特表 2024-519329 合成受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-10

(54)【発明の名称】合成受容体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240501BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240501BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240501BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240501BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20240501BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240501BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240501BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240501BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240501BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240501BHJP

   A61K 31/135 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 31/4418 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 31/4465 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 31/4545 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 31/46 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240501BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240501BHJP

   C07D 211/70 20060101ALN20240501BHJP

   C07D 211/46 20060101ALN20240501BHJP

   C07D 401/04 20060101ALN20240501BHJP

   C07D 451/06 20060101ALN20240501BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/705 ZNA

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/869 Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K45/00

A61P43/00 111

A61K31/7088

A61K9/20

A61P43/00 121

A61P25/00

A61P25/04

A61P9/00

A61P25/08

A61K9/08

A61K9/72

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61K31/135

A61K31/4418

A61K31/4465

A61K31/4545

A61K31/46

A61K48/00

A61K38/17

C07D211/70

C07D211/46

C07D401/04

C07D451/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023569797

(86)(22)【出願日】2022-05-11

(85)【翻訳文提出日】2024-01-09

(86)【国際出願番号】 EP2022062850

(87)【国際公開番号】W WO2022238513

(87)【国際公開日】2022-11-17

(31)【優先権主張番号】2106754.1

(32)【優先日】2021-05-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】505367464

【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】クルマン，ディミトリ

(72)【発明者】

【氏名】リーブ，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】オー デベニシュ，スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】カセラー，テレサ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C063

4C076

4C084

4C086

4C087

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C063AA01

4C063BB01

4C063CC17

4C063DD10

4C063EE01

4C076AA11

4C076AA36

4C076AA93

4C076BB01

4C076BB02

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB16

4C076BB24

4C076BB25

4C076BB29

4C076BB31

4C084AA17

4C084AA20

4C084MA01

4C084MA02

4C084MA13

4C084MA16

4C084MA35

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA06

4C084ZA08

4C084ZA36

4C084ZC41

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA16

4C086MA35

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA57

4C086MA58

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA63

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA06

4C086ZA08

4C086ZA36

4C086ZC41

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA01

4C087MA02

4C087MA16

4C087MA35

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA57

4C087MA58

4C087MA59

4C087MA60

4C087MA63

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA06

4C087NA15

4C087ZA01

4C087ZA06

4C087ZA08

4C087ZA36

4C087ZC41

4C087ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA05

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA11

4C206MA33

4C206MA36

4C206MA55

4C206MA72

4C206MA75

4C206MA77

4C206MA78

4C206MA79

4C206MA80

4C206MA83

4C206MA85

4C206MA86

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZA01

4C206ZA06

4C206ZA08

4C206ZA36

4C206ZC41

4C206ZC75

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA21

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、（ｉ）内因性活性化リガンドに対する応答性が低下し、（ｉｉ）抗ヒスタミン剤などの比較的良性な市販薬であり得る外因性作動薬によって活性化され得る、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に関する。改変は、未改変ＧＰＣＲを基準にした、特定のアミノ酸位置での変異を含む。本発明はまた、例えば、神経回路障害の治療における、改変ＧＰＣＲの投与を含む使用方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であって、
天然ＧＰＣＲである親と比較して、
（ｉ）内因性活性化リガンドに対する応答性が減少され、
（ｉｉ）外因性作動薬に対する応答性が保持又は増強され、
前記親ＧＰＣＲと比較して、以下から選択される位置に、１つ、より好ましくは２つ、３つ、又は４つの改変を含み、
（ｉ）８５
（ｉｉ）４１６
（ｉｉｉ）１２０
（ＩＶ）１２３
加えて任意選択で、前記親ＧＰＣＲと比較して、以下から選択される位置に、１つ以上の改変を含み、
（ｖ）１２８
（ｖｉ）１２１
（ｖｉｉ）２００
（ｖｉｉｉ）２０４
（ｖｉｉｉ）４１０
（ｖｉｘ）４１３
前記改変ＧＰＣＲの前記アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応させて番号付けされる、改変ＧＰＣＲ。
＊＊＊

【請求項2】

前記外因性作動薬は、ジフェンヒドラミン又はそのアナログである、請求項１に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項3】

前記外因性作動薬は、表１（Table 1）又は表２（Table 2）から選択される、請求項１又は請求項２に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項4】

前記外因性作動薬は、ジフェンヒドラミン、シプロヘプタジン、ジフェニルピラリン、デスロラタジン、ベンザトロピンから選択される、請求項１から３のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
＊＊＊

【請求項5】

前記改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の残基を含む、請求項１から４のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
（ａ）１１３Ｃ又は１１３Ｎ、及び
（ｂ）２０３Ｇ

【請求項6】

前記改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の置換のうち１つ以上を含む、請求項１から５のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
（ａ）Ｙ１１３Ｃ又はＹ１１３Ｎ、及び
（ｂ）Ａ２０３Ｇ

【請求項7】

前記改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の残基のうち１つ以上を含む、請求項１から６のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
（ｉ）８５Ｖ又は８５Ｃ
（ｉｉ）１２０Ｉ
（ｉｉｉ）４１６Ｆ
（ｉｖ）１２３Ｃ、１２３Ｉ、１２３Ｔ、又は１２３Ｓ

【請求項8】

前記改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の置換のうち１つ以上を含む、請求項１から７のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
（ｉ）Ｓ８５Ｖ又はＳ８５Ｃ、最も好ましくはＳ８５Ｖ
（ｉｉ）Ｖ１２０Ｉ
（ｉｉｉ）Ｙ４１６Ｆ
（ｉｖ）Ｌ１２３Ｃ、Ｌ１２３Ｉ、Ｌ１２３Ｔ、又はＬ１２３Ｓ

【請求項9】

前記残基（ａ）及び（ｂ）又は改変（ａ）及び（ｂ）に加えて、前記改変ＧＰＣＲは、（ｉ）；（ｉ）及び（ｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の残基又は置換を含む、請求項５から８のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項10】

前記改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の残基のうち１つ以上を含む、請求項１から９のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
（ｖ）１２８Ｉ、１２８Ｌ、又は１２８Ｖ
（ｖｉ）１２１Ｆ
（ｖｉｉ）２００Ｔ
（ｖｉｉｉ）２０４Ｙ（ｖｉｉｉ）４１０Ｖ
（ｉｘ）４１３Ｌ

【請求項11】

前記改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の置換のうち１つ以上を含む、請求項１から１０のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
（ｖ）Ｆ１２８Ｉ、Ｆ１２８Ｌ、又はＦ１２８Ｖ
（ｖｉ）Ｍ１２１Ｆ
（ｖｉｉ）Ａ２００Ｔ
（ｖｉｉｉ）Ｆ２０４Ｙ
（ｖｉｉｉ）Ｉ４１０Ｖ
（ｉｘ）Ｗ４１３Ｌ

【請求項12】

前記改変ＧＰＣＲは、（ｖ）；（ｖ）及び（ｖｉ）の残基又は置換を含む、請求項９に従属する請求項１０から１１のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項13】

前記改変ＧＰＣＲは、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆを含む、請求項１から１２のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項14】

前記改変ＧＰＣＲは、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｌ１２３Ｔ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆを含む、請求項１から１３のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項15】

前記ＧＰＣＲは、Ｇｉ結合型ＧＰＣＲである、請求項１から１４のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項16】

（ｉ）前記ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質を介してイオンチャネルに結合され、前記イオンチャネルが、任意選択で内向き整流性である、及び／又は、前記イオンチャネルが、任意選択でカリウムチャネルであり、好ましくはタンパク質結合型内向き整流性カリウムチャネルであり、及び／又は、（ｉｉ）前記ＧＰＣＲは、Ｇｑ結合型又はＧｓ結合型ＧＰＣＲである、請求項１から１５のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項17】

前記ＧＰＣＲは、コリン作動性受容体ムスカリン性受容体（ＣＨＲＭ）、ヒスタミン受容体（ＨＲＨ）、５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体（ＨＴＲ）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ）、アルファアドレナリン受容体（ＡＤＲＡ）、ベータアドレナリン受容体（β１－４アドレノセプタ）（ＡＤＲＢ）から選択される、請求項１から１６のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項18】

前記ＧＰＣＲは、ＣＨＲＭ４、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ５、ＨＲＨ１、ＨＲＨ２、ＨＲＨ３、ＨＲＨ４、５ＨＴＲ－１Ａ、５ＨＴＲ－１Ｂ、５ＨＴＲ－１Ｄ、５ＨＴＲ－１Ｅ、５ＨＴＲ－１Ｆ、５ＨＴＲ－２Ａ、５ＨＴＲ－２Ｂ、５ＨＴＲ－２Ｃ、５ＨＴＲ－４、５ＨＴＲ－５Ａ、５ＨＴＲ－６、５ＨＴＲ－７、ＤＲＤ－１、ＤＲＤ－２、ＤＲＤ－３、ＤＲＤ－４、ＤＲＤ－５、ＡＤＲＡ－１Ａ、ＡＤＲＡ－１Ｂ、ＡＤＲＡ－１Ｄ、ＡＤＲＡ－２Ａ、ＡＤＲＡ－２Ｂ、ＡＤＲＡ－２Ｃ、ＡＤＲＢ－１、ＡＤＲＢ－２、ＡＤＲＢ－３から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項19】

前記ＧＰＣＲは、表３において特定されたＧＰＣＲから選択される、請求項１から１８のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項20】

前記改変ＧＰＣＲは、表８の配列番号１－３５のいずれか１つのその天然の親ＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１から１９のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。

【請求項21】

前記改変ＧＰＣＲは、前記改変を含む表３～６のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１から２０のいずれか一項に請求する改変ＧＰＣＲ。
＊＊＊

【請求項22】

請求項１から２１のいずれか一項に記載の改変ＧＰＣＲをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項23】

前記核酸は、表８の配列番号３６－７０のいずれか１つのその天然の親ＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項２２に請求するポリヌクレオチド。

【請求項24】

請求項２２又は請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項25】

ウイルスベクターである、請求項２４に請求するベクター。

【請求項26】

アデノウイルスベクター及び／又はアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であり、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びそれらのハイブリッドからなる群より任意で選択される、請求項２５に請求するベクター。

【請求項27】

ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである、請求項２５に請求するベクター。
＊＊＊

【請求項28】

前記改変ＧＰＣＲをコードする前記核酸は、組織又は細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２５から２７のいずれか一項に請求するベクター。

【請求項29】

前記プロモーターは、神経細胞種特異的プロモーターである、請求項２８に請求するベクター。

【請求項30】

前記プロモーターは、ＣａＭｋ２Ａプロモーターである、請求項２９に請求するベクター。

【請求項31】

請求項２４から３０のいずれか一項に記載のベクターを含む、又はそれでトランスフェクションされた、又はそれで形質転換された、宿主細胞。

【請求項32】

請求項１から２１のいずれか一項に記載の改変ＧＰＣＲを作製するためのプロセスであって、
（ａ）請求項２４から３０のいずれか一項に記載の前記発現ベクターで宿主細胞を安定的に形質転換することと、
（ｂ）前記宿主細胞に好適な条件下で前記形質転換された宿主細胞を培養して、前記改変ＧＰＣＲを作製することと、
（ｃ）前記改変ＧＰＣＲを任意選択で再生することとを含む、方法。
＊＊＊

【請求項33】

親の改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に対する抗ヒスタミン剤である外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を増加させる方法であって、前記親の改変ＧＰＣＲは、以下の位置に改変された残基を含み、
（ａ）１１３、及び
（ｂ）２０３
前記親の改変ＧＰＣＲにおける１つ以上の更なる位置で更なる改変を行うことを含み、
前記親の改変ＧＰＣＲの前記アミノ酸位置は、配列番号１の前記アミノ酸配列に対応させて番号付けされる、方法。

【請求項34】

（ｉ）前記抗ヒスタミン剤は、請求項２から４のいずれか一項に定義される、及び／又は
（ｉｉ）前記更なる改変は、請求項７から１３のいずれか一項に定義される、及び／又は
（ｉｉｉ）前記ＧＰＣＲは、請求項１４から２１のいずれか一項に定義される、請求項３３に請求する方法。
＊＊＊

【請求項35】

外因性作動薬に対する応答性が改変された改変Ｇタンパク質共役受容体を作製するためのプロセスであって、親ＧＰＣＲを、以下から選択される位置での２つ、３つ、又は４つの改変によって前記親ＧＰＣＲに比較して改変することを含み、
（ｉ）８５
（ｉｉ）４１６
（ｉｉｉ）１２０
（ＩＶ）１２３
加えて任意選択で、前記親ＧＰＣＲと比較して、以下から選択される位置に、１つ以上の改変を含み、
（ｖ）１２８
（ｖｉ）１２１
（ｖｉｉ）２００
（ｖｉｉｉ）２０４
（ｖｉｉｉ）４１０
（ｉｘ）４１３
前記改変ＧＰＣＲの前記アミノ酸位置は、配列番号１の前記アミノ酸配列に対応させて番号付けされる、プロセス。

【請求項36】

前記外因性作動薬の効力及び／又は奏効性は、前記親ＧＰＣＲと比較して前記改変ＧＰＣＲにおいて増加する、請求項３５に請求するプロセス。

【請求項37】

改変される前記親ＧＰＣＲは、天然のＧＰＣＲ由来であるが、請求項５又は請求項６に定義された前記残基又は置換を含む、請求項３５又は請求項３６に請求するプロセス。

【請求項38】

（ｉ）前記外因性作動薬は、請求項２から４のいずれか一項に定義される、及び／又は
（ｉｉ）前記改変は、請求項７から１４のいずれか一項に定義される、及び／又は
（ｉｉｉ）前記ＧＰＣＲは、請求項１５から２１のいずれか一項に定義される、請求項３５から３７のいずれか一項に請求するプロセス。
＊＊＊

【請求項39】

請求項３２から３８のいずれか一項に記載の前記プロセス又は方法によって得られた、又は得ることができる、改変ＧＰＣＲ。
＊＊＊

【請求項40】

改変の使用であって、前記改変は、親の改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に導入された更なるアミノ酸改変であり、前記親の改変ＧＰＣＲが、以下の位置に改変された残基を含み、
（ａ）１１３、及び
（ｂ）２０３
抗ヒスタミン剤である外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を増加させ、
前記改変ＧＰＣＲの前記アミノ酸位置が、配列番号１の前記アミノ酸配列に対応させて番号付けされる、使用。

【請求項41】

（ｉ）前記抗ヒスタミン剤は、請求項２から４のいずれか一項に定義される、及び／又は
（ｉｉ）前記更なる改変は、請求項７から１４のいずれか一項に定義される、及び／又は
（ｉｉｉ）前記ＧＰＣＲは、請求項１５から２１のいずれか一項に定義される、請求項４０に請求する使用。

【請求項42】

前記改変又は更なる改変は、前記親ＧＰＣＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド上で行われる、請求項３３から４１のいずれか一項に請求する方法、プロセス、又は使用。

【請求項43】

（ｉ）前記親ＧＰＣＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供するステップと、
（ｉｉ）前記アミノ酸の改変又は更なる改変をコードする前記コドンを改変するステップとを含む、請求項４２に請求する方法、プロセス、又は使用。

【請求項44】

被験体又は生物の細胞内で、Ｇタンパク質の活性化を選択的に改変するか、又はＧタンパク質を活性化する方法であって、
（ｉ）請求項１から２１のいずれか一項に定義された改変ＧＰＣＲを前記細胞内で発現させるステップと、
（ｉｉ）前記発現された改変ＧＰＣＲに対する作動薬を前記被験体又は生物に投与するステップとを含む、方法。

【請求項45】

前記被験体は、ヒト被験体である、請求項４４に請求する方法。

【請求項46】

前記被験体又は生物は、非ヒト哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、又は両生類である、請求項４４に請求する方法。
＊＊＊

【請求項47】

前記細胞は、非興奮性細胞であり、任意選択で肝細胞である、請求項４４から４６のいずれか一項に請求する方法。

【請求項48】

前記細胞は、中枢神経系又は末梢神経系からのニューロン、筋細胞、内分泌細胞からなる前記リストから選択される興奮性細胞である、請求項４４から４６のいずれか一項に請求する方法。

【請求項49】

前記Ｇタンパク質の活性化は、任意選択的にニューロンである興奮性細胞の興奮性を変化させる、請求項４８に請求する方法。
＊＊＊

【請求項50】

任意選択で哺乳類のニューロンである興奮性細胞の前記興奮性を領域特異的及び時間特異的な方式で改変するための、請求項４９に請求する方法であって、
（ａ）改変ＧＰＣＲをコードする請求項２２から３０のいずれか一項に定義されたポリヌクレオチド又はベクターの有効量を前記被験体に投与するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記改変ＧＰＣＲを発現させるステップと、
（ｃ）前記発現された改変ＧＰＣＲに対する前記外因性作動薬を前記哺乳類に投与するステップとを含む、方法。

【請求項51】

前記外因性作動薬は、請求項２から４のいずれか一項に定義される、請求項４４から５０のいずれか一項に請求する方法。

【請求項52】

被験体における疾患又は障害を治療する方法であって、
（ｉ）請求項１から２１のいずれか一項に定義された改変ＧＰＣＲを前記被験体の標的細胞又は器官中に発現させるステップと、
（ｉｉ）前記発現された改変ＧＰＣＲに対する作動薬を前記被験体に投与するステップとを含む、方法。

【請求項53】

被験体における疾患又は障害を治療する方法であって、
（ａ）改変ＧＰＣＲをコードする請求項２２から３０のいずれか一項に定義されたポリヌクレオチド又はベクターの有効量を前記被験体に投与するステップと、
（ｂ）前記被験体の標的細胞又は器官中に、ステップ（ａ）の前記改変ＧＰＣＲを発現させるステップと、
（ｃ）前記発現された改変ＧＰＣＲに対する外因性作動薬を前記被験体に投与するステップとを含む、方法。

【請求項54】

前記ポリヌクレオチド又はベクターは、直接注入によって前記被験体に投与される、及び／又は、前記外因性作動薬は、請求項２から４のいずれか一項に定義される、請求項５３に請求する方法。

【請求項55】

前記疾患又は障害は、神経系の疾患又は障害であり、前記改変ＧＰＣＲは、中枢神経系又は末梢神経系において発現される、請求項５２から５４のいずれか一項に請求する方法。

【請求項56】

前記神経系の前記疾患又は障害は、神経回路障害である、請求項５５に請求する方法。

【請求項57】

前記神経系の前記疾患又は障害は、精神神経障害又は神経変性疾患である、請求項５５又は請求項５６に請求する方法。

【請求項58】

前記疾患又は障害は、精神神経障害、神経変性疾患、慢性痛、脳血管障害（ＣＶＡ）、脳卒中から選択される、請求項５５から５７のいずれか一項に請求する方法。

【請求項59】

前記疾患又は障害は、発作性障害である、請求項５５から５７のいずれか一項に請求する方法。

【請求項60】

前記改変ＧＰＣＲが、前記患者の脳中の発作焦点のニューロンにおいて発現されて、前記改変ＧＰＣＲの活性化は、前記発作焦点における前記ニューロンの興奮性を可逆的に変化させる、請求項５９に請求する方法。

【請求項61】

前記改変受容体の活性化は、（ｉ）前記発作焦点における興奮性ニューロンの興奮性及びそれによる神経伝達を可逆的に阻害するか、又は（ｉｉ）前記発作焦点において抑制性ニューロンを可逆的に興奮させる、請求項６０に請求する方法。

【請求項62】

（ｉ）前記発作性障害は、てんかんであり、任意選択で焦点性てんかん又は全般てんかんである、及び／又は
（ｉｉ）前記被験体は、薬剤耐性又は医学的に難治性のてんかんと診断されている、及び／又は
（ｉｉｉ）前記被験体は、抗てんかん薬による既存の治療下にあり、前記方法は、既存の治療を中断すること、又は薬物療法を低減することを可能にする目的を有する、及び／又は、
（ｉｖ）前記被験体は、持続性部分てんかんと診断されている、及び／又は
（ｖ）前記外因性リガンドは、前記患者がてんかん性発作を患う前の前記被験体に投与される、及び／又は
（ｖｉ）前記外因性リガンドは、てんかん性発作中の前記被験体に投与される、及び／又は
（ｖｉｉ）前記外因性リガンドは、てんかん性発作を患った後の前記被験体に投与される、及び／又は
（ｖｉｉｉ）前記外因性リガンドは、前記ヒトがてんかん性発作を患う前３０分以内、又は患った後２４時間以内に前記被験体に投与される、及び／又は
（ｉｘ）前記外因性リガンドは、（ｉ）自動化された発作検出メカニズムに一方に連結されたデバイスによって、又は（ｉｉ）ＥＥＧ解析による予測された発作に応じて、の一方で自動的に前記被験体に投与される、及び／又は
（ｘ）前記外因性リガンドは、前記発作性障害を治療するための１つ以上の他の薬剤との併用療法で投与される、請求項５９から６１のいずれか一項に請求する方法。

【請求項63】

前記疾患又は障害は、非中枢神経系障害及び非末梢神経系障害である、請求項５２から５４のいずれか一項に請求する方法。

【請求項64】

前記作動薬は、経口；静脈内又は筋肉内経路による非経口；皮下注射；舌下、バッカル、鼻腔内、直腸；吸入器又はネブライザを介して；目又は皮膚の局所；耳、くも膜下腔内、腟内、膀胱内からなるリストから選択される経路によって投与される、請求項５２から６３のいずれか一項に請求する方法。
＊＊＊

【請求項64】

任意選択で請求項５２から６３のいずれか一項に定義された方法に従って、被験体における疾患又は障害の治療で使用するための、請求項２２から３０のいずれか一項に定義されたポリヌクレオチド又はベクター。

【請求項65】

任意選択で請求項５２から６３のいずれか一項に定義された方法に従って、被験体における疾患又は障害の前記治療で使用するための、請求項１から２１のいずれか一項に定義された改変ＧＰＣＲ。

【請求項66】

請求項５２から６３のいずれか一項に定義された方法に従って、被験体における疾患又は障害の前記治療で使用するための、請求項２から４のいずれか一項に定義された外因性作動薬。

【請求項67】

発作性障害の治療方法において使用するための医薬品の調製における、請求項６４から請求項６６のいずれか一項に定義されたポリヌクレオチド又はベクター、及び／又は改変ＧＰＣＲ、及び／又は外因性作動薬の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、治療に使用するための合成Ｇタンパク質共役受容体、並びに、それに関連する方法及び材料に関する。

【背景技術】

【0002】

合成Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を使用する遺伝子治療は、神経回路の制御可能な操作を達成するために、外因性薬剤に対するニューロンの感受性を付与するのに大きな期待が持てる。例えば、抑制性ヒトＭ４（ｈＭ４）ムスカリン性受容体は、その内因性リガンドであるアセチルコリンに対して非感受性となるように変異されているが、抗精神病剤であるクロザピン及びオランザピンを含む一連の分子に対して感受性になっている。

【0003】

このように改変された受容体は、文献中ではＤＲＥＡＤＤ（デザイナードラッグによって排他的に活性化されたデザイナー受容体）及びＲＡＳＳＬ（合成リガンドにより単に活性化された受容体）と呼ばれている。

【0004】

実験動物の脳におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用したｈＭ４ ＤＲＥＡＤＤ（ｈｍ４Ｄ）の発現は、忍容性が良好であり、外因性リガンドの非存在下では効果がない。

【0005】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１３６２４７号（ユーシーエルビジネスリミテッド）は、ｈＭ４由来ＤＲＥＡＤＤ（ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ））が、齧歯類の脳のてんかん原性領域で発現されたとき、クロザピン、オランザピン又はクロザピン－Ｎ－酸化物、クロザピンの代謝物の投与において、発作をどのようにオンデマンドで抑制できたかを記載している。他のＤＲＥＡＤＤについても記載されている。

【0006】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０４５１７８Ａ１号（ラトガーズ、州立大学）は、被験体の神経系の疾患又は障害の治療における使用に関する。

【0007】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／１７５４４３号（ピッツバーグ大学－コモンウェルス高等教育システム）は、神経系関連の疾患又は障害の治療のための興奮性細胞又は分泌細胞で使用するための改変されたリガンド依存性イオンチャネルタンパク質に関する。

【0008】

技術における更なる開発は、Ａｖａｌｉａｎｉ Ｎら、「ＤＲＥＡＤＤｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｓｅｉｚｕｒｅ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ．」、Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２３．１０（２０１６）：７６０－７６６ｌ；Ｅｖａｎ Ｗｉｃｋｅｒ及びＰａｔｒｉｃｋ Ａ Ｆｏｒｃｅｌｌｉ、「Ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｌｉｎｅ ａｎｄ ｉｎｔｒａｌａｍｉｎａｒ ｔｈａｌａｍｕｓ ｂｌｏｃｋｓ ａｍｙｇｄａｌａ－ｋｉｎｄｌｅｄ ｓｅｉｚｕｒｅｓ．」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２８３（２０１６）：４０４－４１２；Ｆｒｅｄｒｉｋ Ｂｅｒｇｌｉｎｄ、Ｍｙ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｍｅｒａｂ Ｋｏｋａｉａ、「Ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｅｉｚｕｒｅｓ．」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ８．１（２０１８）：１－１５；Ｊａｎａ Ｄｅｓｌｏｏｖｅｒｅら、「Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．」、Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ、６０．１１（２０１９）：２３１４－２３２４；Ｍｉｋａｉｌ Ｗｅｓｔｏｎ、「Ｏｌａｎｚａｐｉｎｅ：ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｇｏｎｉｓｔ ａｔ ｔｈｅ ｈＭ４Ｄ （Ｇｉ） ＤＲＥＡＤＤ ａｍｅｎａｂｌｅ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ５．４（２０１９）：ｅａａｗ１５６７によって記載されている。

【0009】

それらの治療的有用性を考慮すると、当技術分野で公知のものとは異なる活性化特性を有する新規のＤＲＥＡＤＤを提供することによって、この分野で有用な技術的貢献が提供されることがわかる。

【発明の概要】

【0010】

本発明者らは、公知のＤＲＥＡＤＤを活性化するために使用される薬剤が、状況においては最適下限であり得ることを観察した。例えば、オランザピン及びクロザピンは両方とも、それらの抗精神病効果に寄与する、ヒスタミン作動性、ムスカリン性、及びドーパミン作動性受容体を含む多数の薬理標的を有する。それらはいずれも、処方のみの薬である。

【0011】

オランザピンは比較的忍容性が高いが、軽度に鎮静性があり、軽度の体重増加、抗ムスカリン性副作用、好酸球増加症、及び性機能不全を伴う。クロザピンは加えて、てんかん誘発性であり得、頻繁な血液検査を必要とする白血球異常を伴うため、活性化リガンドとしての魅力が薄れる。
＊＊＊

【0012】

本発明者らは、従来技術のＤＲＥＡＤＤで使用されていたものとは異なるタイプの薬剤によって活性化可能となるように、ＧＰＣＲ中の活性化特性を改変する残基を定義するべく、革新的なアプローチを使用した。これらの新たなＤＲＥＡＤＤは、抗ヒスタミン剤などの比較的良性の市販薬であるリガンドによって活性化され得る。

【0013】

非限定的な例として、発明者らは、ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）受容体中の残基を変更することで、忍容性の高い抗ヒスタミン薬ジフェンヒドラミンによって活性化され得るようにした。

【0014】

本発明者らは更に、相応して薬理を改変する他のＧタンパク質共役受容体中の残基を特定した。

【0015】

これらの改変は、望ましい性質の組み合わせ、すなわち、関連する薬剤による比較的高い効力及び比較的高い奏効性、並びにリガンド非存在下における低い基底活性を提供する。市販薬によって活性化され得るこれらのデザイナー受容体は、本明細書において、純粋に簡潔さのために、「ＧＲＡＮＰＡ」（非処方剤によって活性化されるＧタンパク質共役受容体）と称される場合がある。

【0016】

ＧＲＡＮＰＡは、被験体の標的細胞、例えば、ニューロンにおいて、Ｇタンパク質媒介細胞応答に影響を与える、又はそれを誘発するために使用され得る。例えば、細胞集団は、ＧＲＡＮＰＡをコードするベクターで形質転換され得る。したがって、ＧＲＡＮＰＡは、広範囲の適応症、特に神経回路障害の治療に有用性を有する。

【0017】

より具体的には、以下に記載するように、本発明者らは更に、コリン作動性受容体としても公知のＭ４受容体（ＣＨＲＭ４）アセチルコリン受容体に由来するムスカリン性４型ＤＲＥＡＤＤ（ｈＭ４Ｄ）を、既知のＹ１１３Ｃ及びＡ２０３Ｇ置換の組み込みによって改変した。Ｍ４受容体の野生型アミノ酸配列を、配列番号１に示す。別段の記載がない限り、すべての番号付けは、このＭ４受容体配列を指す。

【0018】

ｈＭ４Ｄの広範な変異導入及び新規の「市販の」リガンドを用いた活性の様々なスクリーニングにより、有益な性質を付与するいくつかの新規の変異体が特定された。

【0019】

公知のＤＲＥＡＤＤと同様に、ＧＲＡＮＰＡにおいて、（ｉ）内因性活性化リガンドに対する応答性が低下し、（ｉｉ）本明細書に記載されたタイプの、外因性作動薬（アゴニスト）に対する応答性が保持又は増強する。本明細書に記載の「応答性」は、リガンド又は外因性作動薬の効力（potency）及び／又は奏効性（efficacy）に関する。

【0020】

例えば、Ｓ８５Ｖ及びＹ４１６Ｆにおいては、リガンドジフェンヒドラミンで効力が改善されたが、一方で、Ｖ１２０Ｉにおいては、奏効性が改善された。

【0021】

本明細書で使用される「効力」は、調査されたタンパク質に対する、最大効果の半分（ＥＣ５０）に必要な薬物の濃度である。

【0022】

本明細書で使用される「奏効性」は、対照化合物と比較して、調査されたタンパク質に対する、薬剤で達成され得る最大効果（Ｅｍａｘ）である。

【0023】

これらの変異の組み合わせは、（少なくとも）相加効果を有した。
これらの位置での変異、及び好ましい実施形態において、これらの特定の置換（Ｓ８５Ｖ、Ｙ４１６Ｆ、及びＶ１２０Ｉ）は、個別に及び組み合わされて、本発明の態様を構成している。

【0024】

好ましいｈＭ４Ｄ ＧＲＡＮＰＡにおいては、Ｓ８５Ｖ＋Ｙ１１３Ｃ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｙ４１６Ｆが組み込まれている。

【0025】

有益な性質を付与する他の変異、例えば、Ｌ１２３Ｔ、Ｌ１２３Ｃ、Ｌ１２３Ｓ、Ｌ１２３Ｖ、又はＬ１２３Ｉ、Ｆ１２８Ｉ、Ｆ１２８Ｌ、又はＦ１２８Ｖ、Ｍ１２１Ｆ、Ａ２００Ｔ、Ｆ２０４Ｙ、Ｗ４１３Ｌ、及びＩ４１０Ｖも、本明細書に記載されている。

【0026】

これらの位置での変異、及び好ましい実施形態において、これらの特定の置換も、個別に及び組み合わされて、本発明の態様を構成している。

【0027】

別段の記載がない限り、これらの新規の改変（すなわち、Ｙ１１３Ｃ及びＡ２０３Ｇの変異を含まない）のいずれかは、本明細書において、簡潔さのために「本発明の改変」と称される場合がある。

【0028】

例えば、更に参照された好ましいｈＭ４Ｄ ＧＲＡＮＰＡにおいては、Ｌ１２３ＴがＳ８５Ｖ、Ｙ４１６Ｆ、及び／又はＶ１２０Ｉと組み合わせて組み込まれている。

【0029】

ｈＭ４Ｄ由来のＧＲＡＮＰＡは、Ｇ_ｉアルファサブユニット（又は、Ｇ_ｉ／Ｇ_０、又はＧｉタンパク質）に結合され、Ｇタンパク質結合型内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）を活性化する。

【0030】

上記のように、本発明者らは、他のＧタンパク質共役受容体において対応する残基を特定し、したがってそれらの薬理も同様に改変し得る。したがって、本発明は、ＧＰＣＲに広い適応性を有する。別段の記載がない限り、本発明の改変がＭ４受容体配列を参照して記載される場合は常に、開示は、本明細書で検討されたＧＰＣＲ中の対応する改変について準用することが理解されるであろう。「対応する」位置及び改変の特定は、以下に詳細に記載され、したがって、そのような対応する改変はまた、「本発明の改変」であると理解されるべきである。

【0031】

したがって、本発明の一態様において、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が提供され、改変ＧＰＣＲにおいては、
天然ＧＰＣＲである親と比較して、
（ｉ）内因性活性化リガンドに対する応答性が低下し、
（ｉｉ）外因性作動薬に対する応答性が保持又は増強し、
改変ＧＰＣＲは、親ＧＰＣＲと比較して、以下から選択される位置に、１つ、より好ましくは２つ、３つ、又は４つの改変を含み、
（ｉ）８５
（ｉｉ）４１６
（ｉｉｉ）１２０
（ｉｖ）１２３
加えて任意選択で、親ＧＰＣＲと比較して、以下から選択される位置に、１つ以上の改変を含む。
（ｖ）１２８
（ｖｉ）１２１
（ｖｉｉ）２００
（ｖｉｉｉ）２０４
（ｖｉｉｉ）４１０
（ｖｉｘ）４１３

【0032】

本明細書中の全ての場合において（文脈に別段の要求がない限り）、改変ＧＰＣＲに対して与えられるアミノ酸の位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応させて番号付けされる（すなわち、アミノ酸の位置は、配列番号１の番号付けに対応するものである）。以下でより詳細に記載されるように、実際のアミノ酸の番号付けはそれゆえ、配列番号１と比較して当のＧＰＣＲで異なってよい。

【0033】

上記で説明したように、改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の残基を含んでよい。
（ａ）１１３Ｃ又は１１３Ｎ、及び
（ｂ）２０３Ｇ

【0034】

改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の置換の１つ以上を含んでよい。
（ａ）Ｙ１１３Ｃ又はＹ１１３Ｎ、及び
（ｂ）Ａ２０３Ｇ

【0035】

改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の残基のうちの１つ以上を含んでよい。
（ｉ）８５Ｖ又は８５Ｃ
（ｉｉ）１２０Ｉ
（ｉｉｉ）４１６Ｆ
（ｉｖ）１２３Ｃ、１２３Ｉ、１２３Ｔ、又は１２３Ｓ

【0036】

改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の置換の１つ以上を含んでよい。
（ｉ）Ｓ８５Ｖ又はＳ８５Ｃ、最も好ましくはＳ８５Ｖ
（ｉｉ）Ｖ１２０Ｉ
（ｉｉｉ）Ｙ４１６Ｆ
（ｉｖ）Ｌ１２３Ｃ、Ｌ１２３Ｉ、Ｌ１２３Ｔ、又はＬ１２３Ｓ

【0037】

改変ＧＰＣＲは、残基（ａ）及び（ｂ）又は改変（ａ）及び（ｂ）に加えて、上記（ｉ）；（ｉ）及び（ｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の残基又は置換を含んでよい。

【0038】

上記の残基又は改変に加えて、改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の残基のうちの１つ以上を含んでよい。
（ｖ）１２８Ｉ、１２８Ｌ、又は１２８Ｖ
（ｖｉ）１２１Ｆ
（ｖｉｉ）２００Ｔ
（ｖｉｉｉ）２０４Ｙ（ｖｉｉｉ）４１０Ｖ
（ｉｘ）４１３Ｌ

【0039】

改変ＧＰＣＲは、以下の位置に以下の置換の１つ以上を含んでよい。
（ｖ）Ｆ１２８Ｉ、Ｆ１２８Ｌ、又はＦ１２８Ｖ
（ｖｉ）Ｍ１２１Ｆ
（ｖｉｉ）Ａ２００Ｔ
（ｖｉｉｉ）Ｆ２０４Ｙ
（ｖｉｉｉ）Ｉ４１０Ｖ
（ｉｘ）Ｗ４１３Ｌ

【0040】

一実施形態において、改変ＧＰＣＲは、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｌ１２３Ｔ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆを含む。

【0041】

一実施形態において、改変ＧＰＣＲは、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆを含む。

【0042】

いくつかの実施形態において、改変ＧＰＣＲは、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｔ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｃ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｃ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｓ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｓ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｉ、
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｉ、又は
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｖ、を含む。
＊＊＊

【0043】

別の態様において、親の改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に対する抗ヒスタミン剤である外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を増加させる方法であって、親の改変ＧＰＣＲは、以下の位置に改変された残基を含み、
（ａ）１１３、及び
（ｂ）２０３
上記のような、親の改変ＧＰＣＲにおける１つ以上の更なる位置で更なる改変を行うことを含み、
親の改変ＧＰＣＲのアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応させて番号付けされる。

【0044】

一実施形態において、外因性作動薬（又は外因性リガンド）は、ジフェンヒドラミン又はそのアナログである。他の実施形態において、外因性作動薬又はリガンドは、表１（Table 1）又は表２（Table 2）から選択され、例えば、ジフェンヒドラミン、シプロヘプタジン、ジフェニルピラリン、デスロラタジン、ベンザトロピンから選択される。
＊＊＊

【0045】

ＧＰＣＲ
本明細書で使用される「ＧＰＣＲ」は、そのナチュラルリガンドの結合及び受容体の活性化時に、細胞応答をもたらすＧタンパク質媒介シグナルを伝達する受容体を意味する。ＧＰＣＲは、進化的に関連したタンパク質の大きなファミリーを形成する（国際特許出願公開第ＷＯ９７／０３５４７８号参照）。ＧＰＣＲファミリーのメンバーであるタンパク質は構造的に関連しており、一般に、７つの推定膜貫通ドメインから構成される。

【0046】

ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｇｕｉｄｅｓ／ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／（内容は、相互参照により本明細書に援用する）で説明されるように、ＧＰＣＲは、真核生物における膜受容体の最大のグループであり、脳の中におけるシグナル伝達分子の最大のクラスである。ＧＰＣＲは、光、ペプチド、糖、及び脂質を含む様々な細胞外シグナルを遮断し、シグナル伝達を細胞内Ｇタンパク質に中継し得る細胞表面受容体である。ＧＰＣＲに結合する細胞内Ｇタンパク質は、３つのサブユニット、すなわちアルファ、ベータ、及びガンマサブユニットで構成される。静止状態では、ヘテロ三量体Ｇタンパク質はＧＰＣＲに結合し、特に、アルファサブユニットはその不活性の、ＧＤＰ結合状態にある。シグナルがＧＰＣＲによって受け取られると、Ｇタンパク質を活性化する立体構造シフトを受け、ＧＴＰとＧＤＰの交換を引き起こす。三量体Ｇタンパク質はここで、活性な、ＧＴＰ結合アルファサブユニットとベータ－ガンマ二量体複合体の２つの部分に解離した後、両方とも横方向に拡散し（原形質膜に結合したまま）、他の膜タンパク質にシグナルを伝達し得る。

【0047】

活性化Ｇタンパク質は、他の様々なタンパク質にシグナル伝達し得、セカンドメッセンジャーの産生を活性化し得る。

【0048】

タンパク質サブユニットはそれぞれ、異なる結合パートナーを有する異なるバージョンを有するため、機能する。哺乳類においては、５つのベータサブユニット、１１のガンマサブユニット、及び２０のアルファサブユニットが特定されている。これらのＧタンパク質には、標的を活性化するものもあり、他のものは、阻害効果を有し得、Ｇタンパク質を構成するための様々なＧタンパク質サブユニットの組み合わせによって、生物内のＧタンパク質及びＧＰＣＲシグナル伝達の多様なレパートリーが生じる。例えば、アルファサブユニットαｓ（Ｇαｓ）は、アデニル酸シクラーゼを活性化して、共通のセカンドメッセンジャーの産生を引き起こす。ニューロンにおいては、ｃＡＭＰの上昇はニューロン発火を活性化するが、平滑筋においては、ｃＡＭＰの上昇は筋肉弛緩を引き起こす。あるいは、アルファサブユニットαｉ（Ｇαｉ）は、アデニル酸シクラーゼを阻害し、結果として、対立する効果（それぞれ、ニューロン阻害及び平滑筋収縮）を有し得る。異なるアルファサブユニットも、同様の表現型の結果を有し得る。例えば、アルファサブユニットαｑ（Ｇαｑ）も、平滑筋収縮を引き起こすが、ホスホリパーゼＣの活性化を介してなる。したがって、Ｇタンパク質は、多様なシグナル伝達経路を活性化し得、様々な細胞応答に至り得る。

【0049】

本発明は、抑制性ＧＰＣＲ及び興奮性ＧＰＣＲの両方に有用性がある。

【0050】

ＧＰＣＲは、通常、１つのＧタンパク質サブタイプを好むが、複数のサブタイプに結合することが可能である。例えば、ヒトムスカリン性受容体Ｍ１は、主にＧαｑを活性化するが、Ｇαｉ及びＧαｓの経路に結合することも示されている。しかしながら、ヒトムスカリン性受容体Ｍ３は、Ｇαｑと結合することが示されているのみである。

【0051】

ニューロンにおけるＤＲＥＡＤＤ及びそれらの活性の非限定的な例は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｇｕｉｄｅｓ／ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／において与えられる。

【0052】

【表1】

【0053】

ＧＰＣＲがニューロンの興奮性、ひいては神経伝達を改変し得る別のメカニズムは、Ｇタンパク質を介したＧタンパク質結合型内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）への結合によるものである。ここで、Ｇタンパク質結合型の細胞応答は、したがって、膜過分極及びニューロン阻害である。

【0054】

本明細書で使用される場合、「Ｇタンパク質共役細胞応答」は、ＧＰＣＲによるリガンド結合時に発生する細胞応答又はシグナル伝達経路を意味する。本発明に関するそのようなタンパク質共役細胞応答は、ニューロンの興奮性、ひいては神経伝達を改変するものである。１つの応答は、阻害応答であり、リガンドによる受容体の活性化がシナプスのサイレンシング又は阻害を引き起こす。

【0055】

本明細書に記載されるように、本発明者は、アレスチンの動員、（ｃＡＭＰ産生を阻害する能力を検証するための）Ｇｉカスケード、及び（Ｋｉｒ３．１及びＫｉｒ３．２のＧＩＲＫのＧタンパク質依存性開口を試験するための）電気生理学アッセイを含む種々のアッセイを使用した。

【0056】

一実施形態において、ＧＰＣＲは、Ｇｉ結合型ＧＰＣＲである。

【0057】

一実施形態において、ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質を介してイオンチャネルに結合され、イオンチャネルが、任意選択で内向き整流性である、及び／又は、イオンチャネルが、任意選択でカリウムチャネルであり、好ましくはタンパク質結合型内向き整流性カリウムチャネルである。

【0058】

一実施形態において、ＧＰＣＲは、Ｇｑ結合型又はＧｓ結合型ＧＰＣＲである

【0059】

一実施形態において、ＧＰＣＲは、コリン作動性受容体ムスカリン性受容体（ＣＨＲＭ）、ヒスタミン受容体（ＨＲＨ）、５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体（ＨＴＲ）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ）、アルファアドレナリン受容体（ＡＤＲＡ）、ベータアドレナリン受容体（β１－４アドレノセプタ）（ＡＤＲＢ）から選択される。

【0060】

一実施形態において、ＧＰＣＲは、ＣＨＲＭ４、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ５、ＨＲＨ１、ＨＲＨ２、ＨＲＨ３、ＨＲＨ４、５ＨＴＲ－１Ａ、５ＨＴＲ－１Ｂ、５ＨＴＲ－１Ｄ、５ＨＴＲ－１Ｅ、５ＨＴＲ－１Ｆ、５ＨＴＲ－２Ａ、５ＨＴＲ－２Ｂ、５ＨＴＲ－２Ｃ、５ＨＴＲ－４、５ＨＴＲ－５Ａ、５ＨＴＲ－６、５ＨＴＲ－７、ＤＲＤ－１、ＤＲＤ－２、ＤＲＤ－３、ＤＲＤ－４、ＤＲＤ－５、ＡＤＲＡ－１Ａ、ＡＤＲＡ－１Ｂ、ＡＤＲＡ－１Ｄ、ＡＤＲＡ－２Ａ、ＡＤＲＡ－２Ｂ、ＡＤＲＡ－２Ｃ、ＡＤＲＢ－１、ＡＤＲＢ－２、ＡＤＲＢ－３から選択される。

【0061】

一実施形態において、ＧＰＣＲは、以下の表３で特定されたＧＰＣＲから選択される。
＊＊＊

【0062】

本発明が非ｈＭ４ ＧＰＣＲで利用される場合、Ｍ４受容体（ＣＨＲＭ４）に対して番号付けされたものに「対応する」残基は、本明細書の開示に基づいて容易に特定され得る。

【0063】

実施例１３は、本発明の変異の対応する位置を明示的に示すために、ＧＰＣＲのアライメントを提供する。

【0064】

これらのＧＰＣＲにおける天然の残基は、参照番号付けに使用されたＣＨＲＭ４に与えられたものと必ずしも同一でなくてもよいことが理解されるであろう。それにもかかわらず、アミン作動性ＧＰＣＲ間の高度な保存性（例えば、実施例１３、図２３及び２４参照）のため、本発明は、これらの他のＧＰＣＲに同様に適用され得る。

【0065】

例として、選択されたＧＰＣＲにおけるＣＨＲＭ４のアミノ酸に対応する天然の残基は以下の通りである。
Ｓ８５Ｖ：ＣＨＲＭ（Ｓ）、ＨＲＨ３（Ｃ）、ＨＲＨ４（Ｓ）。したがって、再び例として、ＨＲＨ３における対応する置換は、Ｃ→Ｖである。対応する位置は、８７である。したがって、これは、ＨＲＨ３においてＣ８７Ｖである。
Ｖ１２０Ｉ：ＣＨＲＭ（Ｖ）、ＨＲＨ３（Ａ）、ＨＲＨ４（Ｖ）。したがって、例として、ＨＲＨ３における対応する置換は、Ａ→Ｉである。対応する位置は、１２２である。したがって、これは、Ａ１２２Ｉである。

【0066】

更に、対応する位置及び天然の残基は、実施例１３に列挙される。
＊＊＊

【0067】

あるいは、本発明の任意の態様又は実施形態において、「Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号付けシステム」は、「対応する」位置及び残基を特定するために使用されてよい。このクラスＡ ＧＰＣＲ残基番号付けシステム（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ ＪＡ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｈ、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｂｉｎｇ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ． １９９５；２５：３６６－４２８）は、当技術分野で十分に理解され、２０１５年までに１１００回を超える引用があった（Ｖｉｇｎｉｒ Ｉｓｂｅｒｇら、「Ｇｅｎｅｒｉｃ ＧＰＣＲ ｒｅｓｉｄｕｅ ｎｕｍｂｅｒｓ-ａｌｉｇｎｉｎｇ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｍａｐｓ ｗｈｉｌｅ ｍｉｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇａｐｓ．」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３６．１（２０１５）：２２－３１参照）。

【0068】

簡単に言えば、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号付け方式は、ＧＰＣＲの７回膜貫通型（ＴＭ）ヘリックスのそれぞれにおける高度に保存された残基の存在に基づく。これは、２つの数字からなり、第１の数字は、ヘリックスを示す１～７、第２の数字は、数字５０のように定義された、最も保存された残基を基準にした残基位置を示す。例えば、５．４２は、ＴＭ５に位置し、最も保存された残基であるＰｒｏ５．５０の８残基前に位置する残基を示す。

【0069】

このシステムを使用すると、ＣＨＲＭ４を参照して本明細書に記載される残基は、以下のＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号付けを有する。
Ｓ８５－（２．５７）
Ｙ１１３－（３．３３）
Ｖ１２０－（３．４０）
Ｍ１２１－（３．４１）
Ｌ１２３－（３．４３）
Ｆ１２８－（３．４８）
Ａ２００－（５．４３）
Ａ２０３－（５．４６）
Ｆ２０４－（５．４７）
Ｉ４１０－（６．４５）
Ｗ４１３－（６．４８）
Ｙ４１６－（６．５１）
＊＊＊

【0070】

本発明のＧＲＡＮＰＡは、それ自体が、ＤＲＥＡＤＤ又は天然のＧＰＣＲの機能的変異体であるが、本明細書に記載のＧＲＡＮＰＡ由来の更なる変異体が本発明で同様に採用され得ることを当業者は理解するであろう。

【0071】

例えば、ＧＲＡＮＰＡは、それにもかかわらず、それらの活性又は有用性に実質的に影響を及ぼさない（野生型を基準とした）更なる改変を含んでもよい。本発明によれば、薬剤における好ましい更なる変更は、「保存的な」又は「安全な」置換として一般に知られている。保存的なアミノ酸置換は、薬剤の構造及び生物学的機能を保存するために、化学的性質が十分に類似したアミノ酸との置換である。特に、挿入又は欠失が数個のアミノ酸、例えば、１０未満、好ましくは５未満含むのみであり、薬剤の機能的確認に重要であるアミノ酸（例えば、作動薬結合ポケット）を除去したり置換したりしない場合、機能の変化なしに、アミノ酸の挿入及び欠失が上で定義された配列においても生じ得ることは明らかである。文献は、保存的アミノ酸置換の選択が、天然タンパク質の配列及び／又は構造の統計的及び物理化学的研究に基づいて実施され得る多くのモデルを提供する。このような場合、ＧＲＡＮＰＡは、例えば、ナチュラルリガンドではなく作動薬の存在下での標的細胞活性化など、上で定義された用語の性質を保持する。

【0072】

更に、遺伝コードの縮重により、任意の核酸配列が、それによってコードされる薬剤タンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく、その機能的変異体を提供するために変化又は変更され得ることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更された配列を有する、したがってサイレント変化を生じるものである。
＊＊＊

【0073】

ＧＰＣＲの改変、及びＧＲＡＮＰＡの発現は、従来の分子生物学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）を通じて本開示に照らして、当業者によって行われ得る。例としてのベクター及びプロモーターは、以下に記載される。

【0074】

本発明の実施形態は更に、本明細書に記載のＧＲＡＮＰＡをコードする核酸又は単離核酸を対象とする。更なる実施形態は、調節配列に作動可能に連結された、本明細書に記載の核酸又は単離核酸を含む発現ベクターを対象とする。

【0075】

また、更なる実施形態は、本明細書に記載の発現ベクター、又は本明細書に記載のＧＲＡＮＰＡをコードする核酸を含む宿主細胞を対象とする。

【0076】

更なる別の実施形態は、ＧＲＡＮＰＡをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を安定的に形質転換することと、形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養してＧＲＡＮＰＡを作製することと、ＧＲＡＮＰＡを再生することとを含む、本明細書に記載のＧＲＡＮＰＡを作製する方法を対象とする。

【0077】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞又は真菌細胞である。これらは、例えば、構造分析又は抗体を惹起するためのＧＲＡＮＰＡタンパク質の作製に有用であり得る。

【0078】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳類細胞（例えば本発明の方法によって治療される被験体）又は幹細胞である。この目的に適したベクターは、以下に記載される。

【0079】

ＧＲＡＮＰＡタンパク質の安定的な発現のために、適切な発現宿主は、エスケリキア属（例えば、大腸菌）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス又はシュードモナス・スタッツェレイ）、プロテウス属（例えば、ミラビリス変形菌）、ラルストニア属（例えば、ラルストニア・ユートロファ）、ストレプトマイセス属、ブドウ球菌属（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス）、ラクトコッカス属（例えば、ラクトコッカス・ラクチス）、又はバシラス属（枯草菌、バシラス・メガテリウム、バシラス・リケニフォルミスなど）を含む細菌の発現宿主属である。また、特に適したものは、出芽酵母、分裂酵母、ヤロウィア・リポリティカ、ハンセヌラ・ポリモルファ、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスなどの酵母発現宿主である。

【0080】

また、マウス（例えば、ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ、又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系などの哺乳類の発現宿主も適している。昆虫細胞又はウイルス発現系（例えば、Ｍ１３、Ｔ７ファージ、又はラムダなどのバクテリオファージ、又はバキュロウイルスなどのウイルス）などの他の真核宿主も、ＧＲＡＮＰＡなどの組換えポリペプチドを作製するのに適している。
＊＊＊

【0081】

ＧＲＡＮＰＡは、それらが誘導される野生型参照ＧＰＣＲ又はＤＲＥＡＤＤに「実質的に類似」し得る変異体ポリペプチドであり、それらが誘導された参照ＧＰＣＲと、少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。

【0082】

例えば、それらは、表８で特定された配列番号１－３５のポリペプチド配列のいずれか１つと実質的に類似していてよい。

【0083】

例えば、一実施形態において、改変ＧＰＣＲは、表８の配列番号１－３５のいずれか１つの天然の親ＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有する。

【0084】

改変ＧＰＣＲは、上記改変を含む、表３～６のいずれか１つに示される配列を含んでよい。

【0085】

「変異体ポリヌクレオチド」という用語は、ＧＲＡＮＰＡをコードし、親ポリヌクレオチドと特定の程度の相同性／同一性を有する、又はストリンジェントな条件下で親ポリヌクレオチド又はその相補体にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドをいう。例えば、変異体ポリヌクレオチドは、親ポリヌクレオチドと、少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。

【0086】

例えば、それらは、表８で特定された配列番号３６－７０のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと実質的に類似していてよい。

【0087】

例えば、本発明は、本明細書に記載の改変ＧＰＣＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0088】

核酸は、表８の配列番号３６～７０のいずれか１つのその天然の親ＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有してよい。

【0089】

異なるアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列間の同一性の割合の計算は、以下のように実施され得る。まず、ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムによってマルチプルアライメントが生成される（ペアワイズパラメータ：ギャップオープニング１０．０、ギャップ延長０．１、タンパク質マトリックスＧｏｎｎｅｔ２５０、ＤＮＡマトリックスＩＵＢ；複数のパラメータ：ギャップオープニング１０．０、ギャップ延長０．２、遅延発散配列３０％、ＤＮＡ遷移重量０．５、負のマトリックスオフ、タンパク質マトリックスＧｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡ重量ＩＵＢ；タンパク質ギャップパラメータ、残基特異的ペナルティオン、親水性ペナルティオン、親水性残基ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、ギャップ隔離距離４、エンドギャップ隔離オフ）。次いで、同一性の割合は、マルチプルアライメントから、（Ｎ／Ｔ）＊１００として計算され、ここで、Ｎは、２つの配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、比較された位置の総数である。あるいは、同一性の割合は、（Ｎ／Ｓ）＊１００として算出され得、Ｓは、比較対象であるより短い配列の長さである。アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は、新規に合成されてもよく、又は天然のアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列、又はその誘導体であってもよい。

【0090】

外因性作動薬
上で説明されたように、発明者らは、抗ヒスタミン剤などの市販薬となり得る、従来技術のＤＲＥＡＤＤで使用されていたものとは異なるタイプの薬剤によって活性化可能となるように、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）中の活性化特性を改変する残基を定義するべく、革新的なアプローチを使用した。

【0091】

したがって、ＧＲＡＮＰＡは、外因性作動薬の存在によって活性化される。外因性作動薬（又は「薬剤」、リガンド、又は小分子、用語は一般に、本明細書中でほとんど同じ意味で使用される）は、ＧＲＡＮＰＡを発現する標的細胞に直接的又は間接的に送達され得るものである。投与様式は、以下により詳細に検討される。リガンドは、一般に標的細胞に存在しない、又は、ＧＲＡＮＰＡを活性化しない十分に低い基底濃度で存在するという点で、外因性である。

【0092】

ＧＲＡＮＰＡが発現され得る適切な標的細胞は、以下でより詳細に検討される。

【0093】

一実施形態において、標的細胞は脳内にあり、作動薬は、直接投与されるか、又は、受動的にもしくは能動輸送を介してのいずれかで血液脳関門を透過し得る。通常、血液脳関門を通過する分子は、ペプチド分子よりも荷電が少ない。合成薬物は、分子上の荷電基の数に応じて、血液脳関門を通過するようにも、通過しないようにもすることができる（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、１９９３、Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４０：３３－９８参照）。より小さな分子、例えば、４０００Ｄａ未満の分子も、血液脳関門を通過する可能性がより高い。

【0094】

リガンドは、自然の産物であってもよいが、好ましくは、リガンドは合成である、すなわち自然には発生しない。好ましいリガンドは、ＧＲＡＮＰＡ活性化以外の最小限の又は良性の生物活性を有するものである。好ましくは、リガンドは、本明細書に記載の「市販の」薬剤、例えば、抗ヒスタミン剤又はその構造アナログである。本明細書に記載のこれらのリガンドのいずれかは、簡潔さのために「本発明の作動薬」と称される場合がある。

【0095】

１つの好ましいリガンドは、抗ヒスタミン薬ジフェンヒドラミン（ＤＰＨ）である。これは、Ｎｙｔｏｌ Ｏｒｉｇｉｎａｌ、Ｎｙｔｏｌ Ｏｎｅ－ａ－Ｎｉｇｈｔ、Ｓｌｅｅｐｅａｚｅ、Ｂｅｎｙｌｉｎ Ｃｈｅｓｔｙ Ｃｏｕｇｈｓ、Ｃｏｖｏｎｉａ Ｎｉｇｈｔ Ｔｉｍｅ Ｆｏｒｍｕｌａ、及びＨｉｓｔｅｒｇａｎを含む、英国で利用可能な軽度の鎮静性抗アレルギー又は抗乗り物酔い治療として使用されるいくつかの市販医薬品の有効成分又は構成要素として使用されてきた。米国では、他の人気ブランドの中でもベナドリル及びＮｙｔｏｌとして販売されており、エキセドリン、Ｓｕｄａｆｅｄ、モトリンＰＥ、及びロビタシンＮｉｇｈｔ Ｔｉｍｅ Ｃｏｕｇｈ ａｎｄ Ｃｏｌｄを含む他の多くの非処方医薬品の構成要素である。

【0096】

ＤＰＨは、ＤＲＥＡＤＤのリガンドとしていくつかの利点を提供する。例えば：
（ｉ）忍容性が高く、安全である。
（ｉｉ）その薬理は、よく知られており、Ｈ１拮抗薬として作用する濃度と、異なる受容体に作用する濃度との間で十分に分離されている。
（ｉｉｉ）乗り物酔いでの使用を含む軽度の鎮静剤として有効であるという事実は、それがヒトの中枢神経系に浸透することの確認である。
多くの天然のＧＰＣＲは、既存のＤＲＥＡＤＤで使用されるクロザピンと比較して、ＤＰＨに対して比較的低い結合親和性を示す。

【0097】

【表2】

【0098】

本明細書に記載の改変は、ＤＰＨ又は関連化合物の効力及び／又は奏効性を増強するために使用され得、それによって、それらを治療用ＧＲＡＮＰＡに対する有効な作動薬にする。

【0099】

代替リガンドは、以下から選択されてよい。
表１（Table 1）－ジフェンヒドラミンと化学的類似性を有する薬剤及びその塩の例
（－）－セチリジン、アルプラゾラム、アミトリプチリン、アモキサピン、アンタゾリン、ベンザトロピン、臭化ビベンゾニウム、ビペリデン、ブロマジン、ブロモジフェンヒドラミン、塩酸ブロモジフェンヒドラミン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、ブトルファノール、ブトリプチリン、カプトジアム、カルビノキサミン、マレイン酸カルビノキサミン、セチリジン、クロルシクリジン、クロルフェナミン、クロルフェノキサミン、シンナリジン、シノキサシン、クロミプラミン、クロペラスチン、シアメマジン、シクリジン、シクロベンザプリン、シクロペントレート、シクリミン、デメキシプチリン、デシプラミン、デスベンラファキシン、デクスブロムフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、クエン酸ジフェンヒドラミン、塩酸ジフェンヒドラミン、臭化メチルジフェンヒドラミン、サリチル酸ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、ドキセピン、ドキシラミン、エンブラミン、エメダスチン、フェルバメート、フェンジリン、フルコナゾール、フルメキサドール、フルナリジン、フルオレセイン、ホスフェニトイン、グリコピロレート、ヒドロキシジン、イミプラミン、レバロルファン、レボセチリジン、マジンドール、メクリジン、メピラミン、メキタジン、メトジラジン、メチキセン、ミアンセリン、モキサスチン、ネホパム、ノルトリプチリン、オランザピン、オルフェナドリン、クエン酸オルフェナドリン、塩酸オルフェナドリン、オキシトリプチリン、パロキセチン、ペルヘキシリン、フェニンダミン、フェニラミン、プロシクリジン、プロガビド、プロトリプチリン、ロトキサミン、トリヘキシフェニジル、トリミプラミン、トリペレナミン、トリプロリジン、チマゾリン。

【0100】

表２（Table 2）－他の抗ヒスタミン剤
アクリバスチン、アリメマジン、酒石酸アリメマジン、アンタゾリン、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、ベポタスチン、ビラスチン、ブロマジン、ブロモジフェンヒドラミン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、カルビノキサミン、セチリジン、クロルシクリジン、クロロジフェンヒドラミン、クロロピラミン、クロルフェナミン、クロルフェニラミン、シンナリジン、クレマスチン、クロフェダノール、シクリジン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスブロムフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、マレイン酸デクスクロルフェニラミン、デキストロメトルファン、ジメンヒドリナート、マレイン酸ジメチンデン、ジメチンデン、ジフェニルピラリン、ドスレピン、ドキシラミン、エバスチン、エンブラミン、エメダスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、ケトチフェン、レボカバスチン、レボセチリジン、ロラタジン、メクリジン、メピラミン、ミルタザピン、ミゾラスチン、ナファゾリン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルプロパノールアミン、フェニルトロキサミン、ピゾチフェン、プロメタジン、プロピオマジン、プソイドエフェドリン、ピリラミン、クエチアピン、キフェナジン、ルパタジン、セルトラリン、テルフェナジン、トンジルアミン、トラゾドン、トリメプラジン、トリペレナミン、トリプロリジン、キシロメアゾリン。
＊＊＊

【0101】

ＧＲＡＮＰＡが、その対応する天然のＧＰＣＲによるナチュラルリガンドの結合を基準として、減少した、好ましくは実質的に減少した、より好ましくは実質的に排除された、選択されたナチュラルリガンドに対する結合を示すという点で、本明細書で使用されるＧＲＡＮＰＡは、それらの対応する天然のＧＰＣＲ対して改変されることが理解される。したがって、ＧＲＡＮＰＡ活性は、選択されたナチュラルリガンド（例えば、アセチルコリン）の自然な変動によって比較的影響を受けない。好ましくは、選択されたナチュラルリガンドのＧＲＡＮＰＡ結合は、少なくとも５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは５０倍、更により好ましくは７５倍減少され、ＧＲＡＮＰＡの対応する天然のＧタンパク質共役受容体による結合を基準として１００倍以上減少し得る。

【0102】

ＧＲＡＮＰＡは、選択されたナチュラルリガンドの結合親和性に対する、合成リガンド（例えば、上記の抗ヒスタミン剤又は他の薬剤）結合親和性の比によっても特徴付けられ得る。好ましくは、本発明のＧＲＡＮＰＡは、選択されたナチュラルリガンド結合に対する高い合成リガンド結合の比を示し、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、好ましくは少なくとも１．０、より好ましくは少なくとも５、更に好ましくは１０、更により好ましくは１００以上の合成リガンド：選択されたナチュラルリガンド結合比を示す。

【0103】

好ましくは、ＧＲＡＮＰＡは、天然のＧタンパク質共役受容体の合成リガンド：選択されたナチュラルリガンド結合比よりも、２倍大きい、好ましくは５倍大きい、より好ましくは１０倍大きい、更に好ましくは５０～１００倍大きい結合比を示す。

【0104】

ＧＲＡＮＰＡは、選択されたナチュラルリガンドへの露出による活性化レベルに対する、合成リガンドへの露出による活性化のレベルの比（「活性化率」）によっても特徴付けられ得る。活性化レベルは、本明細書の実施例に記載されるように測定され得る。好ましくは、本発明のＧＲＡＮＰＡは、選択されたナチュラルリガンド活性化に対する合成リガンド活性化の比を示し、少なくとも０．８、好ましくは少なくとも１．０、より好ましくは少なくとも５、更に好ましくは１０、更により好ましくは１００以上の合成リガンド：選択されたナチュラルリガンド活性化率を示す。好ましくは、ＧＲＡＮＰＡは、天然のＧタンパク質共役受容体の合成分子リガンド：選択されたナチュラルリガンド活性化率よりも、２倍大きい、好ましくは５倍大きい、より好ましくは１０倍大きい、更に好ましくは５０～１００倍大きい活性化率を示す。
＊＊＊

【0105】

本発明は、本明細書に記載の本発明のアミノ酸改変のうち１つ以上で、ペプチド又はそれをコードする核酸を改変することによって、変異体又は改変ＧＰＣＲを作製する方法を提供する。これらは、（抗ヒスタミン剤などの）外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を増加させるために使用され得る。

【0106】

本発明は、本明細書に記載のＧＲＡＮＰＡを、それをコードする核酸からの発現によって作製する方法を提供する。

【0107】

本発明は、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に対する（抗ヒスタミン剤などの）外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を増加させる方法であって、
改変ＧＰＣＲが、以下の位置に改変された残基を含み、
（ａ）１１３、及び
（ｂ）２０３
改変ＧＰＣＲにおける１つ以上の更なる位置で、本発明の追加の改変を行うことを含む方法を提供する。そのような方法は、通常、それをコードする核酸の改変によって実施され得る。

【0108】

本発明は、新規の技術的効果を達成するための、本明細書に記載の本発明の変形の使用を提供する。そのような改変は、改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に導入された１つ以上のアミノ酸であり、改変ＧＰＣＲは、以下の位置に改変された残基を含み、
（ａ）１１３、及び
（ｂ）２０３
（抗ヒスタミン剤などの）外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を増加させる。この使用は、それをコードする核酸の改変を含み得る。

【0109】

したがって、一態様において、外因性作動薬に対する応答性が改変された改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を作製するためのプロセスであって、親ＧＰＣＲを、以下から選択される位置での２つ、３つ、又は４つの改変によって親ＧＰＣＲに比較して改変することを含み、
（ｉ）８５
（ｉｉ）４１６
（ｉｉｉ）１２０
（ＩＶ）１２３
加えて任意選択で、親ＧＰＣＲと比較して、以下から選択される位置に、１つ以上の改変を含み、
（ｖ）１２８
（ｖｉ）１２１
（ｖｉｉ）２００
（ｖｉｉｉ）２０４
（ｖｉｉｉ）４１０
（ｉｘ）４１３
改変ＧＰＣＲのアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応させて番号付けされる、プロセスが提供される。

【0110】

このプロセスは、親ＧＰＣＲと比較して、改変ＧＰＣＲにおける外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を改善するためであってよい。

【0111】

改変される親ＧＰＣＲは、上記の（例えば、１１３及び／又は２０３での）特定の残基又は置換を含む天然ＧＰＣＲに由来してもよい。

【0112】

本明細書に記載のプロセス又は方法によって得られた、又は得ることができる改変ＧＰＣＲも提供される。

【0113】

本発明の別の態様は、抗ヒスタミン剤などの外因性作動薬の効力及び／又は奏効性を増加させるための、本明細書に記載の改変の使用を提供し、この改変は、親の改変Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に導入された更なるアミノ酸改変である。親の改変ＧＰＣＲは、以下の位置、（ａ）１１３及び（ｂ）２０３に改変された残基を含み、改変ＧＰＣＲのアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応させて番号付けされる。

【0114】

有用性及び使用方法
一態様において、本発明は、被験体又は生物の細胞において、Ｇタンパク質の活性化を選択的に改変する、又はＧタンパク質を活性化する方法であって、
（ｉ）細胞内でＧＲＡＮＰＡを発現させるステップと、
（ｉｉ）発現されたＧＲＡＮＰＡに対する本発明の作動薬を被験体又は生物に投与するステップとを含む、方法を提供する。

【0115】

ＧＲＡＮＰＡは、通常、作動薬の投与前に細胞内で発現される。そのような方法は、領域及び時間特異的な方式で細胞におけるＧタンパク質の活性化を変化させるために使用され得る。

【0116】

したがって、被験体又は生物は、方法の実施前に、ポリヌクレオチドを前もって投与されていてもよい。それらの場合、異種ＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが、被験体又は生物の細胞内にすでに存在する。

【0117】

次いで、活性化されると、Ｇタンパク質は、例えば、細胞、組織、被験体、又は生物の興奮性又は他の特徴に影響を与え得る、更なるシグナル伝達経路及び細胞プロセス又は応答を阻害又は刺激し得る（Ｇαｓ、Ｇαｉ、及びＧαｑタンパク質、並びに、上記対応する改変ＧＰＣＲの議論を参照）。

【0118】

被験体又は生物
哺乳類は、ヒト被験体であってよい。

【0119】

哺乳類は、非ヒト哺乳類、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット）又は霊長類などの試験動物であってもよい。哺乳類は、遺伝子組換え哺乳類であってもよい。

【0120】

被験体又は生物は、鳥類、魚類、爬虫類、又は両生類であってもよい。

【0121】

そのような試験動物（ヒトではない）は、本発明の更なる態様を構成する。

【0122】

標的細胞種
本明細書に記載されるように、方法は、多種多様な標的細胞種で有用性があり、発現（例えば、細胞特異的発現）及び投与の方法又は様式は、被験体及び所望の標的細胞種に応じて採用される。

【0123】

好ましくは、細胞は、中枢神経系又は末梢神経系のニューロン、横紋筋及び平滑筋を含む筋細胞、又は内分泌細胞などの「興奮性細胞」である。

【0124】

ＧＲＡＮＰＡは、ｈＭ３Ｄ（Ｇｑ）が以前にこのように使用されていたため、自律神経系及び心臓の操作に有用性があり得る（Ａｇｕｌｈｏｎ Ｃ、Ｂｏｙｔ ＫＭ、Ｘｉｅ ＡＸ、Ｆｒｉｏｃｏｕｒｔ Ｆ、Ｒｏｔｈ ＢＬ、ＭｃＣａｒｔｈｙ ＫＤ、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｂｙ ａｃｕｔｅ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．」、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３ Ｎｏｖ １５；５９１．２２：５５９９－６０９、ｄｏｉ：１０．１１１３／ｊｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３．２６１２８９、Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｓｅｐ １６、ＰＭＩＤ：２４０４２４９９、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８５３４９８；Ｋａｉｓｅｒ Ｅ、Ｔｉａｎ Ｑ、Ｗａｇｎｅｒ Ｍ、Ｂａｒｔｈ Ｍ、Ｘｉａｎ Ｗ、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｌ、Ｒｕｐｐｅｎｔｈａｌ Ｓ、Ｋａｅｓｔｎｅｒ Ｌ、Ｂｏｅｈｍ Ｕ、Ｗａｒｔｅｎｂｅｒｇ Ｐ、Ｌｕ Ｈ、ＭｃＭｉｌｌｉｎ ＳＭ、Ｂｏｎｅ ＤＢＪ、Ｗｅｓｓ Ｊ、Ｌｉｐｐ Ｐ、「ＤＲＥＡＤＤ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｍａｊｏｒ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｇｑ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｏｎ ｃａｒｄｉａｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２０１９ Ｍａｙ １；１１５（６）：１０５２－１０６６、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｙ２５１、ＰＭＩＤ：３０３２１２８７、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６７３６０７９）。

【0125】

ＧＲＡＮＰＡは、膵臓のアルファ細胞を操作するためにｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）が以前にこのように使用されているため、膵機能を変化させるのに有用性があり得る（Ｚｈｕ Ｌ、Ｄａｔｔａｒｏｙ Ｄ、Ｐｈａｍ Ｊ、Ｗａｎｇ Ｌ、Ｂａｒｅｌｌａ ＬＦ、Ｃｕｉ Ｙ、Ｗｉｌｋｉｎｓ ＫＪ、Ｒｏｔｈ ＢＬ、Ｈｏｃｈｇｅｓｃｈｗｅｎｄｅｒ Ｕ、Ｍａｔｓｃｈｉｎｓｋｙ ＦＭ、Ｋａｅｓｔｎｅｒ ＫＨ、Ｄｏｌｉｂａ ＮＭ、Ｗｅｓｓ Ｊ、「Ｉｎｔｒａ－ｉｓｌｅｔ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．」、ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１９ Ａｐｒ ２３；５（１０）：ｅ１２７９９４、ｄｏｉ：１０．１１７２／ｊｃｉ．ｉｎｓｉｇｈｔ．１２７９９４、ＰＭＩＤ：３１０１２８６８、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６５４２６００）。

【0126】

他の実施形態において、細胞は、「非興奮性」細胞、例えば、肝細胞である。例えば、肝細胞におけるｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）の活性化は、グルコース制御を悪化させ、肝細胞におけるＧｉの欠失は、グルコース制御を改善すると考えられている（Ｒｏｓｓｉ Ｍ、Ｚｈｕ Ｌ、ＭｃＭｉｌｌｉｎ ＳＭ、Ｐｙｄｉ ＳＰ、Ｊａｉｎ Ｓ、Ｗａｎｇ Ｌ、Ｃｕｉ Ｙ、Ｌｅｅ ＲＪ、Ｃｏｈｅｎ ＡＨ、Ｋａｎｅｔｏ Ｈ、Ｂｉｒｎｂａｕｍ ＭＪ、Ｍａ Ｙ、Ｒｏｔｍａｎ Ｙ、Ｌｉｕ Ｊ、Ｃｙｐｈｅｒｔ ＴＪ、Ｆｉｎｋｅｌ Ｔ、ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ ＯＰ、Ｗｅｓｓ Ｊ、Ｈｅｐａｔｉｃ Ｇｉ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｗｈｏｌｅ－ｂｏｄｙ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１８ Ｆｅｂ １；１２８（２）：７４６－７５９、ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ９４５０５、Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｊａｎ １６、ＰＭＩＤ：２９３３７３０１、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５７８５２５７）。したがって、Ｇｓ連結型ＧＲＡＮＰＡは、グルコース制御の改善に有用性があり得る。
＊＊＊

【0127】

本発明の一態様において、哺乳類の中枢神経系（例えば、脳）におけるニューロンの興奮性を領域及び時間特異的な方式で選択的に改変する方法であって、
ａ．ＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを被験体に投与するステップと、
ｂ．ＧＲＡＮＰＡに対する作動薬の投与前に、ステップ（ａ）のＧＲＡＮＰＡを発現させるステップと、
ｃ．発現されたＧＲＡＮＰＡに対する作動薬を被験体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

【0128】

上記で説明したように、好ましい実施形態において、上記ＧＲＡＮＰＡの活性化は、被験体の神経系のニューロンの興奮性を変化させる。

【0129】

通常、ＧＲＡＮＰＡは、中枢神経系（脳又は脊髄）で発現される。この目的に適したベクター及びプロモーターは、以下に記載される。

【0130】

ＧＲＡＮＰＡの活性化は、興奮性ニューロンによる神経伝達を阻害し得るか、又は抑制性ニューロンを活性化し得る。抑制性ニューロンの活性化は、シナプスのサイレンシング又は阻害などの抑制性応答をもたらし得る。

【0131】

他の実施形態において、ＧＲＡＮＰＡの活性化は、興奮性ニューロンを活性化し得る。

【0132】

他の実施形態において、ＧＲＡＮＰＡの活性化は、興奮性ニューロンを阻害し得る。

【0133】

他の実施形態において、ＧＲＡＮＰＡの活性化は、抑制性ニューロンを阻害し得る。

【0134】

したがって、一態様において、本発明は、哺乳類の中枢神経系（例えば、脳）におけるニューロンの興奮性を領域及び時間特異的な方式で選択的に改変する方法であって、被験体において、
（ｉ）ＧＲＡＮＰＡに対する作動薬の投与前に、ＧＲＡＮＰＡを発現させるステップと、
（ｉｉ）発現されたＧＲＡＮＰＡに対する本発明の作動薬を被験体に投与するステップとを含む、方法を提供する。

【0135】

投与様式
外因性作動薬は、それによってＧＲＡＮＰＡを含む標的細胞に分布されるのであれば、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって投与され得る。

【0136】

非限定的な投与経路には、以下が含まれる。
ａ）経口
ｂ）静脈内又は筋肉内経路による、非経口
ｃ）皮下注射（例えば、痛み、吐き気、又は不安の緩和にＧＲＡＮＰＡが使用される緩和ケアにおいて好まれ得る）
ｄ）舌下、バッカル、鼻腔内、直腸、迅速な吸収のため、成人又は子供の急性発作の治療におけるベンゾジアゼピン類に使用される経路（例えば、直腸のジアゼパム、バッカル又は鼻のミダゾラム）
ｅ）吸入器又は噴霧器を介して（慢性閉塞性気道疾患、嚢胞性繊維症、肺気腫、細気管支炎、又は気管支拡張症の治療において好まれ得る、ＣＯＡＤの治療に使用されるベータ２アドレナリン作動薬であるサルブタモールとの類似性から）
ｆ）局所：目、緑内障などの眼疾患の治療に好まれ得る、開放隅角緑内障の治療に使用されるチモロール（アルファ２アドレナリン作動薬）点眼剤との類似性から
ｇ）局所：皮膚（経皮）、神経因性疼痛の治療に使用される局所クロニジンゲル（アルファ２アドレナリン作動薬）との類似性から
ｈ）他の局所経路：耳、くも膜下腔内、腟内、膀胱内

【0137】

全身投与様式が好ましい場合がある。

【0138】

外因性作動薬は、当技術分野で公知の方法に従って、投与経路に採用され得る。例えば、ジフェンヒドラミンの経口、注射可能、及び局所の処方は、当技術分野で公知である。
＊＊＊

【0139】

本明細書に記載の新規ＧＲＡＮＰＡは、例えば、神経系の幅広い疾患又は障害、例えば、神経回路障害の遺伝子治療に有用性があり得る。これらには、精神神経障害、神経変性疾患、慢性痛、脳血管障害（ＣＶＡ）、又は脳卒中が含まれる。ＧＲＡＮＰＡが有用性を示し得る疾患の例は、以下に示される。

【0140】

特定の実施形態において、ＧＲＡＮＰＡは、ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）（ヒトＭ４ムスカリン性コリン作動性Ｇｉ結合型ＤＲＥＡＤＤ）に基づく。特定の実施形態において、ＤＲＥＡＤＤは、本明細書に記載の本発明の改変を含む、ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ４である。

【0141】

非限定的な例として、（例えば、Ｇｉ結合型受容体による興奮性ニューロンの阻害、又は抑制性ニューロンの活性化による）活性化神経伝達の制御された抑制は、てんかん、並びに、片頭痛、群発頭痛、三叉神経痛、ヘルペス後神経痛、発作性運動障害、及び単極性又は双極性の情動障害などの異常な細胞活性のエピソードにより特徴付けられた他の疾患において有用性がある。

【0142】

特定の実施形態において、ＧＲＡＮＰＡは、Ｇｑと結合している。特定の実施形態において、ＧＲＡＮＰＡは、本明細書に記載の発明の変形を含む、Ｇｑ結合型ヒトＭ３ムスカリン性受容体（ｈＭ３Ｄｑ）に基づいている（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、（２００９）Ｎｅｕｒｏｎ ６３（１）：２７－３９；Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら、（２００７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｔ、１０４（１２）：５１６３－５１６８参照）。

【0143】

興奮性（例えば、Ｇｓ結合型及びＧｑ結合型）ＧＰＣＲの活性化は、パーキンソン病、及び、いくつかの神経回路が不活発であると考えられる他の疾患などの他の精神健康障害において有用であり得る。
＊＊＊

【0144】

本発明の一態様において、被験体において疾患又は障害を治療する方法であって、
（ｉ）ＧＲＡＮＰＡを被験体の標的細胞又は器官中に発現させるステップと、
（ｉｉ）発現されたＧＲＡＮＰＡに対する作動薬を被験体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

【0145】

本発明の一態様において、被験体において疾患又は障害を治療する方法であって、
（ａ）例えば、ＧＲＡＮＰＡをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド又はベクターを有効量、直接注入によって被験体に投与するステップと、
（ｂ）被験体の標的細胞又は器官中に、ステップ（ａ）のＧＲＡＮＰＡを発現させるステップと、
（ｃ）発現されたＧＲＡＮＰＡに対する外因性作動薬を被験体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

【0146】

本発明の一態様において、被験体において神経系の疾患又は障害を治療する方法であって、
ａ．ＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを被験体に投与するステップと、
ｂ．ＧＲＡＮＰＡに対する作動薬の投与前に、ステップ（ａ）のＧＲＡＮＰＡを発現させるステップと、
ｃ．発現されたＧＲＡＮＰＡに対する作動薬を被験体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

【0147】

上記で説明したように、通常、ＧＲＡＮＰＡは、中枢神経系（脳又は脊髄）において発現される。

【0148】

一態様において、被験体において神経系の疾患又は障害を治療する方法であって、
（ｉ）ＧＲＡＮＰＡに対する作動薬の投与前に、ＧＲＡＮＰＡを発現させるステップと、
（ｉｉ）発現されたＧＲＡＮＰＡに対する作動薬を被験体に投与するステップとを含む、方法が提供される。
＊＊＊

【0149】

国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１３６２４７号で説明されるように、ＤＲＥＡＤＤの使用によって、治療効果の微調整が潜在的に可能になるため、正常な脳機能への標的外効果を最小限にして回路機能の最適な調節が達成され得る。治療は、ウイルスベクターが導入される脳領域とその領域内の細胞種の両方を標的とすることができるため、リガンドが送達される際の効果を効果的に局所化することができる。リガンドなしでは、脳機能への任意の効果を期待できないであろう。したがって、療法は、標的が限定され、時間的にも限定される。しかしながら、主要な抑制性ＤＲＥＡＤＤ ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）は、活性化リガンドの副作用プロファイルによって限定される。

【0150】

したがって、一態様において、上記障害に苦しんでいる患者において、発作性障害を治療する方法であって、
（ａ）ＧＲＡＮＰＡが患者の脳における発作焦点の発現されたニューロンである、ＧＲＡＮＰＡをコードするベクターを患者に投与することと、
（ｂ）外因性作動薬を患者に投与することとを含み、
それによって、患者の脳における作動薬の存在が、ＧＲＡＮＰＡを活性化し、
ＧＲＡＮＰＡの活性化が、発作焦点におけるニューロンの興奮性を可逆的に変化させる、方法が提供される。

【0151】

上記障害を患っている患者において発作性障害を治療する方法であって、
患者は、ＧＲＡＮＰＡをコードするベクターを以前に投与されており、ＧＲＡＮＰＡは、患者の脳における発作焦点の発現されたニューロンであり、
外因性作動薬を患者に投与することを含み、
それによって、患者の脳における作動薬の存在が、ＧＲＡＮＰＡを活性化し、
ＧＲＡＮＰＡの活性化が、発作焦点におけるニューロンの興奮性を可逆的に変化させる、方法が提供される。

【0152】

本発明の文脈において、ＧＲＡＮＰＡは、上記疾患を患っている被験体において発作性障害を治療するために使用され得る。このような治療において、患者の脳における作動薬の存在は、ＧＲＡＮＰＡを活性化し、それによって発作焦点のニューロンの興奮性を可逆的に変化させる、好ましくは阻害する。

【0153】

例えば、ＧＲＡＮＰＡの活性化は、（ｉ）発作焦点における興奮性ニューロンの興奮性及びそれによる神経伝達を可逆的に阻害するか、又は（ｉｉ）発作焦点において抑制性ニューロンを可逆的に興奮させる。

【0154】

好ましい実施形態において、発作性障害は、てんかん、例えば、特発性、症候性、及び原因不明のてんかんである。本明細書に記載の方法は、てんかん原性活性を抑える、又は遮断するために使用されてよい。これらの方法は、それを必要とする患者の脳又は神経組織で発作閾値を上昇させること、又は患者の脳細胞のてんかん突発を減少させるために使用され得る。

【0155】

本発明の化学－遺伝学の組み合わせ（化学遺伝学的として知られる）方法は、領域及び時間特異的な方式で発作の抑制を介しててんかんの治療に使用され得る。

【0156】

一実施形態において、てんかんは、全般てんかんである。抑制性介在ニューロンのサイレンシングによって発作が悪化し得ることは報告されており（Ｗｉｃｋｅｒ、Ｅｖａｎ及びＰａｔｒｉｃｋ Ａ． Ｆｏｒｃｅｌｌｉ、「Ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｌｉｎｅ ａｎｄ ｉｎｔｒａｌａｍｉｎａｒ ｔｈａｌａｍｕｓ ｂｌｏｃｋｓ ａｍｙｇｄａｌａ－ｋｉｎｄｌｅｄ ｓｅｉｚｕｒｅｓ．」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２８３ （２０１６）：４０４－４１２）、他の操作（視床皮質興奮性細胞のサイレンシング）によってオンデマンドのけいれん抑制が達成されることを示唆している。
一実施形態において、てんかんは、ヒト焦点性てんかんである。

【0157】

患者は、脳の新皮質の単一領域に影響を与える、明確な焦点性てんかんであると診断された者でよい。焦点性てんかんは、例えば、発達異常、又は以下の脳卒中、腫瘍、穿通性脳損傷もしくは感染から発生し得る。

【0158】

しかしながら、本発明は、複数の特定された場所に直接注入することによって、複数のてんかん焦点を同時に治療するために使用されてもよい。

【0159】

患者は、薬剤耐性又は医学的に難治性のてんかんであると診断された者でもよいが、これは、抗てんかん薬の適切な投与にもかかわらず、てんかんの発作が継続することを意味する。

【0160】

患者は、抗てんかん薬による既存の治療下にある者であってもよく、この方法は、既存の治療を中断すること、又は薬物療法を減らすことを目的としている。

【0161】

患者は、持続性部分てんかんであると診断されている者でもよい。

【0162】

本発明の治療は、（例えば、カリウムチャネルの過剰発現によって達成され得るような）ニューロンの興奮性の永続的な低下が望ましくない場合、例えば、正常な脳機能にとってリスクが高すぎるため、特に有用である。てんかん原性領域が言語又は運動機能を担う皮質領域にある場合でも、リガンドが投与されるときを除いて、これらの機能に影響を及ぼさないであろう。難治性の焦点性てんかんの患者は、これを許容可能な副作用であると考える可能性が高い。

【0163】

本発明は、側頭葉てんかん及び焦点性新皮質てんかんなどの、焦点性の発症を特徴とする発作性障害に特に有用であるが、より全般的な形態のてんかんに、特に二次治療の指示として適用されてもよい。これらの場合、送達の標的は、状態に応じて適切に選択される。例えば、視床に対して両側的に送達されてもよい。したがって、本発明が適用され得る他の障害には、乳児けいれん、ミオクローヌス性発作及び「小運動」発作、並びに、強直間代性発作及び複雑部分発作が含まれる。

【0164】

更に、本発明は、原則として、いくつかの状況において、てんかん原性回路を「リセット」することを目的として、一定の期間ニューロンの興奮性の連続的な変化を引き起こすことによって予防的に使用されてよく、リガンドの投与よりも長く続く発作の持続的な減少をもたらす。

【0165】

したがって、本発明の異なる実施形態において、
（ｉ）発作性障害は、てんかんであり、任意選択で焦点性てんかん又は全般てんかんである、及び／又は
（ｉｉ）被験体は、薬剤耐性又は医学的に難治性のてんかんと診断されている、及び／又は
（ｉｉｉ）被験体は、抗てんかん薬による既存の治療下にあり、方法は、既存の治療を中断すること、又は薬物療法を低減することを可能にする目的を有する、及び／又は、
（ｉｖ）被験体は、持続性部分てんかんと診断されている、及び／又は
（ｖ）外因性リガンドは、患者がてんかん性発作を患う前の被験体に投与される、及び／又は
（ｖｉ）外因性リガンドは、てんかん性発作中の被験体に投与される、及び／又は
（ｖｉｉ）外因性リガンドは、てんかん性発作を患った後の被験体に投与される、及び／又は
（ｖｉｉｉ）外因性リガンドは、ヒトがてんかん性発作を患う前３０分以内、又は患った後２４時間以内に被験体に投与される、及び／又は
（ｉｘ）外因性リガンドは、（ｉ）自動化された発作検出メカニズムに一方に連結されたデバイスによって、又は（ｉｉ）ＥＥＧ解析による予測された発作に応じて、の一方で自動的に被験体に投与される、及び／又は
（ｘ）外因性リガンドは、発作性障害を治療するための１つ以上の他の薬剤との併用療法で投与される。
＊＊＊

【0166】

ジフェンヒドラミンの過剰投与の研究においては、最も一般的な有害事象は頻脈、幻覚、傾眠、激越、及び散瞳であり、発作の発生は、はるかに低いと結論付けられた（Ｐａｌｍｅｒら、２０１９、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８０／１５５６３６５０．２０１９．１６０９６８３）。発作閾値を低下させる効果は、他の抗ヒスタミン薬と同様にまれな副作用であるが、一般に、抗ムスカリン性効果に関連すると考えられている。我々の薬理学的研究は、ジフェンヒドラミンが、ムスカリン性受容体を遮断するよりも低い濃度で、ＧＲＡＮＰＡを活性化することを示唆している。
＊＊＊

【0167】

上で検討された疾患に加えて、ＤＲＥＡＤＤ（及び、ひいてはＧＲＡＮＰＡ）は、他の障害において可能性を有する。例えば、齧歯類モデルにおいて、ＤＲＥＡＤＤは、ニューロン活性を制御して、パーキンソン病^６、ダウン症候群^７、及び自閉症^１０のように多様な状態において疾患表現型を改善する能力を示した。また、ＤＲＥＡＤＤ型のアプローチは、中毒^{１１，１２}、睡眠^１３、攻撃性^１４、呼吸^１５、及び摂食^{１６－１８}のような多様な行動を調整する。ＤＲＥＡＤＤはまた、学習記憶を強化及び沈黙させ、人工的な記憶を作成するために使用されてきた^{１９－２１}。

【0168】

当技術分野において示唆されたＤＲＥＡＤＤ型の治療法の他の中枢神経系への適用としては、精神刺激薬（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、２０１１）及びエタノール（Ｐｌｅｉｌら、２０１５）の乱用、うつ病（Ｕｒｂａｎら、２０１５）、心的外傷後ストレス障害（Ｚｈｕら、２０１４）、難治性発作（Ｋａｔｚｅｌら、２０１４）、及び他の多くの障害（Ｅｎｇｌｉｓｈ及びＲｏｔｈ、２０１５）を含む。

【0169】

ＤＲＥＡＤＤが神経系に与える効果が十分に確立されていることに加えて、多くの研究では、他の器官にＤＲＥＡＤＤを使用した潜在的な治療戦略も特定されている。ＤＲＥＡＤＤによって治療されるこのような疾患／障害の動物モデルとしては、糖尿病（Ｊａｉｎ、Ｓら、「Ｃｈｒｏｎｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｇ（ｑ）－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｓ β ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３：１７５０－１７６２）、代謝障害（Ｌｉ、Ｊら、「Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｇ（ｑ）－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０１３；１５４：３５３９-３５５１）、炎症性障害（Ｐａｒｋ、Ｊら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ－ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｔｏ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｂｉｏｉｎｅｒｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１４；１１１：５８９６-５９０１）、及び呼吸器障害（Ｃｕｒａｄｏ、Ｔら、「ＤＲＥＡＤＤ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｌｅｅｐ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ」、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、印刷前１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０２００２－０３２１ＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0170】

治療上の利益のためにＧＲＡＮＰＡによって操作され得る標的回路の具体例は、神経学的及び精神神経的な回路障害の前臨床モデルを使用した以下の研究に記載されている。
・痛み（Ｗｅｉｒら、ＰＭＩＤ：２８９６９３７５）
・痙縮及び脊髄損傷（Ａｓｂｏｔｈら、ＰＭＩＤ：２９５５６０２８、Ｃｈｅｎら、ＰＭＩＤ：３００３３３６３）
・パーキンソン病、ジストニア、舞踏病、ハンチントン病（Ａｓｓａｆ及びＳｃｈｉｌｌｅｒ、ＰＭＩＤ：３０５３６７７８）
・アルツハイマー病及び前頭側頭変性症（Ｒｏｒａｂａｕｇｈら、ＰＭＩＤ：２９０５３８２４、Ｙｕａｎら、ＰＭＩＤ：２６７５８８５０）
・筋萎縮性側索硬化症（Ｋｈａｄｅｍｕｌｌａｈら、ＰＭＩＤ：３２２０３５７８、Ａｌａｍｉら、ＰＭＩＤ：３２９００８２６）
・注意欠陥／多動性障害、強迫性障害、衝動制御障害、トゥレット症候群、及び自閉症スペクトラム障害（Ｒａｐａｎｅｌｌｉら、ＰＭＩＤ：２８５８４１１７）
・統合失調症（Ｂｏｅｋｈｏｕｄｔら、ＰＭＩＤ：２７７１２８６２、Ｋａｔｚｅｌら、ＰＭＩＤ：３３１７８０１０、Ｋａｔｚｅｌ及びＫｕｌｌｍａｎｎ、「統合失調症における創薬のための光遺伝学的及び化学遺伝学的ツール（Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）」、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／９７８１７８２６２２４９９－００２３４）
・大うつ病性障害、双極性障害（Ｂｉｓｅｌｌｉら、ＰＭＩＤ：３１６３３８３３、Ｍｕｉｒら、ＰＭＩＤ：３０５５５１６１）
・不安及び全般性不安障害（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら、ＰＭＩＤ：２９０２７９０３、Ｊｉａｎｇら、ＰＭＩＤ：２９４１０２１８）
・不眠症及び睡眠障害（Ｓａｓａｋｉら、ＰＭＩＤ：２１６４７３７２）
・拒食症、過食症、及びその他の摂食障害（Ｋｒａｓｈｅｓ、ＮＢＫ４５３１５０、Ｘｕら、ＰＭＩＤ：２９６７０２８３）

【0171】

本発明の他の実施形態において、疾患又は障害は、非中枢神経系及び／又は非末梢神経系の障害である。

【0172】

ベクター
上記で説明したように、本発明のＧＲＡＮＰＡは、通常、生体内で発現されて、それらの医学的利益を提供する。これは、ＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの使用によって達成され、適切なプロモーターに作動可能に連結されている。通常は、ポリヌクレオチドは、例えば、中枢神経系ニューロン又は他の興奮性細胞における細胞特異的な発現を支配する転写制御要素の転写制御下で、ＧＲＡＮＰＡをコードするオープンリーディングフレームを含む遺伝子コンストラクトの形態であるか、又はその中に含まれる。

【0173】

標的中枢神経系ニューロンとしては、脳幹、後脳、中脳、又は前脳の興奮性又は抑制性細胞集団を含むがこれらに限定されない、後角細胞及び／又は脳細胞などの脊髄細胞が挙げられる。

【0174】

本明細書に記載の任意の態様によるＧＲＡＮＰＡをコードする核酸を細胞又は患者に送達する方法において、核酸は、遺伝子療法の分野における当業者によって認識されるように、任意の有用な方法によって、任意の有用な形で送達され得る。核酸は、リポソーム、例えば、カチオン性リポソーム、又はナノ粒子などの、例えば、限定するものではないが、コロイド状薬物送達方法によって堆積した、プラスミド、又は組換えウイルスゲノムの一部などのネイキッド核酸であってよく、広く知られているとおりである。

【0175】

一般に、当業者は、組換え遺伝子発現のためのベクターを構築し、プロトコルを設計することが十分可能である。適切なベクターは、上記の本発明の要素に加えて、プロモーター配列、ターミネータ断片、ポリアデニル化配列、マーカ遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含んで、選択又は構築され得る。更なる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ（１９９５、及び定期的に補足）を参照。

【0176】

例えば、ポリヌクレオチドは、ＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列、及び任意選択で３’非翻訳領域に作動可能に連結されたプロモーターを含むウイルスベクターの形であるか、又はその中に含まれ得る。

【0177】

本発明によれば、様々なベクターのいずれかを使用して、ＧＲＡＮＰＡ発現細胞を作製し得る。本発明の治療における使用のためのベクターは、生体内の遺伝子治療プロトコルに適している。ベクターは、安定な組み込みベクター又は安定な非組み込みベクターであってよい。好ましいベクターは、レンチウイルスベクター又はＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターなどのウイルスベクターである。

【0178】

これら両方のタイプのウイルスベクターの使用は、遺伝子治療の分野でよく知られている。単なる例として、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０１１３８１号は、被験体において受容体を発現させるためのこれら及び他のベクターの使用について記載している。ＡＡＶ及びレンチウイルスベクターの調製及び特徴のその記述に関して、その出願の内容は、参照により具体的に本明細書に援用する。

【0179】

簡単に言えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０１１３８１号に記載されるように、ＡＡＶは欠損性パルボウイルスであり、多くの細胞種に感染し得、ヒトに非病原性であるため、好ましいベクターである。ＡＡＶタイプのベクターは、約４～５ｋｂを輸送し得、野生型ＡＡＶは、染色体１９に安定に挿入することが知られている。
別のタイプのＡＡＶベクターは、異種遺伝子（ここでは、ＧＲＡＮＰＡ）に作動可能に連結された細胞特異的発現を指示するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する１対の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む。更なる情報は、米国特許第６，２６１，８３４号に見られる。ＡＡＶベクターは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／１７５４４３号において検討されている。

【0180】

ウイルスベクターは当技術分野でよく知られており、例えば、Ｖｉｒａｌｇｅｎ、Ｐａｒｑｕｅ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏ ｙ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｃｏ ｄｅ Ｇｉｐｕｚｋｏａ、Ｐａｓｅｏ Ｍｉｋｅｌｅｔｅｇｉ ８３、２０００９ Ｓａｎ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｓｐａｉｎから市販されている。

【0181】

レンチウイルスベクターは、特別なタイプのレトロウイルスベクターであり、通常、感染のための長い潜伏期間を有することを特徴とする。更に、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染し得る。レンチウイルスベクターは、ウイルスのレンチウイルスファミリーからのウイルスの核酸骨格に基づく。通常、レンチウイルスベクターは、ＳＩＶ及びＨＩＶなどのレンチウイルスの５’及び３’ＬＴＲ領域を含む。レンチウイルスベクターはまた、通常、ＳＩＶ及びＨＩＶなどのレンチウイルスのＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を含む。レンチウイルスベクターの例としては、Ｄｕｌｌ、Ｔら、「Ａ Ｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２（１１）：８４６３－７１（１９９８）にあるものが挙げられる。
＊＊＊

【0182】

本明細書に記載のベクターは、当技術分野で知られている様々なアクセス方法で標的細胞に局所的に送達され得る。

【0183】

例えば、核酸を含むリポソーム又はナノ粒子は、特定のニューロン組織内又はそれに隣接するなどの所望の部位に注入され得る。他の態様において、組換えウイルス粒子（伝達粒子）は、特定のニューロン組織内もしくはそれに隣接する、又はそれを標的とするなどの、所望の部位に送達、例えば、注入される。核酸は、標的ニューロンにおけるＧＲＡＮＰＡの十分な発現を確立するために、１回又は１回より多く注入されてよい。

【0184】

特に送達は、直接間質注入、バーホール開頭、及び定位注入などの公知の方法を使用した脳への直接注入を介したものであり得る（例えば、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ」、編集者：Ｎｉｋｋｈａｈ及びＰｉｎｓｋｅｒ、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１１７巻、２０１３を参照）。

【0185】

発作性障害の治療のために、注入は、（例えば、焦点性てんかんにおいて）定義された発作焦点に、又はより一般的には、他の発作疾患において過活動が疑われる脳の領域に標的化される。

【0186】

ベクターは、永久的な形質転換をもたらすために使用されてもよく、又は脳内で一時的に発現されるだけでもよい。

【0187】

したがって、一実施形態において、上記の本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター及び／又はアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であってよく、任意選択で、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びそれらのハイブリッドからなる群より任意で選択される。あるいは、ベクターは、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターであってよい。
＊＊＊

【0188】

好ましくは、ＤＮＡコンストラクトは、標的細胞内でＧＲＡＮＰＡをコードするＤＮＡの発現を容易にするためのプロモーターを含む。

【0189】

プロモーターは、遺伝子治療に適した当技術分野で知られた任意のものでよい。例えば、Ｐａｐａｄａｋｉｓ Ｅ．Ｄ．ら、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ：ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ、４．１（２００４）：８９－１１３、及びＪｏｓｈｉ ＣＲ、Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ Ｖ、Ｇｈｏｒｐａｄｅ Ａ、「Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｂｒａｉｎ：ｔｈｅ Ｐａｓｔ、Ｐｒｅｓｅｎｔ、ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．」、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１７；１２（１）：５１－８３を参照。プロモーターは、天然のヌクレオチド配列、又はエンハンサなどの他の調節要素と最小プロモーター配列との合成の組み合わせであってよい。一般に使用されるプロモーターとして、ｈＳｙｎ、ｍｄｌ，ＣＢＡ、Ｅｆ１ａ、ＴＨ、ＣＭＶ、ｍＤｌｘ５／６、ＤＲＤ２、Ｄｒｄ１ａが挙げられる。

【0190】

しかしながら、特異性は、例えば、組織又は領域特異的プロモーターを使用して、受容体の局所及び細胞種特異的発現によってのみ達成され得る。

【0191】

例えば、プロモーターは、後角ニューロン、脊髄細胞、又は脳細胞などの中枢神経系ニューロンにおいて、又は抑制性ニューロン又は神経細胞において細胞特異的な発現を指示し得る。

【0192】

特定の細胞内の上記ＧＲＡＮＰＡの有用な又は治療的な有効量の作製に十分な程度の遺伝子の、それらの細胞における遺伝子発現を引き起こすが、使用、例えば、治療的使用の文脈において他の場所では無意味な発現を引き起こす場合、プロモーターは、特定の細胞（例えば、興奮性細胞又は分泌細胞）に「特異的」である。

【0193】

一例は、前脳において比較的特異的に発現を駆動する、Ｃａｍｋ２ａ（アルファＣａＭキナーゼＩＩ遺伝子）プロモーターである。例えば、Ｓａｋｕｒａｄａら、（２００５）「Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ＣａＭ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ ｇｅｎｅ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｚｉｃ２、ａ Ｚｉｃ ｆａｍｉｌｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ２００５ Ｎｏｖ；５３（３）：３２３－３０、Ｅｐｕｂ ２００５ Ｓｅｐ １２を参照。

【0194】

他の神経細胞種特異的プロモーターには、ＮＳＥプロモーター（Ｌｉｕ Ｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２３（１８）：７１４３－５４、２００３）、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Ｋｅｓｓｌｅｒ ＭＡら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１２（ｌ－２）：８－２３、２００３）、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター（Ｋｅｓｓｌｅｒ ＭＡら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２８８（４）：８０９－１８、２００１）、グリア繊維性酸性タンパク質プロモーター（Ｎｏｌｔｅ Ｃら、ＧＬＩＡ、３３（ｌ）：７２－８６、２００１）、ニューロフィラメント遺伝子（重鎖、中鎖、軽鎖）プロモーター（Ｙａｗｏｒｓｋｙ ＰＪら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２７２（４０）：２５１１２－２０、１９９７）が含まれる。（これらの全ては、少なくともプロモーターの配列及び関連配列については、参照により本明細書に援用する。） ＮＳＥプロモーターは、Ｐｅｅｌ ＡＬら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４（１）：１６－２４、１９９７に開示されている（配列番号６９）（ｐＴＲ－ＮＴ３ｍｙｃ、Ｐｏｗｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ ＦＬ）。更に適切なプロモーターは、シナプシン１プロモーターである（Ｋｕｇｌｅｒら、「Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００３ Ｆｅｂ：１０（４）：３３７－４７参照）。更に適切なプロモーターは、ミクログリアで発現されるｃｄ６８プロモーターである。一般的な発現に適したプロモーターには、ＥＦ１ａプロモーター又はＣＡＧプロモーターが含まれる。

【0195】

一実施形態において、ＧＲＡＮＰＡをコードするベクターは、これらのプロモーターのいずれかを含み得る。

【0196】

一実施形態において、改変ＧＰＣＲをコードする核酸は、組織又は細胞特異的プロモーター、例えば、神経細胞種特異的プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態において、プロモーターは、ＣａＭｋ２Ａプロモーターである。

【0197】

更に別の実施形態において、ニューロン特異的プロモーターは、プレプロタキキニン－１プロモーター（ＴＡＣ－１）である。
＊＊＊

【0198】

リガンドは単独で使用（例えば、投与）されることが可能であるが、例えば、薬学的に許容される担体又は希釈剤を用いて、組成物又は配合物として存在することが好ましいことが多い。

【0199】

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又はその他の問題又は合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比に応じて、当人（例えば、ヒト）における被験体の組織と接触して使用するのに適した、化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。各担体、希釈剤、賦形剤などもまた、配合物の他の成分と適合性であるという意味で「許容可能」でなければならない。

【0200】

いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載のリガンド、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含む、又は主成分とする、又は唯一の活性成分としてなる、医薬組成物（例えば、製剤、調剤薬、医薬品）である。

【0201】

国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０９６２６８号に記載されているように、ＧＲＡＮＰＡのウイルス送達を採用する遺伝子治療の実施形態において、単位用量は、投与されているウイルス粒子の用量で算出されてよい。ウイルス用量には、特定の数のウイルス粒子又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）が含まれる。ＡＡＶを含む実施形態の場合、特定の単位用量は、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、もしくは１０^１４ｐｆｕ又はベクターゲノムを含む。感染欠損粒子の存在により、粒子用量は、幾分より高くなり得る（１０～１００倍）。

【0202】

一実施形態において、ベクターは、５×１０^１１ｖｇ／ｍｌの懸濁液５００マイクロリットル（＝２．５×１０^１１ウイルスゲノム）として注射される。
＊＊＊

【0203】

疾患の治療においてＧＲＡＮＰＡと共に使用されるリガンドの場合、半減期、並びに他の薬物動態及び薬力学的パラメータに基づいて、適切な投与量が利用され得る。例えば、ＤＰＨの場合、約９時間までの半減期に基づくと、１日３～４回での服用を意味するのが好ましいであろう。Ｈ１及びＧＲＡＮＰＡでの同等の親和性に基づく典型的な用量は、成人で約２５～５０ｍｇ（経口）を１日３～４回であり得る。しかしながら、医師の裁量に基づいて、他の用量も想定される。

【0204】

剤形は、持続放出又は遅放出（例えば、Ｋｒｏｗｃｚｙｎｓｋｉ、Ｌａｅｚｅｋ、「Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ」、ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ、２０２０参照）、又は即時放出性形態（例えば、Ｎｙｏｌ、Ｓａｎｄｅｅｐ、及びＭ．Ｍ．Ｇｕｐｔａ、「Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、３．２（２０１３）参照）であってよい。

【0205】

一実施形態において、ジフェンヒドラミンは、分割用量で１日あたり５０－１００ｍｇで投与される。
＊＊＊

【0206】

いくつかの実施形態において、本発明の方法又は治療は、症候性又は疾患の改善を問わず、他の治療法と組み合わせてよい。

【0207】

「治療」という用語は、組み合わせ治療及び療法を含み、２つ以上の治療又は療法が、例えば、連続して又は同時に組み合わせられる。

【0208】

例えば、本明細書に記載の化合物による治療を、１つ以上の（例えば、１、２、３、４つの）他の薬剤又は療法と組み合わせることが有益であり得る。

【0209】

共治療の適切な例は、本明細書の開示に基づいて当業者に知られるであろう。通常、共治療は、治療される個体の診断を条件に、本明細書に記載の疾患の治療において治療効果を与え得ると考えられる、当技術分野で知られている任意のものであり得る。例えば、てんかんは、根底にある病因を直接治療することによって時に改善され得るが、異常放電と発作を抑制するフェニトイン、ガバペンチン、ラモトリギン、レベチラセタム、カルバマゼピン、及びクロバザム、並びにトピラマートなどの抗けいれん薬が従来の治療の主力である（Ｒｈｏ及びＳａｎｋａｒ、１９９９、Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ４０：１４７１－１４８３）。

【0210】

特定の組み合わせは、医師の裁量によるもので、医師は、彼らの共通の一般的知識及び、熟練した医療実践者に公知な投与レジメンを使用して投与量も選択する。

【0211】

薬剤（すなわち、ＧＲＡＮＰＡ及びリガンド、並びに１つ以上の他の薬剤）は、同時に又は連続して投与されてよく、個々に変動する用量スケジュールで且つ異なる経路を介して投与されてよい。例えば、連続して投与される場合、薬剤は、密な間隔で（例えば、５－１０分の期間にわたって）、又はより長い間隔で（例えば、１、２、３、４時間以上の間隔をあけて、又は必要な場合は更に長い間隔をあけて）投与され得、正確な投与量レジメンは、治療剤の性質に応じる。
＊＊＊

【0212】

本発明の態様が、ＧＲＡＮＰＡ、又はＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、及び／又は作動薬の使用によって疾患又は障害を治療する方法を含む場合、以下も提供される。
（ｉ）そのような方法において使用するための、ＧＲＡＮＰＡ、又はＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のベクター）、及び／又は作動薬、
（ｉｉ）そのような治療のための医薬品の調製における、ＧＲＡＮＰＡ、又はＧＲＡＮＰＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のベクター）、及び／又は作動薬の使用。
＊＊＊

【0213】

本発明はまた、上記障害を患っている患者の発作性障害の治療方法における使用のための、ＧＲＡＮＰＡをコードするベクター、及び上記受容体に対する外因性作動薬を提供し、この治療は、
（ａ）ＧＲＡＮＰＡが、患者の脳の発作焦点のニューロンにおいて発現される、ベクターを患者に投与することと、
（ｂ）外因性作動薬を患者に投与することとを含み、
それによって、患者の脳における作動薬の存在が、ＧＲＡＮＰＡを活性化し、
ＧＲＡＮＰＡの活性化が、発作焦点におけるニューロンの興奮性を可逆的に変化させる、方法が提供される。

【0214】

本発明はまた、上記障害を患っている患者の発作性障害の治療方法における使用のための、ＧＲＡＮＰＡをコードするベクターを提供し、この治療は、
（ａ）ＧＲＡＮＰＡが、患者の脳の発作焦点のニューロンにおいて発現される、ベクターを患者に投与することと、
（ｂ）外因性作動薬を患者に投与することとを含み、
それによって、患者の脳における作動薬の存在が、ＧＲＡＮＰＡを活性化し、
ＧＲＡＮＰＡの活性化が、発作焦点におけるニューロンの興奮性を可逆的に変化させる。

【0215】

本発明はまた、上記障害を患っている患者の発作性障害の治療方法における使用のための外因性作動薬を提供し、この治療は、
（ａ）患者の脳の発作焦点のニューロンにおいて発現されるＧＲＡＮＰＡをコードするベクターを患者に投与することと、
（ｂ）外因性作動薬を患者に投与することとを含み、
それによって、患者の脳における作動薬の存在が、ＧＲＡＮＰＡを活性化し、
ＧＲＡＮＰＡの活性化が、発作焦点におけるニューロンの興奮性を可逆的に変化させる。

【0216】

本発明はまた、上記障害を患っている患者の発作性障害の治療方法における使用のための外因性作動薬を提供し、
患者には、ＧＲＡＮＰＡをコードするベクターが以前に投与されており、ＧＲＡＮＰＡは、患者の脳の発作焦点のニューロンにおいて発現され、
この治療は、外因性作動薬を患者に投与することを含み、
それによって、患者の脳における作動薬の存在が、ＧＲＡＮＰＡを活性化し、
それによって、ＧＲＡＮＰＡの活性化は、発作焦点におけるニューロンの興奮性を可逆的に変化させる。

【0217】

本発明はまた、発作性障害を治療するこれらの方法における使用のために定義されたベクター及び／又は作動薬を提供する。

【0218】

本発明はまた、本明細書に記載の治療又は治療の方法における使用のための医薬品の調製における、本明細書に記載のＧＲＡＮＰＡ及び／又はベクター及び／又はポリヌクレオチド及び／又は作動薬の使用を提供する。
＊＊＊

【0219】

本発明はまた、ウイルスベクター、プロモーター、及びＧＲＡＮＰＡを含むが、それらに限定されない１つ以上の構成要素を備えたキットを提供する。薬学的に許容される担体及びＧＲＡＮＰＡ作動薬を含むが、それらに限定されない１つ以上の追加の構成要素も共に検討される。

【0220】

ウイルスベクター、プロモーター、ＧＲＡＮＰＡ組成物、及び／又はＧＲＡＮＰＡ作動薬は、純粋な組成物として、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて、薬学的組成物中に配合され得る。

【0221】

キットはまた、本明細書に記載の方法における使用説明書とともに、プライマ、緩衝液、及びプローブを含んでよい。

【0222】

一実施形態において、キットは、一方の容器中に、ウイルスベクター、プロモーター、本発明のＧＲＡＮＰＡの組成物、又はその薬学的組成物を含み、別の容器中（例えば、滅菌されたガラス又はプラスチックのバイアル中）に、ＧＲＡＮＰＡ作動薬又はその薬学的組成物を含む。

【0223】

キットは、被験体への非経口投与のための薬学的組成物を含む場合、そのような投与を行うためのデバイスを含み得る。例えば、キットは、１つ以上の皮下注射針又は他の注入デバイスを含み得る。

【0224】

一般的な表現
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結された複数のアミノ酸を含む分子をいう。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、交換可能に使用される。タンパク質は、任意選択で、機能を追加するために改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、及びスルホン化）され得る。アミノ酸残基について従来の１文字又は３文字のコードが使用され、アミノ酸配列は、標準的なアミノ末端からカルボキシ末端への方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表示される。

【0225】

「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二重鎖、及びポリペプチドをコードし得る合成分子を包含する。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、化学的改変を有してもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用される。遺伝コードが縮重であるため、特定のアミノ酸をコードするために、１を超えるコドンが使用されてもよく、本組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。別段の指示がない限り、核酸配列は、５’から３’への方向で表示される。

【0226】

本明細書で使用される場合、「野生型」、「天然の」、又は「参照」という用語は、自然界に見られるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドに関して、この用語は、１つ以上のアミノ酸位置に人為的な置換、挿入、又は欠失を含まない自然発生のポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドに関する用語は、１つ以上のヌクレオシドにおける人為的な置換、挿入、又は欠失を含まない自然発生のポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型又は天然又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、自然発生のポリヌクレオチドに限定されず、そのポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。

【0227】

「に由来する」という用語は、「から始まった」、「から得られた」、「から得ることができる」、「から単離された」、及び「から作られた」という用語を包含し、一般に、ある特定の材料が、別の特定の材料に由来する、又は、（「参照」又は「親」と称され得る）別の特定の材料を参照して説明され得る特徴を有することを示す。本明細書のＧＲＡＮＰＡは、従来技術の野生型ＧＰＣＲ又はＤＲＥＡＤＤであり得る、参照配列又は親配列に由来する。

【0228】

「ハイブリダイゼーション」という用語は、当技術分野で知られているように、核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と接合するプロセスをいう。「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーション反応が行われる条件をいう。これらの条件は、通常、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度によって分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔ^ｍ）に基づき得る。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、約Ｔ^ｍ－５℃（プローブのＴ^ｍより５℃下）で生じ、Ｔ^ｍの約５－１０℃下で「高ストリンジェンシー」、プローブのＴ^ｍの約１０－２０℃下で「中間のストリンジェンシー」、Ｔ^ｍの約２０－２５℃下で「低ストリンジェンシー」が生じる。代替的又は追加的に、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション及び／又は１つ以上のストリンジェンシー洗浄の塩又はイオン強度条件に基づき得る。例えば、６Ｘ生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）＝非常に低いストリンジェンシー、３Ｘ ＳＳＣ＝低～中間のストリンジェンシー、１Ｘ ＳＳＣ＝中間ストリンジェンシー、及び０．５Ｘ ＳＳＣ＝高ストリンジェンシーである。機能的に、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又は厳密に近い同一性を有する核酸配列を特定するために使用されてよく、一方、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を特定するために、高いストリンジェンシー条件が使用される。高い選択性を必要とする用途の場合、通常、比較的ストリンジェントな条件を使用してハイブリッドを形成するのに使用されることが望ましい（例えば、比較的低い塩及び／又は高温条件が使用される）。

【0229】

少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈における「実質的に類似の」及び「実質的に同一の」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、親配列もしくは参照配列に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列、又は、機能を追加することなく現在のタイプを回避するためだけに行われたアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は改変を含む配列のいずれかを含むことを意味する。

【0230】

「発現ベクター」という用語は、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、適切な宿主においてポリペプチドの発現に影響を与え得る適切な制御配列に作動可能に連結された、ＤＮＡコンストラクトをいう。このような制御配列は、転写をもたらすためのプロモーター、かかる転写を制御するための任意選択のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の停止を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に潜在的なゲノムインサートであってもよい。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製して機能し得る、又は場合によっては、ゲノム自体に統合され得る。

【0231】

「組換え」という用語は、コード配列を変異させて、変更されたポリペプチドを作製する、コード配列を別の遺伝子のそれに融合する、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に置く、異種生物内で遺伝子を発現させる、減少又は上昇させた濃度で遺伝子を発現させる、自然な発現プロファイルとは異なるやり方で条件的又は構成的に遺伝子を発現させるなどによって、その配列又は発現の特徴を変更させるために改変した遺伝物質（すなわち、核酸、それがコードするポリペプチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞）をいう。一般に、組換えの核酸、ポリペプチド、及びそれに基づく細胞は、人によって操作されているため、自然界で見られる関連の核酸、ポリペプチド、及び細胞と同一ではない。

【0232】

「受容体リガンド結合」、「リガンド結合」、及び「結合」は、本明細書において交換可能に使用され、受容体（例えば、天然のＧＰＣＲ又はＧＲＡＮＰＡ）とリガンド（例えば、ナチュラルリガンド、（例えば、ペプチドリガンド）又は合成リガンド（例えば、合成小分子リガンド））の間の物理的相互作用を意味する。リガンド結合は、当技術分野で公知の様々な方法（例えば、放射性標識リガンドとの結合の検出）によって測定され得る。

【0233】

「シグナル伝達」は、リガンド結合の結果として（例えば、合成リガンドがＧＲＡＮＰＡに結合した結果として）の生化学的又は生理的応答の発生を意味する。

【0234】

「受容体活性化」、「ＧＲＡＮＰＡ活性化」、及び「ＧＰＣＲ活性化」は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達、及びＧタンパク質媒介シグナル伝達に関連する生理的又は生化学的応答を誘導する方式での、受容体へのリガンド（例えば、ナチュラルリガンド又は合成リガンド）の結合を意味する。活性化は、Ｇタンパク質関連シグナルに関連する生体シグナルを測定する（例えば、本明細書に記載の電気生理学又は他のアッセイを使用する）ことによって測定され得る。

【0235】

「標的化細胞活性化」及び「標的細胞活性化」は、本明細書において交換可能に使用され、標的細胞における特定のＧタンパク質媒介性の生理応答のＧＲＡＮＰＡ媒介性の活性化を意味し、ＧＲＡＮＰＡ媒介性の活性化は、ＧＲＡＮＰＡへの合成小分子の結合によって発生する。本明細書で使用される場合、細胞活性化には、シナプスのサイレンシング又は阻害などの阻害応答、並びに抑制細胞及び刺激細胞の両方におけるＧタンパク質の活性化が含まれる（が、これに限定されない）。

【0236】

「ナチュラルリガンド」、及び「自然発生のリガンド」、及び「内因性リガンド」は、本明細書において交換可能に使用され、哺乳類宿主に内因性生体分子を意味し、この生体分子は、天然ＧＰＣＲに結合してＧタンパク質結合型細胞応答を誘発する。一例は、アセチルコリンである。

【0237】

「合成小分子」、「合成小分子リガンド」、「合成リガンド」、及び「合成作動薬」等は、本明細書において交換可能に使用され、ＧＰＣＲ又は改変ＧＰＣＲ（すなわち、ＧＲＡＮＰＡ）の膜貫通ドメイン内に結合得、受容体の活性化及び受容体媒介応答を促進し得る。

【0238】

「トランスフェクションする」、「トランスフェクション」、「トランスフェクションされた」などの用語は、このような場合、ニューロン又はケラチノサイトなどの真核細胞への遺伝子の導入をいい、例えば、組換えＡＡＶ、アデノウイルス（Ａｄ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、又は任意の他の適用可能なウイルス媒介遺伝子導入プラットフォームの使用による、ウイルス媒介遺伝子導入である「形質導入」を含む。

【0239】

「形質転換」は、新たなＤＮＡ（すなわち、細胞に外因性のＤＮＡ）の組み込み後に細胞に誘導される一過性又は永久的な遺伝子変化を意味する。細胞が哺乳類細胞である場合、永久的な遺伝子変化は、一般に、細胞のゲノムへのＤＮＡの導入によって達成される。

【0240】

「プロモーター」は、作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写を指示するのに十分な最小限のＤＮＡ配列を意味する。「プロモーター」はまた、細胞種特異的、組織特異的、又は外部シグナルもしくは薬剤によって誘導可能に、制御可能なプロモーター依存性遺伝子発現に十分なそれらのプロモーター要素を包含することを意味し、そのような要素は、天然遺伝子の５’又は３’領域に位置し得る。

【0241】

「被験体」は、ヒト又は動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、サル、チンパンジー、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、モルモット、及びトリを含む脊椎動物又は哺乳類であり得る。被験体は「患者」であってよい。

【0242】

状態の治療の文脈で本明細書において使用される、用語「治療」は、一般に、ヒトであろうと動物であろうと（例えば、脊椎動物適用において）例えば、状態の進行の抑制といった、いくつかの所望の治療効果が達成される治療及び療法に関し、進行率の減少（生存延長）、進行率の停止、状態の後退、状態の改善、及び状態の治癒を含む。

【0243】

本明細書で使用される「治療上有効な量」という用語は、所望の治療レジメンに従って投与された場合の合理的な利益／リスク比に相応して、いくつかの所望の治療効果をもたらすために有効である、本発明の化合物、又は、化合物を含む材料、組成物もしくは剤形の量に関する。

【0244】

本発明は、予防手段も含んで「治療すること」が理解される、治療も包含する。予防治療は、「予防有効量」を利用し、これは、本明細書で使用される場合、所望の治療レジメンに従って投与された場合の合理的な利益／リスク比に相応して、いくつかの所望の治療効果をもたらすために有効である、薬剤の量に関する。

【0245】

本明細書の文脈における「予防」は、完全な成功、すなわち、完全な保護又は完全な防止を規定するものと理解されるべきではない。むしろ、本文脈における予防は、症候性の状態を遅らせ、緩和し、又は回避するのを補助することによって健康を維持することを目的として、その症状の検出に先立って実施される手段をいう。
＊＊＊

【0246】

薬剤を採用する治療方法が本明細書に記載されている場合は常に、関連疾患を治療するための医薬品の製造における使用のための薬剤と同様に、その方法における使用のための薬剤もまた記載されることが理解されよう。

【0247】

組成物が本明細書に記載されている場合は常に、関連疾患を治療するための医薬品の製造における使用のための組成物と同様に、本明細書に記載の治療方法（予防方法を含む）で使用される同じ組成物も想定されることが理解されよう。

【0248】

本発明及び本発明が関連する最新技術を、より完全に説明及び開示するために、多数の特許及び刊行物が本明細書において引用される。これらの参考文献は、各々、個々の参考文献が参照により援用することが具体的及び個別に示されたのと同様の範囲で、その全体を参照により本開示に援用する。

【0249】

以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通じて、文脈から別段の求めがない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載された整数、又はステップ、又は整数もしくはステップのグループを含むが、他の任意の整数、又はステップ、又は整数もしくはステップのグループを除外することではないことを意味すると理解されるであろう。

【0250】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の表現「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「薬剤学的担体（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃａｒｒｉｅｒ）」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物等を含む。

【0251】

範囲は、本明細書において、しばしば、１つの特定の値「約」から、及び／又は別の特定の値「約」までとして表現される。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用して、値が近似として表現される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。

【0252】

本明細書の任意のサブタイトルは、便宜上のみに含まれており、決して本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0253】

本発明は、ここで、以下の非限定的な図及び実施例を参照して更に説明される。当業者は、これらに照らして、本発明の他の実施形態を想起するであろう。

【0254】

本明細書で引用されたすべての参考文献の開示は、当業者によって本発明を実施するために使用され得るのと同様に、相互参照によって具体的に本明細書に援用する。

【図面の簡単な説明】

【0255】

【図1】Ａ）ジフェンヒドラミン（ＤＰＨ、青）とイペロキソ（オレンジ、ＰＤＢエントリ４ＭＱＳ（Ｋｒｕｓｅ，Ｒｉｎｇら、２０１３）（Ｍ２ムスカリン性受容体に結合したイペロキソ））の結合様式の比較は、チロシンがイペロキソとの疎水性相互作用に関与しているが、ＤＰＨと衝突することを示唆している。Ｂ）メチセルギド（赤スティック）の（点線の円で強調された）メチル基は、活性５－ＨＴ２Ｂ立体構造においてＡ２２５（金色スティック）と衝突するが（金、ＰＤＢエントリ６ＤＲＹ（ＭｃＣｏｒｖｙら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１８、２５、７８７－７９６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９４－０１８－０１１６－７））、Ａ２２５Ｇ変異体（緑、ＰＤＢエントリ６ＤＲＺ（ＭｃＣｏｒｖｙら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１８、２５、７８７－７９６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９４－０１８－０１１６－７））では適合する。結合部位の視認性を向上させるために、残基１８０－１９８及び残基１３２－１３８は示されていないことに留意されたい。

【図2】Ａ）ＤＰＨによる野生型ｈＭ４（ＷＴ ＣＨＲＭ４）の活性化。Ａ２０３Ｎではなく、Ａ２０３Ｇと組み合わせたＹ１１３Ｃは、ＤＰＨを拮抗薬から低効力の作動薬に変換する。Ｂ）Ｙ１１３Ｎは、Ｙ１１３Ｃを置換し得るが、他のいくつかのＹ１１３置換は、効力を実質的に変化させることなく、ＤＰＨ奏効性を減少させる。Ｃ）更に他のＹ１１３Ｃ置換は、ＤＰＨ依存性活性化を無効にする。参考までに、二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃ（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら、２００７によって最初に報告されたｈＭ４Ｄ）は、青で示されている。

【図3】Ｓ８５は、活性（左）立体構造において、Ｄ１１２、Ｙ４４３、及び、Ｓ１１６と相互作用ネットワークに関与しており、不活性（右）立体構造において、Ｄ１１２及びＹ４４３と相互作用ネットワークに関与している。

【図4】Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃと組み合わせたＤＰＨ依存性活性化に及ぼすＳ８５変異の効果。二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃは、比較のために青で示されている。

【図5】Ｙ４１６は、オランザピンとの水素結合相互作用に関与するが（左パネル）、疎水性ＤＰＨフェニル環の結合との適合性が低い極性結合部位を作成する（右パネル）。Ｙ４１６Ｆ変異は、この領域の結合部位を疎水性にする。

【図6】Ａ）Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃとの組み合わせにおけるＤＰＨ依存性活性化に対するＹ４１６変異の効果。二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃは、参照のために青で示されている。Ｂ）Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃと同様に、Ｓ８５Ｖと組み合わせたＹ４１６Ｆの効果。

【図7】ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）に結合したオランザピン（緑）及びＤＰＨ（青）の整列モデルは、Ｉｌｅのメチル基が、ＤＰＨに欠落している、オランザピンのメチル基の欠失を補うことを示唆する。

【図8】Ａ）Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃとの組み合わせにおけるＤＰＨ依存性活性化に対するＶ１２０変異の効果。二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃは、参照のために青で示されている。Ｂ）Ｖ１２０Ｉはまた、図６に記載されるＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆとの組み合わせでＤＰＨの奏効性を増加させる。参考までに、コンストラクトＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆは、緑で示されている。

【図9】Ｌ１２３の変異は、活性立体構造に存在する相互作用のネットワークを安定化し得るが（左パネル）、不活性立体構造においては形成され得ない（右パネル、ＰＤＢエントリ５ＤＳＧ（チオトロピウムに結合したｈＭ４）（Ｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１６、５３１：３３５－３４０、ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７１８８））。

【図10】Ａ）Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃとの組み合わせにおけるＤＰＨ依存性活性化に対するＬ１２３変異の効果。二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃは、参照のために青で示されている。Ｂ）Ｌ１２３変異体の追加は、追加のコンストラクトにおいても、ＤＰＨの奏効性／効力の増加をもたらす。参照のために、コンストラクトＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆは、緑で示され、コンストラクトＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉは、赤で示されている。

【図11】Ｆ１２８変異体の追加は、追加のコンストラクトにおいても、ＤＰＨの奏効性／効力の増加をもたらす。参照のために、コンストラクトＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆは、緑で示され、二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃは、青で示されている。

【図12】Ｍ１２１Ｆ変異体の追加は、ＤＰＨの効力の増加をもたらす。参照のために、二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃを青で示す。

【図13】Ａ２００Ｔ変異は、Ｎ４１７との水素結合を導入するため、受容体の活性立体構造を安定化する。

【図14】Ａ２００Ｔ変異体の追加は、ＤＰＨの効力の増加をもたらす。参照のために、二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃを青で示す。

【図15】Ｆ２０４Ｙ変異は、Ｔ４１４との新しい水素結合を導入するため、受容体の活性立体構造を安定化する。

【図16】Ｆ２０４Ｙ変異体の追加は、ＤＰＨの効力の増加をもたらす。参照のために、二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃを青で示す。

【図17A】Ｗ４１３Ｌ変異体の追加は、ＤＰＨの効力の増加をもたらす。参照のために、二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃを青で示す。

【図17B】Ｉ４１０Ｖ変異体の追加は、ＤＰＨの奏効性の増加をもたらす。参照のために、二重変異体Ａ２０３Ｇ＋Ｙ１１３Ｃを青で示す。

【図18】ＧｌｏＳｅｎｓｏｒアッセイで測定したｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）（Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ）のＧｉ結合型活性。変異Ｓ８５Ｖ、Ｖ１２０Ｉ、及びＹ４１６Ｆの追加は、ＤＰＨのＥＣ５０を１．４μＭから３．７ｎＭにシフトする。

【図19】ＧｌｏＳｅｎｓｏｒアッセイで測定したｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）（Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ）及び変異体のＧｉ結合型活性。

【図20】ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）及び変異体は、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒアッセイを使用して基底ｃＡＭＰ濃度への影響を試験した。

【図21】ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）活性化の電気生理学に基づくスクリーニング。Ａ）左：Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔを発現する細胞において、作動薬の適用あり（＋ＤＰＨ、１００ｎＭ、下部）及びなし（ベースライン、上部）におけるＫｉｒ３．１及びＫｉｒ３．２の電流の代表的なトレース。中央：保持電圧に対してプロットされた、左パネルのグレー領域によって示される時間中に測定された平均電流。赤い線は、０と＋５０ｍＶの間の線形フィットから得られた膜の漏れコンダクタンスの計算を示している。右：負の電位における電流への線形フィット（青）と共に、リークを差し引いたＫｉｒ３．１／Ｋｉｒ３．２を介した電流。電流電圧相関の傾斜（ｋ）を、変異体活性化の後続の分析に使用した。Ｂ）左：ＤＰＨは、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ及びＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ変異体の両方に対して、強力な作動薬として作用する。右：Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ及びＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ変異体のＥＣ５０（ｎＭ）。Ｃ）作動薬の適用がない場合、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ変異体は、ＧＦＰのみのトランスフェクション及びＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ変異体と比較して、著しい基底活性を示す（ＧＦＰ対Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ ｐ＝０．００８、ＧＦＰ対Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ ｐ＝０．７７７、ボンフェローニ事後検定を含む一元配置分散分析）。Ｄ）図１０Ｂとは対照的に、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ変異体は、Ｋｉｒ３．１及びＫｉｒ３．２活性化（ｐ＝０．５１３、対応のないｔ検定）において、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆよりも低いＤＰＨ奏効性を示さない。

【図22】他の薬剤は、活性化リガンドとして使用され得る。Ａ）他の薬剤は、通常、ＤＰＨと比較して弱いｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）の活性化を示す。Ｂ）それらの効力及び／又は奏効性は、変異Ｓ８５Ｖ、Ｖ１２０Ｉ、及びＹ４１６Ｆの追加時に改善される。

【図23】近縁のＧＰＣＲファミリーメンバーのアライメントは、高い構造保存性を示す。全ての構造のアラインメント（ａ）、及びＣＨＲＭ４（赤、ＰＤＢエントリ５ＤＳＧ（Ｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１６、５３１：３３５－３４０））の（ｂ）ＣＨＲＭ２（橙、ＰＤＢエントリ５ＺＫＣ（Ｓｕｎｏら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１８、１４：１１５０－１１５８））、（ｃ）ＡＤＲＢ２（シアン、ＰＤＢエントリ３ＰＤＳ（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４６９：２３６－２４０））、（ｄ）ＨＲＨ１（青、ＰＤＢエントリ３ＲＺＥ（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４７５：６５－７０））とのペアワイズアラインメント。ジフェンヒドラミンと共結晶化されたリガンドであるドキセピンとの間の構造的類似性が高いことに留意されたい。（ｅ）ＤＲＤ３（紫、ＰＤＢエントリ３ＰＢＬ（Ｃｈｉｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０、３３０：１０９１－１０９５））及び（ｆ）ＨＴＲ２Ａ（ダークブルー、ＰＤＢエントリ６Ａ９３（Ｋｉｍｕｒａら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１９、２６：１２１－１２８））図及びＲＭＳＤ値は、ＰｙＭＯＬ分子グラフィックスシステムバージョン１．８．０．０（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）のデフォルトのアライメント関数を使用して得られている。

【図24】ＣＨＲＭ４（赤、ＰＤＢエントリ５ＤＳＧ（Ｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１６、５３１：３３５－３４０））と、（ａ）ＣＨＲＭ２（橙、ＰＤＢエントリ５ＺＫＣ（Ｓｕｎｏら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１８、１４：１１５０－１１５８））、（ｂ）ＡＤＲＢ２（シアン、ＰＤＢエントリ３ＰＤＳ（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４６９：２３６－２４０））、（ｃ）ＨＲＨ１（青、ＰＤＢエントリ３ＲＺＥ（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４７５：６５－７０））、（ｄ）ＤＲＤ３（紫、ＰＤＢエントリ３ＰＢＬ（Ｃｈｉｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０、３３０：１０９１－１０９５））、及び（ｅ）５－ＨＴ２Ａ（ダークブルー、ＰＤＢエントリ６Ａ９３（Ｋｉｍｕｒａら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１９、２６：１２１－１２８））との間のＧＲＡＮＰＡ残基の比較。残基は、ＣＨＲＭ４（太字）、並びに、ＣＨＲＭ３（ａ）、ＡＤＲＢ２（ｂ）、ＨＲＨ１（ｃ）、ＤＲＤ３（ｄ）、及びＨＴＲ２Ａ（ｅ）の番号付けに従って表記される。Ｌ１１９Ｗ及びＭ１６４Ｗ変異体は、ＤＲＤ３（ＰＤＢエントリ６ＰＢＬ）及びＨＴＲ２Ａ（ＰＤＢエントリ６Ａ９３）の結晶化コンストラクトに導入されていることに留意されたい。これらは、ＰｙＭＯＬバージョン１．８．０．０を使用して、野生型残基に戻して変異させている。

【図25】生体内でのジフェンヒドラミンによるＧＲＡＮＰＡ活性化は行動を変化させる。

【実施例】

【0256】

方法
ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ） ＤＲＥＡＤＤと関連のベータアドレナリン受容体及びヒスタミン受容体との比較について、ＰＤＢエントリ３ＰＤＳ（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｚｈａｎｇら、２０１１）（不可逆的な作動薬と複合したベータ２アドレナリン受容体）及び３ＲＺＥ（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ、Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉら、２０１１）（ドキセピンと複合したＨ１ヒスタミン受容体）は、Ｗｅｓｔｏｎら（Ｗｅｓｔｏｎ、Ｋａｓｅｒｅｒら、２０１９）において報告されたオランザピン－ＤＲＥＡＤＤモデルとアラインメントされ、ＰｙＭＯＬバージョン０．９９ｒｃ６（２０１４）を使用して手動で詳しく調べられた。

【0257】

未加工のジフェンヒドラミン（ＤＰＨ）－ＤＲＥＡＤＤ結合モデルは、ＫＮＩＭＥバージョン４．０．０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｃｅｂｒｏｎら、２００７）のＲＤＫｉｔ Ｏｐｅｎ ３Ｄアラインメントノードを使用して、ＤＰＨをオランザピン結合ポーズにアライメントさせることによって生成された（Ｍａｓｓｏｎ、Ｅｌｌｉｓら、１９９２、Ｙｏｕｎｇ、Ｆｏｎｇら、２０１４）。精密化のために、ねじれ角が調整され、ＵＣＳＦ－Ｃｈｉｍｅｒａ１．１３．１（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ、Ｇｏｄｄａｒｄら、２００４）にてモデルが最小化された。ＤＰＨ－ＤＲＥＡＤＤモデルは、チオトロピウムと複合したＭ４ムスカリン性受容体とアライメントされて（ＰＤＢエントリ５ＤＳＧ（Ｔｈａｌ、Ｓｕｎら、２０１６）、活性状態及び不活性状態を比較し、構造はＰｙＭＯＬバージョン１．８．０．０を使用して手動で分析された（Ｈａｕｓｓｅｒ、２０１４）。ＣＨＲＭ４の非コンセンサスアミノ酸を識別するためのモノアミン神経伝達物質受容体のポリペプチドアライメントは、ＭＥＧＡ Ｘバージョン１０．１．８^１１を使用して実施された。

【0258】

変異体の作製
Ｇｉ結合型ヒトムスカリン性受容体「ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）」は、経口的に生物学的利用可能性があり、通常不活性な、クロザピンの代謝物である、クロザピンＮ酸化物（ＣＮＯ）に感受性になっている。この改変ＧＰＣＲは、以下の変異を含む。Ｙ１１３Ｃ／Ａ２０３Ｇ。

【0259】

改変受容体ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）は、最初は、Ｂ．Ｎ．Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ、Ｘ．Ｌｉ、Ｍ．Ｈ．Ｐａｕｓｃｈ、Ｓ．Ｈｅｒｌｉｔｚｅ、Ｂ．Ｌ．Ｒｏｔｈ、“Ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃｋ ｔｏ ｆｉｔ ｔｈｅ ｋｅｙ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｎｅｒｔ ｌｉｇａｎｄ”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４、５１６３-５１６８（２００７）において記載された。それらの著者は、ムスカリン性ＡＣｈ受容体（ｍＡＣｈＲ）ＤＲＥＡＤＤのファミリーを作るために利用された、定義されたリガンド特異性を有するＧＰＣＲを生成するための一般的で検証済みでバイアスのないアプローチを説明している。これらＤＲＥＡＤＤの調製及び特徴のその記述に関して、その刊行物の内容は、参照により具体的に本明細書に援用する。

【0260】

ヒトＭ４ ＤＲＥＡＤＤの調製はまた、Ｖ．Ｎａｗａｒａｔｎｅ、Ｋ．Ｌｅａｃｈ、Ｎ．Ｓｕｒａｔｍａｎ、Ｒ．Ｅ．Ｌｏｉａｃｏｎｏ、Ｃ．Ｃ．Ｆｅｌｄｅｒ、Ｂ．Ｎ．Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ、及びＡ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、（２００８）．“Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ４ ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｇａｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ａｎｄ ａ ＤＲＥＡＤＤ（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｄｒｕｇ）”．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、７４（４）、１１１９－１１３１において説明されている。

【0261】

ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）をコードするプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ０２１３９）から、ｐｌａｓｍｉｄ４５５４８：ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ－ＨＡ－ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）として市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４５５４８／）。

【0262】

ｈＭ３Ｄｑをコードするプラスミドも、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４４３６１／）。この受容体は、パーラピン（２７）に感受性である。

【0263】

ＤＮＡの操作は、従来の分子生物学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）によって、又は製造元のプロトコルに従って市販のキットで行われた。部位特異的突然変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った。Ｑ５部位特異的突然変異及びＨｉ－Ｆｉアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＤＮＡの他の改変を行った。Ｍｏｎａｒｃｈ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）又はＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ ｍｉｄｉ ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した吸収分光光度法によってＤＮＡを定量化し、Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＵＫ）によるサンガー配列決定を受けた。

【0264】

置換は以下の通りであった。
２５３－２５５ - Ｓ８５： ＴＣＣ
Ｖ － ＧＴＴ／ＧＴＣ／ＧＴＡ／ＧＴＧ
３３７－３３９ - Ｙ１１３ ＴＡＣ
Ｃ － ＴＧＴ／ＴＧＣ
Ｎ － ＡＡＴ／ＡＡＣ
３５８－３６０ - Ｖ１２０ ＧＴＣ
Ｉ － ＡＴＴ／ＡＴＣ／ＡＴＡ
３６１－３６３ - Ｍ１２１ ＡＴＧ
Ｆ － ＴＴＴ／ＴＴＣ
３６７－３６９ - Ｌ１２３ ＣＴＴ
Ｃ － ＴＧＴ／ＴＧＣ
Ｉ － ＡＴＴ／ＡＴＣ／ＡＣＡ
Ｓ － ＴＣＴ／ＴＣＣ／ＴＣＡ／ＴＣＧ／ＡＧＴ／ＡＧＣ
Ｔ － ＡＣＴ／ＡＣＣ／ＡＣＡ／ＡＣＧ
Ｖ － ＧＴＴ／ＧＴＣ／ＧＴＡ／ＧＴＧ
３８２－３８４ - Ｆ１２８ ＴＴＴ
Ｉ － ＡＴＴ／ＡＴＣ／ＡＴＡ
Ｌ － ＴＴＡ／ＴＴＧ／ＣＴＴ／ＣＴＣ／ＣＴＡ／ＣＴＧ
Ｖ － ＧＴＴ／ＧＴＣ／ＧＴＡ／ＧＴＧ
５９８－６００ - Ａ２００ ＧＣＣ
Ｔ － ＡＣＴ／ＡＣＣ／ＡＣＡ／ＡＣＧ
６０７－６０９ - Ａ２０３ ＧＣＣ
Ｇ － ＧＧＴ／ＧＧＣ／ＧＧＡ／ＧＧＧ
６１０－６１２ - Ｆ２０４ ＴＴＣ
Ｙ － ＴＡＴ／ＴＡＣ
１２２８－１２３０ - Ｉ４１０ ＡＴＣ
Ｖ － ＧＴＴ／ＧＴＣ／ＧＴＡ／ＧＴＧ
１２３７－１２３９ - Ｗ４１３ ＴＧＧ
Ｌ － ＴＴＡ／ＴＴＧ／ＣＴＴ／ＣＴＣ／ＣＴＡ／ＣＴＧ
１２４６－１２４８ - Ｙ４１６ ＴＡＣ
Ｆ － ＴＴＴ／ＴＴＣ

【0265】

細胞培養及びアッセイ
すべての哺乳類細胞は、ＤＭＥＭ（３７℃及び５％ＣＯ_２の１０％ＦＢＳプラス関連抗生物質）中で維持された。選択された変異体を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介してＣＨＲＭ４－Ｔａｎｇｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃６６２５１）に組み込み、ＤＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ｍｉｎｉ－又はｍｉｄｉ－ｐｒｅｐ ｋｉｔｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を介して得た。コンストラクトＤＮＡ４μｇを、ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１２μＬを含むｏｐｔｉｍｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）４００μＬと混合し、完全培地４ｍＬ中において、Ｔ２５フラスコ内の７０％のコンフルエントなＨＴＬＡ細胞（ｔＴＡ依存性ルシフェラーゼレポーター及びベータアレスチン２－ＴＥＶ融合遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞種）^{１２，１３}にトランスフェクションした。２日後、細胞をクエン酸食塩水で剥離し、異なる濃度の薬剤を含むｏｐｔｉｍｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）４０μＬが入った白色１／２面積９６ウェルプレートに移動した。細胞を一晩静置し、ＧｌｏＭａｘ／Ｇｌｏ溶解用緩衝液（１：１、Ｐｒｏｍｅｇａ）４０μＬを直接添加して溶解した後、ウェルあたり１秒積算で、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で発光を計数した。

【0266】

ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ ｃＡＭＰアッセイを使用して、選択変異体の結果を確認した。ここで、コンストラクトＤＮＡは、２２Ｆレポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に、上記のｔｕｒｂｏｆｅｃｔを有するＴ２５フラスコ内のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に１：１でコトランスフェクションされた。翌日、細胞をクエン酸食塩水で剥離し、ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１００μＬが入った白色１／２面積９６ウェルプレートに移動した。１日後、培地を除去し、細胞をＨＢＳＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）１００μＬで洗浄した後、続いてＨＢＳＳ中の５％ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ試薬４０μＬを添加した。１時間インキュベーションした後、ＨＢＳＳ中の様々な濃度の薬剤１０μＬを各ウェルに添加した。ウェルあたりの１秒積算で、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で、発光を１５分間計数した後、終濃度が２００ｎＭになるようにＨＢＳＳ中のイソプレナリン１０μＬを添加した。プレートを再び１５分間読み取った。

【0267】

Ｇｉ依存性Ｋｉｒ３．１／３．２のＧｉ活性化の電気生理学的な確認のために、変異体をｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）－プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４５５４８）に挿入した。上記のトランスフェクション後、Ｇｉ依存性Ｋｉｒ３．１／３．２の活性化は、Ｗｅｓｔｏｎら^３に記載されたように、全細胞パッチクランプ技術を使用して定量化した。

【0268】

方法についての参考文献
1. Rosenbaum, D.M., et al. Structure and function of an irreversible agonist-β2 adrenoceptor complex. Nature 469, 236-240 (2011).
2. Shimamura, T., et al. Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin. Nature 475, 65-70 (2011).
3. Weston, M., et al. Olanzapine: A potent agonist at the hM4D(Gi) DREADD amenable to clinical translation of chemogenetics. Science Advances 5, eaaw1567 (2019).
4. The, P.O.N.E.S. Correction: Targeting Photoreceptors via Intravitreal Delivery Using Novel, Capsid-Mutated AAV Vectors. PloS one 9, e110030 (2014).
5. Young, D., et al. Adenosine kinase, glutamine synthetase and EAAT2 as gene therapy targets for temporal lobe epilepsy. Gene therapy (2014).
6. Masson, N., Ellis, M., Goodbourn, S. & Lee, K.A. Cyclic AMP response element-binding protein and the catalytic subunit of protein kinase A are present in F9 embryonal carcinoma cells but are unable to activate the somatostatin promoter. Molecular and cellular biology 12, 1096-1106 (1992).
7. Berthold, M.R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. in Studies in Classification, Data Analysis, and Knowledge Organization (GfKL 2007) (Springer, 2007).
8. Pettersen, E.F., et al. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry 25, 1605-1612 (2004).
9. Thal, D.M., et al. Crystal structures of the M1 and M4 muscarinic acetylcholine receptors. Nature 531, 335-340 (2016).
10. Hausser, M. Optogenetics: the age of light. Nature methods 11, 1012-1014 (2014).
11. Kumar, S., et al. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35, 1547-1549 (2018).
12. Barnea, G, et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proc Natl Acad Sci U S A.105, 64-69 (2008).
13. Kroeze, W.K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nat Struct Mol Biol 22, 362-369 (2015).

【0269】

実施例１：Ｙ１１３及びＡ２０３変異の効果の構造的基礎
これらは、Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら、ＰＮＡＳ ２００７、１０４、５１６３－５１６８によって報告された本来の残基である。

【0270】

提案された作用メカニズムは以下の通りである。
Ｙ１１３Ｃ：内因性作動薬であるアセチルコリンと比較して、より大きな分子を活性の立体構造に結合させ得る空間を作る。また、内因性リガンド又は同様のサイズの他の作動薬（イペロキソなど）への疎水性接触が失われるため、結合が阻害される（図１Ａ）。
Ａ２０３Ｇ：受容体活性化時のヘリックス５の動きを阻害する、立体バルクを除去することによって、拮抗薬を作動薬に転換する。セロトニン作動性ＨＴＲ２Ｂ受容体において対応するＡ２２５Ｇ変異は、拮抗薬メチセルジドを部分作動薬に転換するが、作動薬メチルエルゴノビンの効力又は奏効性に実質的に影響を及ぼさない（ＭｃＣｏｒｖｙら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１８、２５、７８７－７９６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９４－０１８－０１１６－７）。図１Ｂは、メチセルジドのメチル基が活性ＨＴＲ２Ｂ立体構造においてＡ２２５とどのように衝突するかを強調するが、Ａ２２５Ｇ変異体と適合性がある。

【0271】

実験結果を図２に示す。Ａ２０３Ｇが作動薬活性を提供すると結論付けることができる。

【0272】

Ｙ１１３は、Ｃ及びＮへの、より低いレベルでＡ及びＶへの、並びに、ある程度でＴ、Ｑ、及びＳへの変異を忍容する。

【0273】

実施例２：位置８５での変異の効果
提案された作用メカニズムは以下の通りである。
Ｓ８５Ｖ：図３に示すように、これは、活性（図３左）の立体構造においてＤ１１２，Ｙ４４３、及びＳ１１６、並びに、不活性（図３右）の立体構造においてＤ１１２及びＹ４４２を含む水素結合ネットワークの一部である。リガンドが結合すると、Ｄ１１２のカルボキシ基は異なる回転異性体をとる。Ｓ８５Ｖ変異における疎水性の導入は、不活性状態のＤ１１２回転異性体と適合しないが、Ｄ１１２活性立体構造回転異性体のＣベータ原子と疎水性接触を形成するため、活性立体構造を安定化し得る。

【0274】

実験結果を図４に示す。Ｓ８５Ｖ及びＳ８５Ｃは、ＤＰＨ効力を増加させる（Ｙ４１６Ｆとの組み合わせにおいても、以下を参照）。しかしながら、Ｓ８５Ｖ及びＳ８５Ｃはともに奏効性を低下させる。

【0275】

実施例３：位置４１６での変異の効果
提案された作用メカニズムは以下の通りである。
Ｙ４１６Ｆ：図５に示されるように、これは、そうでなければ、ＤＰＨの疎水性フェニル環に近接する、ＯＨ基の極性を除去する。ＯＨ基との相互作用は、ＯＨ基がオランザピンのベンゾジアゼピン－窒素の水素結合に潜在的に関与していたため、オランザピンで忍容された（これは、Ｗｅｓｔｏｎら、２０１９、Ｓｃｉ Ａｄｖ．、２０１９ Ａｐｒ １７；５（４）：ｅａａｗ１５６７において、ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）の完全作動薬であると示された）。不可逆的作動薬と複合したベータ２アドレナリン受容体の結晶構造との比較がされ得る（３ＰＤＳ；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４６９：２３６－２４０）。

【0276】

実験結果を図６に示す。Ｙ４１６Ｆは、ＤＰＨの効力を増加させ、Ｓ８５Ｖと組み合わせたＹ４１６Ｆは、更に効力を増加させる。

【0277】

実施例４：位置１２０での変異の効果
提案された作用メカニズムは以下の通りである。
Ｖ１２０Ｉ：図７に示すように、この変異は、結合部位の空間をよりよく「埋め」得るため、疎水性接触を増加させる。Ｖａｌと比較したＩｌｅの追加のメチル基は、オランザピン－メチル基の欠失を補償する。残基３．４０及びＴＭ６上でのその接触の重要性は、Ｍ２受容体のＮＭＲ分光学的研究で説明されている（Ｘｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、２０１９、７５：５３-６５）。

【0278】

実験結果を図８に示す。Ｖ１２０Ｉ変異は、ＤＰＨの奏効性を高める。

【0279】

実施例５：位置１２３での変異の効果
提案された作用メカニズムは以下の通りである。
Ｌ１２３Ｔ／Ｓ：図９に示すように、この改変は、受容体の活性化時に形成された相互作用のネットワークを安定化し得るが、不活性な立体構造においては欠いている。

【0280】

実験結果を図１０に示す。Ｌ１２３の変異は、ＤＰＨの効力及び／又は奏効性を増加させる。他のＬ１２３の置換のいくつかは、構成的に活性な受容体に至る。図１０Ｂは、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉと比較して、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３ＴでのＤＰＨの奏効性がより低いことを示唆する。しかしながら、このアッセイは、βアレスチンの動員を測定し、より低い奏効性は、ＧＩＲＫ（Ｋｉｒ３．１及びＫｉｒ３．２）コンダクタンスのＧ_β／γ依存性活性化を測定するアッセイにおいて明らかであることに留意されたい（図２１Ｄ）。したがって、これは、Ｇタンパク質シグナル伝達を維持しつつ、βアレスチンの動員の減少を示す。

【0281】

実施例６：位置１２８での変異の効果
図１１に示すように、Ｙへではなく、Ｉ、Ｌ、又はＶへのＦ１２８の変異は、ＤＰＨの奏効性及び／又は効力を増加させる。

【0282】

実施例７：位置１２１での変異の効果
図１２に示すように、Ｌへではなく、ＦへのＭ１２１の変異は、ＤＰＨの効力を増加させる。

【0283】

実施例８：位置２００及び２０４での変異の効果
提案された作用メカニズムは以下の通りである。
Ａ２００Ｔ：図１３に示すように、この改変は、水素結合をＮ４１７に導入し、新しい疎水性接触を潜在的に導入することによって、受容体の活性の立体構造を明らかに安定化させる。

【0284】

実験結果を図１４に示す。Ｇ又はＳへではなく、ＴへのＡ２００の変異は、効果が小さく、奏効性を減少させるというコストを伴うものの、ＤＰＨの効力を増加させる。

【0285】

位置２０４に関連して、提案された作用メカニズムは、以下の通りである：
Ｆ２０４Ｙ：図１５に示すように、この改変は、水素結合をＴ４１４に導入することによって、受容体の活性の立体構造を明らかに安定化させる。

【0286】

実験結果を図１６に示す。Ｈへではなく、ＹへのＦ２０４の変異は、ＤＰＨの効力を増加させる。

【0287】

実施例９：位置４１３での変異の効果
図１７Ａに示すように、Ｗ４１３Ｌの変異は、奏効性を減少させるという代償はあるが、ＤＰＨの効力を増加させる。

【0288】

図１７Ｂに示すように、Ｉ４１０Ｖ変異体は、ＤＰＨの奏効性の増加をもたらす。

【0289】

実施例１０：代替リガンドの提供
代替のリガンドは、２つの異なる研究戦略によって提供された。
検索戦略１は、化学的類似性に基づいており、以下を含む。
ａ）Ｓｗｉｓｓ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙウェブサーバを使用したＳｈａｐｅ－ＩＴによってジフェンヒドラミンと類似する承認された薬剤（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｗｉｓｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．ｃｈ／；Ｚｏｅｔｅ Ｖ．、Ｄａｉｎａ，Ａ．、Ｂｏｖｉｇｎｙ Ｃ．、及びＭｉｃｈｉｅｌｉｎ、Ｏ．、ＳｗｉｓｓＳｉｍｉｌａｒｉｔｙ：Ａ Ｗｅｂ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｌｏｗ ｔｏ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｌｉｇａｎｄ－Ｂａｓｅｄ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．、２０１６、５６（８）、１３９９－１４０４．）。
ｂ）ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒ及びＦｒａｇＦＰを使用してジフェンヒドラミンに対して０．５の類似性を有する化合物（Ｔｈｏｍａｓ Ｓａｎｄｅｒ、Ｊｏｅｌ Ｆｒｅｙｓｓ、Ｍｏｄｅｓｔ ｖｏｎ Ｋｏｒｆｆ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｒｕｆｅｎｅｒ、ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒ：Ａｎ Ｏｐｅｎ－Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｗａｒｅ Ｄａｔａ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ．、Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｍｏｄｅｌ、２０１５、５５、４６０－４７３、ｄｏｉ １０．１０２１／ｃｉ５００５８８ｊ）。
ｃ）ＣｈＥＭＢＬウェブサーバを使用してジフェンヒドラミンに対して０．５の類似性を有する承認された薬剤（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｈｅｍｂｌ／；Ａ．Ｇａｕｌｔｏｎ、Ｌ．Ｂｅｌｌｉｓ、Ｊ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ、Ｍ．Ｄａｖｉｅｓ、Ａ．Ｈｅｒｓｅｙ、Ｙ．Ｌｉｇｈｔ、Ｓ．ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ、Ｒ．Ａｋｈｔａｒ、Ａ．Ｐ．Ｂｅｎｔｏ、Ｂ．Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ、Ｄ．Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｃｈ、及びＪ．Ｐ．Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ、（２０１２）、「ＣｈＥＭＢＬ：Ａ Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、４０ Ｄ１１００－１１０７．、ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ７７７、ＰＭＩＤ：２１９４８５９４；Ａ．Ｐ．Ｂｅｎｔｏ、Ａ．Ｇａｕｌｔｏｎ、Ａ．Ｈｅｒｓｅｙ、Ｌ．Ｊ．Ｂｅｌｌｉｓ、Ｊ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ、Ｍ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｆ．Ａ．Ｋｒｕｇｅｒ、Ｙ．Ｌｉｇｈｔ、Ｌ．Ｍａｋ、Ｓ．ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ、Ｍ．Ｎｏｗｏｔｋａ、Ｇ．Ｐａｐａｄａｔｏｓ、Ｒ．Ｓａｎｔｏｓ及びＪ．Ｐ．Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ、（２０１４）、「Ｔｈｅ ＣｈＥＭＢＬ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｄａｔａｂａｓｅ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、４２ １０８３－１０９０．、ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１０３、ＰＭＩＤ：２４２１４９６５）。

【0290】

結果を表１（Table 1）に列挙する。

【0291】

検索戦略２は、機能的、ひいては構造的な類似性に基づいており、以下を含む。
２．） ＧＲＡＮＰＡに結合する抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン）であることが期待され得る承認された抗ヒスタミン剤。

【0292】

結果を表２（Table 2）に列挙する。

【0293】

実施例１１：異なるアッセイによるＧＲＡＮＰＡ変異の更なる分析
図１８は、ｃＡＭＰ産生を阻害する能力を検証するために使用された、ＧｉカスケードのＧｌｏＳｅｎｓｏｒアッセイによって測定された本発明の変異の組み合わせを示す。

【0294】

図１９は、ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）（Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ）のＧｉ結合型活性の結果、及びＧｌｏＳｅｎｓｏｒアッセイで測定された変異体を示す。Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ±Ｖ１２０Ｉ±Ｌ１２３（Ｔ／Ｃ／Ｓ／Ｉ／Ｖ）の追加により、ＤＰＨによる活性化の効力が増加した。データは、２０μＭのＤＰＨで処理された対照ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）と比較した、光出力によって測定されるｃＡＭＰの阻害の割合として正規化された。コンストラクトのＥＣ５０及びスパンは以下の通りである。
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ（７１７ｎＭ；９４％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ（１．５０ｎＭ；１１６％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ（１．８０ｎＭ；１１１％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ（０．９４９ｎＭ；１２９％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｔ（０．９５６ｎＭ；１２９％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｃ（０．３６６ｎＭ；１１５％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｃ（０．２５２ｎＭ；１０１％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｓ（０．５２８ｎＭ；８３％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｓ（０．３２１ｎＭ；１１０％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｉ（１．４１ｎＭ；９８％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｌ１２３Ｉ（０．８８０ｎＭ；１１９％）
Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｖ（１．１５ｎＭ；１０９％）

【0295】

図２０は、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒアッセイを使用して基底ｃＡＭＰ濃度への影響を試験された、ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）及び変異体の結果を示す。データは、ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）（Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ）に対して正規化された。薬物治療を行わなかった基底発光の減少は、構成的活性の増加を示す。Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ（１００％）は、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ（９３％）及びＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｖ１２０Ｉ（９５％）と有意に異ならず、一方で他の変異体の組み合わせは異なった（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ，Ｐ＜０．０５）。

【0296】

図２１は、Ｋｉｒ３．１及びＫｉｒ３．２のＧタンパク質結合型内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）のＧ_β／γ依存性の増強を試験する電気生理学アッセイの結果を示す。

【0297】

ＧＩＲＫアッセイは、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ及びＹ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔの両方がＤＰＨによって強力に活性化されていることを確認している。対照的に、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔは、図１０Ｂのβ－アレスチンアッセイデータにおいてより少ない動員を示した。しかしながら、それらはＧＩＲＫアッセイにおいて同様の奏効性を示すが、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔではなく、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆは、ある程度の基底活性を示す。

【0298】

したがって、Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔが好ましいＧＲＡＮＰＡである。

【0299】

実施例１２：他の活性化リガンド
図２２は、他の抗ヒスタミン剤及び抗ムスカリン剤を含む他の薬剤が活性化リガンドとして使用され得、特にそれらの効力及び／又は奏効性が、例えば、Ｓ８５Ｖ、Ｖ１２０Ｉ、及びＹ４１６Ｆなどの本発明の改変の使用によって改善され得ることを確認している。

【0300】

実施例１３－好ましい実施形態の概要及びアミノ酸配列対応番号付け
参照のｍＡＣｈＲ４番号付けを、括弧内にはＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号付けを示す。
本来のＤＲＥＡＤＤ：
Ｙ１１３－Ｃ／Ｎ （３．３３）
Ａ２０３－Ｇ （５．４６）
実質的にＤＰＨの効力／奏効性が増加した変異：
Ｓ８５－Ｖ （２．５７）
Ｖ１２０－Ｉ （３．４０）
Ｌ１２３－Ｃ／Ｉ／Ｓ／Ｔ／Ｖ （３．４３）
Ｆ１２８－Ｉ／Ｌ／Ｖ （３．４８）
Ｙ４１６－Ｆ （６．５１）
ＤＰＨ効力が実質的な増加でない：
Ｍ１２１－Ｆ （３．４１）
Ａ２００－Ｔ （５．４３）
Ｆ２０４－Ｙ （５．４７）
Ｉ４１０－Ｖ （６．４５）
Ｗ４１３－Ｌ （６．４８）

【0301】

近縁のＧＰＣＲファミリーメンバーのアライメントは、高い構造保存性を示しており（図２３）、ＣＨＲＭ４で特定された残基は、他のアミン作動性ＧＰＣＲでの対応する残基に容易にアライメントされ得る（図２４）。

【0302】

他のアミン作動性ＧＰＣＲにおける対応する残基を以下に示す。ＦＡＳＴＡペプチド配列のアライメントは、ＭＥＧＡ Ｘ １０．１．８（Ｋｕｍａｒ Ｓ．ら、「ＭＥＧＡ Ｘ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｃｒｏｓｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ３５、１５４７－１５４９（２０１８））を使用して、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズム（標準設定：Ｇａｐ Ｏｐｅｎ＝－２．９、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｔ＝０．０、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ＝１．２、Ｍａｘ Ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ＝１６、Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ＝ＵＰＧＭＡ、Ｍｉｎ Ｄｉａｇ Ｌｅｎｇｔｈ＝２４）で行われた。

【0303】

実施例１４－生体内でのジフェンヒドラミンによるＧＲＡＮＰＡ活性化は行動を変化させる
ｈＣａＭＫＩＩプロモーター（タイタ：６．７×１０∧１４ｖｇ／ｍＬ）の下でＧＲＡＮＰＡ（Ｙ１１３Ｃ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｓ８５Ｖ＋Ｖ１２０Ｉ＋Ｙ４１６Ｆ＋Ｌ１２３Ｔ）を発現する、ＡＡＶ９カプシドにより偽型化した組換えアデノ随伴ウイルスを、麻酔下のマウスの右の黒質（容積：３００ナノリットル）に注射した。３週間後、マウスは、単独で、又はジフェンヒドラミン（１ｍｇ／ｋｇ）と一緒に、自発運動を増強するアンフェタミン（３ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注入を受けた。次に、マシンビジョンツールを使用して、全身の左及び右への回転を計数した。ジフェンヒドラミンによって、左回転の有意な増加に至った（ｎ＝９、ｐ＝０．０３７、スチューデント対応有りｔ検定、図２５）。

【0304】

【表3】

【0305】

ＡＣＭ４ Ｓ８５（残基２．５７）は、ＡＣＭ１ Ｓ７８、ＡＣＭ２ Ｓ７６、ＡＣＭ３ Ｓ１２１、ＡＣＭ５ Ｓ８３、ＨＲＨ３ Ｃ８７、ＨＲＨ４ Ｓ６８、ＡＤＡ２Ｂ Ｉ６５に対応する。

【0306】

【表4】

【0307】

ＡＣＭ４ Ｖ１２０（残基３．４０）は、ＡＣＭ１ Ｖ１１３、ＡＣＭ２ Ｖ１１１、ＡＣＭ３ Ｖ１５６、ＡＣＭ５ Ｖ１１８、ＨＲＨ３ Ａ１２２、ＨＲＨ４ Ｖ１０２に対応する。

【0308】

ＡＣＭ４ Ｍ１２１（残基３．４１）は、ＡＣＭ１ Ｍ１１４、ＡＣＭ２ Ｍ１１２、ＡＣＭ３ Ｍ１５７、ＡＣＭ５ Ｍ１１９、ＨＲＨ１ Ｆ１１６、ＨＲＨ２ Ｌ１０８、ＨＲＨ３ Ｆ１２３、ＨＲＨ４ Ｙ１０３、５ＨＴ１Ｆ Ｌ１１２、５ＨＴ１Ｅ Ｌ１１１、５ＨＴ１Ｄ Ｌ１２７、５ＨＴ１Ｂ Ｌ１３８、５ＨＴ５Ａ Ｗ１３０、５ＨＴ７ Ｍ１７１、５ＨＴ１Ａ Ｌ１２５、５ＨＴ２Ａ Ｍ１６４、ＤＲＤ３ Ｌ１１９、ＤＲＤ２ Ｌ１２３、ＤＲＤ４ Ｆ１２４、ＡＤＡ１Ｂ Ｌ１３４、ＡＤＡ１Ｄ Ｌ１８５、ＡＤＡ１Ａ Ｍ１１５、ＡＤＡ２Ｂ Ｖ１０１、ＡＤＡ２Ａ Ｖ１３７、ＡＤＡ２Ｃ Ｖ１４０、５ＨＴ６ Ｌ１１５、５ＨＴ２Ｂ Ｍ１４４、５ＨＴ２Ｃ Ｍ１４３、ＤＲＤ１Ｂ Ｌ１２９、ＤＲＤ１Ａ Ｌ１１２、５ＨＴ４ Ｆ１０９、ＡＤＲＢ３ Ｅ１２６、ＡＤＲＢ１ Ｅ１４７、ＡＤＲＢ２ Ｅ１２２に対応する。

【0309】

ＡＣＭ４ Ｌ１２３（残基３．４３）は、ＡＣＭ１ Ｌ１１６、ＡＣＭ２ Ｌ１１４、ＡＣＭ３ Ｌ１５９、ＡＣＭ５ Ｌ１２１、ＨＲＨ１ Ｖ１１８、ＨＲＨ２ Ｌ１１０、ＨＲＨ３ Ｉ１２５、ＨＲＨ４ Ｉ１０５、５ＨＴ１Ｆ Ｌ１１４、５ＨＴ１Ｅ Ｌ１１３、５ＨＴ１Ｄ Ｌ１２９、５ＨＴ１Ｂ Ｌ１４０、５ＨＴ５Ａ Ｖ１３２、５ＨＴ７ Ｌ１７３、５ＨＴ１Ａ Ｌ１２７、５ＨＴ２Ａ Ｌ１６６、ＤＲＤ３ Ｌ１２１、ＤＲＤ２ Ｌ１２５、ＤＲＤ４ Ｌ１２６、ＡＤＡ１Ｂ Ｌ１３６、ＡＤＡ１Ｄ Ｌ１８７、ＡＤＡ１Ａ Ｌ１１７、ＡＤＡ２Ｂ Ｌ１０３、ＡＤＡ２Ａ Ｌ１３９、ＡＤＡ２Ｃ Ｌ１４２、５ＨＴ６ Ｌ１１７、５ＨＴ２Ｂ Ｌ１４６、５ＨＴ２Ｃ Ｌ１４５、ＤＲＤ１Ｂ Ｌ１３１、ＤＲＤ１Ａ Ｌ１１４、５ＨＴ４ Ｌ１１１、ＡＤＲＢ３ Ｌ１２８、ＡＤＲＢ１ Ｌ１４９、ＡＤＲＢ２ Ｌ１２４に対応する。

【0310】

ＡＣＭ４ Ｆ１２８（残基３．４８）は、ＡＣＭ１ Ｆ１２１、ＡＣＭ２ Ｆ１１９、ＡＣＭ３ Ｆ１６４、ＡＣＭ５ Ｆ１２６、ＨＲＨ１ Ｉ１２３、ＨＲＨ２ Ｌ１１５、ＨＲＨ３ Ｙ１３０、ＨＲＨ４ Ｙ１１０、５ＨＴ１Ｆ Ｌ１１９、５ＨＴ１Ｅ Ｌ１１８、５ＨＴ１Ｄ Ｌ１３４、５ＨＴ１Ｂ Ｌ１４５、５ＨＴ５Ａ Ｌ１３７、５ＨＴ７ Ｉ１７８、５ＨＴ１Ａ Ｌ１３２、５ＨＴ２Ａ Ｌ１７１、ＤＲＤ３ Ｉ１２６、ＤＲＤ２ Ｉ１３０、 ＤＲＤ４ Ｖ１３１、ＡＤＡ１Ｂ Ｉ１４１、ＡＤＡ１Ｄ Ｖ１９２、ＡＤＡ１Ａ Ｉ１２２、ＡＤＡ２Ｂ Ｌ１０８、ＡＤＡ２Ａ Ｌ１４４、ＡＤＡ２Ｃ Ｌ１４７、５ＨＴ６ Ｌ１２２、５ＨＴ２Ｂ Ｖ１５１、５ＨＴ２Ｃ Ｌ１５０、ＤＲＤ１Ｂ Ｖ１３６、ＤＲＤ１Ａ Ｖ１１９、５ＨＴ４ Ｌ１１６、ＡＤＲＢ３ Ｖ１３３、ＡＤＲＢ１ Ｌ１５４、ＡＤＲＢ２ Ｖ１２９に対応する。

【0311】

【表5】

【0312】

ＡＣＭ４ Ａ２００（残基５．４３）は、ＡＣＭ１ Ａ１９３、ＡＣＭ２ Ａ１９１、ＡＣＭ３ Ａ２３６、ＡＣＭ５ Ａ１９８、ＨＲＨ１ Ａ１９５、ＨＲＨ２ Ｇ１８７、ＨＲＨ３ Ｓ２０３、ＨＲＨ４ Ｓ１７９、５ＨＴ２Ａ Ｓ２３９、ＤＲＤ３ Ｓ１９３、ＤＲＤ２ Ｓ１９４、ＤＲＤ４ Ｓ１９７、ＡＤＡ１Ｂ Ｓ２０８、ＡＤＡ１Ｄ Ｓ２５９、ＡＤＡ１Ａ Ａ１８９、ＡＤＡ２Ｂ Ｓ１７７、ＡＤＡ２Ａ Ｃ２１６、ＡＤＡ２Ｃ Ｃ２１５、５ＨＴ６ Ｓ１９３、５ＨＴ２Ｂ Ｓ２２２、５ＨＴ２Ｃ Ｓ２１９、ＤＲＤ１Ｂ Ｓ２３０、ＤＲＤ１Ａ Ｓ１９９、５ＨＴ４ Ｓ１９７、ＡＤＲＢ３ Ｓ２０９、ＡＤＲＢ１ Ｓ２２９、ＡＤＲＢ２ Ｓ２０４に対応する。

【0313】

ＡＣＭ４ Ｆ２０４（残基５．４７）は、ＡＣＭ１ Ｆ１９７、ＡＣＭ２ Ｆ１９５、ＡＣＭ３ Ｆ２４０、ＡＣＭ５ Ｆ２０２、ＨＲＨ１ Ｆ１９９、ＨＲＨ２ Ｆ１９１、ＨＲＨ３ Ｆ２０７、ＨＲＨ４ Ｆ１８３、５ＨＴ１Ｆ Ｆ１９０、５ＨＴ１Ｅ Ｆ１９１、５ＨＴ１Ｄ Ｆ２０６、５ＨＴ１Ｂ Ｆ２１７、５ＨＴ５Ａ ２０９、５ＨＴ７ ２４８、５ＨＴ１Ａ Ｆ２０４、５ＨＴ２Ａ Ｆ２４３、ＤＲＤ３ Ｆ１９７、ＤＲＤ２ Ｆ１９８、 ＤＲＤ４ Ｆ２０１、ＡＤＡ１Ｂ Ｆ２１２、ＡＤＡ１Ｄ Ｆ２６３、ＡＤＡ１Ａ Ｆ１９３、ＡＤＡ２Ｂ Ｆ１８１、ＡＤＡ２Ａ Ｆ２２０、ＡＤＡ２Ｃ Ｆ２１９、５ＨＴ６ Ｆ１９７、５ＨＴ２Ｂ Ｆ２２６、５ＨＴ２Ｃ Ｆ２２３、ＤＲＤ１Ｂ Ｆ２３４、ＤＲＤ１Ａ Ｆ２０３、５ＨＴ４ Ｆ２０１、ＡＤＲＢ３ Ｆ２１３、ＡＤＲＢ１ Ｆ２３３、ＡＤＲＢ２ Ｆ２０８に対応する。

【0314】

【表6】

【0315】

ＡＣＭ４ Ｉ４１０（残基６．４５）は、ＡＣＭ１ Ｉ３７５、ＡＣＭ２ Ｉ３９７、ＡＣＭ３ Ｉ５０１、ＡＣＭ５ Ｉ４５２、ＨＲＨ１ Ｉ４２５、ＨＲＨ２ Ｉ２４４、ＨＲＨ３ Ｇ３６８、ＨＲＨ４ Ａ３１３、５ＨＴ１Ｅ Ｉ３０１、５ＨＴ１Ｄ Ｉ３１１、５ＨＴ１Ｂ Ｉ３２４、５ＨＴ７ Ｔ３３７、５ＨＴ１Ａ Ｉ３５５、ＤＲＤ３ Ｉ３３９、ＤＲＤ２ Ｉ３８３、ＤＲＤ４ Ｌ３５６、ＡＤＡ１Ｂ Ｉ３０４、５ＨＴ６ Ｆ２７８、５ＨＴ２Ｂ Ｌ３３４、５ＨＴ２Ｃ Ｌ３２１、５ＨＴ４ Ｃ２６９、ＡＤＲＢ３ Ｔ３０２、ＡＤＲＢ１ Ｔ３３４、ＡＤＲＢ２ Ｔ２８３に対応する。

【0316】

ＡＣＭ４ Ｗ４１３（残基６．４８）は、ＡＣＭ１ Ｗ３７８、ＡＣＭ２ Ｗ４００、ＡＣＭ３ Ｗ５０４、ＡＣＭ５ Ｗ４５５、ＨＲＨ１ Ｗ４２８、ＨＲＨ２ Ｗ２４７、ＨＲＨ３ Ｗ３７１、ＨＲＨ４ Ｗ３１６、５ＨＴ１Ｆ Ｗ３０６、５ＨＴ１Ｅ Ｗ３０４、５ＨＴ１Ｄ Ｗ３１４、５ＨＴ１Ｂ Ｗ３２７、５ＨＴ５Ａ Ｗ２９８、５ＨＴ７ Ｗ３４０、５ＨＴ１Ａ Ｗ３５８、５ＨＴ２Ａ Ｗ３３６、ＤＲＤ３ Ｗ３４２、ＤＲＤ２ Ｗ３８６、ＤＲＤ４ Ｗ３５９、ＡＤＡ１Ｂ Ｗ３０７、ＡＤＡ１Ｄ Ｗ３６１、ＡＤＡ１Ａ Ｗ２８５、ＡＤＡ２Ｂ Ｗ３８４、ＡＤＡ２Ａ Ｗ４０２、ＡＤＡ２Ｃ Ｗ３９５、５ＨＴ６ Ｗ２８１、５ＨＴ２Ｂ Ｗ３３７、５ＨＴ２Ｃ Ｗ３２４、ＤＲＤ１Ｂ Ｗ３０９、ＤＲＤ１Ａ Ｗ２８５、５ＨＴ４ Ｗ２７２、ＡＤＲＢ３ Ｗ３０５、ＡＤＲＢ１ Ｗ３３７、ＡＤＲＢ２ Ｗ２８６に対応する。

【0317】

ＡＣＭ４ Ｙ４１６（残基６．５１）は、ＡＣＭ１ Ｙ３８１、ＡＣＭ２ Ｙ４０３、ＡＣＭ３ Ｙ５０７、ＡＣＭ５ Ｙ４５８、ＨＲＨ１ Ｙ４３１、ＨＲＨ２ Ｙ２５０、ＨＲＨ３ Ｙ３７４、ＨＲＨ４ Ｙ３１９に対応する。

【0318】

【表7】

【0319】

【表8】

【0320】

参考文献
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【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【配列表】

2024519329000001.app

【国際調査報告】