特表 2024-519691 腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）の産出方法およびヒト腫瘍治療のための細胞治療薬としてのその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）の産出方法およびヒト腫瘍治療のための細胞治療薬としてのその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/078 20100101AFI20240514BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240514BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240514BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240514BHJP

【ＦＩ】

C12N5/078

C12N5/0783

C12N1/00 B

A61P35/00

A61P37/04

A61K35/17

A61P31/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565894

(86)(22)【出願日】2021-12-08

(85)【翻訳文提出日】2023-12-14

(86)【国際出願番号】 DE2021000194

(87)【国際公開番号】W WO2022247975

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】102021002748.5

(32)【優先日】2021-05-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523403704

【氏名又は名称】ゼルワーク ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＺＥＬＬＷＥＲＫ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】110003487

【氏名又は名称】弁理士法人東海特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ホフメイスター，ハンス

(72)【発明者】

【氏名】イェーガー，エルケ

(72)【発明者】

【氏名】カルバッハ，ユリア

(72)【発明者】

【氏名】シネルニコフ，エフゲニー

(72)【発明者】

【氏名】グスタフ，ディルク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BA30

4B065BB19

4B065BC25

4B065CA44

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB64

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB32

(57)【要約】

本発明は、免疫細胞を、特に原発性腫瘍組織、転移組織、リンパ組織から得た腫瘍浸潤自己Ｔリンパ球（ＴＩＬ）を、および、他の組織（例えば、血液、リンパ液）から得たＴ細胞をも、ミアンダ灌流バイオリアクタ内で単離し、活性化しおよび増殖させる方法、ならびに、これらから、膵臓、肺、肝臓、前立腺、乳房、卵巣、胃、結腸、直腸、骨、脳および皮膚の腫瘍ならびにその他の悪性腫瘍と闘うための免疫細胞治療薬を産出する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＩＬおよび他のＴ細胞をエクスビボで得る方法、ならびに腫瘍と闘うために患者個人の細胞治療薬として使用する方法であって、
該方法の第１段階において、粉砕された組織部分から、規定の細胞を閉鎖ミアンダ灌流バイオリアクタ容器中に入れ、かつ均一に分布させ、
前記細胞を、灌流ミアンダ・バイオリアクタ中にある培養培地中で十分に成長させ、同時に活性化かつ増殖させ、
この際、前記灌流バイオリアクタの流路を通る培地流は、上部流では、フルード数＜０．００５、好ましくは＜０．００２で、底部流では、０または０に近いフルード数で、ミアンダ形状で流れ、
前記培地は、前記沈殿したＴＩＬの上方を、細胞にストレスを与えない指向性のある層流で流れ、かつ十分に成長しおよび拡大培養した細胞が所定の密度に達した後に、前記培地を前記組織部分から分離し、純粋な形態で回収し、こうして分離された前記細胞を遠心分離し、バイアル中の凍結培地中で再懸濁し、アリコート量に分けおよび凍結保存し、かつ、
第２段階で、前記凍結保存されたバイアルを融かし、前記凍結培地を洗浄し、かつ前記細胞を新たに適切な前記培養培地中で懸濁させ、運転準備が整って設置されたさらなるミアンダ灌流バイオリアクタ中に移し、前記バイオリアクタの面積は、前記第１段階の前記ミアンダ灌流バイオリアクタの面積と比較して５対１の比率以上の大きさのコロニー面積を有し、
この際、前記第１段階および前記第２段階のバイオリアクタ容器中で、前記培養培地は酸素が指向性をもって灌流し、かつ前記培養培地に、ＡＢヒト血清、サイトカインおよび抗体の混合物を添加する、方法において、
組織片から十分に成長した前記細胞は、前記ミアンダ灌流バイオリアクタの流路の底で沈殿し、
前記細胞は、前記沈殿後、ほぼ静止する細胞層を形成し、前記細胞層中で、細胞同士は接するが、軽く移動もし、この際、沈殿層中でのＴＩＬ細胞数は、０．１～２×１０^６ＴＩＬ／ｃｍ^２、好ましくは０．５～１×１０^６ＴＩＬ／ｃｍで安定的に増殖し、
前記培養培地はサイトカインおよび抗体を含有し、前記サイトカインはインターロイキン１２の形態、または、インターロイキン２とインターロイキン１２とからなる混合物からなり、かつ前記抗体は抗体４－１ｂｂの形態であり、かつ
前記細胞は、ＴＩＬまたはその他のＴ細胞の高成長量に応じて、添加培地と酸素とを、高酸素的または通常酸素的に、自動制御された供給により得る
ことを特徴とする、方法。

【請求項2】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、腫瘍浸潤ＮＫ細胞（ＴＩＮＫ）またはさらに別の細胞様式である前記細胞を、前記ミアンダ灌流バイオリアクタ内で、適切に添加された培地中で培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記凍結保存されたバイアルを、さらなる拡大培養のために融かし、
前記凍結培地を、遠心分離して前記細胞を再懸濁することにより、ＡＢヒト血清とサイトカインと抗体との混合物からなる新鮮な添加した培地により洗い流し、
細胞懸濁液を、第２段階で、第１段階と同じ様式であるか、またはより大きなコロニー面積を有する一つ以上のミアンダ灌流バイオリアクタ中に移すか、または分割し、
前記ＴＩＬを、前記培養後１２～２０日にわたって前記バイオリアクタ内で拡大培養させ、回収し、ＮａＣｌ溶液で洗浄し、遠心分離し、
前記細胞を、０．９％のＮａＣｌ、２％アルブミンおよび１０％のＤＭＳＯを含有する溶液中で再懸濁し、かつ前記懸濁液を通常の冷却プロセス後に、１００ｍｌのクライオバッグ中に規定量ずつ充填し、窒素を介して貯蔵し、かつ、
このようにして保存されたＴＩＬ懸濁液を引き出し、融かし、適切な投与量を患者に投与する、
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からなる前記細胞治療薬が、腫瘍および感染症の治療のための細胞治療薬として使用するための医薬組成物として用いられることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞治療薬の産出方法。

【請求項5】

前記細胞治療薬を、膵臓、肺、卵巣、乳、結腸、骨髄腫、肝臓、脳腫、前立腺、胃、直腸、血液の腫瘍、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、またはそれらの組み合わせの治療のために採用することを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞治療薬の産出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫細胞、特に原発性腫瘍組織、転移組織、リンパ組織からの腫瘍浸潤自己Ｔリンパ球（ＴＩＬ）を、および他の組織（例えば血液、リンパ液）からのＴ細胞をも、ミアンダ灌流バイオリアクタ内で単離、活性化および増殖させる方法に関し、ならびに、これらから、膵臓、肺、肝臓、前立腺、乳房、卵巣、胃、結腸、直腸、骨、脳および皮膚の腫瘍ならびにその他の悪性腫瘍と闘うための、免疫細胞治療薬を産出に関する。

【背景技術】

【0002】

先行技術から公知であるのは、リンパ球の培養のために、およびこれから癌疾患の治療のための免疫細胞治療薬を「先進的治験医薬品（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（ＡＩＭＰ）として産出するために、以下のインターロイキンを、以下の抗体、血漿増量ゼラチンなどのコーティング剤を有する成長因子、ならびにポリエチレンイミン、ポリエチレングリコールおよびＣ１～Ｃ９などのプロスタサイクリン補体物質などの添加物とともに、使用することが公知であり、すなわち、
・インターロイキン２を、
－抗ＣＤ３抗体とともに、
－抗ＣＤ３および抗ＣＤ１６抗体とともに、
－抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体とともに、
－抗ＣＤ１６抗体とともに、
－抗ＣＤ２８抗体とともに、
－抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ５６抗体とともに、
－インターロイキン７とインターロイキン１７とを併用して、
－インターロイキン１２と抗体ＣＤ３とを併用して、
・インターロイキン１ａを、インターロイキン１５および抗ＣＤ２８抗体と併用して、
・インターロイキン１０を抗ＣＤ８抗体とともに、
・インターロイキン２１を抗ＣＤ５６抗体とともに、
・インターロイキン１９を抗ＣＤ３抗体とともに、
使用することが公知である。

【0003】

さらに、効率的で細胞毒性の高いナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のインビトロでの増幅方法として、抗体４－１ＢＢＬとともにインターロイキン２１を採用することが先行技術から公知である。

【0004】

さらに、先行技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４年；１７２：４７７９）では、ＩＬ－１２遺伝子導入と４－１ＢＢ共刺激の併用が、モデル腫瘍（肺転移モデル）に対する協同抗腫瘍効果にどのような影響を及ぼすかについての実験結果が論じられている。このモデル腫瘍に対する上述の協同抗腫瘍効果を調べるために、ＩＬ－１２遺伝子導入と４－１ＢＢ共刺激とを併用する。ＩＬ－１２によって活性化されたナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）によって媒介される自然免疫応答が、免疫系の活性化を引き起こし、Ｔ細胞の活性化につながる一方で、４－１ＢＢ共刺激は腫瘍特異的Ｔ細胞の機能を改善すると想定された。

【0005】

逆に、ＩＬ－１２遺伝子導入も抗４－１ＢＢ抗体の投与もそれぞれ単独では効果がない。併用療法により、皮下接種した腫瘍の成長を有意に遅らせ、腫瘍を有するマウスの５０％が、腫瘍が完全に退縮して生存した。

【0006】

Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００５ Ｏｃｔ；１２（２０）：１５２６－３３では、Ｘｕ ＤＰ、Ｓａｕｔｅｒ ＢＶ、Ｈｕａｎｇ ＴＧ、Ｍｅｓｅｃｋ Ｍ、Ｗｏｏ ＳＬおよびＣｈｅｎ ＳＨ．は、Ｉｇ－４－１ＢＢＬの全身投与が、局所的な遺伝子導入よりも良好な抗腫瘍反応をもたらしうることを発表した。Ｉｇ－４－１ＢＢＬは、アゴニスト抗４－１ＢＢＢ抗体と比較して、等価の生物学的機能を有していた。従って、可溶性４－１ＢＢＬダイマーは、ヒトの癌治療のための有望な薬剤として開発することができる。

【0007】

ここでは、マウスの癌腫に対する上記の組み合わせを用いた治療の効果についてのみ説明され、腫瘍、転移およびその他の組織の組織部分から細胞を単離しかつ増殖させるための方法、特に培養培地については説明されていない。

【0008】

さらに、先行技術で知られている細胞の全ての培養方法は、培地中の細胞への酸素の供給を、上方にあるもしくはオーバーフローするオーバーレイ雰囲気から、または上にあるオーバーレイおよび下にあるアンダーレイ雰囲気からも行っており、この際、アンダーレイ雰囲気は、酸素透過性膜を用いて、中に細胞を含有する上方にある培地から、上方にある培地へ追加の酸素を放出する。これらの培養方法中に統合された装置または可能性は、培養経過時に増殖する免疫細胞の酸素必要量の増加を、制御して確保するが、これらで記載された培養方法には、これらの装置または可能性が規定されておらず、また、これを行うこともできない（例えば、ＧＲｅｘ容器；アストロム ヴェリセル システム（Ａａｓｔｒｏｍ Ｖｅｒｉｃｅｌｌ－Ｓｙｓｔｅｍ））。

【0009】

また、マウスモデルでの併用応用による好ましい効果が、ヒトでも同じように生じるか否かも公知ではない。マウスモデルで見られた効果が、ヒトでは見られないことは非常に多い。

【0010】

ＷＯ ２０１５ １８９ ３５６ Ａ１は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびインターロイキン２１（ＩＬ－２１）から選択される少なくとも２種類のサイトカインを含むリンパ球を拡大培養するための組成物に関する。さらに、この文献は、臨床的に重要なリンパ球集団を産出する方法に関し、この方法は以下の工程を含み、すなわち、少なくとも１つのリンパ球を含む、哺乳動物由来の身体試料、特に組織試料または体液試料を得る工程と、場合によって身体試料中の細胞を分離する工程と、インビトロでこの身体試料を培養して試料中のリンパ球を拡大培養および／または刺激する工程であって、この培養工程が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１を使用して、場合によって無作為抽出検査で培養試料中の臨床的に重要なリンパ球の存在を決定する工程を含む。この発明はまた、免疫療法と、臨床的に重要なリンパ球の集団とに関する。この身体試料は、哺乳動物の末梢血から選択され、この際、特に腫瘍疾患に罹患しているヒトが選択され、または、哺乳動物、腫瘍疾患を発症するリスクを有する哺乳動物、感染症に罹患している哺乳動物、感染症を発症するリスクを有する哺乳動物、自己免疫疾患に罹患している哺乳動物もしくは自己免疫疾患を発症するリスクを有する哺乳動物から選択される。

【0011】

ＷＯ ２０１５ １８９３５７ Ａ１は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびインターロイキン２１（ＩＬ－２１）から選択される少なくとも２種類のサイトカインを含むリンパ球を拡大培養するための組成物が記載されている。さらに、この文献は、臨床的に重要なリンパ球集団を産出する方法に関し、この方法は以下の工程を含み、すなわち、少なくとも１つのリンパ球を含む、哺乳動物由来の身体試料、特に組織試料または体液試料を得る工程と、場合によって身体試料中の細胞を分離する工程と、インビトロでこの身体試料を培養して試料中のリンパ球を拡大培養および／または刺激する工程であって、この拡大培養工程が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１を使用して、場合によって培養試料中の臨床的に重要なリンパ球の存在を決定する工程を含む。この発明はまた、免疫療法と、臨床的に重要なリンパ球の集団とに関する。

【0012】

ＷＯ ２０２０ ０２５ ７０６ Ａ１には、癌患者の治療に使用するための、腫瘍過剰反応性免疫細胞（ＴＵＲＩＣ）を含有するＴ細胞生成物の産出方法、および、ＴＵＲＩＣを有する少なくとも１つのＴ細胞生成物を含有する組成物が記載されている。この方法は、以下の工程を含んでいて、すなわち、
ａ）患者のＴ細胞を含有する身体試料を準備する工程、
ｂ）場合によって、このＴ細胞を上述の身体試料から単離する工程、
ｃ）サイトカインであるインターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）およびインターロイキン２１（ＩＬ－２１）のサイトカインカクテルならびに刺激ペプチドまたは刺激ペプチド群の存在下において、インビトロで上述のＴ細胞を刺激する工程、
ｄ）上述のＴ細胞試料中の反応係数を決定する工程であって、この反応係数は、上述の刺激ペプチドまたは刺激ペプチド群の少なくとも１つのペプチドを標的とするＴ細胞の存在を示す、工程
ｅ）上述の反応係数が正の場合、上述のＴ細胞試料を腫瘍反応性Ｔ細胞試料として特定し、そうでなければ、上述のＴ細胞試料を非反応性Ｔ細胞試料として特定する工程、
ｆ）ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１の上述のサイトカインカクテルと、自己腫瘍細胞または上述の刺激ペプチドもしくは上述の刺激ペプチド群のうちのいずれか１つとの存在下で、上述の非反応性試料をインビトロで培養する工程、
ｇ）場合によって、上述のＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１のサイトカインカクテルと、上述の刺激ペプチドまたは上述の刺激ペプチド群との存在下において、インビトロで上述のＴ細胞生成物を刺激する工程、
ｈ）上述のＴ細胞生成物中の上述の反応係数を決定する工程、ならびに
ｉ）上述の反応係数が正の場合、上述のＴ細胞生成物を、ＴＵＲＩＣを含有するＴ細胞生成物として選択する工程を
を含む。

【0013】

ＷＯ ２０２０ １９８ ０３１ Ａ１は、肺癌特異的骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬｓ」）の産出方法および使用を開示している。この方法は、以下の工程を含む。
ａ．肺癌患者から得られた骨髄試料を、低酸素環境下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体とともに培養し、低酸素で活性化された骨髄浸潤リンパ球を産出する工程と、
ｂ．低酸素で活性化された上述の骨髄浸潤リンパ球を正常酸素環境で培養して、治療活性化された骨髄浸潤リンパ球を産生する工程と
（ｃ）上述の治療活性化された骨髄湿潤リンパ球を肺癌対象者へ投与する工程と
を含む。

【0014】

ＥＰ ３７ ３０ ６０８ Ａ１による発明は、癌患者を治療する方法に関し、この方法は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与する工程を含み、この方法は以下の工程を含み、すなわち、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１ＴＩＬ集団を得る工程と、
（ｂ）上述の腫瘍断片を閉鎖系に加える工程と、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地で上述の第１ＴＩＬ集団を培養し、第２ＴＩＬ集団を生成することにより、第１拡大培養を実施する工程であって、上述の第１拡大培養は、第１気体透過性表面積を提供する閉鎖した容器内で実施され、上述の第１拡大培養は、上述の第２ＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、上述の第２ＴＩＬ集団の数は、上述の第１ＴＩＬ集団の数よりも少なくとも５０倍多く、工程（ｂ）から工程（ｃ）への移行は上述の系を開放せずに行う、工程と、
（ｄ）上述の第２ＴＩＬ集団の上述の細胞培養培地に、追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２拡大培養を実施して、第３ＴＩＬ集団を生じさせる工程であって、上述の第３ＴＩＬ集団を得るために、上述の第２拡大培養工程を約７～１４日間実施し、この際、上述の第３ＴＩＬ集団は、上述の第２のＴＩＬ集団に比較して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加した亜集団を含み、前記第２の拡大培養は、第２ガス透過性表面積を提供する閉鎖した容器内で実施され、工程（ｃ）から工程（ｄ）への移行は、この系を開放せずに実施する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）から得られた上述の治療用ＴＩＬ集団を回収する工程であって、工程（ｄ）から工程（ｅ）への移行は上述の系を開放せずに行う、工程と、
（ｆ）上述の工程（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸液バッグ中に移す工程であって、工程（ｅ）から（ｆ）への移行は、上述の系を開放せずに行う、工程と
（ｇ）凍結保存方法を使用して、工程（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存する工程と、
（ｈ）工程（ｇ）における上述の輸注バッグからのＴＩＬ集団を対象者に投与する工程と
を含む、方法である。

【0015】

工程（ｈ）での治療上有効な投与量を投与するのに十分なＴＩＬの数は、約１×１０^９～約９×１０^１０個である。

【0016】

この医薬組成物は、癌治療用薬の産出のために採用され、この際、この癌は、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、および腎細胞癌からなる群から選択される。

【0017】

ＷＯ ２０２０ ２３１ ０５８ Ａ１は、ＣＤ８＋ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞が２０％以上の割合で存在するサイトカイン誘導キラー細胞を含む活性化リンパ球、およびその産出方法に関するが、特に、インターロイキン－２の併用投与およびその産出方法が必要ではないので、高い腫瘍細胞殺能力および高い成長率を有し、かつほぼ副作用がないサイトカイン誘導殺細胞を含む活性化リンパ球に関する。

【0018】

ＥＰ ３５ ６５ ８８８ Ａ１は、サイトカインＩＬ２と抗ＣＤ３（Ｏｋｔ３）／抗ＣＤ２８抗体とを用いた２段階／３段階の方法で腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養させる方法を開示している。細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３（抗ＣＤ３）抗体、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、および場合によってはＩ－４ｂｂのようなＴＮＦＲＳＦアゴニストおよび第２ＴＮＦＲＳＦアゴニストを含有する。

【0019】

先行技術で説明されている培養培地は、一貫して非常に高価である。このため、統計的に意味のある臨床研究を行うことが難しく、免疫細胞を用いた治療の一般的な応用の妨げとなっている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

本発明の目的は、細胞、特に腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）およびヒトリンパ組織由来のさらなるＴ細胞を、ミアンダ灌流バイオリアクタを備えた培養システム中で培養する方法を開発することであり、この方法を用いて、従来のインビトロ培養方法で存在する問題である、標準化および再現性の低さ、これらの細胞を大量に得るための困難なプロセス、一般臨床での応用におけるさらにコスト高および不便な条件、ならびに産出コストの高さといった問題が、根本的に解決される。

【課題を解決するための手段】

【0021】

驚くべきことに、これらの本発明の課題は、以下の方法によって解決されることが判明した。すなわち、この方法では
・患者個人の腫瘍から粉砕した組織片を規定の数だけ、ミアンダ灌流バイオリアクタに投入し、均一に分布させ、
・この組織片から成長した細胞、特に腫瘍浸潤Ｔリンパ球を流路の底に沈殿させ、
・沈殿後の細胞は、ほぼ静止した細胞層を形成し、良好な増殖のために細胞同士が密接にかつ同時に交互に接触し、この細胞層中で細胞同士が接触するが、わずかな動きも生じ、これにより、沈殿層中のＴＩＬ細胞数は、安定した増殖のために０．１～２×１０^６ＴＩＬ／ｃｍ^２、好ましくは０．５～１×１０^６ＴＩＬ／ｃｍ^２となり、
・灌流バイオリアクタの流路を通る培地流のミアンダ形状の流れは、フルード数＜０．００５、好ましくは＜０．００２の上部の流れと、０または０に近いフルード数の底面の流れにより行われ、培地は沈殿したＴＩＬの上方を、指向性のある層流で、自然の血管中の血流に似たように流れ、細胞にストレスを与えず、
・この培地は、ＡＢヒト血清、サイトカイン、抗体ならびに照射されおよび破砕されたヒトフィーダー細胞を添加した通常の基本培地からなり、この際、サイトカインは、インターロイキン１２単独、またはインターロイキン２とインターロイキン１２との混合物からなり、もしくはＩＬ１２とＩＬ１５との混合物からなり、かつすべての混合物はさらに抗体４－１ＢＢを含有し、
・アンダーレイチャンバおよびオーバーレイチャンバからなるバイオリアクタ容器内の組織片とそこから十分に成長する細胞には、同時に高酸素または正常酸素で酸素が供給される。

【0022】

上記の組み合わせは、初期段階において、突然変異ＴＩＬおよびその他の組織（血液やリンパ液など）由来の突然変異Ｔ細胞をも特異的に増殖させ、これにより腫瘍の新抗原で予備刺激をされた細胞が増殖するために必要であり、これにより増殖の後期段階において、ＴＩＬの分裂能力は、静置培養または乱流培地中で培養された同じＴＩＬと比較して、顕著により長い時間維持され続け（したがって、著しく高い収率が達成される）ことができる。

【0023】

この新しい方法により、完全に閉鎖された培養方法で、ＡＴＭＰとして数１０^９個から数１０^１０個の免疫細胞を産出することができる。このために、最初にシングルユースの灌流バイオリアクタを私達のＧＭＰブリーダーの無菌室中に設置し、作動させ、かつ制御ユニットを用いて監視する。培地および気体の供給を調節して行い、ｐＨ値、ｐＯ_２濃度および温度は、培地中でセンサーによって継続的に測定され、かつ一定に保たれる。バイオリアクタ容器内のＴＩＬ量が増加するにしたがって、培地供給量はアルゴリズムを介して自動的に増加する。

【0024】

十分な腫瘍組織があれば、１５０ＭＭのバイオリアクタを利用する。免疫細胞を含有する破砕された組織片は、ＧＭＰブリーダーの無菌室中で、運転準備が整って接続されたシングルユース・バイオリアクタ中に入れられる。約１ｍｍ^３の腫瘍組織片を、オーバーレイチャンバの培地中に均一に分布させる。バイオリアクタ容器内で、ＴＩＬは、標準培地（これは、ヒト血清、ＩＬ２、Ｏｃｔ３および照射されたフィーダー細胞を添加した、および／または照射後超音波で破砕されたフィーダー細胞を添加した標準培地である）中で、７～１４日間、腫瘍組織片から継続的に成長し、増殖する。このようにして、４～１０×１０^９個のＴＩＬを育てることができる。培養の間、培地は低流速で沈殿したＴＩＬの上方を循環するように送り出され、グルコース消費量に応じて、培地の規定の割合が新鮮な培地と置き換えられる。これは、制御ユニットのアルゴリズムによって自動的に制御される。ＴＩＬの場合、全拡大培養期間の間、良好な増殖には、細胞間の密接な接触および同時に接触の交換が必須である。ＴＩＬの増殖の前提は、対応する細胞が沈殿後にほぼ静止した細胞層を形成することであり、その細胞層中では細胞は互いに接触するが、わずかな動きも生じ、この際、ＴＩＬの沈殿層中では０．１～２×１０^６ＴＩＬ／ｃｍ^２、好ましくは０．５～１×１０^６ＴＩＬ／ｃｍ^２の細胞数が生じ、ＴＩＬが恒常的に増殖する。

【0025】

患者の治療のためにより多量のＴＩＬを数回投与し、かつこれを、時間間隔を空けて行うべき場合、第１培養過程から回収したＴＩＬの量を分割し、このＴＩＬ量を、作業細胞バンクとして４～８個の１５０ＭＭのバイオリアクタで並行してコロニー形成させるために利用することができる。これらのバイオリアクタの運転により、数１０^１０個のＴＩＬを産出することができる。

【0026】

ＴＩＬの培養には、（例えば、生検から）少量の腫瘍組織しか入手できない場合、オーバーレイおよびアンダーレイチャンバを備えた３０ＭＭのミアンダ灌流バイオリアクタを使用する。３０ＭＭのバイオリアクタ中で、拡大培養過程で得られたＴＩＬをさらに増殖させる場合、次の方法が可能である。すなわち、１５０ＭＭのバイオリアクタをＧＭＰブリーダー内に運転準備を整えて設置し、その上に３０ＭＭのバイオリアクタも設置する。３０ＭＭのバイオリアクタを、その下に配置された１５０ＭＭバイオリアクタと、当初は閉じたホースを介してしっかりと接続する。３０ＭＭのバイオリアクタ内でＴＩＬが通常の量まで増殖し、指数関数的な増殖が平坦化するとすぐに、ＴＩＬは、短時間の振盪により懸濁液になり、１５０ＭＭのバイオリアクタへのホース接続が開放され、ＴＩＬ懸濁液は濾過網を備えた出口はめ管および接続ホースを通って１５０ＭＭのバイオリアクタ容器に移送される。気体の供給、自動的に適合された培地の供給、ならびに培養プロセスの制御および記録は継続される。１５０ＭＭのバイオリアクタ中で３～７日間拡大培養した後、４×１０^９～１×１０^１０のＴＩＬを回収することができ、これはさらなる拡大培養過程に適している。

【0027】

沈殿したＴＩＬに、指向性をもって培地を層状にオーバーフローさせ、この際、全拡大培養期間にわたってグルコースおよび乳酸の濃度を均一に保ち、かつ培地中の酸素分圧を安定させることによって、上記の方法で産生されるＴＩＬの高い再現性が保証される。さらに、灌流技術によって特定の亜集団を好適に増殖できる点が明らかである。ＩＬ２、Ｏｃｔ３およびＩＬ１２の濃度を変更し、ならびにこれらの添加物の持続時間、時系列およびこれに続くこれらの添加物がない新鮮な培地の供給を変更することによりこれらの添加物の洗浄を変更することによって、拡大培養したＴＩＬのいくつかの亜集団の割合に影響を与えることができる。したがって、例えば、ＩＬ１２の作用時間を短くすることにより、ＣＤ８＋ＴＩＬの割合が著しく増加する。さらに、少量のポリエチレングリコールまたはポリエチレンイミンを、バイオリアクタ中での拡大培養期のより遅い過程で添加すると、回収したＴＩＬのトラフィッキング受容体の発現が質的にも量的にも改善される。上述の添加により、新抗原で予備刺激されたＴＩＬを濃縮された量生成することができ、これが腫瘍／腫瘍転移組織に到達する。

【0028】

この新規の培養方法で得られた免疫細胞は、癌と闘うためのＡＴＭＰの産出において、従来公知の方法と比較してさらなる利点を提供するが、これは、この細胞治療薬の産出方法では、同一クリーンルーム内で異なる患者の細胞を並行して培養することが所轄官庁によって承認されている点である、この理由は、いずれにせよ密閉されたバイオリアクタが、非常に有用な無菌バンクであるＧＭＰブリーダー内でそれぞれ追加的に作動するからである。これにより、患者試料間の交差汚染が防止されている。

【0029】

この培養方法は、卓上装置としてモジュール構築されている点も特に重要である。患者個人のＴＩＬ（あるいは他の免疫細胞または幹細胞治療薬）の産出は、適切な装備のある臨床研究施設で可能であり、ＧＭＰ条件下で患者の近くで細胞を培養することが容易になる。

【0030】

本発明による方法により、突然変異腫瘍細胞に対して細胞毒性作用する十分な量のＴＩＬを、制御されたプロセスで再現可能な方法で育ておよび単離することが可能になり、細胞治療で採用するための日常的な産出が実現可能になる。

【0031】

この方法は、腫瘍、転移組織およびその他の組織由来の組織部分から、ＴＩＬをエクスビボで単離、活性化および増殖させるための２段階培養方法として設計されていて、この方法では、時間的に制限された短い初期段階において、細胞は粉砕された組織部分から、灌流バイオリアクタ容器内にある培地中に入り、十分に成長し始める。十分に成長したＴＩＬが所定の密度に達した後、抗ＩＬ２でさらに短期間にわたって特異的に活性化され、かつその後、抗ＩＬ２のない培地でさらに拡大培養する。

【0032】

灌流バイオリアクタ中での第１培養過程からのＴＩＬの回収は、バイオリアクタが完全に成長した時点（これは、それまでに培養培地中で指数関数的なグルコースの上昇が平坦になることで認識できる時点である）で開始される。ＧＭＰに準拠したＴＩＬ回収のために、バイオリアクタを短時間振盪する。ＴＩＬ懸濁液は、バイオリアクタの濾過用はめ管を通って滅菌接続されたホースを介して、２００ｍｌ血液バッグまたは１００ｍｌ血液バッグに移される。この血液バッグをバイオリアクタから分離し、血液バッグ中のＴＩＬの数をアリコートで測定する。１５０ＭＭの灌流バイオリアクタから、Ｔ細胞組織によって異なるが、４～１０×１０^９のＴＩＬが期待できる。

【0033】

第１培養過程から得られた血液バッグ内の懸濁液は、作業細胞バンクとして利用される。それぞれ０．７５×１０^９個のＴＩＬを含有する体積分画が取り出される。ＴＩＬの初回投与量をできるだけ早く患者に利用できるようにするため、１つ以上の部分懸濁液が直ちに１５０ＭＭのバイオリアクタに移され、そこで即座にさらなる培養過程で拡大培養される。第１のＴＩＬ回収から得られた残りの体積分画は、ＤＭＳＯを加えて適切な凍結バッグ中で凍結保存して貯蔵され、その後、第１のＴＩＬ治療後も腫瘍疾患の徴候が検出され、例えば、より高投与量が医学的に必須と判断されるか、または再発もしくは転移により必須となった場合には、この体積分画は、第２培養工程で、１５０ＭＭのバイオリアクタで増殖される。

【0034】

患者個人のＴＩＬ ＡＴＭＰの第２拡大培養は、ＩＬ２、ＩＬ１２および４－１ＢＢ－ＡＢを添加した標準培地中で行う。ＴＩＬの収率は、通常第１増殖時の収率とほぼ同じである。

【0035】

第２培養過程で回収された各ＴＩＬ懸濁液は以下のように処理される。すなわち、１５０ＭＭのバイオリアクタは、容積５０ｍｌのＴＩＬ懸濁液を含有する。この懸濁液は、濾過用はめ管を通って、体積１００ｍｌの血液バッグに移され、バッグ内のＴＩＬがバッグの双方のホース接続部に対して沈殿しうるように、動かさずに２°～８℃で３時間貯蔵される。培地上清は血液バッグから無菌で約２０ｍｌの体積の残量を除いてピペットで取り出される。その後、このＴＩＬを８０ｍｌの０．９％のＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、遠心管（５０ｍｌ）中に充填し、遠心分離し、かつその後新たに、２％のヒトアルブミンと１０％のＤＭＳＯとを含有する合計９０ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁する。細胞の計数およびＡＴＭＰの放出に関する分析のために、懸濁液を１０ｍｌ取り出し、クライオチューブ中に分布させ、必要な分析を行う。取り出した試料（合計１０ｍｌ）中の細胞数を測定し、ＦＡＣＳ分析を行う。残りの８０ｍｌのＴＩＬ懸濁液中には３～８×１０^９ＴＩＬが含有されているはずである。この懸濁液をさらに１００ｍｌの血液バッグ中に分布させ、各バッグが、２．５×１０^９のＴＩＬが２％のヒトアルブミンを含む０．９％ＮａＣｌ溶液中に含有するようにする。ＴＩＬ－ＡＩＭＰバッグが薬局方の基準値に基づいて放出されると、製剤は、既知の条件下でかつ既知の期限内に、患者を治療する医者に輸送され、かつ引き渡される。この細胞懸濁液は、６時間から最長２０時間以内に輸液に使用されなければならない。輸液バッグが常温になったら、患者に静脈輸液を行う。投与量は治療する医者が決定する。

【0036】

本発明の方法のある構成では、十分に成長した１５０ＭＭのバイオリアクタから、エクスビボで増殖したＴＩＬを、組織残渣から濾過し、回収し、洗浄し、遠心分離し、ヒトアルブミンを含むＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、規定のポーションとして、輸液バッグ中に充填し、および数時間以内に制御された輸送条件下で患者に輸送することができ、そこで常温にして、患者に輸注することができるが、これにより、まだ他の治療法が知られていない本願導入部で挙げた腫瘍疾患（膵臓癌、肺癌、子宮内膜癌、乳癌、結腸癌、肝臓癌、脳腫瘍、前立腺癌、胃癌、黒色腫、進行リンパ腫）の治療のために用いることができる。

【0037】

本発明の別の構成では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または他の由来のＴ細胞は、細胞治療薬としての医薬組成物として培養され、この際、治療用の細胞治療薬またはその組み合わせが培養される。

【0038】

臨床応用のために、凍結保存されたバイアルを、治療上有意な量のＴＩＬが第２拡大培養段階で予定時期に産出されるように、適時融かす。この目的のために、凍結培地を洗浄した後、ＴＩＬを新たに適切な培養培地中で懸濁する。ＴＩＬ懸濁液（５千万から１億個の生きた細胞）は、運転準備が整って設置されたさらなるミアンダ・バイオリアクタに移される。ＴＩＬをさらに拡大培養させるためのこの第２プロセス段階は、上述のミアンダ・バイオリアクタと同様のミアンダ・バイオリアクタで行われるが、コロニー形成面積はより広い。さらなる増殖のために、新鮮な添加された培養培地を使用する。１２～２０日間増殖すると、５億個以上のＴＩＬがミアンダ灌流バイオリアクタ内で規則的に大いに成長する。このＴＩＬを回収し、洗浄後、ヒトアルブミンを含むＮａＣｌ溶液中に再懸濁する。このＴＩＬ懸濁液を輸液バッグ中に充填する。細胞回収日に生存率と細胞数とを測定し、さらに薬局方に従い、無菌性、マーカープロファイル、細胞のパラクリン発生を分析する。このＴＩＬ懸濁液を常温に保ち、直ちに臨床担当者に輸送する。ＴＩＬは遅くとも１２～２０時間後に適用されなければならない。

【0039】

過剰量のＴＩＬは凍結保存される。これは、後にさらなるＴＩＬ投与量の産出が必須になった場合に使用可能となる。５億個のＴＩＬの場合、ヒトアルブミンを含むＮａＣｌ溶液を最大１００ｍｌ投入する。

【0040】

本発明を、ミアンダ灌流バイオリアクタ中におけるＴＩＬの単離および増殖のための実施例に基づき、より詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】ミアンダ灌流バイオリアクタの概略断面図である。

【図2】実施例１による方法が実施されるミアンダ灌流バイオリアクタの概略上面図である。

【符号の説明】

【0042】

１ バイオリアクタ容器
２ カバー
３ アンダーレイチャンバ
４ ミアンダ灌流チャンバ
５ オーバーレイチャンバ
６ 底面プレート
７ 膜
８ 仕切り壁
９ アンダーレイ雰囲気の供給部
１０ アンダーレイ雰囲気の排出部
１１ 培養培地の供給部
１２ 培養培地の排出部
１３ オーバーレイ雰囲気の供給部
１４ オーバーレイ雰囲気の排出部
１５ 流出はめ管
１６ 濾過網
１７ セルブロスのオーバーフロー

【発明を実施するための形態】

【0043】

（実施例１）
ＴＩＬまたは他のＴ細胞を産出するための出発材料は、例えば、固形の臓器腫瘍もしくはその転移組織、またはそのすぐ周囲の組織を外科的に除去する際に生じる組織画分、またはこの目的のために取り出される組織画分である。出発材料としては、通常約１ｍｌの体積の組織量で十分である。この組織試料は培地とともに輸送容器に入れられる。この容器は閉鎖されて常温に保たれ、組織取り出し場所から、免疫細胞製剤の産出のためにクリーンルーム領域中に搬送される。この手術組織片は、クリーンルーム内で、ＬＦＢ下で１～２ｍｍ^３の大きさの片に粉砕され、第１段階でＤＥ１０ ２０１８ ０００ ５６１．６に記載のミアンダ灌流バイオリアクタに移される。粉砕された組織片は、ミアンダ灌流バイオリアクタ内で均一に分布し、灌流モードで培養される。ミアンダ・バイオリアクタは、ＧＭＰブリーダー内で運転準備が整った状態で接続され、制御ユニットにより、継続的に監視され、ほぼ自動的に制御され、かつ記録される。

【0044】

ミアンダ灌流バイオリアクタは、好ましくは透明なポリマー材料からなる長方形のバイオリアクタ容器１からなり、蓋２で、無菌的に閉じられている。バイオリアクタ容器１は、上下に重なって配置された３つのチャンバ３、４、５に区分されていて、最も低いチャンバ３はアンダーレイチャンバとして、アンダーレイチャンバ３の上方に配置されたチャンバ４はミアンダ灌流チャンバとして、かつミアンダ灌流チャンバ４の上方に配置されたチャンバ５はオーバーレイチャンバとして形成されている。

【0045】

アンダーレイチャンバ３とミアンダ灌流チャンバ４とは、穴あき底面プレート６によって互いに分けられていて、この底面プレートは、上に酸素を透過する膜７が密に固定されている。アンダーレイチャンバ３には、気体、特に空気と酸素との混合気体または窒素と酸素との混合気体（酸素の割合が調整されている）を流入させるための供給部９と排出部１０とが存在していて、これらにより、気体、特に、空気と酸素との混合物、または、窒素と酸素との混合物が貫流可能になり、この中で、酸素の割合が調節されている。酸素は、ミアンダ灌流チャンバ４の穴あき底面プレート６に密に固定された気体透過性膜７を通して、窒素よりも好都合に拡散する。ミアンダ灌流チャンバ４内の貫流では、細胞の拡大培養の間、オーバーレイチャンバからも、アンダーレイチャンバからも、（拡散によって）調節された量の酸素が培養培地中に到達する。

【0046】

ミアンダ灌流チャンバ４には、培地用の供給部１１および排出部１２があり、オーバーレイチャンバ５には、オーバーレイ雰囲気用の供給部および排出部１３、１４ならびに出口はめ管１５が存在する。オーバーレイチャンバ５内部には、流出部の手前に、出口はめ管１５に濾過網１６が配置されている。ミアンダ灌流チャンバ４の排出部１２には、さらに、使用済みセルブロスを排出するための余水部１７もある。余水部の高さは調節可能である。

【0047】

ミアンダ灌流チャンバ４は、仕切り壁８を備えた底面プレート６）からなり、これらの仕切り壁８は、上面８上に配置された帯状の仕切り壁であり、これらの仕切り壁８は、底面プレート６を区分し、ミアンダ灌流チャンバ４に気体と培地とによるミアンダ貫流を発生させ、この際、仕切り壁８どうしの距離Ａと、およびミアンダ灌流チャンバ４の側壁と端壁とからの距離Ａの選択は、流れ筋中で、仕切り壁８により形成される流路が、フルード数＜０．００５の平均層上流を形成するように行われている。細胞量（ＴＩＬまたは他の細胞）の増殖過程で細胞数が増加するにつれて、新鮮な培地の供給が継続的に増え、この際、これは適切なアルゴリズムによって自動的に制御されている。この際、底面流は、フルード数０に近い状態に保たれ、これにより細胞の攪拌が防がれる。ここで記した流動状況により、細胞ストレスが防止され、流路の底面で成長する細胞層全体にわたって、均質な栄養材の供給が確保される。

【0048】

オーバーレイチャンバ（５）は、気体のオーバーフロー用の供給部１３および排出部１４を有する。このオーバーレイチャンバには、アンダーレイチャンバ５）と同じ気体／気体混合物が貫流するが、細胞には、細胞のタイプに応じて、高酸素性（９０％までのＯ_２）、通常酸素性（２１％までのＯ_２）または低酸素性（２％までのＯ_２）で酸素が供給される。

【0049】

培養過程では、通常７～１４日間、細胞を組織片から十分に成長させ、この十分に成長した細胞も同時に増殖する。このようにして、腫瘍組織からＴＩＬをより大量に産出することができる。しかし、ＴＩＮＫおよびさらなる細胞もこのようにして組織から得ることができる。バイオリアクタ内のグルコース消費量が１日あたり１００～３００ｍｇに達すると、ＴＩＬは、濾過網１６を備えた、バイオリアクタ容器１の出口はめ管１５を介して、濾液として組織残渣から分離される。

【0050】

第１段階で組織片をバイオリアクタ容器１中に移して以降、活性化され拡大培養した細胞を充填するまでの全プロセスは、完全に閉鎖された容器系で行われる。培養は、適切な培地、すなわち、ＡＢヒト血清、サイトカイン、抗体および照射ヒトフィーダー細胞からなる特定の混合物を一時的に添加した適切な培地中で行われ、この際、インターロイキン１２の形態のサイトカインまたはインターロイキン２とインターロイキン１２との混合物からなるサイトカインと、抗体４－１ｂｂの形態での抗体とが入れられる。個別の場合に応じて、バイオリアクタの流路の表面上に固定された添加物により、より速い増殖および活性化が達成できる。ＴＩＬおよびその他の免疫細胞の場合、この第１段階で増殖および分離したＴＩＬを遠心分離し、凍結培地中で再懸濁し、およびアリコート量に分ける（１バイアルあたり約５０００万個のＴＩＬ）。試料は液体窒素を介して気相で貯蔵される。

【0051】

腫瘍、転移組織および他の組織の組織部分から細胞を単離および増殖させるための本発明による方法により、単一の閉じた工程で、自己組織片からなる細かく切った組織片から、所定量の細胞を、バイオリアクタ内にある培養培地中で十分に成長させ、同時にこれらの細胞を活性化および増殖させ、その後それらを組織残渣から分離することが可能である。特に、このようにして、腫瘍浸潤自己Ｔリンパ球（ＴＩＬ）を、腫瘍組織、転移組織、それらの周辺組織、および腫瘍細胞に侵されたリンパ節から得ることができる。本発明による培養培地により、灌流バイオリアクタの流路内の流動条件および気体条件下で細胞を急速に成長させることができる。ＴＩＬの場合、好ましくは、特に腫瘍細胞またはこの周囲から得られる細胞が拡大培養され、これらの細胞が腫瘍細胞に対して特異的な細胞毒性を有する。

【図1】

【図2】

【国際調査報告】