特表 2024-519578 新規タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-17

(54)【発明の名称】新規タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20240510BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240510BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240510BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47 ZNA

C07K19/00

C07K16/28

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568076

(86)(22)【出願日】2022-05-03

(85)【翻訳文提出日】2023-11-02

(86)【国際出願番号】 KR2022006356

(87)【国際公開番号】W WO2022235061

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】10-2021-0057062

(32)【優先日】2021-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0054782

(32)【優先日】2022-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519367980

【氏名又は名称】セレメディー カンパニー，リミテッド

【住所又は居所原語表記】Ｈ４３０１， ４ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｂｕｎｄａｎｇ Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ． Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＨＩＰ， １７２ Ｄｏｌｍａ－ｒｏ， Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １３６０５ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100137095

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 武史

(74)【代理人】

【識別番号】100091627

【弁理士】

【氏名又は名称】朝比 一夫

(72)【発明者】

【氏名】リ， ジェ ウォン

(72)【発明者】

【氏名】リ， ボ ラム

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、外表面に外来ペプチドが融合し、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異したフェリチンタンパク質に関し、様々な外来ペプチド由来の活性を示すことができるタンパク質に関する。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

外表面に外来ペプチドが融合し、
ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異したフェリチンタンパク質。

【請求項2】

前記外来ペプチドは、薬理活性ペプチドである、請求項１に記載のフェリチンタンパク質。

【請求項3】

前記外来ペプチドは、免疫チェックポイント分子と結合可能なリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片；または疾患抗原エピトープである、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項4】

前記免疫チェックポイント分子は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１およびＮＴＲＫ２からなる群より選択されるいずれかである、請求項３に記載のタンパク質。

【請求項5】

前記抗原結合部位は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３からなる群より選択されるいずれかである、請求項３に記載のタンパク質。

【請求項6】

前記疾患抗原エピトープは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（proteinsase－3）、ムチン１（mucin－1）、ＨＰＶ Ｅ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ １２５、ＡＦＰ、サバイビン (Survivin)、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４、ネオアンチゲン（neoantigen）およびＧＶ１００１からなる群より選択される、請求項３に記載のタンパク質。

【請求項7】

前記外来ペプチドは、フェリチン単量体の隣接するαヘリックスの間の少なくとも１つに融合する、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項8】

前記外来ペプチドは、フェリチン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合する、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項9】

前記外来ペプチドは、フェリチン単量体のＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループまたはＤＥループに融合する、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項10】

前記外来ペプチドは、フェリチン単量体のＮ末端とＡヘリックスの間、またはＥヘリックスとＣ末端の間に融合する、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項11】

突然変異した前記フェリチンタンパク質は、配列番号１の配列において、１５番、１６番、２３番、８２番、８４番、１１７番、１２０番または１２４番のアミノ酸がアラニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換されたものである、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項12】

トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式１を満たす、請求項１に記載のタンパク質。

【数1】

（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、前記フェリチンタンパク質と前記トランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態における前記フェリチンタンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態における前記トランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態における前記フェリチンタンパク質と前記トランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）

【請求項13】

前記トランスフェリン受容体は、ヒトトランスフェリン受容体である、請求項１２に記載のタンパク質。

【請求項14】

前記フェリチンは、ヒトフェリチン重鎖である、請求項１に記載のタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は新規タンパク質に関する。

【背景技術】

【0002】

薬物送達システムとは、医薬品の副作用を最小限に抑え、効能及び効果を極大化し、必要な量の薬物、例えば、タンパク質、核酸又はその他の低分子などを効率よく送達する医薬技術を意味する。新薬開発に必要なコストと時間を低減する効果を有する前記技術は、最近になってナノテクノロジーと結合し、医薬系において新たな付加価値を創出する先端技術の一分野として位置づけている。米国と日本などの技術先進国では、去る８０年代後半から、製薬会社などの企業を中心に新薬開発とともに薬物送達システムの開発に全力を注いでいる。

【0003】

これまでは、ウイルス遺伝子、組換えタンパク質、リポソーム（liposome）、陽イオン性高分子、並びに様々な形態のナノ粒子とナノ物質が、動物細胞内への薬物送達に使用されてきた。しかし、多くの陽イオン性リポソームと陽イオン性高分子は、細胞に強い毒性を示すため、臨床に適用するには不適なことが判明した。また、核酸の安定な細胞膜透過のために、核酸の主鎖を化学的に変形する方法も試みられた。しかし、この方法は、高コストで長時間がかかり、労働集約的な工程を必要とするため、臨床への適用には適していない。意味のある試みとして、量子ドット、磁性粒子又は金ナノ粒子を含む様々な形態のナノ粒子を用いる薬物送達システム（drug delivery system、DDS）が開発されている。しかし、これらの粒子は、細胞に毒性を示し、核酸などの生体高分子を導入するのに容易でない構造を有し、また細胞内への導入効率も低いという欠点があった。

【0004】

細胞内におけるタンパク質／ペプチドの機能の研究または細胞内送達のためには、効率いい送達システムが必要となる。しかしながら、広範なタンパク質／ペプチドを送達できる汎用的な送達システム、多量のタンパク質／ペプチドを収容及び送達できるシステムの開発は、まだ不十分な状況である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、外表面に外来ペプチドが融合し、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異した新規なタンパク質を提供することを目的とする。

【0006】

本発明は、前記タンパク質を含む薬学組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、外表面に外来ペプチドが融合し、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異した免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質を提供する。

【0008】

前記外来ペプチドは、薬理活性ペプチドであってもよい。

【0009】

前記外来ペプチドは、前記免疫チェックポイント分子と結合可能なリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片；または疾患抗原エピトープであってもよい。

【0010】

前記免疫チェックポイント分子は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１およびＮＴＲＫ２からなる群より選択されるいずれかであってもよい。

【0011】

前記抗原結合部位は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３からなる群より選択されるいずれかであってもよい。

【0012】

前記疾患抗原エピトープは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（proteinsase－3）、ムチン１（mucin－1）、ＨＰＶ Ｅ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ １２５、ＡＦＰ、サバイビン (Survivin)、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４、ネオアンチゲン（neoantigen）およびＧＶ１００１からなる群より選択されるものであってもよい。

【0013】

本発明のフェリチンタンパク質は、前記外来ペプチドが融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してなる球状のタンパク質であってもよい。

【0014】

本発明において、前記外来ペプチドは、フェリチン単量体の隣接するαヘリックスの間の少なくとも１つに融合することができる。

【0015】

本発明において、前記外来ペプチドは、フェリチン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。

【0016】

本発明において、前記外来ペプチドは、フェリチン単量体のＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループまたはＤＥループに融合することができる。

【0017】

本発明において、前記外来ペプチドは、フェリチン単量体のＮ末端とＡヘリックスの間、またはＥヘリックスとＣ末端の間に融合することができる。

【0018】

本発明のフェリチンタンパク質は、配列番号１の配列において、１５番、１６番、２３番、８２番、８４番、１１７番、１２０番または１２４番のアミノ酸がアラニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換されたものであってもよい。

【0019】

本発明のフェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式１を満たすことができる。

【0020】

【数1】

【0021】

（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、フェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態におけるフェリチンタンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態におけるトランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態におけるフェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）

【0022】

本発明における前記トランスフェリン受容体への結合力は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力であってもよい。

【0023】

本発明におけるフェリチンは、ヒトフェリチン重鎖であってもよい。

【0024】

本発明のフェリチンタンパク質は、大腸菌生産システムにおいて４０％以上が水溶性分画として存在してもよい。

【発明の効果】

【0025】

本発明のタンパク質は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が低下し、外来ペプチド由来の活性を十分に示すことができる。

【0026】

本発明のタンパク質は、外来ペプチドが多数融合することができ、その外来ペプチド自体と比較してより強化された活性を示すことができる。

【0027】

本発明のタンパク質は、生体適合性と安全性に優れ、炎症反応または免疫原性誘発の可能性が非常に低い。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、野生型（wild type）（native）のヒトフェリチン重鎖（ｈｕＨＦ）およびミュータント（mutant）ヒトフェリチン重鎖タンパク質を製造する基本ベクターの模式図である。

【図2】図２は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌを製造するベクターの模式図およびそのフェリチンタンパク質の製造を確認できる図である。

【図3】図３は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１を製造するベクターの模式図およびそのフェリチンタンパク質の製造を確認できる図である。

【図4】図４は、ｈｕＨＦ_ｎａｔｉｖｅ－ｈ_ｓｍＰＤ１のヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。

【図5】図５は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ－ｈ_ｓｍＰＤ１のヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。

【図6】図６は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌのヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。

【図7】図７は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌのヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。

【図8】図８は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価結果である。

【図9】図９は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価結果である。

【図10】図１０は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価結果である。

【図11】図１１は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞の癌細胞死滅能の評価結果である。

【図12】図１２は、ＬＬＣ１肺癌動物モデルの製造および腫瘍抑制実験の概要図である。

【図13】図１３は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理による腫瘍成長抑制の評価結果である。

【図14】図１４は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理による腫瘍成長抑制の評価結果である。

【図15】図１５は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌの肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティ（avidity）の評価結果である。

【図16】図１６は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌの肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティ（avidity）の評価結果である。

【図17】図１７は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌの肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティ（avidity）の評価結果である。

【図18】図１８は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌまたはこれと抗癌剤の併用時のＬＬＣ１肺癌動物モデルにおける腫瘍成長抑制の評価結果である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明は、外表面に外来ペプチドが融合し、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異した免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合されたフェリチンタンパク質に関する。

【0030】

フェリチン（Ferritin）は、ヒト、動物および微生物に由来するフェリチンであってもよい。

【0031】

ヒトフェリチンは、重鎖（heavy chain、21kDa）と軽鎖（light chain、19kDa）で構成され、前記フェリチンを成している単量体の自己集合能によって球状のナノ粒子を形成する特性を示す。フェリチンは、２４個の単量体が集まって球状の立体構造を有する自己集合体を形成することができる。

【0032】

ヒトフェリチンの場合は、外径が約１２ｎｍ、内径が約８ｎｍである。フェリチン単量体の構造は、５つのαヘリックス構造、すなわちＡヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、ＤヘリックスおよびＥヘリックスが順次連結された形態であり、ループ（loop）と呼ばれる各々のαヘリックス構造のポリペプチドを連結する非定型ポリペプチド部分を含む。

【0033】

ループは、フェリチンにペプチドまたは小さいタンパク質抗原などが挿入されても構造的に壊れない領域（region）である。ここにペプチドを、クローニングを用いて融合させることにより、フェリチンの単量体にエピトープなどのペプチドが位置するペプチド－フェリチン融合タンパク質単量体を製造することができる。ＡヘリックスとＢヘリックスを連結するループをＡＢループ、ＢヘリックスとＣヘリックスを連結するループをＢＣループ、ＣヘリックスとＤヘリックスを連結するループをＣＤループ、ＤヘリックスとＥヘリックスを連結するループをＤＥループとする。

【0034】

フェリチンの情報はＮＣＢＩに公知になっている（GenBank Accession No．NM_000146、NM_002032など）。

【0035】

フェリチンはフェリチン重鎖であってもよく、具体的にはヒトフェリチン重鎖であってもよい。ヒトフェリチン重鎖は「ｈｕＨＦ」と混用して用いられる。

【0036】

フェリチンタンパク質はフェリチン単量体であってもよい。そのため、フェリチン重鎖単量体であってもよく、ヒトフェリチン重鎖単量体であってもよい。

【0037】

フェリチンは、その単量体のいくつかが自己集合して、組織的な構造またはパターンを形成する。本発明のフェリチンタンパク質はナノスケールの粒子である。例えば、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合し、フェリチンタンパク質を形成することができる。

【0038】

本発明のフェリチンタンパク質は球状であってもよい。球状の場合、例えばその粒径は８～５０ｎｍであってもよい。より具体的には、８ｎｍ～５０ｎｍ、８ｎｍ～４５ｎｍ、８ｎｍ～４０ｎｍ、８ｎｍ～３５ｎｍ、８ｎｍ～３０ｎｍ、８ｎｍ～２５ｎｍ、８ｎｍ～２０ｎｍ、８ｎｍ～１５ｎｍであってもよい。

【0039】

本発明のフェリチンタンパク質は、外表面に外来ペプチドが融合したものである。外来ペプチドは、フェリチンに対する外来ペプチドであってもよい。フェリチンタンパク質の外表面に外来ペプチドが融合していればよく、フェリチンタンパク質をなす全てのフェリチン単量体に外来ペプチドが融合している必要はない。

【0040】

例えば、外来ペプチドが融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してフェリチンタンパク質を形成するとき、２４個のフェリチン単量体のうちの少なくとも１個のフェリチン単量体に外来ペプチドが融合していればよい。フェリチンタンパク質の外表面の免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の密度を高めるために、２４個のフェリチン単量体のすべてに外来ペプチドを融合することができる。

【0041】

フェリチンタンパク質をなす各フェリチン単量体には、免疫チェックポイント分子と外来ペプチドを１種または２種以上融合することができる。フェリチンタンパク質をなす各フェリチン単量体は、互いに異なる外来ペプチドが融合していてもよい。

【0042】

外来ペプチドは、薬理活性ペプチドであってもよい。薬理活性を有するものであれば、いずれのペプチドでも制限なく使用することができ、例えば、免疫チェックポイント分子と結合可能なリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片；または疾患抗原エピトープであってもよい。

【0043】

免疫チェックポイント分子（Immune checkpoint molecule）は、Ｔ細胞に結合してＴ細胞を不活性化する役割を果たす。この免疫チェックポイント分子は、例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２などであってもよい。

【0044】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、免疫チェックポイント分子と結合可能なリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片であってもよい。

【0045】

抗体は、ＣＤＲ（complementarity－determining regions）を有する全ての抗体であってもよく、ＩｇＡ、ＩＧＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＷクラス等に属する全ての抗体、その抗原結合断片、ｓｃＦｖなどを含むことができる。

【0046】

例えば、抗体は、疾患抗原の抗体、免疫チェックポイント分子に対する抗体、診断、予測、評価などの目的で検出しようとする抗原に対する抗体、疾患の治療標的となる抗原の抗体などであってもよい。

【0047】

疾患抗原は、免疫応答によって予防、治療、緩和または改善できる全ての疾患の抗原であってもよい。例えば、疾患抗原は、癌細胞、病原体細胞、または病原体に感染した細胞の細胞表面抗原であってもよい。疾患抗原の抗原特異性を決定する特定の部位が疾患抗原エピトープである。

【0048】

疾患は、抗体によって治療できる全ての疾患を含み、例えば、感染性疾患、癌、炎症性疾患などであってもよい。

【0049】

感染性疾患は、例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫またはプリオン感染症であってもよい。

【0050】

炎症性疾患は、例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、自己免疫疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、痛風性関節炎、変形性関節症、腱炎、滑液包炎、乾癬、嚢胞性線維症、骨関節炎、関節リウマチ、炎症性関節炎、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、進行性全身性強皮症（皮膚硬化症）、強直性脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、糖尿病（例えば、１型）、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、グッドパスチャー病、混合性結合組織病、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、悪性貧血、炎症性皮膚疾患、通常型間質性肺炎、石綿肺症、珪肺症、気管支拡張症、ベリリウム肺症、滑石症、塵肺症、サルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、巨細胞性間質性肺炎、細胞性間質性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症および関連形態の血管炎（側頭動脈炎および結節性多発動脈炎）、炎症性皮膚病、肝炎、遅延型過敏反応（例えば、ツタウルシ過敏症）、肺炎、気道の炎症、成人呼吸窮迫症候群、脳炎、即時型過敏反応、喘息、花粉症、アレルギー、急性アナフィラキシー、リウマチ熱、糸球体腎炎、腎盂腎炎、蜂巣炎、膀胱炎、慢性胆嚢炎、虚血（虚血性傷害）、再灌流障害、同種移植片拒絶、宿主対移植片拒絶、虫垂炎、動脈炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、子宮頸管炎、胆管炎、絨毛羊膜炎、結膜炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、脊髄炎、心筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、中耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、睾丸炎、扁桃炎、尿道炎、膀胱炎、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎、外陰炎、外陰膣炎、血管炎、慢性気管支炎、骨髄炎、視神経炎、側頭動脈炎、横断性脊髄炎、壊死性筋膜炎、および壊死性腸炎を含む。

【0051】

癌は、例えば、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌であってもよい。

【0052】

炎症性疾患抗原は、例えば、炎症性サイトカインであってもよい。例えば、ヒト成長ホルモン（human growth hormone）、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン（N－methionyl human growth hormone）およびウシ成長ホルモン（bovine growth hormone）などの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone）；チロキシン（thyroxine）；インシュリン（insulin）；プロインシュリン（proinsulin）；リラキシン（relaxin）；プロリラキシン（prorelaxin）；卵胞刺激ホルモン（follicle stimulating hormone、FSH）、甲状腺刺激ホルモン（thyroid stimulating hormone、TSH）および黄体形成ホルモン（luteinizing hormone、LH）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子（hepatic growth factor）；線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor）；プロラクチン（prolactin）；胎盤性ラクトゲン（placental lactogen）；腫瘍壊死因子－α（tumor necrosis factor such as tumor necrosis factor－alpha、TNF－α）および腫瘍壊死因子－β（tumor necrosis factor－beta、TNF－β）などの腫瘍壊死因子；ミュラー管（mullerian）抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド（mouse gonadotropin－associated peptide）；インヒビン（inhibin）；アクチビン（activin）；血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor）；インテグリン（integrin）；トロンボポエチン（thrombopoietin、TPO）；ＮＧＦ－α（NGF－α）などの神経成長因子（nerve growth factors）；血小板成長因子（platelet－growth factor）；胎盤増殖因子（placental growth factor）；ＴＧＦ－αおよびＴＧＦ－βなどのトランスフォーミング増殖因子（transforming growth factors、TGF）；インスリン様増殖因子－１および－１１（insulin－like growth factor－1 and －11）；エリスロポエチン（erythropoietin、EPO）；骨誘導因子（osteoinductive factors）；インターフェロン－α (IFN－α)、インターフェロン－β（IFN－β）およびインターフェロン－γ（IFN－γ）などのインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（macrophage－CSF、M－CSF）などのコロニー刺激因子（colony stimulating factors、CSF）；顆粒球マクロファージ－ＣＳＦ（granulocyte macrophage－CSF、GM－CSF）；顆粒球－ＣＳＦ（granulocyte－CSF、G－CSF）；ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３などのインターロイキン；並びにＬＩＦおよびキットリガンド（kit ligand、KL）を含むその他のポリペプチド因子を含む。

【0053】

癌抗原は、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（proteinsase－3）、ムチン１（mucin－1）、ＨＰＶ Ｅ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ １２５、ＡＦＰ、サバイビン (Survivin)、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４ネオアンチゲン（neoantigen）であってもよい。前記ネオアンチゲンとは、腫瘍細胞内の体性突然変異によって誘導されて形成される免疫原性ペプチドを意味する。前記ネオアンチゲンは、ＭＨＣ Ｉと複合体を形成し、腫瘍細胞の表面に移動して抗原エピトープとして表示され得るが、Ｔ細胞の受容体（T－cell receptor、TCR）がこのネオアンチゲン－ＭＨＣ Ｉ複合体を認識することによって免疫応答を誘導することができる。

【0054】

抗体は、例えば、癌細胞またはＴ細胞の表面の免疫チェックポイント分子に対する抗体であってもよい。例えば、ＰＤ－１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４０Ｌ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ５２、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１またはＮＴＲＫ２であってもよい。

【0055】

検出しようとする抗原は、例えばバイオマーカーであってもよく、例えば、疾患診断用バイオマーカー、発症リスク予測用バイオマーカー、特定の医薬の予後診断用バイオマーカーなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0056】

ＣＤＲは、抗体の構成成分であるＣＤＲであり、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３からなる群より選択される少なくともいずれか一つであってもよく、例えばＨＣＤＲ３であってもよい。

【0057】

１つまたは２つ以上のＣＤＲをフェリチン単量体に融合することができる。

【0058】

２つ以上のＣＤＲが融合した場合、同一抗体の同一ＣＤＲを２つ以上含んでもよく、同一抗体の互いに異なるＣＤＲを含んでもよく、互いに異なる抗体のＣＤＲを含んでもよい。

【0059】

また、本発明のタンパク質は、互いに異なるＣＤＲが融合したフェリチン単量体を含んで自己集合したものであってもよい。

【0060】

互いに異なるＣＤＲは、同一抗体の互いに異なるＣＤＲまたは互いに異なる抗体のＣＤＲであってもよい。

【0061】

疾患抗原エピトープは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（proteinsase－3）、ムチン１（mucin－1）、ＨＰＶ Ｅ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ １２５、ＡＦＰ、サバイビン (Survivin)、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４、ネオアンチゲン（neoantigen）およびＧＶ１００１からなる群より選択されるものであってもよい。

【0062】

外来ペプチドは、フェリチンタンパク質の外表面に露出することができれば、フェリチン単量体のどこに融合してもよい。外来ペプチドは、フェリチン単量体の自己集合を阻害しない位置に融合する。

【0063】

外来ペプチドがフェリチン単量体の内部に融合し、フェリチンタンパク質の構造が変化し得る。フェリチン単量体の各構成部分のうち内側に入り込んだ部分は、外来ペプチドの融合によって外側に突出することができ、逆に、フェリチン単量体の各構成部分のうち外側に突出していた部分は、外来ペプチドの融合によって内側に入り込むことができる。

【0064】

外来ペプチドは、フェリチンタンパク質のヒトトランスフェリン受容体との結合力を減少させるか、またはヒトトランスフェリン受容体との結合力を阻害する位置に融合することが好ましい。

【0065】

外来ペプチドは、その構造、分子量およびアミノ酸の長さを特定の範囲に限定しない。

【0066】

外来ペプチドは、例えば、そのアミノ酸の長さが２５ａａ以下のリガンド、抗体、またはこれらの断片であってもよい。より具体的には、アミノ酸の長さが２５ａａ以下、２４ａａ以下、２３ａａ以下、２２ａａ以下、２１ａａ以下、２０ａａ以下、１９ａａ以下、１８ａａ以下、１７ａａ以下、１６ａａ以下、１５ａａ以下、１４ａａ以下、１３ａａ以下、１２ａａ以下、１１ａａ以下、１０ａａ以下、９ａａ以下、８ａａ以下、７ａａ以下、６ａａ以下、５ａａ以下であってもよい。また、例えば、そのアミノ酸の長さが３ａａ以上、４ａａ以上、５ａａ以上、６ａａ以上、７ａａ以上、８ａａ以上、９ａａ以上、１０ａａ以上であってもよい。

【0067】

外来ペプチドの融合位置は、特定の位置に限定されず、例えば、フェリチン単量体のαヘリックスの内部（Ａヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、Ｄヘリックス、またはＥヘリックス）、隣接するαヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、ＥヘリックスとＣ末端の間、ヘリックスの内部などに融合することができる。

【0068】

本発明のフェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体に対しては良好に結合しないように突然変異したものである。例えば、本発明のフェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体に対して下記数学式１を満たす。

【0069】

【数2】

【0070】

（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、フェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態におけるフェリチンタンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態におけるトランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態におけるフェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）

【0071】

前記結合力は、例えば、ヒトトランスフェリン受容体への結合力であってもよい。

【0072】

数学式１のＫの値は、１０ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、６０ｎＭ以上、７０ｎＭ以上、８０ｎＭ以上、９０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、１１０ｎＭ以上、１２０ｎＭ以上、１２５ｎＭ以上、１２５ｎＭ超え、１５０ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、２１０ｎＭ以上、２２０ｎＭ以上、２３０ｎＭ以上、２４０ｎＭ以上、２５０ｎＭ以上、２６０ｎＭ以上、２７０ｎＭ以上、２８０ｎＭ以上、２９０ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、３５０ｎＭ以上、４００ｎＭ以上、４５０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、５５０ｎＭ以上、６００ｎＭ以上、７００ｎＭ以上、８００ｎＭ以上、９００ｎＭ以上、１０００ｎＭ以上である。数学式１のＫの値が大きいほど、トランスフェリン受容体への結合力が減少する。

【0073】

トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）は、本発明のフェリチンタンパク質（Ａ）とトランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態で測定される。平衡状態におけるフェリチンタンパク質の濃度（［Ｐ］）、トランスフェリン受容体の濃度（［Ｔ］）、および本発明のタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の濃度（［ＰＴ］）は、公知の様々な方法で測定できる。

【0074】

本発明のフェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体への結合力を低くするために、トランスフェリン受容体との結合に関与する部位に外来ペプチドを融合させることができる。例えば、本発明のフェリチンタンパク質のＢＣループおよびＡヘリックスの部分に外来ペプチドが位置するように前記外来ペプチドを融合させることができる。

【0075】

本発明のフェリチンタンパク質は、当該タンパク質をコードする配列を発現する微生物内で製造されるものであってもよい。

【0076】

微生物は、当該分野で公知の微生物を制限なく使用することができる。例えば、大腸菌であってもよく、具体的にはＢＬ２１（ＤＥ３）であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0077】

微生物系でタンパク質を製造する場合には、得られるタンパク質が細胞質に溶解した状態で存在する場合に分離／精製が容易である。多くの場合、製造されたタンパク質が封入体（inclusion body）などで凝集した状態で存在する。本発明のフェリチンタンパク質は、微生物生産システムにおいて細胞質に溶解した割合が高く示される。そのため、分離／精製および活用が容易である。

【0078】

本発明のフェリチンタンパク質は、例えば、それを製造する大腸菌システムにおいて、全タンパク質における水溶性分画の割合が４０％以上の状態で製造できる。具体的には、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上であってもよい。その上限は、例えば１００％、９９％、９８％、９７％、９６％などであってもよい。

【0079】

本発明のフェリチンタンパク質は、その外来ペプチドの種類によって様々な用途に用いることができる。

【0080】

例えば、外来ペプチドが薬理活性ペプチドである場合、そのような薬理活性を活用する薬学組成物として用いることができる。具体的には、外来ペプチドが免疫チェックポイント分子と結合可能なリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片；または疾患抗原エピトープである場合、前記薬学組成物は癌、感染性疾患、炎症性疾患などであってもよい。

【0081】

本発明は、前記フェリチンタンパク質を含む薬学組成物を提供する。以上のフェリチンタンパク質に関する全ての説明は、本発明の薬学組成物の有効成分としてのフェリチンタンパク質にそのまま適用される。

【0082】

本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を非常に刺激せず、投与成分の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を指す。本発明における「薬学的に許容可能な担体」としては、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうちの１成分又は１成分以上を混合して使用することができる。必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤などの他の通常の添加剤を添加して、組織または臓器に注入するのに適した注射剤の形で製剤化することができる。また、等張性滅菌溶液、または場合によって滅菌水や生理食塩水を添加して注射可能な溶液となり得る乾燥剤（特に凍結乾燥剤）に製剤化することもできる。さらに、標的器官に特異的に作用できるように、標的器官特異的な抗体または他のリガンドを前記担体と結合して使用することができる。

【0083】

また、本発明の組成物は、充填剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤をさらに含むことができる。さらに、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように当業界で公知の方法を使用して製剤化することができる。

【0084】

一実施形態では、前記薬学組成物は注射製剤であってもよく、静脈内投与されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0085】

本発明の用語「有効量」とは、目的とする治療すべき特定の疾患の発症または進行を遅らせるか、または完全に増進するのに必要な量を意味する。

【0086】

本発明において、組成物は薬学的有効量で投与することができる。前記薬学組成物の適切な１日総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で治療医によって決定され得ることは当業者にとって自明なことである。

【0087】

本発明の目的のために、特定の患者に対する具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類および程度、場合によっては他の製剤が使用されるかどうかを含む具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食物、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と併用または同時使用される薬物を含む様々な因子および医薬分野でよく知られている類似因子によって異なるように適用することが好ましい。

【0088】

本発明において、前記薬学組成物は、必要に応じて薬物の製造、使用および販売を管轄する行政機関によって指定された方式での、容器に付帯する注意書きを添付してもよい。前記注意書きは、組成物の形またはヒトもしくは獣医的な投与に関する私益機関による認可を示し、例えば処方薬に関する米国食品医薬品局により認可された表示でもよい。

【0089】

癌は、例えば、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌であってもよい。

【0090】

感染性疾患は、例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫またはプリオン感染症であってもよい。

【0091】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。

【0092】

実施例
１．タンパク質製造用発現ベクターの構成
ｈｕＨＦは、２４個の単量体で構成されている球状のタンパク質ナノ粒子（１２ｎｍ）であり、各単量体は合計５個のαヘリックスで構成されている。本発明者らは、遺伝子クローニングにより、ｈｕＨＦ単量体のトランスフェリン受容体と結合するアミノ酸配列に突然変異を誘導し、表１のｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１（Ｑ１５Ａ、Ｄ１６Ａ、Ｒ２３Ａ、Ｆ８２Ａ、Ｑ８４Ａ）、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ２（Ｑ１５Ａ、Ｄ１６Ａ、Ｒ２３Ａ、Ｆ８２Ａ、Ｑ８４Ａ、Ｅ１１７Ａ、Ｋ１２０Ａ、Ｄ１２４Ａ）を確保した。ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１と２のαヘリックスの間のループ（ＰＤＢ ３ＡＪＯシーケンスを基準にｈｕＨＦ ５Ｔ～１７６Ｇ中のＢＣループ；９２Ｄ／９３Ｗ）とＣ末端の中から選択される位置に抗体ＣＤＲ３ペプチドおよびドメインを遺伝子クローニングにより挿入して送達体を確保した。

【0093】

下記表２の配列を使用し、下記図１～３、表３のベクター模式図に従ってＰＣＲを行い、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ（ＢＣループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌ（ＢＣループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１（Ｃ末端）を製造した。製造された全てのプラスミド発現ベクターをアガロースゲルで精製し、完全なＤＮＡシーケンシングによって配列を確認した。

【0094】

【表1】

【0095】

【表2】

【0096】

【表3】

【0097】

２．タンパク質の生合成
大腸菌株ＢＬ２１［（ｆｈｕＡ２［ｌｏｎ］ｏｍｐＴｇａｌ［ｄｃｍ］ΔｈｓｄＳ）］を前記で製造された発現ベクターでそれぞれ形質転換し、カナマイシン－抵抗性形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌を、５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇのＬ－１カナマイシンを含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ三角フラスコ（Erleｎｍeyer flasks）、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。培地の濁度（Ｏ．Ｄ６００）が約０．５～０．７に達したとき、ＩＰＴＧ（Isopropyl－β－Dthiogalactopyranosid）（１．０ｍＭ）を注入して組換え遺伝子の発現を誘導した。

【0098】

２０℃で１６～１８時間培養した後、培養した大腸菌を４，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体沈殿物を回収し、５ｍｌの破砕溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕機（Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT、USA）を用いて破砕した。破砕後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液と不溶性凝集体を分離した。分離した上澄み液を後の実験で使用した。

【0099】

３．タンパク質の精製
前記実施例２で得られた上澄み液を３段階の過程を経て精製した。まず、１）組換えタンパク質に融合したヒスチジンとニッケルの結合を用いたＮｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを行った後、２）組換えタンパク質を濃縮し、バッファー交換によって蛍光物質を付着し、３）最後に、蛍光物質が付着した自己集合タンパク質ナノ粒子のみを分離するために、スクロース勾配超遠心分離（ultracentifugation）を行った。各段階の詳細は以下の通りである。

【0100】

１）Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー
組換えタンパク質を精製するために、前記と同様の方法で培養された大腸菌を回収し、その細胞ペレットを５ｍＬのライシスバッファー（ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に再浮遊し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕した細胞液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してその上澄み液のみを分離した後、各組換えタンパク質をＮｉ^２＋－ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてそれぞれ分離した（洗浄バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭイミダゾール／溶出バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール）。

【0101】

２）スクロース勾配超高速遠心分離
ＰＢＳ（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）バッファーにスクロースを濃度別にそれぞれ添加し、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％のスクロースを含む溶液をそれぞれ準備した。その後、超高速遠心分離用チューブ（ultraclear 13.2ml tube、Beckman）に各濃度別（４５～２０％）のスクロース溶液を濃度の高い溶液から２ｍｌずつ入れた後、準備した自己集合用バッファーに存在する組換えタンパク質溶液を１ｍｌ充填した後、３５，０００ｒｐｍにおいて４℃で１６時間超高速遠心分離を行った（Ultracentrifuge L－90k、Beckman）。遠心分離後、慎重にパイペットを用いて上層（２０－２５％スクロース溶液部分）を、前記２）に記載されているように超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter）とＰＢＳバッファーを用いて組換えタンパク質のバッファーを交換した。

【0102】

４．タンパク質の水溶性分画の確認
ｐＣＭ（Tac promoter）ベースの様々な発現ベクターでＢＬ２１コンピテントセル（competent cell）を形質転換（transformation）した。単一コロニーをカナマイシン１００ｍｇ／Ｌが添加されたＬＢ液体培地（５０ｍＬ）に接種し、振とう培養器（shaking incubator）で３７℃、１３０ｒｐｍの条件で培養した。濁度（turbidity／optical density at 600nm）が０．５に達すると、ＩＰＴＧの１ｍＭを投与して標的タンパク質の発現を誘導した。その後、２０℃で１２～１６時間培養した後、培養液中の細胞を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）によってスピンダウン（spun－down）し、細胞ペレットを回収して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）バッファーに再浮遊させた。再浮遊された細胞は、ブランソンのソニファイアー（Branson Sonifier、Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT）を用いて破裂した。音波処理後、溶解性タンパク質を含む上澄み液と不溶性タンパク質を含む凝集体は、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）で分離した。分離された溶解性、不溶性タンパク質分画のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって溶解度を確認した（図２、図３）。

【0103】

５．タンパク質の集合の検証
実施例３で製造した各タンパク質の精製された組換えタンパク質ナノ粒子の構造を分析するために、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で組換えタンパク質を撮影した。まず、染色していない精製タンパク質のサンプルを、カーボンコートされた銅電子顕微鏡グリッド（grids）に載せて自然乾燥した。タンパク質の染色された画像を得るために、自然乾燥したサンプルを含む電子顕微鏡グリッドを２％（ｗ／ｖ）水性ウラニルアセテート溶液と共に１０分間室温でインキュベートし、蒸留水で３～４回洗浄した。タンパク質の画像をフィリップスＴｅｃｈｎａｉ １２０ｋＶ電子顕微鏡を用いて観察したところ、各々の粒子が球状のナノ粒子を形成することを確認した（図２、図３）。

【0104】

６．タンパク質の抗原への結合力の測定
前記実施例で製造したタンパク質のＮａｔｉｖｅ型とＭｕｔａｎｔ（ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌ）とのヒトトランスフェリン受容体への結合力を比較した。

【0105】

製造したタンパク質の抗原への結合力Ａを以下の方法により測定した。

【0106】

まず、ヒトトランスフェリン受容体－Ｆｃタグスタンダードを高結合（high－binding）９６ウェルプレートに２μｇ／ｍｌで１００μｌずつ４℃において一晩（オーバーナイト）付着した。

【0107】

そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＢｌｃｏｋ^ＴＭ（ＰＢＳ）ブロッキングバッファー（thermo cat#37515）を１００μｌずつ１時間常温でブロッキングプロセスを行った。

【0108】

そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。前記実施例で製造したタンパク質を濃度区間別に１００μｌずつ４℃で一晩（オーバーナイト）処理した。

【0109】

そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。ｈｅｘａ－Ｈｉｓタグに特異的に結合する抗体（mouse anti His tag antibody、Hisprobe）を１／１０００でＰＢＳＴに希釈し、それを１００μｌずつ１時間常温で処理した。

【0110】

そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。マウス抗体に特異的に結合する抗体（goat anti mouse igG antibody－HRP）を１／１０００でＰＢＳＴに希釈し、それを１００μｌずつ１時間常温で処理した。

【0111】

そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。ＨＲＰと反応して発色反応を示すＴＭＢ溶液を１００μｌずつ１５分間常温で処理した。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液を５０μｌずつ処理した後、ＴＥＣＡＮで波長４５０ｎｍにおける光学密度（optical density）を測定した。それをＬａｎｇｍｕｉｒ ｅｑｕａｔｉｏｎを用いて計算した（表４、図４～図６）。

【0112】

【表4】

【0113】

図７は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌとｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌのｈＴｆＲへの結合力を評価・比較したものである。ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌの場合は、濃度を１００００ｎＭまで増加させても飽和しないことから、ｈＴｆＲへの結合力がさらに減少したことを確認できる。予想飽和点を選定してその結合力Ｋｄの値を計算すれば、約４４００ｎＭとなる。

【0114】

８．ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価
蛍光物質であるＣＦＳＥでヒト肺癌細胞株であるＡ５４９を標識した。１０^６個の細胞にＣＦＳＥを５μＭの濃度で２０分間３７℃のインキュベーターで反応させた。それをＰＢＳで洗浄し、１０^５細胞を２ｍｌのセルプレート（cell plate）に２ｍｌの培養培地（culture media）に希釈して１日間培養した。

【0115】

その後、１０^５個のＮＫ細胞をＣＦＳＥで染色されたＡ５４９細胞株と反応させた。

【0116】

このとき、対照群としてＰＢＳの１０μｌを使用し、実験群としてＣｙ５．５蛍光染料が標識されたｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌ（dICB、dual immune checkpoint blocker）を３μＭ １０μｌ入れた。

【0117】

インキュベーターで１０分間反応させた後、ＮＫ １．１ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＰＥ抗体を用いてＮＫ細胞を標識した。

【0118】

４％ホルムアルデヒド（formaldehyde）でサンプルを固定し、蛍光顕微鏡（fluorescence microscopy）を用いて蛍光画像を確認した。

【0119】

対照群（ＰＢＳ）と比較して、実験群（ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌ）の蛍光画像において、ＮＫ細胞がＡ５４９細胞にさらに付着していることを確認した（図８）。

【0120】

９．ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能およびＮＫ細胞の癌細胞死滅能の評価
蛍光物質であるＣＦＳＥでヒト肺癌細胞株であるＡ５４９を標識した。１０^６個の細胞にＣＦＳＥを５μＭの濃度で２０分間３７℃のインキュベーターで反応させた。それをＰＢＳで洗浄し、１０^４細胞を９６ウェルプレートに２００μｌの培養培地（culture media）に希釈して１日間培養した。

【0121】

その後、ＤＡＰＩで標識された１０^４～１０^５個のＮＫ細胞を、条件に従ってＣＦＳＥで染色されたＡ５４９細胞株と反応させた。

【0122】

このとき、ＰＢＳ １０μｌ、Ａｂｓ（Tecentriq＋mAb－mTIGIT（Bio X Cell, #BE0274）併用投与群）３μＭ １０μｌ（それぞれ３μＭ、合計６μＭ）、およびｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌを３μＭ １０μｌ入れた。

【0123】

結合の測定は、前記反応液をインキュベーターで３０分間反応させた後、ＦＡＣＳ装置でＣＦＳＥ蛍光（fluorescence）とＤＡＰＩ蛍光（fluorescence）を同時に示す細胞の割合を分析した（図９）。これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌ処理時にＮＫ細胞のＡ５４９細胞への結合能が増加することを確認できる。

【0124】

これに関し、蛍光顕微鏡（Fluorescence microscopy）を用いて蛍光画像を確認した（図１０）。ＮＫ １．１ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＰＥ抗体でＮＫ細胞を標識した。

【0125】

毒性の測定は、前記反応液をインキュベーター中で４８時間反応させた後、ＦＡＣＳ装置でサンプルによる毒性能力を検証した。７－ＡＡＤで細胞が死滅する程度を分析した。

【0126】

ＣＦＳＥ蛍光（fluorescence）および７－ＡＡＤ蛍光（fluorescence）を同時に示す細胞の割合を分析し、ＮＫ細胞と癌細胞の割合およびサンプルによるＮＫ細胞の毒性能力を分析した（図１１）。これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌを処理した場合、ＮＫ細胞のＡ５４９細胞に対する死滅能が増加することを確認できる。

【0127】

１０．癌細胞成長抑制能の評価
次のサンプル群（PBS、Tecentriq、Tecentriq＋mAb－mTIGIT、huHF_mutant－dual）に対して、各５匹ずつ、マウス肺癌細胞株であるＬＬＣ１に対する癌細胞成長抑制効果を検証した。テセントリク（Tecentriq）は、肺癌などの治療に使用されるＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体であり、ｍＡｂ－ｍＴＩＧＩＴは、ｍｕｒｉｎｅ ＴＩＧＩＴに結合するモノクローナル抗体である。

【0128】

ＬＬＣ１を５×１０^５個ずつＣ５７ＢＬ／６に皮下移植して腫瘍モデルを形成した。

【0129】

７日後、個体ごとに腫瘍サイズを測定および分類し、各群ごとに同じサイズに調整した。

【0130】

７日目からサンプルを３日ごとに尾静脈を介して静脈注射し、各個体の腫瘍サイズを測定して腫瘍成長抑制効果を比較した（図１２）。

【0131】

図１３には各実験群における日付別の腫瘍サイズを示し、図１４には各実験群における２２日目の腫瘍サイズを示す。これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌの場合は、より少ない用量で処理したにもかかわらず腫瘍サイズが最も小さく、その効果が優れていることを確認できる。

【0132】

１１．細胞アビディティ（Cell avidity）の評価
ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌおよびｍｕｔ－ｈｕＨＦのヒト肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティを分析した。

【0133】

まず、標的細胞（immune cell、cancer cell）を培養して分注した。

【0134】

（１×１０^５個／１０μｌ、１ＦＡＣＳカラム（5ml polystyrene round－bottom tube、Falcon（352052）））。

【0135】

その後、サンプル（薬物（drug）, 抗体（antibody）（抗マウスPD-L1抗体（anti－mouse PD－L1 antibody（BE0101））、抗マウスTIGIT抗体（anti－mouse TIGIT antibody（BE0274））、抗ヒトPD-L1（anti－human PD－L1（BE0285）））を１００μｌ／ＦＡＣＳカラム（column）処理し、対照群には、１００μｌのＦＡＣＳバッファー（0.1% BSA＋0.01% sodium azide in PBS）を処理した（3hr、室温（room temperature））。

【0136】

ＦＡＣＳバッファーを各１ｍｌずつ前記ＦＡＣＳカラムに入れた後、１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去する工程を３回繰り返した。

【0137】

その後、蛍光抗体（Fluorescence antibody）（抗His Tag抗体－PE（anti his tag antibody－PE（SC－8036PE））、抗IgG抗体－PE（anti－IgG antibody－PE）（PE goat F（ab'）2 anti－rat（IgG）secondary antibody（ab7010）、PE F（ab'）2－goat anti－mouse IgG（H＋L）secondary antibody（12－4010－82）））を処理した（2hr, 室温（room temperature））。

【0138】

ＦＡＣＳバッファーを各１ｍｌずつ前記ＦＡＣＳカラムに入れた後、１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去する工程を３回繰り返した。

【0139】

その後、各サンプルＦＡＣＳカラムにＦＡＣＳバッファーを１００ｕｌ入れた後、７－ＡＡＤ（BD Pharmigen（559925））の２μｌを５分間処理した。

【0140】

ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＡＣＳ装置により、各ＦＡＣＳカラムでのライブセルのうちＰＥ蛍光を示す標的細胞の割合を用いて分析した（図１５－１７）。

【0141】

これにより、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌの方が、細胞当たりに結合するサンプルの数が多く、結合した細胞の数にも優れていることを検証した。

【0142】

１２．腫瘍成長抑制能の評価
次のようなサンプル群（PBS、Ab－1、huHF_mutant－dual、huHF_mutant－dual＋Vac）に対して、各５匹ずつ、マウス肺癌細胞株であるＬＬＣ１に対する癌細胞成長抑制効果を検証した。Ａｂ－１はマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用し（Bio X Cell、＃BE0101）、ワクチン（Vac）としてはＬＬＣ－１ ｎｅｏ－ａｎｔｉｇｅｎ ｖａｃｃｉｎｅ（配列番号１０）を使用した。

【0143】

ＬＬＣ１を５×１０^５個ずつＣ５７ＢＬ／６に皮下移植して腫瘍モデルを形成した。

【0144】

７日目からサンプルを３日ごとに尾静脈を介して静脈注射し（Ｇ２群の場合は、６日ごとに注射）、各個体の腫瘍サイズを測定して腫瘍成長抑制効果を比較した（図１８）。

【0145】

Ａｂ－１は３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌは３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、Ｖａｃは１０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で注射した。

【0146】

これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌ処理群の腫瘍成長抑制能に優れており、ワクチンとの併用時にさらに優れた効果を示すことを確認できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【国際調査報告】