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▶ ブイエルピー・セラピューティクス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-09
(54)【発明の名称】ガレクチン標的の免疫療法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240430BHJP
C12N 7/04 20060101ALI20240430BHJP
C12N 15/40 20060101ALI20240430BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240430BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240430BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240430BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240430BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240430BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240430BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240430BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240430BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240430BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240430BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240430BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20240430BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240430BHJP
C07K 14/18 20060101ALN20240430BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240430BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N7/04 ZNA
C12N15/40
C12N15/12
C12N15/63 Z
A61P37/04
A61K39/00 H
A61P35/00
A61P37/06
A61P1/16
A61P29/00
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K35/76
A61K39/12
C07K19/00
C07K14/18
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564484
(86)(22)【出願日】2022-04-22
(85)【翻訳文提出日】2023-12-19
(86)【国際出願番号】 JP2022018610
(87)【国際公開番号】W WO2022225057
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】63/178,755
(32)【優先日】2021-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514207706
【氏名又は名称】ブイエルピー・セラピューティクス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＬＰ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】赤畑 渉
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065BA01
4B065BD15
4B065BD18
4B065CA24
4B065CA45
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA03
4C085BA61
4C085BB11
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087BC83
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA75
4C087ZB08
4C087ZB09
4C087ZB11
4C087ZB21
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA01
4H045CA40
4H045DA80
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA15
(57)【要約】
本開示は、ウイルス構造タンパク質およびガレクチンエピトープペプチドを含むウイルス様粒子、ならびにそれらを含む組成物またはワクチン、医学における、特に免疫療法におけるその使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルファウイルスのウイルス構造タンパク質および少なくとも１つのガレクチン抗原を含むウイルス様粒子。
【請求項2】
前記ウイルス構造タンパク質がアルファウイルスに由来する、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項3】
前記ウイルス構造タンパク質がチクングニアウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来する、請求項２に記載のウイルス様粒子。
【請求項4】
前記ウイルス構造タンパク質が、カプシド、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３を含む、請求項３に記載のウイルス様粒子。
【請求項5】
前記ウイルス構造タンパク質が、チクングニアウイルス株３７９９７もしくは株ＯＰＹ－１、またはベネズエラウマ脳炎ウイルス株ＴＣ－８３に由来する、請求項３に記載のウイルス様粒子。
【請求項6】
少なくとも１つのガレクチン抗原がエンベロープタンパク質Ｅ３に挿入されている、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項7】
前記少なくとも１つのガレクチン抗原が、配列番号１もしくは配列番号２の残基３２１と残基３２６の間にもしくは配列番号１もしくは配列番号２の残基３２１および残基３２６に相当する残基の間、または、配列番号３の残基３３０と残基３３５の間にもしくは配列番号３の残基３３０および残基３３５に相当する残基の間に挿入されている、請求項５に記載のウイルス様粒子。
【請求項8】
前記少なくとも１つのガレクチン抗原がガレクチン－１のペプチド断片である、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項9】
前記少なくとも１つのガレクチン抗原が：#5: SFVLNLGKDSNNLSLHFNPRFNAHGDANTIVSNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGS
#7: ANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEA
#12: SFVLNLGKDSNNLSLHFNPRFNAHGDANTIVSNTKEDGTWGTEHREPAFPFQPGS、および
#14: ADLTIKLPDGHEFKFPNRLNMEA
からなる群から選択される、請求項８に記載のウイルス様粒子。
【請求項10】
前記少なくとも１つのガレクチン抗原がガレクチン－３のペプチド断片である、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項11】
前記少なくとも１つのガレクチン抗原が：#17: ADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPA
#21: YPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGA
#22: YPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGA、および
#23: ADSFSLNDALAGSGNPNPQGYPGAWGNQPA
からなる群から選択される、請求項１０に記載のウイルス様粒子。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の前記ウイルス様粒子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項13】
請求項１２に記載の前記核酸分子を含むベクターであって、前記核酸分子に作動可能に連結されている発現制御配列を含んでもよい、
ベクター。
【請求項14】
（ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の前記ウイルス様粒子、請求項１２に記載の前記核酸分子、および／または請求項１３に記載の前記ベクター；ならびに（ｂ）医薬的に許容される担体、
を含む医薬組成物またはワクチン組成物。
【請求項15】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の前記ウイルス様粒子、請求項１２に記載の前記核酸分子、および／または
請求項１３に記載の前記ベクター
の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、
ガレクチン標的の免疫療法の方法。
【請求項16】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の前記ウイルス様粒子、請求項１２に記載の前記核酸分子、および／または請求項１３に記載の前記ベクターの使用であって、がんもしくは炎症性疾患を処置もしくは予防する；
哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生する；
免疫応答を調節する；
免疫賦活；
ガレクチン間の相互作用を阻害する；または
ガレクチン活性を阻害する、
免疫療法向けの医薬組成物またはキットの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ガレクチン標的の免疫療法に関する。
【背景技術】
【0002】
ガレクチンは、β－ガラクトシドに対して高親和性を示すレクチンファミリーのメンバである。哺乳動物では、ＬＧＡＬＳ遺伝子によってコードされる約１５のガレクチンが発見されてきたが、これらは連続的に付番されている。現在のところ、ヒトでは、ガレクチン－１、－２、－３、－４、－７、－７Ｂ、－８、－９、－９Ｂ、－９Ｃ、－１０、－１２、－１３、－１４および－１６のみが特定されている。
【0003】
ガレクチン－１（Ｇａｌ－１）は、Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ；Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）含有糖タンパク質または糖脂質に結合する動物レクチンの高度に保存されたファミリーのメンバである（非特許文献１：Barondes SH 1994）。Ｇａｌ－１は、多数の腫瘍で著しく上方制御され、分泌される。高レベルのＧａｌ－１は、多数のがんの腫瘍攻撃性、転移、および低い生存率と関連する（非特許文献２：Astorgues-Xerri L 2014）。先の研究が説明したところは、Ｇａｌ－１が、免疫抑制表現型に向けて、Ｔ細胞枯渇を誘導することによって、Ｔ細胞の生存を制限することによって、制御性Ｔ細胞の増殖を助けることによって、ナチュラルキラー細胞を非活性化することによっておよび骨髄細胞を極性化することによって、免疫回避プログラムを促進する新規な調節性チェックポイントとして浮上してきたこと、である（非特許文献３：Banh A 2011）。ガレクチン－１の発現は低酸素状態によって上方制御され、グリコシル化依存性のガレクチン－受容体相互作用が血管新生を制御する（非特許文献４：Rabinovich 2014）（非特許文献５：Xu-Yun Zhao 2010）。したがって、ガレクチン－グリカン相互作用を標的とすることで、抗腫瘍免疫を増強することおよび異常な血管新生を抑制することを同時に行うことにより、腫瘍の進行が妨げられる可能性がある（非特許文献６：Thijssen VL 2006）。
【0004】
がんの発生および予後の過程におけるガレクチンおよび／またはガレクチン結合複合糖質の本質的かつ多機能な役割に起因して、これらの分子間の相互作用をブロックする可能性のある様々な候補阻害剤が潜在的な抗がん薬として提案されてきた（非特許文献７：Lucile Astorgues-Xerri 2014）。現在のところ、最もよく知られたガレクチンアンタゴニストは、糖模倣薬であり、ガラクトシドの誘導体またはアナログであり、ガレクチンの正準な炭水化物結合部位を標的とする（非特許文献８：Koonce NA 2017）。ペプチドおよび抗体のＧａｌ－１阻害剤は、ガレクチン－受容体相互作用に拮抗するその能力についても報告されている（非特許文献９：Diego O. Croci 2012、非特許文献１０：van der Schaft DW 2002）。
【0005】
ガレクチン－３（Ｇａｌ－３）は、β－ガラクトシド含有複合糖質（糖タンパク質または糖脂質）に結合する、動物レクチンの高度に保存されたファミリーのメンバである（非特許文献１１：M. A. Henderson NC 2006、非特許文献１２：Mourad-Zeidan AA 2008）。Ｇａｌ－３は、他のガレクチンファミリータンパク質の内で２つのドメインから構成される構造においてユニークである：炭水化物結合領域を含有するカルボキシル末端ドメインおよび炭水化物と非炭水化物リガンドを架橋する９個のアミノ酸のタンデムリピートから主に構成されるアミノ末端ドメインである（図１２Ａ）（非特許文献１３：Liu 1990、非特許文献１：Barondes SH 1994）。Ｇａｌ－３は、単球、マクロファージおよび上皮細胞を始めとする種々のタイプの細胞によって、しかし主にマクロファージによって分泌される（非特許文献１４：Reynolds 2005、非特許文献１５：MacKinnon AC 2008）。分泌された細胞外Ｇａｌ－３はホモ二量体または五量体を形成し、これは生物学的機能にとって重要である。ガレクチン－３のＮ末端ドメインは、タンパク質オリゴマーの形成に重要であることが実証されている（図１２Ｂ）（非特許文献１３：Liu 1990、非特許文献１６：Dumic J 2006、非特許文献１７：Kuklinski S 1998、非特許文献１８：Lepur A 2012）。放出されたタンパク質は細胞外分子として機能して、細胞を活性化し、細胞－細胞および細胞－ＥＣＭの相互作用を媒介し、種々のタイプの細胞の遊走を誘導し、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を負に調節することができる（非特許文献１９：Yang RY 1996）。Ｇａｌ－３は、肺線維症、肝線維症、全身性硬化症および心筋線維症を始めとする線維性疾患および患者の種々のモデルで増加することが示された（非特許文献２０：M. A. Henderson NC 2008、非特許文献２１：Barman, et al. 2019、非特許文献２２：Nishi Y 2007、非特許文献２３：De Boer 2010）。このことが示唆するところは、Ｇａｌ－３が組織線維症の重要なメディエーターであるとともに組織線維症の効果的な治療標的である可能性があること、である。現在のところ、治験的なガレクチン－３阻害剤の前臨床および臨床研究により、線維性障害に対する保護作用が示された（非特許文献２４：Nikhil Hirani 2017、非特許文献２５：Yu L 2013）。
【0006】
過去１００～１５０年間の医学における主たる成功例の１つは、種々の感染症を標的とするワクチンである。ワクチンは、抗生物質と一緒に、ヒトの他のどの部分よりもヒトの健康にとってより重要であった可能性が高い。ワクチンが成功したことから、アレルギー、自己免疫、およびがんなどの非感染性疾患の処置にワクチン技術を使用することへの関心が高まっている。しかし、こういった疾患の標的は一般に自己抗原であり、このことが有効性に問題を引き起こす場合がある。非自己抗原の細菌、ウイルス、または寄生虫のタンパク質と比較して、自己抗原に対して強力な抗体応答を誘導することは、耐性機構のために相当に困難である（非特許文献２６：Hellman 2008、非特許文献２７：Falk Saupe 2015）。
【0007】
アルファウイルスは、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科の遺伝的、構造的、および血清学的に関連した蚊が媒介する一連のウイルスを含む。アルファウイルスには、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ヌドゥムウイルス、およびバギークリークウイルスが含まれる。単一のウイルスタンパク質を含有する構造サブユニットであるカプシドは、正２０面体ヌクレオカプシドでＲＮＡゲノムと会合する。ビリオン中ではカプシドは、膜貫通タンパク質スパイクの規則的なアレイで覆われた脂質エンベロープに囲まれており、このスパイクのそれぞれが、２つの糖タンパク質Ｅ１とＥ２のヘテロダイマー複合体からなる。
【0008】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、標準の天然ウイルスの組織化および立体構造を模倣するが、ウイルスゲノムを欠損している多タンパク質構造であり、したがって、より安全かつより安価なワクチン候補をもたらす可能性がある。ひと握りのＶＬＰベースの予防ワクチンが現在のところ世界的には市販されている：ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＥｎｇｅｒｉｘ（登録商標）（Ｂ型肝炎ウイルス）およびＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（ヒトパピローマウイルス）、ならびにＭｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．のＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（登録商標）（Ｂ型肝炎ウイルス）およびＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（ヒトパピローマウイルス）が、いくつかの例である。他のＶＬＰベースのワクチンの候補は、臨床試験中であるかまたは前臨床評価が行われており、例えば、インフルエンザウイルス、パルボウイルス、ノーウォークウイルスおよび種々のキメラＶＬＰである。前臨床試験でのそれらの成功にも関わらず、ほかの多数が小規模の基盤研究になおも限定されている。大規模なＶＬＰ生産の意義が、プロセス制御、監視化および最適化に関連して議論されている。主たる上流および下流の技術的課題が特定され、それに応じて議論されている。ＶＬＰベースのワクチンの成功した画期的新薬が、臨床試験の最新の結果および治療用または予防用ワクチン接種のいずれかに向けられたキメラＶＬＰベースの技術における近年の発展と同時に簡潔に発表されている。
【0009】
これまでに、ヒトおよび他の動物に感染する３０種を超える様々なウイルスに対するＶＬＰベースのワクチンが生産されてきた。例としては、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、Ｈ５Ｎ３（トリインフルエンザ）、ＢＦＤＶ（セキセイインコ雛病ウイルス）、ＢＴＶ（ブルータングウイルス）、エボラ、エンテロウイルス７１、ＧＨＰＶ（ガチョウ出血性ポリオーマウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＤＶ（δ型肝炎ウイルス）、ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウイルス）、ＨＩＶ、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、ＩＢＤＶ（伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）、インフルエンザＡ型、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１型、インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２型、ＪＣポリオーマウイルス、マールブルグ（Ｍａｒｇｕｒｇ）、ＭＳ２、ＩＰＣＶ（インドラッカセイクランプウイルス）、ＮＤＶ（ニューカッスル病ウイルス）、Ｎｏ（ノロウイルス）、Ｎｖ（ノーウォークウイルス）、ＰｈＭＶ（ホオズキモットルウイルス）、ポリオーマウイルス、ＰＰＶ（ブタパルボウイルス）、ＲＨＤＶ（ウサギ出血病ウイルス）、ロタウイルス、ＳＡＲＳ、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＳＶ４０（サルウイルス４０）、ＳＶＤＶ（ブタ水疱病ウイルス）等が挙げられる。（非特許文献２８：Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010）。
【0010】
米国特許第９，３５３，３５３号（特許文献１）には、感染またはその少なくとも１つの症状に対して免疫を誘導する、チクングニアに対するワクチンまたは抗原性組成物を製剤化するのに有用である、１つまたは複数のチクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が開示されている。米国特許第９，４８７，５６３号（特許文献２）には、アルファウイルスまたはフラビウイルスの改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）とアルファウイルスおよびフラビウイルス媒介性疾患の予防または処置に使用するための、改変ＶＬＰの生産を増強する方法が開示されている。米国特許第９，２４９，１９１号（特許文献３）には、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のウイルス様粒子が開示されており、この場合、前記ウイルス様粒子は、Ｅ２エンベロープタンパク質に挿入されて融合タンパク質を形成する、少なくとも１つの抗原を含有する。米国特許第９，９６９，９８６号には、アルファウイルスのウイルス様粒子が開示されており、この場合、前記ウイルス様粒子は、エンベロープタンパク質Ｅ３を含むアルファウイルスのウイルス構造タンパク質を含み、前記エンベロープタンパク質Ｅ３は、そのフーリン切断部位に挿入された少なくとも１つの外来抗原を含有するように改変されている。引用された参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】米国特許第９，３５３，３５３号
【特許文献2】米国特許第９，４８７，５６３号
【特許文献3】米国特許第９，２４９，１９１号
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Barondes SH, Cooper DN, Gitt MA, Leffler H. 1994. "Galectins. Structure and function of a large family of animal lectins." J Biol Chem 269:20807-20810.
【非特許文献2】Astorgues-Xerri L, Riveiro ME, Tijeras-Raballand A, Serova M, Neuzillet C, Albert S, Raymond E, Faivre S. 2014. "Unraveling galectin-1 as a novel therapeutic target for cancer" Cancer Treat Rev. 40:307-19.
【非特許文献3】Banh A, Zhang J, Cao H, Bouley DM, Kwok S, Kong C, et al. 2011. "Tumor galectin-1 mediates tumor growth and metastasis through regulation of T-cell apoptosis" Cancer Res 71:4423-31.
【非特許文献4】Rabinovich, Mariana SalatinoEmail authorDiego O. CrociDiego J. LaderachDaniel CompagnoLucas GentiliniTomas Dalotto-MorenoL. Sebastian Dergan-DylonSantiago P. Mendez-HuergoMarta A. ToscanoJuan P. CerlianiGabriel A. 2014. "Regulation of Galectins by Hypoxia and Their Relevance in Angiogenesis: Strategies and Methods" Methods in Molecular Biology Galectins pp 293-304.
【非特許文献5】Xu-Yun Zhao, Ting-Ting Chen, Li Xia, Meng Guo, Ying Xu, Fei Yue, Yi Jiang, Guo-Qiang Chen, Ke-Wen Zhao. 2010. "Hypoxia inducible factor-1 mediates expression of galectin-1: the potential role in migration/invasion of colorectal cancer cells." Carcinogenesis 31(8); 1367-1375.
【非特許文献6】Thijssen VL, Postel R, Brandwijk RJ, Dings RP, Nesmelova I, Satijn S, Verhofstad N, Nakabeppu Y, Baum LG, Bakkers J, Mayo KH, Poirier F, Griffioen AW. 2006. "Galectin-1 is essential in tumor angiogenesis and is a target for antiangiogenesis therapy." Proc Natl Acad Sci U S A. 103(43):15975-80.
【非特許文献7】Lucile Astorgues-Xerri, Maria E. Riveiro, Annemilai Tijeras-Raballand, Maria Serova. 2014. "Unraveling galectin-1 as a novel therapeutic target for cancer." Cancer Treatment Reviews 307-319.
【非特許文献8】Koonce NA, Griffin RJ, Dings RPM. 2017. "Galectin-1 Inhibitor OTX008 Induces Tumor Vessel Normalization and Tumor Growth Inhibition in Human Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Models." Int J Mol Sci. 9(18); 2671.
【非特許文献9】Diego O. Croci, Mariana Salatino, Natalia Rubinstein, Juan P. Cerliani, Lucas E. Cavallin, Howard J. Leung, Jing Ouyang, Juan M. Ilarregui, Marta A. Toscano, Carolina I. Domaica, Maria C. Croci, Margaret A. Shipp, Enrique A. Mesri, Adriana Albini, Gabriel. 2012. "Disrupting galectin-1 interactions with N-glycans suppresses hypoxia-driven angiogenesis and tumorigenesis in Kaposi’s sarcoma." J. Exp. Med 209:1985-2000.
【非特許文献10】van der Schaft DW, Dings RP, de Lussanet QG, van Eijk LI, Nap AW, Beets-Tan RG, Bouma-Ter Steege JC, Wagstaff J, Mayo KH, Griffioen AW. 2002. "The designer anti-angiogenic peptide anginex targets tumor endothelial cells and inhibits tumor growth in animal models." FASEB J. 16(14):1991-3.
【非特許文献11】Henderson NC, Mackinnon AC, Farnworth SL, Poirier F, Russo FP, Iredale JP, Haslett C, Simpson KJ, Sethi T. 2006. "Galectin-3 regulates myofibroblast activation and hepatic fibrosis." Proc Natl Acad Sci U S A 103(13):5060-5.
【非特許文献12】Mourad-Zeidan AA, Melnikova VO, Wang H, Raz A, and Bar-Eli M. 2008. "Expression profiling of Galectin-3-depleted melanoma cells reveals its major role in melanoma cell plasticity and vasculogenic mimicry." Am J Pathol 173:1839-1852.
【非特許文献13】Liu, T F. 1990. "Molecular biology of IgE-binding protein, IgE-binding factors, and IgE receptors." Crit Rev Immunol. 10(3):289-306.
【非特許文献14】Reynolds, HY. 2005. "Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s." Am J Respir Crit Care Med 171:98-102.
【非特許文献15】MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, Henderson NC, Atkinson KM, Leffler H, Nilsson UJ, Haslett C, Forbes SJ, and Sethi T. 2008. "Regulation of alternative macrophage activation by galectin-3." J Immunol 180:2650-2658.
【非特許文献16】Dumic J, Dabelic S, Flougel M. 2006. "Galectin-3: An open-ended story." BBA-Gen Subjects 1760:616-635.
【非特許文献17】Kuklinski S, Probstmeier R. 1998. "Homophilic binding properties of galectin-3: Involvement of the carbohydrate recognition domain." J Neurochem 70:814-823.
【非特許文献18】Lepur A, Salomonsson E, Nilsson UJ, Leffler H. 2012. "Ligand induced galectin-3 protein self-association." J Biol Chem 287:21751-21756.
【非特許文献19】Yang RY, Hsu DK, and Liu FT. 1996. "Expression of galectin-3 modulates T-cell growth and apoptosis." Proc Natl Acad Sci USA 93:6737-6742.
【非特許文献20】Henderson NC, Mackinnon AC, Farnworth SL, Kipari T, Haslett C, Iredale JP, Liu FT, Hughes J, Sethi T. 2008. "Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis." Am J Pathol. 172(2):288-98.
【非特許文献21】Barman, Scott A, Xueyi Li, Stephen Haigh, Dmitry Kondrikov, Keyvan Mahboubi, Zsuzsanna Bordan, and Stepp W David. 2019. "Galectin-3 is Expressed in Vascular Smooth Muscle Cells and Promotes Pulmonary Hypertension through changes in Proliferation, Apoptosis and Fibrosis." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. Feb 6, Epub ahead of print.
【非特許文献22】Nishi Y, Sano H, Kawashima T, Okada T, Kuroda T, Kikkawa K, Kawashima S, Tanabe M, Goto T, Matsuzawa Y, Matsumura R, Tomioka H, Liu FT, Shirai K. 2007. "Galectin-3 regulates myofibroblast activation and hepatic fibrosis." Allergol Int. 56(1):57-65.
【非特許文献23】De Boer, R. A., Yu, L., and van Veldhuisen, D. J. 2010. "Galectin-3 in cardiac remodeling and heart failure." Curr. Heart Fail. Rep. 7, 1-8.
【非特許文献24】Nikhil Hirani, Alison Mackinnon , Lisa Nicol , Jeremy Walker , Paul Ford , Hans Schambye , Anders Pederson , Ulf Nilsson , Hakon Leffler , Tracy Thomas , Danielle Francombe , John Simpson , Michael Gibbons , Toby M. Maher. 2017. "TD139, A Novel Inhaled Galectin-3 Inhibitor for the Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF). Results from the First in (IPF) Patients Study." American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 195:A7560.
【非特許文献25】Yu L, Ruifrok WP, Meissner M, Bos EM, van Goor H, Sanjabi B, van der Harst P, Pitt B, Goldstein IJ, Koerts JA, et al. 2013. "Genetic and pharmacological inhibition of galectin-3 prevents cardiac remodeling by interfering with myocardial fibrogenesis." Circ Heart Fail 6:107-117.
【非特許文献26】Hellman, L. 2008. "Therapeutic vaccines against IgE-mediated allergies." Expert Rev Vaccines 7(2):193-208.
【非特許文献27】Falk Saupe, Elisabeth J. M. Huijbers, Tobias Hein, Julia Femel, Jessica Cedervall, Anna-Karin Olsson, and Lars Hellman. 2015. "Vaccines targeting self-antigens: mechanisms and efficacy-determining parameters." FASEB J 29(8):3253-62.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
【課題を解決するための手段】
【0014】
本開示は、ガレクチン標的の免疫療法に関する。
【0015】
第１の態様では、本開示は、ウイルス構造タンパク質および少なくとも１つのガレクチン抗原を含むウイルス様粒子を提供する。
【0016】
第２の態様では、本開示は、本出願の第１の態様で提供されるウイルス様粒子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【0017】
第３の態様では、本開示は、第２の態様の核酸分子を含むベクターであって、核酸分子に作動可能に連結されている発現制御配列を含んでもよい、ベクターを提供する。
【0018】
第４の態様では、本開示は、（ａ）第１の態様のウイルス様粒子、第２の態様の核酸分子、および／または第３の態様のベクター；ならびに（ｂ）医薬的に許容される担体、を含む医薬組成物またはワクチン組成物を提供する。
【0019】
第５の態様では、本開示は、第１の態様のウイルス様粒子、第２の態様の核酸分子、および／または第３の態様のベクターの有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、ガレクチン標的の免疫療法を提供する。本方法は、がん、炎症性疾患、および線維性疾患の処置または予防するのに有用とすることができる。対象において免疫応答を調節するための、対象を免疫賦活するための、非ヒト哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生するための；対象の免疫応答を調節するための；対象における免疫賦活のための；対象においてガレクチン－グリカン相互作用を阻害するための；またはガレクチン活性を阻害するための、方法も提供される。
【0020】
第６の態様では、本開示は、第１の態様のウイルス様粒子、第２の態様の核酸分子、および／または第３の態様のベクターの使用であって、
対象において免疫応答を調節するための、対象を免疫賦活するための、非ヒト哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生するための；対象において免疫応答を調節するための；対象における免疫賦活のための；対象においてガレクチン－グリカン相互作用を阻害するための、
免疫療法向けの医薬組成物またはキットの製造のための、使用を提供する。
対象において免疫応答を調節するための、対象を免疫賦活するための、非ヒト哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生するための；対象において免疫応答を調節するための；対象における免疫賦活のための；対象においてガレクチン－グリカン相互作用を阻害するための、
免疫療法向けの医薬組成物またはキットの製造のための、使用を提供する。
【0021】
第６の態様では、本開示は、第１の態様のウイルス様粒子、第２の態様の核酸分子、および／または第３の態様のベクターの使用であって、
がんもしくは炎症性疾患を処置もしくは予防する；哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生するための；免疫応答を調節するための；免疫賦活のための；ガレクチン－グリカン相互作用を阻害するための；またはガレクチン活性を阻害するための、
免疫療法向けの第４の態様の医薬組成物またはワクチン組成物の製造のための、使用を提供する。
がんもしくは炎症性疾患を処置もしくは予防する；哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生するための；免疫応答を調節するための；免疫賦活のための；ガレクチン－グリカン相互作用を阻害するための；またはガレクチン活性を阻害するための、
免疫療法向けの第４の態様の医薬組成物またはワクチン組成物の製造のための、使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ＶＥＥＶ Ｇａｌ－１ ＶＬＰの調製。各レーンは、左から右へ、それぞれ、Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃５、＃７、＃１２、および＃１４を担持するＶＥＥＶ ＶＬＰである。右端は、抗原ペプチド無しの対照ＶＬＰである。
【図2】［図２Ａ］ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃５～＃１０（ヒトに由来する）を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの免疫原性。 ［図２Ｂ］ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃５（ヒトに由来する）および＃１２（マウスに由来する）を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの免疫原性。
【図3】［図３Ａ］Ｇａｌ－１エピトープペプチドを担持するＶＥＥＶ－ＶＬＰの発現。 ［図３Ｂ］Ｇａｌ－１タンパク質の３Ｄ構造。Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃５および＃１２は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）近傍の４つのβシートＳ３、Ｓ４、Ｓ５、およびＳ６をコードする。 ［図３Ｃ］Ｇａｌ－１タンパク質の３Ｄ構造。Ｇａｌ－１ペプチド＃７および＃１４は、同種親和的二量体化において重要である可能性があるＦ４およびＦ５のβシートをコードする。 ［図３Ｄ］Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃５、＃７、＃１２、および＃１４を担持するＶＥＥＶ－ＶＬＰで免疫したマウス血清中の抗ヒトＧａｌ－１抗体力価。 ［図３Ｅ］Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃５、＃７、＃１２、および＃１４を担持するＶＥＥＶ－ＶＬＰで免疫したマウス血清中の抗マウスＧａｌ－１抗体力価。 ［図３Ｆ］ヒトＧａｌ－１およびマウスＧａｌ－１に由来するＧａｌ－１エピトープペプチド間の比較。それらエピトープペプチド間で異なるアミノ酸には下線が引かれている。
【図4】［図４Ａ］Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃７および＃１２を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰで免疫したマウス血清中の抗マウスＧａｌ－１抗体力価。 ［図４Ｂ］Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃７および＃１２を担持するＶＥＥＶ－ＶＬＰで免疫したマウス血清中のＣＨＩＫＶスパイクタンパク質に対する抗体力価。 ［図４Ｃ］Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃１２および＃１４を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰで免疫したマウス血清中の抗体の免疫グロブリンサブクラス。
【図5】［図５Ａ］マウスにおける、ルイス肺癌に対するＧａｌ－１エピトープペプチド＃７および＃１２を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの効果。（対照） ［図５Ｂ］マウスにおける、ルイス肺癌に対するＧａｌ－１エピトープペプチド＃７および＃１２を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの効果。（対照ＶＬＰ） ［図５Ｃ］マウスにおける、ルイス肺癌に対するＧａｌ－１エピトープペプチド＃７および＃１２を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの効果。（Ｇａｌ－１ ＃７ ＶＬＰ） ［図５Ｄ］マウスにおける、ルイス肺癌に対するＧａｌ－１エピトープペプチド＃７および＃１２を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの効果。（Ｇａｌ－１ ＃１２ ＶＬＰ） ［図５Ｅ］各群のエンドポイントの腫瘍重量。対照群とＶＬＰ処置群との間には腫瘍容量（図５Ａ～Ｄ）および（図５Ｅ）に統計学的に有意な差はなかったが、Ｇａｌ－１ ＃１２で処置したマウスの腫瘍増殖は他群の腫瘍増殖よりも遅かった。
【図6】［図６Ａ］マウスＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌細胞モデルに対する、Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃１２および＃１４を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの効果。Ｇａｌ－１ ＃１４ＶＬＰワクチンで処置したマウスの腫瘍増殖は対照の腫瘍増殖よりも遅かったが、いずれの群間でも統計学的に有意な差ではなかった。 ［図６Ｂ］マウスＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌細胞モデルのエンドポイント重量に対するＧａｌ－１エピトープペプチド＃１２および＃１４を担持するＣＨＩＫＶ－ＶＬＰの効果。
【図7】Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃１７、＃２１、＃２２および＃２３ならびに対照ＶＬＰを担持するＶＥＥＶ－ＶＬＰの分子サイズおよび純度。
【図8】マウスにおける、Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃１７、＃２１、＃２２および＃２３を担持するＶＥＥＶ－ＶＬＰの免疫原性。
【図9】フローサイトメトリー解析。Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃１７および＃２２を担持するＶＬＰで免疫したマウスからの血清を、細胞表面Ｇａｌ－３への結合について解析した。
【図10】Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃１７および＃２２を担持するＶＬＰによってマウスで誘導された抗Ｇａｌ－３抗体の中和能力。
【図11】［図１１Ａ］マウスＳＴＡＭ非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルに対するＧａｌ－３エピトープペプチド＃２２および＃２３を担持するＶＬＰの効果。（脂肪変性スコア） ［図１１Ｂ］マウスＳＴＡＭ非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルに対する、Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃２２および＃２３を担持するＶＬＰの効果。（炎症スコア） ［図１１Ｃ］マウスＳＴＡＭ非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルに対する、Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃２２および＃２３を担持するＶＬＰの効果。［風船様変性（Ｂａｌｌｏｎｉｎｇ）スコア］
【図12】（Ａ）ガレクチン－３タンパク質の構造はＮ末端ドメインから構成され、これは、セリン６（６）リン酸化部位を含有する１２個のアミノ酸のＮ末端領域と１００ａａ長のコラーゲン様反復配列とを有する。炭水化物認識ドメイン（ＣＤＲ）１３０ａａはＣ末端を含み、ＮＷＧＲモチーフを含有する；（Ｂ）ガレクチン－３の五量体構造。
【発明を実施するための形態】
【0023】
定義
「作用剤」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
「作用剤」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【0024】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、製剤中で特定の免疫原と組み合わせて使用される場合、結果として得られる免疫応答を増強、変更または改変することになる化合物を意味する。ある特定の実施形態では、アジュバントはＶＬＰと組み合わせて使用される。他の実施形態では、アジュバントはＤＮＡワクチンと組み合わせて使用される。免疫応答の改変には、抗体による免疫応答と細胞性免疫応答のいずれかまたは両方の特異性の強化または拡大が含まれる。免疫応答の改変とはまた、ある特定の抗原特異的な免疫応答を低下させることまたは抑制することを意味する場合もある。
【0025】
本明細書で使用される場合、「寛解させる」とは、疾患またはその症状の発生または進行を低下させる、抑制する、弱める、軽減する、阻止するまたは安定化させることを意味する。
【0026】
本明細書で使用される場合、「変更」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列に関して特定の位置にてのアミノ酸またはヌクレオチドの変化を意味する。本明細書で使用される場合、変更には、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの特定の位置にてのアミノ酸またはヌクレオチドの置換、欠失、または挿入が含まれる。一部の実施形態では、アルファウイルスカプシドタンパク質核局在化シグナルの変更には、非荷電アミノ酸（例えば、アラニンもしくはアスパラギン、またはリジンもしくはアルギニンなどの塩基性荷電アミノ酸を除く任意のアミノ酸）による荷電アミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）の置換が含まれる。
【0027】
本明細書で使用される場合、「アナログ」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特性を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチドアナログは、相当する天然に存在するポリペプチドの生物活性を保持するが、一方、天然に存在するポリペプチドと比べてアナログの機能を増強するある特定の生化学的改変を有する。このような生化学的改変は、例えば、リガンド結合を変更することなく、アナログのプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を高める可能性がある。アナログは非天然アミノ酸を含んでもよい。
【0028】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法のそれらに帰する意味を有することができ、かつ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと／含めて（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができ；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に米国特許法に帰する意味を有するが、その用語はオープンエンドであり、したがって、記載されているものの基本的または新規な特徴が記載されているものを超える存在によって変更されない限り、記載されているものを超える存在を許容するが、先行技術の実施形態を除外する。
【0029】
本明細書で使用される場合、「検出する」とは、検出されるべき検体の存在、不在または量を特定することを意味する。
【0030】
本明細書で使用される場合、「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷するかまたは妨げるあらゆる状態または障害を意味する。
【0031】
本明細書で使用される場合、「有効量」とは、未処置の患者と比べて疾患の症状を寛解させるのに必要とされる作用剤の量を意味する。疾患の予防または処置のために本発明を実践するのに使用される活性化合物の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、および全体的な健康に応じて変化する。最終的に、主治医または獣医が適当な量および投薬レジメンを決定することになる。かかる量を「有効」量と称する。
【0032】
本明細書で使用される場合、「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この一部分は、好ましくは、参照の核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。断片は、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有することができる。
【0033】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本開示の核酸分子が由来する生命体の天然に存在するゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸分子（例えばＤＮＡ）を意味する。したがってこの用語には、例えば、ベクターに組み入れられている組換えＤＮＡ；自律的複製をするプラスミドもしくはウイルスに組み入れられている組換えＤＮＡ；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられている組換えＤＮＡ；または、他の配列から独立して分離された分子（例えば、ｃＤＮＡ、または、ＰＣＲや制限酵素消化により産生されたゲノムもしくはｃＤＮＡの断片）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。加えて、この用語には、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、ならびに追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡが含まれる。
【0034】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」とは、天然で当該ポリペプチドに付随する成分から分離された、本開示のポリペプチドを意味する。通常には、天然で当該ポリペプチドに付随するタンパク質および天然に存在する有機分子が重量で少なくとも６０％無い場合に、そのポリペプチドは単離されていることになる。好ましくは、調製物とは、重量で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％が、本開示のポリペプチドである。本開示の単離されたポリペプチドは、例えば、天然資源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学合成することによって、取得することができる。純度は、適当な任意の方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【0035】
本明細書で使用される場合、「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変更を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【0036】
本明細書で使用される場合、「作用剤を得ること」のように「得ること」には、当該作用剤を合成すること、購入すること、またはその他の方法で取得することが含まれる。
【0037】
本明細書で使用される場合、「減少させる」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変更を意味する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「参照」とは、標準または対照の状態を意味する。
【0039】
本明細書で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較用の基準として使用される規定された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットであっても全体であってもよい；例えば、完全長ｃＤＮＡ配列もしくは遺伝子配列のセグメントであってもよく、または完全なｃＤＮＡ配列もしくは遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドに関して、参照ポリペプチド配列の長さは概して、少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸、さらにより好ましくは約３５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸であろう。核酸に関して、参照核酸配列の長さは概して、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個のヌクレオチド、さらにより好ましくは約１００個のヌクレオチドもしくは約３００個のヌクレオチドまたはそれら付近もしくはそれらの間の任意の整数であろう。
【0040】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」とは、ポリペプチドまたはタンパク質を認識し結合するが、当該ポリペプチドまたはタンパク質を天然に含む試料、例えば、生体試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない、化合物または抗体を意味する。
【0041】
本明細書で使用される場合、「対象」とは、それらに限定されないが、ヒトまたはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含めて、哺乳動物を意味する。
【0042】
本明細書で提供される範囲は、当該範囲内の全ての値についての略記であると理解される。例えば、１～５０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からのあらゆる数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
【0043】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」等の用語は、障害および／またはそれに関連する症状を軽減または寛解させることを指す。妨げられるものではないが、障害または状態を処置することは、障害、状態またはそれらに関連する症状が完全に解消されることを必要としないことが、理解されるであろう。
【0044】
具体的に明記されていないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または」という用語は包括的であると理解される。
【0045】
具体的に明記されていないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、単数または複数であると理解される。
【0046】
具体的に明記されていないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、本技術分野で通常許容される範囲内のものとして理解され、例えば、平均値の２標準偏差以内として理解される。約は、言及された値の１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内、０．１％以内、０．０５％以内、または０．０１％以内として理解することができる。文脈に明らかに反しない限り、本明細書で提供される全ての数値は約という用語によって修飾される。
【0047】
発明の詳細な説明
本開示では、ウイルス構造タンパク質およびガレクチン抗原を含むウイルス様粒子が提供される。
本開示では、ウイルス構造タンパク質およびガレクチン抗原を含むウイルス様粒子が提供される。
【0048】
本明細書で使用される場合、「ガレクチン抗原」という用語は、免疫系によって認識され得る、ならびに／または細胞性免疫応答を賦活するかつ／または抗原に特異的な抗体の産生を賦活する、ガレクチンタンパク質のいずれかに由来する任意の抗原構造を指す。ガレクチンエピトープペプチドは、天然に存在するガレクチンタンパク質の断片であってもよく、一部の改変を有する天然に存在するガレクチンタンパク質の断片であってもよい。天然に存在するガレクチンタンパク質は、ガレクチン－１（Ｇａｌ－１）であってもガレクチン－３（Ｇａｌ－３）であってもよい。ガレクチンタンパク質としては、ヒトガレクチンタンパク質であることが好ましく、とりわけヒトガレクチン－１タンパク質またはヒトガレクチン－３タンパク質であることが好ましい。一実施形態では、改変断片は、天然に存在するガレクチンタンパク質の断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、改変ペプチド断片は、天然に存在するガレクチンタンパク質の断片に対して、アミノ酸のうちの多くても１０％が欠失、置換および／または付加されている突然変異型である。
【0049】
天然に存在するヒトガレクチン－１およびヒトガレクチン－３のアミノ酸配列は以下のとおりである：ガレクチン－１［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］
MACGLVASNLNLKPGECLRVRGEVAPDAKSFVLNLGKDSNNLCLHFNPRFNAHGDANTIVCNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGSVAEVCITFDQANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEAINYMAADGDFKIKCVAFD（配列番号７）
MACGLVASNLNLKPGECLRVRGEVAPDAKSFVLNLGKDSNNLCLHFNPRFNAHGDANTIVCNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGSVAEVCITFDQANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEAINYMAADGDFKIKCVAFD（配列番号７）
【0050】
ガレクチン－３［ヒト］（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＢ８６５８４．１）
MADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI（配列番号８）
MADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI（配列番号８）
【0051】
ガレクチン抗原、すなわちガレクチンエピトープペプチドの例としては以下を挙げることができる：
Ｇａｌ－１エピトープペプチド
#5: SFVLNLGKDSNNLSLHFNPRFNAHGDANTIVSNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGS（配列番号９）
#7: ANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEA（配列番号１０）
#12: SFVLNLGKDSNNLSLHFNPRFNAHGDANTIVSNTKEDGTWGTEHREPAFPFQPGS（配列番号１１）
#14: ADLTIKLPDGHEFKFPNRLNMEA（配列番号１２）
Ｇａｌ－１エピトープペプチド
#5: SFVLNLGKDSNNLSLHFNPRFNAHGDANTIVSNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGS（配列番号９）
#7: ANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEA（配列番号１０）
#12: SFVLNLGKDSNNLSLHFNPRFNAHGDANTIVSNTKEDGTWGTEHREPAFPFQPGS（配列番号１１）
#14: ADLTIKLPDGHEFKFPNRLNMEA（配列番号１２）
【0052】
Ｇａｌ－３エピトープペプチド
#17: ADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPA（配列番号１３）
#21: YPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGA（配列番号１４）
#22: YPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGA（配列番号１５）
#23: ADSFSLNDALAGSGNPNPQGYPGAWGNQPA（配列番号１６）
#17: ADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPA（配列番号１３）
#21: YPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGA（配列番号１４）
#22: YPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGA（配列番号１５）
#23: ADSFSLNDALAGSGNPNPQGYPGAWGNQPA（配列番号１６）
【0053】
Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃５はヒトＧａｌ－１に由来する断片であり、＃１２はマウスＧａｌ－１に由来する相当する断片であり、この場合、野生型配列のシステインがセリンで置き換えられている（下線が引かれている）。Ｇａｌ－１エピトープペプチド＃７は野生型ヒトＧａｌ－１の断片であり、＃１４はマウス野生型Ｇａｌ－１の相当する断片である。
【0054】
Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃１７は、ヒトＮ末端Ｇａｌ－３エピトープペプチドからなる。Ｇａｌ－３エピトープペプチド＃２１および２２はヒトＧａｌ－３Ｎ末端反復配列エピトープペプチドからなり、＃２２は＃２１の反復配列よりも長い反復配列を有する。＃２３はマウスＧａｌ－３Ｎ末端ペプチドをコードする。
【0055】
本開示では、「アルファウイルス」とは、ウイルスのトガウイルス科に属するＲＮＡ含有ウイルスを指すこととする。例示的なトガウイルス科ウイルスとして、それらに限定されないが、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ヌドゥムウイルス、バギークリークウイルス、オケルボウイルスが挙げられる。
【0056】
本出願により提供されるウイルス様粒子では、ウイルス構造タンパク質と抗原は、ウイルス構造タンパク質に存在する少なくとも１つの第１の付着部位および抗原に存在する少なくとも１つの第２の付着部位をとおして連結することができる。
【0057】
本明細書で使用される場合、「第１の付着部位」および「第２の付着部位」それぞれは、２つ以上の物質が互いに連結する部位を指す。
【0058】
ウイルス構造タンパク質と抗原は、直接に融合されても、間接に融合されてもよい。一実施形態では、１つまたは２つのリンカーが、抗原のＮ末端残基とウイルス構造タンパク質との間に、および／または抗原のＣ末端残基とウイルス構造タンパク質との間に介在してもよい。
【0059】
抗原またはウイルス構造タンパク質を切断し、短いリンカーによって置き換えることができる。一部の実施形態では、抗原またはウイルス構造タンパク質は、１つまたは複数のペプチドリンカーを含む。典型的には、リンカーは、２個から２５個までのアミノ酸（例えば２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸）からなる。通常、リンカーは、２個から１５個までのアミノ酸の長さであるが、ある特定の状況では、リンカーは、単一グリシン（Ｇ）残基などの１個だけであってもよい。
【0060】
一実施形態では、ウイルス構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドが抗原をコードするポリヌクレオチドと遺伝子的に融合されているような核酸分子が、宿主細胞［例えば、哺乳動物細胞（例えば、２９３Ｆ細胞）］内で発現され、その結果、第１の付着部位と、第２の付着部位はペプチド結合をとおして連結される。この場合、ウイルス構造タンパク質と抗原はペプチド結合をとおして連結される。この実施形態に関して、第１の付着部位および／または第２の付着部位は、元のタンパク質または抗原から遺伝子的に改変することができる。例えば、第１の付着部位は、ＳＧ、ＧＳ、ＳＧＧ、ＧＧＳおよびＳＧＳＧを始めとするリンカーペプチドをとおしてタンパク質が抗原とコンジュゲートするように、ウイルス構造タンパク質から改変される。ウイルス構造タンパク質が抗原と化学的にコンジュゲートされる場合、第１の付着部位と第２の付着部位は、化合物である化学架橋リンカーをとおして連結することができる。架橋リンカーの例として、それらに限定されないが、ＳＭＰＨ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＰＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡおよびＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な他の架橋リンカーが挙げられる。
【0061】
アルファウイルスの好ましい例としては、チクングニアウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスが挙げられる。チクングニアウイルスの例としては、チクングニアウイルス３７９９７株およびＯＰＹ－１株が挙げられ得る。ベネズエラウマ脳炎ウイルスの例としては、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＴＣ－８３株が挙げられ得る。
【0062】
ウイルス構造タンパク質には、カプシドタンパク質および／もしくはエンベロープタンパク質、その断片またはそれらの複合体が含まれ得る。したがって、本出願に使用されるウイルス構造タンパク質は、カプシドタンパク質および／もしくはエンベロープタンパク質ならびに／またはその断片もしくは誘導体を含むことができる。一実施形態では、本開示によって提供されるウイルス様粒子は、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、およびＥ１の各タンパク質、ならびにガレクチン抗原を含む。
【0063】
好ましくは、抗原は、遺伝子工学によって作製される融合タンパク質として、チクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質またはベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質に連結することができる。
【0064】
生理学的条件下では、Ｅ３をフーリン切断後にＥ２から解離させることができる。一実施形態では、Ｅ３に位置するフーリン切断部位を突然変異させて、フーリン部位が切断されるのを妨げることができる。例えば、抗原をフーリン切断部位に挿入して、フーリン切断部位中に突然変異を導入することができる。この実施形態では、提供されるウイルス様粒子は、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、およびＥ１の各タンパク質からなるか、またはそれらを含むことができ、この場合、Ｅ３はＥ２に結合して単一タンパク質を形成し、抗原はＥ３領域に挿入される。例えば、本出願によって提供されるウイルス様粒子は、２４０のカプシド、２４０のＥ１タンパク質、２４０のタンパク質であって、このそれぞれにおいてＥ２がＥ３に結合し、抗原がＥ３領域のそれぞれに挿入されている２４０のタンパク質、をアセンブルすることによって形成することができる。
【0065】
本出願で使用されるチクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質またはベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質は、天然に存在するウイルス構造タンパク質であってもその改変タンパク質であってもよい。改変タンパク質は、天然に存在するウイルス構造タンパク質の断片であってもよい。一実施形態では、改変タンパク質は、天然に存在するウイルスカプシドおよび／またはエンベロープタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、改変タンパク質は、天然に存在するウイルスカプシドおよび／またはエンベロープタンパク質に対して、アミノ酸のうちの多くても１０％が欠失、置換および／または付加されている突然変異型である。例えば、Ｋ６４ＡまたはＫ６４Ｎ突然変異を、本出願で使用されるベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質のカプシドに導入することができる。
【0066】
例示的なチクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＸ４０００６．１（配列番号１）で提供される。別の例示的なチクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＸ４００１１．１（配列番号２）で提供される。
【0067】
例示的なベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質を配列番号３に示す。
【0068】
一実施形態では、第１の付着部位はアミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むことができる。第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むことができる。
【0069】
一実施形態では、チクングニアウイルス様粒子またはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子を提供することができ、このウイルス様粒子は、チクングニアウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質および少なくとも１つのガレクチン抗原を含み、この場合、少なくとも１つのガレクチン抗原はウイルス構造タンパク質のＥ３に挿入され、かつ、チクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質またはベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質とガレクチン抗原とが、融合タンパク質として発現する。ガレクチン抗原は、ウイルス構造タンパク質のＥ３に直接に挿入されても間接に挿入されてよい。
【0070】
チクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質に関して、配列番号１もしくは２のＥ３の３２２Ｒから３２５Ｒまでのフーリン切断部位（ＲＫＲＲ）、または、配列番号１もしくは２の３２２Ｒから３２５Ｒまでのフーリン部位（ＲＫＲＲ）に相当する部位の代わりに、少なくとも１つのガレクチン抗原を挿入することができる。例えば、チクングニアウイルスのウイルス構造タンパク質に関して、配列番号１もしくは２の３２１位にての残基Ｈと３２６位にての残基Ｓとの間に；配列番号１もしくは２の３２０位にてのＰと３２６位にてのＳの間に；または配列番号１もしくは２の３１９位にてのＳと３２６位にてのＳの間にまたは相当する部位に、少なくとも１つのガレクチン抗原が挿入される。ＶＬＰ＿ＣＨＩ ０．５６ベクターを、ガレクチン抗原が配列番号１または２の残基３２１と残基３２６の間に挿入されているチクングニアウイルス様粒子を調製するために使用することができる。ガレクチン抗原が、配列番号１または２の残基３２１と残基３２６の間に挿入される場合、本出願によって提供されるウイルス様粒子は、Ｅ２とＥ３の複合体、カプシドおよびＥ１を含むチクングニアウイルス様粒子とすることができるが、この場合、少なくとも１つのガレクチン抗原がＥ３領域に挿入される。
【0071】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質に関して、配列番号３のＥ３の３３１Ｒから３３４Ｒまでのフーリン切断部位（ＲＫＲＲ）、または、配列番号３の３３１Ｒから３３４Ｒまでのフーリン切断部位に相当する部位の代わりに、少なくとも１つのガレクチン抗原を挿入することができる。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのウイルス構造タンパク質に関して、配列番号３の３３０位にてのＧと３３５位にてのＳとの間に；配列番号３の３２９位にてのＰと３３５位にてのＳの間に；または配列番号３の３２８位にてのＣと３３５位にてのＳの間にまたは相当する部位に、少なくとも１つのガレクチン抗原が挿入される。ＶＬＰ＿ＶＥＥＶ ０．６６ベクターを、抗原が配列番号３の残基３３０と残基３３５の間に挿入されているベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子を調製するために使用することができる。抗原が、配列番号３の残基３３０と残基３３５の間に挿入される場合、本出願によって提供されるウイルス様粒子は、Ｅ２とＥ３の複合体、カプシドおよびＥ１を含むベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子とすることができるが、この場合、少なくとも１つのガレクチン抗原はＥ３領域に挿入される。
【0072】
２つのタンパク質またはアミノ酸配列のアミノ酸位置に関して本明細書で使用される場合、「に相当する」という用語は、２つのタンパク質が標準的な配列アラインメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）に供される場合、第１の配列の特定のアミノ酸位置にてのアミノ酸残基が、第２のタンパク質の当該アミノ酸位置に一致するかまたはそれと合致することを指示して使用される。したがって、位置「Ａ」および「Ｂ」にての残基が配列アラインメントにおいて互いに一致する場合、第１のタンパク質のアミノ酸位置「Ａ」は、第２の配列のアミノ酸位置「Ｂ」に相当することになる。
【0073】
チクングニアウイルスならびにベネズエラウマ脳炎のウイルス構造タンパク質は、カプシド、Ｅ１、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ３を含む。６Ｋはアセンブルのプロセスの過程で自然に切断され、ＶＬＰから除かれる。本明細書および特許請求の範囲において、「ウイルス構造タンパク質」とは、６Ｋを有するもののみならず、６Ｋが除かれた後のものも指す。
【0074】
実用的な例で使用されるＣＨＩＫＶおよびＶＥＥＶの６Ｋ配列は以下のとおりである：
ＣＨＩＫＶ ＯＰＹ－１株、６Ｋ：配列番号１の７４９～８０９ａａ
atyqeaaiylwneqqplfwlqaliplaalivlcnclrllpcccktlaflavmsvgahtvsa（配列番号４）
ＣＨＩＫＶ ３７９９７株、６Ｋ：配列番号２の７４９～８０９ａａ
atyyeaaaylwneqqplfwlqaliplaalivlcnclkllpcccktlaflavmsigahtvsa（配列番号５）
ＶＥＥＶ ＴＣ－８３株、６Ｋ：配列番号３の７５８～８１３ａａ
ettwesldhlwnnnqqmfwiqlliplaalivvtrllrcvccvvpflvmagaagaga
(配列番号６)
ＣＨＩＫＶ ＯＰＹ－１株、６Ｋ：配列番号１の７４９～８０９ａａ
atyqeaaiylwneqqplfwlqaliplaalivlcnclrllpcccktlaflavmsvgahtvsa（配列番号４）
ＣＨＩＫＶ ３７９９７株、６Ｋ：配列番号２の７４９～８０９ａａ
atyyeaaaylwneqqplfwlqaliplaalivlcnclkllpcccktlaflavmsigahtvsa（配列番号５）
ＶＥＥＶ ＴＣ－８３株、６Ｋ：配列番号３の７５８～８１３ａａ
ettwesldhlwnnnqqmfwiqlliplaalivvtrllrcvccvvpflvmagaagaga
(配列番号６)
【0075】
本明細書で提供される核酸分子には、本開示のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常には実質的な同一性を呈することになる。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることが通常にはできる。本開示の方法において有用な核酸分子には、本開示のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常には実質的な同一性を呈することになる。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることが通常にはできる。「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェンシー条件下で、相補性ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）どうしの間またはその一部どうしの間で二本鎖分子を形成する対を意味する。（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399；Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
【0076】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウムとなる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは少なくとも約３７℃の、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれることになる。ハイブリダイゼーションの時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの含入または排除などの種々の追加のパラメーターは、当業者であればよく知られている。必要に応じてこれら種々の条件を組み合わせることによって、種々のレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、３０℃で、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳ中で行われることになる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、３７℃で、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１００μｇ／ｍｌ中で行われることになる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、４２℃で、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよびｓｓＤＮＡ ２００μｇ／ｍｌ中で行われることになる。これらの条件の有用な変形形態は、当業者であれば容易に明らかであろう。
【0077】
ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なることになる。洗浄ストリンジェンシーの条件は、塩濃度によっておよび温度によって定義することができる。上のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによってまたは温度を上昇させることによって高めることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムとなる。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約２５℃の、より好ましくは少なくとも約４２℃の、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度が含まれることになる。好ましい実施形態では、洗浄工程は、２５℃で、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中で行われることになる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、４２℃で、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中で行われることになる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、６８℃で、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中で行われることになる。
【0078】
これらの条件の追加の変形形態は、当業者であれば容易に明らかとなるであろう。ハイブリダイゼーション技法は、当業者であればよく知られており、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977)；Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)；Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。「実質的に同一である」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の同一性を呈するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸にて少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは９０％、９５％または９９％も同一である。
【0079】
配列同一性は通常、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。かかるソフトウェアによって、相同性の程度を種々の置換、欠失、および／または他の改変に割り当てることにより同一または類似の配列を整合させる。保存的置換には通常、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、この場合、ｅ＜”３＞とｅ＜”１００＞との間の確率スコアによって、密接に関連した配列が指示される。
【0080】
本明細書における可変基の任意の定義における化学基のリストの記載は、リストされた基の任意の単一の基または組合せとしてのその可変基の定義を含む。本明細書における可変基または態様に関する実施形態の記載は、任意の単一の実施形態としてのまたは任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせられた、その実施形態を含む。
【0081】
本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供される他の組成物および方法のいずれかの１つまたは複数と組み合わせることができる。
【0082】
本開示の一部の実施形態では、タンパク質は、サイレント置換、付加または欠失を生じるがコードされたタンパク質の特性もしくは活性または当該タンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する突然変異を含むことができる。様々な理由のために、例えば特定の宿主に対してコドン発現を最適化するために、ヌクレオチド変異型を造り出すことができるが、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１１８１９１号を参照されたい。
【0083】
加えて、ヌクレオチドを配列決定して、正しいコード領域がクローニングされたがこれは不要な突然変異をまったく含有しないことを確実にすることができる。上記ヌクレオチドを、任意の細胞中で発現させるための発現ベクター（例えばバキュロウイルス）へとサブクローニングすることができる。当業者であれば、種々のサブクローニング方法が利用できかつ可能であることを理解するであろう。
【0084】
単離された核酸は実質的に精製されているとすることができるが、そうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離されている核酸は、それが存在する細胞内においてわずかな割合の物質のみを含む場合があるという点で、純粋ではない。そのような核酸は、その用語が本明細書で使用される場合、単離されているが、なぜなら、当業者に知られている標準技法によって容易に操作可能であるからである。
【0085】
ポリペプチドの発現
一般に、アルファウイルスのウイルス構造タンパク質および少なくとも１つのガレクチン（ｇｅｌａｃｔｉｎ）抗原を含むＶＬＰは、適切な発現媒体中で、ポリペプチドをコードする核酸分子もしくはその断片の全部または一部で適切な宿主細胞を形質転換することによって作製することができる。
一般に、アルファウイルスのウイルス構造タンパク質および少なくとも１つのガレクチン（ｇｅｌａｃｔｉｎ）抗原を含むＶＬＰは、適切な発現媒体中で、ポリペプチドをコードする核酸分子もしくはその断片の全部または一部で適切な宿主細胞を形質転換することによって作製することができる。
【0086】
分子生物学分野の当業者であれば、多種多様な発現系のいずれかを使用して、組換えタンパク質を提供することができることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は、本開示にとって重要ではない。本開示のポリペプチドは、原核性宿主［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）］中または真核性宿主［例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳの各細胞］中で産生させることができる。このような細胞は、広範囲の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＤ；また、例えば、Ausubel et al.、上掲も参照されたい）から入手可能である。昆虫細胞の非限定的な例は、ツマジロクサヨトウ.（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞、例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、ならびにショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞である。真菌（酵母を含めて）宿主細胞の例は、Ｓ．セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス［Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）］、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＣ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）を始めとするカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ［Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）］、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ならびにヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＨｅｐ－２細胞である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵巣細胞または両生類起源の他の細胞もまた、使用することができる。原核生物宿主細胞には、細菌細胞、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびマイコバクテリウムが含まれる。
【0087】
前記タンパク質をクローニングする方法は当技術分野で既知である。例えば、特定のアルファウイルスのウイルス構造タンパク質、例えばＣＨＩＫＶまたはＶＥＥＶのウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子は、前記ウイルスを感染させておいた細胞から抽出されたポリアデニル化ｍＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって単離することができる。生成する産物の遺伝子は、ＤＮＡインサートとしてベクターにクローニングすることができる。「ベクター」という用語は、手段であって、これによって核酸を生物体間、細胞間、または細胞成分間で伝播および／または導入することができる手段を指す。ベクターには、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等が含まれ、それらは自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体に統合することができる。ベクターはまた、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内のＤＮＡとＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ－リジンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡ等とすることができるが、それらは自律的に複製しない。多くの、全てではないが、一般的な実施形態では、本発明のベクターはプラスミドまたはバクミドである。
【0088】
本開示は、ＶＬＰの形成をもたらす細胞において発現させることができる発現ベクターにクローニングされた、キメラ分子を含めて、タンパク質をコードするヌクレオチドをさらに提供する。「発現ベクター」とは、その中に組み込まれた核酸の発現ならびに複製を促進することができる、プラスミドなどのベクターである。
【0089】
通常には、発現される核酸分子は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「作動可能に連結され」ており、プロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御の支配下にある。
【0090】
本開示のポリペプチドの生成向けに様々な発現系が存在する。かかるポリペプチドを生成するのに有用な発現ベクターとして、限定されないが、染色体、エピソーム、およびウイルス由来の各ベクター、例えば、細菌プラスミドに由来する、バクテリオファージに由来する、トランスポゾンに由来する、酵母エピソームに由来する、挿入エレメントに由来する、酵母染色体エレメントに由来する、バキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスに由来する各ベクター、ならびにそれらの組合せに由来するベクターが挙げられる。
【0091】
本明細書で提供されるコンストラクトおよび／またはベクターは、本明細書に記載のエンベロープタンパク質もしくはカプシドタンパク質またはその一部を含めて、構造タンパク質をコードするアルファウイルスポリヌクレオチドを含む。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスの各ベクターとすることができる。ヌクレオチドを含むコンストラクトおよび／またはベクターは、非限定的な例であるが、ＣＭＶプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの、適当なプロモーターに作動可能に連結されていることが求められる。他の適切なプロモーターは、宿主細胞および／または所望の発現率に応じて当業者に知られている。発現コンストラクトは、転写開始、終結のための部位、および転写領域では、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有する。コンストラクトによって発現される転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めに翻訳開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの末端に適当に配列される終止コドンを含む。
【0092】
発現ベクターは少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましいであろう。かかるマーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８またはネオマイシンの耐性、ならびに大腸菌および他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリンの各耐性遺伝子が含まれる。ベクターのうちで好ましいのは、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、豚痘ウイルス等）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスベクターである。本開示とともに使用することができる他のベクターは、細菌において使用するためのベクターを含み、これは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ－９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。好ましい真核生物ベクターのうちには、ｐＦａｓｔＢａｃｌ、ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌおよびｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。他の適切なベクターは当業者にとって容易に明らかになるであろう。
【0093】
組み換えコンストラクトを、調製および使用して、真核細胞および／または原核細胞へとトランスフェクトする、感染させるかまたはトランスフォームすることができ、かつ、それらへと本明細書に記載のものを含めてウイルスタンパク質を発現させることができる。したがって、本開示は、宿主細胞であって、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥｌもしくはそれらの部分を含めて、アルファウイルスのウイルス構造遺伝子、ならびに／または上記の任意のキメラ分子をコードする核酸を含有するとともに、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥｌもしくはそれらの部分を含めて、アルファウイルスのウイルス構造遺伝子、ならびに／または上記の任意のキメラ分子の発現を、ＶＬＰの形成を行うことができる条件下で前記宿主細胞において可能とする、あるベクター（または複数のベクター）を含む、宿主細胞を提供する。
【0094】
一実施形態では、前記ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態では、前記組換えバキュロウイルスを昆虫細胞にトランスフェクトする。好ましい実施形態では、前記細胞は昆虫細胞である。別の実施形態では、前記昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【0095】
別の実施形態では、前記ベクターおよび／または宿主細胞は、記載されるカプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１、またはそれらの一部を含めて、アルファウイルス遺伝子をコードするヌクレオチドを含む。
【0096】
別の実施形態では、前記ベクターおよび／または宿主細胞は、本明細書に記載のアルファウイルスカプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１、またはそれらの一部から本質的になる。さらなる実施形態では、前記ベクターおよび／または宿主細胞は、本明細書に記載の、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１、またはそれらの一部を含むアルファウイルスタンパク質からなる。これらのベクターおよび／または宿主細胞は、本明細書に記載の、アルファウイルスコア、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１、またはそれらの一部を含有し、ｃｅｌｌｕｌＶＬＰｒｏｔｅｉｎｓ、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物等などの追加の細胞成分を含有してもよい。
【0097】
ポリペプチド産生向けの特定の一細菌発現系は大腸菌ｐＥＴ発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）である。この発現系によれば、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、発現を可能とするように設計された方向でｐＥＴベクターに挿入する。かかるポリペプチドをコードする遺伝子はＴ７調節シグナルの制御下にあるので、ポリペプチドの発現は宿主細胞におけるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導することによって行われる。このことは通常には、ＩＰＴＧ誘導に応答してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主株を使用して行われる。いったん産生されると、組換えポリペプチドは次いで、当技術分野において既知の標準法、例えば、本明細書に記載の方法に従って単離される。
【0098】
ポリペプチド産生用の別の細菌発現系はｐＧＥＸ発現系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。このシステムは、融合タンパク質としての遺伝子または遺伝子断片を高レベルで発現し、この場合、機能性遺伝子産物を迅速に精製および回収できるように設計されているＧＳＴ遺伝子融合システムを用いる。目的のポリペプチドは、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）由来のグルタチオンＳタンパク質転移酵素のカルボキシル基末端に融合され、そして、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細菌溶解物から容易に精製される。融合タンパク質は、穏和な条件下でグルタチオンを用いる溶出により回収することができる。融合タンパク質からのグルタチオンＳ転移酵素ドメインの切断は、このドメイン上流の部位特異的プロテアーゼの認識部位が存在することにより促進される。例えば、ｐＧＥＸ－２Ｔプラスミドで発現するタンパク質はトロンビンにより切断することができる；ｐＧＥＸ－３Ｘで発現するものは因子Ｘａにより切断することができる。
【0099】
医薬組成物および投与
本開示は、本明細書に記載のＶＬＰを含む医薬組成物を特徴とする。本明細書で有用な医薬組成物は、適切な任意の希釈剤または賦形剤を含めて、医薬的に許容される担体であって、組成物を受ける脊椎動物にとって有害な免疫応答の生成をそれ自体誘導しないあらゆる医薬品が含まれるとともに過度の毒性なしで投与することができる担体と、本開示のＶＬＰとを含有する。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、哺乳動物での、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認済みであること、または米国薬局方、欧州薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチンおよび／または抗原組成物として有用とすることができる。
本開示は、本明細書に記載のＶＬＰを含む医薬組成物を特徴とする。本明細書で有用な医薬組成物は、適切な任意の希釈剤または賦形剤を含めて、医薬的に許容される担体であって、組成物を受ける脊椎動物にとって有害な免疫応答の生成をそれ自体誘導しないあらゆる医薬品が含まれるとともに過度の毒性なしで投与することができる担体と、本開示のＶＬＰとを含有する。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、哺乳動物での、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認済みであること、または米国薬局方、欧州薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチンおよび／または抗原組成物として有用とすることができる。
【0100】
医薬的に許容される担体には、それらに限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張性水性緩衝剤、およびこれらの組合せが含まれる。医薬的に許容される担体、希釈剤、およびその他の賦形剤に関する徹底した考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．現行版）に発表されている。製剤は投与の様式に適することが求められる。好ましい実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に適するものであり、滅菌されており、非微粒子状であり、かつ／または非発熱性であることが好ましい。
【0101】
所望であれば、組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤も含有することができる。組成物は、再構成に適した凍結乾燥粉末などの固体の形態、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤とすることができる。経口用製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準の担体を含んでもよい。
【0102】
ある特定の実施形態では、ＶＬＰ組成物は、例えば、ＶＬＰ組成物の量および濃度を表示する密閉容器中で、液体形態で供給される。
【0103】
好ましくは、液体形態のＶＬＰ組成物は、密閉容器の少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌで供給される。
【0104】
代替的に、ワクチン製剤は、点滴、大粒子エアロゾル（約１０ミクロン超）もしくは上気道への噴霧または小粒子エアロゾル（１０ミクロン未満）もしくは下気道への噴霧のいずれかによって、鼻腔内に投与される。上記のデリバリー経路のいずれもが免疫応答をもたらすが、一方で、鼻腔内投与によれば、アルファウイルス、例えば、ＣＨＩＫＶまたはＶＥＥＶを含めて、多くのウイルスの侵入部位で粘膜免疫を誘発するという付加的な利点が付与される。
【0105】
したがって、本開示はまた、哺乳動物への感染またはその少なくとも１つの症状に対する免疫を誘導するワクチンまたは抗原性組成物を製剤化する方法であって、前記製剤に有効用量のＶＬＰ、例えば、アルファウイルス（例えば、ＣＨＩＫＶまたはＶＥＥＶ）を添加することを含む、方法も含む。
【0106】
ある特定の場合では、単回用量での免疫の賦活が好ましいが、しかし、追加の投薬量を同じまたは異なる経路によって投与して、所望の効果を達成することもできる。新生児および幼児では、例えば、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回の投与が必要とされる場合がある。投与は、十分なレベルまたは防御を維持するために必要に応じて、小児期全体をとおして間隔をおいて継続してもよい。
【0107】
同様に、例えば、医療従事者、デイケア従事者、低年齢小児の家族メンバ、高齢者、および心肺機能または免疫系が損なわれた個人などの、反復性または重篤な感染に特にかかりやすい成人は、防御免疫応答を確立し、および／または維持するために複数の免疫を必要とする場合がある。誘導された免疫のレベルを、例えば、中和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによってモニタリングし、必要に応じて、投薬量を調節してまたはワクチン接種を繰り返して、所望のレベルの防御を誘発および維持することができる。
【0108】
医薬製剤の投薬量は、例えば、予防的もしくは治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を最初に特定することによって、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することによって、または血清試料もしくは尿試料もしくは粘膜分泌物中の抗体の阻害率を測定することによって、当業者であれば、容易に決定することができる。前記投薬量は動物試験から決定することができる。ワクチンの有効性を研究するために使用される動物の非限定的なリストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウスおよびコットンラット、ならびに非ヒト霊長類が含まれる。ほとんどの動物は感染病原体に対する自然宿主ではないが、それでも疾患の種々の態様の研究に役立つことができる。例えば、上記動物のいずれかに、ワクチン候補、例えば、本開示のＶＬＰを投薬して、誘導された免疫応答を部分的に特徴付けること、および／または任意の中和抗体が産生されているかどうかを判定することができる。例えば、マウスは小型であり、その低コストであることより研究者はラージスケールで研究を実行することができるので、多数の研究がマウスモデルにおいて実行されてきた。
【0109】
加えて、ヒト臨床研究を、ヒトのための好ましい有効用量を決定するために当業者によって実施することができる。そのような臨床研究はルーチンであり、当技術分野においてよく知られている。用いられるべき正確な用量はまた、投与経路に依存することになる。有効用量は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または動物試験システムから導き出される用量－応答曲線から外挿することができる。
【0110】
また、当技術分野においてよく知られているように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的賦活剤の使用によって増強することができる。アジュバントは、未知の抗原に対する免疫の全般的な高まりを促進するために経験的に使用されてきた。免疫プロトコルでは、長年にわたって応答を賦活するためにアジュバントが使用されており、したがって、アジュバントは当業者によく知られている。いくつかのアジュバントは、抗原が提示される様式に影響を及ぼす。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がミョウバンによって沈殿する場合、高まる。抗原の乳化もまた、抗原提示の期間を延長する。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)"に記載の任意のアジュバントの包含は、本発明の範囲内で想定される。
【0111】
例示的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント［死菌結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する免疫応答の非特異的賦活剤］、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントは、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ－ＭＤＰおよびｎｏｒ－ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含む。２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ－８０エマルション中の、細菌から抽出された３つの成分、ＭＰＬ、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩもまた、企図される。ＭＦ－５９、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）、ＭＨＣ抗原もまた、使用することができる。
【0112】
本開示のＶＬＰはまた、「免疫賦活剤」と製剤化することができる。それらは、免疫系の応答を高めるための身体自身の化学的メッセンジャー（サイトカイン）である。免疫賦活剤には、限定されないが、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３）などの、免疫賦活活性、免疫増強活性、および炎症促進活性を有する種々のサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン；増殖因子［例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ）］；およびマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等などの他の免疫賦活分子が含まれる。免疫賦活分子は、ＶＬＰと同じ製剤中で投与してもよく、または別々に投与してもよい。タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫賦活作用を生成するために投与することができる。したがって、一実施形態では、本開示は、アジュバントおよび／または免疫賦活剤を含む抗原製剤およびワクチン製剤を含む。
【0113】
本開示によれば、組成物は、
がんもしくは肝臓の繊維症を始めとする炎症性疾患を処置もしくは予防する；
哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生する；
対照において免疫応答を調節する；
対照における免疫賦活；
ガレクチンとガレクチン受容体の間の相互作用を阻害する；または
ガレクチン活性を阻害する、
免疫療法にとって有用である。
がんもしくは肝臓の繊維症を始めとする炎症性疾患を処置もしくは予防する；
哺乳動物においてガレクチンに対する抗体を産生する；
対照において免疫応答を調節する；
対照における免疫賦活；
ガレクチンとガレクチン受容体の間の相互作用を阻害する；または
ガレクチン活性を阻害する、
免疫療法にとって有用である。
【0114】
本組成物によって処置することができるがんの例としては、それらに限定されないが、頭頸部がん、肺がん、非小細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、黒色腫、乳がん、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、結腸がん、十二指腸がん、肛門がん、胃がん、肝臓がん、精巣がん、卵管がん、子宮体がんおよび子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、前立腺がん、腎盂のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによるがんを始めとする環境誘発性がん、ならびにそれらの組合わせが挙げられる。
【0115】
とりわけ、少なくとも１つのガレクチン抗原が、下のＧａｌ－１エピトープペプチド＃５、＃７、＃１２または＃１４、とりわけＧａｌ－１エピトープペプチド＃５または＃７などのガレクチン－１エピトープペプチドである場合、本開示により提供されるＶＬＰは、肺がんなどのがん、およびＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患または状態を処置または予防するために使用することができる。
【0116】
少なくとも１つのガレクチン抗原が、下のＧａｌ－３エピトープペプチド＃１７、＃２１、＃２２または＃２３、とりわけＧａｌ－３エピトープペプチド＃１７、＃２１または＃２２などのガレクチン－３エピトープペプチドである場合、本開示により提供されるＶＬＰは、それらに限定されないが、肺線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を始めとする肝臓線維症、全身性硬化症および心筋線維症を始めとする線維症に関連する疾患または状態を処置または予防するために使用することができる。
【0117】
本出願は以下の実施例を参照して詳細に記載されるが、それらは本出願の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１］
［実施例１］
【0118】
Ｇａｌ－１ ＶＬＰの調製
材料および方法
ガレクチン－１（Ｇａｌ－１）ワクチンエピトープを、ヒトおよびマウスのＧａｌ－１タンパク質のアミノ酸配列と３Ｄ構造を使用することによって設計した（表１）。
表１において、エピトープペプチド＃５～＃１０はヒトｇａｌ－１の断片であり、エピトープペプチド＃１２および＃１４はマウスｇａｌ－１タンパク質の断片である。Ｇａｌ－１エピトープペプチドをタンパク質粒子の表面上で提示するために、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のウイルス構造タンパク質のＥ３領域をＧａｌ－１エピトープペプチドで改変した。エピトープペプチドを、ＣＨＩＫＶについては配列番号２の３２１位にてのＨと３２６位にてのＳとの間に、ＶＥＥＶについては配列番号３の３３０位にてのＧと３３５位にてのＳの間に、リンカーＳＧＧ（Ｎ末端）およびＧＧＳ（Ｃ末端）をとおして融合した。
材料および方法
ガレクチン－１（Ｇａｌ－１）ワクチンエピトープを、ヒトおよびマウスのＧａｌ－１タンパク質のアミノ酸配列と３Ｄ構造を使用することによって設計した（表１）。
表１において、エピトープペプチド＃５～＃１０はヒトｇａｌ－１の断片であり、エピトープペプチド＃１２および＃１４はマウスｇａｌ－１タンパク質の断片である。Ｇａｌ－１エピトープペプチドをタンパク質粒子の表面上で提示するために、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のウイルス構造タンパク質のＥ３領域をＧａｌ－１エピトープペプチドで改変した。エピトープペプチドを、ＣＨＩＫＶについては配列番号２の３２１位にてのＨと３２６位にてのＳとの間に、ＶＥＥＶについては配列番号３の３３０位にてのＧと３３５位にてのＳの間に、リンカーＳＧＧ（Ｎ末端）およびＧＧＳ（Ｃ末端）をとおして融合した。
【0119】
哺乳動物発現ベクター、ｐＣＨＩＫＶ－Ｇａｌ－１またはｐＶＥＥＶ Ｇａｌ－１のプラスミドＤＮＡベクターの生成の場合、Ｇａｌ－１エピトープペプチド配列（ｇＢｌｏｃｋｓ、ＩＤＴ）の合成ｄｓＤＮＡ断片を、ｐＣＨＩＫＶベクターまたはｐＶＥＥＶベクター内のＣＨＩＫＶ Ｅ３エンベロープタンパク質ＤＮＡの特定の位置に挿入した。Ｇａｌ－１エピトープペプチドの挿入が全くないｐＣＨＩＫＶベクターまたはｐＶＥＥＶベクターを、対照ＶＬＰ発現ベクターとして使用した。
【0120】
【表1】
【0121】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｒ７９０－０７）を、振盪インキュベーター（ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ）を使用して、８％ＣＯ２の存在下、３７℃でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１２３３８－０１８）を含む懸濁液中で培養した。２９３Ｆ細胞に、ｐＣＨＩＫＶ Ｇａｌ－１ ＃７、＃１２または対照プラスミドＤＮＡ発現ベクターを、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃２３９６６）により、ＤＮＡ ０．８μｇ／１０６個の細胞、ＤＮＡ：ＰＥＩ＝１：３、および１．２５×１０６個の細胞／培養培地１ｍＬの条件で、トランスフェクトした。培養上清を、トランスフェクションの４日後に回収し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）によって、これに続いて０．４５μｍ ＰＥＳメンブレンフィルターシステム（ＶＷＲ ＃１００４０－４７０）での濾過によって、清澄化した。Ｇａｌ－１ ＶＬＰの生成を、ウサギ抗ＣＨＩＫＶ抗血清（ＶＬＰ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）またはマウス抗ＶＥＥＶ血清（ＡＴＣＣ）および種特異的ＨＲＰ標識二次抗体を使用することによって、精製または濃縮まったく無しで、濾過した培養上清のウェスタンブロット分析によって確認した。
【0122】
Ｇａｌ－１ ＶＬＰの精製および濃縮の場合、ＶＬＰ含有培養上清をＯｐｔｉＰｒｅｐ（６０％ｗ／ｖ）（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃ＡＮ１１１４５４２）１．５ｍＬ上へと重ね、ＳＷ－２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で５２，０００×ｇで１．５時間遠心分離した。界面の上に１．５ｍＬを残すように上清を取り除いた後、２つの層を混合し、ＮＶＴ１００ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で３６０，０００×ｇで２．５時間遠心分離して、密度勾配を形成した。
【0123】
粗ＶＬＰを収集し、ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００ ＨＲカラム（ＧＥ、＃２８－９３５６－０６）を備えたＢｉｏｌｏｇｉｃＤｕｏ－Ｆｌｏｗ ＦＰＬＣシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＶＬＰを含有する画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＵＦＣ９１００２４）によって濃縮し、０．２０μｍのＰＥＳメンブレンを通して濾過した。
【0124】
総タンパク質濃度を、製造業者の取扱説明書に従ってＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）によって測定した。ＶＬＰ試料の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（Ａｎｙ ｋＤ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃４５６－９０３５）、これに続いて、ＱＣ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１６１０８０３）を使用するクマシー色素ベースの染色によって確認した。スクロースおよびＥＤＴＡを、それぞれ最終濃度２５０ｍＭおよび５ｍＭへとＶＬＰ溶液に添加した。Ｇａｌ－１ ＶＬＰ試料のタンパク質濃度を０．４ｍｇ／ｍＬに調整し、－８０℃で保存した。
【0125】
２９３Ｆ細胞（１０ｍｌ）を、表示のＧａｌ－１エピトープをコードするプラスミド１０ｕｇでＶＥＥＶ ＶＬＰへとトランスフェクトした。上清を回収し、ウェスタンブロッティングを実施して、抗ＶＥＥＶマウス血清を検出した（１：１０００希釈）。上清中でＧａｌ－１エピトープペプチド＃５、＃７、＃１２、＃１４を担持するＶＬＰの発現が確認された（図１）。
［実施例２］
［実施例２］
【0126】
マウス免疫原性の研究
材料および方法
免疫試料の調製の場合、ＶＬＰ溶液を解凍し、２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバント（１０ｍｇ／ｍｌのアルミニウム、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、＃２５０－８４３２６１、バッチ＃５０１４）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。マウス（８週齢の雌性、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｅｎｖｉｇｏ）に、０．０５ｍＬ中の１０ｕｇ（タンパク質）を大腿部に筋肉内で１日目、４日目、および８日目に、注射した。自己抗原に対する抗体力価に及ぼすペプチド－ＶＬＰ融合タンパク質の効果を評価するために、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントとともに完全長組換えヒトまたはマウスのＧａｌ－１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１０ｕｇを、対照として異なる２つの群のマウスに注射した。血液試料を、０日目および１５日目に顎下静脈を介して、２９日目に心臓穿刺により採取した。動物の取り扱い、免疫、採血、血清の調製は、動物実験委員会のガイドラインに準じてＳｍｉｔｈｅｒｓ Ａｖａｎｚａ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で実行した。全血試料をＳｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃４５０４７２）に採取し、１，２００×ｇで５分間遠心分離して血清を分離した。採取血清は解析まで－２０度で保存した。
材料および方法
免疫試料の調製の場合、ＶＬＰ溶液を解凍し、２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバント（１０ｍｇ／ｍｌのアルミニウム、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、＃２５０－８４３２６１、バッチ＃５０１４）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。マウス（８週齢の雌性、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｅｎｖｉｇｏ）に、０．０５ｍＬ中の１０ｕｇ（タンパク質）を大腿部に筋肉内で１日目、４日目、および８日目に、注射した。自己抗原に対する抗体力価に及ぼすペプチド－ＶＬＰ融合タンパク質の効果を評価するために、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントとともに完全長組換えヒトまたはマウスのＧａｌ－１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１０ｕｇを、対照として異なる２つの群のマウスに注射した。血液試料を、０日目および１５日目に顎下静脈を介して、２９日目に心臓穿刺により採取した。動物の取り扱い、免疫、採血、血清の調製は、動物実験委員会のガイドラインに準じてＳｍｉｔｈｅｒｓ Ａｖａｎｚａ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で実行した。全血試料をＳｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃４５０４７２）に採取し、１，２００×ｇで５分間遠心分離して血清を分離した。採取血清は解析まで－２０度で保存した。
【0127】
ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｇａｌ－１特異的血清抗体力価を間接ＥＬＩＳＡによって決定した。免疫アッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、＃４４２４０４）を、組換えヒトまたはマウスのガレクチン－１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１０２９０－ＨＮＡＥおよび＃５０１００－ＭＮＡＥ）のＰＢＳ １００μＬ（５００ｎｇ／ｍＬ）で４度で一晩コーティングした。ＴＢＳ－Ｔでリンス後、ウェルをブロッキング緩衝剤（ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルク）３５０μＬで室温で１時間ブロックした。ウェルをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。マウス血清を１：５０に希釈し、ブロッキング緩衝剤で最終希釈率１：７８１，２５０へと１：５でさらに連続希釈した。希釈血清をコーティングウェル中で室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳ－Ｔ ４００μＬで５回洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃ＰＡ１－８４３８８）とともに室温で３０分間さらにインキュベートした。プレートウェルをＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＨＲＰ基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ １－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ、＃５１２０－００７６）１００μＬとともにインキュベートした。反応を停止溶液（１Ｍ Ｈ２ＳＯ４）１００μＬで停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ／ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）によって４５０ｎｍの吸光度を測定した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して解析した。エンドポイント力価は、標準偏差値３つ分をプラスしたブランク値よりも高い吸光度測定値を生じる、より高い血清希釈として定義した。
Ｇａｌ－１特異的血清抗体力価を間接ＥＬＩＳＡによって決定した。免疫アッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、＃４４２４０４）を、組換えヒトまたはマウスのガレクチン－１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１０２９０－ＨＮＡＥおよび＃５０１００－ＭＮＡＥ）のＰＢＳ １００μＬ（５００ｎｇ／ｍＬ）で４度で一晩コーティングした。ＴＢＳ－Ｔでリンス後、ウェルをブロッキング緩衝剤（ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルク）３５０μＬで室温で１時間ブロックした。ウェルをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。マウス血清を１：５０に希釈し、ブロッキング緩衝剤で最終希釈率１：７８１，２５０へと１：５でさらに連続希釈した。希釈血清をコーティングウェル中で室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳ－Ｔ ４００μＬで５回洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃ＰＡ１－８４３８８）とともに室温で３０分間さらにインキュベートした。プレートウェルをＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＨＲＰ基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ １－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ、＃５１２０－００７６）１００μＬとともにインキュベートした。反応を停止溶液（１Ｍ Ｈ２ＳＯ４）１００μＬで停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ／ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）によって４５０ｎｍの吸光度を測定した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して解析した。エンドポイント力価は、標準偏差値３つ分をプラスしたブランク値よりも高い吸光度測定値を生じる、より高い血清希釈として定義した。
【0128】
免疫血清中の抗Ｇａｌ－１抗体の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスを、間接ＥＬＩＳＡおよびサブクラス特異的二次抗体パネルによって決定した。免疫アッセイプレートを、組換えマウスガレクチン－１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５０１００－ＭＮＡＥ）のＰＢＳ １００μＬ（５００ｎｇ／ｍＬ）で４度で一晩コーティングした。ＴＢＳ－Ｔでリンス後、ウェルをブロッキング緩衝剤（ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルク）３５０μＬで室温で１時間ブロックした。ウェルをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。マウス血清をブロッキング緩衝剤で１：１０００に希釈した。各希釈血清を異なる８つのＧａｌ－１コーティングウェルに移し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳ－Ｔ ４００μＬで５回洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇサブクラス特異的抗体のＭｏｕｓｅ Ｔｙｐｅｒ Ｓｕｂ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｐａｎｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１７２－２０５５）とともに室温で３０分間、さらにインキュベートした。プレートウェルをＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＨＲＰ基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ（商標）ＴＭＢ １－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ、＃５１２０－００７６）１００μＬとともにインキュベートした。反応を停止溶液１００μＬで停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0129】
結果
Ｇａｌ－１ペプチド断片のスクリーニング（表１に記載）により、本発明者らは、ＣＨＩＫＶウイルス様粒子プラットフォームとの抗ヒトＧａｌ－１抗体の組合わせを誘導する有望な２つのＧａｌ－１ワクチン候補＃５および＃７を特定した（図２Ａ）。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＧａｌ－１ ＶＬＰの免疫原性を、それぞれマウスＧａｌ－１およびヒトＧａｌ－１についてＥＬＩＳＡによって測定した。第１の注射の４週間後、Ｇａｌ－１ ＶＬＰで免疫したマウスにおいて抗ヒトおよび抗マウスのガレクチン－１抗体が誘導された。マウスモデルにおける概念実証研究の場合、ヒトＧａｌ－１に由来するＧａｌ－１ ＶＬＰ ＃５のペプチド配列をマウスＧａｌ－１配列で改変し、Ｇａｌ－１ ＶＬＰ ＃１２を得た。Ｇａｌ－１ ＃５ＶＬＰで免疫した血清によるｒｈＧａｌ－１の結合は、ｒｍＧａｌ－１結合にまさって優先性があった（図２Ｂ）。他方、Ｇａｌ－１ ＃１２ ＶＬＰで免疫した血清によるｒｍＧａｌ－１の結合は、ｒｈＧａｌ－１結合にまさって優先性があった。
Ｇａｌ－１ペプチド断片のスクリーニング（表１に記載）により、本発明者らは、ＣＨＩＫＶウイルス様粒子プラットフォームとの抗ヒトＧａｌ－１抗体の組合わせを誘導する有望な２つのＧａｌ－１ワクチン候補＃５および＃７を特定した（図２Ａ）。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＧａｌ－１ ＶＬＰの免疫原性を、それぞれマウスＧａｌ－１およびヒトＧａｌ－１についてＥＬＩＳＡによって測定した。第１の注射の４週間後、Ｇａｌ－１ ＶＬＰで免疫したマウスにおいて抗ヒトおよび抗マウスのガレクチン－１抗体が誘導された。マウスモデルにおける概念実証研究の場合、ヒトＧａｌ－１に由来するＧａｌ－１ ＶＬＰ ＃５のペプチド配列をマウスＧａｌ－１配列で改変し、Ｇａｌ－１ ＶＬＰ ＃１２を得た。Ｇａｌ－１ ＃５ＶＬＰで免疫した血清によるｒｈＧａｌ－１の結合は、ｒｍＧａｌ－１結合にまさって優先性があった（図２Ｂ）。他方、Ｇａｌ－１ ＃１２ ＶＬＰで免疫した血清によるｒｍＧａｌ－１の結合は、ｒｈＧａｌ－１結合にまさって優先性があった。
【0130】
Ｇａｌ－１ ＶＬＰの効率的生成にあたって、ＶＬＰの起源をチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）からベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に変更した。４つのＧａｌ－１ ＶＥＥＶ ＶＬＰ（表１、＃５、＃７、＃１２および＃１４）および対照ＶＥＥＶ ＶＬＰを始めとする異なる計５つの粒子を調製した。Ｇａｌ－１ ＶＬＰおよび対照ＶＬＰの分子サイズと純度を、変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図３Ａ）。ＶＬＰ全試料が理論上の分子量と一致し、純度は９０％を超えていた。５０～７５ｋＤａの間のタンパク質バンドは、Ｇａｌ－１ペプチドとウイルス構造タンパク質の融合タンパク質である。分子量は挿入されたＧａｌ－１ペプチドの長さに応じて変化する。マウスに、水酸化アルミニウムアジュバントとともにＧａｌ－１ ＶＬＰタンパク質１０μｇを週に３回筋肉内注射した。免疫の４週間後、ヒトまたはマウスＧａｌ－１に特異的な抗Ｇａｌ－１抗体力価をそれぞれＥＬＩＳＡによって決定した。４つのＧａｌ－１ペプチドコンジュゲートのＶＬＰ分子＃５、７、１２、および１４はマウスにおいて抗マウスＧａｌ－１抗体を誘導したが、組換えマウスＧａｌ－１タンパク質は誘導しなかった（図３Ｄ、Ｅ）。Ｇａｌ－１ ＃５と＃７とは異なるヒトＧａｌ－１エピトープ配列ペプチドであり、これらのペプチドを担持するＶＬＰは抗ヒトＧａｌ－１抗体を誘導した。Ｇａｌ－１ ＶＬＰ ＃１２と＃１４とは異なるマウスＧａｌ－１エピトープペプチドであり、これらのペプチドを担持するＶＬＰは抗マウスＧａｌ－１抗体を効率的に誘導した（図３Ｅ）。Ｇａｌ－１ペプチド＃５および＃１２は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）近傍の４つのβシートＳ３、Ｓ４、Ｓ５、およびＳ６をコードする（図３Ｂ）。Ｇａｌ－１ペプチド＃７および＃１４は、同種親和的二量体化において重要である可能性があるＦ４およびＦ５のβシートをコードする（図３Ｃ）。ＶＬＰタンパク質ナノ粒子上に提示されたウイルス由来タンパク質との自己タンパク質のキメラ抗原は、自己タンパク質に対する免疫寛容を破壊し、効率的に抗体産生を賦活する。Ｇａｌ－１タンパク質は種間で高度に保存されているが（図３Ｆ）、異なる種由来のＧａｌ－１エピトープペプチドで免疫した血清は、ヒトまたはマウスの選択的抗Ｇａｌ－１抗体を誘導した（図３Ｅ）。Ｇａｌ－１ ＶＬＰワクチンは、自己タンパク質に対する液性免疫応答を効果的に賦活することができた。
［実施例３］
［実施例３］
【0131】
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデル
材料および方法
動物の取り扱い、免疫、採血、腫瘍接種、腫瘍測定および血清の調製は、動物実験委員会のガイドラインに準じて、Ｍｏｏｒｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの教授、Ｊｕｄｉｔｈ Ｖａｒｎｅｒ博士の監督の下で実行した。腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍容量はＤ×ｄ２／２として算出した（式中、Ｄ＝最長直径およびｄ＝最短直径）。４１日目にマウスを屠殺し、血液および腫瘍組織を採取した。エンドポイント腫瘍重量を測定した。研究で収集したすべてのデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって解析した。
材料および方法
動物の取り扱い、免疫、採血、腫瘍接種、腫瘍測定および血清の調製は、動物実験委員会のガイドラインに準じて、Ｍｏｏｒｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの教授、Ｊｕｄｉｔｈ Ｖａｒｎｅｒ博士の監督の下で実行した。腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍容量はＤ×ｄ２／２として算出した（式中、Ｄ＝最長直径およびｄ＝最短直径）。４１日目にマウスを屠殺し、血液および腫瘍組織を採取した。エンドポイント腫瘍重量を測定した。研究で収集したすべてのデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって解析した。
【0132】
ＬＬＣモデル
Ｃ５７ＢＬ６（雌性、８週齢）マウスに、１：１（ｖ／ｖ）にての２％ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントとともにＣＨＩＫＶ Ｇａｌ－１ウイルス様粒子ワクチン１０μｇを１、４、および８日目に３回、筋肉内注射により免疫した（ｎ＝８）。対照マウスに、２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含むＰＢＳを注射した。１５日目に、血液２００μｌを腫瘍接種前に各動物から採取した。血液は血漿として処理され、－２０度で保存した。マウスに、無血清ＰＢＳ中のルイス肺癌細胞（１×１０６個の細胞／１００μＬ）を脇腹で皮下（ｓ．ｃ．）に曝露した。
Ｃ５７ＢＬ６（雌性、８週齢）マウスに、１：１（ｖ／ｖ）にての２％ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントとともにＣＨＩＫＶ Ｇａｌ－１ウイルス様粒子ワクチン１０μｇを１、４、および８日目に３回、筋肉内注射により免疫した（ｎ＝８）。対照マウスに、２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含むＰＢＳを注射した。１５日目に、血液２００μｌを腫瘍接種前に各動物から採取した。血液は血漿として処理され、－２０度で保存した。マウスに、無血清ＰＢＳ中のルイス肺癌細胞（１×１０６個の細胞／１００μＬ）を脇腹で皮下（ｓ．ｃ．）に曝露した。
【0133】
ＭＥＥＲ ＨＰＶモデル
Ｃ５７ＢＬ６（雌性、８週齢）マウスに、１：１（ｖ／ｖ）にての２％ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントとともにＶＥＥＶ Ｇａｌ－１のウイルス様粒子ワクチン１０μｇを１、４、および８日目に３回、ならびに１５日目以降は毎週、筋肉内注射により免疫した。対照マウスに、２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含む対照ＶＥＥＶ ＶＬＰワクチンを注射した。１５日目に、血液２００μｌを腫瘍接種前に各動物から採取した。血液は血漿として処理され、－２０度で保存した。マウスに、無血清ＰＢＳ中のＭＥＥＲ ＨＰＶ＋細胞（１×１０６個の細胞／１００μＬ）を脇腹で皮下（ｓ．ｃ．）に曝露した。
Ｃ５７ＢＬ６（雌性、８週齢）マウスに、１：１（ｖ／ｖ）にての２％ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントとともにＶＥＥＶ Ｇａｌ－１のウイルス様粒子ワクチン１０μｇを１、４、および８日目に３回、ならびに１５日目以降は毎週、筋肉内注射により免疫した。対照マウスに、２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含む対照ＶＥＥＶ ＶＬＰワクチンを注射した。１５日目に、血液２００μｌを腫瘍接種前に各動物から採取した。血液は血漿として処理され、－２０度で保存した。マウスに、無血清ＰＢＳ中のＭＥＥＲ ＨＰＶ＋細胞（１×１０６個の細胞／１００μＬ）を脇腹で皮下（ｓ．ｃ．）に曝露した。
【0134】
結果
がん治療に対するＧａｌ－１ ＶＬＰワクチンの効果を肺がんのマウスモデルで調べた。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、腫瘍接種の２週間前に対照ＶＬＰまたはＧａｌ－１ ＶＬＰで予備免疫した。抗マウスＧａｌ－１抗体力価はＥＬＩＳＡにより決定した。（図４Ａ）。ウイルスタンパク質に対する抗体力価も免疫の参照として調べた（図４Ｂ）。Ｇａｌ－１ ＶＬＰを受けたマウスは、異なるマウス系統で先に観察されたように、抗マウスＧａｌ－１抗体を産生した。異なる２つのＧａｌ－１ ＶＬＰで免疫したマウスは、ＩｇＧ２ａ抗マウスＧａｌ－１抗体を優先的に発現した（図４Ｃ）。
がん治療に対するＧａｌ－１ ＶＬＰワクチンの効果を肺がんのマウスモデルで調べた。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、腫瘍接種の２週間前に対照ＶＬＰまたはＧａｌ－１ ＶＬＰで予備免疫した。抗マウスＧａｌ－１抗体力価はＥＬＩＳＡにより決定した。（図４Ａ）。ウイルスタンパク質に対する抗体力価も免疫の参照として調べた（図４Ｂ）。Ｇａｌ－１ ＶＬＰを受けたマウスは、異なるマウス系統で先に観察されたように、抗マウスＧａｌ－１抗体を産生した。異なる２つのＧａｌ－１ ＶＬＰで免疫したマウスは、ＩｇＧ２ａ抗マウスＧａｌ－１抗体を優先的に発現した（図４Ｃ）。
【0135】
ルイス肺癌細胞を１５日目に皮下接種し、腫瘍増殖をモニタリングした。対照群とＶＬＰ処置群との間に腫瘍容量（図５Ａ～Ｄ）およびエンドポイント腫瘍重量（図５Ｅ）に統計学的に有意な差はなかったが、Ｇａｌ－１ ＃１２で処置したマウスの腫瘍増殖は他の群の腫瘍増殖よりも遅かった。
【0136】
マウスＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮（Ｓｑｕａｒｅ）癌細胞モデルに対するＧａｌ－１ワクチンの効果を調べた。Ｇａｌ－１ ＃１４ＶＬＰワクチンで処置したマウスの腫瘍増殖は、対照の腫瘍増殖よりも遅かったが、いずれの群間でも統計学的に有意な差はなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。
［実施例４］
［実施例４］
【0137】
Ｇａｌ－３抗原を有するＶＬＰの調製
材料および方法
ガレクチン３（Ｇａｌ－３）エピトープペプチドを、ヒトおよびマウスのＧａｌ－３タンパク質のタンパク質のアミノ酸配列ならびに３Ｄ構造を使用することによって設計した（表２）。哺乳動物発現ベクター、ｐＶＥＥＶ Ｇａｌ－３プラスミドＤＮＡベクターの生成の場合、Ｇａｌ－３エピトープペプチド配列（ｇＢｌｏｃｋｓ、ＩＤＴ）の合成ｄｓＤＮＡ断片を、ｐＶＥＥＶベクター内のＶＥＥＶ Ｅ３エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡの特定の位置に挿入した（３３０位にてのＧと３３５位にてのＳの間）。Ｇａｌ－１エピトープペプチドの挿入が全くないｐＶＥＥＶベクターを対照ＶＬＰ発現ベクターとして使用した。
材料および方法
ガレクチン３（Ｇａｌ－３）エピトープペプチドを、ヒトおよびマウスのＧａｌ－３タンパク質のタンパク質のアミノ酸配列ならびに３Ｄ構造を使用することによって設計した（表２）。哺乳動物発現ベクター、ｐＶＥＥＶ Ｇａｌ－３プラスミドＤＮＡベクターの生成の場合、Ｇａｌ－３エピトープペプチド配列（ｇＢｌｏｃｋｓ、ＩＤＴ）の合成ｄｓＤＮＡ断片を、ｐＶＥＥＶベクター内のＶＥＥＶ Ｅ３エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡの特定の位置に挿入した（３３０位にてのＧと３３５位にてのＳの間）。Ｇａｌ－１エピトープペプチドの挿入が全くないｐＶＥＥＶベクターを対照ＶＬＰ発現ベクターとして使用した。
【0138】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｒ７９０－０７）を、振盪インキュベーターを使用して、８％ＣＯ２で、３７℃でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１２３３８－０１８）を含む懸濁液中で培養した。２９３Ｆ細胞に、ｐＶＥＥＶ Ｇａｌ－３ ＶＬＰまたは対照プラスミドＤＮＡ発現ベクターを、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃２３９６６）により、ＤＮＡ ０．８μｇ／１０６個の細胞、ＤＮＡ：ＰＥＩ＝１：３（ｗ／ｗ）、および１．２５×１０６個の細胞／培養培地１ｍＬの条件で、トランスフェクトした。培養上清を、トランスフェクションの４日後に回収し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）によって、これに続いて０．４５μｍ ＰＥＳメンブレンフィルターシステム（ＶＷＲ ＃１００４０－４７０）での濾過によって、清澄化した。
【0139】
ＶＬＰ含有培養上清をＯｐｔｉＰｒｅｐ（６０％ｗ／ｖ）（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃ＡＮ１１１４５４２）１．５ｍＬ上へと重ね、ＳＷ－２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）で５２，０００×ｇで１．５時間遠心分離した。界面の上に１．５ｍＬを残すように上清を取り除いた後、２つの層を混合して５０％ＯｐｔｉＰｒｅｐ溶液を作製し、ＮＶＴ１００ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で３６０，０００×ｇで２．５時間遠心分離して密度勾配を形成した。
【0140】
粗ＶＬＰを収集し、ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００ ＨＲカラム（ＧＥ、＃２８－９３５６－０６）を備えたＢｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｕｏ－Ｆｌｏｗ ＦＰＬＣシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＶＬＰを含有する画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＵＦＣ９１００２４）によって濃縮し、０．２０μｍのＰＥＳメンブレンを通して濾過した。
【0141】
総タンパク質濃度を、製造業者の取扱説明書に従ってＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）によって測定した。ＶＬＰ試料の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（Ａｎｙ ｋＤ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃４５６－９０３５）、これに続いて、ＱＣ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１６１０８０３）を使用するクマシー色素ベースの染色によって確認した。スクロースおよびＥＤＴＡを、それぞれ最終濃度２５０ｍＭおよび５ｍＭへとＶＬＰ溶液に添加した。ＶＬＰ試料のタンパク質濃度を０．４ｍｇ／ｍＬに調整し、－８０℃で保存した。
【0142】
【表2】
［実施例５］
【0143】
マウス免疫原性研究
材料および方法
免疫試料の調製の場合、ＶＬＰ溶液を解凍し、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバント（１０ｍｇ／ｍｌのアルミニウム、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、＃２５０－８４３２６１、バッチ＃５０１４）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。マウス（８週齢の雌性、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｅｎｖｉｇｏ）に、０．０５ｍＬ中の１０ｕｇ（タンパク質）を大腿部に筋肉内で１日目、４日目、および８日目に、注射した。血液試料を、０日目および１５日目に顎下静脈を介して、２９日目に心臓穿刺により採取した。動物の取り扱い、免疫、採血、血清の調製は、動物実験委員会のガイドラインに準じて、Ｓｍｉｔｈｅｒｓ Ａｖａｎｚａ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で実行した。全血試料をＳｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃４５０４７２）に採取し、１，２００×ｇで５分間遠心分離して血清を分離した。採取血清は解析まで－２０度で保存した。
材料および方法
免疫試料の調製の場合、ＶＬＰ溶液を解凍し、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバント（１０ｍｇ／ｍｌのアルミニウム、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、＃２５０－８４３２６１、バッチ＃５０１４）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。マウス（８週齢の雌性、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｅｎｖｉｇｏ）に、０．０５ｍＬ中の１０ｕｇ（タンパク質）を大腿部に筋肉内で１日目、４日目、および８日目に、注射した。血液試料を、０日目および１５日目に顎下静脈を介して、２９日目に心臓穿刺により採取した。動物の取り扱い、免疫、採血、血清の調製は、動物実験委員会のガイドラインに準じて、Ｓｍｉｔｈｅｒｓ Ａｖａｎｚａ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で実行した。全血試料をＳｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃４５０４７２）に採取し、１，２００×ｇで５分間遠心分離して血清を分離した。採取血清は解析まで－２０度で保存した。
【0144】
ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｇａｌ－３特異的血清抗体力価を間接ＥＬＩＳＡによって決定した。免疫アッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、＃４４２４０４）を、組換えヒトまたはマウスのガレクチン－３タンパク質（ＧＡ３－Ｈ５１２９、ＡｃｒｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ＃５９９８０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のＰＢＳ １００ｕＬ（５００ｎｇ／ｍＬ）で４度で一晩コーティングした。ＴＢＳ－Ｔでリンス後、ウェルをブロッキング緩衝剤（ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルク）３５０ｕＬで室温で１時間ブロックした。ウェルをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。マウス血清を１：５０に希釈し、ブロッキング緩衝剤で最終希釈率１：７８１，２５０へと１：５でさらに連続希釈した。希釈血清をコーティングウェル中で室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳ－Ｔ ４００ｕＬで５回洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃ＰＡ１－８４３８８）とともに室温で３０分間さらにインキュベートした。プレートウェルをＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＨＲＰ基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ（商標）ＴＭＢ １－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ、＃５１２０－００７６）１００ｕＬとともにインキュベートした。反応を停止溶液１００ｕＬで停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ／ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）によって４５０ｎｍの吸光度を測定した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して解析した。マウス血清のエンドポイント力価は、そのＯＤがアッセイ対照＋対照の３×ＳＤよりも高い最高の希釈によって決定した。
Ｇａｌ－３特異的血清抗体力価を間接ＥＬＩＳＡによって決定した。免疫アッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、＃４４２４０４）を、組換えヒトまたはマウスのガレクチン－３タンパク質（ＧＡ３－Ｈ５１２９、ＡｃｒｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ＃５９９８０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のＰＢＳ １００ｕＬ（５００ｎｇ／ｍＬ）で４度で一晩コーティングした。ＴＢＳ－Ｔでリンス後、ウェルをブロッキング緩衝剤（ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルク）３５０ｕＬで室温で１時間ブロックした。ウェルをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。マウス血清を１：５０に希釈し、ブロッキング緩衝剤で最終希釈率１：７８１，２５０へと１：５でさらに連続希釈した。希釈血清をコーティングウェル中で室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳ－Ｔ ４００ｕＬで５回洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃ＰＡ１－８４３８８）とともに室温で３０分間さらにインキュベートした。プレートウェルをＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＨＲＰ基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ（商標）ＴＭＢ １－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ、＃５１２０－００７６）１００ｕＬとともにインキュベートした。反応を停止溶液１００ｕＬで停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ／ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）によって４５０ｎｍの吸光度を測定した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して解析した。マウス血清のエンドポイント力価は、そのＯＤがアッセイ対照＋対照の３×ＳＤよりも高い最高の希釈によって決定した。
【0145】
結果
ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＧａｌ－３ ＶＬＰの免疫原性を、ＥＬＩＳＡによって決定した。第１の注射の４週間後、Ｇａｌ－３ ＶＬＰで免疫したマウス血清中の抗ヒトおよび抗マウスのガレクチン－３抗体を、組換えマウスまたはヒトのＧａｌ－３タンパク質を使用して解析した。結果を図８に示す。Ｇａｌ－３ ＶＬＰ ＃１７はヒトＮ末端Ｇａｌ－３エピトープペプチドからなり、抗マウスＧａｌ－３よりも多くの抗ヒトＧａｌ－３抗体を誘導した。対照的に、Ｇａｌ－３ ＶＬＰ ＃２３は、マウスＧａｌ－３Ｎ末端ペプチドをコードし、抗ヒトＧａｌ－３抗体よりも多くの抗マウスＧａｌ－３抗体を誘導した。Ｇａｌ－３ ＶＬＰ ＃２１および２２はヒトＧａｌ－３Ｎ末端反復配列エピトープペプチドからなり、＃２２は＃２１の反復配列よりも長い反復配列を有する。
［実施例６］
ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＧａｌ－３ ＶＬＰの免疫原性を、ＥＬＩＳＡによって決定した。第１の注射の４週間後、Ｇａｌ－３ ＶＬＰで免疫したマウス血清中の抗ヒトおよび抗マウスのガレクチン－３抗体を、組換えマウスまたはヒトのＧａｌ－３タンパク質を使用して解析した。結果を図８に示す。Ｇａｌ－３ ＶＬＰ ＃１７はヒトＮ末端Ｇａｌ－３エピトープペプチドからなり、抗マウスＧａｌ－３よりも多くの抗ヒトＧａｌ－３抗体を誘導した。対照的に、Ｇａｌ－３ ＶＬＰ ＃２３は、マウスＧａｌ－３Ｎ末端ペプチドをコードし、抗ヒトＧａｌ－３抗体よりも多くの抗マウスＧａｌ－３抗体を誘導した。Ｇａｌ－３ ＶＬＰ ＃２１および２２はヒトＧａｌ－３Ｎ末端反復配列エピトープペプチドからなり、＃２２は＃２１の反復配列よりも長い反復配列を有する。
［実施例６］
【0146】
細胞表面Ｇａｌ－３に結合する血清抗体のフローサイトメトリー解析
材料および方法
２９３Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培養培地中で２×１０６個の細胞／ｍＬ）を組換えヒトガレクチン－３（３０μｇ／ｍＬ）とともに室温で３０分間インキュベートした。細胞を遠心沈殿させ、細胞培養培地で２回洗浄した。ペレット化した細胞をＦＣ染色緩衝剤（ＰＢＳ中５％ＦＢＳ）に再懸濁し、１００μＬを９６ウェルＶ底プレートに移した。プレートを８００×ｇで遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した。５匹のマウスの血清をプールし、ＦＣ染色緩衝剤を用いて１：２５０で希釈した。希釈血清を、Ｇａｌ－３処理の有り無し両方で、ペレット化した細胞を有するウェルに添加した。細胞をピペッティングにより再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を沈殿させ、ＦＣ染色緩衝剤に再懸濁して細胞を洗浄した。洗浄工程を２回繰り返し、細胞をＡｌｅｘａ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００倍希釈）に再懸濁し、遮光して室温で３０分間インキュベートする。細胞をＦＣ染色緩衝剤で２回洗浄した。細胞をＦＣ染色緩衝剤２００μＬに再懸濁し、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって解析した。
材料および方法
２９３Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培養培地中で２×１０６個の細胞／ｍＬ）を組換えヒトガレクチン－３（３０μｇ／ｍＬ）とともに室温で３０分間インキュベートした。細胞を遠心沈殿させ、細胞培養培地で２回洗浄した。ペレット化した細胞をＦＣ染色緩衝剤（ＰＢＳ中５％ＦＢＳ）に再懸濁し、１００μＬを９６ウェルＶ底プレートに移した。プレートを８００×ｇで遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した。５匹のマウスの血清をプールし、ＦＣ染色緩衝剤を用いて１：２５０で希釈した。希釈血清を、Ｇａｌ－３処理の有り無し両方で、ペレット化した細胞を有するウェルに添加した。細胞をピペッティングにより再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を沈殿させ、ＦＣ染色緩衝剤に再懸濁して細胞を洗浄した。洗浄工程を２回繰り返し、細胞をＡｌｅｘａ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００倍希釈）に再懸濁し、遮光して室温で３０分間インキュベートする。細胞をＦＣ染色緩衝剤で２回洗浄した。細胞をＦＣ染色緩衝剤２００μＬに再懸濁し、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって解析した。
【0147】
結果
細胞表面Ｇａｌ－３タンパク質への抗Ｇａｌ－３抗体の認識および結合についてフローサイトメトリー解析によって調べた。２９３Ｆ細胞におけるＧａｌ－３タンパク質の内因性発現は、ウェスタンブロッティング分析によっては検出可能ではなかった。２９３Ｆ細胞の単一細胞懸濁液を組換えヒトＧａｌ－３タンパク質とともにインキュベートし、次いで３回洗浄して未結合のタンパク質を取り除いた。Ｇａｌ－３ ＶＬＰ免疫の血清をブロッキング緩衝剤で希釈し、これに蛍光標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍが続いた。対照ＶＬＰで免疫したマウス血清を対照として使用した。Ｇａｌ－３ ＃１７および＃２２で免疫したマウスの血清は両方とも、Ｇａｌ－３処理細胞に結合した。（図９）
［実施例７］
細胞表面Ｇａｌ－３タンパク質への抗Ｇａｌ－３抗体の認識および結合についてフローサイトメトリー解析によって調べた。２９３Ｆ細胞におけるＧａｌ－３タンパク質の内因性発現は、ウェスタンブロッティング分析によっては検出可能ではなかった。２９３Ｆ細胞の単一細胞懸濁液を組換えヒトＧａｌ－３タンパク質とともにインキュベートし、次いで３回洗浄して未結合のタンパク質を取り除いた。Ｇａｌ－３ ＶＬＰ免疫の血清をブロッキング緩衝剤で希釈し、これに蛍光標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍが続いた。対照ＶＬＰで免疫したマウス血清を対照として使用した。Ｇａｌ－３ ＃１７および＃２２で免疫したマウスの血清は両方とも、Ｇａｌ－３処理細胞に結合した。（図９）
［実施例７］
【0148】
プルダウンアッセイ
材料および方法
免疫マウス血清２０μＬ、マウス抗Ｇａｌ－３モノクローナル抗体（ｃｌ．Ｂ２Ｃ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）２０μｇ、またはマウス対照ＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）２０μｇをＰＢＳで１ｍＬに希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）４０μＬとともにローテーター上で室温で１時間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でＰＢＳで３回洗浄する。コーティング磁気ビーズを、５０ｍＭラクトースの存在下または非存在下で組換えヒトＧａｌ－３溶液（２ｕｇ／ｍＬ）１ｍＬに再懸濁し、ローテーター上で室温で１時間インキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、２－メルカプトエタノール含有の１×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝剤５０μＬとともに煮沸した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離させ、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。Ｇａｌ－３タンパク質を、抗Ｇａｌ－３モノクローナル抗体（ｃｌ．Ｇａｌ３９７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを用いてプローブした。メンブレンをＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とともにインキュベートし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって画像をとらえた。
材料および方法
免疫マウス血清２０μＬ、マウス抗Ｇａｌ－３モノクローナル抗体（ｃｌ．Ｂ２Ｃ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）２０μｇ、またはマウス対照ＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）２０μｇをＰＢＳで１ｍＬに希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）４０μＬとともにローテーター上で室温で１時間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でＰＢＳで３回洗浄する。コーティング磁気ビーズを、５０ｍＭラクトースの存在下または非存在下で組換えヒトＧａｌ－３溶液（２ｕｇ／ｍＬ）１ｍＬに再懸濁し、ローテーター上で室温で１時間インキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、２－メルカプトエタノール含有の１×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝剤５０μＬとともに煮沸した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離させ、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。Ｇａｌ－３タンパク質を、抗Ｇａｌ－３モノクローナル抗体（ｃｌ．Ｇａｌ３９７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを用いてプローブした。メンブレンをＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とともにインキュベートし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって画像をとらえた。
【0149】
結果
Ｇａｌ－３ ＶＬＰワクチンにより誘導された抗Ｇａｌ－３抗体の中和能をプルダウンアッセイによって調べた。溶液中の浮遊組換えＧａｌ－３タンパク質を、プロテインＧ磁気ビーズに連結した抗Ｇａｌ－３抗体によって捕捉した。Ｇａｌ－３タンパク質は、モノクローナルＧａｌ－３抗体Ｂ２Ｃ１０およびＧａｌ－３ ＶＬＰワクチン接種マウス由来の抗血清でプルダウンされたが、対照ＶＬＰにおいてはプルダウンされなかった。Ｇａｌ－３ ＶＬＰは、Ｇａｌ－３タンパク質の膜結合型および浮遊型を認識する高力価抗Ｇａｌ－３抗体を効果的に誘導した。（図１０）
［実施例８］
Ｇａｌ－３ ＶＬＰワクチンにより誘導された抗Ｇａｌ－３抗体の中和能をプルダウンアッセイによって調べた。溶液中の浮遊組換えＧａｌ－３タンパク質を、プロテインＧ磁気ビーズに連結した抗Ｇａｌ－３抗体によって捕捉した。Ｇａｌ－３タンパク質は、モノクローナルＧａｌ－３抗体Ｂ２Ｃ１０およびＧａｌ－３ ＶＬＰワクチン接種マウス由来の抗血清でプルダウンされたが、対照ＶＬＰにおいてはプルダウンされなかった。Ｇａｌ－３ ＶＬＰは、Ｇａｌ－３タンパク質の膜結合型および浮遊型を認識する高力価抗Ｇａｌ－３抗体を効果的に誘導した。（図１０）
［実施例８］
【0150】
マウスＮＡＳＨモデル
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（妊娠１４日の雌性）を日本エスエルシー株式会社（日本）から入手した。研究で使用する動物は全て、動物使用に関する日本薬学協会ガイドラインに準じて収容し維持した。動物については、温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、照明（１２時間の人工の明暗サイクル；８：００から２０：００まで明）および換気の制御条件下で、ＳＰＦ施設内で飼育した。
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（妊娠１４日の雌性）を日本エスエルシー株式会社（日本）から入手した。研究で使用する動物は全て、動物使用に関する日本薬学協会ガイドラインに準じて収容し維持した。動物については、温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、照明（１２時間の人工の明暗サイクル；８：００から２０：００まで明）および換気の制御条件下で、ＳＰＦ施設内で飼育した。
【0151】
ＮＡＳＨについては、生後２日でストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）２００μｇの溶液の単回皮下注射および４週齢後に高脂肪飼料（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％脂肪、Ｃａｔ#ＨＦＤ３２、日本クレア株式会社、日本）を給餌することによって２５匹の雄性マウスにおいて誘導した。Ｇａｌ－３ ＶＬＰ、対照ＶＬＰおよびビヒクルを５０μＬ／１体の容量で筋肉内（大腿）投与した。注射の脚を毎回変更して、局所的炎症を回避した。生存、臨床徴候および挙動を毎日モニタリングした。処置前に体重を記録した。マウスを、各投与の約６０分後に毒性、瀕死状態および死亡の顕著な臨床徴候について観察した。動物を、イソフルラン麻酔（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）下で、直接心臓穿刺による放血によって９週齢で屠殺した。
【0152】
血清試料については、非絶食の血液を、顔面静脈から抗凝固剤無しの血清セパレートチューブに１５日目（６週齢）に採取した。採取血液を４℃、３，５００×ｇで５分間遠心分離した。上清２０μＬを採取し、生化学用に－８０℃で保存した。血清ＡＬＴレベルを、ＦＵＪＩ ＤＲＩ－ＣＨＥＭ ７０００（富士フイルム株式会社、日本）により測定した。ＨＥ染色については、切片を、ブアン液で前固定した肝臓組織のパラフィンブロックから切り出し、Ｌｉｌｌｉｅ－Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（武藤化学株式会社、日本）およびエオシン溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）で染色した。統計学的解析を、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｅｓｔ ｏｎ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、米国）を使用して実施した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であるとした。傾向（ｔｒｅｎｄ）または傾向（ｔｅｎｄｅｎｃｙ）については、片側ｔ検定がＰ値＜０．１を返した場合に想定した。結果は平均値±ＳＤとして表した。
【0153】
結果
Ｇａｌ－３ ＶＬＰワクチンによるＧａｌ－３阻害の効果を、マウスＳＴＡＭ非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルで調べた。ＳＴＺで処置され、高脂肪食を給餌されたマウスは、６～８週齢で非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）およびＮＡＳＨを発生する。対照またはＧａｌ－３ ＶＬＰで処置されたマウスは、４週齢で開始し、最初の週で３回、次いで８週齢まで毎週、合計６回の注射であった。
Ｇａｌ－３ ＶＬＰワクチンによるＧａｌ－３阻害の効果を、マウスＳＴＡＭ非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルで調べた。ＳＴＺで処置され、高脂肪食を給餌されたマウスは、６～８週齢で非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）およびＮＡＳＨを発生する。対照またはＧａｌ－３ ＶＬＰで処置されたマウスは、４週齢で開始し、最初の週で３回、次いで８週齢まで毎週、合計６回の注射であった。
【0154】
任意の２つの群間で観察された、体重変化、エンドポイントの肝臓重量および腎臓重量において有意な差はなかった。群５の１匹のマウスが研究日２３に死亡しているのが見出されたが、これは事故死と思われ、処置の毒性とは関係ない。研究のエンドポイントに、肝臓損傷の一般的なマーカーとして血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを測定した。研究ラットのＡＬＴレベルは正常レベルのそれ（１７．５～３０．２Ｕ／Ｌ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ－Ｄｅｌａｎｅｙ １９９６）よりも高い。いずれの群間でもＡＬＴに有意な差はなかった。ＮＡＳＨ疾患の進行に対するＧａｌ－３ワクチンの効果を評価するために、Ｋｌｅｉｎｅｒの基準に従ってＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）を算出した（Kleiner, et al. 2005）。脂肪変性、小葉の炎症、および肝細胞の風船様変性におけるＮＡＳについて、異なる３つの要素評価がある（表３、図１１Ａ～Ｃ）。ＮＡＳＨモデルでの研究からのＨ＆Ｅ染色肝臓切片をスコア化し解析した（表４）。ビヒクル群からの肝臓切片は、微小胞および大胞の脂肪の沈着、肝細胞の風船様変性、および炎症性細胞の浸潤を呈した。対照ＶＬＰ群およびＧａｌ－３ ＃２３ ＶＬＰ群のＮＡＳは、ビヒクル群と比較して低下する傾向があった（図１１、表４）。とりわけ肝細胞において、風船様変性スコアは、ＶＬＰワクチンにより低下した。参加したいずれの群間でも、総ＮＡＳスコアには統計学的に有意な差はなかったが、対照ＶＬＰまたはＧａｌ－３ワクチンで処置した群において風船様変性スコアがより低い傾向が観察された。
【0155】
【表3】
【0156】
【表4】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】