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特表2024-519324改善された半減期を有する改変ＦＣＲＮ結合フラグメント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-10
(54)【発明の名称】改善された半減期を有する改変ＦＣＲＮ結合フラグメント
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240501BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240501BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240501BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240501BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240501BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240501BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240501BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240501BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240501BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240501BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240501BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240501BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240501BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240501BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/62 Z
C07K16/00
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N7/01
C07K19/00
C07K16/46
C12N15/113 Z
C12N1/15
C12P21/02 C
A61K39/395 Y
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023568728
(86)(22)【出願日】2022-05-09
(85)【翻訳文提出日】2023-12-26
(86)【国際出願番号】 US2022072205
(87)【国際公開番号】W WO2022241398
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】63/186,445
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504333972
【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】オガネシャン，バヘー ユニ
(72)【発明者】
【氏名】シャン，ルー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085BB11
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC01
4C085CC08
4C085CC22
4C085DD31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA10
4H045BA54
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA22
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は改善された半減期を有する改変ＦｃＲｎ結合フラグメント、具体的には前記改変ＦｃＲｎ結合フラグメントを含む融合タンパク質及びポリペプチド、並びに前記融合タンパク質を製造する方法、及び治療方法におけるそれらの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントを含む融合タンパク質であって、前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ａ．３５１位にＦ
ｂ．３５４位にＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｌ又はＭ
ｃ．３６６位にＲ
ｄ．３９５位にＫ
ｅ．４０５位にＲ；及び
ｆ．４０７位にＥ
を含む
（ここで、前記アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）
融合タンパク質。
【請求項2】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントを含むポリペプチドであって、前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ａ．３５１位にＦ
ｂ．３５４位にＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｌ又はＭ
ｃ．３６６位にＲ
ｄ．３９５位にＫ
ｅ．４０５位にＲ；及び
ｆ．４０７位にＥ
を含む
（ここで、前記アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）
ポリペプチド。
【請求項3】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントにコンジュゲートした非タンパク質剤を含む分子であって、前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ａ．３５１位にＦ
ｂ．３５４位にＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｌ又はＭ
ｃ．３６６位にＲ
ｄ．３９５位にＫ
ｅ．４０５位にＲ；及び
ｆ．４０７位にＥ
を含む
（ここで、前記アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）
分子。
【請求項4】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５４位にＲ、Ｋ、Ｄ又はＥ、任意選択によりＤ又はＥを含む（ここで、前記アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）、請求項１に記載の融合タンパク質、請求項２に記載のポリペプチド又は請求項３に記載の分子。
【請求項5】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５４位にＥを含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項6】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＩｇＧ分子の約２１６位のアミノ酸残基から約４４６位のアミノ酸残基までを含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項7】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＩｇＧ分子の約２３６位のアミノ酸残基から約４４６位のアミノ酸残基までを含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項8】
前記ＩｇＧ分子はＩｇＧ４である、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項9】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、半減期延長変異をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項10】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、２５２位にＹ、２５４位にＴ、及び２５６位にＥを含む（ここで、番号付けは、ＥＵインデックスに従う）、請求項９に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項11】
前記Ｆｃ領域は、以下のアミノ酸：ａ．４３２位及び４３７位にＣ；
ｂ．４３３位にＳ、Ｈ、Ｒ、Ｐ、Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｍ又はＮ；
ｃ．４３４位にＹ、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｓ、Ｍ又はＴ；
ｄ．４３５位にＨ；及び
ｅ．４３６位にＬ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｈ、Ｓ又はＴ
を含む
（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、
請求項９に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項12】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ａ．４３４位にＹ、Ｒ、Ｗ、Ｈ又はＦ；及び
ｂ．４３６位にＬ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｖ又はＨ
を含む
（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、
請求項１１に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項13】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、以下のアミノ酸：ａ．４３２位及び４３７位にＣ；
ｂ．４３３位にＳ；
ｃ．４３４位にＹ；
ｄ．４３５位にＨ；及び
ｅ．４３６位にＬ
を含む
（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、
請求項１２に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項14】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは４３８位にアミノ酸の欠失を含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項15】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントのＱ４３８（ＥＵインデックスによる番号付け）は欠失している、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項16】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、４３７位の残基の直後に挿入されたＥを含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）、請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項17】
少なくとも１つ、例えば１つ又は２つの抗原結合ドメインを含む、請求項１、２、及び４～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項18】
２つの抗原結合ドメインを含む、請求項１、２、及び４～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項19】
第１の抗原結合ドメインは、前記ＦｃＲｎ結合フラグメントのＮ末端にある、請求項１、２、及び４～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項20】
第２の抗原結合ドメインは、前記ＦｃＲｎ結合フラグメントのＣ末端にある、請求項１、２、及び４～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項21】
各抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体及びｓｃＦｖから独立して選択される、請求項１、２、及び４～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項22】
非ＩｇＧタンパク質ドメインを含む、請求項１、２、及び４～２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項23】
前記非ＩｇＧドメインは、免疫修飾物質、受容体、ホルモン、酵素又は薬物である、請求項２２に記載の融合タンパク質又はポリペプチド。
【請求項24】
前記非タンパク質剤は、核酸（例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）、脂質、糖脂質、多糖、薬物、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子又はレポーター基、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項25】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はマイクロＲＮＡである、請求項２４に記載の分子。
【請求項26】
前記薬物は、細胞障害性剤、化学療法剤、抗腫瘍薬、血管新生阻害剤又はアポトーシス促進剤である、請求項２４に記載の分子。
【請求項27】
前記ＦｃＲｎ結合フラグメントは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質、請求項２に記載のポリペプチド又は請求項３に記載の分子。
【請求項28】
請求項１、２、４～２３及び２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項29】
請求項２８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項30】
請求項２８に記載の核酸又は請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項31】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の分子の前記ＦｃＲｎ結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項32】
請求項３１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項33】
請求項３１に記載の核酸又は請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項34】
請求項３０に記載の宿主細胞から前記融合タンパク質又はポリペプチドを発現させる工程、及び前記融合タンパク質又はポリペプチドを精製する工程を含む、請求項１～２３又は２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを生成する方法。
【請求項35】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子、薬学的に許容される担体及び希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項36】
治療に使用するための請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項37】
請求項３５に記載の医薬組成物の、治療における使用。
【請求項38】
治療に使用するための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子。
【請求項39】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子の、治療における使用。
【請求項40】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子の、疾患の治療のための医薬の製造における使用。
【請求項41】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子、或いは請求項３５に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は改善された半減期を有する改変ＦｃＲｎ結合フラグメント、具体的には前記改変ＦｃＲｎ結合フラグメントを含む融合タンパク質及びポリペプチド、並びに前記融合タンパク質を製造する方法、及び治療方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの２つのセットからなるホモ二量体であり、高い発現収率、単純化された精製プロセス及び長い血清半減期を有する２アームタンパク質融合体を生成するために利用されている。しかしながら、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの１つのセットを有する単量体Ｆｃを有する１アーム融合タンパク質を生成する試みは、ＦｃＲｎに対する結合の弱さ又は部分的な単量体形成などの課題に悩まされることが多い。
【0003】
臨床にまで進んだＦｃ融合タンパク質の一価バージョン（Ａｌｐｒｏｌｉｘ－血液凝固第ＩＸ因子融合、Ｅｌｏｃｔａｔｅ－第ＶＩＩＩ因子融合）又は一価抗体（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ－抗ｃＭｅｔ １アームｍＡｂ）は、結合又は「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」技術でヘテロ二量体を形成するように操作されたＦｃ領域を利用する。これらは、他のヘテロ二量体Ｆｃ技術と共に、望ましくない鎖対合を除き、均一な融合タンパク質を得るために、ロバストな精製プロセスに依存する。製品開発を単純化することを目的とする代替アプローチを探索するために、相互作用を弱めることによって、又はＦｃ中のＣＨ３－ＣＨ３二量体界面にグリカンを付加して立体障害を生成することによって、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの１つのセットのみからなる単量体Ｆｃモダリティを備えた融合タンパク質プラットフォームを操作することに多大な努力がなされてきた。これまでのところ、これらのアプローチのほとんどは、溶解性及び安定性、ＦｃＲｎ結合の喪失、又は均一性の欠如を含むいくつかの面で課題に直面している。加えて、以前に操作された単量体Ｆｃ分子の多くは、動的光散乱によって凝集の傾向を有することが観察され、ホモ二量体界面を弱めた後に単量体の立体構造を安定化させるという課題が強調された。操作された単量体Ｆｃモダリティの中で、明らかな均一性及び安定性を有する結晶構造を有することが報告されているのは２つの分子のみである。これらのうちの１つは、ＣＨ３－ＣＨ３相互作用を遮断するグリコシル化部位の付加によって安定化されるモノマーである。もう１つは、以前の知見に基づいて合理的に設計されたＩｇＧ４ファージライブラリーに由来する単量体Ｆｃである（非特許文献１）。しかしながら、第２のプラットフォームは高濃度でオリゴマー化する可能性があることが知られており、これは高濃度での送達を必要とする医薬製品に対するその有用性を損なう可能性がある。
【0004】
承認された生物学的治療薬の優先順位が高まっており、またそれらの投与方法や使用方法も拡大していることから、Ｆｃ融合タンパク質の一価バージョンのロバストなプラットフォームを開発することが依然として望まれている。例えば、遺伝子治療の適用及び吸入可能な製品は、いずれも生物学的治療モダリティの豊富な開発領域である。しかしながら、いずれも、治療薬をコードするＤＮＡをパッケージングする能力、又は肺における有効な生体内分布のための最適なサイズに関して、サイズの制約を有する。さらに、モノクローナル抗体と同様の薬物動態学的又は薬力学的特性を有するより小さな分子を生成することは、一般に、商業的製造収率を高め、製品コストを低減するために魅力的である。
【0005】
したがって、Ｆｃ融合タンパク質の一価バージョンを提供する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ（２０１６）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１（８）：ｅ０１６０３４５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示は、ＦｃＲｎ－ＣＨ３二量体化界面における改変がＦｃＲｎ結合フラグメントの単量体化を改善するという驚くべき発見に関する。したがって、これらのＦｃＲｎ結合フラグメントは、Ｆｃ領域に由来する一価のＦｃＲｎ結合フラグメントを必要とする又は所望する融合タンパク質、ポリペプチド又はＦｃＲｎ結合フラグメント－非タンパク質剤コンジュゲート（本明細書では「分子」と称する）において使用された場合、優れた開発可能性を有する。
【0008】
したがって、本開示は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントを含む融合タンパク質であって、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５１位にフェニルアラニン（Ｆ）；３５４位にアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）；３６６位にアルギニン（Ｒ）；３９５位にリシン（Ｋ）；４０５位にアルギニン（Ｒ）；及び４０７位にグルタミン酸（Ｅ）を含む（ここで、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）融合タンパク質を提供する。これらの各位置の野生型残基をこれらのアミノ酸で置換することにより、ＦｃＲｎ結合フラグメントの単量体安定性が改善されることがわかった。
【0009】
別の態様では、本開示は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントを少なくとも含むポリペプチドであって、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５１位にフェニルアラニン（Ｆ）；３５４位にアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）；３６６位にアルギニン（Ｒ）；３９５位にリシン（Ｋ）；４０５位にアルギニン（Ｒ）；及び４０７位にグルタミン酸（Ｅ）を含む（ここで、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）ポリペプチドを提供する。
【0010】
別の態様では、本開示は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントにコンジュゲートした非タンパク質剤を含む分子であって、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５１位にフェニルアラニン（Ｆ）；３５４位にアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）；３６６位にアルギニン（Ｒ）；３９５位にリシン（Ｋ）；４０５位にアルギニン（Ｒ）；及び４０７位にグルタミン酸（Ｅ）を含む（ここで、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）分子を提供する。
【0011】
別の態様では、本開示は、前記融合タンパク質又はポリペプチド又は前記分子にコンジュゲートしたＦｃＲｎ結合フラグメントをコードする核酸を提供する。
【0012】
別の態様では、本開示は、前記核酸を含むベクターを提供する。
【0013】
別の態様では、本開示は、前記ベクター又は核酸を含む宿主細胞を提供する。
【0014】
別の態様では、本開示は、前記融合タンパク質、前記分子で使用するためのＦｃＲｎ結合フラグメントのポリペプチドを、前記宿主細胞から前記融合タンパク質、ＦｃＲｎ結合フラグメントのポリペプチドを発現させ、それから精製することによって製造する方法を提供する。
【0015】
別の態様では、本開示は、治療に使用するための融合タンパク質、ポリペプチド又は分子を提供する。
【0016】
別の態様では、本開示は、疾患の治療のための医薬の製造における融合タンパク質、ポリペプチド又は分子の使用を提供する。
【0017】
別の態様では、本開示は、治療有効量の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子を、それを必要とする患者に投与することを含む治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】［図１Ａ］以前のファージライブラリーキャンペーンからの野生型ＩｇＧ４、ＭＦｃ１及びＭＦｃ２、ＭＦｃ１ ＣＨ２ドメインにおけるＹＴＥ変異をＣＨ３変異セットで置き換えたＴ１バリアント、並びにＭＦｃ３及びＭＦｃ４の最終配列におけるＣＨ２及びＣＨ３ドメインの配列アラインメントを示す。［図１Ｂ］Ｔ１の結晶構造を示す。［図１Ｃ］Ｔｈｒ３５０／Ｌｅｕ４４０及びＧｌｎ３５５／Ｇｌｕ３５６において形成された水素結合の小セットを詳述する、Ｔ１の拡大図を示す。
【図2】［図２Ａ］残基Ｓ３５４を標的とする点変異バリアントのパネルの、野生型ＩｇＧ４、Ｔ１及びＴ１－ｌｉｂにおけるＣＨ２及びＣＨ３ドメインの配列アラインメントを示す。［図２Ｂ］良好な均一性を有する約２６～２７ｋＤａの分子量を示すＴ１点変異体を示す代表的なＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を示す。［図２Ｃ］中程度に高い熱安定性を有するＳ３５４Ｅ及びＳ３５４Ｄを同定するためのＴ１精製変異体間のＤＳＦ比較を示す。
【図3】非グリコシル化形態（Ｎ２９７Ｄ）の新しい単量体ＦｃのＭＦｃ３の結晶構造を示す。ＭＦｃ３（橙色）とＭＦｃ２（又はＣ４ｎ）の以前に解析された構造（淡紫色）との重ね合わせは、両方が類似の単量体Ｆｃ構造を維持し、Ｓ３５４Ｅ変異がＦｃ領域構造に顕著な変化を引き起こさなかったことを示す。設計通り、Ｓ３５４Ｅ変異のために、グルタミン酸側鎖は、Ｔ１において観察された任意の可能な二量体相互作用に突出ている。
【図4】［図４Ａ］ＭＦｃ３（橙色）及びＦｃＲｎ（青色）／β２－マクログロブリン（桃色）複合体の構造調査を示す。［図４Ｂ］ＭＦｃ３（橙色）とＦｃＲｎ（青）との間の結合界面を示す。水素結合は破線で示されている。［図４Ｃ］ＭＦｃ４（緑色）及びＦｃＲｎ（青色）／β２－マクログロブリン（桃色）複合体を示す。［図４Ｄ］ＭＦｃ４（緑色）とＦｃＲｎ（青）との間の結合界面を示す。水素結合は破線で示されている。［図４Ｅ］受容体結合界面に関与する各ＭＦｃ残基の示差溶媒和エネルギーΔｉＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）寄与を示すヒートマップである。より高い正の値は、単量体Ｆｃ結合表面からのより強い溶媒和効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
定義
本明細書で使用される場合、文脈上明白に他の意味で使用されている場合を除き、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、特別に、それらが言及する用語の複数形も包含するものとする。
本明細書で使用される場合、文脈上明白に他の意味で使用されている場合を除き、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、特別に、それらが言及する用語の複数形も包含するものとする。
【0020】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者により決定される場合の特定の値に対する許容可能な誤差を意味し、その値がどのように測定又は決定されるかに一部依存する。特定の実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、１、２、３又は４標準偏差内を意味する。特定の例では、「約」又は「およそ」という用語は、示された値又は範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．０５％内を意味する。「約」又は「およそ」という用語が一連の２つ以上の数値における最初の数値の前に来る場合は常に、「約」又は「およそ」という用語がその一連の数値のそれぞれに適用されると理解されたい。「約」がアミノ酸位置と併せて使用される場合、それは指定位置の１、２、３、４、５又は１０アミノ酸以内を意味する。
【0021】
「アミノ酸欠失」又は「欠失した」は、親配列中に存在するアミノ酸残基を除去することを指す。親配列内のアミノ酸は、例えば、この分野で知られた組換え方法によって欠失され得る。したがって、「位置Ｘにおける欠失」への言及は、位置Ｘに存在するアミノ酸の欠失を指す。欠失パターンはスキーマＡＸに従って記載することができ、ここで、Ａは位置Ｘに天然に存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ａは、欠失されたアミノ酸残基である。したがって、Ｌ２３４は、２３４位のロイシンアミノ酸（Ｌ）の欠失を指す。このような状況の下では、残基２３３及び２３５が、配列において、次にコードされる。
【0022】
「アミノ酸置換」又は「置換」という用語は、親配列内に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを指す。親配列内のアミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を介して又は当該技術分野で知られた組換え方法によって置換され得る。したがって、「位置Ｘでの置換」又は「位置Ｘでの置換」への言及は、位置Ｘに存在するアミノ酸の他のアミノ酸残基による置換を指す。置換パターンはスキーマＡＸＹに従って記載することができ、ここで、Ａは、位置Ｘに天然に存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ａは置換アミノ酸残基である。したがって、Ｌ２３４Ｆは、２３４位のロイシンアミノ酸（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換を指す。
【0023】
「抗体」又は、は、最も広範な意味で用いられ、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、様々な抗体構造、例えば、以下に限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを包含する。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）などの免疫グロブリンは、抗体の一例である。抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれａ、８、Ｅ、ｙ及び１１と呼ばれる。
【0024】
「抗原結合フラグメント」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体結合ドメインの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗原結合フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗原結合ドメインのレビューについては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントのレビューについては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい；また国際公開第９３／１６１８５号パンフレット、並びに米国特許第５，５７１，８９４号明細書及び同第５，５８７，４５８号明細書も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察については、米国特許第５，８６９，０４６号明細書を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号パンフレット；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。
【0025】
「ＥＵインデックス」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，１９９１ ＮＩＨ Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１－３２４２（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））のＥＵナンバリングインデックスを指す。本明細書に開示されるＦｃＲｎ結合フラグメントのアミノ酸残基は、この番号付けシステムに従って番号付けされる。
【0026】
「Ｆａｂ」は、ＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬ対合を含む抗体フラグメントを指す。この用語は、典型的には高い配列可変性に関連する配列領域の外側のＦａｂ内のアミノ酸置換、欠失又は挿入などの非カノニカル配バリアントを含むＦａｂを包含する。例えば、Ｆａｂバリアントは、ＶＨ若しくはＶＬフレームワーク領域又はＣＨ１若しくはＣＬドメインにおける非カノニカルアミノ酸又は配列変化を含むＦａｂを含む。このような変化には、非カノニカルシステイン又は他の誘導体化可能なアミノ酸の存在が含まれ得、これは前記Ｆａｂバリアントを異種部分にコンジュゲートするために使用され得る。他のそのような変化には、非カノニカルポリペプチドリンカーの存在が含まれ、これは２つのドメイン間を共有結合的に架橋するポリペプチド配列である。例えば、Ｆａｂバリアントは、Ｆａｂが単一のポリペプチド鎖として発現され得るように、ＣＨ１ドメインをＶＬドメインに、又はＣＬドメインをＶＨドメインに共有結合させるリンカーポリペプチドを含み得る。
【0027】
「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域である。それは抗原結合活性を有しないが、炭水化物部分と、ＦｃＲｎ受容体をはじめとする補体受容体及びＦｃ受容体のための結合部位とを含有する（下記を参照）。Ｆｃ領域は、第２の定常ドメインＣＨ２全体（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧの２３１～３４０の残基）及び第３の定常ドメインＣＨ３（３４１～４４７の残基）を含む。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の参照配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０１８５７により見出すことができる。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域の参照配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０１８６１により見出すことができる。
【0028】
「ＦｃＲｎ結合フラグメント」は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃ領域の断片を指す。ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＦｃＲｎへの結合に関与する重鎖ＣＨ２－ＣＨ３領域又はヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３領域の部分を含むことができる（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：７１５－７２５（２００７）を参照されたい。
【0029】
「ＦｃＲｎ受容体」又は「ＦｃＲｎ」は、ヒト若しくは霊長類胎盤、又は卵黄嚢（ウサギ）を通じた胎児への、及び小腸を通じた初乳から新生児への、母親ＩｇＧの移行に関与することが知られている、Ｆｃ受容体を指す（「ｎ」は新生児を示す）。ＦｃＲｎが、ＩｇＧ分子に結合してそれらを血清中にリサイクルすることで、一定した血清ＩｇＧレベルの維持に関与することもまた知られている。天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の分子に対するＦｃＲｎの結合は、厳密にはｐＨ依存性であり、ｐＨ６で最適に結合する。ＩｇＧ３は、４３５の位置に既知の変異を有し（すなわち、ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４に見られるＨ４３５の代わりにＲ４３５を有する）、これはｐＨ６での結合の低下をもたらし得る。ＦｃＲｎは、分子量がそれぞれおよそ５０ｋＤ及び１５ｋＤである２つのポリペプチドのヘテロ二量体を含む。５０ｋＤポリペプチドの細胞外ドメインは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩα鎖に関連し、１５ｋＤポリペプチドは、非多形性β２－ミクログロブリン（β２－ｍ）であることが示された。ＦｃＲｎはまた、胎盤及び新生児腸管に加えて、生物種全体にわたり様々な組織で、並びに様々なタイプの内皮細胞系で発現する。それはまた、成人の血管内皮、筋肉血管系及び肝類洞で発現し、内皮細胞がヒト及びマウスにおける血清ＩｇＧレベルの維持に最も関与している可能性があることが示唆される。
【0030】
「融合タンパク質」は、自然界では天然に連結しない第２のポリペプチドと連結する、第１のポリペプチドを含んでいるキメラポリペプチドを指す。融合タンパク質は、３つ以上のドメインを含み得る。
【0031】
「ヒンジＦｃ領域」、「Ｆｃヒンジ領域」、「ヒンジＦｃドメイン」、又は「Ｆｃヒンジドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され、Ｆｃ領域（ＥＵインデックスによる番号付けで、２３１～４４７の残基）と、Ｆｃ領域のＮ末端から伸びるヒンジ領域（ＥＵインデックスによる番号付けで、２１６～２３０の残基）とからなるＩｇＧ分子の領域を指す。
【0032】
「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされ、又はファージミド又若しくはバクテリオファージで感染された特定の対象細胞、及びこのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指す。このような細胞の子孫は、後続世代において、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みにおいて生じ得る変異又は環境の影響のために、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一でなくてもよい。
【0033】
「連結した」、「融合した」又は「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的結合又は組換え手段をはじめとする何らかの手段によって、２つ以上の要素又は成分を連結することを指す。
【0034】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。
【0035】
「ＳｃＦｖ」は、抗体のＶＨ／ＶＬドメイン対合を含む抗体断片を指す。ｓｃＦｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖはまた、操作されたシステインなどの非カノニカルアミノ酸配列バリアントを含み得る。ｓｃＦｖは、ドメイン内ジスルフィド結合形成のための一対の操作されたシステインを含み得る。
【0036】
「対象」は、本発明の方法による治療が提供される動物、ヒト又は非ヒトを指す。獣医学的及び非獣医学的適用が企図される。この用語には、哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、マウス及びラットなどのげっ歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ及びヤギが含まれるが、これらに限定されない。典型的な対象には、ヒト、家畜、並びにネコ及びイヌなどの家庭用ペットが含まれる。好ましい対象はヒトである。
【0037】
「治療有効量」は、対象又は哺乳動物における疾患又は障害を「治療する」のに有効な融合タンパク質、ポリペプチド、分子、又はそれらの医薬組成物の量を指す。
【0038】
「治療すること」又は「治療」又は「治療する」は、（１）診断された病的状態又は障害を治癒し、遅延させ、症状を軽減させ、且つ／又は進行を食い止める治療手段、及び（２）標的の病的状態又は障害の進行を阻止し、且つ／又は遅延させる予防又は防止手段の両方を指す。したがって、治療が必要とされる者としては、障害を既に有する者；障害を有しやすい者；及び障害を予防すべき者が挙げられる。特定の態様では、患者が、疾患又は病態、例えばあるタイプの癌の完全な、部分的な又は一時的な寛解を示す場合、対象は、本開示の方法により疾患又は病態、例えば癌が良好に「治療」される。
【0039】
「ベクター」は、宿主細胞に１つ以上の目的の遺伝子又は配列を送達し、一部の態様では発現させる能力を有するコンストラクトを指す。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
ＦｃＲＮ結合フラグメント
Ｆｃ領域は、抗体を介した様々な機能を促進する抗体の非抗原結合成分である。特定の機能の１つは、ＦｃＲｎ受容体と結合して抗体のリサイクルを促進し、抗体の半減期を調節することである。Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの間のエンドソームｐＨでの高い親和性の結合は、酸性エンドソームからの抗体の輸送を促進して、リソソームでの抗体の分解を抑制する。
Ｆｃ領域は、抗体を介した様々な機能を促進する抗体の非抗原結合成分である。特定の機能の１つは、ＦｃＲｎ受容体と結合して抗体のリサイクルを促進し、抗体の半減期を調節することである。Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの間のエンドソームｐＨでの高い親和性の結合は、酸性エンドソームからの抗体の輸送を促進して、リソソームでの抗体の分解を抑制する。
【0041】
本開示は、様々な治療方法の半減期を延長するために使用することができる、単量体形態で安定化されたＦｃＲｎ結合フラグメントの開発に関する。このような強化は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎ－リサイクリング特性がモノマー形態で達成されることを可能にすることによって達成される。ＦｃＲｎ結合フラグメントを使用して融合タンパク質を作製し、ＦｃＲｎリサイクリングから恩恵を受ける治療方法のレパートリーを拡大することができる。
【0042】
したがって、本開示は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントを提供する。ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５１位にＦ、３５４位にＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｌ又はＭ、３６６位にＲ、３９５位にＫ、４０５位にＲ、及び４０７位にＥを含む。アミノ酸の番号付けは、ＥＵインデックスによる。
【0043】
実施例は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域の野生型（ｗｔ）配列に対するこれらのアミノ酸置換が、ＦｃＲｎ結合フラグメントの単量体安定性を改善することを示す。ｗｔ抗体中のＦｃ領域は、典型的には二量体形態で存在する。モノマー安定性の改善は、治療用タンパク質が単量体であることが望ましい融合タンパク質でＦｃＲｎ結合フラグメントを利用する場合（例えば、遺伝子治療用途において、又は吸入による送達のために、パッキングサイズの制限又はエアロゾル化特性が、これらの経路を介する標準抗体の投与を妨げる場合）に有利である。融合タンパク質、ポリペプチド、又は非タンパク質剤へコンジュゲーとするためのＦｃＲｎ結合フラグメントの発現及び精製はまた、第四級構造を有する治療用タンパク質を単離することと比較して、大規模製造における収率を改善し得る。
【0044】
一般に、配列中の指定された各位置のアミノ酸は非カノニカルであり、これは、それらが野生型Ｆｃ領域、特に野生型ヒトＦｃ領域中の指定された位置に通常見出されないことを意味する。アミノ酸の改変（例えば、置換、欠失又は挿入）は、当業者によく知られた周知の標準的な遺伝子工学技術を使用して、配列に操作され得る。
【0045】
したがって、本開示は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメントを提供する。ＦｃＲｎ結合フラグメントは、以下のアミノ酸置換を含む：３５１位のＦ、３５４位のＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｌ又はＭ、３６６位のＲ、３９５位のＫ、４０５位のＲ、及び４０７位のＥ。アミノ酸の番号付けは、ＥＵインデックスによる。
【0046】
本明細書において別段の記載がない限り、Ｆｃ領域中の特定の位置における特定のアミノ酸（ＥＵインデックスによる番号付け）への言及は、アミノ酸が天然配列と比較してその特定の位置における置換であることを意味する。
【0047】
いくつかの例において、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５４位にＲ、Ｋ、Ｄ又はＥを、任意選択によりＤ又はＥにＲ、Ｋ、Ｄ又はＥをさらに含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）。実施例は、Ｓ３５４が高濃度でＦｃＲｎ結合フラグメントの二量体化を補助することを示す。高濃度での高次種の形成は、皮下注射により高濃度溶液として投与される特定の治療薬にとって望ましくない場合がある。特定の治療では、治療効果を達成するために、比較的高い（例えば、３００ｍｇを超える）量の投与を必要とし得る。高い量は、注射容量を減少させるために高濃度製剤を必要とし得る。より多くの注射量は患者にとって一般に望ましくない。高濃度での高次種の形成は粘度を増加させる可能性があり、これは、製剤がプレフィルドシリンジなどの加圧デバイスから投与される場合に問題となり得る。さらに、より高次の種が製造プロセス中、例えば濾過又は分画中に失われる場合、高濃度でのより高い単量体純度は、生産収率を増加させ得る。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５４位にＥをさらに含む。
【0048】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、約アミノ酸残基から、ＩｇＧ分子の約２１６位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基までを含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）。残基２１６～４４７は、ヒンジ－Ｆｃ領域（ＥＵインデックスに従って番号付けで、２１６～２３０の残基）及びＦｃ領域（ＥＵインデックスによる番号付けで、２３１～４４７の残基）を含む。
【0049】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、約アミノ酸残基から、ＩｇＧ分子の約２３１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基までを含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）。
【0050】
特定の例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＩｇＧのＩｇＧ４サブクラスに由来するが、所与の動物の他の任意のＩｇＧサブクラスであってもよい。例えば、ヒトでは、ＩｇＧクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。特定の例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域に由来する。
【0051】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３５１位にＦ、３５４位にＥ、３６６位にＲ、３９５位にＫ、４０５位にＲ、及び４０７にＥを含む（ここで、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）。
【0052】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、以下のこれらのアミノ酸位置のそれぞれにおけるこれらのアミノ酸のそれぞれに関して、保存的アミノ酸置換を含み得る：３５１位のＦ、３５４位のＥ、３６６位のＲ、３９５位のＫ、４０５位のＲ、及び４０７のＥ（ここで、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスに従う）。
【0053】
これらのアミノ酸のそれぞれについての例示的な保存的アミノ酸置換は、以下の通りである。
【0054】
【表1】
【0055】
保存的置換は、所与のアミノ酸を、生化学的特性（例えば、電荷、疎水性及びサイズ）が類似している異なるアミノ酸に変化させる、タンパク質におけるアミノ酸置換である。したがって、当業者は、保存的アミノ酸置換が、単量体の形成及び半減期の改変に関して、本明細書に記載の最も例示的なＦｃＲｎ結合フラグメントと同様の利益を生じることを期待し得る。当業者であれば、３５１位、３５４位、３６６位、３９５位、４０５位及び４０７位（ＥＵインデックスによる番号付け）のうちの１つ以上に保存的アミノ酸置換を有するＦｃＲｎ結合フラグメントを生成し、これらのバリアントが実施例に記載される実験を実施することによって、本明細書に開示される好ましいＦｃＲｎ結合フラグメントと類似の特性（例えば、単量体安定性、ＦｃＲｎ結合能、半減期特性）を有するかどうかを試験することができる。
【0056】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなる。
【0057】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、半減期延長変異（例えば、アミノ酸の挿入、欠失又は置換）を含む。
【0058】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、３００ｎＭ未満のヒトＦｃＲｎに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。実施例は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域がｐＨ６において、およそ３００ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合することを示す。対照的に、操作されたＦｃＲｎ結合フラグメントは、ｐＨ６．０において、実質的に改善されたＫＤでヒトＦｃＲｎに結合することができる。より低いｐＨでのより強い結合は、エンドソームからのリサイクリング傾向が天然配列を含むＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して改善され得ることを意味する。
【0059】
ＫＤは、実施例に概説する技術を含む、当業者によく知られた様々な技術によって測定することができる。例えば、精製された組換えヒトＦｃＲｎへのＦｃＲｎ結合フラグメントの結合は、バイオレイヤー干渉法によって測定することができる。バイオレイヤー干渉法は、Ｏｃｔｅｔ３８４装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて実施することができる。例えば、３ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及びＴｗｅｅｎ２０（１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒ；ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）又は１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中の１μｇ／ｍＬのビオチン化ＦｃＲｎを、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で捕捉する。次いで、ロードされたバイオセンサーをアッセイ緩衝液で洗浄して結合していないタンパク質を除去し、続いて、所望のｐＨでの異なるＦｃバリアント又はＦｃ融合構築物の連続希釈によって結合及び解離を測定する。その後、Ｏｃｔｅｔソフトウェア（バージョン７．２）を用いて、データの１：１結合動態モデルに基づく非線形適合から動態パラメータ（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）と見かけのＫＤを次式により算出する。
【数1】
【0060】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、少なくとも３００ｎＭのヒトＦｃＲｎに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【0061】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ヒトＦｃＲｎに、ｐＨ６において、約１ｎＭ～約３００ｎＭ（例えば、約１ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１ｎＭ～約２４０ｎＭ、約１ｎＭ～約２３０ｎＭ、約１ｎＭ～約２００ｎＭ、約１ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、約１ｎＭ～約８０ｎＭ、約１ｎＭ～約６０ｎＭ、約１ｎＭ～約４０ｎＭ、約１ｎＭ～約２０ｎＭ、又は約１ｎＭ～約１００ｎＭ）のＫＤで結合する。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ｐＨ６において、約１ｎＭ～約１０ｎＭのＫＤでヒトＦｃＲｎに結合する。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ又は約１０ｎＭのＫＤでヒトＦｃＲｎに結合する。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ｐＨ６．０において、約５ｎＭのＫＤでヒトＦｃＲｎに結合する。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ｐＨ６．０において、５ｎＭのＫＤでヒトＦｃＲｎに結合する。
【0062】
いくつかの例では、ＫＤ値は、例えば、上記及び実施例に記載されるように、バイオレイヤー干渉法によって決定し得る。
【0063】
抗原結合ドメイン
特定の例では、本開示は、本明細書に開示されるＦｃＲｎ結合フラグメントに共有結合した少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
特定の例では、本開示は、本明細書に開示されるＦｃＲｎ結合フラグメントに共有結合した少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【0064】
いくつかの例では、融合タンパク質又はポリペプチドは、複数の抗原結合ドメインを含む。
【0065】
いくつかの例では、融合タンパク質又はポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの抗原結合ドメインを含む。
【0066】
いくつかの例では、融合タンパク質又はポリペプチドは、２つの抗原結合ドメインを含む。
【0067】
いくつかの例では、第１の抗原結合ドメインは、ＦｃＲｎ結合フラグメントのＮ末端にある。
【0068】
いくつかの例では、第２の抗原結合ドメインは、ＦｃＲｎ結合フラグメントのＣ末端にある。
【0069】
いくつかの例では、各抗原結合ドメインは、ＦｃＲｎ結合フラグメントのＮ末端にある。
【0070】
いくつかの例では、各抗原結合ドメインは、ＦｃＲｎ結合フラグメントのＣ末端にある。
【0071】
いくつかの例では、各抗原結合ドメインは、異なる抗原に特異的に結合する。
【0072】
いくつかの例では、各抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体又はｓｃＦｖから独立して選択される。
【0073】
いくつかの例では、抗原結合断片はＦａｂである。
【0074】
いくつかの例では、抗原結合断片はｓｃＦｖである。
【0075】
いくつかの例では、融合タンパク質又はポリペプチドは、Ｆａｂである第１及び第２の抗原結合ドメインを含む。
【0076】
いくつかの例では、融合タンパク質又はポリペプチドは、ｓｃＦｖである第１及び第２の抗原結合ドメインを含む。
【0077】
いくつかの例では、融合タンパク質又はポリペプチドは、Ｆａｂである第１の抗原結合ドメイン及びｓｃＦｖである第２の抗原結合ドメインを含む。
【0078】
実施例は、本明細書に開示されるＦｃＲｎ結合フラグメントが二重特異性分子の生成に使用できることを示す。
【0079】
Ｆｃ領域バリアント
特定の例では、１つ以上のアミノ酸改変をＦｃ領域内に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。次いで、このＦｃ領域バリアントを、本明細書に開示されるＦｃＲｎ結合フラグメントに組み込むことができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
特定の例では、１つ以上のアミノ酸改変をＦｃ領域内に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。次いで、このＦｃ領域バリアントを、本明細書に開示されるＦｃＲｎ結合フラグメントに組み込むことができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【0080】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、これを、インビボのＦｃＲｎ結合フラグメントの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）は不要又は有害である用途のための所望の候補にする、一部の、しかし全部ではないエフェクター機能を有する。インビトロ及び／又はインビボの細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、この抗体にＦｃγＲ結合が欠如している（したがって、ＡＤＣＣ活性が欠如している可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力は維持していることを確かなものにすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩＡのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号明細書（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。或いは、又はさらに、対象分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）で開示されるものなどの動物モデルで評価し得る。またＣ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認することもできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレット及び国際公開第２００５／１００４０２号パンフレット中のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当技術分野で知られた方法を用いて行うこともできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。
【0081】
いくつかの例では、ＦｃＲｎへの結合を増加させるために、１つ又は複数のアミノ酸改変をＦｃ領域に導入することができる。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＥＵインデックスにより番号付けされた、以下の３つの変異を含む：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ変異」）（米国特許第８，６９７，６５０号明細書；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１（３３）：２３５１４－２３５２４（２００６）も参照されたい）。
【0082】
特定の例では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）ＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合フラグメントの血清中半減期を延長させる。いくつかの例では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）ＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合フラグメントの血清中半減期を２倍延長させる。いくつかの例では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）ＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合フラグメントの血清中半減期を３倍延長させる。いくつかの例では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）ＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合フラグメントの血清中半減期を４倍延長させる。いくつかの例では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）ＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合フラグメントの血清中半減期を少なくとも５倍延長させる。いくつかの例では、ＹＴＥ変異は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）ＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合フラグメントの血清中半減期を少なくとも１０倍延長させる。例えば、米国特許第８，６９７，６５０号明細書を参照されたい；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１（３３）：２３５１４－２３５２４（２００６）もまた参照されたい。
【0083】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、エフェクター機能を低下させるために変異される。いくつかの例では、エフェクター機能が低下したＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＥＵインデックスにより番号付けされたＦｃ領域の２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の残基のうちの１つ以上の置換を有するものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）。このような変異ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＥＵインデックスにより番号付けされた２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位のアミノ酸のうちの２つ以上に置換を有するもの、例えば、ＥＵインデックスにより番号付けされた２６５及び２９７の残基のアラニンへの置換（すなわち、ＥＵ番号付けによるＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ）を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ領域変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）。特定の例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、以下の２つのアミノ酸置換を含む：Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ。特定の例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、以下の２つのアミノ酸置換からなる：Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ。
【0084】
特定の例では、３２９位のプロリン（ＥＵインデックスによる番号付け）（Ｐ３２９）は、グリシン若しくはアルギニン、又はＦｃのＰ３２９とＦｃｇＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｗ８７及びＷ１１０との間に形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチを破壊するのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ ４０６，２６７－２７３（２０ Ｊｕｌｙ ２０００））。さらなる例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントにおける少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、全てＥＵインデックスによる番号付けで、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、又はＰ３３１Ｓであり、さらに別の例では、前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａであるか、又はヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅである（米国特許第８，９６９，５２６号明細書）。
【0085】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号明細書に記載される１つ以上の置換を含む。このようなＦｃＲｎ結合フラグメントとしては、ＥＣインデックスによる番号付けで、Ｆｃ領域残基の ２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ以上に置換を有するもの、例えばＦｃ領域の残基４３４、の置換を有する者が挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号明細書）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関するＤｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号明細書；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；及び国際公開第９４／２９３５１号パンフレットも参照されたい。
【0086】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、ＦｃＲｎへの結合を調節する、国際公開第２０１５／１７５８７４号パンフレット（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＨｉｓ４３５ループ変異を含む。実施例は、Ｈｉｓ４３５ループ変異が、ＥＵインデックスにより番号付けで４３２～４３７位に天然アミノ酸残基を含むＦｃＲｎ結合フラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合フラグメント血清中半減期を延長することを示す。
【0087】
いくつかの例では、Ｆｃ領域は、以下の置換を含む：４３２位のＣ；残基４３３のＨ、Ｒ、Ｐ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ａ、Ｍ又はＮ；残基４３４のＹ、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｓ、Ｍ又はＴ；残基４３５のＨ；残基４３６のＬ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｈ、Ｓ又はＴ；及び残基４３７のＣ。いくつかの例では、改変ＦｃＲｎ結合フラグメントのインビボ半減期は、天然（すなわち、非ＹＴＥ変異体）のＦｃＲｎ結合フラグメントより増大する。生理活性分子のインビボ半減期の増大には、例えば、ワクチン、受動的免疫療法、及びその他の治療及び予防法において、これらの分子の投与量及び／又は投与頻度の減少を含む多くの利点がある。
【0088】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントバリアントは、以下の置換を含む：４３２位のＣ；残基４３３のＳ、Ｈ、Ｒ、Ｐ、Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｍ又はＮ；残基４３４のＹ、Ｒ、Ｗ、Ｈ又はＦ；残基４３５のＨ；残基４３６のＬ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｖ又はＨ；及び残基４３７のＣ（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントは、以下を含む：４３２位のＣ；４３３位のＳ；４３４位のＷ又はＹ；４３５位のＨ；４３６位のＬ、及び４３７位のＣ（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントバリアントは、４３２位にＣ；４３３位にＳ、４３４位にＹ；４３５位にＨ；４３６位にＬ及び４３７位にＣを含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）。国際公開第２０１５／１７５８７４号パンフレット及び本開示の実施例は、変異のこの特定の組合せが、ＦｃＲｎへのＦｃ領域のｐＨ依存性結合を増加させ、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ媒介リサイクリングを増加させ、それによって半減期を改善することを示す。
【0089】
いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントバリアントは、ＥＵインデックスによる番号付けで４３８位にアミノ酸の欠失を含む。実施例は、驚くべきことに、配列からこのアミノ酸を欠失させることにより、開発可能性プロファイルを含まずに、少なくとも同等の半減期延長特性を有するＦｃＲｎ結合フラグメントが生成されることを示す。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合フラグメントはＱ４３８の欠失を含む（ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う）。
【0090】
治療の方法
本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子は、治療の方法、例えば癌を治療する方法において使用され得る。治療を必要としている対象に、治療有効量の本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子を投与することを含む、治療方法もまた提供される。実際の投与量、並びに投与の速度及び時間的経過は、治療されるものの性質及び重症度に依存する。治療の処方箋、例えば投与量に関する決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内にある。
本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子は、治療の方法、例えば癌を治療する方法において使用され得る。治療を必要としている対象に、治療有効量の本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子を投与することを含む、治療方法もまた提供される。実際の投与量、並びに投与の速度及び時間的経過は、治療されるものの性質及び重症度に依存する。治療の処方箋、例えば投与量に関する決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内にある。
【0091】
核酸
本開示は、本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ、またＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖であっても非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。特定の例では、ＤＮＡは、天然には存在しない組換え融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントを生成するために使用されるｃＤＮＡである。
本開示は、本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ、またＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖であっても非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。特定の例では、ＤＮＡは、天然には存在しない組換え融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントを生成するために使用されるｃＤＮＡである。
【0092】
特定の例では、ポリヌクレオチドは単離されている。特定の例では、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。特定の例では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を補助するポリヌクレオチド（天然又は異種）に同じリーディングフレーム内で融合した成熟ポリペプチドのコード配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）を含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟形態のポリペプチドを形成するため宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有することができる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞のためのコドン使用を最適化するように改変される。
【0093】
特定の態様では、ポリヌクレオチドは、同一リーディングフレーム内で、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にする異種性マーカー配列に融合された、融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントをコードする配列を含む。例えば、マーカー配列は、ｐＱＥ－９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであってもよく、それにより細菌宿主の場合にマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製が提供され、又はマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ－７細胞）を使用するときには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。
【0094】
ポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、又はその双方に、改変を含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、又は欠失を生じさせるが、コードされるポリペプチドの特性又は活性を変化させない変化を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、遺伝子コードの縮重によるサイレント置換によって作製される。ポリヌクレオチドバリアントはまた、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主にとって好ましいものに変更する）ためなどの多様な理由から、生成され得る。
【0095】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。（合成、部位特異的変異誘発又は別の方法による）構築時、目的の特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、発現ベクターに挿入し、所望の宿主中でのタンパク質発現に適した発現制御配列に作動可能に連結させ得る。適切なアセンブリは、ヌクレオチドシーケンシング、制限マッピング、及び好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当該技術分野においてよく知られているように、宿主におけるトランスフェクトした遺伝子の高い発現レベルを達成するためには、その遺伝子を、選択の発現宿主で機能する転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結しなければならない。
【0096】
特定の例では、組換え発現ベクターは、本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントをコードするＤＮＡを増幅及び発現させるために使用される。組換え発現ベクターは、複製可能なＤＮＡコンストラクトであり、これは、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結した融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントのポリペプチド鎖をコードする、合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する。転写単位は、一般に、以下にさらに詳細に記載するように、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳の開始及び終止配列との集合を含む。このような調節エレメントとして、転写を制御するオペレーター配列が挙げることができる。多種多様な発現宿主／ベクターの組合せを利用可能である。真核宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、及びサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、既知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、より広範な宿主プラスミド、例えばＭ１３、及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
【0097】
本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントの発現に好適な宿主細胞としては、適切プロモーターの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫又はより高等な真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が挙げられる。高等真核細胞としては、以下に記載の哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。無細胞翻訳系も用いることができる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物の細胞宿主との使用に適したクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）に記載されており、この関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。抗体生成を含むタンパク質生成の方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許題．６，４１３，７４６号明細書及び同第６，６６０，５０１号明細書、並びに国際公開第０４／００９８２３号パンフレットにおいて見出すことができ、これらの各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0098】
形質転換宿主により産生された融合タンパク質、ポリペプチド又は分子のＦｃＲｎ結合フラグメントは、任意の好適な方法によって精製することができる。このような標準的方法としては、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイズカラムクロマトグラフィー法）、遠心分離法、溶解度差法、又は任意の他の標準的タンパク質精製技術による方法が挙げられる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に付着させて、適切なアフィニティーカラムに通過させることによる容易な精製が可能となり得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学などの技術を使用して物理的に特徴付けることができる。
【0099】
別の態様では、本開示は、本明細書で定義される融合タンパク質、ポリペプチド又はＦｃＲｎ結合フラグメントを作製する方法を提供する。本方法は、（ｉ）３５１、３５４、３６６、３９５、４０５及び４０７のアミノ酸位置のコドンを、本明細書に記載の各位置のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって、ＦｃＲｎ結合フラグメントをコードする核酸配列の変異を誘発させる工程を含む。アミノ酸位置の番号付けは、ＥＵインデックスに従う。この方法は、変異誘発された核酸配列を発現させる工程；及び発現された融合タンパク質、ポリペプチド又はＦｃＲｎ結合フラグメントを単離する工程をさらに含む。
【0100】
いくつかの例では、本方法は、本明細書に開示されるように、ＦｃＲｎ結合フラグメントを非タンパク質剤と反応させて分子を形成するさらなる工程を含む。
【0101】
医薬組成物
本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子を含む組成物、特に、本開示の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子、及び医薬賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物（又は診断組成物）に及ぶ。
本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子を含む組成物、特に、本開示の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子、及び医薬賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物（又は診断組成物）に及ぶ。
【0102】
組成物は、通常、薬学的に許容される担体を通常含む無菌医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、ワクチン製剤に関連して、薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含み得る。
【0103】
本開示はまた、前記組成物を調製する方法、例えば、本開示の分子、例えば、本開示の加水分解された分子を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１種以上を添加し、一緒に混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製に及ぶ。
【0104】
本開示の融合タンパク質、ポリペプチド又は分子は、医薬又は診断組成物中の唯一の活性成分であっても他の活性成分を伴ってもよい。
【0105】
医薬組成物は、好適には、治療有効量の本開示による融合タンパク質、ポリペプチド又は分子を含む。治療有効量は最初に、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類で、推定することができる。また、動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。
【0106】
組成物は、患者に単独で投与することができ、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組合せて（例えば、同時に、連続的に若しくは別個に）投与することができる。
【0107】
薬学的に許容される担体は、それ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体の生成を誘導すべきでなく、また毒性であるべきでもない。
【0108】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水などの液体をさらに含有し得る。湿潤剤及び乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの助剤物質が、そのような組成物中に含まれてもよい。このような担体により、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸薬、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤及び懸濁液として製剤化することができる。
【0109】
好適な投与形態としては、非経口投与に好適な形態、例えば、注射又は注入によるもの、例えば、ボーラス注射又は連続注入によるものが挙げられる。製品が注射又は注入用である場合、それは懸濁液、溶液又はエマルションの形態をとり得、配合剤、例えば懸濁化剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤を含有し得る。或いは、本開示の分子は、使用前に適切な無菌の液体で再構成する乾燥形態であり得る。
【0110】
本開示による配合物においては、好適には、最終配合物のｐＨは、融合タンパク質、ポリペプチド又は分子の等電点の値と類似せず、例えば、配合物のｐＨが７である場合、８～９以上のｐＩが適切であり得る。
【0111】
本発明の医薬組成物は、以下に限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、国際公開第９８／２０７３４号パンフレットを参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む、任意の数の経路により投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物は、注射剤として、溶液又は懸濁液として調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態を調製することもできる。
【0112】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内若しくは筋肉内送達により達成することができ、又は組織の間質腔に送達される。組成物はまた、病変に投与することもできる。投薬治療は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールであり得る。
【0113】
薬学的に許容される担体の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。
【実施例】
【0114】
実施例１
創薬の分野では、疾患生物学及び抗体技術の両面での画期的な進歩と共に、パラダイムシフト抗体と抗体誘導体治療薬の開発が著しく進んでいる。１，２免疫腫瘍学における研究の進歩と、新規の二重特異性及び多重特異性ターゲティングプラットフォームの開発との間の相乗効果は、癌治療における最新の成功を推進するための多くの有望な可能性を生み出している。３－７臨床的有効性を達成しながら毒性を最小限にすることの重要性は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又はフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）融合タンパク質のデフォルトの二価フォーマットから標的化価を微調整する必要性を強調している。証拠の増加は、非特異的細胞死滅、サイトカイン放出、並びに望ましくない受容体架橋を減少させ、受容体アゴニズム及び輸送を改善するために、一価のターゲティングアームを有する二重特異性及び多重特異性フォーマットが必要であることを示している。８－１１Ｔ細胞エンゲージャー又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞エンゲージャー、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅ）、二重親和性再ターゲティングタンパク質（ＤＡＲＴ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、及び三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）は、一価の二重特異性及び多重特異性ターゲティングで臨床的に有望であることが示されているが、半減期が短いという欠点がある。ヘテロ二量体Ｆｃ工学は、二重特異性及び多重特異性標的化のための正しい鎖対合に導くことができるノブ・イン・ホール、ＣｒｏｓｓｍＡｂ及びＤｕｅｔｍＡｂなどの技術の開発によって、これらのエンゲージャーの半減期を延長することを可能にした。１１－１３
創薬の分野では、疾患生物学及び抗体技術の両面での画期的な進歩と共に、パラダイムシフト抗体と抗体誘導体治療薬の開発が著しく進んでいる。１，２免疫腫瘍学における研究の進歩と、新規の二重特異性及び多重特異性ターゲティングプラットフォームの開発との間の相乗効果は、癌治療における最新の成功を推進するための多くの有望な可能性を生み出している。３－７臨床的有効性を達成しながら毒性を最小限にすることの重要性は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又はフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）融合タンパク質のデフォルトの二価フォーマットから標的化価を微調整する必要性を強調している。証拠の増加は、非特異的細胞死滅、サイトカイン放出、並びに望ましくない受容体架橋を減少させ、受容体アゴニズム及び輸送を改善するために、一価のターゲティングアームを有する二重特異性及び多重特異性フォーマットが必要であることを示している。８－１１Ｔ細胞エンゲージャー又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞エンゲージャー、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅ）、二重親和性再ターゲティングタンパク質（ＤＡＲＴ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、及び三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）は、一価の二重特異性及び多重特異性ターゲティングで臨床的に有望であることが示されているが、半減期が短いという欠点がある。ヘテロ二量体Ｆｃ工学は、二重特異性及び多重特異性標的化のための正しい鎖対合に導くことができるノブ・イン・ホール、ＣｒｏｓｓｍＡｂ及びＤｕｅｔｍＡｂなどの技術の開発によって、これらのエンゲージャーの半減期を延長することを可能にした。１１－１３
【0115】
「調整可能である」血清中半減期を有する立体配座的に安定な単量体Ｆｃ抗体フラグメントの生成に成功すれば、抗体及びＦｃ融合治療薬の新たな可能性を開くことになるであろう。米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から承認を受けた１８０を超える治療用タンパク質の多くは、活性で長く持続する融合タンパク質に適合する可能性を有する。１４－１８免疫－細胞エンゲージャー、抗体－薬物コンジュゲート、免疫サイトカイン融合体、及び他の治療用タンパク質は、活性の増強及び毒性の低減のために、単一特異性及び多重特異性の両方の形式で一価のターゲティングを提供するようにオーダーデザイン（ｔａｉｌｏｒ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ）することができる。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの１つのセットとして定義される単量体Ｆｃを操作するためのこれまでの努力は、ＣＨ３－ＣＨ３二量体界面で破壊すべき広範な相互作用のために困難であることがわかっている。高濃度では、多くの変異体で単量体－二量体平衡が観察されている。１９，２０操作された単量体Ｆｃモダリティの中で、明白な均一性及び安定性を有する結晶構造を有することが報告されているのは２つの分子のみである。１３，２１これらのうちの１つは、ＣＨ３－ＣＨ３相互作用を遮断するグリコシル化部位の付加によって安定化される単量体である。２１本発明者らのグループによって生成されたもう１つは、以前の知見に基づいて合理的に設計されたＩｇＧ４ファージライブラリーに由来する単量体Ｆｃである。１３
【0116】
タンパク質治療薬の次の波のための単量体Ｆｃプラットフォームの適用を拡大するために、本発明者らは、この努力の相互に関連した次の３つの重要な側面に取り組むことにした：（１）調節可能な血清中半減期、（２）一価の二重特異性分子の多様な構築、及び（３）胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とＦｃバリアントとの相互作用の容易な構造調査。ｐＨ依存性Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用は、抗体及びその誘導体の血清中半減期の延長に関与する重要な因子である。ＦｃＲｎは抗体分子を利用し、酸性エンドソーム小胞を通してそれらを運び、リソソーム分解からそれらを保護し、中性ｐＨでの弱い結合のために細胞外にそれらを放出する。２２，２３単量体Ｆｃバリアントは、二量体結合力の喪失により、ＦｃＲｎへの見かけの結合が減少することが予想され観察される。１３，２１以前、本発明者らは、ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）変異をファージライブラリーテンプレート設計に組み込むことによって、ＦｃＲｎ結合の喪失を回避した。得られた単量体Ｆｃ分子は、ＹＴＥを含まないその対応物と比較して、ＦｃＲｎ結合親和性の１０倍を超える改善をもたらした。１３，２４
【0117】
本研究では、以前に組に込んだＹＴＥ変異により達成されたものを超える半減期延長の改変に適応可能な単量体Ｆｃ分子を操作するための構造誘導方法を報告する。これは、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインの１つのコピーのみでインビボでの血清中半減期を有意に改善することができることを示す最初の概念実証単量体二重特異性分子設計である。ＦｃＲｎとのこれらの単量体Ｆｃ分子の共結晶構造により、他の半減期延長を構築するための基礎として役立ち得る界面の詳細が明らかになった。
【0118】
結果
構造的洞察に基づくＣＨ３－ＣＨ３界面の破壊。以前の研究では、本発明者らは、Ｆｃ二量体界面の破壊を完全に安定化させるためのＣＨ３ドメインにおける一組の変異を含む合理的に設計されたＩｇＧ４ファージライブラリーから、単量体ＦｃバリアントＣ４（ＭＦｃ１という名称に変更）を生成した（図１ａ）。ＹＴＥ以外の半減期延長変異を有するこれらの二量体破壊変異の適合性を拡張するために、本発明者らは、単量体Ｆｃ配列のＣＨ２ドメインにおけるＹＴＥ変異を、残基４３２～４３８付近のＣＨ３における新たな半減期改変変異のセットで置き換えることによって、試験バリアントＴ１を用いた取り組みを開始した。この変異セットは、以下の２つの基準に適合したために選択された。第１に、新たな変異セットは、ＹＴＥ変異よりもＦｃＲｎ結合をより改善し得ることを示す以前のファージライブラリーキャンペーンの知見に基づいて、半減期をさらに延長させる方法を探求するのに役立つであろう。２５第２に、この変異セットの広範な性質は、Ｆｃ二量体化界面における破壊を維持する単量体Ｆｃの能力に関する「ストレス試験」になろう。
構造的洞察に基づくＣＨ３－ＣＨ３界面の破壊。以前の研究では、本発明者らは、Ｆｃ二量体界面の破壊を完全に安定化させるためのＣＨ３ドメインにおける一組の変異を含む合理的に設計されたＩｇＧ４ファージライブラリーから、単量体ＦｃバリアントＣ４（ＭＦｃ１という名称に変更）を生成した（図１ａ）。ＹＴＥ以外の半減期延長変異を有するこれらの二量体破壊変異の適合性を拡張するために、本発明者らは、単量体Ｆｃ配列のＣＨ２ドメインにおけるＹＴＥ変異を、残基４３２～４３８付近のＣＨ３における新たな半減期改変変異のセットで置き換えることによって、試験バリアントＴ１を用いた取り組みを開始した。この変異セットは、以下の２つの基準に適合したために選択された。第１に、新たな変異セットは、ＹＴＥ変異よりもＦｃＲｎ結合をより改善し得ることを示す以前のファージライブラリーキャンペーンの知見に基づいて、半減期をさらに延長させる方法を探求するのに役立つであろう。２５第２に、この変異セットの広範な性質は、Ｆｃ二量体化界面における破壊を維持する単量体Ｆｃの能力に関する「ストレス試験」になろう。
【0119】
本発明者らは、Ｔ１の結晶構造を解明し、二量体ＩｇＧ４ Ｆｃの結晶構造と、単量体ＦｃのＭＦｃ２（又は、ＹＴＥ変異を有さないＣ４ｎ；ＰＤＢ ＩＤ：５ＨＶＷ）の以前に解明された構造と共に解析した。１３ＭＦｃ２及びＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ３ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｃ５４）を、それぞれＣα原子上に約０．７及び０．５Åの二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有するＴ１と重ね合わせた（ＭＦｃ２構造中に人工鎖交換を形成する最後の１１残基を除外する場合）。ＣＨ３ドメインの高度の類似性にもかかわらず、Ｔ１は予想外にホモ二量体の形成を示した（図１ｂ）。しかしながら、二量体界面は、野生型ＩｇＧ４のものと大きく異なっていた。アミノ酸Ｔｈｒ３５０／Ｌｅｕ４４０及びＧｌｎ３５５／Ｇｌｕ３５６を含む水素結合の小さなセットが鎖間に形成され、単量体Ｆｃ形成の破れの可能性が示された（図１ｃ）。ＭＦｃ２と重ね合わされた新たに形成されたＴ１二量体界面を調べると、ＭＦｃ２における変異の１つ、すなわちＡｒｇ３６６がその側鎖において位置をシフトしていることが観察された。このシフトは、各鎖からのＰｈｅ３５１が「到達」し、疎水性スタッキング相互作用を形成することを可能にした。さらに、Ａｒｇ３６６変異は二量体を安定化させる新たな水素結合をほとんど確立しなかった（図１ｃ）。構造の詳細な検討から、本発明者らは、Ａｒｇ３６６シフトはＳｅｒ３５４側鎖上に空間が存在することにより部分的に可能になったと推論した。解析方法は比較的良好に挙動するＴ１タンパク質を示したが、結晶構造は、二量体界面の広範な破壊にもかかわらず、高タンパク質濃度では操作されたＦｃが二量体形成に関与し得る可能性が残っていることを示唆する。
【0120】
構造に基づく工学並びに結合及び生物物理学的特性の特徴付け。Ｔ１結晶構造において観察された新たに形成された相互作用は、より適応可能な単量体Ｆｃ分子を構築する機会を作り出した。Ｔ１二量体界面の構造検査（図１ｃ）から、３５４位のセリンをより大きな側鎖を有するアミノ酸で置換することにより、Ｐｈｅ３５１が関与する疎水性相互作用の道を開くのをＡｒｇ３６６側鎖が妨げる可能性があると考えられた。この置換はまた、結果として生じる水素結合形成を妨げる可能性がある。興味深いことに、Ｓｅｒ３５４は、本発明者らの最初のモノマーＦｃ構築物であるＭＦｃ１がＳｅｒ３５４以外の全ての標的位置に変異を生成していたにもかかわらず、元のファージライブラリーテンプレートにおいて、界面の変異位置の１つとして選ばれていた（図１ａ）１３したがって、本発明者らは、より大きな側鎖を導入するか静電反発を導入するかによってモノマー形成が完全に安定化されるかどうかを調べるために、３５４位の改良変異の小パネルを設計した。３５４位に荷電残基（Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）と嵩高い極性及び非極性の残基（Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｑ、Ｌ、Ｍ）による置換を含むＴ１バリアント（Ｔ１－ｌｉｂ）を構築し（図２ａ）、続いてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析により、ほとんど全てのＴ１－ｌｉｂ改良バリアントが単量体であることを明らかになった（図２ｂ）。
【0121】
Ｔ１－ｌｉｂバリアントの中で最も安定なモノマーを選択するために、本発明者らは、疎水性（Ｔｈ）残基の曝露の関数として熱変性を評価するための直交スクリーニングツールとして確立された示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を使用した。３２，３３Ｔ１－ｌｉｂバリアントにおける熱変性をモニターし、疎水性曝露の転移温度Ｔｈの変化を観察した。特に、アミノ酸置換のタイプは、酸性残基（Ｇｌｕ及びＡｓｐ）が塩基性残基（Ａｒｇ及びＬｙｓ）よりも最大３℃高い転移温度を生じたため、Ｔｈ順位に影響を及ぼした（図２ｃ）。
【0122】
Ｓ３５４Ｅを有する単量体Ｆｃ構造（ＭＦｃ３及びＭＦｃ４）の構造及び特性。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ及びＤＳＦの結果に基づいて、Ｓ３５４Ｅ変異を選択し、ＭＦｃプラットフォームの一般的な適用性を探索した。最初に、元の単量体Ｆｃ構築物との適合性を確認するために、結晶構造確認のために、ＭＦｃ１のＳ３５４Ｅ点変異体であるＭＦｃ３を、その非グリコシル化バリアント（Ｎ２９７Ｄ）と共に作製した（図１ａ）。非グリコシル化ＭＦｃ３タンパク質の結晶は容易に成長し、２．４Åに回折した。解明された構造は、ＭＦｃ３分子が高タンパク質濃度で単量体状態を維持することを示した（図３）。ＭＦｃ２について以前に発表された単量体Ｆｃ構造との重ね合わせは、Ｓ３５４Ｅ変異がＦｃのＣＨ２又はＣＨ３ドメインの構造に大きな変化を引き起こさなかったことを示した。１３Ｒ４０５側鎖位置のわずかな変化は別として、ＭＦｃ１における二量体破壊的変異の他の全ての元のセットは互いにほぼ完全に整列した。重要なことに、この結晶構造は、設計通り、３５４位のグルタミン酸側鎖置換が実際に突出し、Ｔ１において観察された相互作用の種類を破壊することを示した。
【0123】
ＦｃＲｎ媒介循環半減期を調節するために一組の単量体Ｆｃバリアントを構築するという本発明者らの目標に従い、本発明者らは、本発明者らの単量体Ｆｃ分子とのＦｃＲｎの相互作用の機能的及び構造的特徴付けに焦点を当てた。組換えＦｃＲｎ結合解析を用いて、本発明者らは、ＭＦｃ３がＭＦｃ１と有意に異なり、およそ３００ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を示すことを見出した（表Ａ）。この知見は、Ｓ３５４Ｅ置換がＦｃＲｎとの相互作用を変化させないことを示唆した。この結合様式を確認するために、ＭＦｃ３／ＦｃＲｎ複合体を低ｐＨで調製し、続いて精製及び結晶化し、回折データを２．６Åの分解能で収集した（図４ａ）。比較のために利用可能な最も近いＦｃ－ＦｃＲｎ複合体構造は、本発明者らのグループが解明した、３．８Åでヒト血清アルブミンと複合体を形成してヒトＦｃＲｎに結合したヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＹＴＥセットの変異を有する）からなるものであった（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｎ０Ｕ）。２９２つの界面の比較は、相互作用の様式がほぼ同じであり、電子密度マップ中の側鎖の分解の差から生じた可能性が最も高いわずかな差を有することを示した。Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用のこの構造的及び機能的不変性は、Ｓ３５４Ｅ変異がＦｃＲｎ界面から２０Å以上離れているために予想された。
【0124】
表Ａ．組換え１：１結合フォーマットにおける単量体ＦｃバリアントのヒトＦｃＲｎへの平衡結合
【0125】
【表2】
【0126】
Ｓ３５４Ｅ変異が実際にＴ１を単量体状態にするために使用することができるかどうかを評価するために、ＦｃＲｎと複合体を形成したＴ１－Ｓ３５４Ｅ（ＭＦｃ４）を結晶化させた（図４ｂ）。解析したＭＦｃ４／ＦｃＲｎ複合体構造は、ＭＦｃ４が実際に単量体であることを示した。ＭＦｃ３／ＦｃＲｎ及びＭＦｃ４／ＦｃＲｎ複合体の結晶化条件の探索が独立して行われたという事実にもかかわらず、結晶は同じ条件から成長し、ほぼ同一のセルパラメータ及び空間群を示した。以前の研究から予想されるように、ＭＦｃ３からＭＦｃ４への配列変化は、３００ｎＭから５ｎＭへの組換えＦｃＲｎ結合親和性の有意な増加をもたらした（表Ａ）２５これらの分子では、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合が観察され、ｐＨ６から中性ｐＨへの変化で結合は約５０倍の減少を示した（データは示さず）。ＭＦｃ４／ＦｃＲｎ及びＭＦｃ３／ＦｃＲｎ複合体の全体的な構造は、３，７００個の非水素原子上に０．３５ÅのＲＭＳＤで重なり合い、高度の類似性を示唆する。ＭＦｃ３／ＦｃＲｎ複合体とＭＦｃ４／ＦｃＲｎ複合体の構造を比較した図は、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用の明確な詳細を明らかにし、ＦｃＲｎ結合で観察された違いの構造的説明を提供した。ＭＦｃ４に新たに導入されたＴｙｒ４３４及びＬｅｕ４３６は、界面面積を５００Å２からほぼ６００Å２に増加させる一方、相互作用にいくらかの疎水性を加えた（図４ｃ、４ｄ）。Ｆｃ／ＦｃＲｎ界面における疎水性に寄与するものであることが知られていたＦｃＲｎ中の残基Ｌｅｕ１３５は、２９ＭＦｃ４中のＴｙｒ４３４及びＬｅｕ４３６の存在により関与していた。
【0127】
ＰＤＢｅＰＩＳＡ分析を用いて、示差溶媒和エネルギーヒートマップを用いて、ＭＦｃ３／ＦｃＲｎとＭＦｃ４／ＦｃＲｎの結合ポケットにおける個々の残基からのエネルギー寄与を捕捉した（図４ｅ）。結合界面の程度の測定として、示差溶媒和エネルギー計算は、溶媒にアクセスできなくなる構造の表面の部分を反映する。３０，３１ＭＦｃ４からの結合界面への最も強い寄与因子は、ＭＦｃ３中の残基Ｉｌｅ２５３及びＴｈｒ２５４とは対照的に、Ｉｌｅ２５３、Ｔｙｒ４３４、及びＬｅｕ４３６であることがわかった。全溶媒和エネルギー変化はＭＦｃ４で５．０９ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、ＭＦｃ３よりも著しく強い疎水性相互作用を示し、全ΔｉＧは３．１４ｋｃａｌ／ｍｏｌであった（図４ｅ）。比較として、他の利用可能なヒトＹＴＥ ＩｇＧ１ Ｆｃ－ＦｃＲｎ複合体のみについて同じ計算を行ったところ、２．６７ｋｃａｌ／ｍｏｌの類似のΔｉＧを見出し、これは、結合親和性測定と一致した。
【0128】
ＭＦｃ４／ＦｃＲｎ複合体構造はまた、野生型ヒトＦｃ／ＦｃＲｎ相互作用への構造的洞察を提供したが、これは２つの理由でこれまで利用可能ではなかった。第１に、野生型ヒトＦｃ／ＦｃＲｎ相互作用は比較的弱く、複合体の精製を不可能ではないにしても困難にする。第２に、二量体Ｆｃの結晶化傾向（したがって、「結晶化可能な断片」という名称）が非常に高いので、ほとんどの試みは、Ｆｃのみを含む結晶をもたらす（未公開データ）。本発明者らの安定な単量体Ｆｃ変異体が利用可能になる前に、本発明者らは、ＦｃとＦｃＲｎとの間の親和性を改善するためにラットＦｃ又はＦｃＹＴＥに依拠し、Ｆｃ結晶格子形成を破壊するためにアルブミンと共に、結晶形成のための結合状態の滞留時間を増加させなければならなかった。２９ＦｃＲｎとのＭＦｃ３及びＭＦｃ４構造複合体の助けを借り、それらの２つの遠位セットの変異を用いることにより、野生型結合界面とそれらの変異セットとの間のより良好な理解を得ることが可能になった。例えば、ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）変異が存在する残基２５２、２５４及び２５６付近の野生型界面では、界面溶媒和エネルギーマップは、Ｍｅｔ２５２がＦｃＲｎ界面に中程度の寄与しか有さず、Ｔｈｒ２５６は実際には関与していないことを示した（図４ｅ）。２５２－２５４－２５６ループからの最も有意なＦｃＲｎ相互作用は、Ｓｅｒ２５４によって提供された。この分析はまた、ＹＴＥの変異セットがＦｃとＦｃＲｎとの間の親和性を改善することができる理由、及びそのＳ２５４Ｔ置換が最も強い寄与を示した理由を説明する。
【0129】
モノマー二重特異性分子の構築。これらの単量体Ｆｃ分子は、一価の二重標的化Ｆｃ融合タンパク質を設計するための構成要素として容易に使用することができる。以前、本発明者らは、オナルツズマブＦａｂ－ＭＦｃ１融合タンパク質を生成するためにＭＦｃ１バリアントを使用した。８，１３本研究では、本発明者らは、単量体Ｆｃ構築物を用いて一価の二重特異性ターゲティング分子の最初の例を設計した。単一プラスミド構築により、本発明者らはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする抗体のＣ末端一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と共に、オナルツズマブ由来の同じＦａｂドメインをＭＦｃ１又はＭＦｃ４のＮ末端に結合させた（図５ａ）。構築物を、ＨＥＫ２９３懸濁培養物中での一時的発現のためにトランスフェクトし（発現力価約９０ｍｇ／Ｌ）、その後、タンパク質を一段階プロテインＡ精製で精製した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、タンパク質が単分散であり、１００ｋＤａの予想分子量を有することを示唆した（図５ｂ）。単量体二重特異性分子の二重標的化活性を、Ｏｃｔｅｔプラットフォームでサンドイッチ形式で確認した（図５ｃ）。二重特異性分子はまた、ｐＨ６で、それらの対応するＦｃＲｎ結合を、Ｆｃドメイン単独の結合の２～３倍で維持した。
【0130】
次世代単量体Ｆｃによるインビボ半減期の改善。本発明者らは、ＭＦｃ１と比較して、ＭＦｃ４バリアントにおけるインビトロＦｃＲｎ結合の有意な改善を達成した。また、本発明者らは、この改善がインビボでの血清中半減期の延長につながるかどうかを評価したいと考えた。典型的な腎臓濾過クリアランスサイズ（約６０ｋＤａ）をはるかに上回る分子量（１００ｋＤａ）を有する、新たに生成されたＦａｂ－ＭＦｃ４－ｓｃＦｖ及びＦａｂ－ＭＦｃ１－ｓｃＦｖは、３４ＦｃＲｎ結合のインビボ半減期を改善することの意味を評価するための理想的な分子である。本発明者らは、ヘミ接合ヒトＦｃＲｎ（ＴＧ２７６）トランスジェニックマウスにおけるインビボ薬物動態（ＰＫ）研究を行った。このマウスモデルは、Ｆｃ変異及び約１８時間の血清中半減期を有する標準ＩｇＧ１からのヒトＦｃＲｎ結合に対する実証可能なＰＫへの影響を反映する、よく研究されたモデルである。１３，２５，３５マウスに２．５ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を投与し、血清タンパク質濃度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。Ｆａｂ－ＭＦｃ４－ｓｃＦｖ二重特異性タンパク質は、Ｆａｂ－ＭＦｃ１－ｓｃＦｖよりも高い血清レベルを有した（図６ａ）。ＰＫパラメータを分析し、決定したところ、Ｆａｂ－ＭＦｃ４－ｓｃＦｖのクリアランス速度及び終末相半減期は、Ｆａｂ－ＭＦｃ１－ｓｃＦｖのクリアランス速度及び終末相半減期よりも有意に大きく、ほぼ２倍であった。これは、より強いＭＦｃ４媒介ヒトＦｃＲｎ結合が、ＭＦｃ１と比較して、血清タンパク質リサイクリングの増強に寄与することを示す。予想どおり、分子サイズの増加は、Ｆａｂ－ＭＦｃ１から二重特異性分子Ｆａｂ－ＭＦｃ１－ｓｃＦｖへのクリアランスの減少に寄与した。
【0131】
考察
単量体Ｆｃに基づく一価抗体又は融合タンパク質は、拡張されたクラスのタンパク質治療薬にＩｇＧ様血清特性を付与する可能性を有する。安定な単量体Ｆｃの操作の成功に続いて、我々はいくつかの重要な特性を達成するために、ＭＦｃプラットフォームの有用性を構築し拡大するための挑戦に取り組んだ。
単量体Ｆｃに基づく一価抗体又は融合タンパク質は、拡張されたクラスのタンパク質治療薬にＩｇＧ様血清特性を付与する可能性を有する。安定な単量体Ｆｃの操作の成功に続いて、我々はいくつかの重要な特性を達成するために、ＭＦｃプラットフォームの有用性を構築し拡大するための挑戦に取り組んだ。
【0132】
第１に、本発明者らは、さらなる半減期延長の可能性を含む、半減期調整のための代替Ｆｃ変異を含む、より普遍的な単量体Ｆｃ分子を確立したいと考えた。第２に、本発明者らは、ＭＦｃプラットフォームが実際に単量体状態を維持し、二重特異性分子ターゲティング、免疫腫瘍学及び受容体媒介性トランスサイトーシスを含む新規な治療用途を可能にする所望のターゲティング戦略に対して安定であり得ることを示そうと考えた。４－７，９単量体Ｆｃの周りに構築された一価の二重特異性薬物フォーマットは、エフェクター機能の完全なアブレーション、並びに毒性及びオフターゲットシンクの低減、Ｔ細胞及び他の免疫細胞エンゲージャーに最適な設計特徴の利点を提供し得る。最後に、本発明者らは、将来の単量体Ｆｃ設計の開発を可能にする計算アプローチを検証することを目的とした。これらの目標を達成するために、構造誘導分子設計の力を利用することを試みた。
【0133】
本発明者らは、以前に、ＭＦｃ１におけるＹＴＥ変異がＦｃＲｎ結合親和性を改善して、結合親和力の低下を相殺することができることを示した。１３以前のＦｃファージライブラリー及び工学的研究からのアウトプットに基づいて、本発明者らは、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合の有望な増強を伴う変異セットＴ１（図１）を特定した。これにより、ＣＨ２ドメインからのＹＴＥ変異とは対照的に、ＣＨ３ドメインにおける半減期変異に対する単量体安定化変異の適応性を評価するための理想的なテストケースが提供された。
【0134】
Ｔ１タンパク質の結晶構造は、操作されたＦｃが高タンパク質濃度で新たに充填された二量体形成に関与する可能性があることを示唆した。本発明者らはこの新たな形態のＦｃ二量体化に対する新たな半減期延長変異セットによる直接的な寄与を見出さなかったが、本発明者らはこれらの変異がタイトパッキング条件下で誘導された二量体化を可能にする役割を果たすと考える。この二量体界面の綿密な検討は、３５４位の残基の側鎖を拡大するための我々の合理的な設計を導いた。セリン残基を置換する一連の変異から、優れた熱安定性プロファイルに基づいてグルタミン酸を選択した（図２）。溶液分析法及び結晶学を用いて、本発明者らは、Ｓ３５４Ｅが単量体Ｆｃ構造を維持することができ、グルタミン酸側鎖が設計どおりに突出していることを示した（図３）。単量体Ｆｃ構造に対するＳ３５４Ｅの適応性及び活性の確認は、ＭＦｃ３及びＭＦｃ４が単量体状態を維持し、ＦｃＲｎとの広範な係合を維持した場合に共結晶構造において観察された（図４ａ、４ｃ）。これにより、Ｆｃ－ＦｃＲｎ界面を調べるために共結晶構造を容易に生成することができ、それらの結合相互作用に定量可能な差異が存在することが初めて実証された。結合界面の示差溶媒和エネルギー計算を用いて、本発明者らは、ＭＦｃ４における拡張された疎水性相互作用に起因するＦｃＲｎ結合の増強を定量することができた（図４ｂ～ｅ）。
【0135】
可変ＦｃＲｎ結合能力を有する単量体Ｆｃ分子の利用可能性により、一価の二重特異性分子ターゲティングを構築するためのＭＦｃプラットフォームの使用を検証することが可能になった。本発明者らは、実証可能なモノマー立体配座純度及び二重標的化活性を有するＭＦｃ１及びＭＦｃ４の両方を有するＦａｂ－ＭＦｃ－ｓｃＦｖ分子を作製した。腎臓濾過カットオフを十分に上回る分子サイズでは、これらの分子はＦｃＲｎ結合の改善からのインビボ薬物動態学的結果を評価するのに十分に適している。本発明者らは、Ｆａｂ－ＭＦｃ４－ｓｃＦｖ二重特異性分子が、Ｆａｂ－ＭＦｃ１－ｓｃＦｖよりも高く、標準ＩｇＧ１抗体の血清レベルに近い血清レベルを維持することを見出した。これらの結果はまた、これらのＭＦｃ構築物が調整可能な血清タンパク質リサイクリングに寄与することができ、治療の進歩を支援する次の波の技術を開発するための多用途の二重特異性プラットフォームを提供することができることを示す。
【0136】
Ｆｃ二量体の破壊によるＣＨ３ドメインの曝露は、新たな現象ではない。ＩｇＧ４骨格は、二量体－単量体平衡の間でＦｃを交互にするＩｇＧ４分子のＦａｂ－アーム交換の容易な係合のために、本発明者らのＭＦｃプラットフォームに選択された。３６さらに、強力且つ特異的な免疫応答を開始するために、Ｔ細胞エピトープは、抗原提示細胞によってプロセシングされ、提示される必要がある。３７新たに導入された変異が新規のＴ細胞エピトープを形成し得るという懸念を緩和するために、ＭＦｃ１及びＭＦｃ４における単量体形成変異周辺のインシリコＴ細胞エピトープ予測を行った。本発明者らは、これらの変異について全体的に低い予測結合率を観察し、より低い免疫原性リスクを示した。３８
【0137】
治癒的治療の最終的な成功は、免疫及び翻訳科学の深い理解と併せて、効力対毒性、及び血清中半減期対組織浸透のバランスに対処するための多くの共同努力に依拠するであろう。ＭＦｃプラットフォームは、ＩｇＧ様血清特性を模倣しながら、任意の望ましくないＦｃ受容体媒介性細胞毒性及びオフターゲットシンクを回避するための一価の二重特異的ターゲティングモチーフを提示する能力及び柔軟性を有することから、免疫細胞エンゲージャーの探索をさらに拡大するタイムリーな可能性を提供する。
【0138】
方法
倫理の表明。これらの研究において動物の使用を必要とするプロトコル（ＭＩ－１３－００１２）は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａの動物実験委員会によってレビュー、承認され、米国農務省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）の動物福祉基準、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ及び実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）に準拠する。
倫理の表明。これらの研究において動物の使用を必要とするプロトコル（ＭＩ－１３－００１２）は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａの動物実験委員会によってレビュー、承認され、米国農務省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）の動物福祉基準、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ及び実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）に準拠する。
【0139】
抗体のクローニング、発現及び精製。全ての抗体位置は、可変ドメインについてのＫａｂａｔ番号付け規則、及びＣＨ２－ＣＨ３ドメインについてのＥＵ番号付け規則に従って列挙されている。４１，４２全ての化学物質は分析グレードのものであった。オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から購入した。ｍＡｂ－Ｊをコードするプラスミドは、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）製のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキットを用いて作製し、可変重鎖及び可変軽鎖配列を社内ＩｇＧ１哺乳動物発現ベクターにコード化した。点変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、部位特異的変異誘発によって導入した。
【0140】
バリアントは、２９３Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３ＦＴに一過性にトランスフェクトした。細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させた。発現した抗体は、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって細胞上清から精製した。抗体をＰｉｅｒｃｅ ＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で溶出し、１Ｍトリス、ｐＨ８．０で中和した。抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に透析した。全ての抗体についての単量体含量は、分析ＳＥＣによって９５％超であると決定された。
【0141】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ及び分析用超遠心分離。１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の精製されたＦｃクローン及び融合タンパク質を、１１００ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により、室温で、総容積１４ｍＬのＴＳＫ－ＧＥＬ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、ＳＥＣにより分析した。試料を、１ｍＬ／ｍｉｎの流量で２０分間、ＰＢＳ中均一濃度で溶出した。溶出したタンパク質を、波長２８０ｎｍの紫外線吸光度で検出した。データ分析は、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（バージョンＡ．０２．１０）を用いて行った。カラム較正は、１０～５００ｋＤａの範囲の一連の分子量標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて行った。インラインＳＥＣ－ＭＡＬＳを実施した。試料測定は、Ｏｐｔｉｌａｂ Ｒｅｘ屈折計（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を備えたＤａｗｎ Ｈｅｌｅｏｓ ＩＩ ＭＡＬＳで行った。定義されたクロマトグラフィーピーク内の各タンパク質の分子量を、Ａｓｔｒａ、バージョン６．１（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて計算した。
【0142】
分析用超遠心分離分析では、試料及び参照バッファを、Ｅｐｏｎ中心ピースを有する１２ｍｍのダブルセクターセルに装填し、次いで、２０℃に設定されたＯｐｔｉｍａ ＸＬ－Ｉ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて、５０，０００ｒｐｍでの超遠心分離のためにＡｎ－５０ Ｔｉローターに配置した。走査２～１６０について２８０ｎｍで収集された沈降データをＳｅｄｆｉｔソフトウェア（バージョン１６．１ｃ）で分析して、ｃ（ｓ）分布を生成した。４３，４４部分比容を０．７３ｍＬ／ｇに設定した。ＰＢＳの溶液濃度及び粘性値は、Ｓｅｄｎｔｅｒｐプログラム（バージョン２０１３０８１３）からの計算値を用いて、それぞれ１．００５２３ｇ／ｍＬ及び１．０１９ｍＰａ・ｓに設定した。４５スウェドベリの式に基づいて、分子量２７ｋＤａの単量体Ｆｃは、摩擦比を１．３～１．８（球状から拡張形状）と仮定して、１．７～２．４Ｓ（スウェドベリ単位）の沈降係数を有すると予想される。
【0143】
結晶化、データ収集及び構造決定。結晶化の前に、プロテインＡで精製したＴ１、ＭＦｃ３及びＭＦｃ４を、ｐＨ８の２５ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＱ ＨＰ５ｍＬプレパックカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製し、２５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８、及び１００ｍＭ ＮａＣｌで予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＳＥＣによりさらに精製した。回収後の組換えヘテロ二量体ＦｃＲｎの培養培地を、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でアフィニティー精製用にｐＨ調整した。ＦｃＲｎをＱ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した後、ｐＨ５．２の３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に透析し、１％モル欠損のＦｃＲｎでＭＦｃ３及びＭＦｃ４と複合体を形成させ、この複合体を３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、及び１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した同じＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを用いてＳＥＣにより精製した。複合体組成を、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって確認した。
【0144】
全てのタンパク質及びタンパク質複合体の初期結晶化試験を、２０℃でシッティングドロップ蒸気拡散法により行った。結晶化液滴を、９６ウェル結晶化プレート（Ｉｎｔｅｌｌｉ－ｐｌａｔｅ １０２－０００１－２０；Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に、Ｐｈｏｅｎｉｘロボット（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって分注し、等容量のタンパク質及びリザーバー緩衝液から構成した。Ｔ１及びＭＦｃ３を単独で結晶化させるために、市販のスクリーン（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、ＵＫ）を使用した。ＦｃＲｎ複合体タンパク質の結晶化のために、本発明者らは、市販のスクリーニングに含まれる低ｐＨ条件の組合せからなる新しいスクリーニングを作製した。以下の結晶化溶液から、吊り下げ液滴形式で結晶化最適化工程において回折品質の結晶を成長させた：Ｔ１：０．０１Ｍ硫酸亜鉛七水和物；０．１Ｍモルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）一水和物、ｐＨ６．５、及び２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ５５０ ＭＭＥ、タンパク質濃度５．５ｍｇ／ｍＬ。ＭＦｃ４／ＦｃＲｎ複合体：０．２Ｍ塩化マグネシウム六水和物、１Ｍヨウ化ナトリウム、０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ６、及び２０％ＰＥＧ６０００、タンパク質濃度６．３５ｍｇ／ｍＬ。ＭＦｃ３／ＦｃＲｎ複合体：０．２Ｍ塩化マグネシウム六水和物、３０％１，５－ジアミノペンタン二塩酸塩、０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ６、及び２０％ＰＥＧ６０００、タンパク質濃度６ｍｇ／ｍＬ。ＭＦｃ３の結晶を、元のシッティングドロッププレートから、０．８％麻酔用アルカロイド（２ｗ／ｖ％塩酸リドカイン一水和物、２ｗ／ｖ％プロカイン塩酸塩、２ｗ／ｖ％塩酸プロパラカイン、２ｗ／ｖ％テトラカイン塩酸塩）、０．１Ｍ ＭＯＰＳ（酸）及びナトリウムＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、並びに沈殿物の５０ｖ／ｖ％ミックス（４０ｖ／ｖ％エチレングリコール、２０ｗ／ｖ％ＰＥＧ８０００）、タンパク質濃度７ｍｇ／ｍＬからなる条件から、直接収集した。Ｘ線分析のために収集した全ての結晶を、液体窒素中に浸漬することによってフラッシュ冷却した。Ｐｉｌａｔｕｓ ６Ｍ ＰＡＤ検出器（Ｐａｕｌ Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、スイス）を備えたＳｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ＬｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅのビームラインＢＬ９－２上の単結晶から、１８０°の振動範囲、０．５°の増分、及び１画像あたり０．８秒の露光で回折データを収集した。ＸＤＳプログラムを用いて回折データを処理した。４６全ての結晶学的計算を、ＣＣＰ４ソフトウェアスイート（バージョン７．０）を用いて行った。４７分子置換手順は、Ｍｏｌｒｅｐプログラムを用いて行った。４８Ｒｅｆｍａｃ５で構造微調整を行い、「Ｏ」プログラムでモデル調整を行った４９，５０構造を含む図は、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を用いて作成した。
【0145】
Ｏｃｔｅｔ結合分析。単量体Ｆｃ及びその融合タンパク質の社内精製組換えヒトＦｃＲｎへの結合測定は、Ｏｃｔｅｔ３８４装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）でバイオレイヤー干渉法によって行った。３ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及びＴｗｅｅｎ２０（１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒ；ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）又は１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中の１μｇ／ｍＬのビオチン化ＦｃＲｎを、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で捕捉した。ロードされたバイオセンサーをアッセイ緩衝液で洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、続いて、異なるＦｃバリアント又はＦｃ融合構築物の連続希釈によって結合及び解離を測定した。Ｏｃｔｅｔソフトウェア（バージョン７．２）を用いて、データの１：１結合動態モデルに基づく非線形適合から動態パラメータ（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）と見かけの親和性（ＫＤ）を次式により算出する。
【数2】
【0146】
組換え抗原タンパク質に対するＦａｂ－ＭＦｃ－ｓｃＦｖ分子の同時結合測定も行った。ビオチン化ｃＭｅｔタンパク質を、１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒを用い、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中のストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で５μｇ／ｍＬで捕捉した。結合工程は３００ｎＭのＦａｂ－ＭＦｃ－ｓｃＦｖを緩衝液対照と共に含み、続いて、抗原２に緩衝液対照と共に結合した。
【0147】
ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるインビボＰＫ。本研究で使用されるヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスは、マウスＦｃＲｎ欠損Ｂ６．１２９Ｘ１－Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ及びヒトＦｃＲｎ ｃＤＮＡトランスジェニック系統Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ Ｔｇ（ＣＡＧ－ＦＣＧＲＴ）２７６Ｄｃｒ／ＤｃｒＪのＦ１交配である。性別をマッチさせた（６～１６週齢）マウスに、０日目に２．５ｍｇ／ｋｇ単量体Ｆｃ融合タンパク質のボーラス静脈内用量が投与された。１つのタンパク質あたり８匹のマウスを使用し、２群のマウス（Ａ群及びＢ群）を別の時点で採血した。血液サンプルは、２～３週間試験全体を通じて異なる時点で、毛管ピペットを使用して眼窩後方神経叢から得た。全ての動物は、試験全体を通して健康なままであった。定量的ＥＬＩＳＡを使用して、試験抗体の血清濃度をモニターした。簡単に述べると、９６ウェルプレートを２μｇ／ｍＬのｃＭｅｔ細胞外ドメインでコーティングした。５μｇ／ｍＬのｃＭｅｔでコーティングされたプレートを、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の３％ウシ血清アルブミンでブロックし、次いで、異なる時点で希釈血清試料と共にインキュベートした。１：１０４希釈のヤギ抗ヒトＦｃ特異的西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を検出のために使用した。製造業者の指示に従って、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）による発色後に、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各抗体バリアントについて標準曲線を作成した。標準曲線の直線部分をＰｒｉｓｍ（バージョン６；ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で作成し、次いで、血清試料中のヒト抗ｃＭｅｔ融合タンパク質を定量するために使用した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて非コンパートメントＰＫデータ分析を行った。最大観察ピーク血漿濃度を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを用いて観察データを検査することによって決定した。終末相消失半減期を、式ｌｎ（２）／λｚ（式中、λｚは少なくとも最後の３つの時点の線形回帰によって決定される、自然対数濃度－時間曲線の終末部分の勾配である）を用いて決定した。全身曝露を、線形／対数台形則を用いて、投与開始から最後の測定可能な濃度までの血漿濃度対時間グラフ（ＡＵＣｌａｓｔ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって決定した。時間０から無限大までの血漿濃度対時間グラフのＡＵＣ（ＡＵＣ∞）を、以下のように計算した：ＡＵＣｌａｓｔ＋Ｃｌａｓｔ／λｚ（式中、Ｃｌａｓｔは最後の定量可能な濃度である）。クリアランス（ＣＬ）は用量／ＡＵＣ∞によって計算し、定常状態分布容積は、以下のように計算した：（ＡＵＭＣ∞×ＣＬ）／ＡＵＣ∞（式中、ＡＵＭＣ∞は、無限大に外挿させた最初の瞬間からのＡＵＣである）。ＰＫパラメータは統計的に要約し、平均値として示した。
【0148】
参考文献
１．Ｋａｐｌｏｎ，Ｈ．＆ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｗａｔｃｈ ｉｎ ２０１９．ＭＡｂｓ １１，２１９－２３８（２０１９）．
２．Ｈａｙ，Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ｃ．＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，４０－５１（２０１４）．
３．Ｗｏｌｆ，Ｅ．，Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｋｕｆｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，Ｂ．＆ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．ＢｉＴＥｓ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｅｄ １０，１２３７－４４（２００５）．
４．Ｆｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．，Ｌｅｎｖｉｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｚ．Ｂ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．＆ Ｖａｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＢｉＫＥｓ ａｎｄ ＴｒｉＫＥｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ＮＫ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４４１，３３３－４６（２０１６）．
５．Ｖａｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＩＬ１５ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｉｌｌｅｒ ｅｎｇａｇｅｒｓ（ＴｒｉＫＥ）ｍａｋｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＣＤ３３＋ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｈｉｌｅ ａｌｓｏ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ，ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２，３４４０－５０（２０１６）．
６．Ｓｕｕｒｓ，Ｆ．Ｖ．，Ｌｕｂ－ｄｅＨｏｏｇｅ，Ｍ．Ｎ．，ｄｅ Ｖｒｉｅｓ，Ｅ．Ｇ．Ｅ．＆ ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｄ．Ｊ．Ａ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１，１０３－１１９（２０１９）．
７．Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．，Ｊａｎｍａａｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆ Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，５８５－６０８（２０１９）．
８．Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ，ａ ＭＥＴ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０，Ｅ２９８７－９６（２０１３）．
９．Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｒａｉｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｈｕｔｔｌｅ．Ｎｅｕｒｏｎ ８１，４９－６０（２０１４）．
１０．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＡＴＴＡＣＫ，ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ ＥＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＣＤ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７，ｅ１３７７８７４（２０１７）．
１１．Ｍａｚｏｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ｄｅｓｉｇｎ．ｍＡｂｓ ７，３７７－８９（２０１５）．
１２．Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．＆ Ｒｅｇｕｌａ，Ｊ．Ｔ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＣｒｏｓｓＭＡｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉ－ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｍＡｂｓ ８，１０１０－２０（２０１６）．
１３．Ｓｈａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ４ Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１，ｅ０１６０３４５（２０１６）．
１４．Ｚｈｏｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｃ－ｄｉｍｅｒ－ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １１７，２４－３１（２０１７）．
１５．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒＨａｌｆ－Ｌｉｆｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ Ｍａｋｅ Ｂｉｏｂｅｔｔｅｒｓ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２９，２１５－３９（２０１５）．
１６．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｔｒｏｈｌ，Ｌ．Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｄｒｉｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｅａ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，（Ｃａｍｄｒｉｇｅ，２０１２）．
１７．Ｒａｔｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ＦｃＲｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｏｒ ｌｏｎｇｅｒ－ｌａｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５，２３５－５４（２０１５）．
１８．Ｌｉｕ，Ｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ９，１５－３２（２０１８）．
１９．Ｙｉｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＦｃＲｎ．ｍＡｂｓ ７，９２２－３０（２０１５）．
２０．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ４ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＭＡｂｓ ５，４０６－１７（２０１３）．
２１．Ｉｓｈｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｄａｌｉｔｙ ｂｙ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８，１６５２９－３７（２０１３）．
２２．Ｇｈｅｔｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，６３７－４０（１９９７）．
２３．Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．＆ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．ＦｃＲｎ：ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７，７１５－２５（２００７）．
２４．Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ａｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，５１７１－８０（２００２）．
２５．Ｂｏｒｒｏｋ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ＦｃＲｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｔｈａｔ ｇｏｖｅｒｎｓ ＩｇＧ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０，４２８２－９０（２０１５）．
２６．Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｈａｌｆ－ｌｉｆｅ．ｍＡｂｓ １１，１２７６－１２８８（２０１９）．
２７．Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｌ．，Ｗｅｓｔ，Ａ．Ｐ．，Ｊｒ．，Ｇａｎ，Ｌ．＆ Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｔ ２．８ Ａ ｏｆ ａｎ ＦｃＲｎ／ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７，８６７－７７（２００１）．
２８．Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｌ．＆ Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２：１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｆｃ ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８，１２６３９－４７（１９９９）．
２９．Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８９，７８１２－２４（２０１４）．
３０．Ｖｉｓｗａｎａｔｈ，Ｓ．，Ｒａｖｉｋａｎｔ，Ｄ．Ｖ．＆ Ｅｌｂｅｒ，Ｒ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｔｏｍｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８１，５９２－６０６（２０１３）．
３１．Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｅ．＆Ｈｅｎｒｉｃｋ，Ｋ．Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｓｔａｔｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７２，７７４－９７（２００７）．
３２．Ｉａｃｏｂ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆＨ／ＤＸ－ＭＳ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １０２，４３１５－２９（２０１３）．
３３．Ｉｏｎｅｓｃｕ，Ｒ．Ｍ．，Ｖｌａｓａｋ，Ｊ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．＆ Ｋｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｍ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧ１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７，１４１４－２６（２００８）．
３４．Ｔａｎｇ，Ｌ．，Ｐｅｒｓｋｙ，Ａ．Ｍ．，Ｈｏｃｈｈａｕｓ，Ｇ．＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ，Ｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３，２１８４－２０４（２００４）．
３５．Ｈａｒａｙａ，Ｋ．，Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｔ．，Ｎａｎａｍｉ，Ｍ．＆ Ｉｓｈｉｇａｉ，Ｍ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｓ ａ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ４４，１１２７－３４（２０１４）．
３６．Ｒｉｓｐｅｎｓ，Ｔ．，Ｏｏｉｊｅｖａａｒ－ｄｅＨｅｅｒ，Ｐ．，Ｂｅｎｄｅ，Ｏ．＆ Ａａｌｂｅｒｓｅ，Ｒ．Ｃ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ４ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３３，１０３０２－１１（２０１１）．
３７．Ｐａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｃ．Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，３３１－６０（１９９３）．
３８．Ｊａｗａ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ－Ｕｐｄａｔｅｄ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ ２０２０．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，１３０１（２０２０）．
３９．Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．＆ Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．Ｔｏｐ １０ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５２，１７－３５（２０２０）．
４０．Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩ：ｎｏ ｄｉｒｅｃｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ７１，２３５４－６１（２０１５）．
４１．Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ γＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ６３，７８－８５（１９６９）．
４２．Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｔｅ Ｗｕ，Ｔ．，Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．＆ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅａｌｔｈ ａｎｄＨｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）．
４３．Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｈ．，Ｂａｌｂｏ，Ａ．＆ Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １８，Ｕｎｉｔ １８．１５（２００８）．
４４．Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐ．Ｓｉｚｅ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｍｍ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ７８，１６０６－１９（２０００）．
４５．Ｌａｕｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｓｈａｈ，Ｂ．Ｄ．，Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｔ．Ｍ．＆ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｓ．Ｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄｓ．Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｅ．，Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｊ．＆Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．）９０－１２５（Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９２）．
４６．Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ｘｄｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，１２５－３２（２０１０）．
４７．Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７，２３５－４２（２０１１）．
４８．Ｖａｇｉｎ，Ａ．＆ Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＭＯＬＲＥＰ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，２２－５（２０１０）．
４９．Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，Ｚｏｕ，Ｊ．Ｙ．，Ｃｏｗａｎ，Ｓ．Ｗ．＆ Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄ，Ｍ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ４７（Ｐｔ ２），１１０－９（１９９１）．
５０．Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＲＥＦＭＡＣ５ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７，３５５－６７（２０１１）．
１．Ｋａｐｌｏｎ，Ｈ．＆ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｗａｔｃｈ ｉｎ ２０１９．ＭＡｂｓ １１，２１９－２３８（２０１９）．
２．Ｈａｙ，Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ｃ．＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，４０－５１（２０１４）．
３．Ｗｏｌｆ，Ｅ．，Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｋｕｆｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，Ｂ．＆ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．ＢｉＴＥｓ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｅｄ １０，１２３７－４４（２００５）．
４．Ｆｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．，Ｌｅｎｖｉｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｚ．Ｂ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．＆ Ｖａｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＢｉＫＥｓ ａｎｄ ＴｒｉＫＥｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ＮＫ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４４１，３３３－４６（２０１６）．
５．Ｖａｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＩＬ１５ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｉｌｌｅｒ ｅｎｇａｇｅｒｓ（ＴｒｉＫＥ）ｍａｋｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＣＤ３３＋ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｈｉｌｅ ａｌｓｏ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ，ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２，３４４０－５０（２０１６）．
６．Ｓｕｕｒｓ，Ｆ．Ｖ．，Ｌｕｂ－ｄｅＨｏｏｇｅ，Ｍ．Ｎ．，ｄｅ Ｖｒｉｅｓ，Ｅ．Ｇ．Ｅ．＆ ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｄ．Ｊ．Ａ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１，１０３－１１９（２０１９）．
７．Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．，Ｊａｎｍａａｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆ Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，５８５－６０８（２０１９）．
８．Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ，ａ ＭＥＴ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０，Ｅ２９８７－９６（２０１３）．
９．Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｒａｉｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｈｕｔｔｌｅ．Ｎｅｕｒｏｎ ８１，４９－６０（２０１４）．
１０．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＡＴＴＡＣＫ，ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ ＥＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＣＤ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７，ｅ１３７７８７４（２０１７）．
１１．Ｍａｚｏｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ｄｅｓｉｇｎ．ｍＡｂｓ ７，３７７－８９（２０１５）．
１２．Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．＆ Ｒｅｇｕｌａ，Ｊ．Ｔ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＣｒｏｓｓＭＡｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉ－ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｍＡｂｓ ８，１０１０－２０（２０１６）．
１３．Ｓｈａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ４ Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１，ｅ０１６０３４５（２０１６）．
１４．Ｚｈｏｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｃ－ｄｉｍｅｒ－ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １１７，２４－３１（２０１７）．
１５．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒＨａｌｆ－Ｌｉｆｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ Ｍａｋｅ Ｂｉｏｂｅｔｔｅｒｓ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２９，２１５－３９（２０１５）．
１６．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｔｒｏｈｌ，Ｌ．Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｄｒｉｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｅａ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，（Ｃａｍｄｒｉｇｅ，２０１２）．
１７．Ｒａｔｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ＦｃＲｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｏｒ ｌｏｎｇｅｒ－ｌａｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５，２３５－５４（２０１５）．
１８．Ｌｉｕ，Ｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ９，１５－３２（２０１８）．
１９．Ｙｉｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＦｃＲｎ．ｍＡｂｓ ７，９２２－３０（２０１５）．
２０．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ４ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＭＡｂｓ ５，４０６－１７（２０１３）．
２１．Ｉｓｈｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｄａｌｉｔｙ ｂｙ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８，１６５２９－３７（２０１３）．
２２．Ｇｈｅｔｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，６３７－４０（１９９７）．
２３．Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．＆ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．ＦｃＲｎ：ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７，７１５－２５（２００７）．
２４．Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ａｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，５１７１－８０（２００２）．
２５．Ｂｏｒｒｏｋ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ＦｃＲｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｔｈａｔ ｇｏｖｅｒｎｓ ＩｇＧ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０，４２８２－９０（２０１５）．
２６．Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｈａｌｆ－ｌｉｆｅ．ｍＡｂｓ １１，１２７６－１２８８（２０１９）．
２７．Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｌ．，Ｗｅｓｔ，Ａ．Ｐ．，Ｊｒ．，Ｇａｎ，Ｌ．＆ Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｔ ２．８ Ａ ｏｆ ａｎ ＦｃＲｎ／ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７，８６７－７７（２００１）．
２８．Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｌ．＆ Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２：１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｆｃ ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８，１２６３９－４７（１９９９）．
２９．Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８９，７８１２－２４（２０１４）．
３０．Ｖｉｓｗａｎａｔｈ，Ｓ．，Ｒａｖｉｋａｎｔ，Ｄ．Ｖ．＆ Ｅｌｂｅｒ，Ｒ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｔｏｍｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８１，５９２－６０６（２０１３）．
３１．Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｅ．＆Ｈｅｎｒｉｃｋ，Ｋ．Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｓｔａｔｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７２，７７４－９７（２００７）．
３２．Ｉａｃｏｂ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆＨ／ＤＸ－ＭＳ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １０２，４３１５－２９（２０１３）．
３３．Ｉｏｎｅｓｃｕ，Ｒ．Ｍ．，Ｖｌａｓａｋ，Ｊ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．＆ Ｋｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｍ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧ１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７，１４１４－２６（２００８）．
３４．Ｔａｎｇ，Ｌ．，Ｐｅｒｓｋｙ，Ａ．Ｍ．，Ｈｏｃｈｈａｕｓ，Ｇ．＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ，Ｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３，２１８４－２０４（２００４）．
３５．Ｈａｒａｙａ，Ｋ．，Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｔ．，Ｎａｎａｍｉ，Ｍ．＆ Ｉｓｈｉｇａｉ，Ｍ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｓ ａ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ４４，１１２７－３４（２０１４）．
３６．Ｒｉｓｐｅｎｓ，Ｔ．，Ｏｏｉｊｅｖａａｒ－ｄｅＨｅｅｒ，Ｐ．，Ｂｅｎｄｅ，Ｏ．＆ Ａａｌｂｅｒｓｅ，Ｒ．Ｃ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ４ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３３，１０３０２－１１（２０１１）．
３７．Ｐａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｃ．Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，３３１－６０（１９９３）．
３８．Ｊａｗａ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ－Ｕｐｄａｔｅｄ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ ２０２０．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，１３０１（２０２０）．
３９．Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．＆ Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．Ｔｏｐ １０ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５２，１７－３５（２０２０）．
４０．Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｗｉｔｈ ＦｃｇａｍｍａＲＩ：ｎｏ ｄｉｒｅｃｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ７１，２３５４－６１（２０１５）．
４１．Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ γＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ６３，７８－８５（１９６９）．
４２．Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｔｅ Ｗｕ，Ｔ．，Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．＆ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅａｌｔｈ ａｎｄＨｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）．
４３．Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｈ．，Ｂａｌｂｏ，Ａ．＆ Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １８，Ｕｎｉｔ １８．１５（２００８）．
４４．Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐ．Ｓｉｚｅ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｍｍ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ７８，１６０６－１９（２０００）．
４５．Ｌａｕｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｓｈａｈ，Ｂ．Ｄ．，Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｔ．Ｍ．＆ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｓ．Ｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄｓ．Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｅ．，Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｊ．＆Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．）９０－１２５（Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９２）．
４６．Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ｘｄｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，１２５－３２（２０１０）．
４７．Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７，２３５－４２（２０１１）．
４８．Ｖａｇｉｎ，Ａ．＆ Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＭＯＬＲＥＰ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，２２－５（２０１０）．
４９．Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，Ｚｏｕ，Ｊ．Ｙ．，Ｃｏｗａｎ，Ｓ．Ｗ．＆ Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄ，Ｍ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ４７（Ｐｔ ２），１１０－９（１９９１）．
５０．Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＲＥＦＭＡＣ５ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７，３５５－６７（２０１１）．
【0149】
配列
ｍＦｃ４（配列番号１）
ｍＦｃ４（配列番号１）
【化1】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】