特表 2024-519087 アミノ酸エクスポーターの不活性化によりグアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生するための改善された生物工学的な方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-08

(54)【発明の名称】アミノ酸エクスポーターの不活性化によりグアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生するための改善された生物工学的な方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240426BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240426BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20240426BHJP

   C12P 7/54 20060101ALI20240426BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240426BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20240426BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20240426BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20240426BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240426BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12N15/31

C12P1/04 Z

C12P7/54

C12N15/54

C12N9/10

C12N15/60

C12N15/55

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571881

(86)(22)【出願日】2022-05-10

(85)【翻訳文提出日】2023-11-20

(86)【国際出願番号】 EP2022062663

(87)【国際公開番号】W WO2022243116

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】21175138.3

(32)【優先日】2021-05-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21208485.9

(32)【優先日】2021-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519414848

【氏名又は名称】エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １－１１， ４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】フランク ヤンコヴィッチュ

(72)【発明者】

【氏名】カイ マリン

(72)【発明者】

【氏名】フランク シュナイダー

(72)【発明者】

【氏名】ブリギッテ バーテ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AD04

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA11

4B065AA01X

4B065AA24X

4B065AA26X

4B065AA43X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA16

4B065CA43

(57)【要約】

本発明は、不活性化されたアミノ酸エクスポーターを有する、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生することが可能となるように形質転換された微生物、およびそのような微生物を用いてＧＡＡを発酵により産生するための方法に関する。本発明は、クレアチンを発酵により産生するための方法にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物であって、
野生型微生物の能力と比較して、Ｌ－アルギニンを提供する能力が増加させられ、
Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有し、
細胞周期の同じ状態で前記野生型微生物中のそれぞれのタンパク質の活性と比較して、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質の活性が低減されている、
微生物。

【請求項2】

アルギニン応答性リプレッサータンパク質ＡｒｇＲの活性が弱められているかまたは欠失している、請求項１記載の微生物。

【請求項3】

前記野生型微生物中のそれぞれの酵素活性と比較して、カルバモイルホスファートシンターゼの機能を有する酵素活性が増加させられている、請求項１または２記載の微生物。

【請求項4】

カルバモイルホスファートシンターゼの前記機能を有する前記酵素活性の増大が、カルバモイルホスファートシンターゼの前記機能を有する酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または過剰発現により達成される、請求項３記載の微生物。

【請求項5】

オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＦ／ａｒｇＦ２、
アルギニノスクシナートシンテターゼをコードするａｒｇＧおよび
アルギニノスクシナートリアーゼをコードするａｒｇＨ
を有する、Ｌ－オルニチンおよびＬ－アルギニンの生合成系路の酵素をコードする少なくとも１つ以上の遺伝子が過剰発現される、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項6】

グルタマートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｇｄｈが過剰発現される、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項7】

Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの前記機能を有する前記タンパク質をコードする前記遺伝子が異種である、請求項１から６までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項8】

Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの前記機能を有する前記タンパク質が、配列番号１３によるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から７までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項9】

アルギニンエクスポーターの前記機能を有する前記タンパク質をコードする遺伝子が、不活性化されているかまたは欠失している、請求項１から８までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項10】

アルギニンエクスポーターの前記機能を有する前記タンパク質をコードする遺伝子の転写活性因子をコードする遺伝子が欠失している、請求項１から９までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項11】

前記微生物は、コリネバクテリウム属、腸内細菌属またはシュードモナス属に属する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項12】

前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムであり、アルギニンエクスポーターの前記機能を有する前記タンパク質をコードする遺伝子は、ｌｙｓＥであり、転写活性因子をコードする遺伝子は、ｌｙｓＧである、請求項１１記載の微生物。

【請求項13】

前記微生物は、大腸菌であり、アルギニンエクスポーターの前記機能を有する前記タンパク質をコードする遺伝子は、ａｒｇＯ（ｙｂｊＥ）である、請求項１１記載の微生物。

【請求項14】

前記微生物は、シュードモナス・プチダであり、アルギニンエクスポーターの前記機能を有する前記タンパク質は、ｌｙｓＥである、請求項１１記載の微生物。

【請求項15】

グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を発酵により産生するための方法であって、
ａ）請求項１から１４までのいずれか１項記載の微生物を適切な培地中で適切な条件下で培養するステップと、
ｂ）前記培地中にＧＡＡを蓄積させて、ＧＡＡ含有発酵ブロスを形成するステップと
を含む、方法。

【請求項16】

ＧＡＡを前記ＧＡＡ含有発酵ブロスから単離することをさらに含む、請求項１５記載の方法。

【請求項17】

前記ＧＡＡ含有発酵ブロスを乾燥させかつ／または造粒することをさらに含む、請求項１５記載の方法。

【請求項18】

グアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１から１４までのいずれか１項記載の微生物。

【請求項19】

グアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼの前記活性を有する酵素をコードする前記遺伝子が過剰発現される、請求項１８記載の微生物。

【請求項20】

クレアチンを発酵により産生するための方法であって、
ａ）請求項１８または１９記載の微生物を適切な培地中で適切な条件下で培養するステップと、
ｂ）前記培地中にクレアチンを蓄積させて、クレアチン含有発酵ブロスを形成するステップと
を含む、方法。

【請求項21】

クレアチンを前記クレアチン含有発酵ブロスから単離することをさらに含む、請求項２０記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生することが可能となるように形質転換された微生物、およびそのような微生物を用いてＧＡＡを発酵により産生するための方法に関する。本発明は、クレアチンを発酵により産生するための方法にも関する。

【0002】

ＧＡＡは、動物飼料添加物として使用される有機化合物である（国際公開第２００５１２０２４６号／米国特許出願公開第２０１１２５７０７５号明細書）。ＧＡＡは、クレアチンの天然前駆体である。したがって、ＧＡＡの補給は、生物内でクレアチンの最適な供給を可能にする。

【0003】

本発明は、出発材料として工業用供給原料（例えば、アンモニア、アンモニウム塩およびグルコースまたは糖含有基質）を用いる発酵プロセスによりＧＡＡを産生するための方法に関する。生物系において、ＧＡＡおよびオルニチンは、クレアチン生合成における最初のステップであるＬ－アルギニン：グリシン－アミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ；ＥＣ２．１．４．１）の触媒作用により出発物質としてアルギニンおよびグリシンから形成される：

【化1】

【0004】

Guthmiller et al.（J Biol Chem. 1994 Jul 1;269(26):17556-60）は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中での酵素のクローニングおよび異種発現によるラット腎臓ＡＧＡＴを特性決定した。Muenchhoff et al.（FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860）は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中での酵素のクローニングおよび異種発現による原核生物由来のＡＧＡＴの最初の特性決定も報告している。全細胞触媒によりＬ－アルギニンおよびグリシンからＧＡＡを産生するために、Zhang et al.は、異なる種（例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ）、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ））由来の異種ＡＧＡＴを導入し、シトルリン合成モジュール（例えば、ｃａｒＡＢ、ａｒｇＦおよびａｒｇｌの過剰発現）およびアルギニン合成モジュール（例えば、ａｒｇＧ、ａｒｇＨの過剰発現；ａｓｐＡの導入）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内に導入することにより、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内に再構築されたオルニチンサイクルを設計した（Yiwen Zhang, Hang Zhou, Yong Tao,およびBaixue Lin, ACS Synth. Biol. 2020, 9, 2066-2075）。

【0005】

ＧＡＡ合成における出発材料の１つ、すなわち、Ｌ－アルギニンの、微生物、特に細菌中での産生を増加させるための幾つかのアプローチは、文献からも公知である。Ｌ－アルギニン産生用コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））の代謝工学についての概要は、Park et al.（NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618）により提供されている。彼らは、既にＬ－アルギニン産生Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株、例えばＡＴＣＣ２１８３１（NakayamaおよびYoshida 1974、米国特許第３８４９２５０号明細書）のＬ－アルギニン産生用のランダム突然変異誘発およびスクリーニングならびに菌株工学ステップを通したＬ－アルギニン産生を徐々に増加させる結果となる代謝のシステム全体の分析に基づく段階的な合理的な代謝工学を提案している。Yim et al.（J Ind MicrobiolBiotechnol (2011) 38:1911-1920）は、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）内の染色体ａｒｇＲ遺伝子を破壊することにより、Ｌ－アルギニン生合成経路を制御する中央リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードするａｒｇＲ遺伝子の不活性化が、改善されたアルギニン産生株を生じさせることを示すことができた。Ginesy et al.（Microbial Cell Factories (2015) 14:29）は、アルギン産生を高めるために大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の操作に成功したことを報告している。とりわけ、彼らは、ａｒｇＲリプレッサー遺伝子の欠失を提案している。

【0006】

Kurahashi et al.（欧州特許出願公開第１０５７８９３号明細書）は、例えば、エシェリキア属に属する微生物に由来するアセチルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ－アセチルグルタミン酸－γ－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ－アセチルグルタモキナーゼおよびアルギニノスクシナーゼについての遺伝子を含むベクターＤＮＡおよびＤＮＡ断片を有する組換えＤＮＡを収容するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を用いることにより、組換えＤＮＡ技術を利用するＬ－アルギニン生合成酵素の向上により微生物のＬ－アルギニン産生能力を増加する方法を報告している。改善されたＬ－アルギニン産生のために、著者らは、さらに、細胞内グルタマートデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の活性が高められかつＬ－アルギニン産生能力を有する微生物を提案している。

【0007】

Suga et al.により、アルギニン生合成オペロンａｒｇＲの発現を阻害する遺伝子が不活性化された遺伝子組換え株を使用する方法が報告された（米国特許第７１６０７０５号明細書）。特に、アルギニンオペロンを制御するａｒｇＲ内の欠失は、アルギニン産生における重要な因子と見なされていた。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の微生物において、アルギニン生合成に関与するａｒｇＣＪＢＤＦＲ遺伝子は、オペロンの形態で構成され、細胞内アルギニンによるフィードバック阻害を受ける（Sakanyan et al., Microbiology, 142:9-108, 1996）ため、その高い収率のＬ－アルギニン産生に制限が課せられる。アルギニンオペロンは、Ｌ－アルギニン生合成のメカニズムに関与する酵素をコードする遺伝子からなるオペロンであり、特に、アルギニンオペロンは、Ｌ－アルギニン生合成のサイクルステップを構成する酵素をコードする遺伝子からなる。特に、アルギニンオペロンは、Ｎ－アセチルグルタミルホスファートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、グルタマートＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、Ｎ－アセチルグルタマートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、およびアルギニンレプレッサー（ＡｒｇＲ）からなる。これらの酵素は、Ｌ－アルギニン生合成の連続的酵素反応に関与する。

【0008】

文献によれば、アミノ酸エクスポーターＬｙｓＥは、Ｌ－リシンだけでなく、Ｌ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの細胞排出輸送も触媒する。ＬｙｓＧは、アミノ酸エクスポーターのＬｙｓＥをコードする遺伝子ｌｙｓＥの転写を活性化する。ＬｙｓＧは、補助インデューサー、例えばＬ－リシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリンまたはＬ－ヒスチジンを必要とする（Lubitz et al. (2016). 「Roles of export genes cgmA and lysE for the production of L-arginine and L-citrulline by Corynebacterium glutamicum.」 Appl MicrobiolBiotechnol 100(19): 8465-8474）。Lubitz et al.は、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＡＲＧ２（Peters-Wendisch et al. (2014) Engineering biotin prototrophic Corynebacterium glutamicum strains for amino acid, diamine and carotenoid production. J Biotechnol. doi:10.1016/j.jbiotec.2014.01.023）を使用し、この株はＡｒｇＢのフィードバック耐性対立遺伝子（ＡｒｇＢ^ｆｂｒ）のプラスミドに基づく発現と組み合わせた欠失によるａｒｇＲ遺伝子の不活性化により特徴付けられる。両方の修飾を有するこの株について、著者らは、培養の上澄み中のＬ－アルギニンの蓄積を記載している。さらに、Lubitz et al.は、そのような株において、遺伝子ｌｙｓＥおよび膜タンパク質をコードするｃｍｇの不活性化が、アルギニン形成を低減する結果となることを記載している。

【0009】

Ginesy et al.（M. Ginesy et al., Microbiol Cell Factories (2015) 14:29, DOI 10.1186/s12934-015-0211-y）は、とりわけ欠失したａｒｇＲリプレッサー遺伝子を有する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）産生株を用いるアルギニン産生が、アルギニンエクスポーター系の過剰発現により増加することができることを示すことができた。

【0010】

しかしながら、細胞内で比較的高いＬ－アルギニン濃度を得るために、Ｌ－アルギニン排出輸送を妨げる必要がある。アミノ酸エクスポーターＬｙｓＥは、基質アルギニンを細胞から効率的に輸送することにより、細胞内アルギニン濃縮を妨げ、基質利用率を低下させる。さらに、アルギニン生合成からのシトルリンも、活性ＬｙｓＥエクスポーターにより培地中へ分泌される。ＬｙｓＥは、転写活性化因子ＬｙｓＧ（Bellmann, A., et al. (2001). 「Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum.」 Microbiology (Reading) 147(Pt 7): 1765-1774）により調節される。

【0011】

Fan Wenchaoは、非病原性微生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の発酵によりクレアチンを産生するための方法を開示している（中国特許出願公開第１０６０６５４１１号明細書）。微生物は、以下の生体内変換機能：Ｌ－グルタミン酸へのグルコール変換；Ｌ－グルタミン酸からＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸への変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸からＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸セミアルデヒドへの変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸セミアルデヒドからＮ－アセチル－Ｌ－オルニチンへの変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－オルニチンからＬ－オルニチンへの変換；Ｌ－オルニチンからＬ－シトルリンへの変換；Ｌ－シトルリンからアルギニノコハク酸への変換；アルギニノコハク酸からＬ－アルギニンへの変換；Ｌ－アルギニンからグアニジノ酢酸への変換；および最終的に、グアニジノ酢酸からクレアチンへの変換：を有する。Fan Wenchaoは、この微生物が、Ｎ－アセチルグルタマートシンターゼ、Ｎ－アセチルオルニチン－δ－アミノトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルオルニチナーゼ、オルニチン－カルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノスクシナートシンテターゼ、グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．４．１）、およびグアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．１．２）からなる群から選択される１つ以上の酵素を過剰発現することを提案している。微生物は、好ましくはグリシンアミノトランスフェラーゼ（Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ）およびグアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼを過剰発現する。

【0012】

本発明の根底にある課題は、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生することが可能となるように形質転換された改善された微生物を提供すること、およびこのような微生物を用いてＧＡＡを発酵により産生するための方法を提供することである。

【0013】

この課題は、微生物であって、野生型微生物の能力と比較して、Ｌ－アルギニンを提供する能力が増加させられ、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有し、細胞周期の同じ状態で野生型微生物中のそれぞれのタンパク質の活性と比較して、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質の活性が低減されている、微生物により解決される。

【0014】

これは、本発明による微生物中のアルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質が、細胞周期を通して任意の時間および状況で、細胞周期を通して同じ時間および状況で野生型微生物中のそれぞれのタンパク質の活性と比較して、人為的に設計された低減された活性を示すことを意味する。

【0015】

本発明による微生物は、好ましくは、天然では生じない遺伝子組換え微生物（ＧＭＯ）である。ＧＭＯでは遺伝子材料は、遺伝子工学技術を用いて変更されている。好ましくは、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が遺伝子工学技術を用いて導入されている。好ましくは、野生型微生物中のそれぞれのタンパク質の活性と比較して、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質の活性の減少も遺伝子工学技術を使用して達成されている。

【0016】

Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質は、アミジノトランスフェラーゼファミリーに属する。アミジノトランスフェラーゼファミリーは、それぞれクレアチンおよびストレプトマイシン生合成に関連する酵素であるグリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．４．１）およびイノサミンアミジノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．４．２）を有する。このファミリーは、アルギニンデイミナーゼ、ＥＣ：３．５．３．６も含む。これらの酵素は、アルギニン＋Ｈ_２Ｏ⇔シトルリン＋ＮＨ_３の反応を触媒する。このファミリーには、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）抗腫瘍糖タンパク質も見られる。Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）活性を有する酵素またはタンパク質は、ＰＦＡＭファミリー：Amidinotransf（ＰＦ０２２７４）（Marchler-Bauer A et al. (2017),「CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures.」, Nucleic Acids Res. 45(D1):D200-D203.）に属する保存ドメインを有することも記載されていて、以下の刊行物：Pissowotzki K et al., Mol Gen Genet 1991;231:113-123 (PUBMED:1661369 EPMC:1661369); D’Hooghe I et al., J Bacteriol 1997;179:7403-7409 (PUBMED:9393705 EPMC:9393705); Kanaoka M et al., Jpn J Cancer Res 1987;78:1409-1414 (PUBMED:3123442 EPMC:3123442)にも記載されている。ＡＧＡＴの特別な例は、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、マレーヒヨケザル（Ｇａｌｅｏｐｔｅｒｕｓ ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ）、およびシリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ）のものである。

【0017】

本発明の文脈において、Ｌ－アルギニンを提供する改善された能力を有する微生物は、それ自体の必要性を越えてＬ－アルギニンを産生またはリサイクルする微生物を意味する。この特性は、天然のＬ－アルギニン産生者であるかもしくは突然変異によりＬ－アルギニンを産生する能力を獲得されもよい微生物の選択により達成されてよい。このようなＬ－アルギニン産生微生物の例は、例えばＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ２１８３１またはPark et al. (NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618)もしくはGinesy et al. (Microbial Cell Factories (2015) 14:29)に記載されたものである。

【0018】

本発明の一実施形態では、本発明による微生物中のアルギニン応答性リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードするａｒｇＲ遺伝子が弱められているかまたは欠失されている。

【0019】

本発明による微生物中のカルバモイルホスファートシンターゼ（ＥＣ６．３．４．１６、例えばＣａｒＡＢ）の機能を有する酵素の活性が、野生型微生物中のそれぞれの酵素活性と比較して増加させられていてよい。これは、カルバモイルホスファートシンターゼの機能を有する酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または過剰発現により達成されてよい。

【0020】

さらに、本発明による微生物中で、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＦ／ａｒｇＦ２、アルギニノスクシナートシンテターゼをコードするａｒｇＧおよびアルギニノスクシナートリアーゼをコードするａｒｇＨを有する、Ｌ－オルニチンおよびＬ－アルギニンの生合成経路の酵素をコードする少なくとも１つ以上の遺伝子が過剰発現されてよい。

【0021】

さらにまたはこれとは別に、グルタマートデヒドロゲナーゼをコードするｇｄｈ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＪ、アセチルグルタマートキナーゼをコードするａｒｇＢ、アセチルグルタミルホスファートレダクターゼをコードするａｒｇＣおよびアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードするａｒｇＤを有するＬ－オルニチンおよびＬ－アルギニンの生合成経路の酵素をコードする少なくとも１つ以上の遺伝子が本発明による微生物中で過剰発現されてよい。

【0022】

遺伝子の過剰発現は、一般に、遺伝子のコピー数を増加させることによりかつ／または遺伝子を強いプロモーターと機能的に連結することによりかつ／またはリボソーム結合部位を高めることによりかつ／または開始コドンもしくは全遺伝子のコドン使用頻度の最適化によりまたは上述の全ての方法の選択を有する組合せにより達成される。

【0023】

本発明による微生物中で、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、異種であってよい。

【0024】

本発明による微生物は、好ましくは、組換体であり、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは異種である。

【0025】

異種遺伝子は、天然ではこの遺伝子を有しない宿主生物内へ遺伝子が挿入されたことを意味する。宿主内の異種遺伝子の挿入は、組換えＤＮＡ技術により行われる。組換えＤＮＡ技術を受けた微生物は、トランスジェニック、遺伝子組換えまたは組換体と言われている。

【0026】

本発明の微生物中では、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、さらに過剰発現されてよい。遺伝子の過剰発現は、一般に、遺伝子のコピー数を増加させることによりかつ／または遺伝子を強いプロモーターと機能的に連結することによりかつ／またはリボソーム結合部位を高めることによりかつ／または開始コドンもしくは全遺伝子のコドン使用頻度の最適化によりまたは上述の全ての方法の選択を有する組合せにより達成される。

【0027】

本発明の微生物中で少なくとも１つのそれぞれの遺伝子によりコードされるＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質は、例えば、配列番号１３によるアミノ酸配列、すなわち、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）のＡＧＡＴ（「ＡＧＡＴ＿Ｍｐ」）と少なくとも７０％同一、好ましくは８０％または少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有してよい。本発明の更なる実施態様では、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１３（データベスUniPort, 15 February 2017, 「Glycine amidinotransferase」, XP055706853, ＥＢＩ受け入れ番号UNIPROT: A0A1D8TKD3参照）によるアミノ酸配列と同一である。モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＡＧＡＴをコードする野生型ＤＮＡの配列は、配列番号１２であり、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）用に最適化されたコドンを有する対応するＤＮＡ配列は、配列番号１４である。

【0028】

本発明の微生物中での少なくとも１つのそれぞれの遺伝子によりコードされるＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質は、例えば、シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ）ＡＴＷ２０５（J. Muenchhoff et al., FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860）のＡＧＡＴのアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。

【0029】

本発明の微生物中での少なくとも１つのそれぞれの遺伝子によりコードされるＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質は、マレーヒヨケザル（Ｇａｌｅｏｐｔｅｒｕｓ ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ）のＡＧＡＴのアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有してよい。

【0030】

本発明の微生物中でのＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質は、ホモ・サピエンス（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＡＧＡＴ、例えばホモ・サピエンス自体（A. Humm, Biochem. J. (1997) 322, 771-776）のＡＧＡＴまたはドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）のＡＧＡＴのアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有してよい。

【0031】

一般に、本発明によれば、遺伝子の過剰発現は、遺伝子のコピー数を増加させることによりかつ／または調節因子を高めることにより、例えば遺伝子を強いプロモーターと機能的に連結することによりかつ／またはリボソーム結合部位を高めることによりかつ／または開始コドンまたは全遺伝子のコドン使用頻度の最適化により達成される。遺伝子発現に肯定的な影響を与えるそのような調節因子の向上は、例えば、プロモーターの有効性を増加させるために、構造遺伝子の上流のプロモーター配列を改変することによるかまたは前記プロモーターをより有効であるかもしくはいわゆる強いプロモーターに完全に置き換えることにより達成することができる。プロモーターは遺伝子の上流に位置する。プロモーターは、約４０～５０の塩基対からなり、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素についての結合部位および転写開始部位を構成するＤＮＡ配列であり、それにより、制御されるポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現の強度に影響を及ぼすことができる。一般に、例えば、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）についてはM. Patek et al. （Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117）により教示されているように、強力なプロモーターの選択により、例えば、強力な天然の（本来は他の遺伝子に割り当てられていた）プロモーターでの原型のプロモーターの置き換えによるかまたはコンセンサス配列に対する所与の天然のプロモーター（例えば、いわゆる－１０および－３５領域）の所定の領域の変更により、細菌内で遺伝子の過剰発現を達成するかまたは発現の増加を達成することができる。「強力な」プロモーターの例は、スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ）プロモーター（「Ｐｓｏｄ」；Z. Wang et al., Eng. Life Sci. 2015, 15, 73-82）である。「機能的に連結」は、遺伝子の転写を引き起こすプロモーターと遺伝子との連続的整列を意味すると解釈される。

【0032】

遺伝コードが縮重されているとは、特定のアミノ酸が多数の異なるトリプレットによりコードされていてよいことを意味する。コドン使用頻度という用語は、一般に、所定の生物が、所定のアミノ酸についてのあらゆる可能なコドンを同じ頻度で使用するわけではないという観察を指す。その代わりに、生物は、一般に、特定のコドンについての所定の優先性を示し、これは、これらのコドンが生物の転写された遺伝子のコード配列においてより頻繁に見出されることを意味する。将来的な宿主に対して外来、すなわち、異種由来の所定の遺伝子を、将来的な宿主生物中で発現させるべき場合に、前記遺伝子のコード配列は、前記将来的な宿主生物のコドン使用頻度に適合されるべきである（すなわち、コドン使用頻度の最適化）。

【0033】

表１は、多様な種、すなわち、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（Ｐ． ｐｕｔｉｄａ））におけるアルギニン生合成に関与するかまたは寄与する多様な名称の酵素を示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0034】

本発明の微生物中では、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、不活性化または欠失されていてよい。さらに、本発明の微生物中では、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の転写活性化因子をコードする遺伝子は、欠失されていてよい。

【0035】

本発明の微生物は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、または腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）属、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ））、またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、好ましくはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（Ｐ． ｐｕｔｉｄａ））に属していてよい。

【0036】

コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）において、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ｌｙｓＥであり、転写活性化因子をコードする遺伝子は、ｌｙｓＧである。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ａｒｇＯ（ｙｂｊＥ）である。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）において、アルギニンエクスポーターの機能を有するタンパク質は、ｌｙｓＥである。

【0037】

先に言及された課題は、さらに、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を発酵により産生するための方法であって、ａ）先に定義された本発明による微生物を適切な培地中で適切な条件下で培養するステップと、ｂ）培地中にＧＡＡを蓄積させて、ＧＡＡ含有発酵ブロスを形成するステップとを含む、方法により解決される。

【0038】

本発明による方法は、さらに、培地にグリシンを添加しかつ／またはＬ－アルギニンを添加しかつ／またはＬ－オルニチンを添加することを含んでよい。好ましくは、培地は、培地ｌＬあたりグリシン０．１～３００ｇの範囲、好ましくは培地１Ｌあたりグリシン０．８２ｇの濃度でグリシンが補充されていて、かつ／または培地１ＬあたりＬ－アルギニン０．１～２００ｇの範囲、好ましくは培地１ＬあたりＬ－アルギニン１．９ｇの濃度を得るためにＬ－アルギニンが補充されている。

【0039】

本発明の方法は、さらに、発酵ブロスからＧＡＡを単離するステップを含んでいてよい。

【0040】

本発明による方法は、さらに、ＧＡＡ含有発酵ブロスを乾燥させかつ／または造粒するステップを含んでいてよい。

【0041】

本発明は、さらに、グアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．１．２）の活性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに有する、先に定義された微生物に関する。好ましくは、グアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子は、過剰発現される。

【0042】

本発明は、また、クレアチンを発酵により産生するための方法であって、ａ）グアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子を有する本発明による微生物を適切な培地中で適切な条件下で培養するステップと、ｂ）培地中にクレアチンを蓄積させて、クレアチン含有発酵ブロスを形成するステップとを含む、方法に関する。

【0043】

好ましくは、この方法は、さらに、クレアチンをクレアチン含有発酵ブロスから単離することを含む。クレアチンは、等電点法および／またはイオン交換法により発酵ブロスから抽出されてよい。あるいは、クレアチンは、さらに、水中での再結晶化する方法により精製することができる。

【0044】

実験セクション
Ａ）材料および方法
化学薬品
ストレプトミセス・カナミセティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）からのカナマイシン溶液は、Sigma Aldrich（St. Louis, 米国, Cat. no. K0254）から仕入れた。他に言及されない限り、他の全ての化学薬品は、Merck （Darmstadt, ドイツ）、Sigma Aldrich（St. Louis, 米国）またはCarl-Roth（Karlsruhe, ドイツ）から分析純度で仕入れた。

【0045】

細胞増殖のための培養
他に言及されない限り、培養／インキュベーション手順は、以下のように実施した：
ａ．Merck（Darmstadt, ドイツ; Cat. no. 110285）のＬＢブロス（MILLER）を、液体培地中で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株を培養するために使用した。液体培地（３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ毎に液体培地１０ｍｌ）を、Infors GmbH（Bottmingen, スイス）のInfors HT Multitron標準インキュベーターシェイカー中で３０℃で２００ｒｐｍでインキュベートした。

【0046】

ｂ．Merck（Darmstadt, ドイツ, Cat. no. 110283）のＬＢ寒天（MILLER）を、寒天プレート上で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株の培養のために使用した。寒天プレートを、ＶＷＲ（Radnor, 米国）のINCU-Line（登録商標）ミニインキュベーター中で３０℃でインキュベートした。

【0047】

ｃ．Merck（Darmstadt, ドイツ, Cat. no. 110493）のブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ）を使用して、液体培地中でＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を培養するために使用した。液体培地（３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ毎に液体培地１０ｍｌ）は、Infors GmbH（Bottmingen, スイス）のInfors HT Multitron標準インキュベーターシェイカー中で３０℃で２００ｒｐｍでインキュベートした。

【0048】

ｄ．Merck（Darmstadt, ドイツ, Cat. no. 113825）のブレインハート寒天（ＢＨＩ－寒天）を、寒天プレート上でＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を培養するために使用した。寒天プレートを、Kelvitron（登録商標）温度コントローラー（Hanau, ドイツ）を備えたHeraeus Instrumentsのインキュベーター中で３０℃でインキュベートした。

【0049】

ｅ．エレクトロポレーション後にＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を培養するために、ＢＨＩ寒天（Merck, Darmstadt, ドイツ, Cat. no. 113825）に、ソルビトール（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, ドイツ）１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物（Oxoid/ThermoFisher Scientific, Waltham, 米国, Cat. no. LP0021）２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充した。寒天プレートを、Kelvitron（登録商標）温度コントローラー（Hanau, ドイツ）を備えたHeraeus Instrumentsのインキュベーター中で３０℃でインキュベートした。

【0050】

細菌懸濁液の光学密度の決定
ａ．振盪フラスコ培養中の細菌懸濁液の光学密度を、Eppendorf AG（Hamburg, ドイツ）のビオフォトメータを使用して６００ｎｍ（ＯＤ６００）で決定した。

【0051】

ｂ．Wouter Duetz（WDS）マイクロ発酵システム（２４穴プレート）中で製造された細菌懸濁液の光学密度を、Tecan Group AG（Maennedorf, スイス）のGENios（商標）プレートリーダーを用いて６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）で決定した。

【0052】

遠心分離
ａ．２ｍｌの最大容積を有する細菌懸濁液を、Eppendorf 5417 Rベンチトップ遠心分離器（１３，０００ｒｐｍで５分）を使用する１．５ｍｌまたは２ｍｌの反応チューブ（例えばEppendorf Tubes（登録商標） 3810X）中で遠心分離した。

【0053】

ｂ．５０ｍｌの最大容積を有する細菌懸濁液を、Eppendorf 5810 Rベンチトップ遠心分離器を使用する１５ｍｌまたは５０ｍｌの反応チューブ（例えばFalcon（商標） 50 ml Conical Centrifuge Tubes）中で４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。

【0054】

ＤＮＡ単離
プラスミドＤＮＡを、製造元の指示に従って、Qiagen（Hilden, ドイツ, Cat. No. 27106）のQIAprep Spin Miniprepキットを使用して大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞から単離した。

【0055】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
プルーフリーディング（高再現性）ポリメラーゼを用いるＰＣＲを、Sanger配列決定またはＤＮＡアセンブリのためのＤＮＡの所望の断片を増幅するために使用した。ノンプルーフリーディングポリメラーゼキットは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）またはＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）コロニーから直接所望のＤＮＡ断片の存在または非存在を決定するために使用した。

【0056】

ａ．New England BioLabs Inc.（Ipswich, 米国, Cat. No. M0530）のPhusion（登録商標）高再現性ＤＮＡポリメラーゼキット（Phusion Kit）を、製造元の指示に従って、選択されたＤＮＡ領域の鋳型正確増幅のために使用した（表参照）。

【表2】

【0057】

ｂ．Qiagen（Hilden, ドイツ, Cat. No.201203）のTaq PCR Core Kit（Taq Kit）を、存在を確認するために、ＤＮＡの所望の断片を増幅するために使用した。キットは、製造元の指示に従って使用した（表参照）。

【表3】

【0058】

ｃ．Takara Bio Inc（Takara Bio Europe S.A.S., Saint-Germain-en-Laye, フランス, Cat. No. RR350A/B）のSapphireAmp（登録商標）Fast PCR Master Mix（Sapphire Mix）を、製造元の指示に従って、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）またはＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）コロニーから採取した細胞中のＤＮＡの所望の断片の存在を確認するための代替として使用した（表参照）。

【表4】

【0059】

ｄ．全てのオリゴヌクレオチドプライマーを、McBrideおよびCaruthers（1983）により記載されたホスホラミダイト法を用いてEurofins Genomics GmbH（Ebersberg, ドイツ）により合成した。

【0060】

ｅ．ＰＣＲ鋳型として、単離されたプラスミドＤＮＡまたは液体培地から単離された全ＤＮＡまたは細菌コロニー中に含まれる全ＤＮＡの適切な希釈溶液を使用した（コロニーＰＣＲ）。前記コロニーＰＣＲについて、寒天プレート上のコロニーから爪楊枝を用いて細胞材料を採取し、細胞材料をＰＣＲ反応チューブ内へ直接入れることにより、鋳型を調製した。細胞材料を、SEVERIN Elektrogeraete GmbH（Sundern, ドイツ）の電子レンジ型Mikrowave & Grill中で８００Ｗで１０秒加熱し、次いで、ＰＣＲ試薬をＰＣＲ反応チューブ内で鋳型に添加した。

【0061】

ｆ．全ＰＣＲ反応は、Eppendorf AG（Hamburg, ドイツ）のＰＣＲサイクルタイプMastercyclerまたはMastercycler nexus gradient中で実施した。

【0062】

ＤＮＡの制限酵素消化
制限酵素消化のために、「FastDigest制限エンドヌクレアーゼ（ＦＤ）」（ThermoFisher Scientific, Waltham, 米国）またはNew England BioLabs Inc.（Ipswich, 米国）の制限エンドヌクレアーゼを使用した。反応は、製造元マニュアルの指示に従って実施した。

【0063】

ＤＮＡ断片のサイズの決定
ａ．小さなＤＮＡ断片（＜１０００ｂｐｓ）のサイズは、通常では、Qiagen（Hilden, ドイツ）のQIAxcelを用いる自動キャピラリー電気泳動により決定された。

【0064】

ｂ．ＤＮＡ断片が単離をする必要がある場合かまたはＤＮＡ断片が＞１０００ｂｐｓである場合、ＤＮＡをＴＡＥ寒天ゲル電気泳動により分離し、GelRed（登録商標）Nucleic Acid Gel Stain（Biotium, Inc., Fremont, カナダ）を用いて染色した。染色されたＤＮＡを、３０２ｎｍで可視化した。

【0065】

ＰＣＲ増幅および制限断片の精製
ＰＣＲ増幅物および制限断片は、製造元の指示に従って、Qiagen（Hilden, ドイツ; Cat. No. 28106）のQIAquick ＰＣＲ精製キットを用いて清浄化した。ＤＮＡを、１０ｍＭのＴｒｉｓ＊ＨＣｌ（ｐＨ８．５）３０μｌで溶出した。

【0066】

ＤＮＡ濃度の決定
ＤＮＡ濃度を、２０１５年以来ＶＷＲブランド（Erlangen, ドイツ）のPEQLAB Biotechnologie GmbHのNanoDrop分光光度計ND-1000を用いて測定した。

【0067】

アッセンブリクローニング
プラスミドベクターは、New England BioLabs Inc.（Ipswich, 米国, Cat. No. E5520）から仕入れた「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」を用いて組み立てた。線状ベクターおよび少なくとも１つのＤＮＡインサートを含む反応混合物を５０℃で６０分インキュベートした。アッセンブリ混合物０．５μｌを各々の形質転換実験のために使用した。

【0068】

大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の化学的形質転換
プラスミドクローニングのために、化学的コンピテントな「NEB（登録商標） Stable Competent E. coli（高性能）」（New England BioLabs Inc., Ipswich, 米国, Cat. No. C3040）を、製造元のプロトコルに従って形質転換した。成功裏に形質転換された細胞を、２５ｍｇ／ｌカナマイシンを補充したＬＢ寒天上で選択した。

【0069】

Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の形質転換
プラスミドＤＮＡを用いるＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の形質転換は、Ruan et al.（2015）に記載されているように、「Gene Pulser Xcell」（Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, ドイツ）を用いてエレクトロポレーションにより実施した。エレクトロポレーションは、１ｍｍのエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, ドイツ）内で、１．８ｋＶで実施し、固定時間定数を５ｍｓに設定した。形質転換された細胞を、ソルビトール１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＨＩ寒天上で選択した。

【0070】

Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２（DSM 20300, Kinoshita S, Udaka S, Shimono M., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205）、Ｃ．グルタミクム野生型株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）またはＤＳＭＺ－German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbHから市場で入手可能である。

【0071】

コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ２１８３１、Ｌ－アルギニン産生Ｃ．グルタミクム株（米国特許第３８４９２５０号明細書）は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から市場で入手可能である。

【0072】

ヌクレオチド配列の決定
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を、Sanger et al.（Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977）のジデオキシ鎖終結法を用いるサイクルシーケンシングによってEurofins Genomics GmbH（Ebersberg, ドイツ）により決定した。Scientific & Educational Software（Denver, 米国）のClonemanager Professional 9ソフトウェアを、配列の可視化および評価のために使用した。

【0073】

大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）およびＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株のグリセロールストック
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株およびＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株の長期保存のために、グリセロールストックを調製した。選択された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）クローンをグルコース２ｇ／ｌを補充したＬＢ培地１０ｍｌ中で培養した。選択されたＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）クローンをグルコース２ｇ／ｌを補充した二倍濃縮ＢＨＩ培地１０ｍｌ中で培養した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株およびＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を含むプラスミドを増殖させる培地にカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充した。培地を、３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ内に装入した。これに、コロニーから採取した細胞のループを接種した。次いで、培養を３０℃で２００ｒｐｍで１８ｈインキュベートした。前記インキュベーション期間の後に、８５％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロール１．２ｍｌを培養に添加した。次いで、得られたグリセロール含有細胞懸濁液を、２ｍｌの分量に分け、－８０℃で保存した。

【0074】

振盪フラスコ培養におけるＧＡＡ産生
２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ中の振盪フラスコ培養を、株のＧＡＡ産生の評価のために使用した。

【0075】

株の前培養を、種培地（ＳＭ）１０ｍｌ中で行った。この培地を１００ｍｌ三角フラスコ中に装入した。これにグルコース保存培養１００μｌを接種し、この培養を３０℃で２００ｒｐｍで２４ｈインキュベートした。種培地（ＳＭ）の組成を表に示す。カナマイシンを、プラスミドを維持するために必要な培養に添加した。

【表5】

【0076】

前記インキュベーション期間の後に前培養の光学密度ＯＤ６００を決定した。０．５のＯＤ６００まで産生培地（ＰＭ）２．５ｍｌを接種することが必要な容量を、前培養からサンプリングし、遠心分離し（８０００ｇで１分）、上澄液を廃棄した。次いで、細胞を産生培地２００μｌ中に懸濁させた。

【0077】

主培養を、前培養から再懸濁された細胞１００μｌずつを、産生培地（ＰＭ）２．４ｍｌを含む２４穴ＷＤＳプレートの穴に接種することにより開始した。産生培地（ＰＭ）の組成を表に示す。

【表6】

【0078】

主培養を、グルコースが完全に消費するまで、Infors GmbH（Bottmingen, スイス）のInfors HT Multitron標準インキュベーター振盪器内で、３０℃で２００ｒｐｍで４８ｈインキュベートした。懸濁液中のグルコース濃度は、LifeScan（Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, ドイツ）の血糖測定器OneTouch Vita（登録商標）を用いて分析した。

【0079】

培養後に培養懸濁液を５０ｍｌの遠心分離管（例えば、Falcon（商標） 50 ml Conical Centrifuge Tubes）に移した。培養懸濁液の一部を、適切に希釈してＯＤ６６０を測定した。培養の他の部分を遠心分離し、上澄液中のＧＡＡ濃度を以下に記載するように分析した。

【0080】

ＧＡＡの定量化
試料を、質量分析器「Triple Quad 6420」（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, 米国）と組み合わせたＨＰＬＣ「Infinity 1260」からなるAgilentの分析システムで分析した。クロマトグラフィー分離を、３５℃で、Atlantis HILIC Silicaカラム、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Waters Corporation, Milford, 米国）で行った。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．２％ギ酸を有する水であった。移動相Ｂは、アセトニトリル９０％および水１０％の混合物であり、１０ｍＭのギ酸アンモニウムを混合物に添加した。ＨＰＬＣシステムは、Ｂ１００％で開始し、２２分間線形勾配および０．６ｍＬ／分の一定流量でＢ６６％まで続けた。質量分析をＥＳＩ陽イオン化モードで操作した。ＧＡＡの検出のために、ｍ／ｚ値をＭＲＭ断片化［Ｍ＋Ｈ］＋１１８－７６を用いることにより監視した。ＧＡＡについての定量化限界（ＬＯＱ）を７ｐｐｍに固定した。

【0081】

Ｂ）実験結果
例１：Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ベースの株中で遺伝子ｌｙｓＥおよびｌｙｓＧの染色体欠失のためのプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｌｙｓＥＧのクローニング。
遺伝子ｌｙｓＥは、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）中のＬ－リシン、Ｌ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの外向きフラックスを触媒するエクスポータータンパク質をコードする。ｌｙｓＥの発現は、ｌｙｓＧの遺伝子産物によりポジティブに制御される。両方の遺伝子は、互いに隣り合って位置しているが、発散的に転写される。

【0082】

トランスポータータンパク質ＬｙｓＥおよびポジティブレギュレータータンパク質ＬｙｓＧを不活性化するために、プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｌｙｓＥＧ（配列番号１）を、Vrljic et. al 1996（Vrljic, M., et al. (1996). 「A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum.」 Mol Microbiol 22(5): 815-826; https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1996.01527.x）でｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｌｙｓＥＧについて記載されたように組み立てた。

【0083】

例２：ＡＴＣＣ１３０３２中の遺伝子ａｒｇＲの染色体欠失
細胞内のＬ－アルギニン形成およびＬ－オルニチンからのＬ－アルギニンリサイクリングを改善するために、Ｌ－アルギニン生合成経路を制御するセントラルリプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードする遺伝子ａｒｇＲを不活性化した。

【0084】

そのため、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤａｒｇＲを以下のように組み立てた。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Schaefer, 1994）を、Ｘｂａｌを用いて切断し、線状化ベクターＤＮＡ（５７２１ｂｐｓ）を「QIAquick Gel Extraction Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて精製した。

【0085】

インサートを組み立てるために、２つのＤＮＡ断片を、以下のプライマーの対を用いてＰＣＲにより作成した（鋳型としてＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡ）：
ＤａｒｇＲ＿ｌｆ（配列番号２）＋ＤａｒｇＲ＿ｌｒ（配列番号３）＝左ホモロジーアーム（９８３ｂｐｓ）
ＤａｒｇＲ＿ｒｆ（配列番号４）＋ＤａｒｇＲ＿ｒｒ（配列番号５）＝左ホモロジーアーム（９８４ｂｐｓ）

【0086】

生成物ＤＮＡを、「QIAquick PCR Purification Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて精製した。

【0087】

次いで、線状化プラスミドおよびＰＣＲ産物を、「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」（New England BioLabs Inc., Ipswich, 米国, Cat. No. E5520）を用いて組み立てた。得られた欠失ベクターを、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤａｒｇＲと名付けた。これを制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により検証した。

【0088】

ａｒｇＲ遺伝子の欠失のために、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤａｒｇＲをエレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２内へ形質転換した。染色体統合（第１の組換えイベントから生じる）を、ソルビトール１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養することにより選択した。寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。

【0089】

個々のコロニーを、新たな寒天プレート（カナマイシン２５ｍｇ／ｌを有する）上に移し、３３℃で２４ｈインキュベートした。これらのクローンの液体培養を、３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ中に装入されたＢＨＩ培地１０ｍｌ中で３３℃で２４ｈ培養した。第２の組換えイベントを受けたクローンを単離するために、アリコートを各液体培養から採取し、適切に希釈し、１０％サッカロースを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養した（典型的には１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。次いで、サッカロース含有寒天プレート上で増殖するコロニーを、カナマイシン感受性について試験した。このため、爪楊枝を使用してコロニーから細胞材料を取り出し、これをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＨＩ寒天上および１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天上に移した。これらの寒天プレートを３３℃で６０ｈインキュベートした。カナマイシンに敏感でかつサッカロースに耐性のあることが判明したクローンを、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により検査した。得られた株を、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲと名付けた。

【0090】

例３：ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ中のｃａｒＡＢオペロンの上流のｓｏｄプロモーターの染色体挿入
Ｌ－アルギニンの産生を改善するために、強力なｓｏｄ－プロモーターを、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲのゲノム内へｃａｒＡＢオペロンの上流に挿入した。そのため、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを以下のように組み立てた。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを、ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、線状化ベクターＤＮＡ（５６７０ｂｐｓ）をアガロースゲルから切り出した。ＤＮＡを、「QIAquick PCR Purification Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて抽出した。

【0091】

インサートを組み立てるために、３つのＤＮＡ断片を、以下のプライマーの対を用いてＰＣＲにより作成した（鋳型としてＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡ）：
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｆ（配列番号６）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｒ（配列番号７）＝左ホモロジーアーム（１０２５ｂｐｓ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｆ（配列番号８）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｒ（配列番号９）＝ｓｏｄ－プロモーター（２５０ｂｐｓ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｆ（配列番号１０）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｒ（配列番号１１）＝左ホモロジーアーム（９４４ｂｐｓ）

【0092】

生成物ＤＮＡを、「QIAquick PCR Purification Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて精製した。次いで、線状化プラスミドおよびＰＣＲ産物を、「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」（New England BioLabs Inc., Ipswich, 米国, Cat. No. E5520）を用いて組み立てた。適切なプラスミドクローンを、制限消化およびＤＮＡ配列決定により同定した。

【0093】

次に、得られたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを、エレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ内へ形質転換した。染色体統合（第１の組換えイベントから生じる）を、ソルビトール１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養することにより選択した。寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。

【0094】

個々のコロニーを、新たな寒天プレート（カナマイシン２５ｍｇ／ｌを有する）上に移し、３３℃で２４ｈインキュベートした。これらのクローンの液体培養を、３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ中に装入されたＢＨＩ培地１０ｍｌ中で３３℃で２４ｈ培養した。第２の組換えイベントを受けたクローンを単離するために、アリコートを各液体培養から採取し、適切に希釈し、１０％サッカロースを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養した（典型的には１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。次いで、サッカロース含有寒天プレート上で増殖するコロニーを、カナマイシン感受性について試験した。このため、爪楊枝を使用してコロニーから細胞材料を取り出し、これをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＨＩ寒天上および１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天上に移した。これらの寒天プレートを３３℃で６０ｈインキュベートした。カナマイシンに敏感でかつサッカロースに耐性のあることが判明したクローンを、ｓｏｄプロモーターの適切な組み込みについてＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により検査した。得られた株を、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢと名付けた。

【0095】

例４：ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ中の遺伝子ｌｙｓＥおよびｌｙｓＧの染色体欠失
遺伝子ｌｙｓＥは、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）中のＬ－リシン、Ｌ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの外向きフラックスを触媒するエクスポータータンパク質をコードする。ｌｙｓＥの発現は、ｌｙｓＧの遺伝子産物によりポジティブに制御される。両方の遺伝子は、互いに隣り合って位置しているが、発散的に転写される。遺伝子ｌｙｓＥおよびｌｙｓＧ遺伝子を欠失させるために、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤｌｙｓＥＧ（例１参照）を、エレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ内へ形質転換した。染色体統合（第１の組換えイベントから生じる）は、ソルビトール１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養することにより選択した。寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。

【0096】

個々のコロニーを、新たな寒天プレート（カナマイシン２５ｍｇ／ｌを有する）上に移し、３３℃で２４ｈインキュベートした。これらのクローンの液体培養を、３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ中に装入されたＢＨＩ培地１０ｍｌ中で３３℃で２４ｈ培養した。第２の組換えイベントを受けたクローンを単離するために、アリコートを各液体培養から採取し、適切に希釈し、１０％サッカロースを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養した（典型的には１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。次いで、サッカロース含有寒天プレート上で増殖するコロニーを、カナマイシン感受性について試験した。このため、爪楊枝を使用してコロニーから細胞材料を取り出し、これをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＨＩ寒天上および１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天上に移した。これらの寒天プレートを３３℃で６０ｈインキュベートした。カナマイシンに敏感でかつサッカロースに耐性のあることが判明したクローンを、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により検査した。得られた株を、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤｌｙｓＥＧと名付けた。

【0097】

例５：モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）由来のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（AGAT, EC 2.1.4.1）をコードする遺伝子ＡＧＡＴ－Ｍｐのクローニング
モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）は、繊維状シアノバクテリアである。モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）株ＰＡＬ－８－１５－０８－１のゲノムは、Leao et al.（Leao T, Castelao G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114; Genbank accession Number CP017599.1）により公開された。これは、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼをコードするオープンリーディングフレーム（AGAT, EC 2.1.4.1; locus_tag BJP34_00300 配列番号１２参照）を含む。配列番号１３は、誘導されたアミノ酸配列を示す（Genbank受け入れ番号WP_070390602）。

【0098】

ソフトウェアツール「Optimizer」（http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/）を用いて、このアミノ酸配列を、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のコドン使用頻度について最適化されたＤＮＡ配列（配列番号１４）に翻訳し直した。

【0099】

塩基対１３～１１４２からなる最適化された遺伝子の断片は、その５’末端にＢｓｍＢＩ制限部位で拡張された。３’末端に第２の停止コドン、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のｌｙｓＳターミネーターおよびＢｓｍＢＩ制限部位が追加された。得られたＤＮＡ配列（配列番号１５）は、遺伝子合成用にInvitrogen/Geneart（Thermo Fisher Scientific, Waltham, 米国）から取り寄せ、アンピシリン耐性遺伝子を有するクローニングプラスミド（ｐＭＡ－ＲＱ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ｏｐｔと表される）の一部として配達された。

【0100】

アッセンブリクローニング用の配列、プロモーター配列、リボソーム結合部位および最適化されたＡＧＡＴ－Ｍｐ遺伝子の最初の８１のヌクレオチドからなる第２のＤＮＡ断片を設計した。この配列は、遺伝子合成用の線状ＤＮＡストリングとしてInvitrogen/Geneart（Thermo Fisher Scientific, Waltham, 米国; 配列番号１６）から取り寄せた。

【0101】

例６：発現プラスミドｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐのクローニング
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）－Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）シャトルプラスミドｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１は、ｐＢＬ１由来の複製起点、ｐＳＣ１０１複製起点、カナマイシン耐性遺伝子およびＮｏｔＩ制限部位の下流のBioBricks Terminator BBa_B1006を有する（配列番号１７）。これを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩを用いて消化し、ＤＮＡを、「QIAquick PCR Purification Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて精製した。

【0102】

プライマーＡＧＡＴ＿ｆ（配列番号１８）およびＡＧＡＴ＿ｒ（配列番号１９）を用いて、鋳型としてｐＭＡ－ＲＱ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ｏｐｔでＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物を、「QIAquick PCR Purification Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて精製した。

【0103】

線状化プラスミド、ＤＮＡストリングを含むプロモーターおよびＰＣＲ産物を、「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」（New England BioLabs Inc., Ipswich, 米国, Cat. No. E5520）を用いて組み立てた。組み立て産物を、「NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)」（New England Biolabs, Ipswich, 米国）内へ形質転換し、細胞を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天上で増殖させた。適切なプラスミドクローンを、制限消化およびＤＮＡ配列決定により同定した。得られたプラスミドを、ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐと名付けた。

【0104】

例７：強力な構成性プロモーターＰｇ３の制御下でのアルギニン生合成遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨの染色体発現
ＡｒｇＦ、ＡｒｇＧおよびＡｒｇＨの活性を高めるために、対応する遺伝子の付加的コピーをゲノム内へ挿入した。Ｐｇ３、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨおよびゲノム統合のためのフランキング領域からなる合成オペロンを設計した（配列番号２０）。

【0105】

ＤＮＡ配列は、遺伝子合成用にInvitrogen/Geneart（Thermo Fisher Scientific, Waltham, 米国）から取り寄せ、これは、アンピシリン耐性遺伝子を有するクローニングプラスミド（ｐＭＡ－ＲＱ＿ａｒｇＦＧＨ）と表される）の一部として配達された。

【0106】

プライマーａｒｇＦＧＨ＿ｆ（配列番号２１）およびａｒｇＦＧＨ＿ｒ（配列番号２２）を用いて、鋳型としてｐＭＡ－ＲＱ＿ａｒｇＦＧＨでＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物を、「QIAquick PCR Purification Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて精製した。

【0107】

プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Schaefer, A. et al., Gene. 1994 Jul 22;145(1):69-73. doi: 10.1016/0378-1119(94)90324-7）を、ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、線状化ベクターＤＮＡ（５６７０ｂｐｓ）をアガロースゲルから切り出した。ＤＮＡを、「QIAquick PCR Purification Kit」（Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ）を用いて抽出した。

【0108】

線状化プラスミドおよびＰＣＲ産物を、「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」（New England BioLabs Inc., Ipswich, 米国, Cat. No. E5520）を用いて組み立てた。組み立て産物を、「NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)」（New England Biolabs, Ipswich, 米国）内へ形質転換し、細胞を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天上で増殖させた。適切なプラスミドクローンを、制限消化およびＤＮＡ配列決定により同定した。得られたプラスミドを、ｐＫ１８＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ（配列番号２３）と名付けた。

【0109】

合成オペロンを挿入するため、ｐＫ１８＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨを、エレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ内へ形質転換した。染色体統合（第１の組換えイベントから生じる）を、ソルビトール１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養することにより選択した。寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。個々のコロニーを、新たな寒天プレート（カナマイシン２５ｍｇ／ｌを有する）上に移し、３３℃で２４ｈインキュベートした。これらのクローンの液体培養を、３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ中に装入されたＢＨＩ培地１０ｍｌ中で３３℃で２４ｈ培養した。第２の組換えイベントを受けたクローンを単離するために、アリコートを各液体培養から採取し、適切に希釈し、１０％サッカロースを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養した（典型的には１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。次いで、サッカロース含有寒天プレート上で増殖するコロニーを、カナマイシン感受性について試験した。このため、爪楊枝を使用してコロニーから細胞材料を取り出し、これをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＨＩ寒天上および１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天上に移した。これらの寒天プレートを３３℃で６０ｈインキュベートした。カナマイシンに敏感でかつサッカロースに耐性のあることが判明したクローンを、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により検査した。得られた株を、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨと名付けた。

【0110】

例８：ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ中の遺伝子ｌｙｓＥおよびｌｙｓＧの染色体欠失。
遺伝子ｌｙｓＥは、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）中のＬ－リシン、Ｌ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの外向きフラックスを触媒するエクスポータータンパク質をコードする。ｌｙｓＥの発現は、ｌｙｓＧの遺伝子産物によりポジティブに制御される。両方の遺伝子は、互いに隣り合って位置しているが、発散的に転写される。遺伝子ｌｙｓＥおよびｌｙｓＧ遺伝子を欠失させるために、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤｌｙｓＥＧ（例１参照）を、エレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ内へ形質転換した。染色体統合（第１の組換えイベントから生じる）を、ソルビトール１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養することにより選択した。寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。

【0111】

個々のコロニーを、新たな寒天プレート（カナマイシン２５ｍｇ／ｌを有する）上に移し、３３℃で２４ｈインキュベートした。これらのクローンの液体培養を、３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ中に装入されたＢＨＩ培地１０ｍｌ中で３３℃で２４ｈ培養した。第２の組換えイベントを受けたクローンを単離するために、アリコートを各液体培養から採取し、適切に希釈し、１０％サッカロースを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養した（典型的には１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。次いで、サッカロース含有寒天プレート上で増殖するコロニーを、カナマイシン感受性について試験した。このため、爪楊枝を使用してコロニーから細胞材料を取り出し、これをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＨＩ寒天上および１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天上に移した。これらの寒天プレートを３３℃で６０ｈインキュベートした。カナマイシンに敏感でかつサッカロースに耐性のあることが判明したクローンを、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により検査した。得られた株を、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ＿ＤｌｙｓＥＧと名付けた。

【0112】

例９：ＡＴＣＣ２１８３１＿ＤｌｙｓＥＧ中の遺伝子ｌｙｓＥおよびｌｙｓＧの染色体欠失。
遺伝子ｌｙｓＥは、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）中のＬ－リシン、Ｌ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの外向きフラックスを触媒するエクスポータータンパク質をコードする。ｌｙｓＥの発現は、ｌｙｓＧの遺伝子産物によりポジティブに制御される。両方の遺伝子は、互いに隣り合って位置しているが、発散的に転写される。遺伝子ｌｙｓＥおよびｌｙｓＧ遺伝子を欠失させるために、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤｌｙｓＥＧ（例１参照）を、エレクトロポレーションによりＡＴＣＣ２１８３１＿ＤｌｙｓＥＧ内へ形質転換した。染色体統合（第１の組換えイベントから生じる）を、ソルビトール１３４ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養することにより選択した。寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。

【0113】

個々のコロニーを、新たな寒天プレート（カナマイシン２５ｍｇ／ｌを有する）上に移し、３３℃で２４ｈインキュベートした。これらのクローンの液体培養を、３つのバッフルを備えた１００ｍｌ三角フラスコ中に装入されたＢＨＩ培地１０ｍｌ中で３３℃で２４ｈ培養した。第２の組換えイベントを受けたクローンを単離するために、アリコートを各液体培養から採取し、適切に希釈し、１０％サッカロースを補充したＢＨＩ寒天上で平板培養した（典型的には１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８ｈインキュベートした。次いで、サッカロース含有寒天プレート上で増殖するコロニーを、カナマイシン感受性について試験した。このため、爪楊枝を使用してコロニーから細胞材料を取り出し、これをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＢＨＩ寒天上および１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天上に移した。これらの寒天プレートを３３℃で６０ｈインキュベートした。カナマイシンに敏感でかつサッカロースに耐性のあることが判明したクローンを、ＰＣＲにより検査した。得られた株を、ＡＴＣＣ２１８３１＿ＤｌｙｓＥＧと名付けた。

【0114】

例１０：ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－ＭＰを用いたＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株の形質転換
Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の以下の株を、エレクトロポレーションによりｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐで形質転換し、プラスミド含有細胞をカナマイシン２５ｍｇ／ｌで選択した。得られたプラスミド含有株を表に示す。

【表7】

【0115】

・ Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２：一般的に使用される野生型株（Kinoshita et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205）
・ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ：ＡｒｇＲレギュレータータンパク質の活性の低減およびＡＴＣＣ１３０３２中のｃａｒＡＢの上流の強力なｓｏｄプロモーターの組み込みによるＬ－アルギニン産生能力の増加。
・ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤｌｙｓＥＧ：ＡｒｇＲレギュレータータンパク質の活性の低減およびＡＴＣＣ１３０３２中のｃａｒＡＢの上流の強力なｓｏｄプロモーターの組み込みによるＬ－アルギニン産生能力の増加。Ｌ－アルギニンの排出輸送活性の低減。
・ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ：ＡｒｇＲレギュレータータンパク質の活性の低減およびＡＴＣＣ１３０３２中の強力なプロモーターＰｇ３の制御下でａｒｇＦＧＨ発現カセットのゲノム組み込みによるＬ－アルギニン産生能力の増加。
・ ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ＿ＤｌｙｓＥＧ：ＡｒｇＲレギュレータータンパク質の活性の低減およびＡＴＣＣ１３０３２中の強力なプロモーターＰｇ３の制御下でａｒｇＦＧＨ発現カセットのゲノム組み込みによるＬ－アルギニン産生能力の増加。Ｌ－アルギニンの排出輸送活性の低減。
・ Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＡＴＣＣ２１８３１（Park et al., Nat Commun. 2014 Aug 5; 5:4618）は、アンモニアおよびグルコースのような一次基質からＬ－アルギニンを合成する。Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＡＴＣＣ２１８３１＿ＤｌｙｓＥＧ（Park et al., Nat Commun. 2014 Aug 5; 5:4618）は、アンモニアおよびグルコースのような一次基質からＬ－アルギニンを合成する。Ｌ－アルギニンの排出輸送活性の低減。

【0116】

例１１：Ｌ－アルギニン産生能力の増加とアルギニン排出輸送の低減のＧＡＡ産生に及ぼす影響
Ｌ－アルギニン産生能力の増加およびＬ－アルギニン排出輸送の低減のＧＡＡ産生に及ぼす複合的影響を評価するために、株ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤｌｙｓＥＧ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－ＭｐおよびＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ＿ＤｌｙｓＥＧ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐを産生培地中でWouter Duetz系中で培養し、得られたＧＡＡ力価を決定した。

【表8】

【0117】

表に示すように、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）由来のＡＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを有し、欠失されたａｒｇＲ遺伝子を有し、ｃａｒＡＢまたはａｒｇＦＧＨ遺伝子の発現が増加させられたＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－ＭｐおよびＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐは、それぞれＧＡＡ２．２ｇ／ｌまたは１．７ｇ／ｌを産生する。

【0118】

株ＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤｌｙｓＥＧ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－ＭｐおよびＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｒｇＲ＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨ＿ＤｌｙｓＥＧ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐも、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）由来のＡＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを有し、欠失されたａｒｇＲ遺伝子を有し、ｃａｒＡＢまたはａｒｇＦＧＨ遺伝子の発現を増加させる。さらに、遺伝子ｌｙｓＥＧは、不活性化され、これらは、Ｌ－アルギニン排出輸送活性を低減する。これらの株は、それぞれＧＡＡ２．３ｇ／ｌおよび１．９ｇ／ｌを産生し、これらは、低減されたＬ－アルギニン排出輸送なしの株と比較して改善されている。発明者は、酵素ＡＧＡＴ活性と、Ｌ－アルギニン産生活性の増加と、Ｌ－アルギニン排出輸送の低減との組合せが、ＧＡＡ産生を改善すると結論づけた。

【0119】

例１２：Ｌ－アルギニン産生能力の増加とアルギニン排出輸送の低減の、Ｌ－アルギニン産生株ＡＴＣＣ２１８３１を用いるＧＡＡ産生に及ぼす影響。
Ｌ－アルギニン産生能力の増加およびＬ－アルギニン排出輸送の低減のＧＡＡ産生に及ぼす複合的影響を評価するために、株ＡＴＣＣ２１８３１、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１およびＡＴＣＣ２１８３１／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐを産生培地中でWouter Duetz系中で培養し、得られたＧＡＡ力価を決定した。

【表9】

【0120】

表９に示すように、ＡＴＣＣ２１８３１、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１およびＡＴＣＣ２１８３１＿ＤｌｙｓＥＧ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１は、ＧＡＡを産生することはできない。

【0121】

株ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐも、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）由来のＡＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを有し、ＧＡＡ５．０ｇ／ｌを産生する。さらに、表８に示すように、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）由来のＡＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを有するが、付加的Ｌ－アルギニンを供給することができない株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐは、ＧＡＡ１．１ｇ／Ｌしか産生しない。

【0122】

株ＡＴＣＣ２１８３１＿ＤｌｙｓＥＧ／ｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１＿ＡＧＡＴ－Ｍｐも、モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）由来のＡＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを有するが、付加的に遺伝子ｌｙｓＥＧは、その株内で不活性化されていて、低減されたＬ－アルギニン排出輸送活性を有する。この株は、ＧＡＡ５．６ｇ／ｌを産生し、これは、低減されたＬ－アルギニン排出輸送なしの株と比較して改善されている。

【0123】

発明者は、酵素ＡＧＡＴ活性と、Ｌ－アルギニンを提供する能力の増加と、Ｌ－アルギニン排出輸送の低減との組合せが、ＧＡＡ産生を改善すると結論づけた。

【0124】

配列の概要：
配列番号１：Vrljic et. al 1996（Vrljic, M., et al. (1996). 「A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum.」 Mol Microbiol 22(5): 815-826）に記載されたように組み立てられたプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＤｌｙｓＥＧをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２：プライマーＤａｒｇＲ＿ｌｆをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号３：プライマーＤａｒｇＲ＿ｌｒをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号４：プラスミドＤａｒｇＲ＿ｒｆをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号５：プライマーＤａｒｇＲ＿ｒｒをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号６：プライマーＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－ＦをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号７：プライマーＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－ＲをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号８：プライマーＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＦをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号９：プライマーＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１０：プライマーＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－ＦをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１１：プライマーＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－ＲをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１２：Ｌアルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（AGAT, EC 2.1.4.1; locus_tag BJP34_00300）をコードするオープンリーディングフレームを示す。
配列番号１３：配列番号１２から誘導されたアミノ酸配列（Genbank受け入れ番号WP_070390602）を示す。
配列番号１４：Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のコドン使用頻度について最適化されたモオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（AGAT, EC 2.1.4.1）由来のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５：５’末端にＢｓｍＢＩ制限部位で拡張された塩基対１３～１１４２からなる断片を有する、配列番号１４から誘導されたＣ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のコドン使用頻度が最適化されたモオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）（AGAT, EC 2.1.4.1）由来のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を示す。さらに、３’末端に第２の停止コドン、Ｃ．グルタミクム（Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のｌｙｓＳターミネーターおよびＢｓｍＢＩ制限部位が付加された。
配列番号１６：アッセンブリクローニング用の配列、プロモーター配列、リボソーム結合部位および最適化されたＡＧＡＴ－Ｍｐ遺伝子の最初の８１のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片。
配列番号１７：ｐＢＬ１由来の複製起点、ｐＳＣ１０１複製起点、カナマイシン耐性遺伝子およびＮｏｔＩ制限部位の下流のBioBricks Terminator BBa_B1006を有する、シャトルプラスミドｐＬＩＢ＿ｐＢＬ１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８：プライマーＡＧＡＴ＿ｆのＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９：プライマーＡＧＡＴ＿ｒのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０：プロモーターＰｇ３－ａｒｇＦＧＨのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１：プライマーａｒｇＦＧＨ＿ｆのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２：プライマーａｒｇＦＧＨ＿ｒのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２３：プラスミドｐＫ１８＿ＩＢｃｇ００５４：：Ｐｇ３－ａｒｇＦＧＨのＤＮＡ配列を示す。

【配列表】

2024519087000001.app

【国際調査報告】