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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-08
(54)【発明の名称】核酸標的の検出のためのユニバーサルＬＡＭＰアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20240426BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240426BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20240426BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6876 Z
C12N9/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572121
(86)(22)【出願日】2022-05-20
(85)【翻訳文提出日】2024-01-22
(86)【国際出願番号】 US2022030312
(87)【国際公開番号】W WO2022246237
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/191,590
(32)【優先日】2021-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】レイフ，ジョン・エイチ
(72)【発明者】
【氏名】ソン，シン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QR06
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS34
(57)【要約】
各標的にカスタム化された従来のＬＡＭＰプライマー設計を必要とすることなく１つまたは複数の核酸標的のループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）を可能にする、組成物および方法が開示されている。変換反応は、ＬＡＭＰ反応の上流で行われる。変換反応は、標的核酸がサンプル中に存在する場合に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを生じさせる。変換反応で生じたｓｓＤＮＡは、ユニバーサルＬＡＭＰテンプレートの所要のＬＡＭＰプライマーとして機能する。ｓｓＤＮＡはこうして、ＬＡＭＰ反応を促進する。ＬＡＭＰ生成物の分析は、１つまたは複数の核酸標的の存在を決定することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプルを準備するステップ、および標的核酸がサンプル中に存在する場合に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを生じさせるように機能する変換反応を行うステップ
を含む、標的核酸のループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）を行う方法であって、
変換反応によって生じた前記ｓｓＤＮＡが、ユニバーサルＬＡＭＰテンプレートの所要のＬＡＭＰプライマーとして機能し、ＬＡＭＰプライマーがこうして、存在する場合には、ＬＡＭＰ反応を進行させる、方法。
【請求項2】
前記ＬＡＭＰ反応が逆転写ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＬＡＭＰテンプレートが標的核酸に依存しない、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記変換反応の結果生じた前記ＬＡＭＰプライマーの存在が、ＬＡＭＰ反応が進行することになるかどうかを決定するように、他の所要のＬＡＭＰプライマーが準備される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記変換反応が、標的核酸と結び付くように構成されている１セットの変換プライマーをサンプルに混合するステップ
を含み、
第１の変換プライマー（Ａ）が、
標的核酸の部分配列Ｐ１とハイブリダイズし得る部分配列
【数1】
部分配列
【数2】
部分配列
【数3】
を含み、
第２の変換プライマー（Ｂ）が、標的核酸の部分配列Ｐ２とハイブリダイズし得る配列
【数4】
第３の変換プライマー（Ｃ）が、標的核酸のＰ３部分配列と適合する配列Ｐ３を含み、かつ
変換プライマーセットおよび鎖置換ポリメラーゼを使用する増幅がＵの放出をもたらす、
請求項１に記載の方法。
【請求項6】
Ｐ２が標的核酸上のＰ１の３’であり、Ｐ３がＰ１の５’である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
【数5】
【数6】
【請求項8】
前記第１の変換プライマー（Ａ）が、１つまたは複数の追加の部分配列をさらに含み、これら部分配列の各々が、ＬＡＭＰ反応のためのプライマーとして機能する核酸鎖に相補的である、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
前記変換反応が、２つ以上の標的核酸のいずれか１つがサンプル中に存在する場合に同一の変換されたＬＡＭＰプライマーを生じさせるように機能する変換反応である「ＯＲ」反応として構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記変換反応が、サンプル内に存在する各々の標的化された核酸の異なる所要のＬＡＭＰプライマーを生じさせるように機能する変換反応である「ＡＮＤ」反応として構成されており、その結果、各々の標的化された核酸がサンプル内に存在する場合にのみＬＡＭＰ反応が進行する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記標的核酸が感染性疾患と関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記感染性疾患が、エボラ、ジカ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、マラリア、結核、デング、黄熱などである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記サンプルが環境サンプルであり、環境モニタリングまたは環境評価プロセスの一部として行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記環境サンプルが水サンプルまたは土壌サンプルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
標的核酸のループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）を可能にするように調製された組成物であって、ユニバーサルＬＡＭＰテンプレート、
ユニバーサルＬＡＭＰテンプレートに対応する不完全なＬＡＭＰプライマーセット、および
標的核酸と結び付くように構成されたプライマーセットであり、標的核酸がサンプル中に存在する場合に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを生じさせる変換反応を可能にするように構成され、ｓｓＤＮＡが、ＬＡＭＰ反応を促進させるためのＬＡＭＰプライマーの１つとして機能する、プライマーセット
を含む、組成物。
【請求項16】
鎖置換ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
逆転写酵素をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項18】
前記ＬＡＭＰテンプレートが標的核酸に依存しない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項19】
前記プライマーセットが、異なる核酸標的にそれぞれ向けられている少なくとも２つのプライマーサブセットを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項20】
前記プライマーセットが、マルチ入力「論理ＯＲ」決定のために構成されており、２つ以上のプライマーサブセットが、それらのそれぞれの核酸標的の存在下で同一のＬＡＭＰプライマーを生じさせるようにそれぞれ構成され、このことによって、ＬＡＭＰ反応がこれらの核酸標的のいずれかの存在下で進行することを可能にする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記不完全なＬＡＭＰプライマーセットが、２つ以上のプライマーサブセットの核酸標的の存在下で生じるＬＡＭＰプライマーのみを欠いており、その結果、ＬＡＭＰ反応が、２つ以上のプライマーサブセットの核酸標的のいずれかの存在下で進行し得る、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記プライマーセットが、マルチ入力「論理ＡＮＤ」決定のために構成されており、２つ以上のプライマーサブセットが、それらのそれぞれの核酸標的の存在下で異なるＬＡＭＰプライマーを生じさせるようにそれぞれが構成され、このことによって、ＬＡＭＰ反応がこれらの核酸標的の各々の存在下でのみ進行することを可能にする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項23】
前記不完全なＬＡＭＰプライマーセットが、２つ以上のプライマーサブセットの核酸標的の存在下で生じるＬＡＭＰプライマーの各々を欠いており、その結果、ＬＡＭＰ反応が、２つ以上のプライマーサブセットの核酸標的の各々の存在下でのみ進行し得る、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記プライマーセットが最大６つのサブセットを含み、これらサブセットの各々が、異なる標的に向けられ、マルチ入力「論理ＡＮＤ」決定の一部として異なるＬＡＭＰプライマーを放出するように構成されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項25】
前記サブセットの１つが、その対応する核酸標的が検出されるとループＦプライマーを放出するように構成されている、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記サブセットの１つが、その対応する核酸標的が検出されるとループＢプライマーを放出するように構成されている、請求項２４に記載の組成物。
【請求項27】
前記プライマーセットが最大４つのサブセットを含み、これらサブセットの各々が、異なる標的に向けられ、それぞれマルチ入力「論理ＡＮＤ」決定の一部として異なるＬＡＭＰプライマーを放出するように構成されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項28】
前記プライマーセットが、「論理ＡＮＤ」決定と組み合わせた「論理ＯＲ」決定のために構成され、前記プライマーセットが、それらのそれぞれの核酸標的の存在下で同一のＬＡＭＰプライマー（Ａ）を生じさせるようにそれぞれ構成されており、その結果、１つまたは複数のプライマーサブセット（ａ）の核酸標的のいずれかの存在下でＬＡＭＰプライマー（Ａ）が生じるようになっている、１つまたは複数のプライマーサブセット（ａ）、および、それらのそれぞれの核酸標的の存在下で同一のＬＡＭＰプライマー（Ｂ）を生じさせるようにそれぞれ構成されており、その結果、２つ以上のプライマーサブセット（ｂ）の核酸標的のいずれかの存在下でＬＡＭＰプライマー（Ｂ）が生じるようになっている、２つ以上のプライマーサブセット（ｂ）
を含み、
前記ＬＡＭＰ反応が、ＬＡＭＰプライマー（Ａ）およびＬＡＭＰプライマー（Ｂ）の両方が生じる場合にのみ進行する、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
前記プライマーセットが、それらのそれぞれの核酸標的の存在下で同一のＬＡＭＰプライマー（Ａ）を生じさせるようにそれぞれ構成されている、２つ以上のプライマーサブセット（ａ）を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
プライマーサブセット（ａ）およびプライマーサブセット（ｂ）に加えて、１つまたは複数のプライマーサブセットのそれぞれの核酸標的の存在下でＬＡＭＰプライマー（Ａ）およびＬＡＭＰプライマー（Ｂ）と異なるＬＡＭＰプライマーを生じさせるように構成されている前記１つまたは複数のプライマーサブセットをさらに含み、前記ＬＡＭＰ反応が、ＬＡＭＰプライマー（Ａ）、ＬＡＭＰプライマー（Ｂ）、および１つまたは複数の追加のＬＡＭＰプライマーの全てが生じる場合にのみ進行する、請求項２８に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001]本願は、この参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／１９１，５９０号に対する利益および優先権を主張するものである。
[0001]本願は、この参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／１９１，５９０号に対する利益および優先権を主張するものである。
【背景技術】
【0002】
[0002]ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）および逆転写ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）（Ｔｏｍｉｔａ，Ｎ．、Ｍｏｒｉ，Ｙ．、Ｋａｎｄａ，Ｈ．、Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ） ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｉｍｐｌｅ Ｖｉｓｕａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２００８、３、８７７～８８２、およびＰａｒｉｄａ，Ｍ．、Ｓａｎｎａｒａｎｇａｉａｈ，Ｓ．、Ｄａｓｈ，Ｐ．Ｋ．、Ｒａｏ，Ｐ．Ｖ．Ｌ．、Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ．Ｌｏｏｐ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）：Ａ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、２００８、１８、４０７～４２１を参照されたい）は、ＰＣＲアッセイおよびＲＴ－ＰＣＲアッセイで必要とされる費用のかかる熱循環設備および時間のかかるプロトコルを必要とすることのない等温条件下での核酸の迅速な指数関数的増幅のための強力な分子技術である（Ｚｈａｏ，Ｙ．、Ｃｈｅｎ，Ｆ．、Ｌｉ，Ｑ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｆａｎ，Ｃ．Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２０１５、１１５、１２４９１～１２５４５を参照されたい）。
【0003】
[0003]単純な反応セットアップ、短いターンアラウンドタイム、複数の利用可能なリードアウト方法、一般的な阻害物質に対する高い耐性、および核酸抽出を回避する可能性などの利点は、ＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰベースの診断法を、新興の病原体（Ｗｏｎｇ，Ｙ．－Ｐ．、Ｏｔｈｍａｎ，Ｓ．、Ｌａｕ，Ｙ．－Ｌ．、Ｒａｄｕ，Ｓ．、Ｃｈｅｅ，Ｈ．－Ｙ．Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）：Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ－Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１８、１２４、６２６～６４３を参照されたい）および感染性疾患（Ｍｏｒｉ，Ｙ．、Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）：Ａ Ｒａｐｉｄ，Ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄ Ｃｏｓｔ－Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００９、１５、６２～６９を参照されたい）の安価な臨床現場即時（ＰＯＣ）検査および患者の近くで行われる検査にとって特に魅力的なものにしている。
【0004】
[0004]しかし、ＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の高い感度および特異性は、基本的に、標的配列上の８つの異なる領域を認識する１セットの６つのプライマーの細部にわたる設計および最適化に基づいている（Ｍｏｅｈｌｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．、Ｃｈｏｉ，Ｇ．、Ｄｕｇａｎ，Ｌ．Ｃ．、Ｓａｌｉｔ，Ｍ．、Ｍｅａｇｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．ＬＡＭＰ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－Ｃａｒｅ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．、２０２１、２１、４３～６１を参照されたい）。それぞれの所望の標的のための新たなＬＡＭＰプライマーセットを完全に設計し直し、スクリーニングし、そして最適化する必要性は、進化していく病原体および新興の感染性疾患に応じた高性能のＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの開発を、費用がかかり、時間がかかり、かつ労力を要するものにしている。
【0005】
[0005]さらに、複数の標的を検出するためには、マルチプレックスＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰの最新技術の方法は、反応ミックスに複数の直交型のＬＡＭＰプライマーセットを含めること（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．、Ｔａｎｎｅｒ，Ｎ．Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０２１、７０、１６７～１７４、およびＪａｎｇ，Ｗ．Ｓ．、Ｌｉｍ，Ｄ．Ｈ．、Ｙｏｏｎ，Ｊ．、Ｋｉｍ，Ａ．、Ｌｉｍ，Ｍ．、Ｎａｍ，Ｊ．、Ｙａｎａｇｉｈａｒａ，Ｒ．、Ｒｙｕ，Ｓ．－Ｗ．、Ｊｕｎｇ，Ｂ．Ｋ．、Ｒｙｏｏ，Ｎ．－Ｈ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ） Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｏｎ－Ｓｉｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２．、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０２１、１６、ｅ０２４８０４２を参照されたい）、ならびに、反応結果を解釈するための、特別なリードアウトメカニズム、例えば、複数のフルオロフォア－クエンチャー対（Ｔａｎｎｅｒ，Ｎ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．、Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ｃ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０１２、５３、８１～８９を参照されたい）、マイクロキャピラリー（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．、Ｚｈａｎｇ，Ｌ．、Ｓｕｎ，Ｊ．、Ｌｉｕ，Ｙ．、Ｍａ，Ｘ．、Ｃｕｉ，Ｓ．、Ｍａ，Ｌ．、Ｘｉ，Ｊ．Ｊ．、Ｊｉａｎｇ，Ｘ．Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－Ｃａｒｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｙ－Ｂａｓｅｄ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１４、８６、７０５７～７０６２、およびＬｉ，Ｒ．、Ｃｈｅｎ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｃｕｉ，Ｊ．、Ｔａｏ，Ｓ．、Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｍｉｎｉ－Ｄｉｓｋ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ａｒｒａｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ＬＡＭＰ ｆｏｒ Ｖｉｓｕａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｓ ａｎ Ｅｘａｍｐｌｅ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、２０２０、６８、８９９～９０６を参照されたい）、ラテラルフロー装置（Ｚｈｕ，Ｘ．、Ｗａｎｇ，Ｘ．、Ｈａｎ，Ｌ．、Ｃｈｅｎ，Ｔ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｌｉ，Ｈ．、Ｌｉ，Ｓ．、Ｈｅ，Ｌ．、Ｆｕ，Ｘ．、Ｃｈｅｎ，Ｓ．ら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－Ｂａｓｅｄ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９．、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．、２０２０、１６６、１１２４３７を参照されたい）、またはアンプリコン融解パターン（Ｄｏｎｇ，Ｊ．、Ｘｕ，Ｑ．、Ｌｉ，Ｃ．、Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｏｌｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１９、５５、２４５７～２４６０を参照されたい）に頼らなくてはならない。これらの実装は、アッセイの全体的なコストおよび複雑さを著しく増大させ、また、汚染のリスクを高める場合がある（例えば、リードアウトおよび分析のために、増幅の後に反応槽が再び開かれなくてはならない場合）。
【0006】
[0006]マルチプレックスＬＡＭＰの実装を単純化するために、最近の研究は、メディエーター－レポーターセットを提案しており（Ｂｅｃｈｅｒｅｒ，Ｌ．、Ｂａｋｈｅｉｔ，Ｍ．、Ｆｒｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｓ．、Ｓｔｉｎｃｏ，Ｓ．、Ｂｏｒｓｔ，Ｎ．、Ｚｅｎｇｅｒｌｅ，Ｒ．、ｖｏｎ Ｓｔｅｔｔｅｎ，Ｆ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｗｉｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１８、９０、４７４１～４７４８を参照されたい）、これは、異なるＬＡＭＰ反応から生じた増幅産物を可視化するために使用される蛍光ヘアピンレポーターを１つにすることを可能にする。この先行技術の設計はマルチプレックスＬＡＭＰのための効率的なリードアウト方法を提供するが、これは、アッセイに使用される標的の１つ１つのためにフルセットのＬＡＭＰプライマーを細部にわたり設計し、スクリーニングし、そして最適化する必要性は依然として回避していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
[0007]したがって、特に、進化していく病原体および新興の感染性疾患に対処するためのアッセイにおいて使用するための、ＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰのための改良されたシステム、方法、および関連するワークフローが現在も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
[0008]本開示は、異なるＤＮＡ／ＲＮＡ標的の効果的な検出のためのユニバーサルＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイを目的としている。従来のＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰ反応では、１セットの６つの固有のプライマーが、それぞれの所望の標的配列のために細部にわたり設計され、最適化されなくてはならない。ＬＡＭＰプライマーでの多くの設計上の制約に起因して、ＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの設計および最適化は通常は困難であり、所望の標的のための複数の候補プライマーセットの冗長な実証的検査を必要とする。その結果、追加の標的の検出は、新たなＬＡＭＰプライマーセットの完全な再設計、スクリーニング、および最適化を必要とし、これは、非常にコストがかかり、時間がかかり、そして労力を要するプロセスであり得る。
【0009】
[0009]本開示は、高度に最適化されたＬＡＭＰ反応の上流で機能して任意の標的ＤＮＡ／ＲＮＡ配列の検出を効果的に変換する新規な変換メカニズムを、アッセイの標的配列に依存しないユニバーサルＬＡＭＰテンプレートの迅速な増幅に一体化させる。変換メカニズム（図１）は、標的配列および３つの設計が容易なプライマーを含み、これらは、単純なハイブリダイゼーションおよび鎖置換重合反応を受けて、ユニバーサルｓｓＤＮＡオリゴの１つまたは複数のコピーを放出し（図２）、当該オリゴの配列は、下流のユニバーサルＬＡＭＰ反応を開始させるための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するように事前設計されている（図３、図４）。
【0010】
[0010]このＬＡＭＰ反応は高度に最適化されており、異なる標的の検出のために調節し直す必要がない。その結果、本発明は、任意の所望の異なるＤＮＡ配列セットまたはＲＮＡ配列セットを高い特異性および感度で検出するために１セットの高度に最適化されたＬＡＭＰプライマーのみを使用すればよいユニバーサルワンポット分子アッセイの迅速な開発を可能にする。ユニバーサルアッセイの設計の単純さは、安価で正確な分子診断法の迅速な配備を促進して、世界的公衆衛生の点で重要な感染性疾患、例えば、エボラ、ジカ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、マラリア、結核、デング、黄熱などを含む、流行中の／新興の病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の広範な臨床現場即時の／患者の近くで行われる検査を可能にする。他の適用としては、環境サンプルの分析が含まれる。例えば、ある特定の態様は、水サンプル、土壌サンプル、および／または他のタイプの環境サンプルを分析することによる環境のモニタリングおよび評価を目的とし得る。
【0011】
[0011]さらに、本明細書において開示されている態様は、アッセイの感度、特異性、および多重性の程度の容易なカスタム化および増強を可能にする、複数の標的の検出におけるブール「論理ＯＲ」（図５）および「論理ＡＮＤ」（図６、図７）の計算のための直接的なサポートを備えたマルチプレックスユニバーサルＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの設計および実装に関する。本明細書において開示されている態様は、ＰＣＲ／ＲＴ－ＰＣＲよりも高い感度および特異性を提供しながら、従来のマルチプレックスＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰよりも単純なアッセイ設計および安い開発コストを特徴とする、シングルプレックスアッセイフォーマットまたはマルチプレックスアッセイフォーマットのいずれかでの核酸のユニバーサル迅速等温検出を達成している。
【0012】
[0012]本明細書において記載される新規な変換メカニズムは、様々な等温増幅法方法およびリードアウト技術と広く適合する。分子診断用途に加えて、提案されている変換メカニズムは、複雑な分子回路での入力シグナルおよび出力シグナルの単純なユニバーサル変換を達成するために、ＤＮＡおよびＲＮＡコンピューティングの分野に広く適用され得る。
【0013】
[0013]この概要は、詳細な説明において以下でさらに記載される単純化された形態に概念の選択を導入するために提供されている。この概要は、特許請求の範囲に記載の主題の重要な特徴または必須の特徴を特定するためのものでも、特許請求の範囲に記載の主題の範囲の指定として使用されるためのものでもない。
【0014】
[0014]本発明の様々な対象、特徴、特性、および利点は、その全てが本明細書の一部を形成する添付の図面および添付の特許請求の範囲と組み合わせて態様の以下の記載から明らかとなり、より容易に理解されるであろう。図面において、リファレンスナンバーのようなものが、様々な図面における対応するまたは類似の部分を指すために利用され得、示されている様々な要素は、必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】[0015]典型的な変換反応を示す図であり、下流の事前設計された最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のためのＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するｓｓＤＮＡオリゴ「Ｕ」の放出をもたらす、標的配列と３つの設計が簡単なプライマーとの間のハイブリダイゼーションおよび鎖置換重合反応を示している。
【図2】[0016]変換反応のためのロードされたプライマーの設計スキームを示す図であり、第２の設計スキームでは、ロードされたプライマーが、それぞれが「Ｕ」のコピーにハイブリダイズする反復ドメインを含み、このことで、標的配列の１つのコピーが検出されると「Ｕ」の複数のコピーを素早く放出させるための変換反応を可能にすることを示しており、また、反復ドメインを有するロードされたプライマーのバックボーンが直接的な合成によってまたはプライマー交換反応などの技術を使用して容易に調製され得ることを示しており、また、第３の設計スキームでは、変換反応の出力が、下流のユニバーサルＬＡＭＰ反応のための６つのプライマーのうちの２つとして機能する「Ｕ１」および「Ｕ２」の同時放出であることを示している。
【図3】[0017]ユニバーサルＬＡＭＰ反応の構成要素を示す図である。
【図4-1】[0018]ユニバーサルＬＡＭＰ反応の例を示す図であり、変換反応から放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ」が、事前設計された高度に最適化されたＬＡＭＰ反応の迅速な開始を引き起こすことを示している。
【図4-2】[0018]ユニバーサルＬＡＭＰ反応の例を示す図であり、変換反応から放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ」が、事前設計された高度に最適化されたＬＡＭＰ反応の迅速な開始を引き起こすことを示している。
【図5】[0019]標的に対する「論理ＯＲ」演算を伴うマルチプレックスユニバーサルＬＡＭＰの反応構成要素を示す図であり、標的に対する「論理ＯＲ」演算を伴うユニバーサルＬＡＭＰの反応ステップは、図４に示すものと同一であり得る。
【図6】[0020]標的に対する「論理ＡＮＤ」演算を伴うマルチプレックスユニバーサルＬＡＭＰの反応構成要素を示す図である。
【図7-1】[0021]標的に対する「論理ＡＮＤ」演算を伴うユニバーサルＬＡＭＰ反応を示す図であり、変換反応からの「Ｕ１」および「Ｕ２」の同時放出が、事前設計された最適化されたＬＡＭＰ反応の開始を引き起こすことを示している。
【図7-2】[0021]標的に対する「論理ＡＮＤ」演算を伴うユニバーサルＬＡＭＰ反応を示す図であり、変換反応からの「Ｕ１」および「Ｕ２」の同時放出が、事前設計された最適化されたＬＡＭＰ反応の開始を引き起こすことを示している。
【発明を実施するための形態】
【0016】
ユニバーサルＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの概要
[0022]異なる標的の効果的な検出のためのＬＡＭＰベースのアッセイの設計および実装を十分に単純化するために、本開示は、任意の所望の標的ＤＮＡ配列セットまたはＲＮＡ配列セットが検出されると高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応を迅速に開始させるための３つの標的特異的なプライマーを含む、新規な変換メカニズムを利用する、ユニバーサルＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰの単純なスキームを記載している。変換反応とＬＡＭＰ反応との間の結び付きは、事前設計された高度に最適化されたＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するユニバーサルｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの、標的によって引き起こされる放出である。
[0022]異なる標的の効果的な検出のためのＬＡＭＰベースのアッセイの設計および実装を十分に単純化するために、本開示は、任意の所望の標的ＤＮＡ配列セットまたはＲＮＡ配列セットが検出されると高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応を迅速に開始させるための３つの標的特異的なプライマーを含む、新規な変換メカニズムを利用する、ユニバーサルＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰの単純なスキームを記載している。変換反応とＬＡＭＰ反応との間の結び付きは、事前設計された高度に最適化されたＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するユニバーサルｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの、標的によって引き起こされる放出である。
【0017】
[0023]したがって、標準的なアプローチでは全ての標的のために６つの特異的なＬＡＭＰプライマーであるのとは対照的に、異なる標的核酸が、わずか３つのプライマーの設計に基づいて、高い特異性および感度で迅速に増幅され得る。多段階反応をＬＡＭＰと一体化させる先行技術の分子アッセイ（例えば、Ｍａｒｃｉｎｉａｋ，Ｊ．Ｙ．、Ｋｕｍｍｅｌ，Ａ．Ｃ．、Ｅｓｅｎｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｍｅｓｓｍｅｒ，Ｂ．Ｔ．Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００８、４５、２７５～２８０を参照されたい）とは対照的に、本明細書に記載のアッセイは、高度に最適化されたＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイと同等の高レベルの感度および特異性を達成するために、追加の酵素、または反応時間の延長を必要としない。
【0018】
[0024]単純な変換メカニズムとユニバーサルＬＡＭＰ反応との一体化はまた、複数の核酸標的の迅速な検出の際のブール論理演算の直接的な実装を容易にする。ユニバーサルＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの感度、特異性、および多重性の柔軟な微調整を可能にするために、「ロードされたプライマー」の様々な代替的な設計スキームがさらに記載される。ブール論理計算のためのビルトインサポートもまた、単純なｐＨに基づく比色分析のリードアウト（例えば、Ｔａｎｎｅｒ，Ｎ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．、Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ｃ．Ｖｉｓｕａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ＰＨ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｙｅｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０１５、５８、５９～６８において記載されているような）の使用、または直接的な目視検査によるマルチプレックス検査の結果の容易な解釈のための他の比較的単純な検出スキームの使用を可能にしている。
【0019】
[0025]ブール論理計算のための内在するサポートを有するマルチプレックスアッセイは、実践的な適用に多くの利点をもたらす。例えば、マルチプレックス「論理ＯＲ」演算は、アッセイの多重性を向上させるため（例えば、複数の病原体、もしくは特定の病原体の複数のサブタイプ／突然変異体を同時に検出することによる）またはアッセイの感度を増強させるため（例えば、特定の標的病原体の複数のゲノム位置を同時に検出することによる）に活用され得る。同様に、「論理ＡＮＤ」演算は、アッセイの多重性を向上させるため（例えば、複数の病原体、もしくは特定の病原体の複数のサブタイプ／突然変異体の共存を検出することによる）またはアッセイの特異性を増強させるため（例えば、特定の標的病原体に特異的な複数のゲノム位置の共存を検出することによる）に活用され得る。
【0020】
[0026]本明細書に記載のアッセイは、ＰＣＲ／ＲＴ－ＰＣＲよりもより高い感度および特異性を提供しながら、従来のマルチプレックスＬＡＭＰ／ＲＴ－ＬＡＭＰよりも単純なアッセイ設計および安い開発コストを特徴とする、シングルプレックスアッセイフォーマットまたはマルチプレックスアッセイフォーマットのいずれかでの核酸（限定はしないが、ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、および核酸類似体、例えばＴＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＧＮＡを含む）のユニバーサル迅速等温検出を可能にする。
【0021】
[0027]本明細書において記載されているユニバーサルアッセイは、限定はしないが比色分析、蛍光、化学発光、電気化学、濁度、およびこれらに類するものを含む複数のリードアウト方法に適合する。本明細書に記載のアッセイはまた、複数のフルオロフォア－クエンチャー対、マイクロキャピラリー、ラテラルフロー装置、またはアンプリコン融解パターンなどのリードアウトメカニズムと組み合わせて利用され得る。
【0022】
[0028]分子診断法における適用に加えて、本明細書において提案される新規な変換メカニズムは、複雑な分子回路での入力シグナルおよび出力シグナルのユニバーサル変換を容易に可能にするために、ＤＮＡおよびＲＮＡコンピューティングの分野に広く適用され得る。本明細書において記載される態様が利用され得るこのようなシステムの例については、Ｓｏｎｇ，Ｘ．、Ｒｅｉｆ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－Ｓｃａｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１９、１３、６２５６～６２６８、およびＳｈａｈ，Ｓ．、Ｗｅｅ，Ｊ．、Ｓｏｎｇ，Ｔ．、Ｃｅｚｅ，Ｌ．、Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｋ．、Ｃｈｅｎ，Ｙ．－Ｊ．、Ｒｅｉｆ，Ｊ．Ｕｓｉｎｇ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｏ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０２０、１４２、ｊａｃｓ．０ｃ０２２４０を参照されたい。
【0023】
[0029]本明細書において提案されるユニバーサル変換メカニズムはまた、ＬＡＭＰに加えて、限定はしないが、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、等温多重置換増幅（ＩＭＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、シングルプライマー等温増幅法（ＳＰＩＡ）、ならびに指数関数的な増幅、線形の増幅、およびカスケード増幅の他のバリエーションを含む、様々な他の等温増幅法技術と広く適合する。これらの技術のさらなる議論については、Ｚｈａｏら、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．、２０１５、およびＧｉｌｌ，Ｐ．、Ｇｈａｅｍｉ，Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２００８、２７、２２４～２４３を参照されたい。
例示的な態様
[0030]図１は、例示的な変換反応を示している。変換の目的は、標的核酸鎖の存在を検出し、それに応じて、下流の事前設計された高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応を迅速に開始させるための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するユニバーサルｓｓＤＮＡオリゴ「Ｕ」を放出させることである。
例示的な態様
[0030]図１は、例示的な変換反応を示している。変換の目的は、標的核酸鎖の存在を検出し、それに応じて、下流の事前設計された高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応を迅速に開始させるための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するユニバーサルｓｓＤＮＡオリゴ「Ｕ」を放出させることである。
【0024】
[0031]示されている変換反応は、これらの構成要素を含んでいる:（１）部分配列Ｐ２、Ｐ１、Ｐ３（３’から５’の方向で列挙されている）を３つの隣接するプライマー結合部位として有する標的鎖、（２）部分配列
【0025】
【数1】
【0026】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むロードされたプライマー「Ａ」、であって、前記プライマー核酸鎖に、部分配列
【0027】
【数2】
【0028】
（バーは配列の逆相補性を示している）にハイブリダイズしている核酸鎖Ｕがロードされている、ロードされたプライマー「Ａ」、（３）プライマー核酸鎖
【0029】
【数3】
【0030】
を含むプライマー「Ｂ」、（４）プライマー核酸鎖Ｐ３を含むプライマー「Ｃ」、（５）鎖置換ポリメラーゼ（例えばＢｓｔ２．０）、ならびに（６）逆転写酵素（標的配列がＲＮＡである場合）。簡潔性のために、反応バッファーおよびヌクレアーゼフリーの水などの一般的な試薬は、図には示されていない。
【0031】
[0032]図１はまた、標的鎖と３つのプライマーＡ、Ｂ、およびＣとの間のハイブリダイゼーションおよび鎖置換重合反応を示しており、これは、下流の事前設計された高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するｓｓＤＮＡオリゴ「Ｕ」の放出をもたらす。
【0032】
[0033]特に、ステップ（ａ）は、標的鎖上のプライマー結合部位Ｐ１を介する、標的鎖とロードされたプライマー「Ａ」との間のハイブリダイゼーション反応を含む。ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で生じた核酸複合体の
【0033】
【数4】
【0034】
の３’末端から開始される重合反応を含む。ステップ（ｃ）は、標的鎖上のプライマー結合部位Ｐ２を介する、プライマー「Ｂ」とステップ（ｂ）で生じた核酸複合体との間のハイブリダイゼーション反応を含む。ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）で生じた核酸複合体の
【0035】
【数5】
【0036】
の３’末端から開始される鎖置換重合反応を含む。ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）で生じた結果物の核酸複合体を示している。ステップ（ｆ）は、プライマー「Ｃ」と、プライマーＣへの結合のための露出している
【0037】
【数6】
【0038】
ドメインを有するステップ（ｅ）で生じた核酸複合体との間のハイブリダイゼーション反応を含む。ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）で生じた核酸複合体のＰ３の３’末端から開始される鎖置換重合反応を示している。ステップ（ｈ）は、ステップ（ｇ）で生じた結果物の核酸複合体を示している。放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ」は、下流の事前設計された高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能する。
【0039】
[0034]図２は、変換反応において使用するためのロードされたプライマーＡの３つの設計スキームを示している。各設計スキームのロードされたプライマーＡは、点線のボックスの内側に示されている。スキーム（a）は、ロードされたプライマーＡの第１の設計に基づく変換反応の入力および出力を示している。このスキームにおいて、ロードされたプライマーＡは、１つの部分配列
【0040】
【数7】
【0041】
および１つの部分配列
【0042】
【数8】
【0043】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖から構成され、当該プライマー核酸鎖には、部分配列
【0044】
【数9】
【0045】
にハイブリダイズしている１つの核酸鎖Ｕがロードされている。１つの標的鎖が検出されると、この反応は、下流の事前設計された最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するｓｓＤＮＡ「Ｕ」を放出する。これは、図１に示す変換反応に対応している。
【0046】
[0035]スキーム（ｂ）は、ロードされたプライマーＡの第２の設計に基づく変換反応の入力および出力を示している。このスキームにおいて、ロードされたプライマーＡは、部分配列
【0047】
【数10】
【0048】
の複数の反復および１つの部分配列
【0049】
【数11】
【0050】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖から構成され、当該プライマー核酸鎖には、部分配列
【0051】
【数12】
【0052】
の複数の反復にハイブリダイズしている核酸鎖Ｕの複数のコピーがロードされている。１つの標的鎖が検出されると、この反応は、下流の事前設計された最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するためのｓｓＤＮＡ「Ｕ」の複数のコピーを放出する。この設計は、アッセイの感度を向上させるために使用され得る。
【0053】
[0036]スキーム（ｃ）は、ロードされたプライマーＡの第３の設計に基づく変換反応の入力および出力を示している。このスキームにおいて、ロードされたプライマーＡは、１つの部分配列
【0054】
【数13】
【0055】
、１つの部分配列
【0056】
【数14】
【0057】
、および１つの部分配列
【0058】
【数15】
【0059】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖から構成され、当該プライマー核酸鎖には、部分配列
【0060】
【数16】
【0061】
および部分配列
【0062】
【数17】
【0063】
にそれぞれハイブリダイズしている１つの核酸鎖Ｕ２および１つの核酸鎖Ｕ１がロードされている。１つの標的鎖が検出されると、この反応は、下流の事前設計された最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のための個別の必須のＬＡＭＰプライマーとしてそれぞれが機能するｓｓＤＮＡ「Ｕ１」およびｓｓＤＮＡ「Ｕ２」を同時放出する。
【0064】
[0037]図３では、ユニバーサルＬＡＭＰ反応の構成要素が示されている。反応バッファー、ヌクレアーゼフリーの水、および当技術分野において公知の他の標準的な増幅構成要素などの一般的な試薬は、図に示されていないが、含まれ得る。ユニバーサルＬＡＭＰ反応は、（１）部分配列
【0065】
【数18】
【0066】
、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（３’から５’の方向で列挙されている）を標準的なＬＡＭＰ反応に必要な６つのプライマー結合部位として有する、高度に最適化されたＬＡＭＰ反応のための事前設計されたユニバーサルテンプレート、（２）プライマー核酸鎖Ｕを含むＦ３プライマー、プライマー核酸鎖Ｂ３を含むＢ３プライマー、部分配列Ｆ１ｃおよびＦ２（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むＦＩＰプライマー、部分配列Ｂ１ｃおよびＢ２（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むＢＩＰプライマー、プライマー核酸鎖ＦＬＰｃを含むループＦプライマー、ならびにプライマー核酸鎖ＢＬＰｃを含むループＢプライマーを含む、ユニバーサルテンプレート（１）の迅速な増幅のための事前最適化されたＬＡＭＰプライマーセット、ならびに（３）鎖置換ポリメラーゼを含み得る。バーでの表記法と同様に、修飾子「ｃ」は、配列の逆相補性を示している。したがって、例えば、Ｆ２ｃは、Ｆ２に対して逆相補的である。
【0067】
[0038]この実施例は、変換反応から放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ」を、ユニバーサルＬＡＭＰ反応におけるＦ３プライマーとして利用する。しかし、実装の優先度に応じて、ｓｓＤＮＡ「Ｕ」は、最適なアッセイパフォーマンスのための必須のＬＡＭＰプライマーのいずれか１つとして機能するように設計され得る。
【0068】
[0039]図４では、本発明のユニバーサルＬＡＭＰ反応が示されている。ユニバーサルＬＡＭＰ反応の目的は、事前設計され高度に最適化されたＬＡＭＰ反応を迅速に開始させるために、変換反応からのｓｓＤＮＡ「Ｕ」の放出を感知することあり、この結果は、例えば、ｐＨに基づく比色分析のリードアウトの単純で迅速な目視検査によって容易に解釈され得る。
【0069】
[0040]ステップ（ａ）は、ユニバーサルテンプレート上のプライマー結合部位Ｆ２ｃを介する、ユニバーサルテンプレートとＦＩＰプライマーとの間のハイブリダイゼーション反応を示している。ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で生じた核酸複合体のＦ２の３’末端から開始される重合反応を示している。ステップ（ｃ）は、ユニバーサルテンプレート上のプライマー結合部位
【0070】
【数19】
【0071】
を介する、変換反応から放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ」とステップ（ｂ）で生じた核酸複合体との間のハイブリダイゼーション反応を示している。ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）で生じた核酸複合体の
【0072】
【数20】
【0073】
の３’末端から開始される鎖置換重合反応を示しており、置換されたｓｓＤＮＡは、その５’末端にループ構造を有する核酸複合体を形成している。ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）で生じた核酸複合体上のプライマー結合部位Ｂ２ｃおよびＢ３ｃをそれぞれ介する、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーと前記複合体とのハイブリダイゼーションを示している。ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）で生じた核酸複合体のＢ２の３’末端から開始される鎖置換重合反応、およびステップ（ｅ）で生じた核酸複合体のＢ３の３’末端から開始される鎖置換重合反応を示しており、置換されたｓｓＤＮＡは、両末端にループ構造を有する核酸複合体を形成している。ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）で生じた核酸複合体上のプライマー結合部位Ｆ２ｃ、Ｂ２ｃ、ＦＬＰ、およびＢＬＰをそれぞれ介する、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＦプライマー、およびループＢプライマーと、前記複合体とのハイブリダイゼーションを示している。ステップ（ｈ）は、ステップ（ｇ）で生じた核酸複合体のＦＩＰの３’末端、ループＢの３’末端、ＢＩＰの３’末端、およびループＦの３’末端からそれぞれ開始される鎖置換重合反応によって促進される、ＬＡＭＰの自己推進型の自己循環増幅を示している。
【0074】
[0041]図５は、複数の標的の検出における「論理ＯＲ」演算をサポートするマルチプレックスユニバーサルＬＡＭＰの反応構成要素を示している。「変換反応の構成要素」は、「論理ＯＲ」に基づく２つの異なる標的の検出のための変換反応の入力および出力を示している。標的のいずれか（または両方）の検出は、下流の高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応を開始させるユニバーサルｓｓＤＮＡオリゴ「Ｕ」の放出をもたらす。
【0075】
[0042]「変換反応の構成要素」において、（１）は、部分配列Ｐ２、Ｐ１、Ｐ３（３’から５’の方向で列挙されている）を３つの隣接するプライマー結合部位として有する、第１の標的鎖の配列組成を示しており、（２）は、部分配列
【0076】
【数21】
【0077】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むロードされたプライマーであって、前記プライマー核酸鎖に、部分配列
【0078】
【数22】
【0079】
にハイブリダイズしている核酸鎖Ｕがロードされている、ロードされたプライマー；プライマー核酸鎖
【0080】
【数23】
【0081】
を含むプライマー；ならびにプライマー核酸鎖Ｐ３を含むプライマーを含む、第１の標的鎖を検出するための３つのプライマーを示している。
[0043]同様に、「変換反応の構成要素」において、（３）は、部分配列Ｑ２、Ｑ１、Ｑ３（３’から５’の方向で列挙されている）を３つの隣接するプライマー結合部位として有する、第２の標的鎖の配列組成を示しており、（４）は、部分配列
[0043]同様に、「変換反応の構成要素」において、（３）は、部分配列Ｑ２、Ｑ１、Ｑ３（３’から５’の方向で列挙されている）を３つの隣接するプライマー結合部位として有する、第２の標的鎖の配列組成を示しており、（４）は、部分配列
【0082】
【数24】
【0083】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むロードされたプライマーであって、前記プライマー核酸鎖に、部分配列
【0084】
【数25】
【0085】
にハイブリダイズしている核酸鎖Ｕがロードされている、ロードされたプライマー；プライマー核酸鎖
【0086】
【数26】
【0087】
を含むプライマー；ならびにプライマー核酸鎖Ｑ３を含むプライマーを含む、第２の標的鎖の検出のための３つのプライマーを示している。第１の標的または第２の標的のいずれか（または両方）の検出は、下流の高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能するｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド「Ｕ」の放出をもたらす。
【0088】
[0044]「ユニバーサルＬＡＭＰ反応の構成要素」は、「論理ＯＲ」に基づく２つの異なる標的の検出のためのユニバーサルＬＡＭＰ反応の構成要素を示しており、（１）は、部分配列
【0089】
【数27】
【0090】
、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（３’から５’の方向で列挙されている）を標準的なＬＡＭＰ反応に必要な６つのプライマー結合部位として有する、高度に最適化されたＬＡＭＰ反応のための事前設計されたユニバーサルテンプレートの配列組成であり、（２）は、プライマー核酸鎖Ｕを含むＦ３プライマー（変換反応によって生じる）、プライマー核酸鎖Ｂ３を含むＢ３プライマー、部分配列Ｆ１ｃおよびＦ２（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むＦＩＰプライマー、部分配列Ｂ１ｃおよびＢ２（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むＢＩＰプライマー、プライマー核酸鎖ＦＬＰｃを含むループＦプライマー、ならびにプライマー核酸鎖ＢＬＰｃを含むループＢプライマーを含む、（１）のユニバーサルテンプレートの迅速な増幅のための事前最適化されたＬＡＭＰプライマーセットであり、そして（３）は、鎖置換ポリメラーゼである。
【0091】
[0045]反応バッファーおよびヌクレアーゼフリーの水などの標準的な公知の試薬は示されていないが、含まれ得る。この実施例において、変換反応から放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ」は、ユニバーサルＬＡＭＰ反応におけるＦ３プライマーとして機能する。実装の優先度に応じて、ｓｓＤＮＡ「Ｕ」は、最適なアッセイパフォーマンスのための必須のＬＡＭＰプライマーのいずれか１つとして機能するように設計され得る。
【0092】
[0046]図６は、複数の標的の検出における「論理ＡＮＤ」演算をサポートするマルチプレックスユニバーサルＬＡＭＰの反応構成要素を示している。「変換反応の構成要素」は、「論理ＡＮＤ」に基づく２つの異なる標的の検出のための変換反応の入力および出力を示している。特に、（１）は、部分配列Ｐ２、Ｐ１、Ｐ３（３’から５’の方向で列挙されている）を３つの隣接するプライマー結合部位として有する、第１の標的鎖の配列組成を示しており、（２）は、部分配列
【0093】
【数28】
【0094】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むロードされたプライマーであって、前記プライマー核酸鎖に、部分配列
【0095】
【数29】
【0096】
にハイブリダイズしている核酸鎖Ｕ１がロードされている、ロードされたプライマー；プライマー核酸鎖
【0097】
【数30】
【0098】
を含むプライマー；ならびにプライマー核酸鎖Ｐ３を含むプライマーを含む、第１の標的鎖を検出するための３つのプライマーを示している。第１の標的の検出は、下流の高度に最適化されたユニバーサルＬＡＭＰ反応のための必須のＬＡＭＰプライマーの１つとして機能する１つのｓｓＤＮＡオリゴ「Ｕ１」（または、ロードされたプライマーのマルチコピー設計スキームを使用する場合には、「Ｕ１」の複数のコピー）の放出をもたらす。
【0099】
[0047]同様に、「変換反応の構成要素」において、（３）は、部分配列Ｑ２、Ｑ１、Ｑ３（３’から５’の方向で列挙されている）を３つの隣接するプライマー結合部位として有する、第２の標的鎖の配列組成を示しており、（４）は、部分配列
【0100】
【数31】
【0101】
（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むロードされたプライマーであって、前記プライマー核酸鎖に、部分配列
【0102】
【数32】
【0103】
にハイブリダイズしている核酸鎖Ｕ２がロードされている、ロードされたプライマー；プライマー核酸鎖
【0104】
【数33】
【0105】
を含むプライマー；ならびに核酸鎖Ｑ３を含むプライマーを含む、第２の標的鎖の検出のための３つのプライマーを示している。第２の標的の検出は、下流のＬＡＭＰ反応のための別の必須のＬＡＭＰプライマーとして機能する１つの異なるｓｓＤＮＡオリゴ「Ｕ２」（または、ロードされたプライマーのマルチコピー設計スキームを使用する場合には、「Ｕ２」の複数のコピー）の放出をもたらす。
【0106】
[0048]「ユニバーサルＬＡＭＰ反応の構成要素」は、「論理ＡＮＤ」に基づく２つの異なる標的の検出のためのユニバーサルＬＡＭＰ反応の構成要素を示しており、（１）は、高度に最適化されたＬＡＭＰ反応のための事前設計されたユニバーサルテンプレートの配列組成である。テンプレートは、部分配列
【0107】
【数34】
【0108】
、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｕ２（３’から５’の方向で列挙されている）を標準的なＬＡＭＰ反応に必要な６つのプライマー結合部位として有しており、（２）は、プライマー核酸鎖Ｕ１を含むＦ３プライマー（変換反応によって生じる）、プライマー核酸鎖Ｕ２を含むＢ３プライマー（変換反応によって生じる）、部分配列Ｆ１ｃおよびＦ２（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むＦＩＰプライマー、部分配列Ｂ１ｃおよびＢ２（５’から３’の方向で列挙されている）を有するプライマー核酸鎖を含むＢＩＰプライマー、プライマー核酸鎖ＦＬＰｃを含むループＦプライマー、ならびにプライマー核酸鎖ＢＬＰｃを含むループＢプライマーを含む、（１）のユニバーサルテンプレートの迅速な増幅のための事前最適化されたＬＡＭＰプライマーセットであり、そして（３）は鎖置換ポリメラーゼである。
【0109】
[0049]反応バッファーおよびヌクレアーゼフリーの水などの標準的な公知の試薬は示されていないが、含まれ得る。この実施例において、変換反応から放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ１」およびｓｓＤＮＡ「Ｕ２」は、下流のユニバーサルＬＡＭＰ反応のためのＦ３プライマーおよびＢ３プライマーとしてそれぞれ機能する。実装の優先度に応じて、ｓｓＤＮＡ「Ｕ１」および「Ｕ２」は、最適なアッセイパフォーマンスのための必須のＬＡＭＰプライマーの任意の対として機能するように設計され得る。
【0110】
[0050]図７は、複数の標的の検出における「論理ＡＮＤ」演算をサポートするマルチプレックスユニバーサルＬＡＭＰ反応を示している。ユニバーサルＬＡＭＰ反応の目的は、事前設計された高度に最適化されたＬＡＭＰ反応を迅速に開始させるために、変換反応からのｓｓＤＮＡ「Ｕ１」およびｓｓＤＮＡ「Ｕ２」の同時放出を感知することであり、この結果は、例えば、ｐＨに基づく比色分析のリードアウトの単純で迅速な目視検査によって容易に解釈され得る。
【0111】
[0051]ステップ（ａ）は、ユニバーサルテンプレート上のプライマー結合部位Ｆ２ｃを介する、ユニバーサルテンプレートとＦＩＰプライマーとの間のハイブリダイゼーション反応を示している。ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で生じた核酸複合体のＦ２の３’末端から開始される重合反応を示している。ステップ（ｃ）は、ユニバーサルテンプレート上のプライマー結合部位
【0112】
【数35】
【0113】
を介する、変換反応から放出されたｓｓＤＮＡ「Ｕ１」とステップ（ｂ）で生じた核酸複合体との間のハイブリダイゼーション反応を示している。ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）で生じた核酸複合体の
【0114】
【数36】
【0115】
の３’末端から開始される鎖置換重合反応を示しており、置換されたｓｓＤＮＡは、その５’末端にループ構造を有する核酸複合体を形成している。ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）で生じた核酸複合体上のプライマー結合部位Ｂ２ｃおよびＵ２ｃをそれぞれ介する、変換反応から放出されたＢＩＰプライマーおよびｓｓＤＮＡ「Ｕ２」と前記複合体との間のハイブリダイゼーションを示している。ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）で生じた核酸複合体のＢ２の３’末端から開始される鎖置換重合反応、およびステップ（ｅ）で生じた核酸複合体のＵ２の３’末端から開始される鎖置換重合反応を示しており、置換されたｓｓＤＮＡは、両末端にループ構造を有する核酸複合体を形成している。ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）で生じた核酸複合体上のプライマー結合部位Ｆ２ｃ、Ｂ２ｃ、ＦＬＰ、およびＢＬＰをそれぞれ介する、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＦプライマー、およびループＢプライマーと前記複合体とのハイブリダイゼーションを示している。そしてステップ（ｈ）は、ステップ（ｇ）で生じた核酸複合体のＦＩＰの３’末端、ループＢの３’末端、ＢＩＰの３’末端、およびループＦの３’末端からそれぞれ開始される鎖置換重合反応によって促進される、ＬＡＭＰの自己推進型の自己循環増幅を示している。
【0116】
[0052]図５に示されている「論理ＯＲ」の態様、および図６に示されている「論理ＡＮＤ」の態様は、このような論理演算をもたらすためにどのように変換およびＬＡＭＰ反応の構成要素が構成され得るかを示す例であるが、本発明の使用は、これらの例のみに限定されるわけではない。例えば、「論理ＯＲ」演算では、それぞれが異なる核酸標的に向けられているが、それぞれがそのそれぞれの標的核酸の存在下で同一のＬＡＭＰプライマーを生じさせるように構成されている、あらゆる数の追加のプライマーサブセットが含まれ得る。
【0117】
[0053]「論理ＡＮＤ」演算では、それぞれが異なる核酸標的に向けられており、かつそれぞれがそのそれぞれの標的核酸の存在下で異なるＬＡＭＰプライマーを生じさせるように構成されている、最大６つのプライマーサブセットが含まれ得る。最大６つのこのようなプライマーサブセットが含まれ得るのは、生じる可能性のあるＬＡＭＰプライマーのそれぞれが、ユニバーサルＬＡＭＰテンプレートの６つのＬＡＭＰプライマーの１つに対応し得るためである。一部の態様は、その代わりに、ループＦプライマーおよびループＢプライマーを除いた、最大４つのこのようなプライマーサブセットを使用し得、その場合、ループＦプライマーおよびループＢプライマーは代わりに、ＬＡＭＰ反応を「加速させる」それらの機能が確実に完全に利用されるように、直接加えられ得る。
【0118】
[0054]一部の態様は、「論理ＡＮＤ」決定と組み合わせた「論理ＯＲ」決定のために構成され得る。例えば、一態様は、１セットのＡＮＤ関係と１つまたは複数のネスト化されたＯＲ関係を含み得る。例えば、プライマーサブセット（ａ１）は、その核酸標的の存在下でＬＡＭＰプライマー（Ａ）を生じさせるように構成され得、また任意選択で、１つまたは複数の異なるプライマーサブセット（ａ２、ａ３、ａ４など）もそれぞれ同様に、そのそれぞれの核酸標的の存在下でＬＡＭＰプライマー（Ａ）を生じさせるように構成されている。そのそれぞれの核酸標的の存在下でＬＡＭＰプライマー（Ａ）を生じさせるようにそれぞれが構成されている、任意の数の追加の（ａ）タイププライマーのサブセットが含まれ得る。態様はまた、その核酸標的の存在下で異なるＬＡＭＰプライマー（Ｂ）を生じさせるように構成されているプライマーサブセット（ｂ１）、および任意選択で、それぞれが同様にそのそれぞれの核酸標的の存在下でＬＡＭＰプライマー（Ｂ）を生じさせるように構成されている１つまたは複数の異なるプライマーサブセット（ｂ２、ｂ３、ｂ４など）を含み得る。そのそれぞれの核酸標的の存在下でＬＡＭＰプライマー（Ｂ）を生じさせるようにそれぞれが構成されている、任意の数の追加の（ｂ）タイププライマーのサブセットもまた含まれ得る。
【0119】
[0055]このような態様は、ＬＡＭＰプライマー（Ａ）およびＬＡＭＰプライマー（Ｂ）の両方が生じる場合にのみＬＡＭＰ反応が進行するため、ＡＮＤ論理を組み込んでいる。この態様はまた、（ａ）タイププライマーのサブセットと関連する核酸標的の少なくとも１つが存在する場合にはＬＡＭＰプライマー（Ａ）が生じ、また、（ｂ）タイププライマーのサブセットと関連する核酸標的の少なくとも１つが存在する場合にはＬＡＭＰ（Ｂ）プライマーが生じるため、ＯＲ論理も組み込んでいる。
【0120】
[0056]一部の態様は、追加のＡＮＤ関係を組み込み得る。例えば、そのそれぞれの核酸標的の存在下でＬＡＭＰプライマー（Ｃ）を生じさせるようにそれぞれが構成されている、１つまたは複数の（ｃ）タイププライマーサブセットが含まれ得る。ＬＡＭＰ反応は、ＬＡＭＰプライマー（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）の各々が生じる場合にのみ進行する。上記のように、最大６つ（または一部の態様では最大４つ）のＬＡＭＰプライマーがこの様式で生じ、各ＬＡＭＰプライマーは、ＯＲ関係を有する複数のプライマーサブセットを任意選択で含み得る。
追加の用語および定義
[0057]本開示のある特定の態様が、具体的な構造、パラメータ、構成要素、要素などを参照して詳細に記載されてきたが、これらの記載は例示的なものであり、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものとは解釈されない。
追加の用語および定義
[0057]本開示のある特定の態様が、具体的な構造、パラメータ、構成要素、要素などを参照して詳細に記載されてきたが、これらの記載は例示的なものであり、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものとは解釈されない。
【0121】
[0058]さらに、記載されている態様の構成要素のあらゆる所与の要素について、別段のことが暗示的にまたは明確に述べられていない限り、その要素または構成要素について列挙されている考えられる代替物のいずれも、個別にまたは互いに組み合わせて一般に使用され得ることが理解されるべきである。
【0122】
[0059]加えて、別段の指示がない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される、量、構成成分、距離、または他の測定値を表す数は、「約」という用語またはその類義語によって任意選択で修飾されていると理解される。「約」、「およそ」、「実質的に」、またはこれらに類する用語が、言及されている量、値、または条件と組み合わせて使用されている場合、これは、言及されている量、値、または条件の２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満の偏差がある量、値、または条件を意味すると解釈され得る。最低でも、また、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限しようとするわけではないが、各数値的パラメータは、報告されている有効数字の数に照らして、および通常の丸め技術を適用することによって、解釈されるべきである。
【0123】
[0060]本明細書において使用されるあらゆる見出しおよび副見出しは、組織化する目的のためにすぎず、明細書の範囲または特許請求の範囲を限定するために使用されることを意図したものではない。
【0124】
[0061]本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、複数形の指示対象を排除しないことにも留意されたい。したがって、例えば、単数形の指示対象（例えば「ウィジェット」）を参照する態様は、２つ以上のこのような指示対象も含み得る。
【0125】
[0062]本明細書において記載される態様が、本明細書において記載される他の態様において記載されている特性、特徴（例えば、成分、構成要素、メンバー、要素、パーツ、および／または部分）を含み得ることも理解される。したがって、所与の態様の様々な特徴は、本開示の他の態様と組み合わされ得る、および／または本開示の他の態様に組み込まれ得る。したがって、本開示の具体的な態様に関連するある特定の特徴の開示は、前記特徴の適用または包含を前記具体的な態様に限定すると解釈されるべきではない。むしろ、他の態様もまた、このような特徴を含み得ることが理解される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【国際調査報告】