特表 2024-518788 ナトリウムチャネル１．６を標的とする組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-02

(54)【発明の名称】ナトリウムチャネル１．６を標的とする組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240424BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240424BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20240424BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/7088

A61P25/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023569684

(86)(22)【出願日】2022-05-10

(85)【翻訳文提出日】2024-01-04

(86)【国際出願番号】 US2022028450

(87)【国際公開番号】W WO2022240795

(87)【国際公開日】2022-11-17

(31)【優先権主張番号】63/186,342

(32)【優先日】2021-05-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516056971

【氏名又は名称】キュー－ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｑ－Ｓｔａｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．

【住所又は居所原語表記】１７９ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アンブローシ， クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアムズ， ルイス

(72)【発明者】

【氏名】リワーク， ケイトリン

(72)【発明者】

【氏名】ガーバー， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】マクマナス， オーウェン

(72)【発明者】

【氏名】アグラワル， スディール

(72)【発明者】

【氏名】デンプシー， グラハム ティー．

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA65

4C086NA14

4C086ZA06

(57)【要約】

本発明は、ＮａｖチャネルｍＲＮＡ上の同定された標的に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む治療的組成物を提供する。ＡＳＯは、その標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する二重鎖を形成してＲＮＡを分解し、それにより、Ｎａｖチャネル合成を下方調節し、これが、ある特定の状態、例えば、てんかんおよび痛覚に寄与するニューロンの能力を阻害する。ＡＳＯは、特異的な同定された標的のうちの１つに結合し、改変ＲＮＡウイングが隣接する中心ＤＮＡセグメントを含むギャップマーとして提供され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約７５％相補的なＲＮＡのセグメントに沿って、ナトリウムチャネルタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズし、それにより、前記ナトリウムチャネルタンパク質への前記ＲＮＡの翻訳を防止するオリゴヌクレオチドを含む組成物。

【請求項2】

前記オリゴヌクレオチドが、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつ発現をノックダウンする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチド中の塩基の配列が、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記オリゴヌクレオチド中の塩基の配列が、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約９５％同一であり、前記オリゴヌクレオチドが、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつＲＮａｓｅ切断を誘導できる、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物が、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約８０％同一な塩基配列を各々が有する複数の治療的オリゴヌクレオチドを含み、前記治療的オリゴヌクレオチドの各々が、改変ＲＮＡウイングが隣接する中心ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し、前記複数の治療的オリゴヌクレオチドが、くも膜下腔内注射のために製剤化された溶液または担体中で提供される、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも約９個のＤＮＡ塩基の中心領域に隣接する２つのウイングを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一方の末端が、改変ＲＮＡ塩基を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

各改変ＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも約１５塩基を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記オリゴヌクレオチドが、約１５と約２５との間の数の塩基を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記オリゴヌクレオチドが、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記オリゴヌクレオチドが、スクリーニングされ、ヒトにおけるいずれの非標的転写物についても閾値マッチを満たさないことが決定された塩基配列を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物が、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約９５％同一な塩基配列を有する治療的オリゴヌクレオチドの複数のコピーを含み、前記治療的オリゴヌクレオチドが、４つの２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ塩基の２つのウイングが隣接する中心の１２塩基のＤＮＡセグメントとホスホロチオエート連結の骨格とを含むギャップマー構造を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記組成物が細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで送達される場合、前記細胞が、Ｎａｖ１．６の用量依存的ノックダウンを示す、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約９０％のマッチを有する塩基配列を有し、塩基が、ホスホロチオエート連結のみによって連結され、前記オリゴヌクレオチドが、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接する中心の１２個のＤＮＡ塩基をさらに含み、前記５’ウイングおよび前記３’ウイングが各々、４つの連続する２’改変ＲＮＡ塩基を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項16】

前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１６、４１、４４、４５、１００、１１７、１２４、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３３、１３４、１３５、１３８、１３９、１４２、１４３および１４４のうちの１つに対して少なくとも約９０％のマッチを有する塩基配列を有する、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１～１５６のうちの１つとマッチする塩基配列を有し、塩基間連結の大多数が、ホスホロチオエート連結を含み、前記オリゴヌクレオチドが、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接する中心の１２個のＤＮＡ塩基をさらに含み、前記５’ウイングおよび前記３’ウイングが各々、４つの連続する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項18】

前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１６、４１、４４、４５、１００、１１７、１２４、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３３、１３４、１３５、１３８、１３９、１４２、１４３および１４４のうちの１つにマッチする塩基配列を有する、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記オリゴヌクレオチドが、ＳＣＮ８Ａ転写物の最初の３７００塩基内の位置にハイブリダイズする、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１６；配列番号４１；配列番号４４；配列番号４５；配列番号１１７；配列番号１２４；配列番号１２６；配列番号１２９；配列番号１３３；配列番号１３５；配列番号１３８；配列番号１３９；配列番号１４２；配列番号１４３；または配列番号１４４からなる群から選択される１つの配列を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項21】

さらに、前記オリゴヌクレオチドが、２つの２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーであり、各ウイングが、１、２または３つのホスホジエステル連結を有し、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記オリゴヌクレオチドが、未処置の対照と比較して約５０～９０％の量まで、ＳＣＮ８Ａ転写物の発現をノックダウンする、請求項１に記載の組成物。

【請求項23】

さらに、前記オリゴヌクレオチドが、以下：
２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５；
２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５；
２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４；ならびに
２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４
からなる群から選択される１つである、請求項１に記載の組成物。

【請求項24】

前記オリゴヌクレオチドが、約１０００ｎＭの濃度で細胞に送達される場合、対照と比較して約５０～７０％の量まで、ＳＣＮ８Ａ転写物の発現をノックダウンする、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

てんかんを有する対象に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、それにより、ＳＣＮ８Ａ遺伝子の発現をノックダウンする、方法。

【請求項26】

前記てんかんが、ドラベ症候群、ＤＥＥ１３、または過剰なＥ／Ｉバランスの発症機構が関与するてんかんを含む、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本開示は、電位依存性ナトリウムチャネル１．６の活性を阻害する組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
ナトリウムチャネルは、細胞の形質膜を横断してナトリウムイオン（Ｎａ＋）を通過させるチャネルとして機能する膜タンパク質である。ナトリウムチャネルは、リガンド依存性または電位依存性であり得、Ｎａ＋のための電位依存性チャネルは、ＮａＶチャネルと呼ばれる。ニューロンおよび心筋細胞などの細胞では、ＮａＶチャネルは、活動電位の上昇相を担う。ＮａＶチャネルは、タンパク質の構造的コンフォメーションによって識別される３つの状態を有する：休止、活性および不活性。

【0003】

心活性、脳機能および身体感覚は、その機能がナトリウムチャネルに依存する心筋細胞およびニューロンを必要とするので、ナトリウムチャネルは、心不整脈、神経学的状態および疼痛の処置のための標的とみなされてきた。一例では、プロカインアミドが、心房細動および複合頻脈を処置するために使用されてきた。別の例では、小分子フナピド（Ｆｕｎａｐｉｄｅ）が、鎮痛薬として開発中である。抗痙攣薬フェニトインおよびカルバマゼピンは、てんかんを処置するために使用され、ナトリウムチャネルブロッカーとして機能すると理解されている。ナトリウムチャネルブロッカーについての報告された潜在的治療標的のリストは、慢性疼痛、片頭痛、てんかん、心血管疾患、精神障害およびさらにはがんを含む。参照により組み込まれるLi, 2019, Voltage-gated sodium channels and blockers: an overview and where will they go?, Curr Med Sci 39(6):867-873を参照されたい。残念ながら、小分子ナトリウムチャネルブロッカーの有用性は、状態依存性、結合動力学、および標的へのアクセスによって制限され得、これは、薬物が、特定のコンフォメーション状態にある標的タンパク質を見出し、それと相互作用することを要求する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Li, 2019, Voltage-gated sodium channels and blockers: an overview and where will they go?, Curr Med Sci 39(6):867-873

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

要旨
本発明は、Ｎａｖ１．６タンパク質の発現を阻害またはノックダウンする組成物を提供する。本発明の組成物は、ナトリウムチャネル機能が関与する状態、例えば、一部の実施形態では発達性てんかん性脳症１３（ＤＥＥ１３）が含まれる、てんかん、心血管疾患、疼痛または精神障害を処置または診断するために潜在的に有用である。本発明の組成物は、予防的処置としても有用である。ヒトでは、電位依存性ナトリウムチャネルの９つのファミリー、すなわち、Ｎａｖ１．１～Ｎａｖ１．９が存在する。これら９つのタンパク質のうち、ＳＣＮ８Ａ遺伝子（１２ｑ１３、１３）によってコードされるＮａｖ１．６は、活動電位の開始を調節し、神経伝導に関与する。Ｎａｖ１．６は、脳において豊富に発現され、神経機能にとって重要である。本開示の組成物は、神経活動およびナトリウムチャネル機能が役割を果たす状態の処置のために、Ｎａｖ１．６の発現をノックダウンするために使用され得る。特に、本開示の組成物は、てんかん、疼痛、またはニューロン興奮性亢進が関与する状態などの状態のための治療的処置として利益を見出し得る。

【0006】

一部の実施形態では、本開示の組成物は、状態非依存的な抗てんかん薬物または抗痙攣薬として有用であり得る。エクソーム配列決定は、ＳＣＮ８Ａとてんかんとの間の関連性を示している。ＳＣＮ８Ａにおける変異は、てんかんおよび関連するてんかん発作を引き起こし得ると考えられる。具体的には、機能獲得型ＳＣＮ８Ａ変異は、興奮性亢進および損なわれたチャネル不活性化を引き起こし得る。実際、てんかん発作は、ナトリウムチャネルを遮断することによって機能する小分子抗てんかん薬物で処置される。共に参照により組み込まれる、Zaman, 2019, A single-center SCN8A-related epilepsy cohort: clinical, genetic, and physiologic characterization, Ann Clin Trans Neurol 6(8): 1445-1455およびBoerma, 2016, Remarkable phenytoin sensitivity in 4 children with SCN8A-related epilepsy: a molecular neuropharmacological approach, Neurotherapeutics 13(1): 192-197を参照されたい。本開示の組成物は、てんかん発作の処置のための場合を含め、例えばてんかんの処置のために、Ｎａｖ１．６の発現を状態非依存的な様式でノックダウンするために使用され得る。かかるアプローチは、ＳＣＮ８Ａ遺伝子における変異から生じる発達性てんかん性脳症ＤＥＥ１３を処置するために使用され得る。かかるアプローチは、ドラベ症候群、および過剰な興奮および阻害（Ｅ／Ｉ）バランスの機構から生じる形態が含まれるがこれに限定されない他の形態のてんかんを処置するためにも適用可能である。

【0007】

ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、例えば、慢性疼痛状態、例えば、がん疼痛または関節炎が含まれる疼痛の処置のための鎮痛薬として有用であり得る。組成物は、神経活動に関与するタンパク質の合成を防止する短い核酸またはオリゴヌクレオチドを含む。例えば、一部のニューロンは、「疼痛感知」神経、すなわち、侵害受容器として動作する。これらの疼痛感知ニューロンは、電位依存性ナトリウムチャネルとして機能するタンパク質を有する。神経終末の刺激が閾値電位（Ｖ）を超える場合、侵害受容器ニューロンは、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）が細胞膜を横断するように導き、これにより、再生的なやり方でニューロンを脱分化させることができ、疼痛の感覚の根底にある伝播性の電気シグナルの「発火」をもたらす。本開示の組成物は、疼痛の処置のために、Ｎａｖ１．６の発現を状態非依存的な様式でノックダウンするために使用され得る。

【0008】

本発明は、Ｎａｖ１．６タンパク質の発現を阻害またはノックダウンする組成物を提供する。本発明の組成物は、Ｎａｖ１．６ナトリウムチャネルタンパク質を作製する際に使用されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、これらのＲＮＡ内の多数の特異的な検証された標的の同定を含む。オリゴヌクレオチドは、標的に対して実質的にまたは完全にアンチセンスであり、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）と記載される。オリゴヌクレオチドは、これらのタンパク質が作製されるのを防止し、これらのナトリウムチャネルを発現する細胞の感度または活動を減少させる。Ｎａｖ１．６発現は、これらの細胞においてノックダウンされるので、これらの細胞は、慢性疼痛、片頭痛、てんかん、心血管疾患、またはある特定の精神障害などの状態に寄与しない。したがって、本開示の組成物は、有用性が結合動力学もしくはコンフォメーション状態依存性、または標的イオンチャネルへのアクセスによって制限され得る小分子チャネルブロッカーの制限に対する代替法を提供する、種々の状態に対する状態非依存的な治療的処置を提供する。

【0009】

本開示によって記載されるオリゴヌクレオチドは、Ｎａｖ１．６タンパク質の合成において使用されるＲＮＡ中のある特定の標的にハイブリダイズするように設計される。オリゴヌクレオチドの結合は、タンパク質合成を防止し、ＮａＶチャネルの発現を下方調節する。具体的には、オリゴヌクレオチドは、ＮａＶチャネル前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡ上の同定された標的のうちの１つに対して実質的にまたは完全に相補的な配列を有する。すなわち、オリゴヌクレオチドは、同定された標的に対してアンチセンスである。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）がその標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、それらは、二本鎖二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）の部分を分解する酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ）を動員する二本鎖ＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖を形成する。ＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖を分解することは、ＮａＶチャネルｍＲＮＡを細胞（例えば、ニューロン）から枯渇させ、これが、細胞によって合成されるＮａＶチャネルの量を減少させる。ＮａＶチャネル発現を下方調節することは、てんかん活性または疼痛の感覚に寄与するニューロンの能力を妨害する。したがって、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ中の同定された標的に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドを含む組成物が患者に投与される場合、その患者は、てんかん発作または疼痛の経験の減退したリスクを有し得る。

【0010】

一部の実施形態について、本発明は、本開示のＡＳＯで有益に標的とするためのホットスポットとして本明細書で同定された転写物の領域を標的とする。ＳＣＮ８Ａ転写物の最初の約３７００塩基内の標的を標的とするある特定のＡＳＯが、所望の量だけのノックダウンにおいて高度に有効であることを示す実験データが、本明細書で示された結果から現れた。本明細書で開示されるいくつかのＡＳＯは、その３７００塩基領域に対して特異的であり、データは、これらのＡＳＯが良好な結果を予期せぬことに生じることを示している。

【0011】

本発明の別の洞察は、ある特定のＡＳＯが、ＳＣＮ８Ａを、１００％ではない有益な量だけノックダウンするということである。いずれの作用機構によっても束縛されないが、完全なノックダウン（またはノックアウト）は有害であるが、１００％のノックダウン、すなわち、０％の相対的な正規化された発現に達しない飽和プロファイルまたはプラトーに達するＡＳＯを使用することによって有益な効果がもたらされ得ると理論化され得る。実際、本開示のある特定のＡＳＯは、それらの配列の結果としてその利益を提供し、これは、厳密には用量依存的効果ではない。用量濃度が増加するにつれ、これらのＡＳＯは、１００未満のいくらかの％のノックダウンにおいてプラトーに達する。本明細書で開示されるある特定の実施形態は、高い濃度または用量においてさえ、ＳＣＮ８Ａの発現を、約５０％と８０％との間の量、例えば、約６０％ノックダウンする。

【0012】

ある特定の態様では、本開示は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも７５％相補的なそのＲＮＡのセグメントに沿って、ナトリウムチャネルタンパク質をコードするｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、それにより、ナトリウムチャネルタンパク質へのＲＮＡの翻訳を防止するオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。オリゴヌクレオチドは、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし得、その発現をノックダウンし得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の塩基の配列は、配列番号１～１４４のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する。例えば、オリゴヌクレオチド中の塩基の配列は、配列番号１～１４４のうちの１つに対して少なくとも９０％または９５％同一であり得、オリゴヌクレオチドは、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかにハイブリダイズし得、そのＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導し得る。組成物は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも８０、９０、９５または１００％同一な塩基配列を各々が有する複数の治療的オリゴヌクレオチドを含み得る。ある特定の好ましいＡＳＯには、ヒトＳＣＮ８Ａ遺伝子のエクソン内の標的に対して相補的な１１個、およびヒトＳＣＮ８Ａ遺伝子のイントロン内の標的に対して相補的な５つが含まれる。ヒトＳＣＮ８Ａ遺伝子のエクソン内の標的に対して相補的な１１個の好ましいＡＳＯには、以下の参照番号によって言及されるＡＳＯが含まれる：１４－０１６（配列番号１６）；１４－０４１（配列番号４１）；１４－０４４（配列番号４４）；１４－０４５（配列番号４５）；１４－１００（配列番号１００）、１４－１１７（配列番号１１７）、１４－１２４（配列番号１２４）、１４－１２５（配列番号１２５）、１４－１２６（配列番号１２６）、１４－１２８（配列番号１２８）、１４－１２９（配列番号１２９）、１４－１３０（配列番号１３０）、１４－１３３（配列番号１３３）、１４－１３４（配列番号１３４）、１４－１３５（配列番号１３５）、１４－１３８（配列番号１３８）、１４－１３９（配列番号１３９）、１４－１４２（配列番号１４２）、１４－１４３配列番号１４３）および１４－１４４（配列番号１４４）。ある特定の最も好ましい実施形態は、配列番号０１６、０４１、０４４、０４５、１１７、１２４、１３５または１４４を含み得る。

【0013】

ヒトＳＣＮ８Ａ遺伝子のイントロン内の標的に対して相補的な５つの好ましいＡＳＯには、以下の参照番号によって言及されるＡＳＯが含まれる：１４－１００（配列番号１００）；１４－１０１（配列番号１０１）；１４－１０２（配列番号１０２）；１４－１０３（配列番号１０３）；および１４－１０４（配列番号１０４）。

【0014】

一部の実施形態は、例えば、以下のうちの１つなどの、ＳＣＮ８Ａ転写物の最初の３７００塩基の領域を標的とするＡＳＯを含む：ＡＳＯ１４－００１（配列番号１）；１４－００２（配列番号２）；１４－００３（配列番号３）；１４－００４（配列番号４）；１４－００５（配列番号５）；１４－００６（配列番号６）；１４－００７（配列番号７）；１４－００８（配列番号８）；１４－００９（配列番号９）；１４－０１０（配列番号１０）；１４－０１１（配列番号１１）；１４－０１２（配列番号１２）；１４－０１３．（配列番号１３）；１４－０１４（配列番号１４）；１４－０１５（配列番号１５）；１４－０１６（配列番号１６）；１４－０４１（配列番号４１）；１４－０４２（配列番号４２）；１４－０４３（配列番号４３）；１４－０４４（配列番号４４）；１４－０４５（配列番号４５）；１４－０４６（配列番号４６）；１４－０４７（配列番号４７）；１４－０４８（配列番号４８）；１４－０４９（配列番号４９）；１４－０５０（配列番号５０）；１４－０５１（配列番号５１）；１４－１１５（配列番号１１５）；１４－１１６（配列番号１１６）；１４－１１７（配列番号１１７）；１４－１１８（配列番号１１８）；１４－１１９（配列番号１１９）；１４－１２０（配列番号１２０）；１４－１２１（配列番号１２１）；１４－１２２（配列番号１２２）；１４－１２３（配列番号１２３）；１４－１２４（配列番号１２４）；１４－１２５（配列番号１２５）；１４－１２６（配列番号１２６）；１４－１２７（配列番号１２７）；１４－１２８（配列番号１２８）；１４－１２９（配列番号１２９）；１４－１３０（配列番号１３０）；１４－１３１（配列番号１３１）；１４－１３２（配列番号１３２）；１４－１３３（配列番号１３３）；１４－１３４（配列番号１３４）；１４－１３５（配列番号１３５）；１４－１３６（配列番号１３６）；１４－１３７（配列番号１３７）；１４－１３８（配列番号１３８）；１４－１３９（配列番号１３９）；１４－１４０（配列番号１４０）；１４－１４１（配列番号１４１）；１４－１４２（配列番号１４２）；１４－１４３（配列番号１４３）；１４－１４４（配列番号１４４）；１４－１４５（配列番号１４５）；１４－１４６（配列番号１４６）；１４－１４７（配列番号１６）；１４－１４８（配列番号１６）；１４－１４９（配列番号４１）；１４－１５０（配列番号４１）；１４－１５１（配列番号４４）；１４－１５２（配列番号４４）；１４－１５３（配列番号４５）；１４－１５４（配列番号４５）；１４－１５５（配列番号１１７）；１４－１５６（配列番号１１７）；１４－１５７（配列番号１２４）；１４－１５８（配列番号１２４）；１４－１５９（配列番号１２６）；１４－１６０（配列番号１２６）；１４－１６１（配列番号１２９）；１４－１６２（配列番号１２９）；１４－１６３（配列番号１３３）；１４－１６４（配列番号１３３）；１４－１６５（配列番号１３５）；１４－１６６（配列番号１３５）；１４－１６７（配列番号１３８）；１４－１６８（配列番号１３８）；１４－１６９（配列番号１３９）；１４－１７０（配列番号１３９）；１４－１７１（配列番号１４２）；１４－１７２（配列番号１４２）；１４－１７３（配列番号１４３）；１４－１７４（配列番号１４３）；１４－１７５（配列番号１４４）；または１４－１７６（配列番号１４４）。特定の実施形態は、以下のうちの１つを使用し得る：ＡＳＯ１４－１４７（配列番号１６）；１４－１４８（配列番号１６）；１４－１４９（配列番号４１）；１４－１５０（配列番号４１）；１４－１５１（配列番号４４）；１４－１５２（配列番号４４）；１４－１５３（配列番号４５）；１４－１５４（配列番号４５）；１４－１５５（配列番号１１７）；１４－１５６（配列番号１１７）；１４－１５７（配列番号１２４）；１４－１５８（配列番号１２４）；１４－１５９（配列番号１２６）；１４－１６０（配列番号１２６）；１４－１６１（配列番号１２９）；１４－１６２（配列番号１２９）；１４－１６３（配列番号１３３）；１４－１６４（配列番号１３３）；１４－１６５（配列番号１３５）；１４－１６６（配列番号１３５）；１４－１６７（配列番号１３８）；１４－１６８（配列番号１３８）；１４－１６９（配列番号１３９）；１４－１７０（配列番号１３９）；１４－１７１（配列番号１４２）；１４－１７２（配列番号１４２）；１４－１７３（配列番号１４３）；１４－１７４（配列番号１４３）；１４－１７５（配列番号１４４）；または１４－１７６（配列番号１４４）。

【0015】

ある特定の好ましい実施形態は、用量が増加するにつれ、ＳＣＮ８Ａノックダウンが、１００％よりも下でプラトーに達するＡＳＯを使用し得る。これらの実施形態は、ＡＳＯ １４－１３５、１４－１６５、１４－１６６、１４－１４４、１４－１７５および１４－１７５のうちの１つを使用し得、これらは、１００％のノックダウンに達することはなく、その代わり、高い用量濃度においてさえ約７０％と８０％との間でプラトーに達することが本明細書で示されており、これは所望されることである。

【0016】

ある特定の実施形態は、配列番号１６；配列番号４１；配列番号４４；配列番号４５；配列番号１１７；配列番号１２４；配列番号１２６；配列番号１２９；配列番号１３３；配列番号１３５；配列番号１３８；配列番号１３９；配列番号１４２；配列番号１４３；または配列番号１４４のうちの少なくとも１つによって与えられる配列を有するギャップマーＡＳＯを使用し、ギャップマーは、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有し、各ウイングは、１つまたは２つのホスホジエステル連結を有し、残りの塩基間連結はホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基は、５－メチル改変を有する。ある特定の最も好ましい実施形態（未処置に対して正規化して約５０％と９０％との間の発現に達するノックダウンプラトーのため）は、１４－１６５、１４－１６６、１４－１７５または１４－１７６を使用する。本明細書で、１４－１６５は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５である。１４－１６６は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５である。１４－１７５は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４である。１４－１７６は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４である。

【0017】

本開示の治療的オリゴヌクレオチドは、改変ＲＮＡウイングが隣接する中心ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し得る。かかる治療的オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ塩基（例えば、約８～１４個、例えば、１２個のＤＮＡ塩基）の中心領域に隣接する２つのウイングを含み得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一方の末端は、改変ＲＮＡ塩基、例えば、任意の数または任意の組合せの２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ（「２’－ＭＯＥ」）および／または２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（「２’－Ｏ－Ｍｅ」）を含む。塩基は改変され得る。例えば、あるパーセンテージまたは全てのシトシンは、５’ＲＮＡウイング、中心ＤＮＡ領域、３’ＲＮＡウイング、または３つ全て中でメチル化され得る（例えば、５－メチルシトシン）。

【0018】

治療的オリゴヌクレオチドは、注射などによる送達のために製剤化された溶液または担体中で提供され得る。オリゴヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、少なくとも約１５塩基、好ましくは、約１５塩基と２５塩基との間のものであり得る。オリゴヌクレオチドは、骨格中にホスホロチオエート結合を有し得る。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされ、ヒトにおけるいずれの長い非コードＲＮＡまたは他のオフターゲット配列もしくは転写物についても閾値マッチを満たさないことが決定された塩基配列を有する。オリゴヌクレオチドは、非ヒト霊長類ゲノム中の相同なセグメントに対して０個のミスマッチを有し、げっ歯類ゲノム中の相同なセグメントにおいて約５つ以下のミスマッチを有する塩基配列を有し得る。

【0019】

組成物がＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで送達される場合、細胞は、Ｎａｖ１．６の用量依存的ノックダウンを示す。オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも９０％のマッチを有する（好ましくは、１４－０１６（配列番号１６）、１４－０４１（配列番号４１）、１４－０４４（配列番号４４）、１４－０４５（配列番号４５０、１４－１００（配列番号１００）、１４－１１７（配列番号１１７）、１４－１２４（配列番号１２４）、１４－１２５（配列番号１２５）、１４－１２６（配列番号１２６）、１４－１２８（配列番号１２８）、１４－１２９（配列番号１２９）、１４－１３０（配列番号１３０）、１４－１３３（配列番号１３３）、１４－１３４（配列番号１３４）、１４－１３５（配列番号１３５）、１４－１３８（配列番号１３８）、１４－１３９（配列番号１３９）、１４－１４２（配列番号１４２）、１４－１４３配列番号１４３）、および１４－１４４（配列番号１４４）のうちの１つに対して少なくとも９０％のマッチを有する）塩基配列を有し、塩基がホスホロチオエート連結によって連結される、ギャップマーであり得る。連結は、全てホスホロチオエートであり得るか、またはホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合との混合物であり得る。オリゴヌクレオチドは、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接する約８個と約１４個との間のＤＮＡ塩基の中心領域をさらに有し得、５’ウイングおよび３’ウイングは各々、いくつかの、例えば、少数の連続する２’改変ＲＮＡ塩基を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１５６のうちの１つにマッチする塩基配列を有し、塩基は、ホスホロチオエート連結によって連結され、構造は、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接する中心ＤＮＡ塩基を有する。ウイング中のＲＮＡ塩基の数および中心セグメント中のＤＮＡ塩基の数は、４－１２－４、５－１０－５、５－９－５、４－１１－４、または類似の適切なパターンであり得る。５’ウイングおよび３’ウイングは各々、数個の２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、中心ＤＮＡセグメントの至る所でのホスホロチオエート連結、およびウイング中のホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合との混合物を伴って、中心の１２個のＤＮＡ塩基と共に、各ウイング中の４つの連続する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を有し得る（「４－１２－４」構造）。

【0020】

組合せ実施形態では、本発明は、適切な製剤または担体中に、上の記載に各々が従う複数の別個の治療的ギャップマーの複数のコピーを含む組成物を提供する。

【0021】

一部の態様では、本開示は、てんかんを処置する方法を提供する。この方法は、てんかんを有する対象に、本明細書に記載される組成物を投与するステップを含み、それにより、ＳＣＮ８Ａ遺伝子の発現をノックダウンする。処置されているてんかんは、ＤＥＥ１３、ドラベ症候群、または過剰なＥ／Ｉバランスの発症機構が関与する任意のてんかんであり得る。

【0022】

本開示の態様は、患者におけるてんかんまたは疼痛などの状態を処置するための医薬の製造のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用を提供する。使用において、ＡＳＯは、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、例えば、９５％または１００％の同一性を有する。好ましい実施形態は、約１５塩基長と２５塩基長との間、好ましくは、約１８塩基長と２２塩基長との間、または約１９塩基長と２１塩基長との間（端の値を含む）であるＡＳＯを使用する。一般に、「１つの（ａｎ）ＡＳＯ」に対する言及は、実質的に同一な分子の多数のコピーを含む。したがって、「１つの（ａｎ）ＡＳＯ」は、任意の数、例えば、数十万または数百万のコピーの示されたＡＳＯであり得る。好ましい実施形態では、ＡＳＯは、２０塩基長であり、配列番号１～１５６のうちの１つの配列を有し、状態の処置のための医薬の製造において使用される。ＡＳＯは、任意の適切な形式で、例えば、微小遠心管または試験管などの管中で凍結乾燥されてまたは管中の溶液中などで、提供され得る。使用の好ましい実施形態は、Ｎａｖ１．６を標的とする。１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つもしくは５つまたはそれよりも多くの）ＡＳＯは、医薬の製造において使用され得る。１つまたは複数のＡＳＯは、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ中の標的にハイブリダイズし得る。使用のある特定の実施形態では、ＡＳＯ中の塩基の配列は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも９０％同一である。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＳＯ中の塩基の配列は、１４－０１６（配列番号１６）、１４－０４１（配列番号４１）、１４－０４４（配列番号４４）、１４－０４５（配列番号４５０、１４－１００（配列番号１００）、１４－１１７（配列番号１１７）、１４－１２４（配列番号１２４）、１４－１２５（配列番号１２５）、１４－１２６（配列番号１２６）、１４－１２８（配列番号１２８）、１４－１２９（配列番号１２９）、１４－１３０（配列番号１３０）、１４－１３３（配列番号１３３）、１４－１３４（配列番号１３４）、１４－１３５（配列番号１３５）、１４－１３８（配列番号１３８）、１４－１３９（配列番号１３９）、１４－１４２（配列番号１４２）、１４－１４３配列番号１４３）、および１４－１４４（配列番号１４４）のうちの１つに対して少なくとも約９５％同一である、またはそれと好ましくはマッチする。使用の実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡウイングが隣接する中心ＤＮＡセグメントを有するギャップマー構造、例えば、中心領域の両方の側の４つの改変ＲＮＡ塩基を伴う１２個のＤＮＡ塩基の中心領域を有し得る。各改変ＲＮＡ塩基は、２’－ＭＯＥであり得る。好ましくは、ＡＳＯの骨格は、複数のホスホロチオエート結合を有し、例えば、数個の、多くの、大部分の、または全ての糖連結は、使用実施形態において、ホスホロチオエートであり得る（ホスホジエステルとバランスをとる）。医薬は、注射、注入またはポンプによる導入に適切な製剤への混合に適切な形態でＡＳＯを含み得る。例えば、ＡＳＯ（数千もしくは数百万またはそれよりも多くのコピーの１つのＡＳＯ）は、管中で凍結乾燥され得る、または既知のモル濃度もしくは濃度で溶液中にあり得る。ＡＳＯは、担体、例えば、溶媒および／または賦形剤がＡＳＯを含む薬学的に許容される組成物中に溶解または希釈され得、ＩＶバッグ、シリンジまたはポンプ中に充填され得る。医薬は、１つよりも多くのＡＳＯ、例えば、２つ、３つ、４つもしくは５つまたはそれよりも多くのＡＳＯの任意の組合せを使用して作製され得る。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、てんかんを処置するための組成物を示す。

【図2】図２は、ギャップマー構造を有するオリゴヌクレオチドを示す。

【図3】図３は、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）改変リボース糖を示す。

【図4】図４は、ＤＮＡのセグメント中のホスホロチオエート結合を示す。

【図5】図５は、配列番号１～７４のＡＳＯによる処置後のＳＣＮ８Ａの発現を示す（各パネル中の最初の２０本の棒は、１つのＡＳＯによる処置を示し、２１番目の棒は、ＮＴ ｓｉＲＮＡである；凡例を参照されたい）。

【図6】図６は、配列番号７５～１１４のＡＳＯによる処置後のＳＣＮ８Ａの発現を示す。

【図7】図７は、異なる複製培養物における本開示のＡＳＯについての再現性分析の結果を与える。

【図8】図８は、配列番号１～４、６、８、１１、１６、４１、４４、４５および１００～１０４のＡＳＯによる処置下の用量応答を示す。

【図9】図９は、完全転写物をタイリングするＳＣＮ８Ａエクソン標的化ＡＳＯによる処置から生じるパーセントノックダウンを示す。

【図10】図１０は、ＳＣＮ８Ａイントロン標的化ＡＳＯによる処置から生じるパーセントノックダウンを示す。

【図11】図１１は、転写物の最初の３７００塩基を全てが標的とするＳＣＮ８Ａ ＡＳＯによる処置から生じるパーセントノックダウンを示す。

【図12】図１２は、完全転写物をタイリングするＳＣＮ８Ａエクソン標的化ＡＳＯによる処置から生じる他のナトリウムチャネル（ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３ＡおよびＳＣＮ９Ａによってコードされる）についてのパーセントノックダウンを示す。

【図13】図１３は、ＳＣＮ８Ａイントロン標的化ＡＳＯによる処置から生じる他のナトリウムチャネル（ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３ＡおよびＳＣＮ９Ａによってコードされる）についてのパーセントノックダウンを示す。

【図14】図１４は、最適化されたＳＣＮ８Ａエクソン標的化ＡＳＯによる処置から生じる他のナトリウムチャネル（ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３ＡおよびＳＣＮ９Ａによってコードされる）についてのパーセントノックダウンを示す。

【図15】図１５は、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞におけるある特定のＡＳＯについての用量応答データを示す。

【図16】図１６は、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞におけるある特定のＡＳＯについての拡大された用量応答データを示す。

【図17】図１７は、ＳＣＮ８Ａエクソンを標的とするリード全ＰＳ骨格候補についての用量応答パーセントノックダウンを示す。

【図18】図１８は、ヒト臨床候補としてのＰＯ改変娘リードについての用量応答パーセントノックダウンを示す。

【図19】図１９は、ヒトＮＧＮ２幹細胞由来ニューロンにおけるＳＣＮ８Ａ転写物のノックダウンを示す。

【図20】図２０は、リード候補を使用した、ヒト初代ニューロンにおけるＳＣＮ８Ａ転写物のノックダウンを示す。

【図21】図２１は、マウス初代皮質ニューロンにおけるＳｃｎ８ａ転写物のノックダウンを示す。

【図22】図２２は、ラット初代海馬ニューロンにおけるＳｃｎ８ａ転写物ノックダウンを示す。

【図23】図２３は、ヒトＮＧＮ２幹細胞由来ニューロンにおけるＳＣＮ８Ａ転写物ノックダウンにおけるプラトーの証拠を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

詳細な説明
図１は、てんかんまたは疼痛を処置するための組成物１０１を含む。組成物１０１は、ｍＲＮＡ １１７またはｐｒｅ－ｍＲＮＡ中の標的セグメント１１５にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド１０７を含む。ｍＲＮＡ １１７は、ナトリウムチャネルタンパク質をコードする。標的を含むｍＲＮＡ １１７のセグメント１１５は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約７５％相補的である。ｍＲＮＡ １１７のセグメント１１５へのオリゴヌクレオチド１０７のハイブリダイゼーションは、ナトリウムチャネルタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を防止する（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド１０７／ＲＮＡ １１７複合体の消化をもたらすＲＮａｓｅ Ｈを動員することによって、またはタンパク質の翻訳を妨害することによって）。オリゴヌクレオチド１０７は、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし得、かつその発現をノックダウンし得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の塩基の配列は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有する。

【0025】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド中の塩基の配列は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも９０％同一であり、オリゴヌクレオチドは、Ｎａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズでき、かつそのＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導できる。

【0026】

オリゴヌクレオチド１０７は、ＲＮＡ １１７中のセグメント１１５にハイブリダイズするが、それは、オリゴヌクレオチド１０７が、ｍＲＮＡ １１７の標的セグメント１１５に対して実質的にまたは完全にアンチセンスであるからである。その意味では、組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。組成物１０１は、塩基対相補性を有する標的ＲＮＡに結合するＡＳＯを含み、ＡＳＯの化学構造および設計に基づいて、種々の効果を発揮する。神経学的疾患の前臨床モデルおよびヒト臨床試験開発において一般に使用される種々の機構が使用され得る。これらの機構には、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の動員を介したＲＮＡ標的分解が含まれる。

【0027】

本開示の好ましい実施形態は、電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＶチャネル）ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を動員するＡＳＯを含む。ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、ＮａＶチャネルＲＮＡを切断し、これが、ＮａＶチャネルタンパク質の発現を下方調節する。したがって、本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、ＮａＶチャネルを、非限定的な例として、例えば、ＤＥＥ１３、ドラベ症候群、および過剰なＥ／Ｉバランス比が関与する発症機構を有するてんかんの形態が含まれるてんかんなどの状態に対する治療の標的とする。本開示は、臨床および前臨床データが、例えば、抗痙攣薬または鎮痛薬としての、治療のための小分子ＮａＶブロッカーの使用を支持するという洞察に基づく。例えば、ジブカイン、メチルベンゼトニウム（benzetheonium）塩化物、ダリフェナシン臭化水素酸塩およびジメチソキン塩酸塩は全て、Ｎａｖ１．６チャネルに対するそれらの阻害活性について調査されている。参照により組み込まれるAtkin, 2018, A comprehensive approach to identifying repurposed drugs to treat SCN8A epilepsy, Epilepsia 59(4):802-813を参照されたい。同様に、ナトリウムチャネルは、疼痛に関連付けられている。抗ＮａＶ ＡＳＯを含む組成物は、てんかんまたは疼痛などの状態を処置するために対象に投与され得る。抗ＮａＶ ＡＳＯは、状態非依存的かつサブタイプ選択的であり得るので、抗ＮａＶ ＡＳＯは、小分子ブロッカーなどの他のアプローチを超える利点を提供することが見出され得る。

【0028】

したがって、本開示は、患者における状態を処置するための医薬の製造のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用を提供する。使用において、ＡＳＯは、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、例えば、９５％またはそれよりも高い同一性を有する。好ましい実施形態は、約１５塩基長と２５塩基長との間、好ましくは、約１８塩基長と２２塩基長との間（端の値を含む）であるＡＳＯを使用する。一般に、「１つの（ａｎ）ＡＳＯ」に対する言及は、実質的に同一な分子の多数のコピーを含む。したがって、「１つの（ａｎ）ＡＳＯ」は、数十万または数百万よりも多くのコピーの規定されたＡＳＯであり得る。好ましい実施形態では、ＡＳＯは、２０塩基長であり、配列番号１～１５６のうちの１つの配列を有し、医薬の製造において使用される。ＡＳＯは、任意の適切な形式で、例えば、微小遠心管または試験管などの管中で凍結乾燥されてまたは管中の溶液中などで、提供され得る。使用の好ましい実施形態は、Ｎａｖ１．６を標的とする。１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つもしくは５つまたはそれよりも多くの組合せの）ＡＳＯは、医薬の製造において使用され得る。１つまたは複数のＡＳＯは、Ｎａｖ１．６ ＲＮＡ中の標的にハイブリダイズし得る。使用のある特定の実施形態では、ＡＳＯ中の塩基の配列は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％または１００％同一である。例えば、ＡＳＯ中の塩基の配列は、好ましい配列のうちの１つに対して少なくとも９０％、９５％または１００％同一であり得る。

【0029】

使用の実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡウイングが隣接する中心ＤＮＡセグメントを有するギャップマー構造、例えば、中心領域の両方の側の４つの改変ＲＮＡ塩基を伴う１２個のＤＮＡ塩基の中心領域、すなわち、４－１２－４構造を有し得る。構造は、５－１０－５または４－９－４または４－１０－４－または５－９－５などであり得る。各改変ＲＮＡ塩基は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡまたは他の適切な糖であり得る。好ましくは、ＡＳＯの骨格は、複数のホスホロチオエート結合を排他的に有するか、またはホスホジエステル連結もまた含むかのいずれかであり、例えば、糖連結の大部分または全ては、使用実施形態ではホスホロチオエートであり得る。医薬は、例えば、注射を介した送達のために製剤化され得る。したがって、ＡＳＯは、最初は、ＩＶバッグ、シリンジまたはくも膜下腔内ポンプ中への導入に適切な製剤へと混合するために適切な形態であり得る。例えば、ＡＳＯ（数千もしくは数百万またはそれよりも多くのコピーの１つのＡＳＯ）は、管中で凍結乾燥され得る、または既知のモル濃度もしくは濃度で溶液中にあり得る。ＡＳＯは、担体、例えば、溶媒または賦形剤がＡＳＯを含む薬学的に許容される組成物中に溶解または希釈され得、ＩＶバッグ、シリンジまたはくも膜下腔内ポンプ中に充填され得る。医薬は、１つよりも多くのＡＳＯ、例えば、２つ、３つ、４つもしくは５つまたはそれよりも多くのＡＳＯの任意の組合せを使用して作製され得る。

【0030】

使用実施形態に記載される任意のＡＳＯ（複数可）が、本開示の組成物中に含まれ得る。本開示の組成物の好ましい実施形態は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも９０％同一な塩基配列を各々が有する１つまたは複数の治療的オリゴヌクレオチドを含み、治療的オリゴヌクレオチドの各々は、改変ＲＮＡウイングが隣接する中心ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し、複数の治療的オリゴヌクレオチドは、くも膜下腔内注射のために製剤化された溶液または担体中で提供される。

【0031】

図２は、ギャップマー構造を有するオリゴヌクレオチド２０７を示す。オリゴヌクレオチド２０７は、約１２個のＤＮＡ塩基の中心領域２２１に隣接する２つのウイング（第１のウイング２１５および第２のウイング２１６）を含む。好ましい実施形態では、ウイング２１５、２１６は、全てがまたは大部分がＲＮＡ塩基であるが、中心領域２２１は、全てがまたは大部分がＤＮＡ塩基である。好ましくは、ウイングは、全てＲＮＡ塩基であり（改変または未改変）、中心領域は、全てＤＮＡ塩基である。一部の実施形態では、各ウイングは、４つのＲＮＡ塩基からなり、その全てまたは大部分は、改変ＲＮＡ塩基であり、例えば、各改変ＲＮＡ塩基は、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡからなる群から選択される。改変ＲＮＡ塩基は、リボース糖の２’ヒドロキシル基上に置換を含み得る。

【0032】

図３は、ＲＮＡ塩基中に含まれ得る２’－Ｏ－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）改変糖を示す。

【0033】

オリゴヌクレオチド２０７は、好ましくは、少なくとも約１５塩基を含み、約１５と約２５との間の数の塩基を含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド２０７は、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する。

【0034】

図４は、ＤＮＡのセグメント、例えば、オリゴヌクレオチド２０７の中心領域２２１の骨格内のホスホロチオエート結合５０５を示す。オリゴヌクレオチド２０７は、１つのまたは任意の数のホスホロチオエート結合５０５を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチド２０７内の全ての骨格連結がホスホロチオエートであり得、またはほとんどもしくは約半分がホスホロチオエートであり得る。

【0035】

組成物１０１は、送達のために製剤化され得る。したがって、オリゴヌクレオチド１０７は、最初は、シリンジ、バッグまたは注射ポンプ中への導入に適切な製剤へと混合するために適切な形態であり得る。例えば、オリゴヌクレオチド１０７（数千もしくは数百万またはそれよりも多くのコピーの１つのオリゴヌクレオチド１０７）は、管中で凍結乾燥され得る、または既知のモル濃度もしくは濃度で溶液中にあり得る。オリゴヌクレオチド１０７は、担体、例えば、溶媒または賦形剤がオリゴヌクレオチド１０７を含む薬学的に許容される組成物中に溶解または希釈され得、ＩＶバッグ、シリンジまたはくも膜下腔内ポンプ中に充填され得る。記載されるように、組成物１０１は、配列番号１～１５６のうちの１つとの比較によって規定される配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド１０７を含む。したがって、本開示の組成物は、同定された標的によって規定され示される。

【0036】

具体的には、オリゴヌクレオチド１０７は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約７５％相補的なｍＲＮＡのセグメントに沿って、ナトリウムチャネルタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズし、それにより、ナトリウムチャネルタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を防止する。これは、オリゴヌクレオチドが、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約７５％の同一性、好ましくは、少なくとも約９０％または９５％の同一性を有する場合に達成される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１５６のうちの１つの配列を有するが、当業者は、相補的な標的に対して９０％または好ましくは９５％の同一性を有するオリゴヌクレオチドが、配列特異的様式で標的にハイブリダイズする傾向がなおもあることを理解する。ワトソン・クリック塩基対合および塩基スタッキングを介して二本鎖構造を形成することは、エネルギー的に十分に好都合であり、二本鎖構造は、１０塩基対かそこら毎におよそ約１つのミスマッチした塩基対を許容し得る。したがって、細胞における中程度にストリンジェントな生理的条件の下では、９５％の同一性は、特に、オリゴヌクレオチドが、酵素的分解からオリゴヌクレオチドを保護するために、少なくとも少数の改変ＲＮＡ塩基またはホスホロチオエート骨格連結を有するギャップマー構造を有する場合に、有効なはずである。

【0037】

実際、本開示の組成物の特色および利益は、標的（配列番号１～１５６）が、ナトリウムチャネル転写物以外の分子中に相補体が存在する配列を除外するためにスクリーニングされていることである。例えば、配列は、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含むＲＮＡ転写物のデータベースに対してスクリーニングされており、非標的配列とマッチした初期配列が排除されている。したがって、配列番号１～１５６の配列を有するＡＳＯは、患者に投与された場合に、非標的配列にハイブリダイズする機会が最小化されているはずである。したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド１０７は、スクリーニングされ、ヒトにおけるいずれのオフターゲットコードＲＮＡまたは長い非コードＲＮＡについても閾値マッチを満たさないことが決定された塩基配列を有する。上述の基準を満たす組成物または使用は、オフターゲット材料、例えば、ｌｎｃＲＮＡにｉｎ ｖｉｖｏで結合しないはずであるが、それは、含まれた配列が、ｌｎｃＲＮＡのデータベースに対してスクリーニングされているからである。本開示の配列は、標的特異性についてスクリーニングされている。好ましくは、オリゴヌクレオチド１０７は、非ヒト霊長類ゲノム中の相同なセグメントに対して０個のミスマッチを有し、げっ歯類ゲノム中の相同なセグメントにおいて約５つ以下のミスマッチを有する塩基配列を有する。

【0038】

組成物が細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで送達される場合、細胞は、Ｎａｖ１．６の用量依存的ノックダウンを示す。

【0039】

図５は、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞に１００ｎＭで送達された配列番号１～７４のエクソン性ＡＳＯについての、ＳＣＮ８Ａの相対的な正規化された発現（ｙ軸上）を示す。各パネルにおいて、最初の２０本の棒は、１つのそれぞれのＡＳＯに対応する。２１番目および引き続く棒は、凡例において示された対照のうちの１つに対応する。ＡＳＯの棒は、配列番号による番号順である、すなわち、つまり、「ＡＳＯｓ ０４１－＞０６０」と標識された３番目のパネルでは、最初の棒は、配列番号４１のＡＳＯからの結果であり、４番目の棒は、配列番号４４のＡＳＯからの結果である。これらの棒は、ＡＳＯの全てが、ビヒクルと比較していくらかのノックダウンを示したこと、ならびに配列番号１～４、６～１１、１６、４１および４３～４５のＡＳＯが、約６０％以上の非常に良好なノックダウンを示したことを示している。

【0040】

全ての場合において、ＡＳＯは、最後の３桁によって同定され、その結果、ＡＳＯ－００１は００１であり、１４－００１はＱＳ－Ｔｓ１４－ＡＳＯ－００１である。これらは、同じものに言及する等価な標識である。ある場所では、より短いバージョンが、書式設定のために使用される。

【0041】

図６は、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞に１００ｎＭで送達された配列番号７５～１１４のイントロン性ＡＳＯについての、ＳＣＮ８Ａの相対的な正規化された発現（ｙ軸上）を示す。図中、比較のために、発現は、未処置の、低分子干渉ＲＮＡ、ビヒクル（ＡＳＯなし）、オフターゲットＡＳＯ（例えば、ＮａＶ１．７に対する）および「スクランブル」ＡＳＯで処置した細胞について測定される。これらの棒は、ＡＳＯの大部分が、ビヒクルと比較していくらかの発現ノックダウンを示したこと、ならびに配列番号７５、７７、８２、８５、８７、８８、９０、９８、１００～１０４および２０９のＡＳＯが、例えば、約６０％以上の、非常に良好なノックダウンを示したことを示している。

【0042】

図７は、ＳＣＮ８Ａエクソンを標的とする配列番号１～７４のＡＳＯ、およびＳＣＮ８Ａイントロンを標的とする配列番号７５～１１４のＡＳＯについての、組み合わされた再現性分析の結果を与える。散布図は、単一用量で＞６０％の転写物ノックダウンを示す１６個のＡＳＯ（１１個のエクソン性および５つのイントロン性）の優先順位付けと併せた、２つの複製実験にわたるノックダウンを示す。これらの実験は、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞における単一用量ＡＳＯスクリーニング（１００ｎＭでのトランスフェクションによる）を含んだ。軸は、異なる複製試験である。配列番号１～３、４、６、８、１１、１６、４１、４４および４５のエクソン性ＡＳＯならびに配列番号１００～１０４のイントロン性ＡＳＯは、用量依存性試験のために優先順位付けされ選択された１６個である。

【0043】

図８は、選択されたＡＳＯの用量依存的効果を示す。グラフは、ラウンド２における、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞における、各々６．２５ｎＭから１００ｎＭまでの増分での５つの濃度の、配列番号１～３、４、６、８、１１、１６、４１、４４、４５および１００～１０４の選択されたＡＳＯによるＡＳＯ処置の４８時間後のｉｎ ｖｉｔｒｏ ２日目（ＤＩＶ２）におけるＳＣＮ８Ａの相対的な正規化された発現量を与える。用量応答を、１６倍の濃度範囲（１００、５０、２５、１２．５および６．２５ｎＭ）で完了させた。用量依存性について試験したＡＳＯは、本開示の実施形態に従って作製した（２０塩基、２’－ＭＯＥ ＲＮＡを有するＲＮＡウイングが隣接した１２塩基のＤＮＡ中心領域、ＡＳＯの至る所での５－メチルシトシンおよびホスホロチオエート連結）。一番右の５本の棒は、ｓｉＲＮＡを使用した場合、スクランブルＡＳＯを使用した場合、ビヒクル単独（ＡＳＯなし）の場合および処置なしの場合の発現レベルを示す。１６個全てのＡＳＯが、対照と比較して、用量依存的様式で、Ｎａｖ１．６発現を減少させた。グラフは、本開示の組成物１０１が、Ｎａｖ１．６の用量依存的ノックダウンを示すことを示している。

【0044】

核酸ハイブリダイゼーションは、ミスマッチに関していくらかの許容度を有するので、配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも９０％のマッチである塩基配列を有し、塩基がホスホロチオエート連結のみによって連結されるオリゴヌクレオチド１０７であって、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接するＤＮＡ塩基の中心セグメント（例えば、５’ウイングおよび３’ウイングが各々、１２個のＤＮＡ塩基に隣接する４つの連続する２’改変ＲＮＡ塩基を含む４－１２－４構造、または５－１０－５構造など）を有するオリゴヌクレオチド１０７が、チャートに示されるパターンに従う用量依存的ノックダウンを示すことが見出され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド１０７は、具体的には、配列番号１～１５６のうちの１つにマッチする塩基配列を有し、塩基は、ホスホロチオエート連結によって（必要に応じて、ウイング中ではいくつかのホスホジエステル連結によって）連結され、オリゴヌクレオチド１０７は、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接する中心の１２個のＤＮＡ塩基を有し、５’ウイングおよび３’ウイングは各々、４つの連続する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む。

【0045】

これらの組成物は、ナトリウムチャネルの発現をノックダウンするに当たり有効であるので、本開示の組成物は、ニューロン活動が重要な役割を果たす状態、例えば、てんかんまたは疼痛などの状態を処置するために使用され得る。かかる状態では、ニューロンの電気生理学が関与し、一部のかかる状態では、ニューロンの活動は、神経活動において示される活動電位の形状またはスパイクパターンによって検出され得る状態特異的表現型によって特徴付けられ得る。本開示の組成物は、状態特異的表現型を健康な表現型に回復させ得、その回復効果は、電気生理学アッセイを介してｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、ニューロンに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで、実証可能であり得る。ニューロンに対する化合物の効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏニューロンを用いた光遺伝学的アッセイを使用して実証され得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏニューロンは、光刺激（例えば、光に応答してニューロンを発火させる改変型藻類チャネルロドプシン）および神経活動の光学的レポーター（ニューロン膜電位に比例して発光し、ニューロン活動のシグナルを生じる改変型アーキロドプシン）の下で神経活性化を提供する光遺伝学的構築物を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏニューロンは、蛍光顕微鏡機器においてアッセイされ得る。参照により組み込まれる米国特許出願公開２０２１／０１３８０３９号を参照されたい。任意の適切な光遺伝学的構築物、光遺伝学的顕微鏡または疼痛メディエーター組成物が使用され得る。例えば、適切な光遺伝学的構築物には、参照により組み込まれる米国特許第９，５９４，０７５号に記載されるものが含まれる。適切な光遺伝学的顕微鏡には、参照により組み込まれる米国特許第１０，２８８，８６３号に記載されるものが含まれる。適切な疼痛メディエーター組成物には、参照により組み込まれるＷＯ２０１８／１６５５７７に記載されるものが含まれる。

【0046】

組成物を鎮痛特性について試験する一例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＲＧアッセイは、漸増する光刺激の下で光遺伝学的神経試料単独からの光を測定することを含み得る。これは、神経興奮性のベースライン読み取りを与える。次いで、神経試料は、刺激物質（例えば、サイトカイン、プロテアーゼ、ｐＨ、壊死因子、または有痛性の腫瘍の部位においてｉｎ ｖｉｖｏで見出され得る他の因子の混合物を含む疼痛メディエーター組成物）で刺激される。光は、その刺激物質による処置の下で神経試料から測定される。最後に、神経試料は、本開示の組成物で処置される。刺激物質が、測定された興奮性を測定されたベースラインから動かす場合、オリゴヌクレオチド１０７は、測定された興奮性をベースラインに向けて回復させる傾向があることが見出され得る。

【0047】

組成物１０１中の本開示のオリゴヌクレオチド、例えば、ギャップマー、ＡＳＯまたは治療的オリゴヌクレオチド１０７は、表１に示される配列のうちの１つを参照して規定された配列を有し得る。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、表１に示される配列番号１～１５６のうちの１つに対して少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％または完全に同一である配列を有し得る。ＳＣＮ８Ａに対する上位の好ましい実施形態は、１４－０１６（配列番号１６）；１４－０４１（配列番号４１）；１４－０４４（配列番号４４）；および１４－０４５（配列番号４５）；１４－１００（配列番号１００）、１４－１１７（配列番号１１７）、１４－１２４（配列番号１２４）、１４－１２５（配列番号１２５）、１４－１２６（配列番号１２６）、１４－１２８（配列番号１２８）、１４－１２９（配列番号１２９）、１４－１３０（配列番号１３０）、１４－１３３（配列番号１３３）、１４－１３４（配列番号１３４）、１４－１３５（配列番号１３５）、１４－１３８（配列番号１３８）、１４－１３９（配列番号１３９）、１４－１４２（配列番号１４２）、１４－１４３配列番号１４３）、および１４－１４４（配列番号１４４）を含む。データは、本開示の組成物が、Ｎａｖ１．６のロバストで有意なノックダウン活性（＞７０％）を用量依存的様式で示すことを示している。

【0048】

ＡＳＯの塩基配列

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【0049】

他の特色および実施形態が、本開示の範囲内である。本開示の実施形態は、Ｎａｖ１．６の発現を阻害することが可能な、ＳＣＮ８Ａを標的とするロックト核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる、オリゴヌクレオチドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、てんかんまたは疼痛などの状態の予防または処置において使用され得る。本発明は、ヒトＮａｖ１．６のオリゴヌクレオチド阻害剤、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ剤、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡによって標的化され得るヒトＮａｖ１．６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ上の有利な標的部位配列をさらに提供する。

【0050】

本発明は、ヒトＮａｖ１．６ ＲＮＡに対して少なくとも９０％の相補性、好ましくは１００％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチド１０７は、配列番号１～１５６のうちの１つに対して１００％同一、または好ましくは、少なくとも９０％同一であり得る。

【0051】

実施形態は、本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明に従うコンジュゲートの薬学的に許容される塩を含む。

【0052】

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートと薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。

【0053】

本発明は、薬における使用のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の薬学的塩もしくは医薬組成物を提供する。

【0054】

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的塩を提供する。本発明は、てんかんまたは疼痛などの状態の処置、予防または軽減のための医薬の調製における、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。

【0055】

オリゴヌクレオチドは、固相化学合成とその後の精製および単離とによって、実験室において作製され得る。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合により連結されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの、核酸塩基部分の配列または順序、あるいはそれらの改変に対して言及がなされる。本発明のオリゴヌクレオチドは、人造であり得る、すなわち、化学的に合成され得、典型的には、精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の改変ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば、２’糖改変ヌクレオシドを含み得る。

【0056】

改変ヌクレオチドは、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル改変ヌクレオチド、２’－フルオロ改変ヌクレオチド、２’－デオキシ改変ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、アンロックト（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）ヌクレオチド、コンフォメーション的に制約された（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ヌクレオチド、拘束された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ改変ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル改変ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル改変ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル（hydroxl）改変ヌクレオチド、２’－メトキシエチル改変ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール改変ヌクレオチド、シクロヘキセニル改変ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－リン酸を含むヌクレオチド、５’－リン酸模倣物を含むヌクレオチド、グリコール改変ヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）改変ヌクレオチド、ならびにそれらの組合せからなる群から独立して選択され得る。

【0057】

ＡＳＯの窒素含有塩基は、天然に存在する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン、ならびに天然に存在しないバリアント、例えば、置換プリンまたは置換ピリミジン、例えば、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ（thiozolo）－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、いくつかの、多くの、大部分の、または全てのシトシン塩基が、メチル化された形態、例えば、５－メチルシトシンで存在する、オリゴヌクレオチドを含む。

【0058】

核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵについての文字コードによって示され得、各文字は、必要に応じて、等価な機能の改変核酸塩基を含み得る。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５－メチルシトシンから選択される。必要に応じて、ＬＮＡギャップマーについては、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

【0059】

本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、ナトリウムチャネル（Ｎａｖ１．６）の発現を下方調節（阻害）することが可能である。一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それを阻害または下方調節することによって、標的の発現をモジュレートすることが可能である。好ましくは、かかるモジュレーションは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％の阻害を生じる。

【0060】

本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を介して）標的核酸のレベルを減少させ得、または例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーションを介して、標的核酸の機能性を減少させ得る（もしくは機能性を変更し得る）。

【0061】

本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるリボース糖部分と比較した場合、改変糖部分、すなわち、糖部分の改変を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分の改変を有する多数のヌクレオシドが、主に、オリゴヌクレオチドのある特定の特性、例えば、親和性および／またはヌクレアーゼ抵抗性を改善することを目的として、作製されている。かかる改変には、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環による置き換えによって改変されたもの（ＨＮＡ）、またはリボース環上のＣ２炭素とＣ４炭素との間に架橋を典型的には有する二環式環による置き換えによって改変されたもの（ＬＮＡ）、またはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を典型的には欠如する未連結のリボース環による置き換えによって改変されたもの（例えば、ＵＮＡ）が含まれる。改変ヌクレオシドには、糖部分が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合など、非糖部分で置き換えられたヌクレオシド、またはモルホリノ核酸も含まれる。

【0062】

糖改変には、リボース環上の置換基を、水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシド中に天然に見出される２’－ＯＨ基に変更することを介して作製された改変もまた含まれる。置換基は、例えば、２’位、３’位、４’位または５’位において導入され得る。

【0063】

オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックト核酸（ＬＮＡ）塩基を含み得る。ＬＮＡは、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを連結するビラジカル（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’改変ヌクレオシドを含み得、これが、リボース環のコンフォメーションを制約またはロックする。これらのヌクレオシドは、文献中で架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。リボースのコンフォメーションのロックは、ＬＮＡが相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチド中に取り込まれた場合のハイブリダイゼーションの増強された親和性（二重鎖安定化）に関連する。これは、オリゴヌクレオチド／相補体二重鎖の融解温度を測定することによって決定され得る。非限定的な例示的なＬＮＡヌクレオシドは、全て参照により組み込まれるＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７およびＷＯ２００８／１５０７２９中に開示されている。

【0064】

本開示のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩には、生物学的にも他の意味でも望ましくないことのない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩が含まれる。塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸、および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、スルホン酸またはサリチル酸を用いて形成される。さらに、これらの塩は、無機塩基または有機塩基の遊離酸への添加から調製され得る。無機塩基に由来する塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基に由来する塩には、第１級、第２級および第３級アミン、天然に存在する置換アミンが含まれる置換アミン、環状アミンならびに塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。

【0065】

オリゴヌクレオチド１０７は、ナトリウムチャネルｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物のヌクレアーゼ媒介性分解を媒介または促進し得る。ヌクレアーゼ媒介性分解は、そのような配列と二重鎖を形成する場合に相補的なヌクレオチド配列の分解を媒介することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介性分解を介して機能し得、このとき、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特に、エンドヌクレアーゼ、好ましくは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することが可能である。ヌクレアーゼ媒介性機構を介して動作するオリゴヌクレオチド設計の例は、少なくとも５つまたは６つ連続するＤＮＡヌクレオシドの領域を典型的には含み、親和性増強性ヌクレオシドが一方の側または両方の側で隣接するオリゴヌクレオチド、例えば、ギャップマーである。アンチセンスオリゴヌクレオチド１０７のＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的なＲＮＡ分子との二重鎖中にある場合にＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。

【0066】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド１０７、またはその連続するヌクレオチド配列は、ギャップマーオリゴヌクレオチドまたはギャップマー設計とも呼ばれるギャップマーであり得る。アンチセンスギャップマーは、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性分解を介して標的核酸を阻害するために一般に使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造的領域：５’－＞３’配向で、５’－隣接部、ギャップおよび３’－隣接部、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続するＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域には、１つまたは複数の糖改変ヌクレオシド、有利に高い親和性の糖改変ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）、および１つまたは複数の糖改変ヌクレオシド、有利に高い親和性の糖改変ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）が隣接する。領域ＦおよびＦ’中の１つまたは複数の糖改変ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（すなわち、親和性増強性糖改変ヌクレオシドである）。一部の実施形態では、領域ＦおよびＦ’中の１つまたは複数の糖改変ヌクレオシドは、例えば、ＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択される、２’糖改変ヌクレオシド、例えば、高い親和性の２’糖改変である。

【0067】

混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’－フルオロ－ＡＮＡ単位、またはそれらの組合せからなる群から独立して選択される２’置換ヌクレオシドを含む、ＬＮＡギャップマーであり得る。領域ＦおよびＦ’のうち少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む一部の実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、２’－ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’のうち少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む一部の実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、２’－ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。一部の混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方は、１つまたは複数のＤＮＡヌクレオシドをさらに含み得る。ギャップマー設計は、共に参照により組み込まれるＷＯ２００８／０４９０８５およびＷＯ２０１２／１０９３９５で議論されている。

【0068】

１つまたは複数の非ヌクレオチド部分へのオリゴヌクレオチド１０７のコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込みまたは安定性に影響を与えることによって、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善し得る。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排出、透過性および／または細胞取込みを改善することによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改変または増強することができる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の臓器、組織または細胞型に標的化し得、それにより、その臓器、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強する。コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または臓器におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば、オフターゲット活性または非標的細胞型、組織もしくは臓器における活性を低減させるようにも機能し得る。

【0069】

ある実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）またはそれらの組合せからなる群から選択される。

【0070】

本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、上述のオリゴヌクレオチドおよび／またはそのオリゴヌクレオチドコンジュゲートもしくは塩のうちのいずれかと薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物中で提供され得る。薬学的に許容される希釈剤には、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝食塩水または無菌炭酸ナトリウム緩衝液である。一部の好ましい実施形態では、臨床的適用のための希釈剤には、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液および／またはＡＣＳＦ人工脳脊髄液が含まれる。

【0071】

一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または炭酸ナトリウム緩衝液中に溶解された薬学的に許容される希釈剤中の溶液の形態である。オリゴヌクレオチドは、溶液中で事前製剤化され得る、または一部の実施形態では、投与の前に薬学的に許容される希釈剤中に溶解され得る乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）の形態であり得る。適切に、例えば、オリゴヌクレオチドは、０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解され得る。

【0072】

本開示の組成物は、てんかんまたは疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発疼痛もしくは侵害受容性疼痛などの状態の予防または処置のために患者に投与され得る。好ましい実施形態は、ＤＥＥ１３、ドラベ症候群、または過剰なＥ／Ｉバランス比の発症機構が関与するてんかんの処置のために使用される。本発明のオリゴヌクレオチド、または本発明のコンジュゲート、塩もしくは医薬組成物は、局所鎮痛薬としての使用のためであり得る。

【0073】

本開示は、状態を患っているかまたは状態に罹患している可能性が高い対象、例えば、ヒトにおける状態を処置または予防するための方法であって、例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを含む本開示の組成物の治療または予防的有効量を、てんかんまたは疼痛、例えば、がん疼痛、変形性関節症疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発疼痛もしくは侵害受容性疼痛などの状態を患っているかまたは状態に罹患している対象に投与するステップを含み、オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載される特色の任意の組合せを有する、本明細書の記載のいずれかに従って、配列番号１～１１４のうちの１つに対して相補的な配列に標的化される、方法を提供する。

【実施例】

【0074】

図９～図１１は、ＳＣＮ８Ａ ＡＳＯの単一用量スクリーニングからのノックダウンパーセントの要約データを与える。ＳＣＮ８Ａ標的化ＡＳＯを、９６ウェルプレートの１ウェル当たり２０，０００個の細胞でプレートしたＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞を１００ｎＭのＡＳＯで処置することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングした。２つのラウンド（複製）からのデータが、各図について示される。ＡＳＯを、９６ウェルプレートの１ウェル当たり０．３ｕＬのＲＮＡｉＭａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。示されるデータは、本発明者らの一次スクリーニングにおいてスクリーニングした１４６個のＡＳＯについてのＳＣＮ８ＡノックダウンのｑＰＣＲ読み出し（ＳＣＮ８Ａノックダウンのパーセントとして表される）の要約表を示す。全ての試料を、ビヒクルのみ（すなわち、ＲＮＡｉＭａｘのみ）条件に対して正規化した。

【0075】

図９は、完全転写物を標的とするＳＣＮ８Ａエクソン標的化ＡＳＯを示す。

【0076】

図１０は、ＳＣＮ８Ａイントロン標的化ＡＳＯを示す。

【0077】

図１１は、転写物の最初の３７００ヌクレオチドに焦点を合わせた最適化されたＳＣＮ８Ａエクソン標的化ＡＳＯからの結果を与える。全ての細胞に、プレーティングの時点でＡＳＯをトランスフェクトし、ＡＳＯトランスフェクションの４８時間後に、ｑＰＣＲのために細胞を回収した。ハウスキーピング遺伝子アクチンについての転写物レベルを、ＳＣＮ８Ａについてのレベルを正規化するために使用した。全てのデータは、プレーティング、ＡＳＯ処置およびｑＰＣＲの２つの独立したラウンドにわたって示される。

【0078】

注記：１１５～１４６で終わるＩＤを有するＡＳＯは、００１～０７４で終わるＩＤを有するＡＳＯのスクリーニング後に設計し、このとき、本発明者らは、ＡＳＯによるモジュレーションのホットスポットとして、ＳＣＮ８Ａ転写物（ＮＭ＿０１４１０１．４）の最初の３７００ヌクレオチドを同定した。言い換えれば、この領域を標的とするより多数のＡＳＯが、ＳＣＮ８Ａ転写物を少なくとも約６０％ノックダウンすることに成功した。転写物のこの部分についての配列は、受託番号ＮＭ＿０１４１０１．４の下で、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能である。

【0079】

図１２～図１４は、単一用量スクリーニングにおいて少なくとも６０％の標的ノックダウンを達成するＳＣＮ８Ａ ＡＳＯを用いたナトリウムチャネルカウンタースクリーニングの要約データを与える。

【0080】

単一用量スクリーニング実験（図９～図１１に示される）から、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞において少なくとも６０％のＳＣＮ８Ａ転写物ノックダウンを達成したＡＳＯに優先順位付けした。ナトリウムチャネルにわたる転写物配列における公知の相同性に起因して、ＡＳＯ候補をさらにスクリーニングして、他のナトリウムチャネルをノックダウンするそれらの能力（これは、リード候補の所望の特徴ではない）を定量化した。ｑＰＣＲを介した実験の焦点は、この細胞型において発現されることが公知のＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３ＡおよびＳＣＮ９Ａに対してであった。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞では発現されない他のナトリウムチャネルについて、ＡＳＯのオフターゲット効果の潜在性をおよそ１１～４０のスケール（ここで、４０は、完全マッチを示す）で予測する計算アラインメントスコア（右の列、図１２および図１４）を計算した。本明細書で、全てのナトリウムチャネルにわたるｑＰＣＲノックダウンおよび最大の予測されたアラインメントスコアが、優先順位付けされたＡＳＯについて示される。

【0081】

図１２は、完全転写物を標的とするＳＣＮ８Ａエクソン標的化ＡＳＯからのデータを与える。

【0082】

図１３は、ＳＣＮ８Ａイントロン標的化ＡＳＯからのデータを与える。

【0083】

図１４は、転写物の最初の３７００ヌクレオチドに焦点を当てた最適化されたＳＣＮ８Ａエクソン標的化ＡＳＯからのデータを与える。相同なナトリウムチャネルに対する予測されたアラインメントを、ＡＳＯ １１５～１４６の設計において考慮したので、このバッチでは、全体的なオフターゲットノックダウンのより低いレベルが存在する。最大の予測されたアラインメントスコアは、エクソンに対するアラインメントに基づいているので、イントロン標的化ＡＳＯについては示されていないことに留意されたい。

【0084】

図１５および図１６は、ＳＣＮ８ＡリードＡＳＯ候補の用量応答スクリーニングの例を与える。

【0085】

候補リードＳＣＮ８Ａ標的化ＡＳＯを、単一用量スクリーニングにおける少なくとも６０％のＳＣＮ８Ａ転写物ノックダウン（図９～１１）および相同なナトリウムチャネルにおける約２０％未満の転写物ノックダウン（図１０、１２～１４）に基づいて選択した。各候補リード配列について、同一な配列を有する新たなＡＳＯを、３’および５’の２’－ＭＯＥ ＲＮＡ様ウイング中の各々１～３個のＰＯ骨格改変を伴って合成した（ＡＳＯ１つ当たり合計で３～４個のＰＯ改変）。次いで、これらの候補リードを、ＳＣＮ８Ａ転写物発現の用量応答モジュレーションについて試験した。これらの実験のために、９６ウェルプレートの１ウェル当たり２０，０００細胞の密度でプレートしたＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞を、ある範囲の濃度：８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５ｎＭで処置した。ＡＳＯを、９６ウェルプレートの１ウェル当たり０．３ｕＬのＲＮＡｉＭａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。全ての細胞に、プレーティングの時点でＡＳＯをトランスフェクトし、ＡＳＯトランスフェクションの４８時間後に、ｑＰＣＲのために細胞を回収した。アクチンを、ＳＣＮ８Ａに対する正規化遺伝子として使用した。各データポイントは、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を示す。

【0086】

図１５は、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞における２つのリードＳＣＮ８Ａ ＡＳＯ親候補（１１７、１２４）およびそれらのＰＯ改変娘分子（１５５、１５６、１５７、１５８）についての５ポイント用量応答データを示す。

【0087】

図１６は、同じＰＯ改変娘分子についての９ポイント用量応答データを示す。

【0088】

図１７および図１８は、ＳＣＮ８Ａ ＡＳＯリード候補の用量応答スクリーニングの要約データを与える。

【0089】

候補リードＳＣＮ８Ａ標的化ＡＳＯを、一次単一用量スクリーニングにおける少なくとも６０％の転写物ノックダウンに基づいて選択した。各候補リードについて、同一な配列を有する新たなＡＳＯを、３’および５’の２’－ＭＯＥ ＲＮＡ様ウイング中の各々１～３個のＰＯ骨格改変を伴って合成した（ＡＳＯ１つ当たり合計で３～４個のＰＯ改変）。次いで、全ての候補リードを、ＳＣＮ８Ａ転写物発現の用量応答モジュレーションについて試験した。これらの実験のために、９６ウェルプレートの１ウェル当たり２０ｋでプレートしたＳＫ－Ｎ－ＡＳ神経芽細胞腫細胞を、９６ウェルプレート上にプレートした。ＡＳＯを、５つの用量でスクリーニングした：１００、５０、２５、１２．５、６．２５ｎＭ。ＡＳＯを、９６ウェルプレートの１ウェル当たり０．３ｕＬのＲＮＡｉＭａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。全ての細胞に、プレーティングの時点でＡＳＯをトランスフェクトし、ＡＳＯトランスフェクションの４８時間後に、ｑＰＣＲのために細胞を回収した。アクチンを、ＳＣＮ８Ａに対する正規化遺伝子として使用した。全ての試料を、各実験内でビヒクル条件に対してさらに正規化した。全てのリード候補についての用量応答データが示され、分析される。

【0090】

図１７は、ＳＣＮ８Ａエクソンを標的とするリード全ＰＳ骨格候補についてのデータを示す。

【0091】

図１８は、ヒト臨床候補としてのＰＯ改変娘リードについてのデータを示す。

【0092】

図１９は、ＳＣＮ８Ａリード候補を使用した、ヒトＮＧＮ２幹細胞由来ニューロンにおけるＳＣＮ８Ａ転写物のノックダウンを示す。

【0093】

ＳＣＮ８Ａは、ニューロンの興奮性において重要であり、結果として、この細胞型は、標的転写物ノックダウンの機能的効果を評価するために重要である。本発明者らのＡＳＯが、関連するヒト細胞型において有効であることを示すために、本発明者らは、ヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロン（ＮＧＮ２過剰発現および二重ＳＭＡＤ阻害を介して分化させた）に、本発明者らのＳＣＮ８Ａ ＡＳＯをトランスフェクトした。ニューロンを、９６ウェルプレート上に、１ウェル当たり７０ｋでプレートし、２５０および１００ｎＭのＳＣＮ８Ａ ＡＳＯで処置した。ＡＳＯを、ＤＩＶ２０に、Ｅｎｄｏｐｏｒｔｅｒ ＰＥＧトランスフェクション試薬（１ウェル当たり０．６ｕＬ）を用いてニューロン中にトランスフェクトした。細胞を、ＤＩＶ２４に、処置の４日後に、ｑＰＣＲのために回収した。多くのＡＳＯは、ヒトニューロンにおいて、ＳＣＮ８Ａ転写物の＞８０％のノックダウンを示す。ベータチューブリンを、ＳＣＮ８Ａに対する正規化遺伝子として使用した。各棒は、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を示す。

【0094】

図２０は、ＳＣＮ８Ａリード候補を使用した、ヒト初代ニューロンにおけるＳＣＮ８Ａ転写物のノックダウンを示す。

【0095】

ＳＣＮ８Ａは、ニューロンの興奮性において重要であり、結果として、この細胞型は、標的転写物ノックダウンの機能的効果を評価するために重要である。本発明者らのＡＳＯが、関連するヒト細胞型において有効であることを示すために、本発明者らは、ヒト初代ニューロン（１９週齢の雌性胎仔に由来する；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌから取得した）に、選択されたＳＣＮ８Ａ ＡＳＯをトランスフェクトした。ニューロンを、９６ウェルプレート上に、１ウェル当たり３０ｋでプレートし、１ｕＭのＳＣＮ８Ａ ＡＳＯで処置した。ＡＳＯを、ＤＩＶ１に裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ）送達した。細胞を、ＡＳＯ処置の１３日後に、ｑＰＣＲのために回収した。多くのＡＳＯは、裸での送達により、ヒト初代ニューロンにおいて、ＳＣＮ８Ａ転写物の５０～６０％のノックダウンを示す。ベータチューブリンを、ＳＣＮ８Ａに対する正規化遺伝子として使用した。各棒は、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を示す。

【0096】

図２１は、ＳＣＮ８Ａリード候補を使用した、マウス初代皮質ニューロンにおけるＳｃｎ８ａ転写物のノックダウンを示す。

【0097】

Ｒ１８７２ＷおよびＮ１７６８Ｄの変異を有するＳＣＮ８Ａ起因性の脳症の２つのマウスモデルが入手可能である（以下の参考文献）。これらのマウスモデルは、疾患モデル系においてｉｎ ｖｉｖｏで概念実証および有効性を示すのに有用である。選択されたＡＳＯが、関連するマウス細胞型において有効であることを示すために、本発明者らは、マウス初代皮質ニューロン（Ｂｒａｉｎｂｉｔｓ）を、選択されたＳＣＮ８Ａ ＡＳＯで処置した。ニューロンを、９６ウェルプレート上に、１ウェル当たり５０ｋでプレートし、５００ｎＭのＳＣＮ８Ａ ＡＳＯで処置した。ＡＳＯを、ＤＩＶ５に裸で送達した。細胞を、ＡＳＯ処置の７日後（ＤＩＶ１２）に、ｑＰＣＲのために回収した。骨格改変を有するＳＣＮ８Ａの最適化されたリード候補を、スクリーニングした。マウス相同性を有するＡＳＯは、少なくとも６０％のノックダウンを示す。ベータチューブリンを、Ｓｃｎ８ａに対する正規化遺伝子として使用した。各棒は、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を示す。

【0098】

ＳＣＮ８Ａ－Ｒ１８７２Ｗマウスモデルの参考文献は、参照により組み込まれるBunton-Stasyshyn, 2019, Prominent role of forebrain excitatory neurons in SCN8A encephalopathy, Brain 142(2): 362-375に記載されている。

【0099】

ＳＣＮ８Ａ－Ｎ１７６８Ｄマウスモデルの参考文献は、参照により組み込まれるWagnon, 2015, Convulsive seizures and SUDEP in a mouse model of SCN8A epileptic encephalopathy, Hum Mol Genet 24(2): 506-515に記載されている。

【0100】

図２２は、ＳＣＮ８Ａリード候補を使用した、ラット初代海馬ニューロンにおけるＳｃｎ８ａ転写物のノックダウンを示す。

【0101】

リードＡＳＯを、ラットにおいてｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングして、忍容性、毒物学、ＰＫおよびＰＤについて試験する。選択されたＡＳＯが、関連するラット細胞型において有効であることを示すために、ラット初代海馬ニューロン（Ｂｒａｉｎｂｉｔｓ）を、選択されたＳＣＮ８Ａ ＡＳＯで処置した。ニューロンを、９６ウェルプレート上に、１ウェル当たり１２ｋでプレートし、４５０ｎＭのＳＣＮ８Ａ ＡＳＯで処置した。ＡＳＯを、ＤＩＶ５に裸で送達した。細胞を、ＤＩＶ１２に、ＡＳＯ処置の７日後に、ｑＰＣＲのために回収した。骨格改変を有するＳＣＮ８Ａの最適化されたリード候補を、スクリーニングした。ラット相同性を有するＡＳＯは、少なくとも６０％のノックダウンを示す。ベータチューブリンを、Ｓｃｎ８ａに対する正規化遺伝子として使用した。各棒は、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を示す。

【0102】

図２３は、ヒトＮＧＮ２幹細胞由来ニューロンにおける転写物ノックダウンにおけるプラトーの証拠を示す。Ｎａｖ１．６ヌルマウスは早期に死亡したことが観察されている。参照により組み込まれるRaman, 1997, Altered subthreshold sodium currents and disrupted firing patterns in Purkinje neurons of Scn8a Mutant Mice, Neuronを参照されたい。文献は、正常レベルのＮａｖ１．６の１０％を発現する低形質（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）マウスが、重症ジストニアを経験することを示唆している。参照により組み込まれるKearney, 2002, Molecular and pathological effects of a modified gene on deficiency of the sodium channel Scn8a (Navi.6), Hum Mol Genetを参照されたい。証拠は、Ｓｃｎ８ａを５０％ノックダウンするＡＳＯで処置されたＤＥＥ１３マウスが、減少したてんかん発作および増加した寿命を経験することを示唆している。参照により組み込まれるLenk, 2020, Scn8a antisense oligonucleotide is protective in mouse models of SCN8A encephalopathy and Dravet syndrome, Ann Neurolを参照されたい。その背景を考慮して、本発明者らは、治療域が、５０～９０％の範囲内のタンパク質ノックダウンであると仮説を立てている。５０％のノックダウンを達成し、９０％未満の十分に許容されるノックダウンレベルにおいてプラトーに達する、ＳＣＮ８Ａノックダウンについての濃度応答を有するＡＳＯは、最適な治療プロファイルを生じ得る。

【0103】

本発明者らは、ヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロン（ＮＧＮ２過剰発現および二重ＳＭＡＤ阻害を介して分化させた）に、本発明者らのＳＣＮ８Ａ ＡＳＯをトランスフェクトした。ニューロンを、９６ウェルプレート上に、１ウェル当たり７０ｋでプレートし、１０００、８００、５００、２５０および１００ｎＭのＳＣＮ８Ａ ＡＳＯで、用量応答において処置した。ＡＳＯを、ＤＩＶ２０に、Ｅｎｄｏｐｏｒｔｅｒ ＰＥＧトランスフェクション試薬（１ウェル当たり０．６ｕＬ）を用いてニューロン中にトランスフェクトした。細胞を、ＤＩＶ２４およびＤＩＶ３０に、処置の４日後および１０日後に、ｑＰＣＲのために回収した。ベータチューブリンを、ＳＣＮ８Ａに対する正規化遺伝子として使用した。各棒は、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を示す。

【0104】

１６５、１６６、１７５および１７６で示されるＡＳＯは、５００ｎＭのＡＳＯ処置から始まって７０～８０％の最大ノックダウンを示すが、１５３、１５４、１５７および１５８で示されるＡＳＯは、１００ｎＭから始まって＞８０％のノックダウンを示す。

【0105】

１４－１６５としても公知のＡＳＯ １６５は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５である。１４－１６６としても公知のＡＳＯ １６６は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５である。１４－１７５としても公知のＡＳＯ １７５は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４である。１４－１７６としても公知のＡＳＯ １７６は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４である。グラフは、これら４つの組成物が、試験した濃度範囲について約７０～８０％の最大ノックダウンを示すことを示している（？）。

【0106】

ｉｎ ｖｉｖｏ研究のためのＳＣＮ８Ａリード候補ＡＳＯは、以下の供給業者の注文フォーマット（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの供給業者から注文できる）で示され、ＡＳＯ－１４７～１５８、１６５、１６６、１７５および１７６が含まれる。他に示されない限り、全てのＡＳＯは、１２塩基の中心および３～５塩基の２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングを有するギャップマーである。全てのＡＳＯは、供給業者の注文フォーマットで示される場合を除き、大抵はＰＳ骨格を有する。シトシンはメチル化される。

【0107】

リードＡＳＯを、単一用量および用量応答有効性、ナトリウムチャネルカウンタースクリーニングデータ、配列モチーフ傾向およびオフターゲットアラインメント分析に基づいて選択した。ＳＣＮ８Ａに対する最も高いｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を有し、他のナトリウムチャネルにおけるノックダウンがなく、オフターゲットアラインメントが最も低く、配列モチーフの懸念が限定的であるＡＳＯを、リードとして優先順位付けした。

【0108】

表１において、最初の３７００ヌクレオチド内に入るＡＳＯは、アスタリスク（^＊）で示される。これらのうち、ＩＤ ＡＳＯ １４－００１～１４－１４６ならびに１６－００３、１６－００４、１６－００９、１６－０１１、１６－０１３、１６－０１４、１６－０１６、１６－０１７、１６－０１９および１６－０２０を有するＡＳＯを、以下の化学を用いて合成した：４（２’－ＭＯＥ）×１２（ＤＮＡ）×４（２’－ＭＯＥ）；全てのＣ塩基は５－メチル改変を有する；全ＰＳ骨格。

【0109】

以下の目録は、合成されたある特定のＳＣＮ８Ａ ＡＳＯ候補を示す。ＡＳＯ １４－１４７～１７６を、ＦＡＳＴＡリストに示されるように、以下の改変連結を用いて合成した：２ＭＯＥｒ＝２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ；ｉ２ＭＯＥｒ＝内部２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ；ｉＭｅ－ｄＣ／２ＭＯＥｒＣ／ｉ２ＭＯＥｒＣ＝５－メチル改変；およびＰＳ連結（^＊）対ＰＯ（／／）連結。

【0110】

ＦＡＳＴＡ目録に示されるように、ある特定の実施形態は、配列番号１６；配列番号４１；配列番号４４；配列番号４５；配列番号１１７；配列番号１２４；配列番号１２６；配列番号１２９；配列番号１３３；配列番号１３５；配列番号１３８；配列番号１３９；配列番号１４２；配列番号１４３；または配列番号１４４のうちの少なくとも１つによって与えられる配列を有するギャップマーＡＳＯを使用し、ギャップマーは、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有し、各ウイングは、１つまたは２つのホスホジエステル連結を有し、残りの塩基間連結は、ホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基は、５－メチル改変を有する。

【0111】

ある特定の最も好ましい実施形態（未処置に対して正規化して約５０％と９０％との間の発現を達成するノックダウンプラトーのため）は、１４－１６５、１４－１６６、１４－１７５または１４－１７６を使用する。

【0112】

本明細書で、１４－１６５は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５である。

【0113】

１４－１６６は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１３５であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１３５である。１４－１７５は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４である。１４－１７６は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡウイングが隣接する１２塩基のＤＮＡの中心セグメントを有するギャップマーでの配列番号１４４であって、２番目、３番目、４番目および１８番目の塩基間連結がホスホジエステルであり、残りの塩基間連結がホスホロチオエートであり、全てのシトシン塩基が５－メチル改変を有する、配列番号１４４である。ＦＡＳＴＡ目録は、かかるＡＳＯを注文するためにＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの供給業者に提示され得るフォーマットである。

【0114】

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【手続補正書】

【提出日】2024-01-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024518788000001.app

【国際調査報告】