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特表2024-519469遺伝性障害の治療のためのインビボヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-14
(54)【発明の名称】遺伝性障害の治療のためのインビボヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20240507BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240507BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20240507BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240507BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240507BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240507BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
C12N15/55 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/09 110
C12N15/11 Z
C12N15/35
C12N15/864 100Z
A61K38/43
A61P1/16
A61K35/76
A61K31/7105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023566465
(86)(22)【出願日】2022-04-27
(85)【翻訳文提出日】2023-12-25
(86)【国際出願番号】 US2022026483
(87)【国際公開番号】W WO2022232232
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】63/180,603
(32)【優先日】2021-04-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/242,474
(32)【優先日】2021-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/301,933
(32)【優先日】2022-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/244,205
(32)【優先日】2021-09-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/331,385
(32)【優先日】2022-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＬＡＢＲＡＳＯＬ
(71)【出願人】
【識別番号】502409813
【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
(74)【代理人】
【識別番号】110000741
【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ワン，リリー
(72)【発明者】
【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム
(72)【発明者】
【氏名】トレティアコバ，アンナ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084DC22
4C084NA14
4C084ZA75
4C086AA01
4C086AA02
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA02
4C087NA14
4C087ZA75
(57)【要約】
遺伝性障害を治療するためのデュアルベクターシステムが提供される。本システムは、（ａ）ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、発現カセットを含む、遺伝子編集ベクターと、（ｂ）ドナーベクターであって、ＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、システムが、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含み、標的細胞における天然ＰＣＳＫ９が、任意選択的に、デュアルベクターシステムの投与後に、アブレーション又は低減される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝性障害を治療するためのシステムであって、前記システムが、（ａ）ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、遺伝子編集ベクターと、
（ｂ）ドナーベクターであって、導入遺伝子をコードする核酸配列及び前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含む、導入遺伝子カセットを含み、前記ドナーベクターが、前記導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同組換え（ＨＤＲ）アームを更に含み、前記導入遺伝子が、ＰＣＳＫ９ではない、ドナーベクターと、を含む、システム。
【請求項2】
ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞における前記ヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を更に含む、請求項１に記載のシステム
【請求項3】
前記ヌクレアーゼが、ＰＣＳＫ９エクソン７を標的化する、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項4】
前記ヌクレアーゼが、ＰＣＳＫ９に特異的なメガヌクレアーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項5】
前記メガヌクレアーゼが、ＡＲＣＵＳメガヌクレアーゼである、請求項４に記載のシステム。
【請求項6】
前記遺伝子編集ベクターが、核局在化シグナルに隣接するＣａｓ９をコードする配列を含む、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項7】
前記遺伝子編集ベクターが、前記ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する、少なくとも２０個のヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡを更に含み、前記標的部位が、前記Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、請求項６に記載のシステム。
【請求項8】
前記ドナーベクターが、少なくとも２０ヌクレオチドのシード領域を含むｓｇＲＮＡを更に含み、前記ｓｇＲＮＡが、前記ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合し、前記標的部位が、前記Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、請求項６に記載のシステム。
【請求項9】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項10】
前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、Ｕ６プロモーターである、請求項９に記載のシステム。
【請求項11】
前記Ｕ６プロモーターが、前記ｓｇＲＮＡの５’側に位置する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項12】
前記シード領域が、前記標的部位配列と１００％相補的である、請求項７～１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項13】
前記シード領域が、前記標的部位配列と１００％未満相補的である、請求項７～１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項14】
前記導入遺伝子が、ＯＴＣ、ＰＫＵ、ＣＴＬＮ１、又はＬＤＬＲである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項15】
前記ドナーベクター及び遺伝子編集ベクターのうちの少なくとも１つが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項16】
（ａ）の遺伝子編集ＡＡＶベクターと（ｂ）のドナーＡＡＶベクターとの比が、（ｂ）のドナーＡＡＶベクターが（ａ）の遺伝子編集ベクターを超えるような比である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項17】
遺伝性障害を治療するためのシステムであって、前記システムが、（ａ）遺伝子編集ＡＡＶであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるメガヌクレアーゼの発現を指示する調節配列の制御下でＰＣＳＫ９を標的化する前記メガヌクレアーゼをコードする配列、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶ、並びに
（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む、システム。
【請求項18】
遺伝性障害を治療するためのシステムであって、前記システムが、（ａ）遺伝子編集ＡＡＶであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるｓａＣａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶ、並びに
（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡであって、前記ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、前記標的部位が、前記Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む、システム。
【請求項19】
遺伝性障害を治療するためのシステムであって、前記システムが、（ａ）遺伝子編集ＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子の標的部位に特異的に結合する、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、前記標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及び前記ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞における前記Ｃａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクター、並びに
（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む、システム。
【請求項20】
遺伝性障害を治療するためのシステムであって、前記システムが、（ａ）遺伝子編集ベクターであって、
（ｉ）脂質ナノ粒子、
（ｉｉ）ｓｇＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、前記標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡであって、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、前記Ｃａｓ９をコードする配列、３’ＮＬＳを含む、ｍＲＮＡ、を含む、遺伝子編集ベクター、並びに
（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む、システム。
【請求項21】
（ａ）の前記遺伝子編集ＡＡＶベクター及び（ｂ）の前記ドナーＡＡＶベクターが、同じＡＡＶカプシドを有する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項22】
前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ３Ｂ、ｈｕ３７、ｒｈ７９、及びｒｈ６４から選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項23】
Ｃａｓ９が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９から選択される、請求項６～１８又は１８～２２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項24】
前記ヌクレアーゼが、組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項２～１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項25】
前記ヌクレアーゼが、構成的プロモーターの制御下にある、請求項２～１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項26】
前記ヌクレアーゼが、肝臓特異的プロモーター、任意選択的に、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、又はハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）の制御下にある、請求項２４に記載のシステム。
【請求項27】
請求項１～２６のいずれか一項に記載のシステムを同時投与することによって、ヒトにおける障害を治療する方法。
【請求項28】
新生児対象における肝臓代謝障害を治療する方法であって、前記方法が、肝臓代謝障害を有する前記対象に、（ａ）ヌクレアーゼをコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞における前記ヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクター、並びに
（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、導入遺伝子及び前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含み、前記ドナーベクターが、導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同組換え（ＨＤＲ）アームを更に含む、ドナーＡＡＶベクター、を同時投与することを含む、方法。
【請求項29】
（ａ）の前記遺伝子編集ＡＡＶベクター及び（ｂ）の前記ドナーベクターが、同じ経路を介して本質的に同時に送達される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
（ａ）の前記遺伝子編集ＡＡＶベクターが、約２×１０１１ＧＣ／ｍＬ～約２×１０１２ＧＣ／ｍＬの濃度で注射用のビヒクル中に懸濁される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項31】
（ａ）の前記ＡＡＶ標的化ベクターが、約２×１０１２ＧＣ／ｍＬ～約１×１０１３ＧＣ／ｍＬの濃度で注射用のビヒクルに懸濁される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項32】
前記肝臓代謝障害が、オルニチントランスカルバミラーゼである、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記肝臓代謝障害が、ＯＴＣ、ＦＨ、シトルリン血症Ｉ型（ＣＴＬＮ１）、又はフェニルケトン尿症である、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
遺伝性障害を治療するためのシステムであって、前記システムが、（ａ）ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ配列を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と、
（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、導入遺伝子及び前記標的細胞におけるその発現を指示する調節配列を含み、前記ドナーベクターが、前記導入遺伝子の５’及び３’側に相同組換え（ＨＤＲ）アームを更に含む、ドナーＡＡＶベクターと、を含む、システム。
【請求項35】
前記ヌクレアーゼが、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化する、請求項３４に記載のシステム。
【請求項36】
前記ヌクレアーゼが、ＰＣＳＫ９エクソン７を標的化する、請求項３４に記載のシステム。
【請求項37】
前記ヌクレアーゼが、ＰＣＳＫ９に特異的なメガヌクレアーゼである、請求項３４に記載のシステム。
【請求項38】
前記メガヌクレアーゼが、ＡＲＣＵＳメガヌクレアーゼである、請求項３７に記載のシステム。
【請求項39】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記ＬＮＰが、ｓｇＲＮＡを含む、請求項３４に記載のシステム。
【請求項40】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、核局在化シグナルに隣接する、請求項３９に記載のシステム。
【請求項41】
前記ｓｇＲＮＡが、前記ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、前記標的部位が、前記Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、請求項３９又は４０に記載のシステム。
【請求項42】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に含む、請求項３４～４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項43】
前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、Ｕ６プロモーターである、請求項４３に記載のシステム。
【請求項44】
前記Ｕ６プロモーターが、前記ｓｇＲＮＡの５’側に位置する、請求項４６に記載のシステム。
【請求項45】
前記ｓｇＲＮＡが、前記標的部位配列と１００％相補的である、請求項３４～４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項46】
前記ｓｇＲＮＡが、前記標的部位配列と１００％未満相補的である、請求項３４～４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項47】
前記導入遺伝子が、肝臓で発現される遺伝子である、請求項３４～４６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項48】
前記導入遺伝子が、ＯＴＣ、ＰＫＵ、ＣＴＬＮ１、及びＦＨから選択される、請求項３４～４７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項49】
遺伝性障害を治療するためのシステムであって、前記システムが、（ａ）ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、遺伝子編集ベクターと、
（ｂ）ドナーベクターであって、ＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、
前記システムが、前記ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含み、
任意選択的に、標的細胞における天然ＰＣＳＫ９が、デュアルベクターシステムの投与後にアブレーション又は低減される、システム。
【請求項50】
請求項４９に記載のシステムを使用して患者を治療する方法であって、前記患者の天然ＰＣＳＫ９の発現レベルが低下し、前記患者が、前記外因性産物を発現する、方法。
【請求項51】
配列番号１７の操作されたコード配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む、発現カセット。
【請求項52】
ＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲを更に含む、請求項５１に記載の発現カセット。
【請求項53】
請求項５１又は５２に記載の発現カセットを含む、ＡＡＶベクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
部位特異的ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はメガヌクレアーゼなど）は、染色体において二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、ＤＮＡ修復をもたらす。ドナーＤＮＡの存在下では、相同組換え修復（ＨＤＲ）が起こり、染色体の遺伝情報が、ドナー遺伝子からの新しい情報で置き換えられる。
【0002】
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、ＤＮＡ鋳型を使用する相同組換えによって修復されるプロセスである。この鋳型は、姉妹クロマチドが有糸分裂の完了前に利用可能である、細胞周期の後期Ｓ期又はＧ２期中に細胞内から生じ得る。更に、外因性修復鋳型を、最も頻繁に合成一本鎖ＤＮＡドナーオリゴ又はドナープラスミドの形態で細胞内に送達して、ゲノムの正確な変化を生成することができる。
【0003】
セーフハーバー部位（ＳＨＳ）は、遺伝子又は他の遺伝エレメントを安全に挿入及び発現させることができるゲノム遺伝子座である。これらのＳＨＳは、効果的なヒト疾患遺伝子療法、遺伝子構造、機能及び調節を調査するため、並びに細胞を標識及び追跡するために重要である。
【0004】
必要とされるのは、遺伝子編集のための改善された組成物及び方法である。
【発明の概要】
【0005】
本明細書では、天然ＰＣＳＫ９遺伝子のノックダウン又はアブレーション、並びにＰＣＳＫ９遺伝子座における外因性導入遺伝子の挿入及び／又は発現を可能にする、遺伝子編集のための組成物、方法、システム、及びキットが提供される。
【0006】
第１の態様では、遺伝性障害を治療するためのシステムが本明細書に提供される。本システムは、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列と、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列と、を含む、発現カセットを含む、遺伝子編集成分を含む。本システムは、ドナーベクターであって、導入遺伝子をコードする核酸配列及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含む、導入遺伝子カセットを含み、ドナーベクターが、導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）アームを更に含み、導入遺伝子が、ＰＣＳＫ９ではない、ドナーベクターを更に含む。ヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９エクソン７を標的化する。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＡＲＣＵＳメガヌクレアーゼである。
【0007】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集成分は、Ｃａｓ９をコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子編集ベクターは、少なくとも２０ヌクレオチドのシード領域を含むｓｇＲＮＡをコードする配列を更に含み、ｓｇＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合し、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。
【0008】
他の実施形態では、ドナーベクターは、少なくとも２０ヌクレオチドのシード領域を含むｓｇＲＮＡをコードする配列を更に含み、ｓｇＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合し、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。
【0009】
別の態様では、遺伝性障害を治療するためのシステムが本明細書に提供される。本システムは、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む遺伝子編集成分を含む。本システムは、導入遺伝子をコードする核酸配列及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含む導入遺伝子カセットを含むドナーベクターを更に含み、ドナーベクターが、導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）アームを更に含み、導入遺伝子が、ＰＣＳＫ９ではない。ヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化する。特定の実施形態では、遺伝子編集成分は、脂質ナノ粒子に提供される。
【0010】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集成分は、Ｃａｓ９をコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子編集ベクターは、少なくとも２０ヌクレオチドのシード領域を含むｓｇＲＮＡをコードする配列を更に含み、ｓｇＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合し、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。
【0011】
他の実施形態では、ドナーベクターの更なる成分は、少なくとも２０ヌクレオチドのシード領域をコンポーネント含むｓｇＲＮＡをコードする配列を含み、ｓｇＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合し、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。
【0012】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、肝臓代謝障害に関連する。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＯＴＣ、ＰＫＵ、ＣＴＬＮ１、又はＬＤＬＲである。
【0013】
特定の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、ベクターが、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。
【0014】
別の実施形態では、遺伝性障害を治療するためのデュアルベクターシステムは、遺伝子編集ＡＡＶであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、メガヌクレアーゼをコードする配列であって、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるメガヌクレアーゼの発現を指示する調節配列の制御下でＰＣＳＫ９を標的化する、配列、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶ、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含み、導入遺伝子が、ＰＣＳＫ９をコードしない、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0015】
別の実施形態では、遺伝性障害を治療するためのデュアルベクターシステムは、遺伝子編集ＡＡＶであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるｓａＣａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶ、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、Ｕ６プロモーター、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する少なくとも２０個のヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡであって、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、及び３’ＩＴＲを含み、導入遺伝子が、ＰＣＳＫ９をコードしない、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0016】
更に別の実施形態では、遺伝性障害を治療するためのデュアルベクターシステムは、遺伝子編集ＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるＣａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクター、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集ＡＡＶベクター及びドナーＡＡＶベクターは、同じＡＡＶカプシドを有する。他の実施形態では、遺伝子編集ＡＡＶベクター及びドナーＡＡＶベクターは、異なるＡＡＶカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ３Ｂ、ｈｕ３７、ｒｈ７９、及びｒｈ６４から選択される。
【0018】
別の態様では、本明細書に記載されるデュアルベクターシステムを同時投与することによって、ヒトにおける障害を治療する方法が提供される。
【0019】
別の態様では、対象における肝臓代謝障害を治療する方法が提供され、本方法は、肝臓代謝障害を有する対象に、遺伝子編集ＡＡＶベクターであって、ヌクレアーゼをコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクターと、ドナーＡＡＶベクターであって、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含み、ドナーベクターが、導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同組換え（ＨＤＲ）アームを更に含み、導入遺伝子が、ＰＣＳＫ９ではない、ドナーＡＡＶベクターと、を同時投与することを含む。特定の実施形態では、肝臓代謝障害は、オルニチントランスカルバミラーゼである。他の実施形態では、家族性高コレステロール血症又はフェニルケトン尿症。一実施形態では、対象は、新生児である。
【0020】
別の態様では、遺伝性障害を治療するためのシステムが提供される。本システムは、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化するヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ配列を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と、ドナーＡＡＶベクターであって、導入遺伝子及び標的細胞におけるその発現を指示する調節配列を含み、ドナーベクターが、導入遺伝子の５’及び３’側に相同組換え（ＨＤＲ）アームを更に含み、導入遺伝子が、ＰＣＳＫ９ではない、ドナーＡＡＶベクターと、を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９エクソン７を標的化する。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＡＲＣＵＳメガヌクレアーゼである。
【0021】
他の実施形態では、遺伝子編集ベクターは、Ｃａｓ９をコードする。特定の実施形態では、遺伝子編集ベクターは、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する少なくとも２０個のヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡを更にコードし、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。いくつかの実施形態では、システムが、ＬＮＰを含み、ＬＮＰが、Ｃａｓ９コード配列及びｇＲＮＡの両方を含む。
【0022】
他の実施形態では、ドナーベクターは、少なくとも２０ヌクレオチドのシード領域を含むｓｇＲＮＡを更にコードし、ｓｇＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異
的に結合し、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。
的に結合し、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。
【0023】
更に別の態様では、遺伝性障害を治療するためのデュアルベクターシステムが提供される。本システムは、ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、発現カセットを含む、遺伝子編集ベクターと、ドナーベクターであって、ＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、システムは、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含み、標的細胞における天然ＰＣＳＫ９は、任意選択的に、デュアルベクターシステムの投与後に、アブレーション又は低減される。
【0024】
更に別の態様では、本明細書に記載されるシステムを使用して、患者の天然ＰＣＳＫ９発現レベルが低下し、患者が外因性産物を発現する、患者を治療する方法が提供される。
【0025】
更に別の態様では、オルニチントランスカルバミラーゼの操作されたコード配列が提供される。また、ベクター、発現カセット、及びそれらを含む組換えウイルスも含まれる。
【0026】
本発明の他の態様及び利点は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】エクソン７内のドナースプライス部位、及び目的のドナー鋳型（例えば、ｈＦＩＸ、ｈＯＴＣ）を含むＨＤＲドナーベクターを示す、ｒｈＰＣＳＫ９遺伝子座の概略図を示す。
【図2】新生児ＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ２又はＳａＣａｓ９によるＰＣＳＫ９遺伝子座におけるｈＦＩＸミニ遺伝子ノックインを含むパイロット研究のタイムラインを示す。
【図3A-3C】ＳａＣａｓ９又はＡＲＣＵＳ媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶベクターシステムの概略図を示す。図３Ａは、ＡＲＣＵＳ２媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステムの概略図を示し、ＡＡＶｈｕ３７ドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。図３Ｂは、ＳａＣａｓ９媒介性遺伝子修正（トランス；ＡＡＶｈｕ３７－ＳａＣａｓ９）のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステムの概略図を示し、ＳａＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの発現カセットが、２つの別個のベクターにあり、ＡＡＶｈｕ３７．ｓｇＲＮＡドナーベクターが、ｈＯＴＣドナー鋳型配列及びＵ６．ｓｇＲＮＡカセットを含む。図３Ｃは、ＳａＣａｓ９媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステム（シス；ＡＡＶｈｕ３７．ＰＣＳＫ９－ｓｇＲＮＡ．ＳａＣａＳ９）の概略図を示し、ＳａＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの発現カセットが、同じベクターにあり、ｈＯＴＣドナーベクターが、別個のベクターにある。
【図4A-4H】新生児ＮＨＰにおけるヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のインビボ試験を示す。動物に、図４Ａ、４Ｂ、及び５Ｇに示されるように、１×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２．ＷＰＲＥ及び３×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ｈＦＩＸｃｏ－ＨＤＲ、又は１×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＳａＣａｓ９．ＷＰＲＥ及び３×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ｈＦＩＸｃｏ－ＨＤＲ．Ｕ６．ｓｇＲ、又は１×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ及び３×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ｈＦＩＸｃｏ－ＨＤＲ．Ｕ６．ｓｇＲを投与した。図４Ｃは、新生児ＮＨＰにおける、示された時点でのｈＦＩＸレベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図４Ｄは、新生児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（０日目のベースラインのパーセンテージとしてプロットされている）を示す。図４Ｅは、新生児ＮＨＰにおける、示された時点（Ｕ／Ｌとしてプロットされている）でのＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルを示す。図４Ｆは、新生児ＮＨＰにおける、示された時点での抗ＦＩＸ ＩｇＧレベル（希釈係数、１／希釈としてプロットされている）を示す。図４Ｇは、新生児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図４Ｈは、新生児ＮＨＰにおいて測定された体重（ｇとしてプロットされている）を示す。
【図5A-5H】３ヵ月齢の乳幼児ＮＨＰに投与した、図４に記載のインビボ試験の結果を示す。図５Ａは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのｈＦＩＸレベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図５Ｂは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（０日目のベースラインのパーセンテージとしてプロットされている）を示す。図５Ｃは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点（Ｕ／Ｌとしてプロットされている）でのＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルを示す。図５Ｄは、乳幼児のＮＨＰにおける、示された時点での抗ＦＩＸ ＩｇＧレベル（希釈係数、１／希釈としてプロットされている）を示す。図５Ｅは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図５Ｆは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点（ｇとしてプロットされている）で測定された体重を示す。図５Ｇは、図４Ａ～５Ｇに記載の実験からのデータを示す要約表である。図５Ｈは、試験した新生児と乳幼児のＮＨＰとの間の様々なデータの比較を示す。
【図6A-6G】図４Ａ～４Ｈに記載のように処置されたＮＨＰにおける処置後の様々な日に採取された肝臓生検試料におけるベクターの形質導入（ＧＣ）及び導入遺伝子の発現を示す。図６Ａは、二倍体細胞当たりのＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）としてプロットされた、肝臓生検試料におけるベクターの形質導入のレベルを示す。図６Ｂは、肝臓生検試料における導入遺伝子ＲＮＡの相対発現を示す。図６Ｃは、肝臓生検においてＦＩＸ及びＡＲＣＵＳを検出するための特異的プローブを使用したデュアルインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す。図６Ｄは、形質導入のパーセンテージの定量に使用されるデジタル化ＩＳＨ画像を示す。図６Ｅは、ＩＳＨによって定量化され、パーセント形質導入としてプロットされたＦＩＸ導入遺伝子の形質導入効率を示す。
【図7A-7L】ＮＨＰにおける処置の８４日後に採取された肝臓生検におけるＦＩＸ及びＡＲＣＵＳを検出するための特異的プローブを使用した、様々な倍率の視野で示されたデュアルインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す（ＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸで処置されたＮＨＰ）。図７Ａは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳを示す。図７Ｂは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図７Ｃは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図７Ｄは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図７Ｅは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳを示す。図７Ｆは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図７Ｇは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図７Ｈは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図７Ｉは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ発現を示す。図７Ｊは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図７Ｋは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図７Ｌは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。
【図8A-8M】ＮＨＰにおける処置の８４日後に採取された肝臓生検におけるＦＩＸ及びＡＲＣＵＳを検出するための特異的プローブを使用した、様々な倍率の視野で示されたデュアルインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す（ＡＡＶｈｕ３７．ＥＧＦＰ及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸ．Ｕ６．ｓｇＲで処置されたＮＨＰ）。図８Ａは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥを示す。図８Ｂは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図８Ｃは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図８Ｄは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図８Ｅは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥを示す。図８Ｆは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図８Ｇは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図８Ｈは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図８Ｉは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥの発現を示す。図８Ｊは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図８Ｋは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図８Ｌは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図８Ｍは、未処理の対照において２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。
【図9】ＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸで処置されたＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ媒介性オンターゲット編集を示す。処置の８４日後に、肝臓生検試料を採取し、そこに存在する標的領域における総インデルのパーセンテージを、アンプリコン－ｓｅｑに基づいて計算した。
【図10A-10B】ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスモデルの概略図を示す。図１０Ａは、ヒトｐｃｓｋ９エクソン７に置き換えられたマウスｐｃｓｋ９エクソン７の概略図を示す（ｈＥ７は、ＡＲＣＵＳ標的化配列を含む）。ヒトＰＣＳＫ９エクソン７の配列は、配列番号４４に示される。図１０Ｂは、ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスモデルを、ＯＴＣ ｓｐｆａｓｈ、ＫＩ－ｓｐｆａｓｈモデルなどの他の疾患マウスモデルと交配する概略図を示す。ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩノックインマウスモデルは、マウスＰｃｓｋ９遺伝子のエクソン７を含む領域を、エクソン７を含有するヒトＰＣＳＫ９遺伝子の領域に置き換えることによって最初に生成された。次いで、ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスを、Ｏｔｃ遺伝子のエクソン４の末端のスプライスドナー部位でのＧからＡへの点変異に起因するＯＴＣ発現の２０倍の減少を示すｓｐａｒｓｅ ｆｕｒ ａｓｈ（ｓｐｆａｓｈ）マウスと交配した。この交配からのマウスを、ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスと名付け、本明細書に記載のように利用した。略語：ｂｐ：塩基対、Ｅ６：エクソン６、Ｅ７：エクソン７、Ｅ８：エクソン８、ＨＤＲ：相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、ＰＣＳＫ９：プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（遺伝子、ヒト）、Ｐｃｓｋ９：プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（遺伝子、マウス）。
【図11A-11I】図１１Ｉに示されるベクターについての、新生児ＮＨＰにおけるヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のインビボ試験を示す。図１１Ａは、実施例３に記載されるベクターについての、新生児ＮＨＰにおけるヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のインビボ試験の実験設計を示す図表である。動物２１－１１１、２１－１２２、及び２１－１１３は、投与前にＡＡＶ結合抗体（ＢＡｂ）が陽性であった。Ｂａｂアッセイを妨げるベクター投与後、２１－１７８の０日目の試料を採取した。ｃ：独立したＩＴＲｓｅｑアッセイで同定されたＯＴ部位の数が列挙されている。図１１Ｂは、図１１Ａに示される群について、ｎｇ／ｍＬ（上の行）又は０日目の％（下の行）として示されるＰＣＳＫ９レベルを示す。図１１Ｃは、図１１Ａに示される群について、Ｕ／Ｌ（上の行）として示されるＡＬＴレベル又はＵ／Ｌ（下の行）として示されるＡＳＴを示す。図１１Ｄは、ＩＳＨ又はＩＦによって定量化され、形質導入された肝細胞の割合としてプロットされた、ＯＴＣ導入遺伝子の形質導入効率を示す。図１１Ｅは、マウスの体重を示す。図１１Ｆは、８４日目の定量的ＰＣＲ分析による肝臓におけるベクターのＧＣを示す。図１１Ｇは、肝臓生検試料から単離された総ＲＮＡに対する定量的ＰＣＲ、その後の逆転写によって測定され、ＧＡＰＤＨレベルによって正規化された相対発現レベルとして表された、８４日目のマカクザルの肝臓におけるｈＯＴＣ及びヌクレアーゼの発現を示す。図１１Ｈは、アンプリコン－ｓｅｑによって行われたｒｈＰＣＳＫ９標的遺伝子座のインデル分析を示す。図１１Ｉは、実施例３に記載の実験のために試験されたベクターを含む、新生児ＮＨＰにおけるヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のインビボ試験のタイムラインの概略図である。
【図12】ｐｃｓｋ９－ｈＥ７ノックインアレルのヒトＰＣＳＫ９配列、マウスＰＣＳＫ９（ｍＰＣＳＫ９）及びアカゲザルＰＣＳＫ９（ｒｈＰＣＳＫ９）を表す、２６５ｂｐ配列の配列アラインメントを示す。略称：ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＧＣ：ゲノムコピー、ｈＯＴＣ：ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ、ＯＴ：オフターゲット、ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応、ｒｈＰＣＳＫ９：プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（アカゲザル遺伝子）、ＲＮＡ：リボ核酸。
【図13】ＡＲＣＵＳ２媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶベクターシステムのためのドナー構築物の概略図を示す。ＡＡＶドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。ノックインマウスモデル（図１０Ａ～１０Ｂ）、ＮＨＰ、及びヒトの標的領域との、構築物におけるＨＤＲアームの相同性を示す。
【図14A】実施例５に記載されるように、ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆ－ａｓｈ仔（部分的ＯＴＣ欠損モデル）において行われた、ＡＲＣＵＳ２によるＰＣＳＫ９遺伝子座におけるｈＯＴＣミニ遺伝子のノックインを含む研究のタイムラインを示す。
【図14C-14I】高タンパク質（ＨＰ）ダイエットを１０日間与えられた、図７に示されるベクターで処置されたマウス又は処置（ＫＩ ＷＴ）されていないマウスの研究の結果を示す。図１４Ｃは、生存確率を示す。図１４Ｄは、ＨＰダイエットの導入前の体重のパーセンテージとしての体重を示す。図１４Ｅは、ＨＰダイエットの１０日目の血漿中ＮＨ３レベルを示す。図１４Ｆは、４８日目のｍＰＣＳＫ９タンパク質レベルを示す。図１４Ｇは、５９日目のアンプリコン－ｓｅｑによって測定されたインデル（％）を示す。図１４Ｈは、５９日目に測定された二倍体細胞当たりのＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）としてプロットされた、肝臓生検試料におけるベクターの形質導入のレベルを示す。図１４Ｉは、８週目のＯＴＣのＩＦを示す。
【図15】ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｌｄｌｒ－／ｌｄｌｒ－．ａｐｏｂｅｃ－／ａｐｏｂｅｃ－仔（ｈｏＦＨモデル）におけるＳａＣａｓ９によってＰＣＳＫ９遺伝子座にｈＬＤＬＲミニ遺伝子のノックインを生成するための、実施例１０に記載の実験設計の概略図である。
【図16】実施例１０で使用したベクターを示す概略図である。
【図17】実施例１０の実験設計を示す。
【図18A-18D】実施例１０の実験の結果を示す。図１８Ａは、ｓｈＨＤＲ＋ｓａＣａｓ９、ｍｈＨＤＲ＋ｓａＣａｓ９、ｓｈＨＤＲのみ、及び未処置マウスの血清ＬＤＬレベルを示す。図１８Ｂは、ｓｈＨＤＲ＋ｓａＣａｓ９、ｍｈＨＤＲ＋ｓａＣａｓ９、ｓｈＨＤＲのみで処置されたマウスのインデルのパーセンテージを示す。図１８Ｃは、６３日目の肝臓で測定した、二倍体ゲノム当たりのｈＬＤＬＲゲノムコピーを示す。図１８Ｄは、６３日目のｓｈＨＤＲ＋ｓａＣａｓ９、ｍｈＨＤＲ＋ｓａＣａｓ９、ｓｈＨＤＲのみ、及び未処置マウスの血清ＬＤＬレベルを示す。
【図19】実施例１０のマウスについて６３日目に採取した肝臓試料の免疫組織化学データを示す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本明細書では、肝臓代謝障害を含む特定の遺伝性障害を有する患者に安定した長期的な治療効果を提供する、組成物、キット、及び方法が提供される。組成物、キット、及び方法は、標的細胞のＰＣＳＫ９遺伝子座を標的化するヌクレアーゼを利用し、ドナーベクタ
ーは、ＰＣＳＫ９遺伝子座への組み込み及びそれからの発現のための外因性産物を含む鋳型を提供し、挿入された核酸配列は、ＰＣＳＫ９をコードせず、内因性ＰＣＳＫ９の発現が破壊され、発現レベルが低下する。
ーは、ＰＣＳＫ９遺伝子座への組み込み及びそれからの発現のための外因性産物を含む鋳型を提供し、挿入された核酸配列は、ＰＣＳＫ９をコードせず、内因性ＰＣＳＫ９の発現が破壊され、発現レベルが低下する。
【0029】
ＰＣＳＫ９
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９（ＰＣＳＫ９）は、肝臓及び肝外の両方の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体（ＬＤＬＲ；６０６９４５）レベルを低下させ、血漿ＬＤＬコレステロールを増加させるセリンプロテアーゼである。ＰＣＳＫ９は、血漿コレステロールホメオスタシスの調節に重要である。ＰＣＳＫ９は、低密度脂質受容体ファミリーメンバーの低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質Ｅ受容体（ＬＲＰ１／ＡＰＯＥＲ）、及びアポリポタンパク質受容体２（ＬＲＰ８／ＡＰＯＥＲ２）に結合し、細胞内酸性区画におけるそれらの分解を促進する。ヒトＰＣＳＫ９は、配列番号２３に示されるように、ＮＰ＿７７７５９６．２のタンパク質配列を有し、配列番号２２に示されるコード配列を有する。
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９（ＰＣＳＫ９）は、肝臓及び肝外の両方の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体（ＬＤＬＲ；６０６９４５）レベルを低下させ、血漿ＬＤＬコレステロールを増加させるセリンプロテアーゼである。ＰＣＳＫ９は、血漿コレステロールホメオスタシスの調節に重要である。ＰＣＳＫ９は、低密度脂質受容体ファミリーメンバーの低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質Ｅ受容体（ＬＲＰ１／ＡＰＯＥＲ）、及びアポリポタンパク質受容体２（ＬＲＰ８／ＡＰＯＥＲ２）に結合し、細胞内酸性区画におけるそれらの分解を促進する。ヒトＰＣＳＫ９は、配列番号２３に示されるように、ＮＰ＿７７７５９６．２のタンパク質配列を有し、配列番号２２に示されるコード配列を有する。
【0030】
ＰＣＳＫ９遺伝子は、コレステロール関連疾患の治療のために標的化されているが、本明細書では、ＰＳＣＫ９遺伝子座が、他の非ＰＣＳＫ９導入遺伝子の挿入のための遺伝子標的化のためのセーフハーバーであることが実証される。したがって、本明細書に提供される組成物、キット、及び方法は、ＰＣＳＫ９遺伝子座を標的化するヌクレアーゼを利用し、ドナー鋳型を使用して、治療用導入遺伝子を標的ＰＣＳＫ９遺伝子座に挿入する。
【0031】
本明細書に提供される組成物、キット、及び方法は、遺伝子編集成分（いくつかの実施形態では、ベクター）と、ドナーベクター（宿主細胞で発現させるための治療用導入遺伝子を提供する）と、を含む。
【0032】
遺伝子編集成分
本明細書に提供される組成物、キット、及び方法は、遺伝子編集構成要素を含み、これは、ヌクレアーゼ（又はしたがって、コード配列）と、ヌクレアーゼに、染色体１上の天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列と、を含む。本明細書で使用される場合、「標的ＰＣＳＫ９遺伝子座」又は「ＰＣＳＫ９遺伝子座」は、異種導入遺伝子の挿入が所望されるＰＣＳＫ９コード領域における任意の部位である。特定の実施形態では、標的ＰＣＳＫ９遺伝子座は、ＰＣＳＫ９コード配列のエクソン７にある。図１２は、ＳａＣａｓ９及びＰＣＳＫ９を標的化するメガヌクレアーゼ（ＡＲＣＵＳと称される）を使用して本明細書に例示される、ヒト（ｈ）、アカゲザル（ｒｈ）、及びマウス（ｍ）のＰＣＳＫ９エクソン７スプライス部位の整列を提供する。
本明細書に提供される組成物、キット、及び方法は、遺伝子編集構成要素を含み、これは、ヌクレアーゼ（又はしたがって、コード配列）と、ヌクレアーゼに、染色体１上の天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列と、を含む。本明細書で使用される場合、「標的ＰＣＳＫ９遺伝子座」又は「ＰＣＳＫ９遺伝子座」は、異種導入遺伝子の挿入が所望されるＰＣＳＫ９コード領域における任意の部位である。特定の実施形態では、標的ＰＣＳＫ９遺伝子座は、ＰＣＳＫ９コード配列のエクソン７にある。図１２は、ＳａＣａｓ９及びＰＣＳＫ９を標的化するメガヌクレアーゼ（ＡＲＣＵＳと称される）を使用して本明細書に例示される、ヒト（ｈ）、アカゲザル（ｒｈ）、及びマウス（ｍ）のＰＣＳＫ９エクソン７スプライス部位の整列を提供する。
【0033】
本明細書では、組成物、特に、ヌクレアーゼが記載され、これは、導入遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９に特異的なヌクレアーゼ）の挿入のための遺伝子を標的化するのに有用である。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、天然に存在しない。すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン及び／又は切断ドメインにおいて操作されている。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように改変され得る（例えば、同種の結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクタヌクレアーゼ、異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。
【0034】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９を標的化するメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）、例
えば、Ｉ－ＳｃｅＩを特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。ヌクレアーゼと組み合わせると、ＤＮＡを特定の位置で切断することができる。制限酵素は、遺伝子編集における使用のために、又はインサイツのゲノム編集のために、細胞内に導入され得る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号３１）ファミリーのメンバーである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、２２塩基対の認識配列（配列番号３２－ＣＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧ）を認識し、切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＩ－ＣｒｅＩファミリーのメンバーである。例えば、ＷＯ２００９／０５９１９５を参照されたい。Ｉ－ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計して、哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスのゲノムにおける部位を含む、広く分岐したＤＮＡ部位を標的化することができる、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号３２）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計するための方法が記載された（ＷＯ２００７／０４７８５９）。一実施形態では、ヌクレアーゼは、配列番号１９（ｎｔ３３０～１４２４）に示される配列、又はそれと少なくとも９５％、９８％、若しくは９９％の同一性を共有する配列によってコードされる。一実施形態では、ヌクレアーゼのタンパク質配列は、配列番号２０で示される配列、又はそれと少なくとも９５％、９８％、若しくは９９％の同一性を共有する配列である。かかるヌクレアーゼは、本明細書ではＡＲＣＵＳヌクレアーゼと称されることがある。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。その全体が本明細書に援用される、特定のＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼを記載する、ＷＯ２０１８／１９５４４９を参照されたい。
えば、Ｉ－ＳｃｅＩを特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。ヌクレアーゼと組み合わせると、ＤＮＡを特定の位置で切断することができる。制限酵素は、遺伝子編集における使用のために、又はインサイツのゲノム編集のために、細胞内に導入され得る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号３１）ファミリーのメンバーである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、２２塩基対の認識配列（配列番号３２－ＣＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧ）を認識し、切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＩ－ＣｒｅＩファミリーのメンバーである。例えば、ＷＯ２００９／０５９１９５を参照されたい。Ｉ－ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計して、哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスのゲノムにおける部位を含む、広く分岐したＤＮＡ部位を標的化することができる、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号３２）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計するための方法が記載された（ＷＯ２００７／０４７８５９）。一実施形態では、ヌクレアーゼは、配列番号１９（ｎｔ３３０～１４２４）に示される配列、又はそれと少なくとも９５％、９８％、若しくは９９％の同一性を共有する配列によってコードされる。一実施形態では、ヌクレアーゼのタンパク質配列は、配列番号２０で示される配列、又はそれと少なくとも９５％、９８％、若しくは９９％の同一性を共有する配列である。かかるヌクレアーゼは、本明細書ではＡＲＣＵＳヌクレアーゼと称されることがある。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。その全体が本明細書に援用される、特定のＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼを記載する、ＷＯ２０１８／１９５４４９を参照されたい。
【0035】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の独自の配列を標的にすることが可能になる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して、高等生物のゲノムを正確に変更し、ゲノム編集の分野における卓越したツールとして機能することができる。転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作することができる制限酵素である。これらは、ＴＡＬエフェクタＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。別の実施形態では、コード配列は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする。
【0036】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）、任意選択的に、Ｃａｓ９である。「Ｃａｓ９」（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、２つのシグネチャーヌクレアーゼドメインＲｕｖＣ（非コード鎖を切断する）及びＨＮＨ（コード鎖）を特徴とするＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼのファミリーを指す。Ｃａｓ９の好適な細菌源としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ［ＫＭ Ｅｓｔｅｌｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈ，１０：１１１６－１１２１（２０１３）］が挙げられる。野生型コード配列は、本明細書に記載の構築物に利用され得る。あるいは、細菌コドンは、例えば、様々な既知のヒトコドン最適化アルゴリズムのいずれかを使用して、ヒトにおける発現のために最適化される。あるいは、これらの配列は、完全に又は部分的に、合成的に産生され得る。同様の特性を有する他のエンドヌクレアーゼは、任意選択的に置換されてもよい。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｕ－ｐｓｕｄ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒでアクセス可能な公開ＣＲＩＳＰＲデータベース（ｄｂ）を参照されたい。
【0037】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼコード配列の組成物、キット、及び方法は、遺伝子
編集ベクターに含まれる。遺伝子編集ベクターは、ヌクレアーゼをコードする核酸配列と、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列と、を含む、発現カセットを含む。
編集ベクターに含まれる。遺伝子編集ベクターは、ヌクレアーゼをコードする核酸配列と、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列と、を含む、発現カセットを含む。
【0038】
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、当該核酸配列の複製又は発現のために適切な宿主細胞に導入され得る。一般的なベクターとしては、非ウイルスベクター及びウイルスベクターが挙げられる。本明細書で使用される場合、非ウイルス系は、ナノ粒子、エレクトロポレーションシステム、及び新規の生体材料、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、プラスミド、コスミド（Ｐｈｉｌｌｉｐ ＭｃＣｌｅａｎ、ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｅｄｕ／ｐｕｂｗｅｂ／～ｍｃｃｌｅａｎ／－ｐｌｓｃ７３１／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｃｌｏｎｉｎｇ４．ｈｔｍ）、並びに人工染色体（Ｇｏｎｇ，Ｓｈｉａｏｃｈｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔｌａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ ４２５．６９６１（２００３）：９１７－９２５）から選択され得る。
【0039】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、生物学的に有用な核酸配列と、核酸配列（例えば、タンパク質、酵素、又は他の有用な遺伝子産物、ｍＲＮＡなどをコードする遺伝子ｃＤＮＡ）及びその遺伝子産物の転写、翻訳、並びに／若しくは発現を指示又は調節する、それと作動可能に連結された制御性配列と、を含む、核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列には、核酸配列に隣接する調節配列と、配列を制御するためにトランスで又は離れて作用する調節配列との両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、コザック配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。発現カセットは、他の要素の中で、遺伝子配列の上流（５’～）の制御性配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどのうちの１つ以上、及びエンハンサー、又は遺伝子配列の下流（３’～）の制御性配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域のうちの１つ以上を含有し得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からの１つ以上のＤＮＡ配列を指す。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのかかる発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含み得る。
【0040】
ヌクレアーゼのコード配列に加えて、特定の実施形態では、遺伝子編集ベクターには、宿主細胞においてヌクレアーゼの発現を指示する調節配列が含まれる。特定の実施形態では、調節エレメントは、プロモーターを含む。特定の実施形態では、本システムは、肝細胞における変異又は表現型を特徴とする代謝障害の治療のために設計され、遺伝子編集ベクターは、ヌクレアーゼが肝臓特異的プロモーターの制御下で発現されるように設計され得る。本明細書に記載の例示的なプラスミド及びベクターは、配列番号４１の配列を特徴とする、肝臓特異的プロモーターであるチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）を使用する。他の実施形態では、配列番号１１の配列を特徴とするＴＢＧの短縮バージョン（本明細書ではＴＢＧ－Ｓ１と呼ばれるバリアント）が有用である。別の実施形態では、配列番号１２の配列を有するハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を利用する。
【0041】
いくつかの実施形態では、低転写活性を有するプロモーター、又は弱いプロモーターを利用することが望ましい。一実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターの弱化バージョンである。一実施形態では、弱いプロモーターは、天然プロモーター又はＴＢＧ－Ｓ１配列の５’又は３’末端で切断される。別の実施形態では、プロモーターは、ＴＢＧ－Ｓ１プロモーターから３’末端１１３ｎｔ
のみを保持し、Ｆ１１３と呼ばれる（ＴＢＧ－Ｓ１－Ｆ１１３とも呼ばれる）（配列番号１９、ｎｔ２０６～３１８）。２０２０年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，１４５号、２０２０年６月２日に出願された第６３／０３３，７３８号、２０２０年１０月９日に出願された第６３／０８９，７９６号、２０２１年４月２７日にともに出願されたＰＣＴ／ＵＳ２１／２９３８６号及びＰＣＴ／ＵＳ２１／２９４０３号は、各々「低転写活性を有するＡプロモーターを使用してヌクレアーゼ発現及びオフターゲット活性を低下させるための組成物及び方法」と題され、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
のみを保持し、Ｆ１１３と呼ばれる（ＴＢＧ－Ｓ１－Ｆ１１３とも呼ばれる）（配列番号１９、ｎｔ２０６～３１８）。２０２０年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１６，１４５号、２０２０年６月２日に出願された第６３／０３３，７３８号、２０２０年１０月９日に出願された第６３／０８９，７９６号、２０２１年４月２７日にともに出願されたＰＣＴ／ＵＳ２１／２９３８６号及びＰＣＴ／ＵＳ２１／２９４０３号は、各々「低転写活性を有するＡプロモーターを使用してヌクレアーゼ発現及びオフターゲット活性を低下させるための組成物及び方法」と題され、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【0042】
あるいは、他の肝臓特異的プロモーター、例えば、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２（１９９７））、及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９（１９９６）、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、α－アンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）を使用してもよい。例えば、肝臓特異的遺伝子プロモーターデータベース、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤを参照されたい。あるいは、他の組織特異的プロモーター、例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターなどの筋肉特異的プロモーター又は筋肉ハイブリッド（ＭＨ）プロモーターなどを使用してもよい。あるいは、他のプロモーター、例えば、構成的プロモーター（ＣＭＶ、ＣＢＧ、ＣＢ７など）、調節可能（誘導性）プロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい（参照により本明細書に援用される）］、又は生理学的キューに応答するプロモーターを、本明細書に記載のベクターに利用してもよい。任意選択的に、調節可能なシステムが選択される場合、調節機能を提供するために第３のベクターが必要になる可能性がある。
ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９（１９９６）、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、α－アンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）を使用してもよい。例えば、肝臓特異的遺伝子プロモーターデータベース、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤを参照されたい。あるいは、他の組織特異的プロモーター、例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターなどの筋肉特異的プロモーター又は筋肉ハイブリッド（ＭＨ）プロモーターなどを使用してもよい。あるいは、他のプロモーター、例えば、構成的プロモーター（ＣＭＶ、ＣＢＧ、ＣＢ７など）、調節可能（誘導性）プロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい（参照により本明細書に援用される）］、又は生理学的キューに応答するプロモーターを、本明細書に記載のベクターに利用してもよい。任意選択的に、調節可能なシステムが選択される場合、調節機能を提供するために第３のベクターが必要になる可能性がある。
【0043】
プロモーターに加えて、遺伝子編集カセット、発現カセット、及び／又はベクターは、１つ以上の適切な「調節エレメント」又は「調節配列」を含有することができ、これには、エンハンサー、転写因子、転写終結因子、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）などの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を向上させる配列、並びに必要に応じて、コードされた産物の分泌を向上させる配列が含まれるが、これらに限定されない。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、及びＴＫポリＡが挙げられる。好適なエンハンサーの例としては、例えば、とりわけαフェトタンパク質エンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１－マイクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。これらの制御配列又は調節配列は、ヌクレアーゼコード配列及び導入遺伝子コード配列に作動可能に連結される。
【0044】
特定の実施形態では、遺伝子編集ベクターは、ＴＢＧプロモーター、１つ以上のαｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＡＲＣＵＳメガヌクレアーゼのコード配列、任意選択的に、ＷＰＲＥ、及びポリＡを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号４２のｎｔ２１１～ｎｔ２９６４を含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集成分は、ヌクレアーゼをＰＣＳＫ９標的遺伝子座における標的部位に導く配列を更に含む。ＰＣＳＫ９に特異的なメガヌクレアーゼなどの特定の実施形態では、ヌクレアーゼを標的部位に導くために更なる配列は必要とされない。しかしながら、例えば、Ｃａｓ９の場合、「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる、標的配列に特異的な追加の配列が提供される。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９と同じベクター上に（シス）、又は異なるベクター上に（トランス）提供され得る。本明細
書で使用される場合、ｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ足場と組み合わせて、特異的ＤＮＡ結合（すなわち、標的ＤＮＡと相同）のための少なくとも２０塩基の配列（又は約２４～２８塩基、シード領域と呼ばれることもある）を有する。ｓｇＲＮＡの転写は、その５’末端で正確に開始される必要がある。鋳型ＤＮＡ鎖を標的化する場合、ｓｇＲＮＡの塩基対形成領域は、転写配列と同じ配列同一性を有する。非鋳型ＤＮＡ鎖を標的化する場合、ｓｇＲＮＡの塩基対形成領域は、転写配列の逆相補鎖である。任意選択的に、遺伝子編集ベクターは、２つ以上のｓｇＲＮＡを含み得る。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９（又はＣｐｆ１）酵素によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。典型的には、ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の「すぐに」５’側にあり、すなわち、スペーサー又は介在配列が存在しない。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ「シード」コード配列は、ＡＡＧＴＴＧＧＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＣ（配列番号８）であり、これは、ＳａＣａｓ９がヒト及びマカクＰＣＳＫ９のエクソン７を標的化するのに有用である。しかしながら、他のｓｇＲＮＡも、当業者によって設計され得る。
書で使用される場合、ｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ足場と組み合わせて、特異的ＤＮＡ結合（すなわち、標的ＤＮＡと相同）のための少なくとも２０塩基の配列（又は約２４～２８塩基、シード領域と呼ばれることもある）を有する。ｓｇＲＮＡの転写は、その５’末端で正確に開始される必要がある。鋳型ＤＮＡ鎖を標的化する場合、ｓｇＲＮＡの塩基対形成領域は、転写配列と同じ配列同一性を有する。非鋳型ＤＮＡ鎖を標的化する場合、ｓｇＲＮＡの塩基対形成領域は、転写配列の逆相補鎖である。任意選択的に、遺伝子編集ベクターは、２つ以上のｓｇＲＮＡを含み得る。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９（又はＣｐｆ１）酵素によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。典型的には、ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の「すぐに」５’側にあり、すなわち、スペーサー又は介在配列が存在しない。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ「シード」コード配列は、ＡＡＧＴＴＧＧＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＣ（配列番号８）であり、これは、ＳａＣａｓ９がヒト及びマカクＰＣＳＫ９のエクソン７を標的化するのに有用である。しかしながら、他のｓｇＲＮＡも、当業者によって設計され得る。
【0046】
特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合し、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある。いくつかの実施形態では、シード領域は、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位と１００％の相補性を共有する。他の実施形態では、シード領域は、標的部位と比較して、１、２、３、４、又は５つのミスマッチを含有する。
【0047】
ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及び／又はターミネーターの制御下にある。特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６プロモーターなどのＰｏｌＩＩＩプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、Ｈ１プロモーターである。例示的なＵ６プロモーターの配列は、配列番号１０に見出すことができる。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ドナーベクターに位置する。
【0048】
他の実施形態では、例えば、ヌクレアーゼがＣａｓ９である場合、遺伝子編集成分は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｃａｓ９のコード配列に隣接する。特定の実施形態では、ＮＬＳは、配列番号５のｎｔ４２４１～４２８８の配列を有する。例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ，Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ（Ｍａｙ ２０２１）１９：６０（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【0049】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼのコード配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として提供される。ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、及び／又はコード若しくは翻訳配列を含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９のコード配列は、ｍＲＮＡとして提供される。
【0050】
ｍＲＮＡは、天然に存在する又は天然に存在しないｍＲＮＡであり得る。ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物中のｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含み、例えば、インビボでのヌクレアーゼ消化に対する改善された耐性を含む、核酸に向上した又は強化された安定性を付与する。ｍＲＮＡは、数十、数百、又は数千の塩基対を含む、任意の数の塩基対を含み得る。任意の数（例えば、全て、いくつか、又はなし）の核酸塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドは、置換、修飾、又はそうでなければ天然に存在しない正準種の類似体であり得る。特定の実施形態では、特定の核酸塩基型の全てが修飾され得る。例え
ば、ｍＲＮＡにおける全てのシトシンが、５－メチルシトシンであり得る。本明細書で使用される場合、「修飾」及び「修飾された」という用語は、かかる用語が本明細書に提供される核酸に関連する場合、好ましくは、安定性を向上させ、ｍＲＮＡを、野生型のｍＲＮＡ又は天然に存在するバージョンのｍＲＮＡよりも安定（例えば、ヌクレアーゼ消化に耐性）にする少なくとも１つの改変を含む。本明細書で使用される場合、「安定した」及び「安定性」という用語は、かかる用語が本発明の核酸に関連する場合（特に、ｍＲＮＡに関して）、例えば、通常、そのようなｍＲＮＡを分解することができるヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ）による分解に対する向上した又は強化された耐性を指す。安定性の向上には、例えば、内因性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼ）による加水分解、又は他の破壊、又は標的細胞若しくは組織内の状態に対する感受性の低下が含まれ得、それによって、標的細胞、組織、対象、及び／又は細胞質におけるそのようなｍＲＮＡの存在を増加又は増強する。本明細書に提供される安定化ｍＲＮＡ分子は、それらの天然に存在する非修飾対応物（例えば、ｍＲＮＡの野生型バージョン）と比較して、より長い半減期を示す。また、「修飾」及び「修飾された」という用語は、かかる用語が本発明のｍＲＮＡに関連する場合、例えば、タンパク質翻訳の開始において機能する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）の包含を含む、ｍＲＮＡ核酸の翻訳を改善又は増強する改変も企図する。
ば、ｍＲＮＡにおける全てのシトシンが、５－メチルシトシンであり得る。本明細書で使用される場合、「修飾」及び「修飾された」という用語は、かかる用語が本明細書に提供される核酸に関連する場合、好ましくは、安定性を向上させ、ｍＲＮＡを、野生型のｍＲＮＡ又は天然に存在するバージョンのｍＲＮＡよりも安定（例えば、ヌクレアーゼ消化に耐性）にする少なくとも１つの改変を含む。本明細書で使用される場合、「安定した」及び「安定性」という用語は、かかる用語が本発明の核酸に関連する場合（特に、ｍＲＮＡに関して）、例えば、通常、そのようなｍＲＮＡを分解することができるヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ）による分解に対する向上した又は強化された耐性を指す。安定性の向上には、例えば、内因性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼ）による加水分解、又は他の破壊、又は標的細胞若しくは組織内の状態に対する感受性の低下が含まれ得、それによって、標的細胞、組織、対象、及び／又は細胞質におけるそのようなｍＲＮＡの存在を増加又は増強する。本明細書に提供される安定化ｍＲＮＡ分子は、それらの天然に存在する非修飾対応物（例えば、ｍＲＮＡの野生型バージョン）と比較して、より長い半減期を示す。また、「修飾」及び「修飾された」という用語は、かかる用語が本発明のｍＲＮＡに関連する場合、例えば、タンパク質翻訳の開始において機能する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）の包含を含む、ｍＲＮＡ核酸の翻訳を改善又は増強する改変も企図する。
【0051】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡは、それらをより安定にするために、化学的又は生物学的な修飾を受けている。ｍＲＮＡに対する例示的な修飾としては、塩基の枯渇（例えば、１つのヌクレオチドの欠失若しくは別のヌクレオチドとの置換による）又は塩基の修飾（例えば、塩基の化学修飾）が挙げられる。本明細書で使用される「化学修飾」という語句は、自然に存在するｍＲＮＡに見られるものとは異なる化学物質を導入する修飾、例えば、修飾されたヌクレオチドの導入などの共有結合修飾（例えば、ヌクレオチド類似体、又はそのようなｍＲＮＡ分子における天然には見出されないペンダント基の包含）を含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ配列におけるＣ及び／又はＵ残基の数が減少する。別の実施形態では、Ｃ及び／又はＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードする１つのコドンが、同じ又は関連するアミノ酸をコードする別のコドンに置換されることによって減少する。本発明のｍＲＮＡ核酸に対する想定される修飾には、プソイドウリジン、プソイドウリジン（ψ）又は５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）の組み込みも含まれる。本発明のｍＲＮＡに対する置換及び修飾は、当業者に容易に知られている方法によって行うことができる。
【0053】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ、及び／又はポリアデニル化シグナルを含む。キャップ構造又はキャップ種は、リンカーによって結合された２つのヌクレオシド部分を含む化合物であり、天然に存在するキャップ、天然に存在しないキャップ若しくはキャップ類似体、又はアンチリバースキャップ類似体から選択され得る。ｍＲＮＡは、代わりに又は追加的に、鎖終結ヌクレオシドを含み得る。
【0054】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒストンステムループなどのステムループを含む。ステムループは、１、２、３、４、５、６、７、８つ、又はそれ以上のヌクレオチド塩基対を含み得る。ステムループは、ｍＲＮＡの任意の領域に位置し得る。例えば、ステムループは、非翻訳領域（５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域）、コード領域、又はポリＡ配列若しくはポリＡテールの中、前、又は後に位置し得る。
【0055】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。ポリＡ配列は、アデニンヌクレオチド又はその類似体若しくは誘導体の全体又は大部分で構成され得る。特定の実施形態
では、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に隣接して位置するテールである。
では、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に隣接して位置するテールである。
【0056】
ｍＲＮＡは、任意の天然に存在する若しくは天然に存在しない、又はそうでなければ修飾されたポリペプチドを含む、目的の任意のポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ）をコードし得る。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、任意のサイズであり得、任意の二次構造又は活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、細胞内で発現された場合、治療効果を有し得る。
【0057】
ドナーベクター
組成物、キット、及び方法は、治療用導入遺伝子のコード配列を提供するドナーベクターを含む。特定の実施形態では、ドナーベクターは、導入遺伝子をコードする核酸配列と、標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列と、を含む、発現カセットを含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、肝臓代謝障害又は他の遺伝性障害において異常に発現するタンパク質をコードする。導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９以外のタンパク質をコードする。そのようなタンパク質としては、ＯＴＣ、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）、第ＩＸ因子、例えば、配列番号５５若しくは５６に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列、及び第ＶＩＩＩ因子、例えば、配列番号５３若しくは５４に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
組成物、キット、及び方法は、治療用導入遺伝子のコード配列を提供するドナーベクターを含む。特定の実施形態では、ドナーベクターは、導入遺伝子をコードする核酸配列と、標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列と、を含む、発現カセットを含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、肝臓代謝障害又は他の遺伝性障害において異常に発現するタンパク質をコードする。導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９以外のタンパク質をコードする。そのようなタンパク質としては、ＯＴＣ、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）、第ＩＸ因子、例えば、配列番号５５若しくは５６に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列、及び第ＶＩＩＩ因子、例えば、配列番号５３若しくは５４に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【0058】
ドナーベクターを介して送達され得る更なる例示的な遺伝子としては、糖原病又は１Ａ型欠損症（ＧＳＤ１）に関連するグルコース－６－ホスファターゼ、ＰＥＰＣＫ欠損症に関連するホスホエノールピルビン酸－カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、発作及び重度の神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られているサイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、ガラクトース血症に関連するガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（例えば、配列番号６３若しくは６４に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＧＯ／ＨＡＯ１）（例えば、配列番号４９若しくは５０に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）及びＡＧＸＴ（例えば、配列番号４７若しくは４８に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）を含む原発性高シュウ酸尿症１型に関連する遺伝子産物、メープルシロップ尿症に関連するＢＣＫＤＨ、ＢＣＫＤＨ－Ｅ２、ＢＡＫＤＨ－Ｅ１ａ、及びＢＡＫＤＨ－Ｅ１ｂを含む分岐鎖α－ケト酸デヒドロゲナーゼ、チロシン血症１型に関連するフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、メチルマロン酸血症に関連するメチルマロニル－ＣｏＡムターゼ、中鎖アセチルＣｏＡ欠損症に関連する中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、シトルリン血症に関連するアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）（例えば、配列番号６９若しくは７０に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病Ｃ１型に関連するＮＰＣ１、プロピオン酸血症（ＰＡ）、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質（例えば、配列番号７３若しくは７４に示され
る配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列（例えば、ＷＯ２０１５／１６４７７８に記載されているものなどＬＤＬＲバリアント）、あるいは配列番号に示される配列、又は、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、認知症に関連するＡｐｏＥ及びＡｐｏＣタンパク質、クリグラー・ナジャー病に関連するリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）（例えば、配列番号６７若しくは６８に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ、重症複合免疫不全症に関連するアデノシンデアミナーゼ、痛風及びレッシュ・ナイハン症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチミダーゼ欠損症に関連するビオチミダーゼ、ファブリー病に関連するα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧａｌＡ）（例えば、配列番号７５若しくは７６に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連するβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、ウィルソン病に関連するＡＴＰ７Ｂ、ゴーシェ病２型及び３型に関連β－グルコセレブロシダーゼ（例えば、配列番号５１若しくは５２に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ツェルウェーガー症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ、異染性白質ジストロフィーに関連するアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、クラッベ病に関連するガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素、ポンペ病に関連するα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）（例えば、配列番号７９若しくは８０に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ニーマン・ピック病Ａ型に関連するスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子、カルノシナーゼ（ＣＮ１）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、カルバミルリン酸シンテターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）（アルギニノコハク酸尿症）（例えば、配列番号５７若しくは５８に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）及びアルギナーゼ（ＡＧ）、成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連するアルギニノコハク酸シンターゼ（ＷＯ２０１８／１４４７０９、参照により本明細書に援用される）、尿素サイクル障害に関連するカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、脊髄性筋萎縮症に関連する運動神経細胞生存（ＳＭＮ）タンパク質、ファーバー脂肪肉芽腫症に関連するセラミダーゼ、ＧＭ２ガングリオシドーシス及びテイ・サックス病及びサンドホフ病に関連するｂ－ヘキソサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミン尿症に関連するアスパルチルグルコサミニダーゼ、フコシドーシスに関連するα－フコシダーゼ、α－マンノシドーシスに関連するα－マンノシダーゼ、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連するポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、アルファ－１アンチトリプシン欠損症（肺気腫）の治療のためのα－１アルファ－１アンチトリプシン（例えば、配列番号７７若しくは７８に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、サラセミア又は腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン、虚血性疾患の治療のための血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、及び線維芽細胞増殖因子、アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症などに見られる閉塞した血管の治療のためのトロンボモジュリン及び組織因子経路阻害因子、パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）及びチロシンヒドロキシラーゼ（
ＴＨ）、うっ血性心不全の治療のためのβアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンス又はホスホランバンの変異型、筋小胞体アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、及び心臓アデニリルシクラーゼ、様々ながんの治療のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、炎症性障害、免疫障害、及びがんの治療のためのサイトカイン（例えば、様々なインターロイキンのうちの１つ）、筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィン若しくはミニジストロフィン及びユートロフィン若しくはミニユートロフィン、並びに糖尿病の治療のためのインスリン又はＧＬＰ－１が挙げられるが、これらに限定されない。
る配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列（例えば、ＷＯ２０１５／１６４７７８に記載されているものなどＬＤＬＲバリアント）、あるいは配列番号に示される配列、又は、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、認知症に関連するＡｐｏＥ及びＡｐｏＣタンパク質、クリグラー・ナジャー病に関連するリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）（例えば、配列番号６７若しくは６８に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ、重症複合免疫不全症に関連するアデノシンデアミナーゼ、痛風及びレッシュ・ナイハン症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチミダーゼ欠損症に関連するビオチミダーゼ、ファブリー病に関連するα－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧａｌＡ）（例えば、配列番号７５若しくは７６に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連するβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、ウィルソン病に関連するＡＴＰ７Ｂ、ゴーシェ病２型及び３型に関連β－グルコセレブロシダーゼ（例えば、配列番号５１若しくは５２に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ツェルウェーガー症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ、異染性白質ジストロフィーに関連するアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、クラッベ病に関連するガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素、ポンペ病に関連するα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）（例えば、配列番号７９若しくは８０に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ニーマン・ピック病Ａ型に関連するスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子、カルノシナーゼ（ＣＮ１）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、カルバミルリン酸シンテターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）（アルギニノコハク酸尿症）（例えば、配列番号５７若しくは５８に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）及びアルギナーゼ（ＡＧ）、成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連するアルギニノコハク酸シンターゼ（ＷＯ２０１８／１４４７０９、参照により本明細書に援用される）、尿素サイクル障害に関連するカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、脊髄性筋萎縮症に関連する運動神経細胞生存（ＳＭＮ）タンパク質、ファーバー脂肪肉芽腫症に関連するセラミダーゼ、ＧＭ２ガングリオシドーシス及びテイ・サックス病及びサンドホフ病に関連するｂ－ヘキソサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミン尿症に関連するアスパルチルグルコサミニダーゼ、フコシドーシスに関連するα－フコシダーゼ、α－マンノシドーシスに関連するα－マンノシダーゼ、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連するポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、アルファ－１アンチトリプシン欠損症（肺気腫）の治療のためのα－１アルファ－１アンチトリプシン（例えば、配列番号７７若しくは７８に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、サラセミア又は腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン、虚血性疾患の治療のための血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、及び線維芽細胞増殖因子、アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症などに見られる閉塞した血管の治療のためのトロンボモジュリン及び組織因子経路阻害因子、パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）及びチロシンヒドロキシラーゼ（
ＴＨ）、うっ血性心不全の治療のためのβアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンス又はホスホランバンの変異型、筋小胞体アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、及び心臓アデニリルシクラーゼ、様々ながんの治療のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、炎症性障害、免疫障害、及びがんの治療のためのサイトカイン（例えば、様々なインターロイキンのうちの１つ）、筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィン若しくはミニジストロフィン及びユートロフィン若しくはミニユートロフィン、並びに糖尿病の治療のためのインスリン又はＧＬＰ－１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0059】
送達のための好適な導入遺伝子の例としては、家族性高コレステロール血症（例えば、ＶＬＤＬｒ、ＬＤＬｒ、ＡｐｏＥ、例えば、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０２０／１３２１５５、ＷＯ２０１８／１５２４８５、ＷＯ２０１７／１００６８２を参照）、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、及び希少疾患又は奇病に関連するものが含まれ得る。そのような希少疾患の例としては、とりわけ、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えば、フラタキシン）、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、及び意味認知症を含む、非アルツハイマー性脳変性に関連する）が含まれ得る。他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ欠損症の治療のためのアルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマル酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、アカゲザルアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、グルコース－６－ホスファターゼ（例えば、配列番号５９若しくは６０に示される配列、又は配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、遺伝性血管浮腫に関連する血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）（例えば、配列番号６１若しくは６２に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ホモシスチン尿症に関連するシスタチオンβシンターゼ（例えば、配列番号６５若しくは６６に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列）、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、プロテインＨ、プロテインＴ、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニ又はマイクロジストロフィン］が挙げられる。更に他の有用な遺伝子産物は、酵素補充療法に有用であり得るような酵素を含み、これは酵素の不十分な活性に起因する様々な状態において有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含む酵素は、リソソーム蓄積症の治療に利用され得る（例えば、好適な遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子を含む）。送達のための好適な導入遺伝子の例としては、参照により本明細書に援用される、２０２０年１２月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／６６１６７、２０１９年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９５０，８３４号、及び２０２１年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１３６，０５９号に記載される、ＡＡＶベクターで送達されるヒトフラタキシンが挙げられ得る。送達のための好適な導入遺伝子の別の例としては、例えば、参照により本明細書に援用される、現在はＷＯ２０２０／２２３３６２Ａ１として公開されている、２０２０年４月３０
日のＰＣＴ／ＵＳ２０／３０４９３、現在はＷＯ２０２０／２２３３５６Ａ１として公開されている、２０２０年４月２０日のＰＣＴ／ＵＳ２０／３０４８４、２０１９年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，９１１号、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９１３，４０１号、２０２０年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０２４，９４１号、及び２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，６７７号に記載される、ＡＡＶベクターで送達されるヒト酸－α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）が含まれ得る。また、送達のための好適な導入遺伝子の別の例としては、例えば、参照により本明細書に援用される、現在はＷＯ２０１４／１５１３４１として公開されている２０１４年３月１３日のＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２５５０９、及び２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８８，７２４号に記載される、ＡＡＶベクターで送達されるヒトα－Ｌ－イドゥロニダーゼ（ＩＤＵＡ）が含まれ得る。
日のＰＣＴ／ＵＳ２０／３０４９３、現在はＷＯ２０２０／２２３３５６Ａ１として公開されている、２０２０年４月２０日のＰＣＴ／ＵＳ２０／３０４８４、２０１９年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，９１１号、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９１３，４０１号、２０２０年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０２４，９４１号、及び２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，６７７号に記載される、ＡＡＶベクターで送達されるヒト酸－α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）が含まれ得る。また、送達のための好適な導入遺伝子の別の例としては、例えば、参照により本明細書に援用される、現在はＷＯ２０１４／１５１３４１として公開されている２０１４年３月１３日のＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２５５０９、及び２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８８，７２４号に記載される、ＡＡＶベクターで送達されるヒトα－Ｌ－イドゥロニダーゼ（ＩＤＵＡ）が含まれ得る。
【0060】
他の有用な治療用産物としては、心筋を含む筋肉で発現されるものが挙げられる。導入遺伝子によってコードされる他の有用な治療用産物としては、ホルモン並びに増殖因子及び分化因子が含まれ、限定されないが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、形質転換増殖因子βスーパーファミリーのうちのいずれか１つ（ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン）、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１－１５のうちのいずれか、成長因子のヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ－３及びＮＴ－４／５）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうちのいずれか１つ、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、チロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。本明細書で有用な他の導入遺伝子としては、ムコ多糖症Ｉ－ＶＩＩ型（ＩＤＵＡ、ＩＤＳ、ＧＮＡ、ＨＧＳＮＡＴ、ＮＡＧＬＵ、ＳＧＳＨ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＧＵＳＢ）を治療するためのものが挙げられる。ＭＰＳＩを治療するのに有用な例示的な配列は、ＷＯ２０１９／０１０３３５に見出すことができる（参照により本明細書に援用される）。ＭＰＳＩＩを治療するのに有用な例示的な配列は、ＷＯ２０１９／０６０６６２に見出すことができる（参照により本明細書に援用される）。ＭＰＳＩＩＩａを治療するのに有用な例示的な配列は、ＷＯ２０１９／１０８８５７に見出すことができる（参照により本明細書に援用される）。ＭＰＳＩＩＩｂを治療するのに有用な例示的な配列は、ＷＯ２０１９／１０８８５６に見出すことができる（参照により本明細書に援用される）。
【0061】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子カセットは、プロモーター、導入遺伝子コード配列、及びポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＴＢＧプロモーター、ＴＢＧ－Ｓ１プロモーター、ＨＬＰプロモーター）又は本明細書に記載の他のプロモーターである。他の実施形態では、導入遺伝子は、プロモーターなしで提供され、天然ＰＳＣＫ９プロモーターの下流のゲノムに挿入される。
【0062】
導入遺伝子カセット、発現カセット、及び／又は（編集若しくはドナー）ベクターは、
エンハンサー、転写因子、転写終結因子、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）などの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡ、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を安定させる配列、翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を向上させる配列、並びに必要に応じて、コードされた産物の分泌を向上させる配列を含むが、これらに限定されない、１つ以上の適切な「調節エレメント」又は「調節配列」を含有し得る。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、及びＴＫポリＡが挙げられる。好適なエンハンサーの例としては、例えば、とりわけαフェトタンパク質エンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１－マイクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。これらの制御配列又は調節配列は、ヌクレアーゼコード配列又は導入遺伝子コード配列に作動可能に連結される。
エンハンサー、転写因子、転写終結因子、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）などの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡ、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を安定させる配列、翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を向上させる配列、並びに必要に応じて、コードされた産物の分泌を向上させる配列を含むが、これらに限定されない、１つ以上の適切な「調節エレメント」又は「調節配列」を含有し得る。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、及びＴＫポリＡが挙げられる。好適なエンハンサーの例としては、例えば、とりわけαフェトタンパク質エンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１－マイクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。これらの制御配列又は調節配列は、ヌクレアーゼコード配列又は導入遺伝子コード配列に作動可能に連結される。
【0063】
導入遺伝子カセットに加えて、特定の実施形態では、ドナーベクターはまた、導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同組換え（ＨＤＲ）アームを含み、内因性ゲノムへの導入遺伝子の相同組換えを促進する。相同性アームは、標的ＰＣＳＫ９遺伝子座に向けられ、様々な長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、ＨＤＲアームは、各々、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐの長さである。他の実施形態では、ＨＤＲアームは、各々、約１３０ｂｐ～約５００ｂｐである。他の実施形態では、ＨＤＲアームは、各々、約１００ｂｐ～約３００ｂｐである。他の実施形態では、ＨＤＲアームは、各々、約１００ｂｐ～約４００ｂｐである。他の実施形態では、ＨＤＲアームは、各々、約２５０ｂｐ～約５００ｂｐである。他の実施形態では、ＨＤＲアームは、各々、約３００ｂｐ～約５００ｂｐである。特定の実施形態では、ＨＤＲアームは、各々、約１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐ、２２５ｂｐ、２５０ｂｐ、２７５ｂｐ、３００ｂｐ、３２５ｂｐ、３５０ｂｐ、３７５ｂｐ、４００ｂｐ、４２５ｂｐ、４５０ｂｐ、４５０ｂｐ、４７５ｂｐ、又は５００ｂｐである。一実施形態では、ＨＤＲアームは、１３０ｂｐである。別の実施形態では、ＨＤＲアームは、１３７ｂｐである。他の実施形態では、ＨＤＲアームは、約１３０ｂｐ～１４０ｂｐである。別の実施形態では、ＨＤＲアームは、約５００ｂｐである。別の実施形態では、ＨＤＲアームは、存在しない。ＨＤＲアームは、理想的には、１００％の相補性である必要はないが、標的ＰＣＳＫ９遺伝子座と高レベルの相補性を共有する。いくつかの実施形態では、各ＨＤＲアームには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上のミスマッチが許される。ＰＣＳＫ９エクソン７を標的化するための好適なＨＤＲアーム配列は、配列番号２４～２９に示されている。一実施形態では、ＨＤＲアーム配列は、配列番号２４～２９から選択される。
【0064】
また、本明細書では、ＯＴＣ欠損症を有する患者に長期の治療効果を提供する、ゲノムのＰＣＳＫ９セーフハーバーにおけるＯＴＣ導入遺伝子カセットのヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みのための組成物、キット、及び方法も提供される。ＯＴＣの操作されたコード配列は、本明細書ではｈＯＴＣｃｏ２と称され、配列番号１７に示される。配列番号１７の配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９％の同一性を共有する配列を有する核酸が提供される。一実施形態では、核酸は、配列番号３０に示される天然ＯＴＣコード配列と、８０％未満、７９％未満、７８％未満、７７％未満、７６％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満、又は７０％未満の同一性を共有する。
【0065】
ＯＴＣの治療に有用な他の配列は、ＷＯ２０１５／１３８３４８及びＷＯ２０１５／１３８３５７に記載されている（参照により本明細書に援用される）。ＰＫＵの治療に有用な例示的な配列は、ＷＯ２０１８／１２６１１２に記載されている（参照により本明細書
に援用される）。他の配列は、配列番号７１若しくは７２に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列である。
に援用される）。他の配列は、配列番号７１若しくは７２に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列である。
【0066】
ウイルスベクター及び非ウイルスベクター
本明細書に記載の（遺伝子編集及びドナー）発現カセット又はコード配列は、標的細胞（例えば、肝細胞）への送達のために、任意の好適な遺伝エレメント（例えば、ベクター）に操作され得る。本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、当該核酸配列の複製又は発現のために適切な宿主細胞に導入され得る。一般的なベクターとしては、非ウイルスベクター及びウイルスベクターが挙げられる。本明細書で使用される場合、非ウイルス系は、ナノ粒子、エレクトロポレーションシステム、及び新規の生体材料、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、プラスミド、コスミド（Ｐｈｉｌｌｉｐ ＭｃＣｌｅａｎ、ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｅｄｕ／ｐｕｂｗｅｂ／～ｍｃｃｌｅａｎ／－ｐｌｓｃ７３１／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｃｌｏｎｉｎｇ４．ｈｔｍ）、並びに人工染色体（Ｇｏｎｇ，Ｓｈｉａｏｃｈｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔｌａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ ４２５．６９６１（２００３）：９１７－９２５）から選択され得る。一実施形態では、核酸は、本明細書に記載される、又は当該技術分野で既知の非ウイルスベクター又は脂質ナノ粒子を介して送達される。
本明細書に記載の（遺伝子編集及びドナー）発現カセット又はコード配列は、標的細胞（例えば、肝細胞）への送達のために、任意の好適な遺伝エレメント（例えば、ベクター）に操作され得る。本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、当該核酸配列の複製又は発現のために適切な宿主細胞に導入され得る。一般的なベクターとしては、非ウイルスベクター及びウイルスベクターが挙げられる。本明細書で使用される場合、非ウイルス系は、ナノ粒子、エレクトロポレーションシステム、及び新規の生体材料、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、プラスミド、コスミド（Ｐｈｉｌｌｉｐ ＭｃＣｌｅａｎ、ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｅｄｕ／ｐｕｂｗｅｂ／～ｍｃｃｌｅａｎ／－ｐｌｓｃ７３１／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｃｌｏｎｉｎｇ４．ｈｔｍ）、並びに人工染色体（Ｇｏｎｇ，Ｓｈｉａｏｃｈｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔｌａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ ４２５．６９６１（２００３）：９１７－９２５）から選択され得る。一実施形態では、核酸は、本明細書に記載される、又は当該技術分野で既知の非ウイルスベクター又は脂質ナノ粒子を介して送達される。
【0067】
特定の実施形態では、遺伝子編集成分は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化される。例えば、Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｍＲＮＡ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｈｉｇｈｌｙ
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ，２７（４）：８６６－８７７（Ａｐｒｉｌ ２０１９）（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む移送ビヒクルを指す。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１つ以上のｍＲＮＡを１つ以上の標的細胞（例えば、肝臓及び／又は筋肉）に送達するように製剤化される。好適な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）が含まれる。また、単独で、又は他の移送ビヒクルと組み合わせての、移送ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、及びポリエチレンイミンが含まれ得る。一実施形態では、移送ビヒクルは、標的細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。ｍＲＮＡに有用な脂質ナノ粒子は、タンパク質産生のためのデポーとして機能する標的細胞へのｍＲＮＡの送達をカプセル化及び／又は増強するための陽イオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、選択されたｐＨ、例えば、生理的ｐＨで正味の正電荷を担持するいくつかの脂質種のいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を用いる変動する比の多成分脂質混合物を含むことによって調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、コレステロール、イオン化性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及びカ
プセル化核酸の周囲に脂質二重層を形成するポリマーを含む慣例的な手順を使用して実施される（Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２７（４）：７１０－７２８）。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質ＤＯＰＥを有するカチオン性脂質（すなわち、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ））を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化性脂質Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡイオン化性脂質、又はジケトピペラジン系イオン化性脂質（ｃＫＫ－Ｅ１２）を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリ（β－アミノ）エステル（ＰＢＡＥ）を含む。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。特定の実施形態では、遺伝子編集成分は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含み、ＬＮＰは、ｇＲＮＡも含む。
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ，２７（４）：８６６－８７７（Ａｐｒｉｌ ２０１９）（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む移送ビヒクルを指す。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１つ以上のｍＲＮＡを１つ以上の標的細胞（例えば、肝臓及び／又は筋肉）に送達するように製剤化される。好適な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）が含まれる。また、単独で、又は他の移送ビヒクルと組み合わせての、移送ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、及びポリエチレンイミンが含まれ得る。一実施形態では、移送ビヒクルは、標的細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。ｍＲＮＡに有用な脂質ナノ粒子は、タンパク質産生のためのデポーとして機能する標的細胞へのｍＲＮＡの送達をカプセル化及び／又は増強するための陽イオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、選択されたｐＨ、例えば、生理的ｐＨで正味の正電荷を担持するいくつかの脂質種のいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を用いる変動する比の多成分脂質混合物を含むことによって調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、コレステロール、イオン化性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及びカ
プセル化核酸の周囲に脂質二重層を形成するポリマーを含む慣例的な手順を使用して実施される（Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２７（４）：７１０－７２８）。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質ＤＯＰＥを有するカチオン性脂質（すなわち、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ））を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化性脂質Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡイオン化性脂質、又はジケトピペラジン系イオン化性脂質（ｃＫＫ－Ｅ１２）を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリ（β－アミノ）エステル（ＰＢＡＥ）を含む。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。特定の実施形態では、遺伝子編集成分は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含み、ＬＮＰは、ｇＲＮＡも含む。
【0068】
本明細書で有用な特定のＬＮＰとしては、ＷＯ２０２１／０７７０６６及びＷＯ２０２１／０５５８９２に記載されているものが挙げられる（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。有用なＬＮＰとしては、肝臓への送達の増強を示すものが挙げられる。ＬＮＰ製剤は、肝臓送達を増強するために変動し得る。例えば、型及びイオン化可能な脂質：ｍＲＮＡ比、ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ比、イオン化可能な脂質のモル比、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質などが変動し得る。一実施形態では、ＬＮＰは、Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｈ．；Ｈｅａｒｔｌｅｉｎ，Ｍ．Ｗ．；ＤｅＲｏｓａ，Ｆ．；Ｍｉｒ，Ｆ．Ｆ．；Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏ．Ｓ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ
ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ａｎｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｓ．Ｎａｎｏ ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１５，１５（１１），７３００－７３０６（参照により本明細書に援用される）に記載されているものである。特定の実施形態では、ＬＮＰは、５：１～２５：１の間で変化するイオン化可能な脂質：ｍＲＮＡ重量比で設計される。特定の実施形態では、イオン化可能な脂質：ｍＲＮＡ重量比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２．５：１、１５：１、２０：１、又は２５：１である。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ重量比は、１：１、１：２、２：１、１：４、１：５、５：１、４：１、３：１、又は２：１である。
ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ａｎｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｓ．Ｎａｎｏ ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１５，１５（１１），７３００－７３０６（参照により本明細書に援用される）に記載されているものである。特定の実施形態では、ＬＮＰは、５：１～２５：１の間で変化するイオン化可能な脂質：ｍＲＮＡ重量比で設計される。特定の実施形態では、イオン化可能な脂質：ｍＲＮＡ重量比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２．５：１、１５：１、２０：１、又は２５：１である。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ重量比は、１：１、１：２、２：１、１：４、１：５、５：１、４：１、３：１、又は２：１である。
【0069】
他のＬＮＰも記載されており、本明細書で有用である。例えば、ＷＯ２０１６／１１８７２４、ＵＳ１０，４１３，６１８Ｂ２、ＵＳ１０，７２３，６９２Ｂ２、及びＵＳ８７５４０６２Ｂ２（これらの各々は、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【0070】
本明細書の特定の例は、ＡＡＶベクターゲノムにおける遺伝子編集成分（ヌクレアーゼ）コード配列及び導入遺伝子コード配列を含有するＡＡＶベクターの使用を例示する。しかしながら、本明細書に記載の構築物の使用は、ＡＡＶ構築物に限定されず、他のベクターに使用することができる。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、異なるベクター（例えば、組換えボカウイルス）にパッケージングされ得る。特定の実施形態では、発現カセットは、異なるウイルスベクターに、非ウイルスベクターに、及び／又は異なる送達系にパッケージングされ得る。特定の実施形態では、遺伝子編集成分は、ＬＮＰ中に提供される。
【0071】
「プラスミド」又は「プラスミドベクター」は、一般に、本明細書では、ベクター名の前及び／又は後に小文字のｐで示される。本発明に従って使用することができるプラスミ
ド、他のクローニング及び発現ベクター、それらの特性、並びにそれらの構築／操作方法は、当業者には容易に明らかである。一実施形態では、本明細書に記載される核酸配列又は本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを生成すること、及び／又は宿主細胞、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどへの送達に有用であり、その上で担持されるヌクレアーゼ配列を転写する、好適な遺伝要素（ベクター）に操作される。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む、任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
ド、他のクローニング及び発現ベクター、それらの特性、並びにそれらの構築／操作方法は、当業者には容易に明らかである。一実施形態では、本明細書に記載される核酸配列又は本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを生成すること、及び／又は宿主細胞、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどへの送達に有用であり、その上で担持されるヌクレアーゼ配列を転写する、好適な遺伝要素（ベクター）に操作される。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む、任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
【0072】
特定の実施形態では、発現カセットは、ウイルスカプシドへのパッケージングのためにベクターゲノムに位置する。例えば、ＡＡＶベクターゲノムについて、発現カセットの成分は、ＡＡＶ逆位末端反復配列によって５’最末端及び３’最末端に隣接される。例えば、５’ＡＡＶ ＩＴＲ、発現カセット、３’ＡＡＶ ＩＴＲ。他の実施形態では、自己相補性ＡＡＶが選択されてもよい。他の実施形態では、レトロウイルス系、レンチウイルスベクターシステム、又はアデノウイルス系が使用され得る。
【0073】
ＡＡＶベクター
特定の実施形態では、遺伝子編集ベクター及び／又はドナーベクターは、組換えＡＡＶとして提供される。「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシド内にパッケージングされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」又は「ＡＡＶベクター」という語句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子又は機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、後代を生成することができないため、「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージングされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’及び３’最末端に位置する。
特定の実施形態では、遺伝子編集ベクター及び／又はドナーベクターは、組換えＡＡＶとして提供される。「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシド内にパッケージングされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」又は「ＡＡＶベクター」という語句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子又は機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、後代を生成することができないため、「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージングされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’及び３’最末端に位置する。
【0074】
ＡＡＶカプシドの供給源は、数十種の天然に発生し、利用可能なアデノ随伴ウイルス、及び操作されたＡＡＶのうちのいずれかの１つであり得る。遺伝子編集ベクター及び／又はドナーベクターのためのＡＡＶカプシドの供給源は、一実施形態では、同じである。別の実施形態では、遺伝子編集ベクター及び／又はドナーベクターのためのＡＡＶカプシドの供給源は、異なる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中に、標的細胞に送達するための核酸配列がパッケージングされる。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上述のＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９、ＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）及びＷＯ２０１８／１６０５８２（ＡＡＶｈｕ６８）も参照されたい
。これらの文献は、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶも記載し、参照により組み込まれる。
。これらの文献は、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶも記載し、参照により組み込まれる。
【0075】
別途指定されない限り、本明細書に記載されるＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７９、及びＡＡＶＰＨＰ．Ｂとして一般的に同定されるＡＡＶ、並びに既知の若しくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、又は未だ発見されていないＡＡＶ若しくはそのバリアント、又はそれらの混合物を含む任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、参照により本明細書に援用される、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシド若しくはそのバリアント、ＡＡＶ８カプシド若しくはそのバリアント、ＡＡＶ９カプシド若しくはそのバリアント、ＡＡＶｈｕ．６８カプシド若しくはそのバリアント、ＡＡＶｒｈ．１０カプシド若しくはそのバリアント、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１カプシド若しくはそのバリアント、ＡＡＶｈｕ．３７カプシド若しくはそのバリアント、又はＡＡＶ３Ｂ若しくはそのバリアントである。一態様では、カプシドは、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドである。例えば、ＷＯ２０１９／１６８９６１及びＷＯ２０１９／１６９００４（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。他の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ７９カプシド又はそのバリアントである。他の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ．９０又はそのバリアントである。
【0076】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ３７カプシドを含む。ＡＡＶｈｕ３７カプシドは、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号３８の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８でのアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号３８の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、配列番号３８のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化をもたらす。ＡＡＶｈｕ３７は、ＡＡＶｈｕ３７ ＶＰ１（配列番号３８）の番号付けに基づいて、例えばＮ５７位、Ｎ２６３位、Ｎ３８５位、及び／又はＮ５１４位に高度脱アミド化残基を有することによって特徴付けされる。
【0077】
脱アミド化は、以下の表に示されるように、他の残基において、及び、例えば、ＷＯ２０１９／１６８９６１（２０１９年９月６日公開、参照により本明細書に援用される）において観察されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７カプシドは、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。例えば、特定の実施形態では、Ｇは、例えば、５８位、２６４位、３８６位、又は５１５位でＳ又はＡに修飾され得る。一実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７カプシドは、Ｎ５７位／Ｇ５８位からＮ５７Ｑ位又はＧ５８Ａ位で修飾され、この位置で減少した脱アミド化を有するカプシドを得る。別の実施形態では、Ｎ５７／Ｇ５８は、ＮＳ５７／５８又はＮＡ５７／５８に改変される。しかしながら、特定の実施形態では、ＮＧがＮＳ又はＮＡに改変される場合、脱アミド化の増加が観察される。特定の実施形態では、ＮＧ対のＮは、Ｇを保持しながらＱに修飾される。特定の実施形態では、ＮＧ対の両方のアミノ酸が修飾される。特定の実施形態では、Ｎ３８５Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な低減をもたらす。特定の実施形態では、Ｎ４９９Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な増加をもたらす。
【0078】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７は、これら又は他の残基が、例えば、典型的には
１０％未満で脱アミド化され得、かつ／又はメチル化（例えば、～Ｒ４８７）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満）、異性化（例えば、Ｄ９７で）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満、リン酸化（例えば、存在する場合、約１０～約６０％、又は約１０～約３０％、又は約２０～約６０％の範囲）（例えば、Ｓ１４９、～Ｓ１５３、～Ｓ４７４、～Ｔ５７０、～Ｓ６６５のうちの１つ以上で）、若しくは酸化（例えば、Ｗ２４８、Ｗ３０７、Ｗ３０７、Ｍ４０５、Ｍ４３７、Ｍ４７３、Ｗ４８０、Ｗ４８０、Ｗ５０５、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６１、Ｗ６２１、Ｍ６３７、及び／又はＷ６９７のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意選択的に、Ｗは、キヌレニンに酸化され得る。
１０％未満で脱アミド化され得、かつ／又はメチル化（例えば、～Ｒ４８７）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満）、異性化（例えば、Ｄ９７で）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満、リン酸化（例えば、存在する場合、約１０～約６０％、又は約１０～約３０％、又は約２０～約６０％の範囲）（例えば、Ｓ１４９、～Ｓ１５３、～Ｓ４７４、～Ｔ５７０、～Ｓ６６５のうちの１つ以上で）、若しくは酸化（例えば、Ｗ２４８、Ｗ３０７、Ｗ３０７、Ｍ４０５、Ｍ４３７、Ｍ４７３、Ｗ４８０、Ｗ４８０、Ｗ５０５、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６１、Ｗ６２１、Ｍ６３７、及び／又はＷ６９７のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意選択的に、Ｗは、キヌレニンに酸化され得る。
【表1】
【0079】
更に他の位置は、これら又は他の修飾（例えば、アセチル化又は更なる脱アミド化）を有し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ３７ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３７で提供される。他の実施形態では、配列番号３７と７０％～９９．９％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｈｕ３７カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一である。しかしながら、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ３７カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７の核酸配列、又は配列番号３８をコードする配列番号３７と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７の核酸配列、又は配列番号３７の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１４と、少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３８のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３８）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７の約ｎｔ６１０～約ｎｔ２２１４の核酸配列、又は配列番号３７のｎｔと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３８のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０４～７３８）をコードする。ＥＰ２３４５７３１Ｂ１及びその中の配列番号８８（参照により援用される）を参照されたい。
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３８のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３８）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３７の約ｎｔ６１０～約ｎｔ２２１４の核酸配列、又は配列番号３７のｎｔと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３８のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０４～７３８）をコードする。ＥＰ２３４５７３１Ｂ１及びその中の配列番号８８（参照により援用される）を参照されたい。
【0080】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８カプシドを含む。ＡＡＶ８カプシドは、質量分析を使用して決定される、カプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表に定義されるように脱アミド化されるＶＰアイソフォームの異種集団を含む。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に援用される。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定されるように、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、以下に示される位置の１つとは異なる位置に導入される。特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。例えば、特定の実施形態では、Ｇは、例えば、５８位、６７位、９５位、２１６位、２６４位、３８６位、４１１位、４６０位、５００位、５１５位、又は５４１位でＳ又はＡに修飾され得る。ＮＧ５７／５８がＮＳ５７／５８又はＮＡ５７／５８に改変される場合、脱アミド化の有意な減少が観察される。しかしながら、特定の実施形態では、ＮＧがＮＳ又はＮＡに改変される場合、脱アミド化の増加が観察される。特定の実施形態では、ＮＧ対のＮは、Ｇを保持しながらＱに修飾される。特定の実施形態では、ＮＧ対の両方のアミノ酸が修飾される。特定の実施形態では、Ｎ３８５Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な低減をもたらす。特定の実施形態では、Ｎ４９９Ｑは、その位置における脱アミド化の有意な増加をもたらす。特定の実施形態では、ＮＧ変異は、Ｎ２６３（例えば、Ｎ２６３Ａ）に位置する対に作製される。特定の実施形態では、ＮＧ変異は、Ｎ５１４（例えば、Ｎ５１４Ａ）に位置する対に作製される。特定の実施形態では、ＮＧ変異は、Ｎ５４０（例えば、Ｎ５４０Ａ）に位置する対に作製される。特定の実施形態では、複数の変異及びこれらの位置での変異の少なくとも１つを含むＡＡＶ変異が操作される。特定の実施形態では、変異は、Ｎ５７位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ９４位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ３０５位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｇ３８６位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｑ４６７位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ４７９位に作製されない。特定の実施形態では、変異は、Ｎ６５３位に作製されない。特定の実施形態では、カプシドは、「ＮＧ」対以外の位置で「Ｎ」又は「Ｑ」を減少させるように修飾される。残基番号は、配列番号３６に再現される公開されたＡＡＶ８配列に基づく。
【表2-1】
【表2-2】
【0081】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、２０１９年９月６日に公開されたＷＯ２０１９／１６９００４（参照により本明細書に援用される）に記載されているようなＡＡＶｒｈ７９カプシドを含む。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７９カプシドは、ＡＡＶｒｈ７９ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶｒｈ７９ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶｒｈ７９ ｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７９カプシドは、配列番号３４の１～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列から発現することにより産生される。任意選択的に、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～１３７）又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～２０３）を除く核酸配列からのｖｐ３タンパク質、配列番号３３から産生されるｖｐ１タンパク質、又は配列番号３４の１～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質を共発現する配列。他の実施形態では、配列番号３４の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｒｈ７９ ｖｐ２タンパク質、配列番号３３の少なくともヌクレオチド４１２～２２１４を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号３４の少なくともアミノ酸約１３８～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号３３の少なくともヌクレオチド４１２～２２１４と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号３４の少なくともアミノ酸約２０４～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｒｈ７９ ｖｐ３タンパク質、配列番号３３の少なくともヌクレオチド６１０～２２１４を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号３４の少なくとも約アミノ酸２０４～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号３３の少なくともヌクレオチド６１０～２２１４と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質。
【0082】
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７９カプシドは、配列番号３４のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号３４の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８でのアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タン
パク質の異種集団、及び配列番号３４の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。
パク質の異種集団、及び配列番号３４の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。
【0083】
ＡＡＶｒｈ７９ ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、配列番号３４におけるアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化をもたらす。配列番号３４の数と比較して、Ｎ－Ｇ対Ｎ５７、Ｎ２６３、Ｎ３８５、及び／又はＮ５１４で高いレベルの脱アミド化が観察される。脱アミド化は、以下の表及び実施例に示されるように、他の残基において観察されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７９は、他の残基が、例えば、典型的には１０％未満で脱アミド化され得、かつ／又はメチル化（例えば、～Ｒ４８７）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満）、異性化（例えば、Ｄ９７で）（典型的には、所与の残基で５％未満、より典型的には１％未満、リン酸化（例えば、存在する場合、約１０～約６０％、又は約１０～約３０％、又は約２０～約６０％の範囲）（例えば、Ｓ１４９、～Ｓ１５３、～Ｓ４７４、～Ｔ５７０、～Ｓ６６５のうちの１つ以上で）、若しくは酸化（例えば、Ｗ２４８、Ｗ３０７、Ｗ３０７、Ｍ４０５、Ｍ４３７、Ｍ４７３、Ｗ４８０、Ｗ４８０、Ｗ５０５、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６１、Ｗ６２１、Ｍ６３７、及び／又はＷ６９７のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意選択的に、Ｗは、キヌレニンに酸化され得る。
【表3】
【0084】
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７９カプシドは、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される、上記の表で特定された位置の１つ以上で、以下に示す範囲で修飾される。特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。残基番号は、本明細書に提供されるＡＡＶｒｈ７
９配列に基づく。配列番号３４を参照されたい。
９配列に基づく。配列番号３４を参照されたい。
【0085】
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７９ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３３で提供される。他の実施形態では、配列番号３３と７０％～９９．９％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｒｈ７９カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号３３と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％、又は９９．９％同一である。しかしながら、配列番号３４のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶカプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３３の核酸配列、又は配列番号３４をコードする配列番号３３と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３３の核酸配列、又は配列番号３３の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１４と少なくともと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号３４のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３８）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３３の約ｎｔ６１０～約ｎｔ２２１４の核酸配列、又は配列番号３４のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０４～７３８）をコードする配列番号３３のｎｔと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する。
【0086】
本発明はまた、変異体ＡＡＶｒｈ７９をコードする核酸配列を包含し、１つ以上の残基は、本明細書で特定される脱アミド化又は他の修飾を低減させるために改変されている。かかる核酸配列は、変異体ｒＡＡＶｒｈ７９カプシドの産生において使用することができる。
【0087】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、２０２０年１１月５日に公開されたＷＯ２０２０／２２３２３２（参照により本明細書に援用される）に記載されているＡＡＶｒｈ．９０カプシドを含む。更なる態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供され、これは、（Ａ）ＡＡＶｒｈ．９０カプシドであって、（１）配列番号４０の１～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号３９から産生されるｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号４０の１～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３９と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９０ ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号４０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号３９の少なくともヌクレオチド４１２～２２１４を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号４０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３９の少なくともヌクレオチド４１２～２２１４と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９０ ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号４０の少なくとも約アミノ酸２０４～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号３９の少なくともヌクレオチド６１０～２２１４を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号４０の少なくとも約アミノ酸２０４～７３８の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３９の少なくともヌクレオチド６１０～２２１４と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９０ ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／又は（２）配列番号４０のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号４０の
少なくとも約アミノ酸１３８～７３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号４０の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号４０のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ．９０カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、及び宿主細胞における産物の発現を指示する配列と作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。
少なくとも約アミノ酸１３８～７３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号４０の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号４０のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ．９０カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、及び宿主細胞における産物の発現を指示する配列と作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。
【0088】
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９０のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、配列番号４０のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす。配列番号４０の数と比較して、Ｎ－Ｇ対の～Ｎ５７、～Ｎ２６３、～Ｎ３８５、及び／又は～Ｎ５１４で、高いレベルの脱アミド化が観察される。以下の表に示されるように、脱アミド化は、他の残基において観察されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９０は、脱アミド化された他の残基を有し得（例えば、～Ｎ３０５、～Ｎ４９９、及び／若しくは～Ｎ５９９、典型的には２０％未満）、かつ／又はリン酸化（例えば、Ｓ１４９で）（例えば、存在する場合、約２～約３０％、又は約２～約２０％、若しくは約２～約１０％の範囲で）、又は酸化（例えば、～Ｗ２３、～Ｍ２０４、～Ｍ２１２、Ｗ２４８、Ｗ２８２、Ｍ４０５、Ｍ４７３、Ｗ４８０、Ｗ５０５、Ｍ５２６、～Ｎ５４４、Ｍ５６１、及び／若しくは～Ｍ６０７のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意選択的に、Ｗは、キヌレニンに酸化され得る。
【表4】
【0089】
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドは、上記の表で特定される１つ以上の位置、提供される範囲で修飾されており、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される。特定の実施形態では、１つ以上の位置、又はＮに続くグリシンは、本明細書に記載されるように修飾されている。残基番号は、本明細書に提供されるＡＡＶｒｈ．９０配列に基づく。配列番号４０を参照されたい。
【0090】
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドは、配列番号４０のアミノ酸配列をコ
ードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号４０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８でのアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号４０の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。
ードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号４０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３８でのアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号４０の少なくともアミノ酸２０４～７３８をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。
【0091】
特定の実施形態では、パルボウイルスベクターカプシドは、肝臓トロピズムについて選択され、治療される患者が、肝臓代謝障害を有する。特定の実施形態では、パルボウイルスベクターカプシドは、心臓トロピズムについて選択され、治療される患者が、心臓障害を有する。特定の実施形態では、パルボウイルスベクターカプシドは、骨格筋の細胞トロピズムについて選択され、治療される患者が、筋肉障害を有する。
【0092】
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシド内にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の実施例では、ベクターゲノムは、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、その発現を指示する調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子又はコード配列を含む発現カセット、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ＩＴＲは、ベクター生成の際にゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝エレメントであり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルスシスエレメントである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、利便性のために使用され得る、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲと、遺伝子産物をコードする核酸配列と、任意の制御性配列と、ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含む。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。一実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、５’ＩＴＲの短縮バージョン（ΔＩＴＲと呼ばれる）が記載されている。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１３０塩基対の短縮されたＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、ここで、外部「ａ」要素は欠失している。短縮されたＩＴＲは、内部Ａ要素をテンプレートとして使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長に戻される。他の実施形態では、全長ＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲが使用される。他の実施形態では、全長ＩＴＲ又は操作されたＩＴＲが選択され得る。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、又は全長ＩＴＲ以外が選択され得る。ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲが使用され得る。好適なＩＴＲ配列の例は、配列表、例えば、配列番号４２、ｎｔ１～１３０及び３０５２～３１８１に示される。更に、ベクターゲノムは、（例えば、転写及び／又は翻訳を調節することによって、直接的又は間接的に）遺伝子産物の発現を直接調節する制御配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。
【0093】
特定の実施形態では、遺伝子編集ベクターゲノムは、ＴＢＧプロモーター、１つ以上のαＭＩＣ／ｂｉｋエンハンサー、ＡＲＣＵＳメガヌクレアーゼのコード配列、任意選択的に、ＷＰＲＥ、及びポリＡを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号４２のｎｔ２１１～ｎｔ２９６４を含み、５’及び３’ＩＴＲに隣接する。
【0094】
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明に有用なプラスミドは、特に、インビトロで原核細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞に複製及びパッケージングするのに好適であるように操作され得る。好適なトランスフェクション技法及びパッケージング宿主細胞は、既知であり
、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。
、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。
【0095】
ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成及び単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々全体が参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々全体が参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
【0096】
「ＡＡＶ中間体」又は「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、それにパッケージングされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。かかるカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を含んでいなくてもよく、又は遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージングされたゲノム配列のみを含んでいてもよい。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。
【0097】
本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能性ｒｅｐ遺伝子、少なくとも、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子で構成される発現カセット、並びに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。カプシドを生成する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
【0098】
一実施形態では、組換えＡＡＶを産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシドへのパッケージングに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ及び宿主細胞中の産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含有するベクターゲノム、並びに組換えＡＡＶカプシドへの核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含有する。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけ、ヒト胎児腎臓２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）からなる。
【0099】
任意選択的に、ｒｅｐ機能は、カプシドを提供するＡＡＶ以外のＡＡＶによって提供される。例えば、ｒｅｐは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ｒｅｐタンパク質、又はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、及びｒｅｐ４０／５２、又はそれらの断片、又は別の供給源であり得る。任意選択的に、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、細胞培養物中の同じ遺伝エレメント上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し得る。これらのＡＡＶ又は変異体ＡＡＶカ
プシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性調節制御配列の制御下にあり得る。
プシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性調節制御配列の制御下にあり得る。
【0100】
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法には、遺伝子療法ベクターの産生に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの、当該技術分野で周知の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、並びにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、並びにベクター含有細胞及び培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。回収されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。更に別のシステムでは、遺伝子療法ベクターは、バキュロウイルスベースのベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい（その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい（その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。
【0101】
粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物のダイアフィルトレーション、ベクター回収物の微小流動化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、微小流動化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過によるバッファー交換、並びに／又はバルクベクターを調製するための製剤化及び濾過などの、方法ステップに供され得る。
【0102】
高塩濃度での２ステップのアフィニティクロマトグラフィ精製、続いてアニオン交換樹脂クロマトグラフィを用いて、ベクター薬物産物を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、国際特許公開第２０１７／１６０３６０号に更に詳細に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ８についての国際特許公開第２０１７／１００６７６号、及びｒｈ１０についての国際特許公開第２０１７／１００７０４号、及びＡＡＶ１についての国際特許公開第２０１７／１００６７４号の精製方法は、全て参照により本明細書に援用される。
【0103】
空及び充填粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされている。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、被験試料のピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。ロードされた２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に、次いで５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割ることにより、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）が得られる。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛けることにより、空粒子のパーセンテージが得られ
る。
る。
【0104】
一般に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性されたカプシドについて試験するために、本方法は、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル、例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲルからなる、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理されたＡＡＶストックを供し、次いで試料材料が分離されるまでゲルを泳動し、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくは、ナイロンにゲルをブロットすることを含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクマシー色素を用いて、銀染色を実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅＩ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用可能である。
【0105】
一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化の後に、試料がプロテイナーゼＫバッファーで希釈され、プロテイナーゼＫで処理され、続いて熱不活性化されることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分～約３０分）にわたって、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分）行われてもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～
約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分～約３０分）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分～約３０分）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
【0106】
加えて又はあるいは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。ｄｄＰＣＲ法は、カプシド化ベクターゲノムの濃度を直接測定する。試料をＤＮａｓｅＩで処理して、試料中に存在する任意の非カプシド化ＤＮＡを消化し、続いて、プロテイナーゼＫで処理してカプシドを破壊する。次いで、試料を、アッセイ範囲に適合するように希釈する。試料を、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘと混合し、ＰＣＳＫ９遺伝子に特異的なメガヌクレアーゼ（Ｍ２ＰＣＳＫ９）を標的化する配列特異的プライマーをこの同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識プローブと組み合わせて使用して、検出を達成する。２０マイクロリットルのｄｄＰＣＲ反応混合物を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ液滴生成器で処理し、ｄｄＰＣＲ反応混合物を≧１０，０００の液滴に分割する。液滴生成後、ｄｄＰＣＲ反応混合物をＰＣＲ増幅し、増幅したｄｄＰＣＲ反応混合物をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒを使用して読み取る。
【0107】
感染ユニット（ＩＵ）アッセイを使用して、ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２を発現するＨｅＬａ細胞）におけるｒＡＡＶベクターの生産的取込み及び複製を測定することができる。以前公開されたものと同様の９６－ウェルエンドポイント形式を用いた。簡潔に言うと、ＲＣ３２細胞は、ｒＡＡＶの各希釈において１２レプリケートで、ｒＡＡＶ ＢＤＳの段階希釈液及びＡｄ５の均一希釈液によって同時感染される。感染の７２時間後、細胞を溶解し、ｑＰＣＲを実施して、インプットに対するｒＡＡＶベクター増幅を検出する。エンドポイント希釈５０％の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）の計算（Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ）は、感染力価を測定するために行われ、ＩＵ／ｍＬとして表される。「感染性」値は、細胞と接触する各粒子、受容体結合、内部移行、核への輸送、及びゲノム複製に依存するので、それらは、アッセイ幾何学、並びに使用される細胞株における適切な受容体の存在、及び結合後経路によって影響を受ける。受容体及び結合後経路は、不死化細胞株において通常は維持されず、故に、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の数の絶対的尺度ではない。しかしながら、カプシドに封入されたＧＣ対「感染ユニット」の比（ＧＣ／ＩＵ比として記載される）は、ロットからロットへの産物一貫性の尺度として使用されることができる。
【0108】
簡潔に言うと、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィに供することを含み、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ中間体は、高ｐＨで平衡化された強力アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０で紫外吸光度のために溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｐＨは、選択されたＡＡＶに応じて調節され得る。例えば、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／１６０３６０（ＡＡＶ９）、ＷＯ２０１７／１００７０４（ＡＡＶｒｈ１０）、ＷＯ２０１７／１００６７６（例えば、ＡＡＶ８）、及びＷＯ２０１７／１００６７４（ＡＡＶ１）］を参照されたい。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達すると溶出される画分から回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用し
てもよい。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。
てもよい。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。
【0109】
デュアルベクターシステム
別の態様では、遺伝性障害を治療するためのデュアルベクターシステムが提供される。システムは、（ａ）遺伝子編集成分であって、ＰＣＳＫ９を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列、及び任意選択的に、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集成分と、（ｂ）ドナーベクターであって、ＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、本システムが、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含む。システムは、任意選択的に、例えば、誘導性プロモーターを用いた誘導剤の使用を介して、デュアルベクターシステムを用いた投与後に、標的細胞中の天然ＰＣＳＫ９がアブレーション又は低減されることを可能にする成分を含む。一実施形態では、遺伝子編集成分は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットと、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列と、を含む、遺伝子編集ベクターに含まれる。デュアルベクターの成分は、本明細書に記載されるものと同じである。
別の態様では、遺伝性障害を治療するためのデュアルベクターシステムが提供される。システムは、（ａ）遺伝子編集成分であって、ＰＣＳＫ９を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列、及び任意選択的に、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集成分と、（ｂ）ドナーベクターであって、ＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、本システムが、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含む。システムは、任意選択的に、例えば、誘導性プロモーターを用いた誘導剤の使用を介して、デュアルベクターシステムを用いた投与後に、標的細胞中の天然ＰＣＳＫ９がアブレーション又は低減されることを可能にする成分を含む。一実施形態では、遺伝子編集成分は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットと、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列と、を含む、遺伝子編集ベクターに含まれる。デュアルベクターの成分は、本明細書に記載されるものと同じである。
【0110】
このシステムは、遺伝子編集成分とドナーベクターとの比が約１～約１である場合に有効であり得るが、ドナー鋳型ベクターが遺伝子編集成分より多く存在することが望ましい。一実施形態では、編集ベクター（ａ）とドナーベクター（ｂ）との比は、約１：３～約１：１００、又は約１：１０である。遺伝子編集酵素（例えば、Ｃａｓ９又はメガヌクレアーゼ）とドナー鋳型とのこの比は、酵素がＡＡＶベクター以外の供給源によって追加的又は代替的に供給される場合でも維持され得る。
【0111】
一実施形態では、デュアルベクターシステムは、遺伝子編集ＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、メガヌクレアーゼをコードする配列であって、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるメガヌクレアーゼの発現を指示する調節配列の制御下でＰＣＳＫ９を標的化する、配列、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクター、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0112】
別の実施形態では、デュアルベクターシステムは、遺伝子編集ＡＡＶであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるＳａＣａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶ、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0113】
別の実施形態では、デュアルベクターシステムは、遺伝子編集ＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、当
該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるＣａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクター、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるＣａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクター、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0114】
本明細書に記載のシステムの特定の実施形態では、遺伝子編集ＡＡＶベクタードナーＡＡＶベクターは、同じＡＡＶカプシドを有する。他の実施形態では、遺伝子編集ＡＡＶベクター及びドナーＡＡＶベクターは、異なるＡＡＶカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ３Ｂ、ｈｕ３７、ｒｈ７９、及びｒｈ６４から選択される。
【0115】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９から選択される。
ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９から選択される。
【0116】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼ及び／又は導入遺伝子は、組織特異的プロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ及び／又は導入遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ及び／又は導入遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ及び／又は導入遺伝子は、肝臓特異的プロモーター、任意選択的に、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、又はハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）の制御下にある。特定の実施形態では、本システムは、誘導剤を更に含む。
【0117】
別の実施形態では、システムは、（ａ）遺伝子編集成分であって、ＰＣＳＫ９を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列、及びＬＮＰにカプセル化されたＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集成分と、（ｂ）ドナーベクターであって、ＬＮＰにカプセル化されたＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、本システムが、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含む。システムは、任意選択的に、例えば、誘導性プロモーターを用いた誘導剤の使用を介して、デュアルベクターシステムを用いた投与後に、標的細胞中の天然ＰＣＳＫ９がアブレーション又は低減されることを可能にする成分を含む。
【0118】
別の実施形態では、システムは、（ａ）遺伝子編集成分であって、ＰＣＳＫ９を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列、及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含み、遺伝子編集成分が、ＡＡＶベクターを介して提供される、遺伝子編集成分と、（ｂ）ドナーベクターであって、ＬＮＰにカプセル化されたＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、本システムが、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含む。システムは、任意選択的に、例えば、誘導性プロモーターを用いた誘導剤の使用を介して、デュアルベクターシステムを用いた投与後に、標的細胞中の天然ＰＣＳＫ９がアブレーション又は低減されることを可能にする成分を含む。
【0119】
別の実施形態では、システムは、（ａ）遺伝子編集成分であって、ＰＣＳＫ９を標的化
するヌクレアーゼをコードする核酸配列、及びＬＮＰにカプセル化されたＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集成分と、（ｂ）ドナーベクターであって、ＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、ドナーベクターが、ＡＡＶベクターであり、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、本システムが、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含む。システムは、任意選択的に、例えば、誘導性プロモーターを用いた誘導剤の使用を介して、デュアルベクターシステムを用いた投与後に、標的細胞中の天然ＰＣＳＫ９がアブレーション又は低減されることを可能にする成分を含む。
するヌクレアーゼをコードする核酸配列、及びＬＮＰにカプセル化されたＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集成分と、（ｂ）ドナーベクターであって、ＰＣＳＫ９遺伝子座からの発現のための外因性産物をコードする核酸配列を含み、ドナーベクターが、ＡＡＶベクターであり、挿入された核酸配列が、ＰＣＳＫ９をコードしない、ドナーベクターと、を含み、本システムが、ヌクレアーゼに、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座を特異的に標的化するように指示する配列を更に含む。システムは、任意選択的に、例えば、誘導性プロモーターを用いた誘導剤の使用を介して、デュアルベクターシステムを用いた投与後に、標的細胞中の天然ＰＣＳＫ９がアブレーション又は低減されることを可能にする成分を含む。
【0120】
一実施形態では、デュアルベクターシステムは、（ａ）ｍＲＮＡを含むＬＮＰであって、ｍＲＮＡが、メガヌクレアーゼをコードし、メガヌクレアーゼが、ＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるメガヌクレアーゼの発現を指示する調節配列の制御下でＰＣＳＫ９を標的化する、ＬＮＰ、並びに（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0121】
別の実施形態では、デュアルベクターシステムは、（ａ）ＬＮＰであって、Ｃａｓ９をコードする配列を含む核酸と、ｓｇＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡと、を含む、ＬＮＰ、並びに（ｂ）ドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。Ｃａｓ９をコードする配列は、ｍＲＮＡとして提供される。
【0122】
別の実施形態では、デュアルベクターシステムは、遺伝子編集ＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡであって、ＰＣＳＫ９遺伝子における標的部位に特異的に結合する少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、当該標的部位が、Ｃａｓ９によって特異的に認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側にある、ｓｇＲＮＡ、５’核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｃａｓ９をコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるＣａｓ９の発現を指示する調節配列、３’ＮＬＳ、及び３’ＩＴＲを含む、第１のベクターゲノムと、を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクター、並びにドナーＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、５’ＩＴＲ、５’相同組換え（ＨＤＲ）アーム、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列、３’ＨＤＲアーム、及び３’ＩＴＲを含む、第２のベクターゲノムと、を含む、ドナーＡＡＶベクター、を含む。
【0123】
薬学的組成物
別の態様では、薬学的組成物が提供され、これは、ｒＡＡＶ遺伝子編集ベクターを含む第１のｒＡＡＶストックであって、ｒＡＡＶ遺伝子編集ベクターが、ＰＣＳＫ９を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、発現カセットを含む、第１のｒＡＡＶストックと、ｒＡＡＶドナーベクターを含む、第２のｒＡＡＶストックであって、ｒＡＡＶドナーベクターが、導入遺伝子をコードする核酸配列及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含む、導入遺伝子カセットを含む、第２のｒＡＡＶストックと、を含む。薬学的組成物は、任意選択的な担体、賦形剤、及び／又は防腐剤を含有する。いくつかの実施形態では、ドナーベクターは、導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同
組換え（ＨＤＲ）アームを更に含む。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ７９カプシドである。別の実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドである。別の実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドである。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドである。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ．６８カプシドである。
別の態様では、薬学的組成物が提供され、これは、ｒＡＡＶ遺伝子編集ベクターを含む第１のｒＡＡＶストックであって、ｒＡＡＶ遺伝子編集ベクターが、ＰＣＳＫ９を標的化するヌクレアーゼをコードする核酸配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、発現カセットを含む、第１のｒＡＡＶストックと、ｒＡＡＶドナーベクターを含む、第２のｒＡＡＶストックであって、ｒＡＡＶドナーベクターが、導入遺伝子をコードする核酸配列及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含む、導入遺伝子カセットを含む、第２のｒＡＡＶストックと、を含む。薬学的組成物は、任意選択的な担体、賦形剤、及び／又は防腐剤を含有する。いくつかの実施形態では、ドナーベクターは、導入遺伝子カセットの５’及び３’側に相同
組換え（ＨＤＲ）アームを更に含む。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ７９カプシドである。別の実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ．９０カプシドである。別の実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドである。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドである。一実施形態では、ドナーベクター、遺伝子編集ベクター、又はその両方のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ．６８カプシドである。
【0124】
本明細書で使用される場合、「担体」は、任意及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁物、コロイドなどを含む。薬学的な活性物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などのような送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクター送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。
【0125】
一実施形態では、組成物は、対象への送達に好適な最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨ及び塩濃度まで緩衝された水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。
【0126】
製剤を作製するための当該技術分野で周知の方法及び薬剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に記載されている。製剤は、例えば、賦形剤、担体、安定剤、若しくは希釈剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、若しくは水素化ナフタレン、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル、塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、及びリジン、単糖類、二糖類、並びにグルコース、マンノース、及びデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含有してもよい。
【0127】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合によって調製された、マイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マ
イクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセルに封入されてもよい。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
イクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセルに封入されてもよい。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【0128】
好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、８４００の平均分子量を有する、ポロキサマー１８８としても知られている、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、第一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を示し、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量パーセントを示す。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。
【0129】
ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供して、過度の悪影響なしに、又は医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来及び薬学的に許容される投与経路には、所望の臓器（例えば、肝臓（任意で肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、及び他の親の投与経路への直接送達が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
【0130】
ウイルスベクターの投与量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの因子に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの約１×１０９～１×１０１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含む溶液の範囲である。投与量は、任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるように調整され、かかる投与量は、組換えベクターが利用される治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター（好ましくは、ミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクター）をもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投与レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫化に利用され得る。
【0131】
ベクター組成物は、ヒト患者にとって、範囲内の全ての整数又は分数を含む、（体重７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣの範囲、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルスを含有する投与量単位で製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、又は９ｘ１０９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、又は９
×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、又は９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、又は９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、又は９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、又は９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
【0132】
これらの上述の用量は、治療される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、及び方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲、又はそれより大きな体積、又はその範囲内の全ての数を含む様々な体積の担体、賦形剤、若しくは緩衝液製剤で投与され得る。
【0133】
任意の好適な投与経路が選択され得る。したがって、薬学的組成物は、任意の適切な投与経路のために、例えば、液体溶液又は懸濁液の形態で（例えば、静脈内投与、経口投与などのために）製剤化され得る。あるいは、薬学的組成物は、固体形態（例えば、例えば、経口投与のための、錠剤又はカプセルの形態）であってもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、粉末、点滴、エアロゾルなどの形態であり得る。
【0134】
一態様では、本明細書に記載の少なくとも１つの遺伝子編集ベクター及び少なくとも１つのドナーベクターを製剤緩衝液中に含むパルボウイルスベクターを少なくとも含む、薬学的組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、異なるベクター集団の組み合わせを含む。一実施形態では、本明細書に記載の単一のｒＡＡＶ集団を製剤緩衝液中に含む、薬学的組成物が提供される。本明細書に提供される方法は、２つの別個のベクター含有懸濁液の同時投与を提供する。
【0135】
方法
本明細書に提供される組成物は、肝臓代謝障害を含む様々な遺伝性障害の治療に有用である。特定の実施形態では、組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼの治療に有用である。他の実施形態では、組成物は、家族性高コレステロール血症の治療に有用である。他の実施形態では、組成物は、フェニルケトン尿症の治療に有用である。
本明細書に提供される組成物は、肝臓代謝障害を含む様々な遺伝性障害の治療に有用である。特定の実施形態では、組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼの治療に有用である。他の実施形態では、組成物は、家族性高コレステロール血症の治療に有用である。他の実施形態では、組成物は、フェニルケトン尿症の治療に有用である。
【0136】
治療することができる例示的な肝疾患又は障害としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、肝臓がん、胆管がん、肝細胞腺腫、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）ベースの疾患若しくは障害、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。更なる障害としては、糖原病若しくは１Ａ型欠損症（ＧＳＤ１）、ＰＥＰＣＫ欠損症、ＣＤＫＬ５欠損症、ガラクトース血症、フェニルケトン尿症（
ＰＫＵ）、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、チロシン血症１型、メチルマロン酸血症、中鎖アセチルＣｏＡ欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、シトルリン血症、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症、アメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病、プロピオン性血症（ＰＡ）、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）、認知症、リポタンパク質リパーゼ欠損症、クリグラー・ナジャー病、重度複合免疫不全症、痛風及びレッシュ・ナイハン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、ファブリー病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病２型及び３型、ツェルウェーガー症候群、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ポンペ病、ニーマン・ピック病Ａ型、アルギニノコハク酸尿症、成人発症ＩＩ型シトルリン血症、尿素サイクル異常症、ファーバー脂肪肉芽腫症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、α－マンノシドーシス、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、アルファ－１アンチトリプシン欠損症（肺気腫）、サラセミア又は腎不全による貧血、虚血性疾患、閉塞した血管（アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症などに見られる）、パーキンソン病、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、並びに糖尿病が挙げられる。
ＰＫＵ）、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、チロシン血症１型、メチルマロン酸血症、中鎖アセチルＣｏＡ欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、シトルリン血症、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症、アメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病、プロピオン性血症（ＰＡ）、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）、認知症、リポタンパク質リパーゼ欠損症、クリグラー・ナジャー病、重度複合免疫不全症、痛風及びレッシュ・ナイハン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、ファブリー病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病２型及び３型、ツェルウェーガー症候群、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ポンペ病、ニーマン・ピック病Ａ型、アルギニノコハク酸尿症、成人発症ＩＩ型シトルリン血症、尿素サイクル異常症、ファーバー脂肪肉芽腫症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、α－マンノシドーシス、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、アルファ－１アンチトリプシン欠損症（肺気腫）、サラセミア又は腎不全による貧血、虚血性疾患、閉塞した血管（アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症などに見られる）、パーキンソン病、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、並びに糖尿病が挙げられる。
【0137】
本明細書に記載の特定の方法では、天然ＰＣＳＫ９の発現が低減又はアブレーションされ、導入遺伝子が、天然ＰＣＳＫ９遺伝子座における挿入から発現される。別の実施形態では、天然ＰＣＳＫ９の発現が低減又は除去され、導入遺伝子が、外因的に、すなわち、対象のゲノムに組み込まれることなく、発現される。
【0138】
本明細書に記載されるデュアルベクターシステムを同時投与することによって、ヒトにおける障害を治療する方法が本明細書に提供される。
【0139】
一実施形態では、対象における肝臓代謝障害を治療する方法が提供される。本方法は、肝臓代謝障害を有する対象に、ＰＣＳＫ９を標的化するヌクレアーゼをコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるヌクレアーゼの発現を指示する調節配列を含む、遺伝子編集ＡＡＶベクターと、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含む、ドナーＡＡＶベクターと、を同時投与することを含む。別の実施形態では、本方法は、肝臓代謝障害を有する対象に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする配列及びＰＣＳＫ９遺伝子を含む標的細胞におけるＰＣＳＫ９を標的化するｓｇＲＮＡを含む、ＬＮＰと、導入遺伝子及び標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列を含む、ドナーＡＡＶベクターと、を同時投与することを含む。一実施形態では、対象は、新生児である。
【0140】
特定の実施形態では、遺伝子編集ＡＡＶベクター及びドナーベクターは、本質的に、同じ経路を介して同時に送達される。他の実施形態では、遺伝子編集ベクターが、最初に投与される。他の実施形態では、ドナーベクターが、最初に投与される。
【0141】
一実施形態では、ｒＡＡＶの投与量は、（体重７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）用量当たり、約１×１０９ＧＣ～約１×１０１５ゲノムコピー（ＧＣ）であり、好ましくは、ヒト患者にとって、１．０×１０１２ＧＣ～２．０×１０１５ＧＣである。別の実施形態では、用量は、対象の約１×１０１４ＧＣ／ｋｇ体重未満である。特定の実施形態では、患者に投与される用量は、少なくとも約１．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０９のＧＣ／ｇ、約２．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０９ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０９ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約２
．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約２．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約２．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約２．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、又は約１．０×１０１４ＧＣ／ｋｇ体重若しくは対象である。
．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約２．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約２．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約１．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約２．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約２．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約３．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約４．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約４．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約５．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約５．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約６．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約６．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約７．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約７．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約８．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約８．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約９．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、約９．５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、又は約１．０×１０１４ＧＣ／ｋｇ体重若しくは対象である。
【0142】
本明細書に記載の組成物を使用して治療され得る好適な疾患の他の例は、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、及び希少疾患又は奇病である。かかる希少疾患の例としては、中でも、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）／ＡＬＳ、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、及び意味性認知症を含む非アルツハイマー型脳変性に関連する）が挙げられ得る。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。本明細書に記載の導入遺伝子によって示される他の疾患も、本明細書に記載の方法を使用して治療してもよい。
【0143】
ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供して、過度の悪影響なしに、又は医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。望ましい投与経路には、所望の臓器（例えば、肝臓（任意選択的に肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、髄腔内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
【0144】
本明細書に記載のシステムは、患者の状態を改善するのに十分な量の機能的酵素又はタンパク質が生成される場合、治療上有用であり得る。特定の実施形態では、健康な患者の
５％と低い遺伝子発現レベルは、患者が非遺伝子療法アプローチで治療可能であるのに十分な治療効果を提供するであろう。他の実施形態では、遺伝子発現レベルは、ヒト（又は他の獣医学的対象）で観察される正常範囲（レベル）の少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最大１００％である。例えば、「機能性酵素」とは、疾患に関連しない野生型酵素又はその天然のバリアント若しくは多形の生物学的活性レベルの少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれとほぼ同じ、又は１００％以上を提供する野生型酵素（例えば、ＯＴＣａｓｅ）をコードする遺伝子を意味する。より具体的には、ヘテロ接合型患者は、約５０％以下の酵素機能レベルを有し得るため、効果的な治療には、酵素活性を「正常」又は非欠損患者の範囲内のレベルに置き換える必要がない可能性がある。同様に、検出可能な量の酵素を有していない患者は、酵素機能を１００％未満の活性レベルまで送達することによって救済され得、任意選択的に、その後、更なる治療を受けることができる。遺伝子機能がドナー鋳型によって送達される特定の実施形態では、患者は、「正常な」健康な対象で見出されるよりも高いレベルを発現し得る。更に他の実施形態では、遺伝子発現の低減が所望される場合、２０％～５０％の低減又は最大約１００％の低減が、所望の利益を提供し得る。本明細書に記載されるように、本明細書に記載の療法は、他の治療（すなわち、対象の（患者の）診断のための標準治療）と併せて使用され得る。
５％と低い遺伝子発現レベルは、患者が非遺伝子療法アプローチで治療可能であるのに十分な治療効果を提供するであろう。他の実施形態では、遺伝子発現レベルは、ヒト（又は他の獣医学的対象）で観察される正常範囲（レベル）の少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最大１００％である。例えば、「機能性酵素」とは、疾患に関連しない野生型酵素又はその天然のバリアント若しくは多形の生物学的活性レベルの少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれとほぼ同じ、又は１００％以上を提供する野生型酵素（例えば、ＯＴＣａｓｅ）をコードする遺伝子を意味する。より具体的には、ヘテロ接合型患者は、約５０％以下の酵素機能レベルを有し得るため、効果的な治療には、酵素活性を「正常」又は非欠損患者の範囲内のレベルに置き換える必要がない可能性がある。同様に、検出可能な量の酵素を有していない患者は、酵素機能を１００％未満の活性レベルまで送達することによって救済され得、任意選択的に、その後、更なる治療を受けることができる。遺伝子機能がドナー鋳型によって送達される特定の実施形態では、患者は、「正常な」健康な対象で見出されるよりも高いレベルを発現し得る。更に他の実施形態では、遺伝子発現の低減が所望される場合、２０％～５０％の低減又は最大約１００％の低減が、所望の利益を提供し得る。本明細書に記載されるように、本明細書に記載の療法は、他の治療（すなわち、対象の（患者の）診断のための標準治療）と併せて使用され得る。
【0145】
一実施形態では、本方法は、免疫抑制性併用療法を対象に投与することを更に含む。そのような免疫抑制性併用療法は、例えば、ＡＡＶカプシドに対する望ましくないほど高い中和抗体レベルが検出された場合、ｒＡＡＶ又は開示される組成物の送達前に開始されてもよい。ある特定の実施形態では、予防措置として、ｒＡＡＶの送達の前に、併用療法を開始してもよい。ある特定の実施形態では、免疫抑制性併用療法は、ｒＡＡＶの送達後、例えば、治療後に望ましくない免疫応答が観察された場合に開始される。
【0146】
かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン又はラパログ）、及び細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、又はイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、プレドニゾロン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体又はＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス
、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。ある特定の実施形態では、免疫抑制療法は、ｒＡＡＶ投与の０日、１日、２日、７日以上前、又はｒＡＡＶ投与の０日、１日、２日、３日、７日以上後に開始され得る。かかる療法は、同じ日に単一の薬物（例えば、プレドニゾロン）又は２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、２週間、３週間、約６０日間、又はそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。ある特定の実施形態では、免疫抑制療法は、ｒＡＡＶ投与の０日、１日、２日、７日以上前、又はｒＡＡＶ投与の０日、１日、２日、３日、７日以上後に開始され得る。かかる療法は、同じ日に単一の薬物（例えば、プレドニゾロン）又は２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、２週間、３週間、約６０日間、又はそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
【0147】
別の実施形態では、本方法は、標準的なＯＴＣ療法との同時処置を含む。ＯＴＣ欠損症の治療は、主に、高アンモニア血症を回避するために、又は高アンモニア血症エピソード中に血液から過剰なアンモニアを除去するために、血中アンモニアレベルの食事管理に焦点を当てている（ＮＯＲＤ、２０２１）。ＯＴＣ欠損症を有する個体は、血中アンモニアレベルを制御するために、タンパク質摂取を制限する食事制限に従う。食事制限は、高アンモニア血症エピソードを引き起こす可能性のある過剰なタンパク質摂取を避けながら、適切な成長を確保するために十分なタンパク質を摂取する必要がある乳幼児において、慎重にバランスをとらなければならない（Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｅｒ，２００１）。したがって、乳幼児は、必須アミノ酸が補充された高カロリー、低タンパク質の食事が与えられる。高アンモニア血症エピソードでは、全てのタンパク質が患者の食事から２４時間除去され得る（ＮＯＲＤ、２０２１）。
【0148】
血流からの窒素の除去を刺激するように設計されたいくつかの薬がある。フェニル酪酸ナトリウム（Ｂｕｐｈｅｎｙｌ）は、ＯＴＣ欠損症を有する患者の慢性高アンモニア血症の治療のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。Ｂｕｐｈｅｎｙｌは、代謝されると、フェニルアセテートに変換される。これが、グルタミンとコンジュゲートして、フェニルアセチルグルタミンを形成し、それが、腎臓によって排泄され、窒素排泄の代替経路を提供する。グリセロールフェニル酪酸（Ｒａｖｉｃｔｉ）は、尿素サイクル障害を有する患者における慢性高アンモニア血症の治療についてＦＤＡ承認されている。Ｂｕｐｈｅｎｙｌと同様に、Ｒａｖｉｃｔｉはフェニルアセテートに変換され、窒素を排泄するための同じ機構に従う（Ｌｉｃｈｔｅｒ－Ｋｏｎｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｇｏｒｄｏｎ，２００３、Ｍａｇｅｌｌａｎ，２０２１）。最後に、Ａｍｍｏｎｕｌ（フェニル酢酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウム）は、尿素サイクル障害を有する患者の急性高アンモニア血症の治療のための補助療法としてＦＤＡによって承認されている。Ａｍｍｏｎｕｌのフェニル酢酸ナトリウム成分は、Ｂｕｐｈｅｎｙｌ及びＲａｖｉｃｔｉによって生成されたフェニル酢酸塩代謝産物と同じ窒素排泄機構に従う。Ａｍｍｏｎｕｌの安息香酸ナトリウム成分は、グリシンとコンジュゲートして、馬尿酸を形成し、馬尿酸が、腎臓によって排泄され、このプロセスを介して窒素が除去される。安息香酸ナトリウムは、ＯＴＣ欠損症の長期維持のための経口調製物としても与えられ、副作用が少ないと考えられたため、多くの場合、Ｂｕｐｈｅｎｙｌ及びＲａｖｉｃｔｉよりも好ましい（Ｌｉｃｈｔｅｒ－Ｋｏｎｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【0149】
一態様では、本明細書に記載されるプロモーターの制御下で、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子における部位を認識するメガヌクレアーゼコード配列を含むヌクレアーゼ発現カセットを使用して、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を有する患者を治療するための方法が提供される。本方法は、本明細書に記載されるように、配列番号１７のＯＴＣ導入遺伝子又はそれと少なくとも９０％の同一性を共有する配列を保有する発現カセットの投与を更に含む。かかる発現カセットは、ウイルス又は非ウイルスベクターを介して送達され得る。特定の実施形態では、発現カセットは、ＬＮＰを使用して送達され得る。天然ヒトＯＴＣコード配列は、配列番号３０に示される。配列番号１７及び配列番号３０は
、約７５．８９％の同一性を共有する。
、約７５．８９％の同一性を共有する。
【0150】
別の態様では、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子内の部位を認識するｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９コード配列を含むヌクレアーゼ発現カセットを使用して、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を有する患者を治療するための方法が提供される。本方法は、本明細書に記載されるように、配列番号１７のＯＴＣ導入遺伝子又はそれと少なくとも９０％の同一性を共有する配列を保有する発現カセットの投与を更に含む。かかる発現カセットは、ウイルス又は非ウイルスベクターを介して送達され得る。特定の実施形態では、発現カセットは、ＬＮＰを使用して送達され得る。
【0151】
インビトロでＯＴＣの発現及び活性レベルを測定するための様々なアッセイが存在する。例えば、Ｘ Ｙｅ，ｅｔ ａｌ，１９９６ Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：３６３９－３６４６）又はインビボを参照されたい。例えば、ＯＴＣ酵素活性は、［１，２，３，４，５－１３Ｃ５］シトルリン（９８％１３Ｃ）に正規化されたシトルリンの形成を検出するために、液体クロマトグラフィ質量分析安定同位体希釈法を使用して測定することができる。本方法は、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ活性の検出のために以前に開発されたアッセイから適合される［Ｍｏｒｉｚｏｎｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００４；８１（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４－１１．］。新鮮な凍結肝臓の破片を秤量し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２．０ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液中で短時間均質化する。均質化緩衝液の体積を調整して、５０ｍｇ／ｍｌの組織を得る。５０ｍＭのＴｒｉｓ－酢酸、４ｍＭのオルニチン、５ｍＭのカルバミルリン酸塩（ｐＨ８．３）中の２５０μｇの肝臓組織を使用して、酵素活性を測定する。酵素活性は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－酢酸（ｐＨ８．３）に溶解させた新鮮に調製した５０ｍＭのカルバミルリン酸を添加することで開始し、２５℃で５分間進行させ、等量の３０％のＴＣＡ中の５ｍＭの１３Ｃ５－シトルリンを添加することによってクエンチする。デブリを５分間の微量遠心分離によって分離し、上清を質量分析のためにバイアルに移す。１０μＬの試料を、９３％溶媒Ａ（１Ｌの水中の１ｍｌのトリフルオロ酢酸）：７％溶媒Ｂ（１Ｌの水／アセトニトリル（１：９）中の１ｍｌのトリフルオロ酢酸）の移動相を用いたアイソクラティック条件下、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＬＣ－ＭＳに注入する。シトルリン［１７６．１質量：電荷比（ｍ／ｚ）］及び１３Ｃ５シトルリン（１８１．１ｍ／ｚ）に対応するピークを定量化し、それらの比を、各アッセイで実行されたシトルリンの標準曲線について得られた比と比較する。試料は、全肝臓組織又はＢｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して決定されたタンパク質濃度のいずれかに対して正規化される。肝臓生検を必要としない他のアッセイも使用され得る。そのようなアッセイの１つは、血漿アミノ酸アッセイであり、ここでは、グルタミンとシトルリンとの比が評価され、グルタミンが高く（＞８００マイクロリットル／リットル）、シトルリンが低い（例えば、一桁）場合、尿素サイクルの欠損が疑われる。血漿中アンモニアレベルを測定してもよく、１リットル当たり約１００マイクロモルの濃度は、ＯＴＣＤを示す。血液ガスは、患者が過呼吸している場合に評価することができ、呼吸性アルカローシスは、ＯＴＣＤで頻繁に起こる。尿中のオロチン酸、例えば、約２０マイクロモル／ミリモルクレアチンを超えるオロチン酸は、アロプリノールチャレンジ試験後の尿中オロチン酸の上昇と同様に、ＯＴＣＤを示す。ＯＴＣＤの診断基準は、Ｔｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｕｒｅａ Ｃｙｃｌｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＵＣＤＣ）ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＲＤＣＲＮ）．Ｔｕｃｈｍａｎ
Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ
ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００８；９４：３９７－４０２（参照により本明細書に援用される）に記載されている。また、ＯＴＣＤの現在の標準治療の議論を提供する、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ１５４３７８／も参照されたい。
ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：３６３９－３６４６）又はインビボを参照されたい。例えば、ＯＴＣ酵素活性は、［１，２，３，４，５－１３Ｃ５］シトルリン（９８％１３Ｃ）に正規化されたシトルリンの形成を検出するために、液体クロマトグラフィ質量分析安定同位体希釈法を使用して測定することができる。本方法は、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ活性の検出のために以前に開発されたアッセイから適合される［Ｍｏｒｉｚｏｎｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００４；８１（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４－１１．］。新鮮な凍結肝臓の破片を秤量し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２．０ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液中で短時間均質化する。均質化緩衝液の体積を調整して、５０ｍｇ／ｍｌの組織を得る。５０ｍＭのＴｒｉｓ－酢酸、４ｍＭのオルニチン、５ｍＭのカルバミルリン酸塩（ｐＨ８．３）中の２５０μｇの肝臓組織を使用して、酵素活性を測定する。酵素活性は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－酢酸（ｐＨ８．３）に溶解させた新鮮に調製した５０ｍＭのカルバミルリン酸を添加することで開始し、２５℃で５分間進行させ、等量の３０％のＴＣＡ中の５ｍＭの１３Ｃ５－シトルリンを添加することによってクエンチする。デブリを５分間の微量遠心分離によって分離し、上清を質量分析のためにバイアルに移す。１０μＬの試料を、９３％溶媒Ａ（１Ｌの水中の１ｍｌのトリフルオロ酢酸）：７％溶媒Ｂ（１Ｌの水／アセトニトリル（１：９）中の１ｍｌのトリフルオロ酢酸）の移動相を用いたアイソクラティック条件下、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＬＣ－ＭＳに注入する。シトルリン［１７６．１質量：電荷比（ｍ／ｚ）］及び１３Ｃ５シトルリン（１８１．１ｍ／ｚ）に対応するピークを定量化し、それらの比を、各アッセイで実行されたシトルリンの標準曲線について得られた比と比較する。試料は、全肝臓組織又はＢｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して決定されたタンパク質濃度のいずれかに対して正規化される。肝臓生検を必要としない他のアッセイも使用され得る。そのようなアッセイの１つは、血漿アミノ酸アッセイであり、ここでは、グルタミンとシトルリンとの比が評価され、グルタミンが高く（＞８００マイクロリットル／リットル）、シトルリンが低い（例えば、一桁）場合、尿素サイクルの欠損が疑われる。血漿中アンモニアレベルを測定してもよく、１リットル当たり約１００マイクロモルの濃度は、ＯＴＣＤを示す。血液ガスは、患者が過呼吸している場合に評価することができ、呼吸性アルカローシスは、ＯＴＣＤで頻繁に起こる。尿中のオロチン酸、例えば、約２０マイクロモル／ミリモルクレアチンを超えるオロチン酸は、アロプリノールチャレンジ試験後の尿中オロチン酸の上昇と同様に、ＯＴＣＤを示す。ＯＴＣＤの診断基準は、Ｔｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｕｒｅａ Ｃｙｃｌｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＵＣＤＣ）ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＲＤＣＲＮ）．Ｔｕｃｈｍａｎ
Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ
ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００８；９４：３９７－４０２（参照により本明細書に援用される）に記載されている。また、ＯＴＣＤの現在の標準治療の議論を提供する、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ１５４３７８／も参照されたい。
【0152】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるヌクレアーゼ発現カセット、非ウイルスベクター、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、又は薬学的組成物中のそれらのいずれかは、患者における遺伝子編集のために投与可能である。特定の実施形態では、本方法は、非胚性遺伝子編集に有用である。特定の実施形態では、患者は、乳児（例えば、出生～約９ヵ月）である。特定の実施形態では、患者は、幼児以上、例えば、１２ヵ月以上である。
【0153】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、１つ又は２つ以上を意味することができる。例えば、「ａ」細胞は、単一の細胞又は複数の細胞を意味することができる。
【0154】
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、認識配列と称される塩基対の特定の配列でのみ、又は特定のセットの認識配列でのみ、二本鎖ＤＮＡ分子を認識及び切断するヌクレアーゼの能力を意味する。認識配列のセットは、特定の保存位置又は配列モチーフを共有するが、１つ以上の位置で変性であり得る。高度に特異的なヌクレアーゼは、１つのみ又は非常に少ない認識配列を切断することができる。特異性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定することができる。
【0155】
略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が担持するコーディング領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計される構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の片割れが会合して、即時の複製及び転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するであろう。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【0156】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、及びトランスで又は離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。
【0157】
核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される「外因性」という用語は、核酸又はタンパク質が、染色体又は宿主細胞に存在する位置では、天然に発生しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ発現カセット又は宿主細胞に由来し、それらに挿入されるが、非天然状態（例えば、異なるコピー数、又は異なる調節エレメントの制御下）で存在する配列を指す。
【0158】
タンパク質又は核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質又は核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない、２つ以上の配列又は部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指向するように配置された、ある遺伝子由来のプロモーターを有する。
【0159】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生プラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、導入遺伝子の発現が望まれる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された外因性又は異種核酸配列を含有する原核細胞又は真核細胞を指す。本明細書の特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載される組成物のインビトロ評価のための様々な哺乳動物種の細胞の培養物を指す。本明細書の他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ウイルスベクター又は組換えウイルスを生成及びパッケージングするために使用される細胞を指す。更に他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載される疾患又は状態についてインビボで治療される対象の標的細胞を指すことが意図される。特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、肝臓細胞又は肝細胞である。
【0160】
「対象」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ）又は非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ヒヒ、若しくはゴリラ）である。患者は、ヒトを指す。獣医学的対象は、非ヒト哺乳動物を指す。特定の実施形態では、対象は、ＰＣＳＫ９遺伝子に欠損を有しない。
【0161】
「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、合成又は人工ウイルス粒子を指し、ここで、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージングされ、同様にウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持する。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の遺伝子のみを含有する、「ガットレス」となるように操作することができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
【0162】
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、又は「同一パーセント」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列又はその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
【0163】
「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸、又はその断片を参照する場合、別の核酸（又はその相補的鎖）と適切なアミノ酸挿入又は欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のアミノ酸配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、若しくはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、又は少なくとも８アミノ酸長であるそれらの断片、若しくはより好ましくは、少なくとも１５アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
【0164】
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者によって知られているアルゴリズム及びコンピュータプログラムに頼ることによって、当業者によって容易に決定される。
【0165】
一般的に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」又は「類似性」について言及する場合、「同一性」、「相同性」又は「類似性」は、「アラインメントされた」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列又は「アラインメント」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加塩基又はアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶ整列を行う。アラインメントは、公的又は商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上記のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会及び検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書に参考として組み込まれる、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で提供される、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどのアミノ酸配列のための複数の配列アラインメントプログラムも利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性又はアラインメントを提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
【0166】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、参照整数から±１０％の変動及びその間の値を指す。例えば、「約」４０塩基対は、±４を含む（すなわち、３６～４４、これには整数３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４が含まれる）。他の値について、特に、パーセンテージ（例えば、９０％同一性、約１０％分散、又は約３６％ミスマッチ）に言及される場合、「約」という用語は、整数及び分数の両方を含む範囲
内の全ての値を含む。
内の全ての値を含む。
【0167】
本出願全体を通して、本発明の様々な態様は、範囲形式で提示され得る。範囲形式の記載は、単に利便性及び簡潔性のためであり、本発明の範囲に関する確固たる限定として解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などを具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0168】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、及びそのバリアントは、他の成分、要素、整数、ステップなどを含む。逆に、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びその変形は、他の成分、要素、整数、ステップなどを除外する。
【0169】
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【実施例】
【0170】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症は、高い死亡率に関連するＸ連鎖性尿素サイクル障害である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）新生児遺伝子療法は、遅発性ＯＴＣ欠損症に対する有望な治療法であるが、組み込まれていないゲノムが肝細胞の増殖中に失われるため、短期的な治療効果しか得られないであろう。ゲノムのセーフハーバーにおけるＯＴＣミニ遺伝子カセットのヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みは、ＯＴＣ欠損症を有する患者に長期的な治療効果を提供するであろう。遺伝子標的化のためのセーフハーバーのうちの１つは、ＰＣＳＫ９遺伝子（例えば、エクソン７領域）である。ヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９を標的化する操作されたメガヌクレアーゼ（ＡＲＣＵＳ２）又はＰＣＳＫ９を標的化する特異的ｓｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり得る。ドナーベクターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＴＢＧプロモーター）、コドン最適化ｈＯＴＣコード配列、及びポリＡ配列を含むミニ遺伝子を含む。ヌクレアーゼ及びドナー鋳型のいずれも、ＡＡＶベクター（デュアルＡＡＶベクターシステム）によって送達され得る。新生児の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるデュアルＡＡＶベクターの単回静脈内注射の１２週間後、１２％の肝細胞における持続的な導入遺伝子の発現及び効率的な遺伝子標的化を実証した。ドナーベクターにおけるミニ遺伝子は、相同組換え（ＨＤＲ）アームに隣接している。
【0171】
新生児又は乳幼児としてのデュアルＡＡＶベクターの単回注射後の治療用タンパク質を発現するためのＰＣＳＫ９遺伝子座のインビボでのヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のＮＨＰにおける初めての実証。ヒト／ＮＨＰのＰＣＳＫ９遺伝子座を遺伝子標的化するためのＯＴＣミニ遺伝子を含有するドナーベクターの組成は、ＯＴＣ欠損症の治療のための臨床試験が行われていない。遺伝子標的化効率については、新生児ＮＨＰにおいてｈＯＴＣドナーベクターを試験し、有効性については、新生児トランスジェニックＯＴＣ欠損マウスにおいてｈＯＴＣドナーベクターを試験する。
【0172】
多くの代謝性疾患は、早期介入及び療法を必要とするが、ＡＡＶ媒介性の新生児遺伝子療法は、新生児期における速い肝細胞増殖（ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）
及びＡＡＶベクターの非組み込み的性質により不安定である。セーフハーバーへの治療用ミニ遺伝子カセットの標的化組み込みにより、ゲノムレベルで治療用遺伝子が持続的に発現され、細胞分裂を介して治療効果が維持されるであろう。ＯＴＣ欠損症などの多くの代謝性疾患の場合、臨床的利益のために、肝臓における十分な形質導入効率を達成する必要がある。
及びＡＡＶベクターの非組み込み的性質により不安定である。セーフハーバーへの治療用ミニ遺伝子カセットの標的化組み込みにより、ゲノムレベルで治療用遺伝子が持続的に発現され、細胞分裂を介して治療効果が維持されるであろう。ＯＴＣ欠損症などの多くの代謝性疾患の場合、臨床的利益のために、肝臓における十分な形質導入効率を達成する必要がある。
【0173】
本発明者らは、乳幼児期に致死的な高アンモニア血症のエピソードを引き起こし得る、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣＤ）の治療のためのゲノム編集アプローチを説明する。ゲノム編集の目標は、治療効果が持続し、変異にかかわらず全てのＯＴＣＤ患者で達成されることである。本発明者らは、生存している新生児を２つのＡＡＶベクターで処置することによって、これを達成することを提案する：１つ目は、ヌクレアーゼを送達してセーフハーバー部位に二本鎖切断を生じさせることであり、２つ目は、この部位にノックインするためのＯＴＣミニ遺伝子を送達することである。本発明者らの仮定は、新生児肝臓の肝細胞を分割することは、ＯＴＣ遺伝子の効率的なノックインを促し、希釈によって組み込まれていない入力ベクターゲノムを排除することである。本発明者らは、ＡＲＣＵＳのＡＡＶ送達後のＰＣＳＫ９の安全で、効率的で、安定した減少を示した成体マカクにおける本発明者らの以前の研究に基づいて、セーフハーバー部位としてのＰＣＳＫ９遺伝子及びそれを標的化するＡＲＣＵＳと呼ばれるメガヌクレアーゼを使用することを決定した。ＯＴＣＤのためのゲノム編集の本発明者らの最初の研究は、内因性ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン７の生殖系修飾を介して、ＰＣＳＫ９ ＡＲＣＵＳヌクレアーゼに感受性になったＯＴＣ欠損マウスで行われた。２つのベクターを新生児マウスに注射すると、ヒトＯＴＣミニ遺伝子の効率的なノックインが得られ、高タンパク質ダイエットでチャレンジした場合の致死性高アンモニア血症に対する保護がもたらされた。臨床試験の準備として、本発明者らは、新生児及び乳幼児マカクにおいて、重要な安全性及び有効性パラメータを評価した。合計２４匹の動物をＡＡＶベクターで処置し、３ヵ月目及び１２ヵ月目の肝臓生検の検査を含む分析を行った。これらの試験では、本発明者らは、編集効率及び毒性に対する以下のパラメータの影響を評価した：導入遺伝子（ヒト第ＩＸ因子及びヒトＯＴＣ）、ＡＲＣＵＳを駆動するプロモーター、クレードＥカプシド、導入遺伝子に隣接するドナーの長さ、及び投薬時のマカクの年齢。ここで、少なくとも３ヵ月目の生検結果を含む２４匹中１６匹の動物の予備データを報告する。本発明者らは、ＡＡＶベクターの注射が、非常に安全であり、いずれのＡＲＣＵＳ処置動物においても、トランスアミナーゼの上昇又は肝臓の組織病理の証拠がないことを見出した。霊長類モデルにおける有効性の重要な尺度は、形質導入効率であり、これは、ヒトＯＴＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質をそれぞれ発現する細胞を検出するためのインサイツハイブリダイゼーション及び免疫染色によって測定される。最も高く、最も一貫性のある結果は、第１のベクターにおいてＴＢＧプロモーターを有するＡＲＣＵＳを駆動する新規のクレードＥカプシドを使用し、ドナーベクター上に５００ｂｐの隣接する相同性アームを使用するベクターを用いて得られた。この組み合わせにより、１０．０±６．４％（Ｎ＝６）の形質導入が達成された。これは、患者に実質的な利益をもたらし得ると考えられる閾値（ＯＴＣ発現細胞の約５％である）よりも高い。予備データは、３ヵ月齢までのマカクに注射した場合、編集レベルが１年にわたって安定し、効率的な標的化挿入が達成され得ることを示唆する。ＰＣＳＫ９標的遺伝子座の分子解析は、ベクターゲノムのノックインの大部分が、相同組換え修復（ＨＤＲ）ではなく、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介していたことを示唆した。要約すると、ＯＴＣＤの新生児形態の実質的に満たされていないニーズは、本報告書に記載されているようなゲノム編集などの実験的療法の検討を正当化する。
【0174】
実施例１－材料及び方法
材料及び方法
ＡＡＶベクターは、以前に確立された手順及び製造業者の指示に従って構築した。ＡＡＶｈｕ３７カプシドを、示されている場合、本明細書に記載される実験に使用した。
材料及び方法
ＡＡＶベクターは、以前に確立された手順及び製造業者の指示に従って構築した。ＡＡＶｈｕ３７カプシドを、示されている場合、本明細書に記載される実験に使用した。
【0175】
全ての動物手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって承認されたプロトコルに従って実施した。
【0176】
実施例２－パイロット試験：新生児ＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ２又はＳａＣａｓ９によるＰＣＳＫ９遺伝子座におけるｈＦＩＸミニ遺伝子のノックイン
この試験では、新生児非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるオンターゲット（ＰＳＫ９）ＳａＣａｓ９又はＡＲＣＵＳ媒介性遺伝子編集及びｈＦＩＸ又はＯＴＣミニ遺伝子ノックの効率を評価した。図１は、エクソン７内のドナースプライス部位及び目的のドナー鋳型（例えば、ｈＦＩＸ、ｈＯＴＣ）を含むＨＤＲドナーベクターを示す、ｒｈＰＣＳＫ９遺伝子座の概略図を示す。更に、図３Ａ～図３Ｃは、ＳａＣａｓ９又はＡＲＣＵＳ媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶベクターシステムの概略図を示す。図３Ａは、ＡＲＣＵＳ２媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステムの概略図を示し、ＡＡＶｈｕ３７ドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。図３Ｂは、Ｓａ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子修正（トランス；ＡＡＶｈｕ３７－ＳａＣａｓ９）のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステムの概略図を示し、ＡＡＶ．ｈｕ３７．ｓｈＲＮＡドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。図３Ｃは、Ｓａ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステム（シス；ＡＡＶｈｕ３７．ＰＣＳＫ９－ｓｇＲＮ．ＳａＣａｓ９）の概略図を示し、ＡＡＶ．ｈｕ３７ドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。
この試験では、新生児非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるオンターゲット（ＰＳＫ９）ＳａＣａｓ９又はＡＲＣＵＳ媒介性遺伝子編集及びｈＦＩＸ又はＯＴＣミニ遺伝子ノックの効率を評価した。図１は、エクソン７内のドナースプライス部位及び目的のドナー鋳型（例えば、ｈＦＩＸ、ｈＯＴＣ）を含むＨＤＲドナーベクターを示す、ｒｈＰＣＳＫ９遺伝子座の概略図を示す。更に、図３Ａ～図３Ｃは、ＳａＣａｓ９又はＡＲＣＵＳ媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶベクターシステムの概略図を示す。図３Ａは、ＡＲＣＵＳ２媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステムの概略図を示し、ＡＡＶｈｕ３７ドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。図３Ｂは、Ｓａ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子修正（トランス；ＡＡＶｈｕ３７－ＳａＣａｓ９）のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステムの概略図を示し、ＡＡＶ．ｈｕ３７．ｓｈＲＮＡドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。図３Ｃは、Ｓａ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子修正のためのデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターシステム（シス；ＡＡＶｈｕ３７．ＰＣＳＫ９－ｓｇＲＮ．ＳａＣａｓ９）の概略図を示し、ＡＡＶ．ｈｕ３７ドナーベクターは、ｈＯＴＣドナー鋳型配列を含む。
【0177】
遺伝子編集ヌクレアーゼ及びドナー鋳型を含む上記のデュアルＡＡＶｈｕ３７ベクターを、新生児ＮＨＰにおいて使用して、ＳａＣａｓ９又はＡＲＣＵＳ２のいずれかによって媒介性されるＰＣＳＫ９遺伝子座におけるｈＦＩＸミニ遺伝子のノックインを調べた。遺伝子編集ＡＡＶｈｕ３７ベクターを、１×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量で送達し、ドナー鋳型ＡＡＶｈｕ３７ベクターを、３×１０１３ＧＣ／ｋｇで送達した。全体として、以下の３つの処置ＮＨＰ群があった：１）ＡＡＶｈｕ３７．ＥＧＦＰ及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸ．Ｕ６．ｓｇＲ、２）ＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸ、３）ＡＡＶｈｕ３７．ＳａＣａｓ９及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸ．Ｕ６．ｓｇＲ。図２は、新生児ＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ２又はＳａＣａｓ９によるＰＣＳＫ９遺伝子座におけるｈＦＩＸミニ遺伝子ノックインを含むパイロット研究のタイムラインを示す。この試験では、０日目にＮＨＰを注射し、血液試料を、２～４週間ごとに採取し（血清化学、血漿中のｈＦＩＸ発現、血清中のＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬレベル、及び中和抗体（ＮＡｂ）レベルを調べるため）、第１の肝臓生検を８４日目に行った（ベクターゲノムレベル、遺伝子発現レベル、オフターゲット編集、及び組織学を調べるため）。
【0178】
ヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のインビボ試験を、新生児及び乳幼児のＮＨＰにおいて行った。図４Ａ、４Ｂ、及び５Ｇに示すように、動物に、１×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２．ＷＰＲＥ及び３×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ｈＦＩＸｃｏ－ＨＤＲ、又は１×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＳａＣａｓ９．ＷＰＲＥ及び３×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ｈＦＩＸｃｏ－ＨＤＲ．Ｕ６．ｓｇＲ、又は１×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ及び３×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ３７．ｈＦＩＸｃｏ－ＨＤＲ．Ｕ６．ｓｇＲを投与した。図４Ｃは、処置後０日～１３ヵ月目の示された時点でのｈＦＩＸレベルを示す（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）。図４Ｄは、処置後０日～１２ヵ月目の示された時点でのＰＣＳＫ９レベルを示す（０日目のベースラインのパーセンテージとしてプロットされている）。図４Ｅは、処置後０～１９６日目の示された時点でのＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルを示す（Ｕ／Ｌとしてプロットされている）。図４Ｆは、処置後
０日～１９６日目の示された時点での抗ＦＩＸ ＩｇＧレベルを示す（希釈係数、１／希釈としてプロットされている）。図４Ｇは、処置後０日～１９６日目の指示された時点でのＰＣＳＫ９レベルを示す（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）。図４Ｈは、治療後０日～１９６日目の示された時点で測定された体重を示す（ｇとしてプロットされている）。図５Ａは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのｈＦＩＸレベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図５Ｂは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（０日目のベースラインのパーセンテージとしてプロットされている）を示す。図５Ｃは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点（Ｕ／Ｌとしてプロットされている）でのＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルを示す。図５Ｄは、乳幼児のＮＨＰにおける、示された時点での抗ＦＩＸ ＩｇＧレベル（希釈係数、１／希釈としてプロットされている）を示す。図５Ｅは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図５Ｆは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点（ｇとしてプロットされている）で測定された体重を示す。図５Ｇは、図４Ａ～５Ｇに記載の実験からのデータを示す要約表である。図５Ｈは、試験した新生児と乳幼児のＮＨＰとの間の様々なデータの比較を示す。
０日～１９６日目の示された時点での抗ＦＩＸ ＩｇＧレベルを示す（希釈係数、１／希釈としてプロットされている）。図４Ｇは、処置後０日～１９６日目の指示された時点でのＰＣＳＫ９レベルを示す（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）。図４Ｈは、治療後０日～１９６日目の示された時点で測定された体重を示す（ｇとしてプロットされている）。図５Ａは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのｈＦＩＸレベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図５Ｂは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（０日目のベースラインのパーセンテージとしてプロットされている）を示す。図５Ｃは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点（Ｕ／Ｌとしてプロットされている）でのＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルを示す。図５Ｄは、乳幼児のＮＨＰにおける、示された時点での抗ＦＩＸ ＩｇＧレベル（希釈係数、１／希釈としてプロットされている）を示す。図５Ｅは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点でのＰＣＳＫ９レベル（ｎｇ／ｍＬとしてプロットされている）を示す。図５Ｆは、乳幼児ＮＨＰにおける、示された時点（ｇとしてプロットされている）で測定された体重を示す。図５Ｇは、図４Ａ～５Ｇに記載の実験からのデータを示す要約表である。図５Ｈは、試験した新生児と乳幼児のＮＨＰとの間の様々なデータの比較を示す。
【0179】
図６Ａ～６Ｅは、ＮＨＰにおける処置後に示される日に採取された肝臓生検試料におけるベクターの形質導入（ＧＣ）及び導入遺伝子の発現を示す。図６Ａは、二倍体細胞当たりのＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）としてプロットされた、肝臓生検試料におけるベクターの形質導入のレベルを示す。図６Ｂは、肝臓生検試料における導入遺伝子ＲＮＡの相対発現を示す。図６Ｃは、肝臓生検においてＦＩＸ及びＡＲＣＵＳを検出するための特異的プローブを使用したデュアルインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す。図６Ｄは、形質導入の定量に使用されるデジタル化ＩＳＨ画像を示す。図６Ｅは、ＩＳＨによって定量化され、パーセント形質導入としてプロットされたＦＩＸ導入遺伝子の形質導入効率を示す。図６Ｆは、肝臓におけるゲノムコピーを示す。両方の時点で、新生児よりも高いＦＩＸｃｏのＧＣが乳幼児（３倍）で観察された。第２の生検では、第１の生検よりもＦＩＸｃｏのＧＣが減少した（１．５～２倍）。図６Ｇは、肝臓生検における導入遺伝子のｍＲＮＡを示す。ＦＩＸｃｏ ｍＲＮＡは、乳幼児では、３ヵ月から１年の間で安定していたが、ＦＩＸｃｏ ｍＲＮＡは、新生児処置動物では、３ヵ月から１年の間で３倍減少した。図６Ｈは、肝臓試料に対する分子解析の結果を示す。アンプリコン－ｓｅｑで測定されたインデル、及びＩＴＲ－ｓｅｑで測定されたオフターゲットを示す。加えて、３６６日目の動物２０－１９６についてのナノポアロングリード配列決定の結果を示す。０．６％のリードが、両側にＨＤＲの組み込みを示した。図６Ｉは、図６Ａ～図６Ｈに記載されているデータの要約表である。
【0180】
図７Ａ～図７Ｌは、ＮＨＰにおける処置の８４日後に採取された肝臓生検におけるＦＩＸ及びＡＲＣＵＳを検出するための特異的プローブを使用した、様々な倍率の視野で示されたデュアルインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す（ＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸで処置されたＮＨＰ）。図７Ａは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳを示す。図７Ｂは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図７Ｃは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図７Ｄは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図７Ｅは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳを示す。図７Ｆは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図７Ｇは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図７Ｈは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図７Ｉは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ発現を示す。図
７Ｊは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図７Ｋは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図７Ｌは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。ベクターの形質導入（ＧＣ／二倍体ゲノム）の要約を、以下の表１に示す。
７Ｊは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図７Ｋは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図７Ｌは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＡＲＣＵＳ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。ベクターの形質導入（ＧＣ／二倍体ゲノム）の要約を、以下の表１に示す。
【表5】
【0181】
図８Ａ～図８Ｍは、ＮＨＰにおける処置の８４日後に採取された肝臓生検におけるＦＩＸ及びＡＲＣＵＳを検出するための特異的プローブを使用した、様々な倍率の視野で示されたデュアルインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す（ＡＡＶｈｕ３７．ＥＧＦＰ及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸ．Ｕ６．ｓｇＲで処置されたＮＨＰ）。図８Ａは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥを示す。図８Ｂは、４倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図８Ｃは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図８Ｄは、４倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図８Ｅは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥを示す。図８Ｆは、１０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図８Ｇは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図８Ｈは、１０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図８Ｉは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥの発現を示す。図８Ｊは、２０倍の倍率で観察した、肝臓生検におけるＩＳＨで検出されたｈＦＩＸを示す。図８Ｋは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸの重ね合わせた画像を示す。図８Ｌは、２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。図８Ｍは、未処理の対照において２０倍の倍率で観察した、ＩＳＨで検出されたＧＦＰ－ＷＲＰＥ及びｈＦＩＸを、ＤＡＰＩ（核の染色）と重ね合わせた画像として示す。ベクターの形質導入（ＧＣ／二倍体ゲノム）の要約を、以下の表２に示す。
【表6】
【0182】
図９は、ＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸで処理されたＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ媒介性オンターゲット編集を示す。処置の
８４日後に、肝臓生検試料を採取し、そこに存在する標的領域における総インデルのパーセンテージを計算した。更に、ＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸで処理されたＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ媒介性オンターゲット編集。処置の８４日後に、肝臓生検試料を採取し、そこに存在する標的領域における総インデルの頻度を計算し、標的に対する固有ＵＭＩ ＯＴリードの頻度としてプロットした。アンプリコン－ｓｅｑによって定量化されたインデルの要約を、以下の表３に示す。
８４日後に、肝臓生検試料を採取し、そこに存在する標的領域における総インデルのパーセンテージを計算した。更に、ＡＡＶｈｕ３７．ＡＲＣＵＳ２及びＡＡＶｈｕ３７．Ｄｏｎｏｒ－ＨＤＲ－ｈＦＩＸで処理されたＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ媒介性オンターゲット編集。処置の８４日後に、肝臓生検試料を採取し、そこに存在する標的領域における総インデルの頻度を計算し、標的に対する固有ＵＭＩ ＯＴリードの頻度としてプロットした。アンプリコン－ｓｅｑによって定量化されたインデルの要約を、以下の表３に示す。
【表7】
【0183】
実施例３－新生児ＮＨＰにおけるＡＲＣＵＳ２媒介性ｈＯＴＣ遺伝子標的化
新生児（１～１６日齢）又は乳幼児（３～４ヵ月齢）のアカゲザルを、非ＧＬＰ準拠ＰＯＣ薬理試験に使用した。Ｍ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼは、ヒト及びアカゲザルのＰＣＳＫ９遺伝子に存在する２２－ｂｐの配列を標的化する。したがって、アカゲザルを使用して、オンターゲット編集（薬理学）及び安全性／毒性学を評価することができる。更に、新生児及び乳幼児のアカゲザルは、ヒトの乳幼児と同様の解剖学的及び生理学的特徴を有し、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）の使用を可能にするであろう。解剖学的構造及びＲＯＡの類似性は、代表的なベクター分布及び形質導入プロファイルをもたらすことが予想され、これにより、オンターゲット及びオフターゲット編集、並びに新生児マウスでは不可能な臨床病理学を含む、被験試料の薬理学及び毒性のより正確な評価が可能になる。
新生児（１～１６日齢）又は乳幼児（３～４ヵ月齢）のアカゲザルを、非ＧＬＰ準拠ＰＯＣ薬理試験に使用した。Ｍ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼは、ヒト及びアカゲザルのＰＣＳＫ９遺伝子に存在する２２－ｂｐの配列を標的化する。したがって、アカゲザルを使用して、オンターゲット編集（薬理学）及び安全性／毒性学を評価することができる。更に、新生児及び乳幼児のアカゲザルは、ヒトの乳幼児と同様の解剖学的及び生理学的特徴を有し、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）の使用を可能にするであろう。解剖学的構造及びＲＯＡの類似性は、代表的なベクター分布及び形質導入プロファイルをもたらすことが予想され、これにより、オンターゲット及びオフターゲット編集、並びに新生児マウスでは不可能な臨床病理学を含む、被験試料の薬理学及び毒性のより正確な評価が可能になる。
【0184】
この試験では、新生児ＮＨＰに、ＡＲＣＵＳ２ヌクレアーゼベクターと、様々な長さのＨＤＲアーム（５００ｂｐアーム又は短いＨＤＲアーム）を有するドナーベクターとを投与した。ベクターの概略図を、図１１Ｊに示す。図１２Ａは、実験からのデータを示す要約表である。全ての１４匹の新生児マカクは、ベクターの注入に十分に耐容性であり（すなわち、明らかな臨床後遺症がない）、時間の経過とともに体重が増加した（図１１Ｉ）。肝臓酵素レベルは、１４日目の一部の動物におけるＡＬＴレベルの一過性及び軽度の上昇を除いて、正常範囲内であった（図１１Ｃ）。
【0185】
投薬前に新生児から採取された０日目の血漿試料の分析は、３匹の動物（２１－１１１、２１－１１３、２１－１２２）がＡＡＶｒｈ７９に対する高レベル（４００以上）の結合抗体を有することを示した（図１１Ａ）。これらの既存の抗ＡＡＶｒｈ７９抗体は、ＡＡＶ遺伝子導入を遮断するであろう。
【0186】
ドナーのみの対照動物を含む全ての新生児動物において、ＰＣＳＫ９レベルを経時的に追跡した。０日目のＰＣＳＫ９レベルは、新生児間で異なっていた（図１１Ｂ）。９匹の動物は、１匹のドナーのみの対照動物を含むベクター投与後のＰＣＳＫ９レベルの低下の傾向を示し、一方、残りの５匹の動物は、投与後のＰＣＳＫ９レベルの持続的又は一過性の上昇を示した（図１１Ｂ）。
【0187】
８４日目に、開腹術による肝臓生検を行った。肝臓におけるｈＯＴＣの形質導入効率を、導入遺伝子ｍＲＮＡを検出するためのｈＯＴＣ特異的プローブ及びＭ２ＰＣＳＫ９特異的プローブを用いるデュアルＩＳＨ、並びにヒトＯＴＣタンパク質を検出するためのＯＴＣ免疫蛍光、続いて、スキャンされたスライド上での定量によって評価した（図１１Ｄ）。投薬時に既存の抗ＡＡＶｒｈ７９結合抗体を有する３匹の動物（２１－１１１、２１－１１３、及び２１－１２２）は、両方の方法で、ＯＴＣ陽性肝細胞を示した。ドナーのみの２匹の対照動物は、低レベルのｈＯＴＣ形質導入（１％以下）を示した。最高の形質導入効率（ＯＴＣ免疫蛍で１１．９％及び１８．６％）は、ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ及びＡＡＶｒｈ７９．ｒｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨドナーベクター（Ｇ６）を同時投与された２匹の動物において検出された。陽性のｈＯＴＣ発現肝細胞も、クラスター中に存在していることが見出された。これらのレベルは、患者に実質的な利益をもたらす閾値（ＯＴＣ発現細胞の約５％である）を上回っている。
【0188】
各動物からの８４日目の肝臓生検試料の分子解析を行い、二倍体ゲノム当たりの導入遺伝子コピー数、ｍＲＮＡ発現レベル、オンターゲット編集、及びオフターゲット編集を測定した（図１１Ｆ）。トランスダクション効率分析と一致して、群６の２匹の動物（２１－１５７及び２１－１７５）は、最も高いｈＯＴＣベクターのＧＣ（図１１Ｆ）、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ（図１２Ｉ）、及びオンターゲットインデル（％）（図１１Ｈ）を有した。動物におけるＭ２ＰＣＳＫ９ベクターのＧＣは、ｈＯＴＣベクターのＧＣよりも２倍～７倍低かったが、Ｍ２ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルは、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡレベルよりも２３倍及び７６５倍低かった（図１１Ｆ及び１１Ｇ）。
【0189】
ＩＴＲ－ｓｅｑによって評価されたオフターゲット活性は、この試験の８４日目の肝臓生検試料において２～４０の潜在的なオフターゲットを同定した。いくつかのオフターゲット部位は、それぞれ、試験２及び試験３において、ｈＦＩＸ乳幼児及びｈＦＩＸ新生児動物を含む複数の動物において検出された。オフターゲット編集は、潜在的なオフターゲット部位のアンプリコン－ｓｅｑによって更に特徴付けられる。
【0190】
まとめると、本発明者らは、Ｍ２ＰＣＳＫ９ベクター及びｈＯＴＣｃｏドナーベクターの組み合わせを同定し、これは、新生児マカクに同時投与した場合、投与後３ヵ月で肝臓において１２～１８．６％の形質導入効率を達成することができ、両方とも、実質的に有益な患者の閾値（すなわち、約５％のＯＴＣ発現肝細胞）よりも高い。この試験における動物は、長期的な効率及び安全性評価のために追跡されている。本発明者らは、投与後１年で第２の肝臓生検を行い、ｈＯＴＣ形質導入の安定性、肝臓における組織病理学、及び肝臓におけるオンターゲティング及びオフターゲティングを評価する。
【0191】
実施例４－ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスモデル
ヒト及びマカクのＰＣＳＫ９遺伝子におけるＭ２ＰＣＳＫ９標的化配列は、マウスＰｃｓｋ９遺伝子では保存されないため、マウスの遺伝子座におけるゲノム編集にＭ２ＰＣＳＫ９を使用することはできない。したがって、本発明者らは、エクソン７を含むマウスＰｃｓｋ９遺伝子の領域を、エクソン７を含むヒトＰＣＳＫ９遺伝子の領域に置き換えるノックインマウスモデル（ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスと名付けられた）を生成するよ
うにＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに依頼した（図１０Ａ～１０Ｃ）。このモデルは、インビボゲノム編集及び遺伝子標的化効率の評価に使用することができる。次いで、ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスを、ｓｐａｒｓｅ ｆｕｒ ａｓｈ（ｓｐｆａｓｈ）マウスと交配した。ｓｐｆａｓｈマウスは、Ｏｔｃ遺伝子のエクソン４の末端のスプライスドナー部位でＧからＡへの点変異を有し、これは、Ｏｔｃ ｍＲＮＡの異常なスプライシングをもたらし、ＯＴＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の両方で２０倍の減少をもたらす（Ｈｏｄｇｅｓ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８９）。罹患した動物は、５～１０％の残存ＯＴＣ活性を有し、固形飼料（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）で生存することができるが、高タンパク質ダイエットの場合は致死的であり得る高アンモニア（ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｉａ）を発症する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
ヒト及びマカクのＰＣＳＫ９遺伝子におけるＭ２ＰＣＳＫ９標的化配列は、マウスＰｃｓｋ９遺伝子では保存されないため、マウスの遺伝子座におけるゲノム編集にＭ２ＰＣＳＫ９を使用することはできない。したがって、本発明者らは、エクソン７を含むマウスＰｃｓｋ９遺伝子の領域を、エクソン７を含むヒトＰＣＳＫ９遺伝子の領域に置き換えるノックインマウスモデル（ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスと名付けられた）を生成するよ
うにＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに依頼した（図１０Ａ～１０Ｃ）。このモデルは、インビボゲノム編集及び遺伝子標的化効率の評価に使用することができる。次いで、ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩマウスを、ｓｐａｒｓｅ ｆｕｒ ａｓｈ（ｓｐｆａｓｈ）マウスと交配した。ｓｐｆａｓｈマウスは、Ｏｔｃ遺伝子のエクソン４の末端のスプライスドナー部位でＧからＡへの点変異を有し、これは、Ｏｔｃ ｍＲＮＡの異常なスプライシングをもたらし、ＯＴＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の両方で２０倍の減少をもたらす（Ｈｏｄｇｅｓ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８９）。罹患した動物は、５～１０％の残存ＯＴＣ活性を有し、固形飼料（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）で生存することができるが、高タンパク質ダイエットの場合は致死的であり得る高アンモニア（ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｉａ）を発症する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0192】
ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスモデルは、ヒトＯＴＣのインビボ遺伝子標的化の有効性の評価、及び標的化効率と有効性との相関の実証に使用することができる。しかしながら、新生児マウスのサイズが小さいため、血液臨床病理及び遺伝子標的化の臨床的有効性の評価は、マウスが離乳した後、十分な体重に達してから、最終手順としてのみ行うことができる。
【0193】
図１２は、ＰＣＳＫ９－ｈＥ７ノックインアレルのヒトＰＣＳＫ９配列、マウスＰｃｓｋ９（ｍＰＣＳＫ９）及びアカゲザルＰｃｓｋ９（ｒｈＰＣＳＫ９）を表す、２６５ｂｐ配列の配列アラインメントを示す。この２６５ｂｐ領域には、ヒト配列とアカゲザル配列との間に６つのミスマッチがある。げっ歯類及び霊長類の配列は、様々なＬＩＮＥ及びＬＴＲの挿入のために、この枠を超えて分岐する。ヒトとマウスとの間には、エクソン７における２つのアミノ酸の違いが存在する。ｈＥ７－ＫＩマウスは、測定されたＥＬＩＳＡによって正常レベルのｍＰＣＳＫ９を発現している。
【0194】
実施例５－ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈ仔におけるＰＣＳＫ９遺伝子座に対するインビボＯＴＣ遺伝子標的化
この進行中の非ＧＬＰ準拠薬理試験は、新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスにおけるヒトＯＴＣ遺伝子のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ媒介性ノックインが、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＭ２ＰＣＳＫ９ヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＯＴＣドナーベクターの単回の同時投与後、ＯＴＣ欠損（肝臓）の治療のための標的組織における治療用ヒトＯＴＣ発現を達成できるかどうかを評価することを目的とする。実験設計の概略図を、図１４Ａに示し、投薬量群を、図１４Ｂに示す。
この進行中の非ＧＬＰ準拠薬理試験は、新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスにおけるヒトＯＴＣ遺伝子のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ媒介性ノックインが、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＭ２ＰＣＳＫ９ヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＯＴＣドナーベクターの単回の同時投与後、ＯＴＣ欠損（肝臓）の治療のための標的組織における治療用ヒトＯＴＣ発現を達成できるかどうかを評価することを目的とする。実験設計の概略図を、図１４Ａに示し、投薬量群を、図１４Ｂに示す。
【0195】
０日目に、新生児（ＰＮＤ１～２）雄ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスに、３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量の３つの異なるＡＡＶｒｈ７９ ｈＯＴＣｃｏドナーベクターのうちの１つと組み合わせて、１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼを発現するＡＡＶｒｈ７９ベクター（ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）を、ＩＶ同時投与した。本試験で評価したＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ発現ベクター（ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）は、リード臨床候補と同一であり、一方、各ｈＯＴＣｃｏドナーベクターは、ＨＤＲアームを除いて、リード臨床候補と同一であった。具体的には、臨床的候補は、ヒトＨＤＲ配列の長鎖バージョン（ＡＡＶｒｈ７９．ｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を含むが、本試験で評価したｈＯＴＣｃｏドナーベクターには、マウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）、ヒトＨＤＲ配列の短鎖バージョン（ＡＡＶｒｈ７９．ｓｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）、又はＨＤＲ配列なし（ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）が含まれる。図１３は、ＨＤＲアームと、ヒト配列、ノックインマウス配列、及びＮＨＰ配列との相同性の比較を示す。陰性対照として、追加の年齢適合ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスに、メガヌクレアーゼを発現しないＡＡＶｒｈ
７９ベクター（ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）を、ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨと組み合わせて投与した。
７９ベクター（ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）を、ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨと組み合わせて投与した。
【0196】
インライフ評価には、毎日行われる生存率モニタリング、体重測定、高タンパク質ダイエットチャレンジ後の血漿中ＰＣＳＫ９、及び血漿中ＮＨ３、及び尿中オロチン酸のレベルの評価、並びに３分の２の部分肝切除後のヒトＯＴＣ形質導入の安定性を評価するための１２０日目の部分肝切除が含まれる。４９日目及び１７０日目に、各コホートからのサブグループに、１０日間の高タンパク質ダイエットでチャレンジし、チャレンジの終了時に剖検を行う。剖検では、肝臓を採取して、ヒトＯＴＣ ｍＲＮＡの発現（インサイツハイブリダイゼーション）、ＯＴＣタンパク質の発現（免疫染色）、並びに染色及び／又は酵素活性アッセイによって評価されるＯＴＣ酵素活性の評価を含む、ヒトＯＴＣ遺伝子のノックインを評価する。肝臓のＤＮＡを単離して、オンターゲット編集（アンプリコン－ｓｅｑ、Ｏｘｆｏｒｄナノポアロングリード配列決定）を評価し、ベクターゲノムコピーを評価する。
【0197】
予備結果は、ｍｈＨＤＲアームを有するベクターを投与されたマウスが、野生型マウスと同等の生存率を示し、ｓｈＨＤＲ処置マウスが、１０日間の高タンパク質ダイエットチャレンジ後に８０％の生存率を達成することを示す（図１４Ｃ）。処置マウスは全て、ＫＩ－ｓｐｆ－ａｓｈ未処置マウスよりも体重を良好に維持した（図１４Ｄ）。ｍＨＤＲ処置マウスの血漿中アンモニアレベルは、未処置マウスと比較して、顕著に低下した（図１４Ｅ）。
【0198】
ｍＰＣＳＫ９レベルを、４８日目に測定し、全ての処置マウスが、減少を示した（図１４Ｆ）。インデルの割合（％）は、ＨＤＲタイプ間でかなり一貫していた（図１４Ｇ）。ｈＯＴＣレベルは、ｓｈＨＤＲ及びｍｈＨＤＲで処置したマウスで増加した（図１４Ｈ）。
【0199】
実施例６－新生児アカゲザルにおけるＰＣＳＫ９遺伝子座へのインビボでのＯＴＣ遺伝子の標的化
この進行中の非ＧＬＰ準拠薬理試験は、新生児アカゲザルにおけるヒトＯＴＣ遺伝子のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ媒介性ノックインが、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＯＴＣドナーベクターの単回の同時投与後、ＯＴＣ欠損（肝臓）の治療のための標的組織における治療用ヒトＯＴＣ発現を達成できるかどうかを評価することを目的とする。
この進行中の非ＧＬＰ準拠薬理試験は、新生児アカゲザルにおけるヒトＯＴＣ遺伝子のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ媒介性ノックインが、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＯＴＣドナーベクターの単回の同時投与後、ＯＴＣ欠損（肝臓）の治療のための標的組織における治療用ヒトＯＴＣ発現を達成できるかどうかを評価することを目的とする。
【0200】
０日目に、新生児（１～１６日齢）アカゲザルに、３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量の２つの異なるＡＡＶ ｈＯＴＣｃｏドナーベクターのうちの１つと組み合わせて、１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼを発現する２つの異なるベクターを、ＩＶ同時投与した。３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量でＡＡＶ ｈＯＴＣｃｏドナーベクターのみを投与された非ヌクレアーゼ群を、ドナーのみの対照として含めた。
【0201】
ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化するＡＡＶベクターについて、本発明者らは、肝臓においてＭ２ＰＣＳＫ９を発現する２つのＡＡＶベクター構築物を比較した。ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＧＨは、全長ＴＢＧプロモーター及び２コピーのエンハンサーエレメントを含み、ＷＰＲＥは、短くて弱いプロモーターを含むＡＡＶ．ＴＢＧ－Ｓ１－Ｆ１１３．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ｂＧＨよりも高いレベルのヌクレアーゼを発現する。ｈＯＴＣドナーベクターについて、本発明者らは、ｈＯＴＣｃｏ導入遺伝子カセットに隣接する相同性アームの長さが異なる２つのＡＡＶ．ｈＯＴＣｃｏドナーベクターを比較した。
【0202】
ＮＨＰは、０日目に、２つのベクターをＩＶ投与され、生存率について毎日モニタリングされている。インライフ評価には、体重の測定、血液の臨床病理、及び血漿の遺伝子編集分析が含まれる。ゲノム編集効率、ベクターゲノムコピー、導入遺伝子の発現、組織病理学、免疫染色、及びＲＮＡ ＩＳＨ染色の分析のための肝臓組織を単離するために、２つの開腹術を計画する。ＮＨＰは、長期間追跡され、剖検され（日付は未定）、その時点で、ゲノム編集効率、ベクターゲノムコピー、導入遺伝子の発現、組織病理学、免疫染色、及びＲＮＡ ＩＳＨ染色の評価のために、肝臓及び他の主要な臓器から組織が採取される。
【0203】
実施例７－ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ＳＰＦａｓｈ仔における有効性の評価及びベクターの比の決定
この計画された非ＧＬＰ準拠薬理試験は、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＭ２ＰＣＳＫ９ヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＯＴＣドナーベクターの単回の同時投与後、ＯＴＣ欠損（肝臓）の治療のための新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスにおけるヒトＯＴＣ遺伝子のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ媒介性ノックインの最高の有効性を達成するために必要なベクター成分の比を評価することを目的とする。
この計画された非ＧＬＰ準拠薬理試験は、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＭ２ＰＣＳＫ９ヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＯＴＣドナーベクターの単回の同時投与後、ＯＴＣ欠損（肝臓）の治療のための新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスにおけるヒトＯＴＣ遺伝子のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ媒介性ノックインの最高の有効性を達成するために必要なベクター成分の比を評価することを目的とする。
【0204】
０日目に、新生児（ＰＮＤ１～２）雄ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスに、マウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を含むｈＯＴＣｃｏドナーベクターの３つの用量のうちの１つと組み合わせて、３つの用量のうちの１つの用量のＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ（ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）を発現するＡＡＶｒｈ７９ベクターを、ＩＶ同時投与する。本試験で評価したＭ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼ発現ベクター（ＡＡＶｒｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＨ）は、臨床候補と同一であり、一方、ｈＯＴＣｃｏドナーベクターは、ＨＤＲアームを除いて、臨床候補と同一であった。具体的には、臨床的候補は、ヒトＨＤＲ配列の長鎖バージョン（ＡＡＶｒｈ７９．ｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を含むが、本試験で評価したｈＯＴＣｃｏドナーベクターには、マウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）が含まれる。
【0205】
ドナーベクター内のマウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を、本試験のために選択して、ドナー配列がＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスの配列と直接相同である、このアプローチの薬理学の評価を可能にした。
【0206】
インライフ評価には、毎日行われる生存モニタリング、体重測定、高タンパク質ダイエットチャレンジ後の血漿中ＮＨ３及び尿中オロチン酸のレベルの評価が含まれる。８１日目に、マウスに１０日間の高タンパク質ダイエットでチャレンジし、チャレンジの終了時に剖検を行う。剖検では、肝臓を採取して、ヒトＯＴＣ ｍＲＮＡの発現（インサイツハイブリダイゼーション）、ＯＴＣタンパク質の発現（免疫染色）、並びに染色及び／又は酵素活性アッセイによって評価されるＯＴＣ酵素活性の評価を含む、ヒトＯＴＣ遺伝子のノックインを評価する。また、肝臓のＤＮＡを単離して、オンターゲット編集（アンプリコン－ｓｅｑ）を評価し、ベクターゲノムコピーを評価する。
【0207】
実施例８－ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ＳＰＦａｓｈ仔における有効性の評価及び最小有効用量の決定
この計画されたＧＬＰ準拠薬理試験は、新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスモデルにおけるＩＶ投与ＡＡＶの有効性を評価し、ＭＥＤを決定することを目的とする。Ｍ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼを発現するＡＡＶｒｈ７９ベクター（ＡＡＶｒ
ｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）は、計画されたＧＬＰ準拠毒性のために製造される毒性学的ベクターロットになる。ヒトＨＤＲ配列の長鎖バージョン（ＡＡＶｒｈ７９．ｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を含む被験試料を利用する代わりに、本試験は、マウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を含むｈＯＴＣｃｏドナーベクターを利用することになる。このベクターは、臨床候補の毒性学的ベクターロットと同等の方法で製造されるであろう。
この計画されたＧＬＰ準拠薬理試験は、新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスモデルにおけるＩＶ投与ＡＡＶの有効性を評価し、ＭＥＤを決定することを目的とする。Ｍ２ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼを発現するＡＡＶｒｈ７９ベクター（ＡＡＶｒ
ｈ７９．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｍ２ＰＣＳＫ９．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）は、計画されたＧＬＰ準拠毒性のために製造される毒性学的ベクターロットになる。ヒトＨＤＲ配列の長鎖バージョン（ＡＡＶｒｈ７９．ｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を含む被験試料を利用する代わりに、本試験は、マウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）を含むｈＯＴＣｃｏドナーベクターを利用することになる。このベクターは、臨床候補の毒性学的ベクターロットと同等の方法で製造されるであろう。
【0208】
この試験のために、ドナーベクター内のマウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ＴＢＧ．ｈＯＴＣｃｏ．ｂＧＨ）（ドナー配列がＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスにおける配列と直接相同である）を使用することを選択して、このアプローチの薬理学を効果的に研究することを可能にした。
【0209】
この試験では、Ｎ＝６０匹の新生児（ＰＮＤ１～２）新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウス、及び対照としてのＮ＝１５匹の年齢適合雄ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ＷＴ（野生型）を評価する。この試験には、１つの剖検時点（９０日）が含まれることになる。有効性評価のために、マウスは、８１日目から９０日目までの１０日間コースの高タンパク質ダイエットによってチャレンジされる。生存率、身体状態、及びバイオマーカーの変化を評価することになる。３つの用量レベルのＡＡＶを、ＩＶ投与を使用して評価する。用量レベルは、以前の非臨床試験で評価された用量範囲に基づいて選択される。評価された用量レベルは、予想される臨床用量を包含する。
【0210】
インライフ評価には、毎日の生存チェック、生存のモニタリング、体重測定、高タンパク質ダイエットチャレンジ後の血清中ＰＣＳＫ９レベル、血漿中ＮＨ３、及び尿中オロチン酸レベルの評価が含まれる。剖検は、９０日目に行われる。剖検では、ＣＢＣ／鑑別及び血清臨床化学分析のために、血液を採取する。組織病理学的評価のために、組織リストが収集される。肝臓を採取して、ヒトＯＴＣ ｍＲＮＡの発現（インサイツハイブリダイゼーション）、ＯＴＣタンパク質の発現（免疫染色）、並びに染色及び／又は酵素活性アッセイによって評価されるＯＴＣ酵素活性の評価を含む、ヒトＯＴＣ遺伝子のノックインを評価する。また、肝臓のＤＮＡを単離して、オンターゲット編集（アンプリコン－ｓｅｑ）を評価し、ベクターゲノムコピーを評価する。
【0211】
ＭＥＤは、ビヒクル処置新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈ分対照マウスと比較して、ＡＡＶ処置新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈの高タンパク質ダイエット後の生存率、高タンパク質ダイエットチャレンジの終了時の血漿中ＮＨ３レベル、ヒトＯＴＣ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現、ＯＴＣの酵素活性、並びにオンターゲット編集の分析に基づいて、決定される。
【0212】
実施例９－ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈ仔における毒性試験
新生児（ＰＮＤ１～２）ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスにおいて、ＩＶ同時投与後の被験試料の安全性、耐容性、薬理学、及び薬物動態を調べるために、６ヵ月間のＧＬＰ準拠安全性試験を実施する。中間解析は、オンターゲット編集、オフターゲット編集、導入遺伝子の発現、及び組織病理学的分析を含み、この解析を、６０日目及び１８０日目（これらの時点は、投与後にヌクレアーゼ依存性遺伝子挿入が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与える）に実施する。新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスに、３つの用量レベル（１．０×１０１２ＧＣ／ｋｇヌクレアーゼベクター及び３．０×１０１２ＧＣ／ｋｇドナーベクター、３．３×１０１２ＧＣ／ｋｇヌクレアーゼベクター及び１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇドナーベクター、又は１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇヌクレアーゼベクター及び３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、１用量当たりＮ＝２０）のうちの１つの被験試料又はビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］、Ｎ
＝２０）を投与する。被験試料又はビヒクルの投与後、インライフ評価には、苦痛の兆候及び異常行動を毎日モニタリングするための臨床観察、体重測定、並びに血液の臨床血清化学（具体的には、ＡＬＴ、ＡＳＴ、及び総ビリルビン）が含まれる。
新生児（ＰＮＤ１～２）ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスにおいて、ＩＶ同時投与後の被験試料の安全性、耐容性、薬理学、及び薬物動態を調べるために、６ヵ月間のＧＬＰ準拠安全性試験を実施する。中間解析は、オンターゲット編集、オフターゲット編集、導入遺伝子の発現、及び組織病理学的分析を含み、この解析を、６０日目及び１８０日目（これらの時点は、投与後にヌクレアーゼ依存性遺伝子挿入が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与える）に実施する。新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスに、３つの用量レベル（１．０×１０１２ＧＣ／ｋｇヌクレアーゼベクター及び３．０×１０１２ＧＣ／ｋｇドナーベクター、３．３×１０１２ＧＣ／ｋｇヌクレアーゼベクター及び１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇドナーベクター、又は１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇヌクレアーゼベクター及び３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇ、１用量当たりＮ＝２０）のうちの１つの被験試料又はビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］、Ｎ
＝２０）を投与する。被験試料又はビヒクルの投与後、インライフ評価には、苦痛の兆候及び異常行動を毎日モニタリングするための臨床観察、体重測定、並びに血液の臨床血清化学（具体的には、ＡＬＴ、ＡＳＴ、及び総ビリルビン）が含まれる。
【0213】
被験試料投与の６０日後、コホート１、３、５、及び７を安楽死させ、脳、脊髄、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、生殖器、副腎、及びリンパ節を含むが、これらに限定されない組織の包括的なリストに対して、組織病理学的分析を行う。必要に応じて、臓器の重量を測定する。
【0214】
肝臓試料は、アンプリコン－ｓｅｑ及びＡＭＰ－ｓｅｑによるオンターゲット編集、ＩＴＲ－ｓｅｑ及びアンプリコン－ｓｅｑによるオフターゲット編集、ベクターの生体内分布、及び導入遺伝子の発現のために採取及び分析される。肝臓試料において、生体内分布は、ＰＣＲによって評価され、メガヌクレアーゼのＲＮＡ発現は、ＲＴ－ＰＣＲによって分析される。高度に灌流された臓器は、メガヌクレアーゼＲＮＡについて分析され、メガヌクレアーゼＲＮＡの検出可能な発現を有する組織は、オンターゲット編集についてアンプリコン－ｓｅｑによって評価される。検出可能なオンターゲット編集を有する組織は、オフターゲット編集について更に評価される。
【0215】
ベクターの生体内分布については、デュアルベクターの導入遺伝子（Ｍ２ＰＣＳＫ９及びｈＯＴＣｃｏ）に特異的なｑＰＣＲ検出が開発される。アッセイの効率、直線性、精度、再現性、及び検出限界は、標的配列の代用としてのＡＡＶシスプラスミドを使用して評価される。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は、試験組織又は排泄物に対するアッセイが開始される前に決定される。認定計画は、導入遺伝子特異的アッセイを以前に実施した認定試験に橋渡しするために実装される。試験したマトリックスには、意図された標的、生体内分布のための肝臓が含まれる。マトリックス効果は、生体内分布試験の過程で試験された全ての試料からのスパイクされた標的対照の回収、並びに以前に実施された認定試験から差し引かれたデータに基づいて更に評価される。
【0216】
実施例１０－ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｌｄｌｒ－／ｌｄｌｒ－．ａｐｏｂｅｃ－／ａｐｏｂｅｃ－仔（ｈｏＦＨモデル）におけるＳａＣａｓ９によるＰＣＳＫ９遺伝子座におけるｈＬＤＬＲミニ遺伝子ノックイン
本試験は、新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｌｄｌｒ－／ｌｄｌｒ－．ａｐｏｂｅｃ－／ａｐｏｂｅｃ－マウスにおけるヒトＬＤＬＲ遺伝子のＣａｓ９媒介性ノックインが、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＳａＣａｓ９ヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＬＤＬＲドナーベクターの単回の同時投与後、家族性高コレステロール血症（肝臓）の治療のための標的組織における治療用ヒトＬＤＬＲ発現を達成できるかどうかを評価することを目的とする。図１５の実験設計を使用して、マウスモデルを生成した。マウスモデルでは、マウスＰＣＳＫ９エクソン７が、ＳａＣａｓ９標的化配列を含有するヒトＰＣＳＫ９エクソン７に置き換えられる。
本試験は、新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｌｄｌｒ－／ｌｄｌｒ－．ａｐｏｂｅｃ－／ａｐｏｂｅｃ－マウスにおけるヒトＬＤＬＲ遺伝子のＣａｓ９媒介性ノックインが、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＶ）を介したＳａＣａｓ９ヌクレアーゼ発現ベクター及びヒトＬＤＬＲドナーベクターの単回の同時投与後、家族性高コレステロール血症（肝臓）の治療のための標的組織における治療用ヒトＬＤＬＲ発現を達成できるかどうかを評価することを目的とする。図１５の実験設計を使用して、マウスモデルを生成した。マウスモデルでは、マウスＰＣＳＫ９エクソン７が、ＳａＣａｓ９標的化配列を含有するヒトＰＣＳＫ９エクソン７に置き換えられる。
【0217】
０日目に、新生児ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｌｄｌｒ－／ｌｄｌｒ－．ａｐｏｂｅｃ－／ａｐｏｂｅｃ－マウスに、３．０×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量で、２つの異なるＡＡＶｒｈ７９ ｈＬＤＬＲドナーベクターのうちの１つと組み合わせて、１．０×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量のＣａｓ９を発現するＡＡＶｒｈ７９ベクター（ＡＡＶｒｈ７９．Ｕ６．ｓｇＲ３．ＰＳＣＫ９．ＡＰＢ２．ＨＬＰ．ＳａＣａｓ９．ｂＧＨ）を、ＩＶ同時投与した。使用したベクターを示す概略図を、図１６に示す。具体的には、この試験で評価したドナーベクターのうちの１つは、マウス－ヒトハイブリッドＨＤＲ配列（ＡＡＶｒｈ７９．ｍｈＨＤＲ．ｈＬＤＬＲ０１１）を含み、他方は、ヒトＨＤＲ配列のより短鎖バージョン（ＡＡＶｒｈ７９．ｓｈＨＤＲ．ｈＬＤＬＲ０１１）を含んだ。陰性対照として、追加の年齢適合ＰＣＳＫ９－ｈＥ７－ＫＩ．ｓｐｆａｓｈマウスに、ＡＡＶｒｈ７９．ｓｈ
ＨＤＲ．ｈＬＤＬＲ０１１と組み合わせて、ｓａＣａｓ９を発現しないＡＡＶｒｈ７９ベクターを投与した。
ＨＤＲ．ｈＬＤＬＲ０１１と組み合わせて、ｓａＣａｓ９を発現しないＡＡＶｒｈ７９ベクターを投与した。
【0218】
インライフ評価には、毎日行われる生存率モニタリング、並びに４２、６３、９０、１２０、及び１５０日目の血清ＬＤＬ－ｃレベルの評価が含まれる。ヒトＬＤＬＲ形質導入の安定性を評価するための６３日目の部分肝切除、及び１５０日目の剖検。剖検では、肝臓を採取して、ヒトＬＤＬＲ ｍＲＮＡの発現（インサイツハイブリダイゼーション）、ＬＤＬＲタンパク質の発現（免疫染色）の評価を含む、ヒトＬＤＬＲ遺伝子のノックインを評価する。肝臓のＤＮＡを単離して、オンターゲット編集（アンプリコン－ｓｅｑ、Ｏｘｆｏｒｄナノポアロングリード配列決定）を評価し、ベクターゲノムコピーを評価する。実験設計を、図１７に示す。
【0219】
予備結果は、ｓａＣａｓ９及びドナーベクターを投与されたマウスは、血清中ＬＤＬレベルが有意に減少したことを示す。安定した組み込みを示す２／３部分肝切除後のＬＤＬの変化はなかった（図１８Ａ）。インデルは、ｍｈＨＤＲ及びｓｈＨＤＲドナーベクターを使用して一貫していた（図１８Ｂ）。６３日目に、ｓｈＨＤＲ処置マウスは、わずかに高いｈＬＤＬＲレベル（図１８Ｃ）を示したが、ｍｈＨＤＲ及びｓｈＨＤＲ（ｓａＣａｓ９）ベクターの場合、血清中ＬＤＬレベルが類似していた（図１８Ｄ）。
【0220】
図１９は、部分肝切除後６３日目の肝臓におけるｈＬＤＬＲの発現の免疫組織化学的評価を示す。
【0221】
本明細書に引用される全ての文献は、参照により本明細書に援用され、本明細書に添えて提出される配列表の配列及びテキストも、参照により援用される。２０２１年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８０，６０３号、２０２１年９月９日に出願された第６３／２４２，４７４号、２０２１年９月１４日に出願された第６３／２４４，２０５号、２０２２年１月２１日に出願された第６３／３０１，９３３号、２０２２年４月１５日に出願された第６３／３３１，３８５号は、各々、それらの全体が参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【表8-1】
【表8-2】
【表8-3】
【表8-4】
【表8-5】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A-7D】
【図7E-7H】
【図7I-7L】
【図8A-8D】
【図8E-8H】
【図8I-8M】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B-1】
【図11B-2】
【図11C-1】
【図11C-2】
【図11D】
【図11E-1】
【図11E-2】
【図11F】
【図11G】
【図11H】
【図11I】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図14G】
【図14H】
【図14I】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】