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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-15
(54)【発明の名称】ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20240508BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240508BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240508BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240508BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240508BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240508BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240508BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240508BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240508BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240508BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240508BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240508BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240508BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
A61K47/68
A61K39/395 T
C12N5/10 ZNA
C07K14/705
C12N5/0783
C07K16/00
C07K19/00
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023568007
(86)(22)【出願日】2022-05-06
(85)【翻訳文提出日】2023-12-28
(86)【国際出願番号】 EP2022062374
(87)【国際公開番号】W WO2022234134
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】PCT/ES2021/070316
(32)【優先日】2021-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】ES
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523030500
【氏名又は名称】フンダシオ デ レセルカ クリニック バルセロナ－インスティテュート ディンベスティガシオンス ビオメディケス アウグスト ペイ イ スニェー
(71)【出願人】
【識別番号】513295630
【氏名又は名称】ホスピタル クリニック デ バルセロナ
(71)【出願人】
【識別番号】513295641
【氏名又は名称】ユニベルシタ デ バルセロナ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フアン オテロ マネル
(72)【発明者】
【氏名】ウルバノ イスピッツア アルバロ
(72)【発明者】
【氏名】パスカル カプデビラ マリオナ
(72)【発明者】
【氏名】ジャグエ リベス ジョルディ
(72)【発明者】
【氏名】デルガド ゴンサレス フリオ
(72)【発明者】
【氏名】エステべ レイナー ジョルディ
(72)【発明者】
【氏名】カスティッラ カスティッラ マリア
(72)【発明者】
【氏名】ボロナット バラド アナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB12
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB43
4C085BB50
4C085CC03
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及びＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療におけるその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療における使用のための、複数の細胞を含む組成物であって、前記細胞が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有する、抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを順に含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記ＶＨが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＬがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ１が配列番号１の配列のみからなり、ＨＣＤＲ２が配列番号２の配列のみからなり、ＨＣＤＲ３が配列番号３の配列のみからなり、ＬＣＤＲ１が配列番号４の配列のみからなり、ＬＣＤＲ２が配列番号５の配列のみからなり、ＬＣＤＲ３が配列番号６の配列のみからなり、細胞の漸進的分割投与が行われ、投与される細胞の割合が、投与される各連続分割量において漸進的に増加することを特徴とする、複数の細胞を含む組成物。
【請求項2】
請求項１に記載のＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療に使用するための、複数の細胞を含む組成物であって、前記細胞が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有する、抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを順に含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記ＶＨが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＬがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ１が配列番号１の配列のみからなり、ＨＣＤＲ２が配列番号２の配列のみからなり、ＨＣＤＲ３が配列番号３の配列のみからなり、ＬＣＤＲ１が配列番号４の配列のみからなり、ＬＣＤＲ２が配列番号５の配列のみからなり、ＬＣＤＲ３が配列番号６の配列のみからなり、細胞の分割投与が、０日目に総用量の１０％程度を含む第１の分割量を投与し、続いて総用量の３０％程度を含む第２の分割量、及び総用量の６０％程度を含む第３の分割量を投与することによって行われることを特徴とする、複数の細胞を含む組成物。
【請求項3】
前記抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖが、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、前記ＶＬドメインが、配列番号７のみからなり、前記ＶＨドメインが、配列番号８のみからなる、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項4】
前記ＣＡＲが、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項5】
前記ＣＡＲのヒンジ及び膜貫通ドメインが配列番号９のＣＤ８ａのみからなり、前記共刺激シグナル伝達ドメインが配列番号１０の４－１ＢＢのみからなり、前記細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号１１のＣＤ３δのみからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項6】
前記ＣＡＲが配列番号１２を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項7】
前記細胞が、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項8】
薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項9】
急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫若しくは慢性リンパ性白血病、又は任意のＣＤ１９＋障害の治療における、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項10】
総用量が０．５×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇ、好ましくは１×１０６細胞／ｋｇであることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療分野に関する。特に、本発明は、新たなｓｃＦｖに基づくＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及びＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
自家Ｔ細胞を遺伝子改変してＣＡＲを発現させ、それによって腫瘍細胞を排除するようにリダイレクトすることは、癌治療、特にＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の革新的な治療法である。
【0003】
ＣＡＲは、特定の抗原への結合を担う細胞外領域と、Ｔ細胞の細胞毒性活性及び増殖を促進する細胞内領域とで構成される。選択された抗原へのＣＡＲの結合は、通常、モノクローナル抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）によって媒介される。ｓｃＦｖ由来の領域は、ＣＡＲとそのリガンドとの中程度～高い親和性とＭＨＣ非依存性の相互作用をもたらす。第２世代のＣＡＲとして、このｓｃＦｖは細胞内共刺激ドメイン（通常はＣＤ２８又は４－１ＢＢ）及び活性化促進細胞毒性ドメイン（ＣＤ３ｚ）と組み合わされる。
【0004】
第１世代のＣＡＲでは当初は期待外れの結果であったが、第２世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた最新の臨床試験では、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を有する患者において目覚ましい結果が示されている。ペンシルベニア大学、メモリアルスローンケタリング癌センター、国立癌研究所、及びフレッドハッチンソン癌研究センターを含むいくつかの学術団体が、わずかに異なるＣＡＲコンストラクトを用いてこれらの独創的な研究を進めており、これらのコンストラクトは現在多くの国際多施設臨床試験で評価されている。ＦＭＣ６３クローンと名付けられたモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖをベースにしたこれらのＣＡＲ生成物のうち２つ（チサゲンレクロイセル及びアキシカブタゲンシロロイセル）は、最近、米国食品医薬品局及び欧州医薬品庁によって臨床使用が承認された。有効性については、Ｂ細胞悪性腫瘍及びＣＡＲコンストラクトの種類にもよるが、奏効率は５０％～８５％の範囲であり、無増悪生存期間及び全生存期間は非常に優れている。安全性については、治療に反応した患者は通常、持続性のＢ細胞形成不全と一過性サイトカイン放出症候群を発症するが、これは一部の患者で重症化する可能性がある。
【0005】
このような目覚ましい結果にもかかわらず、この治療法はほんの一握りの施設でしか利用できず、他の場所でいつ、どのくらいの費用でこれを利用できるかは不明である。
【0006】
したがって、本発明は、ＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療のためのＦＭＣ６３クローンと名付けられたモノクローナル抗体とは異なる新たなｓｃＦｖに基づく新たなＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法の開発に焦点を当てている。
【発明の概要】
【0007】
上記で説明したように、本発明は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法及びＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療に対するその使用に関する。
【0008】
本発明で得られた結果（実施例１を参照されたい）によれば、本発明のＣＡＲＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１９＋細胞に対して高い細胞毒性を有し、炎症誘発性サイトカインの分泌及びＣＡＲＴ細胞の増殖を誘導する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、本発明のＣＡＲＴ細胞は、ＮＳＧ異種移植Ｂ－ＡＬＬマウスモデルにおける疾患の進行を完全に制御することができる。前臨床データに基づいて、本発明のＣＡＲＴ細胞はＣＤ１９＋細胞に対して明らかに機能的であると結論付けることができる。
【0009】
一方、本発明は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の第Ｉ相臨床試験に関連して、２８個のＣＡＲ Ｔ細胞生成物を生産することを示している（実施例２を参照されたい）。このシステムは、ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択、レンチウイルス形質導入、及びＩＬ－７／ＩＬ－１５を用いたＴ細胞拡大を含む。製造された２８種類のＣＡＲ Ｔ細胞生成物のうち２７種類が仕様の全リストを満たし、有効な生成物と見なされた。ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞拡大は平均８．５日間続き、平均形質導入率は３０．６％±１３．４４であった。得られた全ての生成物は、ＣＤ１９＋細胞に対して細胞毒性活性を示し、炎症誘発性サイトカインの分泌に長けていた。健康なドナーの細胞と比較して、患者の細胞では拡大動態が遅かった。しかしながら、生成物の効力は同等であった。ＣＡＲ Ｔ細胞サブセットの表現型は患者によって大きく異なり、主に初期生成物によって決定された。得られたＴ細胞表現型は、ＴＣＭ及びＴＥＭが優勢であった。平均して、得られたＣＡＲ Ｔ細胞の３８．７％は、ＴＮ又はＴＣＭ表現型を示し、これらの表現型は、患者のＴ細胞記憶を長期間持続させることができるサブセットである。最適なＴ細胞表現型に寄与する個々の要因を特定するための詳細な分析により、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の拡大によりＴＮ細胞、ＴＳＣＭ細胞、及びＴＥＦＦ細胞の数が減少し、ＴＣＭ細胞は、細胞拡大とＣＡＲ発現の両方により増加することが明らかになった。全体として、これらの結果は、重度の前治療を受けた患者向けに臨床グレードのＣＡＲ Ｔ細胞を生産するための実現可能なシステムであり、得られた生成物がこの分野の現在の品質基準を満たしていることを示している。ｅｘ ｖｉｖｏでの拡大が減少すると、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続性が向上したＣＡＲ Ｔ細胞生成物が得られる可能性がある。
【0010】
最後に、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞の投与が評価され、治療が安全で効果的であることを確認する結果が得られたことを考慮することが最も重要である（実施例３を参照されたい）。
【0011】
したがって、本発明の第１の実施の形態は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ（以下、本発明の抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖ）に関し、上記ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ１は配列番号１の配列のみからなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２の配列のみからなり、ＨＣＤＲ３は配列番号３の配列のみからなり、ＬＣＤＲ１は配列番号４の配列のみからなり、ＬＣＤＲ２は配列番号５の配列のみからなり、ＬＣＤＲ３は配列番号６の配列のみからなる。
【0012】
特に、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列は以下のとおりである：
ＨＣＤＲ１（配列番号１）：FAFSSYWMNWV
ＨＣＤＲ２（配列番号２）：GQIYPGDGDT
ＨＣＤＲ３（配列番号３）：RKRITAVIT
ＬＣＤＲ１（配列番号４）：RASESVDNFGNSFMH
ＬＣＤＲ２（配列番号５）：IYIASNLES
ＬＣＤＲ３（配列番号６）：HQNNEDPLTF
ＨＣＤＲ１（配列番号１）：FAFSSYWMNWV
ＨＣＤＲ２（配列番号２）：GQIYPGDGDT
ＨＣＤＲ３（配列番号３）：RKRITAVIT
ＬＣＤＲ１（配列番号４）：RASESVDNFGNSFMH
ＬＣＤＲ２（配列番号５）：IYIASNLES
ＬＣＤＲ３（配列番号６）：HQNNEDPLTF
【0013】
好ましい実施の形態において、本発明の抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖは、軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）と重鎖可変領域（ＶＨドメイン）とを含み、ＶＬドメインは配列番号７のみからなり、ＶＨドメインは配列番号８のみからなる。
【0014】
特に、ＶＬ及びＶＨの配列は以下のとおりである：
ＶＬ（配列番号７）
TGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFG NSFMHWYQQKSGQPPRLLIYIASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYY
CHQNNEDPLTFGAGTKLELK
注：ＣＤＲには下線が引かれる。
ＶＨ（配列番号８）
HSQIQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYP
GDGDTKYNVKFRGKATLTADESSSTAYIQLTSLTSEDSGVYFCARKRITAVITTVFD
VWGAGTTVTVSS
注：ＣＤＲには下線が引かれる。
ＶＬ（配列番号７）
TGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFG NSFMHWYQQKSGQPPRLLIYIASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYY
CHQNNEDPLTFGAGTKLELK
注：ＣＤＲには下線が引かれる。
ＶＨ（配列番号８）
HSQIQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYP
GDGDTKYNVKFRGKATLTADESSSTAYIQLTSLTSEDSGVYFCARKRITAVITTVFD
VWGAGTTVTVSS
注：ＣＤＲには下線が引かれる。
【0015】
本発明の第２の実施の形態は、ＶＬドメインと、ＶＨドメインと、スペーサーとを順に含むｓｃＦｖを含むＣＡＲ（以下、本発明のＣＡＲ）に関し、ＶＬドメインは配列番号７のみからなり、ＶＨドメインは配列番号８のみからなる。
【0016】
好ましい実施の形態において、本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン、及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。
【0017】
好ましい実施の形態において、ヒンジ及び膜貫通ドメインは配列番号９のＣＤ８ａのみからなり、共刺激シグナル伝達ドメインは配列番号１０の４－１ＢＢのみからなり、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号１１のＣＤ３δのみからなる。
【0018】
特に、ＣＤ８ａ、４－１ＢＢ、及びＣＤ３δの配列は以下のとおりである：
ＣＤ８ａ（配列番号９）
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG
VLLLSLVITLYC
４－１ＢＢ（配列番号１０）
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
ＣＤ３δ（配列番号１１）
RVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNEL
QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＣＤ８ａ（配列番号９）
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG
VLLLSLVITLYC
４－１ＢＢ（配列番号１０）
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
ＣＤ３δ（配列番号１１）
RVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNEL
QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
【0019】
好ましい実施の形態において、本発明のＣＡＲは配列番号１２を含む。
【0020】
特に、本発明のＣＡＲの配列は以下のとおりである：
ＣＡＲ（配列番号１２）
［ＶＬ＋スペーサー＋ＶＨ＋ＣＤ８ａ＋４－１ＢＢ＋ＣＤ３δ］
TGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFG NSFMHWYQQKSGQPPRLLIYIASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCHQNNEDPLTFGAGTKLELK
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
HSQIQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYP
GDGDTKYNVKFRGKATLTADESSSTAYIQLTSLTSEDSGVYFCARKRITAVITTVFD
VWGAGTTVTVSS
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG
VLLLSLVITLYC
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
RVKFSRSA
DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
注：ＣＤＲには下線が引かれる。
ＣＡＲ（配列番号１２）
［ＶＬ＋スペーサー＋ＶＨ＋ＣＤ８ａ＋４－１ＢＢ＋ＣＤ３δ］
TGNIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFG NSFMHWYQQKSGQPPRLLIYIASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCHQNNEDPLTFGAGTKLELK
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
HSQIQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYP
GDGDTKYNVKFRGKATLTADESSSTAYIQLTSLTSEDSGVYFCARKRITAVITTVFD
VWGAGTTVTVSS
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG
VLLLSLVITLYC
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
RVKFSRSA
DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
注：ＣＤＲには下線が引かれる。
【0021】
本発明の第３の実施の形態は、本発明のＣＡＲをコードする核酸、好ましくは配列番号１３を含む核酸に関する。
【0022】
特に、本発明のＣＡＲをコードする核酸の配列は以下のとおりである：
レンチウイルスベクター（配列番号１３）
［ＥＦ１Ａプロモーター＋ＣＤ８ペプチドリーダー＋ＶＬ＋スペーサー＋ＶＨ＋ＣＤ８ａ＋４－１ＢＢ＋ＣＤ３δ］
CGCCTTTTTCCGGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCATGA
GCCTCATCCCGAATG GCT CTG CCT GTC ACT GGA CTG CTG CTG TCA CTG GGG CTG CTG CTG CAC GCC GCA AGA CCA
ACC GGT AAC ATC GTG CTG ACT CAG AGC CCA GCA TCC CTG GCC GTC TCA CTG GGA CAG CGG GCT ACC ATC AGC TGC AGA GCA AGC GAG TCC GTG GAC AAC TTC GGA AAT TCC TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAG TCT GGC CAG CCC CCT CGA CTG CTG ATC TAT ATT GCC TCT AAC CTG GAG AGT GGC GTG CCA GCT AGG TTC TCT GGC AGT GGG TCA CGC ACA GAC TTT ACC CTG ACA ATT GAT CCC GTC GAA GCC GAC GAT GCC GCT ACC TAC TAT TGC CAC CAG AAC AAC GAG GAC CCA CTG ACT TTC GGA GCA GGG ACA AAA CTG GAA CTG AAG
GGTGGAGGCGGGAGC GGAGGAGGCGGGTCG GGAGGAGGAGGATCG GGTGGCGGAG GCTCA
CAT TCT CAG ATT CAG CTG CAG CAG TCAGGG GCA GAG CTG GTG CGG CCA GGG TCC TCA GTC AAG ATT AGT TGT AAG GCT TCA GGC TTT GCT TTC AGC TCC TAC TGG ATG AAC TGG GTG AAA CAG CGA CCA GGA CAG GGA CTG GAG TGG ATC GGA CAG ATC TAC CCC GGA GAC GGC GAT ACA AAG TAT AAT GTC AAA TTT CGG GGC AAG GCC ACC CTG ACA GCT GAC GAG TCT AGT TCA ACC GCC TAC ATC CAG CTG ACT TCA CTG ACC AGC GAA GAT TCC GGC GTG TAT TTC TGC GCT CGA AAG CGG ATC ACT GCA GTC ATT ACC ACA GTG TTT GAC GTG TGG GGG GCA GGA ACT ACC GTG ACC GTC AGC TCC
ACA ACT ACG CCG GCG CCG AGA CCA CCT ACA CCT GCA CCA ACT ATT GCC TCT CAG CCA CTG AGT CTG CGC CCC GAG GCA TGT CGA CCT GCC GCT GGC GGG GCT GTG CAC ACC AGG GGC CTA GAC TTC GCC TGC GAT ATC TATATT TGG GCT CCA CTG GCA GGA ACC TGT GGC GTG CTG CTG CTG TCT CTG GTC ATC ACA CTG TAC TGC
AAA AGA GGC AGG AAG AAA CTG CTG TAT ATT TTC AAG CAG CCC TTT ATG AGA CCT GTG CAG ACA ACT CAG GAG GAA GAC GGG TGC AGC TGT AGG TTC CCT GAG GAA GAG GAA GGA GGC TGT GAG CTG
CGC GTG AAA TTT TCT CGG AGT GCA GAT GCC CCA GCT TAC CAG CAG GGC CAG AAC CAG CTG TAT AAC GAG CTG AAT CTG GGG CGG AGA GAG GAA TAC GAC GTG CTG GAT AAG AGG CGC GGG CGA GAT CCA GAA ATG GGA GGA AAA CCC CAG CGA CGG AAG AAC CCT CAG GAG GGA CTG TAC AAT GAA CTG CAG AAG GAC AAA ATG GCA GAG GCC TAT TCC GAA ATC GGG ATG AAA GGA GAA AGA AGG CGC GGC AAG GGG CAT GAT GGC CTG TAT CAG GGA CTG TCA ACC GCA ACA AAA GAT ACT TAT GAT GCT CTG CAC ATG CAG GCT CTG CCC CCG CGG TAA
レンチウイルスベクター（配列番号１３）
［ＥＦ１Ａプロモーター＋ＣＤ８ペプチドリーダー＋ＶＬ＋スペーサー＋ＶＨ＋ＣＤ８ａ＋４－１ＢＢ＋ＣＤ３δ］
CGCCTTTTTCCGGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCATGA
GCCTCATCCCGAATG GCT CTG CCT GTC ACT GGA CTG CTG CTG TCA CTG GGG CTG CTG CTG CAC GCC GCA AGA CCA
ACC GGT AAC ATC GTG CTG ACT CAG AGC CCA GCA TCC CTG GCC GTC TCA CTG GGA CAG CGG GCT ACC ATC AGC TGC AGA GCA AGC GAG TCC GTG GAC AAC TTC GGA AAT TCC TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAG TCT GGC CAG CCC CCT CGA CTG CTG ATC TAT ATT GCC TCT AAC CTG GAG AGT GGC GTG CCA GCT AGG TTC TCT GGC AGT GGG TCA CGC ACA GAC TTT ACC CTG ACA ATT GAT CCC GTC GAA GCC GAC GAT GCC GCT ACC TAC TAT TGC CAC CAG AAC AAC GAG GAC CCA CTG ACT TTC GGA GCA GGG ACA AAA CTG GAA CTG AAG
GGTGGAGGCGGGAGC GGAGGAGGCGGGTCG GGAGGAGGAGGATCG GGTGGCGGAG GCTCA
CAT TCT CAG ATT CAG CTG CAG CAG TCAGGG GCA GAG CTG GTG CGG CCA GGG TCC TCA GTC AAG ATT AGT TGT AAG GCT TCA GGC TTT GCT TTC AGC TCC TAC TGG ATG AAC TGG GTG AAA CAG CGA CCA GGA CAG GGA CTG GAG TGG ATC GGA CAG ATC TAC CCC GGA GAC GGC GAT ACA AAG TAT AAT GTC AAA TTT CGG GGC AAG GCC ACC CTG ACA GCT GAC GAG TCT AGT TCA ACC GCC TAC ATC CAG CTG ACT TCA CTG ACC AGC GAA GAT TCC GGC GTG TAT TTC TGC GCT CGA AAG CGG ATC ACT GCA GTC ATT ACC ACA GTG TTT GAC GTG TGG GGG GCA GGA ACT ACC GTG ACC GTC AGC TCC
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AAA AGA GGC AGG AAG AAA CTG CTG TAT ATT TTC AAG CAG CCC TTT ATG AGA CCT GTG CAG ACA ACT CAG GAG GAA GAC GGG TGC AGC TGT AGG TTC CCT GAG GAA GAG GAA GGA GGC TGT GAG CTG
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【0023】
本発明の第４の実施の形態は、本発明のＣＡＲ又は本発明のＣＡＲをコードする核酸を含む細胞（以下、本発明のＣＡＲ細胞）に関する。
【0024】
好ましい実施の形態において、細胞はＴ細胞（以下、本発明のＣＡＲＴ細胞）又はＮＫ細胞である。
【0025】
本発明の第５の実施の形態は、複数の本発明の細胞と、任意に、薬学的に許容可能な担体又は添加剤とを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物）に関する。
【0026】
本発明の第６の実施の形態は、医薬品としての、好ましくはＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療における、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫若しくは慢性リンパ性白血病、又は任意のＣＤ１９＋障害の治療における使用のための本発明の細胞又は医薬組成物に関する。
【0027】
あるいは、この第６の実施の形態は、治療上有効な用量の本発明の細胞又は医薬組成物を投与することを含む、ＣＤ１９＋悪性腫瘍、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫若しくは慢性リンパ性白血病、又は任意のＣＤ１９＋障害を治療する方法に関する。
【0028】
好ましい実施の形態において、本発明の細胞組成物の分割投与、特に漸進的用量分割（progressive dose fractionation）が行われた。漸進的用量分割とは、患者が本発明の組成物の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの分割量を受けたことを意味し、投与される細胞の割合は、連続する分割量ごとに漸進的に増加する。好ましい実施の形態において、漸進的用量分割は、０日目に第１の分割量（１０％程度）、その後に続く第２の分割量（３０％程度）及び第３の分割量（６０％程度）を含む。
【0029】
したがって、最初の患者は本発明の組成物の単回静脈内注入を受けたが、漸進的用量分割の概念実証として、次の患者は０日目に第１の分割量（１０％程度）を受け、続いて第２の分割量（３０％程度）及び第３の分割量（６０％程度）を受けた。第２の分割量は、第１の分割量の２４時間～４８時間後に投与するのが好ましく、第３の分割量は、患者にＣＲＳの徴候又は症状がない場合にのみ、第２の分割量の２４時間～４８時間後に投与することが好ましい。
【0030】
この漸進的分割投与の提案の理由は、致死性毒性が３例検出されたため、毒性を回避するためであった。
【0031】
好ましい実施の形態において、本発明の細胞組成物の総用量は、（実施例で説明されているように）治療すべき特定の患者に依存する。典型的な用量は、０．１×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇ、好ましくは０．５×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇ、より好ましくは１×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇである。上記で説明したように、総用量を３つの分割量に分割することが好ましい。
【0032】
本発明の目的のために、以下の用語が定義される：
【0033】
「含む（comprising）」という用語は、「含む」という語の前にある（follows）全てのものを含むが、これに限定されないことを意味する。したがって、「含む」という用語の使用は、列挙された要素が必要であるか、又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
【0034】
「のみからなる（consisting of）」とは、「のみからなる」という表現の前にある全てのものを「含み、これに限定される」ことを意味する。したがって、「のみからなる」という表現は、列挙された要素が必要であるか、又は必須であり、かつ他の要素が何ら存在し得ないことを示す。
【0035】
「薬学的に許容可能な添加剤又は担体」とは、本発明の組成物において任意選択で含まれてよい、患者に有意な有害毒性学的作用を引き起こさない化合物を指す。
【0036】
本発明の組成物の「治療有効用量」とは、本明細書に記載のとおりに投与した場合に、ＣＤ１９＋悪性腫瘍に罹患している被験体において治療反応が良好となる量を意図する。正確な必要量は、年齢、被験体の全身状態、治療される状態の重症度、投与様式等に応じて、被験体ごとに異なる。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、本明細書に提供されている情報に基づいて、日常的な実験を用いて当業者により決定され得る。
【0037】
「Ｆａｂ」は５０ｋＤａ程度の大きさの抗体フラグメントであり、重鎖と軽鎖のそれぞれに１つの定常ドメインと１つの可変ドメインとを含む抗体分子の抗原結合ドメインである。ジスルフィド架橋チオールを含むフラグメントは「Ｆａｂ’フラグメント」と呼ばれ、チオール官能基がないフラグメントは「Ｆａｂフラグメント」と呼ばれる。「Ｆａｂ」フラグメントを生成するには、２つの異なる方法を用いることができる。主な方法は、抗体全体を酵素的／化学的に切断することであり、この方法では、抗体全体が酵素（パパイン、ペプシン、及びフィシン等）によって切断されて「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを形成し、その後、それらのフラグメントを還元して「Ｆａｂ」フラグメントを生成する。別の方法は、「Ｆ（ａｂ’）２」抗体フラグメントを組換え合成し、続いてこれらのフラグメントを化学還元してＦａｂユニットを生成することである。Ｆｃヒンジ領域のごく一部を保持する「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントは、抗原との親和性を高める可能性のある２つの抗原結合領域を有する。「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを還元すると、他の分子との共役に有用な遊離のスルフヒドリル基を持つ２つの一価Ｆａｂ’フラグメントが産生される。酵素的／化学的切断法を利用して「Ｆａｂ」フラグメントを生成することは便利で効率的であるが、出発物質として大量のモノクローナル抗体が必要である。単鎖の「Ｆａｂ」フラグメント（ｓｃＦａｂ）は、「Ｆａｂ」フラグメントの機能及び産生の改善につながる可能性がある。いくつかの研究によると、「ｓｃＦａｂ」フラグメントは「Ｆａｂ」と比較して優れた抗原結合能を示し、大腸菌（E. coli）での可溶性Ｆａｂ産生のいくつかの欠点を補っている。
【0038】
「単鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、ペプチドリンカーによって互いに連結した抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインを含む融合タンパク質を指す。この用語は、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）も含む。ジスルフィド結合によってｓｃＦｖを安定化する方法は、Reiter et al., 1996. Nat Biotechnol. 14(10):1239-45に開示されている。
【0039】
「漸進的用量分割」という表現は、患者が本発明の組成物の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの分割量を受けたことを意味し、投与される細胞の割合は、連続する分割量ごとに漸進的に増加する。好ましい実施の形態において、漸進的用量分割は、０日目に第１の分割量（１０％程度）、その後に続く第２の分割量（３０％程度）及び第３の分割量（６０％程度）を含む。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】本発明のＣＡＲのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）ＣＡＲＴ１９細胞対ＮＡＬＭ６細胞の細胞毒性アッセイ。未処理と比較した標的生存細胞のパーセントを示す（３回の実験の平均±ＳＥＭ）。右側のパネルは、Ｅ：Ｔ比＝１：８の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（Ｂ）ＣＦＳＥアッセイによって測定されたＣＡＲ１９ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を示す。左側のパネルは、代表的なフローサイトメトリーの画像を示す。右側のパネルは、増殖指数（ＰＩ）の定量化を示す。３回の実験の平均±ＳＥＭを示す。（Ｃ）ＥＬＩＳＡで測定した、ＮＡＬＭ６細胞と共培養したＣＡＲＴ１９細胞のサイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ－１０）。３回の実験の平均±ＳＥＭを示す。（＊）は統計的有意性を示し、ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ．は統計的に有意ではないことを示す。
【図2】本発明のＣＡＲのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）上のパネルは、実験計画のタイムラインを示す。下のパネルには、異なる日数の疾患の進行を示す生物発光画像を示す。（＃）で示された動物は、疾患の進行が進んだため、１６日目に屠殺した。残りの動物は１７日目に屠殺した。（Ｂ）（ａ）に示すマウスの骨髄中の腫瘍（ＣＤ１９＋）細胞の検出（平均±ＳＤ）。（Ｃ）血液中の腫瘍（ＣＤ１９＋）細胞の検出。
【図3】本発明のＣＡＲＴ細胞とＦＭＣ６３ベースのＣＡＲＴ細胞との抗腫瘍活性の比較を示す図である。上のパネルは、実験計画のタイムラインを示す（＊Ｉｍ、生物発光画像、＊ＢＩ、血液試料）。下のパネルは、異なる日数の疾患の進行を示す生物発光画像を示す。
【図4】ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙにおける本発明のＣＡＲ細胞の拡大を示す図である。（Ａ）本発明のＣＡＲ細胞の拡大動態（総細胞数）。灰色の点は個々の生成物を示す。黒い三角形は平均±ＳＤ及び調整曲線を示す。（Ｂ）ＣＡＲ１９＋細胞（赤）の拡大動態、及び総細胞数（黒）。平均±ＳＤを表す。（Ｃ）健康な対照及び異なる種類の疾患を比較する、本発明のＣＡＲ細胞の拡大動態（総細胞数）。平均±ＳＥＭを表す。（Ｄ）フローサイトメトリーにより測定されたＣＤ３及びＣＡＲ１９陽性細胞の割合。平均±ＳＤも示す。右側のパネルは、本発明のＣＡＲ細胞（最終生成物）及び対照Ｔ細胞（非形質導入細胞）におけるＣＡＲ１９及びＣＤ３染色に対応するフローサイトメトリーの代表画像を示す。
【図5】本発明のＣＡＲ細胞の細胞効力を示す図である。（Ａ）指定の比率で本発明のＣＡＲ細胞をＮＡＬＭ６細胞と共培養した４時間後の細胞毒性アッセイ。２７種類のＣＡＲ Ｔ細胞生成物全ての平均±ＳＤを示す。（＃）破線は、有効とみなされる生成物における本発明のＣＡＲ細胞の細胞毒性レベルの最小値を示す。（Ｂ）細胞毒性アッセイの上清において測定されたＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びグランザイムＢのレベル。Ｅ：Ｔ比０は標的細胞がないことを示す。（＊）は統計的有意性、ｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）指定の比率での本発明のＣＡＲ細胞とＮＡＬＭ６細胞との４時間共培養後の細胞毒性の可能性の比較。平均±ＳＤを示す。「ｎ．ｓ．」は統計的に有意ではないことを示す（ノンパラメトリック検定）。（Ｄ）Ｅ：Ｔ比１：１での細胞毒性アッセイの上清において測定されたＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びグランザイムＢのレベルの比較。「ＨＤ」は健康なドナーを示す。「ｎ．ｓ．」は統計的に有意ではないことを示す（ＩＦＮγ及びＴＮＦαにはパラメトリック検定を適用し、グランザイムＢにはノンパラメトリック検定を適用した）。
【図6】本発明のＣＡＲ細胞のサブセット特性評価を示す図である。（Ａ）ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択後及び最終生成物のアフェレーシス生成物のＣＤ４／ＣＤ８比。（Ｂ）細胞拡大中のＣＤ４／ＣＤ８比の変動。左側のパネルは、初期比率が１未満の生成物に対応する。右側のパネルは、初期比率が１を超える生成物に対応する。（Ｃ）ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞におけるＣＡＲ１９形質導入効率。平均±ＳＤを示す。（Ｄ）初期生成物（ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択）及び最終生成物（ＣＡＲ－細胞及びＣＡＲ＋細胞）におけるＴ細胞亜集団の割合。（Ｅ）初期生成物と最終生成物におけるＣＤ４５ＲＡとＣＣＲ７のＭＦＩの差。下のパネルは、ＣＣＲ７ ＭＦＩのペア分析を示す。（＊）は統計的有意性、ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ．は統計的に有意ではないことを示す。
【図7】急性リンパ芽球性白血病を有する患者の臨床結果を示す図である。（Ａ～Ｄ）投与タイプ（コホート１及びコホート２対コホート３）による修正最大解析対象集団（modified full analysis set）（ｎ＝３８）に属する急性リンパ芽球性白血病を有する患者の無増悪生存期間（Ａ）、全生存期間（Ｂ）、Ｂ細胞形成不全の持続性によって測定される本発明のＣＡＲ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ生存率（Ｃ）、及び処置関連死亡率（Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明を、その保護範囲を限定する意図なしに、以下の実施例によって例示する。
【実施例】
【0042】
実施例１．本発明の抗ＣＤ１９ ＣＡＲの開発
実施例１．１材料及び方法
実施例１．１．１．ドナー、細胞株、及び抗ＣＤ１９モノクローナル抗体
全てのプロトコルは、対応する機関審査委員会によって承認された。健康なドナーの血液バフィーコートは、地元の参照血液バンク（Banc de Sang i Teixits、バルセロナ）から入手した。ＮＡＬＭ６、ＨＬ６０、Ｋ５６２、及び３００．１９の細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。これら４つの細胞株を、ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株もＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ－１１２６８）から購入し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質中で培養した。全ての細胞株を、３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた。３００．１９－ｈＣＤ１９の安定的トランスフェクト細胞を、ｐＵＮＯ１－ＣＤ１９ ｃＤＮＡ（InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して生成した。
実施例１．１材料及び方法
実施例１．１．１．ドナー、細胞株、及び抗ＣＤ１９モノクローナル抗体
全てのプロトコルは、対応する機関審査委員会によって承認された。健康なドナーの血液バフィーコートは、地元の参照血液バンク（Banc de Sang i Teixits、バルセロナ）から入手した。ＮＡＬＭ６、ＨＬ６０、Ｋ５６２、及び３００．１９の細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。これら４つの細胞株を、ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株もＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ－１１２６８）から購入し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質中で培養した。全ての細胞株を、３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた。３００．１９－ｈＣＤ１９の安定的トランスフェクト細胞を、ｐＵＮＯ１－ＣＤ１９ ｃＤＮＡ（InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して生成した。
【0043】
本発明のマウス抗ＣＤ１９モノクローナル抗体を、免疫学科（ホスピタル・クリニック・デ・バルセロナ）で作製し、その抗ＣＤ１９特異性を確認した。
【0044】
実施例１．１．２．ＣＡＲ１９クローニング及びレンチウイルス産生
本発明の抗体のＶＬ及びＶＨ領域に対応する配列を、マウスＩｇ－プライマーセット（Novagen、カタログ番号６９８３１－３）を用いてハイブリドーマ細胞から抽出した。完全なＣＡＲ１９配列（シグナルペプチド、抗体ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、４－１ＢＢ及びＣＤ３ｚを含む）をＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＥＦ１αプロモーターの制御下で第３世代レンチウイルスベクターｐＣＣＬ（ミラノのサンラファエル病院のルイジ・ナルディーニ博士から善意により提供）にクローニングした。
本発明の抗体のＶＬ及びＶＨ領域に対応する配列を、マウスＩｇ－プライマーセット（Novagen、カタログ番号６９８３１－３）を用いてハイブリドーマ細胞から抽出した。完全なＣＡＲ１９配列（シグナルペプチド、抗体ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、４－１ＢＢ及びＣＤ３ｚを含む）をＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＥＦ１αプロモーターの制御下で第３世代レンチウイルスベクターｐＣＣＬ（ミラノのサンラファエル病院のルイジ・ナルディーニ博士から善意により提供）にクローニングした。
【0045】
前臨床研究用のレンチウイルス粒子を産生するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、直鎖ポリエチレンイミンＭＷ２５０００（ＰＥＩ）（Polysciences、カタログ番号２３９６６－１）を使用して、パッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Addgene、＃１２２５１）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Addgene、＃１２２５３）、及びエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Addgene、＃１２２５９）と共に本発明者らのトランスファーベクター（ｐＣＣＬ－ＥＦ１α－ＣＡＲ１９）をトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクションの２４時間前に、６×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍのディッシュにプレーティングした。トランスフェクション時に、１４μｇのトータルＤＮＡ（６．９μｇのトランスファーベクター、３．４１μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、１．７μｇのｐＲＳＶ－Ｒｅｖ及び２μｇのｐＭＤ２．Ｇ）を無血清ＤＭＥＭで希釈した。３５μｇのＰＥＩを混合物に加え、室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、７ｍｌの完全なＤＭＥＭ培地で培養した細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ複合体を加えた。培地を４時間後に交換した。ウイルス上清を４８時間後に収集し、０．４５μｍフィルターを用いた遠心分離及び濾過により清澄化した。超遠心分離を使用して２６０００ｒｐｍで２時間３０分ウイルス上清を濃縮した。ウイルスを含むペレットを完全ＸＶｉｖｏ１５培地に再懸濁し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0046】
実施例１．１．２．レンチウイルス滴定
形質導入単位の数（ＴＵ／ｍｌ）を、限界希釈法によって決定した。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、形質導入の２４時間前に播種した。次いで、ウイルス上清の１：１０希釈液を調製し、完全ＤＭＥＭ培地＋５μｇ／ｍｌポリブレン中の細胞の上に添加した。４８時間後に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーで分析する前に、ＡＰＣコンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、カタログ番号１１５－１３６－０７２）で標識した。陽性細胞の２％～２０％に相当する希釈液を使用してウイルス力価を計算した。
形質導入単位の数（ＴＵ／ｍｌ）を、限界希釈法によって決定した。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、形質導入の２４時間前に播種した。次いで、ウイルス上清の１：１０希釈液を調製し、完全ＤＭＥＭ培地＋５μｇ／ｍｌポリブレン中の細胞の上に添加した。４８時間後に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーで分析する前に、ＡＰＣコンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、カタログ番号１１５－１３６－０７２）で標識した。陽性細胞の２％～２０％に相当する希釈液を使用してウイルス力価を計算した。
【0047】
実施例１．１．３．Ｔ細胞形質導入及び培養条件
倫理委員会の指示に従って提供が同意された後、密度勾配遠心分離（Ficoll）によりバフィーコートから健康なドナーＰＢＭＣを得た。単球を従来のプレート接着によって除去したが、残りの細胞をＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培地（Cultek、＃ＢＥ０２－０６０Ｑ）、５％ＡＢヒト血清（Sigma、カタログ番号Ｈ４５２２）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍｌ；Miltenyi Biotec）で培養した。次いで、ＣＤ３及びＣＤ２８ ｍＡｂとコンジュゲートしたビーズ（ダイナビーズ、Gibco、＃１１１３１Ｄ）を使用して細胞を２４時間活性化及び拡大させ、２４時間後に８μｇ／ｍｌのポリブレン（Santa Cruz、＃ｓｃ－１３４２２０）の存在下で一晩インキュベートしてレンチウイルスにより形質導入した。実験を行う前に、６日～８日間の細胞拡大期間が必要であった。３種の異なるＰＢＭＣドナーを用いた３種の異なる細胞形質導入を使用して、実験を三連で行った。
倫理委員会の指示に従って提供が同意された後、密度勾配遠心分離（Ficoll）によりバフィーコートから健康なドナーＰＢＭＣを得た。単球を従来のプレート接着によって除去したが、残りの細胞をＸ－ＶＩＶＯ１５細胞培地（Cultek、＃ＢＥ０２－０６０Ｑ）、５％ＡＢヒト血清（Sigma、カタログ番号Ｈ４５２２）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍｌ；Miltenyi Biotec）で培養した。次いで、ＣＤ３及びＣＤ２８ ｍＡｂとコンジュゲートしたビーズ（ダイナビーズ、Gibco、＃１１１３１Ｄ）を使用して細胞を２４時間活性化及び拡大させ、２４時間後に８μｇ／ｍｌのポリブレン（Santa Cruz、＃ｓｃ－１３４２２０）の存在下で一晩インキュベートしてレンチウイルスにより形質導入した。実験を行う前に、６日～８日間の細胞拡大期間が必要であった。３種の異なるＰＢＭＣドナーを用いた３種の異なる細胞形質導入を使用して、実験を三連で行った。
【0048】
実施例１．１．４．フローサイトメトリー
ヒトタンパク質に対する以下のｍＡｂ：ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＢＶ４２１、ＣＤ８－ＡＰＣ、ＣＤ１９－ＰＥ、及びＣＤ３３－ＰＥを使用した（いずれもBD Biosciences製）。７－ＡＡＤ（ThermoFisher、＃Ａ１３１０）を生存率マーカーとして使用した。ＣＡＲ１９の発現を、ＡＰＣコンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、カタログ番号１１５－１３６－０７２）で検出した。試料を蛍光活性化細胞選別フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）に通し、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してデータを分析した。
ヒトタンパク質に対する以下のｍＡｂ：ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＢＶ４２１、ＣＤ８－ＡＰＣ、ＣＤ１９－ＰＥ、及びＣＤ３３－ＰＥを使用した（いずれもBD Biosciences製）。７－ＡＡＤ（ThermoFisher、＃Ａ１３１０）を生存率マーカーとして使用した。ＣＡＲ１９の発現を、ＡＰＣコンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、カタログ番号１１５－１３６－０７２）で検出した。試料を蛍光活性化細胞選別フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）に通し、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0049】
実施例１．１．５．抗腫瘍効果のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＣＡＲＴ１９又は非形質導入Ｔ（ＵＴ）細胞を、特に明記されていない限り、腫瘍標的細胞株（ＮＡＬＭ６又はＨＬ６０）又は初代Ｂ－ＡＬＬ腫瘍細胞と、異なるエフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で１６時間共培養し、一定数の標的細胞を維持した。次いで、細胞をＴｒｕＣＯＵＮＴチューブ（ＢＤ、カタログ番号３４０３３４）に移し、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９（又はＣＤ３３）及び７－ＡＡＤに対してｍＡｂと共にインキュベートした。細胞毒性を、生存している標的細胞（ＮＡＬＭ６標的細胞及びＨＬ６０標的細胞について、それぞれ７－ＡＡＤ陰性／ＣＤ１９又はＣＤ３３陽性細胞として同定された）の数を計算することによって決定した。一定数のビーズを取得して絶対細胞数を計算した後、取得を停止し、異なるＥ：Ｔ比を比較できるようにした。共培養上清をサイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ－１０）について、製造元の指示（BD OptEIA）に従ってＥＬＩＳＡによって分析した。全ての実験を３連で実行した。
ＣＡＲＴ１９又は非形質導入Ｔ（ＵＴ）細胞を、特に明記されていない限り、腫瘍標的細胞株（ＮＡＬＭ６又はＨＬ６０）又は初代Ｂ－ＡＬＬ腫瘍細胞と、異なるエフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で１６時間共培養し、一定数の標的細胞を維持した。次いで、細胞をＴｒｕＣＯＵＮＴチューブ（ＢＤ、カタログ番号３４０３３４）に移し、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９（又はＣＤ３３）及び７－ＡＡＤに対してｍＡｂと共にインキュベートした。細胞毒性を、生存している標的細胞（ＮＡＬＭ６標的細胞及びＨＬ６０標的細胞について、それぞれ７－ＡＡＤ陰性／ＣＤ１９又はＣＤ３３陽性細胞として同定された）の数を計算することによって決定した。一定数のビーズを取得して絶対細胞数を計算した後、取得を停止し、異なるＥ：Ｔ比を比較できるようにした。共培養上清をサイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ－１０）について、製造元の指示（BD OptEIA）に従ってＥＬＩＳＡによって分析した。全ての実験を３連で実行した。
【0050】
ＣＤ１９抗原に応答したＣＡＲ細胞増殖を、ＣＦＳＥアッセイを用いて測定した。簡潔には、ＣＡＲ細胞を１μＭ ＣＦＳＥで標識し、洗浄して、増殖刺激のあり又はなしで培養した（ＩＬ－２ ５０Ｕ／ｍｌ、ＮＡＬＭ６細胞又はＫ５６２細胞）。ＮＡＬＭ６又はＫ５６２を、Ｅ：Ｔ比＝１：１で添加した。９６時間後にアッセイを停止し、細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８で染色した。ＣＦＳＥ染色をＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞において測定し、増殖指数（ＰＩ）を計算した（ＰＩ＝異なる世代の細胞数の合計／計算された元の細胞数）。
【0051】
実施例１．１．６．抗腫瘍効果及び安全性のｉｎ ｖｉｖｏ異種移植モデル
動物実験は、動物実験の管轄倫理委員会であるＣＥＥＡ－ＵＢによって承認された。
動物実験は、動物実験の管轄倫理委員会であるＣＥＥＡ－ＵＢによって承認された。
【0052】
生後３カ月のＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｄｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼを発現するＮＡＬＭ６腫瘍細胞（１×１０６細胞／マウス）を静脈内（尾静脈）注入した。次いで、マウスをＣＡＲ細胞（１０×１０６／マウス）、ＵＴ細胞（１０×１０６細胞／マウス）、又はビヒクルのいずれかにランダムに割り当てた。
【0053】
ＣＡＲ細胞又はＵＴ細胞を、ＮＡＬＭ６の注入の３日後に注入した。Ｄ－ルシフェリンの静脈内投与後、生物発光イメージング（Hamamatsuの検出器）により腫瘍成長を毎週評価した。マウスを１６日目～１７日目に屠殺し、血液及び骨髄の試料中の腫瘍量をフローサイトメトリーで測定した。
【0054】
実施例１．１．７．患者規模のＣＡＲ細胞生産
健康なドナーからの白血球アフェレーシスを、インフォームドコンセントのもと、ホスピタル・クリニック・デ・バルセロナのアフェレーシスユニットで入手し、当院の倫理委員会によって承認された。アフェレーシス処置を、Ａｍｉｃｕｓ装置（Fresenius Kabi、イリノイ州レイクズーリック）を使用して実施した。５０ｍｌの血漿で希釈した最低１×１０８個のＴ細胞が必要であった。細胞を、３％のヒトＡＢ血清とＩＬ－７、ＩＬ－１５（それぞれ、Miltenyi Biotecの＃１７０－０７６－１１１及び＃１７０－０７６－１１４）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地を使用して、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）システム（Miltenyi Biotec）で培養した。Ｔ細胞の活性化には、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＧＭＰグレード（Miltenyi Biotec、カタログ番号１７０－０７６－１５６）を使用した。
健康なドナーからの白血球アフェレーシスを、インフォームドコンセントのもと、ホスピタル・クリニック・デ・バルセロナのアフェレーシスユニットで入手し、当院の倫理委員会によって承認された。アフェレーシス処置を、Ａｍｉｃｕｓ装置（Fresenius Kabi、イリノイ州レイクズーリック）を使用して実施した。５０ｍｌの血漿で希釈した最低１×１０８個のＴ細胞が必要であった。細胞を、３％のヒトＡＢ血清とＩＬ－７、ＩＬ－１５（それぞれ、Miltenyi Biotecの＃１７０－０７６－１１１及び＃１７０－０７６－１１４）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地を使用して、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）システム（Miltenyi Biotec）で培養した。Ｔ細胞の活性化には、ＴｒａｎｓＡｃｔ ＧＭＰグレード（Miltenyi Biotec、カタログ番号１７０－０７６－１５６）を使用した。
【0055】
実施例１．２．結果
実施例１．２．１．本発明の抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体の検証
本発明の抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体は、ｈＣＤ１９でトランスフェクトされたマウスリンパ腫細胞株３００．１９に対して反応するが、トランスフェクトされていない細胞には反応しない。本発明の抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体は、予想通り、ヒト末梢血細胞のサブセットとも反応する。抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体はＢ細胞株Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉと反応するが、Ｔ細胞株、骨髄細胞株又はＮＫ細胞株を使用した場合に反応性は観察されず、ＣＤ１９の発現パターンと一致している。さらに、本発明者らは、Ｄａｕｄｉ細胞を抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３抗体とプレインキュベートすると、モノクローナル抗体の結合がブロックされ、ＣＤ１９に対する特異性が確認されることを示す。最後に、抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体を使用すると、Ｄａｕｄｉ細胞から、ＣＤ１９の予想分子量と一致する１００ｋＤａ程度のバンドが沈澱した。これら全てのデータを総合すると、本発明のモノクローナル抗体はヒトＣＤ１９タンパク質に対する高感度で高特異度の抗体であることがわかる。
実施例１．２．１．本発明の抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体の検証
本発明の抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体は、ｈＣＤ１９でトランスフェクトされたマウスリンパ腫細胞株３００．１９に対して反応するが、トランスフェクトされていない細胞には反応しない。本発明の抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体は、予想通り、ヒト末梢血細胞のサブセットとも反応する。抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体はＢ細胞株Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉと反応するが、Ｔ細胞株、骨髄細胞株又はＮＫ細胞株を使用した場合に反応性は観察されず、ＣＤ１９の発現パターンと一致している。さらに、本発明者らは、Ｄａｕｄｉ細胞を抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３抗体とプレインキュベートすると、モノクローナル抗体の結合がブロックされ、ＣＤ１９に対する特異性が確認されることを示す。最後に、抗ｈＣＤ１９モノクローナル抗体を使用すると、Ｄａｕｄｉ細胞から、ＣＤ１９の予想分子量と一致する１００ｋＤａ程度のバンドが沈澱した。これら全てのデータを総合すると、本発明のモノクローナル抗体はヒトＣＤ１９タンパク質に対する高感度で高特異度の抗体であることがわかる。
【0056】
実施例１．２．２．ＣＡＲ有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
本発明の抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖを、レンチウイルスベクター（ｐＣＣＬ）内の残りのＣＡＲシグナル伝達ドメインと共にインフレームでクローニングした。ＣＡＲ１９の有効性を評価するために、バフィーコートから分離されたＰＢＭＣをＣＤ３及びＣＤ２８ダイナビーズを使用して活性化し、続いてＣＡＲ１９を含むレンチウイルスを使用して形質導入した。拡大期間の後、Ｔ細胞でのＣＡＲ１９の発現をフローサイトメトリーによって確認した。ＣＡＲ細胞の割合は、実験に応じて２０％～５６％の間で変動した。
本発明の抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖを、レンチウイルスベクター（ｐＣＣＬ）内の残りのＣＡＲシグナル伝達ドメインと共にインフレームでクローニングした。ＣＡＲ１９の有効性を評価するために、バフィーコートから分離されたＰＢＭＣをＣＤ３及びＣＤ２８ダイナビーズを使用して活性化し、続いてＣＡＲ１９を含むレンチウイルスを使用して形質導入した。拡大期間の後、Ｔ細胞でのＣＡＲ１９の発現をフローサイトメトリーによって確認した。ＣＡＲ細胞の割合は、実験に応じて２０％～５６％の間で変動した。
【0057】
ＣＡＲ細胞の細胞毒性を、ＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ６細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ根絶によって測定した。この目的のため、本発明者らは、生存可能なＣＤ１９＋細胞の数を定量化するフローサイトメトリーベースのアッセイを開発した（材料及び方法のセクションを参照されたい）。ＮＡＬＭ６細胞は、Ｅ：Ｔ比が非常に低くても（８個の標的細胞ごとに１個のエフェクター細胞）、１６時間の共培養後にほぼ完全に除去された。また、本発明者らは、同種反応性による非形質導入（ＵＴ）細胞のわずかな細胞毒性効果も観察した（図１Ａ）。ＣＡＲ細胞との共培養におけるＣＤ１９陰性ＨＬ６０細胞株の生存率を測定することにより、標的細胞の特異性も試験した。予想通り、この場合、ＣＡＲが媒介する死滅は認められなかった。ＣＡＲ細胞の細胞毒性は、初代Ｂ－ＡＬＬ細胞に対しても試験され、同様の有効性が実証された。これら全てのデータを総合すると、本発明者らのＣＡＲ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１９陽性細胞に対して強力で特異的な細胞毒性効果を示すことがわかる。
【0058】
ＣＤ１９結合時のＣＡＲ細胞応答をよりよく特徴付けるため、９６時間の時点で標準のＣＦＳＥアッセイを使用して細胞増殖を測定した。抗原結合は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を排除するためにＣＡＲ細胞の拡大を促進できるはずである。図１Ｂに示すように、ＣＡＲ細胞はＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６細胞株と接触し、ＩＬ－２に反応して（わずかな程度で）増殖した。刺激がない場合又はＣＤ１９陰性細胞株（Ｋ５６２）と接触した場合、増殖は観察されず、細胞増殖がＣＤ１９認識によって媒介されたことが確認された。
【0059】
最後に、１６時間後にエフェクター－標的細胞共培養物の上清においてＣＡＲ細胞のサイトカイン産生を測定し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。ＣＡＲ細胞又はＵＴ細胞を用いた共培養物からのサイトカインレベルを比較した（図１Ｃ）。ＵＴ細胞はＩＦＮγ及びＴＮＦαの増加を示さなかったが、ＣＡＲ細胞はこれら２つの炎症誘発性サイトカインの有意な増加を示した。予想通り、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０のごくわずかで有意ではない増加が観察された。
【0060】
実施例１．２．３．本発明のＣＡＲ細胞と他のＣＡＲＴ１９コンストラクトとの細胞毒性活性の比較
本発明の抗体由来のｓｃＦｖを含むＣＡＲ細胞が、現在ＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療に使用されている他のＣＡＲＴ１９細胞と比較してどのように機能するかを調べるために、本発明者らは、本発明者らのベクターにＦＭＣ６３抗体のｓｃＦｖをクローニングした。残りのＣＡＲコンストラクトは同じままであったことから、本発明者らは、両方のｓｃＦｖフラグメントの効率を直接比較することができた。これらの分析では、本発明者らは、各ＣＡＲコンストラクトを含むレンチウイルスによりＰＢＭＣを形質導入した。ＣＡＲ１９タンパク質の発現が、ウエスタンブロットによって確認された。次いで、本発明の抗体とＦＭＣ６３ ＣＡＲＴ細胞の細胞毒性活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで比較した。両ＣＡＲ間で細胞毒性効力に有意差はなく、本発明の抗体のｓｃＦｖは同等にＣＤ１９に結合して細胞毒性応答を引き起こすことができることを示している。
本発明の抗体由来のｓｃＦｖを含むＣＡＲ細胞が、現在ＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療に使用されている他のＣＡＲＴ１９細胞と比較してどのように機能するかを調べるために、本発明者らは、本発明者らのベクターにＦＭＣ６３抗体のｓｃＦｖをクローニングした。残りのＣＡＲコンストラクトは同じままであったことから、本発明者らは、両方のｓｃＦｖフラグメントの効率を直接比較することができた。これらの分析では、本発明者らは、各ＣＡＲコンストラクトを含むレンチウイルスによりＰＢＭＣを形質導入した。ＣＡＲ１９タンパク質の発現が、ウエスタンブロットによって確認された。次いで、本発明の抗体とＦＭＣ６３ ＣＡＲＴ細胞の細胞毒性活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで比較した。両ＣＡＲ間で細胞毒性効力に有意差はなく、本発明の抗体のｓｃＦｖは同等にＣＤ１９に結合して細胞毒性応答を引き起こすことができることを示している。
【0061】
実施例１．２．４．ＣＡＲ有効性のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＣＡＲＴ１９細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価するために、本発明者らは、ＮＳＧマウスで異種移植実験を行った。
ＣＡＲＴ１９細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価するために、本発明者らは、ＮＳＧマウスで異種移植実験を行った。
【0062】
マウスを、ビヒクル（Ａ）、ＵＴ細胞（Ｂ）、ＣＡＲ細胞（Ｃ）、ＮＡＬＭ６細胞（Ｄ）、ＮＡＬＭ６細胞＋ＵＴ細胞（Ｅ）、及びＮＡＬＭ６細胞＋ＣＡＲ細胞（Ｆ）の投与にランダムに割り当てた。群Ｄ、群Ｅ、及び群Ｆに対応するマウスに、１日目に尾静脈からＮＡＬＭ６－Ｌｕｃ＋ＧＦＰ＋（ＣＤ１９＋）細胞を接種した。４日目に、群Ｂ、群Ｃ、群Ｅ、及び群Ｆに属するマウスにＵＴ細胞又はＣＡＲ細胞のいずれかを注入した。
【0063】
図２Ａに示すように、ＮＡＬＭ６群（６匹中５匹の動物が進行）及びＮＡＬＭ６＋ＵＴ細胞群（４匹中４匹の動物が進行）のＮＡＬＭ６細胞注入から２週間後に疾患の進行が明確に観察された。しかしながら、ＮＡＬＭ６＋ＣＡＲ群に属するマウスはいずれも疾患は検出されなかった（６匹中０匹のマウスが進行した）。実験は完了し、ＮＡＬＭ６群に属する動物が疾患の明らかな兆候を示し始めた１６日目～１７日目に動物を屠殺した。生物発光イメージングデータを確認するために、骨髄及び血液細胞をフローサイトメトリー用に処理した。抗ヒトＣＤ１９染色により、ＮＡＬＭ６群及びＮＡＬＭ６＋ＵＴ群に腫瘍細胞の存在が確認されたが、他の群では対照と比較して有意な割合の腫瘍細胞は検出されなかった（図２Ｂ～図２Ｃ）。
【0064】
また、図３は、本発明のＣＡＲＴ細胞とＦＭＣ６３ベースのＣＡＲＴ細胞との抗腫瘍活性の比較を示す。上のパネルは、実験計画のタイムラインを示す（＊Ｉｍ、生物発光画像、＊ＢＩ、血液試料）。下のパネルには、異なる日数の疾患の進行を示す生物発光画像を示す。
【0065】
実施例１．２．５．ＣＡＲ１９レンチウイルスの大規模生産
ＣＡＲ細胞の有効性及び特異性をｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで実証したため、本発明者らは、患者規模のＣＡＲ細胞生産のための条件の設定及び標準化を進めた。
ＣＡＲ細胞の有効性及び特異性をｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで実証したため、本発明者らは、患者規模のＣＡＲ細胞生産のための条件の設定及び標準化を進めた。
【0066】
臨床試験を完了するのに十分な量のレンチウイルス上清を生産するために、本発明者らはウイルス生産方法を拡大し、ＧＭＰガイドラインに従ってクリーンルーム施設内で全プロセスを実施したが、レンチウイルス上清は医薬品局の承認という点では中間試薬と見なされていた。各ロットは４Ｌの濃縮されていないウイルスからなり、１ロットあたりの生産時間は１２日であった。ＨＥＫ２９３Ｔをパッケージング細胞株として使用した。生産を開始する前に、ＨＥＫ２９３Ｔのマスターセルバンク及びワーキングセルバンクを作製していたため、全てのロットを同じ継代からＨＥＫ２９３Ｔを使用して生産した。生産するたびに、本発明者らは、最初にＴ１７５フラスコでＨＥＫ２９３Ｔを２継代拡大した（８０×１０６細胞から最低２８２９×１０６細胞に拡大した）。次いで、細胞を４つの１０層セルスタック細胞培養チャンバー（Corning）と１つの１層セルスタックに移し、細胞増殖を制御した。翌日、１リットルあたり３．８６ｍｇのＰＥＩ、７６３μｇのトランスファーベクター、３７７μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、１８８μｇのｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、及び２２１μｇのｐＭＤ２．Ｇを使用してプラスミドトランスフェクションを実施した。ウイルス上清を２日後に収集し、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜を用いて清澄化した。４Ｌのウイルス上清を最終的に濃縮し、ＫｒｏｓＦｌｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩｉタンジェンシャルフロー濾過システム（商標）（Spectrum Labs）及び５００ｋＤ ｍＰＥＳの中空繊維を使用して透析濾過した。２ＬのＰＢＳを透析濾過バッファーとして使用した。各ロットを１００ｍｌに濃縮し、１０ｍｌバッグに分注し、使用するまで－８０℃に保った。ウイルス力価測定、無菌性及び純度分析のため、より小さなアリコートも保管した。プロトコルの検証のために、３つのウイルスロットを生産して分析した。これら３つのロットで実施された分析の結果を表１に示す。凍結濃縮ウイルスのウイルス力価は、１．１×１０８ＴＵ／ｍｌ～２．２×１０８ＴＵ／ｍｌの範囲であった。品質管理試験では、３つのロット全てが細菌真菌の成長、マイコプラズマ、又は複製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）について陰性であることが示された。ウイルスの同定は、主要なウイルス成分のＰＣＲ増幅によっても確認された。
【0067】
【表1】
【0068】
実施例１．２．６．ＣＡＲ細胞の生産
ＣＡＲ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（Miltenyi）を使用して生産した。アフェレーシス生成物をＣＤ４及びＣＤ８の陽性選択に供し、次いで、１００×１０６個のＴ細胞を培養し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。活性化の２４時間後、細胞をＭＯＩ＝１０のＣＡＲ１９レンチウイルスにより形質導入した。細胞をＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地で所望の細胞数に達するまで（通常は８日～９日）培養した。生成物を、ＮａＣｌ０．９％＋０．５％ＨＳＡ中に収集した。本発明者らの生産方法の一貫性及び堅牢性を試験するために、本発明者らは、３人の異なる健康なドナーからのアフェレーシス生成物を使用して３つの手順を実施した。本発明者らの目標は、最低でも３５×１０６個のＣＡＲ細胞と２０％以上の形質導入効率を達成することであった。
ＣＡＲ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（Miltenyi）を使用して生産した。アフェレーシス生成物をＣＤ４及びＣＤ８の陽性選択に供し、次いで、１００×１０６個のＴ細胞を培養し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。活性化の２４時間後、細胞をＭＯＩ＝１０のＣＡＲ１９レンチウイルスにより形質導入した。細胞をＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地で所望の細胞数に達するまで（通常は８日～９日）培養した。生成物を、ＮａＣｌ０．９％＋０．５％ＨＳＡ中に収集した。本発明者らの生産方法の一貫性及び堅牢性を試験するために、本発明者らは、３人の異なる健康なドナーからのアフェレーシス生成物を使用して３つの手順を実施した。本発明者らの目標は、最低でも３５×１０６個のＣＡＲ細胞と２０％以上の形質導入効率を達成することであった。
【0069】
拡大時間は８日～１１日の間で変動した。ＰｒｏｄｉｇｙのＴ細胞拡大能を試験するため、１１日目までランを続けることができたが、既に必要な最小細胞数に達していたため、残りのランを早めに中止した（それぞれ９日目及び８日目）。平均３７８０×１０６個の総細胞が得られ、細胞拡大が終了した時点での形質導入率は平均３５．８％であった。したがって、３つの手順の全てで許容基準に達した。最終生成物に対して実施された品質試験の全リスト、及びそれぞれについて規定された許容基準を表２に提供する。同じ表に示されているように、得られた全てのＣＡＲ生成物は、純度、安全性、及び効力に関する全てのパラメーターについて定められた許容基準を満たしていた。
【0070】
【表2】
【0071】
実施例２．ＣＡＲ Ｔ細胞生産
実施例２．１．材料及び方法
実施例２．１．１．患者及び試料
この原稿を提出した時点で、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の第Ｉ相臨床試験に登録された２７人の患者から２８種類の生成物が生産されている。２７人の患者のうち、２２人がＡＬＬ（成人患者１４人及び小児患者８人）、４人がＮＨＬ、１人がＣＬＬを有していた。臨床試験に含まれた全ての患者は、疾患が再発していた。患者の前治療計画を表３に要約する。
実施例２．１．材料及び方法
実施例２．１．１．患者及び試料
この原稿を提出した時点で、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の第Ｉ相臨床試験に登録された２７人の患者から２８種類の生成物が生産されている。２７人の患者のうち、２２人がＡＬＬ（成人患者１４人及び小児患者８人）、４人がＮＨＬ、１人がＣＬＬを有していた。臨床試験に含まれた全ての患者は、疾患が再発していた。患者の前治療計画を表３に要約する。
【0072】
【表3】
【0073】
成人患者は、インフォームドコンセントに署名した後、ホスピタル・クリニックのアフェレーシスユニットで白血球フェレーシスを受け、小児患者はサン・ジョアン・ド・デウ病院／ＢＳＴのアフェレーシスユニットで白血球アフェレーシスを受けた。アフェレーシス処置を、Ａｍｉｃｕｓ装置（Fresenius Kabi、イリノイ州レイクズーリック）を使用して実施した。５０ｍｌの血漿で希釈した最低１×１０８個の全Ｔ細胞が必要であった。この研究は、ホスピタル・クリニックの研究倫理委員会（ＣｅＩｍ）によって承認された：ＨＣＢ／２０１７／０００１．臨床試験：ＣＡＲＴ１９－ＢＥ－０１．Ｅｕｄｒａ：２０１６－００２９７２－２９。
【0074】
実施例２．１．２．本発明のＣＡＲ細胞の生産
アフェレーシス生成物をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）システム（Miltenyi Biotec）チューブセットに接続した。Ｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔユニットでの密度勾配遠心分離により、赤血球及び血小板を除去した。残りの細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８でコーティングされた磁気ビーズを使用して選択した。選択した細胞を「リアプリケーションバッグ（Reapplication Bag）」で溶出した。選択後、１×１０８個のＴ細胞（リアプリケーションバッグから）を使用して細胞培養を開始した。残りの細胞をバッグ及びバイアルに入れて凍結保存し、生成物の品質アッセイのための対照細胞として、また生産が失敗した場合のバックアップとして使用した。細胞を、３％のヒトＡＢ血清（血液バンクＢＳＴから取得）と、１５５ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－７及び２９０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－１５（それぞれ、Miltenyi Biotec＃１７０－０７６－１１１及び＃１７０－０７６－１１４）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地を使用して培養した。ＴｒａｎｓＡｃｔ ＧＭＰグレード（Miltenyi Biotec、カタログ番号１７０－０７６－１５６）を使用して細胞を直ちに活性化し、２４時間後にＣＡＲ１９を含むレンチウイルスをＭＯＩ＝１０で使用して形質導入を行った。細胞培養物の洗浄を、形質導入の４８時間後にプログラムした。次いで、所望の細胞数に達するまで（通常、細胞培養開始の７日～１０日後）、振蕩を漸増させながら細胞を培養し続けた。最終的に細胞を１００ｍｌ ０．９％ＮａＣｌ＋１％ＨＳＡで溶出し、本発明のＣＡＲ細胞の所望の用量に従って分注し、注入するまで凍結保存した。
アフェレーシス生成物をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）システム（Miltenyi Biotec）チューブセットに接続した。Ｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔユニットでの密度勾配遠心分離により、赤血球及び血小板を除去した。残りの細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８でコーティングされた磁気ビーズを使用して選択した。選択した細胞を「リアプリケーションバッグ（Reapplication Bag）」で溶出した。選択後、１×１０８個のＴ細胞（リアプリケーションバッグから）を使用して細胞培養を開始した。残りの細胞をバッグ及びバイアルに入れて凍結保存し、生成物の品質アッセイのための対照細胞として、また生産が失敗した場合のバックアップとして使用した。細胞を、３％のヒトＡＢ血清（血液バンクＢＳＴから取得）と、１５５ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－７及び２９０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－１５（それぞれ、Miltenyi Biotec＃１７０－０７６－１１１及び＃１７０－０７６－１１４）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地を使用して培養した。ＴｒａｎｓＡｃｔ ＧＭＰグレード（Miltenyi Biotec、カタログ番号１７０－０７６－１５６）を使用して細胞を直ちに活性化し、２４時間後にＣＡＲ１９を含むレンチウイルスをＭＯＩ＝１０で使用して形質導入を行った。細胞培養物の洗浄を、形質導入の４８時間後にプログラムした。次いで、所望の細胞数に達するまで（通常、細胞培養開始の７日～１０日後）、振蕩を漸増させながら細胞を培養し続けた。最終的に細胞を１００ｍｌ ０．９％ＮａＣｌ＋１％ＨＳＡで溶出し、本発明のＣＡＲ細胞の所望の用量に従って分注し、注入するまで凍結保存した。
【0075】
目的は、患者１人あたり、２用量の本発明のＣＡＲ細胞を達成することであった。計画された目標細胞用量は、患者の疾患によって異なる。典型的には、ＡＬＬ及びＣＬＬを有する患者の場合は１×１０６個の本発明のＣＡＲ細胞（細胞／ｋｇ）、ＮＨＬ患者の場合は５×１０６個の本発明のＣＡＲ細胞（細胞／ｋｇ）である。
【0076】
実施例２．１．３．モノクローナル抗体
ＣＡＲ１９の発現を、ＡＰＣコンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories、１１５－１３６－０７２）で検出した。本発明のＣＡＲ細胞を含む生成物の組成を、以下の抗体（いずれもBD製）による染色を用いたフローサイトメトリーによって決定した：ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＢＶ４２１、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ１９－ＰＥＣｙ７、ＣＤ１６－ＰＥ、ＣＤ５６－ＰＥ。
ＣＡＲ１９の発現を、ＡＰＣコンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories、１１５－１３６－０７２）で検出した。本発明のＣＡＲ細胞を含む生成物の組成を、以下の抗体（いずれもBD製）による染色を用いたフローサイトメトリーによって決定した：ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＢＶ４２１、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ１９－ＰＥＣｙ７、ＣＤ１６－ＰＥ、ＣＤ５６－ＰＥ。
【0077】
Ｔ細胞サブセット特性評価実験では、ＣＤ１９－Ｆｃ組換えタンパク質キメラ（R&D、カタログ番号９２６９－ＣＤ－０５０）と二次抗体ＦＩＴＣ－ヤギＦ（ａｂ）２抗ヒトＩｇＧ（Life Technologies、カタログ番号Ｈ１０１０１Ｃ）を使用してＣＡＲ＋細胞を検出した。この染色を、以下のモノクローナル抗体（いずれもBD製）と併用した：ＣＤ３－ＢＶ４２１、ＣＤ８－ＡＰＣ．Ｃｙ７、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥＣｙ７、ＣＤ４５ＲＯ－ＡＰＣ、ＣＣＲ７－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ２８－ＢＶ５１０及びＣＤ９５－ＰＥ（又はＣＤ２７－ＰＥ）。Ｔ細胞亜集団を次のように定義した：ＴＮ：ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋；ＴＳＣＭ：ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ９５＋；ＴＣＭ：ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＣＲ７＋；ＴＥＭ：ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＣＲ７－及びＴＥＦＦ：ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７－。
【0078】
細胞内サイトカイン測定には、いずれもBD製の以下の抗体を使用した：ＣＤ３－ＢＶ４５０、ＣＤ８－ＡＰＣ．Ｈ７、ＣＤ４－ＢＶ５００、ＩＦＮγ－ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５、ＴＮＦα－ＰＥ。
【0079】
反復チャレンジ実験で使用した抗体は、いずれもBD製の以下のものであった：ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＢＶ５１０、ＣＤ８－ＡＰＣ．Ｃｙ７、ＣＤ１９－ＰＥ。
【0080】
フローサイトメトリー分析では、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD）を使用して細胞を取得し、続いてＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【0081】
実施例２．１．４．生成物の品質管理
生成物の効力アッセイを、フローサイトメトリーによって実施した。リアルタイムＰＣＲを使用して、１細胞あたりのコピー数を測定し、最終生成物に含まれる複製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）の存在を評定した。生成物の無菌性、マイコプラズマ、エンドトキシン、及び外来ウイルスが存在しないことを、認定された検査室によって判断した。外来ウイルスとしては、とりわけＨＩＶウイルスの存在の決定を含んだ。従来のＨＩＶ検出方法では、細胞形質導入に使用されるレンチウイルス導入遺伝子の存在も検出されるため、Ｅｎｖ遺伝子の検出に基づく代替ＰＣＲアッセイを使用して、ＨＩＶ感染とレンチウイルス形質導入とを区別した。
生成物の効力アッセイを、フローサイトメトリーによって実施した。リアルタイムＰＣＲを使用して、１細胞あたりのコピー数を測定し、最終生成物に含まれる複製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）の存在を評定した。生成物の無菌性、マイコプラズマ、エンドトキシン、及び外来ウイルスが存在しないことを、認定された検査室によって判断した。外来ウイルスとしては、とりわけＨＩＶウイルスの存在の決定を含んだ。従来のＨＩＶ検出方法では、細胞形質導入に使用されるレンチウイルス導入遺伝子の存在も検出されるため、Ｅｎｖ遺伝子の検出に基づく代替ＰＣＲアッセイを使用して、ＨＩＶ感染とレンチウイルス形質導入とを区別した。
【0082】
実施例２．１．５．サイトカイン測定
サイトカインレベルを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰヒトサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル（Millipore）を使用して測定した。ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１２（Ｐ４０）、ＩＬ－１７、ＩＬ－２、ＩＬ－４、及びＩＰ－１０には１０プレックスキット、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、及びＭＩＰ１Ａには３プレックスキット（カタログ番号ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ）、及びグランザイムＢには１プレックスキット（カタログ番号ＨＣＤ８ＭＡＧ－１５Ｋ）を使用した。アッセイを製造元の指示に従って実施した。試料を、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００システムで実行した。
サイトカインレベルを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰヒトサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル（Millipore）を使用して測定した。ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１２（Ｐ４０）、ＩＬ－１７、ＩＬ－２、ＩＬ－４、及びＩＰ－１０には１０プレックスキット、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、及びＭＩＰ１Ａには３プレックスキット（カタログ番号ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ）、及びグランザイムＢには１プレックスキット（カタログ番号ＨＣＤ８ＭＡＧ－１５Ｋ）を使用した。アッセイを製造元の指示に従って実施した。試料を、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００システムで実行した。
【0083】
あるいは、細胞内サイトカイン産生（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）をフローサイトメトリーで測定した。簡潔には、細胞を最初に細胞外マーカーＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ３について標識し、１５分間インキュベートした。次いで、BDの１×溶解液（カタログ番号３４９２０２）を使用して細胞を固定し、更に１５分間インキュベートした。２回の洗浄後、ＦＡＣＳバッファー＋０．１％サポニンを用いて細胞を透過処理し、１５分間インキュベートした。次いで、細胞を抗ＩＦＮγ及び抗ＴＮＦαと共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄して分析した。
【0084】
実施例２．１．６．小規模Ｔ細胞拡大
０．５×１０６個のＴ細胞をＸ－Ｖｉｖｏ１５細胞培地（Cultek、カタログ番号ＢＥ０２－０６０Ｑ）、５％ＡＢヒト血清（Sigma、カタログ番号Ｈ４５２２）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び指定のサイトカイン：５０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２（Miltenyi Biotec）、又は１５５ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－７及び２９０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－１５（Miltenyi Biotec）で培養した。サイトカインを４８時間ごとに培地に追加した。解凍後２４時間で、製造元の指示に従って細胞をダイナビーズヒトＴアクティベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Gibco、カタログ番号１１１３１Ｄ）で活性化した。更に２４時間後にＭＯＩ １０で細胞を形質導入し、次に０．５×１０６個のＴ細胞／ｍｌ～１．５×１０６個のＴ細胞／ｍｌの濃度で１１日間拡大させた。
０．５×１０６個のＴ細胞をＸ－Ｖｉｖｏ１５細胞培地（Cultek、カタログ番号ＢＥ０２－０６０Ｑ）、５％ＡＢヒト血清（Sigma、カタログ番号Ｈ４５２２）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び指定のサイトカイン：５０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２（Miltenyi Biotec）、又は１５５ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－７及び２９０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－１５（Miltenyi Biotec）で培養した。サイトカインを４８時間ごとに培地に追加した。解凍後２４時間で、製造元の指示に従って細胞をダイナビーズヒトＴアクティベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Gibco、カタログ番号１１１３１Ｄ）で活性化した。更に２４時間後にＭＯＩ １０で細胞を形質導入し、次に０．５×１０６個のＴ細胞／ｍｌ～１．５×１０６個のＴ細胞／ｍｌの濃度で１１日間拡大させた。
【0085】
実施例２．１．７．標的細胞による反復チャレンジ後のＴ細胞拡大
抗原遭遇後のＴ細胞増殖能力を分析するために、本発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＮＡＬＭ６細胞を１：１の比率（それぞれ２５００００細胞）で共培養した。４日間のインキュベーション後、培養液のアリコートを採取して分析し、Ｔ細胞数を決定した。細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９で標識し、次いで２０μｌのビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ、カタログ番号Ｃ３６９５０、Invitrogen）を試料に加えて絶対細胞数を決定した。このプロセスを３回繰り返した。
抗原遭遇後のＴ細胞増殖能力を分析するために、本発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＮＡＬＭ６細胞を１：１の比率（それぞれ２５００００細胞）で共培養した。４日間のインキュベーション後、培養液のアリコートを採取して分析し、Ｔ細胞数を決定した。細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９で標識し、次いで２０μｌのビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ、カタログ番号Ｃ３６９５０、Invitrogen）を試料に加えて絶対細胞数を決定した。このプロセスを３回繰り返した。
【0086】
実施例２．１．８．統計
統計的有意性を、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して評定した。特に明示されない限り、対応のないＴ検定を使用した。マンホイットニーＵ検定を、非正規分布の変数の比較に使用した。ｐ値が０．０５以下の場合、統計的に有意とした。
統計的有意性を、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して評定した。特に明示されない限り、対応のないＴ検定を使用した。マンホイットニーＵ検定を、非正規分布の変数の比較に使用した。ｐ値が０．０５以下の場合、統計的に有意とした。
【0087】
実施例２．２．結果
実施例２．２．１．ＣＡＲ Ｔ細胞拡大
臨床試験に含まれた２７人の患者から２８種類のアフェレーシス生成物を得た。１人の患者については、本発明のＣＡＲ細胞の生産不良（Ｔ１０生成物及びＴ１３生成物は同じ患者のもの）により、アフェレーシス生成物を２回入手した。アフェレーシス生成物の説明を表４に示す。患者のアフェレーシス生成物を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムを使用するＣＤ４＋及びＣＤ８＋の磁気選択に供した。１つ（患者Ｔ２７）を除く全てのケースで、最小数のＴ細胞（１００×１０６個）が得られた（表４）。患者Ｔ２７では、５０×１０６個の細胞で細胞培養を開始した。
実施例２．２．１．ＣＡＲ Ｔ細胞拡大
臨床試験に含まれた２７人の患者から２８種類のアフェレーシス生成物を得た。１人の患者については、本発明のＣＡＲ細胞の生産不良（Ｔ１０生成物及びＴ１３生成物は同じ患者のもの）により、アフェレーシス生成物を２回入手した。アフェレーシス生成物の説明を表４に示す。患者のアフェレーシス生成物を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムを使用するＣＤ４＋及びＣＤ８＋の磁気選択に供した。１つ（患者Ｔ２７）を除く全てのケースで、最小数のＴ細胞（１００×１０６個）が得られた（表４）。患者Ｔ２７では、５０×１０６個の細胞で細胞培養を開始した。
【0088】
【表4】
【0089】
２７種の生成物についてＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙにおける細胞拡大の結果を図４Ａ～図４Ｂに示す。細胞を平均８．５日間、７日～１０日の範囲で拡大した。最終生成物で得られた平均総細胞数は２５４８×１０６、範囲は６００×１０６～５２００×１０６であった。５０×１０６個の細胞で細胞培養を開始した１人の患者でも、最終生成物は許容基準を満たしていた。この特定の場合では、細胞培養を１３日間維持し、最終的に３３００×１０６個の細胞を得た。健康なドナー（過去３回の検証で使用）と比較すると、健康なドナーで実施されるランの数が限られていても、患者の細胞はよりゆっくりと拡大するようである（図４Ｃ）。
【0090】
生成物を、外観、量、同一性、純度、安全性、及び効力の観点から分析した。
【0091】
実施例２．２．２．生成物の純度及び形質導入効率
最終生成物を、細胞生存率、ＣＤ３＋細胞の割合、及びＣＡＲ＋細胞の割合の観点から特性評価した。このデータを表５に要約する。
最終生成物を、細胞生存率、ＣＤ３＋細胞の割合、及びＣＡＲ＋細胞の割合の観点から特性評価した。このデータを表５に要約する。
【0092】
【表5】
【0093】
全ての生成物は、細胞生存率及びＣＤ３＋細胞の割合に関する許容基準（両方のパラメーターで７０％超）を満たしていた。検出された最低値は、細胞生存率について９１％、ＣＤ３＋細胞について８５．７％であった（図４Ｄ）。
【0094】
ＣＡＲ＋細胞の割合を分析するために、本発明者らは、最初にＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２抗マウス抗体の使用に基づく検出方法を検証した。この目的のために、本発明者らは、ＣＡＲ１９とＧＦＰを共発現させるベクターを操作した。ＧＦＰ＋ＡＰＣ＋細胞又はＧＦＰ－ＡＰＣ－細胞間の相関は９３．５％であり、これにより検出方法の感度及び特異度が良好であったことを示す。
【0095】
この検出システムを使用して、本発明者らは、患者の生成物に含まれるＣＡＲ＋細胞（本発明のＣＡＲ細胞）の割合を評定した。１つを除く全ての生成物が、２０％を超える本発明のＣＡＲ細胞の仕様を満たしていた。１つの生成物（Ｔ１０）では、本発明のＣＡＲ細胞は１４．５％しか検出されなかった。その結果、この生成物は生産不良と見なされた。この患者については、２回目のアフェレーシス（Ｔ１３）からＣＡＲ Ｔ細胞の生産を繰り返した。この時には、有効な生成物を入手できた。このシリーズのＣＡＲ＋細胞の割合の平均（±ＳＤ）は３０．６±１３．４４（図４Ｂ～図４Ｄ）であり、小規模拡大で達成された形質導入効率よりわずかに低かった（４５．３％）。健康なドナーと患者との間（３５．８％対３０．６％）、又は異なる疾患間で形質導入効率に有意差は観察されなかった。細胞拡大中の経時的なＣＡＲ＋細胞の割合も調査した。患者間で大きなばらつきが認められ、一部の患者ではＣＡＲ＋細胞の割合が増加し、他の患者では減少した。患者１人あたりの細胞用量の数に関しては、成人で７０ｋｇ及び小児患者で２５ｋｇの標準体重を考慮すると、全てのＡＬＬ患者に対して最低２回の細胞用量（１×１０６個の本発明のＣＡＲ細胞の用量；細胞／ｋｇ）が迅速に（７日目までに）得られた。ＮＨＬ患者（５×１０６個の本発明のＣＡＲ細胞の用量、細胞／ｋｇ）では、９日目までに４人の患者のうち３人に２回の細胞用量が得られた。実際、ＡＬＬで得られた細胞用量の数は、必要量をはるかに上回り（成人患者では９回の細胞用量、小児患者では２５．４回の細胞用量）、これは、これらの患者群では、必要に応じてｅｘ ｖｉｖｏ細胞拡大の時間を短縮できることを示している。ＮＨＬの場合、得られた本発明のＣＡＲ細胞用量の平均数は２．５であった。これまでに生産されたＣＬＬ患者は１人だけである。この患者のＴ細胞は成長が遅く、１０日間の拡大が必要で、最終的に３９８×１０６個の本発明のＣＡＲ細胞が得られた。
【0096】
ＣＡＲ１９形質導入を、ＤＮＡコピー／細胞の観点からも評定した。表５に示すように、ＣＡＲ１９は全ての生成物で０．４コピー／細胞～２．９コピー／細胞の範囲で検出された（いずれも１細胞あたり１０コピー未満という安全と見なされる制限を下回っていた）。予想通り、ＣＡＲ＋細胞の割合とＤＮＡコピー／細胞との間に正の相関関係が得られ、両方の手法が更に検証された。
【0097】
実施例２．２．３．生成物の効力
注入前に、各生成物の細胞毒性の可能性をｉｎ ｖｉｔｒｏで分析した。最終生成物とＮＡＬＭ６細胞株との共培養を、異なるＥ：Ｔ比で開始した。生きたＣＤ１９＋細胞の割合を、４時間後にフローサイトメトリーによって測定した。対照として、同じ患者の非形質導入ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞の細胞毒性活性も測定した。本発明のＣＡＲ細胞とのＣＤ１９＋細胞（比率：１：１）の生存率が７０％未満の場合、生成物は有効であると見なした。結果を表５及び図５Ａに示す。得られた生成物はいずれも、Ｅ：Ｔ比１：１でのＣＤ１９＋生存率が７０％未満であるという仕様を満たし、これは、調製された全ての生成物に、ＣＤ１９＋細胞を除去する固有の能力があることを示している。
注入前に、各生成物の細胞毒性の可能性をｉｎ ｖｉｔｒｏで分析した。最終生成物とＮＡＬＭ６細胞株との共培養を、異なるＥ：Ｔ比で開始した。生きたＣＤ１９＋細胞の割合を、４時間後にフローサイトメトリーによって測定した。対照として、同じ患者の非形質導入ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞の細胞毒性活性も測定した。本発明のＣＡＲ細胞とのＣＤ１９＋細胞（比率：１：１）の生存率が７０％未満の場合、生成物は有効であると見なした。結果を表５及び図５Ａに示す。得られた生成物はいずれも、Ｅ：Ｔ比１：１でのＣＤ１９＋生存率が７０％未満であるという仕様を満たし、これは、調製された全ての生成物に、ＣＤ１９＋細胞を除去する固有の能力があることを示している。
【0098】
サイトカインレベルを、細胞毒性アッセイの上清でも測定した。予想通り、本発明のＣＡＲ細胞をＮＡＬＭ６と共培養した場合、本発明のＣＡＲ細胞単独と比較して、ＩＦＮγ及びＴＮＦα等の炎症誘発性サイトカインのレベルの上昇が観察された。グランザイムＢのレベルも有意に増加し（図５Ｂ）、本発明のＣＡＲ細胞の細胞毒性活性と一致していた。
【0099】
細胞毒性活性及びサイトカイン産生の観点から、患者から生産されたＣＡＲ Ｔ細胞を健康な対照から得られたＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した。図５Ｃに示すように、患者及び健康なドナーのＣＡＲ Ｔ細胞は同様の細胞毒性の可能性を示した（統計的に有意ではなかったが、患者の細胞ではわずかに高かった）。炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）及びグランザイムＢの産生も同等であった（図５Ｄ）。
【0100】
実施例２．２．４．Ｔ細胞サブセットの特性評価
生成物の組成を、ＣＤ４／ＣＤ８比とＴＮ、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥ、及びＴＥＭサブセットの観点から更に分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞療法の候補となった患者の大規模なサブセットでは、ＣＤ４／ＣＤ８比が逆転した（ＣＤ４／ＣＤ８比＜１）（図６Ａ）。アフェレーシス生成物の平均ＣＤ４／ＣＤ８比は０．９３±０．６７であった。この比率は、大多数の患者においてＣＤ４及びＣＤ８細胞選択後に有意に変化しなかった。しかしながら、細胞拡大中にＣＤ４細胞の割合の有意な増加が検出された。ＣＤ４／ＣＤ８比は、ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択後の０．６４±０．６１から、最終生成物では１．６１±１．０４に増加した。このデータを更に詳しく分析したところ、ＣＤ４／ＣＤ８比が１未満で開始した患者では、ＣＤ４＋細胞の割合は、細胞拡大中に増加する傾向があったのに対し、細胞選択後に１を超えるＣＤ４／ＣＤ８比を得た患者では、ＣＤ４＋細胞の割合が減少する傾向があったことが明らかになった（図６Ｂ）。そのため、細胞拡大前後のＣＤ４／ＣＤ８比の差（ΔＣＤ４／ＣＤ８）は、初期比率によって有意に異なっていた。ＣＤ４は有意に高いＣＡＲ＋細胞の割合を示したため、ＣＤ４＋サブセットとＣＤ８＋サブセットとの間で形質導入の効率が異なった（図６Ｃ）。
生成物の組成を、ＣＤ４／ＣＤ８比とＴＮ、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥ、及びＴＥＭサブセットの観点から更に分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞療法の候補となった患者の大規模なサブセットでは、ＣＤ４／ＣＤ８比が逆転した（ＣＤ４／ＣＤ８比＜１）（図６Ａ）。アフェレーシス生成物の平均ＣＤ４／ＣＤ８比は０．９３±０．６７であった。この比率は、大多数の患者においてＣＤ４及びＣＤ８細胞選択後に有意に変化しなかった。しかしながら、細胞拡大中にＣＤ４細胞の割合の有意な増加が検出された。ＣＤ４／ＣＤ８比は、ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択後の０．６４±０．６１から、最終生成物では１．６１±１．０４に増加した。このデータを更に詳しく分析したところ、ＣＤ４／ＣＤ８比が１未満で開始した患者では、ＣＤ４＋細胞の割合は、細胞拡大中に増加する傾向があったのに対し、細胞選択後に１を超えるＣＤ４／ＣＤ８比を得た患者では、ＣＤ４＋細胞の割合が減少する傾向があったことが明らかになった（図６Ｂ）。そのため、細胞拡大前後のＣＤ４／ＣＤ８比の差（ΔＣＤ４／ＣＤ８）は、初期比率によって有意に異なっていた。ＣＤ４は有意に高いＣＡＲ＋細胞の割合を示したため、ＣＤ４＋サブセットとＣＤ８＋サブセットとの間で形質導入の効率が異なった（図６Ｃ）。
【0101】
ＴＮ、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥ、及びＴＥＭのサブセットに関しては、本発明者らは、患者の最終生成物間で大きな変動を観察した（図６Ｄ）。この高い変動性は、様々な患者の試料におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現レベルの違いによって例示されており（図６Ｅ）、異なる疾患に起因するものではない。最終生成物のＣＡＲ＋Ｔ細胞では、大多数の患者で記憶表現型（ＣＭ及びＥＭ）が優勢であった。最終生成物のＣＡＲ＋細胞内の各亜集団の平均割合及びＳＤは次のとおりである：ＴＮ：７．７１±１３．９、ＴＳＣＭ：５．２６±１２．０、ＴＣＭ：３１．０１±１６．７、ＴＥＭ：３５．１１±１７．７及びＴＥ：４．２±９．５。ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞を別々に分析したところ、ＣＤ８細胞はＣＤ４細胞よりもＴＮ、ＴＳＣＭ、及びＴＣＭの表現型を多く有することが示された。また、本発明者らは、初期（ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択後）と最終生成物とのＴ細胞サブセットを比較することにより、これらのサブセットがｅｘ ｖｉｖｏ細胞拡大中にどのように変化するか、またＣＡＲの発現がＴ細胞亜集団に影響したかどうか（ＣＡＲ－細胞対ＣＡＲ＋細胞）を分析した。図６Ｄに示すように、本発明者らは、ＴＮ細胞とＴＥＦＦ細胞が減少する一方で、細胞拡大中にＴＣＭの割合が大幅に増加することを観察した。Ｔ細胞サブセットのこれらの変化は、細胞活性化時に予想されるＣＤ４５ＲＡ発現の減少に起因する可能性がある（図６Ｅ）。
【0102】
最終生成物中のＣＡＲ－細胞とＣＡＲ＋細胞との間でＴ細胞サブセットに統計的に有意な変化は検出されなかったが、ＣＡＲ－と比較してＣＡＲ＋細胞でＴＣＭの更なる増加、及びその結果としてのＴＥＦＦ細胞の減少が観察された（図６Ｄ）。一貫して、ＣＣＲ７発現のわずかな増加は、ＣＡＲ＋細胞対ＣＡＲ－細胞でも検出された（図６Ｅ）。ＣＣＲ７に対するＣＡＲ発現の影響を、独立した小規模拡大で更に調査した（次のセクションを参照されたい）。ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ９５の発現の変化もフローサイトメトリーによって評定した。ＣＤ９５は細胞拡大中に増加し、ＣＤ２７は減少した。ＣＤ２８は、ＣＡＲ－細胞と比較してＣＡＲ＋でより高い発現を示したが、拡大中に有意な変化を示さなかった。
【0103】
実施例２．２．５．ＣＡＲ Ｔ細胞の小規模拡大
培養条件又はＣＡＲ発現がＣＤ４／ＣＤ８比又はＴ細胞表現型の割合に及ぼす影響を更に評価するために、患者の選択された細胞からの細胞拡大を、様々な条件下で小規模な実験で繰り返した。本発明者らは、ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択後に凍結された残存細胞が入手できた患者のうち６人（成人ＡＬＬ３人及びＮＨＬ３人）を選択した。本発明者らは、４つの異なる条件で患者の細胞を拡大させた：（１ａ）ＩＬ２－非形質導入Ｔ細胞、（１ｂ）ＩＬ２－ＣＡＲ Ｔ細胞、（２ａ）ＩＬ７／ＩＬ１５－非形質導入Ｔ細胞、（２ｂ）ＩＬ７／ＩＬ１５－ＣＡＲ Ｔ細胞。細胞を、１１日間で１７倍～１００倍拡大させた。ＣＡＲ１９形質導入Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞と比較して拡大が少ない（又は遅い）ため、ＩＬ２成長細胞はＩＬ７／ＩＬ１５（非形質導入条件とＣＡＲ１９条件の両方）よりも拡大した。細胞形質導入又は使用したサイトカインは、ＣＤ４／ＣＤ８比を一貫して調整しなかった。ただし、Ｐｒｏｄｉｇｙシステムを使用して拡大された生成物で以前に検出されたように、ＣＤ４／ＣＤ８比＞１で開始した患者（Ｔ０４及びＴ３４）では比率が低下する傾向があり、ＣＤ４／ＣＤ８比＜１で開始した患者（Ｔ０２、Ｔ１５、Ｔ２２、及びＴ３４）では比率が増加する傾向があった。実際、Ｐｒｏｄｉｇｙシステムよりも小規模な拡大の方が、拡大が長く維持されたため、本発明者らは、ＣＤ４／ＣＤ８の比率は多かれ少なかれ顕著に増減する可能性があるが、細胞を長期間培養するとＣＤ４／ＣＤ８＝１になる傾向があることを観察した。
培養条件又はＣＡＲ発現がＣＤ４／ＣＤ８比又はＴ細胞表現型の割合に及ぼす影響を更に評価するために、患者の選択された細胞からの細胞拡大を、様々な条件下で小規模な実験で繰り返した。本発明者らは、ＣＤ４－ＣＤ８細胞選択後に凍結された残存細胞が入手できた患者のうち６人（成人ＡＬＬ３人及びＮＨＬ３人）を選択した。本発明者らは、４つの異なる条件で患者の細胞を拡大させた：（１ａ）ＩＬ２－非形質導入Ｔ細胞、（１ｂ）ＩＬ２－ＣＡＲ Ｔ細胞、（２ａ）ＩＬ７／ＩＬ１５－非形質導入Ｔ細胞、（２ｂ）ＩＬ７／ＩＬ１５－ＣＡＲ Ｔ細胞。細胞を、１１日間で１７倍～１００倍拡大させた。ＣＡＲ１９形質導入Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞と比較して拡大が少ない（又は遅い）ため、ＩＬ２成長細胞はＩＬ７／ＩＬ１５（非形質導入条件とＣＡＲ１９条件の両方）よりも拡大した。細胞形質導入又は使用したサイトカインは、ＣＤ４／ＣＤ８比を一貫して調整しなかった。ただし、Ｐｒｏｄｉｇｙシステムを使用して拡大された生成物で以前に検出されたように、ＣＤ４／ＣＤ８比＞１で開始した患者（Ｔ０４及びＴ３４）では比率が低下する傾向があり、ＣＤ４／ＣＤ８比＜１で開始した患者（Ｔ０２、Ｔ１５、Ｔ２２、及びＴ３４）では比率が増加する傾向があった。実際、Ｐｒｏｄｉｇｙシステムよりも小規模な拡大の方が、拡大が長く維持されたため、本発明者らは、ＣＤ４／ＣＤ８の比率は多かれ少なかれ顕著に増減する可能性があるが、細胞を長期間培養するとＣＤ４／ＣＤ８＝１になる傾向があることを観察した。
【0104】
興味深いことに、培養条件によってＴ細胞サブセットに関して有意差が見られた。このシリーズの患者では、成長培地に使用されたサイトカインでは、異なるサブセットごとに有意差は示されなかった。しかしながら、ほとんど全てのサブセットで、ＣＡＲ１９発現細胞と非形質導入Ｔ細胞で有意かつ一貫した差が認められた。ＣＡＲ１９形質導入の結果、培養培地に使用されたサイトカインとは無関係に、ＴＮ、ＴＳＣＭ、及びＴＣＭのサブセットの割合がはるかに高くなった。逆に、ＴＥＭ細胞は、非形質導入試料と比較してＣＡＲ１９＋細胞で減少した。この場合、どちらの条件でも、細胞はｅｘ ｖｉｖｏで活性化及び増殖したため、ＴＮ及びＴＳＣＭの減少を説明することができる、非形質導入細胞とＣＡＲ１９＋細胞との間のＣＤ４５ＲＡ ＭＦＩの差は観察されなかった。しかしながら、ＣＡＲ１９＋細胞では、非形質導入細胞と比較してＣＣＲ７の発現が有意に増加することを観察した。この増加は、ＴＮ、ＴＳＣＭ、及びＴＣＭサブセットの割合が高く、ＴＥＭが低いことを説明している。４－１ＢＢ活性化時のＣＣＲ７発現の増加は、単球で以前に説明されており、ＣＡＲ Ｔ細胞でも提案されている。４－１ＢＢの活性化がＣＡＲ＋細胞で本発明者らが観察したＣＣＲ７の増加の原因であるかどうかを試験するため、本発明者らは、共刺激ドメインをＣＤ２８に変更して本発明者らのＣＡＲコンストラクトを改変した。次いで、健康なドナーからのＴ細胞を形質導入しないままにするか、４－１ＢＢ又はＣＤ２８を含むＣＡＲにより形質導入し、１０日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大させた。繰り返すが、本発明者らは、４－１ＢＢを含むコンストラクトにより形質導入された細胞のＣＡＲ陽性画分では、非形質導入細胞又はＣＤ２８を含むＣＡＲ＋細胞と比較して、ＣＣＲ７の発現が増加することを観察した。予想通り、ＴＣＭ細胞の割合は４－１ＢＢを含むＣＡＲ＋細胞でも高い。
【0105】
最後に、Ｐｒｏｄｉｇｙシステム及び小規模拡大で製造されたＣＡＲ Ｔ細胞の機能性も比較した。この比較では、ＩＬ－７／ＩＬ－１５を用いて拡大した３人の患者の細胞を使用した。炎症誘発性サイトカインの産生、細胞毒性の可能性、及びＴ細胞拡大を、同じ割合のＣＡＲ＋細胞について調整した後に測定した。ＩＦＮγ及びＴＮＦαの産生を、ＣＡＲ Ｔ細胞をＮＡＬＭ６と１：１の比率で共培養した後、４時間の時点で測定した。これら２つのサイトカインのレベルは、細胞内染色及び培地中に存在するサイトカインの両方で測定され、一貫した結果が得られた。Ｐｒｏｄｉｇｙシステムで製造された細胞は、小規模拡大で製造された細胞よりも一貫してわずかに多くのＩＦＮγ及びＴＮＦαを産生した。しかしながら、これらの差は統計的に有意ではなかった。細胞毒性の可能性に関しては、両方の方法で生産された細胞は同等の結果を示した。最後に、新鮮な標的細胞（ＮＡＬＭ６）でチャレンジを繰り返した際のＴ細胞拡大は、統計的有意性には至らなかったものの、小規模拡大よりもＰｒｏｄｉｇｙシステムで製造された細胞の方がわずかに高かった。したがって、本発明者らは、Ｐｒｏｄｉｇｙシステムで製造された細胞は、小規模拡大で製造された細胞と機能的に同等か、わずかに活性が高いと結論付ける。
【0106】
これら全てのデータを総合すると、本発明者らは、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞拡大により、ＴＮ及びＴＥＦＦが失われると結論付け、これは、Ｐｒｏｄｉｇｙシステムと小規模拡大の両方で観察される。それとは対照的に、ＴＣＭ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ拡大とＣＡＲ発現（共刺激ドメインとして４－１ＢＢを含むＣＡＲにおける）の両方の結果として、大きく蓄積される。Ｐｒｏｄｉｇｙシステムで生産された細胞は、小規模拡大で生産された細胞と機能的に類似する。
【0107】
実施例３．ＣＤ１９＋再発／難治性悪性腫瘍を有する患者における細胞療法
実施例３．１．材料及び方法
実施例３．１．１．患者集団
実施された研究は、Ｒ／Ｒ Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者における本発明のＣＡＲ細胞の安全性及び有効性を評価する単群多施設非盲検パイロット研究であった。適格患者は、（ｉ）ＡＬＬ、ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、又はマントル細胞リンパ腫を含むＣＤ１９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍、（ｉｉ）年齢２歳～８０歳、（ｉｉｉ）ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０～２、（ｉｖ）３カ月～２年の推定平均余命、及び（ｖ）適切な静脈アクセスの全てを有していなければならなかった。主な除外基準は、寛解期間が３年以上経過していない限り、悪性腫瘍の既往歴；重度の腎臓、肝臓、肺、又は心臓の機能障害；積極的な免疫抑制療法；ＨＩＶ感染；活動性ＨＢＶ又はＨＣＶの感染；及び全身療法を必要とする活動性感染症を含んだ。注目すべきことに、ＣＮＳへの関与も以前のａｌｌｏＨＣＴもこの試験の除外基準ではなかった。全ての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。スペイン医薬品庁（ＡＥＭＰＳ）及び各研究サイトの機関審査委員会／倫理委員会は、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施された試験を承認した。
実施例３．１．材料及び方法
実施例３．１．１．患者集団
実施された研究は、Ｒ／Ｒ Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者における本発明のＣＡＲ細胞の安全性及び有効性を評価する単群多施設非盲検パイロット研究であった。適格患者は、（ｉ）ＡＬＬ、ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、又はマントル細胞リンパ腫を含むＣＤ１９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍、（ｉｉ）年齢２歳～８０歳、（ｉｉｉ）ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０～２、（ｉｖ）３カ月～２年の推定平均余命、及び（ｖ）適切な静脈アクセスの全てを有していなければならなかった。主な除外基準は、寛解期間が３年以上経過していない限り、悪性腫瘍の既往歴；重度の腎臓、肝臓、肺、又は心臓の機能障害；積極的な免疫抑制療法；ＨＩＶ感染；活動性ＨＢＶ又はＨＣＶの感染；及び全身療法を必要とする活動性感染症を含んだ。注目すべきことに、ＣＮＳへの関与も以前のａｌｌｏＨＣＴもこの試験の除外基準ではなかった。全ての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。スペイン医薬品庁（ＡＥＭＰＳ）及び各研究サイトの機関審査委員会／倫理委員会は、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施された試験を承認した。
【0108】
実施例３．１．２．研究計画、手順、及び治療
主要評価項目は、１００日目及び１年目の処置関連死亡率及びグレード３～グレード４の毒性により決定される安全性であった。特に重要な有害事象（ＡＥ）は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性（現在は免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群［ＩＣＡＮＳ］として知られている）、及び二次腫瘍であった。ＡＥを、共通用語規準（ＣＴＣ）バージョン４．０に従って採点した。ＣＲＳについては、本発明者らは、グレーディングシステムを使用した。副次的評価項目は、ＮＣＣＮ、Ｌｕｇａｎｏ、又はＩＷＣＬＬ基準による客観的奏効率、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、全生存期間（ＯＳ）、奏効期間（ＤＯＲ）、Ｂ細胞形成不全期間、及び治療が生活の質に及ぼす影響を含んだ。
主要評価項目は、１００日目及び１年目の処置関連死亡率及びグレード３～グレード４の毒性により決定される安全性であった。特に重要な有害事象（ＡＥ）は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性（現在は免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群［ＩＣＡＮＳ］として知られている）、及び二次腫瘍であった。ＡＥを、共通用語規準（ＣＴＣ）バージョン４．０に従って採点した。ＣＲＳについては、本発明者らは、グレーディングシステムを使用した。副次的評価項目は、ＮＣＣＮ、Ｌｕｇａｎｏ、又はＩＷＣＬＬ基準による客観的奏効率、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、全生存期間（ＯＳ）、奏効期間（ＤＯＲ）、Ｂ細胞形成不全期間、及び治療が生活の質に及ぼす影響を含んだ。
【0109】
本発明のＣＡＲ細胞を注入する前に、患者は、－６日目、－５日目、及び－４日目に３０ｍｇ／ｍ２／日のフルダラビン＋３００ｍｇ／ｍ２／日のシクロホスファミドを受けた。０日目に、患者は０．５×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇの用量で本発明のＣＡＲ細胞の単回静脈内注入を受けた（後に分割投与に改正された；下記を参照されたい）。
【0110】
当初の試料サイズは１０人の患者（コホート１）であった。研究開始から５カ月後、大幅な改正により試料サイズを３９人の患者に増やし、３カ月以内にＢ細胞が正常回復（早期Ｂ細胞回復）、ＣＤ１９陽性の疾患再発、又はＣＤ１９陽性の難治性疾患のいずれかを有する患者に、本発明のＣＡＲ細胞の２回目の投与を受けさせた（コホート２）。研究開始から１２カ月後、すでに１９人の患者が募集されていたため、２回目の大幅な改正により、試料サイズを合計５４人の患者（コホート３）に増やし、第１及び／又は第２の分割量の後のＣＲＳの欠如を条件とした、本発明のＣＡＲ細胞の分割投与（総用量の１０％、３０％、及び６０％）、またグレード２のＣＲＳを有する患者におけるトシリズマブの早期投与が義務付けられた。この２回目の改正の動機は、グレード５の毒性が３例あったことによるものである。
【0111】
実施例３．１．３．統計分析
統計分析は純粋に記述的なものであり、有害事象及び奏効率を９５％の正確なＣｌｏｐｐｅｒ－Ｐｅａｒｓｏｎ信頼区間で示した。処置関連死亡率（ＰＲＭ）を、疾患の再発を競合事象として考慮した累積発生率として計算した。ＯＳ、ＰＦＳ、ＤＯＲ、及びＢ細胞形成不全の持続性をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を用いてプロットした。Ｂ細胞形成不全の持続性がＰＦＳに及ぼす影響を、Ｍａｎｔｅｌ－Ｂｙａｒ法を用いて評価した。全ての統計分析は、ＳＡＳバージョン９．４（SAS Institute、ノースカロライナ州ケアリー）及びＲバージョン３．６（R Foundation for Statistical Computing、オーストリア、ウィーン）を使用して実施した。
統計分析は純粋に記述的なものであり、有害事象及び奏効率を９５％の正確なＣｌｏｐｐｅｒ－Ｐｅａｒｓｏｎ信頼区間で示した。処置関連死亡率（ＰＲＭ）を、疾患の再発を競合事象として考慮した累積発生率として計算した。ＯＳ、ＰＦＳ、ＤＯＲ、及びＢ細胞形成不全の持続性をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を用いてプロットした。Ｂ細胞形成不全の持続性がＰＦＳに及ぼす影響を、Ｍａｎｔｅｌ－Ｂｙａｒ法を用いて評価した。全ての統計分析は、ＳＡＳバージョン９．４（SAS Institute、ノースカロライナ州ケアリー）及びＲバージョン３．６（R Foundation for Statistical Computing、オーストリア、ウィーン）を使用して実施した。
【0112】
実施例３．２．結果
実施例３．２．１．ベースライン特性
５８人の患者が研究に登録されたが、そのうち４人はスクリーニング段階を通過せず、２人の患者は選択／除外基準を満たさず、２人は最終的に当時入手可能になった市販製品による治療に紹介された。残りの５４人の患者のうち、４７人が本発明のＣＡＲ細胞による治療を受け、１９人がコホート１～コホート２（単回注入）、２８人がコホート３（分割注入）であった。これら４７人の患者（修正最大解析対象集団［ｍＦＡＳ］）は、ＡＬＬ（３８人）、ＤＬＢＣＬ（４人、うち１人はＣＬＬからのリヒター形質転換）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（２人）、濾胞性リンパ腫（２人）、及びＣＬＬ（１人）と診断された。ｍＦＡＳに含まれる患者のベースライン特性を表６に示す。
実施例３．２．１．ベースライン特性
５８人の患者が研究に登録されたが、そのうち４人はスクリーニング段階を通過せず、２人の患者は選択／除外基準を満たさず、２人は最終的に当時入手可能になった市販製品による治療に紹介された。残りの５４人の患者のうち、４７人が本発明のＣＡＲ細胞による治療を受け、１９人がコホート１～コホート２（単回注入）、２８人がコホート３（分割注入）であった。これら４７人の患者（修正最大解析対象集団［ｍＦＡＳ］）は、ＡＬＬ（３８人）、ＤＬＢＣＬ（４人、うち１人はＣＬＬからのリヒター形質転換）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（２人）、濾胞性リンパ腫（２人）、及びＣＬＬ（１人）と診断された。ｍＦＡＳに含まれる患者のベースライン特性を表６に示す。
【0113】
【表6】
【0114】
年齢の中央値は２６歳（範囲、３歳～６７歳）であり、１７人の患者（３６％）が女性であった。データ締め切り日は２０１９年１１月５日であり、注入を受けた全ての患者が最低１００日間のフォローアップを受けたか、疾患の再発又は死亡を経験した。当時、フォローアップの中央値は、本発明のＣＡＲ細胞の注入から５．４８カ月（範囲、１．８７～２３．６）であった。
【0115】
アフェレーシスに進んだ５４人の患者のうち、４７人（８７％）及び７人（１３％）がそれぞれ１回及び２回の処置を必要とした。注入した患者は全員、フルダラビン＋シクロホスファミドリンパ球枯渇を受け、研究組み入れ後中央値５４日（範囲、３４日～２１５日）に本発明のＣＡＲ細胞を受けた。当初の目標用量は、本発明のＣＡＲ細胞の０．５×１０６（細胞／ｋｇ）～５×１０６（細胞／ｋｇ）の範囲であり、ＡＥＭＰＳは、最初の患者が最小用量（０．５×１０６個の本発明のＣＡＲ細胞、細胞／ｋｇ）を受けなければならないという条件を課していた。コホート３では、１人の患者が、ＣＲＳが原因で０．４×１０６個の本発明のＣＡＲ細胞（細胞／ｋｇ）（すなわち、最後の分割量は省略）を受けた。
【0116】
実施例３．２．２．毒性
本発明のＣＡＲ細胞を注入する前であっても、研究対象から生じた全ての有害事象（ＡＥ）を採点して報告した。グレード３以上のＡＥは、＋１００日目にＡＬＬを有する患者の６８．４％、ＮＨＬを有する患者の７５％で報告されたのに対し、重篤なＡＥ（ＳＡＥ）はＡＬＬ及びＮＨＬを有する患者の４４．７％と５０％でそれぞれ観察された（表７）。＋１００日目での処置関連死亡率（ＰＲＭ）は、ＡＬＬを有する患者で７．９％（９５％信頼区間［ＣＩ］１．７％～２１．４％）、ＮＨＬを有する患者で０％であった。４人の患者において、予期しない重篤な副作用の疑い（ＳＵＳＡＲ）が観察され、そのうち２人の患者が致死性ＣＲＳを発症し、１人の患者がグレード４のＣＲＳからの回復中に偽膜性大腸炎で死亡した。コホート１～コホート２に属するこの３人の患者は、前述のように研究の２回目の大幅な改正の動機となった。４人目のＳＵＳＡＲは、グレード２のＣＲＳからの回復中にグレード４の中毒性表皮壊死症を発症したコホート３の濾胞性リンパ腫患者で報告された。
本発明のＣＡＲ細胞を注入する前であっても、研究対象から生じた全ての有害事象（ＡＥ）を採点して報告した。グレード３以上のＡＥは、＋１００日目にＡＬＬを有する患者の６８．４％、ＮＨＬを有する患者の７５％で報告されたのに対し、重篤なＡＥ（ＳＡＥ）はＡＬＬ及びＮＨＬを有する患者の４４．７％と５０％でそれぞれ観察された（表７）。＋１００日目での処置関連死亡率（ＰＲＭ）は、ＡＬＬを有する患者で７．９％（９５％信頼区間［ＣＩ］１．７％～２１．４％）、ＮＨＬを有する患者で０％であった。４人の患者において、予期しない重篤な副作用の疑い（ＳＵＳＡＲ）が観察され、そのうち２人の患者が致死性ＣＲＳを発症し、１人の患者がグレード４のＣＲＳからの回復中に偽膜性大腸炎で死亡した。コホート１～コホート２に属するこの３人の患者は、前述のように研究の２回目の大幅な改正の動機となった。４人目のＳＵＳＡＲは、グレード２のＣＲＳからの回復中にグレード４の中毒性表皮壊死症を発症したコホート３の濾胞性リンパ腫患者で報告された。
【0117】
特に関心のあるＡＥについては、ＡＬＬ及びＮＨＬを有する患者のそれぞれ５５．３％（グレード３以上の１３．２％）と８７．５％（グレード３以上の２５％）でＣＲＳが報告された。ＡＬＬを有する患者において、本発明者らは、２回目の改正後にグレード３以上のＣＲＳ率が２６．７％（コホート１～コホート２）から４．３％（コホート３）に低下し、著しく低下したことを観察した（表７）。
【0118】
【表7】
【0119】
さらに、グレード３以上のＩＣＡＮＳは、ＡＬＬを有する患者の１人（２．６％）でのみ観察された。この研究で観察された唯一のグレード３以上の二次悪性腫瘍は、ＡＬＬと診断され、ＩＯ及びａｌｌｏＨＣＴを含む６種類の治療をすでに受けていた７歳の女児の骨髄異形成であった。この患者は最近、この原因で２回目のａｌｌｏＨＣＴを受けた。
【0120】
世界的に見ると、ＡＬＬを有する患者における最も一般的なＡＥは、好中球減少症（９７．４％）、貧血（８４．２％）、低ガンマグロブリン血症（７８．９％）、血小板減少症（７６．３％）、及びリンパ球減少症（７３．７％）である。主にａｌｌｏＨＣＴの既往患者において、ＡＳＴの増加（５０％）、ＡＬＴの増加（４７．４％）、ＧＧＴの増加（３９．５％）、及びアルカリホスファターゼの増加（３６．８％）を含む肝臓毒性も頻繁に発生した。ＮＨＬを有する患者でも同様の数値が観察された。ａｌｌｏＨＣＴ及びＩＯ療法の既往歴のあるＡＬＬを有する患者２人（３８人中２人、５％）は、重症肝類洞閉塞症候群（ＳＯＳ）を発症したが、従来の支持療法で解消した。
【0121】
実施例３．２．３．有効性
ＡＬＬを有する患者において、測定可能な残存病変（ＭＲＤ）陰性完全奏効率（ＣＲＲ）は、＋１００日目で７１．１％（９５％ＣＩ ５４％～８５％）であった。評価可能な全ての患者（すなわち、早期死亡患者を除く）は、中央値１００日間（９５％ＣＩ ５６日～１００日）続く絶対Ｂ細胞形成不全を発症した。ＡＬＬコホート全体の１年時のＰＦＳ率は４７％（２７％～６７％）であったが、１年時のＯＳ率は６８．６％（４９％～８８％）（小児で７８％、成人で６５％）であった（図７）。＋１００日目までに治療に反応した患者のみを考慮したＤＯＲの中央値は１４．８カ月であった。本発明のＣＡＲ細胞注入後に疾患が進行した１５人の患者のうち、腫瘍細胞は１３人（８７％）でＣＤ１９を発現し、２人（１３％）はＣＤ１９陰性であった。Ｂ細胞形成不全の持続とＰＦＳとの間に関連はなかった（Ｐ＝０．３３、Ｍａｎｔｅｌ－Ｂｙａｒ検定）。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、ＡＬＬを有する患者３６人中９人（２５％）で検出され、そのうち３人は本発明のＣＡＲ細胞の注入前に検出された。ＨＡＭＡの発生とＢ細胞形成不全の喪失又は疾患再発との間に関連はなかった。
ＡＬＬを有する患者において、測定可能な残存病変（ＭＲＤ）陰性完全奏効率（ＣＲＲ）は、＋１００日目で７１．１％（９５％ＣＩ ５４％～８５％）であった。評価可能な全ての患者（すなわち、早期死亡患者を除く）は、中央値１００日間（９５％ＣＩ ５６日～１００日）続く絶対Ｂ細胞形成不全を発症した。ＡＬＬコホート全体の１年時のＰＦＳ率は４７％（２７％～６７％）であったが、１年時のＯＳ率は６８．６％（４９％～８８％）（小児で７８％、成人で６５％）であった（図７）。＋１００日目までに治療に反応した患者のみを考慮したＤＯＲの中央値は１４．８カ月であった。本発明のＣＡＲ細胞注入後に疾患が進行した１５人の患者のうち、腫瘍細胞は１３人（８７％）でＣＤ１９を発現し、２人（１３％）はＣＤ１９陰性であった。Ｂ細胞形成不全の持続とＰＦＳとの間に関連はなかった（Ｐ＝０．３３、Ｍａｎｔｅｌ－Ｂｙａｒ検定）。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、ＡＬＬを有する患者３６人中９人（２５％）で検出され、そのうち３人は本発明のＣＡＲ細胞の注入前に検出された。ＨＡＭＡの発生とＢ細胞形成不全の喪失又は疾患再発との間に関連はなかった。
【0122】
投与タイプ（コホート１～コホート２対コホート３）及び年齢別のサブグループ分析を表８に示す。
【0123】
【表8】
【0124】
小児集団で明らかに低い奏効率が認められるのは、＋１００日目の前に本発明のＣＡＲ細胞の２回目の投与を２人の患者に早期に受けたためであることを強調することが重要である。その時までに両方の患者はＭＲＤ陰性ＣＲ状態であったが、この時点の少し前に２回目の注入を受けた。本発明者らが両者を奏効者として数えると、小児患者のＣＲＲは５５％ではなく７２％、集団全体のＣＲＲは７１％ではなく７６％になる。
【0125】
ＮＨＬを有する患者では、＋１００日目の全奏効率は７５％（３５％～９７％）であったが、ＣＲＲは５０％（１６％～８４％）であった。
【0126】
実施例３．２．４．分割投与
本発明の細胞組成物を患者に投与した。最初の１５人の患者は、０日目に０．５×１０６細胞／ｋｇ～１×１０６細胞／ｋｇ（成人）又は５×１０６細胞／ｋｇ（小児）の単回静脈内注入を受けた。次の３８人の患者は、年齢に関係なく１×１０６細胞／ｋｇを受け、０日目に第１の分割量（１０％程度）、続いて第２の分割量（３０％程度）及び第３の分割量（６０％程度）が続いた。患者にＣＲＳの徴候又は症状がない場合に限り、第２の分割量は第１の分割量の２４時間～４８時間後に投与され、第３の分割量は第２の分割量の２４時間～４８時間後に投与された。この提案の理由は、致死毒性の症例が３例あることであった（難治性ＣＲＳで死亡した１１歳及び１９歳の患者２人、及びグレード４のＣＲＳの合併症として偽膜性大腸炎で死亡した３５歳の患者１人）。
本発明の細胞組成物を患者に投与した。最初の１５人の患者は、０日目に０．５×１０６細胞／ｋｇ～１×１０６細胞／ｋｇ（成人）又は５×１０６細胞／ｋｇ（小児）の単回静脈内注入を受けた。次の３８人の患者は、年齢に関係なく１×１０６細胞／ｋｇを受け、０日目に第１の分割量（１０％程度）、続いて第２の分割量（３０％程度）及び第３の分割量（６０％程度）が続いた。患者にＣＲＳの徴候又は症状がない場合に限り、第２の分割量は第１の分割量の２４時間～４８時間後に投与され、第３の分割量は第２の分割量の２４時間～４８時間後に投与された。この提案の理由は、致死毒性の症例が３例あることであった（難治性ＣＲＳで死亡した１１歳及び１９歳の患者２人、及びグレード４のＣＲＳの合併症として偽膜性大腸炎で死亡した３５歳の患者１人）。
【0127】
有害事象及び奏効率は、９５％の正確なＣｌｏｐｐｅｒ－Ｐｅａｒｓｏｎ ＣＩで示される。ＣＲＳ（全グレード及びグレード３以上）、スクリーニング時の腫瘍量（骨髄（ＢＭ）における芽球が５％未満対５％以上）、及び投与タイプ（単回投与対分割投与）との間の可能性がある関連性をＦｉｓｈｅｒの正確検定を用いて評定した。また、本発明者らは、以下の変数：年齢（２５歳未満対２５歳以上）、投与タイプ、腫瘍量、及びＢ細胞形成不全（ＢＣＡ）の喪失の無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）への影響も分析した（後者は時間依存の共変量として）。ＰＦＳ／ＯＳ曲線を、時間固定共変量の場合はＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法、ＢＣＡ喪失の場合はＳｉｍｏｎ－Ｍａｋｕｃｈ法を使用してプロットした。ＢＣＡ喪失の最も適切な時期を特定するために、ランドマーク解析を行った。単変量Ｃｏｘ回帰を使用してこれらの共変量がＰＦＳ／ＯＳに与える影響を評価し、ＢｅｎｊａｍｉｎｉＨｏｃｈｂｅｒｇの調整済みｐ値が０．１未満のものを多変量Ｃｏｘ回帰に導入した。シェーンフェルト残差を使用して、比例ハザードの仮定を確認した。Ｒ／Ｒ ＡＬＬを有する５３人の患者が、本発明の細胞組成物による治療法を受けた。年齢の中央値は３０歳（範囲、３歳～６８歳）であり、２４人（４５％）の患者は女性であった。
【0128】
患者に、参加後、中央値５５．５日（範囲、２７日～２１６日）に本発明の細胞組成物を投与し、静脈から静脈まで（vein-to-vein）（アフェレーシスから注入まで）の時間の中央値は４３日（範囲、２１日～１９０日）であった。当初の目標用量は、ＣＲＳにより０．１×１０６細胞／ｋｇ～０．４×１０６細胞／ｋｇを受けた３人（５．７％）の患者を除く全ての患者に注入された。ＣＲＳは５６．６％（９５％ＣＩ ４２．３％～７０．２％）の患者で報告され、１１．３％がグレード３以上（９５％ＣＩ ４．３％～２３％）であり、それぞれ２０．７％及び１１．３％の患者でトシリズマブ及びステロイドによる治療が必要であった。ＢＭ内のリンパ芽球が５％以上の患者は、リンパ芽球が５％未満の患者と比較して、ＣＲＳの発生率が高かった（任意のグレード：８２％対３９％、ｐ＝０．００２２、グレード３以上：２７％対０％、ｐ＝０．００３６）。さらに、ＣＲＳの発生率と重症度は、細胞の単回用量対分割投与とも関連していた（任意のグレード：８７％対４５％、ｐ＝０．００６４、グレード３以上：２７％対５％、ｐ＝０．０４７）。神経毒性は患者の１３．２％（９５％ＣＩ ５．５％～２５．３％）で観察され、グレード３以上の自己限定発生（１．９％）が１回発生した。以前に報告された骨髄異形成症例（１／５３、１．９％）を除いて、新たな二次悪性腫瘍は報告されていない。
【0129】
安全性プロファイルは類似製品と同等であり、グレード３以上のＣＲＳ／神経毒性率は５％未満であった。２ ６さらに、同様の研究と同じく、分割投与と腫瘍量の両方がＣＲＳの発生率と有意に関連していた。注目すべきことに、ＣＵＰに登録された２人の患者は、第１の分割量（０．１×１０６細胞／ｋｇ）でグレード３以上のＣＲＳを経験したが、トシリズマブによる治療後に正常に回復した。どちらの患者も、研究に参加した時点で腫瘍量が大きかった（ＢＭの芽球数が９０％超）が、それでも不可逆的な毒性を回避しながら治療を受けることができた。
【0130】
測定可能な残存疾患（ＭＲＤ）陰性ＣＲ率は、＋２８％日目に８８．６％（９５％ＣＩ ７７．０％～９５．７％）、＋１００日目に７９．２％（９５％ＣＩ ６５．９％～８９．２％）であった。毒性のために、受けた細胞数が１×１０６細胞／ｋｇ未満であった３人の患者全員が、ＭＲＤ陰性のＣＲを達成した。評価可能な全ての患者（ｎ＝５０）が絶対ＢＣＡを発症し、中央値は４．２カ月（９５％ＣＩ ３．３２カ月～７．５３カ月）持続した。ＰＦＳは１年及び２年でそれぞれ、５０．９％（９５％ＣＩ ３８．４％～６７．４％）と３２．９％（９５％ＣＩ ２０．６％～５２．６％）であったが、１年及び２年のＯＳは７０．２％（９５％ＣＩ ５８．１％～８４．８％）と５３．９％（９５％ＣＩ ４０．５％～７１．８％）であった。２７人（５０．９％；９５％ＣＩ ３６．８％～６４．９％）の患者に進行性疾患が発生し、その中央値は５．３（範囲、０．２～２３．１）カ月であった。腫瘍細胞はこれらの再発のうち２４人（８９％）でＣＤ１９を発現し、３人（１１％）はＣＤ１９陰性であった。３人（６％）の患者では、これらの細胞がａｌｌｏＨＣＴへの橋渡し役を果たした。２回目の注入は９人の患者（以前に報告されたものより３人多い：ＣＤ１９＋再発による４人、及びＢＣＡの早期喪失を伴う患者の５人）で報告された。その結果、一過性の奏効と短期間のＢＣＡが見られたが、その奏効のうち１回で患者は２回目のａｌｌｏＨＣＴを受けることができた。
【0131】
単変量解析によると、ＰＦＳに影響を及ぼす可能性のある変数は２つのみ、すなわち、２年ＰＦＳが５２．５％（９５％ＣＩ ３６．４％～７５．７％）対１０．７％（９５％ＣＩ ２．１％～５４．４％）の腫瘍量（スクリーニング時のＢＭ中のリンパ芽球数が５％未満対５％以上）、及び芽球が５％以上の患者に対するＨＲ ２．１４（９５％ＣＩ １．０４～４．４２）（調整済みｐ＝０．０７７）であった。一方、ＢＣＡの喪失のＨＲは４．４１（９５％ＣＩ １．５９対１２．２）で、調整済みｐ＝０．０１７２であった。どちらの変数（腫瘍量及びＢＣＡの喪失）も多変量モデルで確認され、スクリーニング時に芽球数が５％以上の患者のＨＲは２．０５（９５％ＣＩ １．００４～４．１７）（ｐ＝０．０４８４）、ＢＣＡを欠く患者のＨＲは４．３２（９５％ＣＩ １．５７～１１．８６）（ｐ＝０．００４５）であった。ＯＳに関しては、評価された共変量のいずれも、多変量解析を正当化するほど十分な影響はなかった。ＢＣＡの喪失がＰＦＳにこのような影響を及ぼしていることを踏まえ、本発明者らは一連のランドマーク分析を行い、臨床診療に最も適したカットオフを特定した。本発明者らのシリーズでＢＣＡが失われるまでの期間の中央値が４．２カ月であったため、潜在的なランドマーク期間として３カ月及び６カ月を選択した。これらの分析によると、３カ月の時点が統計的有意性に最も近かった（ＨＲ １．８３、９５％ＣＩ ０．８２～４．１１、ｐ＝０．１５）。
【0132】
結論として、腫瘍量とＢＣＡ喪失の両方がＰＦＳに大きな影響を及ぼすようであり、細胞注入後の患者の管理において臨床医の指針となる可能性がある。細胞の分割投与の有効性も確認された。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
特許請求の範囲ＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療における使用のための、複数の細胞を含む組成物であって、前記細胞が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有する、抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを順に含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記ＶＨが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＬがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ１が配列番号１の配列のみからなり、ＨＣＤＲ２が配列番号２の配列のみからなり、ＨＣＤＲ３が配列番号３の配列のみからなり、ＬＣＤＲ１が配列番号４の配列のみからなり、ＬＣＤＲ２が配列番号５の配列のみからなり、ＬＣＤＲ３が配列番号６の配列のみからなる、複数の細胞を含む組成物。
【請求項2】
請求項１に記載のＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療における使用のための、複数の細胞を含む組成物であって、前記細胞が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有する、抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を順に含み、前記ＶＨが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＬがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ１が配列番号１の配列のみからなり、ＨＣＤＲ２が配列番号２の配列のみからなり、ＨＣＤＲ３が配列番号３の配列のみからなり、ＬＣＤＲ１が配列番号４の配列のみからなり、ＬＣＤＲ２が配列番号５の配列のみからなり、ＬＣＤＲ３が配列番号６の配列のみからなり、細胞の漸進的分割投与が行われ、投与される細胞の割合が、投与される各連続分割量において漸進的に増加することを特徴とする、複数の細胞を含む組成物。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のＣＤ１９＋悪性腫瘍の治療に使用するための、複数の細胞を含む組成物であって、前記細胞が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有する、抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを順に含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記ＶＨが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＬがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ１が配列番号１の配列のみからなり、ＨＣＤＲ２が配列番号２の配列のみからなり、ＨＣＤＲ３が配列番号３の配列のみからなり、ＬＣＤＲ１が配列番号４の配列のみからなり、ＬＣＤＲ２が配列番号５の配列のみからなり、ＬＣＤＲ３が配列番号６の配列のみからなり、細胞の分割投与が、０日目に総用量の１０％程度を含む第１の分割量を投与し、続いて総用量の３０％程度を含む第２の分割量、及び総用量の６０％程度を含む第３の分割量を投与することによって行われることを特徴とする、複数の細胞を含む組成物。
【請求項4】
前記抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖが、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、前記ＶＬドメインが、配列番号７のみからなり、前記ＶＨドメインが、配列番号８のみからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項5】
前記ＣＡＲが、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項6】
前記ＣＡＲのヒンジ及び膜貫通ドメインが配列番号９のＣＤ８ａのみからなり、前記共刺激シグナル伝達ドメインが配列番号１０の４－１ＢＢのみからなり、前記細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号１１のＣＤ３δのみからなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項7】
前記ＣＡＲが配列番号１２を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項8】
前記細胞が、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項9】
薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物であることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項10】
急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫若しくは慢性リンパ性白血病、又は任意のＣＤ１９＋障害の治療における、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項11】
総用量が０．５×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇ、好ましくは１×１０６細胞／ｋｇであることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【国際調査報告】