発明の別の態様は、細胞または細胞集団の脂肪生成分化を増加させるためのインビトロ方法であって、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、もしくはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらをコード化する核酸分子の有効量に、細胞または細胞集団を曝露することを含む方法に関する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５または１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、細胞または細胞集団は、脂肪前駆細胞である。
【0141】
本発明の別の態様は、対象におけるα－ＳＭＡ発現を減少させる方法であって、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、もしくはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらをコード化する核酸分子の有効量を投与することを含む方法に関する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５または１００％の配列同一性を有する。
【0142】
本発明の別の態様は、細胞または細胞集団におけるα－ＳＭＡ発現を減少させるためのインビトロ方法であって、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、もしくはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらをコード化する核酸分子の有効量に、細胞または細胞集団を曝露することを含む方法に関する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５または１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、細胞または細胞集団は、脂肪前駆細胞である。
【0143】
本発明の別の態様は、対象におけるコラーゲン発現を減少させる方法であって、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、もしくはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらをコード化する核酸分子の有効量を投与することを含む方法に関する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５または１００％の配列同一性を有する。
【0144】
幾つかの実施形態において、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、およびＩＸ型コラーゲンを含む、またはそれらからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである。幾つかの実施形態において、Ｉ型コラーゲンは、Ｉ型アルファ１コラーゲンまたはＩ型アルファ２コラーゲンである。幾つかの実施形態において、Ｉ型コラーゲンは、Ｉ型アルファ１コラーゲンであり、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子によりコード化される。
【0145】
本発明の別の態様は、細胞または細胞集団のコラーゲン発現を減少させるためのインビトロ方法であって、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含む、もしくはそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらをコード化する核酸分子の有効量に、細胞または細胞集団を曝露することを含む方法に関する。幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む、またはそれらからなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５または１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、細胞または細胞集団は、脂肪前駆細胞である。
【0146】
幾つかの実施形態において、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、およびＩＸ型コラーゲンを含む、またはそれらからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである。幾つかの実施形態において、Ｉ型コラーゲンは、Ｉ型アルファ１コラーゲンまたはＩ型アルファ２コラーゲンである。幾つかの実施形態において、Ｉ型コラーゲンは、Ｉ型アルファ１コラーゲンであり、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子によりコード化される。
【0147】
実施例
本発明および開示を、以下の実施例によりさらに例示する。
本発明および開示を、以下の実施例によりさらに例示する。
【0148】
実施例１
１．材料と方法
１．１．試験対象および試料採取
この試験群は、Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで長寿試験の一部として過去に採取された１０６８のアシュケナージ系ユダヤ人（ＡＪ）試料、つまり４９６のＡＪ百寿者および５７２のＡＪ対照からなった。百寿者は、９５歳以上で自立して生活する健常個体と定義され、対照は、稀な長寿の家族歴のない個体と定義され、対照の親は、８５歳以下まで生存した。書面による同意書を、Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓの方針に従って得た。ゲノムＤＮＡを血液試料から抽出し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を用いて増幅した。
１．材料と方法
１．１．試験対象および試料採取
この試験群は、Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで長寿試験の一部として過去に採取された１０６８のアシュケナージ系ユダヤ人（ＡＪ）試料、つまり４９６のＡＪ百寿者および５７２のＡＪ対照からなった。百寿者は、９５歳以上で自立して生活する健常個体と定義され、対照は、稀な長寿の家族歴のない個体と定義され、対照の親は、８５歳以下まで生存した。書面による同意書を、Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓの方針に従って得た。ゲノムＤＮＡを血液試料から抽出し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を用いて増幅した。
【0149】
１．２．２ラウンドのターゲットシーケンシング
ステージ１では、ゲノム維持に関与する３０１の候補遺伝子を、５１の百寿者および５１の対照で選択およびシーケンシングした。３０１の候補遺伝子の全リストを、表１に提供する。
ステージ１では、ゲノム維持に関与する３０１の候補遺伝子を、５１の百寿者および５１の対照で選択およびシーケンシングした。３０１の候補遺伝子の全リストを、表１に提供する。
【表1】
【0150】
ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴターゲットエンリッチメントプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））を適用して、候補ゲノム維持遺伝子のエクソン、エクソン－イントロンジャンクション、および２ｋｂ近位プロモーター配列をカバーするゲノム領域を設計および捕捉した。個別にインデックス化したライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ２０００によりシーケンシングした。シーケンスリードを、ＢＷＡを用いて整列させ、バリアントを、ＧＡＴＫにより呼び出した。１０２の試料中の全てのバリアントを、特徴づけ、ＡＮＮＯＶＡＲを用いて機能的アノテーションを行った。候補遺伝子の優先順位をつけるために、ＵＭＩＮＰ（単変量ｍｉｎＰ）遺伝子に基づく順列による関連づけ（ｎ＝１００）を実施し、少なくとも１種の有意な単一バリアントの影響を考慮して、０．０５未満の名目上のｐ値を示す１２２の遺伝子を同定した（表２）。
【表2】
【0151】
遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析を、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒパッケージを用いて実行し、ＤＮＡ二本鎖切断修復機能における１２２のＵＭＩＮＰでの有意な遺伝子のエンリッチメントを同定した。
【0152】
ステージ２では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する１０６の候補遺伝子を、４９６人の百寿者および５７２人の対照において選択およびシーケンシングした。１０６のＤＳＢ修復遺伝子のリストが、表３に提供される。
【表3】
【0153】
２５の試料をプールするターゲットキャプチャーシーケンシングを、実施した。手短に述べると、同じ群からの２５の試料を、同モル濃度で一緒にプールし、合計２０の百寿者プールおよび２３の対照プールを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ試料調製ロースループット（ＬＴ）プロトコルに従ってインデックス化したライブラリを作成した。捕捉されたライブラリをさらに、候補ＤＳＢ遺伝子のエクソン、エクソン－イントロンジャンクション、および２ｋｂ近位プロモーター配列をカバーするゲノム領域を濃縮するＳｅｑＣａｐ ＥＺ Ｃｈｏｉｃｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を用いて作成し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ２０００によりシーケンシングした。シーケンスリードを、ＢＷＡを用いて整列させ、バリアントが、プールされたＤＮＡ配列データにおいてバリアントを呼び出すために専用で開発されたソフトウエアＣＲＩＳＰ（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅａｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を用いて呼び出した。１０６８の試料中の全てのバリアントを、特徴づけ、ＡＮＮＯＶＡＲを用いて機能的アノテーションを行った。長寿の関連性について検査するために、本発明者らは、希少なバリアントに関するＳＫＡＴ（シーケンシング・カーネル関連検査）、全てのバリアントに関するＳＫＡＴ－Ｃ（一般的および希少）、および指向性のあるバリアントに関するＳＫＡＴ－Ｏ（百寿者または対照のみでエンリッチメント）などのＳＫＡＴ解析の異なるサブタイプを実施した（表４）。
【表4】
【0154】
１．３．細胞株
ＨＥＫ２９３細胞を、ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬を介して直鎖状ＣＭＶ－ＳＩＲＴ６プラスミドでトランスフェクトして、安定して組み込まれたクローンを選択することにより、ＨＥＫ２９３ ＳＩＲＴ６過剰発現株を作製した。クマート誘導型プロモーターの制御下で、ＳＩＲＴ６のＷＴおよび百寿者のアレルを発現する正常なヒト線維芽細胞（クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞）を作製するために、クマートプロモーターの制御下でＳＩＲＴ６アレルを含有する構築物を、ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを介してテロメラーゼ不死化ＳＩＲＴ６－ＫＯヒトＨＣＡ２包皮線維芽細胞のゲノムに組み込んだ。内在性ＳＩＲＴ６を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９を用いてこれらの細胞においてノックアウトした。ＮＨＥＪおよびＨＲレポーターアッセイを、組み込まれたレポーター構築物（Ｉ９ＡおよびＨ１５Ｃ）を含有するテロメラーゼ不死化ＨＣＡ２ヒト線維芽細胞株を用いて実行した。ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ細胞株を用いて、抗腫瘍活性を評価した。
ＨＥＫ２９３細胞を、ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬を介して直鎖状ＣＭＶ－ＳＩＲＴ６プラスミドでトランスフェクトして、安定して組み込まれたクローンを選択することにより、ＨＥＫ２９３ ＳＩＲＴ６過剰発現株を作製した。クマート誘導型プロモーターの制御下で、ＳＩＲＴ６のＷＴおよび百寿者のアレルを発現する正常なヒト線維芽細胞（クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞）を作製するために、クマートプロモーターの制御下でＳＩＲＴ６アレルを含有する構築物を、ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを介してテロメラーゼ不死化ＳＩＲＴ６－ＫＯヒトＨＣＡ２包皮線維芽細胞のゲノムに組み込んだ。内在性ＳＩＲＴ６を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９を用いてこれらの細胞においてノックアウトした。ＮＨＥＪおよびＨＲレポーターアッセイを、組み込まれたレポーター構築物（Ｉ９ＡおよびＨ１５Ｃ）を含有するテロメラーゼ不死化ＨＣＡ２ヒト線維芽細胞株を用いて実行した。ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ細胞株を用いて、抗腫瘍活性を評価した。
【0155】
１．４．細胞株
全ての細胞株を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、３７℃の加湿インキュベータで維持した。細胞は、１５％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地で成長させたが、但し例外としてＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ細胞は、Ｄ－グルコースおよびＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ中での培養であった。細胞株を、マイコプラズマ汚染について日常的に検査する。
全ての細胞株を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、３７℃の加湿インキュベータで維持した。細胞は、１５％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地で成長させたが、但し例外としてＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ細胞は、Ｄ－グルコースおよびＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ中での培養であった。細胞株を、マイコプラズマ汚染について日常的に検査する。
【0156】
１．５．ウェスタンブロット
細胞および反応物を、２×レムリー溶液を用いて回収し、氷中で１５分間インキュベートし、その間、試料を大きなゲージの針に数回通過させ、５分ごとにボルテック処理した。試料をその後、１４，０００ＲＰＭで遠心沈降させて細胞片を除去し、上清を新しい試験管に移した。試料を、沸騰水中で２０分間加熱した後、１４，０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ４～２０％ゲルにロードした。ＰＤＶＦ膜に移してＲＴ（室温）で２時間ブロック（５％粉乳）した後、膜を、２．５％ブロッキング緩衝液中の抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。膜に、ＴＢＳＴでの１０分間の洗浄を３回行い、その後、１×ＴＢＳＴ中の二次抗体を、ＲＴでの２時間インキュベーションの間添加した。膜に、ＴＢＳＴでの１０分間の洗浄を３回行い、その後、イメージングした。
細胞および反応物を、２×レムリー溶液を用いて回収し、氷中で１５分間インキュベートし、その間、試料を大きなゲージの針に数回通過させ、５分ごとにボルテック処理した。試料をその後、１４，０００ＲＰＭで遠心沈降させて細胞片を除去し、上清を新しい試験管に移した。試料を、沸騰水中で２０分間加熱した後、１４，０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ４～２０％ゲルにロードした。ＰＤＶＦ膜に移してＲＴ（室温）で２時間ブロック（５％粉乳）した後、膜を、２．５％ブロッキング緩衝液中の抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。膜に、ＴＢＳＴでの１０分間の洗浄を３回行い、その後、１×ＴＢＳＴ中の二次抗体を、ＲＴでの２時間インキュベーションの間添加した。膜に、ＴＢＳＴでの１０分間の洗浄を３回行い、その後、イメージングした。
【0157】
以下の抗体を用いた：Ｈ３（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ５００）－１：５，０００、Ｈ３Ｋ９ａｃ（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ４４４１）－１：１，０００、Ｈ３Ｋ１８ａｃ（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ１１９１）－１：１，０００、β－チューブリン（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ６０４６）－１：１０，０００、ＳＩＲＴ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）＃１２４８６）－１：１，０００、ＡｂＤ３３２０４（ウサギ、ＲＥＦ）－１：５００、ラミンＡ／Ｃ－１：１，０００（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ１０８５９５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）０５－７１４）、γＨ２ＡＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）０５－６３６）、ＰＡＲＰ１（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ２２７２４４）－１：１，０００、ｍＡＤＰｒ １：５００（ＡｂＤ３３２０４およびＡｂＤ３３２０５）。
【0158】
１．６．免疫沈降（ＩＰ）
細胞を播種し、同投与量のクマートと共に４８時間成長させた後、ＩＰを行った。手短に述べると、細胞をトリプシンおよび遠心分離を介して回収し、その後、ＩＰ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ＝８、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０）＋ＣＯＭｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤を用いて氷中で１０分間溶解した。溶解物に、２５％の出力で１０パルスの音波処理を行い、その後、細胞片を、４℃、１３０００ＲＰＭで１０分間の遠心分離により沈降させた。上清を、新しい試験管に移し、Ａ／Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズによってローター上で４℃で１時間、予めきれいにした。ビーズを遠心分離により除去し、きれいにした試料を新しい試験管に移した。試料５０μｌをインプット対照として保存した。試料を、抗体（ＳＩＲＴ６；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））＃１２４８６ ３μｇ；ＰＡＲＰ１－Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ２２７２４４；ラミンＡ／Ｃ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）０５－７１４；ＡｂＤ３３２０４、ＡｂＤ３３２０５と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、２５％Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ３０μｌと共に４℃で２時間インキュベートした。試料を遠心沈降により沈殿させ、ビーズをＩＰ緩衝液で５回洗浄した。ＩＰ緩衝液１００μｌでの最終的な再懸濁。
細胞を播種し、同投与量のクマートと共に４８時間成長させた後、ＩＰを行った。手短に述べると、細胞をトリプシンおよび遠心分離を介して回収し、その後、ＩＰ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ＝８、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０）＋ＣＯＭｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤を用いて氷中で１０分間溶解した。溶解物に、２５％の出力で１０パルスの音波処理を行い、その後、細胞片を、４℃、１３０００ＲＰＭで１０分間の遠心分離により沈降させた。上清を、新しい試験管に移し、Ａ／Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズによってローター上で４℃で１時間、予めきれいにした。ビーズを遠心分離により除去し、きれいにした試料を新しい試験管に移した。試料５０μｌをインプット対照として保存した。試料を、抗体（ＳＩＲＴ６；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））＃１２４８６ ３μｇ；ＰＡＲＰ１－Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ２２７２４４；ラミンＡ／Ｃ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）０５－７１４；ＡｂＤ３３２０４、ＡｂＤ３３２０５と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、２５％Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ３０μｌと共に４℃で２時間インキュベートした。試料を遠心沈降により沈殿させ、ビーズをＩＰ緩衝液で５回洗浄した。ＩＰ緩衝液１００μｌでの最終的な再懸濁。
【0159】
１．７．ＤＮＡ修復アッセイ
ＮＨＥＪおよびＨＲ効率の両方を、Ｓｅｌｕａｎｏｖら（Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ， ２０１０； ｄｏｉ：１０．３７９１／２００２）において過去に記載されたとおり評価した。手短に述べると、Ｉ－Ｓｃｅ１、ＳＩＲＴ６またはＨＰＲＴ対照、およびｄｓＲＥＤプラスミドを、染色体に組み込まれたＮＨＥＪまたはＨＲレポーターカセット（Ｉ１９ＡまたはＨ１５Ｃ）細胞を含有するテロメラーゼ不死化ヒト包皮線維芽細胞にトランスフェクトした。細胞を、３日間放置して回復させた後、フローサイトメトリーにより分析した。効率を、ｄｓＲＥＤ事象に対するＧＦＰ事象の比として計算した。
ＮＨＥＪおよびＨＲ効率の両方を、Ｓｅｌｕａｎｏｖら（Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ， ２０１０； ｄｏｉ：１０．３７９１／２００２）において過去に記載されたとおり評価した。手短に述べると、Ｉ－Ｓｃｅ１、ＳＩＲＴ６またはＨＰＲＴ対照、およびｄｓＲＥＤプラスミドを、染色体に組み込まれたＮＨＥＪまたはＨＲレポーターカセット（Ｉ１９ＡまたはＨ１５Ｃ）細胞を含有するテロメラーゼ不死化ヒト包皮線維芽細胞にトランスフェクトした。細胞を、３日間放置して回復させた後、フローサイトメトリーにより分析した。効率を、ｄｓＲＥＤ事象に対するＧＦＰ事象の比として計算した。
【0160】
１．８．トランスフェクション
トランスフェクションを、細胞をトランスフェクション前に５００，０００細胞／１０ｃｍプレートの密度で２日間播種することにより実行した。トランスフェクションを、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｆｅｃｔｏｒを正常ヒト皮膚線維芽細胞トランスフェクション溶液と共に用いて、製造業者のプロトコルに従って実行した。がん細胞のトランスフェクションのために、ＪｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬を使用して、プラスミドを細胞に送達した。
トランスフェクションを、細胞をトランスフェクション前に５００，０００細胞／１０ｃｍプレートの密度で２日間播種することにより実行した。トランスフェクションを、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｆｅｃｔｏｒを正常ヒト皮膚線維芽細胞トランスフェクション溶液と共に用いて、製造業者のプロトコルに従って実行した。がん細胞のトランスフェクションのために、ＪｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬を使用して、プラスミドを細胞に送達した。
【0161】
１．９．定量的ＲＴ－ＰＣＲ
総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて８０％コンフルエンシーの細胞から単離し、その後、ＤＮａｓｅで処置した。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））ｃＤＮＡキットをＯｌｉｇｏｄＴプライマーと共に用いて合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ（登録商標） ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ装置とＳＹＢＲ（商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ（登録商標））により、ｃＤＲＡ ３０ｎｇ／反応を用い、３×反応／試料で実施した。全てのプライマーセット（以下の表５参照）を、特異性および効率について検査した。アクチンを、Ｑｕａｎｔｕｍ ｍＲＮＡ Ａｃｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標） ＡＭ１７２０）を用いてアッセイした。
総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて８０％コンフルエンシーの細胞から単離し、その後、ＤＮａｓｅで処置した。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））ｃＤＮＡキットをＯｌｉｇｏｄＴプライマーと共に用いて合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ（登録商標） ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ装置とＳＹＢＲ（商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ（登録商標））により、ｃＤＲＡ ３０ｎｇ／反応を用い、３×反応／試料で実施した。全てのプライマーセット（以下の表５参照）を、特異性および効率について検査した。アクチンを、Ｑｕａｎｔｕｍ ｍＲＮＡ Ａｃｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標） ＡＭ１７２０）を用いてアッセイした。
【表5】
【0162】
１．１０．免疫蛍光およびアポトーシス
γＨ２ＡＸ免疫染色を、Ｍａｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１１； Ｖｏｌ． ３３２：１４４３－１４４６）において過去に記載したとおり実行した。抗γＨ２ＡＸ抗体を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）（０５－６３６）から購入した。線維芽細胞のアポトーシスを、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を用いて測定した。
γＨ２ＡＸ免疫染色を、Ｍａｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１１； Ｖｏｌ． ３３２：１４４３－１４４６）において過去に記載したとおり実行した。抗γＨ２ＡＸ抗体を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）（０５－６３６）から購入した。線維芽細胞のアポトーシスを、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を用いて測定した。
【0163】
１．１１．ガンマ線照射
細胞を、７５％コンフルエンシーまで成長させた後、コーティングしたスライド上で処置した。Ｃｓ－１３７照射器を用いて、２Ｇｙの放射線を細胞に送達した。細胞を、３７℃のコンテナに移動させ、培地を、曝露後に交換した。
細胞を、７５％コンフルエンシーまで成長させた後、コーティングしたスライド上で処置した。Ｃｓ－１３７照射器を用いて、２Ｇｙの放射線を細胞に送達した。細胞を、３７℃のコンテナに移動させ、培地を、曝露後に交換した。
【0164】
１．１２．パラコート処置
細胞を、７５％コンフルエンシーで維持し、その時点で、ピルビン酸ナトリウムを欠如してパラコートを含有する新鮮な培地を、添加した。細胞を、処置した培地中で２４時間維持し、その後、ピルビン酸ナトリウムが欠如した新鮮な培地と交換した。処置の４８時間後に、細胞を染色し、アポトーシスについて評価した。
細胞を、７５％コンフルエンシーで維持し、その時点で、ピルビン酸ナトリウムを欠如してパラコートを含有する新鮮な培地を、添加した。細胞を、処置した培地中で２４時間維持し、その後、ピルビン酸ナトリウムが欠如した新鮮な培地と交換した。処置の４８時間後に、細胞を染色し、アポトーシスについて評価した。
【0165】
１．１３．ＳＩＲＴ６タンパク質精製
ＨｉｓタグＳＩＲＴ６ ｃＤＮＡを、ｐＥＴ１１ａベクターにクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ－Ｇａｍｉ大腸菌細胞に形質転換した。細胞を抗体の存在下で成長させ、その後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによるタンパク質生成を２時間誘導した後、回収した。細胞を、遠心沈降により沈降させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび１０ｍＭイミダゾールと、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）＃８８４９）および１ｍｇ／ｍｌ卵白リゾチームとの溶液を用いて氷中で１時間溶解した後、Ｂｒａｎｓｏｎ装置で音波処理した。遠心分離による細胞片の除去の後、溶解物をＮｉ２＋－ＮＴＡアガロースと共に一晩インキュベートした。ビーズを含む溶液を、重力カラムに入れ、溶解溶液で洗浄した後、２容量の洗浄緩衝液（溶解緩衝液＋３０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。最後に、タンパク質を、溶出緩衝液（溶解緩衝液＋５００ｍＭイミダゾール）で溶出し、画分を回収した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより評価し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させた。３～４の最高濃度の画分をプールし、貯蔵緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）で透析した。
ＨｉｓタグＳＩＲＴ６ ｃＤＮＡを、ｐＥＴ１１ａベクターにクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ－Ｇａｍｉ大腸菌細胞に形質転換した。細胞を抗体の存在下で成長させ、その後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによるタンパク質生成を２時間誘導した後、回収した。細胞を、遠心沈降により沈降させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび１０ｍＭイミダゾールと、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）＃８８４９）および１ｍｇ／ｍｌ卵白リゾチームとの溶液を用いて氷中で１時間溶解した後、Ｂｒａｎｓｏｎ装置で音波処理した。遠心分離による細胞片の除去の後、溶解物をＮｉ２＋－ＮＴＡアガロースと共に一晩インキュベートした。ビーズを含む溶液を、重力カラムに入れ、溶解溶液で洗浄した後、２容量の洗浄緩衝液（溶解緩衝液＋３０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。最後に、タンパク質を、溶出緩衝液（溶解緩衝液＋５００ｍＭイミダゾール）で溶出し、画分を回収した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより評価し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させた。３～４の最高濃度の画分をプールし、貯蔵緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）で透析した。
【0166】
１．１４．細胞培養におけるアミノ酸の安定した同位体標識（ＳＩＬＡＣ）
代謝回転率実験を、ＳＩＲＴ６ ＷＴまたはｃｅｎｔＳＩＲＴ６を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株を用いて実施した。細胞を、１０％透析ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン１３Ｃ６ １５Ｎ４（Ｃａｍｂｒｉｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（登録商標））、およびＬ－リジン１３Ｃ６ １５Ｎ２（Ｃａｍｂｒｉｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（登録商標））を補充したＳＩＬＡＣ用ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｉｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））において、コンフルエントになるまで１週間培養した。培地を、通常の培養培地に交換し、細胞ペレットを、培地交換後０、２、４、６、８、１２および２４ｈ目に回収した。細胞ペレットを、８Ｍ尿素、７５ｍｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））と共に含有する緩衝液に溶解した。ペレットを、３０秒間ボルテックス処理し、音波処理ステップの間に氷中で１分の休止を入れながら１０秒間の超音波処理を５回行った。溶解物を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その後、上清を回収した。
代謝回転率実験を、ＳＩＲＴ６ ＷＴまたはｃｅｎｔＳＩＲＴ６を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株を用いて実施した。細胞を、１０％透析ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン１３Ｃ６ １５Ｎ４（Ｃａｍｂｒｉｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（登録商標））、およびＬ－リジン１３Ｃ６ １５Ｎ２（Ｃａｍｂｒｉｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（登録商標））を補充したＳＩＬＡＣ用ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｉｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））において、コンフルエントになるまで１週間培養した。培地を、通常の培養培地に交換し、細胞ペレットを、培地交換後０、２、４、６、８、１２および２４ｈ目に回収した。細胞ペレットを、８Ｍ尿素、７５ｍｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））と共に含有する緩衝液に溶解した。ペレットを、３０秒間ボルテックス処理し、音波処理ステップの間に氷中で１分の休止を入れながら１０秒間の超音波処理を５回行った。溶解物を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その後、上清を回収した。
【0167】
１．１５．ＳＩＲＴ６脱アシル化活性
この反応の基質は、Ｓｃｈｕｓｔｅｒら（Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０１６； Ｖｏｌ． ６：２２６４３）により最初に開発された合成ＴＮＦ由来ペプチドであり、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（登録商標）が合成した。反応を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％グリセロール、１ｍＭ β－メルカプトエタノール、２μＭ ＳＩＲＴ６、ならびに７～１０００μＭの基質濃度範囲のＮＡＤ＋および２～８８μＭペプチドを用いて実施した。反応を、３７℃で実施し、蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ ２０Ｍプレートリーダーで３１０／４０５ｎｍ励起／発光スペクトルを用いて測定した。３０秒ごとに読み取りを行い、初期速度を、最短で６分にわたる相対蛍光増加から計算した。
この反応の基質は、Ｓｃｈｕｓｔｅｒら（Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０１６； Ｖｏｌ． ６：２２６４３）により最初に開発された合成ＴＮＦ由来ペプチドであり、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（登録商標）が合成した。反応を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％グリセロール、１ｍＭ β－メルカプトエタノール、２μＭ ＳＩＲＴ６、ならびに７～１０００μＭの基質濃度範囲のＮＡＤ＋および２～８８μＭペプチドを用いて実施した。反応を、３７℃で実施し、蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ ２０Ｍプレートリーダーで３１０／４０５ｎｍ励起／発光スペクトルを用いて測定した。３０秒ごとに読み取りを行い、初期速度を、最短で６分にわたる相対蛍光増加から計算した。
【0168】
１．１６．ヒストン分析
ヒストンを、確立された酸抽出法の後に、カバレッジを増強させるためにトリプシン消化の前にリジンのプロピオニル化を使用することにより、クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞（クマート誘導型プロモーターを介してテロメラーゼの触媒サブユニットおよびＳＩＲＴ６の様々なアレルを構成的に発現するＳＩＲＴ６ ＫＯ初代ヒト包皮線維芽細胞）から精製した、。試料を、ＥｐｉＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）を用いるｎａｎｏ－ＬＣにより分離した後、あるいは直接融合後のＥｐｉＰｒｏｆｉｌｅＬｉｔｅ（登録商標）による１分間取得および解析の後に、データ非依存的解析（ＤＩＡ）質量分析（ＭＳ）法を、改変ペプチドの定量に用いた。
ヒストンを、確立された酸抽出法の後に、カバレッジを増強させるためにトリプシン消化の前にリジンのプロピオニル化を使用することにより、クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞（クマート誘導型プロモーターを介してテロメラーゼの触媒サブユニットおよびＳＩＲＴ６の様々なアレルを構成的に発現するＳＩＲＴ６ ＫＯ初代ヒト包皮線維芽細胞）から精製した、。試料を、ＥｐｉＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）を用いるｎａｎｏ－ＬＣにより分離した後、あるいは直接融合後のＥｐｉＰｒｏｆｉｌｅＬｉｔｅ（登録商標）による１分間取得および解析の後に、データ非依存的解析（ＤＩＡ）質量分析（ＭＳ）法を、改変ペプチドの定量に用いた。
【0169】
１．１７．質量分析によるＳＩＲＴ６およびＬＭＮＡタンパク質－タンパク質相互作用の分析
クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞を、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６および野生型ＳＩＲＴ６への相互作用を比較するために用いた。核抽出物を、低張溶解緩衝液を用いて調整した。およそ２．５×１０７細胞から単離した核を、１ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％ＮＰ－４０、１×Ｒｏｃｈｅ（登録商標）完全プロテアーゼ阻害剤に加え、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤である１ｍＭ ＮａＶＯ４、１０ｍＭベータ－グリセロリン酸塩、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ）に再懸濁し、２７ゲージ針を通過させた後、氷中のＢｒａｎｓｏｎ（登録商標）音波処理装置での音波処理（一定の２０％出力での３パルス）により、核を破壊した。次に試料を、０．２μｍＭＷＣＯフィルターで濾過し、任意の不溶性材料を除去した（そして非特異的結合を低減した）。タンパク質を、ＢＣＡアッセイを利用して定量し、同量の野生型ＳＩＲＴ６およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６由来抽出物を、それぞれ５本ずつ分割した。抽出物３本ずつに、４μｇ抗ＳＩＲＴ６抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）＃１２４８）または抗ラミンＡ（ラミンＡ／Ｃ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）０５－７１４）および７５μｌのＭｉｔｅｎｙｉ（登録商標）タンパク質Ｇ μＭＡＣＳ磁気粒子を与えた。試料２本ずつを、粒子との非特異的結合のための対照として正常ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）＃２７２９）と混合した。試料を、４℃で６時間回転した後、磁気により分離した。試料を、さらなる３ｍｌの抽出緩衝液で洗浄し、沸騰溶出緩衝液（ｂｏｉｌｉｎｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５を含む５％ＳＤＳ）１００μｌで溶出した。Ｓ－ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｒｏｔｉｆｉ（登録商標）；ＮＹ州ハンティントン）でのＳＤＳ除去およびトリプシン消化の後、ペプチドをＭＳ等級の水に再懸濁し、タンデム質量タグ（ＴＭＴ １０－ｐｌｅｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））で標識した。１．８μｍ Ｃ－１８ビーズをパッケージングした３０ｃｍ自家製カラムを用いた陽イオンモードでのＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ ＭＳ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））でのナノエレクトロスプレーイオン化により、試料を分解し、ペプチドを分解した。溶媒Ａは、０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂは、０．１％ギ酸を含む１００％アセトニトリル（ＣＡＮ）であった。測定の長さは、９０分勾配を含む２時間であった。ＣＩＤ（３５％衝突エネルギー）を、ＭＳ２分画に用いた。ＨＣＤ（６０％衝突エネルギー）を、ＴＭＴ群のＭＳ３検出に用いた。測定パラメータの他の詳細は、ＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅデータベースにアップロードしたＲＡＷデータファイルの埋込み測定レポートに見出され得る。ペプチドのアサインメントを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒおよびＳｅｑｕｅｓｔを用いて行い、ＭＳ３イオンを、定量に用いた。偽発見率（ＦＤＲ）を、０．０１に設定したＴａｒｇｅｔ ＦＤＲ（ｓｔｒｉｃｔ）および０．０５に設定したＴａｒｇｅｔ ＦＤＲ（ｒｅｌａｘｅｄ）でのＤｅｃｏｙ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈを用いて推定した。検証は、ｑ値に基づいた。コンセンサスステップでは、３０％を超える同時分離閾値（ｃｏ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｅｔｈｏｌｄ）を有するイオンを、除外した。単一タンパク質のペプチド数をレーンの全タンパク質の合計で除算する総タンパク質アプローチを利用して、反復測定の間の正規化を実現した。スチューデントｔ検定を用いて正常ＩｇＧ血清と比較した特異的抗体（抗ＳＩＲＴ６または抗ラミンＡのどちらか）の中に出現したタンパク質を、相互作用と見なした。同様に、野生型ＳＩＲＴ６と比較してｃｅｎｔＳＩＲＴ６において高レベルを示すタンパク質は、ｐ＜０．０５に基づいた。
クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞を、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６および野生型ＳＩＲＴ６への相互作用を比較するために用いた。核抽出物を、低張溶解緩衝液を用いて調整した。およそ２．５×１０７細胞から単離した核を、１ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％ＮＰ－４０、１×Ｒｏｃｈｅ（登録商標）完全プロテアーゼ阻害剤に加え、キナーゼ／ホスファターゼ阻害剤である１ｍＭ ＮａＶＯ４、１０ｍＭベータ－グリセロリン酸塩、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ）に再懸濁し、２７ゲージ針を通過させた後、氷中のＢｒａｎｓｏｎ（登録商標）音波処理装置での音波処理（一定の２０％出力での３パルス）により、核を破壊した。次に試料を、０．２μｍＭＷＣＯフィルターで濾過し、任意の不溶性材料を除去した（そして非特異的結合を低減した）。タンパク質を、ＢＣＡアッセイを利用して定量し、同量の野生型ＳＩＲＴ６およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６由来抽出物を、それぞれ５本ずつ分割した。抽出物３本ずつに、４μｇ抗ＳＩＲＴ６抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）＃１２４８）または抗ラミンＡ（ラミンＡ／Ｃ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）０５－７１４）および７５μｌのＭｉｔｅｎｙｉ（登録商標）タンパク質Ｇ μＭＡＣＳ磁気粒子を与えた。試料２本ずつを、粒子との非特異的結合のための対照として正常ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）＃２７２９）と混合した。試料を、４℃で６時間回転した後、磁気により分離した。試料を、さらなる３ｍｌの抽出緩衝液で洗浄し、沸騰溶出緩衝液（ｂｏｉｌｉｎｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５を含む５％ＳＤＳ）１００μｌで溶出した。Ｓ－ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｒｏｔｉｆｉ（登録商標）；ＮＹ州ハンティントン）でのＳＤＳ除去およびトリプシン消化の後、ペプチドをＭＳ等級の水に再懸濁し、タンデム質量タグ（ＴＭＴ １０－ｐｌｅｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））で標識した。１．８μｍ Ｃ－１８ビーズをパッケージングした３０ｃｍ自家製カラムを用いた陽イオンモードでのＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ ＭＳ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））でのナノエレクトロスプレーイオン化により、試料を分解し、ペプチドを分解した。溶媒Ａは、０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂは、０．１％ギ酸を含む１００％アセトニトリル（ＣＡＮ）であった。測定の長さは、９０分勾配を含む２時間であった。ＣＩＤ（３５％衝突エネルギー）を、ＭＳ２分画に用いた。ＨＣＤ（６０％衝突エネルギー）を、ＴＭＴ群のＭＳ３検出に用いた。測定パラメータの他の詳細は、ＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅデータベースにアップロードしたＲＡＷデータファイルの埋込み測定レポートに見出され得る。ペプチドのアサインメントを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒおよびＳｅｑｕｅｓｔを用いて行い、ＭＳ３イオンを、定量に用いた。偽発見率（ＦＤＲ）を、０．０１に設定したＴａｒｇｅｔ ＦＤＲ（ｓｔｒｉｃｔ）および０．０５に設定したＴａｒｇｅｔ ＦＤＲ（ｒｅｌａｘｅｄ）でのＤｅｃｏｙ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈを用いて推定した。検証は、ｑ値に基づいた。コンセンサスステップでは、３０％を超える同時分離閾値（ｃｏ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｅｔｈｏｌｄ）を有するイオンを、除外した。単一タンパク質のペプチド数をレーンの全タンパク質の合計で除算する総タンパク質アプローチを利用して、反復測定の間の正規化を実現した。スチューデントｔ検定を用いて正常ＩｇＧ血清と比較した特異的抗体（抗ＳＩＲＴ６または抗ラミンＡのどちらか）の中に出現したタンパク質を、相互作用と見なした。同様に、野生型ＳＩＲＴ６と比較してｃｅｎｔＳＩＲＴ６において高レベルを示すタンパク質は、ｐ＜０．０５に基づいた。
【0170】
１．１８．トリプトファン蛍光によるＳＩＲＴ６－ＮＡＤ＋結合
緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５０μｌ中の１μＭ ＳＩＲＴ６タンパク質を、ＮＡＤ＋（０～２ｍＭ）の範囲内で混和した。その後、試料を３８４Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）平底黒色プレートに入れ、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（登録商標）２０Ｍプレートリーダで分析した。蛍光を、２８０ｎｍ励起を利用して２ｎｍ段階で３００～４００ｎｍにわたり測定した。７Ｍ尿素により変性したＳＩＲＴ６のＮＡＤ＋によるバックグランドクエンチングを、Ｐａｎら（Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ， ２０１１； Ｖｏｌ． １１５：３２４５－３２５３）により過去に記載したとおりスペクトルから差し引いた。
緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５０μｌ中の１μＭ ＳＩＲＴ６タンパク質を、ＮＡＤ＋（０～２ｍＭ）の範囲内で混和した。その後、試料を３８４Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）平底黒色プレートに入れ、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（登録商標）２０Ｍプレートリーダで分析した。蛍光を、２８０ｎｍ励起を利用して２ｎｍ段階で３００～４００ｎｍにわたり測定した。７Ｍ尿素により変性したＳＩＲＴ６のＮＡＤ＋によるバックグランドクエンチングを、Ｐａｎら（Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ， ２０１１； Ｖｏｌ． １１５：３２４５－３２５３）により過去に記載したとおりスペクトルから差し引いた。
【0171】
１．１９．デアセチラーゼアッセイ
ＳＩＲＴ６タンパク質３μｇを、ヒストン０．５μｇ、１または５ｍＭ ＮＡＤ＋、３０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝８、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよびｄｄＨ２Ｏと混和して５０μｌにした。全ての試薬を、氷中で調製し、インキュベーションの期間、３７℃に移した。反応を、ＢＭＥを含む２×レムリー緩衝液 １容量の直接適用によりクエンチした。試料を１５分間煮沸した後、抗Ｈ３Ｋ９ａｃおよび抗Ｈ３Ｋ１８ａｃ抗体を用いたウェスタン分析で泳動させた。
ＳＩＲＴ６タンパク質３μｇを、ヒストン０．５μｇ、１または５ｍＭ ＮＡＤ＋、３０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝８、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよびｄｄＨ２Ｏと混和して５０μｌにした。全ての試薬を、氷中で調製し、インキュベーションの期間、３７℃に移した。反応を、ＢＭＥを含む２×レムリー緩衝液 １容量の直接適用によりクエンチした。試料を１５分間煮沸した後、抗Ｈ３Ｋ９ａｃおよび抗Ｈ３Ｋ１８ａｃ抗体を用いたウェスタン分析で泳動させた。
【0172】
１．２０．ＰＡＲＰ１リボシラーゼアッセイ
ＳＩＲＴ６タンパク質５μｇを、１００ｆｍ ＰＡＲＰ１、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝８、１０μＭ ＺｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、３００μＭ ＮＡＤ＋、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよびｄｄＨ２Ｏと混和して５０μｌにした。全ての試薬を氷中で調製し、３０分間、３７℃に移した。反応を、ＢＭＥを含む２×レムリー緩衝液 １容量の直接適用によりクエンチした。試料を１５分間煮沸した後、抗ＰＡＤＰＲ抗体を用いてウェスタン分析で泳動させた。
ＳＩＲＴ６タンパク質５μｇを、１００ｆｍ ＰＡＲＰ１、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝８、１０μＭ ＺｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、３００μＭ ＮＡＤ＋、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよびｄｄＨ２Ｏと混和して５０μｌにした。全ての試薬を氷中で調製し、３０分間、３７℃に移した。反応を、ＢＭＥを含む２×レムリー緩衝液 １容量の直接適用によりクエンチした。試料を１５分間煮沸した後、抗ＰＡＤＰＲ抗体を用いてウェスタン分析で泳動させた。
【0173】
１．２１．自己リボシル化アッセイ
ＳＩＲＴ６ ３μｇを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５μＭ ＮＡＤ＋、１μｌ ［３２Ｐ］－ＮＡＤ＋（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、５ｍＣｉ／ｍｌ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）ＢＬＵ０２３×２５０ＵＣ）およびｄｄＨ２Ｏと混和して２０μｌにした。全ての試薬を、ＳＩＲＴ６を除くマスターミックス中、氷中で混和した。マスターミックスを、反応試験管に分取し、ＳＩＲＴ６を添加して、３７℃で３時間インキュベートした。反応を、ＢＭＥを含む２×レムリー緩衝液 １容量でクエンチした。試料を煮沸し、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＤＰＦ膜に移した。自己リボシル化を、ホスホイメージャーを用いてアッセイした。
ＳＩＲＴ６ ３μｇを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５μＭ ＮＡＤ＋、１μｌ ［３２Ｐ］－ＮＡＤ＋（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、５ｍＣｉ／ｍｌ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）ＢＬＵ０２３×２５０ＵＣ）およびｄｄＨ２Ｏと混和して２０μｌにした。全ての試薬を、ＳＩＲＴ６を除くマスターミックス中、氷中で混和した。マスターミックスを、反応試験管に分取し、ＳＩＲＴ６を添加して、３７℃で３時間インキュベートした。反応を、ＢＭＥを含む２×レムリー緩衝液 １容量でクエンチした。試料を煮沸し、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＤＰＦ膜に移した。自己リボシル化を、ホスホイメージャーを用いてアッセイした。
【0174】
１．２２．熱安定性
４μＭ ＳＩＲＴ６タンパク質を、貯蔵緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）中の１×ＳＹＰＲＯ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ｄｙｅと混和して５０μｌにした。試料を、ｑＲＴ－ＰＣＲプレートに入れ、溶融曲線プロトコル（３０℃～７５℃、１０秒間隔で０．５℃段階）を用いてＢｉｏＲａｄ（登録商標） ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ装置で測定した。
４μＭ ＳＩＲＴ６タンパク質を、貯蔵緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）中の１×ＳＹＰＲＯ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ｄｙｅと混和して５０μｌにした。試料を、ｑＲＴ－ＰＣＲプレートに入れ、溶融曲線プロトコル（３０℃～７５℃、１０秒間隔で０．５℃段階）を用いてＢｉｏＲａｄ（登録商標） ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ装置で測定した。
【0175】
１．２３．ＦＲＥＴ
百寿者の変異体（Ｎ３０８Ｋ／Ａ３１３Ｓ）を作製するための突然変異誘発を、ＮＥＢ Ｑ５部位特異的変異導入キットを用い、プライマー設計のためのプロトコルに従って実施した。
百寿者の変異体（Ｎ３０８Ｋ／Ａ３１３Ｓ）を作製するための突然変異誘発を、ＮＥＢ Ｑ５部位特異的変異導入キットを用い、プライマー設計のためのプロトコルに従って実施した。
【0176】
ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を、２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬を用いて製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｉｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））の使用説明書に従ってトランスフェクトした。ＳＩＲＴ６バイオセンサーを、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、カナダ）を用いて発現させた。２日間培養後に、バイオセンサーを高レベルで発現する一過性トランスフェクト細胞株を作製するおよそ３０００万個を生成した。この細胞株を、Ｆ１７培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））＋（２００ｎＭ／ｍＬ）ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）を用いて維持した。
【0177】
各ＦＲＥＴアッセイ日に、各トランスフェクションからのおよそ３０００万個の細胞を回収し、３００×ｇでの遠心分離によりＭｇまたはＣａを含まないＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）；ＭＡ州ウォルサム）で３回洗浄し、７０μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）；ＮＹ州コーニング）を用いて濾過し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）自動細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）；ＣＡ州カールズバッド）を用いて１００万～２００万細胞／ｍＬに希釈した。各実験日に、細胞生存率を、トリパンブルーアッセイを利用して評価した。ＰＢＳでの再懸濁および希釈後に、細胞を室温で磁気撹拌棒により連続で穏やかに撹拌し、細胞を懸濁状態に保持して、凝集を防止した。
【0178】
蛍光測定装置の詳細な説明は、Ｓｃｈａａｆら（ＳＬＡＳ Ｄｉｓｃｏｖ， ２０１７； Ｖｏｌ．２２：２６２－２７３）において過去に発表されている。ＦＬＴ測定のために、観察された蛍光波形を、機器応答関数デコンボリューションしてＦ（ｔ）（方程式１）を決定し、平均エネルギー伝達効率Ｅを、方程式２を用いてドナーτＤおよびドナーアクセプターτＤＡの平均ＦＬＴから計算し、ドナー－アクセプター距離Ｒを、方程式３を用いて計算した。
【数1】
【0179】
１．２４．定量および統計解析
他に断りがなければ、スチューデントｔ検定を、群間の統計学的有意性を決定するために用いた。全ての検定が、両側であり、ｐ値は、０．０５閾値未満を有意と見なした。細胞培養実験は、各遺伝子型について少なくとも２つの別々に誘導した細胞株を用い、他に断りがなければ、三重測定で実施した。インビトロアッセイを、２つ以上の別々のタンパク質単離調製物を使用して三重測定で実施した。
他に断りがなければ、スチューデントｔ検定を、群間の統計学的有意性を決定するために用いた。全ての検定が、両側であり、ｐ値は、０．０５閾値未満を有意と見なした。細胞培養実験は、各遺伝子型について少なくとも２つの別々に誘導した細胞株を用い、他に断りがなければ、三重測定で実施した。インビトロアッセイを、２つ以上の別々のタンパク質単離調製物を使用して三重測定で実施した。
【0180】
結果
ゲノム維持（ＧＭ）が主要な長寿保証システムである、という証拠が存在するが、ヒトおよびマウスにおける生存期間の低減および早期老化につながるＧＭ遺伝子の遺伝子欠損、ならびに動物種全体でのより効率的なＤＮＡ修復とより長い最大生存期間との相関により、ヒトの極度の長寿におけるＧＭの役割は、これまで系統的に試験されていない。
ゲノム維持（ＧＭ）が主要な長寿保証システムである、という証拠が存在するが、ヒトおよびマウスにおける生存期間の低減および早期老化につながるＧＭ遺伝子の遺伝子欠損、ならびに動物種全体でのより効率的なＤＮＡ修復とより長い最大生存期間との相関により、ヒトの極度の長寿におけるＧＭの役割は、これまで系統的に試験されていない。
【0181】
ＧＭがヒトの極度の長寿における役割を担うかどうかを検討するために、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、相同組換え（ＨＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、テロメア維持をはじめとする経路における３０１のゲノム維持遺伝子（表１）、およびこれらの経路の調節に関与する遺伝子のパネルを、アセンブルした。
【0182】
次に、２ラウンドの標的化シーケンシングを実施して、アシュケナージ系ユダヤ人（ＡＪ）百寿者、および発端者に無関係で百寿者の親族を持たない６０～７０歳のＡＪ個体の末梢血からのＤＮＡ中のこれらの遺伝子の希少なバリアントを同定した（図１）。第一ラウンドでは、５１人のＡＪ百寿者および５１人のＡＪ対照を、シーケンシングし、長寿との関連性を示した１２２の遺伝子を同定した（表２）。遺伝子オントロジー解析から、これらの遺伝子がＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機能のために豊富であることが示した。次にＤＳＢ修復遺伝子を、４９６人のＡＪ百寿者および５７２人の対照のより大規模な集団でシーケンシングした（表４）。
【0183】
モデル生物においてＤＳＢ修復のみならず長寿にも機能的に関係する遺伝子ＳＩＲＴ６は、特に興味深かった。ＳＩＲＴ６ノックアウトマウスは、早期老化およびゲノム不安定性を示すが、ＳＩＲＴ６を過剰発現するマウスは、生存期間の延長を示す（Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．； Ｃｅｌｌ， ２００６； Ｖｏｌ． １２４：３１５－３２９参照）。より高いＳＩＲＴ６活性が、哺乳動物種全体でより効率的なＤＳＢ修復およびより長い最大生存期間に関連する。分子レベルでは、ＳＩＲＴ６は、ＤＮＡ修復、テロメア維持、ＬＩＮＥ１レトロトランスポゾンを含む反復エレメントのサイレンシング、グルコース恒常性の調節、炎症および多能性、ならびに腫瘍抑制に関与する。
【0184】
百寿者に豊富に見出されるＳＩＲＴ６アレルは、高可撓性Ｃ末端内に２つのミスセンスを含有し、極性アスパラギン３０８を荷電リジンに変換し（Ｎ３０８Ｋ）、疎水性アラニン３１３を極性セリンに変換している（Ａ３１３Ｓ）。百寿者キャリアにおける遺伝子型決定から、これらの２種のＳＩＲＴ６バリアントが連鎖した二重バリアントとして存在することが確認され、それを本発明者らはｃｅｎｔＳＩＲＴ６と命名した。このアレルは、Ｇｅｉｓｉｎｇｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍにおける主なヨーロッパ起源の人々の成人参加者５０，７２６名の全エクソーム配列データにおいて非常に希少であった（０．００１％というわずかなアレル頻度）。次に、百寿者のＳＩＲＴ６アレルがＳＩＲＴ６タンパク質の生物活性を変更するかどうかを、検査した。
【0185】
異なるＳＩＲＴ６アレルを発現するＨＥＫ２９３細胞のＳＩＬＡＣ分析は、ＷＴとｃｅｎｔＳＩＲＴ６の間にタンパク質代謝回転率の差を示さなかった（図２）。異なるＳＩＲＴ６アレルの生化学的特性を評価するために、各アレルの組換え型を精製した。野生型とｃｅｎｔＳＩＲＴ６とのインビボでの半減期が類似であることと一致して、インビトロでのＳＩＲＴ６アレルの熱安定性の顕著な差は観察されず（図３）、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がフォールディングまたは周囲の安定性を大きく可変しないことが示唆された。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６変異は、残基の極性および電荷を変化させるため、ＳＩＲＴ６の中央およびＣ末端に融合したＳＩＲＴ６ ＦＲＥＴバイオセンサーを使用して、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６変異が引き起こし得るタンパク質構造へのより微細な変化について評価した（図４Ａ～４Ｂ）。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、ドナー－アクセプター距離Ｒにおける３．０±０．４Å増加に対応して、ＦＲＥＴを野生型ＳＩＲＴ６に比べてΔＥ＝６．４±０．１％減少させた。この増加は、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６変異がＳＩＲＴ６構造をよりオープンなコンフォメーションに向けて移行させることを示している。
【0186】
ＳＩＲＴ６デアシラーゼ活性を、野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６のＮＡＧ＋およびペプチドについてのＫｍを決定するためにミリストイル化ペプチドについて検査した。百寿者アレルは、野生型と比較してわずかな活性低減（Ｖｍａｘ）を呈したが（ｐ＝０．０２）（図５Ａ～５Ｂ）、Ｋｍは、両方の基質について野生型とｃｅｎｔＳＩＲＴ６の間で有意差はなかった（表６）。
【表6】
【0187】
ＮＡＤ＋結合によりＳＩＲＴ６の本質的Ｔｒｐ蛍光をクエンチングすると、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６が、野生型アレルと類似のＮＡＤ＋への親和性を有することも示された（図６）。総括すると、これらのデータから、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がデアシラーゼ触媒効率（Ｖｍａｘ／Ｋｍにより定義される）のわずかな低減を付与することが示される（表６）。
【0188】
ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、飽和したＨ３Ｋ９ａｃおよびＨ３Ｋ１８ａｃ修飾を含む組換えヌクレオソームにおいて有意により低いデアセチラーゼ活性を呈した（図７Ａおよび７Ｂ）。加えて、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルは、有意により遅いヒストンデアセチラーゼ反応速度論を呈した（図８Ａ～８Ｂ）。合成ヒストンと同様に、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、ＨｅＬａ細胞から精製したヌクレオソームのＨ３Ｋ９ａｃおよびＨ３Ｋ１８ａ残基ｃの両方を、野生型ＳＩＲＴ６と比較して有意に低い割合で脱アセチル化した（図９Ａ～９Ｂ）。まとめると、デアシラーゼ実験とヒストンデアセチラーゼ実験のデータの組合わせから、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６バリアントが低減されたデアシラーゼ／デアセチラーゼ活性を有することが示される。
【0189】
インビボでのヒストンデアセチラーゼ活性に及ぼすｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルの影響を検査するために、テロメラーゼ不死化ヒトＨＣＡ２線維芽細胞株を、ＳＩＲＴ６ ＷＴ、Ｎ３０８Ｋ、Ａ３１３Ｓ、およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルの発現を駆動するクマートスイッチプロモーターを含有するＳＩＲＴ６ ＫＯバックグランドで作製した（クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞）。各細胞株を、同レベルのＳＩＲＴ６発現を駆動するようにクマートで誘導した（図２７Ａ～２７Ｂ）。精製ヒストンからのヒストン翻訳後修飾を、過去に記載したとおりペプチド標準を用いて質量分析によりこれらの細胞から定量した （Ｓｉｄｏｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ： ＪｏＶＥ， ２０１６； ｄｏｉ：１０．３７９１／５４１１２）。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６、Ｎ３０８Ｋ、およびＡ３１３Ｓ ＳＩＲＴ６アレルを発現する細胞は、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ａｃ、およびＨ３Ｋ５６ａｃを含むＳＩＲＴ６基質であることが知られた全ての部位で類似の包括的ヒストン翻訳後修飾（ＰＴＭ）レベルを示した（図１０）。同様に、ウェスタンブロットにより測定したＨ３Ｋ９ａｃおよびＨ３Ｋ５６ａｃの包括的レベルは、パラコート誘導酸化障害をチャレンジした場合でも、有意な変化を示さなかった（図１１）。これらの結果は、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６の脱アシル化活性の低減がインビボで野生型レベルに近いＳＩＲＴ６脱アセチル化活性の維持を支援する追加的タンパク質因子またはＰＴＭにより補填されることを示唆する。
【0190】
ＳＩＲＴ６は、脱アセチル化活性に加えて、それ自体および他のタンパク質をモノＡＤＰリボシル化することが可能なモノＡＤＰリボシル化（ｍＡＤＰｒ）活性を有する。ｍＡＤＰｒ活性は、ＤＮＡ損傷応答およびＬＩＮＥ１抑制におけるＳＩＲＴ６の役割にとって重大である。ｍＡＤＰｒ活性を評価するために、２種の公知ＳＩＲＴ６基質、つまりＰＡＲＰ１およびＳＩＲＴ６そのものを用いた。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、野生型ＳＩＲＴ６よりも有意に高い、放射線標識ＮＡＤ＋での自己リボシル化率を実証した（図１２）。単一ＳＮＡＰアレルおよび組み合わせたｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、野生型と比較して自己ｍＡＤＰｒの類似の増加を呈し、２種のＳＮＰの間で累積的でない全般的増加を示唆した（図１２および２８）。これに続いて、ｍＡＤＰｒ残基への特異性を有する抗体を利用して、ＮＡＤ＋の滴定を使用して自己リボシル化効率を試験した（Ｂｏｎｆｉｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．； Ｃｅｌｌ， ２０２０； Ｖｏｌ． １８３：１０８６－１１０２）。放射線標識ＮＡＤ＋と同様に、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、野生型ＳＩＲＴ６の１０６＋４５と比較してほぼ２倍高い最大ｍＡＤＰｒ活性を呈し、１４２＋２９のより高いＫｍ ＮＡＤを呈した（図１３）。したがってｍＡＤＰｍａｘ／Ｋａｐｐ ＮＡＤにより定義された全効率は、野生型ＳＩＲＴ６の０．０２３と比較してｃｅｎｔＳＩＲＴ６では０．０３７であり、ほぼ２倍の差となった。トランスでは（Ｉｎ ｔｒａｎｓ）、ＳＩＲＴ６によりリボシル化されることが過去に示されたヒトＰＡＲＰ１とのインキュベーションにより、ｍＡＤＰｒ活性を評価した。自己リボシル化と同様に、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、より高いＰＡＲＰ１リボシル化活性を呈した（図１４）。奇妙にも、両方の単一変異体は、高い活性を有したが、Ａ３１３Ｓアレルは、Ｎ３０８ＫよりもｃｅｎｔＳＩＲＴ６に類似していた（図１４）。これらのデータから、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６が増強したｍＡＤＰｒ活性を呈することが示される。
【0191】
これらのエレメントのサイレンシングの欠如は、ＳＩＲＴ６ ＫＯマウスにおいて、加齢に伴う無菌性炎症に寄与し、早期老化様表現型を駆動する。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がＬＩＮＥ１トランスポゾンをサイレンシングする能力を評価するために、ＳＩＲＴ６のアレルを発現するクマート誘導型線維芽細胞を、用いた。ＬＩＮＥ１の進化的に活性のあるファミリーの５’および３’の両方のバイアス領域（ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）のｑＲＴ－ＰＣＲ分析はいずれも、Ｎ３０８Ｋアレルと同様に、野生型ＳＩＲＴ６と比較して、ＬＩＮＥ１抑制を増強することを示した（図１５）。Ａ３１３Ｓアレルは、より強い抑制への傾向をわずかに示したを、３’バイアスについて評価すると、野生型ＳＩＲＴ６に対して有意な改善を示さなかった。これらの結果から、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６が長寿において機能的に示唆されるＬＩＮＥ１エレメントのサイレンシングにおいてより効率的であることが示される。
【0192】
ＤＳＢ修復を促進する際のＳＩＲＴ６アレルの間の差を定量するために、Ｉ－ＳｃｅＩ酵素により誘導した染色体ＤＳＢの非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）修復を測定するインビボＧＦＰに基づくアッセイが用いられた。ＳＩＲＴ６の異なるアレルを、ＮＨＥＪおよびＨＲレポーターテロメラーゼ不死化ヒト包皮線維芽細胞株において一過性発現した。同量のｃｅｎｔＳＩＲＴ６が野生型ＳＩＲＴ６よりもＮＨＥＪおよびＨＲをそれぞれ２．５倍および２倍大きく刺激することが見出した（図１６Ａ～１６Ｂ）。同様に、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６を発現するクマートＳＩＲＴ６線維芽細胞において、γＨ２ＡＸフォーカスの基礎レベルが単一アレルまたは野生型ＳＩＲＴ６のどちらかで観察されたレベルと比較して５０％低減されることが観察された（図１７）。まとめると、これらのデータは、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルがＤＮＡ修復活性の増強を誘発することが示している。
【0193】
次に、異なるＳＩＲＴ６アレルがストレスにおいて異なる影響を有するかどうかを、比較した。クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞を利用して、細胞を、γ線に曝露され、ＤＳＢの分解を、γＨ２ＡＸ免疫染色を介して経時的に評価した。野生型およびｃｅｎｔＳＩＲＴ６を発現する細胞の両方が、曝露の直後に類似レベルのγＨ２ＡＸフォーカスを有したが、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６を発現する細胞株は、改善した回復率を示した（図１８）。さらに、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６発現細胞が酸化ストレスに誘導したアポトーシスにより抵抗性があることが見出した（図１９Ａ～１９Ｂ）。対照的に、クマート誘導の非存在下では、全ての細胞株が、酸化ストレス後の生存率に有意差を示さなかった（図１９Ａ）。まとめると、これらの結果から、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がＤＳＢ修復およびＤＮＡ損傷への抵抗性を改善することが示される。
【0194】
ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がゲノム維持を増強することをさらに確認するために、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルを担持するノックインヒト胚性幹細胞を、作製した。２種の百寿者変異を、ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳ９を用いて導入し、シーケンシングにより確認した。２種の独立したノックインクローンを、作製され、ＭＳＣに分化させた。ＭＳＣにその後、直鎖状ＮＨＥＪおよびＨＲ ＧＦＰレポーターをトランスフェクトした。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルを宿す細胞は、高い修復効率を示した（図２９Ａ～２９Ｂ）。これらの細胞はまた、強力なＤＮＡ損傷剤であるメタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）によって処置すると、生存率の上昇および５３ＢＰ１フォーカス数の低下を示した（図２９Ｃ～２９Ｄ）。興味深いこととして、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６ノックイン細胞は、ＳＩＲＴ６のより高いタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルを示し（図２９Ｅ～２９Ｆ）、百寿者変異がＳＩＲＴ６酵素活性を調整することに加え、ｍＲＮＡ安定性を上昇させることを示唆した。ＣＲＩＳＰＲノックイン細胞において同レベルのＳＩＲＴ６を比較することはできなかったため、インビボアッセイの大部分は、クマート細胞に依存した。
【0195】
ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルの腫瘍細胞殺滅能力を評価するために、ＳＩＲＴ６アレルを、２種の一般的腫瘍細胞株、つまりＨＴ１０８０線維芽細胞腫細胞およびＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、両方のがん細胞株において約２倍低い接着生存細胞を示した（図２０Ａ）。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルは、野生型ＳＩＲＴ６アレルよりも少なくとも２倍高いアポトーシスレベルを惹起した（図２０Ｂ～２０Ｃ）。これらのデータは、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６が野生型同等物よりもロバストな抗腫瘍活性を付与することを示す。
【0196】
ｃｅｎｔＳＩＲＴ６変異は、ＳＩＲＴ６の可撓性Ｃ末端に位置し、タンパク質－タンパク質相互作用に影響を及ぼし得るため、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６および野生型アレルの相互作用を、比較した。ＳＩＲＴ６に対する抗体を用いて、クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞からのＳＩＲＴ６相互作用タンパク質を免疫沈降させ、正確な定量を可能にするタンデム質量タグ（ＴＭＴ）での質量分析によりそれらを分析した。複数の相互作用タンパク質を、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルにより濃縮した（表７）。
【表7】
【0197】
タンパク質を、クマート誘導型ＳＩＲＴ６細胞株から調製し、ＳＩＲＴ６抗体によって免疫沈澱させ、ウサギ免疫前血清を、対照として用いた。質量分析による分析の前に、試料を、タンデム質量タグで標識した。
【0198】
野生型ＳＩＲＴ６よりも強力な、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６との相互作用を示した最も顕著なタンパク質は、ＬＭＮＡおよびビメンチン（ＶＩＭＥ）であり、それぞれ３８および４０ペプチドを示した。これらのタンパク質は両者とも、ＳＩＲＴ６と相互作用することが知られており、ＬＭＮＡは、ＳＩＲＴ６活性を刺激することが示された。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６セットにおいて、相互作用の欠如または獲得は明らかでなく、新規なアレルの影響が既存のＳＩＲＴ６機能を増強することにあり得ることを示した。
【0199】
ＬＭＮＡは、核構成において中枢的役割を担う核足場タンパク質であり、加齢にも関与する。ＬＭＮＡ ＳＮＰは、ヒト百寿者において同定されたが、ＬＭＮＡの異常なプロセシングは、ヒトの早期老化症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症をもたらす。百寿者から単離された線維芽細胞は、高レベルのＬＭＮＡ前駆体を有することも示され、調整されたＬＭＮＡ機能が早期老化と例外的長寿の両方に関連することを示唆した。ＳＩＲＴ６とＬＭＮＡとの相互作用に関する質量分析データを確認するために、ｃｏ－ＩＰをＳＩＲＴ６抗体によって実施し、その後、クマートＳＩＲＴ６線維芽細胞を用いてＬＭＮＡ抗体によるウェスタンブロットを実施した。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は実際に、野生型ＳＩＲＴ６アレルよりも強力にＬＭＮＡと会合することが見出され（図２１および図２２）、その影響は、ＬＭＮＡ抗体によるｃｏ－ＩＰ、およびその後のＳＩＲＴ６抗体によるウェスタンブロットにより評価したとおり相互的であった（図２１および図２３）。まとめると、これらの結果は、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６が野生型同等物よりも強力にＬＭＮＡと相互作用することが実証する。
【0200】
ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルのｍＡＤＰｒ活性が増強することを前提として、次に、ｍＡＤＰｒ抗体を用いてＬＭＮＡのリボシル化状態を評価した。ｍＡＤＰｒ特異性抗体を用いてクマートＳＩＲＴ６線維芽細胞で実施したＳＩＲＴ６ ＩＰでは、精製ＳＩＲＴ６タンパク質によりインビトロで実証したとおり（図１３）、インビボでｃｅｎｔＳＩＲＴ６がよりリボシル化されることが示した（図２４）。ｍＡＤＰｒ特異性抗体を用いたＩＰおよび続く抗ＬＭＮＡ抗体でのウェスタンブロットで、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルの存在下でのＬＭＮＡのリボシル化の増加が明らかとなった（図２５）。ＬＭＮＡは、インビボで複数の残基でＡＤＰリボシル化されることが報告されている。
【0201】
ｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルがＬＭＮＡと他のタンパク質との相互作用に影響を及ぼし得るという仮説を立てた。これを試験するために、野生型ＳＩＲＴ６またはｃｅｎｔＳＩＲＴ６アレルのどちらかを発現するクマート線維芽細胞からのＬＭＮＡを、免疫沈降させ、ＴＭＴ標識を用いた定量的タンパク質相互作用分析、およびその後の質量分析を、実施した。多くのタンパク質が、ＬＭＮＡとの類似の相互作用を示したが、存在するＳＩＲＴ６アレルとは無関係に、大きなタンパク質群が、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６の存在下でのＬＭＮＡとの相互作用の増強を示した（図２６）。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６により増強されたＬＭＩＮＡ相互作用のパートナーは、ＥＬＡＶＬ１、ＦＵＳ、ＰＣＢＰ２、ＳＡＦＢ、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＴＦＩＰ１１、ＴＨＲＡＰ３、ＢＣＬＡＦ１、およびＵ２ＡＦＢＰを含み、全てのタンパク質が、ＤＮＡ損傷応答とＲＮＡプロセシングとの連携を容易にする。ＳＩＲＴ６およびＬＭＩＮＡ ＩＰで同定されたタンパク質の多くは、ＡＤＰリボシル化され（図２６に六角形で示される）、ＳＩＲＴ６またはＳＩＲＴ６活性化ＰＡＲＰ１によるＡＤＰリボシル化がこれらの相互作用を媒介することにおいて役割を担い得ることを示唆する。まとめると、これらのデータは、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がＤＮＡ修復を促進してＬＩＮＥ１エレメントを抑制する増強された能力を有し、それが、増強されたｍＡＤＰｒ活性およびＬＭＮＡとのより強力な相互作用により媒介される可能性があることを示す。
【0202】
考察
百寿者コホートにおいて増強したｍＡＤＰ活性に関連する有益なＳＩＲＴ６変異の発見は、上昇したＳＩＲＴ６活性がヒトの長寿に利益をもたらすことを示唆する。上昇したＳＩＲＴ６活性は、モデル生物においてより長い生存期間と相関するが、ＳＩＲＴ６の酵素活性のどれが長寿の中枢であるかは、明らかにされていない。興味深いこととして、ヒトのＳＩＲＴ６デアセチル化活性の欠如またはサルのＳＩＲＴ６ノックアウトは、早期老化よりむしろ重度の発達表現型をもたらし、少なくとも霊長類では、ＳＩＲＴ６の脱アセチル化活性が発達に必要とされるが、必ずしも成人の長寿には必須でないことを示唆している。脱アセチル化とｍＡＤＰｒ酵素活性とのバランスの変化は、ｍＡＤＰｒ活性を必要とする、ＤＮＡ修復、ＬＩＮＥ１抑制およびがん細胞殺滅におけるＳＩＲＴ６機能の増強をもたらす。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６バリアントはまた、ＬＭＮＡへの増強された結合を示し、それがさらに、ＳＩＲＴ６酵素活性の直接刺激を介して、そしてＬＭＮＡと他のＬＭＮＡ複合体成分との連携した相互作用により、ＤＮＡ修復およびクロマチン構成においてその機能を促進し得る。
百寿者コホートにおいて増強したｍＡＤＰ活性に関連する有益なＳＩＲＴ６変異の発見は、上昇したＳＩＲＴ６活性がヒトの長寿に利益をもたらすことを示唆する。上昇したＳＩＲＴ６活性は、モデル生物においてより長い生存期間と相関するが、ＳＩＲＴ６の酵素活性のどれが長寿の中枢であるかは、明らかにされていない。興味深いこととして、ヒトのＳＩＲＴ６デアセチル化活性の欠如またはサルのＳＩＲＴ６ノックアウトは、早期老化よりむしろ重度の発達表現型をもたらし、少なくとも霊長類では、ＳＩＲＴ６の脱アセチル化活性が発達に必要とされるが、必ずしも成人の長寿には必須でないことを示唆している。脱アセチル化とｍＡＤＰｒ酵素活性とのバランスの変化は、ｍＡＤＰｒ活性を必要とする、ＤＮＡ修復、ＬＩＮＥ１抑制およびがん細胞殺滅におけるＳＩＲＴ６機能の増強をもたらす。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６バリアントはまた、ＬＭＮＡへの増強された結合を示し、それがさらに、ＳＩＲＴ６酵素活性の直接刺激を介して、そしてＬＭＮＡと他のＬＭＮＡ複合体成分との連携した相互作用により、ＤＮＡ修復およびクロマチン構成においてその機能を促進し得る。
【0203】
実施例２
材料と方法
細胞培養
３Ｔ３－Ｌ１、ＬＸ２、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ｂ（全てマナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ－ＡＴＣＣから購入）およびＷＳＦ（ＮＪ州のＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｆ９６６５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｌ０１８０、Ｂｉｏｗｅｓｔ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標） Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×、３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン溶液（Ｌ００２２、Ｂｉｏｗｅｓｔ）、１００ｎＭピルビン酸ナトリウム（１１３６０、Ｇｉｂｃｏ）、ならびに非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ １１１４０、１００×、Ｇｉｂｃｏ）を補充した高グルコース（４．５ｇ／ｌ）ＤＭＥＭ（ＬＭ－Ｄ１１０８／５００、Ｂｉｏｓｅｒａ）からなる基本培地中、３７℃の５％ＣＯ２／湿潤大気中で成長させた。培地を、日常的に２日ごとに交換し、細胞を、９０％コンフルエンスに達すると、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（１×、Ｇｉｂｃｏ）を用いて継代培養した。
材料と方法
細胞培養
３Ｔ３－Ｌ１、ＬＸ２、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ｂ（全てマナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ－ＡＴＣＣから購入）およびＷＳＦ（ＮＪ州のＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｆ９６６５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｌ０１８０、Ｂｉｏｗｅｓｔ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標） Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×、３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン溶液（Ｌ００２２、Ｂｉｏｗｅｓｔ）、１００ｎＭピルビン酸ナトリウム（１１３６０、Ｇｉｂｃｏ）、ならびに非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ １１１４０、１００×、Ｇｉｂｃｏ）を補充した高グルコース（４．５ｇ／ｌ）ＤＭＥＭ（ＬＭ－Ｄ１１０８／５００、Ｂｉｏｓｅｒａ）からなる基本培地中、３７℃の５％ＣＯ２／湿潤大気中で成長させた。培地を、日常的に２日ごとに交換し、細胞を、９０％コンフルエンスに達すると、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（１×、Ｇｉｂｃｏ）を用いて継代培養した。
【0204】
ＩＨＨ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＶＡ州マナサス）から購入し、２ｇ／ｌグルコースを含有し、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン溶液、２０ｍＵ／ｍｌインスリン、ならびに５０ｎＭデキサメタゾンを補充したウィリアムズＥ培地（１２５５１０３２、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃の５％ＣＯ２／湿潤大気中で培養した。細胞培養培地を、２日ごとに交換し、９０％コンフルエンシーに達するとＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて継代培養した。
【0205】
顕微鏡分析の目的で、全ての適当な細胞株を、標準の培養プロトコルをさらに改変せずに、０．２％ゼラチンでコーティングしたガラスカバースリップに播種した。組織線維形成に及ぼすＳＩＲＴ６バリアントおよびそれらの過剰発現の影響の評価のために、適当な細胞株を、線維形成工程の強力な誘導物質としての、１０および２０ｎｇ／ｍｌの濃度の組換えＴＧＦ－β１タンパク質（１００－２１Ｃ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国）で処置した、または処置しなかった。
【0206】
レンチウイルス感染およびＳＩＲＴ６細胞株の樹立
コンフルエンスに達した後の細胞を、分離し、成長表面積２ｃｍ２の２４ウェルプレートに播種し、そこで５０×１０４細胞／ウェルで播種した。播種直後の細胞に、４μｇ／ｍＬポリブレントランスフェクション試薬（ＴＲ－１００３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した基礎ＤＭＥＭ培地中、１～２のＭＯＩでＳＩＲＴ６構築物：ＬＶ２－ＥＭＰＴＹ－ＩｒｅｓＫａｔ２Ｓ、ＬＶ２－ＳＩＲＴ６（ｗｔ）－ＩｒｅｓＫａｔ２Ｓ、ＬＶ２－ＳＩＲＴ６（Ｎ３０８Ｋ）－ＩｒｅｓＫａｔ２ＳおよびＬＶ２－ＳＩＲＴ６（ｃｅｎｔＳＩＲＴ６）－ＩｒｅｓＫａｔ２Ｓを含有するレンチウイルスを感染させた。細胞を、レンチウイルス構築物と共に２４時間の期間、培養し、その後、新鮮な培地を、添加し、細胞を、さらに４８時間培養した。その後、細胞を、５００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（Ｈ３２７４、Ｍｅｒｃｋ）を含む基礎ＤＭＥＭ培地で構成した選択培地で５日間、処置した（１日おきに、培地を新鮮な培地に交換した）。選択の後、残留する細胞を、増殖させ、ｅｘ／ｅｍ ５８８／６３５の蛍光顕微鏡により蛍光Ｋａｔ２Ｓシグナルの存在についてチェックした。ＳＩＲＴ６過剰発現を、ウェスタンブロットにより確認した。
コンフルエンスに達した後の細胞を、分離し、成長表面積２ｃｍ２の２４ウェルプレートに播種し、そこで５０×１０４細胞／ウェルで播種した。播種直後の細胞に、４μｇ／ｍＬポリブレントランスフェクション試薬（ＴＲ－１００３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した基礎ＤＭＥＭ培地中、１～２のＭＯＩでＳＩＲＴ６構築物：ＬＶ２－ＥＭＰＴＹ－ＩｒｅｓＫａｔ２Ｓ、ＬＶ２－ＳＩＲＴ６（ｗｔ）－ＩｒｅｓＫａｔ２Ｓ、ＬＶ２－ＳＩＲＴ６（Ｎ３０８Ｋ）－ＩｒｅｓＫａｔ２ＳおよびＬＶ２－ＳＩＲＴ６（ｃｅｎｔＳＩＲＴ６）－ＩｒｅｓＫａｔ２Ｓを含有するレンチウイルスを感染させた。細胞を、レンチウイルス構築物と共に２４時間の期間、培養し、その後、新鮮な培地を、添加し、細胞を、さらに４８時間培養した。その後、細胞を、５００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（Ｈ３２７４、Ｍｅｒｃｋ）を含む基礎ＤＭＥＭ培地で構成した選択培地で５日間、処置した（１日おきに、培地を新鮮な培地に交換した）。選択の後、残留する細胞を、増殖させ、ｅｘ／ｅｍ ５８８／６３５の蛍光顕微鏡により蛍光Ｋａｔ２Ｓシグナルの存在についてチェックした。ＳＩＲＴ６過剰発現を、ウェスタンブロットにより確認した。
【0207】
３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞への分化
細胞を、５００μＭ ＩＢＭＸ（Ｉ５８７９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μＭロシグリタゾン（Ｉ５８７９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５０ｎＭデキサメタゾン（Ｄ４９０２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭ ３，３’，５’－トリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ６３９７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１７μＭ Ｄ－パントテン酸（２１２１０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｔ８１５８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μｇ／ｍｌインスリン（Ｉ９２７８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加的に補充した標準の基礎高グルコースＤＭＥＭ培地からなる分化培地中で７２時間の期間、インキュベートすることにより、３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の分化を、１００％コンフルエンシーでの播種の２日後に誘導した。その後、細胞を、２５ｎＭデキサメタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌインスリンのみを補充した基礎高グルコースＤＭＥＭ培地からなる維持培地で少なくとも４日の期間、維持する。脂肪細胞分化および／または細胞内脂質の蓄積を、ＢＯＤＩＰＹ色素（１μｇ／ｍｌ）による３０分間の蛍光標識（ｅｘ／ｅｍ ４９３／５０３）および１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ対比染色による３０分間の蛍光標識を利用して評価した。その後、蛍光を、適当な励起／発光フィルターを具備したＡｇｌｉｅｎｔ ＢｉｏＴｅｋ ＦＬ×８００マイクロプレート蛍光リーダにより捕捉した。
細胞を、５００μＭ ＩＢＭＸ（Ｉ５８７９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μＭロシグリタゾン（Ｉ５８７９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５０ｎＭデキサメタゾン（Ｄ４９０２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭ ３，３’，５’－トリヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ６３９７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１７μＭ Ｄ－パントテン酸（２１２１０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｔ８１５８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μｇ／ｍｌインスリン（Ｉ９２７８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加的に補充した標準の基礎高グルコースＤＭＥＭ培地からなる分化培地中で７２時間の期間、インキュベートすることにより、３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の分化を、１００％コンフルエンシーでの播種の２日後に誘導した。その後、細胞を、２５ｎＭデキサメタゾンおよび０．１μｇ／ｍｌインスリンのみを補充した基礎高グルコースＤＭＥＭ培地からなる維持培地で少なくとも４日の期間、維持する。脂肪細胞分化および／または細胞内脂質の蓄積を、ＢＯＤＩＰＹ色素（１μｇ／ｍｌ）による３０分間の蛍光標識（ｅｘ／ｅｍ ４９３／５０３）および１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ対比染色による３０分間の蛍光標識を利用して評価した。その後、蛍光を、適当な励起／発光フィルターを具備したＡｇｌｉｅｎｔ ＢｉｏＴｅｋ ＦＬ×８００マイクロプレート蛍光リーダにより捕捉した。
【0208】
細胞生存率アッセイ
細胞を、９６ウェルプレートに２０００生存可能細胞／ウェルで播種し、２４、４８および７２時間後に、培養培地を、除去し、核染色のために１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ色素を含有する培地と交換した。３７での２０分間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光シグナルを、ｅｘ／ｅｍ ３５５／４８８のＡｇｌｉｅｎｔ ＢｉｏＴｅｋ ＦＬ×８００マイクロプレート蛍光リーダで測定した。異なる時点とＴ０とのシグナルの比を、生存可能細胞の相対的パーセンテージとして用いた。
細胞を、９６ウェルプレートに２０００生存可能細胞／ウェルで播種し、２４、４８および７２時間後に、培養培地を、除去し、核染色のために１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ色素を含有する培地と交換した。３７での２０分間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光シグナルを、ｅｘ／ｅｍ ３５５／４８８のＡｇｌｉｅｎｔ ＢｉｏＴｅｋ ＦＬ×８００マイクロプレート蛍光リーダで測定した。異なる時点とＴ０とのシグナルの比を、生存可能細胞の相対的パーセンテージとして用いた。
【0209】
遺伝子発現測定
ゲノムＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用い、製造業者の使用説明書に従ってカラム分離技術により単離した。少なくとも４つの生物学的反復実験を、各処置群で調製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での単離総ＲＮＡの定量の後、総単離ＲＮＡ １μｇを用いて、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（４３６８８１４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを調製した。リアルタイムＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＳＹＢＲ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（４４７２９０８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて少なくとも２つの技術的反復実験で実施した。ＰＣＲ反応物を、１０μｌ容量に保持し、２５０ｎｇ ｃＤＮＡ／ウェルを、インプット量として用いた。この試験で用いたプライマー配列を、表８に列挙する。
ゲノムＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用い、製造業者の使用説明書に従ってカラム分離技術により単離した。少なくとも４つの生物学的反復実験を、各処置群で調製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での単離総ＲＮＡの定量の後、総単離ＲＮＡ １μｇを用いて、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（４３６８８１４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを調製した。リアルタイムＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＳＹＢＲ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（４４７２９０８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて少なくとも２つの技術的反復実験で実施した。ＰＣＲ反応物を、１０μｌ容量に保持し、２５０ｎｇ ｃＤＮＡ／ウェルを、インプット量として用いた。この試験で用いたプライマー配列を、表８に列挙する。
【表8】
【0210】
テロメア長
定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いて、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌのＲｅｌａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｌｅｎｇｔｈ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（＃８９０９）に基づいて、ＬＶトランスフェクトＷＳＦ細胞および非処置ＷＳＦの平均テロメア長の変化を決定した。キットは、試料の平均テロメア長を直接比較する。テロメアプライマーセットは、テロメア配列を認識および増幅する。シングルコピーリファレンス（ＳＣＲ）プライマーセットは、ヒト染色体１７上の１００ｂｐ長領域を認識および増幅して、データ正規化のための参照として役立つ。注意深く設計したプライマーは、（ｉ）信頼できる定量のための高い効率、および（ｉｉ）非特異的増幅がないことを確実にする。各プライマーセットは、融解曲線分析を用いるｑＰＣＲ、および増幅特異性のためのゲル電気泳動、および増幅効率のためのテンプレート系列希釈により検証されている。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ ハイデン）を用いて単離した。各ＰＣＲ反応物は、ゲノムＤＮＡ試料（０．０１μｇ／μＬ）、テロメアプライマー、２×ｑＰＣＲマスターミックス、およびヌクレアーゼ不含水を含有した。プライマー－プローブ・リアルタイムＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。全ての反応を、二重測定で実施し、テンプレート対照を、各測定に含んだ。増幅を、以下の条件下で実施した：９５℃で１０分間の変性、その後、９５℃で２０秒間の変性、５２℃で２０秒間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸長を３２サイクル。平均テロメア長を、製造業者の使用説明書に従って計算した。
定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いて、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌのＲｅｌａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｌｅｎｇｔｈ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（＃８９０９）に基づいて、ＬＶトランスフェクトＷＳＦ細胞および非処置ＷＳＦの平均テロメア長の変化を決定した。キットは、試料の平均テロメア長を直接比較する。テロメアプライマーセットは、テロメア配列を認識および増幅する。シングルコピーリファレンス（ＳＣＲ）プライマーセットは、ヒト染色体１７上の１００ｂｐ長領域を認識および増幅して、データ正規化のための参照として役立つ。注意深く設計したプライマーは、（ｉ）信頼できる定量のための高い効率、および（ｉｉ）非特異的増幅がないことを確実にする。各プライマーセットは、融解曲線分析を用いるｑＰＣＲ、および増幅特異性のためのゲル電気泳動、および増幅効率のためのテンプレート系列希釈により検証されている。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ ハイデン）を用いて単離した。各ＰＣＲ反応物は、ゲノムＤＮＡ試料（０．０１μｇ／μＬ）、テロメアプライマー、２×ｑＰＣＲマスターミックス、およびヌクレアーゼ不含水を含有した。プライマー－プローブ・リアルタイムＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。全ての反応を、二重測定で実施し、テンプレート対照を、各測定に含んだ。増幅を、以下の条件下で実施した：９５℃で１０分間の変性、その後、９５℃で２０秒間の変性、５２℃で２０秒間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸長を３２サイクル。平均テロメア長を、製造業者の使用説明書に従って計算した。
【0211】
テロメラーゼ活性の定量
ＬＶ ＷＳＦトランスフェクト細胞株および正常ＷＳＦ細胞の相対的テロメラーゼ活性を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎアッセイキット（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌのＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ［ＴＡＱ］、米国ＣＡ州カールズバッド）を用いて、製造業者の推奨に従い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのｑＰＣＲにより評価した。３００万個の細胞を、各試料のために回収した。各実験で、２種の対照：陰性テロメラーゼおよび陽性細胞溶解物（Ｃａｔ＃８９２８ｅ）を、用いた。ＰＣＲを、テロメラーゼ反応後試料 １μＬ、ＴＰＳ ２μＬ、２×ｑＰＣＲ ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）１０μＬおよびヌクレアーゼ不含水７μＬを用いて、最終容量２０μＬで実施した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９５℃で１０分間、その後９５℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で４５秒間を３６サイクル。全ての反応を、三重測定で実施した。データ解析を、製造業者の使用説明書に従って実行した。
ＬＶ ＷＳＦトランスフェクト細胞株および正常ＷＳＦ細胞の相対的テロメラーゼ活性を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎアッセイキット（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌのＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ［ＴＡＱ］、米国ＣＡ州カールズバッド）を用いて、製造業者の推奨に従い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのｑＰＣＲにより評価した。３００万個の細胞を、各試料のために回収した。各実験で、２種の対照：陰性テロメラーゼおよび陽性細胞溶解物（Ｃａｔ＃８９２８ｅ）を、用いた。ＰＣＲを、テロメラーゼ反応後試料 １μＬ、ＴＰＳ ２μＬ、２×ｑＰＣＲ ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）１０μＬおよびヌクレアーゼ不含水７μＬを用いて、最終容量２０μＬで実施した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９５℃で１０分間、その後９５℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で４５秒間を３６サイクル。全ての反応を、三重測定で実施した。データ解析を、製造業者の使用説明書に従って実行した。
【0212】
イムノブロッティング分析
細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて培養プレートから回収し、１×ＰＢＳで洗浄し、３００ｇで遠心分離した。上清を廃棄した後、得られたペレットを、Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（１００×、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補充した１×Ｒｉｐｐａ溶解緩衝液（２０－１８８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）で再懸濁し、１０分ごとに激しくボルテックス処理しながら氷中（４℃）で３０分間溶解した。１０，０００ｇで１０分間遠心沈降させた後、上清を新しいバイアルに移し、タンパク質の濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、製造業者の使用説明書に従って測定した。同量のタンパク質試料（少なくとも２０μｇ）を、１ｘレムリーサンプル緩衝液（１６１０７４７、４×、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合し、９５℃で５分間煮沸して氷中で冷却した後、同量のタンパク質（４０μｌ）を、１０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（４５６８０３４、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にロードし、１２０ボルトで４５分間測定する電気泳動により分離した。タンパク質の移動を、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ＲＴＡ Ｍｉｎｉ ０．４５μｍ ＬＦ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｋｉｔ（１７０４２７４、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と、１，３Ａおよび２５ＶのＢｉｏ－Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍと、を用いてＰＶＤＦ膜で１０分間実施した。膜をその後、ＴＢＳＴ緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解した５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｐ６１５４、ＢｉｏＷｅｓｔ）で少なくとも３０分間ブロックし、ＴＢＳＴブロッキング溶液に適当な希釈率で希釈した特異的一次抗体（以下参照）と共にインキュベートした。ＴＢＳＴ緩衝液での３回の洗浄に続いて、膜を、ＴＢＳＴブロッキング緩衝液で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートした。ＴＢＳＴでのさらなる３回の洗浄の後、タンパク質を、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１７０５０６１、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により顕色し、シグナルを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムで検出した。定量的測定のために、スキャンした膜を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）ソフトウエア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて解析した。
細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて培養プレートから回収し、１×ＰＢＳで洗浄し、３００ｇで遠心分離した。上清を廃棄した後、得られたペレットを、Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（１００×、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補充した１×Ｒｉｐｐａ溶解緩衝液（２０－１８８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）で再懸濁し、１０分ごとに激しくボルテックス処理しながら氷中（４℃）で３０分間溶解した。１０，０００ｇで１０分間遠心沈降させた後、上清を新しいバイアルに移し、タンパク質の濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、製造業者の使用説明書に従って測定した。同量のタンパク質試料（少なくとも２０μｇ）を、１ｘレムリーサンプル緩衝液（１６１０７４７、４×、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合し、９５℃で５分間煮沸して氷中で冷却した後、同量のタンパク質（４０μｌ）を、１０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（４５６８０３４、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にロードし、１２０ボルトで４５分間測定する電気泳動により分離した。タンパク質の移動を、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ＲＴＡ Ｍｉｎｉ ０．４５μｍ ＬＦ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｋｉｔ（１７０４２７４、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と、１，３Ａおよび２５ＶのＢｉｏ－Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍと、を用いてＰＶＤＦ膜で１０分間実施した。膜をその後、ＴＢＳＴ緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解した５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｐ６１５４、ＢｉｏＷｅｓｔ）で少なくとも３０分間ブロックし、ＴＢＳＴブロッキング溶液に適当な希釈率で希釈した特異的一次抗体（以下参照）と共にインキュベートした。ＴＢＳＴ緩衝液での３回の洗浄に続いて、膜を、ＴＢＳＴブロッキング緩衝液で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートした。ＴＢＳＴでのさらなる３回の洗浄の後、タンパク質を、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１７０５０６１、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により顕色し、シグナルを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステムで検出した。定量的測定のために、スキャンした膜を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）ソフトウエア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて解析した。
【0213】
この試験で用いられた抗体：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国ＭＡ州）－ウサギ抗Ａｋｔ（１：１０００）、ウサギ抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（１：１０００）、ウサギ抗ビメンチン（１：１０００）、ウサギ抗ヒストンＨ３（Ｄ１Ｈ２、１：１０００）、Ａｂｃａｍ（ＵＫ）－マウス抗－β－アクチンＨＲＰコンジュゲート抗体（ＡＣ－１５；１：２０００）、マウス抗ＧＡＰＤＨモノクローナルＨＲＰコンジュゲート抗体（１：２０００）、ウサギ抗コラーゲンＩ（１：１０００）、ウサギ抗αＳＭＡ（１：１０００）、ウサギ抗ＳＩＲＴ６抗体（１：１０００、ＥＰＲ１８４６３）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国ＣＡ州）－マウスＩｇＧ１ ＧＡＰＤＨモノクローナルＨＲＰコンジュゲート抗体（１：２０００）、二次ヒツジ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ結合（１：２０００）。
【0214】
３Ｄスフェロイド培養
細胞スフェロイドの作製のための、細胞を、細胞培養のためのＢＩＯＦＬＯＡＴ（商標） ９６ウェル丸底超低接着プレートに１００００生存可能細胞／ウェルで播種した。各ＩＨＨ ＬＶトランスフェクト細胞株（ＣＴＬ／ＥＭＰＴＹ、ＷＴ、Ｎ３０８ＫおよびｃｅｎｔＳＩＲＴ６）を、正常ＬＸ２細胞または過剰発現ｃｅｎｔＳｉｒｔ６ ＬＸ２細胞のどちらかと２０：１の比で共培養し、肝細胞が主な細胞型で肝星細胞を５％だけ含む肝実質内で、生理学的割合で再生させた。スフェロイドを、先に記載した通り補充した基礎高グルコースＤＭＥＭ培地で成長した。プレートを、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で３日間インキュベートし、その後、スフェロイドを、遊離脂肪酸溶液（ＦＦＡ、Ｌ９６５５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置して、また処置せずに、４８時間培養を維持した。その後、スフェロイドを、回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド＋エオジン溶液で２０分間固定し、１０％スクロース中で２０分間インキュベートし、切断および次の免疫組織学的分析のために組織凍結培地（１４０２０１０８９２６、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）に組み入れた。
細胞スフェロイドの作製のための、細胞を、細胞培養のためのＢＩＯＦＬＯＡＴ（商標） ９６ウェル丸底超低接着プレートに１００００生存可能細胞／ウェルで播種した。各ＩＨＨ ＬＶトランスフェクト細胞株（ＣＴＬ／ＥＭＰＴＹ、ＷＴ、Ｎ３０８ＫおよびｃｅｎｔＳＩＲＴ６）を、正常ＬＸ２細胞または過剰発現ｃｅｎｔＳｉｒｔ６ ＬＸ２細胞のどちらかと２０：１の比で共培養し、肝細胞が主な細胞型で肝星細胞を５％だけ含む肝実質内で、生理学的割合で再生させた。スフェロイドを、先に記載した通り補充した基礎高グルコースＤＭＥＭ培地で成長した。プレートを、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で３日間インキュベートし、その後、スフェロイドを、遊離脂肪酸溶液（ＦＦＡ、Ｌ９６５５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置して、また処置せずに、４８時間培養を維持した。その後、スフェロイドを、回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド＋エオジン溶液で２０分間固定し、１０％スクロース中で２０分間インキュベートし、切断および次の免疫組織学的分析のために組織凍結培地（１４０２０１０８９２６、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）に組み入れた。
【0215】
組織学的免疫染色
組織凍結培地中の包埋および瞬間凍結したスフェロイドの試料を、Ｃｒｙｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）により－２０℃で７μｍに切り出し、さらなる使用のために－８０℃で貯蔵した。肝臓組織線維形成に及ぼすＳＩＲＴ６バリアントおよびその過剰発現の影響を評価するために、スフェロイド組織切片を免疫標識して、コラーゲン１Ａを検出した。スライドを１×ＰＢＳで１回洗浄し、組織凍結培地に溶解し、０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０および５％ＢＳＡを補充した１×ＰＢＳでブロックした。一次抗体のウサギ抗コラーゲンＩ（１：５００、ａｂ３４７１０、Ａｂｃａｍ）を、ＤＡＫＯ抗体希釈液（Ｓ２０２２３０－２、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈して、検査室温度の加湿チャンバー内で一夜インキュベートした。１×ＰＢＳでの連続３回の洗浄の後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７をカップリングした二次抗体の（１：５００）ロバ抗ウサギＩｇＧのミックスを、適用し、少なくとも１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、スライドをＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）溶液で１５分間対比染色し、Ｍｏｗｉｏｌ硬化培地で封入した。硬化（４℃で一夜）の後、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０カメラを具備したＡｘｉｏ ｓｃａｎ Ｚ．１（ＺＥＩＳＳ）で画像を獲得し、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ、米国）解析プログラムを用いて、全ての免疫蛍光画像を評価した。各条件／細胞株ごとの少なくとも５のスフェロイドを、連続３回の独立した実験で用い、スフェロイド試料中の線維形成、即ちコラーゲン１Ａの存在量を、１００×倍率でＤＡＰＩ蛍光により輪郭を描かれた全スフェロイド面積の％として評価した。
組織凍結培地中の包埋および瞬間凍結したスフェロイドの試料を、Ｃｒｙｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）により－２０℃で７μｍに切り出し、さらなる使用のために－８０℃で貯蔵した。肝臓組織線維形成に及ぼすＳＩＲＴ６バリアントおよびその過剰発現の影響を評価するために、スフェロイド組織切片を免疫標識して、コラーゲン１Ａを検出した。スライドを１×ＰＢＳで１回洗浄し、組織凍結培地に溶解し、０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０および５％ＢＳＡを補充した１×ＰＢＳでブロックした。一次抗体のウサギ抗コラーゲンＩ（１：５００、ａｂ３４７１０、Ａｂｃａｍ）を、ＤＡＫＯ抗体希釈液（Ｓ２０２２３０－２、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈して、検査室温度の加湿チャンバー内で一夜インキュベートした。１×ＰＢＳでの連続３回の洗浄の後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７をカップリングした二次抗体の（１：５００）ロバ抗ウサギＩｇＧのミックスを、適用し、少なくとも１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、スライドをＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）溶液で１５分間対比染色し、Ｍｏｗｉｏｌ硬化培地で封入した。硬化（４℃で一夜）の後、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０カメラを具備したＡｘｉｏ ｓｃａｎ Ｚ．１（ＺＥＩＳＳ）で画像を獲得し、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ、米国）解析プログラムを用いて、全ての免疫蛍光画像を評価した。各条件／細胞株ごとの少なくとも５のスフェロイドを、連続３回の独立した実験で用い、スフェロイド試料中の線維形成、即ちコラーゲン１Ａの存在量を、１００×倍率でＤＡＰＩ蛍光により輪郭を描かれた全スフェロイド面積の％として評価した。
【0216】
結果
ＳＩＲＴ６野生型、またはヒトの例外的長寿に関連する１つもしくは２つの変異を有するＳＩＲＴ６（ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６）は、種々の細胞株で過剰発現され、これがどのようにして特異的細胞機能に影響を及ぼすかを評価した。
ＳＩＲＴ６野生型、またはヒトの例外的長寿に関連する１つもしくは２つの変異を有するＳＩＲＴ６（ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６）は、種々の細胞株で過剰発現され、これがどのようにして特異的細胞機能に影響を及ぼすかを評価した。
【0217】
ウェルナー症候群モデル
ヒトウェルナー症候群不死化線維芽細胞において、ＳＩＲＴ６ ＷＴ／ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、細胞生存率、増殖またはテロメア長に影響を及ぼさなかった（図３０Ａ～３０Ｂ）。しかしｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、テロメラーゼ活性を低下させた（図３０Ｃ）。
ヒトウェルナー症候群不死化線維芽細胞において、ＳＩＲＴ６ ＷＴ／ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、細胞生存率、増殖またはテロメア長に影響を及ぼさなかった（図３０Ａ～３０Ｂ）。しかしｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、テロメラーゼ活性を低下させた（図３０Ｃ）。
【0218】
逆効果と思われるかもしれないが、ウェルナー症候群不死化線維芽細胞は、発がん性を有し得る、あまり特徴付けがなされていない不死化細胞株である。それゆえ、任意の理論に拘束されることなく、これが当てはまる場合には、テロメラーゼ活性を低下させることは、有益効果になるであろう。
【0219】
ヒト肝細胞がんモデル
ヒト肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞において、ＳＩＲＴ６ ＷＴ／ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６過剰発現は、致死性であり、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６ではより大きな影響が観察した（図３１Ａ～３１Ｂ）。 それゆえ、変異型ＳＩＲＴ６は、がんの処置にとって有用になり得る。
ヒト肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞において、ＳＩＲＴ６ ＷＴ／ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６過剰発現は、致死性であり、ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６ではより大きな影響が観察した（図３１Ａ～３１Ｂ）。 それゆえ、変異型ＳＩＲＴ６は、がんの処置にとって有用になり得る。
【0220】
脂肪生成分化
ＳＩＲＴ６の欠損が低血糖およびエネルギー恒常性の障害をもたらすことが報告されており、ＳＩＲＴ６が脂肪細胞分化を調節することに重要な役割を担う可能性を示唆している。加齢脂肪細胞は、特に高脂肪食摂取の下では、肥大するようになり、インスリン抵抗性になり、広いパターンの炎症促進性サイトカインを生成して、循環するトリグリセリドおよび遊離脂肪酸の増加に寄与し、同時に他の臓器に影響を及ぼして、典型的には肥満に関連する併存疾患をもたらす。その一方で、脂肪生成の増加は、インスリンにより感受性がある新しい脂肪細胞の形成を可能にし、代謝恒常性および炎症レベルの低下に寄与する、脂肪貯蔵能力の上昇およびアディポカインレベルの増加を示す。
ＳＩＲＴ６の欠損が低血糖およびエネルギー恒常性の障害をもたらすことが報告されており、ＳＩＲＴ６が脂肪細胞分化を調節することに重要な役割を担う可能性を示唆している。加齢脂肪細胞は、特に高脂肪食摂取の下では、肥大するようになり、インスリン抵抗性になり、広いパターンの炎症促進性サイトカインを生成して、循環するトリグリセリドおよび遊離脂肪酸の増加に寄与し、同時に他の臓器に影響を及ぼして、典型的には肥満に関連する併存疾患をもたらす。その一方で、脂肪生成の増加は、インスリンにより感受性がある新しい脂肪細胞の形成を可能にし、代謝恒常性および炎症レベルの低下に寄与する、脂肪貯蔵能力の上昇およびアディポカインレベルの増加を示す。
【0221】
本明細書において、結果は、ＳＩＲＴ６が脂肪生成分化の増加において役割を担うことを実証し（図３２）、それはＳＩＲＴ６がエネルギー恒常性におけるこのタンパク質の役割と一致する。ＳＩＲＴ６変異体（ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８ＫおよびｃｅｎｔＳＩＲＴ６）は、この特性を保持しており、これは加齢および加齢に伴う疾患の処置にとって重要である。
【0222】
肝星細胞モデル
α－ＳＭＡ発現は、肝星細胞（ＨＳＣ）活性化の信頼性のあるマーカーおよび肝線維症の重大なバイオマーカーであると考えられている。肝臓では、ＨＳＣは、生理学的組織修復および線維症の発症において中心的な役割を担い、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、炎症工程およびＲＯＳに応答して、「静止期」ＨＳＣから筋線維芽細胞性表現型に分化転換する。
α－ＳＭＡ発現は、肝星細胞（ＨＳＣ）活性化の信頼性のあるマーカーおよび肝線維症の重大なバイオマーカーであると考えられている。肝臓では、ＨＳＣは、生理学的組織修復および線維症の発症において中心的な役割を担い、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、炎症工程およびＲＯＳに応答して、「静止期」ＨＳＣから筋線維芽細胞性表現型に分化転換する。
【0223】
ＳＩＲＴ６ ＷＴ／ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６過剰発現は、細胞生存率または増殖に影響を及ぼさなかった（図３３Ａ）。ＴＧＦベータによってＬＸ２を活性化すると、遺伝子型にかかわらず、レンチウイルス感染による幾つかの線維形成マーカー（ビメンチン、ＴＩＭＰ１）の活性化が遮断される（図３３Ｂ～３３Ｃ）。コラーゲンｍＲＮＡ発現は、ＴＧＦベータにより増加し、ＳＩＲＴ６ ＷＴ／ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ／ｃｅｎｔＳＩＲＴ６過剰発現の影響は認められなかった（図３３Ｄ）。しかし、ｃｅｎｔＳＩＲＴ６は、主要な線維形成性マーカーであるａＳＭＡのｍＲＮＡ発現を有意に減少させた（図３３Ｅ）。
【0224】
対照と比較してｃｅｎｔＳＩＲＴ６ ＬＸ２におけるα－ＳＭＡのより低い遺伝子発現レベルは、肝線維症の防止、および／またはその分解の促進におけるｃｅｎｔＳＩＲＴ６の潜在的な抗線維症効果を示唆している。
【0225】
肝スフェロイドモデル
コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ）は、α－ＳＭＡと共に、重大な線維症マーカーの１種を表す。肝臓におけるその生成は、主に活性化した肝星細胞により増加する。
コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ）は、α－ＳＭＡと共に、重大な線維症マーカーの１種を表す。肝臓におけるその生成は、主に活性化した肝星細胞により増加する。
【0226】
ＩＨＨ細胞、および全細胞塊の５％のＬＸ２（ヒト肝星細胞）から形成されるスフェロイドを、作製した。スフェロイドを、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）で処置したか、または処置せず、免疫蛍光によるコラーゲン生成を評価した（図３４Ａ）。
【0227】
ｃｅｎｔＳＩＲＴ６をトランスフェクトしたＩＨＨを含むＩＨＨ／ＬＸ２スフェロイドにおいて、対照（エンプティ群）と比較した内部コラーゲン量の減少が、観察され、ストレス因子の非存在下の基本レベルでＩＨＨ ｃｅｎｔＳＩＲＴ６がコラーゲン生成を阻害することを、示唆した（図３４Ｂ）。
【0228】
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）への曝露が酸化ストレスを促進し、ＬＸ２を間接的に活性化してコラーゲン生合成を増加させることは、公知である。驚くべきことに、ＦＦＡの存在下では、対照と比較してＩＨＨ ｃｅｎｔＳＩＲＴ６スフェロイド中の内部コラーゲンの増加レベルが、観察された（図３４Ｃ）。ｃｅｎｔＳＩＲＴ６過剰発現により誘導されたベータ－酸化の増強を伴う遊離脂肪酸レベルの上昇は、線維芽細胞の筋線維芽細胞表現型の獲得に必要となるより多くのＡＴＰを提供して、基本レベルで観察したｃｅｎｔＳＩＲＴ６過剰発現により発揮されるコラーゲン生成に及ぼす阻害効果を克服し得る。
【0229】
本明細書で用いられた配列
配列番号１ － 野生型ＳＩＲＴ６アミノ酸配列
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配列番号１ － 野生型ＳＩＲＴ６アミノ酸配列
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【0230】
配列番号２ － ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋバリアントアミノ酸配列
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【0231】
配列番号３ － ＳＩＲＴ６ Ａ３１３Ｓバリアントアミノ酸配列
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【0232】
配列番号４ － ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ Ａ３１３Ｓバリアント（ｃｅｎｔＳＩＲＴ６）アミノ酸配列
ＭＳＶＮＹＡＡＧＬＳＰＹＡＤＫＧＫＣＧＬＰＥＩＦＤＰＰＥＥＬＥＲＫＶＷＥＬＡＲＬＶＷＱＳＳＳＶＶＦＨＴＧＡＧＩＳＴＡＳＧＩＰＤＦＲＧＰＨＧＶＷＴＭＥＥＲＧＬＡＰＫＦＤＴＴＦＥＳＡＲＰＴＱＴＨＭＡＬＶＱＬＥＲＶＧＬＬＲＦＬＶＳＱＮＶＤＧＬＨＶＲＳＧＦＰＲＤＫＬＡＥＬＨＧＮＭＦＶＥＥＣＡＫＣＫＴＱＹＶＲＤＴＶＶＧＴＭＧＬＫＡＴＧＲＬＣＴＶＡＫＡＲＧＬＲＡＣＲＧＥＬＲＤＴＩＬＤＷＥＤＳＬＰＤＲＤＬＡＬＡＤＥＡＳＲＮＡＤＬＳＩＴＬＧＴＳＬＱＩＲＰＳＧＮＬＰＬＡＴＫＲＲＧＧＲＬＶＩＶＮＬＱＰＴＫＨＤＲＨＡＤＬＲＩＨＧＹＶＤＥＶＭＴＲＬＭＫＨＬＧＬＥＩＰＡＷＤＧＰＲＶＬＥＲＡＬＰＰＬＰＲＰＰＴＰＫＬＥＰＫＥＥＳＰＴＲＩＫＧＳＩＰＳＧＰＫＱＥＰＣＡＱＨＮＧＳＥＰＡＳＰＫＲＥＲＰＴＳＰＡＰＨＲＰＰＫＲＶＫＡＫＡＶＰＳ
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【0233】
配列番号５ － 野生型ＳＩＲＴ６核酸配列
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【0234】
配列番号６ － ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋバリアント核酸配列
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【0235】
配列番号７ － ＳＩＲＴ６ Ａ３１３Ｓバリアント核酸配列
ａｔｇｔｃｇｇｔｇａａｔｔａｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇｃｔｇｔｃｇｃｃｇｔａｃｇｃｇｇａｃａａｇｇｇｃａａｇｔｇｃｇｇｃｃｔｃｃｃｇｇａｇａｔｃｔｔｃｇａｃｃｃｃｃｃｇｇａｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｇａａｇｇｔｇｔｇｇｇａａｃｔｇｇｃｇａｇｇｃｔｇｇｔｃｔｇｇｃａｇｔｃｔｔｃｃａｇｔｇｔｇｇｔｇｔｔｃｃａｃａｃｇｇｇｔｇｃｃｇｇｃａｔｃａｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｃｃｃｇａｃｔｔｃａｇｇｇｇｔｃｃｃｃａｃｇｇａｇｔｃｔｇｇａｃｃａｔｇｇａｇｇａｇｃｇａｇｇｔｃｔｇｇｃｃｃｃｃａａｇｔｔｃｇａｃａｃｃａｃｃｔｔｔｇａｇａｇｃｇｃｇｃｇｇｃｃｃａｃｇｃａｇａｃｃｃａｃａｔｇｇｃｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃｇｔｇｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｇｇｔｃａｇｃｃａｇａａｃｇｔｇｇａｃｇｇｇｃｔｃｃａｔｇｔｇｃｇｃｔｃａｇｇｃｔｔｃｃｃｃａｇｇｇａｃａａａｃｔｇｇｃａｇａｇｃｔｃｃａｃｇｇｇａａｃａｔｇｔｔｔｇｔｇｇａａｇａａｔｇｔｇｃｃａａｇｔｇｔａａｇａｃｇｃａｇｔａｃｇｔｃｃｇａｇａｃａｃａｇｔｃｇｔｇｇｇｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｔｇａａｇｇｃｃａｃｇｇｇｃｃｇｇｃｔｃｔｇｃａｃｃｇｔｇｇｃｔａａｇｇｃａａｇｇｇｇｇｃｔｇｃｇａｇｃｃｔｇｃａｇｇｇｇａｇａｇｃｔｇａｇｇｇａｃａｃｃａｔｃｃｔａｇａｃｔｇｇｇａｇｇａｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃｇａｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｃｃｇａｔｇａｇｇｃｃａｇｃａｇｇａａｃｇｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃａｔｃａｃｇｃｔｇｇｇｔａｃａｔｃｇｃｔｇｃａｇａｔｃｃｇｇｃｃｃａｇｃｇｇｇａａｃｃｔｇｃｃｇｃｔｇｇｃｔａｃｃａａｇｃｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｃｃｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｃｇｔｃａａｃｃｔｇｃａｇｃｃｃａｃｃａａｇｃａｃｇａｃｃｇｃｃａｔｇｃｔｇａｃｃｔｃｃｇｃａｔｃｃａｔｇｇｃｔａｃｇｔｔｇａｃｇａｇｇｔｃａｔｇａｃｃｃｇｇｃｔｃａｔｇａａｇｃａｃｃｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｇａｔｃｃｃｃｇｃｃｔｇｇｇａｃｇｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｇａｇｇｇｃｇｃｔｇｃｃａｃｃｃｃｔｇｃｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃａｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｇａｇｃｃｃａａｇｇａｇｇａａｔｃｔｃｃｃａｃｃｃｇｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｃｔａｔｃｃｃｃｔｃｃｇｇｃｃｃｃａａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇｃａｃａａｃｇｇｃｔｃａｇａｇｃｃｃｇｃｃａｇｃｃｃｃａａａｃｇｇｇａｇｃｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｃｃｃｃａａａａｇｇｇｔｇａａｇｇｃｃａａｇｇｃｇｇｔｃｃｃｃａｇｃｔｇａ
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【0236】
配列番号８ － ＳＩＲＴ６ Ｎ３０８Ｋ Ａ３１３Ｓバリアント（ｃｅｎｔＳＩＲＴ６）核酸配列
ａｔｇｔｃｇｇｔｇａａｔｔａｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇｃｔｇｔｃｇｃｃｇｔａｃｇｃｇｇａｃａａｇｇｇｃａａｇｔｇｃｇｇｃｃｔｃｃｃｇｇａｇａｔｃｔｔｃｇａｃｃｃｃｃｃｇｇａｇｇａｇｃｔｇｇａｇｃｇｇａａｇｇｔｇｔｇｇｇａａｃｔｇｇｃｇａｇｇｃｔｇｇｔｃｔｇｇｃａｇｔｃｔｔｃｃａｇｔｇｔｇｇｔｇｔｔｃｃａｃａｃｇｇｇｔｇｃｃｇｇｃａｔｃａｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｃｃｃｇａｃｔｔｃａｇｇｇｇｔｃｃｃｃａｃｇｇａｇｔｃｔｇｇａｃｃａｔｇｇａｇｇａｇｃｇａｇｇｔｃｔｇｇｃｃｃｃｃａａｇｔｔｃｇａｃａｃｃａｃｃｔｔｔｇａｇａｇｃｇｃｇｃｇｇｃｃｃａｃｇｃａｇａｃｃｃａｃａｔｇｇｃｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇａｇｃｇｃｇｔｇｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｇｇｔｃａｇｃｃａｇａａｃｇｔｇｇａｃｇｇｇｃｔｃｃａｔｇｔｇｃｇｃｔｃａｇｇｃｔｔｃｃｃｃａｇｇｇａｃａａａｃｔｇｇｃａｇａｇｃｔｃｃａｃｇｇｇａａｃａｔｇｔｔｔｇｔｇｇａａｇａａｔｇｔｇｃｃａａｇｔｇｔａａｇａｃｇｃａｇｔａｃｇｔｃｃｇａｇａｃａｃａｇｔｃｇｔｇｇｇｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｔｇａａｇｇｃｃａｃｇｇｇｃｃｇｇｃｔｃｔｇｃａｃｃｇｔｇｇｃｔａａｇｇｃａａｇｇｇｇｇｃｔｇｃｇａｇｃｃｔｇｃａｇｇｇｇａｇａｇｃｔｇａｇｇｇａｃａｃｃａｔｃｃｔａｇａｃｔｇｇｇａｇｇａｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃｇａｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｃｃｇａｔｇａｇｇｃｃａｇｃａｇｇａａｃｇｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃａｔｃａｃｇｃｔｇｇｇｔａｃａｔｃｇｃｔｇｃａｇａｔｃｃｇｇｃｃｃａｇｃｇｇｇａａｃｃｔｇｃｃｇｃｔｇｇｃｔａｃｃａａｇｃｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｃｃｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｃｇｔｃａａｃｃｔｇｃａｇｃｃｃａｃｃａａｇｃａｃｇａｃｃｇｃｃａｔｇｃｔｇａｃｃｔｃｃｇｃａｔｃｃａｔｇｇｃｔａｃｇｔｔｇａｃｇａｇｇｔｃａｔｇａｃｃｃｇｇｃｔｃａｔｇａａｇｃａｃｃｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｇａｔｃｃｃｃｇｃｃｔｇｇｇａｃｇｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｇａｇｇｇｃｇｃｔｇｃｃａｃｃｃｃｔｇｃｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃａｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｇａｇｃｃｃａａｇｇａｇｇａａｔｃｔｃｃｃａｃｃｃｇｇａｔｃａａｇｇｇｃｔｃｔａｔｃｃｃｃｔｃｃｇｇｃｃｃｃａａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇｃａｃａａｃｇｇｃｔｃａｇａｇｃｃｃｇｃｃａｇｃｃｃｃａａａｃｇｇｇａｇｃｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｃｃｃｃａａａａｇｇｇｔｇａａｇｇｃｃａａｇｇｃｇｇｔｃｃｃｃａｇｃｔｇａ
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【0237】
配列番号９ － ＬＩＮＥ１ ＯＲＦ１フォワードプライマー
ａｔｇｇｃｇａａａｇｇｃａａａｃｇｔａａｇ
ａｔｇｇｃｇａａａｇｇｃａａａｃｇｔａａｇ
【0238】
配列番号１０ － ＬＩＮＥ１ ＯＲＦ１リバースプライマー
ａｔｔｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｔｇｇｇｇｔｇ
ａｔｔｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｔｇｇｇｇｔｇ
【0239】
配列番号１１ － ＬＩＮＥ１ ＯＲＦ２フォワードプライマー
ｇｃａｇｇｇｇｔｔｇｃａａｔｃｃｔａｇｔｃ
ｇｃａｇｇｇｇｔｔｇｃａａｔｃｃｔａｇｔｃ
【0240】
配列番号１２ － ＬＩＮＥ１ ＯＲＦ２リバースプライマー
ｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔａｔｔｇｇｇｔ
ｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔａｔｔｇｇｇｔ
【0241】
配列番号１３ － αＳＭＡフォワードプライマー
ａａａａｇａｃａｇｃｔａｃｇｔｇｇｇｔｇａ
ａａａａｇａｃａｇｃｔａｃｇｔｇｇｇｔｇａ
【0242】
配列番号１４ － αＳＭＡリバースプライマー
ｇｃｃａｔｇｔｔｃｔａｔｃｇｇｇｔａｃｔｔｃ
ｇｃｃａｔｇｔｔｃｔａｔｃｇｇｇｔａｃｔｔｃ
【0243】
配列番号１５ － ＣＯＬ１Ａ１フォワードプライマー
ｇｔｇｃｇａｔｇａｃｇｔｇａｔｃｔｇｔｇａ
ｇｔｇｃｇａｔｇａｃｇｔｇａｔｃｔｇｔｇａ
【0244】
配列番号１６ － ＣＯＬ１Ａ１リバースプライマー
ｃｇｇｔｇｇｔｔｔｃｔｔｇｇｔｃｇｇｔ
ｃｇｇｔｇｇｔｔｔｃｔｔｇｇｔｃｇｇｔ
【0245】
配列番号１７ － ＴＩＭＰ１フォワードプライマー
ａｃｃａｃｃｔｔａｔａｃｃａｇｃｇｔｔａｔｇａ
ａｃｃａｃｃｔｔａｔａｃｃａｇｃｇｔｔａｔｇａ
【0246】
配列番号１８ － ＴＩＭＰ１リバースプライマー
ｇｇｔｇｔａｇａｃｇａａｃｃｇｇａｔｇｔｃ
ｇｇｔｇｔａｇａｃｇａａｃｃｇｇａｔｇｔｃ
【0247】
配列番号１９ － ビメンチンフォワードプライマー
ａｇｔｃｃａｃｔｇａｇｔａｃｃｇｇａｇａｃ
ａｇｔｃｃａｃｔｇａｇｔａｃｃｇｇａｇａｃ
【0248】
配列番号２０ － ビメンチンリバースプライマー
ｃａｔｔｔｃａｃｇｃａｔｃｔｇｇｃｇｔｔｃ
ｃａｔｔｔｃａｃｇｃａｔｃｔｇｇｃｇｔｔｃ
【0249】
配列番号２１ － ＭＭＰ２フォワードプライマー
ｔａｃａｇｇａｔｃａｔｔｇｇｃｔａｃａｃａｃｃ
ｔａｃａｇｇａｔｃａｔｔｇｇｃｔａｃａｃａｃｃ
【0250】
配列番号２２ － ＭＭＰ２リバースプライマー
ｇｇｔｃａｃａｔｃｇｃｔｃｃａｇａｃｔ
ｇｇｔｃａｃａｔｃｇｃｔｃｃａｇａｃｔ
【0251】
配列番号２３ － ＧＡＰＤＨフォワードプライマー
ｇｇｔｇｃｇｔｇｃｃｃａｇｔｔｇａ
ｇｇｔｇｃｇｔｇｃｃｃａｇｔｔｇａ
【0252】
配列番号２４ － ＧＡＰＤＨリバースプライマー
ｔａｃｔｔｔｃｔｃｃｃｃｇｃｔｔｔｔｔ
ｔａｃｔｔｔｃｔｃｃｃｃｇｃｔｔｔｔｔ
【0253】
配列番号２５ － アクチンβフォワードプライマー
ｃａｔｇｔａｃｇｔｔｇｃｔａｔｃｃａｇｇｃ
ｃａｔｇｔａｃｇｔｔｇｃｔａｔｃｃａｇｇｃ
【0254】
配列番号２６ － アクチンβリバースプライマー
ｃｔｃｃｔｔａａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔ
ｃｔｃｃｔｔａａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B-C】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29A】
【図29B-C】
【図29D-E】
【図29F】
【図30A】
【図30B-C】
【図31A】
【図31B】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図33C-D】
【図33E】
【図34A】
【図34B-C】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】