特表 2024-519700 ナノ粒子分散液の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】ナノ粒子分散液の製造方法

(51)【国際特許分類】

   B01J 19/00 20060101AFI20240514BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 47/14 20170101ALI20240514BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240514BHJP

   A61K 47/08 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 47/06 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240514BHJP

   B01J 19/26 20060101ALI20240514BHJP

   B01J 13/00 20060101ALI20240514BHJP

【ＦＩ】

B01J19/00 N

A61K9/10

A61K9/127

A61K47/12

A61K47/14

A61K47/24

A61K47/28

A61K47/10

A61K47/08

A61K47/06

A61K47/22

A61K47/26

A61K38/02

A61K48/00

A61K31/713

A61K31/7105

A61K31/711

A61P43/00 111

B01J19/26

B01J13/00 B

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023566550

(86)(22)【出願日】2022-05-05

(85)【翻訳文提出日】2023-12-20

(86)【国際出願番号】 EP2022062222

(87)【国際公開番号】W WO2022234050

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】21172324.2

(32)【優先日】2021-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521346313

【氏名又は名称】レオン－ナノドラッグス ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100133503

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 一哉

(72)【発明者】

【氏名】ドゥビエラ， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】フォグラー， ユリアン

(72)【発明者】

【氏名】クレメント， パスカーレ

(72)【発明者】

【氏名】スティーネカー， フランク

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4G065

4G075

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA20

4C076AA21

4C076AA22

4C076CC29

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4G065AB19X

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4G075FB01

4G075FB02

4G075FB04

4G075FB06

4G075FB12

(57)【要約】

本明細書に提示されている本開示は、有機流れと水性流れとを高圧で正面衝突させることを含む方法で、例えばリポソームなどのナノ粒子などの分散液を製造するための方法を提供する。
【選択図】図５Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子の分散液を製造するための方法であって、前記方法が、
ａ）有機溶媒及び前記両親媒性脂質を含む第１の流れを供給するステップと、
ｂ）水性溶媒を含む第２の流れを供給するステップと、
ｃ）第１のノズルを通じて高圧下で前記第１の流れを圧送すること及び第２のノズルを通じて高圧下で反応チャンバに前記第２の流れを圧送することであって、前記第１のノズルが前記第２のノズルから約１８０°の角度で配置されているステップと、
ｄ）反応チャンバ内で前記第１の流れと前記第２の流れを正面で衝突させることであって、
前記第１の流れと前記第２の流れの流量比が、１：１．５～１：４．５の範囲であるステップと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記第１の流れと前記第２の流れの前記流量比が、１：１．５～１：４の範囲、又は１：２～１：４．５の範囲、又は１：２～１：４の範囲であり、前記第１の流れと前記第２の流れの前記流量比が、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４又は約１：４．５である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

総流量の比が、１ｍＬ／分～１，０００ｍＬ／分の範囲、又は５ｍＬ／分～８００ｍＬ／分の範囲である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記総流量の比が、１００ｍＬ／分～５００ｍＬ／分の範囲であり、前記第１の流れと前記第２の流れの前記流量比が１：１．２～１：２．５の範囲、又は１：２～１：４の範囲である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のノズルが第１の開口を含み、前記第２のノズルが第２の開口を含み、前記第１の開口及び前記第２の開口の直径が、４０μｍ～８００μｍの範囲である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の開口又は前記第２の開口の前記直径が、他の開口の直径よりも少なくとも約５０％大きい、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の流れの圧力が、前記第２の流れの圧力以下である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ナノ粒子が、ユニラメラリポソーム、多層リポソーム、単一のバイラメラリポソーム、多重二重層リポソーム、多胞性リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス及びリポポリプレックスからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記両親媒性脂質が、脂肪酸、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、グリセロリン脂質、リン脂質、ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ステロール、コレステロール、プレノール、カロテノイド、レチノール、レチナール、レチノール酸、β－カロテン、トコフェロール、糖脂質、ＬＩＰＯＩＤ Ｓ１００、ＰＥＧ化脂質及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）の群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の流れが、少なくとも１種の更なる両親媒性脂質を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の流れが、両親媒性脂質、又は脂肪酸、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、グリセロリン脂質、リン脂質、ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ステロール、コレステロール、プレノール、カロテノイド、レチノール、レチナール、レチノール酸、β－カロテン、トコフェロール、糖脂質、ＬＩＰＯＩＤ Ｓ１００、ＰＥＧ化脂質、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）及びこれらの任意の組合せの群から選択される脂質の組合せを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第１の流れが、ＰＥＧ化脂質、コレステロール、及びカチオン性脂質、及びリン脂質を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第１の流れが、アルコール、ケトン、ハロゲン化溶媒、アミド又はエーテルから選択される有機溶媒を含み、任意選択で前記溶媒がアルコールであり、好ましくはエタノールである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第１の流れが、０．１モル％～２モル％の範囲の濃度でＰＥＧ化脂質を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第１の流れ又は前記第２の流れが、原薬を更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記原薬が、小分子、ペプチド及び核酸の群から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の流れが、核酸を更に含み、好ましくは、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択され、任意選択で前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレ－ｍｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選択され、更に任意選択で抗原をコードしたＤＮＡ及びｍＲＮＡから選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ナノ粒子分散液を濾過することで精製するステップ、
前記ナノ粒子分散液を凍結乾燥に供するステップ、又は
前記ナノ粒子分散液からクロスフロー濾過で前記有機溶媒を除去するステップ
を更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ナノ粒子の平均粒子径が２０ｎｍ～１００ｎｍである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記反応チャンバ、前記第１のノズル及び前記第２のノズルを含む、ジェット衝突リアクタを設けるステップを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記第１のノズル及び前記第２のノズルのそれぞれが、供給ラインに接続されており、各供給ラインが、前記それぞれのノズルに高圧下で前記第１の流れ及び前記第２の流れを供給するために配置されているポンプに任意選択では関連づけられている、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

各流れの圧力が、０．１～１２０バールの範囲、任意選択で１～４０バールの範囲の値から独立して選択される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

全体の形状が実質的に回転楕円である前記反応チャンバ（６）が反応チャンバ壁（３）の内部表面（２）によって画定され、前記チャンバ（６）が、
（ａ）互いに相対する位置に対してなど、前記反応チャンバ（６）の第１の中心軸（ｘ）上の対向する位置に配置されている第１の流体入口及び第２の流体入口（４）であって、前記第１の流体入口が前記第１のノズルを含み、前記第２の流体入口（４）が前記第２のノズル（５、１３、２３）を含む、第１の流体入口及び第２の流体入口（４）と、
（ｂ）前記第１の中心軸（ｘ）に対して垂直な前記チャンバ（６）の第２の中心軸（ｙ）に配置されている第３の位置に配置されている流体出口（７）と、
を含み、
前記第１のノズル（５、１３、２３）と前記第２のノズル（５、１３、２３）との間の距離（ｄ）が、前記第１の中心軸線（ｘ）に沿って前記反応チャンバ（６）の直径と同一又はこれよりも小さい、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記第１のノズル（５、１３、２３）及び前記第２のノズル（５、１３、２３）がそれぞれ下流端（１２、２２）を有し、それぞれのノズル（５、１３、２３）の前記下流端（１２、２２）が、前記チャンバ壁（３）の前記内部表面（２）と実質的に位置合わせされ、及び／又は前記チャンバ（６）の中心に向かい前記第１の中心軸（ｘ）に沿って前記第１の流れと前記第２の流れを方向付け、前記第１の流れと前記第２の流れを約１８０°の角度で衝突させるように配置されている、請求項２４に記載の方法。

【請求項25】

（ｉ）前記反応チャンバ（６）が、前記第１の中心軸（ｘ）に沿って、高さ、基底及び半径を有する球形キャップの全体的な形状を有し、前記高さが前記半径よりも大きく、前記高さが好ましくは前記半径の１１０％～１７０％であり、前記基底が前記流体出口（７）によって画定され、及び／又は
（ｉｉ）前記反応チャンバ壁（３）の前記内部表面（２）の本質的にすべてが、任意選択で前記第１の流体入口及び／若しくは前記第２の流体入口（４）の一部又は前記流体出口（７）の一部である前記内部表面（２）の一部分を除いて実質的に球形であり、及び／又は
（ｉｉｉ）前記反応チャンバ（６）が、他の入口開口又は出口開口を含まない、
請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

前記反応チャンバ（６）が、０．２５ｍＬ以下の体積を有し、前記第１の流体入口（４）の前記ノズル（５、１３、２３）と前記第２の流体入口（４）のノズル（５、１３、２３）との間の距離（ｄ）が５ｍｍ以下である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記第１の流体入口及び前記第２の流体入口（４）のそれぞれに、上流端（１１、２１）、前記第１の流体入口又は前記第２の流体入口（４）の前記ノズル（５、１３、２３）を保持する下流端（１２、２２）及び前記上流端から前記下流端に流体を導くための流体導管（１４、２４）を有する流体入口コネクタ（１０、２０）が設けられており、各流体入口コネクタ（１０、２０）の前記下流端が、前記第１の流体入口及び前記第２の流体入口（４）を提供するように前記チャンバ壁（３）へと逆向きに挿入可能であり、前記第１の流体入口及び／又は前記第２の流体入口（４）を提供する前記流体入口コネクタ（１０、２０）が、任意選択で、単一フェルール継手又は二重フェルール継手により前記チャンバ壁（３）に接合されている、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記流体入口コネクタ（１０、２０）が、
前記流体入口コネクタ（１０、２０）の前記上流端（１１、２１）及び前記流体導管（１４、２４）の上流部分を含む上流セグメントと、
前記ノズル（５、１３、２３）を備えた前記流体入口コネクタの前記下流端（１２、２２）及び前記流体導管（１４、２４）の下流部分を備えた下流セグメントと、を有し、前記流体導管（１４、２４）の前記上流部分の直径が、前記流体導管（１４、２４）の前記下流部分の直径よりも大きい、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記第１のノズル（５、１３、２３）及び／又は前記第２のノズル（５、１３、２３）が、サファイア、ルビー、ダイアモンド、セラミック又は鋼から任意選択で作製されている単純噴孔ノズル（５、１３、２３）である、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記第１のノズル（５、１３、２３）が第１の孔の直径を有し、前記第２のノズル（５、１３、２３）が第２の孔の直径を有し、前記第１の孔の直径及び／又は前記第２の孔の直径が、２０μｍ～５００μｍの範囲であり、前記第２の孔の直径が、任意選択で前記第１の孔の直径よりも大きく、前記第１の孔の直径に対する前記第２の孔の直径の比率が、任意選択で１．２～５である、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第２の孔の直径に対して前記第１の中心軸（ｘ）に沿った前記反応チャンバ（６）の前記直径の比率が、６～６０の範囲である、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記流体出口（７）の直径に対して前記第１の中心軸（ｘ）に沿った前記反応チャンバ（６）の前記直径の比率が、約１．２～３の範囲である、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記反応チャンバ壁（３）の前記内部表面（２）が、０．８Ｒａ以下の表面粗さを呈し、Ｒａが、ＩＳＯ４２８７：１９９７に従って決定される、請求項２３～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記第１の流れ及び前記第２の流れのそれぞれが、０．１～１２０バールの範囲の圧力で、任意選択では１～４０バールの範囲の圧力でそれぞれのノズル（５、１３、２３）を通じて押し込まれ、任意選択で、前記第１の流体流れ及び前記第２の流体流れのそれぞれが、約１～１０００ｍＬ／分の範囲の流量で前記反応チャンバ（６）に方向付けられる、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記第２のノズル（５、１３、２３）の前記孔が、前記第１のノズル（５、１３、２３）の前記孔より大きく、及び／又は
前記第２の流れの前記流量が、前記第１の流れの前記流量よりも大きく、
前記第１の流れの前記圧力及び前記第２の流れの前記圧力が、前記反応チャンバに入ったとき、前記第１の流れ及び前記第２の流れが実質的に同一の運動エネルギーを有するように適合され、前記運動エネルギーが、任意選択で式Ｅ_ｋ＝１／２＊ｍ＊ｖ^２に従って算出されている、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書に提示されている本開示は、有機流れと水性流れとを高圧で正面衝突させることを含む方法で、例えばリポソーム又は脂質ナノ粒子などの脂質キャリアの分散液を製造するための方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

医薬産業及びバイオテクノロジー産業は、ワクチン接種及び遺伝子治療を含む様々な疾患用途のために、原薬、特に核酸を安全かつ首尾よく送達することができる技術に対する必要をますます高めており、緊急度を高くしている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの供給に対する性能限界及びヒトにおけるアデノウイルス技術の適用に関するいくらかの懸念から理解されるように、現在この必要性を完全には満たしていない。

【0003】

脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＬＮＰ）などの脂質キャリア及び関連技術は、原薬を送達する試験済みの有効で安全な方法を提供する。ＬＮＰについての主な問題のうちの１つは、十分な量での製造と、商品化に必要とされるバッチ再現性基準である。ＬＮＰでの原薬の送達について複数の理論が存在しているが、とりわけジェット衝突技術は、核酸ベースワクチンの製造に首尾よく適用されている。ただし、その効率及び有用性は最適化にはほど遠い状態である。

【0004】

「リポソーム」及び「脂質ナノ粒子」（ＬＮＰ）といった用語は互換的に使用されることもあるが、前者は一般にはリン脂質から構成され、少なくとも１種の脂質二重層を含有する球形の小胞を指すものの、ＬＮＰの構造の構造はそれほど規則ではないことがある。ＬＮＰは、「様々な遺伝的ペイロードの安定かつ十分なカプセル化に十分適しており、内部の水の存在が少ないか最小限である、より複雑な内部脂質構造を有する新世代のリポソーム」として説明されてきた。更には、他の脂質キャリア又は例えばリポプレックス、リポポリプレックス、多層リポソーム又は中実脂質ナノ粒子などの脂質ナノ粒子構造が存在する。

【0005】

リポソームは、少なくとも１種の（ｏｎ）リン脂質二重層に囲まれた水性コアからなる、３０ｎｍ～数マイクロメートルの範囲の粒径を有するナノサイズの小胞構造として定義されている。サイズと疎水性及び親水性といった特性（加えて、生体適合性）ゆえに、リポソームは薬物送達には有望なシステムである。リポソームでは、水溶性薬物を水性コアにカプセル化することができ、脂質二重層は水不溶性薬物の封入を担っている。リポソームの特性は、脂質組成、表面電荷、サイズ及び調製方法によって非常に異なっている。更には、二重層成分の選択によって、「剛性」又は「流動性」及び二重層の電荷が決定される。

【0006】

難溶性原薬の経口バイオアベイラビリティは、原薬の粒径を減少させることで増加可能であることが知られている。更には、難溶性の有効医薬品のナノサイズ化及び／又はカプセル化、並びに例えば非経口投与用の有効医薬品をカプセル化するためのナノ技術の適用は、例えばバイオアベイラビリティの増加、副作用の低減、漏出接合部を通る透過を増強することによる腫瘍部位へのパッシブターゲティングといった点で利点を示した。

【0007】

医薬品を設計するときには、薬物のパッシブターゲティングが可能であることを理由に、粒径を自由に設定可能であることが有利である。更には、医薬品、特に非経口で投与されるときには、無菌でなければならない。したがって、非経口製品については、滅菌濾過を可能とする小さな粒径が有用である。他の種類の滅菌（例えば、オートクレーブ）は、リポソームを破壊する傾向が非常に強いため、使用されない。

【0008】

脂質キャリアシステムを製造するために、様々な技術が使用される。

【0009】

溶媒／非溶媒沈殿法は、ナノ粒子、特に脂質系ナノ粒子の製造に有用であることが分かっている。溶媒／非溶媒沈殿とは、物質が溶媒中に溶解していることを意味する。これによって、液体ジェットと、非溶媒を含有する第２の液体ジェットとが衝突し、それによって溶解した物質が沈殿する。マイクロジェットリアクタ技術は、溶媒／非溶媒沈殿法によるナノ粒子合成のための自動化された連続アプローチのために使用される。この技術は、溶媒と非溶媒の乱流混合ゾーンを生成するが、これはナノメートル範囲の粒子の沈殿に特に好適である。

【0010】

特許文献１は、特許文献２に記載のマイクロジェットリアクタを使用して界面活性分子の存在下で溶媒／非溶媒沈殿を説明する。こうしたマイクロジェットリアクタは、リアクタハウジングによって囲まれているリアクタチャンバで共通する衝突点にて液体媒体を噴霧するための関連ポンプ及び供給ラインをそれぞれ備えた、互いに対向して配置された少なくとも２つのノズル（ピンホール）を有する。別の開口は、ガス、蒸発液体、冷却液体又は冷却ガスが通過してリアクタチャンバ中のガス雰囲気を維持するための、又は冷却するためのリアクタハウジングに設けられている。更なる開口は、得られた生成物及び過剰なガスをリアクタチャンバから取り除くために設けられている。したがって、ガス、蒸発液体又は冷却ガスは、リアクタ内部のガス雰囲気を維持するために、又は得られた生成物を冷却するために開口を通じてリアクタチャンバへと導入され、得られた生成物及び過剰なガスは、ガス入口側で過圧するか、生成物及びガス出口側で加圧することで、この開口を通じてリアクタチャンバから取り除かれる。溶媒／非溶媒沈殿がかかるマイクロジェットリアクタで行われた場合、沈殿粒子の分散液が得られる。

【0011】

例えば治療アプローチ又はワクチン接種のためなど特に脂質ナノ粒子の商業的用途では、容易にスケールアップすることができるロバストな製造方法を提供することと所望の生成物の迅速な製造を提供することが非常に重要である。更には、製造プロセスが、製品開発のプロセス中又はスケールアップ中に生じ得る様々な必要性及び要件に適合可能であることも重要である。脂質ナノ粒子は、ワクチン接種及び遺伝子治療などの治療用途に対して適切であり得る核酸又は核酸構築物にとっての好適なキャリア又は送達ビヒクルであり得るため、製造プロセスはまた、こうした種類の有効成分及び分子を好適に取り扱わなければならない。

【0012】

したがって、異なる種類の生成物への適合、かつロバストで迅速かつ確実に所望の生成物の製造といった点で柔軟性がある脂質系ナノ粒子を製造するための方法を提供することが、本発明の目的である。別の目的は、プロセス開発に汎用性がある脂質系ナノ粒子を製造するための方法を提供することである。先行技術のジェット衝突リアクタの１つ以上の不利又は制限を克服することができるジェット衝突リアクタの使用に基づいた、当該粒子を製造するための方法を提供することが更なる目的である。本発明の更なる目的は、以下の本発明の説明、実施例、及び特許請求の範囲に基づき明らかにされるであろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】欧州特許第２３９５９７８号明細書

【特許文献2】欧州特許第１１６５２２４号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

第１の態様では、本発明は、少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子の分散液を製造するための方法に関し、方法は、ａ）有機溶媒及び少なくとも両親媒性脂質を含む第１の流れを供給するステップと、ｂ）水性溶媒を含む第２の流れを供給するステップと、ｃ）第１のノズルを通じて高圧下で第１の流れを圧送するステップ及び第２のノズルを通じて高圧下で反応チャンバに第２の流れを圧送するステップであって、第１のノズルが第２のノズルから約１８０°の角度で配置されているステップと、ｄ）反応チャンバ内で第１の流れと第２の流れを正面で衝突させるステップであって、第１の流れと第２の流れの流量比が、約１：１．５～約１：４．５未満の範囲であるステップと、を含む。

【0015】

更なる態様では、本発明の第１の態様の方法で製造されたナノ粒子分散液が本明細書に開示される。

【0016】

更なる態様では、本発明の第１の態様の方法で製造されたナノ粒子分散液を含む医薬組成物が本明細書に開示される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A】市販のマイクロ流体ミキサを使用して調製された、実施例１のリポソームの粒径及びＰＤＩにおけるＳＰＣ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ダイズホスファチジルコリン）／コレステロール比の効果を示す。

【図1B】本発明の方法（すなわち、ジェット衝突技術（システムＢ））を使用して調製された、実施例１のリポソームの粒径及びＰＤＩに関するＳＰＣ／コレステロール比の効果を示す。３：１（３３ｍｏｌ％のコレステノール、ＩＤ１、ＩＤ３、ＩＤ５及びＩＤ７）及び２：１（５０ｍｏｌ％のコレステロール、ＩＤ２、ＩＤ４、ＩＤ６、ＩＤ８）のＳＰＣ／コレステロール重量比を試験した。動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を使用してデータを取得した（ｎ＝１）。

【図2】ジェット衝突技術（システムＢ）を用いて観察されたように、実施例１で調製されたリポソームの粒径及びＰＤＩにおけるリアクタノズル径の効果を示す。適用されたノズル径は、第１の開口（有機流れ）については１００μｍで第２の開口（水性流れ）については２００μｍ（ＩＤ３、ＩＤ４）、第１の開口については２００μｍで第２の開口については３００μｍ（ＩＤ９、ＩＤ１０）であった。動的光散乱法を使用してデータを取得する（ｎ＝１）。

【図3A】実施例１で調製されたリポソームの粒径及びＰＤＩにおける流量比（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｒａｔｉｏｓ、ＦＲＲ）及び総流量（ｔｏｔａｌ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ、ＴＦＲ）の効果を示す。

【図3B】実施例１で調製されたリポソームの粒径及びＰＤＩにおける流量比及び総流量の効果を示す。

【図3C】実施例１で調製されたリポソームの粒径及びＰＤＩにおける流量比及び総流量の効果を示す。

【図3D】実施例１で調製されたリポソームの粒径及びＰＤＩにおける流量比及び総流量の効果を示す。図３Ａは、市販のマイクロ流体ミキサのＦＲＲの効果を示す。 図３Ｂは、本発明によるジェット衝突システム（システムＢ）を使用したＦＲＲの効果を示す。図３Ｃは、市販のマイクロ流体ミキサのＴＦＲの効果を示す。 図３Ｄは、本発明によるジェット衝突システム（システムＢ）を使用したＴＦＲの効果を示す。動的光散乱法を使用してデータを取得した（ｎ＝１）。

【図4A】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／ｄｅｆａｕｌｔ－ｓｏｕｒｃｅ／ｐｎｉ－ｆｉｌｅｓ／ ａｐｐ－ｎｏｔｅｓ／ｐｎｉ－ａｐｐ－ｂｔ－０１３．ｐｄｆ？ｓｆｖｒｓｎ＝ａａ６６８３２４＿０、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．から出版されたＢｒｏｗｎ Ａ．，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．，Ｓｈｅｌｌ Ｉｐ，Ｈｅｕｃｋ Ｇ．，Ｒａｍｓａｙ Ｅ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（２０１８）（２０２１年５月５日に再検索）を参照し、市販のマイクロ流体ミキサを使用して得られたリポソームの粒径及びＰＤＩ特性評価を示す。

【図4C】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／ｄｅｆａｕｌｔ－ｓｏｕｒｃｅ／ｐｎｉ－ｆｉｌｅｓ／ ａｐｐ－ｎｏｔｅｓ／ｐｎｉ－ａｐｐ－ｂｔ－０１３．ｐｄｆ？ｓｆｖｒｓｎ＝ａａ６６８３２４＿０、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．から出版されたＢｒｏｗｎ Ａ．，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．，Ｓｈｅｌｌ Ｉｐ，Ｈｅｕｃｋ Ｇ．，Ｒａｍｓａｙ Ｅ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（２０１８）（２０２１年５月５日に再検索）を参照し、市販のマイクロ流体ミキサを使用して得られたリポソームの粒径及びＰＤＩ特性評価を示す。

【図4B】本発明によるジェット衝突法（システムＢ）を使用して調製された実施例２（ｎ＝１）に記載されるような製剤２のリポソームの粒径及びＰＤＩを示す。

【図4D】本発明によるジェット衝突法（システムＢ）を使用して調製された実施例２（ｎ＝１）に記載されるような製剤２のリポソームの粒径及びＰＤＩを示す。図４Ｂでは、流量比（ＦＲＲ）の効果を示す（ＴＦＲは９０ｍＬ／分であった）。ｘ軸上に示された１．０、１．５、２．０、３．０及び４．０の流量は、１：１、１：１．５、１：２．０、１：３．０及び１：４の流量（第１／有機流れ、第２／水性流れ）を指す。図４Ａ及び図４Ｂは、有機溶媒である第１の流れの流量に対する水性溶媒である第２の流れの流量の増加によって粒径が減少し、ＰＤＩが増加するといった傾向が生じることを示す。図４Ｄは、ジェット衝突法を使用して調製されたリポソームのＴＦＲ（有機：水性流れのＦＲＲは１：２であった）の効果を示す。この場合、粒径は、３０ｍＬ／分～３００ｍＬ／分の範囲のＴＦＲに関しては安定したままであった。図４Ｃは、マイクロ流体システムでのＴＦＲの効果を比較して示す。ＴＦＲの増加効果は、粒径に影響を及ぼすと考えられる。

【図5A】実施例２に従って２つの異なるリポソーム脂質製剤から調製されたリポソームでのＦＲＲ及びＴＦＲ効果を示す。

【図5B】実施例２に従って２つの異なるリポソーム脂質製剤から調製されたリポソームでのＦＲＲ及びＴＦＲ効果を示す。

【図5C】実施例２に従って２つの異なるリポソーム脂質製剤から調製されたリポソームでのＦＲＲ及びＴＦＲ効果を示す。

【図5D】実施例２に従って２つの異なるリポソーム脂質製剤から調製されたリポソームでのＦＲＲ及びＴＦＲ効果を示す。

【図5E】実施例２に従って２つの異なるリポソーム脂質製剤から調製されたリポソームでのＦＲＲ及びＴＦＲ効果を示す。

【図5F】実施例２に従って２つの異なるリポソーム脂質製剤から調製されたリポソームでのＦＲＲ及びＴＦＲ効果を示す。ＦＲＲ比較についてはＴＦＲは９０ｍＬ／分であり、ＴＦＲ比較についてはＦＲＲは１：２であった（有機：水性）。図５Ａ及び図５Ｂは、実施例２（ｎ＝３）に記載されるように、製剤１のリポソームについての粒径及びＰＤＩにおけるＦＲＲ（図５Ａ）及びＴＦＲ（図５Ｂ）の効果を示す。図５Ｃ及び図５Ｄは、実施例２（ｎ＝１）に記載されるように、製剤２のリポソームについての粒径及びＰＤＩにおけるＦＲＲ（図５Ｃ）及びＴＦＲ（図５Ｄ）の効果を示す。図５Ｅ及び図５Ｆは、それぞれＴＦＲ及びＦＲＲに基づき、製剤１のＰＥＧ化リポソームの１週間の物理的安定性を示す（粒径直径（ｎｍ）については左の棒：ｔ＝０、右の棒：ｔ＝１週間、○：ＰＤＩについてはｔ＝０、△＝ｔ＝１週間）。動的光散乱法を使用してデータを取得し、平均±ＳＤとして表示する（ｎ＝３）。

【図5G】それぞれＴＦＲ及びＦＲＲに基づき、製剤２（ｎ＝１）のＰＥＧ化リポソームの１週間の物理的安定性を示す（粒径直径（ｎｍ）については左の棒：ｔ＝０、右の棒：ｔ＝１週間、○：ＰＤＩについてはｔ＝０、△＝ｔ＝１週間）。

【図5H】それぞれＴＦＲ及びＦＲＲに基づき、製剤２（ｎ＝１）のＰＥＧ化リポソームの１週間の物理的安定性を示す（粒径直径（ｎｍ）については左の棒：ｔ＝０、右の棒：ｔ＝１週間、○：ＰＤＩについてはｔ＝０、△＝ｔ＝１週間）。動的光散乱法を使用してデータを取得した。

【図6A】異なるＴＦＲ条件で得られたリポソーム試料のクライオＴＥＭ画像を示す。

【図6B】異なるＴＦＲ条件で得られたリポソーム試料のクライオＴＥＭ画像を示す。図６Ａは、試料調製に使用される炭素グリッドに主に接着された数百の小さなユニラメラリポソーム並びに大きなバイラメラ及び多胞性粒子を示す（ＰＤＩ：０．１７、ＴＦＲ：３０ｍＬ／分）。図６Ｂは、炭素グリッドに接着された小さなユニラメラ小胞の主たる粒子画分に加えて、小さなユニラメラリポソーム及びバイラメラリポソームの混合物を示す（ＰＤＩ：０．１６５、ＴＦＲ：９０ｍＬ／分）。

【図7】本発明の方法（システムＢ）で得られた実施例３の粒子のクライオＴＥＭ分析の結果を示す。

【図8】リアクタのノズル径と粒径（Ｚ平均、ｎｍ）との相関を示す。リアクタは、ノズル径に従って直径（μｍ）でラベル付けされる。一例では、リアクタ４００／２００は、第２の（水性）流れがこれを通って圧送される直径４００μｍの（第２の）ノズル開口を有し、第１の（有機）流れがこれを通って圧送される直径２００μｍの（第１の）ノズル開口を有する。

【図9】異なる総流量（ＴＦＲ）Ｌｏｇ圧力（「Ｌｏｇ Ｄｒｕｃｋ ａｂｓｏｌｕｔ［バール］」、ｘ軸）と粒径（Ｚ平均［ｎｍ］、ｙ軸）との相関を示す（○：５０ｍＬ／分、☆：１８０ｍＬ／分、△：３１２．５ｍＬ／分）。パラメータは、切片＝８０．５５６、傾き＝－３．２３６５を推定する。

【図10】流量比（ＦＲＲ）と多分散性指標（ＰＤＩ、ｙ軸）との相関を示す。ｘ軸上に示された１．５、２、２．５、３、３．５及び４といった流量比（ＦＲＲ）は、それぞれ、１：１．５、１：２、１：２．５、１．３、１：３．５及び１：４の流量（第１／有機流れ：第２／水性流れ）を指す。点線は、９５％の信頼区間（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ、ＣＩ）バンドを示す。

【図11】実施例５に記載されるように、システムＢで循環されたＦｌｕｃ ｍＲＮＡ（ＡＰＥｘｂｉｏ）のゲル電気泳動を示す。以下の時点：Ｌ（ラダー）、ｔ＝０、開始前、プライミング後、２秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、３分、４分及び空のレーン、の後に試料を採取し、左から右へと別個のレーンで分析した。開始ｔ＝０及び４分時点と比較すると、有意なｍＲＮＡ分解は観察されない（機器を通る約１２０個の通路に対応）。

【図12】トランスフェクションあたり１０μｇのｍＲＮＡ（ＥＥ％アッセイによる）を使用し、実施例６に記載のインビトロトランスフェクションアッセイの結果を示す。すべてのデータは、ｎ＝６、ノンパラメトリック、クラスカル・ウォリスポストＡＶＧ＋／－ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１である。ジェット衝突及びマイクロ流体混合のそれぞれによって生成された両方の試験群のＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ内封ＬＮＰについて、高いトランスフェクションを観察した。

【図13】実施例６に記載のインビボトランスフェクションアッセイの結果のグラフ表示である。これは、（投与後の）経時的な全身のインビボ遺伝子送達定量化を示す。図に示されるように、Ｆｌｕｃ発現は、両方の試験群と同様に、投与後６時間でピークに達してその後低下することを観察した。

【図14】縮尺どおりではないが、本開示の一実施形態による、ジェット衝突リアクタ（１）を示す。チャンバ壁（３）の内部表面（２）により画定された反応チャンバ（６）は、２つの流体入口（４）及び流体出口（７）を除いて実質的に球形である。流体入口（４）は、反応チャンバ（６）の第１の中心軸（ｘ）上の対向する位置に配置され、互いに向き合っている。流体入口（４）のそれぞれは、本実施形態では単純噴孔ノズルであるノズル（５）を含む。流体出口（７）は、第１の中心軸（ｘ）に垂直な第２の中心軸（ｙ）上に位置づけられている。２つのノズル（４）間の距離（ｄ）は、球形の反応チャンバ（６）の直径と実質的に同一である。

【図15】本開示の一実施形態による、流体入口コネクタ（１０）を示す。コネクタ（１０）は、上流端（１１）、その下流位置でノズル（１３）を保持する下流端（１２）及び上流端（１１）から下流端（１２）まで流体を導通するための流体導管（１４）を有する。流体入口コネクタ（１０）は、本発明によるジェット衝突リアクタ（図示せず）用の流体入口を設け、こうしたリアクタの壁へと逆向きに挿入可能であるように設計されている。図は縮尺どおりではない。

【図16】縮尺どおりではないが、本開示の別の実施形態による流体入口コネクタ（２０）を示す。また、このコネクタ（２０）は、流体入口を設けるように、本発明によるジェット衝突リアクタ（図示せず）の壁へと逆向きに挿入可能であるように設計されている。このコネクタ（２０）は、上流端（２１）、その下流位置でノズル（２３）を保持する下流端（２２）及び上流端（２１）から下流端（２２）まで流体を導通するための流体導管（２４）を有する。

【発明を実施するための形態】

【0018】

第１の態様では、本発明は、少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子の分散液を製造するための方法に関し、方法は、ａ）有機溶媒及び両親媒性脂質を含む第１の流れを供給するステップと、ｂ）水性溶媒を含む第２の流れを供給するステップと、ｃ）第１のノズルを通じて高圧下で第１の流れを圧送するステップ及び第２のノズルを通じて高圧下で反応チャンバに第２の流れを圧送するステップであって、第１のノズルが第２のノズルから約１８０°の角度で配置されているステップと、ｄ）反応チャンバ内で第１の流れと第２の流れを正面で衝突させるステップであって、第１の流れと第２の流れの流量比が、１：１．５～１：４．５の範囲であるステップと、を含む。

【0019】

本発明の主題は、本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することで更に容易に理解することができる。本開示は、本明細書に記載及び／又は示された特定の生成物、方法、条件又はパラメータを限定せず、本明細書で使用される用語は、単なる例として特定の実施形態を記載する目的のためであり、請求される開示を限定しようとするものではないことを理解されたい。

【0020】

特段本明細書で定義されない限り、本願と関連して使用される化学用語及び技術用語は、当業者によって共通して理解されるような意味を有するものとする。更には、特段文脈で必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0021】

本開示では、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の言及を含んでおり、特段文脈が明確にそれ以外の言及を示さない限りは、特定の数値への言及は少なくともそうした特定の値を含む。「複数の」という用語は、本明細書に使用される場合、２つ以上を意味する。値が概数として表されるときには、「約」という先行詞の使用により、特定の値は別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は、包括的であり、かつ組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、指示された数字又は数字の範囲から０．０００１～１０％の逸脱を指す。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、指示された数字又は数字の範囲から最大２５％の逸脱を指す。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、列挙されたすべての要素を包含するが、更なる命名されていない要素もまた含んでもよく、すべての同じ品質及び意味を有する「を包含する」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「を含有する」という用語と互換的に使用されてもよい。「からなる」という用語は、列挙された要素又はステップから構成されることを意味しており、すべての同じ品質及び意味を有する「から構成される」という用語と互換的に使用されてもよい。

【0022】

ナノ粒子の分散液
「分散液」という用語は、本明細書に使用される場合、両親媒性脂質を含むナノ粒子が、水性液体などの別の物質の連続相に分散されている系を指す。いくつかの実施形態では、分散液は、コロイド溶液、コロイド又は懸濁液を含む。

【0023】

当業者であれば、超微細粒子とも称される「ナノ粒子」は、約１０００ｎｍ未満の物質の粒子として通常定義されることを理解するであろう。本明細書に開示されたものなどのナノ粒子分散液では、ナノ粒子の粒径に変動がある。したがってナノ粒子の「平均粒子径」及び「多分散性指標」又は「ＰＤＩ」を指すのに有用である。「平均粒子径」といった用語は、ナノ粒子の径を記載するために本明細書で使用されるときには、ｚ平均径を指す。本明細書全体を通じ、動的光散乱法によってｚ平均径を測定する。動的光散乱法（ＤＬＳ）は、懸濁液中における小粒子の粒度分布プロファイルを決定するために使用されることで一般には知られている物理的技術である。測定については、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ａｄｖａｎｃｅ Ｒａｎｇｅ又はＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＡＴ又はＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ若しくはＺＳ９０といったＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．製のＺｅｔａｓｉｚｅｒデバイス、あるいはＷｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＤＬＳ技術などの他の好適なデバイスを使用することができ、Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ製のＳｔｕｎｎｅｒなどのデバイスもまた使用することができる。平均粒子径の決定については、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ又はＵｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ Ｓｔｕｎｎｅｒを、測定中２５℃の一定の温度にて使用することができる。多分散性指標（ＰＤＩ）とともにｚ平均径は、好ましくはＩＳＯ２２４１２：２００８に定義されるようにＤＬＳ測定強度自己相関関数のキュムラント分析から算出される。ＰＤＩは、０～１の範囲で調整される、粒子径分布幅の無次元概算値である。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによれば、０．４以下のＰＤＩを有する試料は、単分散であると考えられる。

【0024】

いくつかの実施形態では、分散液のナノ粒子の平均粒子径は、１～５００ｎｍ、５～４００ｎｍ、１０～２００ｎｍ、又は２０～１００ｎｍ、又は３０～９０ｎｍ、又は４０～８０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍ未満、又は９０ｎｍ未満、又は８０ｎｍ未満、又は７０ｎｍ未満の平均粒子径を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均粒子径は、１０～２０ｎｍ、２０～３０ｎｍ、３０～４０ｎｍ、４０～５０ｎｍ、５０～６０ｎｍ、６０～７０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、８０～９０ｎｍ又は９０～１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均粒子径は、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ又は１００ｎｍである。

【0025】

いくつかの実施形態では、分散液のナノ粒子の多分散性指標（ＰＤＩ）は、０．４未満、又は０．３未満、又は０．２５未満、又は０．２未満、又は０．１未満である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のＰＤＩは、０．０１～０．０５、又は０．０５～０．１、又は０．１～０．１５、又は０．１５～０．２、又は０．２～０．２５、又は０．２５～０．３の範囲である。

【0026】

脂質ナノ粒子組成物
本発明の方法で製造されたナノ粒子は、少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子である。言い換えれば、製造されたナノ粒子は、脂質系ナノ粒子又は脂質ナノ粒子である。脂質ナノ粒子の例としては、複雑な内部構造を有するナノ粒子、いくつかの場合では、リポソームなどの、水性の内部を最小限～全く含有しない、より構造化されたナノ粒子が挙げられてもよい。この用語は、少なくとも１つの脂質二重層と、任意選択で水系内部相を含むナノ粒子を指すために典型的には使用される。ただし、「リポソーム」及び「脂質ナノ粒子」（ＬＮＰと略されることもある）という用語もまた、多くの場合互換的に使用される。他の表現は多くの場合、リポプレックス、リポポリプレックス、ユニラメラリポソーム又は多層リポソームなどの特定の種類の脂質ナノ粒子に使用される。

【0027】

一実施形態では、本開示による方法は、脂質ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス又はリポポリプレックス及びこれらの組合せから選択されるナノ粒子の分散液を製造する。他の実施形態では、本発明の方法により製造された脂質系ナノ粒子は、ユニラメラリポソーム（単一の二重層）、多層リポソーム、多重小胞リポソーム、単一のバイラメラリポソーム、多重二重層リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス及びリポポリプレックスの群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明の方法により製造された脂質系ナノ粒子は、上に列挙された種類の脂質ナノ粒子のいずれかの組合せである。

【0028】

当業者であれば、大量の脂質ナノ粒子が臨床目的で現在使用されているか臨床開発段階にあることを理解するであろう。これらのナノ粒子のうちのいずれかは、有機溶媒流れ及び／又は水性溶媒流れのすべての成分又はそれらの成分の一部を衝突させることで本明細書に開示される方法によって製造され得る。

【0029】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ホスファチジルコリン、ＨＳＰＣ（水素添加ダイズホスファチジルコリン）、ＰＥＧ化脂質（例えば、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ポリエチレングリコール）ポリマーにコンジュゲートされた脂質）、ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＧ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、ＥＰＣ（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、卵ホスファチジルコリン）、ＤＯＰＳ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ジオレオイルホスファチジルセリン）、ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＳＭ（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ、スフィンゴミエリン）、ＭＰＥＧ（ｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、メトキシポリエチレングリコール）、ＤＭＰＣ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＧ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＳＰＧ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ＤＥＰＣ（ｄｉｅｒｕｃｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ジエルコイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｌｙ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｐｈｏｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ジオレオリーｓｎ－グリセロ－ホホエタノールアミン）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）に共有結合、すなわちコンジュゲートされた脂質、ｍＰＥＧ－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン脂質コンジュゲート、ｍＰＥＧに共有結合されたリン脂質、カルジオリピン、ＤＳＰＥ－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］又はこれらの任意の組合せの群から選択される両親媒性脂質を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は５６：３９：５のモル比でＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は２：１のモル比でＤＳＰＣとコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＧ、コレステロール及びトリオレインを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５５：４５のモル比でＥＰＣとコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３：７のモル比でＤＯＰＳとＰＯＰＣを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は６０：４０のモル比でＳＭとコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は３：２：０．０１５のモル比でＤＳＰＣ、ＭＰＥＧ－２０００及びＤＳＰＥを含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は７：３のモル比でＤＭＰＣとＤＭＰＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２：０．８：１：０．４のモル比でＨＳＰＣ、ＤＳＰＧ、コレステロール及び有効成分（例えば、アンホテリシンＢ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１：１のモル比で硫酸コレステリルとアンホテリシンＢを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１：８のモル比でＤＭＰＣとＥＰＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＧ、コレステロール及びトリオレインを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＤＥＰＣ、ＤＰＰＧ、コレステロール及びトリカプリンを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、７５：２５のモル比でＤＯＰＣとＤＯＰＥを含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート）、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＳＭ－１０２、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］、２０００－ジミリストイルグリセロール［ＤＭＧ］、コレステロール及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＤＳＰＣ］を含む。

【0033】

当業者であれば、「両親媒性脂質」という用語が、親水性及び親油性を含む任意の脂質を包含すること、並びにこれらの両親媒性脂質のうちのいずれかが本明細書に開示される方法で使用され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、両親媒性脂質は、脂肪酸、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、グリセロリン脂質、リン脂質、ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ステロール、コレステロール、プレノール、カロテノイド、レチノール、レチナール、レチノール酸、β－カロテン、トコフェロール、糖脂質、ＬＩＰＯＩＤ Ｓ１００、ＰＥＧ化脂質、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）及びこれらの脂質の組合せの群から選択される。好ましい実施形態のうちの１つでは、両親媒性脂質は、リン脂質であるかこれを含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、両親媒性脂質は、カチオン性脂質、アニオン性脂質又は中性脂質、すなわちそれぞれ約ｐＨ３～ｐＨ９、特にｐＨ５～ｐＨ８の範囲のｐＨで正味正電荷、正味負電荷又は正味中性の電荷を有する資質を含む。いくつかの実施形態では、両親媒性脂質は、ＰＥＧ化脂質、すなわちポリエチレングリコールポリマーとコンジュゲートされている脂質を含む。

【0035】

一実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１種のカチオン性脂質、すなわち約ｐＨ３～ｐＨ９で正味正電荷を有する脂質を含む。カチオン性脂質は、モノカチオン性又はポリカチオン性であり得る。例えば少なくとも１種の親水性部分及び親油性部分を含む分子などの任意のカチオン性両親媒性分子は、本発明の意味の範囲内のカチオン性脂質である。一実施形態では、カチオン性脂質はイオン化可能な脂質である。一実施形態では、少なくとも１種のカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉ－Ｏ－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＭＡ）若しくはその類似体、若しくはその誘導体、及び／又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）若しくはその類似体、若しくはその誘導体を含む。少なくとも１種のカチオン性脂質は、例えば核酸などの負に荷電した原薬と複合体を形成するときに正電荷を与える。

【0036】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質及びコレステロールなどの両親媒性脂質を含む。

【0037】

少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子を製造するための本開示による方法は、有機溶媒及び少なくとも１種の当該両親媒性脂質を含む第１の流れを供給するステップを含む。したがって第１の流れは、有機溶媒及び本明細書に記載の両親媒性脂質のうちのいずれか１つ、又は本明細書に記載の両親媒性脂質のクラス若しくは種の組合せなどの少なくとも１種の両親媒性脂質を含んでもよい。

【0038】

いくつかの実施形態では、第１の流れは、有機溶媒及び両親媒性脂質の組合せを含んでもよい。一実施形態では、第１の流れは、有機溶媒、並びにカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。好ましくは、第１の流れは溶液、すなわち、エタノールなどの有機溶媒に１つ以上の脂質を可溶化又は完全に溶解させた液体溶液である。特定の一実施形態では、第１の流れは、エタノール、アミノ脂質（例えば、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ又はＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）などのイオン化可能なカチオン性脂質、コレステロール、リン脂質及びＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質又はイオン化可能なカチオン性脂質の量は、有機流れ又は溶媒中の脂質の全組成に対し、少なくとも５０ｍｏｌ％である。

【0039】

いくつかの実施形態では、第１の流れは、エタノール、並びに脂質であるＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ－（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエン－１－イル－１，３－ジオキソラン－４－エタンアミン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールから構成されてもよい。いくつかの実施形態では、第１の流れは、有機溶媒としてエタノール、並びに脂質であるＤＭＧ－ＰＥＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを含む。

【0040】

他の実施形態では、第１の流れ又は第２の流れは、少なくとも１種の更なる両親媒性脂質を更に含む。本明細書で理解されるように、少なくとも１種の更なる両親媒性脂質は、少なくとも１種の両親媒性脂質に加えて、第２、第３又は第４の両親媒性脂質などを指す。好ましくは、有機溶媒流れは、１種以上の両親媒性脂質を含む。更なる両親媒性脂質は、ＰＥＧ化脂質、コレステロール、イオン化可能なカチオン性脂質及びリン脂質（ＤＳＰＣなど）の群から好ましくは選択される。特定の実施形態では、第１の流れ又は第２の流れは、０．１ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％の範囲の濃度でＰＥＧ化脂質を含む。特定の一実施形態では、第１の流れは、０．１ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％の範囲の濃度で有機溶媒及びＰＥＧ化脂質を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、開示された方法により調製されたナノ粒子は、少なくとも１種のヘルパー脂質を更に含む。ヘルパー脂質は、中性又はアニオン性脂質であってもよい。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、リン脂質なのどの天然脂質を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は天然脂質の類似体を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は完全合成脂質を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、天然脂質と類似性がない脂質様分子を含む。ヘルパー脂質は、脂質ナノ粒子の安定性及び送達効率に寄与する。特定の実施形態では、ヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ＰＥＧ化脂質、脂肪酸及びヘミコハク酸コレステリル（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ、ＣＨＥＭＳ）又はこれらの化合物の類似体若しくは誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、カチオン性脂質及び中性脂質又はアニオン性脂質から選択されたヘルパー脂質を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子分散液又はナノ粒子は、単一のバイラメラリポソームを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子分散液又はナノ粒子は、多重二重層リポソームを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の分散液は、２種以上のリポソームを含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、両親媒性脂質を含むナノ粒子分散液又はナノ粒子は、ユニラメラリポソームを含む。当業者であれば、ユニラメラリポソームは、水溶液を封入する単一のリン脂質二重層球を有する小胞を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は多層リポソームを含む。多層リポソームは、「タマネギ」構造、すなわち、他の小胞内部の一連の複数のユニラメラ小胞がある小胞を含み、水の層で分離された同心リン脂質球の多層構造を作成する。

【0044】

いくつかの実施形態では、開示された方法に従って製造されたナノ粒子分散液は、核酸を含む脂質ナノ粒子の分散液である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子分散液又はナノ粒子は、リポプレックスを含む。当業者であれば、リポポリプレックスとも呼ばれることがあるリポプレックスは脂質小胞でカプセル化された核酸を含む複合体を指すことを理解するであろう。リポポリプレックスは、核酸及び脂質成分に加えて、典型的にはポリマーもまた含んでもよい。いくつかの実施形態では、脂質小胞はリポソーム、すなわち核酸を含む水性コアを有する二重層構造であり得る。いくつかの実施形態では、リポプレックスは、脂質と核酸との間に定義されていない複合体を含む。いくつかの実施形態では、リポプレックスは、正に荷電した脂質小胞と負に荷電した核酸との間の静電相互作用によって形成され得る。

【0045】

いくつかの実施形態では、本開示によるナノ粒子のナノ粒子分散液は、従来のリポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、カチオン性リポソーム、長期循環リポソーム又は免疫リポソームを含む。

【0046】

原薬（ＡＰＩ）
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、原薬（ＡＰＩ）を含む。いくつかの実施形態では、特にＡＰＩが核酸を表さない小分子である場合、ＡＰＩは、第１の流れの有機溶媒に溶解又は可溶化される。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、第２の流れの水性溶媒に溶解又は可溶化である。言い換えれば、本発明の方法のステップａ）で供給された第１の流れは、ＡＰＩを更に含んでもよい。代替的には、本発明の方法のステップｂ）で供給された第２の流れは、ＡＰＩを更に含んでもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ステップａ）及び／又はステップｂ）で供給され得る少なくとも２種の異なるＡＰＩを含む。これらの実施形態によって、異なる程度の溶解度を有する有効成分と統合するときに柔軟性が提供される。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＡＰＩは疎水性分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは親水性分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは両親媒性分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは小分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは核酸又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ベクター用の遺伝物質であるかこれを含む核酸分子であってもよく、例えばこれはウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）又はプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ＤＮＡ分子又はその誘導体、例えばプラスミドＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ＲＮＡ分子又はその誘導体を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンスＲＮＡの群から選択される。特定の実施形態では、核酸は、抗原をコードしたＤＮＡ又はｍＲＮＡなど、抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ポリペプチド又はその誘導体を含む。

【0048】

当業者であれば、市場又は開発段階で大量のＡＰＩが利用可能であり、これらのＡＰＩのいずれかは、本明細書に開示される方法で使用可能であることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ジドブジン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、ドキソルビチン、ケタコナゾール、アセタゾールアミド、Ｎ－メチル－Ｎ－Ｄ－フルクトシルアンホテリシンＢメチルエステル（ＭＦＡＭＥ）、硫酸鉄、ヒドロキシジン、トポテカンＨＣｌ、ダウノルビチン、シタラビン／Ａｒａ－Ｃ、ミファムルチド、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシンＢ、ベルテポルフィン、硫酸モルフィン、ブピバカイン、不活性化Ａ型肝炎ウイルス（ＲＧＳＢ株）、インフルエンザウイルスＡ型及びＢ型の不活性化ヘマグルチニン、アミカチン、テセモチド、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、プロスタグランジンＥ－１（ＰＧＥ－１）、シスプラチン、白金類似体シス－（トランス－Ｒ，Ｒ－１，２－ジアミノシクロヘキサン）ビス（ネオデカノアート）白金（ＩＩ）、半合成ドキソルビチン類似体アンナマイシン、ルルトテカン、強力トポイソメラーゼＩ阻害剤、イリノテカンの活性代謝物質、パクリタキセル、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓレチノール酸、ミトキサントロン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ－２）、ビノレルビン酒石酸塩、トポテカン、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、ＰＫＮ３ ｓｉＲＮＡ、ＣＥＢＰＡ ｓｉＲＮＡ、ドセタキセル、ｐ５３遺伝子若しくはビノレルビン、又はこれらの組合せから選択されるが、これらに限定されない。

【0049】

いくつかの実施形態では、有効成分は、例えばコロナウイルス抗原をコードするＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの抗原をコードするＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ＢＮＴ１６２ｂ２ ＲＮＡ（ＢｉｏＮＴｅｃｈ）を含む。いくつかの実施形態では、有効成分は、ｍＲＮＡ－１２７３（Ｍｏｄｅｒｎａ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、ＣｈＡｄＯｘ１－ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。

【0050】

言及されるように、本開示による方法は、水性溶媒を含む第２の流れを供給するステップを含む。水性溶媒は、緩衝液系、例えば、ＰＢＳ、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液又はＴＲＩＳ緩衝液などの緩衝水性溶媒であり得る。任意選択では、水性溶媒は、他の賦形剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、水性溶媒は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、フルクトース、プロリン、ソルビトール、グリシンベタイン、ポリエチレングリコール、デンプン及びデキストランなどの抗凍結剤を含んでもよい。水性溶媒は、いくつかの実施形態では、ＡＰＩが第１の流れで供給されるときには、ＡＰＩにとって溶媒ではなくてもよい。

【0051】

衝突ジェットリアクタ
言及されるように、本発明の方法は、ジェット衝突とも称される２つの流れの正面衝突に関連する。本明細書に使用される場合、流れは、液体などの流体材料の流れを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子は、衝突ジェットリアクタで製造される。こうしたリアクタの例は、欧州特許第１１６５２２４号明細書、欧州特許第１３５２６８２号明細書及び米国特許出願公開第２０１７／０３６１２９９号明細書で開示される。マイクロジェットリアクタは、衝突ジェットリアクタの一例である。

【0052】

更には、ジェット衝突による溶媒／非溶媒沈殿の方法は、当該技術分野で説明されており、例えば欧州特許第２３９５９７８号明細書に開示される。

【0053】

本発明の方法に使用されるような衝突ジェットリアクタは、有機溶媒を含む第１の流れ及び水性溶媒を含む第２の流れを供給するリアクタを含む。各流れは、ノズルを通じて高圧で押し出される。ノズルは、直径５～９００μｍの範囲の開口を有し得る。約２０μｍ～約８００μｍの範囲の直径も好ましい。

【0054】

本明細書ではピンホールとも呼ばれるノズルは、一方に対向するもう一方に配置される。すなわち、それらのピンホールは、例えば約１８０°の角度で互いに相対するように配置される。したがって、注入された流れは正面で、すなわち約１８０°で、リアクタの混合チャンバ内で高速で衝突する。こうすることで、ナノ粒子懸濁液を生成する集中的にかつ乱流の混合を生み出す。これらのノズル又はピンホールはリアクタチャンバで衝突する高圧ジェットを作り出し、これによって混合時間を減少させること又は短縮させることが可能となる。

【0055】

より具体的には、本発明の方法に従い、有機溶媒及び両親媒性脂質を含む第１の流れは、第１のノズルを通じて高圧下で圧送される。水性溶媒を含む第２の流れは、第２のノズルを通じて高圧下で圧送される。高圧は、当業者に知られているように、第１のポンプ及び第２のポンプによって提供される。本明細書に使用される場合、「高圧（ｒａｉｓｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）」という用語は、高圧（ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、すなわち上昇した流体力学的圧力と互換的に使用することができ、大気圧を超える任意の圧力を指す。

【0056】

第１の流れ及び第２の流れは、２つの流れが正面衝突する反応チャンバへと圧送される。本明細書で並行して使用される反応チャンバ、すなわちリアクタチャンバは、２つの流れのための空洞を設け、高度な乱流混合ゾーンを形成する。

【0057】

第１の流れ及び第２の流れの衝突中、流れは、液体ジェットを衝突させるものであると見なされ得る。いくつかの実施形態では、製造中に使用された衝突ジェットのための流体力学的圧力は、理論的根拠により算出され、及び／又は圧力メータを使用してモニタリングされる。

【0058】

第１の流れ及び第２の流れの衝突流れについて流体力学的圧力の算出は、数１によって算出することができる。

【数1】

式中、
ｐ＝流れ中の圧力（［バール］又は［ｋＰａ］、ここでは１バールは１００ｋＰａ）
ρ＝流れ（［ｋｇ／ｍ^３］）の組成物（すべての成分）の密度
Ｑ＝流れの流量（［ｍ^３／ｓ］）
ｒ＝ピンホールの半径（［ｍ］）

【0059】

流れの速さであるｖ［ｍ／ｓ］は、数２に従って算出することができる。

【数2】

【0060】

いくつかの実施形態では、流量は、流れをプロセス中にも確認することができるように、衝突ジェットリアクタ（例えば、マイクロジェットリアクタ）への供給ラインにフローメータを組み込むことで測定される。

【0061】

いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子の分散液を製造するための方法を提供し、方法は、ａ）有機溶媒及び両親媒性脂質を含む第１の流れを供給するステップと、ｂ）水性溶媒を含む第２の流れを供給するステップと、ｃ）第１のノズルを通じて高圧下で第１の流れを圧送するステップ及び第２のノズルを通じて高圧下で反応チャンバに第２の流れを圧送するステップであって、第１のノズルが第２のノズルから約１８０°の角度で配置されているステップと、ｄ）反応チャンバ内で第１の流れと第２の流れを正面で衝突させるステップであって、第１の流れと第２の流れの流量比が、１：１．５～１：４．５の範囲であるステップと、を含み、方法は、当該第１のノズル及び当該第２のノズルを含む衝突ジェットリアクタ並びに反応チャンバの使用又は提供を含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子の分散液を製造するための方法を提供する。該方法は、第１のノズルが、第２のノズルから約１８０°の角度で配置されている、第１のノズル及び第２のノズルを含むジェット衝突リアクタ並びに反応チャンバを提供するステップと、
ａ）有機溶媒及び両親媒性脂質を含む第１の流れを供給するステップと、
ｂ）水性溶媒を含む第２の流れを供給するステップと、
ｃ）第１のノズルを通じ、高圧下で第１の流れを圧送するステップと、第２のノズルを通じ、高圧下で第２の流れを反応チャンバへと圧送するステップと、
ｄ）反応チャンバ内で第１の流れと第２の流れを正面で（約１８０°の角度で）衝突させるステップと、
を含み、
第１の流れと第２の流れとの流量比は、１：１．５～１：４．５の範囲である。

【0063】

いくつかの実施形態では、本開示による方法で提供された衝突ジェットリアクタは、（互いに約１８０°の角度で）互いに対向して配置された少なくとも２つのノズル（ピンホール）を有する。第１のノズル及び第２のノズルのそれぞれは、供給ラインに接続されてもよく、任意選択では、各供給ラインは、本明細書に記載の実施形態又は実施形態の組合せによる、第１の流れ及び第２の流れを、それぞれのノズルに高圧で供給するために配置されたポンプに関連づける。これらの流れは、任意選択では、リアクタハウジングで囲まれ得るリアクタチャンバ内の共通する衝突点で衝突させることができる。最適な実施形態では、別の開口は、任意選択でガス、蒸発液体、冷却液体又は冷却ガスが通過してリアクタチャンバ中のガス雰囲気を維持するか冷却するためのリアクタハウジングに設けられている。更なる実施形態では、こうした開口は存在しない。更なる開口は、得られた生成物及び任意選択で過剰なガスをリアクタチャンバから取り除くために設けられている。リアクタ内部のガス雰囲気を維持するため、又は得られた生成物を冷却するため、ガス、蒸発液体又は冷却ガスが開口を通じてリアクタチャンバへと導入される場合、得られた生成物及び過剰なガスは、ガス入口側で過圧するか、生成物及びガス出口側で加圧することで、この開口を通じてリアクタチャンバから取り除かれてもよい。溶媒／非溶媒沈殿の使用は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つ又はこれらの組合せに関連して記載されるように、沈殿した脂質系ナノ粒子の分散液を得るために、こうした衝突ジェットリアクタで行われてもよい。

【0064】

いくつかの実施形態では、本発明による方法で使用又は提供されるジェット衝突リアクタは、以下に詳細に記載されるような全体の形状が実質的に回転楕円である反応チャンバ壁の内部表面によって画定されている反応チャンバを含む。反応チャンバは、（ａ）互いに相対するように反応チャンバの第１の中心軸の対向する位置で配置されており、それぞれノズルを含む第１の流体入口及び第２の流体入口と、（ｂ）第２の中心軸が第１の中心軸に対して垂直であり、当該チャンバの第２の中心軸上に配置された第３の位置に配置された流体出口と、を含むという点を更に特徴とする。更には、第１の流体入口のノズルと第２の流体入口のノズルとの距離は、第１の中心軸に沿って反応チャンバの直径と同じかこれよりも小さい。

【0065】

従来のジェットリアクタに関する実質的な改善は、このようなリアクタ、特にその全体の形状が実質的に回転楕円である反応チャンバ及び特に流体入口ノズル間の距離が比較的短いことを反映したサイズの小ささに基づいて達成され得る。理論に束縛されることを望むものではないが、全体的な回転楕円形状は、内角、縁又は角及び関連するデッドボリューム・ゾーンを有する、当該技術分野で知られている不規則な形状の反応チャンバによる有害な効果のいくつかを取り除くと考えられている。流体入口ノズル間の小さいサイズ及び最小距離によって、チャンバ内での流体の乱流混合が増大し、ノズルによってチャンバへと注入される２つの流れの正面衝突を達成するなど、同じ軸上でのノズルの適切な位置合わせが促進されると考えられている。

【0066】

本明細書に使用される場合、その全体の形状が実質的に回転楕円であるということは、チャンバ壁の内部表面に画定される反応チャンバの少なくとも大きな部分の形状が、球形又は球形に類似するものであることを意味している。例えば、回転楕円体は、その断面の一部が楕円形となるように形成されてもよい。一実施形態では、入口又は出口開口を保持又は画定する部分を除いて、反応チャンバ又はチャンバ壁の内部表面のすべての部品又はすべての部分は、実質的に回転楕円体又は球形でさえある。

【0067】

ノズルの直径又は入口開口と比較して、その直径が典型的に相対的に大きい出口開口が反応チャンバのその他の球形から逸脱していると理解される場合には、反応チャンバの形状は、球形ドームとも称される球形キャップとしても記載されてもよい。好ましい実施形態では、こうした球形キャップは、第１の中心軸（すなわち、２つの流体入口が位置づけられる）に沿って高さ、基底及び半径を有し、高さは当該半径よりも大きく、基底は流体出口により画定される。言い換えれば、反応チャンバにより形成された球形ドームは、対応する半球よりも体積が大きい。これはまた、出口開口の直径が反応チャンバの最大直径よりも小さいことを意味している。特定の実施形態では、ドームの高さは、半径の約１１０％～約１７０％の範囲である。例えば、高さは、例えば半径の約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％又は約１６０％など、半径の約１２０％～約１６０％であってもよい。

【0068】

本開示による方法に関連して使用され得るリアクタの別の好ましい外形は、ノズルの配置に関する。言及されるように、第１の流体入口と第２の流体入口のそれぞれはノズルを含み、組み立てられたリアクタの状態では、第１の流体入口のノズルと第２の流体入口のノズルとの距離は、第１の中心軸に沿って反応チャンバの直径と同じであるかこれよりも小さい。これは、格納されているノズルを有する当該技術分野で知られているいくつかのジェットリアクタとは対照的である。本発明の好ましい実施形態では、ノズル、より正確にはそれらの下流端は、反応チャンバへと突出していないが、反応チャンバ壁の内部表面と実質的には位置合わせされる。

【0069】

上で説明された選択によって配置される場合には、反応チャンバは、ノズル間の短い距離にも対応する非常に小さな内部体積を設けることが更に好ましい。本明細書に使用される場合、第１のノズルと第２のノズルとの距離は、下流端（すなわち、反応チャンバの中心を示唆するノズルの端部）間の距離として理解されなければならない。好ましい反応チャンバ体積は約０．５ｍＬ未満であり、ノズル間の好ましい距離は約７ｍｍ未満であることが好ましい。特に好ましい一実施形態では、反応チャンバは、約０．２５ｍＬ以下の体積を有し、第１の流体入口のノズルと第２の流体入口のノズルとの距離は５ｍｍ以下である。更に好ましい実施形態では、反応チャンバの体積は、例えば約０．１５ｍＬなど、約０．２ｍＬ以下であり、２つのノズル間の距離は約４ｍｍ以下である。更に小さな寸法もまた有用であってもよい。明確にするために記すと、反応チャンバの体積に対してこれらの選択を提供する目的のために、それぞれの値は、反応チャンバが出口開口に関係なく実質的に球形を有しているという推定の下に算定されていることに留意されたい。言い換えれば、出口開口は、由来する球形よりも体積が小さい球形キャップの基部を形成するものとであると解釈されていない。反応チャンバの体積を表す球形セグメントの基部を形成するために出口開口が平坦であると理解されるべき場合には、上で提供されたｍＬによる値は、出口開口の寸法を考慮した上で修正されるべきである。

【0070】

一実施形態では、反応チャンバは他の入口開口又は出口開口を含まない。言い換えれば、第１の流体入口及び第２の流体入口並びに流体出口は、チャンバ壁に設けられている反応チャンバの唯一の開口を表す。これはまた、反応チャンバに導入されるガス用の入口又は脱気目的の出口など、１つ以上の更なる入口を呈し得るジェット衝突リアクタの他の実施形態とは対照的である。衝突プロセスに悪影響を及ぼし、制御不可能な沈殿又はこうした更なる開口での混入の増大をもたらし得る更なる入口又は出口を有さないことは、有利であり得る。こうしたリアクタは、第１の流体流れと第２の流体流れとの相互作用及びこれらの混合、向上した洗浄性並びに向上したバッチ間での一貫性についての良好な制御をもたらし得る。

【0071】

本明細書に使用される場合、閉鎖機構により不作動状態となった１つ以上の更なる入口開口又は出口開口を備えた反応チャンバを有するリアクタは、その反応チャンバが、第１の流体及び第２の流体のために本質的に必要とされる２つの入口開口及び反応チャンバ内で第１の流体流れと第２の流体流れの混合（及び／又は反応）から生じる流体用の出口開口以外に更なる入口又は出口開口を有さないリアクタであるということもまた理解するべきである。

【0072】

ジェット衝突リアクタの基本的な概念によれば、いくつかの実施形態では、リアクタは、第１の流体（すなわち、有機溶媒及び両親媒性脂質を含む第１の流れ）及び第２の流体（すなわち、水性溶媒を含む第２の流れ）を、２つの流れが互いに衝突する又は正面衝突するように反応チャンバへと方向付けるよう、好ましくは構成及び／又は配置されるべきである。これは、２つの流体入口に含まれるノズルの正確な位置づけ及び配向にとって特に関連している。したがって、好ましい実施形態では、ジェット衝突リアクタは第１の流体入口及び第２の流体入口のノズルは、第１の中心軸に沿ってチャンバ中心に向かって第１の流体流れ及び第２の流体流れを方向付けるように配置され、第１の流体流れ及び第２の流体流れを約１８０°の角度で衝突させるという点を特徴とする。本明細書に使用される場合、約１８０°の角度での衝突は、正面衝突とも称され得る。この文脈では、「約」といった表現は、例えば典型的には数ミリ秒以内といった非常に短い時間内で全体的な混合が生じるように、第１の液体流れと第２の液体流れとの衝突により、混合ゾーンで迅速かつ高い乱流の流体流れが確実に生じるように実際の角度が１８０°に十分近いことを意味する。

【0073】

いくつかの実施形態では、ジェット衝突リアクタは交換可能なノズルを備えている。これは同じリアクタを使用したプロセスパラメータの迅速なスクリーニングを可能にするため、製品及びプロセス開発の努力を加速させる。これは、ある特定のプロセスパラメータの試験、特に異なるノズル直径の試験は、それぞれの一連の実験内で複数のリアクタの使用を必要とするように、典型的には着脱不可能又は置換不可能なノズル、すなわち取り外しが不可能な方式でリアクタから取り外すことができないように接着、溶接、圧着又は熱嵌合されたノズルを有する先行技術のリアクタとは異なっている。本明細書に使用される場合、ノズル直径は、ノズルが単純噴孔ノズルである場合には、ピンホール径又は直径とも称され得る、ノズル開口の内径として理解されるべきである。言い換えれば、本実施形態は、リアクタの汎用性を実質的に増加させる。

【0074】

一実施形態では、第１の流体入口及び第２の流体入口のそれぞれは、上流端、第１の流体入口又は第２の流体入口のノズルを保持する下流端、及び上流端から下流端へ流体を導通するための流体導管を有する流体入口コネクタによって提供され、各流体入口コネクタの下流端は、第１の流体入口及び第２の流体入口を提供するように、チャンバ壁へと逆向きに挿入可能である。本実施形態によれば、ノズルを保持する逆向きに挿入可能な入口コネクタが設けられるという点で、ノズルは交換可能である。ノズルは、交換可能なコネクタに強固に固定され得る。本明細書に使用される場合、入口コネクタ（又は流体入口コネクタ）は、上流端及び下流端並びに上流端と下流端との間に流体接続を提供するように構成された内部流体導管を有する任意の部品であってもよい。

【0075】

交換可能な流体入口コネクタ（及びそれにより交換可能なノズル）を備えたこうしたリアクタ構成の利点は、リアクタが良好な洗浄性と減少したサイクル時間を呈するという点である。容易に置換可能である交換可能なノズル又は流体入口コネクタを有するリアクタの更なる利点によって、１つの同じリアクタチャンバを使用し、異なるノズル直径で作動する可能性を含むリアクタの汎用性は実質的に増加し得る。

【0076】

一実施形態では、流体入口コネクタは、解放可能な圧縮取付具によってチャンバ壁へと固定される。例えば、第１の流体入口及び／又は第２の流体入口を提供する流体入口コネクタは、単一のフェルール継手又は二重フェルール継手によってチャンバ壁へと固定される。高圧下での漏れを防ぐことができる他の強固な継手は、解放可能な程度までは同様に有用である。

【0077】

好ましい一実施形態では、リアクタは、流体入口コネクタの上流端と流体導管の上流部分を含む上流セグメントと、（ｉｉ）ノズルを備えた流体入口コネクタの下流端及び流体導管の下流部分を含む下流セグメントと、を有する流体入口コネクタを含み、流体導管の流体部分の直径は、流体導管の上流部分の直径よりも大きい。この文脈では、直径は内径として理解されるべきである。

【0078】

下流部分は、その直径が上流部分の直径よりも実質的に小さい毛細管として形成されてもよく、又はこうした毛細管によって設けられてもよい。例えば、一実施形態では、下流部分の直径は、上流部分の直径の半分以下である。別の実施形態では、下流部分の直径は、上流部分の直径の約４０％以下である。任意選択では、上流部分は、下流部分よりも実質的に長くてもよい。例えば、下流部分の長さに対する上流部分の長さの比は、５：１以上、又は８：１以上であってもよい。

【0079】

特定の一実施形態では、流体入口コネクタの下流端は外部が円錐形状であり、チャンバ壁は、流体入口コネクタの下流端を受容するように、円錐形状でもあり寸法決めされている対応する空隙を呈する。この構成を使用することで、流体入口コネクタのリアクタへの挿入、そして同時に上記のような第１の中心軸上のそれぞれのノズルの適切な位置合わせが容易となる。好ましくは、リアクタは、ノズルが異なる直径を有し得ることを除き、基本的には全体的に同じ構成を有する２つの流体入口コネクタを備える。本明細書に記載の流体入口コネクタは、本開示の一態様を表す。

【0080】

ノズルは、適切な圧力を使用し、液体流れの形態で第１の流体及び第２の流体を反応チャンバに注入することが可能である任意の種類又は形状であってもよい。

【0081】

好ましい実施形態のうちの１つでは、第１の流体入口及び／又は第２の流体入口のノズルは単純噴孔ノズルである。本実施形態については、両方のノズルは単純噴孔ノズルであることが更に好ましい。本明細書に使用される場合、単純噴孔ノズルは、単純な（すなわち、実質的には円筒形の）貫通孔の形状を本質的に有する単純な孔を特徴とするノズルである。これは、その小さな寸法といった観点からピンホールとも称され得る。代替的には、選択された形状がそれぞれの作動圧力で反応チャンバ内で第２の流体流れと正面で衝突可能である流体流れの生成をもたらす限りは、ノズルは成形された孔のノズルとしても設けられてもよい。

【0082】

単純噴孔ノズルが使用される場合には、こうしたノズルは、サファイア、ルビー、ダイアモンド、セラミック、ガラス（ホウケイ酸ガラスなど）又は鋼などの特に硬い材料から製造された部品として提供されてもよい。鋼の場合には、タングステン、モリブデン、クロム、バナジウム及びコバルトなどの炭化物形成元素を含有し、合金元素の総量が典型的には約１０～２５重量％の範囲である、合金鋼である高速度鋼（ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｓｔｅｅｌ、ＨＳＳ）、又はタングステン及びコバルトが主要な合金元素であり、硬質合金とも称されるタングステン鋼などの高い硬度及び低い摩損性を有する品質の鋼が使用されることが好ましい。

【0083】

サファイア、ルビー又はダイアモンドノズルが使用される場合には、これらは予め製造されて流体入口コネクタの下流部分の下流端へと挿入され、例えば圧着によって固定され得る。予め製造する方法によって変化するノズルの公差を考慮すべきである。鋼のノズルが使用される場合には、それぞれの鋼品質により流体入口コネクタすべて又は少なくともその下流部分を調製し、次いで必要とされる孔を導入することが有用である。この方式では、第１の中心軸とノズルとの位置合わせが更に改善される。

【0084】

ノズル、すなわちノズルの孔の直径は、典型的には約１ｍｍ未満の範囲である。医薬分野、特に新規の化学成分、新規生物学的薬物、先進的な治療のために高度に特殊化したコロイドキャリア系などのナノ粒子形態の開発については、プロセス開発は多くの場合非常に高価な材料の使用を含むことから、プロセス開発に使用される液体の体積は最小限にすべきである。これは、とりわけ直径０．５ｍｍ以下の孔を有するノズルなどの更に小さなノズルを用いて最良に達成される。

【0085】

したがって、上記のようなジェット衝突リアクタは、第１の流体入口のノズルが第１の孔の直径を有し、第２の流体入口のノズルが第２の孔の直径を有する点と、第１の孔の直径及び／又は第２の孔の直径が２０μｍ～５００μｍの範囲である点とを特徴とすることは、本発明の好ましい実施形態のうちの１つである。好ましくは、第１の孔の直径と第２の孔の直径の両方は、２０μｍ～５００μｍの範囲、又は約５０μｍ～約５００μｍの範囲である。孔の直径の少なくとも１つは、それぞれ、約５００μｍ、約４００μｍ、約３００μｍ、約２００μｍ、約１００μｍ、約５０μｍ又は約２０μｍであるようなリアクタ構成もまた好ましい。例えば２０μｍ未満など、更に小さな直径が考えられてもよい。

【0086】

いくつかの実施形態では、第１のノズル及び第２のノズルの直径（すなわち、ノズルの孔又は開口）は、約３００μｍ、約２００μｍ、約１００μｍなど同じである。本開示で使用されたリアクタのより好ましい実施形態では、リアクタは、径の異なる２つのノズルを有する。言い換えれば、こうした更に好ましい実施形態によれば、孔の直径のうちの１つは他の孔の直径よりも大きい。こうした非対称のノズル構成は、様々な方法において有利であり得る。これは、例えば処理のためには必要ではあるが、最終生成物においては望ましくない溶媒の導入を最小にするために使用されてもよい。これらの２つの液体流れは、ノズルを通じて衝突する反応チャンバへと注入されるため、異なる流量を有するが、類似する運動エネルギーを有する２つの液体流れを生成するために使用されてもよい。

【0087】

一実施形態では、第２のノズル（すなわち、その孔）の直径は、第１のノズルの直径よりも少なくとも２０％大きい。更なる実施形態では、第１の孔の直径に対する第２の孔の直径の比率は、約１．２～約５である。例えば、以下のノズル対が使用されるが、第１の値は第２の孔のおよその直径を表し、第２の値が第１の孔のおよその直径を表している。すなわち、１００μｍ及び５０μｍ、２００μｍ及び１００μｍ、２００μｍ及び５０μｍ、３００μｍ及び２００μｍ、３００μｍ及び１００μｍ、３００μｍ及び５０μｍ、４００μｍ及び３００μｍ、４００μｍ及び２００μｍ、４００μｍ及び１００μｍ、４００μｍ及び５０μｍ、５００μｍ及び４００μｍ、５００μｍ及び３００μｍ、５００μｍ及び２００μｍ、５００μｍ及び１００μｍ、５００μｍ及び５０μｍである。ここでも、これらの対は非限定的な例であり、他の孔の直径の組合せは、特定の生成物又はプロセスに応じて有用でもある。

【0088】

更には、本発明者らは、リアクタの構成において、特に小さなノズルが使用されるときには、特定の寸法的な関係を観察することが有用であることを見出した。既に言及されたように、反応チャンバは、一般的に言えば反応チャンバが好ましい。いくつかのプロセスにとっては、ノズルの孔の１００倍以下の直径である反応チャンバ直径を有するリアクタか、異なるサイズのノズルが使用される場合には、より大きなノズルの孔の直径の約１００倍の直径以下のチャンバ直径を有するリアクタを提供することが有用であることが見出された。例えば、より大きなノズルが１００μｍの孔の直径を有する場合には、こうした特定の実施形態によれば反応チャンバの直径は約１０ｍｍ以下であることが好ましい。

【0089】

関連する実施形態では、第２の孔の直径に対する第１の中心軸に沿った反応チャンバの直径の比率は、６～６０の範囲である。例えば、第２の孔の直径は約２００μｍである場合、第１の中心軸に沿った反応チャンバの直径は、特定の実施形態によれば約１．２～約１２ｍｍの範囲（ｒａｇｅ）であり得る。ただし、より大きなノズルを備えたリアクタは、寸法に関する他の考慮が求められる場合がある。

【0090】

更に関連する実施形態によれば、流体出口の直径に対する第１の中心軸に沿った反応チャンバの直径の比率は、約１．２～約３の範囲である。例えば、約３ｍｍの直径を有する反応チャンバは、特定の実施形態に従って、約１ｍｍ～約２．５ｍｍの出口直径を有する。

【0091】

出口直径を選択するときには、ノズルの孔の直径もまた考慮しなければならない。例えば、１００μｍ未満の小さなノズル径（すなわち、孔）は、反応チャンバ内での圧力が、２つの乱流を支持するには十分高く、かつ２つの流れを迅速に混合することを確実にするため、１ｍｍ未満などの小さな流体出口直径と組み合わせられなければならない。例えば、５０μｍの孔を有する２つのノズルを使用するときに、０．５ｍｍの流体出口直径が使用されてもよい。本開示及び上に提供されるガイダンスに基づいて、更なる種類の寸法因子は、ある特定の生成物を収容する又は要件を処理するためには有用でもあり得ることは、当業者には明らかである。

【0092】

リアクタの材料、特にチャンバ壁の材料に関しては、様々な種類の十分に硬く、抗摩耗性がある材料が使用されてもよい。実施形態のうちのいくつかでは、反応チャンバ壁（３）は、金属、ガラス、ガラスセラミック、セラミック及び熱可塑性ポリマーから選択される材料から製造される。有用な金属の一例は、ステンレス鋼である。好ましい実施形態のうちの１つでは、本発明のリアクタは、ステンレス鋼から製造された反応チャンバ壁を含む。リアクタの製造に使用されることになる製品の種類に応じて、炭化物及びコーティングされた合金もまた使用されてもよい。更には、チャンバ壁の内部表面は滑らかな仕上がりを呈することもまた好ましい。滑らかな仕上がりは、表面粗さを表すＲａ値の低さを特徴とし得る。Ｒａ値は、表面の輪郭に沿って表面を測定するときのすべての値の量からの相加平均粗さの値を表す。好ましい実施形態のうちの１つによれば、反応チャンバ壁の内部表面は、０．８Ｒａ以下の表面粗さを呈する。この場合、ＲａはＩＳＯ ４２８７：１９９７に従って決定される。

【0093】

代替的な実施形態では、本開示の方法により提供されたジェット衝突リアクタは、熱可塑性ポリマーの混合物又は熱可塑性ポリマーと、着色剤、酸化防止剤、帯電防止剤、ガラスファイバーなどの添加剤の混合物などの熱可塑性ポリマー、又は熱可塑性ポリマーを含む材料から製造された反応チャンバ壁を含む。熱可塑性ポリマー又は熱可塑性ポリマーをベースとした材料から製造された反応チャンバ壁の利点は、リアクタが、潜在的には非常に費用効率の良い製造方法である射出成形によって製造され得る点である。潜在的に好適である熱可塑性ポリマーの例として、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ、ＰＴＦＥ）、ポリアミド、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＰＣ）、ポリエーテルエーテルケトン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｅｔｈｅｒ ｋｅｔｏｎｅ、ＰＥＥＫ）、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ、ＰＥ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ、ＰＰ）、ポリスチロール（ｐｏｌｙｓｔｙｒｏｌ、ＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ｓｔｙｒｅｎｅ、ＡＢＳ）、ポリオキシメチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ、ＰＯＭ）、ポリフェニルスルホン（ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ、ＰＰＳＦ又はＰＰＳＵ）及びポリエーテルイミド（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ、ＰＥＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。複数の実施形態のうちの１つでは、熱可塑性ポリマーは、ＰＴＦＥ及びＰＥＥＫから選択される。

【0094】

いくつかの実施形態では、ジェット衝突リアクタは、（ｉ）熱可塑性ポリマーから製造された、又は熱可塑性ポリマーを含む反応チャンバ壁と、（ｉｉ）金属、ガラス、ガラスセラミック及びセラミックから選択される材料から製造される流体入口ノズル（すなわち、第１の流体入口及び第２の流体入口のノズル）と、を含む。こうした実施形態の特定の利点は、高い硬度と強度を有するノズルを含むが、同時にリアクタの本体、すなわち反応チャンバ壁を射出成形で費用効果が高い方法で製造することができるという点である。これらの実施形態では、流体入口ノズルは、反応チャンバ壁に対して交換可能又は交換不可能な方式のいずれかで配置されてもよい。交換可能であるように設計される場合、ジェット衝突リアクタは汎用性があり、かつ様々な製品及びプロセスにとって柔軟性が高い状態で使用することができるという利点がもたらされる。一方、交換不可能であるように設計される場合、こうすることで、ノズルを予め製造し、次いでリアクタの本体、すなわち少なくとも反応チャンバ壁を製造する射出成形プロセスの間、又はこの最中にそれぞれの型へと挿入することができるという点で非常に費用効果が高い形で製造するという利点がもたらされる。溶融した熱可塑性ポリマーが型へと挿入され得る温度など、方法に関する更なる詳細は、選択された材料、すなわち熱可塑性ポリマーの性質によって変化する。これは、当業者に一般に知られている。

【0095】

更なる態様では、本発明は上に詳細に記載されているリアクタの使用に基づく方法を提供する。特に、本発明は、２つの流体を混合する方法を開示しており、該方法は、（ｉ）上記のジェット衝突リアクタを設けるステップと、（ｉｉ）第１の流体入口を通じて第１の流体流れを反応チャンバに方向付けるステップと、（ｉｉｉ）約１８０°の角度で第１の流体流れを衝突させるように、第２の流体入口を通じて第２の流体流れを反応チャンバに方向付けるステップと、を含む。

【0096】

本明細書に使用される場合、流体は、せん断応力を受けるときには連続して流れる、又は変形する液体又は気体の材料である。好ましくは、本発明に従って混合される２つの流体は、液体溶液、懸濁液又はエマルジョンなどの液体材料であり、液体溶液が最も好ましい。本明細書に使用される場合、リアクタ内で２つの流体を混合することは、任意選択では、沈殿、乳化、錯体形成、自己組織化又は更なる化学反応など、単なる混合を超えた他の物理変化又は化学変化を更に含む。ただし、すべてのこれらの最適なプロセスは、本発明によるジェット衝突リアクタの使用で得られるように、２つの液体を混合することで引き起こされる。

【0097】

ジェット衝突条件下でリアクタを操作することは、典型的には上記のように適切なノズル径の選択と、理想的には正面衝突するその中心に向かって、ノズルを通じて流体を反応チャンバへと注入させる圧力又は流量で２つの流体流れを供給することと、を含む。

【0098】

リアクタが、第１の流体入口及び第２の流体入口を設けるように、チャンバ壁へと逆向きに挿入可能である交換可能な流体入口コネクタを有するように構成されている場合、ジェット衝突リアクタを設ける方法のステップは、（ｉ）第１のノズルを有する第１の流体入口コネクタと第２のノズルを有する第２の流体入口コネクタを選択するサブステップと、（ｉｉ）第１の流体入口及び第２の流体入口を有するジェット衝突リアクタを設けるために、第１の流体入口コネクタ及び第２の流体入口コネクタをチャンバ壁へと挿入するサブステップと、を含んでもよい。上で説明されるように、孔の直径は、第１のノズルと第２のノズルとの間で異なっていてもよい。

【0099】

方法の好ましい実施形態のうちの１つでは、反応チャンバ内で２つの流れが衝突及び混合することによって、両親媒性脂質を含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子又はリポソーム）の沈殿又は自己組織化が生じるように、第１の流体流れは、有機溶媒及び少なくとも１種の両親媒性脂質を含み、第２の流体流れは、少なくとも１種の両親媒性脂質にとって非溶媒又は抗溶媒として作用し得る水性溶媒である。好ましい実施形態のうちの１つでは、第１の流体流れ及び第２の流体流れは、約０．１～約１２０バールの範囲の圧力で、それぞれの流体入口ノズルを通じて押し出される。この文脈では、かつ特段文脈が指示しない限り、圧力はゲージ圧力、すなわち過圧又は測定されるそれぞれの流体と流体接続する圧力ゲージから典型的に得られる周囲圧力（大気圧）に対して異なる圧力として表される。更に好ましい実施形態では、第１の流体流れ及び第２の流体流れは、約１～約４０バールの範囲の圧力でそれぞれの流体入口ノズルを通じて押し出される。

【0100】

更に好ましい実施形態では、第１の流体流れと第２の流体流れのそれぞれは、約１～約１０００ｍＬ／分の範囲の流量で反応チャンバへと方向付けられる。この文脈では、特段指示しない限り、それぞれ個別の流れにその流量を供給する。流量の他の好ましい範囲は、それぞれ、約２～約１０００ｍＬ／分、５～１０００ｍＬ／分、約５～約５００ｍＬ／分及び約１０～約３００ｍＬ／分である。

【0101】

圧力に関しての選択と同様、好ましい流量は、一般的に適用可能なものであり、それによって組み合わせることができると理解されなければならない。言い換えれば、約１０～約３００ｍＬ／分の範囲の流量で、約０．１～約１２０バール、特に約１～約４０バールの範囲の圧力にて、第１の流体及び第２の流体がそれぞれのノズルを通じて反応チャンバへと方向付けられる方法の実施形態についての選択肢又は更には選択もまた存在する。

【0102】

上記のように、ジェット衝突リアクタの好ましい実施形態のうちの１つによれば、２つのノズルはピンホール径とは異なっていてもよい、すなわち第１のノズルの孔は第２のノズルの孔よりも大きい、又は小さくてもよい。関連する実施形態では、本発明の方法は、２つの異なるノズルを備えたこうしたリアクタで実施される。代替的には、又はこれに加えて、第２の流体流れとも称される第２の流れの流量は、第１の（流体）流れの流量よりも大きくてもよい。更に好ましい実施形態では、方法は、（ｉ）第２のノズルの孔が第１のノズルの孔よりも大きく、及び／又は（ｉｉ）第２の流体流れの流量が第１の流体流れの流量よりも大きく、反応チャンバに入ったときには第１の流体流れ及び第２の流体流れに実質的に同じ運動エネルギーを持たせるように、第２の流体流れの圧力及び第１の流体流れの圧力が適合されているという点を特徴とする。

【0103】

この文脈では、運動エネルギーは任意選択で、式
Ｅ_ｋ＝１／２＊ｍ＊ｖ^２
（式中、ｍは体積単位あたりの流れの質量であり、ｖは流れの速度である）に従って算出されてもよい。

【0104】

類似の、又は更には実質的に同じ運動エネルギーを有する２つの流体流れを用いて作動することの利点は、回転楕円体（すなわち、対称の）反応チャンバ内の衝突点が、チャンバの中心又はその近傍にあるという点である。したがって、衝突プロセスを良好に制御し、かつプロセスに関する様々な未知の、又は望ましくない効果を有し得る、制御されていない衝突点の影響を除外することが可能である。好ましくは、流体流れの運動エネルギーは、反応チャンバの中心又はその近くで衝突（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ）又は衝突（ｉｍｐｉｎｇｅｍｅｎｔ）を生じさせるには十分類似している。

【0105】

ナノ粒子懸濁液を製造するための方法
予想しなかったことではあったが、特定の条件下では、流量比、流れの圧力及びピンホールの半径などのパラメータは、ジェット衝突リアクタにより製造されたナノ粒子の特性に影響することが本明細書で見出された。

【0106】

本発明の一態様によれば、特定の流量比（ＦＲＲ）で２つの流れを衝突させることを含む方法によって、所望の径及びＰＤＩを含むナノ粒子の分散液を製造するための方法が本明細書に開示される。いくつかの特定のＦＲＲは、例えば小さな径及び低ＰＤＩなどの所望の特性のナノ粒子を製造するためには有用であった。

【0107】

本発明の第１の態様によれば、第１の流れ（有機溶媒）と第２の流れ（水性溶媒）の流量比は、約１：１．５～約１：４．５の範囲である。驚くべきことに、この比率が適用されるときには、この方法によってロバストかつ安定したプロセスが提供され、安定し、品質が良好な粒子を再現可能に得ることが見出された。１：６又は１：８といった範囲外の流量比はリポソーム及びＬＮＰの多分散性指標（ＰＤＩ）に悪影響を及ぼすことが、本発明者らによって観察された。好ましい実施形態では、第１の流れと第２の流れの流量比、約１：１．５～約１：４、又は約１：２～約１：４の範囲である。図３Ｂ及び図５Ａで見られるように、これらの流量比は、それぞれ８０ｎｍ未満、又は６０ｎｍ未満などの小さな平均粒子径を有する脂質系ナノ粒子を得るには特に有利であることが示され得る。いくつかの実施形態では、第１の流れと第２の流れの流量比は、１：１．５～１：３の範囲、より好ましくは１：１．５～１：２．５、より好ましくは１：１．５～１：２の範囲である。更なる実施形態では、第１の流れと第２の流れの流量比は、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５又は約１：４である。

【0108】

更には、特定の総流量比（ＴＦＲ）で２つの流れを衝突させることを含む、所望の径及びＰＤＩを含むナノ粒子の分散液を製造するための方法が本明細書に開示される。一般には、ＴＦＲは約０．１ｍＬ／分～約２，０００ｍＬ／分の範囲である。好ましい実施形態のうちの１つでは、ＴＦＲは、約１ｍＬ～約１，０００ｍＬ／分、又は約５ｍＬ／分～約８００ｍＬ／分、又は約１０ｍＬ／分～約８００ｍＬ／分、又は約２５ｍＬ／分～約８００ｍＬ／分、又は３０ｍＬ／分～約８００ｍＬ／分の範囲から選択される。

【0109】

本発明の方法に従って流量比を適用するときには、ナノ粒子の製造は、例えばナノ粒子のサイズ及び安定性といった点では、第１の流れ及び第２の流れの総流量に影響されなかったことを見出すことができた。したがって、異なるスケール又は出力率でナノ粒子の分散液を製造するためのロバストなプロセスが本発明に提供される。

【0110】

驚くべきことに、特定の条件下では、約２００ｍＬ／分を超えるＴＦＲなどの高ＴＦＲであっても、小さいサイズ及び低ＰＤＩといった望ましい特性のナノ粒子を本明細書に開示される方法で得ることができることが見出された。例えば、約２００ｍＬ／分～約１，０００ｍＬ／分の範囲のＴＦＲは、プロセス効率及び高い生産性が重要である状況では有用であり得る。特定の一実施形態では、ＴＦＲは、約２００ｍＬ／分～約８００ｍＬ／分の範囲である。別の特定の実施形態では、ＴＦＲは、約３００ｍＬ／分など、２８０ｍＬ／分～３２０ｍＬ／分である。

【0111】

当業者であれば、総流量（ＴＦＲ）は、時間単位あたりに反応チャンバへと注入される総体積を指す。言い換えれば、総流量は、第１の流れと第２の流れの流量の合計である。

【0112】

いくつかの実施形態では、総流量、すなわち第１の流れと第２の流れの流量の合計は、約２００ｍＬ／分又は更には約１００ｍＬ／分未満など低いものである。例えば、ＴＦＲは、約１ｍＬ／分～２００ｍＬ／分、又は約５ｍＬ／分～２００ｍＬ／分、又は１０ｍＬ／分～２００ｍＬ／分、１５ｍＬ／分～２００ｍＬ／分、又は約１ｍＬ／分～約１００ｍＬ／分、又は約５ｍＬ／分～約８０ｍＬ／分の範囲であってもよい。こうした低いＴＦＲは、小バッチに高級な出発材料を使用する状況では有用であり得る。

【0113】

いくつかの実施形態では、総流量、すなわち第１の流れと第２の流れの流量の合計は、３０ｍＬ／分～３２０ｍＬ／分、好ましくは１００ｍＬ／分～３２０ｍＬ／分、最も好ましくは２８０ｍＬ／分～３２０ｍＬ／分の範囲である。更に特定の実施形態では、総流量は、２８０ｍＬ／分～３２０ｍＬ／分、より好ましくは２９０ｍＬ／分～３１０ｍＬ／分の範囲である。いくつかの実施形態では、ＴＦＲは、約２０ｍＬ／分～約５００ｍＬ／分、又は約５０ｍＬ／分～約２００ｍＬ／分、又は５０ｍＬ／分～１００ｍＬ／分である。

【0114】

特定の実施形態では、総流量は、１００ｍＬ／分～５００ｍＬ／分の範囲であり、第１の流れと第２の流れとの流量比は、１：１．２～１：２．５の範囲である。より特定の実施形態では、総流量比は、約３００ｍＬ／分であり、第１の流れと第２の流れとの流量比は１：２である。パラメータ（流量比及び高い総流量）のこうした組合せによって、例えば６０ｎｍ未満の平均径及び０．２５未満のＰＤＩといった有利な特性を有するナノ粒子の製造が可能となった。

【0115】

いくつかの実施形態では、ＴＦＲは、約３０ｍＬ／分、又は約４０ｍＬ／分、又は約５０ｍＬ／分、又は約６０ｍＬ／分、又は約７０ｍＬ／分、又は約８０ｍＬ／分、又は約９０ｍＬ／分、又は約１００ｍＬ／分である。

【0116】

いくつかの実施形態では、ＴＦＲは、約１５０ｍＬ／分、又は約２００ｍＬ／分、又は約２５０ｍＬ／分、又は約３００ｍＬ／分、又は約３２０ｍＬ／分、又は約３５０ｍＬ／分である。

【0117】

上記式１に示されるように、流れの圧力は、とりわけノズル開口のサイズによって調節される。いくつかの実施形態では、第１のノズル開口及び第２のノズル開口径は、直径では１００μｍよりも小さい。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、１００～２００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、２００～３００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、３００～４００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、４００～５００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、５００～６００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、６００～７００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、２００μｍよりも大きい。

【0118】

いくつかの実施形態では、第１のノズル開口及び／又は第２のノズル開口径の半径は、約１００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約２００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約３００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約４００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約５００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約６００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約７００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約８００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約９００μｍである。いくつかの実施形態では、ノズル開口径の半径は、約１０００μｍである。

【0119】

いくつかの実施形態では、第１の開口及び第２の開口の半径は同一である。いくつかの実施形態では、第１の開口及び第２の開口の半径は異なっている、又は非対称である。いくつかの実施形態では、当該第２の開口の半径は１００μｍであり、当該第１の開口の半径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。いくつかの実施形態では、第２の開口の半径は２００μｍであり、当該第１の開口の半径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。いくつかの実施形態では、当該第２の開口の半径は３００μｍであり、当該第１の開口の半径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。

【0120】

いくつかの実施形態では、当該第２の開口の半径は４００μｍであり、当該第１の開口の半径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。いくつかの実施形態では、当該第２の開口の半径は５００μｍであり、当該第１の開口の半径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。

【0121】

いくつかの実施形態では、当該第１の開口及び当該第２の開口の半径は、それぞれ３００μｍと２００μｍである。いくつかの実施形態では、当該第１の開口及び当該第２の開口の半径は、それぞれ４００μｍと２００μｍである。いくつかの実施形態では、当該第１の開口及び当該第２の開口の半径は、それぞれ５００μｍと２００μｍである。

【0122】

いくつかの実施形態では、第１のノズルは第１の開口を含み、第２のノズルは第２の開口を含み、第１の開口及び第２の開口の半径は、２００μｍ～５００μｍの範囲である。

【0123】

本開示による方法の別の実施形態では、第１のノズルは第１の開口を含み、第２のノズルは第２の開口を含み、第１の開口及び第２の開口の直径は、４０μｍ～８００μｍの範囲である。一実施形態では、第１のノズルは第１の開口を含み、第２のノズルは第２の開口を含み、第１の開口及び第２の開口の直径は、２００μｍ～５００μｍの範囲である。

【0124】

いくつかの実施形態では、第１の開口及び第２の開口の直径は同一であってもよく、他の実施形態では、第１の開口及び第２の開口の直径は、異なっている、又は非対称である。いくつかの実施形態では、当該第１の開口は１００μｍであり、当該第２の開口の直径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。いくつかの実施形態では、第１の開口は２００μｍであり、当該第２の開口の直径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。いくつかの実施形態では、当該第１の開口は３００μｍであり、当該第２の開口の直径は１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ又は５００μｍである。

【0125】

特定の実施形態では、第１の開口の直径は、第２の開口の直径と異なっている。一実施形態では、第１の開口又は第２の開口の直径は、他の開口の直径よりも少なくとも約５０％大きい。一実施形態では、第２の開口の直径は、第１の開口の直径よりも大きくてもよい。好ましい実施形態のうちの１つでは、第２の開口の直径は、第１の開口の直径よりも少なくとも５０％大きい。別の実施形態では、第２の開口の直径は、第１の開口の直径よりも約１．５倍（５０％）～約５倍大きい。

【0126】

いくつかの実施形態では、当該第１の開口及び当該第２の開口の直径は５００μｍである。上述されるように、第１の流れ及び第２の流れは、高圧で第１のノズル及び第２のノズルを通じて圧送される。当該圧力は、上記式１に示されるように、流量及び流れの密度及び流れが排出されるピンホールの半径から算出されることができる。

【0127】

当業者であれば、本明細書にて互換的に使用される「高圧」、［高圧」、「過圧」又は「流体力学的圧力」といった用語が、大気圧以上のいずれかの圧力を指すことを理解するであろう。更には、本明細書に使用される場合、いくつかの実施形態では、第１の流れ及び第２の流れの圧力は、大気圧と比較することで測定される。したがって、０．１バールの圧力は、大気圧よりも０．１バール高いものとして理解されよう。

【0128】

いくつかの実施形態では、第１の流れ及び第２の流れの圧力は同様である。いくつかの実施形態では、第１の流れの圧力は、第２の流れの圧力よりも高い。いくつかの実施形態では、第１の流れの圧力は、第２の流れの圧力以下である。

【0129】

いくつかの実施形態では、第１の流れの圧力は約３０バール未満、約２５バール未満、約１２バール未満、約５バール以下よりも低い。いくつかの実施形態では、第１の流れの圧力は、約０．０００１バール～約３０バール、約０．００１バール～約２５バール、約０．０１バール～約１２バール、又は約０．０１バール～約５バールである。

【0130】

いくつかの実施形態では、第２の流れの圧力は約３０バール未満、約２５バール未満、約１２バール未満、約５バール以下よりも低い。いくつかの実施形態では、第２の流れの圧力は、約０．０００１バール～約３０バール、約０．００１バール～約２５バール、約０．０１バール～約１２バール、又は約０．０１バール～約５バールである。

【0131】

いくつかの実施形態では、当該第１の流れ又は当該第２の流れの圧力は０．１バール未満である。いくつかの実施形態では、第１の流れ又は第２の流れの圧力は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９又は１バールである。いくつかの実施形態では、第１の流れ又は第２の流れの圧力は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０バールである。いくつかの実施形態では、第１の流れ又は第２の流れの圧力は、約１０、約１５、約２０、約２５又は約３０バールである。いくつかの実施形態では、第１の流れ又は第２の流れの圧力は、３０バールよりも高い。

【0132】

いくつかの実施形態では、第１の流れ及び／又は第２の流れの圧力は、０．１～４５バールである。いくつかの実施形態では、第１の流れ及び／又は第２の流れの圧力は、０．１～１５バールである。

【0133】

当業者であれば、いくつかの例で、第１の流れ及び第２の流れの圧力の合計として本明細書で定義される全圧を算出及び使用することが有用であると理解するであろう。

【0134】

流体力学的圧力とジェット速度との数学的関係に基づき、第１の流れ及び第２の流れのジェット速度は、ノズル開口半径で制御又は決定され得る。いくつかの実施形態では、ジェット速度は、７０ｍ／ｓ未満、５０ｍ／ｓ未満、２５ｍ／ｓ未満又は１０ｍ／ｓ未満である。いくつかの実施形態では、第１の流れ及び第２の流れのジェット速度は異なっている。

【0135】

いくつかの実施形態では、第１の流れは有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、両親媒性脂質、ＡＰＩ又はそれら両方のための溶媒である。当業者であれば、多くの有機溶媒が医薬産業で使用されていることを理解するだろう。これらのいずれも、本明細書に開示される方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アルコール、ケトン、ハロゲン化溶媒、アミド又はエーテルを含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノール、エチレン、ブロミド、ブタノール、アセトン、クロロホルム、２－エチルヘキサノールメチルエチルケトン、塩化エチレン、イソブタノール、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メチルイソプロピルケトン、テトラクロロエチレンメタノール、酸化メシチル、四塩化炭素、プロパノール、トリクロロエチレン、プロピレングリコール、１，４－ジオキサンブチルエーテル、エチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジイソプロピルエーテル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、炭化水素、芳香族炭化水素、シクロヘキサン、トルエン、ヘキサン及びキシレンを含む群から選択される。

【0136】

いくつかの実施形態では、有機溶媒は水と相溶性がある。いくつかの実施形態では、有機溶媒は２種類以上の有機溶媒の混合物を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒はアルコールである。いくつかの実施形態では、有機溶媒はエタノールを含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒はアセトンを含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、第２の流れは水性溶媒を含む。いくつかの実施形態では、水性溶媒は両親媒性脂質、ＡＰＩ又はこれら両方のための溶媒ではない。当業者であれば、多くの水性溶媒が医薬産業で使用されていることを理解するだろう。これらのいずれも、本明細書に開示される方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、水性溶媒は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、水性溶媒のｐＨは、任意の所望の値に変更される。

【0138】

更なる態様
いくつかの実施形態では、方法は、ナノ粒子分散液を濾過することで精製するステップ、ナノ粒子分散液を凍結乾燥に供するステップ、又はナノ粒子分散液からクロスフロー濾過で有機溶媒を除去するステップを更に含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子分散液は滅菌濾過に供される。いくつかの実施形態では、濾過材は、酢酸セルロース、再生セルロース、ポリアミド、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、変性ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）及びポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から選択される。当業者であれば、滅菌濾過によって、生成物の非経口適用が可能となり、これが湿式加熱又は乾式加熱により最終的に滅菌することができない非経口用途用の生成物を選択する方法であることが理解されよう。いくつかの実施形態では、ナノ粒子分散液は凍結乾燥に供される。凍結乾燥は、脂質系ナノ粒子（例えば、リポソーム又はＬＮＰ）分散液の安定性を増加することができる。

【0140】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子分散液の製造に使用される有機溶媒は、クロスフロー濾過プロセスを介して除去することができる。一実施形態では、脂質系ナノ粒子（例えば、リポソーム又はＬＮＰ）分散液の製造に使用される有機溶媒は、クロスフロー濾過プロセスを介して除去される。

【0141】

更なる態様では、本発明の第１の態様の方法で製造されたナノ粒子分散液が本明細書に開示される。一実施形態では、ナノ粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定する場合、４０ｎｍ～８０ｎｍなど、２０ｎｍ～１００ｎｍ、又は３０ｎｍ～９０ｎｍの範囲である。

【0142】

更なる態様では、本発明の第１の態様の方法で製造されたナノ粒子分散液を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口用途又は経口用途が意図されている。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、適用前に再構成するための凍結乾燥物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、濾過滅菌によって最終的に滅菌することができる。

【0143】

本開示に含まれる更なる実施形態は、番号を付けた項目の以下の一覧に含まれる。

【0144】

１．少なくとも１種の両親媒性脂質を含むナノ粒子の分散液を製造するための方法であって、方法は、
ａ）有機溶媒及び両親媒性脂質を含む第１の流れを供給するステップと、
ｂ）水性溶媒を含む第２の流れを供給するステップと、
ｃ）第１のノズルを通じて高圧下で第１の流れを圧送するステップ及び第２のノズルを通じて高圧下で反応チャンバに第２の流れを圧送するステップであって、第１のノズルが第２のノズルから約１８０°の角度で配置されているステップと、
ｄ）反応チャンバ内で第１の流れと第２の流れを正面で衝突させるステップであって、
第１の流れと第２の流れの流量比が、約１：１．５～約１：４．５の範囲であるステップと、
を含む、方法。

【0145】

２．第１の流れと第２の流れの流量比は、１：１．５～１：４の範囲、又は１：２～１：４．５の範囲、又は１：２～１：４の範囲であり、第１の流れと第２の流れの流量比は、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４又は約１：１．４５である、項目１に記載の方法。

【0146】

３．総流量の比は、１ｍＬ／分～１，０００ｍＬ／分の範囲、又は５ｍＬ／分～８００ｍＬ／分の範囲である、項目１又は２に記載の方法。

【0147】

４．総流量の比は、１００ｍＬ／分～５００ｍＬ／分の範囲であり、第１の流れと第２の流れの流量比は１：１．２～１：２．５の範囲である、項目１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0148】

５．第１のノズルは第１の開口を含み、第２のノズルは第２の開口を含み、第１の開口及び第２の開口の直径は、４０μｍ～８００μｍの範囲である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。

【0149】

６．第１の開口又は第２の開口の直径は、他の開口の直径よりも少なくとも約５０％大きい、項目５に記載の方法。

【0150】

７．第１の流れの圧力は、第２の流れの圧力以下である、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。

【0151】

８．ナノ粒子は、ユニラメラリポソーム、多層リポソーム、単一のバイラメラリポソーム、多重二重層リポソーム、多胞性リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、リポポリプレックス及び中実脂質ナノ粒子からなる群から選択される、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。

【0152】

９．両親媒性脂質は、脂肪酸、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、グリセロリン脂質、リン脂質、ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ステロール、コレステロール、プレノール、カロテノイド、レチノール、レチナール、レチノール酸、β－カロテン、トコフェロール、糖脂質、ＬＩＰＯＩＤ Ｓ１００、ＰＥＧ化脂質及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）の群から選択される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。

【0153】

１０．第１の流れ又は第２の流れは、少なくとも１種の更なる両親媒性脂質を更に含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。

【0154】

１１．第１の流れ又は第２の流れは、０．１モル％～２モル％の範囲の濃度でＰＥＧ化脂質を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【0155】

１２．第１の流れ又は第２の流れは、原薬を更に含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【0156】

１３．原薬は、小分子、ペプチド及び核酸の群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【0157】

１４．ナノ粒子分散液を濾過することで精製するステップ、
ナノ粒子分散液を凍結乾燥に供するステップ、又は
ナノ粒子分散液からクロスフロー濾過で有機溶媒を除去するステップを更に含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【0158】

１５．ナノ粒子の平均粒子径は好ましくは２０ｎｍ～１００ｎｍである、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法によって製造されたナノ粒子分散液。

【実施例】

【0159】

以下の実施例は、本明細書に開示される技術のいくつかの実施形態をより完全に例証するために提示されている。ただし、こうした実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでは決してない。本実施例は、リポソーム及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製造するための本明細書に開示される衝突ジェット技術の適合性を示すことを目的として、複雑性を増してゆく形で段階的アプローチを開示する。

【0160】

本明細書に開示される実験に使用された機器システム及びリアクタの特徴を表１に列挙する。システムＡ（又は装置Ａ、又は機器Ａ）は、リアクタに応じて、流量が０．１ｍＬ／分～最大６０ｍＬ／分である、バッチ式又は連続製造用の小規模システムとして意図されている。システムＢは、総流量が最大約５００ｍＬ／分と高いバッチ式又は連続製造に適合されている。乱流混合ベースのジェット衝突リアクタシステムＡ及びＢとの比較として、層流混合を提供する市販のマイクロ流体システム（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｉｇｎｉｔｅ（商標），Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）及び小規模沈殿システムを使用した。明確にするために記すと、コンパレータシステムは、ジェット衝突リアクタのように２つの流れを正面で衝突させることがない。

【0161】

【表1】

実施例１－ダイズホスファチジルコリン及びコレステロールを含むリポソームの製造

【0162】

方法：脂質系ナノ粒子を製造するためのジェット衝突技術の有用性を実証するために、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）及びコレステロールを使用した製剤を選択した。

【0163】

異なるノズル開口直径を使用し、異なる流量比（ＦＲＲ）、総流量（ＴＦＲ）及び異なるＳＰＣ／コレステロール比にてシステムＢとして本明細書に上で記載された機器を使用し、合計１０回の実験を行った。

【0164】

加えて、２つのシステムを比較するため、コンパレータシステムであるＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍ社製のＩｇｎｉｔｅ機器で８回の実験を行った。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用し、動的光散乱法（ＤＬＳ）で平均粒子径及び多分散性指標（ＰＤＩ）について試料を分析した。

【0165】

ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）とコレステロールからなるエタノール溶液を調製し、第１の（有機）液体流れとしてこれを使用した。エタノール中の総脂質濃度は４ｍｇ／ｍＬを使用した。第２の（水性）液体流れについては、ｐＨ７．４の水性緩衝液（ＰＢＳ）を使用した。システムＢで試験した総流量は、５０ｍＬ／分及び１００分／ｍＬであった。１：１及び１：４である第１の（有機）流れ：第２の（水性）流れの流量比（ＦＲＲと略する）を試験した。３：１及び２：１のＳＰＣ：コレステロールモル比を試験した。実験で使用したパラメータを表２Ａにまとめる。コンパレータ機器での実験に使用したパラメータを表２Ｂにまとめる。これらのパラメータは、ＦＲＲ及び試験製剤については類似しているが、システムＢについてのスケール差によりＴＦＲのみが異なっている。

【0166】

【表2A】

【0167】

【表2B】

【0168】

結果：ジェット衝突リアクタシステムＢ及び市販の層流リアクタシステム（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｉｇｎｉｔｅ（商標））を使用して、動的光散乱法で測定されたリポソームの粒径及びＰＤＩについて同等の結果を得た。これは、内封されていないリポソームを得るためのジェット衝突リアクタ及び乱流混合の使用と、更にはパイロットスケールの機器の使用の実現可能性を実証する。各システムを使用して得られた結果を図１～図３に示す。
実施例２－ＰＥＧ化リポソームの製造

【0169】

方法：
ジェット衝突リアクタを含む上記表１に記載の機器システムＢを使用し、ＰＥＧ化脂質、ホスファチジルコリン及びコレステロールを含むＰＥＧ化リポソームを調製した。

【0170】

それぞれ３６．２％、６３．２％及び０．６％のモル比（製剤１）及びそれぞれ５２％、４５％及び３％のモル比（製剤２）で、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、コレステロール及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコールを含み、そのどちらの場合もエタノールに溶解させて２つの有機液体を調製し、それらのうちのいずれかを第１の流れとして使用した。どちらの場合も、有機溶液中の総脂質濃度は６ｍｇ／ｍＬであった。ｐＨ７．４のＰＢＳを第２の流れの水性液体として使用した。

【0171】

３０ｍＬ／分、９０ｍＬ／分、１８０ｍＬ／分又は３００ｍＬ／分の総流量（ＴＦＲ）及び１：１、１：１．５、１：２、１：３又は１：４である第２の（水性）流れに対する第１の（有機）流れの流量比（ＦＲＲ）で粒子を製造した。２００μｍ（第１のノズル）及び３００μｍ（第２のノズル）のノズル直径を有する衝突ジェットリアクタを使用し、すべての試料を調製した。動的光散乱法（ＤＬＳ）で粒径及び多分散性指標（ＰＤＩ）について試料を分析し、クライオＴＥＭで選択した試料を分析した。製造直後及びＤＬＳ分析前に、本発明に従って製造されたすべての試料を５％のＥｔＯＨ含量に希釈した。

【0172】

結果：試験製剤の両方について、均一な粒度分布及び低いＰＤＩ（０．２未満）のリポソームを得た。

【0173】

製剤２から得られたリポソームの特性を、層流に基づくマイクロ流体ミキサシステムで生成され、同様の組成を有するリポソームの公開データと比較した（２０１８年にＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．によって公開されたＢｒｏｗｎ Ａ．，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．，Ｓｈｅｌｌ Ｉｐ，Ｈｅｕｃｋ Ｇ．，Ｒａｍｓａｙ Ｅ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／ｄｅｆａｕｌｔ－ｓｏｕｒｃｅ／ｐｎｉ－ｆｉｌｅｓ／ ａｐｐ－ｎｏｔｅｓ／ｐｎｉ－ａｐｐ－ｂｔ－０１３．ｐｄｆ？ｓｆｖｒｓｎ＝ａａ６６８３２４＿０（２０２１年５月５日に再検索）を参照されたい）。これは図４Ａ及び図４Ｃに示されている。公開データによれば、こうした種類の機器及び混合を使用する第１の（すなわち、有機）流れと比較して第２の（すなわち、水性流れ）の流量を増加させた効果により、粒径の減少とＰＤＩの増加傾向が生じた。このマイクロ流体システムにおけるＴＦＲの増加は、粒径の減少にもつながった。

【0174】

層流混合システムと類似して、本発明の衝突ジェット法を使用したときのＦＲＲが低いことによる効果によっても、より小さな粒径及びより大きなＰＤＩ値への傾向につながることが観察された（図４Ｂを参照されたい）。ただし、比較すると、本発明の衝突ジェット法を使用したときには、リポソームの粒径及びＰＤＩにおけるＴＦＲの影響は何ら観察されなかった（図４Ｄを参照されたい）。粒径は、３０ｍＬ／分～３００ｍＬ／分の範囲のＴＦＲについては安定したままであったことが観察された。これは、ジェット衝突、すなわち第１の流れと第２の流れとの正面衝突によって得られるような高度の乱流混合プロセスは、ロバストで拡張可能なプロセスを達成するには有利であり、これによって例えば、必要に応じてリポソーム又は脂質ナノ粒子の複数のバッチを低容量又は高容量で調製することを含む、様々な製造シナリオに容易に適合可能な汎用性のあるプロセス技術を提供することを示している。

【0175】

システムＢ機器を使用して２つの異なる脂質製剤から調製されたリポソームの特性評価を行った（図５Ａ～図５Ｆを参照されたい）。ＦＲＲ及びＴＦＲについて定性的に類似する傾向を、両方の製剤で観察することができた。１のＦＲＲでは、ＰＥＧ脂質の含量が低い製剤（製剤１）は最も高いＰＤＩを示した（０．３５）が、より高いＰＥＧ脂質濃度を有する製剤（製剤２）については、最も低いＰＤＩを示した（０．０６）。更には、粒径においてＦＲＲ（第２の、すなわち水性流れの流量に対する、第１の、すなわち有機流れの流量との比）を減少する効果は、ＰＥＧ脂質含量がより低い製剤については更に顕著である。

【0176】

より高い濃度のＰＥＧ脂質を有する製剤は、１週間後により高い物理的安定性を示し（図５Ｇ及び図５Ｈ）ＰＥＧ脂質の安定効果を強調した。限界サイズのような基本的な粒子特性とプロセスパラメータに対する応答性の両方は、リポソームの組成によって決定されると結論づけることができる。一般には、ＰＥＧ脂質濃度の高さは、プロセスパラメータによる影響が小さかった、より小さくより安定した粒子をもたらす。

【0177】

クライオＴＥＭ分析は、製造されたリポソームが主にユニラメラ又はバイラメラである（図６Ａ及び図６Ｂ）ことを示し、ＤＬＳ粒径結果が確認された。大部分のクライオＴＥＭ画像では、様々な形態を有するより大きな粒子（最大でμｍ範囲）も確認された。こうしたより大きな粒子は、必要に応じてクライオＴＥＭ分析前に濾過（例えば、０．２μｍ）により取り除くことができる。この結果は、より大きなＴＦＲ及び関連するより高い全圧などのプロセス条件により、更に多数のバイラメラリポソームと更に不均一な形態がもたらされることを示している。
実施例３－実験の脂質ナノ粒子設計

【0178】

上に要約されているように、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製造するためのジェット衝突プロセスの適合性を検証し、かつシステムＢ機器を使用するＬＮＰ製造のプロセス及び結果に影響を与える重要なプロセスパラメータを識別するため、実験の統計学的設計（ＤｏＥ）アプローチを実施した。簡潔に言えば、Ｄ最適設計（Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ｖ１２ソフトウェア）を用いたＤｏＥでは、プロセスパラメータであるＴＦＲ、ＦＲＲ及び３個の異なるリアクタ（２００／３００、２００／４００、５００／５００μｍノズル径）を変更し、ＰＢＳを用いた透析時に粒径、ＰＤＩ及び形態へのそれらの影響を評価した。試験製剤は、ｓｉＲＮＡが使用されないことを除いては、Ｏｎｐａｔｔｒｏ（登録商標）（ｐａｔｉｓｉｒａｎ）の組成物を基としていた（ＥｔＯＨ中の総脂質濃度１０ｍｇ／ｍＬでは５０／３８．５／１０／１．５のモル比を有するＤＬｉｎ－ＭＣ３／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）。

【0179】

ＤｏＥの２０個すべての資料は、ＤＬＳ及びクライオＴＥＭ分析で測定されるように、粒径範囲が６４～１０６ｎｍ（ＰＤＩ：０．１２～０．２５）である内封されていないＬＮＰを含有していた（図７の試料を参照されたい）。これは、公的評価報告書で言及されるように、６０～１００ｎｍの範囲の粒径のＯｎｐａｔｔｒｏ（登録商標）と一致していた。

【0180】

これらの結果は、ジェット衝突プロセスが、最大約３００ｍＬ／分の総流量で製造され、高出力率であってもプラセボＬＮＰ製剤を使用して高品質の（内封されていない）ＬＮＰを製造するのに好適であることを提案している。すべての試料は、冷蔵条件（＋４℃）で１週間にわたって長期で貯蔵した後に粒径及びＰＤＩを保持しており、本発明のプロセスが使用された製剤のＬＮＰ製造に好適であることを更に示している。

【0181】

ＤｏＥは、３つの調査されたプロセスパラメータが粒径及びＰＤＩに影響を及ぼすことを明らかにした（図８、図９及び図１０を参照されたい）。統計分析で使用されたモデル（Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ｖ．１２はソフトウェアである）に関連する検定力は８０％を超え、０．０５未満のＰ値は統計学的に有意であると見なされた。統計分析は、プロセスパラメータと粒子の特質との間に以下の相関が存在することを示唆している。
ａ．ノズル系は粒径に影響を及ぼす：リアクタのノズル径がより大きくなると、粒径がより大きくなる
ｂ．全圧（Ｔｏｔａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ＴＰ）は粒径に影響する：全圧がより高くなるほど粒子は小さくなる
ｃ．ＦＲＲはＰＤＩに影響を及ぼす：ＦＲＲがより小さくなれば、ＰＤＩがより高くなる

【0182】

リアクタ＆全圧（ＴＰ）：システムＢ機器の作動圧範囲（０．１～４１．７バール）については、平均粒子径におけるＴＰの影響は中程度であり、平均粒子径は最低平均粒子径を約６０％超える。これは、均一な粒径（約６４～１０６ｎｍ）、安定したＰＤＩ（０．１２～０．２５）及び均一な形態などの重要な特性を保持しながら、試験製剤の内封されていないＬＮＰを非常に広範な圧力範囲にわたってジェット衝突で製造することができる。

【0183】

流量比（ＦＲＲ）：１：１．５～１：４のＦＲＲ範囲を試験した。原則として、この範囲内のすべてのＦＲＲは好適である。同時に、ＦＲＲとＰＤＩとの相関（Ｐ値＝０．００８８、Ｒ２＝０．３２、図１０）を観察した。１：３又は１：２のＦＲＲは、少なくとも試験製剤については、０．２５未満のＰＤＩを有するＬＮＰを製造するのに特に有用であると考えられる。
実施例４－ｍＲＮＡ内封脂質ナノ粒子の調製

【0184】

衝突ジェット法によるＲＮＡ内封脂質ナノ粒子を調製するために、上記表１に記載のパイロットスケールの機器システムＢを使用した。有機溶媒流れは、有機溶媒としてＥｔＯＨに溶解され、５０／３８．５／１０／１．５ｍｏｌ％の比率で脂質であるＤＬｉｎ－ＭＣ３／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有するモデル脂質組成物を含んでいた（総脂質濃度は１０ｍｇ／ｍＬ）。ポリ（Ａ）（ポリアデニル酸）をモデルＲＮＡとして使用し、０．０９６ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）にこれを供給し、第２の（すなわち、水性）流れのための溶液として使用した。

【0185】

２００μｍ（第１のノズル、有機液体流れ）及び４００μｍ（第２のノズル、水性液体流れ）のノズル開口直径を有する衝突ジェットリアクタを使用し、ポリ（Ａ）内封ＬＮＰを製造した。それぞれ１：３の流量比（水性流れに対する有機流れ）で、異なる総流量（ＴＦＲ）の適合性を調査した（４０ｍＬ／分、１２０ｍＬ／分、２８０ｍＬ／分）。ＤＬＳ（Ｓｔｕｎｎｅｒ，Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ ｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用して透析した後、粒子を分析した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより、カプセル化効率を決定した。

【0186】

結果：想定された径の範囲内で、低ＰＤＩ及び高カプセル化効率（ＥＥ％と略される）を有する、ポリ（Ａ）をカプセル化する脂質ナノ粒子をすべての総流量で生成した。これは、プロセスのロバスト性を示す。

【0187】

【表3】

【0188】

安定性及び透析前のエタノール濃度への影響を決定するために、透析前に試料についてＤＬＳ測定もまた実施した。冷蔵温度下で試料を製造及び貯蔵したおよそ３時間後、製造直後の１０％エタノールで希釈された試料及び更なる希釈を行わなかった試料（２５％エタノール）を分析した。

【0189】

【表4】

【0190】

表４に示されるように、更なる希釈なく３時間にわたって貯蔵された試料の粒径では最小限の変化を観察した。ＰＤＩは、エタノール希釈のない試料についてはより小さいか同等であった。このことは、一切希釈していない状態でも透析前のＬＮＰの安定性が良好であることを一般に示唆する。
実施例５－ｍＲＮＡ完全性評価

【0191】

方法：有意なせん断力を生じさせるために、５５００ｒｐｍの高ポンプ速度かつ６～７バールの圧力で、２００／４００μｍの衝突ジェットリアクタ（２００μｍのノズルをプラグで遮断した）の４００μｍのピンホールを通じ、システムＢ機器の片側を通してホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ＦＬｕｃ）ｍＲＮＡ（ＡＰＥｘＢＩＯ）の水性流れを循環した。間隔（２秒～４分）ごとに試料を採取し、自動ゲル電気泳動（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して分析した。以下の時点：ｔ＝０、開始前、プライミング後、２秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、３分、４分の後に試料を採取し、別個のレーンで分析した。

【0192】

結果：機器システムを通したｍＲＮＡの循環は、循環時間に関係なく、検出可能なｍＲＮＡ分解を生じなかった。システムＢ機器を１回通り抜けるのには約２秒かかる。したがって、４分間の循環時間は、高ポンプ速度及び高圧でノズルを通る約１２０個の通路に対応する。４分後であっても（図１１を参照されたい）、ｍＲＮＡはその完全性を保持していた。これは、本明細書に開示される方法によりｍＲＮＡ内封脂質ナノ粒子を製造するときに経験した圧力及びせん断力条件は、ｍＲＮＡに有害ではないことを示す。
実施例６－ＦＬｕｃｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の調製

【0193】

１００μｍ（第１のノズル、有機液体流れ）及び２００μｍ（第２のノズル、水性液体流れ）のノズル開口直径を有するベンチスケールの機器システムＡを使用するジェット衝突法を用いて、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を調製した。比較として、層流ベースのマイクロ流体混合機器（Ｉｇｎｉｔｅ（商標）、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）も使用して粒子を製造した。これらのシステムを使用して製造された脂質ナノ粒子のトランスフェクション性能もまた試験した。

【0194】

方法：有機（すなわち、第１の）流れとして、有機溶媒（１０ｍｇ／ｍＬの総脂質濃度）としてのＥｔＯＨ中ＤＬｉｎ－ＭＣ３／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００が５０／３８．５／１０／１．５ｍｏｌ％である、有効成分を含まないＯｎｐａｔｔｒｏ（登録商標）脂質製剤を使用した。水性（すなわち、第２の）流れとして、５０ｍＭ クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４）中０．０９ｍｇ／ｍＬの濃度のＦＬｕｃ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ又はＡＰＥｘＢＩＯ）を使用した。ジェット衝突システムを用いて３０ｍＬ／分の総流量で、及びマイクロ流体機器を用いて１０ｍＬ／分の総流量で１：３（水性流れに対する有機流れ）の流量比（ＦＲＲ）を使用した。Ｓｔｕｎｎｅｒ装置（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を使用し、動的光散乱法（ＤＬＳ）で粒子の粒径（ｚ平均）及び多分散性指標（ＰＤＩ）を決定した。クライオ透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）試料を、Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０ ＴＥＭで検査した。蛍光Ｑｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ ＲＮＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、カプセル化効率を決定し、定量した。

【0195】

インビトロトランスフェクションアッセイについては、ＨｅｐＧ２細胞を、様々な用量のＦＬｕｃ ｍＲＮＡ内封脂質ナノ粒子とともに、２４ウェルプレート形式でインキュベートした。インビボトランスフェクションアッセイも実施した：Ｂ６アルビノマウス（群あたりｎ＝６）は、６０μｇのｍＲＮＡ内封脂質ナノ粒子の単回ＩＶ（尾静脈）注射を受けた（２．４ｍｇ／ｋｇ）。投与６時間後、２４時間後＆４８時間後に、ＩＶＩＳスペクトラムイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で生物発光イメージングを実施した。

【0196】

結果．衝突方法に従って調製されたＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ内封脂質ナノ粒子は、有用な粒径、ＰＤＩ及びカプセル化効率を有することが分かった。それぞれの値は、コンパレータの層流マイクロ流体システムを使用して得られたナノ粒子について測定されたものと同様であった（以下の表を参照されたい）。

【0197】

システムＡを使用して調製された脂質ナノ粒子の試料のクライオＴＥＭ（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０ ＴＥＭ）分析は、球形粒子を示した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡの９７％超の高カプセル化効率は、細胞アッセイ（図１２を参照されたい、トランスフェクションあたりのＥＥ％アッセイによる１０μｇのｍＲＮＡを使用したインビトロトランスフェクションアッセイを示す。すべてのデータは、ｎ＝６、ノンパラメトリック、クラスカル・ウォリスポスト ＡＶＧ＋／－ＳＤ，＊＊ｐ＜０．０１である）でのトランスフェクション率及びインビボアッセイ（図１３を参照されたい、経時的な全身のインビボ遺伝子送達定量化を示す）でのトランスフェクション率へと変換された。この場合、ＦＬｕｃ発現は、投与６時間後にピークに達し、両方の試験群ではその後低下することが観察された。インビボＦＬｕｃ生物発光イメージングは、両方のシステムで製造された脂質ナノ粒子によるＦｌｕｃ ｍＲＮＡの全身送達が存在していたことを示唆していた。
実施例７－ｐＤＮＡのカプセル化

【0198】

より大きな核酸生成物を含むかカプセル化するナノ粒子分散液を調製するための本開示による方法の使用も試験した。

【0199】

方法：直径にして１００μｍ（第１のノズル、有機流れ用）及び２００μｍ（第２のノズル、水性流れ用）の開口を有するノズルに備え付けられた衝突ジェットリアクタを有するシステムＡ機器を使用して、ｐＤＮＡを内封した脂質ナノ粒子を調製した。ホタルルシフェラーゼ ｐＤＮＡの原液（９７９０ｂｐ、０．９ｍｇ／ｍＬ）を更に含む５０ｍＭ クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４）を水性流れとして供給し、エタノールに溶解させた２つの脂質製剤を供給した。これらそれぞれは、有機流れ：エタノール中、脂質であるＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ／コレステロール／ＤＯＰＥ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を５０／３８．５／１０／１．５ｍｏｌ％の比率で含む製剤（「製剤Ａ」、総脂質濃度１０ｍＭ）及びエタノール中ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を５０／３８．５／１０／１．５ｍｏｌ％の比率で含む脂質組成物（「製剤Ｂ」、総脂質濃度１０ｍＭ）を個別に使用した。

【0200】

ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ；ｍＲＮＡ（５－メトキシウリジン、１９２９ヌクレオチド）をカプセル化するため、製剤Ａと同じではあるが、エタノール中の総脂質濃度が１７．２ｍＭである脂質組成物（「製剤Ｃ」）もまた使用した。

【0201】

総流量（ＴＦＲ）３０ｍＬ／分、及び流量比（ＦＲＲ）が１：３（水性流れに対する有機流れ）にて、ｐＤＮＡ又はｍＲＮＡのカプセル化を実施した。回収後、５０ｍＭ クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４）を用いて試料を１０％エタノールに希釈し、透析してから濾過した。ＤＬＳ（Ｓｔｕｎｎｅｒ，ｕｎｃｈａｉｎｅｄ ｌａｂｓ）で粒径及びＰＤＩを決定した。ｍＲＮＡのＤＮＡ及びＲＮＡアッセイキット用のｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、製造業者のプロトコルに従ってカプセル化効率（ＥＥ％）を決定した。

【0202】

結果
本開示による衝突方法によりｐＤＮＡをカプセル化する脂質ナノ粒子を得た。これは驚くべきことに高いカプセル化効率を有していた。これは、両方の脂質組成物で観察された。プラスミドＤＮＡを含む脂質粒子は、これらの分子のサイズが大きいことから、ｍＲＮＡよりも大きな粒径を有していた。

【0203】

クライオＴＥＭ分析によるナノ粒子の更なる分析を実施したが、これは、概して球形粒子が得られたことを示した。試験製剤のインビボ効力が観察されると予想される、製造された脂質ナノ粒子懸濁液のトランスフェクション効率を評価するため、更なるインビボアッセイを実施した。
実施例８－ジェット衝突リアクタを用いた脂質ナノ粒子の調製

【0204】

上記にて本明細書で記載された実験と類似又はこれと同様の実験でのモデル脂質ナノ粒子（試験核酸分子を内封していない、及び／又は内封している）は、反応チャンバ壁（３）の内部表面（２）によって画定され、全体の形状が実質的に回転楕円である反応チャンバ（６）を含む衝突ジェットリアクタを使用して調製される。当該チャンバ（６）は、本開示の実施形態に従って記載されるように、（ａ）第１の流体入口及び第２の流体入口（４）を含み、第１の流体入口及び第２の流体入口（４）が、互いに相対する位置に対してなど、反応チャンバ（６）の第１の中心軸（ｘ）上の対向する位置に配置され、第１の流体入口及び第２の流体入口（４）のそれぞれがノズル（５、１３、２３）を含み、（ｂ）当該チャンバ（６）の第２の中心軸（ｙ）上に配置されている第３の位置に配置された流体出口（７）であって、第２の中心軸（ｙ）は第１の中心軸（ｘ）に対して垂直であり、第１の流体入口（４）のノズル（５、１３、２３）と第２の流体入口（４）のノズル（５、１３、２３）との距離（ｄ）が、第１の中心軸（ｘ）に沿った反応チャンバ（６）の直径と同一又はそれよりも小さい。低い多分散性指標と安定した粒径を有する脂質ナノ粒子の分散液は、再現可能な方法で、広範な範囲の総流量にわたって、かつ上記のような他のジェット衝突機器を用いて得られた粒子と同等に得られるであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【国際調査報告】