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▶ ベイジン アンシンフエイド バイオテック． シーオー．， エルティーディーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-10
(54)【発明の名称】２つのＴＲＡＩＬ三量体を含むスーパーＴＲＡＩＬ分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240501BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240501BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240501BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240501BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240501BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240501BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20240501BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240501BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
A61K38/17
A61P35/00
C07K19/00 ZNA
C07K14/705
C07K16/00
C07K14/765
C12N15/12
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573077
(86)(22)【出願日】2022-05-27
(85)【翻訳文提出日】2024-01-12
(86)【国際出願番号】 CN2022095472
(87)【国際公開番号】W WO2022247923
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/096498
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523444589
【氏名又は名称】ベイジン アンシンフエイド バイオテック． シーオー．， エルティーディー
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】シングオ チャン
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ ホン
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA18
4C084CA53
4C084DA25
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA53
4H045BA55
4H045BA57
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA70
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインと、柔軟なリンカーと、Ｎ末端からＣ末端までの第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインとを含む融合タンパク質を示す。「スーパーＴＲＡＩＬ」と呼ばれるこの融合タンパク質は、溶液中に２つのＴＲＡＩＬ三量体を含む六量体を形成し、この融合タンパク質は、野生型ヒトＴＲＡＩＬと比較して、癌細胞においてアポトーシスを誘導する生物学的活性が大幅に向上している。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインと、柔軟なリンカーと、Ｎ末端からＣ末端までの第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインとを含む融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドが、溶液中に２つのＴＲＡＩＬ三量体を含む六量体を形成する、融合ポリペプチド。
【請求項2】
前記融合ポリペプチドは、野生型ヒトＴＲＡＩＬと比較して、癌細胞においてアポトーシスを誘導する生物学的活性が大幅に向上している、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項3】
前記融合ポリペプチドが、前記野生型ヒトＴＲＡＩＬと比較して改善されたインビボ血漿半減期を示す、請求項１又は２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項4】
前記第１ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン及び前記第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインが、ＴＲＡＩＬ残基１１４～２８１、ＴＲＡＩＬ残基１１８～２８１、ＴＲＡＩＬ残基１１９～２８１、ＴＲＡＩＬ残基１２０～２８１、及びＴＲＡＩＬ残基１２２～２８１からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項5】
前記第１ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン及び前記第２ＴＲＡＩＬ細胞外ドメインが同じであるか、又は異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項6】
前記融合ポリペプチドが、配列番号２～１１から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項7】
前記融合ポリペプチドが、ＰＥＧ化、脂質化、又はグリコシル化によって修飾されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項9】
前記融合タンパク質がＩｇＧ Ｆｃ又はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、又は請求項８若しくは９に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド又は請求項８若しくは９に記載の融合タンパク質と、生理学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項12】
柔軟なリンカーを介して２つのＴＮＦスーパーファミリーメンバー分子を連結して、ＴＮＦファミリーメンバーの２つの三量体の六量体を構成することを含む、より生物学的に強力なＴＮＦ（腫瘍壊死因子）スーパーファミリーメンバーを生成する方法。
【請求項13】
前記ＴＮＦファミリーメンバーが、ＴＮＦ、４－１ＢＢＬ、Ｆａｓリガンド、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８及びＧＩＴＲＬからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
癌治療用の薬剤の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド又は請求項８若しくは９に記載の融合タンパク質の応用。
【請求項15】
前記癌が多発性骨髄腫又は肺癌である、請求項１４に記載の応用。
【請求項16】
癌を治療する方法であって、治療を必要とする被験者に、治療有効量の請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項８若しくは９に記載の融合タンパク質、又は請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項17】
前記癌が多発性骨髄腫又は肺癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
癌の治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項８若しくは９に記載の融合タンパク質、又は請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記癌が多発性骨髄腫又は肺癌である、請求項１８に記載の使用するための融合ポリペプチド、融合タンパク質、又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年５月２７日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９６４９８の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月２７日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９６４９８の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、癌細胞においてアポトーシスを誘導する強力な生物学的活性を示す組換え融合タンパク質を開示する。この融合タンパク質は、複数の癌を治療するための生物学的製剤として利用することができる。
【背景技術】
【0003】
ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ、ＴＲＡＩＬ）遺伝子は、１９９５年にＷｉｌｅｙらによって最初にクローニングされ、命名された［１］。１９９６年に同じ遺伝子がクローニングされ、Ａｐｏ２Ｌと命名された［２］。ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子は、細胞質尾部、膜貫通領域、及びＮ末端からＣ末端までの細胞外ドメインを含むタンパク質をコードする。ＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは、タンパク質分解的切断によって細胞膜から放出されることもある。完全長の膜結合型ＴＲＡＩＬと可溶性ＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは両方とも、安定したホモ三量体を形成し、それらの受容体に結合して生物学的効果を発揮する。多数のインビボ及びインビトロ実験により、ＴＲＡＩＬが多くの腫瘍細胞及び形質転換細胞のアポトーシスを選択的に誘導できることが示されている。腫瘍を有する動物に組換えＴＲＡＩＬタンパク質を適用すると、腫瘍細胞の増殖を大幅に阻害し、宿主に明らかな損傷を与えることなく腫瘍を退縮させることさえできる。
【0004】
ＴＲＡＩＬは腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）スーパーファミリーに属し、ＴＮＦ相同性細胞外ドメインを含むＩＩ型膜タンパク質であり、溶液中で安定なホモ三量体を形成する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、免疫応答や炎症だけでなく、増殖、分化、アポトーシス、及び胚形成も含む幅広い細胞機能を調節する。ＴＮＦスーパーファミリーには１９のメンバーが含まれており、それらはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合することによって機能する。
【0005】
ＴＲＡＩＬは、その受容体ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）及びＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）に結合して、ＴＲＡＩＬホモ三量体の周囲に３つの受容体をクラスター化し、下流のシグナル伝達を開始することができる。ＤＲ５に対する抗体をＴＲＡＩＬと同時投与すると、おそらくＴＲＡＩＬ受容体クラスターが更に架橋されることにより、ＴＲＡＩＬの活性が有意に増加することができることが報告されている［３］。更に、ＤＴＴの添加によりハイパーオリゴマー化されたＴＲＡＩＬは、インビトロで癌細胞を殺す活性が大幅に向上した［４］。本発明では、ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインと、柔軟なリンカーと、Ｎ末端からＣ末端までの第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインとを含む融合タンパク質が開示される。この融合タンパク質は、野生型ヒトＴＲＡＩＬと比較して、癌細胞におてアポトーシスを誘導する生物学的活性が大幅に向上しているため、この融合タンパク質を「スーパーＴＲＡＩＬ」と名付けた。
【発明の概要】
【0006】
一態様では、本開示は、第１ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインと、柔軟なリンカーと、Ｎ末端からＣ末端までの第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインとを含む融合ポリペプチドを提供し、融合ポリペプチドは、溶液中に２つのＴＲＡＩＬ三量体を含む六量体を形成し、融合ポリペプチドは、野生型ヒトＴＲＡＩＬと比較して、癌細胞においてアポトーシスを誘導する生物学的活性が大幅に向上している。
【0007】
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、野生型ヒトＴＲＡＩＬと比較して改善されたインビボ血漿半減期を示す。
【0008】
いくつかの実施形態では、ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは、ＴＲＡＩＬ残基１１４～２８１、ＴＲＡＩＬ残基１１８～２８１、ＴＲＡＩＬ残基１１９～２８１、ＴＲＡＩＬ残基１２０～２８１、又はＴＲＡＩＬ残基１２２～２８１から選択され得るが、これらに限定されない。また、第１ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン及び第２ＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは同じであっても異なっていてもよい。
【0009】
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２～１１から選択されるタンパク質配列を有する。
【0010】
別の態様では、本発明は、上記の融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質には、融合ポリペプチドを含むＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質及び融合ポリペプチドを含むＨＳＡ（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ヒト血清アルブミン）融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【0011】
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは任意の修飾ポリペプチドであってよく、修飾としては、ＰＥＧ化、脂質化、及びグリコシル化が挙げられるが、これらに限定されない。修飾された融合ポリペプチドは、延長されたインビボ血漿半減期又は低下した免疫原性を示す可能性がある。
【0012】
別の態様では、本開示は、融合ポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列相同性であるアミノ配列を有するポリペプチドを提供する。
【0013】
別の態様では、本開示は、融合ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【0014】
別の態様では、本開示は、融合ポリペプチド又は融合タンパク質及び生理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0015】
別の態様では、本開示は、より生物学的に強力なＴＮＦ（腫瘍壊死因子）スーパーファミリーメンバーを生成する方法を開示し、この方法は、柔軟なリンカーを介して２つのＴＮＦスーパーファミリーメンバー分子を連結して、ＴＮＦファミリーメンバーの２つの三量体の六量体を構成することを含む。ＴＮＦファミリーメンバーとしては、ＴＮＦ、４－１ＢＢＬ、Ｆａｓリガンド、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８及びＧＩＴＲＬが挙げられるが、これらに限定されない。
【0016】
別の態様では、本開示は、癌治療用の薬剤の製造における融合ポリペプチド又は融合タンパク質の応用を提供する。
【0017】
いくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫又は肺癌である。
【0018】
別の態様では、本開示は、癌を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする被験者に、治療有効量の融合ポリペプチド、融合タンパク質、又は医薬組成物を投与することを含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫又は肺癌である。本発明は、柔軟なリンカーによって連結された２つのヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを含む「スーパーＴＲＡＩＬ」分子を示す。組換えスーパーＴＲＡＩＬタンパク質は、野生型ＴＲＡＩＬと比較して、癌細胞においてアポトーシスを誘導する活性が大幅に向上した。分子量が増加したため、スーパーＴＲＡＩＬタンパク質は、野生型ＴＲＡＩＬと比較して、被験者に投与された場合に改善された薬物動態プロファイルを示す。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】スーパーＴＲＡＩＬ分子の概略図である。Ａ）野生型ＴＲＡＩＬホモ三量体。ＴＲＡＩＬモノマーは、赤、緑、及び青の楕円で示されている。１つのモノマーのＮ末端とＣ末端が標識されている。Ｂ）スタッキングモデルを用いて形成された２つの三量体のＴＲＡＩＬ六量体を含むスーパーＴＲＡＩＬ分子。スーパーＴＲＡＩＬモノマーは２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを含み、赤、緑、及び青で示されている。このモデルでは、２つのＴＲＡＩＬ三量体は、３つの柔軟なリンカーを介して連結されており、２つの三量体は互いに重なって配置されている。したがって、２つの三量体は逆平行に配置されている。Ｃ）サイドバイサイドモデルによって折りたたまれた２つの三量体のＴＲＡＩＬ六量体を含むスーパーＴＲＡＩＬ分子。このモデルでは、２つのＴＲＡＩＬ三量体は１つの柔軟なリンカーを介して連結されており、２つの三量体は並んで配置されている。２つの三量体は平行に配置されている。
【0021】
【図2】スーパーＴＲＡＩＬ分子は、溶液中で２つのＴＲＡＩＬ三量体の六量体を形成する。Ａ）スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１と野生型ＴＲＡＩＬのゲル濾過プロファイル。精製したタンパク質を両方とも、ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００にロードした。タンパク質標準品の分子量を矢印で示す。プロファイルから推定したＡＸ－１６１１の見かけの分子量は約９６ｋＤであった。ゲル濾過クロマトグラフィーは、スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１が６つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを含む３つのモノマーを含むことを示した。縦軸はＯＤ２８０の測定値を示し、横軸は溶出量（ｍｌ）を示す。Ｂ）スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のネガティブ染色電子顕微鏡研究。上部のパネルは、ネガティブ染色電子顕微鏡からの生の画像の１つを示す。ピーナッツ様粒子の一部を矢印で示す。下部のパネルは、ソフトウェアＲｅｌｉｏｎを使用したネガティブ染色画像の２Ｄ分類からのトップピックを示す。Ｃ）スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の３Ｄ再構成。ヒトＴＲＡＩＬホモ三量体構造のうちの２つを、Ｒｅｌｉｏｎによって生成されたＡＸ－１６１１分子に適合させることができる。この構造では、２つのＴＲＡＩＬ三量体は、サイドバイサイドモデルを介して会合している可能性がある。２つのＴＲＡＩＬ三量体は、構造で明確に示されている単一の柔軟なリンカーによって連結されている。２つの三量体は構造内に平行に配置されている。ＡＸ－１６１１分子は、赤、緑、及び青で示されている（図１Ｃと同様）３つのＡＸ－１６１１モノマーを含む。
【0022】
【図3】ＡＸ－１６１１のインビトロ生物学的活性。横軸はタンパク質濃度を示し、縦軸はＭＴＳアッセイからのＯＤ４９０を示す。Ａ）マウスＬ９２９細胞においてアポトーシスを誘導するＡＸ－１６１１及び野生型ＴＲＡＩＬ（ｗｔＴＲＡＩＬ）の生物学的活性。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を示す。Ｂ）ヒトＨ４６０細胞においてアポトーシスを誘導するＡＸ－１６１１及び野生型ＴＲＡＩＬの生物学的活性。Ｃ）ヒトＲＰＭＩ－８２２６細胞においてアポトーシスを誘導するＡＸ－１６１１及び野生型ＴＲＡＩＬの生物学的活性。
【0023】
【図4】スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１及び野生型Ｔｒａｉｌのインビボ抗腫瘍活性。ＲＰＭＩ－８２２６異種移植片が確立されたヌードマウスに、ＡＸ－１６１１（２、１０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与）又は野生型Ｔｒａｉｌ（１０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与）を連続１０日間投与した（ｎ＝５／群）。示された結果は群平均（±Ｓ．Ｄ）である。横軸は最初の治療後の日数を示す。
【0024】
【図5】スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１及び野生型Ｔｒａｉｌのインビボ抗腫瘍活性。ＮＣＩ－Ｈ４６０異種移植片が確立されたヌードマウスに、ＡＸ－１６１１（１０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与）又は野生型Ｔｒａｉｌ（１０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与）又はＰＢＳを連続１０日間投与した（ｎ＝５／群）。示された結果は群平均（±Ｓ．Ｄ）である。横軸は最初の治療後の日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明で使用される用語
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【0026】
「ＴＲＡＩＬ」、「天然ＴＲＡＩＬ」、「野生型ＴＲＡＩＬ」又は「ｗｔＴＲＡＩＬ」という用語は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドを示す。ＴＲＡＩＬには、Ａｐｏ２Ｌ、ＣＤ２５３、又はＴＮＦＳＦ１０などの別名がある。天然ＴＲＡＩＬは溶液中でホモ三量体を形成する。ヒトＴＲＡＩＬの配列を配列番号１に示す。
【0027】
「柔軟なポリペプチドリンカー」という用語は、動きが柔軟であり、いかなる規則的で安定した二次及び三次タンパク質構造も形成しないアミノ酸配列を指す。「柔軟なポリペプチドリンカー」、「柔軟なリンカー」、「柔軟な非構造化ポリペプチド」、「柔軟な非構造化ポリペプチド配列」、及び「柔軟な非構造化リンカー」「柔軟な非構造化ポリペプチドリンカー」という用語は、本発明において同じ意味で使用される。
【0028】
本明細書における「ＩｇＧ」という用語は、抗体免疫グロブリンＧを指す。ＩｇＧタンパク質は、２つの同一の重鎖及び２つの同一の側鎖を含む。
【0029】
本明細書における「Ｆｃ部分」、「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、抗体ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域が含まれる。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒンジ領域、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。
【0030】
「ＥＣ５０」という用語は、半数効果濃度としても知られ、半最大応答を与えるタンパク質又は薬物の濃度を指す。
【0031】
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、被験者に投与するための治療用化合物の担持又は輸送に関与する薬学的に許容される物質、組成物又はビヒクル（液体又は固体の充填剤、希釈剤、担体、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸亜鉛、又はステアリン酸）、溶媒又はカプセル化材料など）を指す。各賦形剤は、製剤の他の成分と適合性があり、被験者に有害ではないという意味で「許容される」ものである必要がある。
【0032】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益な結果又は所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される被験者及び疾患状態、被験者の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などのうちの１つ以上に応じて変化し得るが、これは、当業者であれば容易に決定することができる。具体的な用量は、従うべき投与計画、他の治療薬と組み合わせて投与するか否か、投与のタイミング、画像化すべき組織、及びそれを運ぶ物理的送達システムのうちの１つ以上に応じて変化し得る。
【0033】
「被験者」という用語には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば哺乳類、及び非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの非哺乳類が含まれる。特に断りのない限り、「患者」又は「被験者」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。
【0034】
本明細書で使用される「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指し、又は説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、白血病、芽腫、及び肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺腺癌、頭部／頸部扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、消化管（管）癌、直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、骨癌、ユーイング肉腫、子宮頸癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、子宮癌、卵巣癌、及び頭頸部癌が挙げられる。
【0035】
２つ以上のペプチドの文脈における「配列同一性」という用語は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって最大の一致を達成した後、参照ペプチド又は抗体配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴソフトウェアを通じて取得され、このソフトウェアは、ワールドワイドウェブ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で公的に入手可能であり、デフォルトのパラメータを有する。
【0036】
生物学的に強力なスーパーＴＲＡＩＬ分子の設計
ＴＲＡＩＬホモ三量体は、３つのＴＲＡＩＬ受容体を結合させることによってアポトーシスシグナル伝達経路を開始する。説得力のあるデータは、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４又はＤＲ５の高次オリゴマー化がアポトーシスに対するより強力なシグナルを生成する可能性があることを示している。本発明では、本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインと、柔軟なリンカーと、Ｎ末端からＣ末端までの第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインとを含むスーパーＴＲＡＩＬタンパク質を設計した。各ＴＲＡＩＬモノマーは安定した三量体を形成するため、３つのスーパーＴＲＡＩＬポリペプチド鎖は、同時に折りたたまれて２つの連結されたＴＲＡＩＬ三量体になる。スーパーＴＲＡＩＬ分子は、スタッキングモデル又はサイドバイサイドモデルのいずれかを使用して形成された２つの三量体のＴＲＡＩＬ六量体を含む場合がある（図１）。スーパーＴＲＡＩＬタンパク質内では、２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン間の柔軟なリンカーは、タンパク質を正しく折りたたむための十分な柔軟性を提供する可能性がある。本発明者らは、スーパーＴＲＡＩＬが６つのＴＲＡＩＬ受容体と同時に相互作用することにより、アポトーシスを誘導する強力な生物学的活性を示す可能性があると推論した。
ＴＲＡＩＬホモ三量体は、３つのＴＲＡＩＬ受容体を結合させることによってアポトーシスシグナル伝達経路を開始する。説得力のあるデータは、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４又はＤＲ５の高次オリゴマー化がアポトーシスに対するより強力なシグナルを生成する可能性があることを示している。本発明では、本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインと、柔軟なリンカーと、Ｎ末端からＣ末端までの第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインとを含むスーパーＴＲＡＩＬタンパク質を設計した。各ＴＲＡＩＬモノマーは安定した三量体を形成するため、３つのスーパーＴＲＡＩＬポリペプチド鎖は、同時に折りたたまれて２つの連結されたＴＲＡＩＬ三量体になる。スーパーＴＲＡＩＬ分子は、スタッキングモデル又はサイドバイサイドモデルのいずれかを使用して形成された２つの三量体のＴＲＡＩＬ六量体を含む場合がある（図１）。スーパーＴＲＡＩＬタンパク質内では、２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン間の柔軟なリンカーは、タンパク質を正しく折りたたむための十分な柔軟性を提供する可能性がある。本発明者らは、スーパーＴＲＡＩＬが６つのＴＲＡＩＬ受容体と同時に相互作用することにより、アポトーシスを誘導する強力な生物学的活性を示す可能性があると推論した。
【0037】
スーパーＴＲＡＩＬ分子は、溶液中で２つのＴＲＡＩＬ三量体の六量体を形成する
本発明のいくつかの実施形態では、本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ残基１１４～２８１と、５つのグリシン残基のリンカーと、ヒトＴＲＡＩＬ残基１２２～２８１とを含むスーパーＴＲＡＩＬ分子ＡＸ－１６１１を生成した。スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の配列を配列番号２に示す。組換えスーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１を発現させ、均一になるまで精製した。精製したＡＸ－１６１１をゲル濾過カラムｓｕｐｅｒｄｅｘ２００にロードし、溶出プロファイルから推定したＡＸ－１６１１の見かけの分子量は約９６ｋＤであった（図２）。各ＡＸ－１６１１モノマーについて計算した分子量は３８ｋＤであるため、ＡＸ－１６１１分子は３つのモノマーを含む可能性がある。各ＡＸ－１６１１モノマーは２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインで構成されているため、ＡＸ－１６１１分子は６つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを含む可能性がある。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ残基１１４～２８１と、５つのグリシン残基のリンカーと、ヒトＴＲＡＩＬ残基１２２～２８１とを含むスーパーＴＲＡＩＬ分子ＡＸ－１６１１を生成した。スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の配列を配列番号２に示す。組換えスーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１を発現させ、均一になるまで精製した。精製したＡＸ－１６１１をゲル濾過カラムｓｕｐｅｒｄｅｘ２００にロードし、溶出プロファイルから推定したＡＸ－１６１１の見かけの分子量は約９６ｋＤであった（図２）。各ＡＸ－１６１１モノマーについて計算した分子量は３８ｋＤであるため、ＡＸ－１６１１分子は３つのモノマーを含む可能性がある。各ＡＸ－１６１１モノマーは２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインで構成されているため、ＡＸ－１６１１分子は６つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを含む可能性がある。
【0038】
精製したＡＸ－１６１１をネガティブ染色電子顕微鏡で更に調べた。ネガティブ染色画像は、多くのＡＸ－１６１１分子がピーナッツ様粒子として現れていることを示した（図２）。ソフトウェアＲｅｌｉｏｎを使用したネガティブ染色画像の３Ｄ再構成により、解像度～２５ÅでのＡＸ－１６１１の分子形状が得られた。ヒトＴＲＡＩＬホモ三量体構造のうちの２つを、ＲｅｌｉｏｎによってＡＸ－１６１１分子にうまく適合させることができる。この構造は、ＡＸ－１６１１内の２つのＴＲＡＩＬ三量体が単一の柔軟なリンカーによって連結されていることを明確に示す（図２）。この構造では、３つのＡＸ－１６１１モノマーを２つのＴＲＡＩＬ三量体に折りたたむことができ、２つのＴＲＡＩＬ三量体はサイドバイサイドモデルを介して会合している。ＡＸ－１６１１内の２つのＴＲＡＩＬ三量体は、（逆平行ではなく）平行に整列しているため、スーパーＴＲＡＩＬは６つのＴＲＡＩＬ受容体と都合よく相互作用することができる。生化学的及び生物物理学的データは、スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１が、サイドバイサイドモデルを使用して２つの三量体に配置されたＴＲＡＩＬ細胞外ドメインの六量体を含むことを示す。
【0039】
スーパーＴＲＡＩＬは、野生型ＴＲＡＩＬと比較して、癌細胞においてアポトーシスを誘導する活性が大幅に向上している
本発明者らは、複数の細胞株でアポトーシスを誘導するスーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のインビトロ生物学的活性を調べた。マウスＬ９２９細胞株は、ＴＲＡＩＬ活性を試験するための標準細胞として利用されている。スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１は、野生型ＴＲＡＩＬと比較して、Ｌ９２９細胞でアポトーシスを誘導する活性が約３０倍向上した（図３）。ヒト肺癌細胞株Ｈ４６０及びヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ－８２２６においても、スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１は野生型ＴＲＡＩＬと比較してはるかに強い活性を示した（図３）。また、本発明者らは、腫瘍細胞異種移植モデルを使用して、スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のインビボ抗腫瘍活性を調べた。ＲＰＭＩ－８２２６異種移植モデルでは、ＡＸ－１６１１による治療は、顕著な腫瘍退縮をもたらすことができる。データは、ＡＸ－１６１１が２ｍｇ／ｋｇの用量であっても、１０ｍｇ／ｋｇの用量の野生型ＴＲＡＩＬよりも腫瘍抑制においてより強力であることを明確に示した（図４）。ＮＣＩ－Ｈ４６０異種移植モデルのデータは、ＡＸ－１６１１が野生型ＴＲＡＩＬよりもはるかに強力な抗腫瘍活性を示すことを示した（図５）。本発明者らは、スーパーＴＲＡＩＬが２つのＴＲＡＩＬ三量体の六量体を含み、スーパーＴＲＡＩＬ分子が６つのＴＲＡＩＬ受容体に同時に結合できると推論する。したがって、スーパーＴＲＡＩＬの多価性により、野生型ＴＲＡＩＬホモ三量体よりも優れた生物学的活性が得られる。
本発明者らは、複数の細胞株でアポトーシスを誘導するスーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のインビトロ生物学的活性を調べた。マウスＬ９２９細胞株は、ＴＲＡＩＬ活性を試験するための標準細胞として利用されている。スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１は、野生型ＴＲＡＩＬと比較して、Ｌ９２９細胞でアポトーシスを誘導する活性が約３０倍向上した（図３）。ヒト肺癌細胞株Ｈ４６０及びヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ－８２２６においても、スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１は野生型ＴＲＡＩＬと比較してはるかに強い活性を示した（図３）。また、本発明者らは、腫瘍細胞異種移植モデルを使用して、スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のインビボ抗腫瘍活性を調べた。ＲＰＭＩ－８２２６異種移植モデルでは、ＡＸ－１６１１による治療は、顕著な腫瘍退縮をもたらすことができる。データは、ＡＸ－１６１１が２ｍｇ／ｋｇの用量であっても、１０ｍｇ／ｋｇの用量の野生型ＴＲＡＩＬよりも腫瘍抑制においてより強力であることを明確に示した（図４）。ＮＣＩ－Ｈ４６０異種移植モデルのデータは、ＡＸ－１６１１が野生型ＴＲＡＩＬよりもはるかに強力な抗腫瘍活性を示すことを示した（図５）。本発明者らは、スーパーＴＲＡＩＬが２つのＴＲＡＩＬ三量体の六量体を含み、スーパーＴＲＡＩＬ分子が６つのＴＲＡＩＬ受容体に同時に結合できると推論する。したがって、スーパーＴＲＡＩＬの多価性により、野生型ＴＲＡＩＬホモ三量体よりも優れた生物学的活性が得られる。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明者らは、野生型ＴＲＡＩＬと比較して、癌性細胞においてアポトーシスを誘導する活性が大幅に向上したスーパーＴＲＡＩＬ分子を生成した。スーパーＴＲＡＩＬは、抗体又はＤＴＴなどの他の架橋試薬を添加することなく、それ自体で強力な活性を示す。更に、スーパーＴＲＡＩＬ分子には野生型ＴＲＡＩＬ配列のみが含まれており、他の外来配列は含まれていない。これにより、スーパーＴＲＡＩＬをヒトに投与すると、その免疫原性が低下する可能性がある。ＩｇＧ Ｆｃと一本鎖ＴＲＡＩＬ融合タンパク質が生成されており、野生型ＴＲＡＩＬよりも優れた活性を有する可能性がある［５］。データは、スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１が、Ｆｃ一本鎖ＴＲＡＩＬ融合タンパク質と比較して、Ｌ９２９細胞においてアポトーシスを誘導する約５～１０倍強力な活性を示すことを示した。本発明者らは、スーパーＴＲＡＩＬ分子が、ＴＲＡＩＬ受容体と相互作用してアポトーシスを誘導するのに十分な位置にある２つのＴＲＡＩＬ三量体を含むと推論する。これは、他の融合タンパク質に比べてスーパーＴＲＡＩＬに利点をもたらす可能性がある。
【0041】
スーパーＴＲＡＩＬ配列中の柔軟なリンカー
スーパーＴＲＡＩＬタンパク質配列では、柔軟なポリペプチドリンカーを利用して２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを連結する。本発明のいくつかの実施形態では、融合タンパク質中の柔軟なポリペプチドリンカーは、グリシン残基及びセリン残基が豊富である。柔軟なポリペプチドリンカー配列では、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ａ、Ｐ、及びＴのアミノ酸残基の合計は、一次配列の９０％以上を構成する可能性がある。また、柔軟なポリペプチド配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ、９０％を超える非構造化ランダムコイル構造を有する。
スーパーＴＲＡＩＬタンパク質配列では、柔軟なポリペプチドリンカーを利用して２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを連結する。本発明のいくつかの実施形態では、融合タンパク質中の柔軟なポリペプチドリンカーは、グリシン残基及びセリン残基が豊富である。柔軟なポリペプチドリンカー配列では、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ａ、Ｐ、及びＴのアミノ酸残基の合計は、一次配列の９０％以上を構成する可能性がある。また、柔軟なポリペプチド配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定したところ、９０％を超える非構造化ランダムコイル構造を有する。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態では、柔軟なリンカーは、（Ｇ５Ｓ）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（Ｇ３Ｓ）ｎ、（Ｇ２Ｓ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（Ｇ２Ｓ２）ｎ、（Ｇ３Ｓ３）ｎ、（ＧＳ３）ｎを含む配列を含む可能性があり、ここで、ｎは整数である。柔軟なリンカーは、０～１００個のアミノ酸残基を含んでもよい。
【0043】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、柔軟なリンカーは５～２０個のアミノ酸残基を含んでもよい。本発明者らは、柔軟なリンカー長が５～１５個のアミノ酸残基の範囲である多数のスーパーＴＲＡＩＬ分子を構築した。これらのスーパーＴＲＡＩＬ分子の配列を配列番号３～１０に示す。これらのスーパーＴＲＡＩＬ分子はすべて、Ｌ９２９細胞株を使用して測定したところ、アポトーシスを誘導する生物学的活性を示した（表１）。
【0044】
【表1】
【0045】
スーパーＴＲＡＩＬ配列内のＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン
ヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースによりＴＲＡＩＬ残基３９～２８１であると推定した。ＴＲＡＩＬ（１１４～２８１）は癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに効果的であることが報告されている［３］。ＴＲＡＩＬ（９５～２８１）、ＴＲＡＩＬ（１１８～２８１）、ＴＲＡＩＬ（１１９～２８１）及びＴＲＡＩＬ（１２０～２８１）などの他の構築物はすべて、アポトーシスを誘導するために生物学的に活性である。本発明では、ＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは、アポトーシスを誘導するために生物学的に活性であるヒトＴＲＡＩＬ残基３９～２８１の範囲の任意の断片から選択されてもよい。
ヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースによりＴＲＡＩＬ残基３９～２８１であると推定した。ＴＲＡＩＬ（１１４～２８１）は癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに効果的であることが報告されている［３］。ＴＲＡＩＬ（９５～２８１）、ＴＲＡＩＬ（１１８～２８１）、ＴＲＡＩＬ（１１９～２８１）及びＴＲＡＩＬ（１２０～２８１）などの他の構築物はすべて、アポトーシスを誘導するために生物学的に活性である。本発明では、ＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは、アポトーシスを誘導するために生物学的に活性であるヒトＴＲＡＩＬ残基３９～２８１の範囲の任意の断片から選択されてもよい。
【0046】
本発明では、本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインと、柔軟なリンカーと、Ｎ末端からＣ末端までの第２ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインとを含むスーパーＴＲＡＩＬを生成する。本発明のいくつかの実施形態では、スーパーＴＲＡＩＬ配列内の２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは同一であってもよい（配列番号１１）。本発明のいくつかの実施形態では、スーパーＴＲＡＩＬ内の２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインは異なる（配列番号２～１０）。当業者であれば、柔軟なリンカーによって連結された２つのヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインの様々な設計が本発明の範囲に含まれることを理解できるであろう。
【0047】
スーパーＴＲＡＩＬの修飾
インビボ血漿半減期を延長したり、目的のタンパク質の免疫原性を低下させたりするために、ＰＥＧ化、脂質化、及びグリコシル化などの多くのタンパク質修飾方法が開発されている。当業者であれば、ＰＥＧ化、脂質化及びグリコシル化を含むがこれらに限定されないスーパーＴＲＡＩＬ分子のあらゆる修飾が本発明の範囲内であることを理解できるであろう。
インビボ血漿半減期を延長したり、目的のタンパク質の免疫原性を低下させたりするために、ＰＥＧ化、脂質化、及びグリコシル化などの多くのタンパク質修飾方法が開発されている。当業者であれば、ＰＥＧ化、脂質化及びグリコシル化を含むがこれらに限定されないスーパーＴＲＡＩＬ分子のあらゆる修飾が本発明の範囲内であることを理解できるであろう。
【0048】
ＩｇＧ Ｆｃ又はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）とのタンパク質融合により、目的のタンパク質のインビボ半減期が大幅に延長される可能性がある。スーパーＴＲＡＩＬを含むＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質、スーパーＴＲＡＩＬを含むＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）融合タンパク質を含むがこれらに限定されないあらゆる融合タンパク質も、本発明の開示された範囲内である。
【0049】
実施例
本明細書に記載される実施例は、以下の実験が実施されたすべての実験又は唯一の実験であることを示すことを意図したものではない。使用された数値（例えば、量、温度など）の正確性を確保するために努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差を考慮すべきである。
本明細書に記載される実施例は、以下の実験が実施されたすべての実験又は唯一の実験であることを示すことを意図したものではない。使用された数値（例えば、量、温度など）の正確性を確保するために努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差を考慮すべきである。
【0050】
実施例１。スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の構築
本実施例では、本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ残基１１４～２８１と、５つのグリシン残基の柔軟なリンカーと、ヒトＴＲＡＩＬ残基１２２～２８１とを含むスーパーＴＲＡＩＬ分子ＡＸ－１６１１を構築した。スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の配列を配列番号２に示す。
本実施例では、本発明者らは、ヒトＴＲＡＩＬ残基１１４～２８１と、５つのグリシン残基の柔軟なリンカーと、ヒトＴＲＡＩＬ残基１２２～２８１とを含むスーパーＴＲＡＩＬ分子ＡＸ－１６１１を構築した。スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の配列を配列番号２に示す。
【0051】
ＡＸ－１６１１配列をコードする遺伝子をコドン最適化し、合成した。組換えＡＸ－１６１１は、細菌発現系又は哺乳類発現系のいずれかを使用して産生することができる。組換えＡＸ－１６１１を発現させ、均一になるまで精製した。
【0052】
ＡＸ－１６１１のオリゴマー化状態を分析するために、精製したＡＸ－１６１１をＰＢＳ緩衝液中のゲル濾過カラムｓｕｐｅｒｄｅｘ２００にロードした。溶出プロファイルから推定したＡＸ－１６１１の見かけの分子量は約９６ｋＤであった（図２）。各ＡＸ－１６１１モノマーについて計算した分子量は３８ｋＤであるため、ＡＸ－１６１１分子は３つのモノマーを含む可能性がある。各ＡＸ－１６１１モノマーは２つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインで構成されているため、ＡＸ－１６１１分子は６つのＴＲＡＩＬ細胞外ドメインを含む可能性がある。
【0053】
ヒト野生型ＴＲＡＩＬ残基１１４～２８１を発現させ、精製して、対照として使用した。
【0054】
実施例２。ネガティブ染色電子顕微鏡によるＡＸ－１６１１の構造研究
精製したＡＸ－１６１１をネガティブ染色電子顕微鏡で更に調べた。ネガティブ染色画像は、多くのＡＸ－１６１１分子がピーナッツ様粒子として現れていることを示した（図２）。ソフトウェアＲｅｌｉｏｎによるネガティブ染色画像の２Ｄ分類により、２つのドットの粒子による明確なクラスが得られた（図２）。選択した１５０９個の粒子の平均化による３Ｄ再構成により、解像度～２５ÅでのＡＸ－１６１１の分子形状が得られた。Ｒｅｌｉｏｎを使用することによって、２つのヒトＴＲＡＩＬホモ三量体をＡＸ－１６１１構造にうまく適合させることができる。電子顕微鏡から得られたＡＸ－１６１１の構造は、２つのＴＲＡＩＬ三量体がサイドバイサイドモデルによって会合していることを明確に示した。構造が示すように、２つのＴＲＡＩＬ三量体は１つのリンカーによって連結されている。２つのＴＲＡＩＬ三量体は平行に並んでいる。
精製したＡＸ－１６１１をネガティブ染色電子顕微鏡で更に調べた。ネガティブ染色画像は、多くのＡＸ－１６１１分子がピーナッツ様粒子として現れていることを示した（図２）。ソフトウェアＲｅｌｉｏｎによるネガティブ染色画像の２Ｄ分類により、２つのドットの粒子による明確なクラスが得られた（図２）。選択した１５０９個の粒子の平均化による３Ｄ再構成により、解像度～２５ÅでのＡＸ－１６１１の分子形状が得られた。Ｒｅｌｉｏｎを使用することによって、２つのヒトＴＲＡＩＬホモ三量体をＡＸ－１６１１構造にうまく適合させることができる。電子顕微鏡から得られたＡＸ－１６１１の構造は、２つのＴＲＡＩＬ三量体がサイドバイサイドモデルによって会合していることを明確に示した。構造が示すように、２つのＴＲＡＩＬ三量体は１つのリンカーによって連結されている。２つのＴＲＡＩＬ三量体は平行に並んでいる。
【0055】
実施例３。スーパーＴＲＡＩＬ分子のインビトロ活性
マウスＬ９２９２細胞株を使用してアポトーシスを誘導するスーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のインビトロ生物学的活性を調べた。Ｌ９２９細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。１ｘ１０４個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。２４時間後、様々な濃度のＡＸ－１６１１を各ウェルに添加した。１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤも各ウェルに添加した。実験では野生型ＴＲＡＩＬを対照として使用した。２４時間後、Ｌ９２９細胞の生存率をＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定することができる。データフィッティングを使用して、ＡＸ－１６１１のＥＣ５０は０．８５ｎｇ／ｍｌであると算出し、野生型ＴＲＡＩＬのＥＣ５０は３２ｎｇ／ｍｌであると推定した（図３）。Ｌ９２９細胞を使用して測定した他のスーパーＴＲＡＩＬ分子のＥＣ５０値を表１に示した。
マウスＬ９２９２細胞株を使用してアポトーシスを誘導するスーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のインビトロ生物学的活性を調べた。Ｌ９２９細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。１ｘ１０４個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。２４時間後、様々な濃度のＡＸ－１６１１を各ウェルに添加した。１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤも各ウェルに添加した。実験では野生型ＴＲＡＩＬを対照として使用した。２４時間後、Ｌ９２９細胞の生存率をＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定することができる。データフィッティングを使用して、ＡＸ－１６１１のＥＣ５０は０．８５ｎｇ／ｍｌであると算出し、野生型ＴＲＡＩＬのＥＣ５０は３２ｎｇ／ｍｌであると推定した（図３）。Ｌ９２９細胞を使用して測定した他のスーパーＴＲＡＩＬ分子のＥＣ５０値を表１に示した。
【0056】
ヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導するＡＸ－１６１１の能力も試験した。ヒト肺癌細胞株Ｈ４６０及びヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ－８２２６を、５％ＣＯ２インキュベーター内で１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。５０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。２４時間後、様々な濃度のＡＸ－１６１１を各ウェルに添加した。実験では野生型ＴＲＡＩＬを対照として使用した。２４時間後、ＭＴＳアッセイを使用して細胞の生存率を測定することができる。Ｈ４６０及びＲＰＭＩ－８２２６に対するＡＸ－１６１１のＥＣ５０値は、それぞれ５４．７ｎｇ／ｍｌ及び１５．４ｎｇ／ｍｌと測定した。一方、Ｈ４６０及びＲＰＭＩ－８２２６に対する野生型ＴＲＡＩＬのＥＣ５０値は、それぞれ１４００及び２７０ｎｇ／ｍｌと推定した（図３）。
【0057】
実施例４：スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１のインビボ抗腫瘍活性
スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の抗腫瘍活性を、ＲＰＭＩ－８２２６異種移植モデルを担持するマウスを使用して調べた。合計１０７個のＲＰＭＩ－８２２６細胞を雌Ｂ－ＮＤＧマウス（５～８週齢、５匹／群）の右脇腹に皮下注射した。腫瘍のサイズを、キャリパーで腫瘍の長さ（ａ）と幅（ｂ）を測定することによって監視し、腫瘍体積を式０．５×ａ×ｂ２で計算した。腫瘍体積が約１６０ｍｍ３に達したときに治療を開始した。ＡＸ－１６１１を２つの異なる用量（２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で１日１回、１０日間腹腔内投与した。対照マウスには、１０ｍｇ／ｋｇの用量で野生型ＴＲＡＩＬを注射した。ＡＸ－１６１１による治療は、いずれの用量でも顕著な腫瘍退縮をもたらすことができる。データは、ＡＸ－１６１１が２ｍｇ／ｋｇの用量であっても、１０ｍｇ／ｋｇの用量の野生型ＴＲＡＩＬよりも腫瘍抑制においてより強力であることを明確に示した（図４）。
スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の抗腫瘍活性を、ＲＰＭＩ－８２２６異種移植モデルを担持するマウスを使用して調べた。合計１０７個のＲＰＭＩ－８２２６細胞を雌Ｂ－ＮＤＧマウス（５～８週齢、５匹／群）の右脇腹に皮下注射した。腫瘍のサイズを、キャリパーで腫瘍の長さ（ａ）と幅（ｂ）を測定することによって監視し、腫瘍体積を式０．５×ａ×ｂ２で計算した。腫瘍体積が約１６０ｍｍ３に達したときに治療を開始した。ＡＸ－１６１１を２つの異なる用量（２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で１日１回、１０日間腹腔内投与した。対照マウスには、１０ｍｇ／ｋｇの用量で野生型ＴＲＡＩＬを注射した。ＡＸ－１６１１による治療は、いずれの用量でも顕著な腫瘍退縮をもたらすことができる。データは、ＡＸ－１６１１が２ｍｇ／ｋｇの用量であっても、１０ｍｇ／ｋｇの用量の野生型ＴＲＡＩＬよりも腫瘍抑制においてより強力であることを明確に示した（図４）。
【0058】
スーパーＴＲＡＩＬ ＡＸ－１６１１の抗腫瘍活性も、ＮＣＩ－Ｈ４６０異種移植モデルを使用して分析した。合計２ｘ１０６個のＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を雌Ｂ－ＮＤＧマウス（５～８週齢、５匹／群）の右脇腹に皮下注射した。腫瘍のサイズを、キャリパーで腫瘍の長さ（ａ）と幅（ｂ）を測定することによって監視し、腫瘍体積を式０．５×ａ×ｂ２で計算した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したときに治療を開始した。ＡＸ－１６１１を１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回、１０日間腹腔内投与した。対照マウスには、１０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれＰＢＳ及び野生型ＴＲＡＩＬを注射した。データは、ＡＸ－１６１１が、ＮＣＩ－Ｈ４６０異種移植モデルを担持するマウスにおいて野生型ＴＲＡＩＬよりもはるかに強力な抗腫瘍活性を示すことを示した（図５）。
【0059】
以下に列挙するのは、本明細書で言及されたいくつかのアミノ酸配列である。
【表2】
【0060】
参考文献
1. Wiley, S.R., et al., Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis. Immunity, 1995. 3 (6) : p. 673-82.
2. Pitti, R.M., et al., Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J Biol Chem, 1996. 271 (22) : p. 12687-90.
3. Graves, J.D., et al., Apo2L/TRAIL and the death receptor 5 agonist antibody AMG 655 cooperate to promote receptor clustering and antitumor activity. Cancer Cell, 2014. 26 (2) : p. 177-89.
4. Kim, S.H., et al., Death induction by recombinant native TRAIL and its prevention by a caspase 9 inhibitor in primary human esophageal epithelial cells. J Biol Chem, 2004. 279 (38) : p. 40044-52.
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3. Graves, J.D., et al., Apo2L/TRAIL and the death receptor 5 agonist antibody AMG 655 cooperate to promote receptor clustering and antitumor activity. Cancer Cell, 2014. 26 (2) : p. 177-89.
4. Kim, S.H., et al., Death induction by recombinant native TRAIL and its prevention by a caspase 9 inhibitor in primary human esophageal epithelial cells. J Biol Chem, 2004. 279 (38) : p. 40044-52.
5. Hutt, M., et al., Superior Properties of Fc-comprising scTRAIL Fusion Proteins. Mol Cancer Ther, 2017.16 (12) : p. 2792-2802．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】