特表 2024-519293 シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-10

(54)【発明の名称】シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240501BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240501BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 11/14 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 11/08 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240501BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/713

A61K47/54

A61K48/00

A61P11/06

A61P11/00

A61P43/00 105

A61P11/14

A61P11/02

A61P11/08

A61K9/12

A61K45/00

A61K9/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566489

(86)(22)【出願日】2022-04-28

(85)【翻訳文提出日】2023-12-05

(86)【国際出願番号】 US2022026645

(87)【国際公開番号】W WO2022232343

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】63/181,356

(32)【優先日】2021-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/232,335

(32)【優先日】2021-08-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】505369158

【氏名又は名称】アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ディートン，エイミー エム

(72)【発明者】

【氏名】ズーバー，ジェフリー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076AA24

4C076AA93

4C076BB16

4C076BB22

4C076BB25

4C076CC15

4C076DD34

4C076DD37

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4C076DD39

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4C076DD55

4C076DD57

4C076DD60

4C076DD63

4C076DD70

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA13

4C084MA17

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4C084NA14

4C084ZA59

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4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA17

4C086MA57

4C086MA59

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA59

4C086ZA61

4C086ZA62

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。本発明はまた、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するためにかかるＲＮＡｉ剤を使用する方法、ならびにＳＴＡＴ６関連障害、例えば、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎を予防および治療する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内のシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、前記センス鎖またはアンチセンス鎖が一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。

【請求項2】

細胞内でシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＳＴＡＴ６をコードするｍＲＮＡに対して相補性領域を含み、前記相補性領域が、表２～３のうちのいずれか一つにおけるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、前記センス鎖またはアンチセンス鎖が、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。

【請求項3】

前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方が、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項4】

前記親油性部分が、前記ｄｓＲＮＡ剤の前記二本鎖領域における一つまたは複数の位置にコンジュゲートされる、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項5】

前記親油性部分が、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされる、請求項１～４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項6】

ｌｏｇＫｏｗによって測定された前記親油性部分の親油性が０を超える、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項7】

前記二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおいて非結合型分画によって測定される前記二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性が０．２を超える、請求項１～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項8】

前記血漿タンパク質結合アッセイが、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項9】

前記ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項10】

前記センス鎖の５以下のヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の５以下のヌクレオチドが、未修飾ヌクレオチドである、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項11】

前記センス鎖のすべてのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが、修飾を含む、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項12】

前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’リン酸または５’ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体を含むヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－リン酸を含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’リン酸を含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－リン酸を含むヌクレオチド、２’－Ｏヘキサデシルヌクレオチド、２’－リン酸を含むヌクレオチド、シチジン－２’－リン酸ヌクレオチド、グアノシン－２’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－グアノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－リン酸ヌクレオチド、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）、２’－デオキシアデノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシシチジン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシウリジンヌクレオチド、およびコレステリル誘導体およびドデカノ酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせの群から選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項13】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項14】

前記修飾ヌクレオチドが、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項15】

前記ヌクレオチドの修飾が、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－デオキシ－修飾、２’フルオロ修飾、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）修飾、および２’－Ｏヘキサデシルヌクレオチド修飾である、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項16】

少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項17】

前記ｄｓＲＮＡ剤が、６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項18】

各鎖が、３０ヌクレオチド以下の長さである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項19】

少なくとも一つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項20】

少なくとも一つの鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項21】

前記二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項22】

前記二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項23】

前記二本鎖領域は、１７～２５ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項24】

前記二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項25】

前記二本鎖領域が、１９～２１ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項26】

前記二本鎖領域が、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項27】

各鎖が、１９～３０ヌクレオチドの長さである、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項28】

各鎖が、１９～２３ヌクレオチドの長さである、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項29】

各鎖が、２１～２３ヌクレオチドの長さである、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項30】

一つまたは複数の親油性部分が、少なくとも一つの鎖における一つまたは複数の内側位置にコンジュゲートされる、請求項１～２９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項31】

前記一つまたは複数の親油性部分が、リンカーまたは担体を介して、少なくとも一つの鎖における一つまたは複数の内側位置にコンジュゲートされる、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項32】

前記内側位置が、前記少なくとも一つの鎖の各末端から末端の二つの位置を除く全ての位置を含む、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項33】

前記内側位置が、前記少なくとも一つの鎖の各末端から末端の三つの位置を除く全ての位置を含む、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項34】

前記内側位置が、前記センス鎖の切断部位領域を除く、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項35】

前記内側位置が、前記センス鎖の前記５’末端から数えて９～１２位を除く全ての位置を含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項36】

前記内側位置が、前記センス鎖の前記３’末端から数えて１１～１３位を除く全ての位置を含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項37】

前記内側位置が、前記アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項38】

前記内側位置が、前記アンチセンス鎖の前記５’末端から数えて１２～１４位を除く全ての位置を含む、請求項３７に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項39】

前記内側位置が、前記３’末端から数えて前記センス鎖上の１１～１３位および前記５’末端から数えて前記アンチセンス鎖上の１２～１４位を除く全ての位置を含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項40】

前記一つまたは複数の親油性部分が、各鎖の前記５’末端から数えて、前記センス鎖上の４～８位および１３～１８位ならびに前記アンチセンス鎖上の６～１０位および１５～１８位からなる群から選択される前記内側位置のうちの一つまたは複数にコンジュゲートされる、請求項１～３９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項41】

前記一つまたは複数の親油性部分が、各鎖の前記５’末端から数えて、前記センス鎖上の５、６、７、１５および１７位ならびに前記アンチセンス鎖上の１５および１７位からなる群から選択される前記内側位置のうちの一つまたは複数にコンジュゲートされる、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項42】

前記二本鎖領域における前記位置は、前記センス鎖の切断部位領域を除く、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項43】

前記センス鎖が、２１ヌクレオチドの長さであり、前記アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチドの長さであり、また前記親油性部分が、各鎖の前記５’末端から数えて、前記センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、７位、６位もしくは２位、または前記アンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項44】

前記親油性部分が、前記鎖の前記５’末端から数えて、前記センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、または７位にコンジュゲートされる、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項45】

前記親油性部分が、前記鎖の前記５’末端から数えて、前記センス鎖の２１位、２０位、または１５位にコンジュゲートされる、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項46】

前記親油性部分が、前記鎖の前記５’末端から数えて、前記センス鎖の２０位または１５位にコンジュゲートされる、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項47】

前記親油性部分が、前記鎖の前記５’末端から数えて、前記アンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項48】

前記親油性部分が、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項49】

前記親油性部分が、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される、請求項４８に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項50】

前記親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される随意の官能基とを含有する、請求項４９に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項51】

前記親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する、請求項５０に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項52】

前記親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、請求項５０に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項53】

前記飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖が、前記鎖の前記５’末端から数えて６位にコンジュゲートされる、請求項５２に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項54】

前記親油性部分が、前記内側位置または前記二本鎖領域における一つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる、請求項１～５１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項55】

前記担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環式基であるか、またはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格系の非環式部分である、請求項５４に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項56】

前記親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して前記二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる、請求項１～５１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項57】

前記親油性部分が、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる、請求項１～５６のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。

【請求項58】

前記親油性部分または標的リガンドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、およびガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される生物切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる、請求項１～５７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項59】

前記センス鎖の前記３’末端が、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、前記環状基が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される、請求項１～５８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項60】

肝組織を標的化する標的リガンドをさらに含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項61】

前記標的リガンドが、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートである、請求項６０に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項62】

前記アンチセンス鎖の前記３’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＳｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記アンチセンス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記センス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結で生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかである、末端キラル修飾と、をさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項63】

前記アンチセンス鎖の前記３’末端における前記第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、前記連結リン原子がＳｐ立体配置である、末端のキラル修飾と、
前記アンチセンス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記センス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかである、末端キラル修飾と、をさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項64】

前記アンチセンス鎖の前記３’末端における前記第一、第二および第三のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＳｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記アンチセンス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記センス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかである、末端キラル修飾と、をさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項65】

前記アンチセンス鎖の前記３’末端における前記第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＳｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記アンチセンス鎖の前記３’末端における前記第三のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記アンチセンス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記センス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかである、末端キラル修飾と、をさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項66】

前記アンチセンス鎖の前記３’末端における前記第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＳｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記アンチセンス鎖の前記５’末端における前記第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置である、末端キラル修飾と、
前記センス鎖の前記５’末端における前記第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾であって、前記連結リン原子がＲｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかである、末端キラル修飾と、をさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項67】

前記アンチセンス鎖の前記５’末端においてホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項68】

前記ホスフェート模倣体が、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項６７に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項69】

前記二重鎖の前記アンチセンス鎖の前記５’末端の一つの位置における前記塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項１～６６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項70】

前記センス鎖が、合計２１ヌクレオチドを有し、また前記アンチセンス鎖が、合計２３ヌクレオチドを有する、請求項１～６６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項71】

請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する、細胞。

【請求項72】

請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害する医薬組成物。

【請求項73】

請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤と脂質製剤とを含む、医薬組成物。

【請求項74】

細胞内においてＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害する方法であって、
（ａ）前記細胞を、請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項７２または７３に記載の医薬組成物と接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）において産生された前記細胞を、ＳＴＡＴ６遺伝子の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって前記細胞内において前記ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害することとを含む、方法。

【請求項75】

前記細胞が、対象内にある、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記対象が、ヒトである、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記細胞を前記ｄｓＲＮＡ剤と接触させることで、ＳＴＡＴ６の発現が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％阻害される、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害のある対象を治療する方法であって、請求項１～７０のいずれか一項に記載の前記ｄｓＲＮＡ剤または請求項７２または７３のいずれか一項に記載の前記医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによってＳＴＡＴ６発現の減少から恩恵を受けることとなる前記障害がある前記対象を治療することを含む、方法。

【請求項79】

シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害のある対象における少なくとも一つの症状を予防する方法であって、請求項１～７０のいずれか一項に記載の前記ｄｓＲＮＡ剤または請求項７２または７３のいずれか一項に記載の前記医薬組成物の予防有効量を前記対象に投与し、それによってＳＴＡＴ６発現の減少から恩恵を受けることとなる前記障害がある前記対象における少なくとも一つの症状を予防することを含む、方法。

【請求項80】

前記障害が、ＳＴＡＴ６関連障害である、請求項７８または７９に記載の方法。

【請求項81】

前記ＳＴＡＴ６関連障害が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎からなる群から選択される呼吸器疾患である、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記ＳＴＡＴ６関連疾患が、喘息である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記対象が、ヒトである、請求項７８または７９に記載の方法。

【請求項84】

前記対象への前記ｄｓＲＮＡ剤の投与が、前記対象におけるＳＴＡＴ６タンパク質蓄積の減少を引き起こす、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記対象への前記ｄｓＲＮＡ剤の投与が、前記対象における前記気道の炎症および／または腫脹を減少させる、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記ｄｓＲＮＡ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項７８～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記ｄｓＲＮＡ剤が、前記対象に肺系投与される、請求項７８～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記肺投与が、経口吸入または鼻腔内によるものである、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記ｄｓＲＮＡ剤が、前記対象に皮下投与される、請求項７８～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記対象からの試料中のＳＴＡＴ６レベルを判定することをさらに含む、請求項７８～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記対象からの試料中の前記ＳＴＡＴ６レベルが、血液または血清中または肺系組織試料中のＳＴＡＴ６タンパク質レベルである、請求項７８～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

ＳＴＡＴ６関連障害の治療または予防に好適な追加的な薬剤または療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項７８～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記追加的な治療剤が、抗炎症剤、抗コリン剤、β２アドレナリン受容体アゴニスト、抗生物質、抗ウイルス剤、抗ヒスタミン薬、免疫調節因子、ホスホジエステラーゼ－５阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗線維化剤、および前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

請求項１～７０のいずれか一項に記載の前記ｄｓＲＮＡ剤、または請求項７２または７３に記載の前記医薬組成物を含む、キット。

【請求項95】

請求項１～７０のいずれか一項に記載の前記ｄｓＲＮＡ剤、または請求項７２または７３に記載の前記医薬組成物を含む、バイアル。

【請求項96】

請求項１～７０のいずれか一項に記載の前記ｄｓＲＮＡ剤、または請求項７２または７３に記載の前記医薬組成物を含む、シリンジ。

【請求項97】

請求項１～７０に記載のいずれか一項の前記ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖を含む、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本出願は、２０２１年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／１８１，３５６号、および２０２１年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２３２，３３５号に対する優先権の利益を主張する。先述の出願の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（配列表）
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。先述のＡＳＣＩＩの写しは、２０２２年４月１９日に作成され、１２１３０１＿１５７２０＿ＳＬ．ＴＸＴという名称で、サイズは２０９，７９０バイトである。

【背景技術】

【0003】

シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）は、アレルギー疾患におけるＴｈ２サイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１３の下流エフェクター機能を調節する主要な転写因子である。ＳＴＡＴ６は、以下の三つの既知のスプライスバリアントＳＴＡＴ６ａ、ＳＴＡＴ６ｂ、ＳＴＡＴ６ｃを有するＳＴＡＴタンパク質ファミリーのメンバーである。潜在細胞質ＳＴＡＴ６は、ＩＬ－４またはＩＬ－１３がそれぞれの受容体に結合するときに活性化される。ＩＬ－４またはＩＬ－１３のそれらの受容体との連結は、リン酸化、およびそれゆえ受容体の細胞質尾部に付着しているヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ）の活性化をもたらす。活性されると、Ｊａｋは受容体上の特定のチロシン残基をリン酸化し、これが次にＳＴＡＴ６単量体の結合部位を生成する。受容体上のホスホチロシンに結合すると、ＳＴＡＴ６自体がチロシン残基上でリン酸化され、これにより二量体を形成することを可能にする。活性ＳＴＡＴ６二量体は、核に急速に転座し、そこで標的遺伝子の発現を制御する。

【0004】

喘息は、主に膨張した気道を伴う気道の炎症を特徴とする。気道が好酸球、肥満細胞、およびＴｈ２細胞により浸潤される。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９およびＩＬ－１３の重要な供給源である。Ｔｈ２サイトカインは、様々な細胞からのケモカイン産生を誘導することができる。上皮下のコラーゲンの沈着（上皮下線維症）、平滑筋過形成、および杯細胞過形成などの特徴的な構造変化がある。気道の慢性炎症および構造変化は、気道の過敏反応性および気流の制限につながる可能性がある。

【0005】

サイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１３の生物学的機能を介在する主な転写因子として、ＳＴＡＴ６は、免疫系のＴｈ２分極および喘息などのアレルギー性炎症の発症において重要な役割を果たす。具体的には、ＳＴＡＴ６は、Ｔｈ２サイトカインのＴｈ２細胞分化および分泌の制御に関与する転写因子を活性化する（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｃｅｌ．Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ， ４， １５－２９）。さらに、ＳＴＡＴ６は、アレルゲン曝露後の喘息持ちの人や喘息患者の気道において上方制御される。（Ｐｈｉｐｐｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＡＪＲＣＭＢ ３１， ６２６－６３２； Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊ． Ａｌｌ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １０７， ５８５－５９１； Ｍａｉｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊ． Ａｌｌ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０８，８３２－８３８）。

【0006】

喘息に対する現在の治療には、気道内の炎症の低減に役立つ予防的な長期制御薬、および即効性吸入器が含まれる。しかしながら、これらの治療は必ずしも有効ではない。したがって、当技術分野においては喘息などの呼吸器疾患を有する対象者への代替的治療に対するニーズがある。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性の切断に影響を与えるｉＲＮＡ組成物を提供する。ＳＴＡＴ６遺伝子は、細胞内に、ヒト対象などである対象内の細胞にあり得る。本発明はまた、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するため、および／またはＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害もしくは減少から恩恵を受けるであろう対象、例えば、ＳＴＡＴ６関連障害、例えば、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎に罹患しているか、または罹患しやすい対象を治療するための、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法を提供する。

【0008】

したがって、一態様においては、本発明は、細胞内でシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、当該ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と０ヌクレオチド以下、１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下または３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と１ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下または３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該センス鎖または該アンチセンス鎖は一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる。

【0009】

別の態様では、本発明は、細胞内のシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、前述のｄｓＲＮＡは、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＳＴＡＴ６をコードするｍＲＮＡに対して相補性領域を含み、該相補性領域は、表２～３のいずれか一つのアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２、または３個以下のヌクレオチドが異なる１５、１６、１７、１８、１９、または２０などの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、該センス鎖またはアンチセンス鎖は一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる。

【0010】

一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる。

【0011】

一実施形態では、親油性部分は、ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域内の一つまたは複数の位置にコンジュゲートされる。

【0012】

一実施形態では、親油性部分は、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされる。

【0013】

一実施形態では、親油性部分の親油性は、ｌｏｇＫｏｗで測定されて、０を超える。

【0014】

一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける非結合型分画で測定され、０．２を超える。

【0015】

一実施形態においては、血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである。

【0016】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。

【0017】

一実施形態では、センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチド、アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、またはセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドが、修飾を含む。

【0018】

一実施形態では、センス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、またはセンス鎖のすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾を含む。

【0019】

一実施形態では、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’リン酸または５’ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体を含むヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－リン酸を含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’リン酸を含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－リン酸を含むヌクレオチド、２’－Ｏヘキサデシルヌクレオチド、２’－リン酸を含むヌクレオチド、シチジン－２’－リン酸ヌクレオチド、グアノシン－２’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－グアノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－リン酸ヌクレオチド、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）、２’－デオキシアデノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシシチジン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’－リン酸ヌクレオチド、２’－デオキシウリジンヌクレオチド、およびコレステリル誘導体およびドデカノ酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。

【0020】

別の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される。

【0021】

別の実施形態においては、修飾ヌクレオチドは、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。

【0022】

なお別の実施形態では、ヌクレオチドにおける修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾、２’デオキシ修飾、および２’フルオロ修飾である。

【0023】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の３’末端にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。関連する実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。別の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。

【0024】

二本鎖領域は、長さが１９～３０ヌクレオチド対、長さが１９～２５ヌクレオチド対、長さが１９～２３ヌクレオチド対、長さが２３～２７ヌクレオチド対、または長さが２１～２３ヌクレオチド対であり得る。

【0025】

一実施形態では、各鎖は独立的に、長さが３０ヌクレオチド以下である。

【0026】

一実施形態では、センス鎖は、長さが２１ヌクレオチドであり、およびアンチセンス鎖は、長さが２３ヌクレオチドである。

【0027】

相補性領域は、長さが少なくとも１７ヌクレオチド、長さが１９～２３ヌクレオチド、または長さが１９ヌクレオチドであり得る。

【0028】

一実施形態では、少なくとも一つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。 別の実施形態では、少なくとも一つの鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。

【0029】

一実施形態では、一つまたは複数の親油性部分は、少なくとも一本の鎖上の一つまたは複数の内側位置にコンジュゲートされる。

【0030】

一実施形態では、一つまたは複数の親油性部分は、リンカーまたは担体を介して少なくとも一本の鎖上の一つまたは複数の内側位置にコンジュゲートされる。

【0031】

一実施形態では、内側位置は、少なくとも一本の鎖の各末端から末端の二つの位置を除く全ての位置を含む。

【0032】

別の実施形態では、内側位置は、少なくとも一本の鎖の各末端から末端の三つの位置を除く全ての位置を含む。

【0033】

別の実施形態では、内側位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。

【0034】

さらに別の実施形態では、内側位置は、センス鎖の５’末端から数えて９～１２位を除く全ての位置を含む。

【0035】

一実施形態では、内側位置は、センス鎖の３’末端から数えて１１～１３位を除く全ての位置を含む。

【0036】

一実施形態では、内側位置は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く。

【0037】

一実施形態では、内側位置は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２～１４位を除く全ての位置を含む。

【0038】

一実施形態では、内側位置は、３’末端から数えてセンス鎖上の１１～１３位と、５’末端から数えてアンチセンス鎖上の１２～１４位とを除く全ての位置を含む。

【0039】

一実施形態では、一つまたは複数の親油性部分は、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の４～８位および１３～１８位ならびにアンチセンス鎖上の６～１０位および１５～１８位からなる群から選択される内側位置のうちの一つまたは複数にコンジュゲートされる。

【0040】

一実施形態では、一つまたは複数の親油性部分は、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の５、６、７、１５、および１７位ならびにアンチセンス鎖上の１５位および１７位からなる群から選択される内側位置のうちの一つまたは複数にコンジュゲートされる。

【0041】

一実施形態では、二本鎖領域における位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。

【0042】

一実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドの長さであり、また親油性部分は、センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、７位、６位、もしくは２位またはアンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる。

【0043】

一実施形態では、親油性部分は、センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、または７位にコンジュゲートされる。

【0044】

一実施形態では、親油性部分は、センス鎖の２１位、２０位または１５位にコンジュゲートされる。

【0045】

一実施形態では、親油性部分は、センス鎖の２０位または１５位にコンジュゲートされる。

【0046】

一実施形態では、親油性部分は、アンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる。

【0047】

一実施形態では、親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である。

【0048】

一実施形態では、親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される。

【0049】

一実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される随意の官能基とを含有する。

【0050】

一実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する。

【0051】

一実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する。

【0052】

一実施形態では、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖は、一方の鎖の５’末端から数えて６位にコンジュゲートされる。

【0053】

一実施形態では、親油性部分は、内側位置または二本鎖領域における一つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる。

【0054】

一実施形態では、担体は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環式基であるか、またはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格系の非環式部分である。

【0055】

一実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。

【0056】

一実施形態では、親油性部分は、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる。

【0057】

一実施形態では、親油性部分または標的リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、およびガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される生物切断可能な（ｂｉｏ－ｃｌｅｖａｂｌｅ）リンカーを介してコンジュゲートされる。

【0058】

一実施形態では、センス鎖の３’末端は、アミンを有する環式基であるエンドキャップを介して保護され、前記環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される。

【0059】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、肝組織を標的とする標的リガンドをさらに含む。

【0060】

一実施形態では、標的リガンドは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートである。

【0061】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかでの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。

【0062】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかでの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾とをさらに含む。

【0063】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一、第二および第三のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかでの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾とをさらに含む。

【0064】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第三のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかでの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾とをさらに含む。

【0065】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置での連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかでの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾とをさらに含む。

【0066】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端におけるホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む。

【0067】

一実施形態では、ホスフェート模倣体は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である。

【0068】

一実施形態では、二重鎖のアンチセンス鎖の５’－末端の１つの位置における塩基対が、ＡＵ塩基対である。

【0069】

一実施形態では、センス鎖は、合計２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３のヌクレオチドを有する。

【0070】

本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ剤のいずれかを含有する細胞、および本発明のｄｓＲＮＡ剤のいずれかを含む医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む脂質製剤を含んでもよい。

【0071】

一態様では、本発明は、細胞内でシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。当該方法は、細胞を本発明のｄｓＲＮＡのいずれかと、または本発明の医薬組成物のいずれかと接触させて、それによって細胞内でＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害することを含む。

【0072】

一実施形態では、細胞は、対象、例えば、ヒト対象、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎などの呼吸器疾患などのＳＴＡＴ６関連障害を有する対象内にある。

【0073】

特定の実施形態では、ＳＴＡＴ６発現は、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％阻害される。

【0074】

一態様では、本発明は、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害がある対象を治療する方法を提供する。この方法は、本発明のｄｓＲＮＡのいずれかまたは本発明の医薬組成物のいずれかの治療有効量を対象に投与し、それによってＳＴＡＴ６発現の減少から恩恵を受けるであろう障害がある対象を治療することを含む。

【0075】

別の態様では、本発明は、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害がある対象の少なくとも一つの症状を予防する方法を提供する。この方法は、本発明のｄｓＲＮＡのいずれかまたは本発明の医薬組成物のいずれかの予防有効量を対象に投与し、それによってＳＴＡＴ６発現の減少から恩恵を受けるであろう障害がある対象における少なくとも一つの症状を予防することを含む。

【0076】

特定の実施形態では、障害は、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）関連障害である。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６関連障害は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎からなる群から選択される呼吸器疾患である。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６関連障害は喘息である。

【0077】

特定の実施形態では、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、対象におけるＳＴＡＴ６タンパク質蓄積の減少を引き起こす。

【0078】

特定の実施形態では、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、対象における気道の炎症および／または腫脹を減少させる。

【0079】

さらなる態様では、本発明はまた、対象におけＳＴＡＴ６の発現を阻害する方法も提供する。方法は、治療有効量の本明細書に提供されるｄｓＲＮＡのいずれかを対象に投与することを含み、それによって対象におけるＳＴＡＴ６の発現を阻害する。

【0080】

一実施形態では、対象はヒトである。

【0081】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。

【0082】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、肺系投与を介して対象に投与される。肺系投与、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤の鼻腔内投与または経口吸入投与によって、本方法は、肺系組織、例えば、上咽頭組織、中咽頭組織、咽喉頭組織、喉頭組織、気管組織、気管分岐部組織、気管支組織、細気管支組織、または肺胞組織におけるＳＴＡＴ６の発現を低減することができる。

【0083】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、鼻腔内、気管内、または口腔吸入によって対象に投与される。

【0084】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に皮下投与される。

【0085】

一実施形態では、本発明の方法は、対象からの試料中のＳＴＡＴ６のレベルをさらに決定することを含む。

【0086】

一実施形態では、対象の試料中のＳＴＡＴ６レベルは、血液または血清試料中または肺系組織試料中のＳＴＡＴ６タンパク質レベルである。

【0087】

特定の実施形態では、本発明の方法は、追加の治療薬を対象に投与することをさらに含む。

【0088】

一実施形態では、追加の治療剤は、抗炎症剤（例えば、全身性コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、抗コリン剤と、β２アドレナリン受容体アゴニスト、抗生物質、抗ウイルス剤、抗ヒスタミン薬、免疫調節因子（例えば、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロホスファミド）、ホスホジエステラーゼ－５阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ニンテダニブ）、抗線維化剤（例えば、ピルフェニドン）、および前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択される。

【0089】

本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡのいずれか、または本発明の医薬組成物のいずれか、および随意で使用説明書を含むキットを提供する。一実施形態では、本発明は、細胞内のＳＴＡＴ６の発現を阻害するのに有効な量で、細胞を本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることによって、細胞内のＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害する方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ＲＮＡｉ剤と、使用説明書を含み、任意に、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段を含む。

【0090】

本発明はさらに、本発明のｄｓＲＮＡ剤のいずれかのアンチセンス鎖を含むＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0091】

本発明は、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性の切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。当該遺伝子は、細胞内に、例えば、ヒトなどである対象内の細胞内にあり得る。これらｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子（ＳＴＡＴ６）のｍＲＮＡの標的分解を可能にする。

【0092】

本発明のｉＲＮＡは、他の哺乳動物種のＳＴＡＴ６オーソログに保存される遺伝子の部分を含める、ヒトシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）を標的とするように設計した。理論に制限されることを意図するものではないが、前述の特徴およびこれらｉＲＮＡにおける特定の標的部位または特定の修飾の組み合わせまたは下位の組み合わせが、本発明のｉＲＮＡの有効性、安定性、効力、耐久性、および安全性を向上させると考えられる。

【0093】

したがって、本発明は、ＳＴＡＴ６遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性の切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を使用して、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）関連障害、例えば、呼吸器疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎を治療および予防するための方法を提供する。

【0094】

本発明のｉＲＮＡは、長さが最大約３０ヌクレオチドまたはそれ未満、例えば長さが１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド、である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、該領域は、ＳＴＡＴ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である。

【0095】

特定の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖または両方の鎖は、長さが最大６６ヌクレオチド、例えば長さが３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチドであり、ＳＴＡＴ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの領域を伴う。一部の実施形態では、より長いアンチセンス鎖を有するこうしたｉＲＮＡ剤は、例えば、長さが２０～６０ヌクレオチドの第二のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み得、この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１８～３０の連続するヌクレオチドの二重鎖を形成する。

【0096】

本発明のｉＲＮＡの使用により、哺乳動物における対応する遺伝子（ＳＴＡＴ６遺伝子）の標的とされたｍＲＮＡの分解が可能になる。本発明者らは、ＳＴＡＴ６遺伝子を標的とするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを強力に介在し、結果としてＳＴＡＴ６遺伝子の発現の有意な阻害をもたらすことができることを、インビトロアッセイにより実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、ＳＴＡＴ６関連障害、例えば、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎を有する対象を治療するのに有用である。

【0097】

したがって、本発明は、ＳＴＡＴ６遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性の切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を使用して、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害または減少から恩恵を受けることとなる障害、例えば、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）関連疾患、例えば、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎を有する対象を治療するための方法および併用療法を提供する。

【0098】

本発明はまた、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害または減少から恩恵を受けることになる障害、例えば、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎を有する対象における少なくとも一つの症状を予防するための方法を提供する。

【0099】

以下の発明の詳細な説明は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作製および使用する方法、ならびにＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害および／または減少から恩恵を受けるであろう対象、例えば、ＳＴＡＴ６関連障害に感受性がある、またはそれと診断される対象を治療する組成物、使用、および方法を開示している。

【0100】

Ｉ．定義
本発明がより容易に理解できるように、特定の用語を、最初に定義する。加えて、パラメータの値または値の範囲が列記される場合にはいつでも、その列記された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることを意図していることを意図するものであるということに留意されたい。

【0101】

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法上の目的語の一つまたは複数（すなわち、少なくとも一つ）を意味するために使用する。例えば、「ある要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、一つの要素または二つ以上の要素、例えば、複数の要素、を意味する。

【0102】

「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「～を含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、また当該語句と区別なく使用する。

【0103】

「または」という用語は、文脈において別途明示しない限り、「および／または」という用語を意味するために本明細書において使用され、また当該用語と区別なく使用する。例えば、「センス鎖またはアンチセンス鎖」は、「センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖」として理解される。

【0104】

「約」という用語は、当技術分野において、典型的な許容誤差の範囲内であることを意味するために本明細書で使用する。例えば、「約」は、平均から約２の標準偏差として理解され得る。特定の実施形態では、約は、±１０％を意味する。特定の実施形態では、約は、±５％を意味する。一連の数字または範囲の前に約がある場合、「約」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。

【0105】

ある数字または連続する数字の前にある「少なくとも」、「以上」または「またはそれ以上」という用語は、文脈から明白な場合、「少なくとも」という用語に隣接する数字、および論理的に含まれ得るそれに続く全ての数字または整数を含むことが理解される。例えば、ある核酸分子内のヌクレオチドの数は、整数であるはずである。例えば、「２１ヌクレオチドの核酸分子のうちの少なくとも１９ヌクレオチド」は、１９、２０、または２１ヌクレオチドが、示した特性を有するということを意味する。連続する数字または範囲の前に少なくともがある場合、「少なくとも」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。

【0106】

本明細書において使用する場合、「～以下」または「またはそれ以下」は、その語句に隣接する値と、文脈から論理的である場合はゼロまでのその値より論理的により小さい値または整数として理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」のオーバーハングを有する二重鎖は、２、１、または０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。連続する数字または範囲の前に「～以下」がある場合、「～以下」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。本明細書において使用する場合、範囲は、上限および下限の両方を含む。

【0107】

本明細書において使用する場合、検出の方法は、存在する分析物の量がその方法の検出レベルを下回る判定を含み得る。

【0108】

示した標的部位と、センス鎖またはアンチセンス鎖に関するヌクレオチド配列と矛盾する場合には、示した配列を優先する。

【0109】

転写物または他の配列上の配列とその示した部位とが一致しない場合には、本明細書において列挙したヌクレオチド配列を優先する。

【0110】

本明細書で使用される場合、「ＳＴＡＴ６」という用語と互換的に使用される「シグナル伝達兼転写活性化因子６」という用語は、転写因子のＳＴＡＴファミリーのメンバーを指す。サイトカインおよび成長因子に応答して、ＳＴＡＴファミリーのメンバーは、受容体関連キナーゼによってリン酸化され、次いで、転写活性化因子として作用する細胞核に転座するホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する。ＳＴＡＴ６は、気道好酸球増加症、上皮粘液産生、平滑筋変化、Ｔｈ２細胞分化、およびＢ細胞からのＩｇＥ産生を含め、動物モデルにおいて、肺炎症反応の多くの病理学的特徴を調節することが実証されている（Ｗｕｒｓｔｅｒ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００；１９：２５７７-８４）。ＳＴＡＴ６は、インターロイキン４誘導性、ＩＬ－４－ＳＴＡＴ、Ｄ１２Ｓ１６４４、ＳＴＡＴ６Ｂ、またはＳＴＡＴ６Ｃとしても知られている。

【0111】

ヒトＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ： １５１９３１３９６９ （ＮＭ＿００３１５３．５、配列番号１、逆相補、配列番号２）に見つけることができる。マウスＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ： １２８４８５７７３（ＮＭ＿００９２８４．２、配列番号３、逆相補、配列番号４）に見つけることができる。ラットＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ： １１３２０５４９９ （ＮＭ＿００１０４４２５０．１、配列番号５、逆相補、配列番号６）に見つけることができる。カニクイザルＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ： ９８２２８２００６ （ＸＭ＿００５５７１２８６．２、配列番号７、逆相補、配列番号８）に見つけることができる。アカゲザルＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ： １６２２８４２９１５ （ＸＭ＿０１５１５２０４４．２、配列番号９、逆相補、配列番号１０）に見つけることができる。

【0112】

ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡＡ配列のさらなる例としては、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、およびＭａｃａｃａゲノムプロジェクトウェブサイトなどの公開されているデータベースを通じて容易に入手可能である。

【0113】

ＳＴＡＴ６に関するさらなる情報は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ＳＴＡＴ６において見出だされ得る。

【0114】

先述のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号および遺伝子データベース番号のそれぞれの内容全体は、本願出願日の時点で参照により本明細書に組み込まれる。

【0115】

用語ＳＴＡＴ６は、本明細書において使用する場合、ＳＮＰデータベースにおいて提供される変異体を含めたＳＴＡＴ６遺伝子のバリエーションも意味する。ＳＴＡＴ６遺伝子内の多数の配列バリエーションは特定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰおよびＵｎｉＰｒｏｔにおいて見られ得る（例えば、その内容全体が本願出願日の時点で参照により本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ／？ｔｅｒｍ＝ＳＴＡＴ６を参照）。

【0116】

本明細書において使用する場合、「標的配列」は、例えば一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡなどである、ＳＴＡＴ６遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列における連続する部分を意味する。一実施形態においては、配列の標的部分は、少なくとも、ＳＴＡＴ６遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の一部分において、またはその近傍におけるｉＲＮＡ依存性の切断のための基質として機能するのに十分な長さであることとなる。

【0117】

標的配列は、長さが約１９～３６ヌクレオチド、例えば、長さが約１９～３０ヌクレオチドであり得る。例えば、標的配列は、長さが約１９～３０ヌクレオチド、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、標的配列は、１９～２３ヌクレオチドの長さであり、随意に２１～２３ヌクレオチドの長さである。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。

【0118】

本明細書において使用する場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの用語体系を使用して言及される配列によって説明するヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

【0119】

概して、「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」のそれぞれが、塩基としてのグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルをそれぞれ含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下においてより詳述されるような修飾ヌクレオチド、または代替置換部分（例えば、表１を参照）も指し得ることは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルは、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく、他の部分で置換することができることを十分に認識している。例えば、これらに限定されるものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合することができる。したがって、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドで、置換することができる。別の実施例では、オリゴヌクレオチド内のいずれの箇所にあるアデニンおよびシトシンも、標的ｍＲＮＡと対合するＧ－Ｕウォッブル塩基を形成するために、それぞれグアニンおよびウラシルで置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に好適である。

【0120】

本明細書において区別なく使用する「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書において用語が定義されるＲＮＡを含有し、かつＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写の標的の切断を介在する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを介してｍＲＮＡの配列特異的な分解を司る。ｉＲＮＡは、細胞内であって、例えば哺乳動物対象などの対象における細胞内で、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を調節、例えば阻害する。

【0121】

一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列と、例えばＳＴＡＴ６標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を司る、一本鎖ＲＮＡを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ（ダイサー）として知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡへと分解されると考えられている（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５：４８５）。ＤｉｃｅｒであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、このｄｓＲＮＡを、特徴的な二つの塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡへとプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。その後ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで一つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を解き、それによって相補的アンチセンス鎖に対して標的認識を誘導することが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の一つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５：１８８）。すなわち、一態様では、本発明は、細胞内で生成され、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進して、標的遺伝子、すなわちＳＴＡＴ６遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記において説明したｉＲＮＡを指すために本明細書において使用される。

【0122】

特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、細胞または有機体に導入されて標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるアルゴノート２に結合し、それは次いで、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、概して、１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載されており、そのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において記載するアンチセンスヌクレオチド配列はいずれも、本明細書において記載する一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される方法によって化学的に修飾されるような一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。

【0123】

特定の実施形態では、本発明の組成物、使用および方法において使用する「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書においては「二本鎖ＲＮＡ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、または「ｄｓＲＮＡ」と称する。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＳＴＡＴ６遺伝子に関して「センス」または「アンチセンス」配向を有するとして言及する、二本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明の一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、本明細書においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称する転写後遺伝子サイレンシング機序を経て、標的ＲＮＡの、例えば、ｍＲＮＡの分解を誘発する。

【0124】

一般的には、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載するように、各鎖または両鎖は、一つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、も含み得る。加えて、本明細書において使用する場合、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得、ｉＲＮＡは、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用する場合、「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間連結、または修飾された核酸塩基、またはそれらのいずれかの組み合わせを、独立して有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基に対する、例えば、官能基または原子などの置換、付加、または除去を包含する。本発明の該剤で使用するのに好適な修飾は、本明細書において開示する修飾または当技術分野で公知の修飾の全てのタイプを包含する。ｓｉＲＮＡタイプの分子において使用される場合、当該修飾はいずれも、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ剤」で包含される。

【0125】

本開示の特定の実施形態では、デオキシ－ヌクレオチドを包含することが、ＲＮＡｉ剤内に存在するならば、修飾ヌクレオチドを構成するとみなすことができる。

【0126】

二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介して所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであってもよく、約１９～３６塩基対の長さ、例えば、約１９～３０塩基対の長さ、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対の長さ、例えば、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さの範囲であってもよい。特定の実施形態では、二重鎖領域は、長さが１９～２１塩基対、例えば、長さが２１塩基対である。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。

【0127】

二重鎖構造を形成する二本の鎖は、一つのより大きいＲＮＡ分子にのうちの異なる部分であり得るか、またはそれらは、別個のＲＮＡ分子であり得る。二本の鎖が、一つのより大きい分子のうちの部分であり、そのために二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれに対応するもう一方の鎖の５’末端との間にある中断されないヌクレオチドの鎖でつながっている場合、その接続しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも一つの不対のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２３またはそれ以上の不対のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、１０以下のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、８以下の不対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～１０の不対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～８のヌクレオチドであり得る。

【0128】

ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な二本の鎖が、別個のＲＮＡ分子で構成される場合、それら分子は必ずしもそうではないが、共有結合で結合することができる。二本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれに対応するもう一方の鎖の５’末端との間にある中断されないヌクレオチドの鎖とは異なる手段で共有結合によりつながっている場合、その接続している構造を「リンカー」と称する。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖にあるヌクレオチドの数から二重鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、一つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。ＲＮＡｉ剤の一実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態においては、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの、例えば２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの、３’オーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの、５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の３’末端および５’末端の両方が、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【0129】

特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡであり、その各鎖が１９～２３ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列、例えばＳＴＡＴ６遺伝子と相互作用して標的ＲＮＡの切断を司る。

【0130】

一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列、例えばＳＴＡＴ６標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を司る２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。

【0131】

本明細書において使用する場合、「ヌクレオチド（の）オーバーハング」という用語は、二本鎖ｉＲＮＡの二重鎖構造から突出する少なくとも一つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、もう一方の鎖の５’末端を越えて延びる場合、またはその逆の場合も同様に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも一つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得、あるいは該オーバーハングは、少なくとも二つのヌクレオチド、少なくとも三つのヌクレオチド、少なくとも四つのヌクレオチド、少なくとも五つのヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどであるヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたは該類似体からなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらのいずれかの組み合わせ上にあり得る。さらに、あるオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。

【0132】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドの一つまたは複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。

【0133】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドの一つまたは複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。

【0134】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖上またはその両鎖上のオーバーハングは、１０ヌクレオチドより長い伸長した長さを含み得、例えば、長さが１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、または１０～１５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハング内のヌクレオチドの一つまたは複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。特定の実施形態では、オーバーハングは、オーバーハングが生理学的条件下において安定なヘアピン構造を形成することができるような自己相補性的部分を含む。

【0135】

「平滑」または「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡ剤のその末端において不対ヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端である」二本鎖ＲＮＡ剤は、その全長にわたって二本鎖であり、すなわち、当該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。本発明のＲＮＡｉ剤は、一端にヌクレオチドオーバーハングがないＲＮＡｉ剤（すなわち、一つのオーバーハングと一つの平滑末端とを有する剤）、またはいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないＲＮＡｉ剤を含む。ほとんどの場合、こうした分子は、その全長にわたって二本鎖となることとなる。

【0136】

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、標的配列、例えばＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡに対して実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖、例えばｄｓＲＮＡを指す。

【0137】

本明細書において使用する場合、「相補性領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＳＴＡＴ６ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が、標的配列に対して完全に相補的でない場合、そのミスマッチは、分子の内部領域または末端領域内にあり得る。概して、最も許容できるミスマッチは、末端領域内にあり、例えば、ｉＲＮＡの５ ’末端または３’末端の５、４または３ヌクレオチドの範囲内にある。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖内のヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡとの４以下のミスマッチを含み、例えば、アンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡとの４、３、２、１、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明のアンチセンス鎖の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖との４以下のミスマッチを含み、例えば、アンチセンス鎖が、センス鎖との４、３、２、１、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖内にヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖は、アンチセンス鎖との４以下のミスマッチを含み、例えば、センス鎖が、アンチセンス鎖との４、３、２、１または０のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３ヌクレオチドの範囲内にある。別の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡ剤の３’末端ヌクレオチド内にある。一部の実施形態では、ミスマッチは、シード領域にはない。

【0138】

したがって、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、標的配列に対する一つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、３以下のミスマッチ（すなわち、３、２、１、または０のミスマッチ）を含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、２以下のミスマッチを含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、１以下のミスマッチを含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、０のミスマッチを含有する。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含有する場合、該ミスマッチは、随意に、相補性領域の５’末端または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチドの範囲内にあるように制限することができる。例えば、そのような実施形態では、２３ヌクレオチドのＲＮＡｉ剤の場合、ＳＴＡＴ６遺伝子の領域に対して相補的な鎖は、概して、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にいかなるミスマッチも含まない。本明細書において記載する方法または当技術分野で公知の方法を使用することにより、標的配列に対してミスマッチを含有するＲＮＡｉ剤が、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害において効果的であるか否かを判定することができる。とりわけ、ＳＴＡＴ６遺伝子における特定の相補性領域が、集団内での多形配列バリエーションを有することがわかっている場合には、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するミスマッチを有するＲＮＡｉ剤の有効性を考慮することが重要である。

【0139】

「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書において使用する場合、用語を本明細書において規定しているアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。

【0140】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」は、広く修飾されているが全体が修飾されているものではなく、また５、４、３、２、もしくは１以下の未修飾のヌクレオチドを含み得る。

【0141】

本明細書において使用する場合、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、切断が生じる箇所である標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端上における、および切断部位に直接隣接している三つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端上における、および切断部位に直接隣接している二つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位において特異的に生じ、またこの切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、および１３を含む。

【0142】

本明細書において使用する場合、特に別段に示さない限り、「相補的」という用語は、第二のヌクレオチド配列との関連において第一のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合には、当業者によって理解されることとなるとおり、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと特定の条件下においてハイブリダイズして二重鎖構造を形成する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、厳しい条件であり得、該厳しい条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間の後の洗浄、を含み得る（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。生物体内で遭遇し得るような生理学的に関連のある条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、二つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができる。

【0143】

ｉＲＮＡ内、例えば本明細書において記載するｄｓＲＮＡ内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたって第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。かかる配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」であると称し得る。しかしながら、本明細書において、第一の配列が第二の配列に対して「実質的に相補的」であるという場合、この二つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらはその最終的な用途に、例えば、インビトロまたはインビボで、遺伝子発現の阻害に最も関連した条件下でハイブリダイズする能力を維持しつつ、最大３０塩基対の二重鎖についてのハイブリダイゼーションの際に、一つまたは複数であるが、概して５、４、３、または２以下である、ミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、二つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に一つまたは複数の一本鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合には、かかるオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチとはみなさないものとする。例えば、長さが２１ヌクレオチドである一方のオリゴヌクレオチドと長さが２３ヌクレオチドであるもう一方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むようなｄｓＲＮＡは、依然として、本明細書において記載する目的に関しては「完全に相補的」と称し得る。

【0144】

「相補的」配列は、本明細書において使用する場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件を満足する限り、非ワトソン・クリック塩基対、または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、または全体的にそれらから形成され得る。かかる非ワトソン・クリック塩基対としては、これらに限定されるものではないが、Ｇ：Ｕウォッブル塩基対またはフーグスティーン塩基対が挙げられる。

【0145】

本明細書における「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」という用語は、それらの使用の文脈から理解されることとなるとおり、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、または二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列などである二つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド間における塩基マッチングに関連して使用され得る。

【0146】

本明細書において使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＳＴＡＴ６遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＳＴＡＴ６遺伝子をコードするｍＲＮＡの中断されない部分に対して実質的に相補的である場合、ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。

【0147】

したがって、一部の実施形態では、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＳＴＡＴ６配列に対して完全に相補的である。他の実施形態では、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＳＴＡＴ６配列に対して実質的に相補的であり、および配列番号１、３、５、７、または９のいずれか一つのヌクレオチド配列の等価領域に対して、または配列番号１、３、５、７、または９のいずれか一つの断片に対して、その全長にわたって少なくとも８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である。

【0148】

他の実施形態では、本明細書において開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＳＴＡＴ６配列に対して実質的に相補的であり、また表２～３のいずれか一つのうちのいずれか一つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つまたは表２～３のいずれか一つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの断片に対して、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的である。

【0149】

一実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であり、ひいては標的ＳＴＡＴ６配列と同じであるセンス鎖を含み、および該センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、もしくは１０の配列番号のヌクレオチド配列等価領域に対して、または配列番号２、４、６、８、もしくは１０のいずれか一つの断片に対して、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的である。

【0150】

一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、同様に標的ＳＴＡＴ６配列に対して相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であるセンス鎖を含み、また該センス鎖ポリヌクレオチドは、表２～３のいずれか一つのうちのいずれか一つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つ、または表２～３のいずれか一つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの断片に対して、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的である。

【0151】

概して、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含む。かかる修飾は、本明細書に開示される、または当技術分野で公知のすべての種類の修飾を含み得る。こうした修飾はいずれも、ｄｓＲＮＡ分子において使用される場合、本明細書および特許請求の範囲の目的のためには「ｉＲＮＡ」で包含される。

【0152】

本開示の特定の実施形態では、デオキシ－ヌクレオチドを包含することが、ＲＮＡｉ剤内に存在するならば、修飾ヌクレオチドを構成するとみなすことができる。

【0153】

本発明の一態様では、本発明の方法および組成物で使用するための薬剤が、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に対して相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと塩基対形成し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害することができる。Ｄｉａｓ， Ｎ． ｅｔ ａｌ ．， （２００２） Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１４～約３０ヌクレオチド長であってもよく、標的配列に相補的な配列を有してもよい。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか一つから少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含んでもよい。

【0154】

ｄｓＲＮＡなどの「ｉＲＮＡと細胞を接触させること」なる語句は、本明細書において使用される場合、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを包む。細胞をｉＲＮＡと接触させることは、インビトロで細胞をｉＲＮＡと接触させること、またはインビボで細胞をｉＲＮＡと接触させることを含む。接触させることは、直接的または間接的に行われ得る。したがって、例えば、ｉＲＮＡは、方法を個別に実施することで細胞と物理的に接触させ得るか、あるいはｉＲＮＡは、その後に細胞と接触することを可能するまたは接触させることとなるような状況に置かれ得る。

【0155】

細胞をインビトロで接触させることは、例えば、細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させることは、例えば、吸入、鼻腔内投与、または気管内投与を介して、ＲＮＡｉ剤を細胞が位置している組織中もしくはその近傍（例えば、肺系）に注入することによって、または別の領域にＲＮＡｉ剤を注入することによって、または薬剤がその後に接触対象の細胞が位置している組織に到達することとなるように、血流もしくは皮下腔にＲＮＡｉ剤を注入することによって、行われ得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、目的の部位、例えば、肺系にＲＮＡｉ剤を向かわせるかまたはそうでなければ安定化するリガンド、例えば、下記において説明され、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１９／２１７４５９号（参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる）においてさらに詳述されるような親油性部分、を含み得るかまたはそれにカップリングされ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、対象部位、例えば、肝臓にＲＮＡｉ剤を向けるか、またはそうでなければ安定化させるリガンド、例えば、以下に記載される一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含有するか、またはそれらに結合することができる。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、親油性部分または一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含有するか、またはそれらに結合することができる。インビトロおよびインビボでの接触方法の組合せもまた可能である。例えば、細胞をインビトロにおいてＲＮＡｉ剤と接触させて、その後に対象に移してもよい。

【0156】

特定の実施形態では、細胞をｉＲＮＡと接触させることは、細胞内への取り込みまたは吸収を促進するまたは生じさせることによって「導入すること」または「ｉＲＮＡを細胞内に送達すること」を含む。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、自発的な拡散もしくは活性な細胞内プロセスを介して、または補助の薬剤もしくはデバイスによって、生じ得る。ｉＲＮＡの細胞内への導入は、インビトロまたはインビボにおいてであり得る。例えば、インビボでの導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入され得るかまたは全身的に投与され得る。インビトロでの細胞内への導入としては、当技術分野で公知の方法、例えばエレクトロポレーション法およびリポフェクション法などが挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書の下記において説明されるか、または当技術分野で公知である。

【0157】

「脂溶性」または「親油性部分」という用語は、脂質に対して親和性を有する任意の化合物または化学部分を広く意味する。親油性部分の親油性を特徴付ける方法の一つは、オクタノール－水分配係数ｌｏｇＫ_ｏｗによるものであり、この場合Ｋ_ｏｗは、平衡状態にある二相系のうちの水相の化学物質の濃度に対するオクタノール相の化学物質の濃度の比である。オクタノール－水分配係数は、物質の実験室測定される特性である。しかしながら、それは、第一原理または経験的方法を使用して算出される化学物質の構造成分に起因する係数を使用することによっても予想され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｃｉ． ４１：１４０７－２１ （２００１）を参照）。それは、水よりもむしろ非水性または油性環境を好む物質の傾向の熱力学的尺度（すなわち、その親水性／親油性バランス）をもたらす。原則として、化学物質は、そのｌｏｇＫ_ｏｗが０を超える場合、性質が親油性である。典型的には、親油性部分は、１を超える、１．５を超える、２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、または１０を超える、ｌｏｇＫ_ｏｗをもつ。例えば、６－アミノヘキサノールのｌｏｇＫ_ｏｗは、例えばおよそ０．７であると予測される。同じ方法を使用することにより、Ｎ－（ヘキサン－６－オール）カルバミン酸コレステリルのｌｏｇＫ_ｏｗは、１０．７であると予測される。

【0158】

分子の親油性は、分子が有する官能基に応じて変化し得る。例えば、親油性部分の末端にヒドロキシル基またはアミン基を付加することにより、親油性部分の分配係数（例えば、ｌｏｇＫ_ｏｗ）の値が増加または減少し得る。

【0159】

あるいは、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定することができる。例えば、特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイの非結合型分画が、二本鎖ＲＮＡｉ剤の相対的疎水性に対して正に相関することを判定することとなれば、それは次いで二本鎖ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性に対して正に相関することとなる。

【0160】

一実施形態では、判定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。この結合アッセイの例示的プロトコールは、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ ２０１９／２１７４５９号において詳細に説明される。結合アッセイにおけるｓｉＲＮＡの非結合画分によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、増強されたｓｉＲＮＡのインビボでの送達の場合では、０．１５を超える、０．２を超える、０．２５を超える、０．３を超える、０．３５を超える、０．４を超える、０．４５を超える、または０．５を超える。

【0161】

したがって、親油性部分を二本鎖ＲＮＡｉ剤の内側位置にコンジュゲートすることによ り、ｓｉＲＮＡにおける増強されたインビボでの送達のために最適の疎水性がもたらされる。

【0162】

「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、例えば核酸分子など、薬学的に活性な分子を封入する脂質層を含むベシクルであり、例えば、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡの転写元のプラスミドなどである。ＬＮＰは、例えば米国特許第６，８５８，２２５号、第６，８１５，４３２、８，１５８，６０１号、および第８，０５８，０６９号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0163】

本明細書で使用される場合、「対象」は哺乳類などの動物であり、霊長類（ヒト、例えばサル、およびチンパンジーである非ヒト霊長類など）、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、またはマウスなど）、または内因性または異種性のいずれかで標的遺伝子を発現する鳥が挙げられる。ある実施形態では、対象はヒトであり、例えばＳＴＡＴ６発現の減少により利益を得るであろう疾患または障害に関して治療または評価されるヒト、ＳＴＡＴ６発現の減少により利益を得るであろう疾患または障害のリスクがあるヒト、ＳＴＡＴ６発現の減少により利益を得るであろう疾患または障害を有するヒト、または本明細書に記載されるＳＴＡＴ６発現の減少により利益を得るであろう疾患または障害が治療されるヒトなどである。一部の実施形態では、対象は、女性であるヒトである。他の実施形態では、対象は、男性であるヒトである。一実施形態では、対象は、成人である対象である。別の実施形態では、対象は、小児である対象である。

【0164】

本明細書において使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、対象におけるＳＴＡＴ６関連障害の少なくとも一つの兆候または症状を減少させるなど、有益または望ましい転帰を指す。治療はまた、望ましくないＳＴＡＴ６発現に関連する一つ以上の徴候または症状の減少、望ましくないＳＴＡＴ６の活性化または安定化の程度の低下、望ましくないＳＴＡＴ６の活性化または安定化の改善または緩和を含む。「治療」はまた、治療が行われない場合に予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことも意味し得る。

【0165】

対象におけるＳＴＡＴ６のレベルまたは疾患マーカーまたは症状の文脈での「低下させる（ｌｏｗｅｒ）」という用語は、こうしたレベルの統計学的に有意な減少を指す。減少は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、減少は、少なくとも２０％である。特定の実施形態では、減少は、疾患マーカーにおいて、例えば、タンパク質レベルまたは遺伝子発現レベルにおいて、少なくとも５０％である。対象におけるＳＴＡＴ６のレベルの文脈での「低下させる」は、好ましくは、当該障害のない個体における正常な領域の範囲内として受け入れられるレベルまで減少することである。特定の実施形態では、標的の発現は、正常化するものであり、すなわち当該障害のない個体における正常な領域の範囲内として受け入れられるレベルに向けて、または該レベルまで減少する（例えば、血中酸素レベル、白血球数、肝臓機能）。本明細書において使用される場合、対象において「低下させる」は、対象の細胞における遺伝子発現またはタンパク質産生が低下することを指し得すが、これは対象のすべての細胞または組織における発現が低下することを必要とするものではない。例えば、本明細書において使用する場合、対象において低下させることは、対象における遺伝子発現またはタンパク質産生が低下することを含み得る。

【0166】

「低下させる」という用語はまた、疾患の症状または病態を正常化すること、すなわちＳＴＡＴ６関連疾患に罹患していない正常な対象のレベルとＳＴＡＴ６関連疾患に罹患している対象のレベルとの差を、ＳＴＡＴ６関連疾患に罹患していない正常な対象のレベルに向けて、またはそのレベルまで減少させること、に関連して使用され得る。本明細書において使用する場合、疾患が、ある症状について値の上昇を伴うならば、「正常」は基準値上限とする。疾患が、ある症状について値の減少を伴うならば、「正常」は基準値下限とする。

【0167】

本明細書で使用される場合、「予防」または「予防する」は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の減少によって治療または改善される疾患、障害またはその状態に言及して使用されるとき、対象がこのような疾患、障害またはその状態に関連する症状、例えば、ＳＴＡＴ６関連疾患の症状、例えば、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎などを発症する可能性の減少を指す。疾患、障害、または状態を発症しないこと、またはこうした疾患、障害、または状態に関連する症状の発症の減少（例えば、その疾患または障害に対して臨床的に受け入れられる規模の少なくとも約１０％の減少）、または遅延された症状の提示の遅延（例えば、数日、数週間、数か月、または数年の遅延）は、有効な予防とみなされる。

【0168】

本明細書で使用される場合、「シグナル伝達兼転写活性化因子６関連疾患」または「ＳＴＡＴ６関連疾患」という用語は、ＳＴＡＴ６遺伝子発現またはＳＴＡＴ６タンパク質産生によって引き起こされる、または関連する疾患または障害である。「ＳＴＡＴ６関連疾患」という用語は、ＳＴＡＴ６遺伝子発現、複製、またはタンパク質活性の減少から利益を得るであろう疾患、障害、または状態を含む。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６関連疾患は、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎である。

【0169】

本明細書で使用される場合、「喘息」という用語は、気道が炎症する慢性の疾患または状態を指す。喘息発作中、気道は腫脹し、その周囲の筋肉は締め付けられ、空気が肺に出入りするのがより困難になり、それによって咳、ゼーゼーいう呼吸、息切れ、および／または胸部の締め付けなどの症状を引き起こす。

【0170】

本明細書で使用される場合、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）という用語は、気流の慢性閉塞を特徴とする肺の疾患を指す。ＣＯＰＤでは、経時的な肺への損傷は、適切な呼気に関与する肺組織の弾性の喪失につながる。この弾性が失われると、呼気の終了時に一部の排二酸化炭素がに肺内に残り、体内での二酸化炭素の蓄積につながる。ＣＯＰＤは肺胞の破壊である肺気腫、および肺の気道管の炎症である慢性気管支炎につながる。

【0171】

本明細書で使用される場合、「嚢胞性線維症」という用語は、組織の肥厚および肺、膵臓、肝臓、腎臓、および腸内での粘液の蓄積をもたらす遺伝性疾患を指す。嚢胞性線維症を有する個人は、肺の気道を遮断し得る濃厚な粘液を発生させる。この粘液の蓄積は、粘液が細菌を捕捉して効率的に除去できないため、呼吸困難および呼吸器感染症に対する感受性の増加をもたらす。この状態はまた、消化系を重度に衰弱させる効果を有し、成長および体重に支障をもたらす。

【0172】

本明細書で使用される場合、「肺線維症」という用語は、組織が肥厚し、瘢痕化する肺の状態を指す。この濃厚な硬い組織は、肺の適切な機能をより困難にする。肺線維症が悪化するにつれて、患者は徐々に息切れがひどくなる。一部の実施形態では、肺線維症の原因は不明である。これらの場合、肺線維症は、「特発性肺線維症（ＩＰＦ）」と呼ばれる。

【0173】

ＳＴＡＴ６関連疾患の症状には、例えば、気道内での粘液の蓄積、呼吸困難、呼吸器感染症に対する感受性の増加、成長および体重の不全、肺組織の弾性の喪失、体内での二酸化炭素の蓄積、肺気腫、慢性気管支炎、息切れ、慢性咳および過剰な粘液、ゼーゼーいう呼吸、胸部の圧迫感、青唇および爪床、ならびにコントロール不良の体重減少が含まれる。様々な疾患または状態の徴候および症状に関するさらなる詳細が本明細書に提供されており、当該技術分野で周知である。

【0174】

「治療有効量」は、本明細書において使用する場合、ＳＴＡＴ６関連疾患がある対象に投与されたときに、（例えば、既存の疾患または疾患の一つ以上の症状を減少、改善、または維持することによって）疾患の治療を行うのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、当該剤の投与方法、疾患およびその重症度および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ある場合には先行するまたは併用する治療の種類、および治療しようとする対象の他の個人的特徴、に応じて変動し得る。

【0175】

「予防有効量」は、本明細書において使用する場合、ＳＴＡＴ６関連障害を有する対象に投与されたときに、疾患または疾患の一つ以上の症状を予防または改善するのに十分である、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾患の改善は、疾患の経過を鈍化させること、またはこれから発症する疾患の重症度を減少させることを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、当該剤の投与方法、疾患のリスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ある場合には先行するまたは併用する治療の種類、および治療しようとする患者の他の個人的特徴、に応じて変動し得る。

【0176】

「治療有効量」または「予防有効量」はまた、任意の治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比においていくつかの所望の効果を生じるＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法において用いるｉＲＮＡは、そうした治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比を生じるのに十分な量で投与され得る。

【0177】

「薬学的に許容される」という語句は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内でのヒト対象および動物対象の組織との接触での使用に好適であるそれら化合物、材料、組成物または剤形を指す。

【0178】

「薬学的に許容される担体」という語句は、本明細書において使用する場合、一つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分への主題化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルであって、例えば液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルク マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料など、を意味する。各担体は、製剤の他の原材料に対して適合性であり、かつ治療される対象に対して有害であってはならないという意味において「許容される」ものでなければならない。こうした担体は、当技術分野で公知である。薬学的に許容される担体には、注射による投与のための担体が含まれる。

【0179】

本明細書で使用される場合、「呼吸系」は、例えば、口、鼻、および鼻腔、洞、気管、咽頭、喉頭、気管支、細気管支、肺胞、および血管系、例えば、毛細血管、造血細胞、リンパ管、および肺、ならびにその中に存在する細胞、組織、および流体から空気が身体の外側から体内の肺に移動し、体内から体外に出る構造として理解される。

【0180】

本明細書で使用される場合、「吸入による送達」などは、気管内投与を含む、鼻または口を通した吸入による送達を含む。吸入による送達は典型的に、薬剤が送達される場所、例えば、鼻、口、肺、および送達される材料のタイプ、例えば滴下、ミスト、乾燥粉末に部分的に基づいて選択される、装置、例えば、吸入器、噴霧器、ネブライザーを使用して実施される。

【0181】

「試料」という用語は、本明細書において使用する場合、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織、および対象内に存在する体液、細胞、または組織の採取物を包含する。生体液の例としては、血液、血清、および漿液、血漿、髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、臓器、または局所領域からの試料を含み得る。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の部分、またはそれら臓器内の体液もしくは細胞に由来するものであり得る。特定の実施形態では、試料は鼻腔スワブに由来してもよい。特定の実施形態では、試料は咽頭スワブに由来してもよい。特定の実施形態では、試料は、肺、または肺内の特定のタイプの細胞に由来してもよい。一部の実施形態では、試料は細気管支に由来してもよい。一部の実施形態では、試料は気管支に由来してもよい。一部の実施形態では、試料は肺胞に由来してもよい。特定の実施形態では、試料は、肝臓（例えば、肝全体または肝臓の特定のセグメント、または肝臓内の特定のタイプの細胞、例えば、幹細胞など）に由来するものであり得る。一部の実施形態では、「対象に由来する試料」は、対象から取得した尿を指す。「対象に由来する試料」は、対象からの血液または血液由来の血清もしくは血漿を指すこともある。

【0182】

ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、対象内の細胞、例えば、ＳＴＡＴ６関連障害、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎などの呼吸器疾患を発症しやすいヒトなどの、例えば、哺乳動物などの細胞内のＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡｉ剤は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、長さが約１９～３０ヌクレオチド（例えば、長さが約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、または１９ヌクレオチド）である。

【0183】

ｉＲＮＡは、ＳＴＡＴ６遺伝子を発現する細胞と接触させると、ＳＴＡＴ６遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、またはラットのＳＴＡＴ６遺伝子）の発現を少なくとも約５０％阻害するが、これは例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）による方法によって、またはタンパク質による方法、例えば免疫蛍光法などによって、例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用して、検定した場合である。特定の実施形態では、発現の阻害は、その中に提供される適切な生物細胞株中で、例えば１０ｎＭの濃度でのｓｉＲＮＡを用いた、本明細書の実施例に提供されるｑＰＣＲ方法によって決定される。特定の実施形態では、インビボでの発現の阻害は、例えば、ＲＮＡ発現の最低値では３ｍｇ／ｋｇで、例えば、単回投与として投与した場合に、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類、例えば、ヒト標的遺伝子を発現するマウスまたはＡＡＶ感染マウスにおいて、ヒト遺伝子をノックダウンすることによって決定される。

【0184】

ｄｓＲＮＡは、二本のＲＮＡ鎖を含み、それらは、相補的であり、またｄｓＲＮＡが使用されることとなる条件下においてハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して、実質的に相補的であり、また概して完全に相補的である、相補性領域を含む。標的配列は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の際に形成されたｍＲＮＡの配列から得られ得る。もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的である領域を含むため、当該二本の鎖は、好適な条件下で組み合わされた場合に、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書の他の箇所で説明し、また当技術分野で公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上において相対するように、単一の核酸分子の自己相補的領域として含ませることもできる。

【0185】

概して、二重鎖構造は、１５～３０塩基対の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さである。特定の実施形態では、二重鎖構造は、１８～２５塩基対の長さ、例えば、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～２５、２３～２４または２４～２５塩基対の長さであり、例えば１９～２１塩基対の長さである。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。

【0186】

同様に、標的配列に対する相補性領域が、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長であり、例えば、１９～２３ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長である。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。

【0187】

一部の実施形態では、二重鎖構造は、長さが１９～３０塩基対である。同様に、標的配列に対する相補性領域は、長さが１９～３０ヌクレオチドである。

【0188】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、長さが約１９～約２３ヌクレオチド、または長さが約２５～約３０ヌクレオチドである。概して、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として機能するのに十分に長い。例えば、長さが約２１～２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒのための基質として機能することができることは、当技術分野において周知である。当業者も認識することとなるように、切断のために標的とされるＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より長いＲＮＡ分子、多くの場合ｍＲＮＡ分子の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ依存性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を経る切断）のための基質となることを可能にさせるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。

【0189】

当業者であれば、二重鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要な機能性部分、例えば、約１９～約３０塩基対、例えば、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の二重鎖領域であることを認識するであろう。すなわち、一実施形態では、切断のために所望のＲＮＡを標的とする、例えば、１５～３０塩基対の機能性二重鎖へとプロセシングされる限り、３０超の塩基対の二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に生じるｍｉＲＮＡではない。別の実施形態では、ＳＴＡＴ６遺伝子発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きなｄｓＲＮＡの切断により標的細胞中で生成されない。

【0190】

本明細書において記載するｄｓＲＮＡは、一つまたは複数の一本鎖のヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得、例えば１～４、２～４、１～３、２～３、１、２、３、または４ヌクレオチドである。少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端の相手方と比較して、優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどであるヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたは該類似体からなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらのいずれかの組み合わせ上にあり得る。その上、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖の５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。

【0191】

ｄｓＲＮＡは、当技術分野で公知の標準的な方法で合成することができる。本発明の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、二段階手法を使用して調製され得る。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別個に調製される。次いで、当該構成要素の鎖がアニーリングされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相の有機合成またはその両方を使用して調製することができる。有機合成は、非天然のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点を提供する。同様に、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相の有機合成またはその両方を使用して調製することができる。

【0192】

一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも二つのヌクレオチド配列、センス配列およびアンチセンス配列を含む。センス鎖は、表２～３のうちのいずれか一つに提供される配列群から選択され、またセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表２～３のうちのいずれか一つの配列群から選択される。この態様においては、二つの配列の一方は、二つの配列の他方に対して相補的であり、この場合、配列の一方は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の際に生じたｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的である。このように、この態様では、ｄｓＲＮＡは、二つのオリゴヌクレオチドを含むこととなるが、一つのオリゴヌクレオチドは、表２～３のいずれか一つにおいてセンス鎖として記載され、第二のオリゴヌクレオチドは、表２～３のいずれか一つにおいて該センス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。

【0193】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、それぞれのオリゴヌクレオチド上に含有される。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、一つのオリゴヌクレオチド上に含有される。

【0194】

一実施形態では、アンチセンス鎖は、表２～３のいずれか一つにおいて、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２、または３ヌクレオチド以下だけ異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続するヌクレオチドを含む。

【0195】

例えば表３の配列は、修飾された配列またはコンジュゲートされた配列として記述されていないが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば本発明のｄｓＲＮＡは、表２～３のいずれか一つに明記される配列のうちのいずれか一つを含み得、それらは、修飾されていない、コンジュゲートされていない、またはその中に記載されるものとは異なるように修飾もしくはコンジュゲートされたものである。言い換えれば、本発明は、本明細書に記載されるような、修飾されていない、コンジュゲートされていない、修飾された、またはコンジュゲートされた、表２～３のｄｓＲＮＡを包含する。

【0196】

当業者は、約２０から２３塩基対、例えば、２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を導入する際に特に有効であるとして歓迎されてきたことを十分に意識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ ２００１， ２０：６８７７－６８８８）。しかしながら、他の者らは、それよりも短いまたは長いＲＮＡ二重鎖構造も有効であり得ることを発見してきた（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ （２００７） ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上記において説明した実施形態においては、表２～３のいずれか一つに提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質を理由に、本明細書において記載するｄｓＲＮＡは、最小２１ヌクレオチドの長さの少なくとも一つの鎖を含むことができる。表２～３のいずれか一つの中の配列のいずれか一つを有するより短い二重鎖から、一方または両方の末端上の少数のヌクレオチドのみを差し引いたものが、上述したｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ると合理的に予想することができる。したがって、表２～３のいずれか一つの配列のいずれか一つから誘導され、かつＳＴＡＴ６遺伝子の発現を約５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下の阻害率で阻害する能力が全配列を含むｄｓＲＮＡとは異なっているものである、少なくとも１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが企図される。

【0197】

さらに、表２～３に提供されるＲＮＡが、ＲＩＳＣ介在性の切断に感受性であるＳＴＡＴ６転写物中の部位を特定する。このように、本発明はさらに、これら部位のうちの一つ内を標的とするｉＲＮＡを取り上げる。本明細書において使用する場合、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡがＲＮＡ転写物の特定の部位内のいずれかの場所で転写物の切断を促進するならば、該特定の部位内を標的としているといわれる。かかるｉＲＮＡは、概して、ＳＴＡＴ６遺伝子内の選択された配列に隣接する領域から取られた追加のヌクレオチド配列に結合した、表２～３のいずれか一つに提供される配列のいずれか一つからの少なくとも約１９の連続するヌクレオチドを含むこととなる。

【0198】

ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、未修飾であり、また例えば、当技術分野において公知で本明細書に記載の化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するように化学修飾される。本発明の特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的にすべてが修飾される。本発明の他の実施形態では、ｉＲＮＡのヌクレオチドの全て、またはｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾され、すなわち５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下の未修飾ヌクレオチドがｉＲＮＡの鎖内に存在する。

【0199】

本発明において取り上げる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法によって、例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡ、に記載された方法などによって合成または修飾することが可能であり、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。修飾としては、例えば末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆方向連結）または３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆方向連結など）や、塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくは伸長したレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）もしくはコンジュゲートされた塩基や、糖修飾（例えば、２’位または４’位における）もしくは糖の置換や、またはホスホジエステル連結の修飾もしくは置換をはじめとする骨格修飾が挙げられる。本明細書において記載する実施形態では有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、これに限定されないが、修飾骨格を含有する、または非天然のヌクレオシド間連結を含有するＲＮＡが挙げられる。修飾骨格を有するＲＮＡとしては、中でも、骨格内にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的上、時には当技術分野で言及されるように、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。一部の実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有することとなる。

【0200】

修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルのホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が連結された３’－５’と５’－３’または２’－５’と５’－２’であるものである反転した極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸の形態も挙げられる。本発明の一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、遊離酸形態である。本発明の他の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、塩形態である。一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、ナトリウム塩形態である。特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤がナトリウム塩形態である場合には、ナトリウムイオンが、薬剤中に存在するホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てに対する対イオンとして薬剤中に存在する。ホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結の実質的に全てがナトリウム対イオンを有する薬剤は、５、４、３、２または１以下の、ナトリウム対イオンを有さないホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤が、ナトリウム塩形態である場合は、ナトリウムイオンは、薬剤中に存在するホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の全てに対する対イオンとして薬剤中に存在する。

【0201】

上記リン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、第６，０２８，１８８号、第６，１２４，４４５号、第６，１６０，１０９号、第６，１６９，１７０号、第６，１７２，２０９号、第６，２３９，２６５号、第６，２７７，６０３号、第６，３２６，１９９号、第６，３４６，６１４号、第６，４４４，４２３号、第６，５３１，５９０号、第６，５３４，６３９号、第６，６０８，０３５号、第６，６８３，１６７号、第６，８５８，７１５号、第６，８６７，２９４号、第６，８７８，８０５号、第７，０１５，３１５号、第７，０４１，８１６号、第７，２７３，９３３号、第７，３２１，０２９号、および米国特許第ＲＥ３９４６４号が含まれ、それら各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0202】

骨格内にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結または一つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２の混合した構成要素部分を有する他のものが挙げられる。

【0203】

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が挙げられ、このそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0204】

ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間連結の両方が、すなわち、その骨格が、新規の基と置換されているものである本明細書で提供するｉＲＮＡにおいて使用するのに好適なＲＮＡ模倣体が考察される。この塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。ＲＮＡ模倣体が優れたハイブリダイゼーション特性を有するとわかっているものである一つのこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物においては、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格で、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基が、保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号および第５，７１９，２６２号が挙げられ、このそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明のｉＲＮＡにおける使用に好適であるさらなるＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７－１５００に記載されている。

【0205】

本発明で取り上げる一部の実施形態には、ホスホロチオエート骨格をもつＲＮＡおよびヘテロ原子骨格をもつオリゴヌクレオシドが挙げられ、特に上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の、－－ＣＨ_２－－ＮＨ－－ＣＨ_２－、－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_３）－－Ｏ－－ＣＨ_２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、－－ＣＨ_２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－、－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_３）－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－、および－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－ＣＨ_２－－、および上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格、が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書において取り上げるＲＮＡは、上記で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－ＯＣＨ２－として表され得る。

【0206】

修飾ＲＮＡはまた、一つまたは複数の置換された糖部分を含有し得る。本明細書において取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの一つを含み得る：ＯＨ、Ｆ、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルであって、式中アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換されたまたは非置換のＣ_１～Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］ _ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）．_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２） _ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２が挙げられ、式中、ｎおよびｍは、１～約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位において以下のうちの一つを含む：Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８：４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基、が挙げられる。別の例示的な修飾には、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下の実施例において記載されるような、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ_２－－Ｏ－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_３）_２がある。さらなる例示的な修飾としては、以下が挙げられる： ５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド、（これら三つのファミリー内のＲおよびＳ異性体の両方）、２’－アルコキシアルキル、および２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。

【0207】

他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ_３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’－５’連結ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においてもなされ得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノース糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許出願第４，９８１，９５７号、５，１１８，８００号、５，３１９，０８０号、５，３５９，０４４号、 ５，３９３，８７８号、５，４４６，１３７号、５，４６６，７８６号、５，５１４，７８５号、５，５１９，１３４号、５，５６７，８１１号、５，５７６，４２７号、５，５９１，７２２号、５，５９７，９０９号、５，６１０，３００号、５，６２７，０５３号、５，６３９，８７３号、５，６４６，２６５号、５，６５８，８７３号、５，６７０，６３３号、および５，７００，９２０号が挙げられるが、限定されるものではなく、これらの一部は本出願と共有されている。前述のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0208】

ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称することも多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書において使用する場合、「未修飾の（修飾されていない）」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が挙げられ、例えばデオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｉｍｉｄｉｎｅ）（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換のアデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換のウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（７－ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニン（３－ｄｅａｚａａｄｅｎｉｎｅ）などである。さらなる核酸塩基としては、米国特許第 ３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ． ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００８に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８－８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９－３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３に開示されるもの、が挙げられる。これら核酸塩基のうちの一部は、特に本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのに有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および０～６置換のプリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸の二重鎖安定性を０．６～１．２℃高めることがわかっており（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄｓ．， ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６－２７８）、そしてさらにより具体的には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、模範的な塩基置換である。

【0209】

上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちの特定のものの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されるものではないが、上記に記載の米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第５，７５０，６９２号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号、および第７，４９５，０８８号が挙げられ、そのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書において組み込まれる。

【0210】

一部の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤はまた、一つまたは複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、隣接するかまたは非隣接かにかかわらず、二つの炭素の架橋によって形成される環によって修飾されるフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、隣接するかまたは非隣接かにかかわらず糖環の二つの炭素原子を架橋して形成される環を含み、それによって二環式環系を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋が、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続するが、これは随意に２’－非環式酸素原子を介する。したがって、一部の実施形態では、本発明の剤は、一つまたは複数のロック核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロック核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する追加の架橋を含むものである、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’－ｅｎｄｏ構造立体配座内にリボースを効率的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロック核酸の付加により、血清中でのｓｉＲＮＡ安定性が増大し、オフターゲット効果が低減するとわかっている（Ｅｌｍｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７、Ｍｏｏｋ， ＯＲ． ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチドで使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、これに限定するものではないが、４’および２’のリボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤としては、４’から２’への架橋を含む一つまたは複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。

【0211】

ロックされたヌクレオシドは、この構造（立体化学は省略する）によって表すことができ、

【化1】

【0212】

式中、Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、Ｌは、リボース環の２’－炭素と４’－炭素とを結合する連結基である。かかる４’から２’の架橋された二環式ヌクレオシドの例としては、これに限定するものではないが、４’－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ_２）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’（「拘束されたエチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照）、４’－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照）、４’－ＣＨ_２－Ｎ（ＯＣＨ_３）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照）、４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号を参照）、４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’であって式中ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは窒素保護基（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照）、４’－ＣＨ_２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ２００９， ７４， １１８－１３４を参照）、および４’－ＣＨ_２－Ｃ（＝ＣＨ_２）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照）、が挙げられる。前述のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0213】

ロック核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開公報としては、これに限定されるものではないが、米国特許第６，２６８，４９０号、第６，５２５，１９１号、第６，６７０，４６１号、第６，７７０，７４８号、第６，７９４，４９９号、第６，９９８，４８４号、第７，０５３，２０７号、第７，０３４，１３３号、第７，０８４，１２５号、第７，３９９，８４５号、第７，４２７，６７２号、第７，５６９，６８６号、第７，７４１，４５７号、第８，０２２，１９３号、第８，０３０，４６７号、第８，２７８，４２５号、第８，２７８，４２６号、第８，２７８，２８３号、米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号が挙げられ、この各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0214】

例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースをはじめとする一つまたは複数の立体化学的な糖立体配座を有する前述の二環式ヌクレオシドのいずれもが、調製可能である（国際公開第９９／１４２２６号を参照）。

【0215】

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、一つまたは複数の拘束されたエチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書において使用される場合、「拘束されたエチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’架橋（すなわち、先述の構造におけるＬ）を含む二環式糖部分を含むロック核酸である。一実施形態では、拘束されたエチルヌクレオチドは、Ｓ立体配座であり、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と称する。

【0216】

本発明のｉＲＮＡはまた、一つまたは複数の「立体配座的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素およびＣ４’炭素を、またはリボースのＣ３炭素および－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配座にロックして、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増大する。リンカーは、酸素を安定性および親和性にとって最適な位置に配置するのに十分な長さのものであり、その結果、リボース環のパッカリングを少なくさせる。

【0217】

上記のＣＲＮのうちの特定のものの調製を教示する代表的な刊行物としては、これに限定されるものではないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号およびＰＣＴ公開公報である国際公開第２０１３／０３６８６８号が挙げられ、この各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0218】

一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロック核酸）ヌクレオチドである一つまたは複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロック非環式核酸であり、その糖の結合のいずれもが除去されていて、アンロック「糖」残基を形成しているものである。一実施例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーも包含する（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素との間の共有結合による炭素－酸素－炭素間結合）。別の実施例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素との間の共有結合による炭素－炭素間結合）が除去されている（Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒｉｅｓ， ５２， １３３－１３４ （２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｓｙｓｔ．， ２００９， １０， １０３９を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。

【0219】

ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国の刊行物として、これに限定されるものではないが、米国特許第８，３１４，２２７号、および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号、第２０１３／００１１９２２号、および第２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、この各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0220】

ＲＮＡ分子の末端に対する安定化修飾として可能性があるものとしては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’’－ホスフェート、逆位塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）およびその他などが挙げられ得る。この修飾の開示内容は、ＰＣＴ国際公開第２０１１／００５８６１号に見ることができる。

【0221】

本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾としては、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖上の５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体、が挙げられる。好適なホスフェート模倣体は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号に開示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0222】

Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤としては、例えば国際公開第２０１３／０７５０３５号において開示されるような化学修飾を有する剤が挙げられ、当該公報は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書および国際公開第２０１３／０７５０３５号において示されるように、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一修飾の一つまたは複数のモチーフが、特に切断部位またはその近傍において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に導入され得る。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、さもなくば完全に修飾され得る。これらモチーフの導入は、存在する場合にはセンス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンを中断する。ｄｓＲＮＡｉ剤は、随意に、例えばセンス鎖上の、親油性リガンドと、例えば、Ｃ１６リガンドとコンジュゲートし得る。ＲＮＡｉ剤は、随意に、例えばアンチセンス鎖の一つまたは複数の残基において、（Ｓ）－グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾で修飾され得る。得られたＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。

【0223】

したがって、本発明は、インビボで標的遺伝子（すなわち、ＳＴＡＴ６遺伝子）の発現を阻害可能な二本鎖ＲＮＡ剤を提供する。このＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、例えば、長さが１７～３０ヌクレオチド、長さが２５～３０ヌクレオチド、長さが２７～３０ヌクレオチド、長さが１９～２５ヌクレオチド、長さが１９～２３ヌクレオチド、長さが１９～２１ヌクレオチド、長さが２１～２５ヌクレオチド、または長さが２１～２３ヌクレオチドであり得る。

【0224】

センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、本明細書において「ｄｓＲＮＡｉ剤」とも称する二重鎖の二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ｄｓＲＮＡｉ剤の二重鎖領域は、例えば、長さが２７～３０ヌクレオチド対、長さが１９～２５ヌクレオチド対、長さが１９～２３ヌクレオチド対、長さが１９～２１ヌクレオチド対、長さが２１～２５ヌクレオチド対、または長さが２１～２３ヌクレオチド対とすることができる二重鎖領域であり得る。別の実施例では、二重鎖領域は、長さが１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７ヌクレオチドから選択される。

【0225】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、一方の鎖または両鎖の３’末端、５’末端または両末端において一つまたは複数のオーバーハング領域またはキャッピング基を含有し得る。オーバーハングは、独立的に、長さが１～６ヌクレオチド、例えば２～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さ、または１～２ヌクレオチドの長さであり得る。特定の実施形態では、オーバーハング領域は、上述のように、伸長したオーバーハング領域を含み得る。オーバーハングは、一方の鎖がもう一方よりも長い結果、または同一の長さの二本の鎖がねじれている結果であり得る。このオーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的とする遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。第一および第二の鎖を、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、連結することもできる。

【0226】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域内のヌクレオチドは、それぞれ独立して、例えば、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メチルの、チミジン（Ｔ）、２｀－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２｀－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２｀－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせを含む、２’－糖修飾を含むが、これに限定されない、修飾または未修飾のヌクレオチドであり得る。

【0227】

例えばＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。このオーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的とする遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。

【0228】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の５’－または３’－のオーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、二つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する二つのヌクレオチドを含有し、当該二つのヌクレオチドは、同一であり得るか、または異なり得る。一部の実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の３’末端に存在する。一部の実施形態では、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一部の実施形態では、この３’－オーバーハングは、センス鎖内に存在する。

【0229】

ｄｓＲＮＡｉ剤は、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、ＲＮＡｉの干渉活性を強化することができる単一のオーバーハングのみを含有し得る。例えば、一本鎖のオーバーハングは、センス鎖の３’末端に、あるいはアンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（すなわち、センス鎖の３’末端）に位置する、または逆も同じである、平滑末端を有し得る。概して、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、また５’末端は平滑である。理論に拘束されることを望むことなく、こうした非対称であるアンチセンス鎖の５’末端にある平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングであることが、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖挿入に好都合である。

【0230】

特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、長さが１９ヌクレオチドの二重平滑末端であるものであり、センス鎖が、５’末端から７、８、９位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。

【0231】

他の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、長さが２０ヌクレオチドの二重平滑末端であり、センス鎖は、５’末端から８、９、および１０位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。

【0232】

さらに他の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、長さが２１ヌクレオチドの二重平滑末端であり、センス鎖は、５’末端から９、１０、および１１位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。

【0233】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むものであり、センス鎖が、５’末端から９、１０、１１位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、アンチセンス鎖が、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑であり、もう一方の末端が２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。一部の実施形態では、２ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある。

【0234】

２ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合には、末端の三つのヌクレオチドの間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結があり得るものであり、該三つのヌクレオチドのうち二つが、オーバーハングヌクレオチドであり、三番目のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、さらに、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において末端の三つのヌクレオチドの間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する。特定の実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、各残基は独立的に、例えば、交互モチーフで、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾されている。随意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンド（親油性リガンド、随意にＣ１６リガンドなど）をさらに含む。

【0235】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むものであり、センス鎖が、長さが２５～３０ヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、第一の鎖の１位～２３位が、少なくとも８リボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、長さが３６～６６ヌクレオチド残基であり、また３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の１～２３位と対合した位置において少なくとも８リボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成するものであり、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、また最大６の連続する３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と対合せず、それによって１～６ヌクレオチドの３’単一鎖のオーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の５’末端が、センス鎖と対合しない１０～３０の連続するヌクレオチドを含み、それによって１０～３０ヌクレオチドの単一鎖の５’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性で整列する場合にアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによってセンス鎖およびアンチセンス鎖間の実質的に二本鎖の領域を形成し、またアンチセンス鎖が、アンチセンス鎖長の少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減させ、またセンス鎖が、三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有するものであり、モチーフのうちの少なくとも一つが、切断部位においてまたは切断部位の近傍で生じる。アンチセンス鎖は、切断部位においてまたはその近傍で三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。

【0236】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むものであり、該ｄｓＲＮＡｉ剤が、少なくとも２５ヌクレオチドであり最大でも２９ヌクレオチドである長さを有する第一の鎖、および５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフをもつ最大でも３０ヌクレオチドである長さを有する第二の鎖を含むものであり、第一の鎖の３’末端および第二の鎖の５’末端が平滑末端を形成し、また第二の鎖が、その３’末端において第一の鎖よりも長い１～４ヌクレオチドであるものであり、二重鎖領域が長さが少なくとも２５ヌクレオチドであり、第二の鎖が、第二の鎖の長さのうちの少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減するものであり、またｄｓＲＮＡｉ剤のＤｉｃｅｒ切断が、第二の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを結果として生じ、それによって哺乳類において標的遺伝子の発現が低減する。随意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。

【0237】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、該モチーフのうち一つは、センス鎖中の切断部位において生じる。

【0238】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はまた、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有することができるものであり、当該モチーフのうち一つが、アンチセンス鎖内の切断部位においてまたはその近傍で生じる。

【0239】

長さが１９～２３ヌクレオチドである二重鎖領域を有するｄｓＲＮＡｉ剤については、アンチセンス鎖の切断部位は通常、５’末端からおよそ１０、１１および１２位にある。したがって、三つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の、９、１０、１１位、１０、１１、１２位、１１、１２、１３位、１２、１３、１４位、または１３、１４、１５位において生じ得、これら数字はアンチセンス鎖の５’末端から一つ目のヌクレオチドから開始するか、またはこれら数字はアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の一つめの対合したヌクレオチドから開始する。アンチセンス鎖内の切断部位はまた、５’末端からのｄｓＲＮＡｉ剤の二重鎖領域の長さに応じて変わり得る。

【0240】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し得、またアンチセンス鎖は、鎖の切断部位においてまたはその近傍において三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の三つのヌクレオチドの一つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の三つのヌクレオチドの一つのモチーフが、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーラップを有するように、すなわち、センス鎖内のモチーフの三つのヌクレオチドの少なくとも一つが、アンチセンス鎖内のモチーフの三つのヌクレオチドの少なくとも一つと塩基対合を形成するように、整列され得る。あるいは、少なくとも二つのヌクレオチドが重複してもよく、または三つのヌクレオチドの全てが重複してもよい。

【0241】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の二つ以上のモチーフを含有し得る。第一のモチーフは、鎖の切断部位においてまたはその近傍に生じ得、またその他のモチーフが、ウイング修飾であり得る。本明細書において「ウイング修飾」という用語は、同一の鎖の切断部位においてまたはその近傍においてのモチーフから分離されている鎖の別の部分において生じるモチーフを指す。ウイング修飾は、第一のモチーフに隣接しているか、または少なくとも一つもしくは複数のヌクレオチドで分離されている。モチーフが互いにすぐ隣に隣接する場合には、モチーフの化学的性質は、互いに別個であり、またモチーフが一つまたは複数のヌクレオチドで分離されている場合には、その化学的性質は、同一であっても異なっていてもよい。二つ以上のウイング修飾が存在する場合もある。例えば、二つのウイング修飾が存在する場合には、各ウイング修飾は、切断部位またはその近傍において第一のモチーフに対して一方の末端において、またはリードモチーフのいずれかの側で生じ得る。

【0242】

センス鎖と同様に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の二つ以上のモチーフを含有する場合があり、該モチーフの少なくとも一つは鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在し得るウイング修飾と同様のアラインメント内に一つまたは複数のウイング修飾を含有し得る。

【0243】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端において最初の一つまたは二つの末端ヌクレオチドを含まない。

【0244】

他の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端において二重鎖領域内の最初の一つまたは二つの対合したヌクレオチドを含まない。

【0245】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも一つのウイング修飾を含有する場合には、ウイング修飾は、二重鎖領域の同一末端に入り得、また一つ、二つまたは三つのヌクレオチドの重複部分を有する。

【0246】

ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖が各々、少なくとも二つのウイング修飾を含有する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれの一本鎖からの二つの修飾が、一つ、二つまたは三つのヌクレオチドの重複部分を有する二重鎖領域の一方の末端に入り、それぞれの一本鎖からの二つの修飾が、一つ、二つまたは三つのヌクレオチドの重複部分を有する二重鎖領域のもう一方の末端に入り、それぞれの一本鎖からの二つの修飾が、二重鎖領域内の一つ、二つまたは三つのヌクレオチドの重複部分を有するリードモチーフの両側に入るように、整列され得る。

【0247】

一部の実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖内のどのヌクレオチドも、修飾され得る。各ヌクレオチドは、同一または異なる修飾で修飾され得、当該修飾としては、非連結ホスフェート酸素の一方もしくは両方の、または連結ホスフェート酸素の一つもしくは複数のうちの一つまたは複数の変更、リボース糖の構成成分の変更、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、ホスフェート部分の「脱リン酸化」リンカーでの大規模な置換、天然に存在する塩基の修飾または置換、およびリボースホスフェート骨格の置換または修飾が挙げられ得る。

【0248】

核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じ、例えば、塩基またはホスフェート部分、またはホスフェート部分の非連結のＯの修飾である。一部の場合では、修飾は、核酸中の対象位置の全てにおいて生じることとなるが、多くの場合、生じることとならない。例として、修飾は、３’末端または５’末端の位置においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内においてのみ生じ得、またはＲＮＡの一本鎖領域内においてのみ生じ得る。例えば、非連結性Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチド内において生じ得、または二本鎖内および一本鎖領域において、特に末端で、生じ得る。５’末端をリン酸化することが可能である。

【0249】

それにより、例えば、安定性を増強すること、オーバーハング内に特定の塩基を含めること、または一本鎖のオーバーハング内、例えば、５’オーバーハングもしくは３’オーバーハング内、または両オーバーハング内に、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング内にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。一部の実施形態では、３’オーバーハングまたは５’オーバーハング内の塩基の全てまたは一部が、例えば、本明細書において記載する修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾された、デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチルの使用、およびホスフェート基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾、を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。

【0250】

一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで独立的に修飾される。鎖は、二つ以上の修飾を含有し得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立的に修飾される。

【0251】

少なくとも二つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それら二つの修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾などであり得る。

【0252】

特定の実施形態では、Ｎ_ａまたはＮ_ｂは、交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」という用語は、本明細書で使用する場合、一つまたは複数の修飾を 有するモチーフを指し、各修飾が、一本鎖の交互ヌクレオチド上で生じる。交互ヌクレオチドとは、一つ置きのヌクレオチド毎に一つまたは三つのヌクレオチド毎に一つまたは類似のパターンを指し得る。例えばＡ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドに対する一タイプの修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。

【0253】

交互モチーフ内に含有されるこのタイプの修飾は、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチド上の一タイプの修飾を表す場合、交互パターン、すなわち、一つ置きのヌクレオチド上の修飾は、同一であり得るが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、例えば「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」、または「ＣＤＣＤＣＤ…」などの交互モチーフの内のいくつかの可能性のある修飾から選択され得る。

【0254】

一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対して相対的にシフトされているセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。当該移動は、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なるように修飾された基に対応するようになされたものであり得、逆もまた同様である。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖内のアンチセンス鎖と対合する場合、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へ「ＡＢＡＢＡＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の５’から３’へ「ＢＡＢＡＢＡ」で開始し得る。別の例として、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へ「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の５’から３’へ「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始し得、その結果、センス鎖およびアンチセンス鎖間の修飾パターンの完全なシフトまたは部分的なシフトが存在するようになる。

【0255】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンを含み、最初に、アンチセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンに対して相対的なシフトを有し、すなわち、センス鎖の塩基対上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、アンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含み、その逆もまた同様である。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾で開始し得、またアンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾で開始し得る。

【0256】

センス鎖またはアンチセンス鎖への三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つまたは複数のモチーフの導入は、センス鎖またはアンチセンス鎖内に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖またはアンチセンス鎖への三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つまたは複数のモチーフを導入することによるセンス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強し得る。

【0257】

一部の実施形態では、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾のモチーフが鎖のいずれかに導入される場合、該モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、そのモチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含有する配列の部分は、「…Ｎ_ａＹＹＹＮ_ｂ…」であり、ここで「Ｙ」は三個の連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、また「Ｎ_ａ」および「Ｎ_ｂ」は、Ｙの修飾とは異なるモチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドに対する修飾を表し、Ｎ_ａおよびＮ_ｂは同一または異なる修飾であり得る。あるいは、ウイング修飾が存在する場合、Ｎ_ａまたはＮ_ｂは存在してもよく、または存在しなくてもよい。

【0258】

ｉＲＮＡは、少なくとも一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置においてセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の任意のヌクレオチド上で生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上でも生じ得、各ヌヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じ得、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンで両方のヌクレオチド間連結修飾を含み得る。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一または異なり得、またセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対してシフトを有し得る。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端において二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結と、３’末端において二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結とを含み、またセンス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。

【0259】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、二つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を有する二つのヌクレオチドを含有し得る。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内の末端の対合したヌクレオチドと連結するようになされ得る。例えば、少なくとも２、３、４または全てのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結によって結合され得、随意に、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対合するヌクレオチドと結合するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結が存在し得る。例えば、三つのヌクレオチドの二つがオーバーハングヌクレオチドであり、三番目が、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである、末端の三つのヌクレオチド間に少なくとも二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し得る。これら末端の三つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、またはアンチセンス鎖の５’末端にあり得る。

【0260】

一部の実施形態では、２－ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の三つのヌクレオチド間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し、該三つのヌクレオチドの二つは、オーバーハングヌクレオチドであり、また三番目のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである。随意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、さらに、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において末端の三つのヌクレオチド間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有し得る。

【0261】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、標的との、二重鎖内のミスマッチまたはその組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域内または二重鎖領域内に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するそれらがもつ傾向に基づいて格付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づくものであり、最も単純なアプローチとしては、個々の対ごとに対を調べることであるが、次に、隣接するまたは同様の分析も使用可能である）。解離の促進の点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、またＩ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準の対合または標準以外の対合（本明細書において別の箇所に記載される）が、標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）の対合より好ましく、またユニバーサル塩基を含む対合が、標準の対合より好ましい。

【0262】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立的に選択されるアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４または５塩基対、および例えば、非標準の対合または標準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合であるミスマッチ対のうちの少なくとも一つを含み、二重鎖の５’末端においてアンチセンス鎖の解離を促進する。

【0263】

特定の実施形態では、アンチセンス鎖内の５’末端から二重鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴから選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２または３の塩基対のうち少なくとも一つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。

【0264】

他の実施形態では、センス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシチミジン（ｄＴ）であるか、またはアンチセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシチミジン（ｄＴ）である。例えば、デオキシチミンジンヌクレオチドの短い配列、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の３’末端上の二つのｄＴヌクレオチド、が存在する。

【0265】

特定の実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（Ｘ Ｘ Ｘ ）_ｉ－Ｎ_ｂ－Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎ_ｂ－（Ｚ Ｚ Ｚ ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’ （Ｉ）で表され得、
式中、
ｉおよびｊは各々独立的に、０または１であり、
ｐおよびｑは各々独立的に、０～６であり、
各Ｎ_ａは独立的に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すものであって、各配列は少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎ_ｂは独立的に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎ_ｐおよびｎ_ｑは独立的に、オーバーハングヌクレオチドを表すものであり、
式中、ＮｂおよびＹは、同一の修飾を有さず、ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは各々独立的に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。一部の実施形態では、ＹＹＹは、すべて２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。

【0266】

一部の実施形態では、Ｎ_ａまたはＮ_ｂは、交互パターンの修飾を含む。

【0267】

一部の実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じ得（例えば、６、７、８位、７、８、９位、８、９、１０位、９、１０、１１位、１０、１１、１２位、または１１、１２、１３位において生じ得る）、この数字は、５’末端から、第一のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始する。

【0268】

一実施形態では、ｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式、
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’ （Ｉｂ）、
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’ （Ｉｃ）、または
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’（Ｉｄ）で表され得る。

【0269】

センス鎖が式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは独立的に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0270】

センス鎖が式（Ｉｃ）で表される場合、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは独立的に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0271】

センス鎖が式（Ｉｄ）で表される場合、各Ｎ_ｂは独立的に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。一実施形態では、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎ_ａは独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0272】

Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。

【0273】

他の実施形態では、ｉは０であり、かつｊは０であり、またセンス鎖は、式
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－ Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’（Ｉａ）で表され得る。

【0274】

センス鎖が、式（Ｉａ）で表される場合、各Ｎ_ａは独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0275】

一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）
５’ ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｌ－Ｎ’_ａ－ｎ_ｐ’３’ （ＩＩ）で表され得、
式中、
ｋおよびｌは各々独立的に、０または１であり、
ｐ’およびｑ’は各々独立的に、０～６であり、
各Ｎ_ａ’は独立的に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すものであり、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎ_ｂ’は独立的に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎ_ｐ’およびｎ_ｑ’は独立的に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
式中、Ｎ_ｂ’およびＹ’は、同一の修飾を有さず、ならびに
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立的に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。

【0276】

一部の実施形態では、Ｎ_ａ’またはＮ_ｂ’は、交互パターンの修飾を含む。

【0277】

Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位、１０、１１、１２位、１１、１２、１３位、１２、１３、１４位、または１３、１４、１５位において生じ得、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始する。一部の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位において生じる。

【0278】

特定の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。

【0279】

特定の実施形態では、ｋは１であり、かつｌは０であるか、またはｋは０であり、かつｌは１であるか、またはｋおよびｌは両方とも１である。

【0280】

したがって、アンチセンス鎖は、以下の式
５’ ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｐ’ ３’ （ＩＩｂ）、
５’ ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎ_ｐ’ ３’ （ＩＩｃ）、または
５’ ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－ Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－ Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｐ’ ３’ （ＩＩｄ）で表され得る。

【0281】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）で表される場合、Ｎ_ｂ ^’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0282】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）で表される場合、Ｎ_ｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0283】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）で表される場合、各Ｎ_ｂ’は独立的に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。一部の実施形態では、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。

【0284】

他の実施形態では、ｋは０であり、かつｌは０であり、またアンチセンス鎖は、式
５’ ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－ Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’ ３’ （Ｉａ）で表され得る。

【0285】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）で表される場合、各Ｎ_ａ’は独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0286】

Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0287】

センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立的に、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシルまたは２’－フルオロで独立的に修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立的に修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表し得る。

【0288】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１ｎｔ（ヌクレオチド）である場合に鎖の９、１０および１１位において生じるＹＹＹモチーフを含有し得、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始し、またＹは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二重鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有し得、またＸＸＸおよびＺＺＺは各々独立的に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。

【0289】

一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位において生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有し得、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始し、またＹ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有し得、またＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立的に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。

【0290】

上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のいずれか一つで表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）のいずれか一つで表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。

【0291】

したがって、本発明の方法において使用するｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、各鎖は、１４～３０ヌクレオチドを有し、ｉＲＮＡ二重鎖は、以下の式（ＩＩＩ）
センス： ５’ ｎ_ｐ －Ｎ_ａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）_ｉ －Ｎ_ｂ－ Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎ_ｂ －（Ｚ Ｚ Ｚ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’
アンチセンス： ３’ ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ ^’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ ^’－ｎ_ｑ ^’ ５’
（ＩＩＩ）で表され、
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立的に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立的に、０～６であり、
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ ^’は独立的に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ ^’は独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
式中、各ｎ_ｐ’、ｎ_ｐ、ｎ_ｑ’およびｎ_ｑは、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立的に表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立的に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。

【0292】

一実施形態では、ｉは０であり、かつｊは０であり、またはｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊは両方とも０であり、またはｉおよびｊは両方とも１である。別の実施形態では、ｋは０であり、かつｌは０であり、またはｋは１であり、かつｌは０であり、ｋは０であり、かつｌは１であり、またはｋおよびｌは両方とも０であり、またはｋおよびｌは両方とも１である。

【0293】

ｉＲＮＡ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組み合わせとしては、以下の式が挙げられる：
５’ ｎ_ｐ － Ｎ_ａ －Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’
３’ ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ ^’ｎ_ｑ ^’ ５’
（ＩＩＩａ）
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎ_ｂ－Ｚ Ｚ Ｚ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’
３’ ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ ^’ｎ_ｑ ^’ ５’
（ＩＩＩｂ）
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－Ｘ Ｘ Ｘ－Ｎ_ｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’
３’ ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ ^’－ｎ_ｑ ^’ ５’
（ＩＩＩｃ）
５’ ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－Ｘ Ｘ Ｘ－Ｎ_ｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎ_ｂ－Ｚ Ｚ Ｚ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ３’
３’ ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ^’ ５’
（ＩＩＩｄ）。

【0294】

ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）で表される場合、各Ｎ_ａは独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0295】

ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）で表される場合、各Ｎ_ｂは独立的に、１～１０、１～７、１～５、または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0296】

ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）で表される場合、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ’は独立的に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0297】

ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ’は独立的に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ、Ｎ_ａ ^’は独立的に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎ_ａ、Ｎ_ａ’、Ｎ_ｂ、およびＮ_ｂ ^’の各々は独立的に、交互パターンの修飾を含む。

【0298】

式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）の中のＸ、Ｙ、およびＺの各々は、互いに同一であっても異なっていてもよい。

【0299】

ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、Ｙ’ヌクレオチドのうちの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、少なくとも二つのＹヌクレオチドが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、または三つのＹヌクレオチドすべてが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0300】

ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、Ｚ’ヌクレオチドのうちの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、少なくとも二つのＺヌクレオチドが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、または三つのＺヌクレオチドすべてが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0301】

ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、Ｘ’ヌクレオチドのうちの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも二つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、またはＸヌクレオチドのうちの三つすべてが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0302】

特定の実施形態では、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾とは異なるか、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾とは異なるか、またはＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾とは異なる。

【0303】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩｉｄ）で表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、またｎ_ｐ’＞０および少なくとも一つのｎ_ｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結する。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０および少なくとも一つのｎ_ｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結し、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカー（以下に記載する）を介して結合される一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０および少なくとも一つのｎ_ｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結し、センス鎖は、少なくとも一つのホスホロチオエート連結を含み、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して結合される一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。

【0304】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）で表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０および少なくとも一つのｎ_ｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結し、センス鎖は、少なくとも一つのホスホロチオエート連結を含み、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して結合される一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。

【0305】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される少なくとも二つの二重鎖を含有する多量体であり、該二重鎖は、リンカーで接続される。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二重鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。

【0306】

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される三、四、五、六、またはそれ以上の二重鎖を含有する多量体であり、該二重鎖は、リンカーで接続される。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二重鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。

【0307】

一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）のうちの少なくとも一で表される二つのｄｓＲＮＡｉ剤は、５’末端において、また３’末端の一方または両方において、互いに連結され、随意に、リガンドにコンジュゲートされる。当該剤は各々、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的とし得、または当該剤の各々が、二つの異なる標的部位において同一の遺伝子を標的にし得る。

【0308】

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含有する少数のヌクレオチド、例えば２’－フルオロ修飾を有する１０以下のヌクレオチド、を含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０のヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する１０ヌクレオチド、例えば、センス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する４ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する６ヌクレオチド、を含有する。別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する６ヌクレオチド、例えば、センス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する４ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する２ヌクレオチド、を含有する。

【0309】

他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含有する極めて少数のヌクレオチド、例えば、２’－フルオロ修飾を含有する２以下のヌクレオチド、を含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する２、１または０のヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する２ヌクレオチド、例えば、センス鎖内に２－フルオロ修飾を有する０ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する２ヌクレオチド、を含有し得る。

【0310】

種々の公開公報には、本発明の方法において使用され得る多量体ｉＲＮＡが記載されている。当該公開公報としては、国際公開第２００７／０９１２６９号、米国特許第７，８５８，７６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、国際公開第２００７／１１７６８６号、国際公開第２００９／０１４８８７号、および国際公開第２０１１／０３１５２０号が挙げられ、それら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0311】

特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、本明細書において記載するようなＲＮＡｉ剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾を含む。例示的な実施形態では、本開示の５’－ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドが、以下の構造を有し、

【化2】

式中、ＸはＯまたはＳであり、
Ｒは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、またはＣ_１～２０アルコキシ（例えば、メトキシまたはｎ－ヘキサデシルオキシ）であり、
Ｒ^５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２であり、またＣ５’炭素とＲ^５’との間の二重結合が、Ｅ配座またはＺ配座（例えば、Ｅ配座）であり、また
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、随意に、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。

【0312】

本開示のビニルホスホネートは、本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに結合し得る。特定の実施形態では、本開示のビニルホスホネートは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に、随意にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端において、結合する。

【0313】

ビニルホスホネート修飾もまた、本開示の組成物および方法として企図される。例示的なビニルホスホネート構造は、前述した構造を含み、式中、Ｒ５’は＝Ｃ（Ｈ）－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素およびＲ５’間の二重結合は、Ｅ配座またはＺ配座（例えば、Ｅ配座）である。

【0314】

以下により詳細に記載するように、ｉＲＮＡへの一つまたは複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含有するｉＲＮＡは、ｉＲＮＡの一つまたは複数の特性を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分は、ｉＲＮＡの修飾サブユニットに結合することとなる。例えば、ｉＲＮＡの一つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは、環式）の担体、で置換され得る。該サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドのサブユニットは、本明細書においては、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称する。環式担体は、環状炭素系であり得、すなわち、すべての環原子が炭素原子であるか、または複素環系であり得、すなわち、一つまたは複数の環原子が例えば、窒素、酸素、硫黄であるヘテロ原子であり得る。環式担体は、単環式環系であり得、または二つ以上の環、例えば、縮合環、を含有し得る。環式担体は、完全に飽和の環系であり得、または一つもしくは複数の二重結合を含有し得る。

【0315】

リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合し得る。該担体は、（ｉ）少なくとも一つの「骨格結合点」、例えば二つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも一つの「係留結合点」とを含む。「骨格結合点」とは、本明細書で使用する場合、例えば、ヒドロキシル基などの官能基を指し、または概して、リボ核酸の骨格、例えば、ホスフェート、もしくは例えば、硫黄含有などの修飾ホスフェートの骨格内に担体を組み込むために利用可能であり好適である結合を指す。一部の実施形態における「係留結合点」（ＴＡＰ）とは、選択された部分を接続する環式担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは別の）を指す。この部分は、例えば、炭水化物であり得、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり得る。随意に、選択部分は、介在する係留によって環式担体に接続される。したがって環式担体は、しばしば、例えば、アミノ基である官能基を含む、または概して結合であって、構成する環への、例えば、リガンドである別の化学的実体の組み込みもしくは係留に適している結合を提供することとなる。

【0316】

ｉＲＮＡは、担体を介してリガンドにコンジュゲートし得るものであり、該担体は、環式基または非環式基であり得る。一実施形態では、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択される。一実施形態では、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格である。

【0317】

ｉ．熱的不安定化修飾
特定の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域中に熱的不安定化修飾を組み込むことによって、ｄｓＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉のために最適化できる。本明細書で使用される場合、「シード領域」は、参照される鎖の５’末端の２～９位を意味する。例えば、熱的不安定化修飾をアンチセンス鎖のシード領域に組み込み、標的外遺伝子サイレンシングを低減または阻害することができる。

【0318】

「熱的不安定化修飾」という用語は、そうした修飾を有していないｄｓＲＮＡの融解温度（Ｔ_ｍ）よりも低い全体的な融解温度（Ｔ_ｍ）を有するｄｓＲＮＡをもたらすこととなる修飾を含む。例えば、熱的不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡのＴ_ｍを、例えば摂氏一度、二度、三度、または四度など、１～４℃だけ減少させることができる。また、「熱的不安定化ヌクレオチド」という用語は、一つまたは複数の熱的不安定化修飾を含有するヌクレオチドを指す。

【0319】

アンチセンス鎖の５’末端から数えて最初の９ヌクレオチドの位置内にある二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことを発見した。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチドの位置内に、二重鎖の少なくとも一つ（例えば、一、二、三、四、五またはそれより多い）の熱的不安定化修飾を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２～９位に、例えば４～８位に、位置する。一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７または８位に位置する。さらに一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５または９位に位置する。

【0320】

ｉＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４～４０ヌクレオチドを有する。ＲＮＡｉ剤は、以下の式（Ｌ）

【化3】

（Ｌ）
で表され得る。

【0321】

式（Ｌ）中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は各々独立的に、２’－Ｏ－アルキル、２’－置換アルコキシ、２’－置換アルキル、２’－ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含有するヌクレオチドである。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’－ＯＭｅ修飾を含有する。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を含有する。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’のうちの少なくとも一つは、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ、２’－Ｏ－ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｍｅ）Ｈ）修飾を含有する。

【0322】

Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域に対向する部位（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位）に配置された熱不安定化ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位におけるヌクレオチドと対合するセンス鎖の位置にある。一実施例では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端から１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、脱塩基修飾、二重鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および糖修飾、例えば２’－デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えばアンロック核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）など、を含み得る熱的不安定化修飾を保持する。一実施形態では、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖内の対向するヌクレオチドとのミスマッチ、ｉｉ）以下からなる群から選択される脱塩基修飾、

【化4】

、
および
ｉｉｉ）以下からなる群から選択される糖修飾であって、

【化5】

式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、Ｒ^１およびＲ^２は独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ_３、またはアルキルであり、およびＲ_３はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である。一実施形態では、Ｃ１における熱的不安定化修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり、随意に、ミスマッチ対内の少なくとも一つの核酸塩基が、２’－デオキシ核酸塩基である。一例では、Ｃ１における熱的不安定化修飾は、ＧＮＡまたは

【化6】

である。

【0323】

Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’はそれぞれ独立的に、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さと等しいかまたはそれ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的嵩高さは、修飾の立体効果の総和を指す。ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定する方法は、当業者に公知である。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位にあり得る、または非リボースヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、もしくはリボース糖の２’位と類似もしくは同等であるヌクレオチドの骨格に対する修飾であり得、そしてヌクレオチドに、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さを提供する。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立的に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’－Ｆ、および２’－Ｆ－５’－メチルから選択される。一実施形態では、Ｔ１はＤＮＡである。一実施形態では、Ｔ１’はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡである。一実施形態では、Ｔ２’はＤＮＡ、またはＲＮＡである。一実施形態では、Ｔ３’はＤＮＡ、またはＲＮＡである。

【0324】

ｎ^１、ｎ^３、およびｑ^１は独立的に、４～１５ヌクレオチドの長さである。

【0325】

ｎ^５、ｑ^３、およびｑ^７は独立的に、１～６ヌクレオチドの長さである。

【0326】

ｎ^４、ｑ^２、およびｑ^６は独立的に、１～３ヌクレオチドの長さであり、あるいはｎ^４は０ヌクレオチドの長さである。

【0327】

ｑ^５は独立的に、０～１０ヌクレオチドの長さである。

【0328】

ｎ^２、およびｑ^４は独立的に、０～３ヌクレオチドの長さである。

【0329】

あるいは、ｎ^４は、０～３ヌクレオチドの長さである。

【0330】

一実施形態では、ｎ^４は、０であり得る。一実施例では、ｎ^４は０であり、またｑ^２およびｑ^６は１である。別の例では、ｎ^４は０であり、またｑ^２およびｑ^６は１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数える）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数える）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。

【0331】

一実施形態では、ｎ^４、ｑ^２、およびｑ^６はそれぞれ１である。

【0332】

一実施形態では、ｎ^２、ｎ^４、ｑ^２、ｑ^４、およびｑ^６はそれぞれ１である。

【0333】

一実施形態では、Ｃ１は、センス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ^４が１であるとき、センス鎖の５’末端の１４～１７位にある。一実施形態では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。

【0334】

一実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位において開始する。一実施例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、またｑ^６が１に等しい。

【0335】

一実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位において開始する。一実施例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、またｑ^２が１に等しい。

【0336】

例示的な実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、またＴ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一実施例では、Ｔ３’はアンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、またｑ^６が１に等しく、またＴ１’はアンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始し、またｑ^２が１に等しい。

【0337】

一実施形態では、Ｔ１’およびＴ３’は、１１ヌクレオチドの長さ（すなわち、Ｔ１’およびＴ３’ヌクレオチドは数えない）だけ分離される。

【0338】

一実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一実施例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、またｑ^２が１に等しく、また非リボースの非環式または骨格における２’位にある修飾は、２’－ＯＭｅリボースよりも少ない立体的嵩高さである。

【0339】

一実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一実施例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、またｑ^６が１に等しく、また非リボースの非環式または骨格における２’位における修飾は、２’－ＯＭｅリボースよりも少ないまたは同等の立体的嵩高さである。

【0340】

一実施形態では、Ｔ１はセンス鎖の切断部位にある。一実施例では、Ｔ１は、センス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ^２が１であるとき、センス鎖の５’末端から１１位にある。例示的な実施形態では、Ｔ１は、センス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ^２が１であるとき、センス鎖の５’末端から１１位にあるセンス鎖の切断部位にある。

【0341】

一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６位において開始する。一実施例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にあり、またｑ^４が１である。

【0342】

例示的な実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にあり、例えばセンス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ^２が１のとき、センス鎖の５’末端から１１位にあり、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、またｑ^２が１に等しく、そしてＴ１’に対する修飾は、リボース糖の２’位、または２’－ＯＭｅリボースよりも立体的嵩高さが少ない非リボースの非環式または骨格内の位置にあり、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にあり、またｑ^４が１であり、ならびにＴ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、またｑ^６が１に等しく、またＴ３’に対する修飾は、２’位にあるか、または２’－ＯＭｅリボースよりも立体的嵩高さが少ない非リボースの非環式または骨格内の位置にある。

【0343】

一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位において開始する。一実施例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位において開始し、またｑ^４が２である。

【0344】

一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位において開始する。一実施例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位にあり、またｑ^４が１である。

【0345】

一実施形態では、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。

【0346】

一実施形態では、ｎ^４は０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。

【0347】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。

【0348】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。

【0349】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が６であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が７であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。

【0350】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が６であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が７であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。

【0351】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。

【0352】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。

【0353】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が５であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、随意に、これらはアンチセンス鎖の３’末端において少なくとも２のさらなるＴＴを伴う。

【0354】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が５であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、随意に、これらはアンチセンス鎖の３’末端において少なくとも２のさらなるＴＴを伴い、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。

【0355】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。

【0356】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。

【0357】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。

【0358】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。

【0359】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。

【0360】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、を伴う。

【0361】

ＲＮＡｉ剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端においてリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端ホスフェート（５’－Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’－ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’－ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭＭｅＰｈｏｓ）、または５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル（

【化7】

）であり得る。５’末端リン含有基が５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）である場合、５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ異性体（すなわち、トランス－ビニルホスホネート、

【化8】

）、５’－Ｚ－ＶＰ異性体（すなわち、シス－ビニルホスホネート、

【化9】

）、またはそれらの混合物のいずれかであり得る。

【0362】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端においてリン含有基を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端においてリン含有基を含む。

【0363】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－Ｐを含む。

【0364】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－ＰＳを含む。

【0365】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－ＶＰを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－Ｅ－ＶＰを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－Ｚ－ＶＰを含む。

【0366】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ_２を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－ＰＳ_２を含む。

【0367】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ_２を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルを含む。

【0368】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0369】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0370】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0371】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0372】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0373】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0374】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0375】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0376】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0377】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0378】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0379】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ｄｓＲＮＡ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0380】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0381】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0382】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0383】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0384】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0385】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0386】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0387】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0388】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0389】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0390】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0391】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ｄｓＲＮＡｉ ＲＮＡ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0392】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0393】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0394】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0395】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0396】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0397】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0398】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0399】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0400】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0401】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0402】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0403】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。

【0404】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。

【0405】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0406】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２も含む。

【0407】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。

【0408】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0409】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0410】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、および標的リガンドも含む。

【0411】

一実施形態では、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0412】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳ_２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0413】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0414】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0415】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0416】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0417】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳ_２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0418】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0419】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0420】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0421】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0422】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳ_２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0423】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ^４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0424】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0425】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0426】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0427】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ_２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－ＰＳ_２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0428】

一実施形態では、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ^１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ^２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ^３が７であり、ｎ^４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ^５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ^２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^３が４であり、ｑ^４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ^５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ^６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ^７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、また標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。

【0429】

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、および
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位から１１位、１３位、１７位、１９位、および２１位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、１４位から１６位、１８位、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端から数えて）、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、１９位、２１位および２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位から８位、１０位、１４位、１６位、１８位、２０位および２２位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ｄｓＲＮＡ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0430】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位から１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0431】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、１０位、および１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、７位および９位における２’－Ｆ修飾、および１１位におけるデオキシ－ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から数えて）、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位から６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）の ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0432】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、１０位、１２位、１４位、および１６位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位、９位、１１位、１３位、および１５位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位から４位、６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0433】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から９位、１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および１０位および１１位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0434】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位から１１位、および１３位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、および１４位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位から７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位から１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、８位、１０位、１４位、１６位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0435】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位、２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１５位、１７位、および１９位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および３位、５位、７位、９位から１１位、１３位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２５ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、４位、６位、７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、および１９位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、２位、３位、５位、８位、１０位、１４位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾、および２４位および２５位におけるデオキシ－ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において四つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0436】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、および１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位、および９位から１１位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位から５位、７位、８位、１０位から１３位、１５位、および１７位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0437】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、および１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位、および９位から１１位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位から５位、７位、１０位から１３位、１５位、および１７位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0438】

別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から４位、６位、および１０位から１９位における２’－ＯＭｅ修飾、および５位、および７位から９位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位から５位、７位、１０位から１３位、１５位、および１７位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの１９位と２０位の間、およびヌクレオチドの２０位および２１位の間（５’末端から数えて）の ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。

【0439】

特定の実施形態では、本発明の方法で使用するｉＲＮＡは、表２～３のいずれか一つから選択される剤から選択される剤である。これらの薬剤は、一つもしくは複数の親油性部分、一つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体、または一つもしくは複数の親油性部分と一つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体の両方などのリガンドをさらに含み得る。

【0440】

ＩＩＩ．リガンドにコンジュゲートしたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または例えば、細胞内への細胞取り込みを増強する一つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートと、ｉＲＮＡを化学的に連結することを含む。かかる部分としては、コレステロール部分などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６： ６５５３－６５５６）。他の実施形態では、リガンドは、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（ｂｅｒｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０：３０６－３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０：５３３－５３８）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１， １０：１１１１－１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム １，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８：３７７７－３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７：９２３－９３７）である。

【0441】

特定の実施形態では、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティング、または寿命を変化させる。一部の実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較した場合に、選択された標的に対する、例えば、分子、細胞または細胞型、例えば、細胞または臓器のコンパートメントなどのコンパートメント、組織、身体の器官または領域に対する、親和性の増強をもたらす。一部の実施形態では、リガンドは、二重鎖核酸における二重鎖対合には関与しない。

【0442】

リガンドとしては、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンまたはヒアルロン酸）、または脂質等を挙げることができる。リガンドはまた、組換え分子または合成分子、例えば合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（Ｌ－ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸（ｐｏｌｙ（２－ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ））、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。

【0443】

リガンドはまた、ターゲティング基、例えば、細胞または組織をターゲットとする剤、例えば、腎細胞など特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、または例えば、抗体などのタンパク質、を含み得る。ターゲティング基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース、例えば、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンである。

【0444】

リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）、サフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレンブタン酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。

【0445】

リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンド（ｃｏ－ｌｉｇａｎｄ）に対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、肝細胞などである特定の細胞型に結合する抗体、であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコース、が含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーターまたはＮＦ－κＢのアクチベーターであり得る。

【0446】

リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格系を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小線維または中間径線維を破壊することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大し得る物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ（ｓｗｉｎｈｏｌｉｄｅ Ａ）、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。

【0447】

一部の実施形態では、本明細書において記載するｉＲＮＡに結合するリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターとしては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的ＰＫモジュレーターとしては、これに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することがわかっており、したがって骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）を結合するアプタマーもまた、本明細書において記載する実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに適している。

【0448】

本発明のリガンドがコンジュゲートしたｉＲＮＡは、反応性官能性ペンダント側鎖を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成でき、例えば該ペンダント側鎖は該オリゴヌクレオチド（以下に記載される）上への連結分子の結合に由来するものなどである。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに結合する連結部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。

【0449】

本発明のコンジュゲートにおいて使用するオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に、ごく普通に作製できる。このような合成のための機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）社（カリフォルニア州、フォスターシティ）をはじめとするいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知であるこうした合成のための任意の他の方法を、追加的に、または代替として、使用してもよい。例えばホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などである、他のオリゴヌクレオチドを調製する同様の技術を使用することも知られている。

【0450】

本発明のリガンドがコンジュゲートしたｉＲＮＡおよびリガンド分子を保有する配列特異的な連結ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシドの前駆体を利用する好適なＤＮＡシンセサイザー、または連結部分を既に保有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に保有するリガンドヌクレオチドもしくはリガンドヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド保有構成単位上において組み立てられ得る。

【0451】

連結部分を既に保有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合には、典型的に、配列特異的に連結されるヌクレオシドの合成が完了してから、次いで、リガンド分子が連結部分と反応して、リガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販の、オリゴヌクレオチド合成でごく普通に使用する標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから誘導したホスホラミダイトを使用して、自動化シンセサイザーによって合成される。

【0452】

Ａ．脂質コンジュゲート
特定の実施形態では、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質系分子である。一実施形態では、このような脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を結合する。ＨＳＡ結合性リガンドは、身体の標的組織への、例えば、腎臓でない標的組織への、コンジュゲートの分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞を含めた肝臓であり得る。ＨＳＡを結合可能である他の分子もまた、リガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大できる、（ｂ）標的の細胞もしくは細胞膜内へのターゲティングもしくは輸送を増大できる、または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用できる。

【0453】

脂質系リガンドを使用して、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害する、例えば、制御することができる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、したがって身体から排除される可能性が低くなる。コンジュゲートが腎臓を標的とするように、あまり強力にＨＳＡに結合しない脂質または脂質系リガンドを使用することができる。

【0454】

特定の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡを結合する。一実施形態では、それはコンジュゲートが非腎臓組織に分布されることとなるように、十分な親和性でＨＳＡを結合する。しかしながら、この親和性は、ＨＳＡ－リガンド間結合を元に戻すことができないほど強力ではないことが好ましい。

【0455】

他の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡを弱く結合するか、または全く結合しない。一実施形態では、コンジュゲートは腎臓に分布される。脂質系リガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的とする他の部分も使用できる。

【0456】

別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる、例えば、ビタミンである部分である。これらは、例えば、悪性または非悪性種の、例えば、がん細胞の望まれない細胞増殖を特徴とする障害の治療に特に有用である。例示的ビタミンとしては、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。他の例示的ビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または肝細胞等の標的細胞によって取り込まれる他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。ＨＳＡおよび低比重リポタンパク（ＬＤＬ）もまた挙げられる。

【0457】

Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えばヘリックス細胞透過剤などである。一実施形態では、該細胞透過剤は、両親媒性である。例示的な細胞透過剤としては、例えばｔａｔまたはａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａなどのペプチドがある。該細胞透過剤がペプチドである場合、それは修飾可能であり、これにはペプチジル模倣体、逆位の異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチドまたはシュードペプチドの連結およびＤ－アミノ酸の使用が挙げられる。一部の実施形態では、ヘリックス剤は、親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス剤である。

【0458】

リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも称する）は、天然ペプチドと類似する規定された三次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長であり得、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長である。

【0459】

ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチドまたは架橋されたペプチドであり得る。別の選択肢としては、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドとしては、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１４）を有するＲＦＧＦがある。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）はまた、ターゲティング部分であり得る。ペプチド部分は「送達」ペプチドであり得、これはペプチド、オリゴヌクレオチド、および細胞膜横断タンパク質を含む大きな極性分子を担持することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１６））およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１７））よりの配列は、送達ペプチドとして機能する能力があることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得、例えばファージディスプレイライブラリーまたはｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：８２－８４， １９９１）から特定されるペプチドなどである。細胞ターゲティングの目的のために組み込まれた単量体ユニットを介してｄｓＲＮＡ剤に係留したペプチドまたはペプチド模倣体の例としては、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体がある。ペプチド部分は、長さが、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば安定性を増大させるまたは立体配座特性を司るなどの構造的な修飾を有し得る。以下に記載する構造的な修飾のいずれもが利用可能である。

【0460】

本発明の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状であっても環状であってもよく、また特定の組織へのターゲティングを促進するように修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化、されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチジオ模倣体（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）は、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、例えば、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦなどであるインテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用できる。

【0461】

「細胞透過ペプチド」は、細胞に、例えば、バクテリア細胞もしくは真菌細胞などである微生物細胞、または例えばヒト細胞などである哺乳類細胞に、透過可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））または一つもしくは二つの支配的なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとの融合ペプチドドメインに由来する、例えばＭＰＧなどである、二部分の両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２７１７－２７２４， ２００３）。

【0462】

Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、炭水化物をさらに含む。炭水化物をコンジュゲートしたｉＲＮＡは、本明細書に記載するように、核酸のインビボでの送達に有利であると同時にインビボでの治療的使用に適した組成物である。本明細書において使用する場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも６個の炭素原子を有する一つもしくは複数の単糖単位で構成されている炭水化物自体（直鎖状、分枝または環状であり得る）、またはその一部として、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々が少なくとも六個の炭素原子を有する一つまたは複数の単糖単位で構成されている炭水化物部分（直鎖状、分枝または環状であり得る）を有する化合物、のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖、および約４、５、６、７、８または９の単糖単位からなるオリゴ糖）ならびに多糖、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖類樹脂、が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５、および上記の（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）糖が挙げられ、二糖および三糖としては、二または三の単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）を有する糖が挙げられる。

【0463】

特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは、単糖である。

【0464】

特定の実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。一つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば米国特許第８，１０６，０２２号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡが特定の細胞を標的にするリガンドとして機能する。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝臓の細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして機能することによって、ｉＲＮＡが肝臓の細胞を標的にする。

【0465】

一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカーを介して、例えば、二価または三価の分枝リンカーを介して、結合させることができる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカーを介して、例えば、本明細書において記載するようなリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の３’末端に）コンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の５’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカーを介して、例えば、本明細書において記載するようなリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の５’末端に）コンジュゲートされる。

【0466】

本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明の他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、四価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。

【0467】

特定の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した一つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。特定の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の（例えば、２、３、４、５または６の）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、この各々は、独立して、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合する。

【0468】

一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立的に含み得る。このヘアピンループはまた、二重鎖のうち一方の鎖内の伸長したオーバーハングによって形成される場合もある。

【0469】

一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立的に含み得る。このヘアピンループはまた、二重鎖のうち一方の鎖内の伸長したオーバーハングによって形成される場合もある。

【0470】

一実施形態では、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される：

【化10】

式ＩＩ、

【化11】

式ＩＩＩ、

【化12】

式ＩＶ、

【化13】

式Ｖ、

【化14】

式ＶＩ、

【化15】

式ＶＩＩ、

【化16】

式ＶＩＩＩ、

【化17】

式ＩＸ、

【化18】

式Ｘ、

【化19】

式ＸＩ、

【化20】

式ＸＩＩ、

【化21】

式ＸＩＩＩ、

【化22】

式ＸＩＶ、

【化23】

式ＸＶ、

【化24】

式ＸＶＩ、

【化25】

式ＸＶＩＩ、

【化26】

式ＸＶＩＩＩ、

【化27】

式ＸＩＸ、

【化28】

式ＸＸ、

【化29】

式ＸＸＩ、

【化30】

式ＸＸＩＩ、

【化31】

式ＸＸＩＩＩ、

【化32】

、
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６であり（式ＸＸＩＶ）、

【化33】

、
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６であり（式ＸＸＶ）、

【化34】

式ＸＸＶＩ、

【化35】

、
式中、ＸはＯまたはＳであり（式ＸＸＶＩＩ）、

【化36】

式ＸＸＶＩＩ、式ＸＸＩＸ、

【化37】

式ＸＸＸ、式ＸＸＸＩ、

【化38】

式ＸＸＸＩＩ、式ＸＸＸＩＩＩ、

【化39】

式ＸＸＸＩＶ。

【0471】

別の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミンであり、例えば

【化40】

式ＩＩ、などである。

【0472】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図で示すようなリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに結合し、式中Ｘは、ＯまたはＳである。

【化41】

．

【0473】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１において規定され、以下に示す、Ｌ９６にコンジュゲートする：

【化42】

【0474】

本明細書において記載する実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、これに限定されないが、

【化43】

（式ＸＸＸＶＩ）、が挙げられ、ＸまたはＹのうち一方がオリゴヌクレオチドである場合は、もう一方が水素である。

【0475】

一部の実施形態では、適したリガンドは、国際公開第２０１９／０５５６３３号において開示されるリガンドであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、リガンドは、以下の構造を含む：

【化44】

【0476】

本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。

【0477】

一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した一つまたは複数のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃは、センス鎖またはアンチセンス鎖上のリンカーを介して任意のヌクレオチドに結合し得る。ＧａｌＮＡｃは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端に結合し得る。一実施形態では、ＧａｌＮＡｃは、例えば、三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端に結合する。

【0478】

他の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の（例えば、２、３、４、５または６の）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々が独立的に、複数のリンカー、例えば、一価リンカーを介して、二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合する。

【0479】

一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立的に含み得る。

【0480】

一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、これに限定されないがＰＫモジュレーターまたは細胞透過ペプチドなどである、上記のような一つまたは複数のさらなるリガンドをさらに含む。

【0481】

本発明において使用するのに適したさらなる炭水化物コンジュゲートおよびリンカーとしては、ＰＣＴ公開公報である国際公開第２０１４／１７９６２０号および国際公開第２０１４／１７９６２７号に記載されるものが挙げられ、当該公報は各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0482】

Ｄ．リンカー
一部の実施形態では、本明細書において記載するコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合させることができる。

【0483】

「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の二つの部分を接続する、例えば、化合物の二つの部分を共有結合で結合させる、有機部分を意味する。典型的には、リンカーは、直接結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨなどのユニット、または原子の鎖であって、例えばこれに限定されるものではないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）など、を含み、一つもしくは複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または置換もしくは非置換複素環によって中断または終結され得、式中、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族、または置換された脂肪族である。一実施形態では、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８、７～１７、８～１７、６～１６、７～１７、または８～１６原子である。

【0484】

切断可能な連結基とは、細胞の外部で十分に安定であるが、標的細胞内に入ると、切断されて、リンカーが一緒に保持している二つの部分を放出する基である。例示的な一実施形態では、切断可能な連結基は、対象の血液中で、または第二の参照条件下（例えば、血液または血清中で見られる条件を模倣または表すように選択され得る）においてよりも、標的細胞において、または第一の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る）で、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、またはそれ以上、または少なくとも１００倍速い速度で切断される。

【0485】

切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在、の影響を受け易い。概して切断剤は、血清または血液中においてよりも、細胞の内部で、より広範に広がっているかまたはより高いレベルもしくは活性で見られる。このような分解剤の例としては、特定の基質のために選択される、または基質特異性を有さない酸化還元剤、例えば還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解できる、細胞中に存在する、例えば、メルカプタンなどの酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤や、エステラーゼや、エンドソームまたは酸性環境を作出できる試薬、例えば、五以下のｐＨをもたらす試薬や、一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびホスファターゼとして作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解もしくは分解できる酵素が挙げられる。

【0486】

切断可能な連結基、例えばジスルフィド結合などは、ｐＨの影響を受け易い場合がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨであり、またリソソームは、およそ５．０のさらにより酸性のｐＨである。一部のリンカーは、選択されたｐＨで切断され、それによって細胞の内部でリガンドから、または細胞の所望のコンパートメント中に、カチオン性脂質を放出するものである、切断可能な連結基を有することとなる。

【0487】

リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的にする細胞に左右され得る。例えば、肝臓ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結できる。肝細胞は、エステラーゼが豊富であるため、リンカーは、肝細胞中では、エステラーゼが豊富でない細胞型においてよりも効率的に切断されることとなる。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。

【0488】

肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とする場合には、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。

【0489】

概して、候補の切断可能な連結基の適合性は、分解剤が候補連結基を切断する能力（または条件）を試験することによって評価可能である。また、血液中で、または他の非標的組織と接触したときに、切断に抵抗する能力について候補の切断可能な連結基を試験することもまた望ましいであろう。したがって、第一および第二の条件の間での切断に対する相対的な感受性を決定することができるものであり、ここで第一の条件は、標的細胞において切断を示すように選択され、第二の条件は、他の組織または生物学的流体中で、例えば、血液もしくは血清中で、切断を示すように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養液において、臓器または組織の培養液において、または動物全身において、実施され得る。無細胞条件または培養条件において最初の評価を行うことおよび動物全身におけるさらなる評価によって確認することが、有用であり得る。特定の実施形態では、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞中で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍速く切断される。

【0490】

ｉ．酸化還元切断可能な連結基
特定の実施形態では、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例としては、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）が挙げられる。候補の切断可能な連結基が、適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書において記載する方法に目を向けることができる。例えば、細胞中であって、例えば、標的細胞中で観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオスレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。ある条件においては、候補化合物は、血液中で最大約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速い速度で分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準酵素動態アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。

【0491】

ｉｉ．ホスフェート系の切断可能な連結基
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ホスフェート系の切断可能な連結基を含む。ホスフェート系の切断可能な連結基は、ホスフェート基を分解または加水分解する試薬により切断される。細胞中においてホスフェート基を切断する試薬の例としては、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系連結基の例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－があり、式中、Ｒｋはそれぞれの出現において、独立的に、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ１～Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、またはＣ７～Ｃ１２アラルキルであり得る。例示的な実施形態としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、および－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－が挙げられる。特定の実施形態では、ホスフェート系連結基は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。

【0492】

ｉｉｉ．酸切断可能な連結基

【0493】

他の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。特定の実施形態では、酸切断可能な連結基は、ｐＨが約６．５またはそれより低い（例えば、約６．０、５．５、５．０またはそれより低い）ものである酸性環境において、または一般酸として作用できる酵素などの試薬によって、切断される。細胞においては、特定の低ｐＨオルガネラ、例えばエンドソームおよびリソソームは、酸切断可能な連結基のための切断環境をもたらすことができる。酸切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。例示的な実施形態は、炭素がエステルの酸素に結合している場合（アルコキシ基）、アリール基、置換アルキル基、または第三級アルキル基、例えばジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。

【0494】

ｉｖ．エステル系連結基

【0495】

他の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステル系の切断可能な連結基を含む。エステル系の切断可能な連結基は、細胞中でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルの切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。

【0496】

ｖ．ペプチド系切断基

【0497】

さらに他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチド系の切断可能な連結基を含む。ペプチド系の切断可能な連結基は、細胞中でペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドが得られるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質が得られるアミド結合の特殊な型である。ペプチド系の切断基は、概して、アミノ酸の間で形成されてペプチドおよびタンパク質が得られるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定されて、すべてのアミド官能基を含むものではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有するものであり、式中、ＲＡおよびＲＢは、二つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。

【0498】

一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの限定されない例としては、これに限定されないが、

【化45】

（式ＸＸＸＶＩＩ）、

【化46】

（式ＸＸＸＶＩＩＩ）、

【化47】

（式ＸＸＸＩＸ）、

【化48】

（式ＸＬ）、

【化49】

（式ＸＬＩ）、

【化50】

（式ＸＬＩＩ）、

【化51】

（式ＸＬＩＩＩ）、および

【化52】

（式ＸＬＩＶ）が挙げられ、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、もう一方は、水素である。

【0499】

本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して結合した一つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。

【0500】

一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、以下の式（ＸＬＶ）～（ＸＬＶＩ）のいずれかに示す構造の群から選択される二価または三価の分枝リンカーにコンジュゲートされる：

【化53】

式ＸＸＸＸＶ、

【化54】

式ＸＬＶＩ、

【化55】

、
式ＸＬＶＩＩ、または

【化56】

式ＸＬＶＩＩＩ
であり、
式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、出現ごとに独立的に、０～２０を表し、また繰り返し単位は、同一である場合も、異なる場合もあり、
Ｐ^２Ａ、Ｐ^２Ｂ、Ｐ^３Ａ、Ｐ^３Ｂ、Ｐ^４Ａ、Ｐ^４Ｂ、Ｐ^５Ａ、Ｐ^５Ｂ、Ｐ^５Ｃ、Ｔ^２Ａ、Ｔ^２Ｂ、Ｔ^３Ａ、Ｔ^３Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^４Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^５Ｂ、Ｔ^５Ｃは、出現ごとに独立的に、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＮＨ、またはＣＨ_２Ｏであり、
Ｑ^２Ａ、Ｑ^２Ｂ、Ｑ^３Ａ、Ｑ^３Ｂ、Ｑ^４Ａ、Ｑ^４Ｂ、Ｑ^５Ａ、Ｑ^５Ｂ、Ｑ^５Ｃは、出現ごとに独立的に、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、式中一つまたは複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ^Ｎ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうち一つまたは複数によって中断または終結され得、
Ｒ^２Ａ、Ｒ^２Ｂ、Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ、Ｒ^４Ｂ、Ｒ^５Ａ、Ｒ^５Ｂ、Ｒ^５Ｃは、出現ごとにそれぞれ独立的に、存在しない、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒ^ａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒ^ａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、

【化57】

またはヘテロシクリルであり、
Ｌ^２Ａ、Ｌ^２Ｂ、Ｌ^３Ａ、Ｌ^３Ｂ、Ｌ^４Ａ、Ｌ^４Ｂ、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５Ｂ、およびＬ^５Ｃはリガンドを表し、すなわち、出現ごとにそれぞれ独立的に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖であり、またＲ^ａはＨまたはアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用であり、例えば以下の式（ＸＬＩＸ）のものなどであり、

【化58】

式ＸＬＩＸ、
式中、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５Ｂ、およびＬ^５Ｃは、単糖、例えばＧａｌＮＡｃ誘導体を表す。

【0501】

ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする二価および三価の分枝のリンカー基の例としては、これに限定されないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸおよびＸＩＩＩのような上記で列挙した構造が挙げられる。

【0502】

ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されるものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号、および第８，１０６，０２２号が挙げられ、この各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0503】

所与の化合物においてすべての位置について均一に修飾される必要はなく、実際には、先述の修飾のうち二つ以上を単一の化合物内に、またはさらにｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいて組み込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。

【0504】

本発明の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、二つ以上の化学的に区別される領域を含有する、例えばｄｓＲＮＡｉ剤などであるｉＲＮＡ化合物であり、そのそれぞれが少なくとも一つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合にはヌクレオチド、により構成される。これらｉＲＮＡは、典型的には、ＲＮＡが、ｉＲＮＡに対してヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取込みの増大、または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するように修飾される、少なくとも一つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡの複合型を切断可能である酵素のための基質として機能し得る。例として、リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、リボヌクレアーゼＨの活性化が、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果的に、これに匹敵する結果は、しばしば、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡを使用する場合により短いｉＲＮＡで得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、ごく普通に検出可能である。

【0505】

特定の例では、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンドの基によって修飾できる。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンドの分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされてきたので、当該コンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。こうした非リガンドの部分には、脂質部分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， ２００７， ３６５（１）：５４－６１、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １９９４， ４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（ｈｅｘｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０：３０６； Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０：５３３）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９１， １０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７：９２３）、が含まれてきた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記で列挙している。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の一つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次いで、アミノ基が、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用することによってコンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、ＲＮＡがまだ固体支持部に結合している状態で、または溶液相でＲＮＡが切断された後で実施可能である。典型的には、ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製によって、純粋なコンジュゲートが得られる。

【0506】

ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
本発明のｉＲＮＡの、細胞、例えば、ヒト対象などの対象内の細胞（例えば、それを必要とする対象、例えば、ＳＴＡＴ６関連障害、例えば、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎に感受性がある、またはそれと診断された対象など）への送達は、多くの異なる方法で達成され得る。例えば、送達は、細胞をインビトロまたはインビボのいずれかで本発明のｉＲＮＡと接触させることによって実施され得る。インビボでの送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ、を含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施され得る。あるいは、インビボでの送達は、ｉＲＮＡをコードしてその発現を誘導する一つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施し得る。これら選択肢は、下記においてさらに説明される。

【0507】

概して、核酸分子を送達（インビトロまたはインビボで）する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡで使用するのに適合させることができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ Ｓ． ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ． （１９９２） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号を参照されたく、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。インビボでの送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮するファクターとしては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的な影響の防止、および標的組織内での送達される分子の蓄積が挙げられる。ＲＮＡ干渉はまた、直接注射によるＣＮＳへの局所送達での成功もわかっている（Ｄｏｒｎ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９、Ｔａｎ， ＰＨ．， ｅｔ ａｌ （２００５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２：５９－６６、Ｍａｋｉｍｕｒａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ （２００２） ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３：１８、Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ， ＧＴ．， ｅｔ ａｌ （２００４） Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８、Ｔｈａｋｋｅｒ， ＥＲ．， ｅｔ ａｌ （２００４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０１：１７２７０－１７２７５、Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ （２００５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ． ９３：５９４－６０２）。ＲＮＡまたは医薬担体の修飾もまた、ｉＲＮＡの標的組織へのターゲティングを可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避させることができる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取込みを強化し、分解を防止するために、例えばコレステロールなどの親油性基への化学コンジュゲーションによって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートさせたＡｐｏＢへと誘導されるｉＲＮＡは、マウスに全身的に注射されたところ、結果として肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを生じた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ （２００４） Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。

【0508】

代替的な実施形態では、ｉＲＮＡは、例えばナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などである薬剤送達システムを使用して送達可能である。正に荷電したカチオン性の送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に荷電した）の結合を促進し、また負に荷電した細胞膜での相互作用も高め、それにより細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にもする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合することができるか、またはｉＲＮＡを封入するベシクルまたはミセルを形成するように誘導することができる（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ， ｅｔ ａｌ （２００８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照）。ベシクルまたはミセルの形成はさらに、全身投与したときのｉＲＮＡの分解を防止する。カチオン性のＲＮＡｉ複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， ＤＲ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６、Ｖｅｒｍａ， ＵＮ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９：１２９１－１３００、Ａｒｎｏｌｄ， ＡＳ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｊ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． ２５：１９７－２０５を参照のこと。これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ （Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， ＤＲ．， ｅｔ ａｌ （２００３）， ｓｕｐｒａ； Ｖｅｒｍａ， ＵＮ， ｅｔ ａｌ （２００３）， ｓｕｐｒａ）， “ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ” （Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， ＴＳ， ｅｔ ａｌ （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）， ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ （Ｃｈｉｅｎ， ＰＹ， ｅｔ ａｌ （２００５） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２：３２１－３２８； Ｐａｌ， Ａ， ｅｔ ａｌ （２００５） Ｉｎｔ Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２６：１０８７－１０９１）， ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ （Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ， ｅｔ ａｌ （２００８） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ； Ａｉｇｎｅｒ， Ａ． （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７１６５９）， Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ （ＲＧＤ） ｐｅｐｔｉｄｅｓ （Ｌｉｕ， Ｓ． （２００６） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ． ３：４７２－４８７）， ａｎｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅｓ （Ｔｏｍａｌｉａ， ＤＡ， ｅｔ ａｌ （２００７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ３５：６１－６７； Ｙｏｏ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １６：１７９９－１８０４）が挙げられる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。投与の方法およびｉＲＮＡとシクロデキストリンとによる医薬組成物は、米国特許第７，４２７，６０５号に見ることができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示の特定の態様は、細胞内においてＳＴＡＴ６遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞を本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることを含む方法に関する。一実施形態では、細胞は肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ）、任意で肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）である。一実施形態では、細胞は、肝外細胞（ｅｘｔｒａｈｅｐｔｉｃ ｃｅｌｌ）であり、随意に肺細胞である。

【0509】

一実施形態では、細胞は、呼吸系の器官または組織に存在し、気管支、細気管支、肺胞、鼻上皮および気道上皮を含む上皮、線毛上皮、および杯細胞、Ｉ型及びＩＩ型の両方の肺胞上皮細胞、マクロファージ、尿細管間質、マクロファージ、脂肪組織、例えば、縦隔脂肪組織、肺細胞、神経細胞、例えば、肺神経叢、クラブ細胞、クララ細胞、常在と一過性の両方の好中球、および口腔粘膜を含むが、これらに限定されない。

【0510】

特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、例えば、肝臓などの呼吸系の器官内に存在する一つまたは複数の組織または細胞型において取り込まれる。

【0511】

本開示の別の態様は、対象においてＳＴＡＴ６遺伝子の発現および／または活性化を低減させる方法であって、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与することを含む。

【0512】

本開示の別の態様は、ＳＴＡＴ６関連障害を有する対象またはＳＴＡＴ６関連障害を有するもしくは発症するリスクを有する対象を治療する方法に関連し、対象に本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤の治療有効量を投与し、それによって対象を治療することを含む。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６関連障害は、呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎である。

【0513】

一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下投与される。

【0514】

一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、肺系投与、例えば、鼻腔内投与、または経口吸入投与によって投与される。

【0515】

一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、鼻腔内投与される。

【0516】

肺系投与、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤の鼻腔内投与または経口吸入投与によって、本方法は、肺系組織、例えば、上咽頭組織、中咽頭組織、咽喉頭組織、喉頭組織、気管組織、気管分岐部組織、気管支組織、細気管支組織、または肺胞組織におけるＳＴＡＴ６標的遺伝子の発現を低減することができる。

【0517】

説明を簡単にするため、この項における製剤、組成物、および方法は、主として修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して述べる。しかしながら、これら製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、未修飾ｓｉＲＮＡ化合物で実施することができ、そして当該実施は、本開示の範囲内であることは理解され得る。ＲＮＡｉ剤を含む組成物は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路としては、肺系、静脈内、脳室内、局所、経直腸、経肛門、経膣、経鼻、および眼内が挙げられる。

【0518】

本開示のＲＮＡｉ剤は、投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。こうした組成物は、通常、一つまたは複数の種のＲＮＡｉ剤と薬学的に許容可能な担体とを含む。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」という語句は、医薬投与に適合性の、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除き、組成物におけるそれらの使用は意図される。補足的な有効成分もまた組成物に組み込まれ得る。

【0519】

本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、ならびに処置される面積に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、例えば、ネブライザーによる粉末またはエアロゾル剤の吸入または吹送による肺内、気管内、鼻腔内、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口、非経口であり得る。非経口投与は、点滴静注、皮下、腹腔内、もしくは筋肉注射、または髄腔内または脳室内の投与を含む。

【0520】

投与の経路および部位は、ターゲティングを増強するように選択され得る。例えば、筋肉細胞を標的とするため、目的の筋肉内への筋肉注射が、論理的な選択となるであろう。肺細胞は、粉末またはエアロゾル形態でのＲＮＡｉ剤の投与によって標的とすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをＲＮＡｉ剤でコーティングすること、およびＲＮＡを機械的に導入することによって標的とすることができる。

【0521】

肺系送達のための組成物は、例えば、鼻腔内または経口吸入投与のための水溶液、例えば、脂質（リポソーム、ニオソーム、マイクロエマルション、脂質ミセル、固体脂質ナノ粒子）またはポリマー（高分子ミセル、デンドリマー、高分子ナノ粒子、ノノゲル、ナノカプセル）から構成される好適な担体、例えば、経口吸入投与のためのアジュバントを含み得る。水性組成物は滅菌されてもよく、緩衝剤、希釈剤、吸収促進剤、および他の適切な添加剤を任意選択で含有してもよい。

【0522】

局所投与用製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、溶液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末、または油状の基剤、増粘剤なども必要であり得、または望ましくあり得る。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用であり得る。

【0523】

経口投与用組成物としては、散剤または顆粒剤、水中の懸濁剤または溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤または非水性媒体、タブレット剤、カプセル剤、ドロップ剤、またはトローチ剤を含む。錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩が挙げられる。錠剤中には、例えばデンプンなどの種々の崩壊剤、および例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどである潤滑剤が、通常使用される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。経口投与のために水性懸濁剤が必要な場合は、核酸組成物を、乳化剤および懸濁剤と組み合わせることができる。所望の場合、特定の甘味剤または風味剤を加えることができる。

【0524】

髄腔内または脳室内に投与されるための組成物は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌の水溶液を含み得る。

【0525】

非経口投与用の製剤は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌の水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えばリザーバに取り付けられた、脳室内カテーテル によって促進され得る。静脈内での使用の場合、溶質の総濃度は、調製物を等張にするように制御され得る。

【0526】

一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、組成物の投与は、非経口であり、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして、または拡散性注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡下、経直腸、経口、経膣、局所、肺系、鼻腔内、経尿道、または眼内である。投与は、対象自身によって、または他の者、例えば、医療提供者などによって提供され得る。医薬品は、測定された用量で、または計量された用量を送達するディスペンサーで、提供することができる。選択される送達形態は、以下においてより詳細に説明する。

【0527】

肺系投与
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、肺系投与される。肺系は、上肺系および下肺系を含む。上肺系は、鼻および咽頭を含む。咽頭は、鼻咽頭、中咽頭、および咽喉頭を含む。下肺系は、喉頭、気管、竜骨、気管支、細気管支、および肺胞を含む。

【0528】

肺系投与は、鼻腔内投与または経口吸入投与であってもよい。かかる投与は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の全身送達および局所送達の両方を可能にする。

【0529】

鼻腔内投与は、一度に数滴を塗布することによって、または霧化を介して、二本鎖ＲＮＡｉ剤をシリンジまたはスポイトで鼻腔内に滴下または注入することを含んでもよい。鼻腔内投与に好適な剤形としては、液滴、粉末、噴霧化したミスト、およびスプレーが挙げられる。鼻送達装置には、蒸気吸入器、点鼻薬、噴霧ボトル、定量噴霧ポンプ、ガス駆動噴霧アトマイザー、ネブライザー、機械粉末噴霧器、呼吸作動式吸入器、および送気装置が含まれるが、これらに限定されない。呼吸系の中、例えば肺の中により深く送達するための装置には、ネブライザー、加圧定量吸入器、乾燥粉末吸入器、および熱気化エアロゾル装置が含まれる。吸入による送達のための装置は、商業的サプライヤーから入手可能である。装置は、例えば、予防または治療する疾患または障害、送達する薬剤の体積、薬剤の送達頻度、および当技術分野における他の考慮事項に応じて、定量または可変用量、単回用量または複数回用量、使い捨てまたは再使用可能であり得る。

【0530】

経口吸入投与は、装置、例えば、受動的呼吸駆動または能動的動力駆動の単回／複数回用量乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）などを使用して、二本鎖ＲＮＡｉ剤を肺系に送達することを含み得る。経口吸入投与に適した剤形には、粉末および溶液が含まれる。経口吸入投与に適した装置には、ネブライザー、定量吸入器、および乾燥粉末吸入器が含まれる。乾燥粉末吸入器は、薬剤、特にタンパク質を肺に送達するために使用される最も一般的な装置である。例示的な市販の入手可能な乾燥粉末吸入器としては、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ（Ｆｉｓｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）およびＲｏｔａｈａｌｅｒ（ＧＳＫ， ＲＴＰ， ＮＣ）が挙げられる。いくつかのタイプのネブライザー、すなわちジェット式ネブライザー、超音波ネブライザー、振動メッシュネブライザーが利用可能である。ジェット式ネブライザーは、圧縮空気によって駆動される。超音波ネブライザーは、開放液体貯蔵部から液滴を作り出すために圧電変換器を使用する。振動メッシュネブライザーは、環状ピエゾ素子によって作動して共振曲げモードで振動する穿孔された膜を使用する。膜中の穴は、液体供給側に大きな断面サイズを、液滴が現れる側に狭い断面サイズを有する。治療用途に応じて、穴のサイズおよび穴の数を調整することができる。適切な装置の選択は、薬剤およびその製剤の性質、作用部位、および肺の病態生理などのパラメータに依存する。水性懸濁液および溶液は、効果的に噴霧される。機械的に生成された振動メッシュ技術に基づくエアロゾルも、タンパク質を肺に送達するために首尾よく使用されてきた。

【0531】

肺系投与のためのＲＮＡｉ剤の量は、一つの標的遺伝子から別の標的遺伝子で変動し得、ならびに適用されるべき適切な量は、標的遺伝子ごとに個別に決定しなければならない場合がある。典型的には、この量は、１０μｇから２ｍｇ、好ましくは５０μｇから１５００μｇ、より好ましくは１００μｇから１０００μｇの範囲である。

【0532】

本発明のｉＲＮＡをコードしたベクター
ＳＴＡＴ６遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＴＩＧ． （１９９６）， １２：５－１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ， ＡらによるＰＣＴ国際出願の公開公報である国際公開第００／２２１１３号、ＣｏｎｒａｄによるＰＣＴ国際出願の公開公報である国際公開第００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄによる米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に応じて、一過性的（数時間から数週間のオーダー）または持続的（数週間から数か月またはそれ以上）であり得る。これら導入遺伝子は、直鎖状の構築物、環状プラスミド、または統合ベクターもしくは非統合ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継代されることを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２：１２９２）。

【0533】

本明細書において記載する方法および組成物と共に用いることができるウイルスベクターシステムとしては、これらに限定されるものではないが、（ａ）アデノウィルスベクター、（ｂ）レトロウイルスベクター、例えばこれに限定されるものではないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）ポックスウイルスベクター、例えば、オルソポックスなどであり、例えば、ワクシニアウイルスベクターなど、またはトリポックスであり、例えば、カナリアポックスもしくは鶏痘など、ならびに（ｊ）ヘルパー依存性アデノウィルスまたはガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウィルスが挙げられる。複製欠損ウイルスもまた有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムの中に組み込まれるようになるかまたは組み込まれるようにならないであろう。当該構築物は、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含めることができる。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター内に、例えば、ＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクター内に、組み込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現のための構築物は、概して、標的細胞におけるｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素を、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを、必要とするであろう。ベクターおよび構築物を考慮する他の態様は、当技術分野で公知である。

【0534】

Ｖ．本発明の医薬組成物

【0535】

本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態では、本明細書において説明されるような、ｉＲＮＡを含有する医薬組成物と、薬学的に許容される担体とを本明細書において提供する。ｉＲＮＡを含む医薬組成物は、ＳＴＡＴ６関連障害、例えば、呼吸器疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎を有する対象を予防または治療するのに有用である。そのような医薬組成物は、送達の態様に基づいて製剤化される。一例は、鼻腔内投与または経口吸入投与、例えば、ネブライザーによるものを含む粉末またはエアロゾルの吸入または注入による肺系への直接送達、気管内または鼻腔内送達用に製剤化される組成物である。別の実施例は、非経口送達により、例えば皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、または静脈内（ＩＶ）の送達により、全身投与用に製剤化される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与され得る。

【0536】

一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、無菌である。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、発熱因子なしである。

【0537】

本発明の医薬組成物は、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与され得る。概して、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、概して１日当たり体重１キログラム当たり約１～５０ｍｇの範囲とすることとなる。典型的には、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることとなる。反復投与レジメンとしては、例えば毎月、３～６か月に一回、または一年に一回など、治療量のｉＲＮＡの定期的な投与を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、およそ一か月当たり一回～およそ六か月当たり一回で投与される。

【0538】

初回治療レジメンの後、治療は、少ない頻度で施与することができる。治療期間は、疾患の重症度に基づいて決定することができる。

【0539】

当業者は、例えばこれらに限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、過去の治療、対象の健康全般または年齢、および存在する他の疾患などである特定のファクターが、対象を効果的に治療するために必要な投薬量および投薬のタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。その上、治療有効量の組成物での対象の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。

【0540】

本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、および処置される面積に応じて、いくつかの方法で施与され得る。投与は、局所的（例えば、経皮パッチによる）、例えば、ネブライザーを含む、粉末またはエアロゾルの吸引または吹送などによる、鼻腔内投与または経口吸入投与による肺系投与、気管内、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内の注射または注入、例えば、植込みデバイスによって皮下への投与、または例えば、実質内、髄腔内、または脳室内の投与によって頭蓋内への投与を含む。

【0541】

ＲＮＡｉ剤は、特定の組織、例えば、肝臓、肺（例えば、細気管支、肺胞、または肺の気管支）、または肝臓と肺の両方などを標的とする方式で送達することができる。

【0542】

局所投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、溶液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、増粘剤などは、必要であり得るか、または望ましいものであり得る。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤としては、本開示で取り上げるＲＮＡｉ剤が、局所送達剤、例えば脂質、リポソーム、脂質酸、脂質酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤との混合物となっているものを含める。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本開示において取り上げるＲＮＡｉ剤は、リポソーム内においてカプセル化することができ、またはリポソームと、特にカチオン性リポソームと複合体を形成することができる。あるいは、ＲＮＡｉ剤は、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化することができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、これに限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ_１～２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0543】

Ａ．膜性分子アセンブリを含むＲＮＡｉ剤製剤
本開示の組成物および方法で使用するためのＲＮＡｉ剤は、膜性分子アセンブリでの、例えば、リポソームまたはミセルでの送達用に製剤化することができる。本明細書において使用する場合、「リポソーム」という用語は、少なくとも一つの二分子層、例えば、一つの二分子層または複数の二分子層内に整列した両親媒性脂質で構成されたベシクルを指す。リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性の内部とを有する単層膜および多重膜のベシクルを含む。水性部分が、ＲＮＡｉ剤組成物を含有する。親油性材料は、典型的にはＲＮＡｉ剤組成物を含まないが一部の実施例では含む場合もある水性の外側部分から、水性の内側部分を隔離する。リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に似ているため、リポソームが組織に適用されるとリポソーム二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進むにつれて、ＲＮＡｉ剤を含む内側水性部分の内容物は、細胞内へと送達されて、そこでＲＮＡｉ剤が、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、そしてＲＮＡｉを媒介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ＲＮＡｉ剤を特定の細胞種に誘導するために、特異的に標的とされる。

【0544】

ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製することができる。一実施例では、リポソームの脂質成分が界面活性剤に溶解され、それによって脂質成分でミセルが形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得、また非イオン性であり得る。例示的な界面活性剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ＲＮＡｉ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質上のカチオン性基が、ＲＮＡｉ剤と相互作用して、ＲＮＡｉ剤の周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、界面活性剤は、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物を得るために、例えば、透析などによって、除去される。

【0545】

必要であれば、凝集反応の際に、例えば、制御された添加によって、凝集を補助する担体化合物を加えることもできる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマーであり得る（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）。ｐＨはまた、縮重に都合よく調節可能である。

【0546】

送達ビヒクルの構造的な成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込んだ安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを産生する方法が、例えば、国際公開第９６／３７１９４号にさらに記載されて、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム形成はまた、Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、米国特許第４，８９７，３５５号、米国特許第５，１７１，６７８号、Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， （１９６５） Ｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３：２３８； Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９７９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ５５７：９； Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．， （１９７８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７５： ４１９４； Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７７５：１６９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７２８：３３９； および Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １１５：７５７、に記載される例示的な方法の一つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するための適切なサイズの脂質凝集体を調製するために通常使用される技術としては、超音波処理および凍結融解に加えて押出成形が挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８５８：１６１を参照されたい。一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が望ましいときには、顕微溶液化を使用することができる（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７７５：１６９。これら方法は、ＲＮＡｉ剤の調製物をリポソームに包含させるために容易に適合される。

【0547】

リポソームは、二つの広いクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正に帯電したリポソームであって、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成するリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合して、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中へと放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４７：９８０－９８５）。

【0548】

リポソームは、ｐＨ感受性であるかまたは負に帯電しており、それらとの複合体ではなく核酸を捕捉する。核酸および脂質の両方が、同様の電荷であるため、複合体形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、一部の核酸は、これらリポソームの水性内側部分内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を、培養液中の細胞単一層に送達するために、ｐＨ感応性リポソームが使用され てきた。外因性遺伝子の発現が、標的遺伝子内において検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １９：２６９－２７４）。

【0549】

リポソーム組成物の主要なタイプの一つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方で、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成され、例えば大豆製ＰＣおよび卵製ＰＣなどである。別のタイプは、リン脂質またはホスファチジルコリンまたはコレステロールの混合物から形成される。

【0550】

インビトロおよびインビボでリポソームを細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号、米国特許第５，１７１，６７８号、国際公開第９４／００５６９号、国際公開第９３／２４６４０号、国際公開第９１／１６０２４号、Ｆｅｌｇｎｅｒ， （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２５５０； Ｎａｂｅｌ， （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０：１１３０７； Ｎａｂｅｌ， （１９９２） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：６４９、Ｇｅｒｓｈｏｎ， （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２：７１４３、およびＳｔｒａｕｓｓ， （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １１：４１７が挙げられる。

【0551】

非イオン性リポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系は、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するためにも試験されてきた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮中にシクロスポリンＡを送達するために使用された。結果として、こうした非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリンＡの蓄積を促進する際に有効であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ．， ４（６）：４６６）。

【0552】

リポソームはまた、「立体的に安定化した」リポソームも含み、当該用語は、本明細書において使用する場合、一つまたは複数の特化された脂質を含むリポソームであって、リポソームに組み込まれた場合に、結果として当該特化された脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命の向上が生じるような一つまたは複数の特化された脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化したリポソームの例としては、リポソームのベシクル形成脂質部分が（Ａ）例えばモノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１などである一つまたは複数の糖脂質を含むか、または（Ｂ）例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などである一つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されている、リポソームである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームの場合、これら立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の向上は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少に由来するということが、当技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２２３：４２； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５３：３７６５）。

【0553】

一つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， （１９８７）， ５０７：６４）は、モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、硫酸ガラクトセレブロシド、およびホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を向上させる能力について報告した。これら知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， （１９８８）， ８５，：６９４９）によって解説された。いずれもＡｌｌｅｎらによる米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開第８８／０４９２４号では、（１）スフィンゴミエリンと（２）ガングリオシドＧ_Ｍ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）では、スフィンゴミエリンを含むリポソームについて開示している。１，２－ＳＮ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、国際公開第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）において開示されている。

【0554】

一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的には融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれるため、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するために使用することができる。

【0555】

リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性および生分解性であること、リポソームは広範囲の水および脂質溶解性薬物を組み込むことができること、リポソームはそれらの内部コンパートメント内のカプセル化されたＲＮＡｉ剤を代謝および分解から保護することができること、が挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，” Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な検討事項は、脂質表面の電荷、ベシクルのサイズ、およびリポソームの水の量である。

【0556】

正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、小リポソームを形成するために使用することができ、該小リポソームは、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合することができる脂質－核酸複合体を形成する核酸と自発的に相互作用して、結果としてＲＮＡｉ剤の送達がなされる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、ならびにＤＯＴＭＡの説明およびＤＮＡとのその使用については米国特許第４，８９７，３５５号を参照）。

【0557】

ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用することにより、ＤＮＡ複合体化ベシクルを形成することができる。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州） は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む、生組織培養細胞内へのアニオン性の核酸の高度な送達に有効な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームを使用すると、結果として得られる複合体上の正味電荷も正である。この方法において調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に結合し、原形質膜と融合して、機能的核酸を、例えば組織培養細胞内へと効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナポリス、インディアナ州）は、オレオイル部分が、エーテル連結ではなくエステルで連結している点がＤＯＴＭＡと異なる。

【0558】

他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、様々な部分にコンジュゲートしているものが挙げられ、例えば二つのタイプの脂質の一方にコンジュゲートしているカルボキシスペルミンなどが挙げられ、また例えば５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン ５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号）。

【0559】

別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム中へと製剤化されているコレステロールでの脂質の誘導体化（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）を含む（Ｇａｏ， Ｘ． ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｌ．， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １７９：２８０を参照）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに効果的であることが報告されている（Ｚｈｏｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０６５：８）。特定の細胞系の場合、コンジュゲートしたカチオン性脂質を含むこれらリポソームは、低い毒性を示すと言われており、またＤＯＴＭＡ含有組成物よりもより効率的なトランスフェクションをもたらす。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ社、ラホヤ、カリフォルニア州）およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．社、ゲイザースバーグ、メリーランド州）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号および国際公開第９６／３７１９４号に記載されている。

【0560】

リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に勝るいくつかの利点をもたらす。こうした利点としては、投与された薬物の高い体内吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増加、およびＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実践形態では、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を上皮細胞に送達するため、および真皮組織内、例えば、皮膚内へのＲＮＡｉ剤の浸透を増強するために、使用される。例えば、リポソームは、局所的に塗布することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所的な送達は、文献 に報告されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ｖｏｌ． ２，４０５－４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １８：２５９－２６５、Ｍａｎｎｉｎｏ， Ｒ． Ｊ． ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ， Ｓ．， （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０、Ｉｔａｎｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６、Ｎｉｃｏｌａｕ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １４９：１５７－１７６、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ， Ｒ． Ｍ． ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ， Ｄ． （１９８３） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１：５１２－５２７、Ｗａｎｇ， Ｃ． Ｙ． ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｌ．， （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５を参照）。

【0561】

非イオン性リポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系は、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するためにも試験されてきた。マウスの皮膚の真皮内に薬物を送達するために、Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０ －ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこうした製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。

【0562】

ＲＮＡｉ剤を含むリポソームは、非常に変形可能に作製することができる。こうした変形能は、リポソームがリポソームの平均半径より小さい孔を通って浸透することを可能にする。例えば、トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なタイプのリポソームである。トランスファーソームは、表面エッジ活性化剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常は界面活性剤、を標準のリポソーム組成物に加えることによって作製することができる。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、ＲＮＡｉ剤を皮膚のケラチン生成細胞に送達するために、感染によって、例えば皮下に送達することができる。脂質ベシクルは、インタクトな哺乳動物の皮膚を通過するために、好適な経皮勾配の影響下において、それぞれが５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。加えて、脂質特性に起因して、これらトランスファーソームは、自己最適性（例えば、皮膚などにおいて、孔の形状に順応性のある）で、自己修復性であり得、ならびに断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達することができ、また多くの場合、自己負荷性（ｓｅｌｆ－ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。

【0563】

本開示に適合する他の製剤は、ＰＣＴ公開公報である国際公開第２００８／０４２９７３号に記載されている。

【0564】

トランスファーソームは、さらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルの関心ある候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質滴であって、該脂質滴より小さい孔を通って容易に浸透することができるほど高度に変形可能である脂質滴として説明することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応可能であり、例えば、それらは、自己最適性（皮膚において孔の形状に順応性のある）で、自己修復性であり、断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達し、また多くの場合自己負荷性である。トランスファーソームを作製するために、表面エッジ活性化剤、通常は界面活性剤、を標準リポソーム組成物に加えることができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されてきた。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同じくらい有効であることが分かっている。

【0565】

界面活性剤は、本明細書において説明されるような製剤において、特にエマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームにおいて、広い応用が見出される。天然および合成の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および格付けする最もよくある手法としては、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を使用するものがある。親水性基（「頭」としても知られる）の性質が、製剤中で使用される様々な界面活性剤を分類するのに最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｐ． ２８５）。

【0566】

界面活性剤分子がイオン化されない場合、それらは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧製品において広い応用が見出され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステルが挙げられる。例えば脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコールおよびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどである非イオン性のアルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も普及した要素である。

【0567】

水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が負電荷を保持する場合、界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、例えばセッケンなどであるカルボン酸エステル、アシル乳酸エステル、アミノ酸のアシルアミド、例えばアルキル硫酸エステルおよびエトキシ化アルキル硫酸エステルなどである硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステルなどであるスルホン酸エステル、アシルイセチオン酸エステル、アシルタウリン酸塩、およびスルホコハク酸塩、およびリン酸塩が挙げられる。アニオン性剤のクラスの最も重要な要素は、アルキル硫酸エステルおよびセッケンである。

【0568】

水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が正電荷を保持する場合、界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される要素である。

【0569】

界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のどちらかを保持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。

【0570】

薬品、製剤、およびエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｐ． ２８５）。

【0571】

本開示の方法での使用のためのＲＮＡｉ剤は、ミセル製剤としても提供することができる。「ミセル」は、本明細書においては、分子の全ての疎水性部分が内側に向くように両親媒性分子が球状構造で整列され、それによって親水性部分が周囲の水相に接触したままになる、特定のタイプの分子アセンブリとして定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置で存在する。

【0572】

経皮的な膜を通る送達に好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液と、アルカリ金属のＣ_８～Ｃ_２２アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物とを混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリジサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン（ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ ｏｘｏ ｃｈｏｌａｎｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ）およびその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、デオキシコール酸塩、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属のアルキル硫酸塩と同時に加えてもよく、またはそれらを加えた後に加えてもよい。混合ミセルは、原材料の、実質的に任意の種類の混合によって形成されることとなるが、より小さいサイズのミセルを提供するために激しい混合によって形成されることとなる。

【0573】

一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と少なくともアルカリ金属のアルキル硫酸塩とを含む第一のミセル組成物が調製される。次いで、第一のミセル組成物を、少なくとも三種のミセル形成化合物と混合し、混合ミセル組成物を形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属のアルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物のうちの少なくとも一つとを混合して、その後に激しく混合しながら、残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。

【0574】

製剤を安定化させるため、および細菌増殖から保護するために、フェノールまたはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に加えてもよい。あるいは、フェノールまたはｍ－クレゾールを、ミセル形成原材料と共に加えてもよい。グリセリンなどの等張剤を、混合ミセル組成物の形成後に加えてもよい。

【0575】

ミセル製剤を噴霧剤として送達する場合には、当該製剤を、エアゾールディスペンサーに入れることができ、そしてディスペンサーには、噴射剤が装填される。噴射剤は、加圧されており、ディスペンサー中では液体状態である。原材料の比率は、水相および噴射剤の相が一つになるように、すなわち、一相で存在するように、調節される。二相で存在する場合には、例えば、計量弁などによって、内容物の一部を噴出する前に、ディスペンサーを振る必要がある。医薬品の分配用量が、微細な噴霧で計量弁から射出される。

【0576】

噴射剤は、含水素クロロフルオロカーボン、含水素フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを含み得る。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用され得る。

【0577】

必須の原材料の特定の濃度は、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔による吸収の場合には、注射でのまたは胃腸管経由の投与のための投与量を、例えば、少なくとも二倍または三倍に、増加させることが望ましいことが多い。

【0578】

脂質粒子
ＲＮＡｉ剤は、例えば、本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、ＬＮＰなどである脂質製剤において、または他の核酸－脂質粒子において、完全にカプセル化され得る。

【0579】

本明細書において使用される場合、「ＬＮＰ」という用語は、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＬＮＰは、静脈（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命の延長を呈し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）において蓄積するため、全身投与に極めて有用である。ＬＮＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含むものであり、それは国際公開第 ００／０３６８３号に記載されるようなカプセル化された縮合剤－核酸複合体を含む。本開示の粒子は、典型的には、平均粒径が約５０ ｎｍから約１５０ｎｍであり、より典型的には約６０ｎｍから約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ ｎｍから約１１０ｎｍであり、最も典型的には約７０ｎｍから約９０ｎｍであり、また実質的には無毒性である。加えて、核酸は、本開示の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を有する。核酸－脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号、および国際公開第９６／４０９６４号において開示されている。

【0580】

一実施形態では、薬物に対する脂質の比（質量／質量比）（例えば、ｄｓＲＮＡに対する脂質の比）は、約１：１から約５０：１、約１：１から約２５：１、約３：１から約１５：１、約４：１から約１０：１、約５：１から約９：１、または約６：１から約９：１の範囲とすることとなる。上記に列記した範囲の中間にある範囲も、本開示の一部であることが企図される。

【0581】

ＲＮＡｉ剤の送達用のある特定のＬＮＰ製剤は、当技術分野において記述されてきたものであり、例えば、国際公開第２００８／０４２９７３号において説明されるような例えば、「ＬＮＰ０１」製剤が挙げられ、当該公開公報は参照により本明細書に組み込まれる。

【0582】

さらなる例示的な脂質－ｄｓＲＮＡ製剤を、下記の表で特定している。

【表1-1】

【表1-2】

ＤＳＰＣ： ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ： ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ－ＤＭＧ： ＰＥＧ－ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１４）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ＤＳＧ： ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール（Ｃ１８－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１８）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１，２－ジミリスチルオキシプロピルアミン（平均分子量２０００のＰＥＧ）

【0583】

製剤を含むＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））は、国際公開第２００９／１２７０６０号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0584】

製剤を含むＸＴＣは、国際公開第２０１０／０８８５３７号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0585】

製剤を含むＭＣ３は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0586】

製剤を含むＡＬＮＹ－１００は、国際公開第２０１０／０５４４０６号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0587】

製剤を含むＣ１２－２００は、国際公開第２０１０／１２９７０９号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0588】

経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁剤または溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は、望ましい場合がある。一部の実施形態では、経口製剤は、本開示において取り上げるｄｓＲＮＡが一つまたは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と共に投与される製剤である。好適な界面活性剤としては、脂肪酸またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態では、浸透促進剤の組合せが用いられ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩である。例示的な組み合わせの一つには、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩がある。さらに、浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示において取り上げるｄｓＲＮＡは、噴霧された乾燥粒子などの粒状形態で、経口で送達することができ、またはマイクロ粒子またはナノ粒子を形成するために複合体化することができる。ｄｓＲＮＡ複合体化薬剤としては、ポリ－アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン、ポリアルキルシアノアクリレート、ＤＥＡＥ誘導ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。好適な複合体化薬剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミン、およびＤＥＡＥデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびその調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３／００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号において詳細に記載されており、それぞれは参照により本明細書に組み込まれる。

【0589】

肺系送達のための組成物は、例えば、鼻腔内または経口吸入投与のための水溶液、例えば、脂質（リポソーム、ニオソーム、マイクロエマルション、脂質ミセル、固体脂質ナノ粒子）またはポリマー（高分子ミセル、デンドリマー、高分子ナノ粒子、ノノゲル、ナノカプセル）から構成される好適な担体、例えば、経口吸入投与のためのアジュバントを含み得る。水性組成物は滅菌されてもよく、緩衝剤、希釈剤、吸収促進剤、および他の適切な添加剤を任意選択で含有してもよい。

【0590】

非経口、実質内（脳内へ）、髄腔内、脳室内、または肝内への投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤、例えばこれらに限定されるものではないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などを含むことができる滅菌水溶液を含むことができる。

【0591】

本開示の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、溶液、エマルション、およびリポソームを含有する製剤を含む。これら組成物は、予め形成した液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含めるがこれらに限定されない様々な構成要素から生成することができる。特に好ましいのは、ＡＰＰ関連疾患または障害を処置する場合において脳を標的化する製剤である。

【0592】

本開示の医薬製剤は、単位剤形において簡便にもたらされ得、製薬産業において周知の従来技術に従って調製することができる。こうした技術としては、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程を含む。概して、製剤は、活性成分を液体担体または微粉化された固体担体またはその両方と均一にかつ密接に混合し、次いで、必要であれば、生成 物を成形することによって調製される。

【0593】

本開示の組成物は、例えば、これらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、坐剤、および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化することができる。本開示の組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質を、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどをさらに含有することができる。懸濁液はまた、安定剤を含有し得る。

【0594】

さらなる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製および製剤化することができる。エマルションは、典型的には、一方の液体が、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態でのもう一方の液体中に分散した不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９、Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ． ３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ． ３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに密に混合し分散した二つの不混和性液相を含む二相系である。概して、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかのものであり得る。水相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の油相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと呼ぶ。あるいは、油相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の水相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ぶ。エマルションは、分散相と、水相、油相、または別個の相としてのそれ自体のいずれかの中に溶液として存在し得る活性薬物とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの医薬賦形剤も、必要に応じてエマルション中に存在していてもよい。医薬エマルションは、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合などで、二相以上で構成される多相エマルションでもあってもよい。こうした複合剤形によれば、多くの場合、単純な二相エマルションでは与えられない一定の利点がもたらされる。ｗ／ｏ／ｗエマルションは、ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小水滴を封入する多相エマルションにより構成される。同様に、ｏ／ｗ／ｏエマルションは、連続油相中で安定化した水の小滴中に封入された油滴の系によりもたらされる。

【0595】

エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことが特徴である。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相中に良好に分散しており、乳化剤または製剤の粘度によってこの形態で維持される。エマルションを安定化させる他の手段としては、該エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、以下の四つのカテゴリ、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体、に大きく分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９を参照）。

【0596】

表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの剤形において広い適用可能性が見出されており、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９を参照）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であるので、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と命名されており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて以下の異なるクラス、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５を参照）。

【0597】

非常に多様な非乳化材料もまた、エマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。

【0598】

皮膚、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９を参照）。

【0599】

ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の、光学的等方性で熱力学的に安定した液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として規定され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、はじめに油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで十分な量の第四の成分、概して中鎖のアルコール、を加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化される、二つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に透明な分散液として説明されてもいる（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ， ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｅｄ．， １９８９， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。

【0600】

ｉｉｉ．マイクロ粒子
本発明のｉＲＮＡは、粒子、例えば微粒子、に組み込まれてもよい。マイクロ粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせなどの他の方法によっても製造され得る。

【0601】

ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、核酸の、特にｉＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を有効にするために、様々な浸透促進剤を採用する。大部分の薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断しようとする膜が、浸透促進剤で処理されていれば、非親油性薬剤であっても細胞膜を横断することができることが分かっている。浸透促進剤はまた、非親油性薬剤が細胞膜を横断して拡散するのを補助することに加えて、親油性薬剤の透過性も高める。

【0602】

浸透促進剤は、五つの広いカテゴリ、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤、のうちのひとつに属するものとして分類することができる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ， Ｍ． Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２を参照）。上述の浸透促進剤の分類の各々、および医薬組成物の製造および医薬品の送達におけるそれらの使用は、当技術分野で周知である。

【0603】

ｖ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、一つまたは複数の核酸を動物に送達する、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、核酸および所定の医薬組成物を他の成分と併用される場合に、所望の体積、稠度などをもたらするように計画された投与の様式を念頭において選択される。こうした薬剤は、当技術分野で周知である。

【0604】

ｖｉ．他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中で従来見られた他の補助成分を、その技術分野で確立されたそれらの使用レベルにおいて追加的に含有することができる。したがって、例えば、組成物は、追加的な、適合性の、薬学的に活性な材料、例えば止痒剤、収れん剤、局部麻酔剤、もしくは抗炎症剤などを含有することができ、または本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加的な材料、例えば色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などを含有することができる。ただし、こうした材料は、添加したときに、本発明の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌され、また所望により、例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤、または芳香物質などである、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤と混合してもよい。

【0605】

水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含有することができる。懸濁液はまた、安定剤を含有し得る。

【0606】

一部の実施形態では、本発明において取り上げる医薬組成物は、（ａ）一または複数のｉＲＮＡ、および（ｂ）非ｉＲＮＡの機序によって機能し、ＳＴＡＴ６関連障害を治療する際に有用である、一つまたは複数の薬剤を含む。こうした薬剤の例には、抗炎症剤（例えば、全身性コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、抗コリン剤、β２アドレナリン受容体アゴニスト、抗感染剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス剤）、抗ヒスタミン薬、免疫調節因子（例えば、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロホスファミド）、ホスホジエステラーゼ－５阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ニンテダニブ）、抗線維化剤（例えば、ピルフェニドン）、および前述のいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0607】

こうした化合物の毒性および予防効果は、例えばＬＤ５０（集団のうちの５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において予防的に有効な用量）を判定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。

【0608】

細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトにおける使用のための範囲の投与量を製剤化する際に使用することができる。本発明における本明細書において取り上げる組成物の投与量は、概して、わずかな毒性であるかまたは毒性が全くない、例えばＥＤ８０またはＥＤ９０などであるＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いる剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明において取り上げる方法で使用される任意の化合物に関して、最初に、細胞培養アッセイから予防的に有効な用量を見積もることができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）またはより高い阻害レベルを含む、化合物の、または適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度の範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する）ように、用量を動物モデルにおいて計画することができる。こうした情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。

【0609】

それらの投与に加えて、上述したように、本発明において取り上げるｉＲＮＡは、ＳＴＡＴ６関連障害、例えば、原発性高シュウ酸尿症の予防または治療に使用される他の公知の薬剤と併用して投与することができる。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書で記載した、有効性の標準的尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。

【0610】

ＶＩ．ＳＴＡＴ６発現を阻害する方法
本発明はまた、細胞内でＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞を、細胞内でＳＴＡＴ６の発現を阻害するのに有効である量のＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡ剤と接触させ、それによって細胞におけるＳＴＡＴ６の発現を阻害することを含む。本開示の特定の実施形態では、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子の発現は、肺系（例えば、肺、気管支、肺胞）細胞において優先的に阻害される。本開示の他の実施形態では、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現は肝臓（例えば、肝細胞）で優先的に阻害される。本開示の特定の実施形態では、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現は、肺系（例えば、肺、気管支、肺胞）細胞および肝臓（例えば、肝細胞）細胞において阻害される。

【0611】

細胞の、ｉＲＮＡとの、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤との接触は、インビトロまたはインビボで行うことができる。細胞をインビボでｉＲＮＡ剤と接触させることは、対象内の、例えば、ヒト対象内の細胞または細胞の群をｉＲＮＡと接触させることを含む。インビトロおよびインビボで細胞を接触させる方法を組み合せることも可能である。細胞を接触させることは、上記に記載したように直接的であっても間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させることは、本明細書に記載する、または当技術分野で公知の任意のリガンドをはじめとするターゲティングリガンドを介して達成できる。一部の実施形態では、標的リガンドは、親油性部分、例えばＣ１６、および／もしくは炭水化物部分、例えばＧａｌＮＡｃ_３リガンドであるか、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位に向ける任意の他のリガンドである。特定の実施形態では、リガンドはコレステロール部分ではない。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的リガンドを含まない。

【0612】

「阻害すること」という用語は、本明細書で使用する場合、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」および他の同様の用語と区別なく使用され、いずれかのレベルの阻害を含む。

【0613】

「ＳＴＡＴ６の発現を阻害すること」という語句は、任意のＳＴＡＴ６遺伝子（例えば、マウスＳＴＡＴ６遺伝子、ラットＳＴＡＴ６遺伝子、サルＳＴＡＴ６遺伝子、またはヒトＳＴＡＴ６遺伝子）、ならびにＳＴＡＴ６遺伝子のバリアントまたは変異体の発現の阻害を指すことが意図されている。したがって、ＳＴＡＴ６遺伝子は、遺伝子操作された細胞、細胞の群または生物の文脈で、野生型ＳＴＡＴ６遺伝子、変異ＳＴＡＴ６遺伝子、または遺伝子導入ＳＴＡＴ６遺伝子であり得る。

【0614】

「ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害すること」は、任意のレベルでのＳＴＡＴ６遺伝子の阻害、例えばＳＴＡＴ６遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制を含む。ＳＴＡＴ６遺伝子の発現は、ＳＴＡＴ６遺伝子発現と関連する任意の変数、例えばＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡレベルもしくはＳＴＡＴ６タンパク質レベルなどの、レベル、またはレベルの変化に基づいて評価され得る。

【0615】

阻害は、対照レベルと比較した、ＳＴＡＴ６発現と関連する一つ以上の変数の絶対レベルまたは相対レベルの低下によって評価され得る。対照レベルは、当技術分野で利用される任意の種類の対照レベルであり得、例えば、投与前ベースラインレベル、または未処理であるかもしくは対照（例えば、バッファーのみの対照または不活性薬剤対照など）で処理された同様の対象、細胞もしくは試料から決定されるレベルであり得る。

【0616】

本発明の方法の一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、またはアッセイの検出レベルを下回るまで阻害される。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現は、少なくとも７０％阻害される。さらに、例えば脳などの他の組織中での発現の有意な阻害を伴うことのない、例えば肺および／または肝臓中などの特定の組織中でのＳＴＡＴ６発現の阻害が所望される場合があることが理解される。一部の実施形態では、発現レベルは、適切な種に合致した細胞株において１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を有する実施例２に提供されるアッセイ方法を使用して決定される。

【0617】

特定の実施形態では、インビボでの発現の阻害は、例えばＲＮＡ発現の最低値で３ｍｇ／ｋｇで、例えば単回投与として投与した場合に、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類において、例えばヒト標的遺伝子（すなわち、ＳＴＡＴ６）を発現するＡＡＶ感染マウスにおいて、ヒト遺伝子をノックダウンすることによって決定される。例えばＲＮＡ発現の最低値では３ｍｇ／ｋｇで、例えば単回投与として投与後に、モデル動物系における内因性遺伝子の発現のノックダウンも判定することができる。当該系は、ヒト遺伝子とモデル動物遺伝子の核酸配列が十分に近いことによりヒトｉＲＮＡがモデル動物遺伝子の効果的なノックダウンをもたらす場合に有用である。肝臓におけるＲＮＡ発現は、実施例２に提供されるＰＣＲ法を使用して判定される。

【0618】

ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害は、第一の細胞または細胞の群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第二の細胞または細胞の群（ｉＲＮＡで処理されていない、または目的の遺伝子を標的とするｉＲＮＡで処理されていない対照細胞）と比較して、ＳＴＡＴ６遺伝子が転写され、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現が阻害されるように処理（例えば、細胞を本発明のｉＲＮＡと接触させることによって、または本発明のｉＲＮＡを、細胞が存在しているもしくは存在していた対象に投与することによって）されている第一の細胞または細胞の群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の低減によって現れ得る。一部の実施形態では、阻害は、種が一致する細胞株において例えば１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用して、および以下の式を使用して処理細胞中のｍＲＮＡのレベルを対照細胞中のｍＲＮＡのレベルの百分率として表現することによって、実施例２に提供される方法によって評価される：

【数1】

【0619】

他の実施形態では、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害は、例えば対象からの血液または血清中のＳＴＡＴ６タンパク質レベルなど、ＳＴＡＴ６遺伝子発現に機能的に結びついたパラメータの減少の観点から評価され得る。ＳＴＡＴ６遺伝子サイレンシングは、発現コンストラクトからの内因性または異種性いずれかのＳＴＡＴ６を発現する任意の細胞において、当技術分野で公知の任意のアッセイによって決定され得る。

【0620】

ＳＴＡＴ６タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞の群によって、または対象の試料中において発現されるＳＴＡＴ６タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中のタンパク質のレベル）の低減によって現れ得る。上記において説明したように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処理した細胞または細胞の群におけるタンパク質発現レベルの阻害を、同様に、対照の細胞または細胞の群におけるタンパク質のレベルの、または例えば対象由来の呼吸系の試料、例えば、喀痰試料または鼻腔スワブなどの対象の試料中のタンパク質レベルの変化の百分率として表すことができる。

【0621】

ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の阻害を評価するために使用できる対照の細胞、細胞の群、または対象の試料には、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触していない細胞、細胞の群または対象の試料が含まれる。例えば、対照の細胞、細胞の群、または対象の試料は、ＲＮＡｉ剤を用いる対象の処理の前の個々の対象（例えば、ヒトまたは動物対象）またはある適切に合致する集団の対照に由来し得る。

【0622】

細胞または細胞の群によって発現されるＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定できる。一実施形態では、試料中のＳＴＡＴ６の発現レベルは、転写されたポリヌクレオチド、またはその一部を、例えばＳＴＡＴ６遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ； Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）社）またはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ（商標）社、スイス国）を使用することを含む、ＲＮＡ抽出技術を使用して細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ラン－オンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析が挙げられる。

【0623】

一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６の発現レベルは、核酸プローブを使用して決定される。「プローブ」という用語は、本明細書において使用する場合、特定のＳＴＡＴ６に選択的に結合可能である任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成できる、または適切な生物学的調製物から誘導できる。プローブは、標識されるように特異的に設計してもよい。プローブとして利用できる分子の例としては、これに限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられる。

【0624】

単離されたｍＲＮＡは、これに限定されるものではないが、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイをはじめとする、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルを決定する方法の一つとしては、単離されたｍＲＮＡを、ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルにかけてｍＲＮＡをゲルから膜へ、例えばニトロセルロースに移行させることによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブを固体表面に固定化して、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者ならば、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡのレベルを決定する際に使用するために容易に適応させることができる。

【0625】

試料中のＳＴＡＴ６の発現レベルを決定する代替的な方法は、例えばＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓによる１９８７年の米国特許第４，６８３，２０２号に記載の試験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉらによる米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法と、その後の当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出を行うことなどの、試料中の例えばｍＲＮＡの核酸増幅または反転転写（ｃＤＮＡを調製するための）のプロセスを伴う。これら検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合に該核酸分子の検出のために有用である。本発明の特定の態様では、ＳＴＡＴ６の発現レベルは、定量的な蛍光ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム）によって決定される。一部の実施形態では、発現レベルは、その種に合致した細胞系において、例えば１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用する実施例２に提供される方法で決定される。

【0626】

ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどといったハイブリダイゼーション分析において使用されるような）またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズまたは繊維（または結合している核酸を含む任意の固相支持体）を使用して観察され得る。米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号、および第５，４４５，９３４号を参照されたく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。ＳＴＡＴ６発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。

【0627】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価される。これら方法の使用は、本明細書において示す実施例において記載され、例示される。一部の実施形態では、発現レベルは、その種に一致した細胞株において、１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用する実施例２に提供される方法で決定される。

【0628】

ＳＴＡＴ６タンパク質の発現レベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定され得る。こうした方法としては、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、吸収分光法、比色分析、分光学的定量法、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一重または二重）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。

【0629】

一部の実施形態では、本発明の方法の有効性は、ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの減少によって評価される（例えば、肺内、生検によって、または別の方法、例えば、喀痰試料もしくは鼻腔スワブ、または肝臓試料内、生検によって）。

【0630】

本発明の方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡが、対象内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＳＴＡＴ６の発現の阻害は、対象（例えば、肝臓および／または肝臓細胞または呼吸系からの液状試料）内の特定の部位から流体または組織に由来する試料中のＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡまたはＳＴＡＴ６タンパク質のレベルの測定値または該レベルの変化を使用して評価され得る。

【0631】

本明細書において使用する場合、分析物のレベルを検出することまたは決定することという用語は、物質が、例えば、タンパク質、ＲＮＡが存在するか否かを決定する工程を実施することを意味すると理解される。本明細書において使用する場合、検出するまたは決定する方法は、使用する方法の検出のレベルを下回る分析物のレベルの検出または決定を含む。

【0632】

ＶＩＩ．本発明の予防および治療方法
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ、または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用して、ＳＴＡＴ６の発現を阻害し、それによってＳＴＡＴ６関連障害、例えば、原発性高シュウ酸尿症および／または尿路結石を予防または治療する方法も提供する。本発明の方法においては、細胞をインビトロまたはインビボでｓｉＲＮＡと接触させることができる、すなわち、細胞は対象内にあり得る。

【0633】

本発明の方法を使用した治療に適する細胞は、ＳＴＡＴ６を発現する呼吸系の細胞などのＳＴＡＴ６遺伝子を発現する任意の細胞であってもよい。本発明の方法での使用に適した細胞は、哺乳類細胞、例えば霊長類細胞（例えば、キメラ非ヒト動物中のヒト細胞をはじめとするヒト細胞、またはサル細胞もしくはチンパンジー細胞などの非ヒト霊長類細胞など）、または非霊長類細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肺細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝臓細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肺細胞およびヒト肝細胞である。

【0634】

ＳＴＡＴ６発現は、細胞において、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または約１００％だけ、すなわち、検出レベル未満に、阻害される。特定の実施形態では、ＳＴＡＴ６発現は、少なくとも５０％阻害される。

【0635】

本発明のインビボでの方法は、対象に、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み得、該ｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ剤を投与しようとする哺乳類のＳＴＡＴ６遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。組成物は、当技術分野で公知の任意の手段によって投与され得るが、例えばこれに限定されるものではないが、経口、腹腔内、または頭蓋内（例えば、脳室内、実質内およびくも膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸などの非経口経路、および局所（頬側および舌下を含む）投与が含まれる。特定の実施形態では、組成物は、静脈内への注入または注射によって投与される。特定の実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。特定の実施形態では、組成物は、筋肉内注射によって投与される。特定の実施形態では、組成物は、肺送達、例えば、経口吸入または鼻腔内送達によって投与される。

【0636】

一部の実施形態では、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期的な時間にわたって一貫した態様でＲＮＡｉ剤を放出し得る。したがって、蓄積注射は、所望の効果、例えば所望のＳＴＡＴ６阻害または治療的もしくは予防的な効果を得るために必要とされる投薬の回数を減らすことができる。蓄積注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することもできる。蓄積注射は、皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態では、蓄積注射は、皮下注射である。

【0637】

一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、肺系投与、例えば、鼻腔内投与、または経口吸入投与によって投与される。肺系投与は、シリンジ、ドロッパ、霧化、または装置、例えば受動的呼吸駆動または能動的動力駆動の単回／複数回用量乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）装置の使用を介してもよい。

【0638】

投与様式は、局所的な治療または全身的な治療のいずれが望まれるかに応じて、また処理しようとする面積に基づいて選択され得る。投与の経路および部位は、ターゲティングを増強するように選択され得る。

【0639】

一態様では、本発明はまた、哺乳類におけるＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞内においてＳＴＡＴ６遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与すること、および哺乳動物をＳＴＡＴ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって、細胞内においてＳＴＡＴ６遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また例えば、実施例２にある、本明細書において記載される方法、例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価され得る。タンパク質産生の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって評価され得る。特定の実施形態では、肺生検試料が、ＳＴＡＴ６遺伝子またはタンパク質の発現の減少を観察するための組織材料として機能する。

【0640】

本発明はまた、それを必要とする対象、例えば、呼吸器疾患などのＳＴＡＴ６関連障害、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎と診断された対象における治療の方法をさらに提供する。

【0641】

本発明はさらに、それを必要とする対象における予防方法を提供する。本発明の治療方法は、対象に、例えばＳＴＡＴ６発現の減少から利益を得るであろう対象に、ＳＴＡＴ６遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡまたはＳＴＡＴ６遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を予防有効量で、本発明のｉＲＮＡを投与することを含む。

【0642】

一態様では、本発明は、ＳＴＡＴ６発現の減少から恩恵を受けることになる障害、例えば、呼吸器疾患などのＳＴＡＴ６関連疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎を有する対象を治療するための方法を提供する。ＳＴＡＴ６遺伝子発現の減少および／または阻害から恩恵から受けるであろう対象の治療には、治療治療（例えば、対象が、呼吸器疾患を有する）および予防的治療（例えば、対象が、呼吸器疾患を有していない、または対象が、呼吸器疾患を発生するリスクがある場合がある）が含まれる。

【0643】

一部の実施形態では、ＳＴＡＴ６関連疾患は、呼吸器疾患である。

【0644】

他の実施形態では、ＳＴＡＴ６関連疾患は喘息である。

【0645】

本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与され得る。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の不在下で投与される。当該そのままのｉＲＮＡは、適したバッファー溶液中にあってもよい。該バッファー溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一実施形態では、バッファー溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有するバッファー溶液のｐＨおよびモル浸透圧濃度は、対象への投与に好適であるように調整され得る。

【0646】

あるいは、本発明のｉＲＮＡは、医薬組成物として、例えばｄｓＲＮＡリポソーム製剤として、投与され得る。

【0647】

ＳＴＡＴ６遺伝子発現の阻害から恩恵を受けるであろう対象は、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎などの呼吸器疾患などのＳＴＡＴ６関連障害に感受性があるか、またはそれと診断された対象である。一実施形態では、方法は、標的ＳＴＡＴ６遺伝子の発現が、用量当たり約１、２、３、４、５、６、１～６、１～３、または３～６か月などの間、減少するように、本明細書において取り上げる組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、組成物は３～６か月に一回投与される。

【0648】

一実施形態では、本明細書において特徴付けられる方法および組成物にとって有用なｉＲＮＡは、標的ＳＴＡＴ６遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的とする。ｉＲＮＡを使用してこれら遺伝子の発現を阻害する組成物および方法は、本明細書に記載するように調製および実施され得る。

【0649】

本発明の方法によるｉＲＮＡの投与は、例えば、呼吸器疾患などのＳＴＡＴ６関連障害、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎の予防または治療をもたらし得る。

【0650】

対象には、治療量のｉＲＮＡ、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇなどが投与され得る。

【0651】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、肺系投与を介して対象に投与される。一実施形態では、肺系投与は、吸入または鼻腔内である。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、皮下に、すなわち、皮下注射によって投与される。所望の用量のｉＲＮＡを対象に送達するために、一回または複数回の注射を使用してもよい。一定期間にわたって、注射を反復してもよい。

【0652】

投与を定期的に反復してもよい。特定の実施形態では、最初の治療レジメン後に、より少ない頻度で治療を施与することができる。反復投与レジメンとしては、例えば一か月に一回から一年に一回など、治療量のｉＲＮＡの定期的な投与を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、約一か月に一回から約三か月に一回、または約三か月に一回から約六か月に一回投与される。

【0653】

本発明は、さらに、ＳＴＡＴ６遺伝子発現の低減および／または阻害から利益を得るであろう対象を、例えばＳＴＡＴ６関連疾患がある対象を、治療するためのｉＲＮＡ剤またはその医薬組成物の方法および使用を、他の医薬および／または他の治療方法と、例えば公知の医薬および／または公知の治療方法、例えばこれら障害を治療するために現在採用されているものなどと組み合わせて、提供する。

【0654】

したがって、本発明の一部の態様では、本発明の単一のｉＲＮＡ剤のいずれかを含む方法は、対象に一つまたは複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む。

【0655】

例えば、特定の実施形態では、ＳＴＡＴ６を標的とするｉＲＮＡは、例えば、他の医薬品または他の治療方法、例えば、既知の医薬品、または例えば、これらの障害の治療に現在使用されているものなどの既知の治療方法と組み合わせて投与される。例えば、特定の実施形態では、ＳＴＡＴ６を標的とするＲＮＡｉ剤は、例えば本明細書において別の場所に記載されるような、またはそうでければ当技術分野で公知であるような、ＳＴＡＴ６関連障害の治療に有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＳＴＡＴ６発現の低減から恩恵を受けることとなる対象を、例えば、ＳＴＡＴ６関連障害を有する対象を治療するのに適した追加の薬剤および治療は、ＳＴＡＴ６関連障害の症状を治療するために現在使用されている薬剤を含み得る。

【0656】

追加的な治療薬および治療の例には、抗炎症剤（例えば、全身性コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、抗コリン剤、β２アドレナリン受容体アゴニスト、抗感染剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス剤）、抗ヒスタミン薬、免疫調節因子（例えば、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロホスファミド）、ホスホジエステラーゼ－５阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ニンテダニブ）、抗線維化剤（例えば、ピルフェニドン）、および前述のいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0657】

ＲＮＡｉ剤および追加の治療薬は、同時にまたは同じ組み合わせで、例えば、肺系投与され得、または追加の治療薬は、別個の組成物の一部として、もしくは別個の時間で、または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載する別の方法によって投与され得る。

【0658】

ＶＩＩＩ． キット
特定の態様においては、本開示は、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物またはｓｉＲＮＡ化合物であるｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、または例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物もしくはｓｉＲＮＡ化合物またはその前駆体であるｓｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を含有する適切な容器を含むキットを提供する。

【0659】

こうしたキットは、一つまたは複数のｄｓＲＮＡ剤と、使用のための使用説明書、例えば、予防的有効量または治療有効量のｄｓＲＮＡ剤を投与するための説明書とを含む。ｄｓＲＮＡ剤は、バイアル瓶または予め充填された注射器内にあり得る。キットは、随意に、ｄｓＲＮＡ剤を投与するための手段（例えば、予め充填された注射器などの注入デバイス）、またはＳＴＡＴ６の阻害を測定するための手段（例えば、ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡ、ＳＴＡＴ６タンパク質、および／またはＳＴＡＴ６活性の阻害を測定するための手段）をさらに含んでもよい。こうしたＳＴＡＴ６の阻害を測定する手段は、対象からの試料、例えば、細胞、組織、血液または肺系の試料を得るための手段を含み得る。本発明のキットは、随意に、治療有効量または予防有効量を決定するための手段をさらに含み得る。

【0660】

特定の実施形態では、医薬製剤の個々の成分は、一容器で、例えば、バイアル瓶または予め充填された注射器で提供され得る。あるいは、医薬製剤の成分を別々に二以上の容器で、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物調製物用の一つの容器と担体化合物のための少なくとももう一つの容器とで、提供することが望ましいものであり得る。キットは、単一の箱内に一つまたは複数の容器などであるいくつかの様々な構成で包装され得る。この様々な構成要素は、例えば、キットと共に提供される使用説明書に従って、組み合わせることができる。当該構成要素は、例えば、医薬組成物を調製および投与するために、本明細書において説明した方法に従って組み合わせることができる。キットはまた、肺投与に適した装置、例えば、ネブライザー、定量吸入器、および乾燥粉末吸入器を含む経口吸入投与に適した装置などの送達装置を含み得る。

【0661】

本発明について、以下の実施例によってさらに説明するが、これらは限定として解釈されるべきではない。本願全体を通して引用されるすべての参考文献、特許公報、および公開された特許出願、ならびに非公式な配列表および図の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0662】

［実施例１］
ｉＲＮＡの合成

【0663】

試薬の供給元
本明細書において試薬の供給元が具体的に与えられていない場合には、当該試薬は、分子生物学で応用するための品質／純度基準にある分子生物学用の試薬の任意の供給元から得ることができる。

【0664】

ｓｉＲＮＡの設計
ヒトシグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）遺伝子（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿００３１５３．５、ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ６７７８）を標的とするｓｉＲＮＡを、カスタムのＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＮＭ＿００３１５３．５ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、長さが３９６３塩基である。

【0665】

非修飾ＳＴＡＴ６のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表２に示す。この修飾されたＳＴＡＴ６のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表３に示す。

【0666】

本願全体にわたって、小数のない二重鎖名は、小数付きの二重鎖名と同等であり、単に二重鎖のバッチ番号を指しているということを理解されたい。例えば、ＡＤ－９５９９１７は、ＡＤ－９５９９１７．１と同等である。

【0667】

ｓｉＲＮＡの合成
ｓｉＲＮＡを、当技術分野で公知の方法を使用して設計、合成、および調製した。

【0668】

簡潔に述べると、ｓｉＲＮＡ配列を、固体支持体上でホスホラミダイトの化学的性質を用いてＭｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して１μｍｏｌスケールで合成した。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンド（３’－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）、ユニバーサル固体支持体（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、または目的の第一ヌクレオチドを装填した制御された細孔ガラス（５００～１０００Å）とした。補助合成試薬および標準的な２－シアノエチルホスホラミダイトモノマー（２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ｈｏｎｇｅｎｅ社（中華人民共和国）、またはＣｈｅｍｇｅｎｅｓ社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から取得した。追加のホスホラミダイトモノマーを、市販の供給元から調達するか、組織内で調製するか、または様々なＣＭＯからのカスタム合成を使用して調達した。ホスホラミダイトを、アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦのいずれかの中で１００ｍＭの濃度で調製し、反応時間４００秒で、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中０．２５Ｍ）を使用して結合した。無水アセトニトリル／ピリジン（９：１ｖ／ｖ）中の３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ社（ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）より取得）の１００ｍＭ溶液を使用して、ホスホロチオエート連結を生成した。酸化時間は５分であった。全ての配列を、ＤＭＴ基の最終的な除去（「ＤＭＴ－Ｏｆｆ」）で合成した。

【0669】

固相合成が完了したら、固体支持したオリゴリボヌクレオチドを、９６ウェルプレート中、室温で、３００μＬのメチルアミン（４０％水溶液）で約２時間にわたって処理し、固体支持体から切断させ、その後追加的な塩基不安定性保護基をすべて除去した。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護された任意の天然リボヌクレオチド連結（２’－ＯＨ）を含有する配列に関しては、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミントリヒドロフルオリド）を使用して第二の脱保護工程を実施した。メチルアミン水溶液中の各オリゴヌクレオチド溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦを加えて、この溶液を６０℃で約３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートを室温まで自然に戻し、１ｍＬの９：１アセトニトリル：エタノールまたは１：１エタノール：イソプロパノールの添加によって、粗オリゴヌクレオチドを沈殿させた。次いでプレートを４℃で４５分間遠心分離し、上清を、マルチチャネルピペットの補助により慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを、２０ｍＭのＮａＯＡｃ中に再懸濁し、その後、オートサンプラー、ＵＶ検出器、電気伝導度計、およびフラクションコレクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣシステム上で、ＨｉＴｒａｐ分子ふるいカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して脱塩した。脱塩したサンプルを９６ウェルプレートに回収し、次いでＬＣ－ＭＳおよびＵＶ分光分析法により分析して、それぞれで同一性を確認し、物質の量を定量した。

【0670】

一本鎖の二重化を、Ｔｅｃａｎ社のリキッドハンドリングロボットで行った。センス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれの単鎖を、９６ウェルプレートにおいて１×ＰＢＳ中１０μＭの最終濃度まで等モル比で合わせて、このプレートを密封し、１００℃で１０分間インキュベートし、その後２～３時間かけてゆっくりと室温まで自然に戻した。各二重鎖の濃度および同一性を確認し、その後インビトロスクリーニングアッセイに利用した。

【0671】

［実施例２］
インビトロスクリーニング法

【0672】

細胞培養およびトランスフェクション
トランスフェクションのために、Ａ５４９細胞を、１０％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ社）で補ったイーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ社）中、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で、ほぼコンフルエントまで増殖させてから、トリプシン化によりプレートから放出した。トランスフェクションを、ウェル当たり７．５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド カタログ番号１３７７８－１５０）を、９６ウェルプレートの個々のウェルに、２．５μｌの各ｓｉＲＮＡ二本鎖に、添加することによって実施した。次いで混合物を、室温で１５分間インキュベートした。次いでｓｉＲＮＡ混合物に、約２×１０^４個の細胞を含有する抗生物質を有さない完全増殖培地を４０μｌ添加した。細胞を２４時間インキュベートし、その後ＲＮＡの精製を行った。単回投与試験を、１０ｎＭの最終二本鎖濃度で実施した。

【0673】

ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）社、部品番号：６１０－１２）を使用した全ＲＮＡの単離
細胞を、ウェル当たり３μＬのビーズを含有する７５μｌの溶解／結合バッファー中で溶解し、静電式振とう機上で１０分間混合した。洗浄工程は、磁気プレート支持体を使用して、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６上で自動化した。ビーズを、バッファーＡ中で一回、バッファーＢ中で一回、およびバッファーＥ中で二回、それぞれの間に吸引工程を入れて洗浄した（９０μＬ中で）。最後の吸引後、以下に説明するように、完全な１０μＬのＲＴ混合物を各ウェルに加えた。

【0674】

ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ番号＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
１反応当たり、１μｌの１０×バッファー、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤および６．６μｌのＨ_２Ｏのマスターミックスを、各ウェルに加えた。プレートを密封し、静電式振とう機で１０分間振とうし、次いで３７℃で２時間インキュベートした。その後、プレートを８０℃で８分間振とうした。

【0675】

リアルタイムＰＣＲ
二マイクロリットル（μｌ）のｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号＃ ０４８８７３０１００１）において、ウェル当たり、０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＳＴＡＴ６、２μｌのヌクレアーゼを含まない水、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号＃０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社）において実施した。

【0676】

相対的な倍率変化を算出するために、データを、ΔΔＣｔ法を使用して分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた細胞またはモックトランスフェクトされた細胞で実施されるアッセイに対して正規化する。ＩＣ_５０は、ＸＬＦｉｔを使用して４パラメータの当てはめモデルを使用して計算し、ＡＤ－１９５５でトランスフェクトした細胞またはモックのトランスフェクト細胞に対して正規化する。ＡＤ－１９５５のセンス配列およびアンチセンス配列は、センスがｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号１８）であり、またアンチセンスがＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号１９）である。

【0677】

Ａ５４９細胞における表２および３に列挙されるｄｓＲＮＡ剤のスクリーニングの結果が、表４に示されている。

【0678】

表１．核酸配列表現で使用されるヌクレオチドモノマーの略語。これらモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在するとき、５’－３’－ホスホジエステル結合によって相互に結合されることが理解され、またヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾を含有するとき、そしてフルオロが親ヌクレオチド内のその位置においてヒドロキシを置換する（すなわち、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドである）ことが理解されるであろう。

【表2-1】

【表2-2】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【表3-8】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【0679】

均等物
当業者は、本明細書に記載される特定の実施形態および方法に対する多くの均等物を認識するか、または通例の実験のみを使用して確認することができるであろう。こうした均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることを意図する。

【配列表】

2024519293000001.app

【国際調査報告】