特表 2024-519558 全視野光断層撮影による生体試料内の透明生体被写体の３次元画像化のための方法およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-16

(54)【発明の名称】全視野光断層撮影による生体試料内の透明生体被写体の３次元画像化のための方法およびシステム

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/17 20060101AFI20240509BHJP

   G02B 21/00 20060101ALI20240509BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20240509BHJP

【ＦＩ】

G01N21/17 620

G02B21/00

G02B21/36

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573596

(86)(22)【出願日】2022-05-23

(85)【翻訳文提出日】2023-12-25

(86)【国際出願番号】 EP2022063907

(87)【国際公開番号】W WO2022248407

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】2105600

(32)【優先日】2021-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514255523

【氏名又は名称】サントレ ナティオナル ド ラ ルシェルシェ シアンティフィク

(71)【出願人】

【識別番号】515185843

【氏名又は名称】エコール・シュペリュール・ドゥ・フィシック・エ・ドゥ・シミー・アンデュストリエル・ドゥ・ラ・ヴィル・ドゥ・パリ

(74)【代理人】

【識別番号】110001416

【氏名又は名称】弁理士法人信栄事務所

(72)【発明者】

【氏名】ボッカラ，アルベール クロード

(72)【発明者】

【氏名】ボッカラ，マルティーヌ

(72)【発明者】

【氏名】トウヴナン，オリヴィエ

【テーマコード（参考）】

2G059

2H052

【Ｆターム（参考）】

2G059AA05

2G059BB14

2G059EE01

2G059EE09

2G059FF02

2G059FF03

2G059JJ11

2G059LL01

2G059MM01

2H052AF25

(57)【要約】

本明細書は、３次元画像化システム（１００）に関し、この画像化システムは、透過している生体試料（１０）を照明するように構成され、所与の中心長を有する空間的非コヒーレント光のビームを放射するように構成された光源（１１０）と、試料（１０）が位置決めされる近傍に所与の被写体焦点面（１２５）を伴う顕微鏡レンズ（１２１）を包含する光学画像化システム（１２０）と、試料に対して顕微鏡レンズを軸方向に移動するための手段と、検出平面（１４１）内に配列された複数の基本検出器を包含し、被写体焦点面と光学的に共役する２次元取得デバイス（１４０）と、処理ユニット（１５０）と、を包含する。試料の生体被写体の各切片について、照明ビームと切片の被写界によって散乱されたビームの間における光干渉からの結果としてもたらされる複数の２次元干渉信号が取得され、複数の２次元干渉信号から少なくとも第１の画像が計算される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

全視野光断層撮影による生体試料（１０）内の透明生体被写体の３次元画像化のための方法であって、
－ 所与の光軸（Δ）を包含する顕微鏡レンズ（１２１）の被写体焦点面（１２５）の近傍に前記試料を位置決めすることと、
－ 所与の中心波長（λ）を伴う空間的非コヒーレント光の照明ビームを用いて、透過する間に前記試料を照明することと、
－ 前記顕微鏡レンズの前記光軸と平行な軸方向に沿って前記顕微鏡レンズを前記試料に対して相対的に変位させ、前記試料の、各位置が前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面上に中心決めされた前記生体被写体の切片（１０１）に対応する複数の位置を定義することと、
－ 前記試料の各位置について、前記切片の被写界の少なくとも１つの第１の画像を作成することと、
を包含し、前記少なくとも１つの第１の画像を作成することが、
－ 前記被写界上に入射する前記照明ビームと前記被写界によって散乱されるビームの間の光干渉の結果生じる複数の２次元干渉信号を検出平面内（１４１）に配列された複数の基本検出器を包含する２次元取得デバイス（１４０）を用いて取得することであって、前記検出平面は、前記顕微鏡レンズを包含する画像化光学システムによって前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面と光学的に共役される、取得することと、
－ 処理ユニット（１５０）を用いて前記複数の２次元干渉信号から前記少なくとも１つの第１の画像を計算することと、
を包含する、３次元画像化方法。

【請求項2】

前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号は、前記切片の前記厚さ内の前記被写体焦点面の異なる位置について取得され、その結果として前記照明ビームと前記散乱されたビームの間において－π／２とπ／２の間の範囲にわたる複数の所定の位相シフトがもたらされる、
請求項１に記載の画像化方法。

【請求項3】

前記少なくとも１つの第１の画像の前記計算は、前記複数の２次元干渉信号の線形結合を包含する、
請求項２に記載の画像化方法。

【請求項4】

前記試料に対する前記顕微鏡レンズの前記相対的な変位は、λが前記照明ビームの前記中心波長である場合の最大振幅λ／４の周期関数に従う、
請求項２または請求項３に記載の画像化方法。

【請求項5】

－ 前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号は、前記試料に対する前記顕微鏡レンズの固定位置について取得され、
－ 前記切片の前記被写界の前記少なくとも１つの第１の画像を計算することが、前記２次元取得デバイスの各基本検出器について、前記基本検出器によって取得された前記２次元干渉信号の強度における前記時間的な変動を表すパラメータの値の関数として少なくとも１つのピクセル値を計算することを包含する、
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の画像化方法。

【請求項6】

前記パラメータは、前記干渉信号の前記強度の時間的な分散を表す、
請求項５に記載の画像化方法。

【請求項7】

全視野光断層撮影による生体試料（１０）内の透明生体被写体の画像化のための３次元画像化システム（１００）であって、
－ 透過する間に前記試料を照明するように構成された、所与の中心長による空間的非コヒーレント光の照明ビームの放射のために構成された光源（１１０）と、
－ 動作時に前記試料（１０）が位置決めされる近傍に所与の光軸（Δ）および所与の被写体焦点面（１２５）を伴う顕微鏡レンズ（１２１）を包含する光学画像化システム（１２０）と、
－ 前記顕微鏡レンズの前記光軸と平行な軸方向に沿って前記試料に対して前記顕微鏡レンズを相対的に変位させるための手段（１３１、１３２、１３５）と、
－ 検出平面（１４１）内に配列された複数の基本検出器を包含する２次元取得デバイス（１４０）であって、前記検出平面は、前記光学画像化システムによって前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面と光学的に共役される２次元取得デバイス（１４０）と、
－ 処理ユニット（１５０）と、
を包含し、前記生体被写体の複数の切片の各切片について、
－ 前記３次元画像化システムは、前記照明ビームと前記切片の被写界によって散乱されたビームの間の光干渉の結果生じる、前記２次元取得デバイス（１４０）を用いた複数の２次元干渉信号の前記取得のために構成され、
－ 前記処理ユニット（１５０）は、前記複数の２次元干渉信号から前記切片の前記被写界の少なくとも１つの第１の画像を計算するように構成される、
３次元画像化システム（１００）。

【請求項8】

前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号は、前記切片の前記厚さ内の前記被写体焦点面の異なる位置について取得され、その結果として前記照明ビームと前記散乱されたビームの間において－π／２とπ／２の間の範囲にわたる複数の所定の位相シフトがもたらされる、
請求項７に記載の画像化システム。

【請求項9】

前記少なくとも１つの第１の画像の前記計算は、前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号の線形結合を包含する、
請求項８に記載の画像化システム。

【請求項10】

前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号は、前記試料に対する前記顕微鏡レンズの固定位置について取得され、前記切片の前記被写界の前記少なくとも１つの第１の画像を計算することが、
－ 前記２次元取得デバイスの各基本検出器について、前記基本検出器によって取得された前記２次元干渉信号の強度における前記時間的な変動を表すパラメータの値の関数として少なくとも１つのピクセル値を計算すること、
を包含する、請求項７から請求項９のいずれか一項に記載の画像化システム。

【請求項11】

前記パラメータは、前記２次元干渉信号の前記強度の時間的な分散を表す、
請求項１０に記載の画像化システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、全視野光断層撮影による生体試料内の透明生体被写体の３次元画像化のための方法およびシステムに関する。これは、特に細胞および細胞内画像化に適用可能である。

【背景技術】

【0002】

特に、細胞または細胞のクラスタ等の生体被写体は、光学顕微鏡法を使用してサブミクロン・スケールにおいて調べることが可能であるが、殆どの生物学的研究においては、試料の遺伝学的または化学的な改変を必要とする蛍光顕微鏡法が使用されている。

【0003】

試料の保存が不可欠な場合においては、生体被写体の本質的な光学的性質に基づく代替案がわずかながら開発されている。それらのうち、位相差顕微鏡法（たとえば、非特許文献１参照）、微分干渉顕微鏡法（たとえば、非特許文献２参照）、またはデジタル・ホログラフィ（たとえば、非特許文献３参照）は、細胞を２Ｄおよび３Ｄ環境において可視化することを可能にする。

【0004】

光断層撮影画像化技術は、生体被写体の深い断面画像を生成することを可能にする。これらの技術のうち、スペクトル広帯域光干渉顕微鏡法に基づく光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、および幾何学的フィルタリングを使用する共焦点顕微鏡法は、特によく知られている。いずれの技術も、試料の正面の画像の生成にその試料の２次元スキャンを必要とする。

【0005】

より最近では、非コヒーレント光全視野干渉顕微鏡法によって画像を取得するための技術が開発され、全視野ＯＣＴ（または、ＦＦ－ＯＣＴ）として知られている。全視野ＯＣＴ画像化技術については、たとえば、非特許文献４をはじめ特許文献１に記載がある。

【0006】

全視野ＯＣＴ画像化技術は、低い時間的コヒーレンス長を伴う光源によって照らされたときに試料によって後方散乱される光の使用、および、特に生体試料の場合においては、微視的な細胞および組織構造によって後方散乱される光の使用に基づく。この技術は、光源の低い時間的および空間的コヒーレンスを利用して、試料内の仮想ディープ・スライスによって後方散乱される光を分離する。干渉計の使用は、干渉現象によって、選択的に試料の所与のスライスから到来する光を表現する干渉信号を生成すること、および試料の残りから到来する光を除去することを可能にする。

【0007】

全視野ＯＣＴ画像化技術は、１μｍ台の代表的な分解能を伴う３次元画像を入手することを可能にし、これは、スペクトル・ドメインＯＣＴ（頭辞語『フーリエ・ドメインＯＣＴ』によって知られる）等のほかの従来的なＯＣＴ技術を用いて入手されることのありがちな１０μｍ台の分解能より高い。その種の高い分解能を用いると、特に、血管、それらの壁、コラーゲン、脂肪細胞等の組織構造の殆どを可視化することが可能になる。それに加えて、この技術は、特に高速である：したがって、全視野ＯＣＴ顕微鏡を使用すると、数ｃｍ^２の表面積を伴うディープ・スライスを表現する画像を生成することがわずか数分で可能になる。

【0008】

生体試料の構造マップの入手に加えて、内因性光学画像化についての別の難題は、細胞レベルにおける生化学的性質を演繹する固有情報の抽出である。

【0009】

特許文献２は、従来的な全視野ＯＣＴ技術に従って入手された画像を用いては知覚可能でない情報、たとえば細胞の内部構造（特に、膜、核、細胞質）へのアクセスを可能にするＤＣ－ＦＦＯＣＴ（『動的コントラストＦＦＯＣＴ』）と呼ばれる全視野干渉顕微鏡法による画像化方法を記述している。この画像化方法は、たとえば、小胞、ミトコンドリア、細胞内小器官の動きに関連付けされる経路差のバリエーションによって誘導される干渉信号の強度における時間的なバリエーションの解析に基づく。その種の動的解析は、細胞がまだ生きている新鮮な組織内の卓越したコントラストを伴う全視野断層撮影画像を入手すること、したがって、コラーゲン等の組織の構造と比較して細胞の後方散乱の光が非常にわずかであることから以前はＯＣＴを用いて知覚可能でなかった生体被写体の構造を可視化することを可能にする。

【0010】

しかしながら、上に述べられているＦＦ－ＯＣＴおよびＤＣ－ＦＦＯＣＴ技術は、反射において働き、たとえば透明底グラス、またはプラスチック・ペトリ皿、またはガラス・スライド等の透明支持体上に置かれた透明度の高い生体被写体には適合できない。実際、支持体によって反射される信号は、生体被写体、たとえば細胞によって後方散乱される信号より大きさにおいて、通常、３乃至５桁も大きく、この信号の除去を困難にする。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】仏国特許発明第ＦＲ２８１７０３０号明細書

【特許文献2】仏国特許発明第ＦＲ３０３４８５８号明細書

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｌａｃｅｙ，Ａ．（レイシー・エー）著『Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ， Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（フェーズ・コントラスト，ライト・マイクロスコーピー・イン・バイオロジー：ア・プラクティカル・アプローチ）』、Ｌａｃｅｙ，Ａ．（レイシー・エー）編集、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（オックスフォード・ユニバーシティ・プレス）、英国、オックスフォード、ｐ２３－２５、（１９９９年）

【非特許文献2】Ｐｌｕｔａ，Ｍ．（プルータ・エム）著『Ｎｏｍａｒｓｋｉ‘ｓ ＤＩＣ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ（ノマルスキーズ・ディーアイシー・マイクロスコーピー：ア・レビュー）』、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ（プロシーディングズ・オブ・エスピーアイイー）１８４６：１０－２５、（１９９４年）

【非特許文献3】Ａｍｏｓ，Ｗ．Ｂ．（エイモス・ダブリュー・ビー）およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｇ．（ホワイト・ジェイ・ジー）著『Ｈｏｗ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｅｎｔｅｒｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ（ハウ・ザ・コンフォーカル・レーザー・スキャニング・マイクロスコープ・エンタード・バイオロジカル・リサーチ）』、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（バイオロジー・オブ・ザ・セル）９５：３３５－３４２、（２００３）

【非特許文献4】Ｈａｒｍｓ，Ｆ（ハームス・エフ）、Ｌａｔｒｉｖｅ，Ａ（ラトリヴ・エー）およびＢｏｃｃａｒａ，Ａ．Ｃ（ボッカラ・エー・シー）著『Ｔｉｍｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｆｕｌｌ Ｆｉｅｌｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（タイム・ドメイン・フル・フィールド・オプティカル・コヒーレンス・トモグラフィー・マイクロスコーピー）』、Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｄｒｅｘｌｅｒ ｂｏｏｋ（ウルフギャング・ドレクスラー・ブック）『Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（オプティカル・コヒーレンス・トモグラフィー）』の７９１ページ、編集者：Ｊａｍｅｓ Ｇ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ（ジェームス・ジー・フジモト）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（スプリンガー）２０１２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本明細書は、卓越したコントラストおよび実装の容易性を伴う、細胞培養または透明度の高い薄い構造等の透明生体被写体の３次元画像化に適合させた全視野光断層撮影による生体試料の３次元画像化のための新しい方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本明細書においては、『包含する』という用語が、『含む』、『含有する』と同じ意味であり、かつ包括的またはオープン・エンドであり、かつ記述されていないか、または表現されていないほかの要素を排除することはない。さらにまた、本明細書において『約』または『実質的に』という用語は、それぞれの値の２０％の下側および／または上側マージンと同義語（同じことを意味する）であり、たとえばそれが１０％である。

【0015】

本明細書は、第１の態様によれば、全視野光断層撮影による生体試料内の透明生体被写体の３次元画像化のための方法に関し、前記３次元画像化方法は、
－ 所与の光軸を包含する顕微鏡レンズの被写体焦点面の近傍に前記試料を位置決めすることと；
－ 所与の中心波長を有する空間的非コヒーレント光の照明ビームを用いて、透過する間に前記試料を照明することと；
－ 前記顕微鏡レンズの前記光軸と平行な軸方向に沿って前記顕微鏡レンズを前記試料に対して相対的に変位させ、前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面と相対的な前記試料の、各位置が前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面上に中心決めされた前記透明生体被写体の切片に対応する複数の位置を定義することと；
－ 前記試料の各位置について、前記切片の被写界の少なくとも１つの第１の画像を作成することと；
を包含し、前記切片の被写界の少なくとも１つの第１の画像を作成することが、
－ 前記被写界上に入射する前記照明ビームと前記被写界によって散乱されるビームの間の光干渉の結果生じる複数の２次元干渉信号を検出平面内に配列された複数の基本検出器を包含する２次元取得デバイスを用いて取得することであって、前記検出平面は、前記顕微鏡レンズを包含する画像化光学システムによって前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面と光学的に共役される、取得することと；
－ 処理ユニットを用いて前記複数の２次元干渉信号から前記少なくとも１つの第１の画像を計算することと；
を包含する。

【0016】

本明細書においては、透明生体被写体が、前記照明ビームからの前記光が通過することがありがちな低散乱（通常、被写体によって散乱される前記入射光の約５％未満）を伴う任意の生体被写体、たとえば、細胞または複数の細胞、たとえば細胞のクラスタ、細胞スキャフォールド、細胞マットまたはバイオフィルム、解剖病理学において準備されるような組織の薄いスライス等であることを理解する。通常、本明細書に従った方法を用いて画像の（少なくとも部分的な）形成が求められる透明生体被写体は、微視的寸法（約１μｍと約２ｍｍの間）を有する。より正確に述べれば、それが細胞または複数の細胞のときは、その種の透明生体被写体が、約２ミクロンと約５０ミクロンの間の寸法を有する。

【0017】

本明細書によれば、前記透明生体被写体は、生体試料の一部、すなわち前記透明生体被写体が置かれる支持体を形成する。前記生体試料は、たとえば、限定ではないが、透明ポリマ内の２Ｄまたは３Ｄの細胞培養、または細針生検（ＦＮＡ）または『穿刺細胞診』の生成物であり、すなわち、細針およびシリンジを使用した細胞および組織のサンプリングの生成物である。

【0018】

本明細書の前記３次元画像化メソッドオブジェクト（method object）においては、前記少なくとも１つの第１の画像を形成するべく取得された前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号の間における位相シフトの導入に、前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面の近傍の前記散乱されたビームの位相におけるグイ位相と呼ばれるバリエーションが使用される。前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面から特定の距離を超えると前記干渉信号の間に位相シフトがなくなることを示すことが可能である。したがって、画像化されるべき前記生体被写体の所与の厚さのスライス内において前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面を変位させることによって、またはこの所与の厚さの同じスライス内における前記生体被写体の内部構造の本質的な動きを用いることによって、異なる位相シフトを伴った２次元干渉信号を取得することが可能であり、それらから画像を計算することが可能である。

【0019】

本明細書に従った前記画像化方法を用いて形成された前記生体被写体の前記画像は、したがって、本明細書において『切片』または『光切片』、したがって『光断層撮影』という用語で呼ばれる所与の厚さのスライスの被写界の画像である。出願人らは、このスライスの厚さが前記顕微鏡レンズの被写界深度のオーダーであり、したがって前記顕微鏡レンズの開口率および前記照明ビームの中心波長に依存することを示した。

【0020】

したがって、本明細書に従った方法においては、画像が形成されることになる前記生体被写体の前記切片の前記被写界を、体積要素または『ボクセル』のセットからなる前記生体被写体の体積によって定義することが可能であり、各ボクセルは、前記顕微鏡レンズの前記被写界深度に等しい長さ、および前記顕微鏡レンズの回折ディスクによって定義される切片の円柱体積に相当する。前記被写界（前記顕微鏡レンズの前記光軸と垂直な平面内）の横方向寸法は、前記顕微鏡レンズを包含する前記画像化光学システムの倍率値によって除した、前記検出平面の有効検出表面によって定義される画像フィールドの横方向寸法と等しい。例示する実施態様においては、前記有効検出表面が、前記２次元取得デバイスの前記基本検出器または『ピクセル』が上に配列される検出表面全体を包含する。他の例示する実施態様においては、前記有効検出表面を、前記検出表面の領域に、たとえば視野絞りを用いて制限することが可能である。実際においては、前記顕微鏡レンズの対物空間内の前記切片の前記被写界のボクセルまたは体積要素が、画像空間（検出平面）において、サンプリング基準に応ずるために前記２次元取得デバイスの複数の、本明細書の中では『ピクセル』という別の呼び方も用いられる基本検出器に対応することができる。

【0021】

１つ以上の例示する実施態様によれば、可視範囲（４００ｎｍ－７００ｎｍ）の前記照明ビームの中心波長を扱う場合においては、本明細書に従った前記方法を用いて画像が形成される被写体の切片の厚さが、１．２５と０．３の間の前記顕微鏡レンズの開口率に対して約２００ｎｍと約１０ミクロンの間になる。実際においては、前記顕微鏡レンズの所与の開口率について、より薄い前記被写体の切片の画像化のために、より短い波長を用いて作業することが可能であろう。切片内の被写界の画像の分解能は、ボクセルの最大横方向寸法によって定義される。可視範囲内において、かつ１．２５と０．３の間の前記顕微鏡レンズの開口率については、分解能が約０．２５ミクロンと約１ミクロンの間である。

【0022】

前記顕微鏡レンズの前記光軸と平行な軸方向に沿った前記試料に対する前記顕微鏡レンズの相対的な変位は、したがって、前記透明生体被写体の複数の切片の画像を作成して前記被写体の３次元画像を作成することを可能にする。

【0023】

したがって、記述されている前記３次元画像化方法は、透過する間に前記試料が照らされる新規な光学的配列を用いて透明生体被写体を含む断層撮影画像化を可能にする。

【0024】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記複数の２次元干渉信号は、前記切片の前記厚さ内の前記被写体焦点面の異なる位置について取得され、その結果として－π／２とπ／２の間の範囲にわたる前記照明ビームと前記散乱されたビームの間の複数の所定の位相シフトがもたらされる。

【0025】

前述の第１の実施態様においては、したがって前記方法は、前記生体被写体の切片の被写界の画像を作成するために、前記顕微鏡レンズの前記光軸と平行な軸方向に沿って前記顕微鏡レンズを前記試料に対して相対的に変位させることと、前記２次元干渉信号を使用して、前記切片内における前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面の種々の位置について取得されている前記切片の被写界の前記画像を計算することと、を包含し、したがって、前記２次元干渉信号が所定の位相シフトを伴って取得されることを可能にする。

【0026】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記少なくとも１つの第１の画像の前記計算が、複数の信号の前記複数の２次元干渉信号のうちの２次元干渉信号の線形結合、たとえば前記２次元干渉信号のうちの２つの減算を包含する。

【0027】

実際においては、前記少なくとも１つの第１の画像の計算が、前記２次元取得デバイスの各基本検出器について、前記基本検出器によって取得された前記２次元干渉信号の強度の線形結合の関数としてピクセル値を計算することを包含する。

【0028】

本明細書においては、『ピクセル値』が、対応するピクセルまたは基本検出器によって測定された信号の値であることを理解する。

【0029】

１つ以上の例示する実施態様によれば、ピクセル値を計算することが、前記顕微鏡レンズと前記試料の間の距離を、被写界深度の約１／１０と前記被写界深度の間、好都合には前記被写界深度の約１／１０と約１／２の間の距離で変化させることによって取得された２次元干渉信号の強度の線形結合の関数である。

【0030】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記試料に対する前記顕微鏡レンズの前記相対的な変位は、λが前記照明ビームの前記中心波長である場合の最大振幅λ／４の周期関数に、たとえば連続周期関数、たとえば正弦関数、または周期的な勾配に従う。前記周期関数は、前記画像の計算に適合された時間的サンプリング、たとえば１周期当たり２つ、３つ、または４つの取得を可能にするべく前記２次元検出器の取得レートの関数として決定された周期を有する。

【0031】

前記第１の態様に従った前記３次元画像化方法の１つ以上の例示する実施態様によれば：
－ 前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号が、前記試料に対する前記顕微鏡レンズの固定位置について取得され、また前記切片の前記被写界の前記少なくとも１つの第１の画像を計算することが、
－ 前記２次元取得デバイスの各基本検出器について、前記基本検出器によって取得された前記２次元干渉信号の強度における時間的な変動を表すパラメータの値の関数として少なくとも１つのピクセル値を計算することを包含する。

【0032】

この第２の実施態様においては、前記透明生体被写体の切片の前記被写界の画像が、前記試料に対する前記顕微鏡レンズの変位を伴うことなく作成される。前記画像は、前記生体被写体の本質的な構造の前記動き、したがって環境の特性であることから、前記第１の実施態様における計算とは異なる。いくつかの実施態様においては、前記生体被写体の画像を、それらの画像が相補的な情報を提供することから前記第１の実施態様および前記第２の実施態様の両方を用いて作成することが可能である。

【0033】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記パラメータが、前記干渉信号の前記強度の時間的な分散を表す。

【0034】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記２次元取得デバイスの各基本検出器について少なくとも１つのピクセル値を計算することが、時間の関数として前記基本検出器によって取得された前記干渉信号のフーリエ変換を計算することを包含する。

【0035】

本明細書は、第２の態様によれば、全視野光断層撮影による生体試料内の少なくとも１つの透明生体被写体の画像化のための３次元画像化システムに関し、前記画像化システムは：
－ 所与の中心長の空間的非コヒーレント光の照明ビームであって、透過する間に前記試料を照明するように構成された前記照明ビームの放射のために構成された光源と；
－ 動作時に前記試料が位置決めされる近傍に所与の光軸および所与の被写体焦点面を伴う顕微鏡レンズを包含する光学画像化システムと；
－ 前記顕微鏡レンズの前記光軸と平行な軸方向に沿って前記試料に対して前記顕微鏡レンズを相対的に変位させるための手段と；
－ 検出平面を包含する２次元取得デバイスであって、前記検出平面が、前記光学画像化システムによって前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面と光学的に共役される２次元取得デバイスと、
－ 処理ユニットと、
を包含し、前記生体被写体の複数の切片の各切片について：
－ 前記３次元画像化システムは、前記照明ビームと前記切片によって散乱されたビームの間における光干渉からの結果としてもたらされる、前記２次元取得デバイスを用いた複数の２次元干渉信号の前記取得のために構成され、
－ 前記処理ユニットは、前記複数の２次元干渉信号から、前記切片の被写界の少なくとも１つの第１の画像を計算するように構成される。

【0036】

その種の新しい画像化システムの配列は、透明生体被写体の光断層撮影画像化を可能にし、それによって３次元画像を作成するために前記生体被写体の切片または『スライス』の画像を作成することが可能になる。

【0037】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号は、前記切片の前記厚さ内の前記被写体焦点面の異なる位置について取得され、その結果として前記照明ビームと前記散乱されたビームの間において－π／２とπ／２の間の範囲にわたる複数の所定の位相シフトがもたらされる。

【0038】

本明細書に従った前記画像化システムのこの第１の実施態様においては、前記試料に対して前記顕微鏡レンズを相対的に変位させるための手段が、前記切片の画像を作成するために前記生体被写体の切片内において前記顕微鏡レンズの前記被写体焦点面を変位させるだけでなく、３次元画像を作成するために前記光軸に沿って前記試料内において前記被写体焦点面を変位させて前記生体被写体の複数の切片の画像を作成するように構成される。

【0039】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記少なくとも１つの第１の画像の前記計算は、前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号の線形結合を包含する。

【0040】

１つ以上の例示する実施態様によれば、前記複数の２次元干渉信号のうちの前記２次元干渉信号が、前記試料に対する前記顕微鏡レンズの固定位置について取得され、また前記切片の前記少なくとも１つの第１の画像を計算することが、
－ 前記２次元取得デバイスの各基本検出器について、前記基本検出器によって取得された前記２次元干渉信号の強度における時間的な変動を表すパラメータの値の関数として少なくとも１つのピクセル値を計算することを包含する。

【0041】

本明細書に従った前記画像化システムのこの第２の実施態様においては、前記試料に対して前記顕微鏡レンズを相対的に変位させるための手段を、３次元画像が作成されるように前記生体被写体の複数の切片の画像を作成するために、画像化されるべき前記生体被写体内において前記光軸に沿って前記被写体焦点面を変位させるためにだけ構成することが可能である。

【0042】

前記第１および第２の実施態様は、画像化されることが求められている前記透明生体被写体の切片の複数の第１の画像および複数の第２の画像を得るために本明細書に従った同一の画像化システム内において実装することが可能である。

【0043】

上に示されている画像化技術のさらなる利点および特徴は、次に挙げる図面を参照した以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1A】本明細書に従った例示による３次元画像化システムを表した概略図である。

【図1B】本明細書に従った例示による３次元画像化システム内の顕微鏡レンズの被写体焦点面をより詳細に表した概略図である。

【図2A】１つの実施態様に従った３次元画像化方法の例示による実装における、透明生体被写体の切片の被写界の画像を作成するための顕微鏡レンズの被写体焦点面の前記切片内の２つの位置を図解した概略図である。

【図2B】第１の実施態様に従った３次元画像化方法の例示による実装において被写体焦点面が透明生体被写体の異なる切片上に中心決めされて前記被写体の３次元画像が作成される顕微鏡レンズの被写体焦点面の複数の位置を図解した概略図である。

【図3A】照明ビームと、たとえばナノメートル寸法の細胞内小器官における場合のように散乱粒子によって散乱されたビームの干渉から結果としてもたらされる２次元干渉信号についての、前記粒子の位置に対する顕微鏡レンズの被写体焦点面の相対的な位置の関数として画像フィールドの中心において計算される理論的な強度を例証として示したグラフである。

【図3B】連続する背景に対応するｚ内の干渉信号の平均値を差し引いた図３Ａにおいて計算され、かつ表現された理論的な強度を図解により示したグラフである。

【図3C】第１の実施態様に従った３次元画像化方法の例示による実装において、所与の被写界深度の１０分の１に等しい距離によって離隔された粒子の２つの位置について、照明ビームと粒子によって散乱されたビームの干渉から結果としてもたらされる２つの２次元干渉信号のそれぞれ毎にフィールドの中心において計算された理論的な強度の間の差を、前記粒子の位置に対する顕微鏡レンズの被写体焦点面の相対的な位置の関数として例証により示したグラフである。

【図3D】正弦関数に従った試料に対する顕微鏡レンズの被写体焦点面の相対的な変位を図解する曲線を上に重ね合わせた図３Ｂにおいて計算され、かつ表現された理論的な強度を例証として示したグラフである。

【図4】第２の実施態様に従った３次元画像化方法の実装における、切片の被写界の画像を作成するための生体被写体の切片に対する顕微鏡レンズの被写体焦点面の位置を図解した概略図である。

【図5】顕微鏡レンズの被写体焦点面に対する生体被写体の本質的な構造のランダムな変位を図解する曲線を上に重ね合わせた図３Ｂにおいて計算され、かつ表現された理論的な強度を例証として示したグラフである。

【図6】本明細書に従った方法の２つの実施態様を用いて、４ミクロンの距離にある２つの異なる切片平面に沿って２つの隣接するＨｅＬａ細胞上において得られた実験に基づく画像を示した説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

図１Ａおよび図１Ｂは、本明細書に従った３次元画像化システム１００の例示による実施態様を概略的に図解している。

【0046】

画像化システム１００は、所与の中心長λの空間的非コヒーレント光の照明ビームを用いて透過する間に試料１０を照明するように構成された光源１１０を包含する。好都合には、必須ではないが、照明ビームが時間的非コヒーレント光ビームであり、望ましくない光学的スペックル効果を回避する。

【0047】

光源１１０は、たとえば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、発熱フィラメント光源、ＶＣＳＥＬ（垂直キャビティ面発光レーザ）タイプの発光素子のマトリクス、膜に関連付けされたレーザ、または任意のそのほかの照明ビームを空間的に非コヒーレントにするための手段である。

【0048】

図１Ａおよび図１Ｂに図解されている例においては、透過する照明ビームを放射するために光源１１０が試料１０に対向して位置決めされているが、そのほかの照明構成も可能である。

【0049】

３次元画像化システム１００は、さらに、動作時に試料１０が近傍に置かれる光軸Δおよび被写体焦点面１２５（図１Ｂ）を伴う顕微鏡レンズ１２１を包含する光学画像化システム１２０を包含する。それに加えて図１Ａの例においては、光学画像化システム１２０が、一般に『鏡筒レンズ』と呼ばれる（オプションの）レンズ１２２を包含する。

【0050】

また３次元画像化システム１００は、顕微鏡レンズの光軸と平行な軸方向に沿って試料１０に対して顕微鏡レンズ１２１を相対的に変位させるための手段も包含する。図１Ａおよび図１Ｂの例においては、相対的変位手段が、顕微鏡レンズ１２１を軸方向に変位させるように構成された第１の圧電素子１３１、および試料１０が上に配される試料ホルダ（図には表されていない）を軸方向に変位させるように構成された第２の圧電素子１３２を包含する。また相対的変位手段は、素子１３１、１３２を制御するための制御ユニット１３５も包含する。しかしながら、ほかの実施態様においては、相対的変位手段が、顕微鏡レンズまたは試料ホルダのいずれかを変位させるための１つの素子だけを包含することができる。

【0051】

３次元画像化システム１００は、上記に加えて、検出平面１４１、すなわち光学画像化システム１２０によって顕微鏡レンズの被写体焦点面１２５と光学的に共役される検出平面１４１を包含する２次元取得デバイス１４０、および取得デバイス１４０の制御・モジュール１４５を包含する。２次元取得デバイス１４０は、マトリクス配列の形式、たとえば２次元マトリクス配列の形式で検出表面に配列された複数の基本検出器、または『ピクセル』を包含する。たとえば、基本検出器のマトリクス配列の寸法は、本明細書に従った画像化システムの画像フィールド１４２の寸法を定義する。ほかの例の実施態様においては、検出平面の有効検出表面または『Ｒ．Ｏ．Ｉ．』（関心領域）が基本検出器の２次元配列によってカバーされる表面より小さくなるように画像フィールド１４２の寸法が、視野絞りによって制限される。画像フィールドは、たとえば約５ｍｍと約５０ｍｍの間の寸法を伴った矩形である。

【0052】

たとえば、２次元取得デバイスは、ＣＣＤまたはＣＭＯＳタイプのカメラである。当然のことながら、ほかのカメラ、たとえばピクセル当たりより大きなロード・キャパシティを伴う超高速カメラ、たとえば、ＡＤＩＭＥＣ（登録商標）（アディメック）のＱＵＡＲＴＺ（クオーツ）シリーズ（登録商標）タイプのカメラを使用することもできる。

【0053】

制御・モジュール１４５は、取得デバイス１４０による取得を制御し、取得デバイス１４０によって送信された電気信号を受信し、それらを処理ユニット１５０へ送る。

【0054】

図１Ａに図解されているとおり、３次元画像化システム１００は、本出願に従った方法において実装される計算および／または処理ステップの実装のために構成される処理ユニット１５０を包含する。

【0055】

概して言えば、本明細書において方法ステップの特に実装について計算または処理ステップと言及するときは、各計算または処理ステップが、ソフトウエア、ハードウエア、ファームウエア、マイクロコード、またはこれらのテクノロジの任意の適切な組み合わせによって実装され得ることを理解されるものとする。ソフトウエアが使用されるときは、各計算または処理ステップを、コンピュータ・プログラムのインストラクションまたはソフトウエア・コードによって実装することが可能である。これらのインストラクションは、コンピュータ可読ストレージ媒体（または、処理ユニット）内に記憶すること、またはそれへ送信すること、および／またはこれらの計算または処理ステップを実装するためにコンピュータ（または、処理ユニット）によって実行することができる。

【0056】

したがって、動作においては、より詳細を後述するとおり、３次元画像化システム１００が、前記２次元取得デバイス１４０を用いる、試料１０上に入射する照明ビームと、試料１０の前記少なくとも１つの透明生体被写体、たとえば細胞または細胞のクラスタによって散乱されたビームの間の光干渉から結果としてもたらされる複数の２次元干渉信号の取得のために構成される。それに加えて、処理ユニットは、複数の２次元干渉信号から、生体被写体の複数の切片１０１のそれぞれの切片の被写界の１つ以上の画像を計算するように構成される。

【0057】

被写界の横方向寸法は、顕微鏡レンズを包含する光学画像化システム１２０の倍率によって除した画像フィールドの横方向寸法と等しい。したがって、たとえば、１０ｍｍ×１０ｍｍの寸法を伴う実質的に矩形の画像フィールドについては、光学画像化システムの倍率が１００×であれば被写界の寸法が１００μｍ×１００μｍであり、光学画像化システムの倍率が２０×であれば５００μｍ×５００μｍである。概して言えば、被写界の寸法は、約５０μｍと約５００μｍの間である。

【0058】

画像が形成されることになる生体被写体の切片１０１の被写界を、体積要素または『ボクセル』のセットからなる体積によって定義することが可能であり、各ボクセルは、顕微鏡レンズの被写界深度に等しい長さを伴い、かつ前記顕微鏡レンズの回折ディスクによって定義される切片成分を伴う円柱体積に相当する。

【0059】

被写界深度Ｌおよび切片成分の直径φは、次式によって与えられる：

【0060】

【数1】

【0061】

【数2】

【0062】

これにおいて、ｎは対物空間を浸漬する媒体（たとえば、油浸レンズの場合においては、屈折率ｎ≒１．５の媒体）の屈折率であり、ＮＡは前記媒体内の顕微鏡レンズの開口率であり、λは照明ビームの中心波長である。

【0063】

図１Ｂに図示されているとおり、各切片１０１は、顕微鏡レンズの光軸Δに対して実質的に垂直である。動作においては、切片の画像を作成するために。顕微鏡レンズの被写体焦点面が、顕微鏡レンズと試料１０の相対的な変位を用いて前記切片上に中心決めされる。切片の画像から、透明生体被写体の３次元画像を作成することが可能である。

【0064】

３次元画像化方法の第１の実施態様を図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄを用いて説明する。この第１の実施態様は、切片の被写界の画像を取得、計算するための第１のモードを記述する。

【0065】

第１の実施態様に従った取得モードにおいては、透明生体被写体、たとえば細胞または細胞のクラスタの切片の被写界の画像を作成するために、顕微鏡レンズの被写体焦点面が前記切片内において、顕微鏡レンズの光軸と平行な軸方向に沿って変位される。

【0066】

複数の２次元干渉信号が、前記切片内の異なる被写体焦点面位置について取得され、結果として、－π／２とπ／２の間の範囲にわたる入射ビームと前記切片によって散乱されたビームの間の複数の位相シフトがもたらされる。切片の被写界全体の画像が、したがって全視野画像化のコンセプトが、その後、前記２次元干渉信号から直接計算される。

【0067】

実例として、図２Ａは、３次元断層撮影画像の作成が求められている２つの細胞２１、２２のクラスタ２０を表している。各細胞は、核小体２１２、２２２を伴う細胞核２１１、２２１、および細胞核周りの、ミトコンドリア、小胞、脂肪体、タンパク質凝縮物等細胞内小器官２１４、２２４を含む細胞質２１３、２２３を包含する。細胞質の細胞内小器官は、細胞核に位置する。細胞質の細胞内小器官または細胞の核の内部構造は、光を散乱する。下記のように、顕微鏡レンズと試料の間の距離を、通常は被写界深度の約１／１０と被写界深度の間、たとえば被写界深度の約１／１０と約１／２の間の距離で変化させることによって、したがって干渉信号の位相を変化させることによって取得される少なくとも２つの２次元干渉信号から細胞の体積内の切片の画像を、たとえば取得された２つの干渉信号の間のピクセル毎の差によって計算することが可能である。破線２０１、２０２は、例として、画像化が求められている切片内におけるレンズの被写体焦点面の２つの位置を図解している。

【0068】

第１の実施態様に従った切片の画像の計算原理を説明するために、取得デバイス１４０（図１Ａ）の検出平面１４１内に受け入れられる電磁場が光源によって放射され、かつ試料によって透過される、この例においては平面波によってモデリングされる入射フィールドと、細胞によって散乱される、解析的公式化に適したガウス・ビームによって被写界の各ボクセルにおいてモデリングされるフィールドの重ね合わせであると仮定する。以下に展開される結論は、厳密に平面波でない照明ビーム、または厳密にガウス・ビームに相当しない散乱ビームの場合においても有効である。

【0069】

照明ビームの空間的非コヒーレンスに起因して、全体の被写界によって散乱されるビームは、実際に、生体被写体のフィールド全体を通じて横並びに配置される複数のビームとして考えることが可能であり、各ビームのサイズは、顕微鏡レンズの分解能によって定義されることに注意すべきである。

【0070】

より正確に述べれば、顕微鏡レンズの光軸と平行な軸ｚ（図１Ｂ）に沿って伝播するガウス・ビームの複素電場は、スカラー近似において次式のとおりに記述される：

【0071】

【数3】

【0072】

座標ｚは、顕微鏡レンズの被写体焦点面において定義される原点（ｚ＝０）に対する顕微鏡レンズの光軸に沿って定義され；ｒは、光軸からの距離であり、ｋ＝２π／λであり、λは、照明ビームの中心波長である。Ｅ_０およびｗ_０は、原点（ｚ＝０、ｒ＝０）におけるビームのフィールドおよびサイズである。原点におけるビームのサイズｗ_０が、上に与えられている［数式２］の顕微鏡レンズの回折ディスクの半径φ／２に等しいと近似することが可能である。実際においては、ビームのサイズが、画像内の最小のアクセス可能な詳細の寸法を定義することに注意すべきである。シャノンの定理としても知られるサンプリング定理に応じた検出デバイスによって取得された干渉信号内のサンプリングを得るために、ｗ_０について、ピクセルの最大サイズより大きいか、またはそれと等しい値を選択することができる。

【0073】

以下においては、ｒ＝０周りの証明を行うが、実際においては拡張された被写界が関係し、以下に記述した曲線が、実際の使用時に顕微鏡レンズが該当する収差のないときの被写界内の任意のポイントで同じになると示すことが可能である。

【0074】

ガウス・ビームについては、それの原点（ｚ＝０）においてビームの幅ｗ（ｚ）が極小となり、ビームの軸に沿った距離ｚにおいてｗ（ｚ）＝ｗ_０（１＋（ｚ／ｚ_０）^２）^０．５に等しい。

【0075】

被写界深度は、２×ｚ_０＝πｗ_０ ^２／λ ｅｔによって与えられ、波動の曲率半径は、Ｒ（ｚ）＝ｚ（１＋（ｚ／ｚ_０）^２）である。

【0076】

波動の電場の式から、グイ位相と呼ばれる位相項を導入することが可能であり、それが焦点において生じる位相ジャンプを表し、次式によって与えられる：

【0077】

【数4】

【0078】

細胞等の生体被写体は、約１０ナノメートルから約１マイクロメートルまでの寸法の内部構造からなる。たとえば、内部構造は、細胞内小器官、フィラメントおよび微小管、小胞、およびミトコンドリアである。記録された信号の軸方向の応答を図解するために、ここでは、顕微鏡レンズの被写体焦点面に対して所与の位置（ｚ）を有する粒子または『散乱体』に相当するその種の内部構造の例を取り上げる。

【0079】

被写界の中心内の粒子によって散乱されたフィールドは、したがって、次のとおりに記述される：

【0080】

【数5】

【0081】

σ／Ａは、粒子の有効散乱断面とＡ、すなわち入射照明ビームの面積の間の比である。

【0082】

入射フィールドは、平面波によってモデリングされる：

【0083】

【数6】

【0084】

したがって、取得デバイスによって測定された、フィールドの中心における２次元干渉信号に対応する強度は、両方のビームに共通し、平均が０になる伝播項およびｅｘｐ（ｉωｔ）項を無視すると：

【0085】

【数7】

【0086】

すなわち：

【数8】

【0087】

概して言えば、小さい粒子については、１と比べると有効断面が非常に小さく、したがって次のとおりに記述することが可能である：

【0088】

【数9】

【0089】

したがって、図３Ａに、σ／Ａ＝０．０１およびｚ_０＝０．２５μｍ（λ＝０．５μｍ、ＮＡ＝１．２５）、すなわち０．５μｍの被写界深度について計算された強度曲線Ｉ（ｚ）を図解する。

【0090】

散乱粒子の位置の関数としての検出平面内において測定された干渉信号におけるこの変動の性質は、透明生体被写体、たとえば細胞の切片の被写界の画像の計算に利用される。

【0091】

前述したように、顕微鏡レンズの試料との相対的な位置は、たとえば、圧電素子（図１Ａの符号１３２）を用いて変更される。したがって、ｚの値を変化させて、いくつかの異なる干渉信号を得ることが可能である。

【0092】

より正確に述べれば、ｚ＝０の近傍における干渉項の線形性が、顕微鏡レンズの焦点に置かれた被写体の有効断面を得るために利用される（図３Ｂ）。この例においては、図３Ｂが、図３Ａに示されている曲線から平均の背景が差し引かれることによって得られる曲線を表す。

【0093】

焦点の近傍においては、正弦関数および逆正接関数を線形化して１／（１＋（ｚ／ｚ０）^２））内の前因子を除去することが可能である。式［数式９］は、次のようになる：

【0094】

【数10】

【0095】

図３Ｂに図解されている曲線上において１ミクロン台のゾーンにわたって線形性ゾーンが広がっていることが観察可能である。

【0096】

ｚ距離が０．１μｍの２つの位置についての連続する画像が、たとえばレンズ（または、試料）を移動することによって得られるが、それらを撮影し、２つの干渉信号の間における差を測定することによって次式が得られる：

【0097】

【数11】

この式は、σ、すなわち粒子の有効散乱断面に正比例する。

【0098】

それに加えて、粒子が焦点から遠く離れている場合には、ｚが大きくなるときにｓｉｎ（ａｔａｎ（ｚ））が０に向かい、かつ前因子（１／（１＋ｚ^２））もまた０に向かうことから、干渉項の強度が０に向かう。

【0099】

その結果として、粒子が焦点から遠く離れている場合には、Δｚ～１μｍによってシフトされた連続する画像の間の差が、ΔＩ（ｚ＞＞ｚ_０）＝０になる。

【0100】

したがって、強度の差は、被写体がレンズの焦点と近い場合に限り、非ゼロになる。

【0101】

本明細書に従った画像化方法は、したがって『オプティカル・セクショニング』、すなわち所与の厚さの試料の切片の画像化を可能にする。言い換えると、いくつかの散乱体／粒子からなる３Ｄ被写体に、２つの位置において画像に差を付けることによって注目する場合には、所与の深度に存在する散乱体のみが分離され、所与の深度における３Ｄ被写体の構造（散乱体内のそれの組成物）を得ることが可能である。

【0102】

－π／２とπ／２の位相シフトは、顕微鏡レンズの被写界深度ｚ_０のオーダーの距離において生じる。試料の薄い切片を得るためには、大きな開口率のレンズが使用される必要がある。たとえば、開口率１．２５を伴う油浸レンズについては、被写界深度が０．５μｍであり、しばしば開口率０．９を伴う水浸レンズについては、被写界深度が１μｍである。

【0103】

上記の曲線の一般的な場合においては、散乱体の種々の位置について、被写界深度のオーダーの距離、たとえば被写界深度の１／１０において得られた２つの画像の間における強度の差をピクセル毎にプロットすることが、図３Ｃに図解されているとおり、可能である。

【0104】

図３Ｃに図解されている曲線から、散乱体は、それが焦点に近接して置かれている場合にのみ可視であることが観察される。任意の基準（たとえば、最大半量における全幅）を定義して光切片、すなわち、その厚さにわたって散乱体が検出可能である切片を定義することが可能であり、かつ、ここではそれが装置の被写界深度のオーダー、すなわち１．２５の開口率を伴う油浸レンズについては０．５ミクロン台であることがわかる。

【0105】

実際においては、０．１と０．４ミクロンの間の軸方向の差について得られる干渉信号を選択することが興味深いと決定された。

【0106】

実際においては、高レートの作業のために、圧電素子が瞬時的な矩形波変位をもたらすべく適合されることが常ではなく、変位のシヌソイド変調を行うことを好ましいとすることができる。光学応答がｚ～０にわたって線形となるゾーンにあるときは、光信号内の変動もまたシヌソイドになり、たとえば４つの画像を採用した同期検出によって非常に良好にフィルタリングすることが可能である。

【0107】

散乱体がこの線形ゾーンの外側となる場合には、同期検出による信号の検出が可能でなくなる。

【0108】

光切片の画像から、図２Ｂに図解されているとおり、その後体積内の試料をスキャンすることが可能になる。その後、『断層撮影』、すなわち試料の３Ｄ画像を提供する種々の対応する軸方向の位置におけるスライスによって散乱された強度の測定を行う。

【0109】

たとえば、被写体焦点面を図２Ｂの参照番号２０１の位置に位置決めすることが可能であり、この平面をはじめ、平面２０１から０．２マイクロメートルだけ離された符号２０２の平面において干渉信号を取得することが可能である。その後、これらの２次元干渉信号の間の差が計算され、第１の切片の画像が決定され、続いて被写体焦点面が変位され、新しい取得が行われて続く切片の画像が決定される。たとえば、別の光切片の画像を計算するべく、符号２０３の平面に被写体焦点面を変位させ、この平面内において干渉信号を取得、平面２０２において取得した干渉信号との差を求めるという形を繰り返すことが可能である。

【0110】

顕微鏡レンズと試料の相対的な位置もまた、図１の２つの圧電変位のうちの１つにシヌソイド電圧を印加することによって周期的に変調することが可能である。信号の同期検出が、その後、周期の半分にわたる少なくとも２つの画像の時間サンプリングによって行われる。

【0111】

図４および図５を用いて、３次元画像化方法の第２の実施態様を説明する。この第２の実施態様においては、切片の画像の取得および計算のための、先行する図面に関連した説明とは異なる別のモードを説明する。それぞれの切片について、第１の実施態様に対応する第１の画像および第２の実施態様に対応する第２の画像を計算することは可能であることに注意すべきである。

【0112】

先の実施態様においては、顕微鏡レンズと試料の相対的な変位が行われて２つの異なる位置における強度の差が測定された。

【0113】

しかしながら、出願人らは、生体被写体内の殆どの細胞内小器官が内部的な動きを有し、それが自発的にそれらの位置を変調していることを見出した。

【0114】

したがって、本明細書に従った断層撮影画像化方法の第２の実施態様においては、以下に詳細を述べるとおり、光切片の画像の計算のための試料に対する顕微鏡レンズの相対的な変位がない。相対的な変位は、異なる光切片の画像の計算のため、したがって３次元画像の再現のためにのみ行われる。

【0115】

しかしながら、実際においては、生体被写体の変位が本来的にランダムであることから、この変位はあらかじめ既知ではなく、ΔＩ～σ．Δｚ［数式１１］とは異なり、そのため、散乱体の有効断面ないしはそれの変位のいずれも決定可能ではなく、単一の散乱体を特徴付けることが可能でない。

【0116】

第２の実施態様に従った断層撮影画像化方法においては、光切片の被写界の画像の計算が、その切片内の被写体焦点面の所与の位置について取得された２次元干渉信号の間の強度における時間的な変動から行われる。

【0117】

たとえば、２次元取得デバイスの各基本検出器について、ピクセル値を、前記基本検出器によって取得された前記２次元干渉信号の強度における時間的な変動を表すパラメータの値の関数として計算することが可能である。パラメータは、たとえば、干渉信号の強度の時間的な分散を表す。

【0118】

実際に、強度信号内の時間的な揺らぎまたは変動は、散乱体の位置における揺らぎに関する情報を与える。たとえば、散乱体がブラウン運動（位置におけるランダムな揺らぎ）を有する場合には、測定された強度信号が純粋にランダムでなければならず、√ｔに従って（または、画像間の時間差の平方根に従って）統計的に増加しなければならないΔＩを伴う。実際においては、生物細胞内の散乱体がより頻繁に考察される。細胞の生理学は、細胞が散乱体の運動を（たとえば、分子モータによって）制御することから、動きがランダムではなくなり、バイアスされることを示す。散乱体の動きによって作り出された強度信号における揺らぎを測定することにより、細胞の代謝に依存する固有信号を入手可能であると示すことが可能である。

【0119】

実際においては、同一平面内における時間の関数としてのＮ個の画像が記録される。その信号は、散乱体の位置もまたランダムであることから、図５に図解されているとおり、本来的にランダムである。

【0120】

この時間トレースから、統計的な処理を行って散乱体の環境に関する情報を提供することが可能である。散乱体の動きに対する感度は、その光切片内の、言い換えると焦点面に非常に近接した散乱体に対してのみ有効である。信号の揺らぎは、したがって、焦点体積から到来する散乱体によってのみ主として生じる。

【0121】

したがって、最終的に動的断層撮影、すなわち１つの平面内における信号の揺らぎを記録し、解析を行い、レンズの位置を移動して再開することの繰り返しを行うことが可能である。散乱体の環境が、このようにして３Ｄにおいてマップされる。

【0122】

たとえば、カメラの各ピクセルが解析および表現が必要とされる信号を時系列に従って記録する。この解析は、いくつかの方法で行われる。たとえば、干渉信号の時系列のフーリエ変換を計算し、それらから多数のピクセル値、たとえば、パワー（ＦＴの絶対値の２乗（squared modulus）のスペクトルにわたる積分）、周波数スペクトルの中心周波数（Ｈ）、およびスペクトル幅（Ｓ）にそれぞれ対応する値を演繹することが可能である。たとえば、ＨＳＶ（色相、彩度、明度）色表現を使用して周波数スペクトルの中心周波数（Ｈ）、スペクトル幅（Ｓ）、およびパワー（Ｖ）をそれぞれ表すことが可能である。

【0123】

そのほかの、干渉信号の時系列の標準偏差の単純計算、またはバイアスされた動きについての前記時系列の累積和（ｃｕｍｓｕｍ関数）の解析といった解析の手段を使用することは可能である。

【0124】

図６は、本明細書に従った図１Ａに表されているものに類似する画像化システムを用いて得られた４ミクロンの距離が離れているＨｅＬａ癌細胞の２つの切片の画像を表している。顕微鏡レンズは、１．２５の開口率を伴う倍率１００×の油浸レンズであり、中心波長は４５０ナノメートルに等しい。使用したカメラは、Ｐｈｏｔｏｎ Ｆｏｃｕｓ（Ｒ）（フォトン・フォーカス）のＭＶ－Ｄ１０２４ＥシリーズＣＭＯＳカメラである。

【0125】

この画像を作成するために、顕微鏡レンズの被写体焦点面が変位され、細胞の２つの切片、すなわち細胞質における第１の切片（６１、６３）および細胞の核における第２の切片（６２、６４）の上に中心決めされた。これらの画像は、細胞を断層撮影する本明細書のメソッドオブジェクトの能力を例証する。下側の画像６３、６４は、細胞の形態を、上側の画像６１、６２は『動的な』部分を表す。スケール・バーは２ミクロンに等しい。

【0126】

例として特定数の実施態様を通して説明してきたが、本明細書に従った断層撮影画像化方法およびシステムは、この分野の当業者には自明になると見られる多様な代替、修正、および改良を包含し、これらの多様な代替、修正、および改良が、以下の請求項によって定義されるとおりの本発明の範囲の部分を形成することは理解される。

【符号の説明】

【0127】

１０ 試料
２０ クラスタ
２１ 細胞
２２ 細胞
６１、６２ 画像
６３、６４ 画像
１００ ３次元画像化システム、画像化システム
１０１ 切片
１１０ 光源
１２０ 光学画像化システム
１２１ 顕微鏡レンズ
１２２ レンズ
１２５ 被写体焦点面
１３１ 第１の圧電素子
１３２ 第２の圧電素子
１３５ 制御ユニット
１４０ ２次元取得デバイス、取得デバイス
１４１ 検出平面
１４２ 画像フィールド
１４５ 制御モジュール
１５０ 処理ユニット
２０１、２０２ 破線
２１１、２２１ 細胞核
２１２、２２２ 核小体
２１３、２２３ 細胞質
２１４、２２４ 細胞内小器官
Δ 光軸
λ 照明ビームの中心波長

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】