▶ ニューラクル ジェネティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-08
(54)【発明の名称】新規なデュアルヘルパープラスミド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240426BHJP
C12N 15/64 20060101ALI20240426BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240426BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240426BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 100Z
C12N15/64 Z ZNA
C12N7/01
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573241
(86)(22)【出願日】2022-05-27
(85)【翻訳文提出日】2023-11-27
(86)【国際出願番号】 KR2022007553
(87)【国際公開番号】W WO2022250491
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】10-2021-0068364
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】17/750,241
(32)【優先日】2022-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520288331
【氏名又は名称】ニューラクル ジェネティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ハン，ジュ ソク
(72)【発明者】
【氏名】コン，フン ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ユン ヒョン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA23
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス生産用デュアルヘルパープラスミドに関する。本発明のデュアルヘルパープラスミドを用いた二重形質感染方法は、伝統的なアデノ随伴ウイルス生産に用いられる三重形質感染方法と比較して、１）同時形質感染確率の増加、２）組換えアデノ随伴ウイルスの生産率増加、３）プラスミド生産及び精製にかかる費用及び時間減少などの長所から、遺伝子治療剤の効率的生産に有用に活用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が順次に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に時計回り方向に（５’から３’に）位置することを特徴とする、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含むデュアルヘルパープラスミド。
【請求項2】
前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結されることを特徴とする、請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項3】
Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が順次に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に反時計回り方向に（３’から５’に）位置することを特徴とする、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含むデュアルヘルパープラスミド。
【請求項4】
前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結されることを特徴とする、請求項３に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項5】
前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子の３’末端は前記ｃａｐ遺伝子の５’末端に連結されることを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項6】
前記Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、図５Ａの開裂地図（ｃｌｅａｖａｇｅ ｍａｐ）のように配列されたことを特徴とする、請求項１、２及び５のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項7】
前記Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、図５Ｂの開裂地図のように配列されたことを特徴とする、請求項３～５のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項8】
前記ｒｅｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ２，ＡＡＶ２）由来のｒｅｐ２遺伝子を含むことを特徴とする、請求項５～７のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項9】
前記ｒｅｐ２遺伝子は、配列番号２９に提示された配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項10】
前記ｃａｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２；ｃａｐ２）、血清型５（ＡＡＶ５；ｃａｐ５）、血清型８（ＡＡＶ８；ｃａｐ８）、又は血清型９（ＡＡＶ９；ｃａｐ９）由来のｃａｐ遺伝子を含むことを特徴とする、請求項５～９のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項11】
前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３に提示された配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項12】
前記Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＥ２ａ遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１～１１のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項13】
前記Ｅ２ａ遺伝子は、配列番号３４に提示された配列を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項14】
前記Ｅ４遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＥ４遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１～１３のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項15】
前記Ｅ４遺伝子は、配列番号３５に提示された配列を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項16】
前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１～１５のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項17】
前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、配列番号３６に提示された配列を含むことを特徴とする、請求項１６に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項18】
調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドであって、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含むことを特徴とするデュアルヘルパープラスミド：（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３０に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【請求項19】
調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドであって、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含むことを特徴とするデュアルヘルパープラスミド：（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３１に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【請求項20】
調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドであって、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含むことを特徴とするデュアルヘルパープラスミド：（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３２に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【請求項21】
調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドであって、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含むことを特徴とするデュアルヘルパープラスミド：（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３３に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【請求項22】
前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、時計回り方向であることを特徴とする、請求項１８～２１のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項23】
前記ｒｅｐ遺伝子の５’末端が前記Ｅ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、前記ｒｅｐ遺伝子の３’末端が前記ｃａｐ遺伝子の５’末端に連結され、前記ｃａｐ遺伝子の３’末端が前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結されることを特徴とする、請求項２２に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項24】
前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、反時計回り方向であることを特徴とする、請求項１８～２１のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項25】
前記ｒｅｐ遺伝子の５’末端が前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結され、前記ｒｅｐ遺伝子の３’末端が前記ｃａｐ遺伝子の５’末端に連結され、前記ｃａｐ遺伝子の３’末端が前記Ｅ２ａ遺伝子の５’末端に連結されることを特徴とする、請求項２４に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項26】
抗生剤抵抗性遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１～２５のいずれかに記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項27】
前記抗生剤抵抗性遺伝子は、アンピシリン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子又は両方を含むことを特徴とする、請求項２６に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項28】
前記アンピシリン抵抗性遺伝子は、配列番号３７に提示された配列を含むことを特徴とする、請求項２７に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項29】
前記カナマイシン抵抗性遺伝子は、配列番号３８に提示された配列を含むことを特徴とする、請求項２７に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項30】
請求項１～２７のいずれか一項のデュアルヘルパープラスミドを含む組成物。
【請求項31】
追加プラスミドをさらに含むことを特徴とする、請求項３０に記載の組成物。
【請求項32】
前記追加プラスミドは、ＡＡＶ構築物プラスミドであることを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記追加プラスミドは、下記を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の組成物：（ａ）逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）；
（ｂ）外来遺伝子；及び
（ｃ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素。
【請求項34】
前記調節要素は、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、エクソン（ｅｘｏｎ）配列、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）配列、スプライシング供与体（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ）又は受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）配列、ｍｉＲＮＡ標的（ｔａｒｇｅｔ）配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＷＰＲＥ）配列、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ，ｐＡ）配列又はこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記外来遺伝子は、野生型ポリペプチド又はその任意の変異体、融合タンパク質、抗体又はその抗原－結合断片、ＲＮＡ－ベース分子又はその任意の組合せをエンコードすることを特徴とする、請求項３０～３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項36】
請求項１～２９のいずれか一項のデュアルヘルパープラスミド又は請求項３０～３５のいずれか一項の組成物を含む細胞。
【請求項37】
第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を変形させる段階を含む組換えＡＡＶ生産方法であって、前記第１プラスミドは、請求項１～２９のいずれか一項のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは、外来遺伝子を含むことを特徴とする方法。
【請求項38】
前記変形させる段階は、前記細胞を前記第１プラスミド及び第２プラスミドで形質感染させる段階を含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記生産された組換えＡＡＶを分離する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項40】
第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を変形させる段階を含む組換えＡＡＶの生産収率を増加させる方法であって、前記第１プラスミドは、請求項１～２９のいずれか一項のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは、外来遺伝子を含み、前記変形後生産された組換えＡＡＶの量は、対照方法で生産された相応する量と比較して増加することを特徴とする方法。
【請求項41】
前記対照方法は、下記３種の別途のプラスミドを含むように該当の細胞を変形させる段階を含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法：ｉ）Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をエンコードする遺伝子を含むＲｅｐ－Ｃａｐプラスミド；ｉｉ）アデノウイルスのタンパク質（Ｅ２ａ、Ｅ４）及びＶＡ ＲＮＡをエンコードする遺伝子を含むヘルパープラスミド；及び、ｉｉｉ）外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミド。
【請求項42】
前記生産された組換えＡＡＶの量が、前記対照方法を用いて生産された相応する量と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍又は少なくとも約５０倍増加したことを特徴とする、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項43】
請求項４０～６２のいずれか一項の方法によって生産された組換えＡＡＶ。
【請求項44】
請求項４３の組換えＡＡＶ及び薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む薬剤学的剤形。
【請求項45】
請求項４３の組換えＡＡＶ又は請求項４４の薬剤学的剤形を対象体に投与する段階を含む、それを必要とする対象体において疾病又は障害を治療する方法。
【請求項46】
それを必要とする対象体の疾病又は障害治療用の請求項４３の組換えＡＡＶ又は請求項４４の薬剤学的剤形。
【請求項47】
それを必要とする対象体の疾病又は障害治療用薬剤の製造における請求項４３の組換えＡＡＶ又は請求項４４の薬剤学的剤形の用途。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、遺伝子伝達体である組換えＡＡＶ生産用の新規なデュアルヘルパープラスミドに関する。
本発明は、遺伝子伝達体である組換えＡＡＶ生産用の新規なデュアルヘルパープラスミドに関する。
【0002】
［背景技術］
アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）は一本鎖ＤＮＡウイルスで、増殖のためにアデノウイルスなどの手助けが必要なヘルパー依存型パルボウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）に属する。これは、ゲノムサイズが約４．７ｋｂｐである非病原性ウイルスであり、細胞性免疫反応を誘導しない。感染対象は血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）によって大きく異なり、ウイルスは、非分裂（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ）及び分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）細胞に遺伝子を伝達することができる。特に、ＡＡＶによって伝達される遺伝子の発現は、生体内で長期間持続する［１－３］。
アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）は一本鎖ＤＮＡウイルスで、増殖のためにアデノウイルスなどの手助けが必要なヘルパー依存型パルボウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）に属する。これは、ゲノムサイズが約４．７ｋｂｐである非病原性ウイルスであり、細胞性免疫反応を誘導しない。感染対象は血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）によって大きく異なり、ウイルスは、非分裂（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ）及び分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）細胞に遺伝子を伝達することができる。特に、ＡＡＶによって伝達される遺伝子の発現は、生体内で長期間持続する［１－３］。
【0003】
一般に、組換えアデノ随伴ウイルスは、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）の三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって生産される［４］。三重形質感染を用いた組換えＡＡＶ生産は、１）ＩＴＲ（逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ））で囲まれた遺伝子発現カセットを持つＡＡＶ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）プラスミド、２）アデノ随伴ウイルスゲノムの複製に必要なＲｅｐタンパク質とウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を構成するカプシド（ｃａｐｓｉｄ）タンパク質を提供する「Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド」、最後に、３）アデノ随伴ウイルスの生活環（ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ）に役立つアデノウイルスのタンパク質（Ｅ２ａ、Ｅ４）及びＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を提供する「ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）プラスミド」が必要である。この３種のプラスミドが、アデノウイルスのＥ１及びＥ３遺伝子を提供するＨＥＫ２９３細胞株などに形質感染されるとアデノ随伴ウイルスが生産される［５］。
【0004】
上述した３種のプラスミドが同時に形質感染された細胞でのみ組換えアデノ随伴ウイルスベクターが生産される。もし、２種のプラスミドを一つに合わせて二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）をすると同時形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の確率が高くなり、結果として組換えアデノ随伴ウイルスの生産率が高まるであろう［６，７］。また、組換えアデノ随伴ウイルスを生産する上で必要なプラスミドの数が３種から２種に減ると、プラスミドを生産及び精製するのにかかる時間と費用も節約されるであろう［８］。
【0005】
組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を保有せず、アデノウイルス由来遺伝子を有していないため、生体内で複製不可である［９］。
【0006】
しかしながら、デュアルヘルパープラスミドを作る過程で、Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドとヘルパープラスミドとを合わせる方法によってプラスミド内のｒｅｐ、ｃａｐ、Ｅ２、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の相対的な位置が変わるが、これは、それぞれの遺伝子発現にそれぞれ異なる程度の影響を与えてしまい、生産性に及ぼす結果が非常に予測し難い。
【0007】
このため、組換えアデノ随伴ウイルスベクターの形質感染確率及びこれによる組換えアデノ随伴ウイルスの生産率を増加させるとともに、生産及び精製にかかる時間及び費用を低減するように考案された操作デュアルヘルパープラスミド及びその製造方法が切実に望まれている。
【0008】
［先行技術文献］
［非特許文献］
非特許文献１］ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７．３１（４）：３１７－３３４．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍ．Ｆ．Ｎａｓｏ，Ｂ．Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｗ．Ｌ．Ｐｅｒｒｙ３ｒｄ，Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ．
［非特許文献２］Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｓａｆ．２００２．１（１）：７９－９１．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｐ．Ｅ．Ｍｏｎａｈａｎ，Ｋ．Ｊｏｏｓｓ，Ｍ．Ｓ．Ｓａｎｄｓ．
［非特許文献３］Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９６．３（８）：６５８－６８．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）－ＣＦＴＲ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｌｕｎｇ．Ｃ．Ｋ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｓ．Ｓ．Ａｌｌｅｎ，Ｓ．Ａ．Ａｆｉｏｎｅ，Ｔ．Ｃ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｓ．Ｅ．Ｂｅｃｋ，Ｍ．Ｆｅｅ－Ｍａｋｉ，Ｘ．Ｂａｒｒａｚｚａ－Ｏｒｔｉｚ，Ｒ．Ａｄａｍｓ，Ｆ．Ｂ．Ａｓｋｉｎ，Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｂ．Ｇｕｇｇｉｎｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献４］Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９８．７２（３）：２２２４－２２３２．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｊ．Ｌｉ，Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ．
［非特許文献５］Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１０．２（８）：１６８１－１７０３．Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉ．Ｋｏｖｅｓｄｉ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｅｄｌｅｙ．
［非特許文献６］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８．９（１８）：２７４５－２７６０．Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｋ．Ｒｉｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献７］Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３．７（６）：８３９－８５０．Ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ，ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ，ａｎｄ ｔｗｏ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ ｔｏ ６．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｍ．Ａ．Ｋａｙ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献８］Ｂｉｏｒｅｓ．Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ．２０２０．９（１）：２１９－２２８．Ｔｗｏ－Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ．Ｑ．Ｔａｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｋｅｅｌｅｒ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｑ．Ｓｕ，Ｚ．Ｌｙｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．Ｇａｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献９］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１７．２８（１１）：１０７５－１０８６ Ｓｍａｌｌ Ｂｕｔ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ Ｍｉｇｈｔｙ：Ｌａｔｅｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｈ．Ｂｕｅｎｉｎｇ．
［発明の概要］
［課題を解決するための手段］
［非特許文献］
非特許文献１］ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７．３１（４）：３１７－３３４．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍ．Ｆ．Ｎａｓｏ，Ｂ．Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｗ．Ｌ．Ｐｅｒｒｙ３ｒｄ，Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ．
［非特許文献２］Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｓａｆ．２００２．１（１）：７９－９１．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｐ．Ｅ．Ｍｏｎａｈａｎ，Ｋ．Ｊｏｏｓｓ，Ｍ．Ｓ．Ｓａｎｄｓ．
［非特許文献３］Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９６．３（８）：６５８－６８．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）－ＣＦＴＲ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｌｕｎｇ．Ｃ．Ｋ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｓ．Ｓ．Ａｌｌｅｎ，Ｓ．Ａ．Ａｆｉｏｎｅ，Ｔ．Ｃ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｓ．Ｅ．Ｂｅｃｋ，Ｍ．Ｆｅｅ－Ｍａｋｉ，Ｘ．Ｂａｒｒａｚｚａ－Ｏｒｔｉｚ，Ｒ．Ａｄａｍｓ，Ｆ．Ｂ．Ａｓｋｉｎ，Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｂ．Ｇｕｇｇｉｎｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献４］Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９８．７２（３）：２２２４－２２３２．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｊ．Ｌｉ，Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ．
［非特許文献５］Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１０．２（８）：１６８１－１７０３．Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉ．Ｋｏｖｅｓｄｉ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｅｄｌｅｙ．
［非特許文献６］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８．９（１８）：２７４５－２７６０．Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｋ．Ｒｉｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献７］Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３．７（６）：８３９－８５０．Ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ，ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ，ａｎｄ ｔｗｏ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ ｔｏ ６．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｍ．Ａ．Ｋａｙ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献８］Ｂｉｏｒｅｓ．Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ．２０２０．９（１）：２１９－２２８．Ｔｗｏ－Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ．Ｑ．Ｔａｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｋｅｅｌｅｒ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｑ．Ｓｕ，Ｚ．Ｌｙｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．Ｇａｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献９］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１７．２８（１１）：１０７５－１０８６ Ｓｍａｌｌ Ｂｕｔ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ Ｍｉｇｈｔｙ：Ｌａｔｅｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｈ．Ｂｕｅｎｉｎｇ．
［発明の概要］
［課題を解決するための手段］
【0009】
本発明は、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は順次に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に時計回り方向に（５’から３’に）位置する。
【0010】
本発明は、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は順次に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に反時計回り方向に（３’から５’に）位置する。
【0011】
本発明は、調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３０に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３０に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0012】
本発明は、調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３１に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３１に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0013】
本発明は、調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３２に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３２に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0014】
本発明は、調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３３に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３３に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0015】
本発明は、本発明のデュアルヘルパープラスミドを含む組成物を提供する。
【0016】
本発明は、本発明のデュアルヘルパープラスミド又は組成物を含む細胞を提供する。
【0017】
本発明は、第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を変形させる段階を含む組換えＡＡＶを製造する方法を提供し、前記第１プラスミドは本発明のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは外来遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含む。
【0018】
本発明は、第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を変形させる段階を含む組換えＡＡＶの生産収率を増加させる方法を提供し、前記第１プラスミドは本発明のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは外来遺伝子を含み、前記変形後に生産された組換えＡＡＶの量は、基準方法で生産された相応する量と比較して増加する。
【0019】
本発明は、本発明の方法によって生産された組換えＡＡＶを提供する。
【0020】
本発明は、本発明の組換えＡＡＶ及び薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む薬剤学的製剤を提供する。
【0021】
本発明は、本発明の組換えＡＡＶ又は薬剤学的製剤を対象体に投与する段階を含む、それを必要とする対象体において疾病又は障害を治療する方法を提供する。
【0022】
本発明は、それを必要とする対象体において疾病又は障害を治療するための薬物の製造における本発明の組換えＡＡＶ又は薬剤学的製剤の用途を提供する。
【0023】
［図面の簡単な説明］
［図１］図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ａは、三重形質感染のためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を概略的に示し、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。図１Ｆは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の開始部分とＥ４遺伝子の末端部分との間に存在するＡｓｉＳＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を概略的に示す。
［図１］図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ａは、三重形質感染のためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を概略的に示し、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。図１Ｆは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の開始部分とＥ４遺伝子の末端部分との間に存在するＡｓｉＳＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を概略的に示す。
【0024】
［図２］アデノ随伴ウイルスベクター血清型２（ＡＡＶ２）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ２構築物の開裂地図を示す。ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造した。
【0025】
［図３］アデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ９構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ９構築物を製造した。
【0026】
［図４］アデノ随伴ウイルスベクター血清型５（ＡＡＶ５）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ５Ｋ構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
【0027】
［図５］図５Ａ及び図５Ｂは、ｐＨＮＧ及びｐＨＮＧＲ構築物の開裂地図を示す。図５Ａは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に正方向に挿入されたｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子断片を示し、図５Ｂは、逆方向に挿入されたｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子断片を示す。
【0028】
［図６］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【0029】
［図７］浮遊細胞株（Ｅｘｐｉ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【0030】
［図８］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ２生産量増加の効果を観察した結果である。
【0031】
［図９］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ９生産量増加の効果を観察した結果である。
【0032】
［図１０］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ５生産量増加の効果を観察した結果である。
【0033】
［図１１］三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物で二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）して生産されたＡＡＶ８間の細胞形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性結果である。
【0034】
［図１２］三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ２構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ２間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【0035】
［図１３］三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ９構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ９間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【0036】
［発明を実施するための形態］
本発明は、組換えＡＡＶを生産するための組成物及び方法、並びに疾患又は障害を治療するための前述のｒＡＡＶの用途に関する。本明細書に述べているように、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、複数の遺伝子（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を含む。本出願人は、特定構成で多重遺伝子を配列することによって、組換えＡＡＶ生産時に収率又は生産性が増加又は減少し得ることを確認した。本発明の他の側面は本出願全体にわたって提供される。
本発明は、組換えＡＡＶを生産するための組成物及び方法、並びに疾患又は障害を治療するための前述のｒＡＡＶの用途に関する。本明細書に述べているように、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、複数の遺伝子（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を含む。本出願人は、特定構成で多重遺伝子を配列することによって、組換えＡＡＶ生産時に収率又は生産性が増加又は減少し得ることを確認した。本発明の他の側面は本出願全体にわたって提供される。
【0037】
Ｉ．定義
本発明全般にわたって用語「一つ」又は「一」は、当該エンティティのうち一つ以上を意味する。例えば、「一つのポリペプチド」は、一つ以上のポリペプチドを表すものと理解される。このように、用語「一つ」（又は、「一」）、「一つ以上」及び「少なくとも一つ」は、本明細書において相互互換的に使われてよい。
本発明全般にわたって用語「一つ」又は「一」は、当該エンティティのうち一つ以上を意味する。例えば、「一つのポリペプチド」は、一つ以上のポリペプチドを表すものと理解される。このように、用語「一つ」（又は、「一」）、「一つ以上」及び「少なくとも一つ」は、本明細書において相互互換的に使われてよい。
【0038】
また、本明細書で使われる「及び／又は」は、他のものがあるか又はない２つの明示された特徴又は構成要素のそれぞれの特定開示として見なされるべきである。したがって、本明細書において、「Ａ及び／又はＢ」のような句において使われる用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」のような句において使われる用語「及び／又は」は、次のそれぞれの側面を含むように意図される：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
【0039】
数字又は一連の数字の前における「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接した数字及び論理的に含まれ得る文脈において明確に全ての後続数字又は整数を含むものと理解される。例えば、核酸分子のヌクレオチド数は整数でなければならない。例えば、「２１－ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８個ヌクレオチド」は、１８個、１９個、２０個又は２１個ヌクレオチドが表示された特性を有するということを意味する。少なくとも一連の数字又は範囲の前にある場合に、「少なくとも」は、一連の数字又は範囲の各数字を修正し得るものと理解される。「少なくとも」は整数に限定されない（例えば、「少なくとも５％」は、有效数字の数を考慮せず、５．０％、５．１％、５．１８％を含む。）。
【0040】
本明細書において、「含む」という用語で記述される場合に、「構成される」及び／又は「本質的に構成される」との用語で記述される類似の形態も提供されるものと理解される。
【0041】
特に断らない限り、本明細書に使われる全ての技術及び科学用語は、本発明に係る技術の分野における通常の技術者が一般に理解するものと同じ意味を有する。例えば、文献（Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）は、本明細書で使われる多数の用語の一般的な意味を当業者に提供する。
【0042】
単位、接頭辞及び記号は、ＳＩ（Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ）許容形式で表示される。数字範囲には、範囲を限定する数字が含まれる。特に表示されない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向へと左側から右側に記録される。本明細書に提供された題目は、明細書全体を参照して有し得る本発明の様々な側面の制限ではない。したがって、下記定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【0043】
用語「約」は、本明細書において概略、凡そ、周辺又は領域を意味するもので使われる。「約」という用語が数値範囲と共に使われる場合に、これは、明示された数値の上下に境界を拡張して当該範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、例えば１０％の変動によって、上又は下に（より高かい又は低い）明示された値の上下に数値を修正し得る。
【0044】
本明細書で使われる用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、ＡＡＶ類型１、ＡＡＶ類型２、ＡＡＶ類型３（類型３Ａ及び３Ｂを含む。）、ＡＡＶ類型４、ＡＡＶ類型５、ＡＡＶ類型６、ＡＡＶ類型７、ＡＡＶ類型８、ＡＡＶ類型９、ＡＡＶ類型１０、ＡＡＶ類型１１、ＡＡＶ類型１２、ＡＡＶ類型１３、ＡＡＶｒｈ．７４、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）ＡＡＶ、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）ＡＡＶ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）ＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、これらののＡＡＶ血清型と系統物（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４）） ａｎｄ Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４））、及び現在知られている或いは後に発見される他のＡＡＶを含むが、これに限定されない（例えば、文献（ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照）。一部の側面において、「ＡＡＶ」は、公知のＡＡＶの誘導体を含む。一部の側面において、「ＡＡＶ」は、修正された又は人工のＡＡＶを含む。
【0045】
用語「投与」、「投与する」及びその類義語は、組成物（例えば、本発明のデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶ伝達体ベクター）を、薬学的に許容可能な経路を通じて対象体に導入することを意味する。対象体に組成物を導入することは、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）、経口、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｉｌｙ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ）、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）（静脈内（ｉｎｔａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、動脈内（ｉｎｔｒａ－ａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）又は皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ））、直腸内（ｒｅｃｔａｌｌｙ）、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、脊髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）、眼球周囲（ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒｌｙ）又は局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）を含む任意の適切な経路による。投与は、自己投与と他人による投与が含まれる。適切な投与経路は、組成物又は作用剤が意図した機能を果たすようにする。例えば、適切な経路が静脈内である場合に、組成物又は作用剤を対象体の静脈に導入することによって組成物を投与する。
【0046】
本発明において、「抗生剤抵抗性遺伝子（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ）」とは、微生物が抗生剤に露出されても生存できるように薬物耐性を付与する目的でプラスミドに挿入された遺伝子を意味する。本出願に記載されているように、一部の側面において、クローニングを用いて所望のプラスミドを有する細胞をスクリーニングするために抗生剤抵抗性遺伝子をプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）に導入できる。本発明に有用な抗生剤抵抗性遺伝子の例は、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、エリスロマイシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、スルファジアジン（Ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ）及びトリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）抵抗性遺伝子を含むが、これに限定されない。
【0047】
また、本明細書に記述されているように、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、特定配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）／構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）でデュアルヘルパープラスミドと一緒に存在するｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む。一部の側面において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、「時計回り方向（ｃｌｏｃｋｗｉｓｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」、「正方向（ｆｏｒｗａｒｄ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」又は「５’→３’」（例えば、図５Ａを参照）であり、これは、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が、時計回り方向に、又は複製が始まる部位（５’）から複製が終る部位（３’）への方向に挿入又は含まれることを意味する。一部の側面において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、「反時計回り方向（ｃｏｕｎｔｅｒｃｌｏｃｋｗｉｓｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」、「逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」又は「３’→５’」（例えば、図５Ｂを参照）であり、これは、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が、反時計回り方向に、又は複製が終わる部位（３’）から複製が始まる部位（５’）への方向に挿入又は含まれることを意味する。
【0048】
本明細書において、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、一つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をエンコードする遺伝子を意味し、前記ＯＲＦは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質又はその変異体又は誘導体をエンコードする。このようなＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（又は、その変異体又は誘導体）は、ＡＡＶゲノム複製及び／又はＡＡＶゲノムパッケージングに関与し、野生型ｒｅｐ遺伝子は、４種のＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をエンコードする。特記しない限り、「ｒｅｐ遺伝子」は、野生型ｒｅｐ遺伝子、その誘導体及び同等な機能を有する人工ｒｅｐ遺伝子を含む。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）に由来するｒｅｐ２遺伝子であってよい。一部の側面において、ｒｅｐ２遺伝子は、配列番号２９に提示された核酸配列を含む。
【0049】
本明細書において、用語「ｃａｐ遺伝子」は、一つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をエンコードする遺伝子を意味し、ＯＲＦは、ＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質、又はその変異体又は誘導体をエンコードする。４個のタンパク質がｃａｐ遺伝子から翻訳される。そのうち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質は、ＡＡＶ粒子を構成する構造タンパク質であり、ＡＡＰ（ａｓｓｅｍｂｌｙ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、構造タンパク質によるＡＡＶ粒子の形成（組立て）を促進する。特記しない限り、「ｃａｐ遺伝子」は、野生型キャップ遺伝子、その誘導体及びこれと同等な機能を有する人工キャップ遺伝子を含む。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２；ｃａｐ２）、血清型５（ＡＡＶ５；ｃａｐ５）、血清型８（ＡＡＶ８；ｃａｐ８）又は血清型９（ＡＡＶ９；ｃａｐ９）に由来するｃａｐ遺伝子である。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子は、配列番号３０（ｃａｐ２）、配列番号３１（ｃａｐ５）、配列番号３２（ｃａｐ８）又は配列番号３３（ｃａｐ９）に提示された核酸配列を含む。
【0050】
本明細書において、用語「Ｅ２ａ遺伝子」は、ＡＡＶのプロモーターを調節し、ＡＡＶゲノム複製を手伝い、Ｒｅｐ ｍＲＮＡのスプライシングとカプシドｍＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の増大によるカプシドタンパク質の生産性増加に関与するアデノウイルスのタンパク質Ｅ２ａをコードする遺伝子を意味する。特記しない限り、「Ｅ２ａ遺伝子」は、野生型Ｅ２ａ遺伝子、その誘導体及びこれと同等な機能を有する人工Ｅ２ａ遺伝子を含む。本発明の具体的な実施例において、前記Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＥ２ａ遺伝子である。一部の側面において、前記Ｅ２ａ遺伝子は、配列番号３４に提示された核酸配列を含む。
【0051】
本明細書において、用語「Ｅ４遺伝子」は、ＡＡＶの生活環においてＡＡＶゲノムの第二鎖（ｓｅｃｏｎｄ－ｓｔｒａｎｄ）の合成に関与し、ＡＡＶゲノムの複製を抑制する細胞内機序を担当するＭＲＮ（Ｍｒｅ１１－Ｒａｄ５０－Ｎｂｓ１）コンプレックス形成抑制によってＡＡＶゲノムの複製を手伝うアデノウイルスのタンパク質Ｅ４をコードする遺伝子を意味する。特記しない限り、「Ｅ４遺伝子」は、野生型Ｅ４遺伝子、その誘導体及び同等な機能を有する人工Ｅ４遺伝子を含む。一部の側面において、Ｅ４遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来するＥ４遺伝子である。一部の側面において、Ｅ４遺伝子は、配列番号３５に提示された核酸配列を含む。
【0052】
本明細書において、用語「ＶＡ ＲＮＡ遺伝子」又は「ＶＡ ＲＮＡ領域」は、ＡＡＶカプシドｍＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）増加及び翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）効率性を向上させ、Ｒｅｐ５２タンパク質の分解防止を手伝うＶＡ ＲＮＡを生産するＶＡ領域を意味する。特記しない限り、「ＶＡ ＲＮＡ遺伝子」は、野生型ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、その誘導体及び同等な機能を有する人工ＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。一部の側面において、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子である。一部の側面において、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、配列番号３６に提示された核酸配列を含む。
【0053】
本明細書において、用語「保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」は、それぞれ比較される２個以上の配列の同じ位置で変更されずに発生するポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を意味する。相対的に保存されたヌクレオチド又はアミノ酸は、配列の他の箇所に現れるヌクレオチド又はアミノ酸に比べて、より関連した配列間に保存されたものである。
【0054】
本明細書において、用語「調節要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、作動可能に連結された核酸（例えば、外来遺伝子）の発現を調節（例えば、増加又は減少）する核酸配列を意味する。適切な調節要素の非制限的な例は、本発明の他のところで提供される。
【0055】
一部の側面において、２個以上の配列が互いに１００％同一である場合に、「完全に保存された（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」又は「同一である（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」ことを表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である場合に、「高度に保存された（ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」と表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約９９％同一である場合に、「高度に保存された」と表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である場合に、「保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」と表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約９９％同一である場合に、「保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」と表す。配列の保存は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用されてもよく、その部分、領域又は特徴に適用されてもよい。
【0056】
本明細書において、用語「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、向上した転写を提供できる配列を含み、一部の場合に、さらに他の制御配列に対するそれらの配向と独立して働き得るＤＮＡの分節を意味する。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサー要素と協力的に又は付加的に働き得る。
【0057】
用語「賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」及び「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、相互互換的に使われ、化合物、例えば外来遺伝子を含み、本明細書に提供されたデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶ伝達体ベクターの投与をより容易にするために薬剤学的組成物に添加される不活性物質を意味する。
【0058】
用語「エクソン（ｅｘｏｎ）」は、タンパク質をエンコードする核酸の限られた部分、又は事前処理された（又は、前駆体）ＲＮＡの一部がスプライシングによって除去された後、ＲＮＡ分子の成熟した形態で表現される核酸配列を意味する。成熟したＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はｒＲＮＡ又はｔＲＮＡのような非暗号化ＲＮＡの機能的形態であってよい。
【0059】
用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを生産する過程を意味する。これは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのポリヌクレオチドの転写及びポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を含むが、これに限定されない。発現は、「遺伝子産物」又は「エンコードされたタンパク質」を生産する。本明細書で使われているように、遺伝子生成物は、例えば、遺伝子の転写によって生成されたＲＮＡのような核酸であってよい。本明細書において、遺伝子産物は、転写体から翻訳される核酸又はポリペプチドであってよい。本明細書に記述された遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化又はスプライシングを有する核酸、又は翻訳後修飾、例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化、脂質の添加、他のタンパク質サブユニットとの結合又はタンパク質分解切断を有するポリペプチドを含む。
【0060】
本明細書において、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、重合体分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間の全体的な単量体保存を意味する。追加修飾語がない「同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」という用語と関連して、例えば、ポリヌクレオチドＡがポリヌクレオチドＢと同一であるということは、ポリヌクレオチド配列が１００％同一であること（１００％配列同一性）を意味する。例えば、「７０％同一」のように２つの配列を記述することは、「７０％配列同一性」を有するものを説明することと同一である。
【0061】
例えば、２個のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、最適の比較目的のために２個の配列を整列することによって行われてよい（例えば、最適配列のために第１及び第２ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列のいずれか一方又は両方にギャップが導入されてよく、同一でない配列は比較目的で無視されてよい。）。特定の側面において、比較目的のために整列された配列の長さは、基準配列の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の参照配列長である。当該アミノ酸位置のアミノ酸又はポリヌクレオチドの場合、塩基を比較する。
【0062】
第一配列の位置が第二配列の当該位置と同じアミノ酸又はヌクレオチドによって占有されている場合に、分子は当該位置において同一である。２個の配列間のパーセント同一性は、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して配列によって共有される同じ位置の数の関数であり、これは、２個の配列の最適整列のために導入される必要がある。配列の比較及び２個の配列間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。
【0063】
様々な配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）を整列するために利用可能な適切なソフトウェアプログラムは、様々なソースから入手可能である。パーセント配列同一性を測定するための一つの適切なプログラムは、米国政府の国立生命工学情報センターＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で利用可能なプログラムのＢＬＡＳＴ製品群の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて両シーケンス間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために用いられるのに対し、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。他の適切なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳ生物情報学プログラム製品群の一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ又はＭａｔｃｈｅｒであり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）でも使用可能である。
【0064】
配列整列は、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ，Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどのような当業界に公知の方法を用いて行われてよい。
【0065】
ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列と整列される単一ポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の様々な領域はそれぞれ、それら自身のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は、最も近似する１０分の１に丸められる点に留意しなければならない。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３及び８０．１４は８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さ値は常に整数である。
【0066】
一部の側面において、第２アミノ酸配列（又は、核酸配列）に対する第１アミノ酸配列（又は、核酸配列）のパーセント同一性（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００ｘ（Ｙ／Ｚ）と計算され、ここで、Ｙは、一番目及び二番目の配列の整列（肉眼検査又は特定配列整列プログラムによって整列される。）において全く同一であると記録されたアミノ酸残基（又は、核塩基）の数であり、Ｚは、二番目の配列にある残基の総数である。第１配列の長さが第２配列よりも長い場合に、第１配列と第２配列のパーセント同一性は、第１配列に対する第２配列のパーセント同一性よりも高いだろう。
【0067】
当業者は、パーセント配列同一性の計算のための配列整列の生成が１次配列データによって排他的に駆動される二元配列－配列比較に限定されないということが理解できよう。また、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の位置）、又は系統発生学的データのような異種ソースからのデータと配列データを統合することによって配列整列が得られることが理解できよう。多重配列整列を得るために異種データを統合する適切なプログラムはＴ－Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、代案として、例えば、ＥＢＩから入手可能である。また、配列パーセント同一性を計算するために用いられる最終整列は自動又は手動で選別可能であることが理解できよう。
【0068】
本明細書において、用語「分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」、「抽出された（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）」及びこれらの類義語は相互互換的に使われ、一つ以上の精製過程を経た本発明の所定の組成物、例えば、外来遺伝子及び非番駅核酸配列を含むポリヌクレオチドの製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の状態を意味する。一部の側面において、本明細書でいう分離又は精製は、本発明の組成物、例えば汚染物を含有するサンプルから本明細書に記述のポリヌクレオチドを除去、部分的除去（例えば、分画）する過程である。
【0069】
本明細書において、用語「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」は、それぞれ、第２アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列に共有又は非共有結合した第１アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を意味する。第１アミノ酸又はポリヌクレオチド配列は、第２アミノ酸又はポリヌクレオチド配列に直接連結されたり併置してよく、或いは、介在配列が第１配列を第２配列に共有的に連結してよい。用語「連結された」は、５’末端又は３’末端において第１ポリヌクレオチド配列と第２ポリヌクレオチド配列が融合していることを意味する他、全体第１ポリヌクレオチド配列（又は、第２ポリヌクレオチド配列）の二番目のポリヌクレオチド配列（又は、一番目のポリヌクレオチド配列）の任意の２つのヌクレオチドへの挿入も含む。第１ポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合又はリンカーによって第２ポリヌクレオチド配列に連結されてよい。リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであってよい。
【0070】
用語「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ」及び「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」は相互互換的に使われ、ＲＮＡベース遺伝子調節に関与する真核生物に発見されるマイクロＲＮＡ分子を意味する。この用語は、前駆体から処理された一本鎖ＲＮＡ分子を表すのに使われる。一部の側面において、また、用語「アンチセンスオリゴマー」は、本発明のマイクロＲＮＡ分子を記述するのに使われてよい。本発明と関連したｍｉＲＮＡの名称及びその配列が本明細書に提供される。ｍｉｃｒｏＲＮＡは不完全な塩基対によって標的ｍＲＮＡを認識し結合して標的ｍＲＮＡの不安定化又は翻訳抑制を誘導し、標的遺伝子発現を下方調節する。逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む分子（一般に、ｍｉＲＮＡのシード領域に相補的な配列を含む分子）を用いてｍｉＲＮＡを標的化することは、標的遺伝子の上方調節を引き起こすｍｉＲＮＡ－誘導翻訳抑制を減少又は抑制させることができる。
【0071】
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」及びこれらの類義語は相互互換的に使われ、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、本明細書において５’から３’方向に提示される。本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子であってよい。ヌクレオチド塩基は、本明細書において次のような単一文字コードで表示される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）及びウラシル（Ｕ）。
【0072】
本明細書において、用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」又は「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、連結されたＤＮＡ配列が互いに隣接して所望の機能を行うことを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列（例えば、外来遺伝子）の転写を開始することに役立てる場合に、このようなプロモーターは、コーディング領域と作動的に連結されてよい。このような機能的関係が維持される限り、プロモーターとコーディング領域とが必ずしも隣接して位置する必要はない。
【0073】
「薬剤学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」、「薬剤学的に許容可能な賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」及びこれらの類義語は、米国連邦政府の規制機関によって承認されたり、又はヒトを含む動物に対する使用に関して米国薬典に述べられた任意の製剤と対象体に対する組成物の投与を禁止し、投与された化合物の生物学的活性及び特性を妨害しない程度に好ましくない生理学的効果の生成を誘発しない任意の担体又は希釈剤を含む。これは、薬剤学的組成物を製造するのに有用であり、一般的に安全で且つ無毒性であり、好ましい賦形剤及び担体を含む。
【0074】
本明細書において、用語「薬剤学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、薬剤学的に許容可能な担体及び賦形剤のような一つ以上の他の化学成分と混合又は組合せされたり、若しくはそれに浮遊された本明細書に記述の一つ以上の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び／又は組換えウイルス）を意味する。
【0075】
本明細書で使われる用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」及び「プロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は相互互換的に使われてよく、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を意味する。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、本来遺伝子（ｎａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ）から全体的に由来可能であるか、自然から発見される様々なプロモーターに由来する様々な要素で構成されるか、ひいては合成ＤＮＡセグメントを含んでよい。様々なプロモーターが様々な組織又は細胞類型において、又は様々な発達段階において、又は様々な環境的又は生理学的条件に対する反応によって遺伝子の発現を指示できるということが当業者には理解される。総じて、大部分の細胞類型に遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という。遺伝子を特定細胞類型において発現させるプロモーターは、通常、「細胞特異的プロモーター（ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」又は「組織特異的プロモーター（ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という。発達又は細胞分化の特定段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「発達特異的プロモーター（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」又は「細胞分化特異的プロモーター（ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」という。プロモーターを誘導する作用剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の露出又は処理後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」又は「調節可能なプロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」を表す。また、総じて、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【0076】
プロモーター配列は典型的に、転写開始部位によってその３’末端に結合し、背景から検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含むように上向き（５’方向）に延長される。プロモーター配列内でＲＮＡポリメラーゼの結合を担当するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）の他にも、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１とのマッピングによって便利に定義される。）が確認されるであろう。一部の側面において、本発明に使用可能なプロモーターは、組織特異的プロモーターを含む。
【0077】
本明細書において、用語「遺伝子調節領域（ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）」又は「調節領域（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）」は、コーディング領域の上流（５’非コーディング配列）、内部又は下流（３’非コーディング配列）に位置しているヌクレオチド配列を意味し、関連したコーディング領域の転写、ＲＮＡ処理、安定性又は翻訳に影響を及ぼす。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダ配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）、ポリアデニル化認識配列（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＲＮＡ加工部位（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇサイト）、エフェクター結合部位又はステム－ループ構造（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を含んでよい。コーディング領域が真核細胞で発現するように意図された場合に、ポリアデニル化信号及び転写終結配列は一般的にコーディング配列の３’に位置するであろう。
【0078】
一部の側面において、本明細書で提供される核酸組成物（例えば、発現構築物）は、一つ以上のコーディング領域と作動可能に関連付けられたプロモーター及び／又は他の発現（例えば、転写）調節要素を含んでよい。作動可能な関連付けにおいて、遺伝子産物に対するコーディング領域は、調節領域の影響又は制御下に遺伝子産物の発現を置く方式で一つ以上の調節領域と関連付けられる。例えば、プロモーター機能の誘導が、コーディング領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を誘導し、プロモーターとコーディング領域間の連結特性が、遺伝子産物の発現を指示するプロモーターの能力を妨害したり又は転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨害したりしてはいけない場合に、コーディング領域とプロモーターは「作動可能に関連付け（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」される。プロモーターに加え、他の発現調節要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結信号も、遺伝子産物発現を指示するコーディング領域と作動可能に関連付けられてよい。
【0079】
本明細書において、用語「外来遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、組換え発現構築物内にエンコードされた一つ以上のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域又はこのようなポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域の発現産物、ポリペプチド又は多重ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド又は調節核酸（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を意味する。一部の側面において、前記外来遺伝子は、対象体又は患者の身体内で持続的な発現を目的とする、特定疾患の治療用ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列であってよい。一部の側面において、「作動的に連結された」又は「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が所望の機能を果たすように隣接して位置することを意味し、例えば、特定プロモーターがコーディング配列（例えば、外来遺伝子）の転写を開始することに役立てる場合に、このようなプロモーターはコーディング領域と作動的に連結されてよい。このような機能的関係が維持された限り、プロモーターとコーディング領域とが必ずしも隣接して位置する必要はない。
【0080】
本明細書において、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」又は「構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、核酸又は遺伝子を挿入できる構築物を意味し、好ましくは、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を含む。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。核酸配列は外来遺伝子であってよい。構築物としては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、ＡＡＶ）を挙げることができるが、これに限定されない。当業者は標準的な組換え技術によって前記ベクター又は構築物を構築できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９４）。
【0081】
本明細書において、用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、転写された遺伝子産物の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むベクター又は構築物を意味する。一部の場合には、転写されたＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。発現構築物には様々な調節要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）が含まれてよい。転写及び翻訳を調節する調節配列に加え、ベクター及び発現ベクターには、さらに他の機能も提供するヌクレオチド配列も含まれてよい。
【0082】
本明細書において、用語「対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ＡＡＶ（本願で提供された方法を用いて生成される。）又はこのようなＡＡＶを含む組成物が投与される対象体を意味する。非制限的な例として、診断、治療又は療法が必要なヒト、家畜（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験室動物（例えば、サル、ネズミ、マウス、ウサギ、ギニアピッグなど）が挙げられ、特にヒトである。本明細書に記載の方法は、ヒト治療及び獣医学適用の両方に適用可能である。
【0083】
本明細書において、「それを必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、本明細書に記述された組成物の投与から利益を得る対象体、例えば哺乳動物を含む。
【0084】
本明細書において、用語「治療的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、所望の治療効果を示すのに十分な本発明の組成物（例えば、外来遺伝子及び非番駅核酸配列を含むポリヌクレオチド）を含む試薬又は薬剤学的化合物の量である。治療的有効量は、予防が療法と見なされ得ることから、「予防的有効量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」であってよい。
【0085】
本明細書において、用語「外来遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、組換え発現構築物又はポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域の発現産物、ポリペプチド又は多重ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は変調（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）又は調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）核酸を意味する。一部の側面において、前記外来遺伝子は、それが挿入（又は、形質導入）される細胞に対して異種であってよい（すなわち、細胞から自然的に発現しない。）。
【0086】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、例えば、疾病又は状態の重症度減少；疾病進行期間短縮；疾病又は状態と関連した一つ以上の症状の改善又は除去；疾病又は状態を必ずしも治療せず、疾病又は状態を持つ被験者に有益な効果を提供すること、を意味する。この用語は、また、疾病又は状態又はその症状の予防又は防止を含む。
【0087】
用語「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」は、基準ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を意味する。
【0088】
本明細書において、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」又は「構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、核酸又は遺伝子が挿入され得る任意の運搬体を意味し、これは、複製可能な細胞への導入のために核酸配列が挿入され得る伝達運搬体のようなものである。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。核酸配列は外来遺伝子であってよい。構築物としては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、ＡＡＶ）を挙げることができるが、これに限定されない。当業者は、標準的な組換え技術によって前記ベクター又は構築物を構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９４）。本明細書において、用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、転写された遺伝子産物の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むベクター又は構築物を意味する。一部の場合には、転写されたＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。発現構築物には様々な調節要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）が含まれてよい。転写及び翻訳を調節する調節配列に加え、ベクター及び発現ベクターにはさらに他の機能も提供するヌクレオチド配列も含まれてよい。
【0089】
ベクターは、ベクターが混入された細胞の選択又は識別のために提供する選択可能なマーカー又はレポーターをエンコードするように操作されてよい。選択可能なマーカー又はレポーターの発現は、ベクターに含まれた他のコーディング領域を包含及び発現する宿主細胞の識別及び／又は選択を可能にする。当業界に公知され、使用されている選別可能なマーカー遺伝子の例は、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）除草剤（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）、スルフォンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）などに対する耐性を提供する遺伝子；及び表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などである。当該分野で公知され、使用されてているレポーターの例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択可能なマーカーはレポーターと考慮されてもよい。
【0090】
ＩＩ．デュアルヘルパープラスミド
ＩＩ．Ａ．Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子
本発明の一部の側面は、デュアルヘルパープラスミドに関する。本明細書で立証されているように、このようなデュアルヘルパープラスミドは、（例えば、関心タンパク質をコードする外来遺伝子を含む）組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生産するのに特に有用であり得る。
ＩＩ．Ａ．Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子
本発明の一部の側面は、デュアルヘルパープラスミドに関する。本明細書で立証されているように、このようなデュアルヘルパープラスミドは、（例えば、関心タンパク質をコードする外来遺伝子を含む）組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生産するのに特に有用であり得る。
【0091】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡウイルスであり、且つヘルパー依存型ヒトパルボウイルスである。ゲノムサイズは約４．７ｋｂｐである。ゲノムのＮ末端は、ウイルス複製及びウイルス遺伝子発現に関与するｒｅｐ遺伝子をエンコードし、Ｃ末端は、ウイルスのカプシドタンパク質を暗号化するｃａｐ遺伝子をエンコードする。約１４５塩基の逆末端反復配列（ＩＴＲ）が両末端部位に挿入されている。Ｔ字状の構造を有する１４５ｂｐサイズのＩＴＲ（逆末端反復配列）は、ウイルス遺伝体複製時に複製原点の機能を果たし、１次的なパッケージング信号として作用する。ＩＴＲは、組換えＡＡＶ構築物を作る時に唯一に必要なｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ塩基配列であり、Ｒｅｐタンパク質の存在下ではエンハンサー活性を有するが、、Ｒｅｐタンパク質がない時には非常に弱い活性を有するので、組換えＡＡＶ構築物に外来遺伝子をクローニングする時に、それを考慮してエンハンサー、プロモーター、ｐＡなどを適切に構成して発現構築物を作製する（ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ａｎｄ Ｎ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌｏ．２０１４．１：４２７－４５１）。ｒｅｐ遺伝子からは４個のタンパク質が翻訳されるが、これらはその分子量によってｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０に区分され、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に重要な働きをする。ｃａｐ遺伝子からは４個のタンパク質が翻訳されるが、そのうち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質はＡＡＶ粒子を構成する構造タンパク質であり、組立－活性化タンパク質（ＡＡＰ，ａｓｓｅｍｂｌｙ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、前記構造タンパク質によるＡＡＶ粒子の形成を促進する。前記アデノ随伴ウイルスが効率的に複製されるためには、アデノウイルス或いはヘルペスシンプレックスウイルスのようなヘルパーウイルス（ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）に由来する一部のタンパク質及びＲＮＡを必要とする（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８，９７－１２９，１９９２）。
【0092】
本明細書において、用語「デュアルヘルパープラスミド（ｄｕａｌ－ｈｅｌｐｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）」は、細胞においてＡＡＶを生成するための要件のうち２個以上を提供できるプラスミドを意味する。外来遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターを生産するためには、下記の構成要素が宿主細胞に提供される必要がある：（１）外来遺伝子、（２）ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質、及び（３）Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡタンパク質。本発明の他の所で記述されているように、伝統的な方法により、異なる要件が、３個の異なるプラスミド（すなわち、（１）ＩＴＲ側面にある外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミド、（２）Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド、及び（３）ヘルパープラスミド）によって細胞に提供される。
【0093】
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記載のデュアルヘルパープラスミドは、前述した要件（２）及び（３）を提供する。例えば、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
【0094】
本明細書で立証されているように、本明細書に記述のデュアルヘルパープラスミドは、前述した遺伝子を含む他にも、前記遺伝子はプラスミドにおいて特定構成で配列される。例えば、一部の側面において、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、デュアルヘルパープラスミド内で順次に連結され、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子（本明細書では「ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子」と言及される。）は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端とを時計回り方向に（５’から３’に）順次に連結する。より具体的には、一部の側面において、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結される。このようなデュアルヘルパープラスミドの非制限的な例は、図５Ａに提示されている。
【0095】
一部の側面において、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は順次に連結され、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は反時計回り方向に（３’から５’に）Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に存在する。より具体的には、一部の側面において、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結される。このようなデュアルヘルパープラスミドの非制限的な例は、図５Ｂに提示されている。
【0096】
本発明から明らかなように、一部の側面において、上述したそれぞれのＥ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子はアデノウイルスに由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、同じＡＡＶ血清型に由来する。例えば、一部の側面において、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ２に由来する（例えば、実施例１－４に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を参照）。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、様々な血清型を有するＡＡＶに由来する。例えば、本明細書で立証されているように、一部の側面において、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８（ｃａｐ８又はその断片）に由来し、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２（ｒｅｐ２又はその断片）に由来する（例えば、実施例１－２に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を参照）。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９（ｃａｐ９又はその断片）に由来し、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２（ｒｅｐ２又はその断片）に由来する（例えば、実施例１－６に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物を参照）。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５（ｃａｐ５又はその断片）に由来し、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２（ｒｅｐ２又はその断片）に由来する（例えば、実施例１－７に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を参照）。
【0097】
本発明で使用可能なＡＡＶの類型又は血清型の非制限的な例は、ＡＡＶｒｈ．ｌＯ（ＡＡＶｒｈｌＯ）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－ｌｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶｌ－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶｌ－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｌ１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．ｌ７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．ｌ５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．ｌ６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．ｌ９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶ Ａ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶ Ａ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－ｌ／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒｌ、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ｃａｐｒｉｎｅ ＡＡＶ、ｂｏｖｉｎｅ ＡＡＶ、ＡＡＶｈＥｌ．１、ＡＡＶｈＥｒｌ．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒｌ．８、ＡＡＶｈＥｒｌ．１６、ＡＡＶｈＥｒｌ．１８、ＡＡＶｈＥｒｌ．３５、ＡＡＶｈＥｒｌ．７、ＡＡＶｈＥｒｌ．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、Ｂ Ｐ６１ＡＡＶ、Ｂ Ｐ６２ＡＡＶ、Ｂ Ｐ６３ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０血清型、及びこれらの組合せを含む。
【0098】
一部の側面において、本発明に有用なアデノ随伴ウイルスの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、又はこれらの組合せを含む。したがって、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ１に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ１に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ１に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ１に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ２に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ２に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ３に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ３に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ３に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ３に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ４に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ４に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ４に由来である。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ４に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ５に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ５に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ６に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ６に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ６に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ６に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ７に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ７に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ７に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ７に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ８に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ８に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ８に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ８に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ９に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ９に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ９に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶｒｈ１０に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶｒｈ１０に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶｒｈ１０に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶｒｈ１０に由来する。
【0099】
一部の側面において、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号２９に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子は、配列番号２９に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子は、配列番号２９に記載された核酸配列を含む。
【0100】
一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９に由来する。
【0101】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。したがって、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ２に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ２）を含む。ＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３０に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３０に提示された配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３０に提示された核酸配列を含む。
【0102】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来する。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドはＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ５に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ５）を含む。ＡＡＶ５ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３１に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドはＥ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は配列番号３１に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３１に提示された核酸配列を含む。
【0103】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ８に由来する。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ８に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ８）を含む。ＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３２に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３２に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３２に提示された核酸配列を含む。
【0104】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９に由来する。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ９）を含む。ＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３３に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３３に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子、は配列番号３３に提示された核酸配列を含む。
【0105】
一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来する。Ａｄ５Ｅ２ａ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３４に提示されている。したがって、一部の側面において、本発明に有用なデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ２ａ遺伝子は配列番号３４に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ２ａ遺伝子は、配列番号３４に提示された核酸配列を含む。
【0106】
一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ４遺伝子はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来する。Ａｄ５ Ｅ４遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３５に提示されている。一部の側面において、本発明に有用なデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ４遺伝子は、配列番号３５に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ４遺伝子は、配列番号３５に提示された核酸配列を含む。
【0107】
一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来する。Ａｄ５ ＶＡ ＲＮＡ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３６に提示されている。一部の側面において、本発明に有用なデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、配列番号３６に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、配列番号３６に提示された核酸配列を含む。
【0108】
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記述されたデュアルヘルパープラスミドは、同一のウイルス供給源又は多重のウイルス供給源に由来する遺伝子を含む。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ２に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３０）；及び（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含む。一部の側面において、記載されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ５に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３１）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（配列番号２９）を含む。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ８に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３２）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含む。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３３）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含む。
【0109】
本明細書に記述され、立証されているように、前述した遺伝子（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）の一つ以上の配列は、本発明のデュアルヘルパープラスミドの特定特性を改善するのに役立ち得る。例えば、一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、それぞれ配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含み、前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は時計回り方向である。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子の５’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、ｒｅｐ遺伝子の３’末端はｃａｐの５’末端に連結され、ｃａｐ遺伝子の３’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結される（図５Ａ参照）。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、それぞれ配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含み、前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は反時計回り方向である。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子の５’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結され、ｒｅｐ遺伝子の３’末端はｃａｐ遺伝子の５’末端に連結され、ｃａｐ遺伝子の３’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結される（図５Ｂ参照）。
【0110】
本明細書に記述された特徴（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の特定配列）に基づいて、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、下記の改善された特性のうち一つ以上を示す：１）宿主細胞が組換えＡＡＶを生産するのに必要な全ての構成要素を有するように同時形質感染確率の増加、２）組換えアデノ随伴ウイルスの生産性の増加、３）プラスミド生産及び精製費用及び時間の減少。このような特性に関する追加開示は、本発明の他の所で提供される。
【0111】
ＩＩ．Ｂ．追加特徴
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、組換えＡＡＶ生産に有用な一つ以上の追加特徴を含む。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、抗生剤抵抗性遺伝子をさらに含む。例えば、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは選別マーカーをさらに含む。本明細書において、用語「選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）」は、核酸配列が発現する細胞を識別するのに使用可能な任意の遺伝子を意味する。したがって、このような選別マーカーは、本明細書に記述されたデュアルヘルパープラスミドで形質感染後に、形質転換された細胞を確認し豊富にするのに用いられてよい。本発明と共に使用可能な選別マーカーは、当業界に公知された任意の適切な選別マーカーを含む。適切な選別マーカーの非制限的な例は、（ｉ）抗生剤に対する抵抗性をエンコードする酵素（すなわち、「抗生剤抵抗性遺伝子」）、例えば、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）又はゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）；又は、（ｉｉ）蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む。
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、組換えＡＡＶ生産に有用な一つ以上の追加特徴を含む。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、抗生剤抵抗性遺伝子をさらに含む。例えば、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは選別マーカーをさらに含む。本明細書において、用語「選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）」は、核酸配列が発現する細胞を識別するのに使用可能な任意の遺伝子を意味する。したがって、このような選別マーカーは、本明細書に記述されたデュアルヘルパープラスミドで形質感染後に、形質転換された細胞を確認し豊富にするのに用いられてよい。本発明と共に使用可能な選別マーカーは、当業界に公知された任意の適切な選別マーカーを含む。適切な選別マーカーの非制限的な例は、（ｉ）抗生剤に対する抵抗性をエンコードする酵素（すなわち、「抗生剤抵抗性遺伝子」）、例えば、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）又はゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）；又は、（ｉｉ）蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む。
【0112】
一部の側面において、選別マーカーは、抗生剤抵抗性遺伝子を含む。一部の側面において、抗生剤抵抗性遺伝子は、アンピシリン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、又は両方を含む。アンピシリン抵抗性遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３７に提示されている。カナマイシン抵抗性遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３８に提示されている。
【0113】
ＩＩＩ．発現構築物
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に提供されたデュアルヘルパープラスミドは、例えば、組換えＡＡＶを生成するとき、一つ以上の追加プラスミドと組み合わせて使用されてよい。一部の側面において、追加プラスミドは、組換え発現構築物、例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド（ここで「発現構築物」という。）を含む。発現構築物の例示的な側面が、下記に記述されている。
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に提供されたデュアルヘルパープラスミドは、例えば、組換えＡＡＶを生成するとき、一つ以上の追加プラスミドと組み合わせて使用されてよい。一部の側面において、追加プラスミドは、組換え発現構築物、例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド（ここで「発現構築物」という。）を含む。発現構築物の例示的な側面が、下記に記述されている。
【0114】
ＩＩＩ．Ａ．外来遺伝子（例えば、ＩＴＲの側面に位置）
本発明の他の所でさらに記述されているように、一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む。このような側面において、（例えば、生産される組換えＡＡＶに導入される）外来遺伝子は、別個の発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）によって提供されてよい。したがって、一部の側面において、発現構築物は外来遺伝子を含む。一部の側面において、外来遺伝子は、逆末端反復配列（ＩＴＲ）の側面に位置する。本発明に有用な外来遺伝子は、外来遺伝子が細胞内に導入される時にポリペプチドに翻訳され得る限り、特に限定されない。したがって、任意の適切な関心外来遺伝子が本発明と共に使用されてよい。一部の側面において、外来遺伝子は、ポリペプチド（又は、その任意の変異体）、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、ＲＮＡベース分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）、又はその任意の組合せをエンコードする。
本発明の他の所でさらに記述されているように、一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む。このような側面において、（例えば、生産される組換えＡＡＶに導入される）外来遺伝子は、別個の発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）によって提供されてよい。したがって、一部の側面において、発現構築物は外来遺伝子を含む。一部の側面において、外来遺伝子は、逆末端反復配列（ＩＴＲ）の側面に位置する。本発明に有用な外来遺伝子は、外来遺伝子が細胞内に導入される時にポリペプチドに翻訳され得る限り、特に限定されない。したがって、任意の適切な関心外来遺伝子が本発明と共に使用されてよい。一部の側面において、外来遺伝子は、ポリペプチド（又は、その任意の変異体）、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、ＲＮＡベース分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）、又はその任意の組合せをエンコードする。
【0115】
一部の側面において、外来遺伝子は、本明細書に記載されたような疾患又は障害の治療に有用なタンパク質をエンコードする。一部の側面において、外来遺伝子は、対象体又は患者の身体において持続した発現を目的に特定疾病に対する治療ペプチドをエンコードする。
【0116】
ＩＩＩ．Ｂ．調節要素
一部の側面において、本発明のデュアルヘルパープラスミドと共に使用可能な発現構築物は、調節要素をさらに含む。一部の側面において、調節要素は、外来遺伝子に作動可能に連結される。
一部の側面において、本発明のデュアルヘルパープラスミドと共に使用可能な発現構築物は、調節要素をさらに含む。一部の側面において、調節要素は、外来遺伝子に作動可能に連結される。
【0117】
したがって、一部の側面において、本明細書に記述された発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）は、下記を含む：
（ａ）ＩＴＲ（逆末端反復配列）；
（ｂ）外来遺伝子；及び
（ｃ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素。
（ａ）ＩＴＲ（逆末端反復配列）；
（ｂ）外来遺伝子；及び
（ｃ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素。
【0118】
本発明に有用な調節要素は、エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、β－アクチンプロモーター）、エクソン（例えば、エクソン１、エクソン２）、イントロン（例えば、イントロンＡ）、スプライシング供与体又は受容体配列、又はこれらの組合せが含まれる。一部の側面において、前記調節要素は、転写終結のための配列（例えば、ポリＡ）、外来遺伝子を安定的に発現させるための配列（例えば、ＷＰＲＥ配列）、外来遺伝子特異的免疫を減少させるための配列（例えば、ｍｉＲＮＡ標的配列）、又はこれらの組合せが含まれてよい。外来遺伝子及び調節要素に対する細部事項（ＩＴＲ配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、Ｅ１配列、スプライシング供与体配列、ＥＦ－１αイントロン又はスプライシング受容体を含むその断片配列、ＥＦ－１α Ｅ２配列、ＷＰＲＥ配列、ｍｉＲ配列、ポリ配列など）は、ＵＳ２０２２／００１０３３２Ａ１から確認でき、その全文が本明細書に参照によって組み込まれる。
【0119】
上述したように、一部の側面において、本発明に有用な発現構築物は、（ｉ）外来遺伝子、及び（ｉｉ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含み、前記調節要素は、下記の成分を含む：
１）ＣＭＶエンハンサー配列；
２）ＣＭＶプロモーター配列、ＥＦ－１αプロモーター配列又はニワトリβ－アクチンプロモーター配列；
３）ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列又はニワトリβ－アクチンＥ１配列；
４）スプライシング供与体配列；
５）ＥＦ－１αイントロン断片配列；及び
６）ＥＦ－１α Ｅ２配列。
１）ＣＭＶエンハンサー配列；
２）ＣＭＶプロモーター配列、ＥＦ－１αプロモーター配列又はニワトリβ－アクチンプロモーター配列；
３）ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列又はニワトリβ－アクチンＥ１配列；
４）スプライシング供与体配列；
５）ＥＦ－１αイントロン断片配列；及び
６）ＥＦ－１α Ｅ２配列。
【0120】
ＩＶ．ベクター
一部の側面において、本明細書に提供された任意のプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び／又は外来遺伝子を含む発現構築物）を含むベクターが本明細書に提供される。また、本明細書で提供されたプラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶが本明細書に提供される。本明細書において、このようなベクターは、宿主細胞及び治療的介入のための標的細胞での組換え発現に有用である。
一部の側面において、本明細書に提供された任意のプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び／又は外来遺伝子を含む発現構築物）を含むベクターが本明細書に提供される。また、本明細書で提供されたプラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶが本明細書に提供される。本明細書において、このようなベクターは、宿主細胞及び治療的介入のための標的細胞での組換え発現に有用である。
【0121】
本発明から明らかなように、一部の側面において、本発明に有用なベクターは、ＡＡＶに由来する。ＡＡＶは、外来ＤＮＡを細胞に伝達するためのベクターシステムとして魅力的な独特の機能を有している。培養中の細胞のＡＡＶ感染は一般的に非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、静か（ｓｉｌｅｎｔ）で且つ無症状である。しかも、ＡＡＶは、多くの様々な類型の哺乳動物細胞を感染させ、生体内で多くの様々な組織を標的化できる。また、ＡＡＶは、他の形態の遺伝子伝達体に比べて、より弱い免疫反応を促進し、非統合、エピソームベクターＤＮＡ（ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ，ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ）に基づいて分裂及び停止細胞の両方で持続して発現し、遺伝子伝達体に対して特に魅力的なウイルスシステムとなる更なる利点を有する。また、ＡＡＶは、アデノウイルスを非活性化するために用いられる条件（５６～６５℃で数時間）を耐えるので、ｒＡＡＶベースワクチンの低温保存の重要性が相対的に少ない。
【0122】
本発明に使用可能なアデノ随伴ウイルスの類型又は血清型の非制限的な例は、本発明の他の所で提供される。
【0123】
Ｖ．細胞
一部の側面において、本発明は、本明細書に記述されたプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物）を含む細胞（ここで「変形された細胞」と呼ぶ。）を提供する。一部の側面において、細胞（例えば、宿主細胞）は、組換えＡＡＶを生産するために、デュアルヘルパープラスミド及びＡＡＶ構成プラスミドで形質感染される。本明細書の一部の側面において、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物を含む）本発明の変形された細胞は、組換えＡＡＶ生産の一つ以上の側面を改善させることができる。例えば、一部の側面において、本明細書に提供された変形された細胞は、対照細胞と比較してより大きい収率で組換えＡＡＶを生産することができる。一部の側面において、対照細胞は、次の３つの別個プラスミドを含むように変形された該当の細胞を含む：（１）ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む第１プラスミド（「ｒｅｐ－ｃａｐプラスミド」）；（２）Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む第２プラスミド（「ヘルパープラスミド」）；及び（３）外来遺伝子を含む第３プラスミド。
一部の側面において、本発明は、本明細書に記述されたプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物）を含む細胞（ここで「変形された細胞」と呼ぶ。）を提供する。一部の側面において、細胞（例えば、宿主細胞）は、組換えＡＡＶを生産するために、デュアルヘルパープラスミド及びＡＡＶ構成プラスミドで形質感染される。本明細書の一部の側面において、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物を含む）本発明の変形された細胞は、組換えＡＡＶ生産の一つ以上の側面を改善させることができる。例えば、一部の側面において、本明細書に提供された変形された細胞は、対照細胞と比較してより大きい収率で組換えＡＡＶを生産することができる。一部の側面において、対照細胞は、次の３つの別個プラスミドを含むように変形された該当の細胞を含む：（１）ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む第１プラスミド（「ｒｅｐ－ｃａｐプラスミド」）；（２）Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む第２プラスミド（「ヘルパープラスミド」）；及び（３）外来遺伝子を含む第３プラスミド。
【0124】
一部の側面において、対照細胞と比較して、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現ベクターを含む）本発明の細胞は、生産された組換えＡＡＶの量を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約１００％以上増加させることができる。一部の側面において、対照細胞と比較して、本発明の細胞は、生産された組換えＡＡＶの量を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、又は少なくとも約１００倍又はそれ以上増加させることができる。一部の側面において、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物を含むように変形された）本明細書に提供された細胞は、対照細胞と比較して生産及び／又は精製時間を減少させることができる。一部の側面において、対照細胞と比較して生産及び／又は精製時間は少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％又はそれ以上減少する。
【0125】
本発明から明らかなように、また、本明細書のプラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶを含むように変形（例えば、形質感染）された細胞が提供される。このような細胞は、例えば、本明細書に記述された外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産するのに特に有用であり得る。任意の一つの理論にとらわれず、一部の側面において、細胞（例えば、宿主細胞）が本明細書に記述のプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び調節要素に作動可能に連結された外来遺伝子を含む発現構築物）で形質感染されるとき、生産された組換えＡＡＶは個別プラスミドの一つ以上の特徴を含む。例えば、一部の側面において、生産された組換えＡＡＶは、調節要素に作動可能に連結された外来遺伝子を含む。
【0126】
本明細書に記載されているように、一部の側面において、本明細書に記載された一つ以上の調節要素は、細胞において外来遺伝子によってコードされるタンパク質（「暗号化されたタンパク質」）の発現を向上させることができる。したがって、一部の側面において、（例えば、本明細書に記述された一つ以上の調節要素に作動可能に連結された外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ伝達体ベクターで形質感染された）本明細書に記述された細胞は、対照細胞と比較して、エンコードされたタンパク質の発現をより多く増加させる。一部の側面において、対照細胞は、当該伝達体ベクターで形質感染されるが、本明細書に記述された調節要素のうち一つ以上が欠如している。
【0127】
一部の側面において、本明細書に記述された細胞は、試験管内で変形（例えば、形質感染）されて関心組成物を生産する。例えば、一部の側面において、細胞は、組換えＡＡＶを生産するために、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物（例えば、本明細書に記載されたもの）で試験管内で形質感染される。一部の側面において、細胞は、組換え遺伝子伝達体ベクターで試験管内で形質感染され、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産する。一部の側面において、本明細書に記述された細胞は、生体内で（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶが投与された対象体で）エンコードされたタンパク質を生産できる。一部の側面において、本明細書に記述された細胞は、試験管内及び生体内の両方において関心組成物（例えば、エンコードされたタンパク質）を生産することができる。
【0128】
本明細書に記載されているように、一部の側面において、本発明は、例えば、外来遺伝子発現のための組換え発現構築物で形質転換、形質導入又は形質感染された宿主細胞を提供する。本明細書において、用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、真核細胞及び原核細胞を含み、例えば、プラスミド又は発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド、Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド、ヘルパープラスミド、デュアルヘルパープラスミドなど）によってエンコードされる遺伝子が発現又は複製され得るように形質導入可能な有機体の細胞を意味する。一部の側面において、これは、分離された（真核）宿主細胞を意味する。本明細書において、用語「形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、形質導入及び形質転換を含むように意図される。宿主細胞は、本明細書に記載された任意のプラスミド、構築物及び／又はベクターで形質感染、形質導入又は形質転換されてよい。これらの用語は、外因性核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。
【0129】
一部の側面において、宿主細胞は真核細胞である。一部の側面において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選ばれる。一部の側面において、宿主細胞は原核細胞である。一部の側面において、原核細胞はバクテリア細胞である。
【0130】
一部の側面において、本発明に有用な細胞（例えば、宿主細胞）は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又は両方を含む。一部の側面において、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞であってよい。一部の側面において、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、ＲＰＥ－１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ－７細胞、Ｃ８Ｄ１ａ細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＥＳ１３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＨＣ７０細胞、ＨＣＣ１４２８細胞、ＢＴ－５４９細胞、ＰＣ３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、Ｃａｐａｎ－１細胞、Ｐａｎｃ－１細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１６６細胞、ＬｏＶｏ細胞、Ａ１７２細胞、ＭＫＮ－４５細胞、ＭＫＮ－７４細胞、Ｋａｔｏ－ＩＩＩ細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＨＴ－１４４細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｃ６細胞、ＨＴ－２２細胞、ＰＣ－１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はこれらの組合せを含む。
【0131】
一部の側面において、本発明に有用な細胞は、ヒト細胞を含む。一部の側面において、ヒト細胞は、本明細書に記述の組換え遺伝子伝達体ベクターが投与される対象体の細胞である。一部の側面において、ヒト細胞は供与者（例えば、健康なヒト被験者）に由来する。
【0132】
ＶＩ．組成物
本発明は、また、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドを含む組成物に関する。本発明から明らかなように、一部の側面において、このような組成物は、追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載された発現構築物（例えば、外来遺伝子発現のためのＡＡＶ構築物プラスミド）をさらに含む。本発明の他の所でも記述されているように、このような組成物は、組換えＡＡＶを生産するのに有用であり得る。
本発明は、また、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドを含む組成物に関する。本発明から明らかなように、一部の側面において、このような組成物は、追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載された発現構築物（例えば、外来遺伝子発現のためのＡＡＶ構築物プラスミド）をさらに含む。本発明の他の所でも記述されているように、このような組成物は、組換えＡＡＶを生産するのに有用であり得る。
【0133】
様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）及び本明細書に開示された細胞（ここで「活性化合物（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」と呼ぶ。）は、投与に適合する薬剤学的組成物に含まれてよい。したがって、一部の側面において、本発明は、このような薬剤学的組成物に関する。例えば、一部の側面において、本発明は、本明細書に記述されたプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）を用いて生産された組換えＡＡＶを含む薬剤学的組成物を提供する。
【0134】
一部の側面において、本明細書に記載された薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含む。
【0135】
本発明に使用可能な薬剤学的に許容可能な担体は、剤形に一般に用いられるものを含む。このような薬剤学的に許容可能な担体の非制限的な例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶質セルロ－ス、ポリビニルピロリドン、セルロ－ス、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル及びこれらの組合せを含むが、これに限定されない。本発明の薬剤学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤及びこれらの組合せのような一つ以上の添加剤をさらに含んでよい。適切な薬剤学的に許容可能な担体及び製剤に関する追加細部事項は、文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５））に説明されている。
【0136】
本発明の薬剤学的組成物は、意図した投与経路と互換するように剤形化される。このような投与経路の非制限的な例は、本発明の他の所で提供される。
【0137】
本明細書に記述された薬剤学的組成物は、単一投与又は多重投与の形態で提供されてよい。一部の側面において、本明細書で提供される薬剤学的組成物は、溶液（例えば、油性又は水性媒質中）、懸濁液、エマルジョン、抽出物、粉末、顆粒、錠剤又はカプセルの形態で剤形化される。一部の側面において、本明細書に記述された薬剤学的組成物を含む剤形は、分散剤、安定剤又は両方をさらに含んでよい。
【0138】
ＶＩＩ．キット
開示された様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）、細胞及び組成物（例えば、薬剤学的組成物）のうち一つ以上を含むキットが本明細書に開示される。一部の側面において、キットは、使用説明書（例えば、前述したもののいずれか又はそれらの組合せをそれを必要とする対象体に投与するための説明書）を含む。
開示された様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）、細胞及び組成物（例えば、薬剤学的組成物）のうち一つ以上を含むキットが本明細書に開示される。一部の側面において、キットは、使用説明書（例えば、前述したもののいずれか又はそれらの組合せをそれを必要とする対象体に投与するための説明書）を含む。
【0139】
本明細書において、用語「キット」及び「システム」は、様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）、細胞、及び組成物（例えば、薬剤学的組成物）、又はそれらの任意の組合せのうち少なくとも一つ以上を表すように意図され、一部の側面において、一つ以上の他の類型の要素又は成分（例えば、他の類型の生化学的試薬、容器、販売のための包装、使用説明書など）と共に提供される。
【0140】
ＶＩＩＩ．用途及び方法
ＶＩＩＩ．Ａ．ＡＡＶ生産方法
本発明の特定の側面は、ＡＡＶを生産する方法に関する。より具体的には、一部の側面において、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶを生産する方法が本発明に提供される。一部の側面において、このような方法は、細胞（例えば、宿主細胞）をデュアルヘルパープラスミド（例えば、本明細書に記載されたもの）及び外来遺伝子を含む発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）で形質感染させることを含む。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で同時に形質感染される。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で順次に形質感染される。特記しない限り、当業界に公知された任意の適切な形質感染方法が本発明と共に用いられてよい。
ＶＩＩＩ．Ａ．ＡＡＶ生産方法
本発明の特定の側面は、ＡＡＶを生産する方法に関する。より具体的には、一部の側面において、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶを生産する方法が本発明に提供される。一部の側面において、このような方法は、細胞（例えば、宿主細胞）をデュアルヘルパープラスミド（例えば、本明細書に記載されたもの）及び外来遺伝子を含む発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）で形質感染させることを含む。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で同時に形質感染される。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で順次に形質感染される。特記しない限り、当業界に公知された任意の適切な形質感染方法が本発明と共に用いられてよい。
【0141】
一部の側面において、組換えＡＡＶを生産する方法は、組換えＡＡＶが生産されるように適切な条件下に形質感染された細胞を培養する段階をさらに含む。一部の側面において、前記方法は、生産された組換えＡＡＶを回収する段階をさらに含む。
【0142】
本明細書に記述された組換えＡＡＶを生産する方法は、明確な利点を提供する。本発明の他の所で記述されているように、ＡＡＶを生産するより伝統的な方法は、三重形質感染を必要とし、宿主細胞は、次の３種の個別プラスミドで形質感染される：ｉ）Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をエンコードする遺伝子を含むＲｅｐ－Ｃａｐプラスミド；ｉｉ）アデノウイルスのタンパク質（Ｅ２ａ、Ｅ４）及びＶＡ ＲＮＡをエンコードする遺伝子を含むヘルパープラスミド；及び、ｉｉｉ）外来遺伝子発現のためのＡＡＶ構築物プラスミド。前記組換えＡＡＶは、細胞が上述の３種のプラスミドの全てによって成功的に形質感染された場合（すなわち、各遺伝子が吸収されて細胞の核に伝達された後、後続的に転写、細胞内で複製及び／又は翻訳された場合）にのみ生産される。関連した複雑性によって、三重形質感染を必要とするこのような方法は、低い収率、高費用及び／又はより労働集約的な結果を招くことがある。
【0143】
このような接近法と比較して、本明細書に提供された組換えＡＡＶを生産する方法は、組換えＡＡＶのより高い収率を得ることができる。一部の側面において、三重形質感染を必要とする方法（すなわち、「対照方法」）と比較して、本発明によって生産された組換えＡＡＶの量は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％又はそれ以上増加する。一部の側面において、対照細胞と比較して、本発明の細胞は、生産された組換えＡＡＶの量を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、又は少なくとも約１００倍以上増加させることができる。
【0144】
本発明の他の所で記述されているように、一部の側面において、本明細書に提供された組換えＡＡＶを生産する方法は、生産及び／又は精製時間を減少させることができる。更なる利点は本発明の他の所で説明される。
【0145】
ＶＩＩＩ．Ｂ．タンパク質生産方法
また、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質（又は、ポリペプチド）を生産する方法が本明細書に開示される。一部の側面において、このような方法は、適切な条件下で（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ伝達体ベクターで形質感染された）本発明の細胞を培養する段階、及びエンコードされたタンパク質を回収する段階を含む。特定の側面において、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産する方法は、組換えＡＡＶを、これを必要とする対象体に投与する段階を含む。
また、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質（又は、ポリペプチド）を生産する方法が本明細書に開示される。一部の側面において、このような方法は、適切な条件下で（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ伝達体ベクターで形質感染された）本発明の細胞を培養する段階、及びエンコードされたタンパク質を回収する段階を含む。特定の側面において、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産する方法は、組換えＡＡＶを、これを必要とする対象体に投与する段階を含む。
【0146】
ＶＩＩＩ．Ｃ．治療用途
一部の側面において、本発明は、様々な治療適用のための本発明のデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶの用途を提供する。
一部の側面において、本発明は、様々な治療適用のための本発明のデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶの用途を提供する。
【0147】
例えば、一部の側面において、本発明は、外来遺伝子を含み、本明細書に記述されているように生成された組換えＡＡＶを対象体に投与する段階を含む、それを必要とする対象体において疾病を治療する方法を提供する。一部の側面において、本明細書に提供された疾病を治療する方法は、（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ遺伝子伝達体ベクターで形質感染された）本明細書に記述された任意の変形された細胞をそれを必要とする対象体に投与する段階を含む。一部の側面において、本明細書に提供された疾病を治療する方法は、（例えば、本明細書に提供された組換えＡＡＶを含む。）本明細書に記載された任意の薬剤学的組成物をそれを必要とする対象体に投与する段階を含む。本発明から明らかなように、前記方法は、例えば、外来遺伝子を変形させることによって任意の関心疾病を治療及び／又は予防するために用いられてよい。
【0148】
本発明によって予防、緩和又は治療される疾病は限定されず、薬物投与回数を減らすべき全ての疾病を含む。このような疾病の非制限的な例は、眼科疾患及び神経系疾患を含む。一部の側面において、前記眼科疾患は、糖尿病性網膜病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、脈絡膜新生血管形成（ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、網膜変性（ｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、黄斑浮腫（ｍａｃｕｌａｒ ｅｄｅｍａ）、網膜浮腫（ｒｅｔｉｎａｌ ｅｄｅｍａ）及び黄斑腫瘍（ｍａｓｃｕｌａｒ ｔｕｍｅｎｔｉａ）又はこれらの組合せを含む。一部の側面において、前記神経系疾患は、中枢神経系、末梢神経系又は両方に影響を及ぼす疾患を含む。神経系疾患の非制限的な例は、不安（ａｎｘｉｅｔｙ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、外傷後ストレス障害（ｐｏｓｔ－ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ，ＰＴＳＤ）、両極性障害（ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、注意力欠乏過剰行動障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ，ＡＤＨＤ）、自閉症（ａｕｔｉｓｍ）、精神分裂症（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）、神経病性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、中毒症（ｔｏｘｉｃｏｓｉｓ）、蜘蛛膜嚢腫（ａｒａｃｈｎｏｉｄ ｃｙｓｔ）、緊張症（ｃａｔａｔｏｎｉａ）、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、てんかん／発作（ｅｐｉｌｅｐｓｙ／ｓｅｉｚｕｒｅ）、閉じ込め症候群（ｌｏｃｋｅｄ－ｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、髓膜炎（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、片頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、脊髄病症（ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、バッテン病（Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、トゥレット症候群（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、脳脊髓損傷（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、振戦（ｔｒｅｍｏｒ）（本態性又はパーキンソン病）、筋緊張異常（ｄｙｓｔｏｎｉａ）、指摘障害（ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）又はこれらの組合せを含む。
【0149】
本発明の一部の側面は、外来遺伝子の連続的発現を達成できる遺伝子治療剤又は疾患を治療するためにこのような製剤を使用する方法に関する。
【0150】
本明細書に提供された遺伝子伝達体システム（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ）の使用は、医師、患者又は対象体の便宜のために薬物投与回数をだいぶ減少させ得る間隔で治療剤（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ）の投与を許容する。例えば、一部の側面において、治療剤は、約１週、約２週、約３週、約１ケ月、約２ケ月、約３ケ月、約４ケ月、約５ケ月、約６ケ月、約７ケ月、約８ケ月、約９ケ月、約１０ケ月、約１１ケ月又は約１年以上の間隔で投与されてよい。一部の側面において、その間隔は、約２～約３ケ月である。一部の側面において、その間隔は約６ケ月である。一部の側面において、その間隔は約１年である。一部の側面において、その間隔は、少なくとも約１年である。一部の側面において、患者の症状によって初期には約１～２週間隔で２～３回投与し、以後は、約２～３ケ月、約６ケ月、又は必要によって約１年以上の間隔で投与できる。
【0151】
投与（例えば、本明細書に記載された任意のＡＡＶ、細胞及び／又は薬剤学的組成物をそれを必要とする対象体に投与）段階を含む本明細書に提供された任意の方法において、治療剤は、対象体に経口又は非経口で投与されてよい。一部の側面において、治療剤（例えば、本明細書に記載された任意のＡＡＶ、細胞及び／又は薬剤学的組成物）は、非経口的に対象体に投与される。非経口投与の非制限的な例は、次を含む：静脈内注入、経皮投与、皮下注入、筋肉内注入、硝子体内注入（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、網膜下注入（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脈絡膜上腔注入（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、点眼投与（ｅｙｅ ｄｒｏｐ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳室内注入（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、髄腔内注射（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、羊膜内注入（ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、動脈内注入（ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、関節腔内注入（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心臓内注入（ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、陰茎海綿体内注入（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脳内注入（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、大槽注入（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、冠動脈内注入（ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、頭蓋内注入（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜内注入（ｉｎｔｒａｄｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜外注入（ｅｐｉｄｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、海馬内注入（ｉｎｔｒａｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、鼻腔内注入（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、骨腔内注入（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内注入（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腔内注入（ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脊髄内注入（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腔内注入（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｃｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腺内注入（ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、子宮内注入（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膣内注入（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心室内注入（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膀胱内注入（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、結膜下注入（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腫瘍内注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、局所注入、腹腔注入（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びこれらの組合せなど。
【0152】
当業者に明らかなように、治療剤（例えば、本発明の薬剤学的組成物）の適切な投与容量は、剤形方法、投与方式、年齢、体重、患者の性別、病理学的状態及び食餌、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応敏感度のような要因によって変わってよい。一部の側面において、治療剤（例えば、本発明の薬剤学的組成物）の１日投与容量は、約０．００００１～１００ｍｇ／ｋｇである。
【0153】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。下記の実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲が実施例によって限定されないということは、当業界における通常の知識を有する者に明らかであろう。
【0154】
実施例
材料及び方法
実施例１．三重形質感染用ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、５、８及び９構築物の製造
実施例１－１．ｐＲＣ８構築物製造
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ８－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／００２組合せを用いて重合酵素連鎖反応（以下、ＰＣＲ）を行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーンＤＮＡ断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ８構築物を製造した。
材料及び方法
実施例１．三重形質感染用ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、５、８及び９構築物の製造
実施例１－１．ｐＲＣ８構築物製造
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ８－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／００２組合せを用いて重合酵素連鎖反応（以下、ＰＣＲ）を行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーンＤＮＡ断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ８構築物を製造した。
【0155】
実施例１－２．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物製造
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－１のｐＲＣ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を、ｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を製造した。
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－１のｐＲＣ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を、ｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を製造した。
【0156】
実施例１－３．ｐＲＣ２構築物製造
ｐＲＣ２－ｍｉ３４２（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／０１０組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて両ＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ２構築物を製造した。
ｐＲＣ２－ｍｉ３４２（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／０１０組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて両ＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ２構築物を製造した。
【0157】
実施例１－４．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物製造
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１１／０１２組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、実施例１－３のｐＲＣ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１３／０１４組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて２ ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を製造した。
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１１／０１２組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、実施例１－３のｐＲＣ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１３／０１４組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて２ ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を製造した。
【0158】
実施例１－５．ｐＲＣ９構築物製造
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ９－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／０１５組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ９構築物を製造した。
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ９－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／０１５組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ９構築物を製造した。
【0159】
実施例１－６．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物製造
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－５のｐＲＣ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を、実施例１－１のｐＲＣ８を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣＲ２Ｃ９構築物を製造した。
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－５のｐＲＣ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を、実施例１－１のｐＲＣ８を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣＲ２Ｃ９構築物を製造した。
【0160】
実施例１－７．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物製造
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、ｐＲＣ５構築物（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００８／００９を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を製造した。
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、ｐＲＣ５構築物（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００８／００９を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を製造した。
【0161】
実施例２．ｐＨＩＯＮ８シリーズ構築物の製造
実施例２－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物製造
ＶＡ－Ｅ４－ｐＵＣ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）とＥ２ａ－ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）の両構築物に共通するＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に両構築物を結合する方法によってクローニングを行い、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧを製造した（図１Ａ）。前記ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧは、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
実施例２－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物製造
ＶＡ－Ｅ４－ｐＵＣ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）とＥ２ａ－ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）の両構築物に共通するＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に両構築物を結合する方法によってクローニングを行い、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧを製造した（図１Ａ）。前記ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧは、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
【0162】
実施例２－２．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な位置にｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子挿入
実施例２－２－１．ｐＨＩＯＮ８－ＢａｍＨＩ－正方向又は逆方向（ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ又は－ＢＲ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。図１Ｂは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向（時計回り方向、５’－＞３’）に挿入して前記構築物を製造した。図１Ｃは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を反時計回り方向である逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）に挿入して前記構築物を製造した。前記ｐＨＩＯＮ８－ＢＦはｐＨＮＧ８と、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲはｐＨＮＧＲ８と命名した。
実施例２－２－１．ｐＨＩＯＮ８－ＢａｍＨＩ－正方向又は逆方向（ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ又は－ＢＲ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。図１Ｂは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向（時計回り方向、５’－＞３’）に挿入して前記構築物を製造した。図１Ｃは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を反時計回り方向である逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）に挿入して前記構築物を製造した。前記ｐＨＩＯＮ８－ＢＦはｐＨＮＧ８と、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲはｐＨＮＧＲ８と命名した。
【0163】
実施例２－２－２．ｐＨＩＯＮ８－ＮｏｔＩ－正方向又は－逆方向（ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ又は－ＮＲ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＮｏｔＩ部位に挿入した（図１Ｄ及び図１Ｅ）。図１Ｄは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向に挿入し、前記構築物を製造した。図１Ｅは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を反時計回り方向である逆方向に挿入し、前記構築物を製造した。
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＮｏｔＩ部位に挿入した（図１Ｄ及び図１Ｅ）。図１Ｄは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向に挿入し、前記構築物を製造した。図１Ｅは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を反時計回り方向である逆方向に挿入し、前記構築物を製造した。
【0164】
実施例２－２－３．ｐＨＩＯＮ８－ＡｓｉＳＩ－正方向（ｐＨＩＯＮ８－ＡＦ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＶＡ ＲＮＡ遺伝子とＥ４遺伝子との間におけるＡｓｉＳＩ部位に時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を製造した（図１Ｆ）。
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＶＡ ＲＮＡ遺伝子とＥ４遺伝子との間におけるＡｓｉＳＩ部位に時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を製造した（図１Ｆ）。
【0165】
実施例３．ｐＨＮＧ２、ｐＨＮＧ５Ｋ及びｐＨＮＧ９構築物製造
実施例３－１．ｐＨＮＧ２構築物製造
実施例１－４のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ２と命名した。
実施例３－１．ｐＨＮＧ２構築物製造
実施例１－４のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ２と命名した。
【0166】
図２は、ｐＨＮＧ２構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ２構築物を製造した。
【0167】
実施例３－２．ｐＨＮＧ９構築物製造
実施例１－６のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ9遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ９と命名した。図３は、ｐＨＮＧ９構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ９構築物を製造した。
実施例１－６のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ9遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ９と命名した。図３は、ｐＨＮＧ９構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ９構築物を製造した。
【0168】
実施例３－３．ｐＨＮＧ５Ｋ構築物製造
実施例３－３－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物製造
ｐＭＫ－ＲＱ－１－ＰＭ構築物（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってカナマイシン抵抗性遺伝子断片を確保し、実施例２－１のｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１を用いてＰＣＲを行うことによってＥ４遺伝子断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２２／０２３を用いてＰＣＲを行うことによってＶＡ ＲＮＡ遺伝子においてＥ２ａ遺伝子のＮ－端末断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２４／０２５を用いてＰＣＲを行うことによってＥ２ａ遺伝子のＣ末端でオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）断片を確保した。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて前記４つのＤＮＡ断片を連結し、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物を製造した。
実施例３－３－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物製造
ｐＭＫ－ＲＱ－１－ＰＭ構築物（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってカナマイシン抵抗性遺伝子断片を確保し、実施例２－１のｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１を用いてＰＣＲを行うことによってＥ４遺伝子断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２２／０２３を用いてＰＣＲを行うことによってＶＡ ＲＮＡ遺伝子においてＥ２ａ遺伝子のＮ－端末断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２４／０２５を用いてＰＣＲを行うことによってＥ２ａ遺伝子のＣ末端でオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）断片を確保した。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて前記４つのＤＮＡ断片を連結し、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物を製造した。
【0169】
実施例３－３－２．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物にｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子挿入
実施例１－７のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６、＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、実施例３－３－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－ＫａｎのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ５Ｋと命名した（Ｋは、抗生剤抵抗性遺伝子であり、カナマイシン抵抗性遺伝子を用いていることを意味する。）。図４は、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
実施例１－７のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６、＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、実施例３－３－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－ＫａｎのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ５Ｋと命名した（Ｋは、抗生剤抵抗性遺伝子であり、カナマイシン抵抗性遺伝子を用いていることを意味する。）。図４は、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
【0170】
前記構築物を製造するために用いられたオリゴの配列を表１に提示する：
【0171】
【表1】
また、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に正方向（時計回り方向、５’－＞３’）に挿入して製造した構築物を総称してｐＨＮＧ（ｐＨＮＧ２、ｐＨＮＧ５（ｐＨＮＧ５Ｋを含む。）、ｐＨＮＧ８、ｐＨＮＧ９など）と命名し、逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）に挿入して製造した構築物を総称してｐＨＮＧＲ（ｐＨＮＧＲ８など）と命名した。これらの開裂地図は、図５Ａ及び図５Ｂに示す。
【0172】
実施例４．外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドの製造
外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドは、大韓民国特許出願第１０－２０２０－００８４０３８号に記載された方法によって製造した。具体的には、ｐＵＣ５７プラスミドに基づいて、ＡＡＶカプシドパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に必要な要素であるＡＡＶ２ ＩＴＲ塩基配列が両側末端に存在し、その間にＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ハイブリッドイントロン、外来遺伝子としてｅＧＦＰ遺伝子、ＷＰＲＥ配列、４つの反復のｍｉＲ１４２－３ｐターゲット配列、ウシ成長ホルモン（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）のｐＡ配列が含まれている形態で製造した。
外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドは、大韓民国特許出願第１０－２０２０－００８４０３８号に記載された方法によって製造した。具体的には、ｐＵＣ５７プラスミドに基づいて、ＡＡＶカプシドパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に必要な要素であるＡＡＶ２ ＩＴＲ塩基配列が両側末端に存在し、その間にＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ハイブリッドイントロン、外来遺伝子としてｅＧＦＰ遺伝子、ＷＰＲＥ配列、４つの反復のｍｉＲ１４２－３ｐターゲット配列、ウシ成長ホルモン（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）のｐＡ配列が含まれている形態で製造した。
【0173】
実施例５．塩基配列の確認
上記で製造した全ての構築物の塩基配列を塩基配列分析（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｂｉｏｎｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）によって確認した。
上記で製造した全ての構築物の塩基配列を塩基配列分析（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｂｉｏｎｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）によって確認した。
【0174】
実施例６．細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞株は、１０％ ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．１６０００－０４４）、１％ベニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｏｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５１４０－１６３）が含まれたＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．４２３６０－０３２）を用いて５％ ＣＯ２、３７℃条件で湿潤培養した。Ｅｘｐｉ２９３細胞株は、１％ベニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＥｘｐｉ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１－０１）を用いて８％ ＣＯ２、３７℃条件で２５０ｒｐｍで振りながら湿潤培養した。
ＨＥＫ２９３細胞株は、１０％ ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．１６０００－０４４）、１％ベニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｏｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５１４０－１６３）が含まれたＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．４２３６０－０３２）を用いて５％ ＣＯ２、３７℃条件で湿潤培養した。Ｅｘｐｉ２９３細胞株は、１％ベニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＥｘｐｉ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１－０１）を用いて８％ ＣＯ２、３７℃条件で２５０ｒｐｍで振りながら湿潤培養した。
【0175】
実施例７．形質感染
実施例７－１．ＡＡＶ生産のための付着細胞の形質感染
形質感染のために、ＨＥＫ２９３細胞株をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１４１９０－２５０）を用いて２回洗浄後にＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２５２００－１１４）を処理して培養皿から剥がして確保した後、１５０ｍｍ培養皿に２×１０７ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈで接種した。２４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、及び外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、総１ｍｌの形質感染溶液を、ＨＥＫ２９３細胞を培養していた培養皿に入れた。
実施例７－１．ＡＡＶ生産のための付着細胞の形質感染
形質感染のために、ＨＥＫ２９３細胞株をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１４１９０－２５０）を用いて２回洗浄後にＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２５２００－１１４）を処理して培養皿から剥がして確保した後、１５０ｍｍ培養皿に２×１０７ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈで接種した。２４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、及び外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、総１ｍｌの形質感染溶液を、ＨＥＫ２９３細胞を培養していた培養皿に入れた。
【0176】
実施例７－２．ＡＡＶ生産のための浮遊細胞の形質感染
ＡＡＶ生産のために、１Ｌエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）培養フラスコにおいて６×１０８細胞を２２０ｍｌのＥｘｐｉ２９３培地に接種した。安定化のために約３～４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５, ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、ｐＨＮＧ２プラスミド又はｐＨＮＧ９プラスミドと、外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、培養フラスコに総２０ｍｌの形質感染溶液を入れた。
ＡＡＶ生産のために、１Ｌエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）培養フラスコにおいて６×１０８細胞を２２０ｍｌのＥｘｐｉ２９３培地に接種した。安定化のために約３～４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５, ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、ｐＨＮＧ２プラスミド又はｐＨＮＧ９プラスミドと、外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、培養フラスコに総２０ｍｌの形質感染溶液を入れた。
【0177】
実施例８．ＡＡＶの精製
実施例７－１又は実施例７－２の形質感染７２時間後に、培養皿及び培養フラスコに５００ｍＭの濃度となるようにＮａＣｌを添加し、３時間反応させた。全ての培養液を回収して遠心分離によって残骸物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、１００ｋＤａの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ）気孔サイズを有するｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０，１００，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４℃で４０００ｒｐｍで上澄液が約２００ｕｌ残るまで遠心分離を行った。その後、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含んでいる上澄液を回収し、実験に使用又は－８０℃に保管した。
実施例７－１又は実施例７－２の形質感染７２時間後に、培養皿及び培養フラスコに５００ｍＭの濃度となるようにＮａＣｌを添加し、３時間反応させた。全ての培養液を回収して遠心分離によって残骸物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、１００ｋＤａの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ）気孔サイズを有するｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０，１００，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４℃で４０００ｒｐｍで上澄液が約２００ｕｌ残るまで遠心分離を行った。その後、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含んでいる上澄液を回収し、実験に使用又は－８０℃に保管した。
【0178】
実施例９．ＡＡＶ力価の決定
実施例８で精製したＡＡＶの力価を決定するためにｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，ＣＦＸ９６）を行った。ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，ＵＳＡ，Ｍ０３０３Ｓ）で１時間３７℃でＡＡＶにＤＮａｓｅＩを処理した。その後、ＤＮａｓｅＩが処理された試料に、プロテアーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＭ２５４８）を５５℃で３０分間処理し、続いて９５℃で１５分間反応させてプロテアーゼＫを不活性化させた。準備した試料をｑＰＣＲの鋳型として使用し、ＡＡＶ構築物プラスミド（７．４×１０８～７．４×１０４、１０倍希釈）を使用して標準曲線を求め、陽性対照群として組換えアデノ随伴ウイルス２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ２－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．ＶＲ－１６１６）又は組換えアデノ随伴ウイルス８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ８－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＲ－１８１６）を使用した。力価決定のためのｑＰＣＲのために、２ｘＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７２－５２８２）とｂＧＨ ｐｏｌｙ Ａ配列特異的プライマー（＃０２６、＃０２７）及びプローブ（＃０２８）を使用した。ｑＰＣＲは、９５℃で１０分変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）後に、９５℃で３０秒、６０℃で１分、を４０回反復した。標準曲線と定量は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸＭａｅｓｔｒｏ １．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
実施例８で精製したＡＡＶの力価を決定するためにｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，ＣＦＸ９６）を行った。ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，ＵＳＡ，Ｍ０３０３Ｓ）で１時間３７℃でＡＡＶにＤＮａｓｅＩを処理した。その後、ＤＮａｓｅＩが処理された試料に、プロテアーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＭ２５４８）を５５℃で３０分間処理し、続いて９５℃で１５分間反応させてプロテアーゼＫを不活性化させた。準備した試料をｑＰＣＲの鋳型として使用し、ＡＡＶ構築物プラスミド（７．４×１０８～７．４×１０４、１０倍希釈）を使用して標準曲線を求め、陽性対照群として組換えアデノ随伴ウイルス２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ２－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．ＶＲ－１６１６）又は組換えアデノ随伴ウイルス８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ８－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＲ－１８１６）を使用した。力価決定のためのｑＰＣＲのために、２ｘＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７２－５２８２）とｂＧＨ ｐｏｌｙ Ａ配列特異的プライマー（＃０２６、＃０２７）及びプローブ（＃０２８）を使用した。ｑＰＣＲは、９５℃で１０分変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）後に、９５℃で３０秒、６０℃で１分、を４０回反復した。標準曲線と定量は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸＭａｅｓｔｒｏ １．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【0179】
実施例１０．試験管内アデノ随伴ウイルスベクターを用いた形質感染
アデノ随伴ウイルスベクターの形質感染のために、２４ウェル培養プレートにウェル当たりに４×１０５のＨＥＫ２９３細胞を接種した。２４時間後に、各ウェルにＭＧ１３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｍ７４４９）を５ｕＭの濃度で８時間処理した。ＡＡＶ２では２，５００ ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９では１０，０００ ＭＯＩで処理し、７２時間培養した。
アデノ随伴ウイルスベクターの形質感染のために、２４ウェル培養プレートにウェル当たりに４×１０５のＨＥＫ２９３細胞を接種した。２４時間後に、各ウェルにＭＧ１３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｍ７４４９）を５ｕＭの濃度で８時間処理した。ＡＡＶ２では２，５００ ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９では１０，０００ ＭＯＩで処理し、７２時間培養した。
【0180】
実施例１１．流細胞分析法を用いたｅＧＦＰ遺伝子の発現強度測定
ｅＧＦＰの発現は、流細胞分析（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ，ＣｙｔｏＦｌｅｘ）によって測定した。形質感染７２時間後に、ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシンで剥がした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を確保し、２％ ＦＢＳが添加されたＤＰＢＳを５００ｕｌ添加して細胞を再懸濁した。流細胞分析において、ＦＳＣ ｖｓ ＳＳＣｐｌｏｔから単一細胞領域が区分付けられ、ＦＬ１－Ａ（ｇｒｅｅｎ）の発現レベルが測定された。全ての流細胞分析結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ １０．５．３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
ｅＧＦＰの発現は、流細胞分析（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ，ＣｙｔｏＦｌｅｘ）によって測定した。形質感染７２時間後に、ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシンで剥がした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を確保し、２％ ＦＢＳが添加されたＤＰＢＳを５００ｕｌ添加して細胞を再懸濁した。流細胞分析において、ＦＳＣ ｖｓ ＳＳＣｐｌｏｔから単一細胞領域が区分付けられ、ＦＬ１－Ａ（ｇｒｅｅｎ）の発現レベルが測定された。全ての流細胞分析結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ １０．５．３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【0181】
実施例１２．統計的分析
全ての実験を３回以上反復した。２グループ間の比較はＰｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ８．１．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてスチューデントｔ－検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）によって、３グループ以上の比較は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔ）によって比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
全ての実験を３回以上反復した。２グループ間の比較はＰｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ８．１．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてスチューデントｔ－検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）によって、３グループ以上の比較は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔ）によって比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【0182】
実験結果
１．増加したＡＡＶ８生産量を示すヘルパー－イン－ワン（Ｈｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ）プラスミド構築物選定
１－１．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において三重形質感染とｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加又は減少効果観察
二重形質感染に用いられる５種のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅプラスミド構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ；ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ）内の様々なｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置がＡＡＶ８生産量に及ぼす影響を付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてテストした。三重形質感染方法によるＡＡＶ８の生産量を１００％としたとき、二重形質感染時には、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置によってＡＡＶ生産量において様々な結果が得られた。ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（ｐＨＮＧ８）を使用した場合に２４４．３％、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（ｐＨＮＧＲ８）を使用した場合に１７０．２％とＡＡＶ８生産量が増加した。ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物を使用した場合に１２６．０％の生産量増加が見られるが、これは統計的に有意でなかった（ｐ＝０．８２）。一方、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を使用した場合に、ＡＡＶ８の生産量が却って減少した（６２．４％（ｐ＝０．５０）、７１．７％（ｐ＝０．７７））（図６）。
１．増加したＡＡＶ８生産量を示すヘルパー－イン－ワン（Ｈｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ）プラスミド構築物選定
１－１．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において三重形質感染とｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加又は減少効果観察
二重形質感染に用いられる５種のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅプラスミド構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ；ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ）内の様々なｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置がＡＡＶ８生産量に及ぼす影響を付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてテストした。三重形質感染方法によるＡＡＶ８の生産量を１００％としたとき、二重形質感染時には、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置によってＡＡＶ生産量において様々な結果が得られた。ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（ｐＨＮＧ８）を使用した場合に２４４．３％、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（ｐＨＮＧＲ８）を使用した場合に１７０．２％とＡＡＶ８生産量が増加した。ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物を使用した場合に１２６．０％の生産量増加が見られるが、これは統計的に有意でなかった（ｐ＝０．８２）。一方、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を使用した場合に、ＡＡＶ８の生産量が却って減少した（６２．４％（ｐ＝０．５０）、７１．７％（ｐ＝０．７７））（図６）。
【0183】
１－２．浮遊細胞株（Ｅｘｐｉ２９３）において三重形質感染とｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加又は減少効果
上の実験結果１－１と同じ実験を浮遊細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）においてテストした。以前の付着細胞株と類似に、二重形質感染時にｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物を使用した場合は、三重形質感染方法に比べて１７７．１％（ｐ＜０．００１）、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物を使用した場合は１７３．１％（ｐ＜０．００１）と、ＡＡＶ８生産量が統計的に有意に増加した。しかし、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦなどの構築物を使用した場合に、４０．９％、６６．７％、４３．１％レベルと、生産量減少が統計的に有意に確認された（図７）。
上の実験結果１－１と同じ実験を浮遊細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）においてテストした。以前の付着細胞株と類似に、二重形質感染時にｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物を使用した場合は、三重形質感染方法に比べて１７７．１％（ｐ＜０．００１）、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物を使用した場合は１７３．１％（ｐ＜０．００１）と、ＡＡＶ８生産量が統計的に有意に増加した。しかし、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦなどの構築物を使用した場合に、４０．９％、６６．７％、４３．１％レベルと、生産量減少が統計的に有意に確認された（図７）。
【0184】
これらの結果は、デュアルヘルパープラスミド内でのｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の相対的位置及び方向によってＡＡＶの生産量が決定され得ることを提示する。その後、二重形質感染のためのｐＨＩＯＮプラスミド内のＢａｍＨＩ部位に正方向（ＢＦ）にｒｅｐ２－ｃａｐ遺伝子が存在する構築物をｐＨＮＧと命名し、逆方向（ＢＲ）に存在する構築物をｐＨＮＧＲと命名した。その後には、ｃａｐ遺伝子が由来したアデノ随伴ウイルスの血清型を数字で表記した（ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ＝ｐＨＮＧ８、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ＝ｐＨＮＧＲ８）。
【0185】
２．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において三重形質感染とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によるＡＡＶ２生産量増加
ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造し、これを二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）方法に使用した（図２）。
ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造し、これを二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）方法に使用した（図２）。
【0186】
三重形質感染法とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染法によるＡＡＶ２の生産を比較した結果、三重形質感染に比べて二重形質感染法においてＡＡＶ２生産量が２７９．６％（ｐ＜０．００１）と有意に増加することを確認した（図８）。このような結果は、上述のｐＨＮＧ８による二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加と類似に、ｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に位置させると二重形質感染によってＡＡＶ２の生産量を増加させ得ることを提示する。
【0187】
３．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によるＡＡＶ９生産量増加
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングによってｐＨＮＧ９構築物を製造した（図３）。
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングによってｐＨＮＧ９構築物を製造した（図３）。
【0188】
三重形質感染とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によるＡＡＶ９の生産を比較した結果、三重形質感染に比べて二重形質感染においてＡＡＶ９生産量が２１４．０％（ｐ＜０．００１）と有意に増加することを確認した（図９）。このような結果は、上述のｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧ２による二重形質感染によるＡＡＶ８又はＡＡＶ２生産量増加と類似であった。結論的に、この結果は、アデノ随伴ウイルスの血清型９（ＡＡＶ９）においてもｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に位置させると二重形質感染法によるＡＡＶの生産量を増加させ得ることを提示する。
【0189】
４．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染によるＡＡＶ５生産量増加
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにＲｅｐ２－Ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて、正方向にクローニングを用いてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した（図４）。
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにＲｅｐ２－Ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて、正方向にクローニングを用いてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した（図４）。
【0190】
三重形質感染とｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染によるＡＡＶ５の生産を比較した結果、三重形質感染に比べて二重形質感染においてＡＡＶ５生産量が１９４．７％（ｐ＝０．００２）と有意に増加することを確認した（図１０）。このような結果は、上記のｐＨＮＧ８、ｐＨＮＧ２及びｐＨＮＧ９による二重形質感染によるＡＡＶ８、ＡＡＶ２又はＡＡＶ９生産量増加と類似であった。
【0191】
結論的に、この結果は、アデノ随伴ウイルスの血清型５（ＡＡＶ５）においてもｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に位置させると二重形質感染法によるＡＡＶの生産量を増加させ得ることを提示する。
【0192】
５．三重形質感染又は二重形質感染（ｐＨＮＧ８又はｐＨＮＧＲ８構築物）で生産したＡＡＶ８間の細胞形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性
三重形質感染によって生産したＡＡＶ８と、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８との細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ８は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ８を感染させ、７２時間後に、流細胞分析を用いて細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ８と比較したとき、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ８はいずれも類似の細胞感染力（Ｔｒｉｐｌｅ：６．０％、ｐＨＮＧ８：５．４％、ｐＨＮＧＲ８：５．７％）を示し、また、感染された細胞内でｅＧＦＰ発現レベルも類似であること（ｐＨＮＧ８：９３．４％、ｐＨＮＧＲ８：９４．６％）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ８とｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１１）。
三重形質感染によって生産したＡＡＶ８と、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８との細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ８は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ８を感染させ、７２時間後に、流細胞分析を用いて細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ８と比較したとき、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ８はいずれも類似の細胞感染力（Ｔｒｉｐｌｅ：６．０％、ｐＨＮＧ８：５．４％、ｐＨＮＧＲ８：５．７％）を示し、また、感染された細胞内でｅＧＦＰ発現レベルも類似であること（ｐＨＮＧ８：９３．４％、ｐＨＮＧＲ８：９４．６％）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ８とｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１１）。
【0193】
６．三重形質感染又は二重形質感染（ｐＨＮＧ２）で生産したＡＡＶ２形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性
ＡＡＶ２を用いて遺伝子を伝達する場合において、三重形質感染によって生産したＡＡＶ２とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ２は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に２，５００ＭＯＩの条件でＡＡＶ２を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって、ｅＧＦＰを発現する細胞の割合及び細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染によるＡＡＶ２と比較したとき、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ２は、細胞感染能力が少なくとも同等であったし（Ｔｒｉｐｌｅ：３２．０％、ＢＦ：４４．７％；ｐ＝０．３８）、感染された細胞当たりｅＧＦＰ発現レベルが同等であるか或いはやや高いこと（１２９．６％、ｐ＝０．０２）を確認した。ただし、両方の場合とも統計的に有意な差異は見られなかった。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ２と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力が少なくとも同等であることを提示する（図１２）。
ＡＡＶ２を用いて遺伝子を伝達する場合において、三重形質感染によって生産したＡＡＶ２とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ２は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に２，５００ＭＯＩの条件でＡＡＶ２を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって、ｅＧＦＰを発現する細胞の割合及び細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染によるＡＡＶ２と比較したとき、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ２は、細胞感染能力が少なくとも同等であったし（Ｔｒｉｐｌｅ：３２．０％、ＢＦ：４４．７％；ｐ＝０．３８）、感染された細胞当たりｅＧＦＰ発現レベルが同等であるか或いはやや高いこと（１２９．６％、ｐ＝０．０２）を確認した。ただし、両方の場合とも統計的に有意な差異は見られなかった。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ２と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力が少なくとも同等であることを提示する（図１２）。
【0194】
７．三重形質感染又は二重形質感染（ｐＨＮＧ９）で生産したＡＡＶ９形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性
ＡＡＶ９を用いて遺伝子を伝達する場合に、三重形質感染によって生産したＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ９は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ９を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ９と比較したとき、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ９は類似のｅＧＦＰ発現レベルを示すこと（９０．９％、ｐ＝０．３５）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１３）。
ＡＡＶ９を用いて遺伝子を伝達する場合に、三重形質感染によって生産したＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ９は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ９を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ９と比較したとき、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ９は類似のｅＧＦＰ発現レベルを示すこと（９０．９％、ｐ＝０．３５）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１３）。
【0195】
以上、本発明の実施例について説明したが、該当技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は追加などによって本発明を様々に修正及び変更可能であり、これも本発明の権利範囲内に含まれるといえよう。
【図面の簡単な説明】
【0196】
【図1A】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ａは、三重形質感染のためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を概略的に示し、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
【図1B】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。
【図1C】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。
【図1D】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。
【図1E】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。
【図1F】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｆは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の開始部分とＥ４遺伝子の末端部分との間に存在するＡｓｉＳＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を概略的に示す。
【図2】アデノ随伴ウイルスベクター血清型２（ＡＡＶ２）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ２構築物の開裂地図を示す。ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造した。
【図3】アデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ９構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ９構築物を製造した。
【図4】アデノ随伴ウイルスベクター血清型５（ＡＡＶ５）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ５Ｋ構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
【図6】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【図7】浮遊細胞株（Ｅｘｐｉ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【図8】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ２生産量増加の効果を観察した結果である。
【図9】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ９生産量増加の効果を観察した結果である。
【図10】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ５生産量増加の効果を観察した結果である。
【図11】三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物で二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）して生産されたＡＡＶ８間の細胞形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性結果である。
【図12】三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ２構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ２間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【図13】三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ９構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ９間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が順次に連結され、（ｉ）前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に時計回り方向に（５’から３’に）位置する：または、
（ｉｉ）前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に反時計回り方向に（３’から５’に）位置することを特徴とする、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含むデュアルヘルパープラスミド。
【請求項2】
前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結されることを特徴とする、請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項3】
前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結されることを特徴とする、請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項4】
前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子の３’末端は前記ｃａｐ遺伝子の５’末端に連結されることを特徴とする、請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項5】
（ｉ）前記ｒｅｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ２，ＡＡＶ２）由来のｒｅｐ２遺伝子を含む：または、
（ｉｉ）前記ｃａｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２；ｃａｐ２）、血清型５（ＡＡＶ５；ｃａｐ５）、血清型８（ＡＡＶ８；ｃａｐ８）、又は血清型９（ＡＡＶ９；ｃａｐ９）由来のｃａｐ遺伝子を含むことを特徴とする、請求項４に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項6】
（ｉ）前記Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＥ２ａ遺伝子を含む：
（ｉｉ）前記Ｅ４遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＥ４遺伝子を含む：または、
（ｉｉｉ）前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミド。
【請求項7】
前記デュアルヘルパープラスミドは、下記を含むことを特徴とする請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミド：（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【請求項8】
請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミドを含む組成物。
【請求項9】
追加プラスミドをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記追加プラスミドは、ＡＡＶ構築物プラスミドであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記追加プラスミドは、下記を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組成物：（ａ）逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）；
（ｂ）外来遺伝子；及び
（ｃ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素。
【請求項12】
請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミド又は請求項８に記載の組成物を含む試験管内の細胞。
【請求項13】
第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を試験管内で変形させる段階を含む組換えＡＡＶ生産方法であって、前記第１プラスミドは、請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは、外来遺伝子を含むことを特徴とする方法。
【請求項14】
第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を試験管内で変形させる段階を含む組換えＡＡＶの生産収率を増加させる方法であって、前記第１プラスミドは、請求項１に記載のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは、外来遺伝子を含み、前記変形後生産された組換えＡＡＶの量は、対照方法で生産された相応する量と比較して増加することを特徴とする方法。
【請求項15】
請求項１３に記載の方法によって生産された組換えＡＡＶ。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、遺伝子伝達体である組換えＡＡＶ生産用の新規なデュアルヘルパープラスミドに関する。
本発明は、遺伝子伝達体である組換えＡＡＶ生産用の新規なデュアルヘルパープラスミドに関する。
【0002】
［背景技術］
アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）は一本鎖ＤＮＡウイルスで、増殖のためにアデノウイルスなどの手助けが必要なヘルパー依存型パルボウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）に属する。これは、ゲノムサイズが約４．７ｋｂｐである非病原性ウイルスであり、細胞性免疫反応を誘導しない。感染対象は血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）によって大きく異なり、ウイルスは、非分裂（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ）及び分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）細胞に遺伝子を伝達することができる。特に、ＡＡＶによって伝達される遺伝子の発現は、生体内で長期間持続する［１－３］。
アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）は一本鎖ＤＮＡウイルスで、増殖のためにアデノウイルスなどの手助けが必要なヘルパー依存型パルボウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）に属する。これは、ゲノムサイズが約４．７ｋｂｐである非病原性ウイルスであり、細胞性免疫反応を誘導しない。感染対象は血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）によって大きく異なり、ウイルスは、非分裂（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ）及び分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）細胞に遺伝子を伝達することができる。特に、ＡＡＶによって伝達される遺伝子の発現は、生体内で長期間持続する［１－３］。
【0003】
一般に、組換えアデノ随伴ウイルスは、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）の三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって生産される［４］。三重形質感染を用いた組換えＡＡＶ生産は、１）ＩＴＲ（逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ））で囲まれた遺伝子発現カセットを持つＡＡＶ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）プラスミド、２）アデノ随伴ウイルスゲノムの複製に必要なＲｅｐタンパク質とウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を構成するカプシド（ｃａｐｓｉｄ）タンパク質を提供する「Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド」、最後に、３）アデノ随伴ウイルスの生活環（ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ）に役立つアデノウイルスのタンパク質（Ｅ２ａ、Ｅ４）及びＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を提供する「ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）プラスミド」が必要である。この３種のプラスミドが、アデノウイルスのＥ１及びＥ３遺伝子を提供するＨＥＫ２９３細胞株などに形質感染されるとアデノ随伴ウイルスが生産される［５］。
【0004】
上述した３種のプラスミドが同時に形質感染された細胞でのみ組換えアデノ随伴ウイルスベクターが生産される。もし、２種のプラスミドを一つに合わせて二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）をすると同時形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の確率が高くなり、結果として組換えアデノ随伴ウイルスの生産率が高まるであろう［６，７］。また、組換えアデノ随伴ウイルスを生産する上で必要なプラスミドの数が３種から２種に減ると、プラスミドを生産及び精製するのにかかる時間と費用も節約されるであろう［８］。
【0005】
組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を保有せず、アデノウイルス由来遺伝子を有していないため、生体内で複製不可である［９］。
【0006】
しかしながら、デュアルヘルパープラスミドを作る過程で、Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドとヘルパープラスミドとを合わせる方法によってプラスミド内のｒｅｐ、ｃａｐ、Ｅ２、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の相対的な位置が変わるが、これは、それぞれの遺伝子発現にそれぞれ異なる程度の影響を与えてしまい、生産性に及ぼす結果が非常に予測し難い。
【0007】
このため、組換えアデノ随伴ウイルスベクターの形質感染確率及びこれによる組換えアデノ随伴ウイルスの生産率を増加させるとともに、生産及び精製にかかる時間及び費用を低減するように考案された操作デュアルヘルパープラスミド及びその製造方法が切実に望まれている。
【0008】
［先行技術文献］
［非特許文献］
非特許文献１］ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７．３１（４）：３１７－３３４．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍ．Ｆ．Ｎａｓｏ，Ｂ．Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｗ．Ｌ．Ｐｅｒｒｙ３ｒｄ，Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ．
［非特許文献２］Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｓａｆ．２００２．１（１）：７９－９１．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｐ．Ｅ．Ｍｏｎａｈａｎ，Ｋ．Ｊｏｏｓｓ，Ｍ．Ｓ．Ｓａｎｄｓ．
［非特許文献３］Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９６．３（８）：６５８－６８．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）－ＣＦＴＲ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｌｕｎｇ．Ｃ．Ｋ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｓ．Ｓ．Ａｌｌｅｎ，Ｓ．Ａ．Ａｆｉｏｎｅ，Ｔ．Ｃ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｓ．Ｅ．Ｂｅｃｋ，Ｍ．Ｆｅｅ－Ｍａｋｉ，Ｘ．Ｂａｒｒａｚｚａ－Ｏｒｔｉｚ，Ｒ．Ａｄａｍｓ，Ｆ．Ｂ．Ａｓｋｉｎ，Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｂ．Ｇｕｇｇｉｎｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献４］Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９８．７２（３）：２２２４－２２３２．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｊ．Ｌｉ，Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ．
［非特許文献５］Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１０．２（８）：１６８１－１７０３．Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉ．Ｋｏｖｅｓｄｉ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｅｄｌｅｙ．
［非特許文献６］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８．９（１８）：２７４５－２７６０．Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｋ．Ｒｉｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献７］Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３．７（６）：８３９－８５０．Ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ，ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ，ａｎｄ ｔｗｏ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ ｔｏ ６．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｍ．Ａ．Ｋａｙ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献８］Ｂｉｏｒｅｓ．Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ．２０２０．９（１）：２１９－２２８．Ｔｗｏ－Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ．Ｑ．Ｔａｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｋｅｅｌｅｒ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｑ．Ｓｕ，Ｚ．Ｌｙｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．Ｇａｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献９］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１７．２８（１１）：１０７５－１０８６ Ｓｍａｌｌ Ｂｕｔ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ Ｍｉｇｈｔｙ：Ｌａｔｅｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｈ．Ｂｕｅｎｉｎｇ．
［発明の概要］
［課題を解決するための手段］
［非特許文献］
非特許文献１］ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７．３１（４）：３１７－３３４．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍ．Ｆ．Ｎａｓｏ，Ｂ．Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｗ．Ｌ．Ｐｅｒｒｙ３ｒｄ，Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ．
［非特許文献２］Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｓａｆ．２００２．１（１）：７９－９１．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｐ．Ｅ．Ｍｏｎａｈａｎ，Ｋ．Ｊｏｏｓｓ，Ｍ．Ｓ．Ｓａｎｄｓ．
［非特許文献３］Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９６．３（８）：６５８－６８．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）－ＣＦＴＲ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｌｕｎｇ．Ｃ．Ｋ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｓ．Ｓ．Ａｌｌｅｎ，Ｓ．Ａ．Ａｆｉｏｎｅ，Ｔ．Ｃ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｓ．Ｅ．Ｂｅｃｋ，Ｍ．Ｆｅｅ－Ｍａｋｉ，Ｘ．Ｂａｒｒａｚｚａ－Ｏｒｔｉｚ，Ｒ．Ａｄａｍｓ，Ｆ．Ｂ．Ａｓｋｉｎ，Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｂ．Ｇｕｇｇｉｎｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献４］Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９８．７２（３）：２２２４－２２３２．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｊ．Ｌｉ，Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ．
［非特許文献５］Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１０．２（８）：１６８１－１７０３．Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉ．Ｋｏｖｅｓｄｉ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｅｄｌｅｙ．
［非特許文献６］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８．９（１８）：２７４５－２７６０．Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｋ．Ｒｉｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献７］Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３．７（６）：８３９－８５０．Ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ，ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ，ａｎｄ ｔｗｏ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ ｔｏ ６．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｍ．Ａ．Ｋａｙ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ．
［非特許文献８］Ｂｉｏｒｅｓ．Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ．２０２０．９（１）：２１９－２２８．Ｔｗｏ－Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ．Ｑ．Ｔａｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｋｅｅｌｅｒ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｑ．Ｓｕ，Ｚ．Ｌｙｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．Ｇａｏ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ．
［非特許文献９］Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１７．２８（１１）：１０７５－１０８６ Ｓｍａｌｌ Ｂｕｔ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ Ｍｉｇｈｔｙ：Ｌａｔｅｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｈ．Ｂｕｅｎｉｎｇ．
［発明の概要］
［課題を解決するための手段］
【0009】
本発明は、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は順次に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に時計回り方向に（５’から３’に）位置する。
【0010】
本発明は、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子及びｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は順次に連結され、前記ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に反時計回り方向に（３’から５’に）位置する。
【0011】
本発明は、調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３０に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３０に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0012】
本発明は、調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３１に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３１に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0013】
本発明は、調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３２に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３２に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0014】
本発明は、調節要素を含むデュアルヘルパープラスミドを提供し、前記調節要素は、（５’から３’に）下記を含む：
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３３に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
（ｉ）配列番号３４に提示された配列を含むＥ２ａ遺伝子；
（ｉｉ）配列番号３５に提示された配列を含むＥ４遺伝子；
（ｉｉｉ）配列番号３６に提示された配列を含むＶＡ ＲＮＡ遺伝子；
（ｉｖ）配列番号３３に提示された配列を含むｃａｐ遺伝子；及び
（ｖ）配列番号２９に提示された配列を含むｒｅｐ遺伝子。
【0015】
本発明は、本発明のデュアルヘルパープラスミドを含む組成物を提供する。
【0016】
本発明は、本発明のデュアルヘルパープラスミド又は組成物を含む細胞を提供する。
【0017】
本発明は、第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を変形させる段階を含む組換えＡＡＶを製造する方法を提供し、前記第１プラスミドは本発明のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは外来遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含む。
【0018】
本発明は、第１プラスミド及び第２プラスミドを含むように細胞を変形させる段階を含む組換えＡＡＶの生産収率を増加させる方法を提供し、前記第１プラスミドは本発明のデュアルヘルパープラスミドであり、前記第２プラスミドは外来遺伝子を含み、前記変形後に生産された組換えＡＡＶの量は、基準方法で生産された相応する量と比較して増加する。
【0019】
本発明は、本発明の方法によって生産された組換えＡＡＶを提供する。
【0020】
本発明は、本発明の組換えＡＡＶ及び薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む薬剤学的製剤を提供する。
【0021】
本発明は、本発明の組換えＡＡＶ又は薬剤学的製剤を対象体に投与する段階を含む、それを必要とする対象体において疾病又は障害を治療する方法を提供する。
【0022】
本発明は、それを必要とする対象体において疾病又は障害を治療するための薬物の製造における本発明の組換えＡＡＶ又は薬剤学的製剤の用途を提供する。
【0023】
［図面の簡単な説明］
［図１］図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ａは、三重形質感染のためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を概略的に示し、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。図１Ｆは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の開始部分とＥ４遺伝子の末端部分との間に存在するＡｓｉＳＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を概略的に示す。
［図１］図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ａは、三重形質感染のためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を概略的に示し、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。図１Ｆは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の開始部分とＥ４遺伝子の末端部分との間に存在するＡｓｉＳＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を概略的に示す。
【0024】
［図２］アデノ随伴ウイルスベクター血清型２（ＡＡＶ２）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ２構築物の開裂地図を示す。ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造した。
【0025】
［図３］アデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ９構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ９構築物を製造した。
【0026】
［図４］アデノ随伴ウイルスベクター血清型５（ＡＡＶ５）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ５Ｋ構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
【0027】
［図５］図５Ａ及び図５Ｂは、ｐＨＮＧ及びｐＨＮＧＲ構築物の開裂地図を示す。図５Ａは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に正方向に挿入されたｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子断片を示し、図５Ｂは、逆方向に挿入されたｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子断片を示す。
【0028】
［図６］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【0029】
［図７］浮遊細胞株（Ｅｘｐｉ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【0030】
［図８］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ２生産量増加の効果を観察した結果である。
【0031】
［図９］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ９生産量増加の効果を観察した結果である。
【0032】
［図１０］付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ５生産量増加の効果を観察した結果である。
【0033】
［図１１］三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物で二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）して生産されたＡＡＶ８間の細胞形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性結果である。
【0034】
［図１２］三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ２構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ２間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【0035】
［図１３］三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ９構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ９間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【0036】
［発明を実施するための形態］
本発明は、組換えＡＡＶを生産するための組成物及び方法、並びに疾患又は障害を治療するための前述のｒＡＡＶの用途に関する。本明細書に述べているように、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、複数の遺伝子（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を含む。本出願人は、特定構成で多重遺伝子を配列することによって、組換えＡＡＶ生産時に収率又は生産性が増加又は減少し得ることを確認した。本発明の他の側面は本出願全体にわたって提供される。
本発明は、組換えＡＡＶを生産するための組成物及び方法、並びに疾患又は障害を治療するための前述のｒＡＡＶの用途に関する。本明細書に述べているように、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、複数の遺伝子（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を含む。本出願人は、特定構成で多重遺伝子を配列することによって、組換えＡＡＶ生産時に収率又は生産性が増加又は減少し得ることを確認した。本発明の他の側面は本出願全体にわたって提供される。
【0037】
Ｉ．定義
本発明全般にわたって用語「一つ」又は「一」は、当該エンティティのうち一つ以上を意味する。例えば、「一つのポリペプチド」は、一つ以上のポリペプチドを表すものと理解される。このように、用語「一つ」（又は、「一」）、「一つ以上」及び「少なくとも一つ」は、本明細書において相互互換的に使われてよい。
本発明全般にわたって用語「一つ」又は「一」は、当該エンティティのうち一つ以上を意味する。例えば、「一つのポリペプチド」は、一つ以上のポリペプチドを表すものと理解される。このように、用語「一つ」（又は、「一」）、「一つ以上」及び「少なくとも一つ」は、本明細書において相互互換的に使われてよい。
【0038】
また、本明細書で使われる「及び／又は」は、他のものがあるか又はない２つの明示された特徴又は構成要素のそれぞれの特定開示として見なされるべきである。したがって、本明細書において、「Ａ及び／又はＢ」のような句において使われる用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」のような句において使われる用語「及び／又は」は、次のそれぞれの側面を含むように意図される：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
【0039】
数字又は一連の数字の前における「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接した数字及び論理的に含まれ得る文脈において明確に全ての後続数字又は整数を含むものと理解される。例えば、核酸分子のヌクレオチド数は整数でなければならない。例えば、「２１－ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８個ヌクレオチド」は、１８個、１９個、２０個又は２１個ヌクレオチドが表示された特性を有するということを意味する。少なくとも一連の数字又は範囲の前にある場合に、「少なくとも」は、一連の数字又は範囲の各数字を修正し得るものと理解される。「少なくとも」は整数に限定されない（例えば、「少なくとも５％」は、有效数字の数を考慮せず、５．０％、５．１％、５．１８％を含む。）。
【0040】
本明細書において、「含む」という用語で記述される場合に、「構成される」及び／又は「本質的に構成される」との用語で記述される類似の形態も提供されるものと理解される。
【0041】
特に断らない限り、本明細書に使われる全ての技術及び科学用語は、本発明に係る技術の分野における通常の技術者が一般に理解するものと同じ意味を有する。例えば、文献（Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）は、本明細書で使われる多数の用語の一般的な意味を当業者に提供する。
【0042】
単位、接頭辞及び記号は、ＳＩ（Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ）許容形式で表示される。数字範囲には、範囲を限定する数字が含まれる。特に表示されない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向へと左側から右側に記録される。本明細書に提供された題目は、明細書全体を参照して有し得る本発明の様々な側面の制限ではない。したがって、下記定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【0043】
用語「約」は、本明細書において概略、凡そ、周辺又は領域を意味するもので使われる。「約」という用語が数値範囲と共に使われる場合に、これは、明示された数値の上下に境界を拡張して当該範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、例えば１０％の変動によって、上又は下に（より高かい又は低い）明示された値の上下に数値を修正し得る。
【0044】
本明細書で使われる用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、ＡＡＶ類型１、ＡＡＶ類型２、ＡＡＶ類型３（類型３Ａ及び３Ｂを含む。）、ＡＡＶ類型４、ＡＡＶ類型５、ＡＡＶ類型６、ＡＡＶ類型７、ＡＡＶ類型８、ＡＡＶ類型９、ＡＡＶ類型１０、ＡＡＶ類型１１、ＡＡＶ類型１２、ＡＡＶ類型１３、ＡＡＶｒｈ．７４、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）ＡＡＶ、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）ＡＡＶ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）ＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、これらののＡＡＶ血清型と系統物（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４）） ａｎｄ Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４））、及び現在知られている或いは後に発見される他のＡＡＶを含むが、これに限定されない（例えば、文献（ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照）。一部の側面において、「ＡＡＶ」は、公知のＡＡＶの誘導体を含む。一部の側面において、「ＡＡＶ」は、修正された又は人工のＡＡＶを含む。
【0045】
用語「投与」、「投与する」及びその類義語は、組成物（例えば、本発明のデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶ伝達体ベクター）を、薬学的に許容可能な経路を通じて対象体に導入することを意味する。対象体に組成物を導入することは、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）、経口、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｉｌｙ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ）、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）（静脈内（ｉｎｔａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、動脈内（ｉｎｔｒａ－ａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）又は皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ））、直腸内（ｒｅｃｔａｌｌｙ）、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、脊髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）、眼球周囲（ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒｌｙ）又は局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）を含む任意の適切な経路による。投与は、自己投与と他人による投与が含まれる。適切な投与経路は、組成物又は作用剤が意図した機能を果たすようにする。例えば、適切な経路が静脈内である場合に、組成物又は作用剤を対象体の静脈に導入することによって組成物を投与する。
【0046】
本発明において、「抗生剤抵抗性遺伝子（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ）」とは、微生物が抗生剤に露出されても生存できるように薬物耐性を付与する目的でプラスミドに挿入された遺伝子を意味する。本出願に記載されているように、一部の側面において、クローニングを用いて所望のプラスミドを有する細胞をスクリーニングするために抗生剤抵抗性遺伝子をプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）に導入できる。本発明に有用な抗生剤抵抗性遺伝子の例は、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、エリスロマイシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、スルファジアジン（Ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ）及びトリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）抵抗性遺伝子を含むが、これに限定されない。
【0047】
また、本明細書に記述されているように、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、特定配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）／構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）でデュアルヘルパープラスミドと一緒に存在するｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む。一部の側面において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、「時計回り方向（ｃｌｏｃｋｗｉｓｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」、「正方向（ｆｏｒｗａｒｄ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」又は「５’→３’」（例えば、図５Ａを参照）であり、これは、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が、時計回り方向に、又は複製が始まる部位（５’）から複製が終る部位（３’）への方向に挿入又は含まれることを意味する。一部の側面において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、「反時計回り方向（ｃｏｕｎｔｅｒｃｌｏｃｋｗｉｓｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」、「逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」又は「３’→５’」（例えば、図５Ｂを参照）であり、これは、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が、反時計回り方向に、又は複製が終わる部位（３’）から複製が始まる部位（５’）への方向に挿入又は含まれることを意味する。
【0048】
本明細書において、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、一つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をエンコードする遺伝子を意味し、前記ＯＲＦは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質又はその変異体又は誘導体をエンコードする。このようなＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（又は、その変異体又は誘導体）は、ＡＡＶゲノム複製及び／又はＡＡＶゲノムパッケージングに関与し、野生型ｒｅｐ遺伝子は、４種のＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をエンコードする。特記しない限り、「ｒｅｐ遺伝子」は、野生型ｒｅｐ遺伝子、その誘導体及び同等な機能を有する人工ｒｅｐ遺伝子を含む。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）に由来するｒｅｐ２遺伝子であってよい。一部の側面において、ｒｅｐ２遺伝子は、配列番号２９に提示された核酸配列を含む。
【0049】
本明細書において、用語「ｃａｐ遺伝子」は、一つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をエンコードする遺伝子を意味し、ＯＲＦは、ＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質、又はその変異体又は誘導体をエンコードする。４個のタンパク質がｃａｐ遺伝子から翻訳される。そのうち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質は、ＡＡＶ粒子を構成する構造タンパク質であり、ＡＡＰ（ａｓｓｅｍｂｌｙ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、構造タンパク質によるＡＡＶ粒子の形成（組立て）を促進する。特記しない限り、「ｃａｐ遺伝子」は、野生型キャップ遺伝子、その誘導体及びこれと同等な機能を有する人工キャップ遺伝子を含む。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２；ｃａｐ２）、血清型５（ＡＡＶ５；ｃａｐ５）、血清型８（ＡＡＶ８；ｃａｐ８）又は血清型９（ＡＡＶ９；ｃａｐ９）に由来するｃａｐ遺伝子である。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子は、配列番号３０（ｃａｐ２）、配列番号３１（ｃａｐ５）、配列番号３２（ｃａｐ８）又は配列番号３３（ｃａｐ９）に提示された核酸配列を含む。
【0050】
本明細書において、用語「Ｅ２ａ遺伝子」は、ＡＡＶのプロモーターを調節し、ＡＡＶゲノム複製を手伝い、Ｒｅｐ ｍＲＮＡのスプライシングとカプシドｍＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の増大によるカプシドタンパク質の生産性増加に関与するアデノウイルスのタンパク質Ｅ２ａをコードする遺伝子を意味する。特記しない限り、「Ｅ２ａ遺伝子」は、野生型Ｅ２ａ遺伝子、その誘導体及びこれと同等な機能を有する人工Ｅ２ａ遺伝子を含む。本発明の具体的な実施例において、前記Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）由来のＥ２ａ遺伝子である。一部の側面において、前記Ｅ２ａ遺伝子は、配列番号３４に提示された核酸配列を含む。
【0051】
本明細書において、用語「Ｅ４遺伝子」は、ＡＡＶの生活環においてＡＡＶゲノムの第二鎖（ｓｅｃｏｎｄ－ｓｔｒａｎｄ）の合成に関与し、ＡＡＶゲノムの複製を抑制する細胞内機序を担当するＭＲＮ（Ｍｒｅ１１－Ｒａｄ５０－Ｎｂｓ１）コンプレックス形成抑制によってＡＡＶゲノムの複製を手伝うアデノウイルスのタンパク質Ｅ４をコードする遺伝子を意味する。特記しない限り、「Ｅ４遺伝子」は、野生型Ｅ４遺伝子、その誘導体及び同等な機能を有する人工Ｅ４遺伝子を含む。一部の側面において、Ｅ４遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来するＥ４遺伝子である。一部の側面において、Ｅ４遺伝子は、配列番号３５に提示された核酸配列を含む。
【0052】
本明細書において、用語「ＶＡ ＲＮＡ遺伝子」又は「ＶＡ ＲＮＡ領域」は、ＡＡＶカプシドｍＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）増加及び翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）効率性を向上させ、Ｒｅｐ５２タンパク質の分解防止を手伝うＶＡ ＲＮＡを生産するＶＡ領域を意味する。特記しない限り、「ＶＡ ＲＮＡ遺伝子」は、野生型ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、その誘導体及び同等な機能を有する人工ＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。一部の側面において、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子である。一部の側面において、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、配列番号３６に提示された核酸配列を含む。
【0053】
本明細書において、用語「保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」は、それぞれ比較される２個以上の配列の同じ位置で変更されずに発生するポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を意味する。相対的に保存されたヌクレオチド又はアミノ酸は、配列の他の箇所に現れるヌクレオチド又はアミノ酸に比べて、より関連した配列間に保存されたものである。
【0054】
本明細書において、用語「調節要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、作動可能に連結された核酸（例えば、外来遺伝子）の発現を調節（例えば、増加又は減少）する核酸配列を意味する。適切な調節要素の非制限的な例は、本発明の他のところで提供される。
【0055】
一部の側面において、２個以上の配列が互いに１００％同一である場合に、「完全に保存された（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」又は「同一である（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」ことを表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である場合に、「高度に保存された（ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」と表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約９９％同一である場合に、「高度に保存された」と表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である場合に、「保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」と表す。一部の側面において、２個以上の配列が互いに約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約９９％同一である場合に、「保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）」と表す。配列の保存は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用されてもよく、その部分、領域又は特徴に適用されてもよい。
【0056】
本明細書において、用語「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、向上した転写を提供できる配列を含み、一部の場合に、さらに他の制御配列に対するそれらの配向と独立して働き得るＤＮＡの分節を意味する。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサー要素と協力的に又は付加的に働き得る。
【0057】
用語「賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」及び「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、相互互換的に使われ、化合物、例えば外来遺伝子を含み、本明細書に提供されたデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶ伝達体ベクターの投与をより容易にするために薬剤学的組成物に添加される不活性物質を意味する。
【0058】
用語「エクソン（ｅｘｏｎ）」は、タンパク質をエンコードする核酸の限られた部分、又は事前処理された（又は、前駆体）ＲＮＡの一部がスプライシングによって除去された後、ＲＮＡ分子の成熟した形態で表現される核酸配列を意味する。成熟したＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はｒＲＮＡ又はｔＲＮＡのような非暗号化ＲＮＡの機能的形態であってよい。
【0059】
用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを生産する過程を意味する。これは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのポリヌクレオチドの転写及びポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を含むが、これに限定されない。発現は、「遺伝子産物」又は「エンコードされたタンパク質」を生産する。本明細書で使われているように、遺伝子生成物は、例えば、遺伝子の転写によって生成されたＲＮＡのような核酸であってよい。本明細書において、遺伝子産物は、転写体から翻訳される核酸又はポリペプチドであってよい。本明細書に記述された遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化又はスプライシングを有する核酸、又は翻訳後修飾、例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化、脂質の添加、他のタンパク質サブユニットとの結合又はタンパク質分解切断を有するポリペプチドを含む。
【0060】
本明細書において、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、重合体分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間の全体的な単量体保存を意味する。追加修飾語がない「同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」という用語と関連して、例えば、ポリヌクレオチドＡがポリヌクレオチドＢと同一であるということは、ポリヌクレオチド配列が１００％同一であること（１００％配列同一性）を意味する。例えば、「７０％同一」のように２つの配列を記述することは、「７０％配列同一性」を有するものを説明することと同一である。
【0061】
例えば、２個のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、最適の比較目的のために２個の配列を整列することによって行われてよい（例えば、最適配列のために第１及び第２ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列のいずれか一方又は両方にギャップが導入されてよく、同一でない配列は比較目的で無視されてよい。）。特定の側面において、比較目的のために整列された配列の長さは、基準配列の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の参照配列長である。当該アミノ酸位置のアミノ酸又はポリヌクレオチドの場合、塩基を比較する。
【0062】
第一配列の位置が第二配列の当該位置と同じアミノ酸又はヌクレオチドによって占有されている場合に、分子は当該位置において同一である。２個の配列間のパーセント同一性は、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して配列によって共有される同じ位置の数の関数であり、これは、２個の配列の最適整列のために導入される必要がある。配列の比較及び２個の配列間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。
【0063】
様々な配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）を整列するために利用可能な適切なソフトウェアプログラムは、様々なソースから入手可能である。パーセント配列同一性を測定するための一つの適切なプログラムは、米国政府の国立生命工学情報センターＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で利用可能なプログラムのＢＬＡＳＴ製品群の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて両シーケンス間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために用いられるのに対し、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。他の適切なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳ生物情報学プログラム製品群の一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ又はＭａｔｃｈｅｒであり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）でも使用可能である。
【0064】
配列整列は、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ，Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどのような当業界に公知の方法を用いて行われてよい。
【0065】
ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列と整列される単一ポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の様々な領域はそれぞれ、それら自身のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は、最も近似する１０分の１に丸められる点に留意しなければならない。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３及び８０．１４は８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さ値は常に整数である。
【0066】
一部の側面において、第２アミノ酸配列（又は、核酸配列）に対する第１アミノ酸配列（又は、核酸配列）のパーセント同一性（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００ｘ（Ｙ／Ｚ）と計算され、ここで、Ｙは、一番目及び二番目の配列の整列（肉眼検査又は特定配列整列プログラムによって整列される。）において全く同一であると記録されたアミノ酸残基（又は、核塩基）の数であり、Ｚは、二番目の配列にある残基の総数である。第１配列の長さが第２配列よりも長い場合に、第１配列と第２配列のパーセント同一性は、第１配列に対する第２配列のパーセント同一性よりも高いだろう。
【0067】
当業者は、パーセント配列同一性の計算のための配列整列の生成が１次配列データによって排他的に駆動される二元配列－配列比較に限定されないということが理解できよう。また、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の位置）、又は系統発生学的データのような異種ソースからのデータと配列データを統合することによって配列整列が得られることが理解できよう。多重配列整列を得るために異種データを統合する適切なプログラムはＴ－Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、代案として、例えば、ＥＢＩから入手可能である。また、配列パーセント同一性を計算するために用いられる最終整列は自動又は手動で選別可能であることが理解できよう。
【0068】
本明細書において、用語「分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」、「抽出された（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）」及びこれらの類義語は相互互換的に使われ、一つ以上の精製過程を経た本発明の所定の組成物、例えば、外来遺伝子及び非番駅核酸配列を含むポリヌクレオチドの製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の状態を意味する。一部の側面において、本明細書でいう分離又は精製は、本発明の組成物、例えば汚染物を含有するサンプルから本明細書に記述のポリヌクレオチドを除去、部分的除去（例えば、分画）する過程である。
【0069】
本明細書において、用語「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」は、それぞれ、第２アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列に共有又は非共有結合した第１アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を意味する。第１アミノ酸又はポリヌクレオチド配列は、第２アミノ酸又はポリヌクレオチド配列に直接連結されたり併置してよく、或いは、介在配列が第１配列を第２配列に共有的に連結してよい。用語「連結された」は、５’末端又は３’末端において第１ポリヌクレオチド配列と第２ポリヌクレオチド配列が融合していることを意味する他、全体第１ポリヌクレオチド配列（又は、第２ポリヌクレオチド配列）の二番目のポリヌクレオチド配列（又は、一番目のポリヌクレオチド配列）の任意の２つのヌクレオチドへの挿入も含む。第１ポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合又はリンカーによって第２ポリヌクレオチド配列に連結されてよい。リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであってよい。
【0070】
用語「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ」及び「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」は相互互換的に使われ、ＲＮＡベース遺伝子調節に関与する真核生物に発見されるマイクロＲＮＡ分子を意味する。この用語は、前駆体から処理された一本鎖ＲＮＡ分子を表すのに使われる。一部の側面において、また、用語「アンチセンスオリゴマー」は、本発明のマイクロＲＮＡ分子を記述するのに使われてよい。本発明と関連したｍｉＲＮＡの名称及びその配列が本明細書に提供される。ｍｉｃｒｏＲＮＡは不完全な塩基対によって標的ｍＲＮＡを認識し結合して標的ｍＲＮＡの不安定化又は翻訳抑制を誘導し、標的遺伝子発現を下方調節する。逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む分子（一般に、ｍｉＲＮＡのシード領域に相補的な配列を含む分子）を用いてｍｉＲＮＡを標的化することは、標的遺伝子の上方調節を引き起こすｍｉＲＮＡ－誘導翻訳抑制を減少又は抑制させることができる。
【0071】
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」及びこれらの類義語は相互互換的に使われ、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、本明細書において５’から３’方向に提示される。本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子であってよい。ヌクレオチド塩基は、本明細書において次のような単一文字コードで表示される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）及びウラシル（Ｕ）。
【0072】
本明細書において、用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」又は「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、連結されたＤＮＡ配列が互いに隣接して所望の機能を行うことを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列（例えば、外来遺伝子）の転写を開始することに役立てる場合に、このようなプロモーターは、コーディング領域と作動的に連結されてよい。このような機能的関係が維持される限り、プロモーターとコーディング領域とが必ずしも隣接して位置する必要はない。
【0073】
「薬剤学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」、「薬剤学的に許容可能な賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」及びこれらの類義語は、米国連邦政府の規制機関によって承認されたり、又はヒトを含む動物に対する使用に関して米国薬典に述べられた任意の製剤と対象体に対する組成物の投与を禁止し、投与された化合物の生物学的活性及び特性を妨害しない程度に好ましくない生理学的効果の生成を誘発しない任意の担体又は希釈剤を含む。これは、薬剤学的組成物を製造するのに有用であり、一般的に安全で且つ無毒性であり、好ましい賦形剤及び担体を含む。
【0074】
本明細書において、用語「薬剤学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、薬剤学的に許容可能な担体及び賦形剤のような一つ以上の他の化学成分と混合又は組合せされたり、若しくはそれに浮遊された本明細書に記述の一つ以上の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び／又は組換えウイルス）を意味する。
【0075】
本明細書で使われる用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」及び「プロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は相互互換的に使われてよく、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を意味する。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、本来遺伝子（ｎａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ）から全体的に由来可能であるか、自然から発見される様々なプロモーターに由来する様々な要素で構成されるか、ひいては合成ＤＮＡセグメントを含んでよい。様々なプロモーターが様々な組織又は細胞類型において、又は様々な発達段階において、又は様々な環境的又は生理学的条件に対する反応によって遺伝子の発現を指示できるということが当業者には理解される。総じて、大部分の細胞類型に遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という。遺伝子を特定細胞類型において発現させるプロモーターは、通常、「細胞特異的プロモーター（ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」又は「組織特異的プロモーター（ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という。発達又は細胞分化の特定段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「発達特異的プロモーター（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」又は「細胞分化特異的プロモーター（ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」という。プロモーターを誘導する作用剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の露出又は処理後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」又は「調節可能なプロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」を表す。また、総じて、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【0076】
プロモーター配列は典型的に、転写開始部位によってその３’末端に結合し、背景から検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含むように上向き（５’方向）に延長される。プロモーター配列内でＲＮＡポリメラーゼの結合を担当するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）の他にも、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１とのマッピングによって便利に定義される。）が確認されるであろう。一部の側面において、本発明に使用可能なプロモーターは、組織特異的プロモーターを含む。
【0077】
本明細書において、用語「遺伝子調節領域（ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）」又は「調節領域（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）」は、コーディング領域の上流（５’非コーディング配列）、内部又は下流（３’非コーディング配列）に位置しているヌクレオチド配列を意味し、関連したコーディング領域の転写、ＲＮＡ処理、安定性又は翻訳に影響を及ぼす。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダ配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）、ポリアデニル化認識配列（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＲＮＡ加工部位（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇサイト）、エフェクター結合部位又はステム－ループ構造（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を含んでよい。コーディング領域が真核細胞で発現するように意図された場合に、ポリアデニル化信号及び転写終結配列は一般的にコーディング配列の３’に位置するであろう。
【0078】
一部の側面において、本明細書で提供される核酸組成物（例えば、発現構築物）は、一つ以上のコーディング領域と作動可能に関連付けられたプロモーター及び／又は他の発現（例えば、転写）調節要素を含んでよい。作動可能な関連付けにおいて、遺伝子産物に対するコーディング領域は、調節領域の影響又は制御下に遺伝子産物の発現を置く方式で一つ以上の調節領域と関連付けられる。例えば、プロモーター機能の誘導が、コーディング領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を誘導し、プロモーターとコーディング領域間の連結特性が、遺伝子産物の発現を指示するプロモーターの能力を妨害したり又は転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨害したりしてはいけない場合に、コーディング領域とプロモーターは「作動可能に関連付け（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」される。プロモーターに加え、他の発現調節要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結信号も、遺伝子産物発現を指示するコーディング領域と作動可能に関連付けられてよい。
【0079】
本明細書において、用語「外来遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、組換え発現構築物内にエンコードされた一つ以上のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域又はこのようなポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域の発現産物、ポリペプチド又は多重ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド又は調節核酸（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を意味する。一部の側面において、前記外来遺伝子は、対象体又は患者の身体内で持続的な発現を目的とする、特定疾患の治療用ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列であってよい。一部の側面において、「作動的に連結された」又は「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が所望の機能を果たすように隣接して位置することを意味し、例えば、特定プロモーターがコーディング配列（例えば、外来遺伝子）の転写を開始することに役立てる場合に、このようなプロモーターはコーディング領域と作動的に連結されてよい。このような機能的関係が維持された限り、プロモーターとコーディング領域とが必ずしも隣接して位置する必要はない。
【0080】
本明細書において、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」又は「構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、核酸又は遺伝子を挿入できる構築物を意味し、好ましくは、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を含む。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。核酸配列は外来遺伝子であってよい。構築物としては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、ＡＡＶ）を挙げることができるが、これに限定されない。当業者は標準的な組換え技術によって前記ベクター又は構築物を構築できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９４）。
【0081】
本明細書において、用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、転写された遺伝子産物の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むベクター又は構築物を意味する。一部の場合には、転写されたＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。発現構築物には様々な調節要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）が含まれてよい。転写及び翻訳を調節する調節配列に加え、ベクター及び発現ベクターには、さらに他の機能も提供するヌクレオチド配列も含まれてよい。
【0082】
本明細書において、用語「対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ＡＡＶ（本願で提供された方法を用いて生成される。）又はこのようなＡＡＶを含む組成物が投与される対象体を意味する。非制限的な例として、診断、治療又は療法が必要なヒト、家畜（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験室動物（例えば、サル、ネズミ、マウス、ウサギ、ギニアピッグなど）が挙げられ、特にヒトである。本明細書に記載の方法は、ヒト治療及び獣医学適用の両方に適用可能である。
【0083】
本明細書において、「それを必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、本明細書に記述された組成物の投与から利益を得る対象体、例えば哺乳動物を含む。
【0084】
本明細書において、用語「治療的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、所望の治療効果を示すのに十分な本発明の組成物（例えば、外来遺伝子及び非番駅核酸配列を含むポリヌクレオチド）を含む試薬又は薬剤学的化合物の量である。治療的有効量は、予防が療法と見なされ得ることから、「予防的有効量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」であってよい。
【0085】
本明細書において、用語「外来遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、組換え発現構築物又はポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域の発現産物、ポリペプチド又は多重ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は変調（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）又は調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）核酸を意味する。一部の側面において、前記外来遺伝子は、それが挿入（又は、形質導入）される細胞に対して異種であってよい（すなわち、細胞から自然的に発現しない。）。
【0086】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、例えば、疾病又は状態の重症度減少；疾病進行期間短縮；疾病又は状態と関連した一つ以上の症状の改善又は除去；疾病又は状態を必ずしも治療せず、疾病又は状態を持つ被験者に有益な効果を提供すること、を意味する。この用語は、また、疾病又は状態又はその症状の予防又は防止を含む。
【0087】
用語「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」は、基準ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を意味する。
【0088】
本明細書において、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」又は「構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、核酸又は遺伝子が挿入され得る任意の運搬体を意味し、これは、複製可能な細胞への導入のために核酸配列が挿入され得る伝達運搬体のようなものである。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。核酸配列は外来遺伝子であってよい。構築物としては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、ＡＡＶ）を挙げることができるが、これに限定されない。当業者は、標準的な組換え技術によって前記ベクター又は構築物を構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９４）。本明細書において、用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、転写された遺伝子産物の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含むベクター又は構築物を意味する。一部の場合には、転写されたＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。発現構築物には様々な調節要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）が含まれてよい。転写及び翻訳を調節する調節配列に加え、ベクター及び発現ベクターにはさらに他の機能も提供するヌクレオチド配列も含まれてよい。
【0089】
ベクターは、ベクターが混入された細胞の選択又は識別のために提供する選択可能なマーカー又はレポーターをエンコードするように操作されてよい。選択可能なマーカー又はレポーターの発現は、ベクターに含まれた他のコーディング領域を包含及び発現する宿主細胞の識別及び／又は選択を可能にする。当業界に公知され、使用されている選別可能なマーカー遺伝子の例は、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）除草剤（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）、スルフォンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）などに対する耐性を提供する遺伝子；及び表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などである。当該分野で公知され、使用されてているレポーターの例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択可能なマーカーはレポーターと考慮されてもよい。
【0090】
ＩＩ．デュアルヘルパープラスミド
ＩＩ．Ａ．Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子
本発明の一部の側面は、デュアルヘルパープラスミドに関する。本明細書で立証されているように、このようなデュアルヘルパープラスミドは、（例えば、関心タンパク質をコードする外来遺伝子を含む）組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生産するのに特に有用であり得る。
ＩＩ．Ａ．Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子
本発明の一部の側面は、デュアルヘルパープラスミドに関する。本明細書で立証されているように、このようなデュアルヘルパープラスミドは、（例えば、関心タンパク質をコードする外来遺伝子を含む）組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生産するのに特に有用であり得る。
【0091】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡウイルスであり、且つヘルパー依存型ヒトパルボウイルスである。ゲノムサイズは約４．７ｋｂｐである。ゲノムのＮ末端は、ウイルス複製及びウイルス遺伝子発現に関与するｒｅｐ遺伝子をエンコードし、Ｃ末端は、ウイルスのカプシドタンパク質を暗号化するｃａｐ遺伝子をエンコードする。約１４５塩基の逆末端反復配列（ＩＴＲ）が両末端部位に挿入されている。Ｔ字状の構造を有する１４５ｂｐサイズのＩＴＲ（逆末端反復配列）は、ウイルス遺伝体複製時に複製原点の機能を果たし、１次的なパッケージング信号として作用する。ＩＴＲは、組換えＡＡＶ構築物を作る時に唯一に必要なｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ塩基配列であり、Ｒｅｐタンパク質の存在下ではエンハンサー活性を有するが、、Ｒｅｐタンパク質がない時には非常に弱い活性を有するので、組換えＡＡＶ構築物に外来遺伝子をクローニングする時に、それを考慮してエンハンサー、プロモーター、ｐＡなどを適切に構成して発現構築物を作製する（ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ａｎｄ Ｎ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌｏ．２０１４．１：４２７－４５１）。ｒｅｐ遺伝子からは４個のタンパク質が翻訳されるが、これらはその分子量によってｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０に区分され、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に重要な働きをする。ｃａｐ遺伝子からは４個のタンパク質が翻訳されるが、そのうち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質はＡＡＶ粒子を構成する構造タンパク質であり、組立－活性化タンパク質（ＡＡＰ，ａｓｓｅｍｂｌｙ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、前記構造タンパク質によるＡＡＶ粒子の形成を促進する。前記アデノ随伴ウイルスが効率的に複製されるためには、アデノウイルス或いはヘルペスシンプレックスウイルスのようなヘルパーウイルス（ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）に由来する一部のタンパク質及びＲＮＡを必要とする（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８，９７－１２９，１９９２）。
【0092】
本明細書において、用語「デュアルヘルパープラスミド（ｄｕａｌ－ｈｅｌｐｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）」は、細胞においてＡＡＶを生成するための要件のうち２個以上を提供できるプラスミドを意味する。外来遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターを生産するためには、下記の構成要素が宿主細胞に提供される必要がある：（１）外来遺伝子、（２）ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質、及び（３）Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡタンパク質。本発明の他の所で記述されているように、伝統的な方法により、異なる要件が、３個の異なるプラスミド（すなわち、（１）ＩＴＲ側面にある外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミド、（２）Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド、及び（３）ヘルパープラスミド）によって細胞に提供される。
【0093】
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記載のデュアルヘルパープラスミドは、前述した要件（２）及び（３）を提供する。例えば、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
【0094】
本明細書で立証されているように、本明細書に記述のデュアルヘルパープラスミドは、前述した遺伝子を含む他にも、前記遺伝子はプラスミドにおいて特定構成で配列される。例えば、一部の側面において、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、デュアルヘルパープラスミド内で順次に連結され、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子（本明細書では「ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子」と言及される。）は、Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端とを時計回り方向に（５’から３’に）順次に連結する。より具体的には、一部の側面において、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結される。このようなデュアルヘルパープラスミドの非制限的な例は、図５Ａに提示されている。
【0095】
一部の側面において、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子は順次に連結され、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子は反時計回り方向に（３’から５’に）Ｅ２ａ遺伝子の５’末端とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端との間に存在する。より具体的には、一部の側面において、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の３’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の５’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結される。このようなデュアルヘルパープラスミドの非制限的な例は、図５Ｂに提示されている。
【0096】
本発明から明らかなように、一部の側面において、上述したそれぞれのＥ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子はアデノウイルスに由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、同じＡＡＶ血清型に由来する。例えば、一部の側面において、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ２に由来する（例えば、実施例１－４に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を参照）。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、様々な血清型を有するＡＡＶに由来する。例えば、本明細書で立証されているように、一部の側面において、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８（ｃａｐ８又はその断片）に由来し、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２（ｒｅｐ２又はその断片）に由来する（例えば、実施例１－２に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を参照）。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９（ｃａｐ９又はその断片）に由来し、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２（ｒｅｐ２又はその断片）に由来する（例えば、実施例１－６に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物を参照）。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５（ｃａｐ５又はその断片）に由来し、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２（ｒｅｐ２又はその断片）に由来する（例えば、実施例１－７に記述されたｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を参照）。
【0097】
本発明で使用可能なＡＡＶの類型又は血清型の非制限的な例は、ＡＡＶｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－ｌｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶｌ－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶｌ－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｌ１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．ｌ７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．ｌ５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．ｌ６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．ｌ９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶ Ａ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶ Ａ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－ｌ／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒｌ、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ｃａｐｒｉｎｅ ＡＡＶ、ｂｏｖｉｎｅ ＡＡＶ、ＡＡＶｈＥｌ．１、ＡＡＶｈＥｒｌ．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒｌ．８、ＡＡＶｈＥｒｌ．１６、ＡＡＶｈＥｒｌ．１８、ＡＡＶｈＥｒｌ．３５、ＡＡＶｈＥｒｌ．７、ＡＡＶｈＥｒｌ．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、Ｂ Ｐ６１ＡＡＶ、Ｂ Ｐ６２ＡＡＶ、Ｂ Ｐ６３ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０血清型、及びこれらの組合せを含む。
【0098】
一部の側面において、本発明に有用なアデノ随伴ウイルスの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、又はこれらの組合せを含む。したがって、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ１に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ１に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ１に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ１に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ２に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ２に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ３に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ３に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ３に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ３に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ４に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ４に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ４に由来である。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ４に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ５に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ５に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ６に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ６に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ６に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ６に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ７に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ７に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ７に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ７に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ８に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ８に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ８に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ８に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶ９に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ９に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶ９に由来する。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドの多重遺伝子のうち一つ以上は、ＡＡＶｒｈ１０に由来する。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶｒｈ１０に由来する。一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶｒｈ１０に由来する。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はいずれもＡＡＶｒｈ１０に由来する。
【0099】
一部の側面において、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号２９に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子は、配列番号２９に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｒｅｐ遺伝子は、配列番号２９に記載された核酸配列を含む。
【0100】
一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９に由来する。
【0101】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来する。したがって、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ２に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ２）を含む。ＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３０に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３０に提示された配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３０に提示された核酸配列を含む。
【0102】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来する。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドはＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ５に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ５）を含む。ＡＡＶ５ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３１に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドはＥ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は配列番号３１に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３１に提示された核酸配列を含む。
【0103】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ８に由来する。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ８に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ８）を含む。ＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３２に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３２に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３２に提示された核酸配列を含む。
【0104】
一部の側面において、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９に由来する。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（ｒｅｐ２）及びＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（ｃａｐ９）を含む。ＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３３に提示されている。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子は、配列番号３３に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ｃａｐ遺伝子、は配列番号３３に提示された核酸配列を含む。
【0105】
一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来する。Ａｄ５Ｅ２ａ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３４に提示されている。したがって、一部の側面において、本発明に有用なデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ２ａ遺伝子は配列番号３４に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ２ａ遺伝子は、配列番号３４に提示された核酸配列を含む。
【0106】
一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ４遺伝子はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来する。Ａｄ５ Ｅ４遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３５に提示されている。一部の側面において、本発明に有用なデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ４遺伝子は、配列番号３５に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記Ｅ４遺伝子は、配列番号３５に提示された核酸配列を含む。
【0107】
一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に由来する。Ａｄ５ ＶＡ ＲＮＡ遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３６に提示されている。一部の側面において、本発明に有用なデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、配列番号３６に提示された配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含み、前記ＶＡ ＲＮＡ遺伝子は、配列番号３６に提示された核酸配列を含む。
【0108】
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記述されたデュアルヘルパープラスミドは、同一のウイルス供給源又は多重のウイルス供給源に由来する遺伝子を含む。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ２に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３０）；及び（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含む。一部の側面において、記載されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ５に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３１）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（配列番号２９）を含む。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ８に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３２）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含む。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、配列番号３３）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含む。
【0109】
本明細書に記述され、立証されているように、前述した遺伝子（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）の一つ以上の配列は、本発明のデュアルヘルパープラスミドの特定特性を改善するのに役立ち得る。例えば、一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、それぞれ配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含み、前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は時計回り方向である。例えば、一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子の５’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結され、ｒｅｐ遺伝子の３’末端はｃａｐの５’末端に連結され、ｃａｐ遺伝子の３’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結される（図５Ａ参照）。一部の側面において、記述されたデュアルヘルパープラスミドは、（ｉ）Ａｄ５に由来するＥ２ａ遺伝子（例えば、配列番号３４）；（ｉｉ）Ａｄ５に由来するＥ４遺伝子（例えば、配列番号３５）；（ｉｉｉ）Ａｄ５に由来するＶＡ ＲＮＡ遺伝子（例えば、配列番号３６）、（ｉｖ）ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９に由来するｃａｐ遺伝子（例えば、それぞれ配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３）；及び、（ｖ）ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号２９）を含み、前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は反時計回り方向である。一部の側面において、ｒｅｐ遺伝子の５’末端はＶＡ ＲＮＡ遺伝子の３’末端に連結され、ｒｅｐ遺伝子の３’末端はｃａｐ遺伝子の５’末端に連結され、ｃａｐ遺伝子の３’末端はＥ２ａ遺伝子の５’末端に連結される（図５Ｂ参照）。
【0110】
本明細書に記述された特徴（例えば、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の特定配列）に基づいて、本発明のデュアルヘルパープラスミドは、下記の改善された特性のうち一つ以上を示す：１）宿主細胞が組換えＡＡＶを生産するのに必要な全ての構成要素を有するように同時形質感染確率の増加、２）組換えアデノ随伴ウイルスの生産性の増加、３）プラスミド生産及び精製費用及び時間の減少。このような特性に関する追加開示は、本発明の他の所で提供される。
【0111】
ＩＩ．Ｂ．追加特徴
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、組換えＡＡＶ生産に有用な一つ以上の追加特徴を含む。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、抗生剤抵抗性遺伝子をさらに含む。例えば、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは選別マーカーをさらに含む。本明細書において、用語「選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）」は、核酸配列が発現する細胞を識別するのに使用可能な任意の遺伝子を意味する。したがって、このような選別マーカーは、本明細書に記述されたデュアルヘルパープラスミドで形質感染後に、形質転換された細胞を確認し豊富にするのに用いられてよい。本発明と共に使用可能な選別マーカーは、当業界に公知された任意の適切な選別マーカーを含む。適切な選別マーカーの非制限的な例は、（ｉ）抗生剤に対する抵抗性をエンコードする酵素（すなわち、「抗生剤抵抗性遺伝子」）、例えば、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）又はゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）；又は、（ｉｉ）蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む。
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、組換えＡＡＶ生産に有用な一つ以上の追加特徴を含む。例えば、一部の側面において、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドは、抗生剤抵抗性遺伝子をさらに含む。例えば、一部の側面において、デュアルヘルパープラスミドは選別マーカーをさらに含む。本明細書において、用語「選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）」は、核酸配列が発現する細胞を識別するのに使用可能な任意の遺伝子を意味する。したがって、このような選別マーカーは、本明細書に記述されたデュアルヘルパープラスミドで形質感染後に、形質転換された細胞を確認し豊富にするのに用いられてよい。本発明と共に使用可能な選別マーカーは、当業界に公知された任意の適切な選別マーカーを含む。適切な選別マーカーの非制限的な例は、（ｉ）抗生剤に対する抵抗性をエンコードする酵素（すなわち、「抗生剤抵抗性遺伝子」）、例えば、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）又はゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）；又は、（ｉｉ）蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む。
【0112】
一部の側面において、選別マーカーは、抗生剤抵抗性遺伝子を含む。一部の側面において、抗生剤抵抗性遺伝子は、アンピシリン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、又は両方を含む。アンピシリン抵抗性遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３７に提示されている。カナマイシン抵抗性遺伝子に対する核酸配列は、配列番号３８に提示されている。
【0113】
ＩＩＩ．発現構築物
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に提供されたデュアルヘルパープラスミドは、例えば、組換えＡＡＶを生成するとき、一つ以上の追加プラスミドと組み合わせて使用されてよい。一部の側面において、追加プラスミドは、組換え発現構築物、例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド（ここで「発現構築物」という。）を含む。発現構築物の例示的な側面が、下記に記述されている。
本発明から明らかなように、一部の側面において、本明細書に提供されたデュアルヘルパープラスミドは、例えば、組換えＡＡＶを生成するとき、一つ以上の追加プラスミドと組み合わせて使用されてよい。一部の側面において、追加プラスミドは、組換え発現構築物、例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド（ここで「発現構築物」という。）を含む。発現構築物の例示的な側面が、下記に記述されている。
【0114】
ＩＩＩ．Ａ．外来遺伝子（例えば、ＩＴＲの側面に位置）
本発明の他の所でさらに記述されているように、一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む。このような側面において、（例えば、生産される組換えＡＡＶに導入される）外来遺伝子は、別個の発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）によって提供されてよい。したがって、一部の側面において、発現構築物は外来遺伝子を含む。一部の側面において、外来遺伝子は、逆末端反復配列（ＩＴＲ）の側面に位置する。本発明に有用な外来遺伝子は、外来遺伝子が細胞内に導入される時にポリペプチドに翻訳され得る限り、特に限定されない。したがって、任意の適切な関心外来遺伝子が本発明と共に使用されてよい。一部の側面において、外来遺伝子は、ポリペプチド（又は、その任意の変異体）、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、ＲＮＡベース分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）、又はその任意の組合せをエンコードする。
本発明の他の所でさらに記述されているように、一部の側面において、本明細書で提供されるデュアルヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む。このような側面において、（例えば、生産される組換えＡＡＶに導入される）外来遺伝子は、別個の発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）によって提供されてよい。したがって、一部の側面において、発現構築物は外来遺伝子を含む。一部の側面において、外来遺伝子は、逆末端反復配列（ＩＴＲ）の側面に位置する。本発明に有用な外来遺伝子は、外来遺伝子が細胞内に導入される時にポリペプチドに翻訳され得る限り、特に限定されない。したがって、任意の適切な関心外来遺伝子が本発明と共に使用されてよい。一部の側面において、外来遺伝子は、ポリペプチド（又は、その任意の変異体）、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、ＲＮＡベース分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）、又はその任意の組合せをエンコードする。
【0115】
一部の側面において、外来遺伝子は、本明細書に記載されたような疾患又は障害の治療に有用なタンパク質をエンコードする。一部の側面において、外来遺伝子は、対象体又は患者の身体において持続した発現を目的に特定疾病に対する治療ペプチドをエンコードする。
【0116】
ＩＩＩ．Ｂ．調節要素
一部の側面において、本発明のデュアルヘルパープラスミドと共に使用可能な発現構築物は、調節要素をさらに含む。一部の側面において、調節要素は、外来遺伝子に作動可能に連結される。
一部の側面において、本発明のデュアルヘルパープラスミドと共に使用可能な発現構築物は、調節要素をさらに含む。一部の側面において、調節要素は、外来遺伝子に作動可能に連結される。
【0117】
したがって、一部の側面において、本明細書に記述された発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）は、下記を含む：
（ａ）ＩＴＲ（逆末端反復配列）；
（ｂ）外来遺伝子；及び
（ｃ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素。
（ａ）ＩＴＲ（逆末端反復配列）；
（ｂ）外来遺伝子；及び
（ｃ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素。
【0118】
本発明に有用な調節要素は、エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、β－アクチンプロモーター）、エクソン（例えば、エクソン１、エクソン２）、イントロン（例えば、イントロンＡ）、スプライシング供与体又は受容体配列、又はこれらの組合せが含まれる。一部の側面において、前記調節要素は、転写終結のための配列（例えば、ポリＡ）、外来遺伝子を安定的に発現させるための配列（例えば、ＷＰＲＥ配列）、外来遺伝子特異的免疫を減少させるための配列（例えば、ｍｉＲＮＡ標的配列）、又はこれらの組合せが含まれてよい。外来遺伝子及び調節要素に対する細部事項（ＩＴＲ配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、Ｅ１配列、スプライシング供与体配列、ＥＦ－１αイントロン又はスプライシング受容体を含むその断片配列、ＥＦ－１α Ｅ２配列、ＷＰＲＥ配列、ｍｉＲ配列、ポリ配列など）は、ＵＳ２０２２／００１０３３２Ａ１から確認でき、その全文が本明細書に参照によって組み込まれる。
【0119】
上述したように、一部の側面において、本発明に有用な発現構築物は、（ｉ）外来遺伝子、及び（ｉｉ）外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含み、前記調節要素は、下記の成分を含む：
１）ＣＭＶエンハンサー配列；
２）ＣＭＶプロモーター配列、ＥＦ－１αプロモーター配列又はニワトリβ－アクチンプロモーター配列；
３）ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列又はニワトリβ－アクチンＥ１配列；
４）スプライシング供与体配列；
５）ＥＦ－１αイントロン断片配列；及び
６）ＥＦ－１α Ｅ２配列。
１）ＣＭＶエンハンサー配列；
２）ＣＭＶプロモーター配列、ＥＦ－１αプロモーター配列又はニワトリβ－アクチンプロモーター配列；
３）ＣＭＶ Ｅ１配列、ＥＦ－１α Ｅ１配列又はニワトリβ－アクチンＥ１配列；
４）スプライシング供与体配列；
５）ＥＦ－１αイントロン断片配列；及び
６）ＥＦ－１α Ｅ２配列。
【0120】
ＩＶ．ベクター
一部の側面において、本明細書に提供された任意のプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び／又は外来遺伝子を含む発現構築物）を含むベクターが本明細書に提供される。また、本明細書で提供されたプラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶが本明細書に提供される。本明細書において、このようなベクターは、宿主細胞及び治療的介入のための標的細胞での組換え発現に有用である。
一部の側面において、本明細書に提供された任意のプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び／又は外来遺伝子を含む発現構築物）を含むベクターが本明細書に提供される。また、本明細書で提供されたプラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶが本明細書に提供される。本明細書において、このようなベクターは、宿主細胞及び治療的介入のための標的細胞での組換え発現に有用である。
【0121】
本発明から明らかなように、一部の側面において、本発明に有用なベクターは、ＡＡＶに由来する。ＡＡＶは、外来ＤＮＡを細胞に伝達するためのベクターシステムとして魅力的な独特の機能を有している。培養中の細胞のＡＡＶ感染は一般的に非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、静か（ｓｉｌｅｎｔ）で且つ無症状である。しかも、ＡＡＶは、多くの様々な類型の哺乳動物細胞を感染させ、生体内で多くの様々な組織を標的化できる。また、ＡＡＶは、他の形態の遺伝子伝達体に比べて、より弱い免疫反応を促進し、非統合、エピソームベクターＤＮＡ（ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ，ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ）に基づいて分裂及び停止細胞の両方で持続して発現し、遺伝子伝達体に対して特に魅力的なウイルスシステムとなる更なる利点を有する。また、ＡＡＶは、アデノウイルスを非活性化するために用いられる条件（５６～６５℃で数時間）を耐えるので、ｒＡＡＶベースワクチンの低温保存の重要性が相対的に少ない。
【0122】
本発明に使用可能なアデノ随伴ウイルスの類型又は血清型の非制限的な例は、本発明の他の所で提供される。
【0123】
Ｖ．細胞
一部の側面において、本発明は、本明細書に記述されたプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物）を含む細胞（ここで「変形された細胞」と呼ぶ。）を提供する。一部の側面において、細胞（例えば、宿主細胞）は、組換えＡＡＶを生産するために、デュアルヘルパープラスミド及びＡＡＶ構成プラスミドで形質感染される。本明細書の一部の側面において、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物を含む）本発明の変形された細胞は、組換えＡＡＶ生産の一つ以上の側面を改善させることができる。例えば、一部の側面において、本明細書に提供された変形された細胞は、対照細胞と比較してより大きい収率で組換えＡＡＶを生産することができる。一部の側面において、対照細胞は、次の３つの別個プラスミドを含むように変形された該当の細胞を含む：（１）ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む第１プラスミド（「ｒｅｐ－ｃａｐプラスミド」）；（２）Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む第２プラスミド（「ヘルパープラスミド」）；及び（３）外来遺伝子を含む第３プラスミド。
一部の側面において、本発明は、本明細書に記述されたプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物）を含む細胞（ここで「変形された細胞」と呼ぶ。）を提供する。一部の側面において、細胞（例えば、宿主細胞）は、組換えＡＡＶを生産するために、デュアルヘルパープラスミド及びＡＡＶ構成プラスミドで形質感染される。本明細書の一部の側面において、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物を含む）本発明の変形された細胞は、組換えＡＡＶ生産の一つ以上の側面を改善させることができる。例えば、一部の側面において、本明細書に提供された変形された細胞は、対照細胞と比較してより大きい収率で組換えＡＡＶを生産することができる。一部の側面において、対照細胞は、次の３つの別個プラスミドを含むように変形された該当の細胞を含む：（１）ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む第１プラスミド（「ｒｅｐ－ｃａｐプラスミド」）；（２）Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む第２プラスミド（「ヘルパープラスミド」）；及び（３）外来遺伝子を含む第３プラスミド。
【0124】
一部の側面において、対照細胞と比較して、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現ベクターを含む）本発明の細胞は、生産された組換えＡＡＶの量を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約１００％以上増加させることができる。一部の側面において、対照細胞と比較して、本発明の細胞は、生産された組換えＡＡＶの量を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、又は少なくとも約１００倍又はそれ以上増加させることができる。一部の側面において、（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び外来遺伝子を含む発現構築物を含むように変形された）本明細書に提供された細胞は、対照細胞と比較して生産及び／又は精製時間を減少させることができる。一部の側面において、対照細胞と比較して生産及び／又は精製時間は少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％又はそれ以上減少する。
【0125】
本発明から明らかなように、また、本明細書のプラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶを含むように変形（例えば、形質感染）された細胞が提供される。このような細胞は、例えば、本明細書に記述された外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産するのに特に有用であり得る。任意の一つの理論にとらわれず、一部の側面において、細胞（例えば、宿主細胞）が本明細書に記述のプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド及び調節要素に作動可能に連結された外来遺伝子を含む発現構築物）で形質感染されるとき、生産された組換えＡＡＶは個別プラスミドの一つ以上の特徴を含む。例えば、一部の側面において、生産された組換えＡＡＶは、調節要素に作動可能に連結された外来遺伝子を含む。
【0126】
本明細書に記載されているように、一部の側面において、本明細書に記載された一つ以上の調節要素は、細胞において外来遺伝子によってコードされるタンパク質（「暗号化されたタンパク質」）の発現を向上させることができる。したがって、一部の側面において、（例えば、本明細書に記述された一つ以上の調節要素に作動可能に連結された外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ伝達体ベクターで形質感染された）本明細書に記述された細胞は、対照細胞と比較して、エンコードされたタンパク質の発現をより多く増加させる。一部の側面において、対照細胞は、当該伝達体ベクターで形質感染されるが、本明細書に記述された調節要素のうち一つ以上が欠如している。
【0127】
一部の側面において、本明細書に記述された細胞は、試験管内で変形（例えば、形質感染）されて関心組成物を生産する。例えば、一部の側面において、細胞は、組換えＡＡＶを生産するために、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物（例えば、本明細書に記載されたもの）で試験管内で形質感染される。一部の側面において、細胞は、組換え遺伝子伝達体ベクターで試験管内で形質感染され、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産する。一部の側面において、本明細書に記述された細胞は、生体内で（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶが投与された対象体で）エンコードされたタンパク質を生産できる。一部の側面において、本明細書に記述された細胞は、試験管内及び生体内の両方において関心組成物（例えば、エンコードされたタンパク質）を生産することができる。
【0128】
本明細書に記載されているように、一部の側面において、本発明は、例えば、外来遺伝子発現のための組換え発現構築物で形質転換、形質導入又は形質感染された宿主細胞を提供する。本明細書において、用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、真核細胞及び原核細胞を含み、例えば、プラスミド又は発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド、Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド、ヘルパープラスミド、デュアルヘルパープラスミドなど）によってエンコードされる遺伝子が発現又は複製され得るように形質導入可能な有機体の細胞を意味する。一部の側面において、これは、分離された（真核）宿主細胞を意味する。本明細書において、用語「形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、形質導入及び形質転換を含むように意図される。宿主細胞は、本明細書に記載された任意のプラスミド、構築物及び／又はベクターで形質感染、形質導入又は形質転換されてよい。これらの用語は、外因性核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。
【0129】
一部の側面において、宿主細胞は真核細胞である。一部の側面において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選ばれる。一部の側面において、宿主細胞は原核細胞である。一部の側面において、原核細胞はバクテリア細胞である。
【0130】
一部の側面において、本発明に有用な細胞（例えば、宿主細胞）は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又は両方を含む。一部の側面において、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞であってよい。一部の側面において、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、ＲＰＥ－１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ－７細胞、Ｃ８Ｄ１ａ細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＥＳ１３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＨＣ７０細胞、ＨＣＣ１４２８細胞、ＢＴ－５４９細胞、ＰＣ３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、Ｃａｐａｎ－１細胞、Ｐａｎｃ－１細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１６６細胞、ＬｏＶｏ細胞、Ａ１７２細胞、ＭＫＮ－４５細胞、ＭＫＮ－７４細胞、Ｋａｔｏ－ＩＩＩ細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＨＴ－１４４細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｃ６細胞、ＨＴ－２２細胞、ＰＣ－１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はこれらの組合せを含む。
【0131】
一部の側面において、本発明に有用な細胞は、ヒト細胞を含む。一部の側面において、ヒト細胞は、本明細書に記述の組換え遺伝子伝達体ベクターが投与される対象体の細胞である。一部の側面において、ヒト細胞は供与者（例えば、健康なヒト被験者）に由来する。
【0132】
ＶＩ．組成物
本発明は、また、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドを含む組成物に関する。本発明から明らかなように、一部の側面において、このような組成物は、追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載された発現構築物（例えば、外来遺伝子発現のためのＡＡＶ構築物プラスミド）をさらに含む。本発明の他の所でも記述されているように、このような組成物は、組換えＡＡＶを生産するのに有用であり得る。
本発明は、また、本明細書に記載されたデュアルヘルパープラスミドを含む組成物に関する。本発明から明らかなように、一部の側面において、このような組成物は、追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載された発現構築物（例えば、外来遺伝子発現のためのＡＡＶ構築物プラスミド）をさらに含む。本発明の他の所でも記述されているように、このような組成物は、組換えＡＡＶを生産するのに有用であり得る。
【0133】
様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）及び本明細書に開示された細胞（ここで「活性化合物（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」と呼ぶ。）は、投与に適合する薬剤学的組成物に含まれてよい。したがって、一部の側面において、本発明は、このような薬剤学的組成物に関する。例えば、一部の側面において、本発明は、本明細書に記述されたプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）を用いて生産された組換えＡＡＶを含む薬剤学的組成物を提供する。
【0134】
一部の側面において、本明細書に記載された薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含む。
【0135】
本発明に使用可能な薬剤学的に許容可能な担体は、剤形に一般に用いられるものを含む。このような薬剤学的に許容可能な担体の非制限的な例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶質セルロ－ス、ポリビニルピロリドン、セルロ－ス、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル及びこれらの組合せを含むが、これに限定されない。本発明の薬剤学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤及びこれらの組合せのような一つ以上の添加剤をさらに含んでよい。適切な薬剤学的に許容可能な担体及び製剤に関する追加細部事項は、文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５））に説明されている。
【0136】
本発明の薬剤学的組成物は、意図した投与経路と互換するように剤形化される。このような投与経路の非制限的な例は、本発明の他の所で提供される。
【0137】
本明細書に記述された薬剤学的組成物は、単一投与又は多重投与の形態で提供されてよい。一部の側面において、本明細書で提供される薬剤学的組成物は、溶液（例えば、油性又は水性媒質中）、懸濁液、エマルジョン、抽出物、粉末、顆粒、錠剤又はカプセルの形態で剤形化される。一部の側面において、本明細書に記述された薬剤学的組成物を含む剤形は、分散剤、安定剤又は両方をさらに含んでよい。
【0138】
ＶＩＩ．キット
開示された様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）、細胞及び組成物（例えば、薬剤学的組成物）のうち一つ以上を含むキットが本明細書に開示される。一部の側面において、キットは、使用説明書（例えば、前述したもののいずれか又はそれらの組合せをそれを必要とする対象体に投与するための説明書）を含む。
開示された様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）、細胞及び組成物（例えば、薬剤学的組成物）のうち一つ以上を含むキットが本明細書に開示される。一部の側面において、キットは、使用説明書（例えば、前述したもののいずれか又はそれらの組合せをそれを必要とする対象体に投与するための説明書）を含む。
【0139】
本明細書において、用語「キット」及び「システム」は、様々なプラスミド（例えば、デュアルヘルパープラスミド）、構築物（例えば、発現構築物）、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ伝達体ベクター）、細胞、及び組成物（例えば、薬剤学的組成物）、又はそれらの任意の組合せのうち少なくとも一つ以上を表すように意図され、一部の側面において、一つ以上の他の類型の要素又は成分（例えば、他の類型の生化学的試薬、容器、販売のための包装、使用説明書など）と共に提供される。
【0140】
ＶＩＩＩ．用途及び方法
ＶＩＩＩ．Ａ．ＡＡＶ生産方法
本発明の特定の側面は、ＡＡＶを生産する方法に関する。より具体的には、一部の側面において、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶを生産する方法が本発明に提供される。一部の側面において、このような方法は、細胞（例えば、宿主細胞）をデュアルヘルパープラスミド（例えば、本明細書に記載されたもの）及び外来遺伝子を含む発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）で形質感染させることを含む。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で同時に形質感染される。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で順次に形質感染される。特記しない限り、当業界に公知された任意の適切な形質感染方法が本発明と共に用いられてよい。
ＶＩＩＩ．Ａ．ＡＡＶ生産方法
本発明の特定の側面は、ＡＡＶを生産する方法に関する。より具体的には、一部の側面において、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶを生産する方法が本発明に提供される。一部の側面において、このような方法は、細胞（例えば、宿主細胞）をデュアルヘルパープラスミド（例えば、本明細書に記載されたもの）及び外来遺伝子を含む発現構築物（例えば、ＡＡＶ構築物プラスミド）で形質感染させることを含む。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で同時に形質感染される。一部の側面において、細胞は、デュアルヘルパープラスミド及び発現構築物で順次に形質感染される。特記しない限り、当業界に公知された任意の適切な形質感染方法が本発明と共に用いられてよい。
【0141】
一部の側面において、組換えＡＡＶを生産する方法は、組換えＡＡＶが生産されるように適切な条件下に形質感染された細胞を培養する段階をさらに含む。一部の側面において、前記方法は、生産された組換えＡＡＶを回収する段階をさらに含む。
【0142】
本明細書に記述された組換えＡＡＶを生産する方法は、明確な利点を提供する。本発明の他の所で記述されているように、ＡＡＶを生産するより伝統的な方法は、三重形質感染を必要とし、宿主細胞は、次の３種の個別プラスミドで形質感染される：ｉ）Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をエンコードする遺伝子を含むＲｅｐ－Ｃａｐプラスミド；ｉｉ）アデノウイルスのタンパク質（Ｅ２ａ、Ｅ４）及びＶＡ ＲＮＡをエンコードする遺伝子を含むヘルパープラスミド；及び、ｉｉｉ）外来遺伝子発現のためのＡＡＶ構築物プラスミド。前記組換えＡＡＶは、細胞が上述の３種のプラスミドの全てによって成功的に形質感染された場合（すなわち、各遺伝子が吸収されて細胞の核に伝達された後、後続的に転写、細胞内で複製及び／又は翻訳された場合）にのみ生産される。関連した複雑性によって、三重形質感染を必要とするこのような方法は、低い収率、高費用及び／又はより労働集約的な結果を招くことがある。
【0143】
このような接近法と比較して、本明細書に提供された組換えＡＡＶを生産する方法は、組換えＡＡＶのより高い収率を得ることができる。一部の側面において、三重形質感染を必要とする方法（すなわち、「対照方法」）と比較して、本発明によって生産された組換えＡＡＶの量は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％又はそれ以上増加する。一部の側面において、対照細胞と比較して、本発明の細胞は、生産された組換えＡＡＶの量を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、又は少なくとも約１００倍以上増加させることができる。
【0144】
本発明の他の所で記述されているように、一部の側面において、本明細書に提供された組換えＡＡＶを生産する方法は、生産及び／又は精製時間を減少させることができる。更なる利点は本発明の他の所で説明される。
【0145】
ＶＩＩＩ．Ｂ．タンパク質生産方法
また、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質（又は、ポリペプチド）を生産する方法が本明細書に開示される。一部の側面において、このような方法は、適切な条件下で（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ伝達体ベクターで形質感染された）本発明の細胞を培養する段階、及びエンコードされたタンパク質を回収する段階を含む。特定の側面において、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産する方法は、組換えＡＡＶを、これを必要とする対象体に投与する段階を含む。
また、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質（又は、ポリペプチド）を生産する方法が本明細書に開示される。一部の側面において、このような方法は、適切な条件下で（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ伝達体ベクターで形質感染された）本発明の細胞を培養する段階、及びエンコードされたタンパク質を回収する段階を含む。特定の側面において、外来遺伝子によってエンコードされるタンパク質を生産する方法は、組換えＡＡＶを、これを必要とする対象体に投与する段階を含む。
【0146】
ＶＩＩＩ．Ｃ．治療用途
一部の側面において、本発明は、様々な治療適用のための本発明のデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶの用途を提供する。
一部の側面において、本発明は、様々な治療適用のための本発明のデュアルヘルパープラスミドを用いて生産された組換えＡＡＶの用途を提供する。
【0147】
例えば、一部の側面において、本発明は、外来遺伝子を含み、本明細書に記述されているように生成された組換えＡＡＶを対象体に投与する段階を含む、それを必要とする対象体において疾病を治療する方法を提供する。一部の側面において、本明細書に提供された疾病を治療する方法は、（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ遺伝子伝達体ベクターで形質感染された）本明細書に記述された任意の変形された細胞をそれを必要とする対象体に投与する段階を含む。一部の側面において、本明細書に提供された疾病を治療する方法は、（例えば、本明細書に提供された組換えＡＡＶを含む。）本明細書に記載された任意の薬剤学的組成物をそれを必要とする対象体に投与する段階を含む。本発明から明らかなように、前記方法は、例えば、外来遺伝子を変形させることによって任意の関心疾病を治療及び／又は予防するために用いられてよい。
【0148】
本発明によって予防、緩和又は治療される疾病は限定されず、薬物投与回数を減らすべき全ての疾病を含む。このような疾病の非制限的な例は、眼科疾患及び神経系疾患を含む。一部の側面において、前記眼科疾患は、糖尿病性網膜病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、脈絡膜新生血管形成（ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、網膜変性（ｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、黄斑浮腫（ｍａｃｕｌａｒ ｅｄｅｍａ）、網膜浮腫（ｒｅｔｉｎａｌ ｅｄｅｍａ）及び黄斑腫瘍（ｍａｓｃｕｌａｒ ｔｕｍｅｎｔｉａ）又はこれらの組合せを含む。一部の側面において、前記神経系疾患は、中枢神経系、末梢神経系又は両方に影響を及ぼす疾患を含む。神経系疾患の非制限的な例は、不安（ａｎｘｉｅｔｙ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、外傷後ストレス障害（ｐｏｓｔ－ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ，ＰＴＳＤ）、両極性障害（ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、注意力欠乏過剰行動障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ，ＡＤＨＤ）、自閉症（ａｕｔｉｓｍ）、精神分裂症（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）、神経病性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、中毒症（ｔｏｘｉｃｏｓｉｓ）、蜘蛛膜嚢腫（ａｒａｃｈｎｏｉｄ ｃｙｓｔ）、緊張症（ｃａｔａｔｏｎｉａ）、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、てんかん／発作（ｅｐｉｌｅｐｓｙ／ｓｅｉｚｕｒｅ）、閉じ込め症候群（ｌｏｃｋｅｄ－ｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、髓膜炎（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、片頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、脊髄病症（ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、バッテン病（Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、トゥレット症候群（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、脳脊髓損傷（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、振戦（ｔｒｅｍｏｒ）（本態性又はパーキンソン病）、筋緊張異常（ｄｙｓｔｏｎｉａ）、指摘障害（ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）又はこれらの組合せを含む。
【0149】
本発明の一部の側面は、外来遺伝子の連続的発現を達成できる遺伝子治療剤又は疾患を治療するためにこのような製剤を使用する方法に関する。
【0150】
本明細書に提供された遺伝子伝達体システム（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ）の使用は、医師、患者又は対象体の便宜のために薬物投与回数をだいぶ減少させ得る間隔で治療剤（例えば、外来遺伝子を含む組換えＡＡＶ）の投与を許容する。例えば、一部の側面において、治療剤は、約１週、約２週、約３週、約１ケ月、約２ケ月、約３ケ月、約４ケ月、約５ケ月、約６ケ月、約７ケ月、約８ケ月、約９ケ月、約１０ケ月、約１１ケ月又は約１年以上の間隔で投与されてよい。一部の側面において、その間隔は、約２～約３ケ月である。一部の側面において、その間隔は約６ケ月である。一部の側面において、その間隔は約１年である。一部の側面において、その間隔は、少なくとも約１年である。一部の側面において、患者の症状によって初期には約１～２週間隔で２～３回投与し、以後は、約２～３ケ月、約６ケ月、又は必要によって約１年以上の間隔で投与できる。
【0151】
投与（例えば、本明細書に記載された任意のＡＡＶ、細胞及び／又は薬剤学的組成物をそれを必要とする対象体に投与）段階を含む本明細書に提供された任意の方法において、治療剤は、対象体に経口又は非経口で投与されてよい。一部の側面において、治療剤（例えば、本明細書に記載された任意のＡＡＶ、細胞及び／又は薬剤学的組成物）は、非経口的に対象体に投与される。非経口投与の非制限的な例は、次を含む：静脈内注入、経皮投与、皮下注入、筋肉内注入、硝子体内注入（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、網膜下注入（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脈絡膜上腔注入（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、点眼投与（ｅｙｅ ｄｒｏｐ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳室内注入（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、髄腔内注射（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、羊膜内注入（ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、動脈内注入（ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、関節腔内注入（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心臓内注入（ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、陰茎海綿体内注入（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脳内注入（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、大槽注入（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、冠動脈内注入（ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、頭蓋内注入（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜内注入（ｉｎｔｒａｄｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜外注入（ｅｐｉｄｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、海馬内注入（ｉｎｔｒａｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、鼻腔内注入（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、骨腔内注入（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内注入（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腔内注入（ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脊髄内注入（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腔内注入（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｃｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腺内注入（ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、子宮内注入（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膣内注入（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心室内注入（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膀胱内注入（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、結膜下注入（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腫瘍内注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、局所注入、腹腔注入（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びこれらの組合せなど。
【0152】
当業者に明らかなように、治療剤（例えば、本発明の薬剤学的組成物）の適切な投与容量は、剤形方法、投与方式、年齢、体重、患者の性別、病理学的状態及び食餌、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応敏感度のような要因によって変わってよい。一部の側面において、治療剤（例えば、本発明の薬剤学的組成物）の１日投与容量は、約０．００００１～１００ｍｇ／ｋｇである。
【0153】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。下記の実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲が実施例によって限定されないということは、当業界における通常の知識を有する者に明らかであろう。
【0154】
実施例
材料及び方法
実施例１．三重形質感染用ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、５、８及び９構築物の製造
実施例１－１．ｐＲＣ８構築物製造
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ８－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／００２組合せを用いて重合酵素連鎖反応（以下、ＰＣＲ）を行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーンＤＮＡ断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ８構築物を製造した。
材料及び方法
実施例１．三重形質感染用ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、５、８及び９構築物の製造
実施例１－１．ｐＲＣ８構築物製造
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ８－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／００２組合せを用いて重合酵素連鎖反応（以下、ＰＣＲ）を行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーンＤＮＡ断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ８構築物を製造した。
【0155】
実施例１－２．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物製造
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－１のｐＲＣ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を、ｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を製造した。
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－１のｐＲＣ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ８遺伝子断片を、ｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を製造した。
【0156】
実施例１－３．ｐＲＣ２構築物製造
ｐＲＣ２－ｍｉ３４２（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／０１０組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて両ＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ２構築物を製造した。
ｐＲＣ２－ｍｉ３４２（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／０１０組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて両ＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ２構築物を製造した。
【0157】
実施例１－４．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物製造
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１１／０１２組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、実施例１－３のｐＲＣ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１３／０１４組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて２ ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を製造した。
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１１／０１２組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、実施例１－３のｐＲＣ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１３／０１４組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ２遺伝子断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて２ ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を製造した。
【0158】
実施例１－５．ｐＲＣ９構築物製造
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ９－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／０１５組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ９構築物を製造した。
ｐＩＤＴ－Ｃａｐ９－Ｋａｎ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００１／０１５組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を確保し、ｐＲＣ６（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００３／００４組合せを用いてＰＣＲを行うことによって、ｒｅｐ２遺伝子を含むプラスミドバックボーン断片を確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ２６１１）を用いて両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＲＣ９構築物を製造した。
【0159】
実施例１－６．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物製造
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－５のｐＲＣ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を、実施例１－１のｐＲＣ８を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣＲ２Ｃ９構築物を製造した。
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、実施例１－５のｐＲＣ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００７／００８を用いてＰＣＲを行うことによってｃａｐ９遺伝子断片を、実施例１－１のｐＲＣ８を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００９／００４を用いてｒｅｐ２遺伝子断片をそれぞれ確保したし、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た３つのＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣＲ２Ｃ９構築物を製造した。
【0160】
実施例１－７．ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物製造
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、ｐＲＣ５構築物（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００８／００９を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を製造した。
ｐＵＣ５７－ＷＰＲＥ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００５／００６組合せを用いてＰＣＲを行うことによってプラスミドバックボーンを確保し、ｐＲＣ５構築物（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｊａｐａｎ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃００８／００９を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて、上で得た両ＤＮＡ断片を連結することによってｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を製造した。
【0161】
実施例２．ｐＨＩＯＮ８シリーズ構築物の製造
実施例２－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物製造
ＶＡ－Ｅ４－ｐＵＣ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）とＥ２ａ－ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）の両構築物に共通するＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に両構築物を結合する方法によってクローニングを行い、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧを製造した（図１Ａ）。前記ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧは、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
実施例２－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物製造
ＶＡ－Ｅ４－ｐＵＣ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）とＥ２ａ－ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）の両構築物に共通するＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に両構築物を結合する方法によってクローニングを行い、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧを製造した（図１Ａ）。前記ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧは、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
【0162】
実施例２－２．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な位置にｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子挿入
実施例２－２－１．ｐＨＩＯＮ８－ＢａｍＨＩ－正方向又は逆方向（ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ又は－ＢＲ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。図１Ｂは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向（時計回り方向、５’－＞３’）に挿入して前記構築物を製造した。図１Ｃは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を反時計回り方向である逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）に挿入して前記構築物を製造した。前記ｐＨＩＯＮ８－ＢＦはｐＨＮＧ８と、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲはｐＨＮＧＲ８と命名した。
実施例２－２－１．ｐＨＩＯＮ８－ＢａｍＨＩ－正方向又は逆方向（ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ又は－ＢＲ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。図１Ｂは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向（時計回り方向、５’－＞３’）に挿入して前記構築物を製造した。図１Ｃは、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を反時計回り方向である逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）に挿入して前記構築物を製造した。前記ｐＨＩＯＮ８－ＢＦはｐＨＮＧ８と、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲはｐＨＮＧＲ８と命名した。
【0163】
実施例２－２－２．ｐＨＩＯＮ８－ＮｏｔＩ－正方向又は－逆方向（ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ又は－ＮＲ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＮｏｔＩ部位に挿入した（図１Ｄ及び図１Ｅ）。図１Ｄは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向に挿入し、前記構築物を製造した。図１Ｅは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を反時計回り方向である逆方向に挿入し、前記構築物を製造した。
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＮｏｔＩ部位に挿入した（図１Ｄ及び図１Ｅ）。図１Ｄは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を時計回り方向である正方向に挿入し、前記構築物を製造した。図１Ｅは、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物の模式図であり、Ｅ４遺伝子の開始部分とＡｍｐＲ遺伝子の開始部分との間に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を反時計回り方向である逆方向に挿入し、前記構築物を製造した。
【0164】
実施例２－２－３．ｐＨＩＯＮ８－ＡｓｉＳＩ－正方向（ｐＨＩＯＮ８－ＡＦ）クローニング
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＶＡ ＲＮＡ遺伝子とＥ４遺伝子との間におけるＡｓｉＳＩ部位に時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を製造した（図１Ｆ）。
実施例１－２のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１組合せを用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＶＡ ＲＮＡ遺伝子とＥ４遺伝子との間におけるＡｓｉＳＩ部位に時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を製造した（図１Ｆ）。
【0165】
実施例３．ｐＨＮＧ２、ｐＨＮＧ５Ｋ及びｐＨＮＧ９構築物製造
実施例３－１．ｐＨＮＧ２構築物製造
実施例１－４のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ２と命名した。
実施例３－１．ｐＨＮＧ２構築物製造
実施例１－４のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ２と命名した。
【0166】
図２は、ｐＨＮＧ２構築物の模式図であり、Ｅ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ２構築物を製造した。
【0167】
実施例３－２．ｐＨＮＧ９構築物製造
実施例１－６のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ9遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ９と命名した。図３は、ｐＨＮＧ９構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ９構築物を製造した。
実施例１－６のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６／＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ9遺伝子断片を確保し、実施例２－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ９と命名した。図３は、ｐＨＮＧ９構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ９構築物を製造した。
【0168】
実施例３－３．ｐＨＮＧ５Ｋ構築物製造
実施例３－３－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物製造
ｐＭＫ－ＲＱ－１－ＰＭ構築物（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってカナマイシン抵抗性遺伝子断片を確保し、実施例２－１のｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１を用いてＰＣＲを行うことによってＥ４遺伝子断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２２／０２３を用いてＰＣＲを行うことによってＶＡ ＲＮＡ遺伝子においてＥ２ａ遺伝子のＮ－端末断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２４／０２５を用いてＰＣＲを行うことによってＥ２ａ遺伝子のＣ末端でオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）断片を確保した。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて前記４つのＤＮＡ断片を連結し、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物を製造した。
実施例３－３－１．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物製造
ｐＭＫ－ＲＱ－１－ＰＭ構築物（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１８／０１９組合せを用いてＰＣＲを行うことによってカナマイシン抵抗性遺伝子断片を確保し、実施例２－１のｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０２０／０２１を用いてＰＣＲを行うことによってＥ４遺伝子断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２２／０２３を用いてＰＣＲを行うことによってＶＡ ＲＮＡ遺伝子においてＥ２ａ遺伝子のＮ－端末断片を確保し、ｏｌｉｇｏ ＃０２４／０２５を用いてＰＣＲを行うことによってＥ２ａ遺伝子のＣ末端でオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）断片を確保した。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用いて前記４つのＤＮＡ断片を連結し、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物を製造した。
【0169】
実施例３－３－２．ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－Ｋａｎ構築物にｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子挿入
実施例１－７のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６、＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、実施例３－３－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－ＫａｎのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ５Ｋと命名した（Ｋは、抗生剤抵抗性遺伝子であり、カナマイシン抵抗性遺伝子を用いていることを意味する。）。図４は、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
実施例１－７のｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５構築物を鋳型にしてｏｌｉｇｏ ＃０１６、＃０１７を用いてＰＣＲを行うことによってｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を確保し、実施例３－３－１で製造したｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ－ＫａｎのＢａｍＨＩ部位に挿入して製造した構築物をｐＨＮＧ５Ｋと命名した（Ｋは、抗生剤抵抗性遺伝子であり、カナマイシン抵抗性遺伝子を用いていることを意味する。）。図４は、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物の模式図であり、ｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて時計回り方向である正方向に挿入し、ｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
【0170】
前記構築物を製造するために用いられたオリゴの配列を表１に提示する：
【0171】
【表1】
また、ｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子とＶＡ ＲＮＡ遺伝子との間に正方向（時計回り方向、５’－＞３’）に挿入して製造した構築物を総称してｐＨＮＧ（ｐＨＮＧ２、ｐＨＮＧ５（ｐＨＮＧ５Ｋを含む。）、ｐＨＮＧ８、ｐＨＮＧ９など）と命名し、逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）に挿入して製造した構築物を総称してｐＨＮＧＲ（ｐＨＮＧＲ８など）と命名した。これらの開裂地図は、図５Ａ及び図５Ｂに示す。
【0172】
実施例４．外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドの製造
外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドは、大韓民国特許出願第１０－２０２０－００８４０３８号に記載された方法によって製造した。具体的には、ｐＵＣ５７プラスミドに基づいて、ＡＡＶカプシドパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に必要な要素であるＡＡＶ２ ＩＴＲ塩基配列が両側末端に存在し、その間にＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ハイブリッドイントロン、外来遺伝子としてｅＧＦＰ遺伝子、ＷＰＲＥ配列、４つの反復のｍｉＲ１４２－３ｐターゲット配列、ウシ成長ホルモン（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）のｐＡ配列が含まれている形態で製造した。
外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドは、大韓民国特許出願第１０－２０２０－００８４０３８号に記載された方法によって製造した。具体的には、ｐＵＣ５７プラスミドに基づいて、ＡＡＶカプシドパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に必要な要素であるＡＡＶ２ ＩＴＲ塩基配列が両側末端に存在し、その間にＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ハイブリッドイントロン、外来遺伝子としてｅＧＦＰ遺伝子、ＷＰＲＥ配列、４つの反復のｍｉＲ１４２－３ｐターゲット配列、ウシ成長ホルモン（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）のｐＡ配列が含まれている形態で製造した。
【0173】
実施例５．塩基配列の確認
上記で製造した全ての構築物の塩基配列を塩基配列分析（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｂｉｏｎｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）によって確認した。
上記で製造した全ての構築物の塩基配列を塩基配列分析（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｂｉｏｎｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）によって確認した。
【0174】
実施例６．細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞株は、１０％ ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．１６０００－０４４）、１％ベニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｏｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５１４０－１６３）が含まれたＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．４２３６０－０３２）を用いて５％ ＣＯ２、３７℃条件で湿潤培養した。Ｅｘｐｉ２９３細胞株は、１％ベニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＥｘｐｉ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１－０１）を用いて８％ ＣＯ２、３７℃条件で２５０ｒｐｍで振りながら湿潤培養した。
ＨＥＫ２９３細胞株は、１０％ ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．１６０００－０４４）、１％ベニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｏｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５１４０－１６３）が含まれたＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．４２３６０－０３２）を用いて５％ ＣＯ２、３７℃条件で湿潤培養した。Ｅｘｐｉ２９３細胞株は、１％ベニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＥｘｐｉ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１－０１）を用いて８％ ＣＯ２、３７℃条件で２５０ｒｐｍで振りながら湿潤培養した。
【0175】
実施例７．形質感染
実施例７－１．ＡＡＶ生産のための付着細胞の形質感染
形質感染のために、ＨＥＫ２９３細胞株をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１４１９０－２５０）を用いて２回洗浄後にＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２５２００－１１４）を処理して培養皿から剥がして確保した後、１５０ｍｍ培養皿に２×１０７ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈで接種した。２４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、及び外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、総１ｍｌの形質感染溶液を、ＨＥＫ２９３細胞を培養していた培養皿に入れた。
実施例７－１．ＡＡＶ生産のための付着細胞の形質感染
形質感染のために、ＨＥＫ２９３細胞株をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１４１９０－２５０）を用いて２回洗浄後にＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２５２００－１１４）を処理して培養皿から剥がして確保した後、１５０ｍｍ培養皿に２×１０７ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈで接種した。２４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、及び外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、総１ｍｌの形質感染溶液を、ＨＥＫ２９３細胞を培養していた培養皿に入れた。
【0176】
実施例７－２．ＡＡＶ生産のための浮遊細胞の形質感染
ＡＡＶ生産のために、１Ｌエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）培養フラスコにおいて６×１０８細胞を２２０ｍｌのＥｘｐｉ２９３培地に接種した。安定化のために約３～４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５, ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、ｐＨＮＧ２プラスミド又はｐＨＮＧ９プラスミドと、外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、培養フラスコに総２０ｍｌの形質感染溶液を入れた。
ＡＡＶ生産のために、１Ｌエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）培養フラスコにおいて６×１０８細胞を２２０ｍｌのＥｘｐｉ２９３培地に接種した。安定化のために約３～４時間培養後に、三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ２、ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ５, ｐＵＣ－Ｒ２Ｃ８又はｐＵＣ－Ｒ２Ｃ９プラスミド、及び外来遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、それぞれ３．７３ｐｍｏｌｅの、ｐＨＩＯＮ８プラスミド、ｐＨＮＧ２プラスミド又はｐＨＮＧ９プラスミドと、外部遺伝子を含むＡＡＶ構築物プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．５１９８５－０３４）に溶かした。そして、ＤＮＡ総量の２倍のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．２３９６６－１）を１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈させた後、直ちに２つの溶液を混ぜて形質感染溶液を製造した。常温で３０分間反応させた後、培養フラスコに総２０ｍｌの形質感染溶液を入れた。
【0177】
実施例８．ＡＡＶの精製
実施例７－１又は実施例７－２の形質感染７２時間後に、培養皿及び培養フラスコに５００ｍＭの濃度となるようにＮａＣｌを添加し、３時間反応させた。全ての培養液を回収して遠心分離によって残骸物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、１００ｋＤａの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ）気孔サイズを有するｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０，１００，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４℃で４０００ｒｐｍで上澄液が約２００ｕｌ残るまで遠心分離を行った。その後、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含んでいる上澄液を回収し、実験に使用又は－８０℃に保管した。
実施例７－１又は実施例７－２の形質感染７２時間後に、培養皿及び培養フラスコに５００ｍＭの濃度となるようにＮａＣｌを添加し、３時間反応させた。全ての培養液を回収して遠心分離によって残骸物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、１００ｋＤａの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ）気孔サイズを有するｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０，１００，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４℃で４０００ｒｐｍで上澄液が約２００ｕｌ残るまで遠心分離を行った。その後、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含んでいる上澄液を回収し、実験に使用又は－８０℃に保管した。
【0178】
実施例９．ＡＡＶ力価の決定
実施例８で精製したＡＡＶの力価を決定するためにｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，ＣＦＸ９６）を行った。ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，ＵＳＡ，Ｍ０３０３Ｓ）で１時間３７℃でＡＡＶにＤＮａｓｅＩを処理した。その後、ＤＮａｓｅＩが処理された試料に、プロテアーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＭ２５４８）を５５℃で３０分間処理し、続いて９５℃で１５分間反応させてプロテアーゼＫを不活性化させた。準備した試料をｑＰＣＲの鋳型として使用し、ＡＡＶ構築物プラスミド（７．４×１０８～７．４×１０４、１０倍希釈）を使用して標準曲線を求め、陽性対照群として組換えアデノ随伴ウイルス２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ２－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．ＶＲ－１６１６）又は組換えアデノ随伴ウイルス８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ８－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＲ－１８１６）を使用した。力価決定のためのｑＰＣＲのために、２ｘＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７２－５２８２）とｂＧＨ ｐｏｌｙ Ａ配列特異的プライマー（＃０２６、＃０２７）及びプローブ（＃０２８）を使用した。ｑＰＣＲは、９５℃で１０分変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）後に、９５℃で３０秒、６０℃で１分、を４０回反復した。標準曲線と定量は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸＭａｅｓｔｒｏ １．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
実施例８で精製したＡＡＶの力価を決定するためにｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，ＣＦＸ９６）を行った。ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，ＵＳＡ，Ｍ０３０３Ｓ）で１時間３７℃でＡＡＶにＤＮａｓｅＩを処理した。その後、ＤＮａｓｅＩが処理された試料に、プロテアーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＭ２５４８）を５５℃で３０分間処理し、続いて９５℃で１５分間反応させてプロテアーゼＫを不活性化させた。準備した試料をｑＰＣＲの鋳型として使用し、ＡＡＶ構築物プラスミド（７．４×１０８～７．４×１０４、１０倍希釈）を使用して標準曲線を求め、陽性対照群として組換えアデノ随伴ウイルス２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ２－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，ＣａｔＮｏ．ＶＲ－１６１６）又は組換えアデノ随伴ウイルス８ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｔｏｃｋ（ｒＡＡＶ８－ＲＳＳ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＲ－１８１６）を使用した。力価決定のためのｑＰＣＲのために、２ｘＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７２－５２８２）とｂＧＨ ｐｏｌｙ Ａ配列特異的プライマー（＃０２６、＃０２７）及びプローブ（＃０２８）を使用した。ｑＰＣＲは、９５℃で１０分変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）後に、９５℃で３０秒、６０℃で１分、を４０回反復した。標準曲線と定量は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸＭａｅｓｔｒｏ １．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【0179】
実施例１０．試験管内アデノ随伴ウイルスベクターを用いた形質感染
アデノ随伴ウイルスベクターの形質感染のために、２４ウェル培養プレートにウェル当たりに４×１０５のＨＥＫ２９３細胞を接種した。２４時間後に、各ウェルにＭＧ１３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｍ７４４９）を５ｕＭの濃度で８時間処理した。ＡＡＶ２では２，５００ ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９では１０，０００ ＭＯＩで処理し、７２時間培養した。
アデノ随伴ウイルスベクターの形質感染のために、２４ウェル培養プレートにウェル当たりに４×１０５のＨＥＫ２９３細胞を接種した。２４時間後に、各ウェルにＭＧ１３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｍ７４４９）を５ｕＭの濃度で８時間処理した。ＡＡＶ２では２，５００ ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９では１０，０００ ＭＯＩで処理し、７２時間培養した。
【0180】
実施例１１．流細胞分析法を用いたｅＧＦＰ遺伝子の発現強度測定
ｅＧＦＰの発現は、流細胞分析（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ，ＣｙｔｏＦｌｅｘ）によって測定した。形質感染７２時間後に、ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシンで剥がした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を確保し、２％ ＦＢＳが添加されたＤＰＢＳを５００ｕｌ添加して細胞を再懸濁した。流細胞分析において、ＦＳＣ ｖｓ ＳＳＣｐｌｏｔから単一細胞領域が区分付けられ、ＦＬ１－Ａ（ｇｒｅｅｎ）の発現レベルが測定された。全ての流細胞分析結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ １０．５．３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
ｅＧＦＰの発現は、流細胞分析（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ，ＣｙｔｏＦｌｅｘ）によって測定した。形質感染７２時間後に、ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシンで剥がした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を確保し、２％ ＦＢＳが添加されたＤＰＢＳを５００ｕｌ添加して細胞を再懸濁した。流細胞分析において、ＦＳＣ ｖｓ ＳＳＣｐｌｏｔから単一細胞領域が区分付けられ、ＦＬ１－Ａ（ｇｒｅｅｎ）の発現レベルが測定された。全ての流細胞分析結果は、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ １０．５．３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【0181】
実施例１２．統計的分析
全ての実験を３回以上反復した。２グループ間の比較はＰｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ８．１．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてスチューデントｔ－検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）によって、３グループ以上の比較は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔ）によって比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
全ての実験を３回以上反復した。２グループ間の比較はＰｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ８．１．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてスチューデントｔ－検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）によって、３グループ以上の比較は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔ）によって比較した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【0182】
実験結果
１．増加したＡＡＶ８生産量を示すヘルパー－イン－ワン（Ｈｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ）プラスミド構築物選定
１－１．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において三重形質感染とｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加又は減少効果観察
二重形質感染に用いられる５種のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅプラスミド構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ；ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ）内の様々なｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置がＡＡＶ８生産量に及ぼす影響を付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてテストした。三重形質感染方法によるＡＡＶ８の生産量を１００％としたとき、二重形質感染時には、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置によってＡＡＶ生産量において様々な結果が得られた。ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（ｐＨＮＧ８）を使用した場合に２４４．３％、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（ｐＨＮＧＲ８）を使用した場合に１７０．２％とＡＡＶ８生産量が増加した。ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物を使用した場合に１２６．０％の生産量増加が見られるが、これは統計的に有意でなかった（ｐ＝０．８２）。一方、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を使用した場合に、ＡＡＶ８の生産量が却って減少した（６２．４％（ｐ＝０．５０）、７１．７％（ｐ＝０．７７））（図６）。
１．増加したＡＡＶ８生産量を示すヘルパー－イン－ワン（Ｈｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ）プラスミド構築物選定
１－１．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において三重形質感染とｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加又は減少効果観察
二重形質感染に用いられる５種のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅプラスミド構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ；ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ）内の様々なｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置がＡＡＶ８生産量に及ぼす影響を付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてテストした。三重形質感染方法によるＡＡＶ８の生産量を１００％としたとき、二重形質感染時には、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の位置によってＡＡＶ生産量において様々な結果が得られた。ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（ｐＨＮＧ８）を使用した場合に２４４．３％、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（ｐＨＮＧＲ８）を使用した場合に１７０．２％とＡＡＶ８生産量が増加した。ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物を使用した場合に１２６．０％の生産量増加が見られるが、これは統計的に有意でなかった（ｐ＝０．８２）。一方、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を使用した場合に、ＡＡＶ８の生産量が却って減少した（６２．４％（ｐ＝０．５０）、７１．７％（ｐ＝０．７７））（図６）。
【0183】
１－２．浮遊細胞株（Ｅｘｐｉ２９３）において三重形質感染とｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加又は減少効果
上の実験結果１－１と同じ実験を浮遊細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）においてテストした。以前の付着細胞株と類似に、二重形質感染時にｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物を使用した場合は、三重形質感染方法に比べて１７７．１％（ｐ＜０．００１）、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物を使用した場合は１７３．１％（ｐ＜０．００１）と、ＡＡＶ８生産量が統計的に有意に増加した。しかし、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦなどの構築物を使用した場合に、４０．９％、６６．７％、４３．１％レベルと、生産量減少が統計的に有意に確認された（図７）。
上の実験結果１－１と同じ実験を浮遊細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）においてテストした。以前の付着細胞株と類似に、二重形質感染時にｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物を使用した場合は、三重形質感染方法に比べて１７７．１％（ｐ＜０．００１）、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物を使用した場合は１７３．１％（ｐ＜０．００１）と、ＡＡＶ８生産量が統計的に有意に増加した。しかし、ｐＨＩＯＮ８－ＮＦ、ｐＨＩＯＮ８－ＮＲ及びｐＨＩＯＮ８－ＡＦなどの構築物を使用した場合に、４０．９％、６６．７％、４３．１％レベルと、生産量減少が統計的に有意に確認された（図７）。
【0184】
これらの結果は、デュアルヘルパープラスミド内でのｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子の相対的位置及び方向によってＡＡＶの生産量が決定され得ることを提示する。その後、二重形質感染のためのｐＨＩＯＮプラスミド内のＢａｍＨＩ部位に正方向（ＢＦ）にｒｅｐ２－ｃａｐ遺伝子が存在する構築物をｐＨＮＧと命名し、逆方向（ＢＲ）に存在する構築物をｐＨＮＧＲと命名した。その後には、ｃａｐ遺伝子が由来したアデノ随伴ウイルスの血清型を数字で表記した（ｐＨＩＯＮ８－ＢＦ＝ｐＨＮＧ８、ｐＨＩＯＮ８－ＢＲ＝ｐＨＮＧＲ８）。
【0185】
２．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において三重形質感染とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によるＡＡＶ２生産量増加
ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造し、これを二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）方法に使用した（図２）。
ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造し、これを二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）方法に使用した（図２）。
【0186】
三重形質感染法とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染法によるＡＡＶ２の生産を比較した結果、三重形質感染に比べて二重形質感染法においてＡＡＶ２生産量が２７９．６％（ｐ＜０．００１）と有意に増加することを確認した（図８）。このような結果は、上述のｐＨＮＧ８による二重形質感染によるＡＡＶ８生産量増加と類似に、ｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に位置させると二重形質感染によってＡＡＶ２の生産量を増加させ得ることを提示する。
【0187】
３．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によるＡＡＶ９生産量増加
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングによってｐＨＮＧ９構築物を製造した（図３）。
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングによってｐＨＮＧ９構築物を製造した（図３）。
【0188】
三重形質感染とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によるＡＡＶ９の生産を比較した結果、三重形質感染に比べて二重形質感染においてＡＡＶ９生産量が２１４．０％（ｐ＜０．００１）と有意に増加することを確認した（図９）。このような結果は、上述のｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧ２による二重形質感染によるＡＡＶ８又はＡＡＶ２生産量増加と類似であった。結論的に、この結果は、アデノ随伴ウイルスの血清型９（ＡＡＶ９）においてもｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に位置させると二重形質感染法によるＡＡＶの生産量を増加させ得ることを提示する。
【0189】
４．付着細胞株（ＨＥＫ２９３）においてｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染によるＡＡＶ５生産量増加
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにＲｅｐ２－Ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて、正方向にクローニングを用いてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した（図４）。
二重形質感染（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のためにＲｅｐ２－Ｃａｐ５遺伝子断片を、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて、正方向にクローニングを用いてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した（図４）。
【0190】
三重形質感染とｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染によるＡＡＶ５の生産を比較した結果、三重形質感染に比べて二重形質感染においてＡＡＶ５生産量が１９４．７％（ｐ＝０．００２）と有意に増加することを確認した（図１０）。このような結果は、上記のｐＨＮＧ８、ｐＨＮＧ２及びｐＨＮＧ９による二重形質感染によるＡＡＶ８、ＡＡＶ２又はＡＡＶ９生産量増加と類似であった。
【0191】
結論的に、この結果は、アデノ随伴ウイルスの血清型５（ＡＡＶ５）においてもｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に位置させると二重形質感染法によるＡＡＶの生産量を増加させ得ることを提示する。
【0192】
５．三重形質感染又は二重形質感染（ｐＨＮＧ８又はｐＨＮＧＲ８構築物）で生産したＡＡＶ８間の細胞形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性
三重形質感染によって生産したＡＡＶ８と、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８との細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ８は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ８を感染させ、７２時間後に、流細胞分析を用いて細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ８と比較したとき、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ８はいずれも類似の細胞感染力（Ｔｒｉｐｌｅ：６．０％、ｐＨＮＧ８：５．４％、ｐＨＮＧＲ８：５．７％）を示し、また、感染された細胞内でｅＧＦＰ発現レベルも類似であること（ｐＨＮＧ８：９３．４％、ｐＨＮＧＲ８：９４．６％）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ８とｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１１）。
三重形質感染によって生産したＡＡＶ８と、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８との細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ８は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ８を感染させ、７２時間後に、流細胞分析を用いて細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ８と比較したとき、ｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ８はいずれも類似の細胞感染力（Ｔｒｉｐｌｅ：６．０％、ｐＨＮＧ８：５．４％、ｐＨＮＧＲ８：５．７％）を示し、また、感染された細胞内でｅＧＦＰ発現レベルも類似であること（ｐＨＮＧ８：９３．４％、ｐＨＮＧＲ８：９４．６％）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ８とｐＨＮＧ８及びｐＨＮＧＲ８を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ８の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１１）。
【0193】
６．三重形質感染又は二重形質感染（ｐＨＮＧ２）で生産したＡＡＶ２形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性
ＡＡＶ２を用いて遺伝子を伝達する場合において、三重形質感染によって生産したＡＡＶ２とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ２は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に２，５００ＭＯＩの条件でＡＡＶ２を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって、ｅＧＦＰを発現する細胞の割合及び細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染によるＡＡＶ２と比較したとき、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ２は、細胞感染能力が少なくとも同等であったし（Ｔｒｉｐｌｅ：３２．０％、ＢＦ：４４．７％；ｐ＝０．３８）、感染された細胞当たりｅＧＦＰ発現レベルが同等であるか或いはやや高いこと（１２９．６％、ｐ＝０．０２）を確認した。ただし、両方の場合とも統計的に有意な差異は見られなかった。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ２と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力が少なくとも同等であることを提示する（図１２）。
ＡＡＶ２を用いて遺伝子を伝達する場合において、三重形質感染によって生産したＡＡＶ２とｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ２は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に２，５００ＭＯＩの条件でＡＡＶ２を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって、ｅＧＦＰを発現する細胞の割合及び細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染によるＡＡＶ２と比較したとき、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ２は、細胞感染能力が少なくとも同等であったし（Ｔｒｉｐｌｅ：３２．０％、ＢＦ：４４．７％；ｐ＝０．３８）、感染された細胞当たりｅＧＦＰ発現レベルが同等であるか或いはやや高いこと（１２９．６％、ｐ＝０．０２）を確認した。ただし、両方の場合とも統計的に有意な差異は見られなかった。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ２と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ２の細胞感染力及び感染後の遺伝子発現能力が少なくとも同等であることを提示する（図１２）。
【0194】
７．三重形質感染又は二重形質感染（ｐＨＮＧ９）で生産したＡＡＶ９形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性
ＡＡＶ９を用いて遺伝子を伝達する場合に、三重形質感染によって生産したＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ９は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ９を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ９と比較したとき、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ９は類似のｅＧＦＰ発現レベルを示すこと（９０．９％、ｐ＝０．３５）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１３）。
ＡＡＶ９を用いて遺伝子を伝達する場合に、三重形質感染によって生産したＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力を比較した。製作したこれらのＡＡＶ９は、ｅＧＦＰタンパク質を発現するように設計した。ＨＥＫ２９３細胞株に１０，０００ＭＯＩの条件でＡＡＶ９を感染させ、７２時間後に流細胞分析によって細胞内ｅＧＦＰの発現程度を測定した。その結果、三重形質感染を用いたＡＡＶ９と比較したとき、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産されたＡＡＶ９は類似のｅＧＦＰ発現レベルを示すこと（９０．９％、ｐ＝０．３５）を確認した。以上の結果は、三重形質感染によって生産されたＡＡＶ９とｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染によって生産したＡＡＶ９の細胞感染力及び遺伝子発現能力には差異がないことを提示する（図１３）。
【0195】
以上、本発明の実施例について説明したが、該当技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は追加などによって本発明を様々に修正及び変更可能であり、これも本発明の権利範囲内に含まれるといえよう。
【図面の簡単な説明】
【0196】
【図1A】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ａは、三重形質感染のためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物を概略的に示し、アデノウイルス血清型５のＥ２ａ、Ｅ４遺伝子及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。
【図1B】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。
【図1C】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｅ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向（時計回り方向、５’－＞３’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＦ構築物（図１Ｂ）及び逆方向（反時計回り方向、３’－＞５’）にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＢＲ構築物（図１Ｃ）を概略的に示す。
【図1D】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。
【図1E】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｄ及び図１Ｅは、Ｅ４遺伝子の開始部分に存在するＮｏｔＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＦ構築物（図１Ｄ）及び逆方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＮＲ構築物（図１Ｅ）を概略的に示す。
【図1F】図１Ａ～図１Ｆは、本発明者らによって製造されたアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）を生産するためのｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ及びＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物（ｐＨＩＯＮ８シリーズ）の開裂地図を示す。図１Ｂ～図１Ｆは、５個のＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ－ＮＧプラスミド（ｐＨＩＯＮ８）構築物を概略的に示し、これは、ｒｅｐ２－ｃａｐ８遺伝子断片をｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧ構築物の様々な領域に挿入して製造されたデュアルヘルパープラスミドである。図１Ｆは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の開始部分とＥ４遺伝子の末端部分との間に存在するＡｓｉＳＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ８構築物を正方向にクローニングして製造したｐＨＩＯＮ８－ＡＦ構築物を概略的に示す。
【図2】アデノ随伴ウイルスベクター血清型２（ＡＡＶ２）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ２構築物の開裂地図を示す。ｐＨｅｌｐｅｒ－ＮＧプラスミド内のＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いてｒｅｐ２－ｃａｐ２遺伝子断片を正方向に挿入してｐＨＮＧ２構築物を製造した。
【図3】アデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ９構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ９遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ９構築物を製造した。
【図4】アデノ随伴ウイルスベクター血清型５（ＡＡＶ５）生産用デュアルヘルパープラスミドであるｐＨＮＧ５Ｋ構築物の開裂地図を示す。二重形質感染のためにｒｅｐ２－ｃａｐ５遺伝子断片をＥ２ａ遺伝子の開始部分とＶＡ ＲＮＡ遺伝子の末端部分との間に存在するＢａｍＨＩ部位を用いて正方向にクローニングしてｐＨＮＧ５Ｋ構築物を製造した。
【図6】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【図7】浮遊細胞株（Ｅｘｐｉ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＩＯＮ８シリーズを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ８生産量の増加又は減少の効果を観察した結果である。
【図8】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ２を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ２生産量増加の効果を観察した結果である。
【図9】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ９を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ９生産量増加の効果を観察した結果である。
【図10】付着細胞株（ＨＥＫ２９３）において、三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）と対比して、ｐＨＮＧ５Ｋを用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によるＡＡＶ５生産量増加の効果を観察した結果である。
【図11】三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はＨｅｌｐｅｒ－Ｉｎ－Ｏｎｅ構築物で二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）して生産されたＡＡＶ８間の細胞形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率の同等性結果である。
【図12】三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ２構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ２間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【図13】三重形質感染（Ｔｒｉｐｌｅ）又はｐＨＮＧ９構築物を用いた二重形質感染（Ｄｏｕｂｌｅ）によって生産されたＡＡＶ９間の細胞形質導入効率の同等性結果である。
【国際調査報告】