特表 2024-519037 屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズを使用する掃引共焦点配置平面励起（ＳＣＡＰＥ）顕微鏡法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-08

(54)【発明の名称】屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズを使用する掃引共焦点配置平面励起（ＳＣＡＰＥ）顕微鏡法

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20240426BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20240426BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G02B21/36

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571361

(86)(22)【出願日】2022-05-16

(85)【翻訳文提出日】2024-01-16

(86)【国際出願番号】 US2022029444

(87)【国際公開番号】W WO2022245730

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】63/189,195

(32)【優先日】2021-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/189,797

(32)【優先日】2021-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/190,110

(32)【優先日】2021-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】306018457

【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ウェンシュアン・リアン

(72)【発明者】

【氏名】エリザベス・エム・シー・ヒルマン

【テーマコード（参考）】

2H052

【Ｆターム（参考）】

2H052AA07

2H052AA09

2H052AB02

2H052AC04

2H052AC09

2H052AC15

2H052AC18

2H052AC34

2H052AF14

(57)【要約】

本出願は、深部組織の３Ｄ画像が光の過度の損失を伴わずに捕捉され得るように画像をそれらの遠位先端からそれらの近位先端へ中継するための屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズを組み込む、掃引共焦点配置平面励起（ＳＣＡＰＥ）顕微鏡法システムを説明する。ＳＣＡＰＥシステムにおいて第２の対物レンズから出て行く光が失われないことを確実にするために、ゼロ作動距離特徴が第３の対物レンズに設計され得る。あるいは、第２の対物レンズから出て行く光が失われないことを確実にするために、テーパ付けされた繊維束が、ＳＣＡＰＥシステムにおいて第２の対物レンズと第３の対物レンズとの間に位置決めされ得る。さらに別の代替形態として、第３の対物レンズの使用を伴わない中間像平面における直接検出が、ＳＣＡＰＥシステムにおいて第２の対物レンズから出て行く光が失われないことを確実にし得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

近位端部および遠位端部を有する第１の光学素子の組であって、前記第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１の対物レンズを含む第１の光学素子の組と、
前記第１の対物レンズを越えて遠位に位置決めされたＧＲＩＮレンズと、
近位端部および遠位端部を有する第２の光学素子の組であって、前記第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズを含む第２の光学素子の組と、
前記第１の光学素子の組の近位端部に対して近位に、かつ前記第２の光学素子の組の近位端部に対して近位に配置された走査素子であって、
前記走査素子が、励起光のシートが近位から遠位の方向において前記第１の光学素子の組および前記ＧＲＩＮレンズを通過して、前記ＧＲＩＮレンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、前記励起光のシートを送るように位置決めされ、前記励起光のシートが、前記第１の対物レンズの光軸に対して斜角で前記試料内に投射され、前記励起光のシートが、前記走査素子の向きに依存して変化する位置において前記試料内に投射され、
前記ＧＲＩＮレンズおよび前記第１の光学素子の組が、前記試料からの検出光を遠位から近位の方向において前記走査素子へ送り返し、
前記走査素子が、前記検出光が近位から遠位の方向において前記第２の光学素子の組を通過して、前記第２の光学素子の組の前記遠位端部を越えた遠位の位置に斜め中間像平面を形成するように、前記検出光を送るようにも位置決めされる、走査素子と、
前記斜め中間像平面に到達する光をカメラに向かって送るように集合的に位置決めされる、関連光学インターフェースを含む第３の対物レンズであって、前記第３の対物レンズおよび前記関連光学インターフェースが、検出ＮＡを最大限に高めるためにゼロ作動距離を提供するように集合的に構成される、第３の対物レンズと、を備える撮像装置。

【請求項2】

励起光のビームを生成する光源と、
前記励起光のビームを前記励起光のシートに拡大し、前記励起光のシートを前記走査素子に向ける、少なくとも１つの光学素子と、
前記カメラと、をさらに備える請求項１に記載の撮像装置。

【請求項3】

前記第３の対物レンズと前記カメラとの間に位置決めされたイメージスプリッタをさらに備え、前記イメージスプリッタが、第１の波長の光を前記カメラ内のイメージセンサの第１の部分に向けるように、および第２の波長の光を前記イメージセンサの第２の部分に向けるように構成される、請求項１に記載の撮像装置。

【請求項4】

前記第２の対物レンズが、空気対物レンズであり、前記第３の対物レンズが、非空浸対物レンズであり、
前記関連光学インターフェースが、前記第３の対物レンズの浸漬媒体の界面に前記斜め中間像平面が形成されるように位置決めされた流体チャンバを含む、請求項１に記載の撮像装置。

【請求項5】

前記第２の対物レンズが、空気対物レンズであり、前記第３の対物レンズが、非空浸対物レンズであり、
前記関連光学インターフェースが、前記第３の対物レンズの浸漬媒体に整合する屈折率を有する硬化ポリマースペーサを含み、前記硬化ポリマースペーサが、前記第３の対物レンズの前面に直接固着され、前記硬化ポリマースペーサが、前記硬化ポリマースペーサの面上に前記斜め中間像平面が形成されるように位置決めされる、請求項１に記載の撮像装置。

【請求項6】

前記第２の対物レンズが、空気対物レンズであり、前記第３の対物レンズが、１．０ＮＡの水浸対物レンズであり、
前記関連光学インターフェースが、１．３３の屈折率を有する硬化ポリマースペーサを含み、前記硬化ポリマースペーサが、前記第３の対物レンズの前面に直接固着され、前記硬化ポリマースペーサが、前記硬化ポリマースペーサの面上に前記斜め中間像平面が形成されるように位置決めされる、請求項１に記載の撮像装置。

【請求項7】

前記第３の対物レンズが、カバーガラスで補正されていない、請求項６に記載の撮像装置。

【請求項8】

前記第３の対物レンズおよび前記関連光学インターフェースが、単一のパッケージに統合される、請求項１に記載の撮像装置。

【請求項9】

近位端部および遠位端部を有する第１の光学素子の組であって、前記第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１の対物レンズを含む第１の光学素子の組と、
前記第１の対物レンズを越えて遠位に位置決めされたＧＲＩＮレンズと、
近位端部および遠位端部を有する第２の光学素子の組であって、前記第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズを含む第２の光学素子の組と、
前記第１の光学素子の組の近位端部に対して近位に、かつ前記第２の光学素子の組の近位端部に対して近位に配置された走査素子であって、
前記走査素子が、励起光のシートが近位から遠位の方向において前記第１の光学素子の組および前記ＧＲＩＮレンズを通過して、前記ＧＲＩＮレンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、前記励起光のシートを送るように位置決めされ、前記励起光のシートが、前記第１の対物レンズの光軸に対して斜角で前記試料内に投射され、前記励起光のシートが、前記走査素子の向きに依存して変化する位置において前記試料内に投射され、
前記ＧＲＩＮレンズおよび前記第１の光学素子の組が、前記試料からの検出光を遠位から近位の方向において前記走査素子へ送り返し、
前記走査素子が、前記検出光が近位から遠位の方向において前記第２の光学素子の組を通過して、前記第２の光学素子の組の遠位端部を越えた遠位の位置に斜め中間像平面を形成するように、前記検出光を送るようにも位置決めされる、走査素子と、
光軸、第１の端部、および第２の端部を有する光学繊維の束であって、前記第１の端部が、前記斜め中間像平面からの光が前記束の第１の端部に入り、前記束を通って前記束の第２の端部に向けられるように、前記斜め中間像平面に位置決めされ、前記第１の端部が、光を収集するとともに像回転を実現するように位置決めされる、光学繊維の束と、
前記束の第２の端部から出て行く光を受け入れて、前記受け入れた光をカメラに向かって送るように位置決めされた第３の対物レンズであって、前記束の光軸と位置合わせされる光軸を有する第３の対物レンズと、を備える撮像装置。

【請求項10】

励起光のビームを生成する光源と、
前記励起光のビームを前記励起光のシートに拡大し、前記励起光のシートを前記走査素子に向ける、少なくとも１つの光学素子と、
カメラと、をさらに備える請求項９に記載の撮像装置。

【請求項11】

前記第１の端部が、前記束の光軸に対して面取りされている、請求項９に記載の撮像装置。

【請求項12】

前記光学繊維の束が、テーパ付けされた繊維の束を含み、前記テーパ付けされた繊維の束は、該束の直径が前記束の前記第２の端部において最大になるように配向される、請求項９に記載の撮像装置。

【請求項13】

前記第１の端部が、前記束の光軸に対して面取りされ、
前記光学繊維の束が、テーパ付けされた繊維の束を含み、前記テーパ付けされた繊維の束は、該束の直径が前記束の前記第２の端部において最大になるように配向され、
前記光学繊維の束の第１の端部が、１．０のＮＡを有する、請求項９に記載の撮像装置。

【請求項14】

広視野カメラと、
第２の光源と、
前記第１の光学素子の組内に位置決めされた第１のビームスプリッタであって、前記ＧＲＩＮレンズが対象組織に埋め込まれた後で前記ＧＲＩＮレンズを取り囲む組織の領域の外側表面を照明光が照らすように、前記第２の光源からの前記照明光を前記第１の対物レンズに向かって送るように構成され、前記外側表面から到達する光を前記広視野カメラに向かって送るようにさらに構成されている第１のビームスプリッタと、をさらに備える請求項９に記載の撮像装置。

【請求項15】

広視野カメラと、
第２の光源と、
前記第１の光学素子の組内に位置決めされた第１のビームスプリッタであって、前記ＧＲＩＮレンズが対象組織に埋め込まれた後で前記ＧＲＩＮレンズを取り囲む組織の領域の外側表面を照明光が照らすように、前記第２の光源からの前記照明光を前記第１の対物レンズに向かって送るように構成され、前記外側表面から到達する蛍光を前記広視野カメラに向かって送るようにさらに構成されている第１のビームスプリッタと、をさらに備える請求項９に記載の撮像装置。

【請求項16】

前記第２の光源からの照明光を前記第１のビームスプリッタに向かって送り、前記第１のビームスプリッタから到達する蛍光を前記広視野カメラに向かって送るように位置決めされ構成された第２のビームスプリッタをさらに備える請求項１５に記載の撮像装置。

【請求項17】

近位端部および遠位端部を有する第１の光学素子の組であって、前記第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１のＧＲＩＮ対物レンズを含む第１の光学素子の組と、
近位端部および遠位端部を有する第２の光学素子の組であって、前記第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズを含む第２の光学素子の組と、
前記第１の光学素子の組の近位端部に対して近位に、かつ前記第２の光学素子の組の近位端部に対して近位に配置された走査素子であって、
前記走査素子が、励起光のシートが近位から遠位の方向において前記第１の光学素子の組を通過して、前記第１のＧＲＩＮ対物レンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、前記励起光を送るように位置決めされ、前記励起光のシートが、前記第１のＧＲＩＮ対物レンズの光軸に対して斜角で前記試料内に投射され、前記励起光のシートが、前記走査素子の向きに依存して変化する位置において前記試料内に投射され、
前記第１の光学素子の組が、前記試料からの光を遠位から近位の方向において前記走査素子へ送り返し、
前記走査素子が、検出光が近位から遠位の方向において前記第２の光学素子の組を通過して、前記第２の対物レンズの前記遠位端部を越えた遠位の位置に斜め中間像平面を形成するように、前記検出光を送るようにも位置決めされる、走査素子と、
前記斜め中間像平面を越えて遠位に位置決めされた少なくとも１つの追加の光学素子であって、（ａ）前記斜め中間像平面に到達する光をカメラに向かって送り、（ｂ）前記斜め中間像平面の角度を補正するように、位置決めされ構成されている少なくとも１つの追加の光学素子と、を備える撮像装置。

【請求項18】

励起光のビームを生成する光源と、
前記励起光のビームを前記励起光のシートに拡大し、前記励起光のシートを前記走査素子に向ける、少なくとも１つの光学素子と、
カメラと、をさらに備える請求項１７に記載の撮像装置。

【請求項19】

前記第２の対物レンズがＧＲＩＮ対物レンズである、請求項１７に記載の撮像装置。

【請求項20】

前記第１のＧＲＩＮ対物レンズおよび前記第２の対物レンズが、同一の仕様を有する、請求項１９に記載の撮像装置。

【請求項21】

前記少なくとも１つの追加の光学素子が、
小端部および大端部を有するテーパ付けされた光学繊維の束と、
前面および後面を有する、１．３３の屈折率のポリマースペーサと、を備え、
前記前面が、前記第２の対物レンズと向かい合って位置決めされ、前記後面が、前記テーパ付けされた光学繊維の束の前記小端部と向かい合って位置決めされる、請求項１７に記載の撮像装置。

【請求項22】

前記少なくとも１つの追加の光学素子が、前記斜め中間像平面に位置決めされる第１の端部を有する光学繊維の束を備える、請求項１７に記載の撮像装置。

【請求項23】

前記第１の端部が、前記光学繊維の束の前記光軸に対して面取りされている、請求項２２に記載の撮像装置。

【請求項24】

前記少なくとも１つの追加の光学素子が、前記斜め中間像平面に対して垂直な光軸を有する第３の対物レンズを備える、請求項１７に記載の撮像装置。

【請求項25】

前記第３の対物レンズの浸漬媒体に整合する屈折率を有する硬化ポリマースペーサをさらに備え、前記硬化ポリマースペーサが、前記第３の対物レンズの前面に直接固着され、前記硬化ポリマースペーサが、前記硬化ポリマースペーサの面上に前記斜め中間像平面が形成されるように位置決めされ、
前記第２の対物レンズが、空気対物レンズであり、前記第３の対物レンズが、非空浸対物レンズである、請求項２４に記載の撮像装置。

【請求項26】

１．３３の屈折率を有する硬化ポリマースペーサをさらに備え、前記硬化ポリマースペーサが、前記第３の対物レンズの前面に直接固着され、前記硬化ポリマースペーサが、前記硬化ポリマースペーサの面上に前記斜め中間像平面が形成されるように位置決めされ、
前記第２の対物レンズが、空気対物レンズであり、前記第３の対物レンズが、１．０ＮＡの水浸対物レンズである、請求項２４に記載の撮像装置。

【請求項27】

前記第３の対物レンズおよび関連光学インターフェースが、単一のパッケージに統合される、請求項２４に記載の撮像装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６３／１８９１９５号（２０２１年５月１６日出願）、米国仮出願第６３／１８９７９７号（２０２１年５月１８日出願）および第６３／１９０１１０号（２０２１年５月１８日出願）の利益を主張するものであり、これら米国仮出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた助成番号ＮＳ１０８２１３、ＮＳ０９４２９６、ＮＳ１０４６４９およびＣＡ２３６５５４の下で政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

生きている動物の脳内の構造を撮像するための既存の手法は、自由に行動している動物における「小型カメラ」ヘッドマウントレコーディングを使用する撮像、および、ポイント走査２光子（ヘッド固定）システムを使用する撮像を含む。小型カメラ画像は、２Ｄ落射蛍光であり、曖昧で解釈するのが難しい可能性がある。また、２光子画像は、典型的には単一の２Ｄ平面しか捕捉せず、３Ｄ体積は捕捉しない。２Ｄデータは、解釈するのが難しく、組織の限られた体積を捕捉し、細胞の同定を困難にする。単一の２Ｄ平面において活動を捕捉する従来技術の手法は、単にネットワークの一部のサンプルであるだけでなく、複数の平面間に広がる細胞間の相互作用のいかなる分析をも妨げる。

【0004】

特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５は、各々が参照により本明細書に組み込まれており、３Ｄ撮像技法である掃引共焦点配置平面励起（ＳＣＡＰＥ，Ｓｗｅｐｔ Ｃｏｎｆｏｃａｌｌｙ－Ａｌｉｇｎｅｄ Ｐｌａｎａｒ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）顕微鏡法を実施するための様々な手法を説明している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第１００６１１１１号明細書

【特許文献2】米国特許第１０８３１０１４号明細書

【特許文献3】米国特許第１０８３５１１１号明細書

【特許文献4】米国特許第１０８５２５２０号明細書

【特許文献5】米国特許第１０９０８０８８号明細書

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Yang et al., “Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution”, Nature methods, 2019; 16 (6): 501-4

【非特許文献2】https://www.mypolymers.com/products

【非特許文献3】https://www.cargille.com/optical-gels/

【非特許文献4】https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=G608N3

【非特許文献5】https://www.mirrorcletech.com/wp/products/mems-mirrors/

【非特許文献6】https://doi.org/10.1117/3.934997.ch51

【非特許文献7】R. P. Barretto, B. Messerschmidt, and M. J. Schnitzer, (2009), “In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses”, Nat Methods, 6: 511-2

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本出願の１つの態様は、第１の撮像装置を対象とする。第１の撮像装置は、第１の光学素子の組、ＧＲＩＮレンズ、第２の光学素子の組、走査素子、および、関連光学インターフェースを含む第３の対物レンズを備える。第１の光学素子の組は、近位端部および遠位端部を有し、第１の光学素子の組は、第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１の対物レンズを含む。ＧＲＩＮレンズは、第１の対物レンズを越えて遠位に位置決めされる。第２の光学素子の組は、近位端部および遠位端部を有し、第２の光学素子の組は、第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズを含む。

【0008】

走査素子は、第１の光学素子の組の近位端部に対して近位に、かつ第２の光学素子の近位端部に対して近位に配置される。走査素子は、励起光のシートが近位から遠位の方向において第１の光学素子の組およびＧＲＩＮレンズを通過して、ＧＲＩＮレンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、励起光のシートを送るように位置決めされる。励起光のシートは、第１の対物レンズの光軸に対して斜角で試料内に投射され、励起光のシートは、走査素子の向きに依存して変化する位置において試料内に投射される。ＧＲＩＮレンズおよび第１の光学素子の組は、試料からの検出光（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｇｈｔ）を遠位から近位の方向において走査素子へ送り返す。走査素子はまた、検出光が近位から遠位の方向において第２の光学素子の組を通過して、第２の光学素子の組の遠位端部を越えた遠位の位置に斜め中間像平面を形成するように、検出光を送るように位置決めされる。関連光学インターフェースを含む第３の対物レンズは、斜め中間像平面に到達する光をカメラに向かって送るように集合的に位置決めされ、第３の対物レンズおよび関連光学インターフェースは、検出ＮＡを最大限に高めるためにゼロ作動距離を提供するように集合的に構成される。

【0009】

第１の撮像装置のいくつかの実施形態は、励起光のビームを生成する光源と、励起光のビームを励起光のシートに拡大し、励起光のシートを走査素子に向ける、少なくとも１つの光学素子と、カメラと、をさらに備える。

【0010】

第１の撮像装置のいくつかの実施形態は、第３の対物レンズとカメラとの間に位置決めされたイメージスプリッタをさらに備える。イメージスプリッタは、第１の波長の光をカメラ内のイメージセンサの第１の部分に向けるように、および第２の波長の光をイメージセンサの第２の部分に向けるように構成される。

【0011】

第１の撮像装置のいくつかの実施形態では、第２の対物レンズは、空気対物レンズであり、第３の対物レンズは、非空浸対物レンズであり、関連光学インターフェースは、第３の対物レンズの浸漬媒体の界面に斜め中間像平面が形成されるように位置決めされた流体チャンバを含む。

【0012】

第１の撮像装置のいくつかの実施形態では、第２の対物レンズは、空気対物レンズであり、第３の対物レンズは、非空浸対物レンズであり、関連光学インターフェースは、第３の対物レンズの浸漬媒体に整合する屈折率を有する硬化ポリマースペーサを含む。硬化ポリマースペーサは、第３の対物レンズの前面に直接固着され、硬化ポリマースペーサは、硬化ポリマースペーサの面上に斜め中間像平面が形成されるように位置決めされる。

【0013】

第１の撮像装置のいくつかの実施形態では、第２の対物レンズは、空気対物レンズであり、第３の対物レンズは、１．０ＮＡの水浸対物レンズであり、関連光学インターフェースは、１．３３の屈折率を有する硬化ポリマースペーサを含む。硬化ポリマースペーサは、第３の対物レンズの前面に直接固着され、硬化ポリマースペーサは、硬化ポリマースペーサの面上に斜め中間像平面が形成されるように位置決めされる。場合により、これらの実施形態では、第３の対物レンズは、カバーガラス補正されない。

【0014】

第１の撮像装置のいくつかの実施形態では、第３の対物レンズおよび関連光学インターフェースは、単一のパッケージに統合される。

【0015】

本出願の別の態様は、第２の撮像装置を対象とする。第２の撮像装置は、第１の光学素子の組、ＧＲＩＮレンズ、第２の光学素子の組、走査素子、光学繊維（光ファイバ）の束、および第３の対物レンズを備える。第１の光学素子の組は、近位端部および遠位端部を有し、第１の光学素子の組は、第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１の対物レンズを含む。ＧＲＩＮレンズは、第１の対物レンズを越えて遠位に位置決めされる。第２の光学素子の組は、近位端部および遠位端部を有し、第２の光学素子の組は、第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズを含む。

【0016】

走査素子は、第１の光学素子の組の近位端部に対して近位に、かつ第２の光学素子の組の近位端部に対して近位に配置される。走査素子は、励起光のシートが近位から遠位の方向において第１の光学素子の組およびＧＲＩＮレンズを通過して、ＧＲＩＮレンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、励起光のシートを送るように位置決めされる。励起光のシートは、第１の対物レンズの光軸に対して斜角で試料内に投射され、励起光のシートは、走査素子の向きに依存して変化する位置において試料内に投射される。ＧＲＩＮレンズおよび第１の光学素子の組は、試料からの検出光を遠位から近位の方向において走査素子へ送り返す。走査素子はまた、検出光が近位から遠位の方向において第２の光学素子の組を通過して、第２の光学素子の組の遠位端部を越えた遠位の位置に斜め中間像平面を形成するように、検出光を送るように位置決めされる。

【0017】

光学繊維の束は、光軸、第１の端部、および第２の端部を有し、第１の端部は、斜め中間像平面からの光が束の第１の端部に入り、束を通って束の第２の端部へ向けられるように、斜め中間像平面に位置決めされる。第１の端部は、光を収集するとともに像回転を実現するように位置決めされる。第３の対物レンズは、束の第２の端部から出て行く光を受け入れて、受け入れた光をカメラに向かって送るように位置決めされ、第３の対物レンズは、束の光軸と位置合わせされる光軸を有する。

【0018】

第２の装置のいくつかの実施形態は、励起光のビームを生成する光源と、励起光のビームを励起光のシートに拡大し、励起光のシートを走査素子に向ける、少なくとも１つの光学素子と、カメラと、をさらに備える。

【0019】

第２の装置のいくつかの実施形態では、第１の端部は、束の光軸に対して面取りされる。第２の装置のいくつかの実施形態では、光学繊維の束は、テーパ付けされた繊維の束を含み、テーパ付けされた繊維の束は、その直径が束の第２の端部において最大になるように配向される。

【0020】

第２の装置のいくつかの実施形態では、第１の端部は、束の光軸に対して面取りされ、光学繊維の束は、テーパ付けされた繊維の束を含み、テーパ付けされた繊維の束は、その直径が束の第２の端部において最大になるように配向され、光学繊維の束の第１の端部は、１．０のＮＡを有する。

【0021】

第２の装置のいくつかの実施形態は、広視野カメラ、第２の光源、および第１のビームスプリッタをさらに備える。第１のビースプリッタは、第１の光学素子の組内に位置決めされ、かつ、ＧＲＩＮレンズが対象組織に埋め込まれた後でＧＲＩＮレンズを取り囲む組織の領域の外側表面を照明光が照らすように、第２の光源からの照明光を第１の対物レンズに向かって送るように構成される。第１のビームスプリッタは、外側表面から到達する光を広視野カメラに向かって送るように、さらに構成される。

【0022】

第２の装置のいくつかの実施形態は、広視野カメラ、第２の光源、および第１のビームスプリッタをさらに備える。第１のビームスプリッタは、第１の光学素子の組内に位置決めされ、かつ、ＧＲＩＮレンズが対象組織に埋め込まれた後でＧＲＩＮレンズを取り囲む組織の領域の外側表面を照明光が照らすように、第２の光源からの照明光を第１の対物レンズに向かって送るように構成される。第１のビームスプリッタは、外側表面から到達する蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｇｈｔ）を広視野カメラに向かって送るように、さらに構成される。

【0023】

場合により、先の段落の実施形態は、第２の光源からの照明光を第１のビームスプリッタに向かって送るように、および第１のビームスプリッタから到達する蛍光を広視野カメラに向かって送るように位置決めされかつ構成された第２のビームスプリッタを、さらに備え得る。

【0024】

本出願の別の態様は、第１の光学素子の組、第２の光学素子の組、走査素子、および少なくとも１つの追加の光学素子を備える、第３の撮像装置を対象とする。第１の光学素子の組は、近位端部および遠位端部を有し、第１の光学素子の組は、第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１のＧＲＩＮ対物レンズを含む。第２の光学素子の組は、近位端部および遠位端部を有し、第２の光学素子の組は、第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズを含む。

【0025】

走査素子は、第１の光学素子の組の近位端部に対して近位に、かつ第２の光学素子の組の近位端部に対して近位に配置される。走査素子は、励起光のシートが近位から遠位の方向において第１の光学素子の組を通過して、第１のＧＲＩＮ対物レンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、励起光のシートを送るように位置決めされる。励起光のシートは、第１のＧＲＩＮ対物レンズの光軸に対して斜角で試料内に投射され、励起光のシートは、走査素子の向きに依存して変化する位置において試料内に投射される。第１の光学素子の組は、試料からの検出光を遠位から近位の方向において走査素子へ送り返す。走査素子はまた、検出光が近位から遠位の方向において第２の光学素子の組を通過して、第２の対物レンズの遠位端部を越えた遠位の位置に斜め中間像平面を形成するように、検出光を送るように位置決めされる。

【0026】

少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面を越えて遠位に位置決めされる。少なくとも１つの追加の光学素子は、（ａ）斜め中間像平面に到達する光をカメラに向かって送るように、および（ｂ）斜め中間像平面の角度を補正するように、位置決めされかつ構成される。

【0027】

第３の装置のいくつかの実施形態は、励起光のビームを生成する光源と、励起光のビームを励起光のシートに拡大し、励起光のシートを走査素子に向ける、少なくとも１つの光学素子と、カメラと、をさらに備える。

【0028】

第３の装置のいくつかの実施形態では、第２の対物レンズは、ＧＲＩＮ対物レンズである。場合により、これらの実施形態では、第１のＧＲＩＮ対物レンズおよび第２の対物レンズは、同一の仕様を有する。

【0029】

第３の装置のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、小端部および大端部を有するテーパ付けされた光学繊維の束と、前面および後面を有する１．３３の屈折率のポリマースペーサと、を備える。前面は、第２の対物レンズと向かい合って位置決めされ、後面は、テーパ付けされた光学繊維の束の小端部と向かい合って位置決めされる。

【0030】

第３の装置のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面に位置決めされる第１の端部を有する光学繊維の束を備える。場合により、これらの実施形態では、第１の端部は、光学繊維の束の光軸に対して面取りされる。

【0031】

第３の装置のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面に対して垂直な光軸を有する第３の対物レンズを備える。

【0032】

第３の装置のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面に対して垂直な光軸を有する第３の対物レンズを備える。これらの実施形態は、第３の対物レンズの浸漬媒体に整合する屈折率を有する硬化ポリマースペーサをさらに備える。硬化ポリマースペーサは、第３の対物レンズの前面に直接固着され、硬化ポリマースペーサは、斜め中間像平面が硬化ポリマースペーサの面上に形成されるように位置決めされる。第２の対物レンズは、空気対物レンズであり、第３の対物レンズは、非空浸対物レンズである。

【0033】

第３の装置のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面に対して垂直な光軸を有する第３の対物レンズを備える。これらの実施形態は、１．３３の屈折率を有する硬化ポリマースペーサをさらに備える。硬化ポリマースペーサは、第３の対物レンズの前面に直接固着され、硬化ポリマースペーサは、斜め中間像平面が硬化ポリマースペーサの面上に形成されるように位置決めされる。第２の対物レンズは、空気対物レンズであり、第３の対物レンズは、１．０ＮＡの水浸対物レンズである。

【0034】

第３の装置のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面に対して垂直な光軸を有する第３の対物レンズを備え、第３の対物レンズおよび関連光学インターフェースは、単一のパッケージに統合される。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】ＧＲＩＮレンズがどのようにして深部細胞の画像をレンズの近位側に中継するかを示す図である。

【図2】従来のＳＣＡＰＥシステムを示す図である。

【図3】対物レンズのＮＡを０．５に減少させた従来のＳＣＡＰＥシステムを示す図である。

【図4】第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１手法の一実施形態を示す図である。

【図5a】ゼロ作動距離手法（ｚｅｒｏ ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ）を分析するために使用される２つの対物レンズ間の幾何学的関係性を示す図である。

【図5b】ゼロ作動距離手法を分析するために使用される２つの対物レンズ間の幾何学的関係性を示す図である。

【図5c】ゼロ作動距離手法を分析するために使用される２つの対物レンズ間の幾何学的関係性を示す図である。

【図5d】ゼロ作動距離手法を分析するために使用される２つの対物レンズ間の幾何学的関係性を示す図である。

【図5e】ゼロ作動距離手法を分析するために使用される２つの対物レンズ間の幾何学的関係性を示す図である。

【図5f】ＺＷＤレンズについてのガラス対水界面に対する予期される角度依存反射損失を示す図である。

【図5g】ＺＷＤレンズについてガラス対水界面に対する予期される角度依存反射損失を示す図である。

【図6】ＺＷＤ理論の幾何学的配置の別の例を示す図である。

【図7a】ＳＣＡＰＥシステムにおける第３の対物レンズとして使用される浸漬レンズの前方に取り付けられた付加型スペーサを示す図である。

【図7b】図８ａに示された付加型スペーサを鋳造し位置決めする方法を示す図である。

【図7c】図８ａに示された付加型スペーサを鋳造し位置決めする方法を示す図である。

【図7d】付加型スペーサを製作するための一連のステップを示す図である。

【図7e】付加型スペーサを製作するための別の一連のステップを示す図である。

【図7f】付加型スペーサを第３の対物レンズに添着するための一連のステップを示す図である。

【図7g】第３の対物レンズに添着された付加型スペーサを示す図である。

【図7h】付加型スペーサを製作し、そのスペーサを第３の対物レンズに添着するための異なる一連のステップを示す図である。

【図7i】付加型スペーサを製作し、スペーサを第３の対物レンズに添着するための異なる一連のステップを示す図である。

【図8】ＧＲＩＮレンズがどのようにして２ｎ－ｆシステムと見なされ得るかを示す図である。

【図9a】最小限侵襲的な様式で内部組織または脳深部にアクセスするためにＧＲＩＮレンズを主対物レンズに結合する方法を示す図である。

【図9b】最小限侵襲的な様式で内部組織または脳深部にアクセスするためにＧＲＩＮレンズを主対物レンズに結合する方法を示す図である。

【図10】ＧＲＩＮリレーが同一のＧＲＩＮ要素で作られる必要がないことを示す図である。

【図11】ＧＲＩＮ部品によって中継される光シートがどのようにして斜めであることを必要としないかを示す図である。

【図12】ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１手法を実施するために使用され得る代替的なレイアウトを示す図である。

【図13】第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｅｓｏ手法の一実施形態を示す図である。

【図14】第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｅｓｏ手法の別の実施形態を示す図である。

【図15】第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の一実施形態を示す図である。

【図16】ＧＲＩＮ対物レンズの概略図である。

【図17】走査レンズが２Ｘの拡大を提供するように選択されることを示す図である。

【図18】実質上のＴ２および実質上のＯ２として同じＧＲＩＮ対物レンズを使用することを示す図である。

【図19】０．７ＮＡの水ＧＲＩＮ対物レンズの円錐角を示す図である。

【図20】２つの軸を走査することができるＭＥＭＳ走査装置の動作を示す図である。

【図21】異なる光学レイアウトのための検出の例を示す図である。

【図22】第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の別の実施形態を示す図である。

【図23】第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の他の実施形態を示す図である。

【図24】第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の追加の実施形態を示す図である。

【図25】第３の対物レンズを伴わない直接検出に依存する追加の実施形態を示す図である。

【図26】主対物レンズおよびチューブが単一の素子において実装される別の実施形態を示す図である。

【図27a】ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の追加の実施形態を示す図である。

【図27b】ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の追加の実施形態を示す図である。

【図28】ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ光学構成がどのようにして使用され得るかを示す概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

同様の参照符号が同様の要素を表す添付の図面を参照しながら、様々な実施形態を以下に詳細に説明する。

【0037】

本出願は、屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズを組み込む従来のＳＣＡＰＥシステムの改良を説明する。本明細書において、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ３は、試料から検出器までのＳＣＡＰＥシステムにおける第１の対物レンズ、第２の対物レンズ、および第３の対物レンズをそれぞれ意味し、ＮＡは、開口数を意味する。

【0038】

光学顕微鏡法の最大の限界のうちの１つは、散乱組織に深く入り込んで撮像する能力が限られていることである。細胞分解能においてマウスの皮質の深層を撮像することは、依然として大きな課題であり、海馬、視床、および線条体などの脳深部領域の細胞撮像は、皮質表面からの従来の非侵襲性顕微鏡法の及ぶ範囲を越えている。

【0039】

ＧＲＩＮレンズは、像をそれらの遠位先端から近位先端へ中継することができる固体ガラス円筒である。２００マイクロメートルから２０００マイクロメートルの間の直径、および８ｍｍを超える長さにより、ＧＲＩＮレンズは、生きている脳に慎重に挿入され、覆っている組織の機能の阻害を最小限に抑えながらほぼ全ての脳領域への光学アクセスを提供する。したがって、ＧＲＩＮレンズは、脳の散乱特性によってもたらされる従来技術の皮質撮像法の侵入深さ限界を克服して、海馬、視床、線条体、眼窩前頭皮質、および脳幹を含む広範な脳深部領域の観察を可能にすることができる。本明細書において説明されるＧＲＩＮレンズベースの実施形態は、自由に行動している覚醒動物における細胞活動パターンを含めて、行動中の広範な細胞型の活動および相互作用を捕捉することができる。

【0040】

本明細書において説明される実施形態は、埋込み型ＧＲＩＮレンズを通じた細胞活動の高速、高分解能、場合により多スペクトルの３Ｄ撮像のための技術であるＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥを開発するために、本発明者の高速３Ｄ掃引共焦点配置平面励起（ＳＣＡＰＥ）顕微鏡法の発展を踏まえる。ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥは、覚醒し行動している動物における複数の細胞型の大集団の３Ｄ動態を捕捉するために、皮質を越えて広範な脳領域を撮像する能力を提供し得る。ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥは、皮質と比較して非常に異なる細胞構成、アーキテクチャ、動態、および機能を有する構造内の回路動態の調査を可能にし得る。

【0041】

本発明者の予備データは、ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥの実現可能性を裏付けるものであり、十分な分解能の生体内３Ｄ撮像には１光子励起で十分であり、複雑さを大いに低減し、かつ、値ごろ感を向上させることを示す。

【0042】

図１に示されるように、ＧＲＩＮレンズが脳または他の組織に挿入されると、ＧＲＩＮレンズは、深部細胞の画像をレンズの近位側へ中継する。したがって、従来のＳＣＡＰＥシステムを埋込み型ＧＲＩＮレンズの近位端部に向ければＧＲＩＮレンズの深端部を越えて直ぐのところに位置決めされた組織の３Ｄ画像が提供されるはずであると、最初に予想するであろう。しかし、図２に示されたＳＣＡＰＥシステムのような従来のＳＣＡＰＥシステムは、比較的高いＮＡ（例えば、Ｏ１の場合は１．０、Ｏ２の場合は０．７５～１．０）を有する対物レンズＯ１およびＯ２を使用するので、この最初の予想は間違っているであろう。

【0043】

ＧＲＩＮレンズは典型的には約０．５のＮＡを有するので、ＧＲＩＮレンズを通して画像を捕捉するために使用されているＳＣＡＰＥシステムにおける対物レンズＯ１およびＯ２のＮＡは、図３に示されるように、同様の水準まで減少されなければならない。しかし、これらの対物レンズＯ１およびＯ２のＮＡが０．５近くまで減少されると、第２の対物レンズＯ２から出て行く光は、第３の対物レンズＯ３によって捕捉されることが「全くなく」、これは、図３の手法が機能しないことを意味する。

【0044】

本出願は、この問題を克服し、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするための、３つの手法を説明する。それらの３つの手法は、本明細書ではＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１、ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｅｓｏ、およびＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉと呼ばれる。

【0045】

図４は、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１手法の一実施形態を示す。

【0046】

図４の実施形態は、近位端部および遠位端部を有する第１の光学素子１０～１４の組を含む。第１の光学素子の組は、第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１の対物レンズ１０を含む。示された実施形態では、第１の光学素子の組はまた、第１の対物レンズ１０に加えて、第１のテレスコープ１２～１４を含む。ＧＲＩＮレンズ８が、第１の対物レンズ１０を越えて遠位に位置決めされる。このＧＲＩＮレンズ８のより詳細な説明は、以下で提供される。

【0047】

図４の実施形態はまた、近位端部および遠位端部を有する第２の光学素子２０～２４の組を含む。第２の光学素子の組は、第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズ２０を含む。示された実施形態では、第２の光学素子の組はまた、第２の対物レンズ２０に加えて、第２のテレスコープ２２～２４を含む。

【0048】

図４の実施形態はまた、第１の光学素子１０～１４の組の近位端部に対して近位に、かつ第２の光学素子２０～２４の組の近位端部に対して近位に配置された走査素子５０を含む。走査素子５０は、例えば、単一自由度（両矢印によって示される）を有する検流計ミラーであり得る。走査素子５０は、励起光のシートが近位から遠位の方向において第１の光学素子１０～１４の組およびＧＲＩＮレンズ８を通過して、ＧＲＩＮレンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、励起光のシートを送るように位置決めされる。励起光のシートは、第１の対物レンズ１０の光軸に対して斜角で試料内に投射され、励起光のシートは、走査素子５０の向きに依存して変化する位置において試料内に投射される。

【0049】

ＧＲＩＮレンズ８および第１の光学素子１０～１４の組は、試料からの検出光を遠位から近位の方向において走査素子５０へ送り返す。走査素子５０はまた、検出光が近位から遠位の方向において第２の光学素子２０～２４の組を通過して、第２の光学素子の組の遠位端部を越えた遠位の（すなわち、図４における第２の対物レンズ２０の左側の）位置に斜め中間像平面を形成するように、検出光を送るように位置決めされる。

【0050】

図４に示された実施形態では、第３の対物レンズ３０および関連光学インターフェース３２が、斜め中間像平面に到達する光をカメラ４０に向かって送るように集合的に位置決めされる。注目すべきことに、第３の対物レンズ３０および関連光学インターフェース３２は、検出ＮＡを最大限に高めるために、ゼロ差動距離（その詳細は以下で説明される）を提供するように集合的に構成される。

【0051】

図４の実施形態はまた、カメラ４０、および励起光のビームを生成する光源６０を含む。少なくとも１つの光学素子７２～８０が、励起光のビームを励起光のシートに拡大し、励起光のシートを走査素子５０に向ける。光源６０は、単一モードファイバを介してシステムに結合されたレーザのうちの１つまたは複数を使用して実装されて、より広い互換性を提供し、レーザボックスがリグから離れて安全に設置されることを可能にし、かつ、多スペクトル取得のための様々なレーザラインのコアライメントを確実にし得る。

【0052】

示された実施形態では、励起光のシートへの励起光のビームの拡大は、プルーセルレンズ７２、および２つの円柱レンズ７４、７６を使用して達成され、励起光のシートは、小ミラー８０により走査素子５０に向けられる。しかし、代替的な実施形態では、これらの２つの機能は、異なる素子を使用して実施され得る。例えば、レンズを使用して励起光のビームを励起光のシートに拡大する代わりに、シートへのビームの拡大は、追加の検流計（図示せず）を使用して実施され得る。その追加の検流計が図４における小ミラー８０の場所に位置決めされる場合、追加の検流計はまた、励起光のシートを走査素子５０に向ける機能を行うことができる。

【0053】

図４に示された実施形態は、第３の対物レンズ３０とカメラ４０との間に位置決めされたイメージスプリッタ４２を含み、このイメージスプリッタ４２は、第１の波長の光をカメラ４０内のイメージセンサの第１の部分に向けるように、および、第２の波長の光をイメージセンサの第２の部分に向けるように、構成される。この特徴は、異なる周波数において動作する複数の光源をシステムが使用する場合に有用である。しかし、単一周波数において動作する単一の光源のみを使用する実施形態では、イメージスプリッタ４２は省略される。

【0054】

第２の対物レンズ２０が空気対物レンズであり第３の対物レンズ３０が非空浸対物レンズである場合、関連光学インターフェース３２は、対物レンズ３０の浸漬媒体の界面に斜め中間像平面が形成されるように位置決めされた流体チャンバであり得る。

【0055】

あるいは、第２の対物レンズ２０が空気対物レンズであり第３の対物レンズ３０が非空浸対物レンズである場合、関連光学インターフェース３２は、第３の対物レンズ３０の浸漬媒体に整合する屈折率を有する硬化ポリマースペーサであってもよい。これらの実施形態では、硬化ポリマースペーサは、第３の対物レンズ３０の前面に直接固着され、硬化ポリマースペーサは、硬化ポリマースペーサの面上に斜め中間像平面が形成されるように位置決めされる。例えば、関連光学インターフェース３２は、第３の対物レンズ３０の前面に直接固着されて、硬化ポリマースペーサの面上に斜め中間像平面が形成されるように位置決めされる、１．３３の屈折率を有する硬化ポリマースペーサであってもよい。これらの実施形態では、第３の対物レンズ３０は、典型的にはカバーガラス補正されない。

【0056】

さらに別の代替形態として、第３の対物レンズおよび関連光学インターフェースは、例えば、ＡＭＳ－ＡＹＧ ｖ１．０対物レンズにおけるように、１．０のＮＡ、０の作動距離、および５ｍｍの有効焦点距離を有する単一のパッケージに統合されてもよい。

【0057】

図４に示されたＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１手法は、脳深部領域における高速度での３Ｄ撮像を達成するために、ＧＲＩＮレンズ８を通じて中継される斜め掃引光シートの幾何形状を利用する。この手法のいくつかの実施形態は、卓上型であり、かつＧＲＩＮレンズを通じて２光子点走査と同様に頭部を固定され覚醒し行動している動物に作用するように設計される。これらの実施形態は、１秒当たり１０ボリュームでの６００×６００×２５０μｍ^３の２～４色の撮像を提供し得る。注目すべきことに、ＧＲＩＮレンズ８の上面において生じる光の斜めシートの走査は、ＧＲＩＮレンズ８を通して脳内へ中継される。

【0058】

多スペクトル検出は、例えば二色ウイルスの後眼窩送達を使用するＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１手法を使用して可能である。これは、特定の細胞型の活動および複数の細胞型間の相互作用をリアルタイムで捕捉するための新たな標識化戦略を活用するために使用され得る（興奮性／抑制性ニューロン、星状膠細胞、小膠細胞、など）。任意の脳領域（皮質だけではない）においてこれを行うことを可能にすることは、哺乳類の脳における特殊化した細胞型間の構造機能相関の理解を大いに深めることができる。散乱脳内への侵入深さが限定的である場合、赤および近赤外蛍光指示薬が、様々なＧＲＩＮレンズとの併用ではるかに大きな視野へのアクセスを可能にするために使用され得る。

【0059】

ここで、本題からそれて、第３の対物レンズ３０および関連光学インターフェース３２（例えば、図４の実施形態における硬化ポリマースペーサ）がどのようにして検出ＮＡを最大限に高めるためにゼロ作動距離を提供するように集合的に構成されるかの光学理論を説明する。この理論は、Ｏ２ ２０とＯ３ ３０との間に２種類の異なる浸漬媒体を有してＯ３内へのはるかに大きな光錐の受入れを可能にすること、および、ゼロ作動距離（ＺＷＤ）長さのレンズをＯ３として設計に組み込むことに依存する。

【0060】

図５ａ～図５ｅは、このＺＷＤ手法の基準を導き出すものであり、Ｏ２が空浸レンズでありＯ３が１．０ＮＡの（非空気）浸漬レンズである場合、原則的に、Ｏ１またはＯ２のＮＡに関わりなく（Ｏ２がＯ１のＮＡの全てを中継するのに十分なＮＡを有しており、偶発的な損失を無視する限り）Ｏ１から来る光の１００％が検出可能であることを示す。

【0061】

ｎ１－ｎ２に対する予期された角度依存損失、偏光依存損失、空気－ガラス対空気－水の屈折率が、より高い屈折率の材料に対して予期された相当な反射とともに、図５ｆ～図５ｇに示されている。この反射は、ＺＷＤ界面を形成する材料の屈折率（ｎ２）に依存するＯ３に入る光の量を減少させ、より高い屈折率（例えば、ガラス）、および、入射角が大きい光線（例えば、Ｂと標識された光線）に対しては、損失が最大である。

【0062】

Ｏ１、Ｏ２、ならびにＯ３のＮＡおよびＲＩを考慮すると、図５ａ～図５ｅを参照すると、従来のＳＣＡＰＥ設計は、典型的に、１．０ＮＡの水浸レンズをＯ１として使用してきた。０．７５ＮＡの空気Ｏ２を使用することにより、Ｏ２の後ろで４８．５９°の全検出角度が保たれる。したがって、Ｏ３としての１．０ＮＡの水浸レンズ（斜光シートの像と位置合わせされる焦点面まで水を含む）は、Ｏ１により試料から収集された光の１００％を捕捉する。これは、空気における１．０ＮＡ＝９０°であり、したがって、Ｏ２としての空気対物レンズと対にされたＯ３としての任意の１．０ＮＡの対物レンズがＯ２からの光の約１００％を捕捉するためである。このことは、標準的な１．０ＮＡの水浸対物レンズが、この要求を満たすために「水スペーサ」の追加によって修正可能であることを意味する。

【0063】

Ｏ２としての非空浸レンズに移ることの便益は、Ｏ１からのより高いＮＡを活用することであり得る。しかし、Ｏ１における１．１ＮＡの水レンズは、Ｏ２において５５．７°を生成し、これは、（ＷＤの制約がなければ）Ｏ２における４０ｘ ０．９５ＮＡの空浸レンズによって受け入れられ得る。Ｏ１およびＯ２のＮＡを増大させることにより、分解能および処理量が高まるが、斜角、反射損失が増大し、また一般に、ＦＯＶが狭くなる。

【0064】

図４の実施形態における事例のように、Ｏ１およびＯ２が低ＮＡ（例えば、空気において０．５）である場合であっても、ＺＷＤの効果は、光検出効率を著しく向上させるであろう。これは、α_１が小さくＯ２およびＯ３がどちらも空気対物レンズである場合にＯ３によって検出される光の量がゼロであり得るという、図３に関連して上述された問題を回避する（例えば、４５＋β－α_１＞α_２／２である場合）。Ｏ３においてＺＷＤレンズを使用することにより、この事例では光収集効率を大きく向上させることができ、例えば広視野、長作動距離、空浸の屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズの適用のために、Ｏ１としての低倍率の（また一般に、低ＮＡの）レンズの使用が可能になる。

【0065】

本発明者らは、非特許文献１による独創性に富んだ研究を基に、代替的なＺＷＤ手法を考案した。Ｙａｎｇらは、中間像平面がレンズの前面と正確に位置合わせされるように位置決めされたＯ３として１．０ＮＡのＺＷＤレンズが使用されるとほぼ全ての入射光が対物レンズに受け入れられ得ることを示した。この手法は、９０°における入射ビームがより高い屈折率ｎの媒体内へ逆正弦（１／ｎ）の角度で曲がる場合の屈折の臨界角特性を活用する。水（ｎ＝１．３３）では、この角度は４８．８°であり、これは、１．０ＮＡの水浸対物レンズの受光角に必然的に対応する。固体ガラス「スノート」を含む商業的なＺＷＤ対物レンズが現在製造されているが、それらは、視野が限られており（１５０／４５０ｕｍ）、かつ、それぞれ１５，０００ドル／３０，０００ドルのコストがかかる。本発明者らは、光学グレードの１．３３の屈折率のＵＶ硬化性ポリマーの精密な「ブロブ」を標準的な２ｍｍ ＷＤ、１．０ＮＡの水浸対物レンズの先端上に単純に鋳造する、多用途かつ低コストの代替的なＺＷＤ手法を最近開発した。得られるレンズは、＞１ｍｍの視野を提供する一方で、システム処理量およびＮＡを、高ＮＡのシステムの場合には２～３倍高め、別の方法であれば無形になるであろう低ＮＡの構成の場合にはさらに高める。この単純な手法は、従来のＳＣＡＰＥシステムの分解能および処理量を大きく向上させるが、低ＮＡのＧＲＩＮレンズを通した撮像を可能にするための本発明者らのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１設計の重要な要素である。

【0066】

図６は、ＺＷＤ理論の幾何学的配置の別の例を示す。この例のためのＯ２ ２０として使用するための適切なレンズは、０．６のＮＡを有するＥｘｃｅｌｉｔａｓ ２８－２０－４６－０００などの、市販の２０×無限遠補正空気対物レンズである。これらのレンズのうちの２つが、１ｘの拡大率を提供するためにＯ１およびＯ２として整合されて、使用され得る。これは、マウス側での結合を、水を使用する場合よりも容易にする。これはまた、Ｏ２との衝突を伴わずにＯ３をＺＷＤレンズに変換するためにＯ３に固着されるポリマースペーサのための十分な余地を残す。あるいは、Ｏ２における２０×、０．６ＮＡの無限遠補正空気対物レンズが、約０．７ＮＡの多浸漬主対物レンズのためのスペーサ修正水対物レンズに適合され得る。

【0067】

ここで、さらに本題からそれて、硬化ポリマースペーサを製作するためのおよび硬化ポリマースペーサを第３の対物レンズ３０に添着するための適切な技法を説明する。

【0068】

スペーサは、第３の対物レンズ（Ｏ３）として使用される１．０ＮＡの浸漬レンズをＺＷＤレンズに変換して検出ＮＡを最大限に高めるために１．０ＮＡの浸漬レンズの前に取り付けられ得る適切な屈折率を有する。これは、１．０ＮＡ、２ｍｍＷＤ、２０ｘの水浸対物レンズ、および１．３３の屈折率を有するＵＶ硬化性ポリマーを使用して達成された。このレンズは、カバーガラス補正されず、したがって、スペーサは、焦点面におけるガラス製カバースリップまたは他の材料を伴わずに単一のユニットとして形成された。使用された材料はまた、自己蛍光が低いものである。図７ａ～図７ｉにおける詳細は、Ｏ３としてガラス錐台ベースのＺＷＤレンズを使用することに優るこの手法の顕著な利点を含めて、この手法（本明細書では「ブロブ」手法と呼ばれる）のための製作手順、取付け手順、および位置合わせ手順を示す。

【0069】

図７ｄは、ＢＩＯ－１３３（水と同じ屈折率を有するＵＶ硬化性ポリマー）を使用して本発明者らがこの節において「ブロブ」と呼ぶものを製作するための第１の手法のステップを示す。第１のステップは、ネガティブモールドを３Ｄ印刷するステップである。次のステップは、３Ｄ印刷したモールド上にスライドガラスを取り付けるステップである。次のステップは、ＢＩＯ－１３３を注入し、次いで真空を用いてガスを除去するステップである。次のステップは、頂部に第２のスライドガラスを追加して平坦面を作り出し、続いてポリマーをＵＶ硬化させるステップである。しかし、この第１の手法は、ＢＩＯ－１３３に横からアクセスすることができず、そのことが（上面および底面に接触することは回避されるべきなので）解放を難しくするため欠点を有するということに、留意されたい。

【0070】

図７ｅは、この節において論じられる「ブロブ」を製作するための第２の手法のステップを説明する。第１のステップは、２重ネガティブモールドを３Ｄ印刷するステップである。次のステップは、ＰＤＭＳを注入し、次いでＰＤＭＳを硬化させ、ＰＤＭＳを第１のモールドから取り出すステップである。この時点で、ＰＤＭＳから作られたネガティブモールドは、薄い底部を有する。次のステップは、薄いＰＤＭＳの底部を取り除いて、通り穴を取り囲む側壁の組を作り出すステップである。側壁の組は、複数の表面（例えば、正方形の事例では４つの側壁）、または（円筒の事例では）単一の連続的な表面のみを含み得る。次のステップは、ＰＤＭＳの側壁を高平坦性スライドガラスに押し付けるステップである。ＰＤＭＳの側壁は、可逆結合によって付着する。次のステップは、ＢＩＯ－１３３を注入し、真空を用いてガスを除去するステップである。次のステップは、頂部に第２のスライドガラスを追加して平坦面を作り出し、続いてＵＶ硬化させるステップである。最後のステップは、ＰＤＭＳの側壁およびスライドガラスを取り外し、硬化したＢＩＯ－１３３ポリマーを残すステップである。酸素はポリマーのＵＶ硬化を弱め、ＰＤＭＳは酸素透過可能であるので、ここでのＰＤＭＳの使用は、ＰＤＭＳ－ＢＩＯ１３３界面間に未硬化ポリマーの層をもたらし、それが取外しを促進する。

【0071】

ここで図７ｆに目を向けると、「ブロブ」を製作するためにどの手法（図７ｄ～図７ｅに関連して上述された２つの手法を含むがそれらに限定されない）が使用されても、ブロブおよび第３の対物レンズＯ３は、例えば図７ｆに示されたステップを使用して、組立体を形成するために組み立てられる。より具体的には、この例の第１のステップは、ポリマーブロブをきれいなパターン化されたスライドガラス（例えば、分解能標的）と接触させるステップである。次のステップは、３Ｄ印刷した支持体をポリマーと優しく接触させるステップである。これは、後でポリマーを支持してポリマーの座屈を回避することを意図されている。支持体およびポリマーは、ＵＶ接着剤を用いて互いに結合され得る。次のステップは、組立体をＯ３の下に設置し、間隙を水で満たすステップ、および、無限遠においてチューブレンズを用いてカメラ上に焦点画像が存在するまでＯ３の焦点を合わせるステップである。次のステップは、３Ｄ印刷した第２のデバイスをポリマー組立体に取り付けるステップである。ここでの意図は、分解能標的をカメラから継続的に観察することによりポリマーブロブを最適な位置に固定することである。しかし、図７ｆの手順が使用される場合、追加されるブロブがその（非常に滑らかな）前面が対物レンズの焦点面と正確に位置合わせされた状態で精密に位置合わせされることを確実にするのが困難であり得ることに、留意されたい。

【0072】

図７ｈは、この節において論じられるブロブを製作するための第３の手法のステップを示し、この第３の手法は、非常に良好な性能をもたらしており、ブロブの前面と第３の対物レンズ（Ｏ３）の焦点面との精密な位置合わせを促進する。この手法は、下方のスライドガラスの代わりに高平坦性ミラー９５が使用されること、および、ＵＶ硬化に先立ってブロブの上に第２のスライドガラスが追加されないこと以外は、多くの点で図７ｅに関連して上述された手法に似ている。したがって、この第３の手法のステップは、以下の通りである。第１のステップは、２重ネガティブモールドを３Ｄ印刷するステップである。次のステップは、ＰＤＭＳを注入し、２重ネガティブモールドを押し込み、次いでＰＤＭＳを硬化させて取り出すステップである。この時点で、薄い底部を有するＰＤＭＳから作られたネガティブモールドを有する。次のステップは、薄いＰＤＭＳの底部を取り除いて、通り穴を取り囲む側壁の組を作り出すステップである。側壁の組は、複数の表面（例えば、正方形の事例では４つの側壁）、または（円筒の事例では）単一の連続的な表面のみを含み得る。次のステップは、ＰＤＭＳの側壁をミラー９５に押し付けるステップである。ＰＤＭＳの側壁は、可逆結合によりミラー９５に付着する。次のステップは、ＢＩＯ－１３３を注入し、真空を用いてガスを除去するステップである。次のステップは、ＵＶ硬化させるステップである。そして最後のステップは、ＰＤＭＳの側壁を取り外し、硬化したＢＩＯ－１３３ポリマーの「ブロブ」を残すステップであり、ブロブは、この時点では依然としてミラー９５に固着されている。いくつかの実施形態では、硬化したブロブは、最終的にブロブが取り付けられる対物レンズの作動距離の７５～９５％の間の厚さを有する。例えば、対物レンズの作動距離が２ｍｍである場合、硬化したブロブは、１．８ｍｍの厚さを有し得る。

【0073】

この第３の手法では、ブロブの前面は、カバーガラスまたは顕微鏡スライドにではなく、非常に平坦なミラー９５上に成型される。誘電性前面ミラーは、超平坦面を有して－およそ４分の１波長の範囲内の精密さで－製造される。したがって、ミラーは、２５０ｎｍ未満の許容誤差で平坦になる。これは、ミラーをブロブの超平坦な共平面を成型するのに理想的なものにするだけではなく、ブロブの前面がミラーに接触するという事実は、以下で詳述されるような位置合わせプロセスのために使用される。

【0074】

次に図７ｉを参照すると、リグ全体が、デジタル傾斜計を用いて最初に位置合わせされる。示されるように、依然としてそれが成型されたミラー９５に取り付けられている最初に成型された約１．８ｍｍ厚さのブロブ９１は、次いで、対物レンズのきれいなガラス前面とＢＩＯ－１３３の硬化したブロブ９１との間にある量の未硬化ＢＩＯ－１３３ポリマー９２を有して、対物レンズ３０の前に位置決めされる。図７ｉにおいて縦縞で標識された光路は、拡大されかつ５０：５０ビームスプリッタを介して対物レンズに送り出された平行レーザ光を表す。この光は、（ブロブを通って）ミラー９５に反射して、対物レンズ３０を通って戻ってくる。次いで、ミラー９５（依然としてブロブ９１が取り付けられている）の位置は、１距離および２Ｄ傾斜の両方において調整され、一方で、戻ってくる光の平行特性は、例えば正確な平行をチェックするシアプレート（ｓｈｅｅｒ ｐｌａｔｅ）を使用して監視される。ミラー（したがって、「ブロブ」の前面）が対物レンズ３０の焦点面と正確に位置合わせされているときにだけ、戻ってくる光が平行になる。いったんこの状態に達すると、ポリマーのブロブ９１の周りの環境から酸素がパージされ（これは、ポリマーの適切な硬化を確実にする）、ＵＶ光（横縞によって表される）が対物レンズを通って（ダイクロイックビームスプリッタを介して）下方に投射され、すでに硬化した「ブロブ」９１と対物レンズ３０のガラス面との間の液体ポリマー９２を硬化させて、恒久的な結合を提供する。次いで、ミラー９５は、「ブロブ」９１の前面から剥離される。次いで、ポリマーの完全硬化を確実にするために、追加のＵＶ光が使用され得る。

【0075】

浸漬対物レンズ３０のためのスペーサを製作するための図７ｈ～図７ｉに示された手法の最も重要なステップは、以下の通りである。最初に、図７ｈに見られるように、側壁の組の間に位置決めされたミラーの部分がネガティブモールドの底部として機能するように、側壁の組がネガティブモールドの底部と協働して液密空洞を形成するように、ネガティブモールドの側壁がミラー９５に押し付けられる。次に、液密空洞は、第１の量のＵＶ硬化性ポリマーで満たされる。次いで、第１の量のＵＶ硬化性ポリマーは、第１の固体塊９１に硬化される。第１の固体塊９１の下面は、ミラー９５に付着する。次に、側壁の組は、第１の固体塊９１の下面とミラーとの間の付着を乱すことなしに、ミラー９５から取り外される。次に、第１の固体塊９１の上面は、第２の量のＵＶ硬化性ポリマー９２が第１の固体塊９１の上面と対物レンズ３０との間の空間を占めている状態で、対物レンズの近くに位置決めされる。位置決めに続いて、第１の固体塊９１の位置は、第１の固体塊の下面（ミラー９５の上面と直接接触している）が対物レンズ３０に対する最終位置に到達するまで、調整される。第１の固体塊９１が最終位置に到達した後、第２の量のＵＶ硬化性ポリマー９２が硬化される。

【0076】

第１の固体塊９１の位置の精密な調整を得るための優れた方法は、ミラー９５によって反射された光の平行特性を検出しながら、対物レンズ３０を通してミラー９５に向かって平行光を投射することである。第１の固体塊９１が最終位置に到達したという判定は、ミラー９５によって反射された光が正確に平行になったときになされる。これは、例えば、シアプレートを使用して達成され得る。

【0077】

第２の量の硬化性ポリマー９２の硬化のための適切な手法は、対物レンズ３０を通して第２の量のＵＶ硬化性ポリマー内にＵＶ光を投射することである。場合により、対物レンズを通して第２の量のＵＶ硬化性ポリマー９２内にＵＶ光を投射することに続いて、第２の量のＵＶ硬化性ポリマーをさらに硬化させるために、追加のＵＶ光が適用される。

【0078】

第２の量のＵＶ硬化性ポリマーの硬化後、ミラー９５は、対物レンズ３０が使用され得るように、第１の固体塊９１の下面から取り外される。

【0079】

ゼロ作動距離手法は、上記の例を超えて拡大され得る。適切な屈折率を有する任意のタイプの固体材料（または、拘束された液体）が、既存の浸漬レンズを修正するために使用され得る。浸漬レンズ（水浸レンズばかりでなく、必ずしも１．０ＮＡのレンズではない）への恒久的な延長部を成型するために使用され得る正確な屈折率を有する多くのＵＶ硬化性の（または、例えば時間、熱、照射、もしくは化学薬品を介して硬化可能／活性化可能な）化合物または接着剤が存在する。例えば、非特許文献２を参照されたい。様々な粘性および最小限の蒸発量を有するＲＩ整合ゲルも利用可能である。例えば、非特許文献３および非特許文献４を参照されたい。

【0080】

別の選択肢は、ＰＤＭＳ（屈折率約１．４３）を組織透明化撮像のために設計されたレンズ（透明度ＲＩ約１．４）と組み合わせて使用することであり、レンズのうちのいくつかは、「ブロブ」材料の屈折率のための精密整合を可能にするために、補正環を有する。Ｏ３においてより多くの光を捕捉するために、精密成型されたスペーサが、それらの高ＮＡ、長ＷＤのレンズに対する恒久的な修正を提供し得る。

【0081】

カバーガラス補正される浸漬レンズもまた、前面がガラスのチャンバとともに使用可能であり、本明細書において説明されるように、空間は液体または例えば硬化性ポリマーで満たされる。ＦＥＰベースの前面の水チャンバは、カバーガラス補正を伴わない水浸漬レンズ（ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｄｉｐｐｉｎｇ ｌｅｎｓ）のために使用され得る。特定の他のプラスチックまたはシリコーン材料もまた、一般的なシリコーンまたはオイル浸漬屈折率に整合するように、固体ブロックまたはチャンバに作られ得る。多浸漬および屈折率調整可能レンズもまた、材料選択の容易さのために用いられ得る。

【0082】

「ブロブ」素子を光学特性、材料の形状、または光学的完全性を変化させ得る粉塵または他の環境要因から保護するために、完成した修正済みレンズの周りに場合により着脱式キャップとともに保護チューブまたはハウジングを追加することが、有利である。この事例は、位置合わせのための両方のレンズの調整を可能にする、示された（浸漬液の追加を伴わない）キャップ付きチャンバの形態をとることができる。

【0083】

ＺＷＤ Ｏ３としてのＮＡ１．０の水対物レンズなどの対物レンズ上のこの「ブロブ」手法の利点は、以下を含む。（１）「ブロブ」手法は、一般的な約＄６，０００の対物レンズ（例えば、１．０ＮＡの水浸レンズ）の単純かつ安価な修正である。（２）変形可能なポリマー材料を使用することにより、位置合わせ中の損傷が防止され、かつ、様々なＯ２の幾何形状に対応するように成形可能である。（３）ブロブは、必要に応じて除去／交換／再生可能である。（４）使用されるＯ３レンズのうまく特徴付けされた性能により、広い（例えば、＞１ｍｍの）視野を得ることができる。（５）高ＮＡのガラスと比較して、空気に対する減少した表面反射：１．３３の界面。（６）Ｏ２からの光の同様の１００％の受光角が達成可能である。また、空気およびガラスと比較して、空気と水との間のより小さな屈折率不整合のおかげで、像平面における焦点外れに対する許容差がより良好である。斜め平面の遠隔焦点マッピングは斜め平面の小さな湾曲を一般に導入するので、上記のことは重要である。しかし、これはＺＷＤ手法に利用可能な深度範囲における制限因子であり得ることに、留意されたい。

【0084】

ここで、再度本題からそれて、第１の対物レンズＯ１ １０の下に位置決めされるＧＲＩＮレンズ８がどのように動作するかの光学理論を説明する。

【0085】

ここで図８に目を向けると、ＧＲＩＮレンズが、そのピッチに応じて、ｎ＝１、２、３…である２ｎ－ｆのシステムと見なされ得る。したがって、ＧＲＩＮレンズは、励起のために光シートを中継するために、また、検出のために画像を送り返すために、使用され得る。

【0086】

次に図９Ａ～図９Ｂに目を向けると、第１の分類のＧＲＩＮベースのＳＣＡＰＥは、最小限侵襲的な様式で内部組織または脳深部にアクセスするためにＧＲＩＮレンズを主対物レンズに結合するためのものである。例示的な図が図９Ａに示されており、この場合、４ｆ相当のＧＲＩＮレンズが、光シートを中継し、このＧＲＩＮレンズはまた、任意の２ｎｆシステムとして働く、任意のピッチのものであり得る。ＧＲＩＮ部品は、主対物レンズＯ１に対して同軸である必要はない。ＧＲＩＮ部品は、図９Ｂに示されるように、主対物レンズの撮像視野内で任意の軸上または軸外の位置に配置され得る。

【0087】

次に図１０に目を向けると、ＧＲＩＮリレーは、同一のＧＲＩＮ要素で作られる必要はない。ＧＲＩＮリレー全体の倍率は、±１である必要はない。ＧＲＩＮリレーは、光シートを中継しながら光シートを拡大または縮小することができる。しかし、中間像平面への試料の適切なマッピングは、全体的な倍率がｎ１／ｎ２であることをなおも必要とし、ここで、ｎ１は試料のＲＩであり、ｎ２はＯ２浸漬のＲＩであることに、留意されたい。

【0088】

異なる集束力（ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｐｏｗｅｒ）（同等に、異なるＮＡ）の２つのＧＲＩＮ部品からＧＲＩＮリレーが作られている１つの例示的な実施形態が示されている。このＧＲＩＮリレーは、斜めシート角度が減少する（すなわち、光軸に対してより真っ直ぐになる）がシート幅は増大するように、より高いＮＡの上部半体、および、より低いＮＡの下部半体を有する。第２の例は、シート角度が増大する一方でシート幅は試料に面する出力側において収縮するように、より低いＮＡの半体が上にある、逆転した事例を示す。

【0089】

球面収差または色焦点シフトなどのような光学収差を補正するのを助長するために、ＧＲＩＮ要素間に挟まれた、特別に設計された回折光学要素または位相マスクなどの他の光学素子も存在し得る。色補正（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）のための回折光学要素を組み込む例示的なＧＲＩＮリレーが示されている。

【0090】

次に図１１に目を向けると、ＧＲＩＮ部品によって中継される光シートは、斜めである必要はない。真っ直ぐな光シートも実行可能である。もはや斜めではない真っ直ぐな光シートの正面図および側面図が、図１１に示されている。側視幾何形状を形成するように、任意の（とはいえ、典型的には９０度の）角度によりビーム経路を反射しかつ折り畳むために、ＧＲＩＮリレーの先端にマイクロプリズムも存在し得る。マイクロプリズムを含む例が、図１１に示されている。プリズムは、任意の方向に面することができ、すなわち、光軸に対して任意の方位角を取ることができる。より高い撮像ＮＡを得るために、および／または収差を補正するために、ＧＲＩＮ素子とともに組み込まれるシングレットマイクロレンズまたはダブレットマイクロレンズなどの１つまたは複数の他の光線曲げ素子（ｌｉｇｈｔ ｂｅｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）も存在し得る。アクロマートダブレットおよびシングレットを組み込む例が、図１１に示されている。そのような組み合わせは、収差補正のためのより多くの自由度を提供するのと同時に、典型的なＧＲＩＮロッドレンズが提供し得る約０．５ＮＡよりも高いＮＡを達成する。

【0091】

余談を終え、ここで本発明者らの元の一連の考えに戻ることにして、第２の対物レンズＯ２から出て行く光のいずれも第３の対物レンズＯ３によって捕捉されない状況を回避するための追加の方法について説明する。

【0092】

図１２は、ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１手法を実施するために図４の実施形態の代わりに使用され得る別の素子の組および代替的なレイアウトを示す。

【0093】

図１３は、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｅｓｏ手法の一実施形態を示す。図１３の実施形態は、近位端部および遠位端部を有する第１の光学素子１０～１４の組を含む。第１の光学素子の組は、第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１の対物レンズ１０を含む。示された実施形態では、第１の対物レンズ１０に加えて、第１の光学素子の組はまた、第１のテレスコープ１２～１４を含む。ＧＲＩＮレンズ８が、第１の対物レンズ１０を越えて遠位に位置決めされる。この図１３の実施形態におけるこのＧＲＩＮレンズ８の詳細は、図４に関連して上述されたものに似ている。

【0094】

図１３の実施形態はまた、近位端部および遠位端部を有する第２の光学素子２０～２４の組を含む。第２の光学素子の組は、第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズ２０を含む。示された実施形態では、第２の対物レンズ２０に加えて、第２の光学素子の組はまた、第２のテレスコープ２２～２４を含む。

【0095】

図１３の実施形態はまた、第１の光学素子１０～１４の組の近位端部に対して近位に、かつ第２の光学素子２０～２４の組の近位端部に対して近位に配置された走査素子５０を含む。走査素子５０は、例えば、単一自由度（両矢印によって示される）を有する検流計ミラーであり得る。走査素子５０は、励起光のシートが近位から遠位の方向において第１の光学素子１０～１４の組およびＧＲＩＮレンズ８を通過して、ＧＲＩＮレンズを越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、励起光のシートを送るように位置決めされる。励起光のシートは、第１の対物レンズ１０の光軸に対して斜角で試料内に入射され、励起光のシートは、走査素子５０の向きに依存して変化する位置において試料内に投射される。

【0096】

ＧＲＩＮレンズ８および第１の光学素子１０～１４の組は、検出光を遠位から近位の方向において試料から走査素子５０へ送り返す。走査素子５０はまた、検出光が近位から遠位の方向において第２の光学素子２０～２４の組を通過して、第２の光学素子の組の遠位端部を越えた遠位の（すなわち、図１３における第２の対物レンズ２０の左側の）位置に斜め中間像平面を形成するように、検出光を送るように位置決めされている。

【0097】

図１３に示された実施形態はまた、光軸、第１の端部、および第２の端部を有する光学繊維（光ファイバ）の束１３０を含む。束１３０の第１の端部は、斜め中間像平面からの光が束の第１の端部に入り、束を通して束の第２の端部へ向けられるように、斜め中間像平面に位置決めされる。したがって、束１３０の第１の端部は、光を収集するとともに像回転を実現するように位置決めされる。

【0098】

第３の対物レンズ３０が、束１３０の第２の端部から出て行く光を受け入れて、受け入れた光をカメラ４０に向かって送るように、位置決めされる。第３の対物レンズは、使用されている束１３０の部分の光軸と位置合わせされる光軸を有し得る。ＧＲＩＮレンズ８がこの図１３の実施形態においてどのように動作するかの光学理論は、図４の実施形態に関連して上述された理論に似ている。

【0099】

図１３の実施形態はまた、カメラ４０、および励起光のビームを生成する光源６０を含む。少なくとも１つの光学素子７２～８０が、励起光のビームを励起光のシートに拡大し、励起光のシートを走査素子５０に向ける。これらの素子４０、６０、および７２～８０の動作は、図４の実施形態に関連して上述されたものに似ている。図４の実施形態に関連して上述された代替形態もまた、図１３の実施形態において使用され得る。

【0100】

束１３０の第１の端部は、図１３に示されるように、束の光軸に対して面取りされ得る。しかし、面取りされていない第１の端部を有する束も使用され得る。光学繊維の束１３０は、テーパ付けされた繊維の束を含むことができ、テーパ付けされた繊維の束は、図１３に示されるように、テーパ付けされた繊維の直径が束の第２の端部において最大になるように配向される。しかし、テーパ付けされていない繊維を有する束も使用され得る。

【0101】

図１３の実施形態のいくつかの好ましい実施態様では、束１３０の第１の端部は、束の光軸に対して面取りされ、束は、テーパ付けされた繊維の直径が束の第２の端部において最大になるように配向された、テーパ付けされた繊維の束を含み、光学繊維の束１３０の第１の端部は、１．０のＮＡを有する。

【0102】

図１３に示された実施形態は、テーパ付けされた光学要素（例えば、テーパ付けされた光学繊維の束）を有し、テーパは、アングルグラウンド縁部に位置合わせされている。この実施形態は、低倍率のＯ１を使用する。本発明者らが見つけることができた最高ＮＡ、低倍率の対物レンズは、Ｎｉｋｏｎによる５×、０．５ＮＡのレンズであり、現在入手可能な／使用されている大半の撮像ＧＲＩＮレンズのための受光角は、０．５ＮＡである。このレンズのための長作動距離（約１５ｍｍ）の空気界面もまた、浸漬媒体または精密な位置決めを必要とせずに覚醒し行動しているマウスに対応することができるので、非常に有用であることを証明した。この実施形態は、より広い視野にわたって比較的低い分解能の撮像を提供するが、ＧＲＩＮレンズは分解能を制限するかなり多くの収差を導入するので、このことは許容される。したがって、この図１３の実施形態のサンプリング密度は、たとえ完全ではなくとも、ＧＲＩＮレンズ下方の多数の細胞の詳細を見るのに十分である。

【0103】

図１４は、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｅｓｏ手法の別の実施形態を示す。この実施形態は、図１３の実施形態のアーキテクチャに基づくが、追加の特徴が加わる。より具体的には、図１４の実施形態の広い視野および空気界面は、皮質の全表面を撮像するために、また、ＧＲＩＮレンズ８を通して光のシートを走査することにより脳のより深い部分を選択的に撮像するために、同じ対物レンズ１０を通して広視野カメラ１００を使用する多モード撮像を実施する機会を広げる。

【0104】

この図１４の実施形態では、参照番号８～８０は、図１３の実施形態に関連して上述されたように機能する。しかし、この図１４の実施形態はまた、広視野カメラ１００、第２の光源８５、ならびに第１および第２のビームスプリッタ８１、８２を含む。第１のビームスプリッタ８１は、第１の光学素子の組内に位置決めされ、第１のビームスプリッタ８１は、ＧＲＩＮレンズが対象組織に埋め込まれた後でＧＲＩＮレンズ８を取り囲む組織の領域の外側表面を照明光が照らすように、第２の光源８５からの照明光を第１の対物レンズ１０に向かって送るように構成される。第１のビームスプリッタ８１はまた、脳の外側表面に到達する光を広視野カメラ１００に向かって送るように位置決めされかつ構成される。

【0105】

脳の外側表面から到達する光は、反射光（すなわち、第２の光源８５の同じ波長における光）、または蛍光（すなわち、第２の光源８５とは異なる波長における光）であり得る。後者の場合では、皮質全体の広視野撮像は、落射蛍光によって（例えば、緑色で励起し赤色で発光するｊＲＧＥＣＯ１ａを使用して）達成可能であり、一方で、ＧＲＩＮレンズの下方で（例えば、青色で励起し緑色で発光するＧＣａＭＰを使用して）より狭い視野を得ることができる。

【0106】

図１４に示された実施形態では、第２のビームスプリッタ８２が、第２の光源８５からの照明光を第１のビームスプリッタ８１に向かって送るように、および、第１のビームスプリッタ８１から到達する蛍光を広視野カメラ１００に向かって送るように、位置決めされかつ構成されることに、留意されたい。しかし、代替的な実施形態では、様々な波長をそれらの望ましい行き先へ送るための異なる手法が使用され得る。

【0107】

この図１４の実施形態の広い視野（例えば、５ｍｍ×５ｍｍ）は、ＧＲＩＮレンズが皮質に対して様々な位置に配置された場合に、システムはたとえ中心に置かれていなくともＧＲＩＮを通して撮像するようになおも導かれ得ることを意味する。場合により、必要に応じて（焦点面が維持され得るのであれば）様々な脳領域に配置された複数のＧＲＩＮレンズの下方を撮像することができる。ＳＣＡＰＥ掃引アーキテクチャは３Ｄ画像を得るのにＯ１レンズの移動を必要としないので、これらは全てうまく機能し、そのため、脳のより深い部分からのデータと同時に広視野データが取得される。

【0108】

図１３および図１４の実施形態は、以下を有利に促進し得る。（ａ）撮像中に試料の光遺伝的操作または他の操作を行うことにより、より多くの複雑性を追加することができる。（ｂ）行動または皮質活動への光のパターンの影響を調べるために、ＧＲＩＮレンズの下方に光のパターンが投射されて細胞を活性化させるかまたは静め得る。パターンは、ＧＲＩＮの視野の対象のサブ領域を塗りつぶすことができるか、または、ホログラフィックのもしくは他の整形を使用して単一の細胞を正確な時間において３Ｄ空間内で正確に対象とすることができる。このビームステアリング／整形は、光路に容易に導入され得る。（ｃ）システムを操作するために、または薬物もしくは他の動揺を与えるために、フラッド照明またはパターン照明を皮質の活発な部分および静寂な部分に適用することもできる。これらの利点は、撮像波長から励起を分離するために波長および出力密度の慎重な整合を必要とし得ることに、留意されたい。

【0109】

図１３および図１４の実施形態では、（ａ）視野は、０．５～１ｍｍ ＮＡの対物レンズの撮像のためだけに使用される場合に、必要であるよりもはるかに大きい。（ｂ）繊維テーパの実施は、分解能を２．５マイクロメートルピッチサイズに制限する。および、（ｃ）０．５ＮＡによってアンダーフィルされるよりもある程度高いＮＡのＧＲＩＮレンズを得ることが可能であることに、留意されたい。

【0110】

図１５は、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の一実施形態を示す。

【0111】

図１５の実施形態は、近位端部および遠位端部を有する第１の光学素子１１０～１１４の組を含む。第１の光学素子の組は、第１の光学素子の組の遠位端部に配置された第１のＧＲＩＮ対物レンズ１１０を含む。示された実施形態では、ＧＲＩＮ対物レンズ１１０は、水における０．７ＮＡ（３１．６°の半円錐角）および反対側の０．１６ＮＡを特徴とする、ＧＲＩＮＴＥＣＨ ＧＴ－ＭＯ－０７０－０１６－ＡＣＲ－ＶＩＳＮＩＲ－３０－２０である。これは、準４ｆシステム（ｑｕａｓｉ－４ｆ ｓｙｓｔｅｍ）である。２５°のシート角度を仮定すると、空気側角度は、ａｓｉｎ（ｓｉｎ（２５°）×１．３３３×０．１６／０．７）＝７．４°になる。このＧＲＩＮ対物レンズ１１０は、主対物レンズおよびチューブレンズの両方を単一のＧＲＩＮベースの素子に統合する。しかし、代替的な実施形態では、異なるＧＲＩＮ対物レンズ１１０が使用され得る。

【0112】

図１５に目を向けると、第１のＧＲＩＮ対物レンズ１１０に加えて、示された実施形態の第１の光学素子の組はまた、Ｅｄｍｕｎｄｓ ＃８４－１２８、ＶＩＳ－ＮＩＲ、ＥＦＬ＝４．０ｍｍ、Ｄｉａｍ＝２．０ｍｍ、ＢＦＬ＝２．９２ｍｍである別のレンズ１１４を含む。走査レンズ＃１の後方のビームオフセットは、４．０×ｓｉｎ（７．４°）＝５１５μｍである。しかし、代替的な実施形態では、異なるレンズ１１４が使用され得る。

【0113】

図１５の実施形態はまた、近位端部および遠位端部を有する第２の光学素子１２０～１２４の組を含む。第２の光学素子の組は、第２の光学素子の組の遠位端部に配置された第２の対物レンズ１２０を含む。示された実施形態では、第２の対物レンズ１２０もまたＧＲＩＮ対物レンズであり、ＧＲＩＮ対物レンズ１１０と同じ部品番号が第２の対物レンズ１２０に使用される。しかし、代替的な実施形態では、異なるＧＲＩＮ対物レンズが第２の対物レンズ１２０として使用され得るか、さらには非ＧＲＩＮ対物レンズが使用され得る。第２の対物レンズ１２０に加えて、示された実施形態の第２の光学素子の組はまた、レンズ１１４に一致する別のレンズ１２４を含む。しかし、代替的な実施形態では、レンズ１２４は、レンズ１１４に一致しない可能性がある。

【0114】

図１５の実施形態はまた、第１の光学素子１１０～１１４の組の近位端部に対して近位に、かつ第２の光学素子１２０～１２４の組の近位端部に対して近位に配置された走査素子１５０を含む。示された実施形態では、走査素子１５０は、Ｍｉｒｒｏｒｃｌｅ Ｓ４６１０５ ＭＥＭＳ要素であり、ミラー径＝２．０ｍｍ、ミラーはガラス面の下方約１．２ｍｍに位置する。基礎寸法（ｂａｓｅｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）は、約１５ｍｍ×１５ｍｍである。しかし、代替的な実施形態では、異なるＭＥＭＳ要素が使用され得る。他の代替的な実施形態では、走査素子１５０は、例えば、検流計ミラーであり得る。

【0115】

走査素子１５０は、励起光のシートが近位から遠位の方向において第１の光学素子１１０～１１４の組を通過して、第１のＧＲＩＮ対物レンズ１１０を越えて遠位に位置決めされた試料に入射するように、励起光のシートを送るように位置決めされる。励起光のシートは、第１のＧＲＩＮ対物レンズ１１０の光軸に対して斜角で試料内に投射され、励起光のシートは、走査素子１５０の向きに依存して変化する位置において試料内に投射される。

【0116】

第１の光学素子１１０～１１４の組は、試料からの検出光を遠位から近位の方向において走査素子１５０へ送り返す。走査素子１５０はまた、検出光が近位から遠位の方向において第２の光学素子１２０～１２４の組を通過して、第２の光学素子の組の遠位端部を越えた遠位の（すなわち、図１５における第２のＧＲＩＮ対物レンズ１２０の左側の）位置に斜め中間像平面を形成するように、検出光を送るように位置決めされる。

【0117】

少なくとも１つの追加の光学素子２００～２１０が、斜め中間像平面を越えて遠位に位置決めされ、少なくとも１つの追加の光学素子は、（ａ）斜め中間像平面に到達する光をカメラ（図示せず）に向かって送るように、および（ｂ）斜め中間像平面の角度を補正するように、位置決めされかつ構成される。

【0118】

この図１５の実施形態における励起ビームは、約０．１２×１．４５×２＝３５０μｍのビーム径をもたらすＴｈｏｒｌａｂｓ ３５４１４０－Ａ非球面レンズ、ＥＦＬ＝１．４５ｍｍ、ｄｉａｍ．＝２．４ｍｍによって平行にされ得る。励起ビームは、２つのマイクロプリズム反射鏡を介してさらに折り畳まれてシステム内へ案内される。シート幅に関して、中央の約２００μｍが大体一様であると仮定すると、個別製作の約４．５×の円柱ビーム拡大器が、励起ビームを約９００μｍの幅になるように拡大し、次いで、励起ビームをＯ１の裏側へ中継するための走査レンズ＃１を含む別の個別製作の４．０－ｍｍ－ＥＦＬ Ｃｙｌ対が、表側での約２００μｍの有用なシート幅をもたらす。シートのＮＡは、０．１２×１．４５／４．０×０．７／０．１６＝０．１９であると推定可能であり、これは、必要に応じてスリットによって減少され得る。補正のために、この実施形態は、第２の対物レンズＯ２ １２０の出力を光ファイバテーパ２０５に「接着」するために、水等価ポリマースペーサ２１０（本明細書では「ブロブ」とも呼ばれる）を用いることができる。テーパ２０５は、繊維の軸がＯ２の軸に平行になるように曲がるように、約４２°だけ面取りされるべきである（コアＮＡ＝１．８と仮定する）。２本の端光線は、繊維の軸に対して約１８°および約５．６°に曲がり、テーパ２０５の小端部内への０．５６ＮＡに対応することに、留意されたい。テーパ２０５の大端部からの出力ＮＡは、さらに小さくなり、したがって、繊維束２００によって十分に補正される（ＮＡ＜０．４）。

【0119】

この実施形態の長所は、テーパを研削することおよび３つの円柱／パウエルレンズ１７１～１７６を個別製作することを除けば最小限の個別製作；優秀なＯ１ ＮＡおよび収集効率；ｃｍレベルのパッケージサイズ；主ＧＲＩＮがどれだけ脳に入り込むかを、主ＧＲＩＮを取り付けるときに決定できること、を含む。この実施形態の短所は、テーパ２０５によりサンプリング密度が約２．８μｍに限定されることを含む。

【0120】

少なくとも１つの光学素子を実装するために、様々な手法が使用され得る。例えば、図１５に示された実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、小端部および大端部を有するテーパ付けされた光学繊維の束２０５と、前面および後面を有する、１．３３の屈折率のポリマースペーサ２１０と、を備える。前面は、第２の対物レンズ１２０と向かい合って位置決めされ、後面は、テーパ付けされた光学繊維の束２０５の小端部と向かい合って位置決めされる。

【0121】

他の実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面に位置決めされる第１の端部を有する光学繊維の束を備える。場合により、これらの実施形態では、第１の端部は、光学繊維の束の光軸に対して面取りされる。

【0122】

他の実施形態では、少なくとも１つの追加の光学素子は、斜め中間像平面に対して垂直な光軸を有する第３の対物レンズを備える。場合により、これらの実施形態は、第３の対物レンズの浸漬媒体に整合する屈折率（例えば、１．３３）を有する硬化ポリマースペーサをさらに備えることができ、硬化ポリマースペーサは、第３の対物レンズ（例えば、１．０ＮＡの水浸対物レンズ）の前面に直接固着され、硬化ポリマースペーサは、斜め中間像平面が硬化ポリマースペーサの面上に形成されるように位置決めされる。これらの実施形態では、第２の対物レンズ２０は、空気対物レンズであってよく、第３の対物レンズは、非空浸対物レンズであってよい。

【0123】

図１６は、図１５の実施形態における第１のＧＲＩＮ対物レンズ１１０および第２の対物レンズ１２０として機能するＧＲＩＮＴＥＣＨ ＧＴ－ＭＯ－０７０－０１６－ＡＣＲ－ＶＩＳＮＩＲ－３０－２０の概略図である。この素子は、ＧＲＩＮＴＥＣＨによる高ＮＡのＧＲＩＮ対物レンズのうちの１つであり、試料側（水浸）に０．７ＮＡを有し、良好な収色性および視野補正（ｆｉｅｌｄ－ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を有する。直径は１．３ｍｍであり、そのため、工学部直径は、約１．０ｍｍである。このマイクロ対物レンズは、テレスコープとしてモデル化可能であり、
実質上の主対物レンズのＥＦＬは、ｆ_ｏｂｊ＝（Ｄ／２）／ＮＡ＝０．５／０．７≒０．７１ｍｍであり、
実質上のチューブレンズのＥＦＬは、ｆ_１＝ｆ_ｏｂｊ（ＮＡ_ｏｂｊ／ＮＡ_１）＝３．１２５ｍｍであると推定することができる。

【0124】

ＧＲＩＮ対物レンズの全長は、８．３６ｍｍであり、そのため、テレスコープは、（おそらくテレセントリック繊維走査のために設計された）おおよそ４ｆのシステムである。これがマウスの脳に挿入されると仮定すると、図１７に示されるように、走査レンズ、ＭＥＭＳ走査装置などでそのシステムをブリッジすることができる。

【0125】

図１７では、単純さのために、実質上のＯ１の背面口径は、直径で１ｍｍ（以下）であり、ＭＥＭＳ走査装置は、直径で３ｍｍよりも大きくてよい（４５度から見たときに、３×ｓｉｎ（４５°）＞２）ので、走査レンズは、実質上のＯ１のＢＦＬからガルボまで２．０Ｘの拡大を提供するように選択される。

【0126】

１つの例示的な選択肢は、マイクロ平凸レンズＥｄｍｕｎｄｓ ＃４９－１７６（直径３．０ｍｍ）、または小アクロマートＥｄｍｕｎｄｓ ＃６３－７１４（直径４．０ｍｍ）であり、どちらもＶＩＳ－ＮＩＲ被覆され、６ｍｍのＥＦＬである。

【0127】

検出アームには、Ｏ１のＢＦＬを単純さのために１：１の比でＯ２のＢＦＬにマップし、ｆ_Ｏ２をｎ_Ｗ・ｆ_Ｏ１≒０．９３ｍｍ ＥＦＬに設定するために、空気中で動作する別のテレスコープを追加することができる。有望な選択肢には、（平凸レンズにすぎないが）１．０ｍｍのＥＦＬの単一のＥｄｍｕｎｄｓ ＃４３－３９４、または、２つのＥｄｍｕｎｄｓ ＃６５－３００（２．０ｍｍのＥＦＬ）を含むプルーセル、または個別製作の高ＮＡのマイクロ対物レンズが含まれる。

【0128】

Ｏ１のＢＦＬは、実質上のＴ１の前焦点面と一致しない可能性があり（元のＧＲＩＮ対物レンズが厳密に４ｆではない可能性があるので）、そのため、Ｔ１－Ｓ１－Ｓ２－Ｔ２テレスコープによって形成されるその画像は、Ｔ２の焦点面と重ならない可能性があるが、Ｏ２を単純にシフトさせてそれと整合させることができる。

【0129】

次に図１８に目を向けると、１つの有望な解決策は、実質上のＴ２および実質上のＯ２として同じＧＲＩＮ対物レンズを単に使用することである。この解決策は、単純であるが、Ｏ１のＢＦＬからＯ２のＢＦＬまでの球面収差の蓄積の可能性を有する。

【0130】

この実施形態および図１７の実施形態の場合、２００μｍの直径の視野（ｘ方向）をカバーするために必要とされるＭＥＭＳの機械的走査角度は、±１００μｍ／ｆ_Ｏ１×ｆ_Ｔ１／ｆ_Ｓ１／２≒±２°であり、Ｍｉｒｒｏｒａｃｌｅ Ｉｎｃ．（非特許文献５）によるＭＥＭＳ走査装置によって容易にカバーされる。

【0131】

次に図１９に目を向けると、この０．７ＮＡの水ＧＲＩＮ対物レンズの円錐角は、３１．６°である。約２４°の斜めシート角度を対象にする場合、Ｏ１の背面口径におけるオフセットは、約３８０μｍになり、したがって、ガルボとＳ１との間は約７６０μｍになる（上の図面）。しかし、ｙ方向に沿って、実質上のＯ１のＢＦＬは、Ｔ１の焦点面と重なる可能性がなく、そのため、差し込まれるシートのウエストは、走査レンズ１の焦点面に一致しない可能性がある（下の図面）。定量的に、１ｍｍの光学的直径を有するＧＲＩＮ対物レンズの場合、達成可能なシート幅は、おおよそ２００μｍである。そのため、後端部からの入来シートは、幅が約８７０μｍである。励起シートは、ビーム経路内のどこでも適当な場所に差し込まれ得る。励起レーザが繊維から来る場合、３つのマイクロ円柱レンズが、繊維出力を所望のガウスシートに変換するために使用され得る。

【0132】

次に図２０に目を向けると、ＭＥＭＳ走査装置は典型的には両方の軸を走査することができるので、ＤＡＲＴシステムにおけるようにデジタル的に合成された光シートを用いることもできる。この場合もやはり、走査装置に先立つビーム経路（中央における上側のトレース）内の任意の場所から励起ビームを導入することが、より容易である。このモードでは、ＭＥＭＳの１つの軸は、達成可能なボリュメトリックフレームレートを最大限に高めるために、潜在的に共振モードで機能し得る。このモードでは、帰還ビームは、高ＮＡの繊維テーパを使用して容易に収集可能であり、限定されたサンプリング密度に関してそれほど心配する必要はない。このモードでは、繊維束を通して戻される帰還蛍光を測定するために、線分検出器が使用され得る。

【0133】

図２１は、異なる光学レイアウトのための検出の例を示す。全体的に見て、共通のＧＲＩＮ要素の限定されたＮＡは集束角を限定し得ることに、留意されたい。

【0134】

図２２は、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の別の実施形態を示す。ＧＲＩＮレンズは、主対物レンズ、または走査レンズもしくはチューブレンズ、またはテレスコープとして機能し得る。そのため、ＳＣＡＰＥシステム全体は、ＧＲＩＮレンズおよびＧＲＩＮベースの対物レンズを使用して小型化され得る。図２２の実施形態では、全ての対物レンズ（主、２次、および３次）が、十分な高さの集束ＮＡを有するＧＲＩＮベースの小型対物レンズに置き換えられる。走査レンズおよびチューブレンズもまた、単一のＧＲＩＮレンズに置き換えられる。それらはまた、複数のＧＲＩＮレンズ、またはマイクロシングレットレンズもしくはマイクロダブレットレンズ、またはそれらの混合で構成され得る。

【0135】

走査装置（ＧＭ）は、ＭＥＭＳミラー（非共振モードもしくは共振モードのどちらかで機能する）、または、いくつかのマイクロモータによって駆動されるマイクロポリゴン、または、他の小型ミラーシステムもしくはデフレクタであり得る。ダイクロイックミラー（ＤＭ）は、励起シートを結合するために使用される。ダイクロイックミラー（ＤＭ）は、マイクロ反射ミラー、または反射面を有するマイクロプリズムに置き換えられてよく、これは、集束開口を少し閉塞することになるが、潜在的に設置面積を減少させることができる。

【0136】

ここで、第３の対物レンズＯ３は、中間像をより効率的に結合するために（例えば、図４の実施形態に関連して上述したように）、個別製作を介してまたはポリマーベースの「ブロブ」と組み合わせることによって実現される、ゼロ作動距離を有することができる。第３の対物レンズは、アレイ検出器またはカプラ様のテーパ付けされた繊維フェースプレート上への中間像を拡大するために、（示されるような）マイクロチューブレンズ、またはＧＲＩＮベースのチューブレンズと対にされ得る。励起ビームは、光学繊維を介して射出され得る。繊維先端は、一方または両方の軸に沿って平行出力を提供するために、レンズ化され得る。１つまたは複数のマイクロ円柱レンズまたはパウエルレンズが、励起シートをさらに調整するために用いられ得る。

【0137】

図２３は、ゼロ作動距離のＯ３（媒体横断中間像結合（ｔｒａｎｓ－ｍｅｄｉｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｍａｇｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ））を含む、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の他の実施形態を示す。この実施形態では、落射蛍光の収集効率を最大限に高めるために、媒体横断中間像結合を利用することができ、すなわち、第２の対物レンズＯ２は、乾燥対物レンズであるように設計可能であり、第３の対物レンズＯ３は、水浸、油浸、またはガラス浸対物レンズであってよく、それにより、Ｏ３の浸漬媒体の界面上に中間像を形成する。

【0138】

これを示すために、図２３の左側の２つの例は、水における１．０ＮＡ（左）、または空気における０．７５ＮＡ（右）に対応する、Ｏ２外の同じ円錐角を特徴付ける。Ｏ３もまた１．０ＮＡの水浸である場合（左）、集束角（紙面上に投射される）は、４３．２°にすぎない。Ｏ３が同じ１．０ＮＡを維持するが、Ｏ２が空気において機能する場合、集束角は、８４．６°へとほぼ倍になる。いくつかの選択肢が存在する。１）１つの選択肢は、ゼロＷＤおよび高ＮＡを有するように直接Ｏ３を設計すること（紫色は、例示的な集束角を示す）である。２）Ｏ３を非ゼロＷＤになるように設計するが、なおも例えば水浸させて、水と同じ屈折率を特徴とするポリマーまたは他の材料で作られたブロブでＯ３を増強し、それにより、同等にゼロＷＤの組み合わせを形成する。

【0139】

ＧＲＩＮレンズの収集ＮＡを向上させるために、１つの選択肢は、ＧＲＩＮレンズを例えばＥｄｍｕｎｄｓによる直径２．０ｍｍのＳ－ＬＡＨ ７９半球レンズ（＃９０－８５８）といった高屈折率半球レンズ（ｈｉｇｈ－ｉｎｄｅｘ ｈａｌｆ－ｂａｌｌ ｌｅｎｓ）と組み合わせることである。Ｓ－ＬＡＨ７９の屈折率はｎ≒２．０であり、そのため、この半球レンズのＥＦＬは、Ｒ／（ｎ－１）≒１．０ｍｍであると推定することができ、すると、収集ＮＡは、理想的には１．０に近づく。実際には、この概念設計は、重度の収差を有する。性能を最適化するために、慎重な設計が使用されることが好ましい。例えば、半球レンズは、ビームを漸進的に曲げるために複数の部品に分割されてもよく、ＧＲＩＮ部品の勾配プロファイルはまた、収差を最小限に抑えるために、特別な四次プロファイルを有するように微調整され得る。

【0140】

ゼロＷＤのＧＲＩＮベースの高ＮＡ複合対物レンズは、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている非特許文献６および非特許文献７で説明されているように、ゼロＷＤのＧＲＩＮベースの高ＮＡ複合対物レンズが特に好ましい。

【0141】

図２４は、Ｏ３（すなわち、第３の対物レンズ）を伴わない直接検出に依存する、第２の対物レンズＯ２から出て行く光が捕捉されることを確実にするためのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ手法の追加の実施形態を示す。Ｏ３を伴わない直接検出は、アレイ検出器またはカプラをＯ２の後に設置し、中間像を直接整合させかつ捕捉することにより屈折性のＯ３を取り除くための、別の主要な変形形態である。アレイ検出器はＣＣＤ／ＣＭＯＳチップであってもよく、その場合、中間像は、直接記録されることになる。検出器は、最大限の収集効率および最小限の等価ＷＤのための裏面照射型（ＢＳＩ）センサであってもよい。それぞれの個々の画素の収集円錐角を拡大するために、マイクロレンズアレイが（特に、検出器がＢＳＩでない場合には）検出器と一体化されてもよい。アレイ検出器は、サンプリング密度を最大限に高めるために、小端部が中間像に面するように構成された、テーパ付けされた光ファイバフェースプレートであってもよい。次いで、そのような離散化した中間像は、大端部上へ中継されかつ拡大され、そこで、中間像は、１）ＣＣＤもしくはＣＭＯＳセンサによって直接記録されるか、または、２）数千のコアを有する可撓性撮像繊維束を通して近位端部のＣＣＤ、ＣＭＯＳ、もしくは任意の他のタイプのセンサへさらに中継される。繊維束およびテーパ付けされた光ファイバフェースプレートのどちらも、可能な限り高い受光ＮＡおよび可能な限り小さいコア間クロストークを有することが好ましい。

【0142】

図２５は、Ｏ３（すなわち、第３の対物レンズ）を伴わない直接検出に依存するさらなる実施形態を示す。これらの実施形態では、テーパ付けされたフェースプレートの軸、または繊維束の軸は、中間像平面に対して垂直である必要はないことに、留意されたい。言い換えれば、中間像を受け入れる端部表面は、角度を付けて切り取られ得る。このようにして、それぞれの個々の繊維の受け入れ円錐は、テーパにおけるものであろうと繊維束におけるものであろうと、Ｏ２から出る光錐に向かって傾けられ、したがって、小端部における収集効率を高めることができる。さらに、テーパ付けされたフェースプレートの場合、このことはまた、大端部からの放射ＮＡの減少をもたらし、後続のＣＣＤによる収集または繊維束（典型的には約０．４のＮＡ）による結合をより容易にし、したがって、全体的な収集効率を高める。最適な切取り角度は、繊維コアの屈折率、中間像平面の角度、および、Ｏ２から出るビーム円錐の角度に依存する。

【0143】

ＭＥＭＳミラーがＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ実施形態において走査素子として使用される場合、ＭＥＭＳミラーの直径は、主ＧＲＩＮベース対物レンズの口径に対応するのに十分な大きさである必要がある。例えばＭｉｒｒｏｒｃｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる典型的な市販製品は、直径２．４ｍｍの一体形ミラー、および、さらに大きな結合ミラー（すなわち、別々に製作されてから走査装置に結合されるミラー）を製作することができる。２ｍｍ径ミラーを含むパッケージ全体は、２．５ｃｍよりも小さくすることができる。ＭｉｒｒｏｒｃｌｅによるＭＥＭＳ走査装置は、典型的には２軸である。Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ ＩＰＭＳによる単軸走査装置は、さらに小さくすることができる。

【0144】

図２６は、主Ｏ１＋チューブレンズが、水における０．７ＮＡ（３１．６°の半円錐角）および反対側の０．１６ＮＡを特徴とする、ＧＲＩＮＴＥＣＨ ＧＴ－ＭＯ－０７０－０１６－ＡＣＲ－ＶＩＳＮＩＲ－３０－２０によって実施される、別の実施形態を示す。これは、準４ｆシステムである。２５°のシート角度を仮定すると、空気側角度は、ａｓｉｎ（ｓｉｎ（２５°）×１．３３３×０．１６／０．７）＝７．４°になる。走査レンズは、Ｅｄｍｕｎｄｓ ＃８４－１２８、ＶＩＳ－ＮＩＲ、ＥＦＬ＝４．０ｍｍ、Ｄｉａｍ＝２．０ｍｍ、ＢＦＬ＝２．９２ｍｍである。走査レンズ＃１後方のビームオフセットは、４．０×ｓｉｎ（７．４°）＝５１５μｍである。ＭＥＭＳは、Ｍｉｒｒｏｒｃｌｅ Ｓ４６１０５であり、ミラー径＝２．０ｍｍ、ミラーはガラス面の下方約１．２ｍｍに位置する。基礎寸法は、約１５ｍｍ×１５ｍｍである。

【0145】

Ｏ２アームは、同じ走査レンズ（ＥＦＬ＝４ｍｍ）を使用し、次いで、Ｅｄｍｕｎｄｓ ＃８４－１２７アクロマート（ＥＦＬ＝３．０ｍｍ）を使用する。Ｏ２自体は、Ｏ１からＯ２までの総合倍率が０．７／０．１６×４／４×０．９／３．０＝１．３１になり、疑似等方性拡大を確実にするように、０．９ｍｍＥＦＬおよび０．５ＮＡを有する個別製作の空気／乾燥対物レンズであるべきである。この個別製作のＯ２は、複数のシングレットおよび／もしくはダブレットを組み合わせること、または、示されるようにＧＲＩＮレンズと屈折レンズを組み合わせることから作られてよい。

【0146】

次いで、Ｏ３は、１）前述のように繊維束に結合された、面取りされテーパ付けされたフェースプレート、または、２）収集を強化するために水等価ポリマーブロブと結合された約４．４×０．７ＮＡ Ｏ１－チューブレンズ（すなわち、ＧＴ－ＭＯ－０７０－０１６－ＶＩＳＮＩＲ－３０－２０）のどちらかであってよい。後者の設計は、中間像を拡大することにより、繊維束または小型ＣＣＤ／ＣＭＯＳをＯ３およびチューブレンズの後方に直接使用するにもかかわらず高密度のサンプリングを可能にする。また、Ｏ３は、収集デバイスにより良く整合するために、および、全体的な収集効率を高めるために、他の拡大およびより高いＮＡにも個別製作され得る。

【0147】

図２７Ａ～図２７Ｂは、ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉの２つのさらなる実施形態を示す。図２７Ａの実施形態は、ｍｉｎｉシステムを顕微鏡として使用することができ、かつ、埋め込まれた別のＧＲＩＮに結合することができる。図２７Ｂの実施形態では、最終的なＧＲＩＮは、埋め込まれたＧＲＩＮ自体であってよく、そのため、顕微鏡は、その遠位端部の実施形態を直接走査する。

【0148】

以下の製作法は、本明細書において説明される実施形態に適し得る。素子の位置決めは、精密機械加工されたアルミニウムケーシング、または高品質３Ｄ印刷されたケーシングによって促進され得る。素子は、所定の位置に接着されて、精密アライメント並進ステージまたはロボットアームなどの第２のシステムによって位置決めされ得る。位置合わせを確実にするために、微調整のための２つ～３つのポイントが必要とされ得る。素子が屈折率整合ＵＶ硬化ポリマーに完全に閉じ込められ得る場合、安定性、防塵性、および耐湿性が著しく向上され得る。高価な素子が、走査ヘッドにコネクタライズ（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒｉｚｅ）され得る。

【0149】

最後に、図２８は、上記のＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉ光学構成が使用され得る全体的なシステムの概略図である。十分に平行にされた光を使用するためのＳＣＡＰＥ顕微鏡法の要件、および、高速の高感度カメラの必要性は、フルサイズのカメラおよびレーザローンチ（ｌａｓｅｒ ｌａｕｎｃｈ）を収容するベースステーションにこの小型化されたシステムが係留され得ることを意味する。小型化により、マウスは、ナビゲーションまたは他の動物との社会的交流などの自由行動中に撮像システムを携行することができる。小型ヘッドマウント撮像ヘッドへの係留接続は、ガルボ駆動信号（ｇａｌｖｏ ｄｒｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ）、レーザ光を送達するための単一モード繊維、および、画像をカメラにマッピングするための可撓性の高密度繊維束を含む。このモジュール式の手法の１つの利点は、各システムの最も高価な素子およびエネルギーを消費する素子が、１つの可動部品のみを含みかつ最小限の局所電気制御を必要とし得る小型走査ヘッドから分離することである。したがって、同じベースカメラおよびレーザ素子を使用して多くの異なる「走査ヘッド」の原型を試験することが可能であるはずであるのと同時に、データ転送速度およびデータ可視化は、ボトルネックにならない。

【0150】

ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｉｎｉの画像をより高品質のカメラへ中継するために繊維束を使用することは、このシステムの空間分解能を制限することを必要としない。第１に、上記で詳述されたＺＷＤおよび／または繊維テーパ法は、像回転を行い、かつ、結果として得られる像が、コネクタライズされた可撓性撮像繊維束上へ拡大されることを可能にし、繊維束の繊維サイズ（例えば、３．３マイクロメートル、０．４ＮＡ）は、システムの必要とされる光学的分解能の＞１／２に相当してよく、したがって、オーバサンプリングするであろう。次いで、この束は、高速カメラ上に撮像されてよく、像の完全性の損失を最小限にするために、再度画素サイズを整合させる。さらに、ＳＣＡＰＥの像形成は、望ましい完全なＸ－Ｙ視野よりもサイズがはるかに小さい可能性がある、試料のＹ－Ｚ投影を捕捉し、Ｘ分解能および視野は、ガルボ走査範囲および撮像速度によって決定される。例えば、６００×６００×２００μｍ^３が、１マイクロメートルのサンプル密度に対して２００×６００本の繊維を有する矩形の繊維束によってサンプリングされ得る。そのような撮像繊維束は、広視野にわたる高密度サンプリングを必要とする高忠実度内視鏡用途のために使用される類いのものと比較して、非常に手頃である。

【0151】

場合により、上記の実施形態のいずれかにおいて、多色撮像（ｍｕｌｔｉ－ｃｏｌｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ）をＧＲＩＮ ＳＣＡＰＥシステムに追加することにより、複数の細胞型の撮像を可能にする大きな利点が提供される。これは、イメージスプリッティング、スペクトル分解、および多重レーザ照射のための戦略を組み込むことができる。赤方偏移もしくは近赤外の単光子蛍光色素分子または２光子励起を利用することにより、ＧＲＩＮレンズの遠位先端における組織のより深い撮像、したがってより大きなニューロン集団のより深い撮像を可能にすることができる。しかし、従来のＳＣＡＰＥシステムと比較して、ＧＲＩＮレンズシステムでは色収差をより慎重に考慮することが重要であり得ることに、留意されたい。

【0152】

ＧＲＩＮの具体的な改善点には、以下が含まれる。（ａ）ＧＲＩＮレンズは、全て、像面湾曲を含む収差を導入する。（ｂ）方法は、事後解析（画像体積と物体体積との間の３Ｄ歪みの幾何学的特性を判定した後）として、ソフトウェアにおいてこの湾曲を補正するために使用され得る。これは、一様な３Ｄ幻像を利用し得る。または、所定の位置にＧＲＩＮレンズを伴う、および伴わない、同じ構造の形状の撮像。（ｃ）歪みはまた、適用されて戻ってくる波面を変化させるために、空間光変調器またはＤＭＤを使用することなどにより、ハードウェアにおいて補正され得る。これは、分解能および撮像の一様性を大いに高めることができるが、走査シートとの調整のために補正が必要とされ得る。

【0153】

本明細書において説明されるＧＲＩＮシステムは、小型カメラおよび照明器をＧＲＩＮレンズに対して繰り返し位置合わせするための方法を組み込むことができる。これらは、３Ｄ印刷されてよく、確実な再位置決めのための磁石を含むことができる。ＧＲＩＮレンズは、脳に埋め込まれて、頭蓋骨に固定され得る。回復後、位置合わせを確実にするために画像をチェックしながら、基礎となるマウントが頭蓋骨上に接着され得る。次いで、撮像部が取り外され、ＧＲＩＮレンズを保護するためにカバーが使用される。類似の手法が、本発明者らの卓上ＧＲＩＮレンズシステムの下でのマウスの位置合わせをより繰り返し可能かつ確実なものにするために使用され得る。ＳＣＡＰＥシステムに位置合わせされるトッププレートが、所定の位置に固定され、かつ、既存の頭蓋骨ベースのハードウェアに適合され得る。固定のために、動物は、ＳＣＡＰＥ固定マウント内にクリップ留めされ得る。場合により、頭蓋骨に取り付けられるバーを介したマウスの２次固定が、撮像中のモーションアーチファクトを最小限に抑えるために使用され得る。

【0154】

頭部固定ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥの実施形態は、ａ）既存のＧＲＩＮインプラント（例えば、Ｉｎｓｃｏｐｉｘおよび小型カメラに適合するインプラント）により、覚醒し行動しているマウスを撮像すること、ｂ）幻像において性能を確立し、また、同じマウスにおけるモダリティ間のデータを比較することにより、細胞特異的な活動パターン抽出を検証すること、ならびに、ｃ）同時ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ＋全皮質広視野マルチＧＲＩＮ撮像および平行光遺伝的操作への拡張を探ることが可能である。

【0155】

多色細胞型記録は、ａ）ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥを様々な細胞型（星状膠細胞、介在ニューロン、ニューロン、小膠細胞、ニューロン亜集団）における機能的指標の多スペクトル記録に拡張すること、ならびに、ｂ）行動中の活動パターンの細胞型特異性抽出のための標識化戦略およびアルゴリズムを確証することが可能である。

【0156】

脳全体にわたる細胞型の多様性の認識が高まるにつれて、本明細書において説明される実施形態は、興奮性ニューロンだけを撮像することを超えて、多くのセル型（例えば、抑制性ニューロンおよび星状膠細胞）間の動的相互作用を同時に捕捉ために使用され得る。それらの相互作用を捕捉するために、細胞の（単にそれらの細胞体だけではなく）全体の活動を観察するのに十分な高速度および３Ｄ分解能による多スペクトル標識化および撮像が、有用である。行動している動物における哺乳類の脳の任意の領域において複数の細胞型における完全に３Ｄの活動を高速度で分解する組み合わせられた能力は、脳の回路および行動中の細胞型の機能的役割についての我々の理解を変える可能性がある。

【0157】

ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥは、覚醒し行動している哺乳類の脳の任意の場所における高忠実度で完全に３Ｄのリアルタイム動的記録（例えば、１０ＶＰＳ超において６００×６００×２５０μｍ^３）を提供し得る。

【0158】

本明細書において説明されるＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ実施形態は、埋込み型ＧＲＩＮレンズの先端において、高速度で完全３Ｄの光学的に区分された画像を提供する。この特徴は、細胞のより大きな集団の同時記録を可能にし、ＧＲＩＮレンズの精密な配置をそれほど必要とせず、かつ、ＧＲＩＮの挿入による潜在的損傷の領域からさらに離れた撮像を可能にする。各細胞の３Ｄ座標が知られ、その同一性を明確に定めて、同じ細胞の活動の（必要に応じて、点走査２光子を使用する構造的な検証を伴う）セッションからセッションへのトラッキングを可能にする。分解能および同時多スペクトル取得を最適化することにより、単一の細胞にわたる全３Ｄ活動ならびに／または３Ｄ体積内の細胞間および細胞型間の複雑な動的相互作用の分析を可能にすることにより、既存の技法を使用して尋ねられ得る質問の種類を増加させるであろう。ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥと、細胞活動の様々な変色指示薬により特定の細胞型を標識することができる方法とを対にすることにより、リアルタイムでの行動における複数の細胞型間の局所的相互作用を捕捉することが可能になる。

【0159】

ヘッドマウントカメラベースの撮像とのＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－１の適合性は、自由に動いているときの行動および表象と頭部が固定されているときの行動および表象との比較を可能にし得る。ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥ－ｍｅｓｏシステムの多目的な形態はまた、脳全体にわたる回路を評価するために一度に複数の脳領域からの撮像を組み合わせる、創意に富んだ実験を可能にし得る（例えば、自発運動との関連における線条体の同時細胞撮像を伴う、感覚皮質および運動皮質の全皮質広視野撮像）。このシステムはまた、パターン化された皮質の活性化および不活性化、撮像中の深部脳領域のＧＲＩＮベースの露出、および、ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥボリュメトリック撮像中のホログラフィックの単一細胞光遺伝的活性化またはサイレンシングを含む、様々な光遺伝的操作に適合するはずである。ＧＲＩＮ－ＳＣＡＰＥは、マウスの他に、弱電気魚、ベタ、および成体サンショウウオの脳におけるＧＣａＭＰコントラストに有用である。

【0160】

本発明は特定の実施形態に関連して開示されたが、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の領分および範囲から逸脱することなしに、説明された実施形態に対する多数の修正、改変、および変更が可能である。したがって、本発明は説明された実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲の文言によって定められる全範囲およびその均等物を有することが、意図されている。

【符号の説明】

【0161】

８ ＧＲＩＮレンズ
１０ 第１の光学素子、第１の対物レンズ
１２ 第１の光学素子、第１のテレスコープ
１４ 第１の光学素子、第１のテレスコープ
２０ 第２の光学素子、第２の対物レンズ
２２ 第２の光学素子、第２のテレスコープ
２４ 第２の光学素子、第２のテレスコープ
３０ 第３の対物レンズ、浸漬対物レンズ
３２ 光学インターフェース
４０ カメラ
４２ イメージスプリッタ
５０ 走査素子
６０ 光源
７２ 光学素子、プルーセルレンズ
７４ 光学素子、円柱レンズ
７６ 光学素子、円柱レンズ
８０ 光学素子、小ミラー
８１ 第１のビームスプリッタ
８２ 第２のビームスプリッタ
８５ 第２の光源
９０ 流体チャンバ
９１ ブロブ、第１の固体塊
９２ 液体ポリマー、第２の量のＵＶ硬化性ポリマー
９５ 高平坦性ミラー
１００ 広視野カメラ
１１０ 第１の光学素子、第１の対物レンズ、ＧＲＩＮ対物レンズ
１１２ 第１の光学素子
１１４ 第１の光学素子、レンズ
１２０ 第２の光学素子、第２の対物レンズ
１２２ 第２の光学素子
１２４ 第２の光学素子、レンズ
１３０ 光学繊維の束
１５０ 走査素子
１７１ 円柱／パウエルレンズ
１７２ 円柱／パウエルレンズ
１７４ 円柱／パウエルレンズ
１７６ 円柱／パウエルレンズ
２００ 光学素子
２０２ 光学素子
２０４ 光学素子
２０５ 光ファイバテーパ、テーパ、テーパ付けされた光学繊維の束
２０６ 光学素子
２０８ 光学素子
２１０ 光学素子、水等価ポリマースペーサ、ポリマースペーサ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図5f】

【図5g-1】

【図5g-2】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図7e】

【図7f】

【図7g】

【図7h】

【図7i】

【図8】

【図9a】

【図9b】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【国際調査報告】