特表 2024-519523 二重特異性抗体薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-15

(54)【発明の名称】二重特異性抗体薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240508BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240508BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240508BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240508BHJP

   A61K 38/07 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20240508BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20240508BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240508BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20240508BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20240508BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240508BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/30

A61K39/395 N

A61K39/395 L

A61K45/00

A61K38/07

A61P35/00

A61P1/02

A61P1/04

A61P1/16

A61P11/00

A61P11/02

A61P11/04

A61P13/10

A61P15/00

A61K47/68

A61K47/55

A61K47/65

C12N15/13

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565593

(86)(22)【出願日】2022-04-26

(85)【翻訳文提出日】2023-12-20

(86)【国際出願番号】 CN2022089229

(87)【国際公開番号】W WO2022228422

(87)【国際公開日】2022-11-03

(31)【優先権主張番号】202110452948.0

(32)【優先日】2021-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521330323

【氏名又は名称】スアンズ バイオファーマシューティカル カンパニー，リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】521467939

【氏名又は名称】ベイジン スアンズ カンビオ カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100115255

【弁理士】

【氏名又は名称】辻丸 光一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100201732

【弁理士】

【氏名又は名称】松縄 正登

(74)【代理人】

【識別番号】100154081

【弁理士】

【氏名又は名称】伊佐治 創

(74)【代理人】

【識別番号】100227019

【弁理士】

【氏名又は名称】安 修央

(72)【発明者】

【氏名】チュー、シャオドン

(72)【発明者】

【氏名】イエ、ジントン

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ジンフェン

(72)【発明者】

【氏名】ホー、ウェイ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076CC10

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC27

4C076EE51

4C076EE59

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA10

4C084BA16

4C084BA23

4C084DA32

4C084NA10

4C084ZA341

4C084ZA591

4C084ZA661

4C084ZA671

4C084ZA751

4C084ZA811

4C084ZB261

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA27

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート、及び上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、並びにがんの予防及び／又は治療のための薬物の製造における、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲート及びその医薬組成物の応用に関する。上記二重特異性抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩを認識及び／又は結合することができる第１のパラトープと、ＨＥＲ２のドメインＩＶを認識及び／又は結合することができる第２のパラトープとを含み、上記毒素は、メイタンシン類、ヘミアスタリン類、アマニチン類、アウリスタチン類、カリケアミシン類又はデュオカルマイシン類を含み、上記リンカーは、切断可能なリンカー及び非切断可能なリンカーを含み、選択的に、上記毒素及び／又はリンカーのうちの１つ又は複数の水素原子は、任意選択的に重水素化される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物であって、
前記二重特異性抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩを認識及び／又は結合することができる第１のパラトープと、ＨＥＲ２のドメインＩＶを認識及び／又は結合することができる第２のパラトープとを含み、前記二重特異性抗体は、Ｆａｂ－Ｉｇ、Ｉｇ－Ｆａｂ、又はヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、好ましくは、前記二重特異性抗体は、ヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、
前記毒素は、メイタンシン類、ヘミアスタリン類、アマニチン類、アウリスタチン類、カリケアミシン類又はデュオカルマイシン類から選ばれ、
前記リンカーは、切断可能なリンカー及び非切断可能なリンカーから選ばれ、前記切断可能なリンカーは、化学的に切断可能なリンカー及び酵素的に切断可能なリンカーを含むが、これらに限定されず、前記酵素的に切断可能なリンカーは、ペプチド成分を含むリンカーを含み、
オプションとして、前記毒素及び／又はリンカーのうちの１つ又は複数の水素原子は、任意選択的に重水素化されることを特徴とする。

【請求項2】

前記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、そのうち、
（１）前記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
前記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、
ａ）Ｓ５６Ｙ／Ｔ／Ａのいずれか、
ｂ）Ｎ３０Ｓ／Ａのいずれか、
ｃ）Ｔ９４Ｗ／Ｆ／Ｙのいずれか、
ｄ）Ｈ９１Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、
ｅ）Ｐ９６Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、又は
ｆ）ａ）～ｅ）の５つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
好ましくは、前記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つの配列改変を含み、
前記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
（２）前記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
前記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、
ｉ）Ｔ３０Ａ／Ｓ／Ｎ／Ｄのいずれか、
ｉｉ）Ｇ５６Ａ／Ｓ／Ｔのいずれか、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
好ましくは、前記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
前記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、
ｉ）Ｎ５４Ｔ／Ｓ／Ａのいずれか、
ｉｉ）Ｄ９８Ｓ／Ｗ／Ｔ／Ｒのいずれか、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
好ましくは、前記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項3】

前記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域が、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項4】

前記二重特異性抗体の２つのＦｃ領域は、Ｍ４２８Ｌからなる置換を含む改変されたＦｃ領域であることを特徴とする、
請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項5】

前記二重特異性抗体のＦｃは、
（１）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を増加させるＦｃ、又は、
（２）抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を増加させるＦｃ、又は、
（３）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を増加させるＦｃを含むことを特徴とする、
請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項6】

前記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体であり、好ましくは、前記脱フコシル化抗体は、フコシル化欠損を有する宿主細胞から産生されることによって得られ、前記フコシル化欠陥は、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトであることを特徴とする、
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項7】

前記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、
好ましくは、前記ｋｎｏｂ部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃ領域であるか、又はＴ３６６Ｗの改変を含み、前記ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域であるか、又はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、
最も好ましくは、前記ｋｎｏｂ部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｔ３６６Ｗ及びＭ４２８Ｌの改変を含み、前記ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域に基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変を含み、且つ、前記二重特異性抗体は、ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域においてＭ４２８Ｌの改変を更に含むことを特徴とする、
請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項8】

前記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８から選ばれ、又は、
前記二重特異性抗体は、脱フコシル化Ｔ５１（Ｔ５１－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５２（Ｔ５２－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５３（Ｔ５３－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５５（Ｔ５５－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５６（Ｔ５６－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５７（Ｔ５７－ＡＦ）、及び脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれることを特徴とする、
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項9】

前記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマヌリン、アマニン、アマニンアミド、γ－アマニン、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、カリケアミシンγ、デュオカルマイシンＡ、ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ及びＣＣ－１０６５、並びにそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ及びモノメチルアウリスタチンＦ、並びにそれらの重水素化物から選ばれ、
前記酵素的に切断可能なリンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記酵素的に切断可能なリンカーは、バリン－シトルリン及びその重水素化物から選ばれることを特徴とする、
請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項10】

二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物であって、
（１）前記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８から選ばれ、好ましくは、前記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ、及びＴ５８－ＡＦであり、
（２）前記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ及びモノメチルアウリスタチンＦ、及びそれらの重水素化物から選ばれ、
（３）前記リンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記リンカーは、バリン－シトルリン及びその重水素化物から選ばれることを特徴とする。

【請求項11】

前記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（Ｉ’）に示される通りである：

【化3】

そのうち、
（１）

【化2】

は、請求項１０に記載の二重特異性抗体を表し、
（２）中間部分は、リンカーとしてのバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃと略称される）部分であり、リンカーは、６－マレイミドヘキサン酸を介して前記二重特異性抗体に連結され、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して最も右側のＤｒｕｇ（毒素部分）に連結され、
前記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、
（３）ｎは、前記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）を表し、１～６から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項12】

前記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（ＩＩ）に示される通りである：

【化4】

そのうち、
（１）

【化2】

は、請求項１０に記載の二重特異性抗体を表し、
（２）［ ］における構造は、リンカー毒素部分Ｖｃ－ＭＭＡＥであり、Ｖｃは、６－マレイミドヘキサン酸を介して前記二重特異性抗体に連結され、Ｖｃは、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して毒素としてのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に連結され、
（３）ｎは、ＤＡＲ値であり、１～６から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項13】

前記二重特異性抗体は、Ｔ５４、Ｔ５８、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）又は脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれることを特徴とする、
請求項１０～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物又は重水素化物。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物、及び薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項15】

がんの予防及び／又は治療のための薬物の製造における、請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は請求項１４に記載の医薬組成物の、応用。

【請求項16】

前記がんは、ＨＥＲ２を発現するがんであり、好ましくは、前記がんは、ＨＥＲ２が中レベルから低レベルまで発現されるがんであり、好ましくは、前記がんは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、胃がん、食道がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、胆管がん及び結腸直腸がんを含む、
ことを特徴とする、請求項１５に記載の応用。

【請求項17】

抗腫瘍併用製剤の製造における、請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は請求項１４に記載の医薬組成物の応用であって、前記併用製剤において、
（１）ＨＥＲ２以外の他の標的を標的とする薬物、
（２）細胞治療薬、
（３）免疫療法薬という腫瘍を治療するための任意の活性成分も含まれる、応用。

【請求項18】

がんの予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項19】

前記がんは、ＨＥＲ２を発現するがんであり、好ましくは、前記がんは、ＨＥＲ２において低レベルで発現されるがんであり、好ましくは、
前記がんは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、胃がん、食道がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、胆管がん及び結腸直腸がんを含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

がんの治療における、請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は請求項１４に記載の医薬組成物の応用であって、
（１）ＨＥＲ２以外の他の標的を標的とする薬物、
（２）細胞治療薬、
（３）免疫療法薬、
（４）手術、
（５）放射線療法などの物理療法というがんを治療する医薬又は治療レジメンと組み合わせて使用されることを特徴とする、応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体医薬技術分野に属し、具体的に、二重特異性抗体薬物コンジュゲートに関し、及び上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、並びにがんの予防及び／又は治療のための薬物の製造における上記二重特異性抗体薬物コンジュゲート及びその医薬組成物の応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２とも呼ばれる）は、チロシンプロテインキナーゼ受容体ＥｒｂＢファミリーのメンバーである。それは、単一チャネル膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン及び細胞質キナーゼドメインを有するＩ型膜タンパク質である。ＨＥＲ２遺伝子は、乳がん患者の約２０％において（ＨＥＲ２^＋）に増幅される。モノクローナル抗体によるＨＥＲ２の標的化は、ＨＥＲ２増幅乳がん患者の治療において非常に有効であることが証明されている。

【0003】

トラスツズマブ（ｍＡｂ４Ｄ５、ハーセプチンＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、ＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩＶに結合するヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であり、ＨＥＲ２^＋乳がんの治療のために１９９８年にＦＤＡにより承認された。

【0004】

ペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ２Ｃ４、ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））は、別のヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるが、トラスツズマブのエピトープとは別々のＨＥＲ２上のエピトープであるＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩＩに結合する。ＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩＩが二量体化に関与するため、ペルツズマブのＨＥＲ２への結合は、ＨＥＲ２と別の受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４など）の二量体化を阻止する。

【0005】

ペルツズマブとトラスツズマブとの組み合わせは、トラスツズマブ単独又はペルツズマブ単独よりも優れた効力を示し、ＦＤＡによりＨＥＲ２^＋転移性乳がんのために承認されており（２０１２）、１年後にＨＥＲ２^＋乳がんのネオアジュバント化学療法のために承認されている（２０１３）。

【0006】

国際特許公開公報ＷＯ２０１８１９１１８８Ａ１は、ＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩＩ及びＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩＶを同時に標的とする、共通の軽鎖を含む二重特異性抗体を開示した。

【0007】

抗体編集（Ｍａｂ Ｅｄｉｔ）は、抗体糖鎖における糖のノックアウト、置換及び付加、抗体ｐａｙｌｏａｄの部位特異的又は非部位特異コンジュゲーション、抗体ＦａｂとＦｃエンジニアリングの正確な改善などの方式を含む抗体に対する配向性の正確な修飾及び改変を指す。抗体編集は、正確な修飾及び改変を強調し、抗体の各機能領域及び異なるモジュールを充分に利用・調節する。天然又は操作された抗体分子の抗体編集により、糖鎖改変抗体、ＡＤＣｓなど、多様な分子構造を有する新規な多機能抗体を構築することができる。

【0008】

抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＡＤＣｓ）は、標的特性を有する抗体と細胞毒性の強い薬物をコンジュゲートした新規な抗腫瘍薬であり、一般的に「生物学的ミサイル」と呼ばれる。ＡＤＣｓは、抗体の標的化作用により、抗原陽性の腫瘍細胞膜に特異的に結合し、薬理作用を発揮することができ、腫瘍細胞エンドサイトーシスによってエンドソームを形成して細胞内に入ることもでき、細胞質に入ったエンドソームは、リソソームと結合し、コンジュゲートした小分子毒素を解離させてその固有性質を回復させることにより、腫瘍細胞を死滅させる。

【0009】

ＡＤＣｓは、プロドラッグと見なすことができ、標的を絞った方法で小分子毒素を腫瘍細胞に導入し、腫瘍細胞における小分子毒素の暴露を増加させ、正常組織への暴露を減少させ、このような小分子毒素の安全性ウインドウ（治療ウインドウ）を拡大することができる。

【0010】

ＡＤＣｓは主に、標的化抗体、コンジュゲートした毒素、抗体と毒素の間のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）という３つの部分で構成され、その作用の標的は通常、腫瘍細胞表面の関連抗原又は特定の受容体である。ＡＤＣにおけるｍＡｂは、（１）小分子毒素をコンジュゲートした後に自身の特性を維持可能なこと、（２）抗原に対する標的性が高いこと、（３）標的細胞の抗原のみに結合すること、（４）抗原と結合した後にｍＡｂに対してネガティブフィードバックをしないこと、（５）他の細胞への非特異的結合が非常に少ないこと、という特徴を有する必要がある。

【0011】

トラスツズマブ－ｅｍｔａｎｓｉｎｅコンジュゲート（ＴＤＭ１）は、小分子毒素ＤＭ１とトラスツズマブを連結して得られた抗体薬物コンジュゲートである。２０１３年２月に、ＴＤＭ１（Ｋａｄｃｙｌａ）は、ＨＥＲ２陽性進行転移性乳がんの治療のためにＦＤＡによって承認された。２０１９年に、ＴＤＭ１は、中国に入る最初のＡＤＣ薬物となっている。

【0012】

二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、２つの異なる標的、又は同じ標的の２つの異なるドメインを同時に標的とすることができ、その治療効果が期待される。しかし、二重特異性抗体を用いるＡＤＣには、依然として満足されない臨床的必要性が大きく残っている。二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、２つの異なる標的、又は同じ標的の２つの異なるドメインを同時に標的とすることができ、その治療効果が期待される。しかし、二重特異性抗体を用いるＡＤＣには、依然として満足されない臨床的必要性が大きく残っている。

【発明の概要】

【0013】

本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物を提供し、上記二重特異性抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩを認識及び／又は結合することができる第１のパラトープと、ＨＥＲ２のドメインＩＶを認識及び／又は結合することができる第２のパラトープとを含み、上記毒素は、メイタンシン類、ヘミアスタリン類、アマニチン類、アウリスタチン類、カリケアミシン類又はデュオカルマイシン類から選ばれ、上記リンカーは、切断可能なリンカー及び非切断可能なリンカーから選ばれ、オプションとして、上記毒素及び／又はリンカーのうちの１つ又は複数の水素原子は、任意選択的に重水素化される。

【0014】

好ましくは、上記重水素化物は、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）における毒素及び／又はリンカーのうちの１つ又は複数の水素原子が任意選択的に重水素化されていることを意味する。

【0015】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩを認識及び／又は結合することができる第１のパラトープと、ＨＥＲ２のドメインＩＶを認識及び／又は結合することができる第２のパラトープとを含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含む。

【0017】

上記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、
ａ）Ｓ５６Ｙ／Ｔ／Ａのいずれか、
ｂ）Ｎ３０Ｓ／Ａのいずれか、
ｃ）Ｔ９４Ｗ／Ｆ／Ｙのいずれか、
ｄ）Ｈ９１Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、
ｅ）Ｐ９６Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、又は
ｆ）ａ）～ｅ）の５つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
いくつかの実施形態において、上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つという配列改変を含み、
上記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示される。
上記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
（１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、
ｉ）Ｔ３０Ａ／Ｓ／Ｎ／Ｄのいずれか、
ｉｉ）Ｇ５６Ａ／Ｓ／Ｔのいずれか、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
いくつかの実施形態において、上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
（２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、
ｉ）Ｎ５４Ｔ／Ｓ／Ａのいずれか、
ｉｉ）Ｄ９８Ｓ／Ｗ／Ｔ／Ｒのいずれか、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
いくつかの実施形態において、上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、
上記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つの配列改変を含み、
上記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
上記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
（１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
（２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含む。
いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、Ｆａｂ－Ｉｇ、Ｉｇ－Ｆａｂ、又はヘテロ二量体Ｉｇの形態である。

【0019】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、ヘテロ二量体Ｉｇの形態である。

【0020】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体におけるＦｃ領域は、ｋｎｏｂ部分のＦｃ領域及びｈｏｌｅ部分のＦｃ領域である２つの相補的なＦｃ領域を含むノブ・イントゥ・ホール構造（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）である。

【0021】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体の２つのＦｃは、Ｍ４２８Ｌからなる置換を含む改変されたＦｃ領域である。

【0022】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体のＦｃは、
（１）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を増加させるＦｃ、又は
（２）抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を増加させるＦｃ、又は
（３）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を増加させるＦｃを含む。

【0023】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体である。
いくつかの実施形態において、上記脱フコシル化抗体は、フコシル化欠損を有する宿主細胞から産生されることによって得られる。

【0024】

いくつかの実施形態において、上記フコシル化欠損は、ＦＵＴ８遺伝子ノックアウトである。
いくつかの実施形態において、上記脱フコシル化抗体は、抗体のＦｃドメインにおいてＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を有すること、又はこれらの変異の任意又は全ての組み合わせによって得られる。

【0025】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、
いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール構造によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、上記ｋｎｏｂ（ノブ）部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃ領域であるか、又はＴ３６６Ｗの改変を含み、上記ｈｏｌｅ（ホール）部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域であるか、又はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、
いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール構造によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、上記ｋｎｏｂ（ノブ）部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｗ及びＭ４２８Ｌの改変を含み、上記ｈｏｌｅ（ホール）部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域に基づき、配列改変を含み、また上記配列改変は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、且つ上記二重特異性抗体は、ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域においてＭ４２８Ｌの改変を更に含む。

【0026】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、
上記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つの配列改変を含み、
上記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
上記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
（１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
（２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含み、
上記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール構造によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、上記ｋｎｏｂ（ノブ）部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｗ及びＭ４２８Ｌの改変を含み、上記ｈｏｌｅ（ホール）部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域に基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、上記二重特異性抗体は、ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域においてＭ４２８Ｌの改変を更に含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、
上記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つの配列改変を含み、
上記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
上記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
（１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
（２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含み、
上記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール構造によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、上記ｋｎｏｂ（ノブ）部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｗ及びＭ４２８Ｌの改変を含み、上記ｈｏｌｅ（ホール）部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域に基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、上記二重特異性抗体は、ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域においてＭ４２８Ｌの改変を更に含み、
且つ、上記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体である。

【0028】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７、及びＴ５８から選ばれる。

【0029】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、脱フコシル化Ｔ５１（Ｔ５１－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５２（Ｔ５２－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５３（Ｔ５３－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５５（Ｔ５５－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５６（Ｔ５６－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５７（Ｔ５７－ＡＦ）、及び脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれる。

【0030】

上記毒素は、メイタンシン類、ヘミアスタリン類、アマニチン類、アウリスタチン類、カリケアミシン類又はデュオカルマイシン類、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0031】

いくつかの実施形態において、上記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマヌリン、アマニン、アマニンアミド、γ－アマニン、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、カリケアミシンγ、デュオカルマイシンＡ、ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ及びＣＣ－１０６５、並びにそれらの重水素化物から選ばれる。

【0032】

上記リンカーは、切断可能なリンカー及び非切断可能なリンカーから選ばれ、上記リンカーにおける１つ又は複数の水素原子は、任意選択的に重水素化され、上記切断可能なリンカーは、化学的に切断可能なリンカー及び／又は酵素的に切断可能なリンカーを含むが、これらに限定されず、上記酵素的に切断可能なリンカーは、例えばペプチド成分を含むリンカーである。

【0033】

いくつかの実施形態において、上記酵素的に切断可能なリンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0034】

いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物を提供し、
上記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、
上記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つの配列改変を含み、
上記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
上記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
（１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
（２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含み、
上記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール構造によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、上記ｋｎｏｂ（ノブ）部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｗ及びＭ４２８Ｌの改変を含み、上記ｈｏｌｅ（ホール）部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域に基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、上記二重特異性抗体は、ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域においてＭ４２８Ｌの改変を更に含み、
上記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体であり、
上記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、
上記リンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0035】

いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物を提供し、
上記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、
上記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つの配列改変を含み、
上記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
上記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
（１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
（２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含み、
上記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール構造によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、上記ｋｎｏｂ（ノブ）部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｗ及びＭ４２８Ｌの改変を含み、上記ｈｏｌｅ（ホール）部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域に基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、上記二重特異性抗体は、ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域においてＭ４２８Ｌの改変を更に含み、
上記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体であり、
上記毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ及びその重水素化物から選ばれ、
上記リンカーは、バリン－シトルリン及びその重水素化物から選ばれる。
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物を提供し、
（１）上記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８から選ばれ、いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ、及びＴ５８－ＡＦであり、
（２）上記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、いくつかの実施形態において、上記毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ及びその重水素化物から選ばれ、
（３）上記リンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、いくつかの実施形態において、上記リンカーは、バリン－シトルリン及びその重水素化物である。

【0036】

いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物を提供し、
（１）上記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８並びに脱フコシル化抗体Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ及びＴ５８－ＡＦから選ばれ、
（２）上記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、
（３）上記リンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0037】

いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物を提供し、
（１）上記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８並びに脱フコシル化抗体Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ及びＴ５８－ＡＦから選ばれ、
（２）上記毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ及びその重水素化物から選ばれ、
（３）上記リンカーは、バリン－シトルリン及びその重水素化物から選ばれる。

【0038】

いくつかの実施形態において、上記バリン－シトルリンリンカーは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、ｐ－アミノベンジルアルコールを介してモノメチルアウリスタチンＥ毒素に連結される。

【0039】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）は、約１～６、例えば、約１、２、３、４、５、６、例えば、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５である。

【0040】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（Ｉ）に示される通りである：

【化1】

そのうち、

【化2】

は、上記二重特異性抗体を表し、中間部分は、リンカーとしてのバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃと略称される）部分であり、リンカーは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して最も右側のＤｒｕｇ（毒素部分）に連結される。

【0041】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造においてさらに明確されるＤＡＲ値（ｎ）は、以下の式（Ｉ’）に示される通りである：

【化3】

そのうち、

【化2】

は、上記二重特異性抗体を表し、中間部分は、リンカーとしてのバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃと略称される）部分であり、リンカーは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して最も右側のＤｒｕｇ（毒素部分）に連結され、上記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、
ｎは、平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）を表し、ｎは、１～６から選ばれ、例えば、約１、２、３、４、５、６、例えば、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５である。

【0042】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（Ｉ’）に示される通りである：

【化3】

そのうち、

【化2】

は、二重特異性抗体を表し、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７、及びＴ５８、並びに脱フコシル化抗体Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ、及びＴ５８－ＡＦから選ばれ、中間部分は、リンカーとしてのバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃと略される）部分であり、リンカーは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して最も右側のＤｒｕｇ（毒素部分）に連結され、上記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、
ｎは、平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）を表し、ｎは、３～４から選ばれ、例えば、約３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４である。

【0043】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（ＩＩ）に示される通りである：

【化4】

そのうち、

【化2】

は、上記二重特異性抗体を表し、［ ］における構造は、リンカー－毒素部分Ｖｃ－ＭＭＡＥであり、Ｖｃは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、Ｖｃは、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して毒素としてのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に連結される。式中、ｎはＤＡＲ値であり、ｎは１～６、例えば約１、２、３、４、５、６、例えば３～４、例えば約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．６５、３．７、３．７５、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５である。

【0044】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）は、３～４、例えば、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．６５、３．７、３．７５、３．８、３．９、４である。

【0045】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（ＩＩ）に示される通りである：

【化4】

そのうち、

【化2】

は、二重特異性抗体を表し、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８、並びに脱フコシル化抗体Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ及びＴ５８－ＡＦから選ばれ、［ ］における構造は、リンカー－毒素部分Ｖｃ－ＭＭＡＥであり、Ｖｃは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、Ｖｃは、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して毒素としてのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に連結される。式中、ｎはＤＡＲ値であり、ｎは、３～４から選ばれ、例えば、約３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４である。

【0046】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（ＩＩ）に示される通りである：

【化4】

そのうち、

【化2】

は、二重特異性抗体を表し、Ｔ５４、Ｔ５８、並びに脱フコシル化抗体Ｔ５４－ＡＦ及びＴ５８－ＡＦから選ばれ、［ ］における構造は、リンカー－毒素部分Ｖｃ－ＭＭＡＥであり、Ｖｃは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、Ｖｃは、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して毒素としてのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に連結される。式中、ｎはＤＡＲ値であり、ｎは、３～４から選ばれ、例えば、約３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４である。

【0047】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７、及びＴ５８から選ばれる。

【0048】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、脱フコシル化Ｔ５１（Ｔ５１－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５２（Ｔ５２－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５３（Ｔ５３－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５５（Ｔ５５－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５６（Ｔ５６－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５７（Ｔ５７－ＡＦ）、及び脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれる。

【0049】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、Ｔ５４、Ｔ５８、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）、及び脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれる。

【0050】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）及び脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれる。

【0051】

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、Ｔ５１－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＭＭＡＥ、Ｔ５４－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＭＭＡＥ、Ｔ５８－ＭＭＡＥ、及び対応する脱フコシル化二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５１－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＡＦ－ＭＭＡＥとＴ５８－ＡＦ－ＭＭＡＥである。

【0052】

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、Ｔ５４－ＭＭＡＥとＴ５８－ＭＭＡＥ、及び対応する脱フコシル化二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥとＴ５８－ＡＦ－ＭＭＡＥである。

【0053】

本発明の別の態様によれば、上記の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物又はその重水素化物、及び薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

【0054】

本発明の別の態様によれば、がんの予防及び／又は治療のための薬物の製造における、上記の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は上記の医薬組成物の応用を提供する。
いくつかの実施形態において、上記がんは、ＨＥＲ２を発現するがんである。
いくつかの実施形態において、上記がんは、ＨＥＲ２が中レベルから低レベルまで発現されるがんである。
いくつかの実施形態において、上記がんは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、胃がん、食道がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、胆管がん及び結腸直腸がんを含む。

【0055】

本発明は、抗腫瘍併用製剤の製造における、上記の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は医薬組成物の応用に関し、上記併用製剤において、任意選択的に、
（１）ＨＥＲ２以外の他の標的を標的とする薬物、
（２）細胞治療薬、
（３）免疫療法薬という腫瘍を治療する活性成分も含まれる。

【0056】

本発明の別の態様によれば、がんの予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の上記の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は上記の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、上記がんは、ＨＥＲ２を発現するがんである。
いくつかの実施形態において、上記がんは、ＨＥＲ２が中レベルから低レベルまで発現されるがんである。
いくつかの実施形態において、上記がんは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、胃がん、食道がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、胆管がん及び結腸直腸がんを含む。

【0057】

本発明は、がんの治療における、上記の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は医薬組成物の応用であって、がんを治療する以下の薬物又は治療レジメンと組み合わせて使用されることを特徴とする応用に更に関する：
（１）ＨＥＲ２以外の他の標的を標的とする薬物、
（２）細胞治療薬、
（３）免疫療法薬、
（４）手術、
（５）放射線療法などの物理療法。

【0058】

本発明は、以下の有益な効果を有する。
（１）本発明による二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物又はその重水素化物は、優れた抗腫瘍活性を有し、特定の用量で、複数の異なるタイプのマウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性がＴＤＭ１（又はＤＳ８２０１）よりも優れており、ＴＤＭ１（又はＤＳ８２０１）と比べ、同じ用量で、より短い時間で腫瘍の増殖をより良好に阻害することができる。
（２）本発明による二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物又はその重水素化物は、良好な耐性及び低い毒性を有する。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1】抗体Ａ及び抗体Ｂから設計された相同軽鎖を有する二重特異性抗体のＦａｂ－Ｉｇ形態の概略図である。

【図2】抗体Ａ及び抗体Ｂから設計された相同軽鎖を有する二重特異性抗体のＩｇ－Ｆａｂ形態の概略図である。

【図3】ノブ・イントゥ・ホール構造によって連結された、抗体Ａ及び抗体Ｂから設計された、相同軽鎖を有する二重特異性抗体のヘテロ二量体ＩｇＧ形態の概略図である。

【図4】静電ステアリング機構によって連結された、抗体Ａ及び抗体Ｂから設計された相同軽鎖を有する二重特異性抗体のヘテロ二量体ＩｇＧ形態の概略図である。

【図5】横軸が時間（ｍｉｎ）を示し、縦軸が吸光度値（ｍＡＵ）を示す、抗体Ｔ５４（５Ａ）及びＴ５４－ＡＦ（５Ｂ）のＳＥＣ純度を示すグラフである。

【図6】横軸が時間（ｍｉｎ）を示し、縦軸が吸光度値（ｍＡＵ）を示す、抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥ（６Ａ）及びＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ（６Ｂ）のＳＥＣ純度を示すグラフである。

【図7】横軸が時間（ｍｉｎ）を示し、縦軸が吸光度値（ｍＡＵ）を示す、抗体Ｔ５４のＨＩＣ－ＨＰＬＣ結果を示すグラフである。

【図8】横軸が時間（ｍｉｎ）を示し、縦軸が吸光度値（ｍＡＵ）を示す、抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥ（８Ａ）及びＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ（８Ｂ）のＨＩＣ－ＨＰＬＣ結果を示すグラフである。

【図9】横軸が濃度の対数を示し、縦軸がＯＤ_４５０値を示す、陽性対照ＡＤＣ（ＤＳ８２０１）、Ｔ５４－ＡＦ及びＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ（Ｔ５４－ＡＦ－ＡＤＣ）とＨＥＲ２抗原との結合曲線グラフである。

【図10】横軸が濃度の対数を示し、縦軸が乳がん細胞ＳＫＢＲ３の細胞生存率を示す、乳がん細胞ＳＫＢＲ３に対する抗体ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｔ５４、及びそれぞれ対応するコンジュゲートＴＤＭ１、Ｔ５４－ＭＭＡＥの増殖阻害曲線を示すグラフである。

【図11】横軸が濃度の対数を示し、縦軸が胃がん細胞Ｎ８７の細胞生存率を示す、胃がん細胞Ｎ８７に対する抗体ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｔ５４及びそれぞれに対応するコンジュゲートＴＤＭ１、Ｔ５４－ＭＭＡＥの増殖阻害曲線を示すグラフである。

【図12】（Ａ）がＢＴ４７４細胞株、（Ｂ）がＮＣＩ－Ｈ２１７０細胞株、（Ｃ）がＭＤＡ－ＭＢ－１７５ＶＩＩ細胞株、（Ｄ）がＳＫＯＶ－３細胞株、（Ｅ）がＭＣＦ－７細胞株、（Ｆ）がＭＤＡ－ＭＢ－４３５細胞株、（Ｇ）がＮＣＩ－Ｈ４４６細胞株である、各細胞株に対するＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ、ＤＳ８２０１、Ｔ５４－ＡＦ、ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｐｅｒｊｅｔａ、Ｉｓｏｔｙｐｅ（アイソタイプ対照、陰性抗体として）の阻害効果を検出する図である。

【図13】横軸が腫瘍移植後の日数を示し、縦軸が腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す、抗体薬物コンジュゲートＴＤＭ１及びＴ５４－ＭＭＡＥによる治療開始後のヒト乳がん異種移植モデルＢＴ４７４の増殖曲線を示すグラフである。

【図14】横軸が腫瘍移植後の日数を示し、縦軸が腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す、陽性対照ＡＤＣ（ＤＳ８２０１）及び脱フコシル化二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ（Ｔ５４－ＡＦ－ＡＤＣ）による治療開始後のヒト乳がん異種移植モデルＢＴ４７４の増殖曲線を示すグラフである。

【図15】横軸が腫瘍移植後の日数を示し、縦軸が腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す、陽性対照ＡＤＣ（ＤＳ８２０１）及び脱フコシル化二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ（Ｔ５４－ＡＦ－ＡＤＣ）による治療開始後のヒト異種移植胃がんモデルＮ８７の増殖曲線を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0060】

本発明は、二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物を開示し、上記二重特異性抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩを認識及び／又は結合し、且つＨＥＲ２のドメインＩＶを認識及び／又は結合し、上記毒素は、メイタンシン類、ヘミアスタリン類、アマニチン類、アウリスタチン類、カリケアミシン類又はデュオカルマイシン類から選ばれ、上記リンカーは、切断可能なリンカー及び非切断可能なリンカーから選ばれ、上記毒素及び／又はリンカーにおける１つ又は複数の水素原子は、任意選択的に重水素化される。

【0061】

本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、天然に存在する哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）（ＩｇＧがその例である）の一般的な構造を有する分子を指す。即ち、１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含む２本の同一軽鎖、及び１つの可変ドメイン及び３つの定常ドメインを含む２本の同一重鎖である。軽鎖及び重鎖は、それらの可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメインによって互いに結合される。これらの２本の重鎖は、第２及び第３の定常ドメインによって互いに結合される。抗体の抗原結合部位は、２つの可変ドメインによって形成され、特に各可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって形成される。抗体が分子と特異的に相互作用し、分子に吸着することができると、抗体が分子（抗原）に結合すると称される。抗体結合は、非特異的又は低親和性相互作用を含まない。「抗体」の意味は、天然に存在する免疫グロブリンの構造を指すが、キメラ、ＣＤＲ移植、及びヒト化抗体などのそのような一般的な構造を保持する設計分子も含む。

【0062】

本明細書で使用されるように、「エピトープ」という用語は、抗体（又は抗体構築物）の抗原結合部位との接触によって、抗原の抗体（又は抗体構築物）への特異的結合を媒介する、抗原上の部分を指す。

【0063】

本明細書で使用されるように、「パラトープ」という用語は、抗原のエピトープとの接触によって、抗体（又は抗体構築物）への抗原の特異的結合を媒介する、抗体（又は抗体構築物）上の部分を指す。

【0064】

本明細書で使用されるように、「改変」、「変異」及び「置換」（及びそれらの文法的形態）という用語は、アミノ酸配列における操作された変化を指す。文脈上別段の指示がない限り、変異は、人的支援による生物学的プロセスによって引き起こされる配列変化を指す。従来、置換は、参照配列中のアミノ酸の一文字コード、参照配列での位置、及び生成された配列中のアミノ酸の一文字コードの３つの部分で表される。例えば、Ａ２６Ｓは、参照配列の２６番目のアラニン（Ａ）が、生成された配列においてセリン（Ｓ）に変更されたことを示す。

【0065】

本明細書で使用するように、「相同」という用語は、２本以上のペプチド鎖のアミノ酸配列が完全に同一であることを意味する。
本明細書で使用されるように、「異種」という用語は、２本以上のペプチド鎖のアミノ酸配列が異なり、完全に同一ではないことを意味する。

【0066】

本明細書で使用されるように、「重水素化物」、「重水素化」という用語は、抗体薬物コンジュゲート構造中の１つ又は複数の水素原子（Ｈ－１）が重水素原子（Ｈ－２）で置換された構造を指す。

【0067】

本発明における化合物の任意の原子は、特に指定しない限り、この原子の任意の安定な同位体を表すことができる。特に明記しない限り、構造内のある位置がＨ、即ち水素（Ｈ－ｌ）と定義される場合、その位置は、天然に存在する同位体のみを含む。同様に、特に明記しない限り、構造内のある位置がＤ、即ち重水素（Η－２）と定義される場合、その位置に含まれる同位体の含有量は、天然に存在する同位体の含有量（０．０１５％）より少なくとも３３４０倍多く（即ち、少なくとも５０．１％の重水素同位体を含む）、本願の化合物の構造内のある位置又はそれ以上の位置がＤ、即ち重水素（Η－２）と定義される場合、その構造によって示される化合物の含有量は、少なくとも５２．５％、少なくとも６０％、少なくとも６７．５％、少なくとも７５％、少なくとも８２．５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％であってもよい。

【0068】

本願の化合物の重水素化率は、天然に存在する同位体の含有量に対する標識合成された同位体の含有量の比を指す。本願の化合物の指定された各重水素原子の重水素化率は、少なくとも３５００倍（５２．５％）、少なくとも４０００倍（６０％）、少なくとも４５００倍（６７．５％）、少なくとも５０００倍（７５％）、少なくとも５５００倍（８２．５％）、少なくとも６０００倍（９０％）、少なくとも６３３３．３倍（９５％）、少なくとも６４６６．７倍（９７％）、少なくとも６５６６．７倍（９８．５％）、少なくとも６６００倍（９９％）、少なくとも６６３３．３倍（９９．５％）であってもよい。

【0069】

本願におけるアイソトポローグ（ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｕｅｓ）とは、化学構造的に同位体組成のみが異なる化合物を意味する。特定の位置に重水素を含む本願の化合物は、その位置における水素アイソトポローグも非常に少なく、本願の重水素化化合物における重水素化位置の水素アイソトポローグの含有量は、重水素化試薬（Ｄ２Ｏ、Ｄ２、ＮａＢＤ４、ＬｉＡｌＤ４など）の重水素同位体の純度、及び重水素同位体を導入する合成方法の有効性を含む多くの要因に依存する。しかし、前述のように、このような重水素化位置の水素アイソトポローグの総含有量は４９．９％未満になる。本願の重水素化化合物における重水素化位置の水素アイソトポローグの総含有量は、４７．５％、４０％、３２．５％、２５％、１７．５％、１０％、５％、３％、１％又は０．５％未満になる。

【0070】

本願において、重水素と指定されていない任意の各原子は、その天然同位体存在度で存在する。
本願において、軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列の番号付けは、いずれもＶａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２０：４１５（２００２）に基づいており、Ｋａｂａ番号付けを使用する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２、ｐｐ６６２、６８０、６８９）（１９９１）。

【0071】

二重特異性抗体
本発明の二重特異性抗体は、多くの異なる全体構造を採用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、同じ抗原又は異なる抗原における２つのエピトープに対して特異的である。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、２つのパラトープを有する。

【0072】

重鎖が、同数のパラトープの形成を促進する、例えば３、４、５、又はそれ以上の可変ドメインを含むように、各重鎖に追加の可変ドメインを付加することができることを理解すべきである。これらの多重パラトープ抗体において、第３のパラトープは、抗体が三重特異性を有するように第３のエピトープに特異性を付与し得る。或いは、第３のパラトープは、抗体が依然として二重特異性を有するが、エピトープのうちの１つの価数を増加させるように、最初の２つのパラトープのいずれかによって認識されたエピトープのうちの１つに特異的であり得る。同様に、第４のパラトープは、抗体構築物が四重特異性を有するように第４のエピトープに特異的であり得るか、又は抗体構築物が三重特異性又は二重特異性を有するように最初の３つのパラトープのいずれかによって認識されたエピトープのうちの１つに特異的であり得る。

【0073】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩを認識及び／又は結合することができる第１のパラトープと、ＨＥＲ２のドメインＩＶを認識及び／又は結合することができる第２のパラトープとを含む。
いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、上記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、
ａ）Ｓ５６Ｙ／Ｔ／Ａのいずれか、
ｂ）Ｎ３０Ｓ／Ａのいずれか、
ｃ）Ｔ９４Ｗ／Ｆ／Ｙのいずれか、
ｄ）Ｈ９１Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、
ｅ）Ｐ９６Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、又は
ｆ）ａ）～ｅ）の５つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
いくつかの実施形態において、上記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つという配列改変を含み、
上記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示される。
上記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
（１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、
ｉ）Ｔ３０Ａ／Ｓ／Ｎ／Ｄ、
ｉｉ）Ｇ５６Ａ／Ｓ／Ｔ、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
いくつかの実施形態において、上記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
（２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、
ｉ）Ｎ５４Ｔ／Ｓ／Ａ、
ｉｉ）Ｄ９８Ｓ／Ｗ／Ｔ／Ｒ、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
いくつかの実施形態において、上記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、上記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含む。
いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、Ｆａｂ－Ｉｇ、Ｉｇ－Ｆａｂ、又はヘテロ二量体Ｉｇの形態である。
いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、ヘテロ二量体Ｉｇの形態である。

【0075】

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ」又は「Ｆｃドメイン」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。当該用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。本明細書で特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムによるものである。

【0076】

定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤのようなヒト免疫グロブリンであり、又はＩｇＧ及びそのアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の定常ドメインであり、又はこれらのタイプ及びアイソタイプから組換えられたＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインの組み合わせである。

【0077】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体のＦｃは、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ６４及びＣ１ｑタンパク質など）に対する結合親和性の増加又は減少により、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性が増加したＦｃを含む。これには、ＡＤＣＣで強化された脱フコシル化抗体が含まれるが、これに限定されず、取得方法は以下の通りである：（１）フコシル化欠損（ＦＵＴ８遺伝子のノックアウトなど）を有する宿主細胞において二重特異性抗体を産生することによる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２、２００４）、（２）抗体のＦｃドメインにおいてＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）又はこれらの変異の任意又は全ての組み合わせを有する（Ｌａｚａｒ ＧＡ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３（１１）：４００５－４０１０、２００６）、又は（３）中国特許出願ＣＮ２０１６１０１９４３２５．７に示される通りである。

【0078】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を低下させるために、Ｆｃドメインにおいて変異を含む。これらには、Ｆｃドメインにおいて、（１）限定されないが、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＧなどのＮ２９７の変異、（２）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４ＧなどのＬ２３４の変異、及び／又はＬ２３５Ａ又はＬ２３５ＧなどのＬ２３５の変異、（３）Ｐ３２９ＧなどのＰ３２９の変異、又は（４）Ｄ２６５ＡなどのＤ２６５の変異、又は任意又は全てのこれらの位置での置換の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。

【0079】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ変異（全ての番号付けは、いずれもＫａｂａｔ番号システムのＥｕインデックスである）は、血清半減期を増加させる変異を含む。一実施形態において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ３におけるＴ２５０Ｑ、又はＭ４２８Ｌ、又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異 （Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６、２００４）という置換を有する。別の実施形態において、二重特異性抗体のＦｃは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ三重変異を有する（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６９（９）：５１７１－８０，２００２）。別の実施形態において、二重特異性抗体のＦｃは、Ｎ４３４Ａ変異（Ｐｅｔｋｏｖａ ＳＢ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１８（１２）：１７５９－１７６９、２００６．）又はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ二重変異、又はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ二重変異（Ｚａｌｅｖｓｋｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（２）：１５７－１５９、２０１０）を有する。

【0080】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体のＦｃ領域は、その血清半減期を増加させるように既に改変されている。いくつかの実施形態において、血清半減期を増加させる改変はＭ４２８Ｌである。

【0081】

本発明の二重特異性抗体は、Ｆａｂ－Ｉｇ（図１に示す）又はＩｇ－Ｆａｂ（図２に示す）などのホモ二量体形態（２つの同じ重鎖を含む）であってもよい。アダプター、任意の組成の０～１００アミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）は、例えば（Ｇ_３Ｓ）_ｎＧ_３であり、そのうち、ｎは、１～２０の間の任意の数である（表８に示す）。

【0082】

本発明の二重特異性抗体は、ヘテロ二量体Ｉｇの形態であってもよい。２つの異なる抗体からの２つの異なる重鎖は、ノブ・イントゥ・ホール構造（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ、図３に示す）、静電ステアリング機構（図４に示す）などを含むがこれらに限定されない当該技術分野において記載される技術により、ヘテロ二量体を形成することができる。

【0083】

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、国際特許公開ＷＯ２０１８／１９１１８８Ａ１号に開示されたものから選ばれる。
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７、及びＴ５８から選ばれる。

【0084】

Ｔ５１～Ｔ５８という８つの二重特異性抗体において、Ｔ５４及びＴ５８は、ヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、ノブ・イントゥ・ホール構造（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）を採用し、残りの６つは、いずれもホモ二量体形態であり、そのうち、Ｔ５３及びＴ５７は、Ｉｇ－Ｆａｂ形態であり、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５５及びＴ５６は、Ｆａｂ－Ｉｇ形態である。

【0085】

Ｔ５１～Ｔ５８という８つの二重特異性抗体に対応する重鎖のコード及びそれらのアミノ酸配列を、表８及び表９に示す。

【0086】

Ｔ５１～Ｔ５８の相同軽鎖は、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインから出発し、部位変異により得られ、変異方法として、例えば、Ｎ３０からＳ（Ｎ３０Ｓ）、Ｓ５６からＹ（Ｓ５６Ｙ）、又はＴ９４からＷ（Ｔ９４Ｗ）への変異、又はＮ３０Ｓ／Ｓ５６Ｙ、Ｎ３０Ｓ／Ｔ９４Ｗ、Ｓ５６Ｙ／Ｔ９４Ｗ、Ｎ３０Ｓ／Ｓ５６Ｙ／Ｔ９４Ｗなどの上記突然変異のうちの２つ又は３つの任意の組み合わせであってもよい。Ｔ５１～Ｔ５８に対応する軽鎖のコードを表８に示し、基本としてのトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列を配列番号５に示す。

【0087】

本明細書により開示される二重特異性抗体は、組換え方法によって産生することができる。組換え生産のための方法は、当該技術分野において周知であり、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質発現、その後の二重特異性抗体の単離、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞における上記抗体の発現のために、抗体配列をコードする核酸は、標準的方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの適切な原核生物又は真核生物宿主細胞において行われ、抗体は、細胞（溶解した細胞又は上清）から回収される。

【0088】

従って、本明細書により開示されるいくつかの実施形態は、ａ）抗体をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの発現ベクターで宿主細胞を形質転換するステップと、ｂ）抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養するステップと、ｃ）培養物から抗体を回収するステップとを含む、二重特異性抗体を製造するための方法を含む。

【0089】

抗体は、プロテインＡ－アガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地から適切に単離される。

【0090】

本明細書で使用されるように、「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」という表現は、交換可能に使用され、このような名称は、すべて子孫を含む。「形質転換株」及び「形質転換細胞」という用語は、初代試験細胞及び継代回数に関係なく、それに由来する培養物を含む。また、意図的な又は意図しない変異のために、全ての子孫のＤＮＡ含有量が完全に同一でない可能性があることも理解される。子孫は、元の形質転換細胞においてスクリーニングされ、同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫を含む。別個の名称が意図されている場合は、「細胞」、「細胞系」又は「細胞培養物」であることは、文脈から明らかに理解される。

【0091】

本明細書で使用されるように、「形質転換」という用語は、ベクター／核酸を宿主細胞に形質転換するプロセスを指す。強力な細胞壁バリアを有さない細胞を宿主細胞として用いると、例えば、リン酸カルシウム沈殿法によってトランスフェクトすることができる。しかし、核注入又はプロトプラスト融合による方法などの、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法を用いることもできる。原核細胞や堅い細胞壁構造を有する細胞を用いると、例えば、トランスフェクション法として、塩化カルシウムによるカルシウム処理が挙げられる。

【0092】

本明細書で使用するように、「発現」は、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（転写物とも呼ばれる）が続いてペプチド類、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称されてもよい。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから由来する配列を含むと、真核細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。

【0093】

「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞内に、及び／又は宿主細胞間に移送する核酸分子、特に自己複製核酸分子である。この用語は、細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入（例えば、染色体組み込み）に主に使用されるベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に使用される複製ベクター、並びにＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳に使用される発現ベクターを含む。１種以上の上記機能を提供するベクターを更に含む。

【0094】

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入される場合、ポリペプチドに転写・翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、一般に、所望の発現産物を産生するために使用され得る発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を指す。

【0095】

本明細書で使用されるように、「宿主細胞」という用語は、本明細書に開示の抗体を産生するように操作され得る任意のタイプの細胞系を指す。いくつかの実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞は、宿主細胞として使用される。
原核生物に適した調節配列は、例えば、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

【0096】

核酸が別の核酸配列と機能的関係にある場合、この核酸は、「操作可能に連結されている」。例えば、リーダー配列又は分泌リーダーのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されると、そのＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼすと、そのプロモーター又はエンハンサーは、コード配列に操作可能に連結され、或いは、リボソーム結合部位が翻訳を容易にするために位置づけられると、そのリボソーム結合部位は、コード配列に操作可能に連結される。一般に、「操作可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には連続しており、且つリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、必ずしも連続的である必要はない。同様に、いくつかの場合において、イントロンは、操作可能に連結された核酸配列間に存在してもよい。連結は、好都合な制限部位での連結反応によって達成される。このような部位が存在しないと、従来の実施のように、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はアダプターを利用する。

【0097】

抗体をコードする核酸配列は、文献から容易に得ることができるか、又は予想される宿主細胞の好ましいコドンを参照して、逆翻訳によって得ることができる。コード核酸は、化学的に合成されたポリヌクレオチド及び／又は予めクローニングされた抗体コードＤＮＡから、おそらく部位特異的変異によって、組み立てられてもよい。

【0098】

抗体の組換え生産のために、この抗体をコードする核酸を単離し、更なるクローニング（ＤＮＡ増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入することができる。抗体をコードするＤＮＡは、従来のプロセスを用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定を行うことができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般にシグナル配列、複製起点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列のうちの１つ又は複数を含むが、それらに限定されず、例えばＵＳ５，５３４，６１５に記載されているように、タンパク質発現に関する全ての開示は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

【0099】

ベクターにおいてＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した本明細書の宿主細胞は、前述した原核細胞、酵母又は高等真核細胞である。この目的のために適した原核生物としては、例えば、グラム陰性生物及びグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などのバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナスのようなシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が挙げられる。例示的な大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も好適である。これらの例は、例示的であり、限定的ではない。

【0100】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、よく見られているパン酵母であり、下等真核宿主微生物において最も一般的に使用されている酵母である。しかし、多くの他の属、種及び株も、本明細書ではよく見られており、利用可能であり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クリベロミセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、クルイベロマイセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．Ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、クルベロミセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）などのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュバニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主である。

【0101】

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、植物及び昆虫細胞などの無脊椎動物細胞を含む多細胞生物に由来する。数多くのバキュロウイルス株及び変異体、並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの対応する許容される昆虫宿主細胞は、既に同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体及びカイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特に、ツマジロクサヨトウ細胞のトランスフェクションのための、本発明による本明細書のウイルスとして用いることができる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物は、宿主として用いられてもよい。

【0102】

しかし、脊椎動物細胞に対する関心は最も高く、培養物（組織培養物）における脊椎動物細胞の増殖は、従来のプロセスとなっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚性腎臓株（２９３又は浮遊培養物での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウス支持細胞（ｓｅｒｔｏｌｉ ｃｅｌｌｓ）（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝がん細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞が挙げられる。

【0103】

宿主細胞は、抗体産生のために上記発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適した、改変された従来の栄養培地で培養される。
抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてもよい。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０及びＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。更に、ＵＳ４，７６７，７０４、ＵＳ４，６５７，８６６、ＵＳ４，９２７，７６２、ＵＳ４，５６０，６５５又はＵＳ５，１２２，４６９、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５又はＵＳＲｅ．３０，９８５に開示されている培地は、宿主細胞の培地として用いることができる。これらの培地のいずれかは、いずれも必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン^ＴＭなど）、微量元素（一般的にマイクロモルの範囲において最終濃度で存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に既知の適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために以前に選ばれた宿主細胞によって使用されるものであり、当業者には明らかである。

【0104】

組換え技術が用いられる場合、抗体は、細胞内、ペリプラズム空間において産生されるか、又は培地に直接分泌されてもよい。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、粒子断片は、宿主細胞であっても溶解断片であっても、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去することができる。

【0105】

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる。全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３について、タンパク質Ｇを使用することが推奨される。アフィニティーリガンドが付着するマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも存在する。制御細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成可能なものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ^ＴＭ樹脂は、精製に用いられてもよい。回収される抗体に応じて、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も利用可能である。

【0106】

任意の予備精製ステップ（１つ以上のステップ）の後、目的の抗体及び汚染物質を含む混合物は、ｐＨが約２．５～４．５の溶出緩衝液を使用して、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供されてもよく、好ましくは低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で行う。

【0107】

精製されると、抗体は、任意の薬学的に許容される緩衝液、塩、又は他の賦形剤を含む水性溶媒に溶解することができる。溶解した抗体は、使用前に冷蔵又は冷凍することができる。或いは、凍結乾燥し、使用直前に再構成することもできる。

【0108】

毒素
抗体とのコンジュゲーションに用いられる毒素は、一般に、以下の３つの条件を満たす必要がある。（１）有糸分裂の遮断及びＤＮＡ損傷の誘発などの作用メカニズムが明らかである。（２）ＥＣ_９０が１ｎｍｏｌ・Ｌ^－１未満であることが、一般的に要求される高活性である。（３）化学的にコンジュゲートし、腫瘍細胞内で高活性な毒素自体又はその高活性誘導体を放出することができる。

【0109】

本発明で使用される毒素は、当該技術分野で通常使用される任意の毒素であってもよく、例えば微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、及び他の毒素分子であってもよい。
いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、例えば、メイタンシン類（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ヘミアスタリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）類、アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）類、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）類、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）類又はデュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）類など、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0110】

マイタンシン類は、ＡＤＣにおいて広く使用される細胞毒素であり、チューブリンの重合作用を阻害することにより、細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ期に停止し、細胞の有糸分裂の進行を阻害し、アポトーシスを引き起こす。

【0111】

マイタンシン誘導体は、例えば、ＤＭ１、ＤＭ４、及びそれらの重水素化物であってもよい。

【化5】

【化6】

【0112】

ヘミアスタリン類は、上記元の天然製品であるヘミアスタリンで修飾されたトリペプチドであり、チューブリン重合阻害剤であり、チューブリンのビンブラスチン部位に非競合的に結合することができる。

【0113】

ヘミアスタリン誘導体は、例えば、Ｅ７９７４（エーザイ）、ＨＴＩ－２８６（ワイス）、及びそれらの重水素化物であってもよい。

【化7】

【0114】

アマニチン類は、毒キノコから抽出され、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩに効率的に結合できる二環式オクタペプチドであり、ＤＮＡ転写を停止させることにより細胞を死滅させ、このような分子は、高い親水性及び高い選択毒性を有する。
アマニチン類は、例えば、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマヌリン又はアマヌリン酸のジデオキシ変異体、又はアマニン、アマニンアミド、γ－アマニン又はγ－アマニンアミドのモノデオキシ変異体など、及びそれらの重水素化物であってもよい。

【0115】

アウリスタチン類は、アプリシアトキシン１０の合成誘導体であり、チューブリン重合を阻害することによって、効果的な有糸分裂阻害作用を達成する。アウリスタチン類は、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＶＢ（ＡＥＶＢ）及びアウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、並びにそれらの重水素化物であってもよい。

【化8】

【化9】

【0116】

カリケアミシン類には７つの主要な誘導体があり、その中でもカリケアミシンγの活性が最も高く、臨床的に最も多く使用される。カリケアミシンは、オリゴ糖、カリケアミシン、及びメチルトリスルフィドの３つの部分を含み、メチルトリスルフィドは、イニシエーターとして機能し、還元後にＢｅｒｇｍａｎ転位反応を開始し、ＤＮＡ切断をもたらす。

【0117】

デュオカルマイシン類は、ＤＮＡの小溝を特異的に認識し、ＤＮＡ塩基のアデニンのＮ３位を効率的にアルキル化することができ、高い抗がん活性を有する。デュオカルマイシン類は、例えば、デュオカルマイシンＡ、ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ、ＣＣ－１０６５、及びそれらの重水素化物であってもよい。

【化10】

【化11】

【化12】

【0118】

本発明で使用される毒素は、例えば、デュオカルマイシン類、ドキソルビシン類（例えば、モルホリノ－ドキソルビシン及びシアノモルホリノ－ドキソルビシン）、ドラスタチン、ｄｏｌｅｓｔａｔｉｎ－１０、コンブレタスタチン、カリケアミシン、ｔｕｂｕｌｙｓｉｎｓ、ｄｉｓｏｒａｚｏｌｅ、エポチロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ－３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、メトプテリン、セマドチン、ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ、メトトレキサート、メチル葉酸、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、メルカプトプリン、メルファラン、ビンロイロシン、ｌｅｕｒｏｓｉｄｅｉｎｅ、アクチノマイシン、ダウノルビシン及びダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド又はエトポシドリン酸塩）、ビンクリスチン、カンプトテシンなど、及びそれらの重水素化物であってもよい。

【0119】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、マイタンシン類及びそれらの重水素化物、例えばＤＭ１、ＤＭ４、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0120】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、ヘミアスタリン類及びその重水素化物、例えば、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0121】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、アマニチン類及びその重水素化物、例えば、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチンなど、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0122】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、ウリスタチン及びそれらの重水素化物から選ばれ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＶＢ（ＡＥＶＢ）、及びアウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、並びにそれらの重水素化物を含むが、これらに限定されない。

【0123】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）及びその重水素化物である。いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びその重水素化物である。

【0124】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、カリケアミシン類及びそれらの重水素化物、例えば、カリケアミシンγ及びその重水素化物から選ばれる。

【0125】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、デュオカルマイシン類及びそれらの重水素化物、例えば、デュオカルマイシンＡ、ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ、ＣＣ－１０６５、及びそれらの重水素化物から選ばれる。

【0126】

いくつかの実施形態において、本発明の毒素は、例えば、メイタンシン類（例えば、ＤＭ１、ＤＭ４）、ヘミアスタリン類（例えば、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６）、アマニチン類（例えば、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン）、アウリスタチン類（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ及びＡＦＰ）、カリケアミシン（例えば、カリケアミシンγ）、デュオカルマイシン（例えば、デュオカルマイシンＡ、ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ、ＣＣ－１０６５）など、及び上記これらの毒素の重水素化物から選ばれる。

【0127】

リンカー
本発明の二重特異性抗体薬物コンジュゲートにおいて、二重特異性抗体と毒素の連結は、リンカーによって達成される。本発明のリンカーは、単一の毒素分子を抗体上の単一部位に連結する単官能性であってもよく、２つ／複数の毒素分子を抗体上の単一部位に連結するか、又は１つの毒素分子を抗体上の２つ／複数の部位に連結する多官能性であってもよい。

【0128】

抗体薬物コンジュゲートであるリンカーは、少なくとも以下の２つの条件を満たす必要がある：（１）体内で十分に安定し、毒素の血液循環中の脱落がなく、毒素の脱落による毒性を回避する。（２）毒素を標的で効率的に放出する。

【0129】

リンカーは、切断可能なリンカー及び非切断可能なリンカーに分類することができ、上記リンカーのうちの１つ又は複数の水素原子は、任意選択的に重水素化される。切断可能なリンカーはまた、化学的に切断可能なリンカー及び酵素的に切断可能なリンカーの両方を含む。

【0130】

いくつかの実施形態において、本発明のリンカーは、切断可能なリンカー又はその重水素化物である。切断可能なリンカーは通常、細胞内条件下で、例えばリソソームによって容易に切断される。

【0131】

いくつかの実施形態において、本発明のリンカーは、化学的に切断可能なリンカー又はその重水素化物である。

【0132】

いくつかの実施形態において、本発明のリンカーは、酵素的に切断可能なリンカー又はその重水素化物である。

【0133】

酵素的に切断可能なリンカーは、例えば、ペプチド成分を含むリンカーであってもよく、上記ペプチド成分は、２つ以上のアミノ酸を含み、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断されてもよい。ペプチド成分は、天然アミノ酸残基及び／又はマイナーアミノ酸及び／又はシトルリンなどの非天然アミノ酸類似体を含んでもよい。ペプチド成分は、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ若しくはＤ又はプラスミンプロテアーゼなどの特定の酵素による酵素的切断のために、設計及び最適化することができる。

【0134】

酵素的に切断可能なリンカーは、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）又はフェニルアラニン－リジン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）を含むリンカーなどのジペプチドを含むリンカーであってもよい。リンカーに含まれる適切なジペプチドの更なる例としては、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｍｅ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－ｈｏｍｏＬｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ａｌａ－Ｐｈｅ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｍｅｔ－Ｌｙｓ、Ａｓｎ－Ｌｙｓ、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ、Ｉｌｅ－Ｖａｌ、Ａｓｐ－Ｖａｌ、Ｈｉｓ－Ｖａｌ、Ｍｅｔ－（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ－（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｖａｌ－（Ｄ）Ａｓｐ、ＮｏｒＶａｌ－（Ｄ）Ａｓｐ、Ａｌａ－（Ｄ）Ａｓｐ、Ｍｅ３Ｌｙｓ－Ｐｒｏ、フェニルＧｌｙ－（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ－（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ－（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－（Ｄ）Ｌｙｓ及びＭｅｔ－（Ｄ）Ｌｙｓが挙げられる。切断可能なリンカーは、トリペプチド、テトラペプチド、又はペンタペプチドなどのより長いペプチド成分を含んでもよい。例としては、トリペプチドＭｅｔ－Ｃｉｔ－Ｖａｌ、Ｇｌｙ－Ｃｉｔ－Ｖａｌ、（Ｄ）Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、及び（Ｄ）Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、並びにテトラペプチドＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ及びＡｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕが挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

いくつかの実施形態において、本発明のリンカーは、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）又はフェニルアラニン－リシン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）、及びそれらの重水素化物から選ばれる。いくつかの実施形態において、本発明のリンカーは、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃ）又はその重水素化物から選ばれる。

【0136】

いくつかの実施形態において、本発明のリンカーは、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃ）であり、毒素はＭＭＡＥであり、即ち、本発明のリンカー－毒素はＶｃ－ＭＭＡＥである。Ｖｃ－ＭＭＡＥ（ｍｃ－Ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ、Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ－ｖａｌｉｎｅ－ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ－ｐ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎＥ、Ｖｅｄｏｔｉｎ）の構造は、以下に示される通りである。

【化13】

【0137】

本発明のＶｃ－ＭＭＡＥ（ｍｃ－Ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）の各リンカーブロック及び毒素ＭＭＡＥは、いずれも市販の方法によって得ることができる。

【0138】

本発明に記載の「ｍｃ」とは、６－マレイミドヘキサン酸、又はそれが二重特異性抗体及び／又はリンカーと、化学結合によって連結された基を意味する。
６－マレイミドヘキサン酸（ｍｃ）の構造式は、以下の通りである：

【化14】

。

【0139】

本発明に記載の「ＰＡＢ」とは、ｐ－アミノベンジルアルコール、又はそれがリンカー及び／又は毒素と、化学結合によって連結された基を意味する。

【0140】

ｐ－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）の構造式は、以下の通りである：

【化15】

。

【0141】

二重特異性抗体薬物コンジュゲート
本発明の二重特異性抗体薬物コンジュゲートにおいて、抗体は、上記の任意の二重特異性抗体であってもよく、リンカーは、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）又はフェニルアラニン－リジン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）を含むリンカーなどのジペプチドを含むリンカーなど、上記の任意のリンカーであってもよく、毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなどの上記の任意の毒素であってもよい。

【0142】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体薬物コンジュゲートの平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）は、約１～６である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体薬物コンジュゲートの平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）は、例えば、約１、２、３、４、５、６である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲは、約２、３、４、５である。いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲは、３～４である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲは、約３、４である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲは、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５などである。

【0143】

二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（Ｉ）に示される通りである：

【化1】

そのうち、

【化2】

は、二重特異性抗体を表し、中間部分は、リンカーとしてのバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃ）部分であり、最も右側のＤｒｕｇは、毒素部分を表す。

【0144】

還元型抗体上の遊離スルフヒドリル基は、マレイミド基（例えば、６－マレイミドヘキサン酸（ｍｃ））と作用することにより、抗体とリンカー（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃ）との間の連結を実現することができる。

【0145】

リンカーは、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して、最も右側のＤｒｕｇ（毒素部分）に連結されている。

【0146】

式（Ｉ）の二重特異性抗体

【化2】

は、上記の二重特異性抗体である。

【0147】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造においてさらに明確されるＤＡＲ値（ｎ）は、以下の式（Ｉ’）に示される通りである：

【化3】

そのうち、

【化2】

は、上記の二重特異性抗体を表し、中間部分は、リンカーとしてのバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃと略称される）部分であり、リンカーは、６－マレイミドヘキサン酸を介して上記二重特異性抗体に連結され、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して最も右側のＤｒｕｇ（毒素部分）に連結され、ｎは、平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）を表し、ｎは、１～６から選ばれ、例えば、約１、２、３、４、５、６、例えば、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５である。

【0148】

二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（ＩＩ）に示される通りである。

【化4】

そのうち、

【化2】

は、二重特異性抗体を表し、［ ］における構造は、リンカー－毒素部分Ｖｃ－ＭＭＡＥであり、ｎ（即ち、平均薬物：抗体比ＤＡＲ値）は、例えば、約１～６、例えば、１、２、３、４、５、６、例えば、３～４、例えば、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５などであってもよい。

【0149】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）は、３～４、例えば、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．６５、３．７、３．７５、３．８、３．９、４である。

【0150】

還元型抗体上の遊離スルフヒドリル基は、マレイミド基（例えば、６－マレイミドヘキサン酸（ｍｃ））と作用することにより、抗体とリンカー（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃ）との間の連結を実現することができる。

【0151】

リンカーは、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して、最も右側の毒素としてのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に連結されている。

【0152】

式（ＩＩ）の二重特異性抗体

【化2】

は、上記の二重特異性抗体である。

【0153】

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、Ｔ５１－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＭＭＡＥ、Ｔ５４－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＭＭＡＥ、Ｔ５８－ＭＭＡＥであってもよい。これらの二重特異性抗体薬物コンジュゲートにおける二重特異性抗体Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８は、脱フコシル化（即ち、Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ及びＴ５８－ＡＦ）されたものであってもよく、対応する二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、Ｔ５１－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＡＦ－ＭＭＡＥ及びＴ５８－ＡＦ－ＭＭＡＥである。

【0154】

本発明に記載の「Ｔ５４－ＭＭＡＥ」は、二重特異性抗体薬物コンジュゲートを指し、具体的な構造は、Ｔ５４－（ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）ｎであり、そのうち、ｎは、平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）であり、Ｔ５４、ｍｃ、ｖｃ、ＰＡＢ及びＭＭＡＥは、上記で定義された通りである。

【0155】

本発明に記載の「Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ」は、二重特異性抗体薬物コンジュゲートを指し、具体的な構造はＴ５４－ＡＦ－（ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）ｎであり、そのうち、ｎは、平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）であり、Ｔ５４－ＡＦ、ｍｃ、ｖｃ、ＰＡＢ及びＭＭＡＥは、上記で定義された通りである。

【0156】

Ｔ５１－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＭＭＡＥ、Ｔ５８－ＭＭＡＥについて、「Ｔ５４－ＭＭＡＥ」の定義と同様になるように理解される。

【0157】

Ｔ５１－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５８－ＡＦ－ＭＭＡＥについて、「Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ」の定義と同様になるように理解される。

【0158】

二重特異性抗体薬物コンジュゲートの製造
本開示のＡＤＣは、当該技術分野で既知のいくつかの経路の１つによって、当業者に既知の有機化学反応、条件及び試薬を用いて製造することができる（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、２０１３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及び本明細書に提供される実施例を参照されたい））。例えば、コンジュゲーションは、（１）抗体の求核基又は求電子基を二官能性リンカーと反応し、共有結合を介して抗体－リンカー中間体を形成した後、活性化毒素（例えば、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなど）と反応すること、又は（２）毒素の求核基又は求電子基をリンカーと反応し、共有結合を介してリンカー－毒素を形成した後、抗体の求核基又は求電子基と反応することによって達成することができる。

【0159】

本開示のＡＤＣは、当該技術分野で既知のいくつかの経路の１つによって、当業者に既知の有機化学反応、条件及び試薬を用いて、製造することができる（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、２０１３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及び本明細書に提供される実施例を参照されたい））。例えば、コンジュゲーションは、（１）抗体の求核基又は求電子基を二官能性リンカーと反応し、共有結合を介して抗体－リンカー中間体を形成した後、活性化毒素（例えば、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなど）と反応すること、又は（２）毒素の求核基又は求電子基をリンカーと反応し、共有結合を介してリンカー－毒素を形成した後、抗体の求核基又は求電子基と反応することによって達成することができる。

【0160】

上記のように、毒素は、ＡＤＣを提供するために適切なリンカーを介して、抗体上の各基にコンジュゲートされてもよい。例えば、コンジュゲーションは、抗体表面のリジンによって、又は酸化された炭水化物によって、又は１つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合の還元によって放出されたシステイン残基によって、行われてもよい。或いは、抗体は、他のシステイン残基、又はセレノメチオニン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ホルミルグリシン、又はｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニンなどの、反応性ハンドルを提供する非天然アミノ酸を含むように修飾されてもよい。このような修飾は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、８，４５５，６２２号及び９，０００，１３０号、Ｈｏｆｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８：１２０４７～１２０５７号（２００９）、Ａｘｕｐら、ＰＮＡＳ，１０９：１６１０１～１６１０６号（２０１２）、Ｗｕら、ＰＮＡＳ，１０６：３０００～３００５号（２００９）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，２５：３５１～３６１号（２０１４）を参照されたい）。

【0161】

いくつかの実施形態において、本開示のＡＤＣは、適切なリンカーを介して、１つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合の還元によって放出された二重特異性抗体上のシステイン残基にコンジュゲートされたアウリスタチン類毒素（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）を含む。

【0162】

システイン残基とのコンジュゲーションのために、抗体鎖間ジスルフィド結合の部分還元を行い、その後リンカー－毒素とコンジュゲートすることができる。適切な還元剤は、当該技術分野において既知であり、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２－メルカプトエタノール、システアミン、及び多くの水溶性ホスフィンを含む。

【0163】

ＡＤＣの平均ＤＡＲは、ＵＶ／ＶＩＳ分光分析、ＥＬＩＳＡベースの技術、クロマトグラフィー技術（疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）など）、ＵＶ－ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＳ）、及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳなどの標準的な技術によって決定することができる。なお、薬物結合形態の分布（例えば、ＤＡＲ０、ＤＡＲ１、ＤＡＲ２などの種類の百分率）は、当該技術分野で既知の様々な技術によって分析することができ、上記技術は、ＭＳ（クロマトグラフィー分離ステップを伴ってもよく、伴わなくてもよい）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、又は等電点電気泳動（ＩＥＦ）を含む（例えば、Ｓｕｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ．、２８：１３７１－８１（２０１７）、Ｗａｋａｎｋａｒら、ｍＡｂｓ、３：１６１－１７２（２０１１）を参照する）。

【0164】

いくつかの実施形態において、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）技術によって測定される。

【0165】

コンジュゲートした後、ＡＤＣは、当該技術分野で既知の精製方法によって精製され、コンジュゲートしていない反応物及び／又は任意のコンジュゲート凝集体からも単離されてもよい。このような方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカス、限外濾過、遠心限外濾過、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0166】

本発明は、更に、上記の二重特異性抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。

【0167】

「治療」という用語は、（１）この状態、疾患又は病症に罹患する可能性があるか、又は罹患する傾向があるが、この状態、疾患又は病症の臨床的又は亜臨床的症状を経験していないか、又は示していない被験者において進行するこの状態、疾患又は病症の少なくとも１つの臨床的又は亜臨床的症状の発生を予防するか又は遅延させること、
或いは、（２）この状態、疾患又は病症を阻害し、即ち疾患の進行又はその再発（治療を維持している場合）、又はその少なくとも１つの臨床的症状又は亜臨床的症状を阻止したり、減少させたり、遅延させたりすること、
或いは、（３）疾患を軽減し、即ち、この状態、疾患又は病症、若しくはその臨床的又は亜臨床的症状の少なくとも１つの軽減をもたらすことを含む。治療を受けている被験者によって得られる利益は、統計的に有意であるか、又は少なくとも患者又は医師にとって知覚可能である。

【0168】

本明細書で使用されるように、用語「治療的に有効な」又は「有効な」が用量又は量に適用されることは、状態、疾患、又は病症を治療（例えば、予防又は改善）するために被験者に投与される場合、そのような治療又は予防が有効な結果を生じるのに十分な化合物又は医薬組成物の量を指す。「治療有効量」は、投与される化合物又は細菌若しくは類似体、並びに疾患及びその重症度、並びに治療される哺乳動物の年齢、体重、身体状態及び応答状態に応じて変化する。

【0169】

本開示の組成物と共に使用される「薬学的に許容される」という語句は、そのような組成物の分子実体及び他の成分が生理学的に許容され、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に有害反応を通常は生じないことを意味する。

【0170】

「医薬製剤」又は「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にする形態であり、製剤が投与される被験者に対して、許容できない毒性を有する追加の成分を含まない製剤又は組成物を指す。

【0171】

「ベクター」という用語は、化合物を投与するための希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような医薬ベクターは、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、又は合成原料を含む水及び油などの無菌液体であってもよい。特に注射可能な溶液の場合、ベクターとして、水又は水溶液、塩水溶液、並びに水性グルコース及びグリセロール水溶液が使用される。或いは、ベクターは、１種以上の（ペレットを圧縮するための）結合剤、流動促進剤、封入剤、香味剤、及び着色剤を含むが、これらに限定されない固体剤形ベクターであってもよい。適切な医薬ベクターは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎの『レミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）』に記載されている。

【0172】

他の実施形態は、がんの予防及び／又は治療のための、本開示の二重特異性抗体薬物コンジュゲート又はそれを含む医薬組成物の応用に関する。別の実施形態において、がんの予防及び／又は治療のための医薬の製造における二重特異性抗体薬物コンジュゲートの応用を提供する。いくつかの実施形態において、上記応用は、がんの治療のためのものである。他の類似の実施形態は、がんを予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の二重特異性抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む方法である。いくつかの実施形態において、被験者は哺乳動物である。幾つかの実施形態において、被験体はヒトである。

【0173】

本明細書に記載のがんは、例えば、ＨＥＲ２を発現するがん、例えば、ＨＥＲ２が中レベルから低レベルまで発現されるがん、例えば、ＨＥＲ２^＋乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、胃がん、食道がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、胆管がん、及び／又は結腸直腸がんであるが、これらに限定されない。

【0174】

本発明の二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、単独投与されるか、又は、がんの治療に適した他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、上記二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、例えば、化学療法若しくは標的療法のため、又は免疫療法のためなどの他の療法と組み合わせて使用することができる。同様に、それらは、放射線療法又は外科手術と組み合わせて使用することができる。

【0175】

二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、任意の適切な経路によって送達することができる。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲートは、注射若しくは注入によって、皮膚パッチによって、デポ／ポンプ装置によって、又は吸入によって送達される。これらの実施形態の様々な態様において、当該コンジュゲートは、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内に投与される。

【0176】

いくつかの実施形態におけるコンジュゲートは、１日１回又はそれ以下の頻度で投与することができる。例えば、いくつかの実施形態において、二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回投与される。

【0177】

有効分子の最適な用量レベルは、患者の年齢、体重、身体状態、他の薬物との可能な組み合わせ、及び病状の重症度を含む様々な要因に依存する。具体的な用量は、当業者が具体的な状況に応じて決定することができる。

【0178】

試薬キット、単位剤形及び製造物品
本開示は、本明細書に記載のコンジュゲート又はその組成物を含む試薬キット、単位剤形、及び製造物品を更に提供する。試薬キット、単位剤形、及び製造物品は、例えば、本明細書に記載のコンジュゲートのバイアル（例えば、密閉バイアル）、プレフィルドシリンジ、及び自己注射器（ペン型）を含んでもよい。
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会のアミノ酸に共通する３文字記号又は１文字（単一文字）記号に従って、本明細書において参照される。

【実施例】

【0179】

以下、具体的な実施例を参照しながら、本発明の技術的解決手段を説明し、本発明の上記内容を更に詳細に説明するが、これは、本発明の上記主旨の範囲が以下の実施例のみに限定されると理解すべきではない。本発明の上記内容に基づいて実現される技術は、いずれも本発明の範囲に属する。

【0180】

実施例１ 二重特異性抗体の製造
エレクトロトランスフェクション技術を利用し、二重特異性抗体重鎖プラスミド及び二重特異性抗体軽鎖プラスミドを、それぞれＣＨＯ－Ｋ１細胞に同時トランスフェクトした。細胞を新鮮なｏｐｔｉ培地（グルタミンを含まず、市販により得られる）で再懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２４時間培養して回復させた。２４時間回復した後、２５μＭのＭＳＸを含む新鮮なｏｐｔｉ培地で再懸濁し、３日ごとに新鮮な培地を交換し、２５μＭのＭＳＸの圧力下で２～４週間培養し続け、生存している混合細胞クローンを選択した。有限希釈法によって混合細胞を新鮮なｏｐｔｉ培地で希釈し、９６ウェルプレートに０．５細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２週間ほど培養し、ＥＬＩＳＡ法により抗体を発現できるクローンを検出し、限界希釈法による２回スクリーニングを行い、最終的に抗体Ｔ５４を発現できるモノクローナルが得られた。

【0181】

中国特許出願ＣＮ２０１６１０１９４３２５．７に記載の方法を参照し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞からＴＡＬＥＮによってＦＵＴ８遺伝子をノックアウトし、ＬＣＡによって加圧し、フコースノックアウト細胞株Ｄ５７を構築し、細胞株Ｄ５７を利用し、実施例１でＴ５４を製造するものと同様の方法によって、脱フコシル化二重特異性抗体Ｔ５４－ＡＦを製造した。

【0182】

二重特異性抗体の安定化系を数日間培養した後、上清に対してｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティ精製及び陽イオン交換精製を行い、二重特異性抗体Ｔ５４、Ｔ５４－ＡＦが得られた。

【0183】

上記実施例１と同様の方法により、対応する二重特異性抗体の重鎖プラスミド及び軽鎖プラスミドを利用してそれぞれＣＨＯ－Ｋ１細胞に同時トランスフェクトし、抗体Ｔ５１、Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５５、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７、Ｔ５７－ＡＦ、Ｔ５８、Ｔ５８－ＡＦを製造した。

【0184】

実施例２ 二重特異性抗体薬物コンジュゲートの製造
実施例１で得られた二重特異性抗体Ｔ５４を、コンジュゲーションための緩衝液（２５ｍＭのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７／２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＰＡ、ｐＨ７．４）に透析し、限外濾過によって濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上になるまで濃縮し、濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。還元剤ＴＣＥＰを加え、２５℃の水浴で２時間反応させた。

【0185】

Ｖｃ－ＭＭＡＥ（ｍｃ－Ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）の各リンカーブロック及び毒素ＭＭＡＥは、いずれも市販の方法によって得ることができる。

【0186】

そのうち、「ｍｃブロック」とは、６－マレイミドヘキサン酸を指し、６－マレイミドヘキサン酸の構造式は、以下の通りである：

【化14】

。

【0187】

「ＰＡＢ」とは、ｐ－アミノベンジルアルコールを指し、ｐ－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）の構造式は、以下の通りである：

【化15】

。

【0188】

Ｖｃ－ＭＭＡＥ（ｍｃ－Ｖｃ－ｐａｂ－ＭＭＡＥ）の化学構造式は、以下の通りである：

【化13】

各ブロックの化学的コンジュゲーションは、いずれも当該技術分野における従来のエステル化又は脱水反応によって完成すればよい。

【0189】

ｍｃ－ｖｃ－ｐａｂ－ＭＭＡＥを１０ｍＭになるまでＤＭＳＯに溶解した。ｍｃ－ｖｃ－ｐａｂ－ＭＭＡＥを抗体と１０：１のモル比で混合し、２５℃の水浴で、２時間反応させてコンジュゲートした。

【0190】

コンジュゲートした産物を透析緩衝液（２０ｍＭのＨｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５．５）に透析し、０．２２μｍ膜で濾過し、二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥが得られた。

【0191】

上記実施例２と同様の方法を利用し、二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５１－ＭＭＡＥ、Ｔ５１－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＭＭＡＥ、Ｔ５２－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＭＭＡＥ、Ｔ５３－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＭＭＡＥ、Ｔ５５－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＭＭＡＥ、Ｔ５６－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＭＭＡＥ、Ｔ５７－ＡＦ－ＭＭＡＥ、Ｔ５８－ＭＭＡＥ、Ｔ５８－ＡＦ－ＭＭＡＥを製造した。

【0192】

実施例３ 二重特異性抗体Ｔ５４、Ｔ５４－ＡＦ及び二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥ、Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥの特徴付け
二重特異性抗体Ｔ５４、Ｔ５４－ＡＦ及び二重特異性抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥ、Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥに対して、ＳＥＣ純度分析及びＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析を行った。

【0193】

ＳＥＣ純度分析に使用される機器及び条件は、以下の通りである：
機器：Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００
カラム：Ｗａｔｅｒｓ、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００Å ＳＥＣ３．５μｍ（７．８×３００ｍｍ）
移動相：１５％イソプロパノールのＰＢＳ、ｐＨ７．４
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、３０ｍｉｎ
ローディング量：４０μｇ。
ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析に使用される機器及び条件は、以下の通りである：
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＭＡｂＰａｃ ＨＩＣ－Ｂｕｔｙｌ
移動相：
移動相Ａ：５０ｍＭのＮａ_３ＰＯ_４、１．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５％イソプロパノール、ｐＨ６．９５
移動相Ｂ：５０ｍＭのＮａ_３ＰＯ_４、５％イソプロパノール、ｐＨ６．９５
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
ローディング量：１００μｇ。

【0194】

１．二重特異性抗体及びそのコンジュゲートの検出結果
抗体Ｔ５４及びそのコンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥに対して、それぞれＳＥＣ純度分析を行い、結果をそれぞれ図５Ａ、図６Ａに示す。図から分かるように、Ｔ５４及びＴ５４－ＭＭＡＥのポリマー含有量は、それぞれ１．９５％、０．２４％であり、モノマー含有量は、それぞれ９７．１７％、９６．７５％であり、両者のモノマー含有量の差は大きくない。

【0195】

抗体Ｔ５４及びそのコンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥに対して、それぞれＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析を行い、結果をそれぞれ図７、図８Ａに示す。図から分かるように、抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＭＭＡＥは、異なる数の毒素をコンジュゲートしており、そのうち、４つの毒素をコンジュゲートした割合は、７３．３１％であり、平均ＤＡＲ値は、３．７０であり、具体的なデータを表１－１に示す。

【0196】

【表1-1】

【0197】

２．脱フコシル化二重特異性抗体及びそのコンジュゲートの検出結果
抗体Ｔ５４－ＡＦ及びそのコンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥに対して、それぞれＳＥＣ純度を行い、結果をそれぞれ図５Ｂ、図６Ｂに示す。図から分かるように、Ｔ５４－ＡＦ及びＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥのポリマー含有量は、それぞれ０．７２％、０．１７％であり、モノマー含有量は、それぞれ９９．２８％、９９．８３％であり、モノマー含有量の差は、大きくない。

【0198】

抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥのコンジュゲートした毒素の数をＨＩＣ－ＨＰＬＣによって分析し、結果を図８Ｂに示す。図から分かるように、抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥは、異なる数の毒素をコンジュゲートしており、そのうち、４つの毒素をコンジュゲートした割合は、６６．６１％であり、平均ＤＡＲ値は、３．４６であり、具体的なデータを表１－２に示す。

【0199】

【表1-2】

【0200】

実施例４ ＨＥＲ２との結合活性の測定
分析対象：
抗体Ｔ５４－ＡＦ
抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ
陽性対照ＡＤＣ ＤＳ８２０１（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ、Ｈｅｒ２を標的とする抗体薬物コンジュゲートであり、ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂからテトラペプチド（ＧＧＦＧ）ｌｉｎｋｅｒを介して、トポイソメラーゼ－Ｉ阻害剤であるカンプトテシン誘導体（ＤＸ－８９５１誘導体ＤＸｄ）にコンジュゲートして得られた）。

【0201】

抗体、抗体薬物コンジュゲートと抗原ＨＥＲ２の結合活性を、ＥＬＩＳＡの方法によって検出した。抗原ＨＥＲ２（２μｇ／ｍＬ）を、１ウェルあたり１００μＬで、４℃で一晩コーティングした。３００μＬのＰＢＳを加えて４回繰り返し洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳを３００μＬ加え、３７℃で２時間ブロッキングし、ＰＢＳで４回繰り返し洗浄した。検出すべき抗体を１００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで４回繰り返し洗浄し、希釈した二次抗体を１００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートし、二次抗体を捨て、ＰＢＳで４回繰り返し洗浄した。１００μＬのＴＭＢ発色液を加え、３７℃で５～１０分間インキュベートした。５０μＬの希硫酸停止液を加えて反応を終了した。マイクロプレートリーダーによってＯＤ_４５０を検出した。

【0202】

データを分析し、抗体Ｔ５４－ＡＦ及び抗体薬物コンジュゲートＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ、ＤＳ８２０１とＨＥＲ２抗原の結合活性曲線を図９に示し、ＥＣ_５０値を表２に示す。

【0203】

【表2】

【0204】

実施例５ ＨＥＲ２発現陽性腫瘍細胞（ＳＫＢＲ３、Ｎ８７）の増殖阻害試験
対数増殖期のＨＥＲ２発現陽性腫瘍細胞（ＳＫＢＲ３、Ｎ８７）をＰＢＳで洗浄し、パンクレアチンを加えて消化させた後、１０％ＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０）でパンクレアチンを中和した後、遠心分離し、標的細胞を対応する１０％ＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０）で再懸濁し、細胞密度を２Ｅ４に調整し、９６ウェルプレートを１ウェルあたり１００μＬで加え、２４時間培養した後、培地で希釈した異なる濃度の薬物を１ウェルあたり１００μＬ（初期濃度３００μｇ／ｍＬ、８倍希釈、８つの濃度）で加えた。７２時間後、細胞上清を吸引し、ｃｃｋ８を添加した培地を１００μＬ加え、４時間インキュベートし、ＯＤ_４５０を検出した。

【0205】

１．二重特異性抗体及びそのコンジュゲートの検出結果
（１）乳がん細胞ＳＫＢＲ３の増殖阻害
ソフトウエアＧｒａｐｈＰａｄ５．０を用いてデータを分析し、乳がん細胞ＳＫＢＲ３に対する各抗体、抗体薬物コンジュゲートの阻害曲線を図１０に示し、ＩＣ_５０値を表３に示す。結果から分かるように、Ｔ５４、Ｔ５４－ＭＭＡＥ、ＴＤＭ１、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、いずれもＳＫＢＲ３腫瘍細胞の増殖を阻害する作用を有するが、抗体薬物コンジュゲートＴＤＭ１、Ｔ５４－ＭＭＡＥは、腫瘍細胞に対する阻害がより明らかであり、最大阻害率が８０％以上に達することができ、Ｔ５４阻害効果は次に高く、最大阻害率が５２．５１％に達することができ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは最も弱く、最大阻害率がわずか３３．５４％である。

【0206】

【表3】

【0207】

（２）胃がん細胞Ｎ８７の増殖阻害
ソフトウエアＧｒａｐｈＰａｄ５．０を用いてデータを分析し、胃がん細胞Ｎ８７に対する各抗体、抗体薬物コンジュゲートの阻害曲線を図１１に示し、ＩＣ_５０値を表４に示す。結果から分かるように、Ｔ５４、Ｔ５４－ＭＭＡＥ、ＴＤＭ１は、Ｎ８７腫瘍細胞の増殖を阻害する作用を有するが、抗体薬物コンジュゲートＴＤＭ１、Ｔ５４－ＭＭＡＥは、腫瘍細胞に対する阻害がより明らかであり、最大阻害率が７０％以上に達することができ、Ｔ５４阻害効果は次に高く、最大阻害率が５５．６％に達することができる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、Ｎ８７に対して明らかな阻害効果を有しない。

【0208】

【表4】

【0209】

２．脱フコシル化二重特異性抗体及びそのコンジュゲートの検出結果
対数増殖期の腫瘍細胞をＰＢＳで洗浄し、パンクレアチンを加えて消化させた後、１０％ＦＢＳを含む培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭなど）でパンクレアチンを中和した後、遠心分離し、標的細胞を対応する１０％ＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭなど）で再懸濁し、細胞密度を４×１０^４／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬで加え、２４時間培養した後、培地で希釈した異なる濃度の薬物を１ウェルあたり１００μＬ（初期濃度１００μｇ／ｍＬ、６倍希釈、８つの濃度）で加えた。７２時間後、細胞上清を吸引し、ｃｃｋ８を添加した培地を１００μＬ加え、４時間インキュベートし、ＯＤ_４５０を検出した。

【0210】

ＨＥＲ２の発現レベルが高、中、低の腫瘍細胞に対するＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ、ＤＳ８２０１、Ｔ５４－ＡＦ、ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｐｅｒｊｅｔａ、Ｉｓｏｔｙｐｅ（アイソタイプ対照、陰性抗体として）の増殖阻害活性をそれぞれ検出し、データを分析し、結果は、図１２に示すように、ＨＥＲ２発現が陽性の異なる腫瘍細胞に対するＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥの増殖阻害効果がいずれもＤＳ８２０１及びＴ５４－ＡＦ、ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｐｅｒｊｅｔａモノクローナル抗体よりも優れていることが示された。

【0211】

実施例６ マウス体内におけるＢＴ４７４乳がん腫瘍細胞の増殖阻害試験
１．二重特異性抗体薬物コンジュゲートの検出結果
（１）細胞培養
ＢＴ４７４腫瘍細胞は、ＡＴＣＣから購入され、番号がＨＴＢ－２０^ＴＭである。腫瘍細胞を、不活化１０％ウシ胎児血清、１ｍＭのＮａｐｙｒ、１ＸのＭＥＭ－ＮＥＡＡ、１ＸのＭＥＭ ＶＩＴＡＭＩＮ、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリンを含むＲＰＭＩ １６４０培地で３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養し、細胞が満ちた３～４日ごとに、フラスコに分けて継代し、対数増殖期にある腫瘍細胞を体内腫瘍の接種に用いた。

【0212】

（２）腫瘍細胞の接種及び群分け
ＢＴ４７４腫瘍細胞をＰＢＳ＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）で再懸濁し、濃度が１×１０^８／ｍＬであり、実験動物の右側前肋部皮下に１００μＬ／匹で接種し、平均体積が１１１ｍｍ^３程度になるまで腫瘍が増殖する時に群分けして投与し、合計３群であり、１群あたり５匹であり、具体的な投与レジメンを表５－１に示す。

【0213】

【表5-1】

【0214】

（３）マウス体重の測定及び実験指標
週に２回腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍体積計算式：体積＝０．５×長径×短径^２に従って腫瘍体積を計算した。腫瘍体積を測定したと同時に、マウス体重を秤量した。マウス体重の変化と投与時間の関係を記録した。同時に、投与期間中の動物の活動、摂食などの一般的状態のような、マウスの生存状況及び健康状態を観察した。

【0215】

Ｔ／Ｃ値を腫瘍体積から計算し、そのうち、Ｔは、ある被験物処理群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値であり、Ｃは、溶媒対照群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値である。ＲＴＶは、投与後と投与前の腫瘍体積の比である。腫瘍増殖阻害率（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％であり、腫瘍増殖阻害率≧６０％であり、統計分析により、ｐ＜０．０５である。

【0216】

（４）サンプル採取及び処理
実験終了後、各群のマウスを安楽死させ、腫瘍組織を剥離し、腫瘍組織を秤量した後に整然と並べて写真を撮った。

【0217】

各群のマウスの腫瘍増殖曲線及び腫瘍増殖阻害率を図１３、表６－１に示す。ＴＤＭ１（２ｍｇ／ｋｇ）、Ｔ５４－ＭＭＡＥ（２ｍｇ／ｋｇ）は、ヒト乳がん異種移植モデルＢＴ４７４において、いずれも強力な抗腫瘍作用を示し、腫瘍増殖を効果的に阻害した。Ｔ５４－ＭＭＡＥの腫瘍阻害効果はＴＤＭ１よりも優れていた。投与前後には、腫瘍担持マウスの体重は減少せず、被験物に対していずれも良好な耐性を示した。

【0218】

【表6-1】

【0219】

２．脱フコシル化二重特異性抗体薬物コンジュゲートの検出結果
（１）細胞培養
ＢＴ４７４細胞を、不活化１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン並びに２ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養し、細胞が満ちた３～４日ごとに、フラスコに分けて継代し、対数増殖期にある腫瘍細胞を体内腫瘍の接種に用いた。

【0220】

（２）腫瘍細胞の接種及び群分け
腫瘍細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（体積比１：１で混合）で再懸濁し、細胞濃度を１×１０^８／ｍＬに調整し、実験動物の右側前肋部皮下に１００μＬ／マウス、即ち１×１０^７／マウスで接種した。実験動物に、接種前日から安息香酸エストラジオール注射液（２ｍＬ：４ｍｇ、寧波第二ホルモン工場）を４０μｇ／匹、週に１回皮下注射した。平均腫瘍体積が１１３ｍｍ^３に達するまで腫瘍が増殖した時、腫瘍体積に応じて群分けして投与し、合計７群であり、各群は５匹の動物であり、具体的な投与レジメンを表５－２に示す。

【0221】

【表5-2】

【0222】

（３）マウス体重の測定及び実験指標
週に２回腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍体積計算式：体積＝０．５×長径×短径^２に従って、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積を測定したと同時に、マウス体重を秤量した。マウス体重の変化と投与時間の関係を記録した。同時に、投与期間中の動物の活動、摂食などの一般的状態のような、マウスの生存状況及び健康状態を観察した。

【0223】

Ｔ／Ｃ値を腫瘍体積から計算し、そのうち、Ｔは、ある被験物処理群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値であり、Ｃは、溶媒対照群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値である。ＲＴＶは、投与前と投与後の腫瘍体積の比である。腫瘍増殖阻害率（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％であり、腫瘍増殖阻害率≧６０％であり、統計分析によりｐ＜０．０５である。

【0224】

（４）サンプル採取及び処理
実験終了後、各群のマウスを安楽死させ、腫瘍組織を剥離し、腫瘍組織を秤量した後に整然と並べて写真を撮った。

【0225】

（５）実験結果
各群のマウスの腫瘍増殖曲線及び投与後の腫瘍増殖阻害状況を図１４、表６－２、続きの表６－２－１及び続きの表６－２－２に示す。結果から分かるように、ヒト乳がん異種移植モデルＢＴ４７４において、
１）ブランク対照（賦形剤）に比べて、４ｍｐｋのＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥは、Ｄ２６に顕著な腫瘍阻害作用を示し始め、１ｍｐｋのＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥは、Ｄ３３（２回目の投与の７日後）に顕著な腫瘍阻害作用を示し始め、
２）同じ用量の対照薬（ＤＳ８２０１）と比べ、Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ高（４ｍｐｋ）は、Ｄ２６（１回目の投与の７日後）及びＤ３３（２回目の投与の７日後）に顕著な有効性を示した。

【0226】

治療中に，腫瘍担持マウスは、高用量、中用量、低用量の二重特異性抗体－ＡＤＣ試験薬物に対していずれも良好な耐性を示し、各群のマウスは、体重が正常であり、異常な徴候がなく、一般的状態が良好である。

【0227】

【表6-2】

【0228】

【表6-2-1】

【0229】

【表6-2-2】

【0230】

実施例７ マウス体内におけるＮ８７胃がん腫瘍細胞の増殖阻害試験
（１）細胞培養
腫瘍細胞を、不活化１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン並びに２ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養し、細胞が満ちた３～４日ごとに、フラスコに分けて継代し、対数増殖期にある腫瘍細胞を
体内腫瘍の接種に用いた。

【0231】

（２）腫瘍細胞の接種及び群分け
腫瘍細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、細胞濃度を１×１０^８／ｍＬに調整し、実験動物の右側前肋部皮下に１００μＬ／マウス、即ち１×１０^７／マウスで接種した。平均腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ^３に達するまで腫瘍が増殖した時、腫瘍体積に応じて群分けして投与し、合計８群であり、各群は８匹の動物であり、具体的な投与レジメンを表７－１に示す。

【0232】

【表7-1】

【0233】

（３）マウス体重の測定及び実験指標
週に２回腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍体積計算式：体積＝０．５×長径×短径^２に従って腫瘍体積を計算した。腫瘍体積を測定したと同時に、マウス体重を秤量した。マウス体重の変化と投与時間の関係を記録した。同時に、投与期間中の動物の活動、摂食などの一般的状態のような、マウスの生存状況及び健康状態を観察した。

【0234】

Ｔ／Ｃ値を腫瘍体積から計算し、そのうち、Ｔは、ある被験物処理群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値であり、Ｃは、溶媒対照群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値である。ＲＴＶは、投与前と投与後の腫瘍体積の比である。腫瘍増殖阻害率（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％であり、腫瘍増殖阻害率≧６０％であり、統計分析によりｐ＜０．０５である。

【0235】

（４）サンプル採取及び処理
実験終了後、各群のマウスを安楽死させ、腫瘍組織を剥離し、腫瘍組織を秤量した後に整然と並べて写真を撮った。

【0236】

（５）実験結果
各群のマウスの腫瘍増殖曲線及び投与後の腫瘍増殖阻害状況を図１５及び表７－２に示す。結果から分かるように、ヒト胃がん異種移植モデルＮ８７において、
１）１ｍｐｋのＤＳ８２０１、０．２５ｍｐｋ、１ｍｐｋ及び４ｍｐｋのＴ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ は、ＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍の増殖を顕著に阻害することができた。
２）同じ用量で、Ｔ５４－ＡＦ－ＭＭＡＥ（１ｍｐｋ）は、腫瘍阻害効果がＤＳ８２０１（１ｍｐｋ）より顕著に優れ、ｐ＝０．００５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）である。

【0237】

治療中に，腫瘍担持マウスは、高用量、中用量、低用量の二重特異性抗体－ＡＤＣ試験薬物に対していずれも良好な耐性を示し、各群のマウスは、体重が正常であり、異常な徴候がなく、一般的状態が良好である。

【0238】

【表7-2】

【0239】

実施例８ 本願の各二重特異性抗体の構造及び配列
本願に係る二重特異性抗体Ｔ５１～Ｔ５８の構造及び配列をそれぞれ表８、９に示す。

【0240】

表８には示されていないが、二重特異性抗体Ｔ５１～Ｔ５８及びその対応する脱フコシル化二重特異性抗体Ｔ５１－ＡＦ～Ｔ５８－ＡＦは、二重特異性抗体の血清半減期を増加させるためにＦｃ領域においてＭ４２８Ｌ置換を含んでいた。

【0241】

表８中の「重鎖＃１」の列の具体的なアミノ酸配列を、表９に示した。

【0242】

【表8】

【0243】

【表9-1】

【0244】

【表9-2】

【0245】

【表9-3】

【0246】

【表9-4】

【0247】

【表9-5】

【0248】

【表9-6】

【0249】

他の説明
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、「配列表－二重特異性抗体薬物コンジュゲート」というファイル名の配列表を含む。

【0250】

別段の指示がない限り、明細書及び特許請求の範囲において使用される、成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。本明細書で使用されるように、「約」及び「およそ」という用語は、１０～１５％以内、好ましくは５～１０％以内を意味する。従って、反対のことが示されない限り、明細書及び添付される特許請求の範囲において提案された数値パラメータは、本発明によって求められる所望の特性に応じて変更され得る近似値である。また、少なくとも本特許請求の範囲の均等物の適用を限定するためのものではなく、各数値パラメータは、少なくとも与えられた有効数字に基づき、通常の四捨五入法を用いて構成されるべきである。本発明の広範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に与えられた数値は可能な限り正確である。しかし、任意の数値は、必然的にそれぞれの測定尺度に存在する標準偏差によって引き起こされる一定の誤差を本質的に含む。

【0251】

本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、本発明の文脈（特に添付される特許請求の範囲の文脈）で使用される用語「１つ」、「１種」、「上記／当該」、及び類似の指示語は、単数形も複数形も含むと解釈されるべきである。本明細書における数値範囲の記載は、この範囲に含まれる個々の値を参照する略記法（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ）として単に使用されることを意図している。本明細書において別段の指示がない限り、個々の値は、本明細書に個別に組み込まれるかのように、明細書に組み込まれる。本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、本明細書に記載の全ての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、別段の指定がない限り、単に本発明をより良く説明することを意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。明細書における全ての言語は、本発明の実施に必要な任意の非請求要素を示すものと解釈されるべきではない。

【0252】

本明細書に開示された本発明の代替的な要素又は実施形態のグループ分けは、限定と解釈されるべきではない。グループの個々のメンバーは、単独で、又は上記グループの他のメンバー又は本明細書の他の要素との任意の組み合わせで参照され、特許請求されてもよい。グループの１又は複数のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、グループに含まれてもよく、又はグループから削除されてもよいことが想定される。任意のそのような包含又は削除が起こる場合、本願は、添付される特許請求の範囲で使用される全てのマルクーシュグループの書面による説明を満たすように、修正されたグループを含むと考えられる。

【0253】

本明細書では、発明者に知られている本発明を実施する最良のモードを含む、本発明のいくつかの実施形態について説明する。当然ながら、上記の説明を読んだ後、これらの記載された実施形態の変形は、当業者には明らかである。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に採用し得ることを想定しており、本発明者らは、本発明を本明細書の特定の説明とは異なる方法で適用することを意図している。従って、適用可能な法律が許すように、本発明は、添付される特許請求の範囲に記載された主旨の全ての修正及び均等物を含む。また、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、本発明は、上記要素を、全ての可能な変形の任意の組み合わせで包含する。

【0254】

本明細書に開示される特定の実施形態は、特許請求の範囲において、…から構成されるか、又は実質的に構成される言語を使用することによって更に限定することができる。特許請求の範囲で使用される場合、提出されたか補正によって追加されたかにかかわらず、「…で構成される」という移行用語は、特許請求の範囲で明示されていない任意の要素、ステップ又は成分を除外する。「実質的に…で構成される」という移行用語は、請求項の範囲を、特定の材料又はステップ、及び基本的および新規な特性（１つ又は複数）に実質的に影響を与えない材料又はステップに制限する。特許請求される本発明の実施形態は、本明細書に内在的又は明示的に記載され、実現される。

【0255】

なお、本明細書の全体を通して、多数の特許及び印刷された刊行物が参考文献として引用されている。上記の各参考文献及び印刷された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0256】

最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するためにのみ使用されることを理解すべきである。採用できる他の修正も本発明の範囲内である。従って、本発明の代替的な構成は、限定ではなく例として、本明細書の教示に従って利用することができる。従って、本発明は、正確に示され、記載された内容に限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A-D】

【図12E-G】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

2024519523000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-12-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物であって、
前記二重特異性抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩを認識及び／又は結合することができる第１のパラトープと、ＨＥＲ２のドメインＩＶを認識及び／又は結合することができる第２のパラトープとを含み、前記二重特異性抗体は、Ｆａｂ－Ｉｇ、Ｉｇ－Ｆａｂ、又はヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、好ましくは、前記二重特異性抗体は、ヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、
前記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、そのうち、
（１）前記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
前記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、
ａ）Ｓ５６Ｙ／Ｔ／Ａのいずれか、
ｂ）Ｎ３０Ｓ／Ａのいずれか、
ｃ）Ｔ９４Ｗ／Ｆ／Ｙのいずれか、
ｄ）Ｈ９１Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、
ｅ）Ｐ９６Ｙ／Ｆ／Ｗのいずれか、又は
ｆ）ａ）～ｅ）の５つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
好ましくは、前記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、Ｎ３０Ｓ、Ｓ５６Ｙ及びＴ９４Ｗの３つの改変のいずれか１つ、２つ、又は３つの配列改変を含み、
前記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
（２）前記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
１）一方の重鎖可変ドメインは、配列番号３に示す配列を有する未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
前記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、
ｉ）Ｔ３０Ａ／Ｓ／Ｎ／Ｄのいずれか、
ｉｉ）Ｇ５６Ａ／Ｓ／Ｔのいずれか、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
好ましくは、前記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｔ３０Ａ及び／又はＧ５６Ａを含み、
２）他方の重鎖可変ドメインは、配列番号７に示す配列を有する未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメイン又は改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインから選ばれ、
前記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、
ｉ）Ｎ５４Ｔ／Ｓ／Ａのいずれか、
ｉｉ）Ｄ９８Ｓ／Ｗ／Ｔ／Ｒのいずれか、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の２つのタイプの改変方法の任意の組み合わせを含み、
好ましくは、前記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及び／又はＤ９８Ｓを含み、
前記毒素は、メイタンシン類、ヘミアスタリン類、アマニチン類、アウリスタチン類、カリケアミシン類又はデュオカルマイシン類から選ばれ、
前記リンカーは、切断可能なリンカー及び非切断可能なリンカーから選ばれ、前記切断可能なリンカーは、化学的に切断可能なリンカー及び酵素的に切断可能なリンカーを含むが、これらに限定されず、前記酵素的に切断可能なリンカーは、ペプチド成分を含むリンカーを含み、
オプションとして、前記毒素及び／又はリンカーのうちの１つ又は複数の水素原子は、任意選択的に重水素化されることを特徴とする。

【請求項2】

前記二重特異性抗体は、１対の相同軽鎖と、２つの異なる重鎖可変ドメインを含む１対の異種重鎖とを含み、そのうち、
（１）前記１対の相同軽鎖は、改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインを含み、
前記改変されたトラスツズマブ軽鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｎ３０Ｓ及びＳ５６Ｙを含み、前記未改変のトラスツズマブ軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号５に示され、
（２）前記２つの異なる重鎖可変ドメインにおいて、
１）一方の重鎖可変ドメインは、改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインであり、前記改変されたペルツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のペルツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｔ３０Ａ、又はＴ３０Ａ／Ｇ５６Ａを含み、前記未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインの配列は、配列番号３に示され、
２）他方の重鎖可変ドメインは、改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインであり、前記改変されたトラスツズマブ重鎖可変ドメインは、未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｎ５４Ｔ及びＤ９８Ｓを含み、前記未改変のトラスツズマブ重鎖可変ドメインの配列は、配列番号７に示される、
ことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項3】

前記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、
好ましくは、前記二重特異性抗体の２つのＦｃ領域は、Ｍ４２８Ｌからなる置換を含む改変されたＦｃ領域であり、
好ましくは、前記二重特異性抗体のＦｃは、
（１）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を増加させるＦｃ、又は
（２）抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を増加させるＦｃ、又は
（３）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を増加させるＦｃを含む、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項4】

前記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体であり、好ましくは、前記脱フコシル化抗体は、フコシル化欠損を有する宿主細胞から産生されることによって得られ、前記フコシル化欠陥は、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトである、
ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項5】

前記二重特異性抗体は、２本の異種重鎖のＦｃ領域がノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）によって連結されるヘテロ二量体Ｉｇの形態であり、
好ましくは、前記ｋｎｏｂ部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃ領域であるか、又はＴ３６６Ｗの改変を含み、前記ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域であるか、又はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変の任意の組み合わせを含み、
最も好ましくは、前記ｋｎｏｂ部分のＦｃ領域は、未改変のペルツズマブ重鎖Ｆｃに基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｔ３６６Ｗ及びＭ４２８Ｌの改変を含み、前記ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域は、未改変のトラスツズマブ重鎖Ｆｃ領域に基づき、配列改変を含み、前記配列改変は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの改変を含み、且つ、前記二重特異性抗体は、ｈｏｌｅ部分のＦｃ領域においてＭ４２８Ｌの改変を更に含む、
ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項6】

前記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８から選ばれ、又は、
前記二重特異性抗体は、脱フコシル化Ｔ５１（Ｔ５１－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５２（Ｔ５２－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５３（Ｔ５３－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５５（Ｔ５５－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５６（Ｔ５６－ＡＦ）、脱フコシル化Ｔ５７（Ｔ５７－ＡＦ）、及び脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれる、
ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項7】

前記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマヌリン、アマニン、アマニンアミド、γ－アマニン、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、カリケアミシンγ、デュオカルマイシンＡ、ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ及びＣＣ－１０６５、並びにそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ及びモノメチルアウリスタチンＦ、並びにそれらの重水素化物から選ばれ、
前記酵素的に切断可能なリンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記酵素的に切断可能なリンカーは、バリン－シトルリン及びその重水素化物から選ばれる、
ことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項8】

二重特異性抗体、毒素及びリンカーを含む二重特異性抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物であって、
（１）前記二重特異性抗体は、Ｔ５１、Ｔ５２、Ｔ５３、Ｔ５４、Ｔ５５、Ｔ５６、Ｔ５７及びＴ５８から選ばれ、好ましくは、前記二重特異性抗体は、脱フコシル化抗体Ｔ５１－ＡＦ、Ｔ５２－ＡＦ、Ｔ５３－ＡＦ、Ｔ５４－ＡＦ、Ｔ５５－ＡＦ、Ｔ５６－ＡＦ、Ｔ５７－ＡＦ、及びＴ５８－ＡＦであり、
（２）前記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ及びモノメチルアウリスタチンＦ、及びそれらの重水素化物から選ばれ、
（３）前記リンカーは、バリン－シトルリン、又はフェニルアラニン－リシン、及びそれらの重水素化物から選ばれ、好ましくは、前記リンカーは、バリン－シトルリン及びその重水素化物から選ばれることを特徴とする。

【請求項9】

前記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（Ｉ’）に示される通りである：

【化3】

そのうち、
（１）

【化2】

は、請求項８に記載の二重特異性抗体を表し、
（２）中間部分は、リンカーとしてのバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖｃと略称される）部分であり、リンカーは、６－マレイミドヘキサン酸を介して前記二重特異性抗体に連結され、ｐ－アミノベンジルアルコールを介してＤｒｕｇ（毒素部分）に連結され、
前記毒素は、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｅ７９７４、ＨＴＩ－２８６、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＶＢ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン、又はそれらの重水素化物から選ばれ、
（３）ｎは、前記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）を表し、数値範囲は１～６である、
ことを特徴とする請求項８に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項10】

前記二重特異性抗体薬物コンジュゲートの構造は、以下の式（ＩＩ）に示される通りである：

【化4】

そのうち、
（１）

【化2】

は、請求項８に記載の二重特異性抗体を表し、
（２）［ ］における構造は、リンカー毒素部分Ｖｃ－ＭＭＡＥであり、Ｖｃは、６－マレイミドヘキサン酸を介して前記二重特異性抗体に連結され、Ｖｃは、ｐ－アミノベンジルアルコールを介して毒素としてのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に連結され、
（３）ｎはＤＡＲ値であり、数値範囲は１～６である、
ことを特徴とする請求項９に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物。

【請求項11】

前記二重特異性抗体は、Ｔ５４、Ｔ５８、脱フコシル化Ｔ５４（Ｔ５４－ＡＦ）又は脱フコシル化Ｔ５８（Ｔ５８－ＡＦ）から選ばれる、
ことを特徴とする請求項８～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物又は重水素化物。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はその重水素化物、及び薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項13】

癌の予防及び／又は治療のための薬物の製造における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は請求項１２に記載の医薬組成物の、応用。

【請求項14】

前記癌は、ＨＥＲ２を発現する癌であり、好ましくは、前記癌は、ＨＥＲ２が中レベルから低レベルまで発現される癌であり、好ましくは、前記癌は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、胆管癌及び結腸直腸癌から選ばれる、
ことを特徴とする請求項１３に記載の応用。

【請求項15】

抗腫瘍併用製剤の製造における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体薬物コンジュゲート、その薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくはその重水素化物、又は請求項１２に記載の医薬組成物の応用であって、前記併用製剤において、
（１）ＨＥＲ２以外の他の標的を標的とする薬物、
（２）細胞治療薬、
（３）免疫療法薬という腫瘍を治療するための任意の活性成分も含まれる、応用。

【国際調査報告】