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特表2024-519536ＰＸＲを標的とする二官能性ＰＲＯＴＡＣ型化合物、同化合物を調製するための方法、及びその治療的使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-15
(54)【発明の名称】ＰＸＲを標的とする二官能性ＰＲＯＴＡＣ型化合物、同化合物を調製するための方法、及びその治療的使用
(51)【国際特許分類】
C07D 403/14 20060101AFI20240508BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240508BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240508BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240508BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20240508BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240508BHJP
【ＦＩ】
C07D403/14 CSP
A61P43/00 111
A61P35/00
A61K47/54
A61K31/496
A61K45/00
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572137
(86)(22)【出願日】2022-05-18
(85)【翻訳文提出日】2023-11-20
(86)【国際出願番号】 EP2022063422
(87)【国際公開番号】W WO2022243365
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】2105217
(32)【優先日】2021-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504007888
【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィーク
(71)【出願人】
【識別番号】521240402
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ド モンペリエ
(71)【出願人】
【識別番号】505386960
【氏名又は名称】アンスティテュト ナショナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム）
(71)【出願人】
【識別番号】520307757
【氏名又は名称】エコール ナシオナル シュペリウール ドゥ シミ ドゥ モンペリエ
【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ ＳＵＰＥＲＩＥＵＲＥ ＤＥ ＣＨＩＭＩＥ ＤＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パスカッシ，ジョン－マルク
(72)【発明者】
【氏名】パネキン，ジュリー
(72)【発明者】
【氏名】アンブラール－コーシル，ミュリエル
(72)【発明者】
【氏名】ラコムド，ギヨーム
(72)【発明者】
【氏名】ジャルバル－シャロワン，サビーヌ
(72)【発明者】
【氏名】シャヴァニュー，アラン
(72)【発明者】
【氏名】ブルゲ，ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】デルフォッセ，ヴァネッサ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC26
4C076CC27
4C076EE59
4C076FF68
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC421
4C084ZC422
4C084ZC751
4C084ZC752
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA04
4C086BC50
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB26
4C086ZC42
(57)【要約】
本出願は、標的タンパク質ＰＸＲ及びＥ３－ユビキチンリガーゼに同時に結合する新規の二官能性ＰＲＯＴＡＣ型化合物、同化合物を調製するための方法、並びにＰＸＲを過剰発現するがんを治療するためのその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（Ｉ）を有する二官能性化合物であって、【化1】
式中、
Ｌ（ＰＸＲ）が、ＰＸＲ核内受容体に結合することが可能なリガンドであり、
Ｌ（Ｅ３リガーゼ）が、Ｅ３－ユビキチンリガーゼのリガンドを表し、
リンカーが、Ｌ（ＰＸＲ）をＬ（Ｅ３リガーゼ）に共有結合することを可能にする基を表す、
二官能性化合物。
【請求項2】
Ｌ（ＰＸＲ）が、式（ＩＩ）の基であって、【化2】
式中、
【化3】
が、リンカーへの前記基の付着を表す、
基、又は薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の二官能性化合物。
【請求項3】
Ｌ（Ｅ３リガーゼ）が、－式（ＩＩＩＡ）の基：
【化4】
及び
－式（ＩＩＩＢ）の基：
【化5】
又は薬学的に許容される塩から選択され、
式中、
Ｘが、ＮＨであり、
Ｘ’が、－Ｃ（Ｏ）－又は－ＣＨ２－であり、
Ｙが、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表し、
【化6】
が、リンカーへの前記基の付着を表す、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
リンカーが、基－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（ＮＯＲ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（ＮＲ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＲ’）－、－Ｃ（ＮＲ’）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＲ’）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、Ｃ３～Ｃ１２カルボシクレン、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１、２、若しくは３個のヘテロ原子を含む３～１２員ヘテロシクレン、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１、２、若しくは３個のヘテロ原子を含む５～１２員ヘテロアリーレン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つによって、いずれか一方及び／又は両方の末端で任意選択的に中断されているか、又は終端している、Ｃ１～Ｃ２０アルキレン基を表し、式中、Ｒ’が、同一であるか、又は異なり、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表す、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
リンカーが、基（ＩＶ）を表し、【化7】
式中、Ｌ１及びＬ２が、同一であるか、又は異なり、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１、２、又は３個のヘテロ原子を含む３～１２員ヘテロシクレンによって任意選択的に中断されているか、又は終端している、１～１２個の炭素原子のアルキレン基を表し、
Ｌ１が、Ｌ（ＰＸＲ）に連結されており、
【化8】
が、Ｌ（Ｅ３リガーゼ）に連結されており、
Ｚが、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表す、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
以下の式（Ｉ－４）及び（Ｉ－５）のうちの１つであって、【化9】
式中、Ｌ（ＰＸＲ）、リンカーが、請求項１～５のいずれか一項に従って定義される、式、
又は薬学的に許容される塩に一致する、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項7】
以下の式（Ｖ）に一致するような化合物であって、【化10】
式中、Ｌ２が、ピペリジニル基によって任意選択的に中断されたＣ２～Ｃ８直鎖アルキレン基を表し、Ｌ（Ｅ３リガーゼ）が、請求項１～６のいずれか一項に従って定義されるとおりである、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
以下の式のうちの１つに一致する、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。【化11】
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物を調製するための方法であって、式（Ｂ）の化合物及び式（Ｃ）の化合物のカップリングを含み、【化12】
式中、Ｌ（ＰＸＲ）及びＬ（Ｅ３リガーゼ）が、請求項１～７のいずれか一項に従って定義されるとおりであり、Ｔ及びＴ’が、各々、相補的反応性末端官能基を有するように、リンカー前駆体の２つの基である、
方法。
【請求項10】
前記化合物（Ｂ）が、式（Ａ）に一致し、【化13】
前記化合物（Ｃ）が、式（Ｃ－１）に一致し、
【化14】
式中、Ｌ２及びＬ（Ｅ３リガーゼ）が、請求項１～７のいずれか一項に従って定義されるとおりである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
式（Ａ）の化合物。【化15】
【請求項12】
請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項13】
ＰＸＲ核内受容体を過剰発現するがんの治療及び／又は予防に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項14】
抗がん剤と組み合わせた、請求項１３に記載の使用のための化合物。
【請求項15】
抗がん剤に耐性がある患者に投与するための、請求項１３又は１４に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がん、より具体的には、結腸直腸がんなどのＰＸＲ核内受容体を過剰発現するがんの治療に関する。
【背景技術】
【0002】
結腸直腸がん（colorectal cancer、ＣＲＣ）は、３番目に多く見られるがんであり、
がんによる第３の死因である。現在の治療には、時として、わずかな改善を示す標的療法と組み合わせて、手術、放射線療法、及び化学療法が含まれる。しかしながら、これらの治療の有効性は、耐性の頻繁な出現によって重篤に損なわれ、これは、治療停止後の患者の再発につながる（患者の５０％）。近年、がん細胞の亜母集団であるがん幹細胞（cancer stem cell、ＣＳＣ）が、腫瘍開始、転移発生、及び薬物耐性に関与し、したがって、腫瘍再発につながることが示されている。
がんによる第３の死因である。現在の治療には、時として、わずかな改善を示す標的療法と組み合わせて、手術、放射線療法、及び化学療法が含まれる。しかしながら、これらの治療の有効性は、耐性の頻繁な出現によって重篤に損なわれ、これは、治療停止後の患者の再発につながる（患者の５０％）。近年、がん細胞の亜母集団であるがん幹細胞（cancer stem cell、ＣＳＣ）が、腫瘍開始、転移発生、及び薬物耐性に関与し、したがって、腫瘍再発につながることが示されている。
【0003】
本発明者らは、現在、ＰＸＲ（ＮＲ１Ｉ２）核内受容体が、がん幹細胞において優先的に活性化され、ＲＮＡ干渉（ｓｈＲＮＡ）によるその発現の消失が、通常は化学療法に耐性であるこの細胞集団を感作し、マウスにおける腫瘍再発を著しく遅延させることを実証している。したがって、ＰＸＲ（ＮＲ１Ｉ２）核内受容体の阻害は、現在の治療に対してがん幹細胞を感作することを可能にする。
【0004】
しかしながら、現在までに同定されたＰＸＲアンタゴニスト（Ｌ－スルホラファン、ケトコナゾール及びＳＡＰ－７０）は、ＰＸＲの不活性化に必要な濃度では非特異的及び／若しくは毒性であるか、又は臨床使用のためにまだ承認されていないかのいずれかである。
【0005】
ＰＲＯＴＡＣ（Proteolysis Targeting Chimera、「タンパク質分解標的化キメラ」）
は、標的タンパク質及びＥ３－ユビキチンリガーゼに同時に結合する二官能性分子である。これは、標的タンパク質のポリユビキチン化を引き起こし、したがって、これは、プロテアソーム複合体によって小ペプチド及びアミノ酸に分解される。したがって、ＰＲＯＴＡＣアプローチは、化学的タンパク質ノックダウン方略である。
は、標的タンパク質及びＥ３－ユビキチンリガーゼに同時に結合する二官能性分子である。これは、標的タンパク質のポリユビキチン化を引き起こし、したがって、これは、プロテアソーム複合体によって小ペプチド及びアミノ酸に分解される。したがって、ＰＲＯＴＡＣアプローチは、化学的タンパク質ノックダウン方略である。
【0006】
したがって、ＰＲＯＴＡＣ方略に従ってＰＸＲの標的タンパク質分解を誘導することが可能な二官能性キメラリガンドを提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，６６：ｐａｇｅｓ１－１９（１９７７）
【非特許文献2】ＬａｒｏｃｋによってＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂ．，１９８９
【非特許文献3】Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１、Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３
【発明の概要】
【0008】
第１の主題によれば、本発明は、一般式（Ｉ）に一致する二官能性化合物であって、
【0009】
【化1】
【0010】
式中、
Ｌ（ＰＸＲ）が、ＰＸＲ核内受容体に結合することが可能なリガンドであり、
Ｌ（Ｅ３リガーゼ）が、Ｅ３－ユビキチンリガーゼのリガンドを表し、
リンカーが、Ｌ（ＰＸＲ）をＬ（Ｅ３リガーゼ）に共有結合することを可能にする基を表す、二官能性化合物に関する。
Ｌ（ＰＸＲ）が、ＰＸＲ核内受容体に結合することが可能なリガンドであり、
Ｌ（Ｅ３リガーゼ）が、Ｅ３－ユビキチンリガーゼのリガンドを表し、
リンカーが、Ｌ（ＰＸＲ）をＬ（Ｅ３リガーゼ）に共有結合することを可能にする基を表す、二官能性化合物に関する。
【0011】
ユビキチン－プロテアソーム経路（ubiquitin-proteasome pathway、ＵＰＰ）は、重要な調節タンパク質を調節し、不正確に折り畳まれたタンパク質又は異常なタンパク質を分解する、不可欠な細胞経路である。ＵＰＰは、いくつかの細胞プロセスの中心にある。それに欠陥があるか、又はそれが不均衡である場合、様々な疾患の病因につながる。特異的なタンパク質基質へのユビキチンの共有結合は、Ｅ３－ユビキチンリガーゼの作用によって得られる。これらのリガーゼは、５００を超える異なるタンパク質を含み、そのＥ３機能活性の構造要素によって定義されるいくつかのクラスに分類される。
【0012】
本発明の化合物の機能様式を構成するＥ３リガーゼリガンドは、Ｅ３－ユビキチンリガーゼに結合する。リガーゼは、標的タンパク質へのユビキチンの共有結合を触媒し、これはひいては、天然プロテアソームによる標的タンパク質の分解を誘導する。したがって、本発明の化合物は、天然細胞分解プロセスを利用するが、分解作用が疾患の病因に関与する望ましくない標的タンパク質に指向される様式で設計される。
【0013】
従来の化学阻害剤とは異なり、本発明によるＰＲＯＴＡＣは、超化学量論的作用の能力を有する分解酵素として作用する。
【0014】
したがって、本発明による化合物は、複数の利点を有する。
１）それらは、阻害剤単独の濃度よりも低い濃度で活性であり、標的の飽和を得るために高レベルの全身曝露を必要とする。
２）それらは、標的タンパク質の分解につながる複数の分解サイクルを実施することができる。
３）その標的に対する阻害剤の急速な解離速度と比較して、ＰＲＯＴＡＣによって誘導される分解後のタンパク質機能の回復は、細胞によるタンパク質のデノボ合成を必要とし、これははるかに長くかかり、したがって、ＰＲＯＴＡＣの効果の持続時間を増加させる。
１）それらは、阻害剤単独の濃度よりも低い濃度で活性であり、標的の飽和を得るために高レベルの全身曝露を必要とする。
２）それらは、標的タンパク質の分解につながる複数の分解サイクルを実施することができる。
３）その標的に対する阻害剤の急速な解離速度と比較して、ＰＲＯＴＡＣによって誘導される分解後のタンパク質機能の回復は、細胞によるタンパク質のデノボ合成を必要とし、これははるかに長くかかり、したがって、ＰＲＯＴＡＣの効果の持続時間を増加させる。
【0015】
Ｌ（ＰＸＲ）は、ＰＸＲに結合する本化合物の機能様式である。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、ＰＸＲ ＪＭＶ６８４５リガンドの類似体である。
【0016】
【化2】
【0017】
一実施形態によれば、Ｌ（ＰＸＲ）は、式（ＩＩ）の基であって、
【0018】
【化3】
【0019】
式中、
【0020】
【化4】
【0021】
が、リンカーへの基の結合を表す、基、
又は薬学的に許容される塩から選択され得る。
又は薬学的に許容される塩から選択され得る。
【0022】
したがって、本発明による化合物は、以下の式（Ｉ－１）であって、
【0023】
【化5】
【0024】
式中、リンカー、Ｌ（Ｅ３リガーゼ）が、上記又は下記に定義されるとおりである、式、又は薬学的に許容される塩に一致し得る。
【0025】
一実施形態によれば、Ｅ３リガーゼリガンドは、セレブロンに結合する。Ｌ（Ｅ３リガーゼ）は、特に、
－式（ＩＩＩＡ）の基：
－式（ＩＩＩＡ）の基：
【0026】
【化6】
【0027】
及び
－式（ＩＩＩＢ）の基：
－式（ＩＩＩＢ）の基：
【0028】
【化7】
【0029】
又は薬学的に許容される塩から選択され得、
式（ＩＩＩＡ）及び（ＩＩＩＢ）中、
Ｘは、ＮＨであり、
Ｘ’は、－Ｃ（Ｏ）－又は－ＣＨ２－であり、
Ｙは、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表し、
式（ＩＩＩＡ）及び（ＩＩＩＢ）中、
Ｘは、ＮＨであり、
Ｘ’は、－Ｃ（Ｏ）－又は－ＣＨ２－であり、
Ｙは、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表し、
【0030】
【化8】
【0031】
は、リンカーへの基の付着を表す。
【0032】
したがって、本発明による化合物は、特に、式（Ｉ－２）又は（Ｉ－３）であって、
【0033】
【化9】
【0034】
式中、リンカー、Ｌ（ＰＸＲ）、Ｌ（Ｅ３リガーゼ）、Ｘ、Ｘ’、Ｙが、上記若しくは下記に定義されるとおりである、式、
又は薬学的に許容される塩に一致し得る。
又は薬学的に許容される塩に一致し得る。
【0035】
より具体的には、本発明による化合物は、以下の式（Ｉ－４）及び（Ｉ－５）のうちの１つであって、
【0036】
【化10】
【0037】
式中、Ｌ（ＰＸＲ）、リンカーが、上記又は下記に定義される、式、
又は薬学的に許容される塩に一致し得る。
又は薬学的に許容される塩に一致し得る。
【0038】
リンカーは、Ｅ３リガーゼリガンドとの標的リガンドの共有結合を提供する。一実施形態によれば、リンカーは、基－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（ＮＯＲ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（ＮＲ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＲ’）－、－Ｃ（ＮＲ’）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＲ’）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキレン、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１、２、若しくは３個のヘテロ原子を含む３～１２員ヘテロシクレン、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１、２、若しくは３個のヘテロ原子を含む５～１２員ヘテロアリーレン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つによって、いずれか一方及び／又は両方の末端で任意選択的に中断されているか、又は終端している、Ｃ１～Ｃ２０アルキレン基を表し、式中、Ｒ’は、同一であるか、又は異なり、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表す。
【0039】
したがって、特定の実施形態によれば、リンカーは、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、ピペリジニル、ピペラジレンから選択される１つ以上の基によって任意選択的に中断されているか、及び／又は終端しているＣ４～Ｃ２０アルキレン基から選択され得る。
【0040】
より具体的には、リンカーは、式（ＩＶ）の基の中で表され得、
【0041】
【化11】
【0042】
式中、Ｌ１及びＬ２は、同一であるか、又は異なり、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１、２、又は３個のヘテロ原子を含む３～１２員ヘテロシクレンによって任意選択的に中断されているか、又は終端している、１～１２個の炭素原子のアルキレン基を表し、
Ｌ１は、Ｌ（ＰＸＲ）に連結されており、
Ｌ１は、Ｌ（ＰＸＲ）に連結されており、
【0043】
【化12】
【0044】
は、Ｌ（Ｅ３リガーゼ）に連結されており、
Ｚは、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表す。
Ｚは、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキル基を表す。
【0045】
より特定の実施形態によれば、Ｌ１は、Ｃ７－アルキレン基（－Ｃ７Ｈ１４－）である。
【0046】
より特定の実施形態によれば、Ｌ２は、ピペリジニル基によって任意選択的に中断された（Ｃ２～Ｃ８）－アルキレン基である。
【0047】
一実施形態によれば、本発明による化合物は、以下の式（Ｖ）に一致し得、
【0048】
【化13】
【0049】
式中、Ｌ２は、ピペリジニル基によって任意選択的に中断されたＣ２～Ｃ８直鎖アルキレン基を表し、Ｌ（Ｅ３リガーゼ）は、上記又は下記に定義されるとおりである。
【0050】
本明細書で表される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＶ）、（Ｖ）はまた、その薬学的に許容される塩、その同位体誘導体、及びその立体異性体も対象とする。
【0051】
上記又は下記で使用される場合、他に特定されない限り、
「アルキル」は、鎖中に約１～約２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐であり得る脂肪族炭化水素基を示す。好ましいアルキル基は、鎖中に１～約１２個の炭素原子、特に、
１～６個の炭素原子を有する。分岐は、メチル、エチル、又はプロピルなどの１つ以上の低級アルキル基が直鎖アルキル鎖に結合されていることを意味する。「低級アルキル」は、直鎖又は分岐であり得る鎖中の約１～約４個の炭素原子を意味する。アルキルは、同一であるか、又は異なり、ハロ、シクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、ヘテロアラルコキシカルボニル、又はＹ１Ｙ２ＮＣＯ－を含み得る、１つ以上の「アルキル基置換基」によって置換され得、Ｙ１及びＹ２は、独立して、水素、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたアラルキル、若しくは任意選択的に置換されたヘテロアラルキルであるか、又はＹ１及びＹ２は、Ｙ１及びＹ２が介して結合されているＮと一緒とみなされ、４～７個の元素ヘテロシクリルを形成する。アルキル基の典型的な例としては、メチル、トリフルオロメチル、シクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、３－ペンチル、メトキシエチル、カルボキシメチル、メトキシカルボニルエチル、ベンジルオキシカルボニルメチル、ピリジルメチルオキシカルボニルメチルが挙げられる。
「アルキル」は、鎖中に約１～約２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐であり得る脂肪族炭化水素基を示す。好ましいアルキル基は、鎖中に１～約１２個の炭素原子、特に、
１～６個の炭素原子を有する。分岐は、メチル、エチル、又はプロピルなどの１つ以上の低級アルキル基が直鎖アルキル鎖に結合されていることを意味する。「低級アルキル」は、直鎖又は分岐であり得る鎖中の約１～約４個の炭素原子を意味する。アルキルは、同一であるか、又は異なり、ハロ、シクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、ヘテロアラルコキシカルボニル、又はＹ１Ｙ２ＮＣＯ－を含み得る、１つ以上の「アルキル基置換基」によって置換され得、Ｙ１及びＹ２は、独立して、水素、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたアラルキル、若しくは任意選択的に置換されたヘテロアラルキルであるか、又はＹ１及びＹ２は、Ｙ１及びＹ２が介して結合されているＮと一緒とみなされ、４～７個の元素ヘテロシクリルを形成する。アルキル基の典型的な例としては、メチル、トリフルオロメチル、シクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、３－ペンチル、メトキシエチル、カルボキシメチル、メトキシカルボニルエチル、ベンジルオキシカルボニルメチル、ピリジルメチルオキシカルボニルメチルが挙げられる。
【0052】
「アルキレン」は、二価である上記で定義されるアルキル基を示す。好ましいアルキレン基は、１～約６個の炭素原子を有する低級アルキレン基である。アルキレン基の典型的な例としては、メチレン及びエチレンが挙げられる。
【0053】
「シクロアルキル」は、約３～約１０個の炭素原子、好ましくは、約５～約１０個の炭素原子の非芳香族単環式又は多環式環系を意味する。環系の環の好ましい環サイズは、１つ以上の置換基によって任意選択的に置換された約５～約６個の環原子を含む。例示的な単環式シクロアルキルは、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及び同等物を含む。例示的な多環式シクロアルキルは、１－デカリン、ノルボルニル、アダマント－（１又は２－）イル、及び同等物を含む。
【0054】
「シクロアルキレン」は、特にシクロヘキシレンなどの飽和した二価である上記で定義されるシクロアルキル基を意味する。
【0055】
「ヘテロシクリル」は、約３～約１０個の炭素原子、好ましくは、約５～約１０個の炭素原子の非芳香族飽和単環式又は多環式環系を意味し、環系中の炭素原子のうちの１つ以上は、炭素以外の１つ以上のヘテロ元素、例えば、窒素、酸素、又は硫黄である。環系の環の好ましい環サイズは、約５～約６個の環原子を含む。ヘテロシクリルの前の接頭辞としてのアザ、オキサ、又はチアの指定は、少なくとも１つの窒素、酸素、又は硫黄原子が、それぞれ、環原子として存在することを定義する。ヘテロシクリルは、同じであるか、又は異なり得、本明細書で定義されるとおりである、１つ以上の置換基によって任意選択的に置換され得る。ヘテロシクリルの窒素原子は、塩基性窒素原子であり得る。ヘテロシクリルの窒素又は硫黄原子はまた、任意選択的に、対応するＮ－オキシド、Ｓ－オキシド、又はＳ，Ｓ－ジオキシドに酸化され得る。例示的な単環式ヘテロシクリル環には、ピペリジル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，３－ジオキソラニル、１，４－ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、及び同等物が含まれる。
【0056】
「ヘテロシクレン」という用語は、二価である上記で定義されるヘテロシクリル基を示す。
【0057】
「ヘテロアリール」は、約５～約１４個の炭素原子、好ましくは、約５～約１０個の炭素原子の単環式又は多環式芳香族環系を意味し、環系中の炭素原子のうちの１つ以上は、炭素以外の１つ以上のヘテロ元素、例えば、窒素、酸素、又は硫黄である。環系の環の好
ましい環サイズは、約５～約６個の環原子を含む。「ヘテロアリール」はまた、１つ以上の置換基によって置換され得る。ヘテロアリールの前の接頭辞としてのアザ、オキサ、又はチアの指定は、少なくとも１つの窒素、酸素、又は硫黄原子が、それぞれ、環原子として存在することを定義する。ヘテロアリールの窒素原子は、塩基性窒素原子であり得、また、任意選択的に、対応するＮ－オキシドに酸化され得る。例示的な置換ヘテロアリール及びヘテロアリール基には、ピラジニル、チエニル、イソチアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、フラザニル、ピロリル、１，２，４－チアジアゾリル、ピリダジニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾ［１，２－ａ］ピリジン、イミダゾ［２，１－ｂ］チアゾリル、ベンゾフラザニル、アザインドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、チエノピリジル、チエノピリミジニル、ピロロピリジル、イミダゾピリジル、ベンゾアザインドール、１，２，４－トリアジニル、ベンズチアゾリル、フラニル、イミダゾリル、インドリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、１，３，４－チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、及びトリアゾリルが含まれる。好ましいヘテロアリール基は、ピラジニル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル、イソオキサゾリル、及びイソチアゾリルを含む。
ましい環サイズは、約５～約６個の環原子を含む。「ヘテロアリール」はまた、１つ以上の置換基によって置換され得る。ヘテロアリールの前の接頭辞としてのアザ、オキサ、又はチアの指定は、少なくとも１つの窒素、酸素、又は硫黄原子が、それぞれ、環原子として存在することを定義する。ヘテロアリールの窒素原子は、塩基性窒素原子であり得、また、任意選択的に、対応するＮ－オキシドに酸化され得る。例示的な置換ヘテロアリール及びヘテロアリール基には、ピラジニル、チエニル、イソチアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、フラザニル、ピロリル、１，２，４－チアジアゾリル、ピリダジニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾ［１，２－ａ］ピリジン、イミダゾ［２，１－ｂ］チアゾリル、ベンゾフラザニル、アザインドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、チエノピリジル、チエノピリミジニル、ピロロピリジル、イミダゾピリジル、ベンゾアザインドール、１，２，４－トリアジニル、ベンズチアゾリル、フラニル、イミダゾリル、インドリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、１，３，４－チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、及びトリアゾリルが含まれる。好ましいヘテロアリール基は、ピラジニル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル、イソオキサゾリル、及びイソチアゾリルを含む。
【0058】
「ヘテロアリーレン」は、二価である上記で定義されるヘテロアリールラジカルを示す。
【0059】
「置換基」は、ハロゲン、シアノ、シクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アロイルアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、ヘテロアラルコキシカルボニルから選択される１つ以上の同一の基又は異なる基を示す。
【0060】
本発明の化合物は、遊離酸若しくは遊離塩基、又は薬学的に許容される塩の形態であり得る。
【0061】
「薬学的に許容される塩」という表現は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機及び有機酸付加塩、並びに塩基付加塩を指す。これらの塩は、化合物の最終的な単離及び精製中にインサイチュで調製され得る。特に、酸付加塩は、精製された化合物をその精製された形態で有機又は無機酸と別々に反応させることによって、かつそのように形成された塩を単離することによって、調製することができる。酸付加塩の例としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプタン酸塩、ラクトビオン酸塩、スルファミン酸塩、マロン酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、メチレンビス－ｂ－ヒドロキシナフト酸塩、ゲンチシン酸、イセチオン酸塩、ジ－ｐ－トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、及びキナ酸ラウリルスルホン酸塩、並びに同等物が挙げられる（例えば、参考文献として本明細書に組み込まれる、非特許文献１を参照）。酸付加塩はまた、精製された化合物をその酸形態で有機又は無機塩基と別々に反応させることによって、かつそのように形成された塩を単離することによって、調製することもできる。酸付加塩には、アミン及び金属塩が含まれる。適切な金属塩には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、マグネシウム、及びアルミニウム塩が含まれる。ナトリウム塩及びカリウム塩が好ましい。好適な塩基性無機付加塩は、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛を含む金属塩基から調製される。適切な塩基性付加塩は、安定した塩を形成するために十分なアルカリ度を有するアミンから調製され、好ま
しくは、その低毒性及び医療用途のためのその容認性に起因して、医薬品化学でしばしば使用されるアミン：アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ－メチル－グルカミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、エフェナミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ－エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、塩基性アミノ酸、例えば、リジン及びアルギニン、並びにジシクロヘキシルアミン、及び同等物を含む。
しくは、その低毒性及び医療用途のためのその容認性に起因して、医薬品化学でしばしば使用されるアミン：アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ－メチル－グルカミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、エフェナミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ－エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、塩基性アミノ酸、例えば、リジン及びアルギニン、並びにジシクロヘキシルアミン、及び同等物を含む。
【0062】
本発明の化合物は、少なくとも１つのキラル中心を有し得、したがって、立体異性体の形態であり得、これは、本明細書で使用される場合、空間内のその原子の配向のみが異なる個々の化合物の全ての異性体を包含する。立体異性体という用語は、鏡像異性体（化合物の（Ｒ－）又は（Ｓ－）配置を含むエナンチオマー）、化合物の幾何化合物（シス／トランス又はＥ／Ｚ、Ｒ／Ｓ異性体）の鏡像異性体の混合物（エナンチオマー及びラセミ体の物理的混合物又はラセミ混合物）、及び互いの鏡像ではない１つを超えるキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオ異性体）を含む。化合物のキラル中心は、インビボでエピマー化を受けることができ、したがって、これらの化合物について、その（Ｒ～）形態での化合物の投与は、その（Ｓ－）形態での化合物の投与と同等とみなされる。したがって、本発明の化合物は、個々の異性体の形態で、他の異性体を実質的に含まない状態で、又は様々な異性体の混合物、例えば、立体異性体のラセミ混合物の形態で、製造及び使用することができる。
【0063】
いくつかの実施形態では、以下の化合物が、セレブロン及びＰＸＲへの結合に好適である。
【0064】
【表1】
【0065】
【表2】
【0066】
【表3】
【0067】
最も具体的には、本発明による化合物は、以下の式のうちの１つに一致する化合物から選択され得る。
【0068】
【化14】
【0069】
更なる主題によれば、本発明はまた、本発明による化合物を調製するための方法に関する。
【0070】
一般式（Ｉ）の化合物は、任意の既知の方法自体及び／又は当業者の手の届く範囲内の任意の既知の方法、特に、非特許文献２に記載されている方法の適用若しくは適合によって、又は以下の実施例に記載される方法を適用若しくは適合することによって、調製することができる。
【0071】
本発明によれば、当該方法は、式（Ｂ）の化合物及び式（Ｃ）の化合物のカップリングを含み、
【0072】
【化15】
【0073】
したがって、Ｌ（ＰＸＲ）及びＬ（Ｅ３リガーゼ）は、上記で定義されるとおりであり、Ｔ及びＴ’は、リンカー前駆体の２つの基であり、すなわち、そのカップリングは、各々がそれぞれ、相補的反応性末端官能基を有するように、リンカー基につながることを可能にする。
【0074】
本明細書では、「相補的反応性官能基」は、一緒に反応して、ＴとＴ’との間の共有結合を確実にする官能基を形成することが可能な２つの官能基を示す。したがって、典型的には、Ｔ及びＴ’は、Ｔがアミン型末端官能基を有し、Ｔ’がカルボン酸型の末端官能基を有するようなものである。
【0075】
したがって、典型的には、Ｔは、式（Ｔ－Ｂ）の基を表し、
【0076】
【化16】
【0077】
Ｔ’は、式（Ｔ－Ｃ）の基を表し、
【0078】
【化17】
【0079】
式中、Ｌ１及びＬ２は、上記で定義されるとおりである。
【0080】
当該カップリングは、有利には、ＢＯＰ（benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino)
phosphonium hexafluorophosphate、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）などのペプチドカップリング剤の存在下で、典型的には、ヒューニッヒ塩基Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ又はＤＩＥＡ）などの有機塩基の存在下で実行することができる。
phosphonium hexafluorophosphate、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）などのペプチドカップリング剤の存在下で、典型的には、ヒューニッヒ塩基Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ又はＤＩＥＡ）などの有機塩基の存在下で実行することができる。
【0081】
一実施形態によれば、化合物（Ｂ）は、式（Ａ）に一致する。
【0082】
【化18】
【0083】
一実施形態によれば、化合物（Ｃ）は、式（Ｃ－１）に一致し、
【0084】
【化19】
【0085】
式中、Ｌ２及びＬ（Ｅ３リガーゼ）は、上記で定義されるとおりである。
【0086】
任意選択的に、当該方法はまた、得られた式（Ｉ）の生成物を単離することからなるステップを含み得る。
【0087】
下記に記載される反応では、反応性官能基、例えば、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオ、カルボキシ基が最終生成物において所望される場合、それらを保護して、反応におけるそれらの望ましくない関与を回避することが必要であり得る。従来の保護基は、標準的な実践に従って使用することができる。例えば、非特許文献３を参照されたい。
【0088】
このようにして調製された化合物は、従来の手段によって反応混合物から回収することができる。例えば、化合物は、反応混合物の溶媒を蒸留することによって、又は必要であれば溶液の混合物の溶媒の蒸留後に、残りを水に注ぎ、続いて、水に非混和性の有機溶媒で抽出することによって、及び抽出物から溶媒を蒸留することによって回収することができる。加えて、所望される場合、生成物は、再結晶、再沈殿、又は種々のクロマトグラフィー技術、特に、カラムクロマトグラフィー又は分取薄膜クロマトグラフィーなどの種々の技術によって、更に精製され得る。
【0089】
本発明による有用な化合物は、不斉中心を含み得ることが分かる。これらの不斉中心は、独立して、Ｒ又はＳ配置であり得る。本発明によるある特定の有用な化合物は、幾何異性も有し得ることが、当業者には明らかであろう。本発明は、上記の式（Ｉ）の化合物の個々の幾何異性体及び立体異性体、並びにラセミ混合物を含むそれらの混合物を含むことが理解されるべきである。このタイプの異性体は、既知の方法、例えば、クロマトグラフィー技術若しくは再結晶技術を適用若しくは適合することによって、それらの混合物から分離され得るか、又はそれらは、それらの中間体の適切な異性体から別々に調製される。
【0090】
使用される塩基生成物又は試薬は、市販されており、及び／又は既知の方法、例えば、参照実施例に記載される方法若しくはその明白な化学的同等物の適用若しくは適合によって調製することができる。
【0091】
本発明による方法は、新規である式（Ａ）の中間体を実装することができる。
【0092】
したがって、更なる主題によれば、本発明はまた、式（Ａ）の化合物に関する。
【0093】
【化20】
【0094】
式（Ａ）の化合物は、以下の化合物をカップリングすることによって調製することができる。
【0095】
【化21】
【0096】
このカップリングは、典型的には、実施例１に記載される手順の適用又は適合によって実行することができる。
【0097】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、ＰＸＲの標的タンパク質分解を誘導することが可能である。したがって、式（Ｉ）の化合物は、がん、特に、ＰＸＲを過剰発現するがんの治療及び／又は予防に有用である。
【0098】
したがって、本発明はまた、薬学的に許容される賦形剤とともに本発明による化合物を含む、医薬組成物に関する。
【0099】
好ましくは、当該組成物は、有効量の本発明による化合物を含有する。
【0100】
更なる主題によれば、本発明はまた、がん、特に、ＰＸＲを過剰発現するがんの治療及び／又は予防のための一般式（Ｉ）の化合物に関する。
【0101】
ＰＸＲを過剰発現するがんは、特に、結腸直腸がん、並びに膵臓がん、肝臓がん、及び乳がんである。
【0102】
典型的には、本発明による化合物は、抗がん剤と組み合わせて使用することができる。そのような抗がん剤は、特に、５－フルオロウラシル（5-Fluorouracil、５－ＦＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ１１）、オキザリプラチン、シスプラチン、タモキシフェン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ボンブラスチン（Vonblastin）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide、ＣＰＡ）、イソホスファミド（Isophosphamide、ＩＦＯ）から選択することができる。
【0103】
好ましくは、当該組成物は、それを必要とする患者に投与される。当該患者は、特に、上述の抗がん剤に耐性がある患者である。
【0104】
本発明の医薬組成物の製剤のタイプは、経腸（例えば、経口）、非経口（例えば、皮下（subcutaneous、ｓｃ）、静脈内（intravenous、ｉｖ）、筋肉内（intramuscular、ｉｍ）及び胸骨内）であり得る注射、又は静脈内若しくは動脈、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所粘膜、経鼻、経口、舌下注入、気管内点滴、気管支点滴、及び／又は吸入であり得る注入技術を含み得る、投与様式に依存する。一般に、最も好適な投与経路は、様々な因子、特に、薬剤の性質（例えば、消化管の環境におけるその安定性）及び／又は対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることが可能であるかどうか）に依存する。いくつかの実施形態では、組成物は、経口又は静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）のために製剤化される。
【0105】
当技術分野で公知である「薬学的に許容される担体」という表現は、哺乳動物への本発明の化合物の投与に好適である、薬学的に許容される物質、組成物、又は担体を示す。好適な支持体には、例えば、１つの器官若しくは身体部分から別の器官若しくは身体部分に化合物を輸送するように動作するか、又は輸送する、液体（水性及び非水性の両方並びにそれらの組み合わせ）、固体、カプセル化材料、気体、及びそれらの組み合わせ（例えば、半固体）が含まれ得る。支持体は、生理学的に不活性であり、製剤の他の成分と適合性があり、対象又は患者にとって非毒性であるという意味で、「許容される」。製剤のタイプに基づいて、
【0106】
結果として、式Ｉの化合物は、固体組成物（例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、ウエハース、及び坐剤）、液体組成物（例えば、化合物が溶解される溶液、化合物の粒子が分散される懸濁液、リポソーム、ミセル、又はナノ粒子を含有するエマルション及び溶液、シロップ及びエリキシル剤）、半固体組成物（例えば、ゲル、懸濁液、及びクリーム）、及びガス（例えば、エアロゾル組成物用の推進剤）として製剤化され得る。化合物はまた、急速放出、中間放出、又は持続放出のために製剤化され得る。
【0107】
固体投与に好適である賦形剤は、固体形態のためのセルロース又は微結晶性セルロースの誘導体、アルカリ土類炭酸塩、リン酸マグネシウム、デンプン、加工デンプン、ラクトースである。非経口使用については、水、水性溶質、生理学的血清、等張溶質が、最も便宜的に使用される担体である。
【0108】
投与量は、治療適応症及び投与経路、並びに対象の年齢及び体重に基づいて、広い限界内で変動し得る。
【図面の簡単な説明】
【0109】
【図1】ＲＴ－ＦＲＥＴによって測定された前駆ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ６９４４のＰＸＲ親和性を描写する。
【図2】ＰＸＲの標的遺伝子であるＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下に置かれたルシフェラーゼレポーター遺伝子によって測定された、前駆ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ６９４４及びそれから生じるＰＲＯＴＡＣによるＰＸＲの活性化を図示する。
【図3A】ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された、前駆ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ６９４４及びそれから生じるＰＲＯＴＡＣによるＰＸＲの標的遺伝子（すなわち、ＣＹＰ３Ａ４）の誘導を描写する。
【図3B】ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された、前駆ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ６９４４及びそれから生じるＰＲＯＴＡＣによるＰＸＲの標的遺伝子（すなわち、ＣＹＰ３Ａ４）の誘導を描写する。
【図4A】ウェスタンブロッティングによってＣＹＰ３４の誘導に対するＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５の効果を図示及び描写する。
【図4B】ウェスタンブロッティングによってＣＹＰ３４の誘導に対するＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５の効果を図示及び描写する。
【図5A】結腸がん由来の様々な細胞株（ＬＳ１７４Ｔ、ＦＩＴ２９）及びプリモ培養（ＣＲＣ１）における細胞生存率に対するＰＲＯＴＡＣの効果を図示する。
【図5B】結腸がん由来の様々な細胞株（ＬＳ１７４Ｔ、ＦＩＴ２９）及びプリモ培養（ＣＲＣ１）における細胞生存率に対するＰＲＯＴＡＣの効果を図示する。
【図6A】ウェスタンブロッティングによって測定されたＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果を描写する。
【図6B】ウェスタンブロッティングによって測定されたＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果を描写する。
【図6C】ウェスタンブロッティングによって測定されたＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果を描写する。
【図6D】ウェスタンブロッティングによって測定されたＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果を描写する。
【図6E】ウェスタンブロッティングによって測定されたＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果を描写する。
【図7A】ウェスタンブロッティングによって測定されたＦＩＥＰＧ２細胞におけるＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果を描写する。
【図7B】ウェスタンブロッティングによって測定されたＡＳＰＣ１細胞におけるＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果を描写する。
【図8A】ウェスタンブロッティングによって測定されたＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果におけるプロテアソーム経路の重要性を図示する。
【図8B】ウェスタンブロッティングによって測定されたＰＸＲタンパク質の分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果におけるプロテアソーム経路の重要性を図示する。
【図9A】ＳＣＩＤマウスにおけるＬＳ１７４Ｔ細胞の異種移植片上のインビボでのＰＸＲタンパク質の分解に対するＪＭＶ７０４８の効果を描写する。
【図9B】ＳＣＩＤマウスにおけるＬＳ１７４Ｔ細胞の異種移植片上のインビボでのＰＸＲタンパク質の分解に対するＪＭＶ７０４８の効果を描写する。
【図9C】ＳＣＩＤマウスにおけるＬＳ１７４Ｔ細胞の異種移植片上のインビボでのＰＸＲタンパク質の分解に対するＪＭＶ７０４８の効果を描写する。
【図10A】図１０Ａ～図１０Ｄは、それぞれ、がん幹細胞の集団に対するＰＲＯＴＡＣの効果：ＡＬＤＦＩ活性の阻害（１０Ａ）、その再生能の阻害（１０Ｂ）、及び化学療法に対する感作（１０Ｃ及び１０Ｄ）を描写する。
【図10B】図１０Ａ～図１０Ｄは、それぞれ、がん幹細胞の集団に対するＰＲＯＴＡＣの効果：ＡＬＤＦＩ活性の阻害（１０Ａ）、その再生能の阻害（１０Ｂ）、及び化学療法に対する感作（１０Ｃ及び１０Ｄ）を描写する。
【図10C】図１０Ａ～図１０Ｄは、それぞれ、がん幹細胞の集団に対するＰＲＯＴＡＣの効果：ＡＬＤＦＩ活性の阻害（１０Ａ）、その再生能の阻害（１０Ｂ）、及び化学療法に対する感作（１０Ｃ及び１０Ｄ）を描写する。
【図10D】図１０Ａ～図１０Ｄは、それぞれ、がん幹細胞の集団に対するＰＲＯＴＡＣの効果：ＡＬＤＦＩ活性の阻害（１０Ａ）、その再生能の阻害（１０Ｂ）、及び化学療法に対する感作（１０Ｃ及び１０Ｄ）を描写する。
【図11A】ｈＰＸＲのＬＢＤとのＪＭＶ６９４４の相互作用様式を図示する。（１１Ａ）複合体の全体構造。活性化ヘリックスＨ１２が示される。矢印は、続いて合成されたＰＲＯＴＡＣの伸長を記号で表す。
【図11B】ｈＰＸＲのＬＢＤとのＪＭＶ６９４４の相互作用様式を図示する。（１１Ｂ）ＪＭＶ６９４４の出力経路の拡大、及びｈＰＸＲ－ＬＢＤ／ＳＲ１２８１３複合体の構造との重畳。Ｈ２’ヘリックスの末端、残基２０６～２０９は、リガンドの存在下で再配列する。
【図11C】ｈＰＸＲのＬＢＤとのＪＭＶ６９４４の相互作用様式を図示する。（１１Ｃ）ｈＰＸＲ結合ポケット残基の残基とのＪＭＶ６９４４の相互作用、及びリガンドの電子密度の描写（ｏｍｉｔ型差異マップ）。
【0110】
以下の実施例は、本発明を例証するが、本発明を限定するものではない。使用される出発生成物は、既知であるか、又は既知の手順に従って調製される生成物である。
【0111】
本発明の化合物は、研究の様々な実施例に記載され、本発明の化合物を調製することができる非限定的なプロセスを図示する、合成図に関連して更に理解されるであろう。割合は、特に指示されない限り、重量で表される。
【0112】
実施例１：ＪＭＶ６９４４の合成
【0113】
【化22】
【0114】
ステップ１：Ｎ１－ベンジル－４－ニトロベンゼン－１，２－ジアミン
【0115】
【化23】
【0116】
Ｋ２ＣＯ３（１３．２８ｇ、９６．０８ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５０ｍｌ）中に２－フルオロ－５－ニトロアニリン（５ｇ、３２．０３ｍｍｏｌ）及びベンジルアミン（７．０１ｍｌ、６４．０５ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、１００℃で２４時間撹拌される。反応媒体が、酢酸エチル／Ｈ２Ｏ混合物中で希釈される。有機相が、水、１Ｎ ＫＨＳＯ４、飽和ＮａＣｌで連続的に洗浄され、硫酸マグネシウム上で乾燥させられる。蒸発後、生成物が、ジエチルエーテル中で粉砕され、排出される。化合物１ Ｎ１－ベンジル－４－ニトロベンゼン－１，２－ジアミンが、７．５ｇの質量を有する黄色固体の形態で得られる（９６％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ２４４．１。
【0117】
ステップ２：Ｎ－｛２－［４－（１－ベンジル－５－ニトロ－１Ｈ－１，３－ベンゾジ
アゾール－２－イル）ブトキシ］エチル｝カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル
アゾール－２－イル）ブトキシ］エチル｝カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル
【0118】
【化24】
【0119】
ＴＦＡ（０．９１ｍｌ、１２．２８ｍｍｏｌ）が、トルエン／ＤＭＦ（９／１）混合物（４５ｍｌ／５ｍｌ）中にＮ１－ベンジル－４－ニトロベンゼン－１，２－ジアミン（０．７４７ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）及びＮ－［８－（１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾール－１－イル）－８－オキソオクチル］カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（１．６３ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、６０℃で６時間撹拌される。反応媒体が、室温まで、次いで、０℃まで冷却される。固体が、排出され、次いで、ジエチルエーテルで２回洗浄される。粉末が、酢酸に溶解され、１００℃まで１８時間加熱される。蒸発後、化合物２ Ｎ－｛２－［４－（１－ベンジル－５－ニトロ－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－２－イル）ブトキシ］エチル｝カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルが、０．５５ｇの黄色の油の形態で得られる（３０％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ５８９．２。
【0120】
ステップ３：Ｎ－［７－（５－アミノ－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－２－イル）ヘプチル］カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル
【0121】
【化25】
【0122】
ＳｎＣｌ２（１．２ｇ、６．３４ｍｍｏｌ）が、エタノール（３０ｍｌ）中にＮ－｛２－［４－（１－ベンジル－５－ニトロ－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－２－イル）ブトキシ］エチル｝カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（０．７５ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、８０℃で２時間撹拌される。反応媒体が、酢酸エチル／ＮａＨＣＯ３の混合物中で希釈され、セライトを通して濾過される。有機相が、回収され、ＭｇＳ０４上で乾燥させられる。蒸発後、化合物３ Ｎ－［７－（５－アミノ－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－２－イル）ヘプチル］カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルが、０．５５ｇの黄色粉末の形態で得られる（収率７７％）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ５５９．３。
【0123】
ステップ４：Ｎ－［２－（７－アミノヘプチル）－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－５－イル］－２，４，６－トリメチルベンゼン－１－スルホンアミド
【0124】
【化26】
【0125】
１分量当たり２－メシチレンスルホニルクロリド（０．１６６ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）が、０℃でピリジン／ＤＣＭ（１／１）混合物（５ｍｌ／５ｍｌ）中にＮ－［７－（５－アミノ－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－２－イル）ヘプチル］カルバミン酸（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（０．３８６ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温にされ、１８時間撹拌される。ジエチルアミン（２ｍｌ）が、反応媒体に添加され、２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、０．２０１ｇの黄色粉末が得られる（５６％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ５１９．４。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １０．５３（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｍ，３Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．９２Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｍ，４Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝６．８１Ｈｚ，２Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝１．７９，８．８８Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｓ，２Ｈ），５．６３（ｓ，２Ｈ），３．０８（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．５８（ｓ，６Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），１．６６（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．２６（ｍ，６Ｈ）。
【0126】
１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １５５．３，１４２．７，１３９．２，１３５．８，１３５．４，１３３．９，１３２．３，１２９．４，１２９．３，１２９．３，１２８．５，１２７．３，１１７．７，１１３．７，４７．７，３９．４，３９．２，２８．６，２８．４，２７．３，２６．５。
【0127】
実施例２：ＪＭＶ７０４８の合成
【0128】
【化27】
【0129】
ステップ１：２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－フルオロイソインドール－１，３－ジオン
【0130】
【化28】
【0131】
酢酸（５０ｍｌ）中に４－フルオロフタル酸無水物（２．４３ｇ、１４．６３ｍｍｏｌ）及び３－アミノピペリジン－２，６－ジオン（２．３８ｇ、１４．６３ｍｍｏｌ）並びに酢酸ナトリウム（２．４ｇ、２９．２６ｍｍｏｌ）を含有する反応媒体が、１００℃まで２４時間加熱される。室温まで冷却した後、水（１５０ｍＬ）を反応混合物に添加し、混合物を排出し、エーテルで数回洗浄する。５０℃で一晩デシケーターに入れ、化合物１，２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－フルオロイソインドリン－１，３－ジオンが、４ｇの質量を有する桃色固体の形態で得られる（収率９９％）ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ２７７．２。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．１５（ｓ，１Ｈ），８．０３－８．００（ｄｄ，Ｊ＝４．５９，８．０２Ｈｚ，１Ｈ），７．８７－７．８５（ｄｄ，Ｊ＝２．２９，８．０２Ｈｚ，１Ｈ），７．７５－７．７１（ｔ，Ｊ＝２．２９，４．５９，８．０２Ｈｚ，１Ｈ），５．１９－５．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．５１，１３．０３，１Ｈ），２．９４－２．８７（ｍ，１Ｈ），２．６４－２．５９（ｍ，１Ｈ），２．５８－２．５１（ｍ，１Ｈ），２．１０－２．０５（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ
ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １７３．２，１７３．２，１７０．２，１７０．１，１６７．４，１６６．６，１６６．６，１６６．３，１６５．４，１３４．
７，１３４．６，１２７．９，１２６．７，１２６．７，１２２．３，１２２．１，１１２．０，１１１．８，４９．６，３１．３，２２．４。
ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １７３．２，１７３．２，１７０．２，１７０．１，１６７．４，１６６．６，１６６．６，１６６．３，１６５．４，１３４．
７，１３４．６，１２７．９，１２６．７，１２６．７，１２２．３，１２２．１，１１２．０，１１１．８，４９．６，３１．３，２２．４。
【0132】
ステップ２：４－（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソインドリン－５－イル）ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル
【0133】
【化29】
【0134】
化合物２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－フルオロイソインドリン－１，３－ジオン（５００ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）が、室温でＮＭＰ（７ｍｌ）に溶解される。ＤＩＥＡ（０．８９ｍｌ、５．４３ｍｍｏｌ）及び１－ピペラジン－カルボン酸ｔ－ブチル（３７０．９ｍｇ、１．９９ｍｍｏｌ）が添加され、混合物が１４０℃で２４時間撹拌される。溶液が、水（１００ｍｌ）中で希釈される。酢酸エチルで２回抽出し、有機相が飽和ＮａＣｌで洗浄され、硫酸マグネシウム上で乾燥させられる。蒸発後、得られた油が、石油エーテル／酢酸エチル溶離液（３／１）を用いてシリカゲル上で精製される。４－（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソインドリン－５－イル）ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチルが、６５５ｍｇの質量を有する黄色固体の形態で得られる（収率８２％）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４４３．１。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０９（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝２．０８Ｈｚ，１Ｈ），７．２６－７．２４（ｄｄ，Ｊ＝２．０８，８．５６Ｈｚ，１Ｈ），５．０８（ｍ，１Ｈ），３．４７（ｓ，８Ｈ），２．９３－２．８６（ｍ，１Ｈ），２．６１－２．４８（ｍ，２Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １７３．２，１７０．５，１６７．９，１６７．４，１５５．４，１５４．３，１３４．３，１２５．３，１１９．０，１１８．３，１０８．５，７９．６，４９．２，４７．０，３１．４，２８．５，２２．６。
【0135】
ステップ３：２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－（ピペラジン－１－イル）イソインドリン－１，３－ジオン
【0136】
【化30】
【0137】
４－（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソインドリン－５－イル）ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（４６４ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）化合物が、ジオキサン（４ｍｌ）中のＨＣｌの４Ｎ溶液に溶解され、反応媒体が、室温で２時間撹拌され、次いで、濃縮され、エーテルで粉砕される。固体が、３２３ｍｇの質量を有する黄色粉末の形態で得られる（９０％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ３４３．１
。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０９（ｓ，１Ｈ），９．７１（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．６１Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝２．０８Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝２．０８，８．６１Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｍ，４Ｈ），３．１９（ｍ，４Ｈ），２．８９（ｍ，１Ｈ），２．６１－２．４８（ｍ，２Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １７３．２，１７０．４，１６７．８，１６７．３，１５４．８，１３４．２，１２５．４，１２０．０，１１９．０，１０９．２，４９．２，４４．５，４２．４，３１．４，２２．６。
。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０９（ｓ，１Ｈ），９．７１（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．６１Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝２．０８Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝２．０８，８．６１Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｍ，４Ｈ），３．１９（ｍ，４Ｈ），２．８９（ｍ，１Ｈ），２．６１－２．４８（ｍ，２Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １７３．２，１７０．４，１６７．８，１６７．３，１５４．８，１３４．２，１２５．４，１２０．０，１１９．０，１０９．２，４９．２，４４．５，４２．４，３１．４，２２．６。
【0138】
ステップ４：６－（４－（２－（２，６－ジオキソピペリド－３－イル）－１．３－ジオキソインドリン－５－イル）ピペラジン－１－イル）ヘキサン酸
【0139】
【化31】
【0140】
化合物２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－（ピペラジン－１－イル）イソインドリン－１，３－ジオン（１００ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）が、アセトニトリル（５ｍｌ）に溶解される。６－ブロモヘキサン酸（１５２ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．１９３ｍｌ、１．１６ｍｍｏｌ）が添加され、混合物が６０℃で２４時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、９０ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（６５％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４５７．３。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １２．０８（ｍ，１Ｈ），１１．０４（ｓ，１Ｈ），９．７３（ｍ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１．９０Ｈｚ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１．９０，８．５０Ｈｚ），５．１０（ｍ，１Ｈ），４．２３（ｍ，２Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｍ，４Ｈ），２．９０（ｍ，１Ｈ），２．５９（ｍ，２Ｈ），２．２５（ｍ，２Ｈ），２．０４（ｍ，１Ｈ），１．６９（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，２Ｈ），１．３３（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １７４．７，１７３．２，１７０．４，１６７．８，１６７．３，１５４．６，１３４．２，１２５．４，１２０．４，１１９．２，１０９．４，５５．７，５０．７，４９．３，４４．８，３３．７，３１．４，２５．９，２４．３，２３．４。
【0141】
ステップ５：ＪＭＶ７０４８
【0142】
【化32】
【0143】
ＢＯＰ（５２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にＮ－［２－（７－アミノヘプチル）－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－５－イル］－２，４，６－トリメチルベンゼン－１－スルホンアミド（４１ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）（実施例１、ＪＭＶ６９４４）、６－（４－（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドール－５－イル）ピペラジン－１－イル）ヘキサン酸（３４ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．０３９ｍｌ、０．２３７ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、５２ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（６６％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ９５８．０。１Ｈ
ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０２（ｓ，１Ｈ），１０．４２（ｍ，１Ｈ），９．７８（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４９Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．２０（ｍ，５Ｈ），７．１１（ｍ，２Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．０１，８．８９Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｓ，２Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝５．５３，１３．１４Ｈｚ，１Ｈ）。
ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０２（ｓ，１Ｈ），１０．４２（ｍ，１Ｈ），９．７８（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４９Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．２０（ｍ，５Ｈ），７．１１（ｍ，２Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．０１，８．８９Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｓ，２Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝５．５３，１３．１４Ｈｚ，１Ｈ）。
【0144】
実施例３：ＪＭＶ７５０５の合成
ステップ１：７－｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝ヘプタン酸
ステップ１：７－｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝ヘプタン酸
【0145】
【化33】
【0146】
化合物２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－（ピペラジン－１－イル）イソインドリン－１，３－ジオン（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）（実施例２、ステップ３）が、アセトニトリル（５ｍｌ）に溶解される。７－ブロモヘプタン酸（１５５ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．１９３ｍｌ、１．１６ｍｍｏｌ）が添加され、混合物が６０℃で２４時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、９３ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（６５％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４７１．３。
【0147】
ステップ２：
【0148】
【化34】
【0149】
ＢＯＰ（５２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にＮ－［２－（７－アミノヘプチル）－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－５－イル］－２，４，６－トリメチルベンゼン－１－スルホンアミド（４１ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）（実施例１、ＪＭＶ６９４４）、６－（４－（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドール－５－イル）ピペラジン－１－イル）ヘキサン酸（３４ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．０３９ｍｌ、０．２３７ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、５２ｍｇの質量を有する白色粉末が得られる（収率６８％）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ９７１．５。１Ｈ
ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０２（ｓ，１Ｈ），１０．４２（ｍ，１Ｈ），９．７８（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４９Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．２０（ｍ，５Ｈ），７．１１（ｍ，２Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．０１，８．８９Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｓ，２Ｈ），５．５３（ｓ，２Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝５．５３，１３．１４Ｈｚ，１Ｈ）。
ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０２（ｓ，１Ｈ），１０．４２（ｍ，１Ｈ），９．７８（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４９Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．２０（ｍ，５Ｈ），７．１１（ｍ，２Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．０１，８．８９Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｓ，２Ｈ），５．５３（ｓ，２Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝５．５３，１３．１４Ｈｚ，１Ｈ）。
【0150】
実施例４：ＪＭＶ７５０６の合成
ステップ１：８－｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリド－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝オクタン酸
ステップ１：８－｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリド－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝オクタン酸
【0151】
【化35】
【0152】
２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－（ピペラジン－１－イル）イソインドリン－１，３－ジオン化合物（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）（実施例２、ステップ３）が、アセトニトリル（５ｍｌ）に溶解される。８－ブロモオクタン酸（１６０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．１９３ｍｌ、１．１６ｍｍｏｌ）が添加され、混合物が６０℃で２４時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、１０１ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（６７％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４８５．６。
【0153】
ステップ２：
【0154】
【化36】
【0155】
ＢＯＰ（５２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にＮ－［２－（７－アミノヘプチル）－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－５－イル］－２，４，６－トリメチルベンゼン－１－スルホンアミド（４１ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）（実施例１、ＪＭＶ６９４４）、６－（４－（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドール－５－イル）ピペラジン－１－イル）オクタン酸（３６ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．０３９ｍｌ、０．０２３ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、４５ｍｇの質量を有する白色粉末が得られる（６１％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ９８５．５。
【0156】
１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．０２（ｓ，１Ｈ），１０．４２（ｍ，１Ｈ），９．７８（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４９Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．２０（ｍ，５Ｈ），７．１１（ｍ，２Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．０１，８．８９Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｓ，２Ｈ），５．５４（ｓ，４Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝５．５３，１３．１４Ｈｚ，１Ｈ）。
【0157】
実施例５：ＪＭＶ７９６５の合成
【0158】
【化37】
【0159】
ステップ１：４－（｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝メチル）ピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル
【0160】
【化38】
【0161】
３ｍｌのＭｅＯＨが、ＤＣＥ中に２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－（ピペラジン－１－イル）イソインドリン－１，３－ジオン（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）（実施例２、ステップ３）及び４－ホルミルピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１１２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で３０分間撹拌される。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを少しずつ添加し、反応媒体を室温で１８時間撹拌する。反応媒体を濃縮し、分取ＨＰＬＣを実行する。凍結乾燥後、８５ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（収率５３％）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ
５４０．２。
５４０．２。
【0162】
ステップ２：２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－｛４－［（ピペリジン－４－イル）メチル］ピペラジン－１－イル｝－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン
【0163】
【化39】
【0164】
４－（｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインド－５－イル］ピペラジン－１－イル｝メチル）ピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル化合物（１００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）が、ＤＣＭ（５０ｍｌ）に溶解される。ＴＦＡ（５ｍｌ）が、反応媒体に一滴ずつ添加され、室温で５時間撹拌される。溶液が減圧下で濃縮される。得られた油（７５ｍｇ、収率９２％）が、そのままステップ３で使用される。ＥＳＩ：Ｍ＋ＦＩ ４４０．３。
【0165】
ステップ３：２－［４－（｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインド－５－イル］ピペラジン－１－イル｝メチル）ピペリジン－１－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
【0166】
【化40】
【0167】
化合物２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－｛４－［（ピペリジン－４－イル）メチル］ピペラジン－１－イル｝－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン（１２８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）が、ＤＩＥＡ（０．１４ｍｌ、０．８８ｍｍｏｌ）の存在下でＤＣＭに溶解される。ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．０４３ｍｌ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１８時間撹拌する。反応媒体を濃縮し、分取ＨＰＬＣを実行する。凍結乾燥後、８５ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（収率５３％）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ５５４．４。
【0168】
ステップ４：２－［４－（｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－
１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインド－５－イル］ピペラジン－１－イル｝メチル）ピペリジン－１－イル］酢酸
１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインド－５－イル］ピペラジン－１－イル｝メチル）ピペリジン－１－イル］酢酸
【0169】
【化41】
【0170】
２－［４－（｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインド－５－イル］ピペラジン－１－イル｝メチル）ピペリジン－１－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル化合物（８３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）が、ＤＣＭ（２５ｍｌ）に溶解される。ＴＦＡ（５ｍｌ）が、反応媒体に一滴ずつ添加され、室温で５時間撹拌される。溶液が減圧下で濃縮される。得られた油（７０ｍｇ、収率９３％）が、そのままステップ３で使用される。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４９８．３。
【0171】
ステップ５：
【0172】
【化42】
【0173】
ＢＯＰ（２７ｍｇ、０．０６０３ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にＮ－［２－（７－アミノヘプチル）－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－５－イル］－２，４，６－トリメチルベンゼン－１－スルホンアミド（２１ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ）（実施例１、ＪＭＶ６９４４）、２－［４－（｛４－［２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝メチル）ピペリジン－１－イル］酢酸（２０ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．０２０ｍｌ、０．１２ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、２５ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（６２％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ９９８．３。
【0174】
実施例６：ＪＭＶ７６０５の合成
【0175】
【化43】
【0176】
ステップ１：４－｛４－［（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）カルバモイル］フェニル｝ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル
【0177】
【化44】
【0178】
ＢＯＰ（１．１１ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５０ｍｌ）中に４－［４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペラジノ］安息香酸（０．７７５ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）、３－アミノピペリジン－２，６－ジオンＨＣｌ（０．５０ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（１．２５ｍｌ、７．５９ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。
【0179】
反応媒体が、室温で２時間撹拌される。水を反応媒体に添加し、酢酸エチルで抽出する。有機相を１Ｎ ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌで連続的に洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。０．４ｇの質量を有する白色粉末が得られる（３８％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４１７．３。
【0180】
ステップ２：Ｎ－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－４－（ピペラジン－１－イル）ベンズアミド
【0181】
【化45】
【0182】
４－｛４－［（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）カルバモイル］フェニル｝ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．４ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）化合物が、ジオキサン（６ｍｌ）中のＨＣｌの４Ｎ溶液に溶解され、反応媒体が、室温で２時間撹拌され、次いで、濃縮され、エーテルで粉砕される。固体が、０．２８５ｍｇの質量を有する白色粉末の形態で得られる（９４％収率）。
【0183】
反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、４５ｍｇの質量を有する白色粉末が得られる（５２％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ３１７．３。
【0184】
ステップ３：７－（４－｛４－［（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）カルバモイル］フェニル｝ピペラジン－１－イル）ヘプタン酸
【0185】
【化46】
【0186】
Ｎ－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－４－（ピペラジン－１－イル）ベンズアミド化合物（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解される。７－ブロモヘプタン酸（６６ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．０７８ｍｌ、０．４７ｍｍｏｌ）が添加され、混合物が１００℃で２４時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、３８ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（５５％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４４５．１。
【0187】
ステップ４：
【0188】
【化47】
【0189】
ＢＯＰ（４４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にＮ－［２－（７－アミノヘプチル）－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－５－イル］－２，４，６－トリメチルベンゼン－１－スルホンアミド（３５ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）（
実施例１、ＪＭＶ６９４４）、７－（４－｛４－［（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）カルバモイル］フェニル｝ピペラジン－１－イル）ヘプタン酸（３０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．０３３ｍｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、４１ｍｇの質量を有する白色粉末が得られる（６５％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ９４５．８。
実施例１、ＪＭＶ６９４４）、７－（４－｛４－［（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）カルバモイル］フェニル｝ピペラジン－１－イル）ヘプタン酸（３０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．０３３ｍｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、４１ｍｇの質量を有する白色粉末が得られる（６５％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ９４５．８。
【0190】
実施例７：ＪＭＶ７１５９の合成（比較例）
【0191】
【化48】
【0192】
ステップ１：５－フルオロ－２－（１－メトキシ－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン
【0193】
【化49】
【0194】
化合物２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－フルオロイソインドリン－１，３－ジオン（２５０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）が、無水ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解され、反応媒体が、撹拌され、０℃にされる。ＮａＨを少しずつ添加し、２０分間撹拌する。ヨウ化メチルを添加し、２時間撹拌する。ＮＨ４Ｃｌ溶液で反応を停止する。酢酸エチルで抽出し、有機相を飽和ＮａＣｌで２回洗浄する。ＭｇＳ０４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。化合物５－フルオロ－２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオンが、２５３ｍｇの質量を有する白色粉末の形態で得られる（９６％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ２９１．１。
【0195】
ステップ２：４－［２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル
【0196】
【化50】
【0197】
化合物５－フルオロ－２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン（２５０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）が、室温でＮＭＰ（４ｍｌ）に溶解される。ＤＩＥＡ（０．４２ｍｌ、２．５８ｍｍｏｌ）及び１－ピペラジン－カルボン酸ｔ－ブチル（１７６ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）が添加され、混合物が１４０℃で２４時間撹拌される。溶液が、水（１００ｍｌ）中で希釈される。酢酸エチルで２回抽出し、有機相が飽和ＮａＣｌで洗浄され、硫酸マグネシウム上で乾燥させられる。蒸発後、得られた油が、石油エーテル／酢酸エチル溶離液（３／１）を用いてシリカゲル上で精製される。４－［２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリド－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチルが、３３８ｍｇの質量を有する黄色固体の形態で得られる（８６％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４５７．３。
【0198】
ステップ３：２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－（ピペラジン－１－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン
【0199】
【化51】
【0200】
４－［２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２５０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）化合物が、ジオキサン（４ｍｌ）中のＨＣｌの４Ｎ溶液に溶解され、反応媒体が、室温で２時間撹拌され、次いで、濃縮され、エーテルで粉砕される。固体が、１７５ｍｇの質量を有する黄色粉末の形態で得られる（９０％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ３５７．３。
【0201】
ステップ４：６－｛４－［２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝ヘキサン酸
【0202】
【化52】
【0203】
化合物２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－５－（ピペラジン－１－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）が、アセトニトリル（５ｍｌ）に溶解される。６－ブロモヘキサン酸（１３６ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．１３９ｍｌ、０．８４ｍｍｏｌ）が添加され、混合物が６０℃で２４時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、８５ｍｇの質量を有する黄色粉末が得られる（６５％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ４７１．３。
【0204】
ステップ５：
【0205】
【化53】
【0206】
ＢＯＰ（３６ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ（５ｍｌ）中にＮ－［２－（７－アミノヘプチル）－１－ベンジル－１Ｈ－１，３－ベンゾジアゾール－５－イル］－２，４，６－トリメチルベンゼン－１－スルホンアミド（２８ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）（実施例１、ＪＭＶ６９４４）、６－｛４－［２－（１－メチル－２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－５－イル］ピペラジン－１－イル｝ヘキサン酸（２６ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．１６５ｍｌ、０．１６５ｍｍｏｌ）を含有する溶液に添加される。反応媒体が、室温で２時間撹拌される。溶液が、減圧下で濃縮される。得られた油が、分取ＨＰＬＣによって精製される。凍結乾燥後、３０ｍｇの質量を有する白色粉末が得られる（５６％収率）。ＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ９７１．６。
【0207】
実施例８：生化学及び結晶学
ヒトＰＸＲ受容体リガンド結合ドメイン（human PXR receptor ligand binding domain、ｈＰＸＲ－ＬＢＤ、残基１３０～４３４）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＤＥ３細菌において組換えタンパク質の形態で産生した。タンパク質を、アフィニティーカラム上で、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。濃縮後、ｈＰＸＲ－ＬＢＤをＪＭＶ６９４４リガンドの存在下で結晶化した。ｈＰＸＲ－ＬＢＤ／ＪＭＶ６９４４複合体の構造を、分子置換法による放射線結晶学によって決定し、次いで、電子密度（ＥＲＦシンクロトロン、Ｇｒｅｎｏｂｌｅにおいて収集された回折データ）に基づいて再構築及び精密化した。その構造が、図１１に示される。Ａでは、複合体の構造全体が、ＪＭＶ６９４４の結合様式を示す。ＪＭＶ６９４４の独創性は、親分子ＪＭＶ６８４５に付加され
た伸長の位置及びタンパク質ドメインから退出するためのその経路にある。全てがアンタゴニストリガンドの修飾に基づく、他の核内受容体で知られているＰＲＯＴＡＣとは異なり、ＪＭＶ６８４５アゴニスト上にグラフトされた伸長は、Ｈ１２ヘリックスに向かって伸長しないが、その代わりに、最終的にＬＢＤの外部表面に到達するために、Ｈ２’、Ｈ６及びＨ７ヘリックスとＳ１鎖との間で反対方向を指す。（Ｂによって囲まれた）アルキル／ＮＨアームの存在は、このリガンドが結合ポケットから抽出され、表面残基Ｃ２０７（Ｃ）と特異的に相互作用することを可能にする、Ｈ２’末端の立体構造変化を誘導する。リガンドの結合ポケット内で、ＪＭＶ６９４４はまた、Ｈ４０７及びＳ２４７との水素結合、並びにＬ４１１及びＦ４２８との疎水性相互作用、並びに「π－トラップ」領域の残基（Ｆ２８８、Ｗ２９９、Ｙ３０６）との疎水性相互作用を確立する。
ヒトＰＸＲ受容体リガンド結合ドメイン（human PXR receptor ligand binding domain、ｈＰＸＲ－ＬＢＤ、残基１３０～４３４）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＤＥ３細菌において組換えタンパク質の形態で産生した。タンパク質を、アフィニティーカラム上で、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。濃縮後、ｈＰＸＲ－ＬＢＤをＪＭＶ６９４４リガンドの存在下で結晶化した。ｈＰＸＲ－ＬＢＤ／ＪＭＶ６９４４複合体の構造を、分子置換法による放射線結晶学によって決定し、次いで、電子密度（ＥＲＦシンクロトロン、Ｇｒｅｎｏｂｌｅにおいて収集された回折データ）に基づいて再構築及び精密化した。その構造が、図１１に示される。Ａでは、複合体の構造全体が、ＪＭＶ６９４４の結合様式を示す。ＪＭＶ６９４４の独創性は、親分子ＪＭＶ６８４５に付加され
た伸長の位置及びタンパク質ドメインから退出するためのその経路にある。全てがアンタゴニストリガンドの修飾に基づく、他の核内受容体で知られているＰＲＯＴＡＣとは異なり、ＪＭＶ６８４５アゴニスト上にグラフトされた伸長は、Ｈ１２ヘリックスに向かって伸長しないが、その代わりに、最終的にＬＢＤの外部表面に到達するために、Ｈ２’、Ｈ６及びＨ７ヘリックスとＳ１鎖との間で反対方向を指す。（Ｂによって囲まれた）アルキル／ＮＨアームの存在は、このリガンドが結合ポケットから抽出され、表面残基Ｃ２０７（Ｃ）と特異的に相互作用することを可能にする、Ｈ２’末端の立体構造変化を誘導する。リガンドの結合ポケット内で、ＪＭＶ６９４４はまた、Ｈ４０７及びＳ２４７との水素結合、並びにＬ４１１及びＦ４２８との疎水性相互作用、並びに「π－トラップ」領域の残基（Ｆ２８８、Ｗ２９９、Ｙ３０６）との疎水性相互作用を確立する。
【0208】
実施例９：生物学的結果
９．１ 前駆ＰＲＯＴＡＣ／ＰＸＲ親和性の測定
ＪＭＶ６９４４（前駆ＰＲＯＴＡＣ）とＰＸＲリガンド結合ドメイン（ligand binding
domain、ＬＢＤ）との間の結合親和性を、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ ＴＲ－ＦＲＥＴ
ＰＸＲ競合結合アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＦＲＥＴによって定量化した。分子を、蛍光参照リガンドの存在下でＰＸＲ ＬＢＤとともに室温で１：３０時間インキュベートした。ＰＨＥＲＡ－Ｓｔａｒ装置（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）上で３３７ｎｍにおける励起後の５２０ｎｍ及び４９５ｎｍにおける発光を読み取ることによって、前駆ＰＲＯＴＡＣ又はＰＸＲ ＳＲ１２８１３リガンドによって引き起こされた蛍光リガンドの変位を測定した。結果が、図１に図示され、これは、分子ＪＭＶ６９４４が１８．３８ｎｍの親和性を有するＰＸＲリガンドであることを示す。
９．１ 前駆ＰＲＯＴＡＣ／ＰＸＲ親和性の測定
ＪＭＶ６９４４（前駆ＰＲＯＴＡＣ）とＰＸＲリガンド結合ドメイン（ligand binding
domain、ＬＢＤ）との間の結合親和性を、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ ＴＲ－ＦＲＥＴ
ＰＸＲ競合結合アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＦＲＥＴによって定量化した。分子を、蛍光参照リガンドの存在下でＰＸＲ ＬＢＤとともに室温で１：３０時間インキュベートした。ＰＨＥＲＡ－Ｓｔａｒ装置（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）上で３３７ｎｍにおける励起後の５２０ｎｍ及び４９５ｎｍにおける発光を読み取ることによって、前駆ＰＲＯＴＡＣ又はＰＸＲ ＳＲ１２８１３リガンドによって引き起こされた蛍光リガンドの変位を測定した。結果が、図１に図示され、これは、分子ＪＭＶ６９４４が１８．３８ｎｍの親和性を有するＰＸＲリガンドであることを示す。
【0209】
９．２ ＰＸＲ（レポーター遺伝子）の転写活性に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
ＰＸＲタンパク質をコードする発現ベクター、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下に置かれたルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＰＸＲ標的遺伝子）、及びシグナルの正規化のためにＣＭＶプロモーターの制御下に置かれたＧＦＰタンパク質をコードする発現カセットで安定的にトランスフェクトされたＬＳ１７４Ｔ細胞の処置。細胞を、５μＭの分子ＪＭＶ６９４４（前駆ＰＲＯＴＡＣ）、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７６０５、並びにリファンピシン（５μＭ、ＰＸＲリガンド）で４８時間処置した。処置の終了時に、ＰＸＲの転写活性が、ＰＨＥＲＡ－Ｓｔａｒ装置（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）上で測定されたルシフェラーゼ／ＧＦＰシグナルの比によって測定される。図２は、前駆ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ６９４４及びリファンピシンのみがＰＸＲの転写活性を活性化することが可能であることを示す。
ＰＸＲタンパク質をコードする発現ベクター、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下に置かれたルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＰＸＲ標的遺伝子）、及びシグナルの正規化のためにＣＭＶプロモーターの制御下に置かれたＧＦＰタンパク質をコードする発現カセットで安定的にトランスフェクトされたＬＳ１７４Ｔ細胞の処置。細胞を、５μＭの分子ＪＭＶ６９４４（前駆ＰＲＯＴＡＣ）、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７６０５、並びにリファンピシン（５μＭ、ＰＸＲリガンド）で４８時間処置した。処置の終了時に、ＰＸＲの転写活性が、ＰＨＥＲＡ－Ｓｔａｒ装置（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）上で測定されたルシフェラーゼ／ＧＦＰシグナルの比によって測定される。図２は、前駆ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ６９４４及びリファンピシンのみがＰＸＲの転写活性を活性化することが可能であることを示す。
【0210】
９．３ ＰＸＲの転写活性（ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現）に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５μＭの分子ＪＭＶ６９４４（前駆ＰＲＯＴＡＣ）、ＪＭＶ７０４８、ＪＭＶ７５０５、又はＪＭＶ５１５９（ＣＮＢＲリガーゼユビキチンリガンド上のメチル基の付加後のＪＭＶ７０４８の不活性同等物）で、５μＭ最終量におけるリファンピシン（ＰＸＲリガンド）の存在又は非存在下で４８時間処置した。細胞の溶解及び全ＲＮＡの精製（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ）後に、相補的ＤＮＡを調製した（６つのヌクレオチドのランダムプライマーの存在下でのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ並びにＲＰＬＯ及びアクチンハウスキーピング遺伝子の発現を、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下でＬＣ４８０装置（Ｒｏｃｈｅ）上でＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。相対発現レベルを、ＲＱ＝相対定量化＝２－ΔΔＣｔ法に従って計算し、未処置細胞が１に設定された較正物として機能した。図３Ａ及び図３Ｂは、前駆ＰＲＯＴＡＣ及び不活性化ＰＲＯＴＡＣ（ＪＭＶ７１５９）がＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの発現に対する相加的効果を有する場合、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５が、リファンピシンによって媒介される
ＣＹＰ３Ａ４の誘導を著しく低減することを示す。
ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５μＭの分子ＪＭＶ６９４４（前駆ＰＲＯＴＡＣ）、ＪＭＶ７０４８、ＪＭＶ７５０５、又はＪＭＶ５１５９（ＣＮＢＲリガーゼユビキチンリガンド上のメチル基の付加後のＪＭＶ７０４８の不活性同等物）で、５μＭ最終量におけるリファンピシン（ＰＸＲリガンド）の存在又は非存在下で４８時間処置した。細胞の溶解及び全ＲＮＡの精製（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ）後に、相補的ＤＮＡを調製した（６つのヌクレオチドのランダムプライマーの存在下でのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ並びにＲＰＬＯ及びアクチンハウスキーピング遺伝子の発現を、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下でＬＣ４８０装置（Ｒｏｃｈｅ）上でＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。相対発現レベルを、ＲＱ＝相対定量化＝２－ΔΔＣｔ法に従って計算し、未処置細胞が１に設定された較正物として機能した。図３Ａ及び図３Ｂは、前駆ＰＲＯＴＡＣ及び不活性化ＰＲＯＴＡＣ（ＪＭＶ７１５９）がＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡの発現に対する相加的効果を有する場合、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５が、リファンピシンによって媒介される
ＣＹＰ３Ａ４の誘導を著しく低減することを示す。
【0211】
９．４ ＰＸＲの転写活性（ＣＹＰ３Ａ４の発現）に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５ｍＭ最終量におけるリファンピシン（ＰＸＲリガンド）の存在又は非存在下で、５ｍＭのＪＭＶ７０４８で４８時間処置した。細胞の溶解（ＲＩＰＡ＋抗プロテアーゼ）後、タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９０μｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＣＹＰ３Ａ４に対する抗体（ｓｃ－５３８５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。シグナルの強度をカメラ（ＢｉｏＲａｄ ＭＰ Ｔｏｕｃｈ）によって測定した。図４Ａ及び図４Ｂは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５が、リファンピシンによって媒介されるＣＹＰ３Ａ４酵素の誘導を低減することを示す。
ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５ｍＭ最終量におけるリファンピシン（ＰＸＲリガンド）の存在又は非存在下で、５ｍＭのＪＭＶ７０４８で４８時間処置した。細胞の溶解（ＲＩＰＡ＋抗プロテアーゼ）後、タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９０μｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＣＹＰ３Ａ４に対する抗体（ｓｃ－５３８５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。シグナルの強度をカメラ（ＢｉｏＲａｄ ＭＰ Ｔｏｕｃｈ）によって測定した。図４Ａ及び図４Ｂは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５が、リファンピシンによって媒介されるＣＹＰ３Ａ４酵素の誘導を低減することを示す。
【0212】
９．５ 細胞生存率に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
細胞生存率に対するＰＲＯＴＡＣの効果は、様々な株ＣＲＣ１、ＨＴ２９、及びＬＳ１７４Ｔで試験されている。細胞を固定し、スルホローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ）によってマークする前に、漸増濃度の分子の存在下で７２時間インキュベートした。細胞の洗浄及び溶解後、細胞によって放出される組み込まれた着色剤は、細胞バイオマスに正比例する。それは、９６ウェルプレート分光光度計（Ｔｅｃａｎ）によって５６５ｎＭで測定される。未処置細胞について得られるシグナルは、１００％に設定される。図５Ａは、ＬＳ１７４Ｔ株上のＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８、ＪＭＶ７５０５、及びＪＭＶ７６０５の毒性の非存在を図示する。図５Ｂでは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８が、ＨＴ２９細胞又はＣＲＣ１プロト培養（結腸がんを有する患者に由来する）の生存率に影響を及ぼさないことが分かる。
細胞生存率に対するＰＲＯＴＡＣの効果は、様々な株ＣＲＣ１、ＨＴ２９、及びＬＳ１７４Ｔで試験されている。細胞を固定し、スルホローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ）によってマークする前に、漸増濃度の分子の存在下で７２時間インキュベートした。細胞の洗浄及び溶解後、細胞によって放出される組み込まれた着色剤は、細胞バイオマスに正比例する。それは、９６ウェルプレート分光光度計（Ｔｅｃａｎ）によって５６５ｎＭで測定される。未処置細胞について得られるシグナルは、１００％に設定される。図５Ａは、ＬＳ１７４Ｔ株上のＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８、ＪＭＶ７５０５、及びＪＭＶ７６０５の毒性の非存在を図示する。図５Ｂでは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８が、ＨＴ２９細胞又はＣＲＣ１プロト培養（結腸がんを有する患者に由来する）の生存率に影響を及ぼさないことが分かる。
【0213】
９．６ インビトロウェスタンブロッティングによるＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＰＸＲ分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
ＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣの影響を、ウェスタンブロッティングによって研究した。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５０ｎＭのＰＸＲを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＸＲ：ＮＲ１Ｉ２ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）の非存在若しくは存在下で移植したか、又はＰＲＯＴＡＣで処置した。細胞の溶解（ＲＩＰＡ＋抗プロテアーゼ）後、タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９Ｃ＾ｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＰＸＲに対する抗体（ｓｃ－４８３４０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ－３２２３３、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）、及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。シグナルの強度をカメラ（ＢｉｏＲａｄ ＭＰ Ｔｏｕｃｈ）によって測定した。図６Ａ～図６Ｃは、５μＭにおける２４時間の処置後に、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８、ＪＭＶ７５０５、ＪＭＶ７５０６、ＪＭＶ７６０５、及びＪＭＶ７９６５が、ＪＭＶ７０４８の不活性変異体（すなわち、ＪＭＶ７１５９）とは異なり、ＰＸＲタンパク質の発現レベルを著しく低減することを示す。図６Ｄ及び図６Ｅは、処置時間（３時間の処置後に最大効果に達した）及び使用される濃度（用量に依存して減少し、最大効果が５００ｎＭから観察された）に基づくＰＸＲの発現レベルに対するＪＭＶ７０４８の効果を図示する。
ＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣの影響を、ウェスタンブロッティングによって研究した。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５０ｎＭのＰＸＲを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＸＲ：ＮＲ１Ｉ２ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）の非存在若しくは存在下で移植したか、又はＰＲＯＴＡＣで処置した。細胞の溶解（ＲＩＰＡ＋抗プロテアーゼ）後、タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９Ｃ＾ｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＰＸＲに対する抗体（ｓｃ－４８３４０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ－３２２３３、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）、及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。シグナルの強度をカメラ（ＢｉｏＲａｄ ＭＰ Ｔｏｕｃｈ）によって測定した。図６Ａ～図６Ｃは、５μＭにおける２４時間の処置後に、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８、ＪＭＶ７５０５、ＪＭＶ７５０６、ＪＭＶ７６０５、及びＪＭＶ７９６５が、ＪＭＶ７０４８の不活性変異体（すなわち、ＪＭＶ７１５９）とは異なり、ＰＸＲタンパク質の発現レベルを著しく低減することを示す。図６Ｄ及び図６Ｅは、処置時間（３時間の処置後に最大効果に達した）及び使用される濃度（用量に依存して減少し、最大効果が５００ｎＭから観察された）に基づくＰＸＲの発現レベルに対するＪＭＶ７０４８の効果を図示する。
【0214】
９．７ インビトロウェスタンブロッティングによるＨＥＰＧ２及びＡＳＰＣ１細胞におけるＰＸＲ分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
ＨｅｐＧ２細胞（肝細胞がん、ＡＴＣＣ＃ＨＢ－８０６５（商標））又はＡＳＰＣ１細胞（ヒト膵臓がん細胞株、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１６８２）におけるＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣ（５ｍＭ、２４時間の処置）の効果を、ウェスタンブロッティングによって研究した。細胞の溶解（ＲＩＰＡ＋抗プロテアーゼ）後、タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９０μｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＰＸＲに対する抗体（ｓｃ－４８３４０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ－３２２３３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。図７Ａ及び図７Ｂは、肝臓がん細胞（７Ａ）又は膵臓がん細胞（７Ｂ）におけるＰＸＲの発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５の効果を図示する。
ＨｅｐＧ２細胞（肝細胞がん、ＡＴＣＣ＃ＨＢ－８０６５（商標））又はＡＳＰＣ１細胞（ヒト膵臓がん細胞株、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１６８２）におけるＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣ（５ｍＭ、２４時間の処置）の効果を、ウェスタンブロッティングによって研究した。細胞の溶解（ＲＩＰＡ＋抗プロテアーゼ）後、タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９０μｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＰＸＲに対する抗体（ｓｃ－４８３４０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ－３２２３３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。図７Ａ及び図７Ｂは、肝臓がん細胞（７Ａ）又は膵臓がん細胞（７Ｂ）におけるＰＸＲの発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５の効果を図示する。
【0215】
９．８ ＰＸＲ分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果についてのプロテアソーム経路の重要性
ＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣの効果におけるプロテアソーム経路の関与を、ウェスタンブロッティングによって研究した。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、ＣＮＢＲユビキチンリガーゼ（ＭＬＮ４９２４）又はプロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）の存在又は非存在下で、ＪＭＶ７０４８で２４時間処置した。図８Ａ及び図８Ｂは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８によって誘導されたＰＸＲタンパク質の発現レベルの減少についてのプロテアソーム経路の重要性を確認した。ＪＭＶ７０４８によって誘導されたＰＸＲの発現レベルの減少が、ＣＲＢＮユビキチンリガーゼ阻害剤（ＭＬＮ４９２４、図８Ａ）又は２６Ｓプロテアソームの阻害剤（ボルテゾミブ、Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ、Ｂｚ、図８Ｂ）によって逆戻りされる一方で、ＪＭＶ７０４８の変異体（すなわち、ＣＮＢＲの動員を可能にしないＪＭＶ７１５９）は、ＰＸＲの発現レベルの減少を引き起こさない。
ＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣの効果におけるプロテアソーム経路の関与を、ウェスタンブロッティングによって研究した。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、ＣＮＢＲユビキチンリガーゼ（ＭＬＮ４９２４）又はプロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）の存在又は非存在下で、ＪＭＶ７０４８で２４時間処置した。図８Ａ及び図８Ｂは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８によって誘導されたＰＸＲタンパク質の発現レベルの減少についてのプロテアソーム経路の重要性を確認した。ＪＭＶ７０４８によって誘導されたＰＸＲの発現レベルの減少が、ＣＲＢＮユビキチンリガーゼ阻害剤（ＭＬＮ４９２４、図８Ａ）又は２６Ｓプロテアソームの阻害剤（ボルテゾミブ、Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ、Ｂｚ、図８Ｂ）によって逆戻りされる一方で、ＪＭＶ７０４８の変異体（すなわち、ＣＮＢＲの動員を可能にしないＪＭＶ７１５９）は、ＰＸＲの発現レベルの減少を引き起こさない。
【0216】
９．９ インビボウェスタンブロッティングによるＰＸＲ分解に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
ＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣの効果を、ＳＣＩＤマウスにおけるＬＳ１７４Ｔ細胞の異種移植片からのウェスタンブロッティングによってインビボで研究した。腫瘍が１００ｍｍ３に達すると、１０匹のマウスを、５％ＥｔＯＨ溶媒、Ｄ５Ｗ中の２０％ソルトール、又はＰＲＯＴＡＣ（２５ｍｇ／ｋｇ）でＩ．Ｖ．によって２４時間毎に４日間処置した。マウスの体重を毎日測定した。最後の処置の４時間後、Ｆａｓｔ－Ｐｒｅｐ２４（ＭＰ－Ｂｉｏ）装置を用いてセラミックビーズ（Ｌｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ Ｄ、ＭＰ－Ｂｉｏ）によりＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させる前に、腫瘍を切除した。タンパク質を、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９０μｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＰＸＲに対する抗体（ｓｃ－４８３４０、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ－３２２３３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。シグナルの強度をカメラ（Ｂｉｏｒａｄ ＭＰ Ｔｏｕｃｈ）によって測定した。図９Ａでは、２５ｍｋ／ｋｂで４日間の処置がマウスの体重を著しく改変しないことが分かる。図９Ｂ及び図９Ｃは、この処置が腫瘍内のＰＸＲタンパク質の発現レベルの著しい低下を誘導することが可能であることを確認する。
ＰＸＲタンパク質の発現レベルに対するＰＲＯＴＡＣの効果を、ＳＣＩＤマウスにおけるＬＳ１７４Ｔ細胞の異種移植片からのウェスタンブロッティングによってインビボで研究した。腫瘍が１００ｍｍ３に達すると、１０匹のマウスを、５％ＥｔＯＨ溶媒、Ｄ５Ｗ中の２０％ソルトール、又はＰＲＯＴＡＣ（２５ｍｇ／ｋｇ）でＩ．Ｖ．によって２４時間毎に４日間処置した。マウスの体重を毎日測定した。最後の処置の４時間後、Ｆａｓｔ－Ｐｒｅｐ２４（ＭＰ－Ｂｉｏ）装置を用いてセラミックビーズ（Ｌｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ Ｄ、ＭＰ－Ｂｉｏ）によりＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させる前に、腫瘍を切除した。タンパク質を、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に堆積させる（９０μｇ）前に精製及びアッセイした。ゲル上への移動後、ＰＸＲに対する抗体（ｓｃ－４８３４０、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（ｓｃ－３２２３３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びβ－アクチンに対する抗体（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ又はＡｂ－２５３２８３、ＡｂＣＡｍ）、次いで、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて明らかにする前に、それらをニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。シグナルの強度をカメラ（Ｂｉｏｒａｄ ＭＰ Ｔｏｕｃｈ）によって測定した。図９Ａでは、２５ｍｋ／ｋｂで４日間の処置がマウスの体重を著しく改変しないことが分かる。図９Ｂ及び図９Ｃは、この処置が腫瘍内のＰＸＲタンパク質の発現レベルの著しい低下を誘導することが可能であることを確認する。
【0217】
９．１０ 結腸がん幹細胞の自己再生及び化学耐性に対するＰＲＯＴＡＣの効果の測定
結腸がん幹細胞の生存及び自己再生に対するＰＲＯＴＡＣの効果を、ＨＴ２９株又は患者から単離されたがん細胞（ＣＲＣ１）上でインビトロで研究した。細胞を、分析する前
に５μＭのＰＲＯＴＡＣの有無別に４８時間処置した：Ａｌｄｅｆｌｕｏｒマーキング、がん幹細胞に優先的に存在する酵素活性（図１０Ａ）、アセリック（aseric）及び非接着条件下での腫瘍球体の形成（図１０Ｂ）、並びに最終的に化学療法に対する耐性（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。
結腸がん幹細胞の生存及び自己再生に対するＰＲＯＴＡＣの効果を、ＨＴ２９株又は患者から単離されたがん細胞（ＣＲＣ１）上でインビトロで研究した。細胞を、分析する前
に５μＭのＰＲＯＴＡＣの有無別に４８時間処置した：Ａｌｄｅｆｌｕｏｒマーキング、がん幹細胞に優先的に存在する酵素活性（図１０Ａ）、アセリック（aseric）及び非接着条件下での腫瘍球体の形成（図１０Ｂ）、並びに最終的に化学療法に対する耐性（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。
【0218】
図１０Ａは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８、ＪＭＶ７５０５、ＪＭＶ７５０６、及びＪＭＶ７９６５が、未処置細胞と比較して、ＣＲＣ１細胞の解離及びＡｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるマーキング後に、ＡＬＤＨ陽性細胞の割合を著しく低減することを示す。図１０Ｂは、分子ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５が、アノイキスを生き延びること、及び腫瘍球体（球体形成細胞）の形成を誘導することが可能なＨＴ２９細胞の数を著しく削減することを示す。５０μＭ超の直径を有する腫瘍球体を、１００μＬの枯渇ＢＣＳ培地中でウェル当たり２００個の細胞（いずれの細胞接着も防止するためにｐｏｌｙ２Ｈｅｍａで事前に処置された）の処置及び培養の１０日後に計数した。これらの培養条件は、がん幹細胞の生存のみを可能にする。図１０Ｃ及び図１０Ｄは、異なる濃度の５－ＦＵ及びＳＮ３８（Ｆｏｌｆｉｒｉ １Ｘ＝５０μｇ ５－ＦＵ＋５００ｎＭ ＳＮ３８）の存在下で維持され、いずれの細胞接着も防止するためにｐｏｌｙ２Ｈｅｍａで前処置された皿内の１００μＬのＢＣＳ培地中で培養されたＨＴ２９細胞の生存（１０Ｃ）及び腫瘍球体を形成する能力（１０Ｄ）に対するＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５の効果を示す。５０μ超の直径を有する腫瘍球体を、２００細胞／ウェルを播種してから１０日後に計数した。したがって、図１０Ａ～図１０Ｄは、ＰＲＯＴＡＣ ＪＭＶ７０４８及びＪＭＶ７９６５を用いた５μＭでの２日間の処置が、結腸がん細胞株における幹細胞の生存及び化学耐性を著しく低減することを示す。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【国際調査報告】