特表 2024-519733 ＤＫＣ１を使用するＲＮＡ編集の組成物、系、及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】ＤＫＣ１を使用するＲＮＡ編集の組成物、系、及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240514BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240514BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/12 ZNA

C12N15/864 100Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/11 Z

C12N9/00

C12N15/52 Z

A61K38/43

A61K31/713

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568295

(86)(22)【出願日】2022-05-26

(85)【翻訳文提出日】2023-11-02

(86)【国際出願番号】 CN2022095172

(87)【国際公開番号】W WO2022247896

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/096122

(32)【優先日】2021-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523416276

【氏名又は名称】モディット セラピューティクス ベイジン リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， メイファン

(72)【発明者】

【氏名】イー， チェンチ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA27

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084BA44

4C084DC01

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZB211

4C084ZB212

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB21

(57)【要約】

ＲＮＡの標的化されたシュードウリジン化のための方法、組成物、及び系を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を編集するための方法であって、操作されたガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）を宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞において細胞質内局在を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）及びＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を前記宿主細胞の中へ導入することを含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記ＤＫＣ１タンパク質を動員して、前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法。

【請求項2】

宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを前記宿主細胞の中へ導入することを含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法。

【請求項3】

宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを前記宿主細胞の中へ導入することを含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法。

【請求項4】

前記ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸を前記宿主細胞の中へ導入することをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＤＫＣ１タンパク質が、前記宿主細胞の内在性ＤＫＣ１タンパク質である、請求項２または３に記載の方法。

【請求項6】

前記ＤＫＣ１タンパク質が、前記宿主細胞において細胞質内局在を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＤＫＣ１タンパク質が、ヒトＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質のアミノ酸残基４１～４２０に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号２に従う、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＤＫＣ１タンパク質が、配列番号８８に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＤＫＣ１タンパク質が、前記宿主細胞において細胞質内局在のある天然に存在するＤＫＣ１アイソフォームを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって（ａ）操作されたｇｓｎｏＲＮＡ及び（ｂ）スプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を前記宿主細胞の中へ導入することを含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、前記ＡＳＯが、前記宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を促進し、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記ＤＫＣ１タンパク質を動員して、前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法。

【請求項11】

前記ＤＫＣ１アイソフォームが、ヒトＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３に対応する、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＤＫＣ１タンパク質が、配列番号２に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記標的ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ではない、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、ＡＣＡ１９、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含む、請求項１及び請求項４～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、ＡＣＡ２ｂに由来するスキャフォールド配列を含む、請求項２または１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、ＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む、請求項２または１４に記載の方法。

【請求項17】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記ＡＣＡ３６スキャフォールドの３’ヘアピン中に突然変異を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１つまたは複数のガイド配列を含み、各々が、前記野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡのヘアピン構造に対応する領域中に所在する、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つが、前記野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの３’端末部でのヘアピン構造中に所在する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つが、前記野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの５’端末部でのヘアピン構造中に所在する、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記野生型ＡＣＡ１９の１つまたは複数のヘアピン構造中に１つまたは複数の突然変異を含む、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記操作されたｇｓｎｏＲＮＡが、前記野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡ中のポリＵ配列のヌクレオチド中に１つまたは複数の置換突然変異を含み、前記ポリＵ配列が、少なくとも連続する４つのＵ残基を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記操作されたｇｓｎｏＲＮＡが、前記標的ウリジンへハイブリダイズする前記ガイド領域中の前記ヌクレオチド残基と前記野生型Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡのＨ／ＡＣＡボックスとの間に位置する１つまたは複数の挿入突然変異または欠失突然変異を含み、それによって、前記操作されたｇｓｎｏＲＮＡが、前記標的ウリジンへハイブリダイズする前記ガイド領域中の前記ヌクレオチド残基と前記Ｈ／ＡＣＡボックスとの間に１４または１５ヌクレオチドを含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記１つまたは複数の突然変異が、ＵＵＣＵによる残基２６～２９の置換、ＵＧＵＵによる残基２６～２９の置換、残基１１５後の３’ヘアピン構造へのＧの添加、及び残基８後の５’ヘアピンへのＣＵの添加からなる群から選択され、ナンバリングが、配列番号３７に従う、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号３～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３～４及び１４～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号１５～１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記方法が、前記ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子を前記宿主細胞の中へ導入することを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記ｇｓｎｏＲＮＡをコードする前記核酸分子が、Ｕ６プロモーター及びＵ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーター下にある、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ｇｓｎｏＲＮＡをコードする前記核酸分子が、第１のエクソン配列と第２のエクソン配列との間に所在するイントロン配列中に埋め込まれ、前記第１のエクソン配列、前記イントロン配列、及び前記第２のエクソン配列が、天然に存在する遺伝子に由来する、請求項２８または２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＤＫＣ１タンパク質をコードする前記核酸分子及び／または前記ｇｓｎｏＲＮＡをコードする前記核酸分子が、ウイルスベクター中に存在する、請求項１、４、及び２８～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記方法が、前記ＤＫＣ１タンパク質をコードする第１の核酸配列及び前記ｇｓｎｏＲＮＡをコードする第２の核酸配列を含むベクターを前記宿主細胞の中へ導入することを含む、請求項１または４に記載の方法。

【請求項33】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１０以下、８以下、６以下、または４以下の化学的に修飾されたヌクレオシドを含む、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１０以下、９以下、８以下、または６以下のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、５’キャップ修飾を含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記５’キャップ修飾が、７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）キャップである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記標的ＲＮＡを編集する効率が、少なくとも１０％である、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジンを含む前記配列が、終止コドンであり、前記標的ウリジンのシュードウリジンへの修飾が、前記終止コドンをコーディングコドンとして翻訳されるようにする、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記終止コドンが、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ＰＴＣが、遺伝性の疾患または病態と関連する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記ＤＫＣ１タンパク質が、前記ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記宿主細胞が、古細菌細胞または真核生物細胞である、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記方法が、インビボで実行される、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記方法が、エクスビボで実行される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

対象における標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する疾患または病態を治療する方法であって、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法を使用して、前記対象の細胞における前記標的ＲＮＡを編集することを含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記標的ＲＮＡ中の前記ＰＴＣへハイブリダイズするガイド配列を含み、前記ＰＴＣ中の前記ウリジン残基のシュードウリジン残基への修飾が、前記標的ＲＮＡ中の前記ＰＴＣの翻訳リードスルーを引き起こし、それによって、前記対象における前記疾患または病態を治療する、前記方法。

【請求項54】

前記疾患または病態が、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠乏症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、８－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、水疱性表皮剥離症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫様ポリープ、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン舞踏病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーベル先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型及びＩＩ型、神経繊維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏｌ関連癌、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異等）、肺高血圧症（常染色体優性）、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌形赤血球貧血症、脊髄筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全症、スタージ・ウェーバー症候群、及びがんからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡであって、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、前記操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項56】

宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡであって、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含み、前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、前記操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項57】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、５’キャップ修飾を含む、請求項５５～５６のいずれか１項に記載の操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項58】

前記５’キャップ修飾が、７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）キャップである、請求項５７に記載の操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項59】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含む、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項60】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項61】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１０以下、８以下、６以下、または４以下の化学的に修飾されたヌクレオシドを含む、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項62】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、請求項５５～６１のいずれか１項に記載の操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項63】

前記ｇｓｎｏＲＮＡが、１０以下、９以下、８以下、または６以下のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、請求項６２に記載の操作されたｇｓｎｏＲＮＡ。

【請求項64】

請求項５５～６３２のいずれか１項に記載のｇｓｎｏＲＮＡをコードする配列を含む、単離された核酸分子。

【請求項65】

（ａ）宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含むｇｓｎｏＲＮＡ、または前記ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子；及び
（ｂ）ＤＫＣ１タンパク質、または前記ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子
を含み、
前記ｇｓｎｏＲＮＡが、前記ＤＫＣ１タンパク質を動員して、前記標的ＲＮＡ中の前記標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、
操作されたＲＮＡ編集系。

【請求項66】

請求項５５～６３のいずれか１項に記載のｇｓｎｏＲＮＡ、請求項６４に記載の核酸分子、または請求項６５に記載の操作されたＲＮＡ編集系、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項67】

請求項５５～６３のいずれか１項に記載のｇｓｎｏＲＮＡ、請求項６４に記載の核酸分子、または請求項６５に記載の操作されたＲＮＡ編集系を含む、宿主細胞。

【請求項68】

請求項５５～６３のいずれか１項に記載のｇｓｎｏＲＮＡ、請求項６４に記載の核酸分子、または請求項６５に記載の操作されたＲＮＡ編集系を含む、宿主細胞における標的ＲＮＡを編集するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９６１２２号の優先権利益を主張し、その内容は、参照することによってその全体が本明細書に援用される。

【0002】

配列表の参照による援用
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容：配列表のコンピューター可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１６５３９２０００４４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録した日付：２０２２年５月２４日、サイズ：７５，９５９バイト）は、参照することによってその全体が本明細書に援用される。

【0003】

本出願は、ＤＫＣ１を使用する標的化シュードウリジン化を介してＲＮＡを編集するための組成物、系、及び方法に関する。

【背景技術】

【0004】

シュードウリジン（Ψ）は、安定的なＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、及びｍＲＮＡが挙げられる）中で最も豊富な転写後修飾ヌクレオチドであり、全リボヌクレオチドのうちのおよそ５％を構成する。ウリジンのΨへの変換（シュードウリジン化）は、２つの別個の化学反応：Ｃ１’－Ｎ１グリコシド結合の破壊、及び塩基を糖へ再連結する新しい炭素－グリコシド（Ｃ１’－Ｃ５）結合の成形を要求する。シュードウリジン化は真の異性化反応であり、余剰の水素結合供与体を生成し、Ψを保有するＲＮＡの型及びＲＮＡ配列内の位置に依存して、様々な機能的側面（タンパク質合成、及び終止コドンリードスルー増加等）に影響を及ぼす（Ｙｕ ａｎｄ Ｍｅｉｅｒ，２０１４，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：１４８３－１４９４）。ｍＲＮＡのΨの多くはコード領域中に存在し、大多数のそれらは環境ストレスへ応答し、機能的有意性を示す（Ｃａｒｌｉｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ５１５：１４３）。

【0005】

真核生物及び古細菌において、シュードウリジン化は、ボックスＨ／ＡＣＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）によって導入され得、当該ＲＮＰの各々は、ユニークな小分子ＲＮＡ（ボックスＨ／ＡＣＡ ＲＮＡ（２つの主要クラスの核小体低分子ＲＮＡまたは「ｓｎｏＲＮＡ」のうちの１つ）及び４つのコアタンパク質（ジスケリン（ＤＫＣ１）、ＮＨＰ２、ＮＯＰ１０、及びＧＡＲ１）を含有する。ジスケリン（ＤＫＣ１；ＮＡＰ５７／ＣＢＦ５としても公知である）は、高度に保存された多機能性タンパク質であり、ＲＮＡガイド型シュードウリジン合成酵素として作用し、特異的なウリジンのシュードウリジンへの酵素的変換を指令する。それは、核小体及びカハール体（ＣＢ）中に濃縮され、そこで、３つの他の高度に保存されたタンパク質（Ｎｏｐ１０、Ｎｈｐ２、Ｇａｒ１）と会合して、重要な生物学的な機能を演じる異なる核ＲＮＰの組成物中に侵入することが可能な四量体を構成する。核小体内で、四量体は、Ｈ／ＡＣＡ核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）と会合して、ｒＲＮＡプロセシングを調節し、ｓｎｏＲＮＡガイド型塩基相補性によってＲＮＡ標的をシュードウリジン化する、Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＰを構成する。ＣＢ内で、当該四量体は、ＣＢ特異的小分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）と会合して、スプライセオソームｓｎＲＮＡのシュードウリジン化を指令する、ｓｃａＲＮＰを構成する。ＮＡＰ５７／ジスケリン（ＤＫＣ１）／ＣＢＦ５は、化学反応を触媒し、標的ウリジンをΨへ変換する。ＲＮＡ構成要素は、基質ＲＮＡとの塩基対相互作用を介して、シュードウリジン化のための標的ウリジンを指定するガイドとして働く（Ｇｅ ａｎｄ Ｙｕ，２０１３，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ３８（４）：２ｌ０－２１８）。このガイド－基質塩基対スキームに基づいて、Ｋａｒｉｊｏｌｉｃｈ ａｎｄ Ｙｕ （２０１１，Ｎａｔｕｒｅ ４７４：３９５－３９８）は、人工的なボックスＨ／ＡＣＡ ＲＮＡをデザインして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて未成熟終止コドン（ＰＴＣ）でｍＲＮＡの中へΨを導入した。彼らは、ΨがＰＴＣでＴＲＭ４ ｍＲＮＡの中へ実際取り込まれることを実証した。シュードウリジン化ＰＴＣは、リボソーム解読の変更によってナンセンス抑制を促進した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｎａｔｕｒｅ ５００：１０７－１１０；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５６０：１８７－２１７；ＵＳ８，６０３，４５７）。類似の戦略を使用して、他の人々は、人工的なＨ／ＡＣＡ ＲＮＡが、アフリカツメガエル卵母細胞の中へのマイクロインジェクション後に、部位特異的にプレｍＲＮＡをシュードウリジン化し得ることを示した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３０：４１０８－４１１９）。両方の例において、人工的なＨ／ＡＣＡ ＲＮＡは、ガイド配列として働くループを変更するために修飾されたが、他の点では、これらのｓｎｏＲＮＡは変更されなかった。
部位特異的シュードウリジン化または標的ＲＮＡは可能性のある強力な技法であるが、ここまで利用可能な方法は、標的ＲＮＡの低い編集効率をもたらしてきた。したがって、最適化されたｇｓｎｏＲＮＡ、ｇｓｎｏＲＮＡベースの遺伝子編集システム、及びシュードウリジン化によって標的ＲＮＡを編集する方法についての当技術分野において必要性がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｙｕ ａｎｄ Ｍｅｉｅｒ，２０１４，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：１４８３－１４９４

【非特許文献2】Ｃａｒｌｉｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ５１５：１４３

【非特許文献3】Ｇｅ ａｎｄ Ｙｕ，２０１３，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ３８（４）：２ｌ０－２１８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本出願は、ｇｓｎｏＲＮＡ及びＤＫＣ１タンパク質を使用して、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法を提供する。方法の実施形態は、本明細書において「ＲＥＳＴＡＲＴ」方法としても参照され、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を有するＲＮＡ転写物のリードスルーを可能にするために使用され得る。

【0008】

いくつかの態様において、本出願は、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、ガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）及びＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含む。

【0009】

いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、野生型ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、またはＡＣＡ１７に由来するスキャフォールド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞の内在性ＤＫＣ１タンパク質である。いくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸を宿主細胞の中へ導入することをさらに含む。

【0010】

いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、表２、表３、または表４中で提供されるヌクレオチド配列からなる基から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。

【0011】

いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。

【0012】

いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号２０～２１及び１４５～１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞の内在性ＤＫＣ１タンパク質である。いくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸を宿主細胞の中へ導入することをさらに含む。

【0013】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞において細胞質内局在を有する。

【0014】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質のアミノ酸残基４１～４２０に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号２に従う。

【0015】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８に少なくとも８５％（例えば少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちの任意の１つ）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞において細胞質内局在のある天然に存在するＤＫＣ１アイソフォームを含む。

【0016】

いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、宿主細胞が、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームを発現し、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１アイソフォームを動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。

【0017】

いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、（ａ）操作されたｇｓｎｏＲＮＡ及び（ｂ）スプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ＡＳＯが、宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を促進し、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含む。

【0018】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１アイソフォームは、ヒトＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３に対応する。

【0019】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号２に少なくとも８５％（例えば少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちの任意の１つ）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0020】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、全長ヒトＤＫＣ１アイソフォーム１タンパク質のアミノ酸残基１～４１９に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号１に従う。

【0021】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂに由来するスキャフォールド配列を含む。上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６スキャフォールドの３’ヘアピン中に突然変異を含む。

【0022】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含む。

【0023】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のガイド配列を含み、各々は、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡのヘアピン構造に対応する領域中に所在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの３’端末部でのヘアピン構造（本明細書において「３’ヘアピン構造」としても参照される）中に所在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの５’端末部でのヘアピン構造（本明細書において「５’ヘアピン構造」としても参照される）中に所在する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２つ以上の（例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上の）ガイド配列を含む。

【0024】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型ＡＣＡ１９の１つまたは複数のヘアピン構造（例えば３’ヘアピン構造及び／または５’ヘアピン構造）中に１つまたは複数の突然変異（例えば置換、挿入、及び／または欠失）を含む。

【0025】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡ中のポリＵ配列のヌクレオチド中に１つまたは複数の置換突然変異を含み、ポリＵ配列は、少なくとも連続する４つのＵ残基を含む。

【0026】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基と野生型Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡのＨ／ＡＣＡボックスとの間に位置する１つまたは複数の挿入突然変異または欠失突然変異を含み、それによって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基とＨ／ＡＣＡボックスとの間に１４または１５ヌクレオチドを含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、ＵＵＣＵによる残基２６～２９の置換、ＵＧＵＵによる残基２６～２９の置換、残基１１５後の３’ヘアピン構造へのＧの添加、及び残基８後の５’ヘアピンへのジヌクレオチド配列（ＸＸ、例えばＣＵ）の添加からなる群から選択され、配列中、Ｘは、Ａ、Ｕ及びＣ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、ナンバリングは、配列番号３７に従う。いくつかの実施形態において、ジヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡへハイブリダイズするようにデザインされたガイドＲＮＡの一部である。

【0028】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号３～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１５～１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0029】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号２０～２１及び１４５～１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0030】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、方法は、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子を宿主細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、小分子ＲＮＡプロモーター下にある。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、Ｕ６プロモーター（例えば、ポリメラーゼＩＩＩによって転写される）及びＵ１プロモーター（例えば、ポリメラーゼＩＩによって転写されるからなる群から選択されるプロモーター下にある。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、第１のエクソン配列と第２のエクソン配列との間に所在するイントロン配列中に埋め込まれ、第１のエクソン配列、イントロン配列、及び第２のエクソン配列は、天然に存在する遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、宿主細胞における内在性遺伝子のイントロンからであり、遺伝子は、ＥＩＦ３Ａ、ＳＮＨＧ１２、ＲＰＬ２１、及びＲＰＳＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、外来性遺伝子（ＨＢＢ等）のイントロンからである。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸は、イントロン配列中に埋め込まれない。

【0031】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子は、ウイルスベクター中に存在する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、ウイルスベクター中に存在する。上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１タンパク質をコードする第１の核酸配列及びｇｓｎｏＲＮＡをコードする第２の核酸配列を含むベクターを宿主細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子及びｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、分離したベクター中に存在する。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

【0032】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、８以下、６以下、または４以下の化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、９以下、８以下、または６以下のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾を含む。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）キャップである。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオシド間連結を含まない。キャップ。

【0033】

【0034】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを編集する効率は、少なくとも１０％（例えば少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、またはそれ以上のうちの任意の１つ）である。

【0035】

標的ＲＮＡ中の標的ウリジンを含む配列が、タンパク質をコードする配列中の未成熟終止コドンである、上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、方法は、宿主細胞において、未成熟終止コドン無しの全長タンパク質の発現レベルの少なくとも４％（例えば少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％）の全長のタンパク質の発現をもたらす。

【0036】

標的ＲＮＡ中の標的ウリジンを含む配列が、タンパク質をコードする配列中の未成熟終止コドンである、上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、方法は、全長タンパク質の発現をもたらし、タンパク質の発現は、エンリッチメント無しで（例えば免疫沈降によるエンリッチメント無しで）検出可能である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タグ（例えば蛍光タグを介して）を介して検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、当技術分野において公知の方法に従って免疫染色によって検出される。

【0037】

標的ＲＮＡ中の標的ウリジンを含む配列が、タンパク質をコードする配列中の未成熟終止コドンである、上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、方法は、宿主細胞のうちの少なくとも２０％（例えば宿主細胞のうちの少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％）において全長タンパク質の発現をもたらす。

【0038】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）（宿主細胞の内在性ｒＲＮＡ等）ではない。

【0039】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的ウリジンを含む配列は、終止コドンであり、標的ウリジンのシュードウリジンへの修飾は、終止コドンをコーディングコドンとして翻訳されるようにする。いくつかの実施形態において、終止コドンは、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）である。いくつかの実施形態において、ＰＴＣは、遺伝性の疾患または病態と関連する。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的ウリジンを含む配列は、終止コドンであり、標的ウリジンのシュードウリジンへの修飾は、ナンセンス媒介性崩壊（ＮＭＤ）を低減または防止する。

【0040】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、ＲＮＰ複合体は、ＮＯＰ１０、ＧＡＲ１、及びＮＨＰ２を含む。

【0041】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、宿主細胞は、古細菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核生物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト細胞である。

【0042】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、方法は、インビボで実行される。いくつかの実施形態において、方法は、エクスビボで実行される。

【0043】

いくつかの態様において、対象における標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する疾患または病態を治療する方法であって、上で記載される方法のうちの任意のものを使用して、対象の細胞における標的ＲＮＡを編集することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中のＰＴＣへハイブリダイズするガイド配列を含み、ＰＴＣ中のウリジン残基のシュードウリジン残基への修飾が、標的ＲＮＡ中のＰＴＣの翻訳リードスルーを引き起こし、それによって、対象における疾患または病態を治療する、前記方法が本明細書において提供される。

【0044】

いくつかの実施形態において、疾患または病態は、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠乏症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、８－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、水疱性表皮剥離症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫様ポリープ、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン舞踏病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーベル先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型及びＩＩ型、神経繊維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏｌ関連癌、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異等）、肺高血圧症（常染色体優性）、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌形赤血球貧血症、脊髄筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全症、スタージ・ウェーバー症候群、及びがんからなる群から選択される。

【0045】

いくつかの態様において、宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号２０～２１及び１４５～１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である。

【0046】

いくつかの態様において、宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡであって、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、前記ｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。

【0047】

上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾を含む。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）キャップである。上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含む。上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意の１つに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、８以下、６以下、または４以下の化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、９以下、８以下、または６以下のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。

【0048】

上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂに由来するスキャフォールド配列を含む。上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６スキャフォールドの３’ヘアピン中に突然変異を含む。

【0049】

上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含む。

【0050】

上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のガイド配列を含み、各々は、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡのヘアピン構造に対応する領域中に所在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの３’端末部でのヘアピン構造中に所在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの５’端末部でのヘアピン構造中に所在する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２つ以上の（例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上の）ガイド配列を含む。

【0051】

上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型ＡＣＡ１９の１つまたは複数のヘアピン構造（例えば３’ヘアピン構造及び／または５’ヘアピン構造）中に１つまたは複数の突然変異（例えば置換、挿入、及び／または欠失）を含む。

【0052】

上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡ中のポリＵ配列のヌクレオチド中に１つまたは複数の置換突然変異を含み、ポリＵ配列は、少なくとも連続する４つのＵ残基を含む。

【0053】

上で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基と野生型Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡのＨ／ＡＣＡボックスとの間に位置する１つまたは複数の挿入突然変異または欠失突然変異を含み、それによって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基とＨ／ＡＣＡボックスとの間に１４または１５ヌクレオチドを含む。

【0054】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、ＵＵＣＵによる残基２６～２９の置換、ＵＧＵＵによる残基２６～２９の置換、残基１１５後の３’ヘアピン構造へのＧの添加、及び残基８後の５’ヘアピンへのジヌクレオチド配列（ＸＸ、例えばＣＵ）の添加からなる群から選択され、配列中、Ｘは、Ａ、Ｕ及びＣ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、ナンバリングは、配列番号３７に従う。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１５～１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0055】

いくつかの態様において、宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡであって、ｇｓｎｏＲＮＡが、野生型ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含み、操作されたｇｓｎｏＲＮＡが、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基と野生型ＡＣＡ１９のＨ／ＡＣＡボックスとの間に位置する１つまたは複数の挿入突然変異または欠失突然変異を含み、それによって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡが、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基とＨ／ＡＣＡボックスとの間に１４または１５ヌクレオチドを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、前記ｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、ＵＵＣＵによる残基２６～２９の置換、ＵＧＵＵによる残基２６～２９の置換、残基１１５後の３’ヘアピン構造へのＧの添加、及び残基８後の５’ヘアピンへのジヌクレオチド配列（ＸＸ、例えばＣＵ）の添加からなる群から選択され、配列中、Ｘは、Ａ、Ｕ及びＣ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、ナンバリングは、配列番号３７に従う。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１５～１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0056】

いくつかの態様において、先行する実施形態のうちの任意のものの操作されたｇｓｎｏＲＮＡをコードする配列を含む単離された核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、核酸分子を含むベクター（例えばウイルスベクター）が本明細書において提供される。

【0057】

いくつかの態様において、（ａ）宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含むｇｓｎｏＲＮＡ、またはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子；及び（ｂ）ＤＫＣ１タンパク質、またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、操作されたＲＮＡ編集系が本明細書において提供される。

【0058】

いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞において細胞質内局在を有する。上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質のアミノ酸残基４１～４２０に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号２に従う。

【0059】

上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８に少なくとも８５％（例えば少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちの任意の１つ）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。上で記載される方法のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞において細胞質内局在のある天然に存在するＤＫＣ１アイソフォームを含む。

【0060】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１アイソフォームは、ヒトＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３に対応する。

【0061】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号２に少なくとも８５％（例えば少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちの任意の１つ）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0062】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、全長ヒトＤＫＣ１アイソフォーム１タンパク質のアミノ酸残基１～４１９に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号１に従う。

【0063】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂに由来するスキャフォールド配列を含む。上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６スキャフォールドの３’ヘアピン中に突然変異を含む。

【0064】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含む。

【0065】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のガイド配列を含み、各々は、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡのヘアピン構造に対応する領域中に所在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの３’端末部でのヘアピン構造中に所在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のガイド配列のうちの少なくとも１つは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの５’端末部でのヘアピン構造中に所在する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２つ以上の（例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上の）ガイド配列を含む。

【0066】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型ＡＣＡ１９の１つまたは複数のヘアピン構造（例えば３’ヘアピン構造及び／または５’ヘアピン構造）中に１つまたは複数の突然変異（例えば置換、挿入、及び／または欠失）を含む。

【0067】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡ中のポリＵ配列のヌクレオチド中に１つまたは複数の置換突然変異を含み、ポリＵ配列は、少なくとも連続する４つのＵ残基を含む。

【0068】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基と野生型Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡのＨ／ＡＣＡボックスとの間に位置する１つまたは複数の挿入突然変異または欠失突然変異を含み、それによって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基とＨ／ＡＣＡボックスとの間に１４または１５ヌクレオチドを含む。

【0069】

操作されたＲＮＡ編集系のいくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、リボヌクレオタンパク質複合体は、ＮＯＰ１０、ＧＡＲ１、及び／またはＮＨＰ２を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、ＵＵＣＵによる残基２６～２９の置換、ＵＧＵＵによる残基２６～２９の置換、残基１１５後の３’ヘアピン構造へのＧの添加、及び残基８後の５’ヘアピンへのジヌクレオチド配列（ＸＸ、例えばＣＵ）の添加からなる群から選択され、配列中、Ｘは、Ａ、Ｕ及びＣ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、ナンバリングは、配列番号３７に従う。

【0071】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号３～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１５～１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0072】

上で記載される操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものに従ういくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号２０～２１及び１４５～１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0073】

いくつかの態様において、上で記載されるｇｓｎｏＲＮＡ、核酸分子、または操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のもの、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。

【0074】

いくつかの態様において、上で記載されるｇｓｎｏＲＮＡ、核酸分子、または操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものを含む宿主細胞が本明細書において提供される。

【0075】

いくつかの態様において、上で記載されるｇｓｎｏＲＮＡ、核酸分子、または操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものを含む宿主細胞における標的ＲＮＡを編集するためのキットが本明細書において提供される。

【0076】

上で記載される方法のうちの任意の１つにおける使用のための組成物、キット、及び製造物品も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0077】

【図1】操作されたガイドｓｎｏＲＮＡによって媒介される未成熟終止コドンのリードスルーを示す。Ａは、「ＲＥＳＴＡＲＴ」方法デザインの概略図を提供する。ｓｎｏＲＮＰ複合体を破線ボックス中に示す。Ｂは、レポーター－１及びガイドｓｎｏＲＮＡコンストラクトの構造を示す概略図を提供する。レポーター－１において、１５塩基が、１５４番目と１５５番目のアミノ酸のコドンの間の位置の中へ挿入される。１５塩基のＤＮＡ配列が示され、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）部位（ＴＡＧ）が示される。陽性対照（Ｖｅｎｕｓ－ＧＧＴ）が含まれる。Ｃ～Ｄでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にレポーター－１及びガイドｓｎｏＲＮＡコンストラクトをコトランスフェクションした。Ｖｅｎｕｓ発現は、ハイコンテントイメージング系によって検出された。Ｃは、Ｖｅｎｕｓの発現レベルを示す細胞の代表的な蛍光画像を示す。バー、２００μｍ。Ｄは、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットを示す。Ｅは、ＤＫＣ１の安定的なノックダウンに際しての、ＤＫＣ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット分析である。Ｆは、レポーター－１及びｇｓｎｏＲＮＡコンストラクトをコトランスフェクションしたｓｈ対照及びＤＫＣ１の安定的なノックダウン細胞におけるＶｅｎｕｓ陽性細胞の相対的割合を示すバープロットである。

【0078】

【図2】異なるコンストラクトのｇｓｎｏＲＮＡによって媒介されるＰＴＣリードスルー効果を示す。ドットプロットは、レポーター－１及び宿主イントロン内のｇｓｎｏＲＮＡ（Ａ）、ＨＢＢイントロン内のｇｓｎｏＲＮＡ（Ｂ）、または小分子ＲＮＡプロモーターから転写されたｇｓｎｏＲＮＡ（Ｃ）をコトランスフェクションしたＶｅｎｕｓ陽性細胞の相対的割合を示す。ｇｓｎｏＲＮＡコンストラクトの構造を、各々のパネルの下部において示した。

【0079】

【図3】図１Ａ～１Ｆ中で使用されるｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドの予測される二次構造を示す。二次構造及び塩基対合確率は、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ ｗｅｂｓｕｉｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６，Ｗ７０－４ （２００８））（その内容は参照することによってその全体が本明細書に援用される）中で記載されるように、ＲＮＡｆｏｌｄ ｓｅｒｖｅｒを使用して予測される。

【0080】

【図4】ｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドの最適化がＰＴＣリードスルーの効率を改善することを示す。Ａは、ｇＡＣＡ１９、ｇＡＣＡ２ｂ、及びｇＡＣＡ３６スキャフォールドの予測される二次構造である。二次構造及び塩基対合確率を、ＲＮＡｆｏｌｄ ｓｅｒｖｅｒを使用して予測する。ｇＡＣＡ１９スキャフォールドの構造中で、７つの突然変異が示される。Ｂは、ｇｓｎｏＲＮＡコンストラクトの構造である。Ｃは、（Ｂ）コンストラクトのレポーター－１及びｇｓｎｏＲＮＡをコトランスフェクションしたＶｅｎｕｓ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットである。Ｄは、（Ｂ）コンストラクトのレポーター－１及びｇｓｎｏＲＮＡをコトランスフェクションした細胞の代表的な蛍光画像である。バー、２００μｍ。Ｅは、レポーター－１及び異なる突然変異を備えた操作されたｇＡＣＡ１９スキャフォールドをコトランスフェクションしたＶｅｎｕｓ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットである。ｇＡＣＡ１９の操作された位置は、（Ａ）中で注釈される。Ｆは、（Ｅ）の代表的な蛍光画像である。バー、２００μｍ。

【0081】

【図5】図４Ａ～４Ｆ中で使用されるｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドの予測される二次構造を示す。二次構造及び塩基対合確率を、ＲＮＡｆｏｌｄ ｓｅｒｖｅｒを使用して予測する。

【0082】

【図6】ｇＡＣＡ３６スキャフォールドの操作を示す。Ａは、操作されたｇＡＣＡ３６スキャフォールドの予測される二次構造である。二次構造及び塩基対合確率を、ＲＮＡｆｏｌｄ ｓｅｒｖｅｒを使用して予測する。Ｂは、レポーター－１及び異なるｇｓｎｏＲＮＡコンストラクトをコトランスフェクションしたＶｅｎｕｓ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットである。

【0083】

【図7A】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。ヒトＤＫＣ１転写物の２つのアイソフォームの構造である。エクソンを上部にナンバリングし、コード領域を塗りつぶしたボックスによって表わし、ＵＴＲを白色ボックスによって表わす。ＮＬＳ、核局在化シグナル。

【図7B】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。レポーター－３コンストラクトの構造を示す概略図であり、ｇｓｎｏＲＮＡは、レポーターと共にタンデムにアレンジされる。ＰＴＣ部位を囲む配列及びＰＴＣ部位（ＴＡＡ／ＴＡＧ／ＴＧＡ）を示す。

【図7C】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ ＤＫＣ１安定的な過剰発現細胞におけるＤＫＣ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット分析である。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ及びＡｂｃａｍの抗ＤＫＣ１抗体は、ＤＫＣ１タンパク質のＣ末端領域及びＮ末端領域をそれぞれ標的化する。

【図7D】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。示されたレポーター－３コンストラクトを、対照ＨＥＫ２９３Ｔ、ＤＫＣ１アイソフォーム１の安定的過剰発現細胞、及びＤＫＣ１アイソフォーム３つの安定的過剰発現細胞の中へ、それぞれトランスフェクションした。細胞の代表的な蛍光画像である。バー、２００μｍ。

【図7E】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。示されたレポーター－３コンストラクトを、対照ＨＥＫ２９３Ｔ、ＤＫＣ１アイソフォーム１の安定的過剰発現細胞、及びＤＫＣ１アイソフォーム３つの安定的過剰発現細胞の中へ、それぞれトランスフェクションした。ＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すバープロットである。

【図7F】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。示されたレポーター－３コンストラクトを、対照ＨＥＫ２９３Ｔ、ＤＫＣ１アイソフォーム１の安定的過剰発現細胞、及びＤＫＣ１アイソフォーム３つの安定的過剰発現細胞の中へ、それぞれトランスフェクションした。ＥＧＦＰ強度の相対的割合を示すバープロットである。

【図7G】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。異なるレポーター－３コンストラクトをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ならびに異なるレポーター－３及びＤＫＣ１アイソフォーム３（２００ｎｇ）コンストラクトをコトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すバープロットである。

【図7H】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。異なるレポーター－３コンストラクトをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ならびに異なるレポーター－３及びＤＫＣ１アイソフォーム３（２００ｎｇ）コンストラクトをコトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ強度の相対的割合を示すバープロットである。

【図7I】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。レポーター－３転写物における遺伝子座特異的Ψ修飾を、放射性同位体標識無しのｑＰＣＲベースの方法によって検出した。高解像度融解分析によって曲線を得た。Ψ部位を、ＣＭＣ化学物質によって特異的に標識し、逆転写後に、Ψ－ＣＭＣ付加物は、ｃＤＮＡ中のΨ部位でまたはその周囲で突然変異／欠失を引き起こし、したがって溶融温度におけるシフトを生じさせる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、異なるレポーター－３及びＤＫＣ１アイソフォーム３（２００ｎｇ）コンストラクトをコトランスフェクションした。

【0084】

【図8】外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質がＰＴＣ－ＲＴの効率を改善することを示す。Ａ～Ｃ、レポーター－１コンストラクトを、対照ＨＥＫ２９３Ｔ、ＤＫＣ１アイソフォーム１の安定的過剰発現細胞、及びＤＫＣ１アイソフォーム３つの安定的過剰発現細胞の中へ、それぞれトランスフェクションした。Ａは、細胞の代表的な蛍光画像である。バー、２００μｍ。Ｂは、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の相対的割合を示すバープロットである。Ｃは、Ｖｅｎｕｓ強度の相対的割合を示すバープロットである。Ｄは、空ベクター（Ｖｅｃ）、ＤＫＣ１アイソフォーム１（ＤＫＣ１ ｉｓｏ１）、またはＤＫＣ１アイソフォーム３（ＤＫＣ１ ｉｓｏ３）コンストラクトと一緒にレポーター－３をコトランスフェクションしたＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットである。バープロットの統計解析は、対応のないスチューデントのｔ検定である。

【0085】

【図9】ＤＫＣ１アイソフォーム３の異なる短縮のリードスルー効率を示す。レポーター－３及び異なるＤＫＣ１アイソフォーム３短縮コンストラクトをコトランスフェクションしたＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットである。

【0086】

【図10】異なる終止コドンについてのリードスルー効率の比較を示す。Ａは、異なるレポーター－３コンストラクトをトランスフェクションした細胞の代表的な蛍光画像である。バー、２００μｍ。Ｂは、示されたレポーター－３及びＤＫＣ１アイソフォーム３（２００ｎｇ）コンストラクトをコトランスフェクションした細胞の代表的な蛍光画像である。バー、２００μｍ。Ｃ～Ｅは、ＤＫＣ１アイソフォーム３コンストラクトの量を減少させると共に、レポーター－３－ＴＡＡ（Ｃ）、レポーター－３－ＴＡＧ（Ｄ）、またはレポーター－３－ＴＧＡ（Ｅ）をコトランスフェクションしたＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すバープロットである。

【0087】

【図11】遺伝子座特異的Ψ修飾の検出を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、異なるレポーター－３及びＤＫＣ１アイソフォーム３（２００ｎｇ）コンストラクトをコトランスフェクションした。レポーター－３転写物（Ａ）及び１８Ｓ ｒＲＮＡ中のΨ１０４５部位（Ｂ～Ｃ）内の遺伝子座特異的Ψ修飾を、放射性同位体標識無しのｑＰＣＲベースの方法によって検出した。高解像度融解分析によって曲線を得た。

【0088】

【図12】ガイドｓｎｏＲＮＡは、ナンセンス突然変異によって引き起こされた遺伝的障害を標的化する。ＰＴＣ疾患レポーター及びｇｓｎｏＲＮＡコンストラクトの概略図である。ｇｓｎｏＲＮＡ（上部）とＰＴＣ疾患遺伝子中の標的部位（下部）との間の相補性領域である。

【0089】

【図13】ｇｓｎｏＲＮＡ（上部）とＰＴＣ疾患遺伝子中の標的部位（下部）との間の相補性領域である。

【0090】

【図14A】ＲＥＳＴＡＲＴが、遺伝的障害を引き起こし得るナンセンス突然変異を修正することを示す。示されたｇｓｎｏＲＮＡ及びＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１ ＰＴＣ疾患レポーターコンストラクトをコトランスフェクションしたＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットである。

【図14B】ＲＥＳＴＡＲＴが、遺伝的障害を引き起こし得るナンセンス突然変異を修正することを示す。示されたｇｓｎｏＲＮＡ及びＲＥＳＴＡＲＴ ｖ２ ＤＫＣ１アイソフォーム３コンストラクトをコトランスフェクションしたＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すドットプロットである。

【図14C】ＲＥＳＴＡＲＴが、遺伝的障害を引き起こし得るナンセンス突然変異を修正することを示す。示されたｇｓｎｏＲＮＡ及びＰＴＣ疾患レポーターを、ＤＫＣ１アイソフォーム３コンストラクト有りまたは無しでコトランスフェクションしたＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すバープロットである。

【0091】

【図15A】ＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＥＳＴＡＲＴの送達を示す。インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡの構造である。

【図15B】ＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＥＳＴＡＲＴの送達を示す。インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡの構造である。

【図15C】ＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＥＳＴＡＲＴの送達を示す。インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡの構造である。

【図15D】ＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＥＳＴＡＲＴの送達を示す。示されたｇｓｎｏＲＮＡコンストラクト、インビトロ転写されたｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチド、または化学的に合成されたｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクションしたＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合を示すバープロットである。

【図15E】ＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＥＳＴＡＲＴの送達を示す。化学的に合成されたｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造である。

【発明を実施するための形態】

【0092】

本出願は、宿主細胞中の標的ＲＮＡを編集するための方法及び組成物であって、操作されたガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）を宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法及び組成物を提供する。いくつかの態様において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型Ｈ／ＡＣＡスキャフォールドに比較して、１つまたは複数の突然変異を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡである。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、ｇｓｎｏＲＮＡの編集効率を増加させる。いくつかの態様において、方法は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１タンパク質の細胞レベルを増加させ、それによってｇｓｎｏＲＮＡ／ＤＫＣ１タンパク質複合体の編集効率が増加することをさらに含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法及び組成物は、標的遺伝子ｍＲＮＡ中の未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を編集し、それによって、ｍＲＮＡのナンセンス媒介性崩壊を抑制し、全長タンパク質の翻訳を促進するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される方法は、標的遺伝子中のＰＴＣに関連する疾患を治療するために使用され得る。

【0093】

いくつかの態様において、本開示は、操作されたｇｓｎｏＲＮＡ及びｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールド、またはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドは、他のスキャフォールドに比較してより高い編集効率を有するとして本発明者らによって同定された野生型Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡスキャフォールドに基づく。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドは、編集効率を増加させる突然変異を含む。

【0094】

本出願において記載される方法及び組成物は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１のアイソフォーム（例えばヒトＤＫＣ１のアイソフォーム３）の発現が、ｇｓｎｏＲＮＡ／ＤＫＣ１系を使用する標的ＲＮＡの編集効率を有意に増加させるという予想外の探索に少なくとも部分的に基づく。一態様において、本発明者らは、細胞質内局在のある外来性ＤＫＣ１アイソフォームを導入することによって、ｇｓｎｏＲＮＡの編集効率を増加させ得ることを認識した。別の態様において、本発明者らは、ｇｓｎｏＲＮＡの編集効率を増加させるために使用され得るＤＫＣ１タンパク質の短縮バリアント及び欠失バリアントを同定した。

【0095】

いくつかの態様において、本明細書において記載される方法に従う使用のためのｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸コンストラクトが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本発明者らは、ｇｓｎｏＲＮＡの編集効率の増加を提供するｇｓｎｏＲＮＡ発現のためのプロモーター及びコンストラクトの構成を同定した。

【0096】

Ｉ．定義
用語は、別段定義されない限り、概して当技術分野において使用されるように、以下の通り本明細書において使用される。

【0097】

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド配列」、及び「核酸配列」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかのヌクレオチドのポリマー形態を指す。

【0098】

本明細書において使用される時、「相補性」は、伝統的なワトソン・クリック型塩基対合及び揺らぎ塩基対合によって、核酸が別の核酸と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸と水素結合（すなわちワトソン・クリック型塩基対合及び揺らぎ塩基対合）を形成し得る核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば１０中の約５、６、７、８、９、１０は、それぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的である」は、すべての核酸配列の連続した残基が、第２の核酸配列中の連続した残基の同じ数と水素結合を形成することを意味する。「実質的に相補的である」は、本明細書において使用される時、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のうちの任意の１つである相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

【0099】

「ハイブリダイゼーション」への参照は、典型的には、特異的なハイブリダイゼーションを指し、非特異的ハイブリダイゼーションを除外する。特異的なハイブリダイゼーションは、プローブと標的との間の安定的相互作用の大多数が、プローブ及び標的が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する場合に確実にされるように、当技術分野において周知の技法を使用して、選ばれた実験条件下で起こり得る。

【0100】

「ミスマッチ」という用語は、本明細書において、ワトソン・クリック型対合法則及び揺らぎ塩基対合法則に従って完全な塩基対を形成しない、二本鎖ＲＮＡ複合体中の向かい合うヌクレオチドを指すように使用される。ミスマッチヌクレオチドは、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕペアである。揺らぎ塩基対は、Ｇ－Ｕ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ａ、及びＩ－Ｃ塩基対である。

【0101】

本開示は、ポリヌクレオチドベースまたはポリペプチドベースの複数の型の組成物（バリアント及び誘導体を包含する）を提供する。これらのものとしては、例えば置換、挿入、欠失、及び共有結合のバリアント及び誘導体が挙げられる。「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義であり、概して、参照分子または出発分子に比べて、任意の手法で修飾及び／または変化された分子を指す。

【0102】

それゆえ、参照配列（特に本明細書において開示されるポリペプチド配列）に関して、置換、挿入及び／または添加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸（１つまたは複数のリジン等）は、ペプチド配列（例えばＮ末端またはＣ末端で）へ添加され得る。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または局在化のために使用され得る。リジンは、ペプチド可溶性を増加させるかまたはビオチン化を可能にするために使用され得る。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に所在するアミノ酸残基は、任意選択で欠失され、短縮配列を提供し得る。ある特定のアミノ酸（例えばＣ末端残基またはＮ末端残基）は、代替的に、配列の用途（例えば可溶性であるかまたは固体支持体へ連結される、より大きな配列の一部としての配列の発現）に依存して、欠失され得る。

【0103】

「同一性」という用語は、ポリマー分子間の、例えばポリヌクレオチド分子（例えばＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間の、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。２つのポリ核酸配列のパーセント同一性の計算は、例えば最適な比較目的のために２つの配列をアライメントさせることによって遂行され得る（例えば最適なアライメントのために、ギャップは、第１核酸配列及び第２の核酸配列のうちの１つまたは両方に導入され得、非同一配列は、比較の目的のために無視され得る）。ある特定の実施形態において、比較の目的のためにアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで対応するヌクレオチド位置でのヌクレオチドは比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合に、その時分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセンテージ同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要のあるギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮に入れて、配列が共有する同一である位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つの核酸配列間のパーセント同一性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１（その各々は参照することによって本明細書に援用される）中で記載されるもの等の方法を使用して決定され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中へ組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ １２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用して、決定され得る。２つの核酸配列間のパーセント同一性は、代替的に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰのプログラムを使用して、決定され得る。配列間のパーセント同一性を決定するために一般的に用いられる方法としては、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３ （１９８８）（参照することによって本明細書に援用される）中で開示されるものが挙げられるがこれらに限定されない。同一性の決定のための技法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化される。２つの配列間の相同性を決定する例示的なコンピューターソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられるがこれらに限定されない。

【0104】

本明細書において同定されるポリペプチド配列に関して、「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮して配列をアライメントさせた後に、比較されているポリペプチド中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、またはＭＵＳＣＬＥソフトウェア等）を使用して、当業者の範囲内の様々な手法で達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを包含する、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータープログラムＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２－１７９７，２００４；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５（１）：１１３，２００４、これらの各々は、それらの全体をすべての目的のために参照することによって本明細書に援用される）を使用して生成される。

【0105】

「天然に存在しない」または「操作された」という用語は、互換的に使用され、人手の関与を示す。当該用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合に、核酸分子またはポリペプチドが、天然に存在する核酸分子またはポリペプチドに比較して、少なくとも１つの修飾（例えば少なくとも１つの突然変異（置換、挿入、または欠失等）、または少なくとも１つの天然に存在しない化学修飾）を含むか、またはそれらが自然界で天然に会合し、自然界で見出されるような少なくとも１つの他の構成要素が少なくとも実質的にないことを意味する。

【0106】

「野生型」という用語は、ＡＣＡスキャフォールド配列を参照して本明細書において使用される時、天然に存在するボックスＨ／ＡＣＡ核小体低分子ＲＮＡの配列を指す。

【0107】

本明細書において使用される時、「発現」は、ＤＮＡ鋳型からポリヌクレオチドが（及びｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物等へと）転写されるプロセス、及び／または転写されたｍＲＮＡが後続してペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するならば、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0108】

「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、本明細書において、すべての種類の天然に存在するタンパク質及び合成タンパク質を網羅し、すべての長さのタンパク質断片、融合タンパク質、及び修飾されたタンパク質（糖タンパク質、そして他のすべての型の修飾されたタンパク質（例えばリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、糖鎖付加、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ＡＤＰリボシル化、ＰＥＧ化、ビオチン化などからもたらされるタンパク質）が限定されずに挙げられる）を包含するように使用される。

【0109】

「医薬組成物」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が効果的であることを許容し、且つ製剤が投与されるであろう対象に許容できない毒性の追加の構成要素を含有しないような形態である調製物を指す。

【0110】

「薬学的に許容される担体」は、対象へ非毒性である活性成分以外の医薬製剤中の１つまたは複数の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、バッファー、賦形剤、安定化物質、凍結保護物質、等張化剤、防腐物質、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは毒性学試験及び製造試験の要求される基準を満たし、及び／または、米国食品医薬品局もしくは他の州政府／連邦政府によって立案されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれるか、または哺乳動物における（より具体的にはヒトにおける）使用のために米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方中でリストされる。

【0111】

「パッケージ挿入物」という用語は、治療製品の商業用パッケージ中に慣習的に含まれる指示書を指すように使用され、これは、かかる治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、及び／または使用に関する警告についての情報を含有する。

【0112】

「製造品」は、少なくとも１つの試薬（例えば疾患もしくは病態（例えばコロナウイルス感染）の治療のための医薬品、または本明細書において記載されるバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブ）を含む、任意の製造物（例えばパッケージまたは容器）またはキットである。ある特定の実施形態において、製造物またはキットは、本明細書において記載される方法の遂行のための単位として促進、分布、または販売される。

【0113】

本明細書において記載される実施形態は、「からなる」実施形態及び／または「から本質的になる」実施形態を包含することが理解される。

【0114】

本明細書における値またはパラメーターの「約」への参照は、その値またはパラメーターそれ自体に関する変動を包含する（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は、「Ｘ」の記載を包含する。

【0115】

本明細書において使用される時、値またはパラメーターの「ではない」への参照は、概して、値またはパラメーターの「以外」を意味及び記載する。例えば、方法がＸ型の疾患を治療するために使用されないとは、方法がＸ型以外の疾患を治療するために使用されることを意味する。

【0116】

本明細書において使用される「約Ｘ～Ｙ」という用語は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。

【0117】

本明細書及び添付の請求項において使用される時、単数形「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、別段文脈が明らかに指示しない限り、複数の指示対象を包含する。

【0118】

「及び／または」という用語は、「Ａ及び／またはＢ」等の語句中で本明細書において使用される時、Ａ及びＢの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；ならびにＢ（単独）を包含することが意図される。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の語句中で本明細書において使用される時、以下の実施形態の各々：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を網羅することが意図される。

【0119】

ＩＩ．組成物及び系
いくつかの態様において、宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡであって、ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、前記ｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、８以下、６以下、または４以下の化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、９以下、８以下、または６以下のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾（例えば７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）キャップ修飾）を含む。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体を使用して、インビトロの転写によって導入される。

【0120】

いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、インビトロの転写によって産生される。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって産生される操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、全長ｇｓｎｏＲＮＡ（例えば３’ヘアピン、５’ヘアピン、Ｈボックス、及びＡＣＡボックスを含む）である。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって産生される操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾（例えば７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）キャップ修飾）を含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、単一のヘアピン及びＨボックスを含むが、ＡＣＡボックスを含まない。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１７９の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、単一のヘアピン及びＡＣＡボックスを含むが、Ｈボックスを含まない。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１８０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、８以下、６以下、または４以下の化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、９以下、８以下、または６以下のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。

【0122】

いくつかの態様において、宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含む操作されたｇｓｎｏＲＮＡであって、ｇｓｎｏＲＮＡが、野生型ＡＣＡ２ｂまたはＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、前記ｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１１または１２の配列に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１１または１２に比較して、１、２、３、または４つの置換変異、欠失変異、及び／または挿入変異を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、８以下、６以下、または４以下の化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１０以下、９以下、８以下、または６以下のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾（例えば７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）キャップ修飾）を含む。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体を使用して、インビトロの転写によって導入される。

【0123】

いくつかの態様において、本明細書において提供されるｇｓｎｏＲＮＡをコードする配列を含む単離された核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂに由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３の発現を促進する物質をコードする配列（例えばスプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＡＳＯは宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を促進する）をさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＤＫＣ１アイソフォームまたはＤＫＣ１タンパク質バリアントをコードする配列をさらに含み、アイソフォームまたはバリアントは細胞質内局在を有する。例示的なＤＫＣ１タンパク質は、以下のセクションＩＩ Ａ中で記載される。

【0124】

いくつかの態様において、（ａ）宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含むｇｓｎｏＲＮＡ（以下のセクションＩＩ Ｂ中で記載されるｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意の１つ等）、またはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子；及び（ｂ）ＤＫＣ１タンパク質（以下のセクションＩＩ Ａ中で記載されるｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意の１つ等）、またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、操作されたＲＮＡ編集系が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームである。

【0125】

いくつかの態様において、本明細書において記載されるｇｓｎｏＲＮＡ、核酸コンストラクト／分子、または操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものを含む宿主細胞が本明細書において提供される。

【0126】

いくつかの態様において、本明細書において記載されるｇｓｎｏＲＮＡ、核酸コンストラクト／分子、または操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のものを含む宿主細胞における標的ＲＮＡを編集するためのキットが本明細書において提供される。

【0127】

Ａ．ＤＫＣ１タンパク質
本出願は、いくつかの実施形態において、操作されたＤＫＣ１タンパク質、またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸コンストラクトを提供する。

【0128】

ジスケリン（ＤＫＣ１）は、高度に保存された多機能性タンパク質であり、ＲＮＡガイド型シュードウリジン合成酵素として作用し、特異的なウリジンのシュードウリジンへの酵素的変換を指令する。ＤＫＣ１は、核小体及びカハール体（ＣＢ）中に濃縮され、そこで、３つの他の高度に保存されたタンパク質（Ｎｏｐ１０、Ｎｈｐ２、Ｇａｒ１）と会合して、重要な生物学的な機能を演じる異なる核ＲＮＰの組成物中に侵入することが可能な四量体を構成する。核小体内で、四量体は、Ｈ／ＡＣＡ核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）と会合して、ｒＲＮＡプロセシングを調節し、ｓｎｏＲＮＡガイド型塩基相補性によってＲＮＡ標的をシュードウリジン化する、Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＰを構成する。ＣＢ内で、当該四量体は、ＣＢ特異的小分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）と会合して、スプライセオソームｓｎｏＲＮＡのシュードウリジン化を指令する、ｓｃａＲＮＰを構成する。

【0129】

ヒト細胞において２つのＤＫＣ１アイソフォームがある。ＤＫＣ１アイソフォーム１は、二部構成のＮ末端及びＣ末端の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するカノニカルなＤＫＣ１形態である。ＤＫＣ１アイソフォーム３は、オルタナティブスプライシングバリアントであり、それはイントロン１２の保持によって産生され、Ｃ末端ＮＬＳを欠如する（図９Ａ）。アイソフォーム１の内在性ｍＲＮＡ発現レベルは、アイソフォーム３のものよりもおよそ２０倍高い^５。驚くべきことに、本発明者らは、ＤＫＣ１アイソフォーム３のレベルを増加させることが、ｇｓｎｏＲＮＡによってガイドされる標的シュードウリジン化編集効率（例えば標的ｍＲＮＡの編集効率）を促進することを見出した。

【0130】

いくつかの態様において、本開示の組成物は、ＤＫＣ１タンパク質の発現のための核酸コンストラクトを含む。いくつかの態様において、本開示の組成物は、ＤＫＣ１タンパク質（例えばｇｓｎｏＲＮＡとの複合体中のＤＫＣ１タンパク質）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、哺乳動物のＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３に相同である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム３である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号２に少なくとも８５％（例えば少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの任意のもの）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。全長のＤＫＣ１（アイソフォーム１）及びアイソフォーム３ ＤＫＣ１の配列、以下の表１中で示される。

【0131】

いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、リボヌクレオタンパク質複合体は、ＮＯＰ１０、ＧＡＲ１、及び／またはＮＨＰ２を含む。

【0132】

いくつかの態様において、短縮されたＤＫＣ１タンパク質バリアント及びそれをコードする核酸コンストラクトが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、同じ種の野生型ＤＫＣ１タンパク質に比べて核局在化シグナル（ＮＬＳ）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ＤＫＣ１アイソフォーム３のアミノ酸残基９～２１の欠失を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号２に基づく。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ＤＫＣ１アイソフォーム３のアミノ酸残基２２～４２０を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号２に基づく。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ＤＫＣ１アイソフォーム３のアミノ酸残基３５～４２０を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号２に基づく。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ＤＫＣ１アイソフォーム３のアミノ酸残基４１～４２０を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号２に基づく。配列番号２におけるＤＫＣ１配列は、ヒトＤＫＣ１のアイソフォーム３であるが、当業者であれば、配列アライメントに基づいた相同なＤＫＣ１タンパク質の対応する短縮バリアント及び欠失バリアント（例えば他の哺乳動物種からのＤＫＣ１タンパク質の対応する欠失バリアント／短縮バリアント）を生成する方法を理解するだろう。

【0133】

いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８５に少なくとも８５％（例えば少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの任意のもの）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８６に少なくとも８５％（例えば少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの任意のもの）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８７に少なくとも８５％（例えば少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの任意のもの）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８に少なくとも８５％（例えば少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの任意のもの）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0134】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるＤＫＣ１タンパク質のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、ＤＫＣ１の（例えばＤＫＣ１の触媒ドメインの）、またはリボヌクレオタンパク質複合体中での他のタンパク質との相互作用の、安定性及び／または他の生物学的特性を改善することが所望され得る。リボヌクレオタンパク質複合体中のＤＫＣ１及び他のタンパク質の構造は、Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２００６）２１（２）：２４９－２６０）及びＣｚｅｋａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０２１）１２：６５４３７０）（それらの内容は参照することによってそれらの全体が本明細書に援用される）中で例えば記載されている。ＤＫＣ１タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、標的結合部分をコードするヌクレオチド配列の中へ適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば標的結合部分のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／または当該残基の中への挿入、及び／または当該残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終的なコンストラクトに到達するために行なわれ得るが、但し、最終的なコンストラクトは所望される特徴を保持するものとする。

【0135】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するＤＫＣ１タンパク質バリアントが提供される。アミノ酸置換がＤＫＣ１タンパク質の中へ導入され、産物は所望される活性についてスクリーニングされ得る。

【0136】

保存的置換は、以下の表Ａ中で示される。

【表5】

【0137】

アミノ酸は、共通の側鎖特性に従って異なるクラスへと分類され得る。
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
ｂ．中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
ｅ．鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
ｆ．芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0138】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うだろう。

【0139】

天然に存在するＤＫＣ１タンパク質の断片またはその機能的バリアント、及び例えばＤＫＣ１断片のＮ末端、Ｃ末端、または内部の所在位置での異種のアミノ酸配列を含む融合タンパク質も企図される。

【0140】

Ｂ．核酸コンストラクト及び操作されたｇｓｎｏＲＮＡ
いくつかの態様において、Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡに基づく操作されたｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２つのガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、２つを超える（例えば３、４、５、６、またはそれ以上の）ガイド配列を含む。例えば、Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡは、２つのヘアピン、続いてＨボックスモチーフ及びＡＣＡボックスモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される操作されたｇｓｎｏＲＮＡの両方のヘアピンは、標的シュードウリジン化部位を標的化することが可能なガイド配列を含有する。他の実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡの１つのヘアピンのみが、標的シュードウリジン化部位を標的化することが可能なガイド配列を含有する。例示的な操作されたｇｓｎｏＲＮＡ配列は、以下の表２及び３中で提供される。

【0141】

いくつかの態様において、本明細書において開示されるｇｓｎｏＲＮＡは、合成オリゴヌクレオチドであり、当技術分野において公知の方法に従って合成され得る。いくつかの実施形態において、本開示に従うｇｓｎｏＲＮＡは、オリゴリボヌクレオチド（完全なＲＮＡ（ｆｕｌｌ ＲＮＡ））である。しかしながら、いくつかの実施形態において、本開示のｇｓｎｏＲＮＡは、ＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、特に生物学的な系において発現され得るヌクレオチドまたは連結のみからなる場合に、ｇｓｎｏＲＮＡは、例えばプラスミドまたはウイルスベクターからインサイチューで発現され得る。

【0142】

いくつかの態様において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂ及びＡＣＡ３６からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの態様において、野生型Ｈ／ＡＣＡスキャフォールドに由来するｇｓｎｏＲＮＡの編集効率は、哺乳動物細胞において（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞等のヒト細胞において）、少なくとも５％（例えば約５％～１５％または５～１０％の間）である。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂに由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含む。

【0143】

いくつかの態様において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡ、及び野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来する（例えばＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、またはＡＣＡ１９からの）操作されたｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドであって、ｇｓｎｏＲＮＡが、タンパク質をコードするＲＮＡ中のＰＴＣを修飾することが可能であり、前記修飾が、全長タンパク質の発現をもたらす、前記ｇｓｎｏＲＮＡ及び前記ｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドが本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、宿主細胞において、未成熟終止コドン無しの全長タンパク質の発現レベルの少なくとも４％（例えば少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％）の全長のタンパク質の発現を引き起こすことが可能である。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、全長タンパク質の発現を引き起こすことが可能であり、タンパク質の発現は、エンリッチメント無しで（例えば免疫沈降によるエンリッチメント無しで）検出可能である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タグ（例えば蛍光タグを介して）を介して検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、当技術分野において公知の方法に従って免疫染色によって検出される。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、宿主細胞のうちの少なくとも２０％（例えば宿主細胞のうちの少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％）において全長タンパク質の発現を引き起こすことが可能である。

【0144】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のガイド配列を含み、各々は、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡのヘアピン構造に対応する領域中に所在する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの３’端末部でヘアピン構造中に所在する１つまたは複数のガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡの５’端末部でヘアピン構造中に所在する１つまたは複数のガイド配列を含む。

【0145】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型ＡＣＡ１９の１つまたは複数のヘアピン構造（例えば３’ヘアピン構造及び／または５’ヘアピン構造）中に１つまたは複数の突然変異（例えば置換、挿入、及び／または欠失）を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型スキャフォールドに比較して、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基とＨ／ＡＣＡボックスとの間の距離を変更する、１つまたは複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、１つまたは複数のヌクレオチド残基の挿入または欠失を含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基とＨ／ＡＣＡボックスとの間に１４のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチド残基とＨ／ＡＣＡボックスとの間に１５のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記突然変異は、野生型スキャフォールドに比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、または１．６倍までシュードウリジン化の効率（例えばＰＴＣリードスルーの効率）を増加させる。

【0146】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、小ポリＵ配列（例えば４以上または５以上の連続したウリジン（Ｕ）残基の配列）中の置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、連続２つ以下のＵ残基を含むように小ポリＵ配列を変更することを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、「ＵＵＵＵ」配列中に単一塩基突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、「ＵＵＣＵ」突然変異または「ＵＧＵＵ」突然変異である。いくつかの実施形態において、突然変異されたポリＵ配列は、ｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドのループ領域中に所在する。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４９または５０の配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１５または１６の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記突然変異は、野生型スキャフォールドに比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、または１．６倍までシュードウリジン化の効率（例えばＰＴＣリードスルーの効率）を増加させる。

【0147】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、野生型スキャフォールドのガイド領域に比較して、ガイド領域の開放性を増加させる突然変異を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、ｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドのガイド領域（例えばｇＡＣＡ１９スキャフォールドの５’ガイド領域）内の１つまたは複数の残基の塩基対合確率を低減する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、残基８の後のＣＵの添加を含み、ナンバリングは配列番号３７に従う。いくつかの実施形態において、操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号５３のｇｓｎｏＲＮＡである。ｇＡＣＡ１９－５ａｄｄＣＵ（配列番号５３）の予測される二次構造は、図５Ｄ中で示される。いくつかの実施形態において、前記突然変異は、野生型スキャフォールドに比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、または１．６倍までシュードウリジン化の効率（例えばＰＴＣリードスルーの効率）を増加させる。

【0148】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、ＵＵＣＵによる残基２６～２９の置換、ＵＧＵＵによる残基２６～２９の置換、残基１１５後の３’ヘアピン構造へのＧの添加、及び残基８後の５’ヘアピンへのジヌクレオチド配列（ＸＸ、例えばＣＵ）の添加からなる群から選択され、配列中、Ｘは、Ａ、Ｕ及びＣ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、ナンバリングは、配列番号３７に従う。

【0149】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１７～１９及び２２～２９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0150】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0151】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１５～１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0152】

いくつかの実施形態において、ｇｓｏＲＮＡは、配列番号２０～２１及び１４５～１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0153】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、疾患を標的化するｇｓｎｏＲＮＡ（例えば表４中に提供されるｇｓｎｏＲＮＡ配列のうちの任意のもの）である。

【0154】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２’Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾または２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本開示に従うｇｓｎｏＲＮＡのほとんど全体は、例えば２’－Ｏ－メチル化された糖部分（２’－ＯＭｅ）を備えたヌクレオチド及び／または２’－Ｏメトキシエチル糖部分（２’－ＭＯＥ）を備えたヌクレオチドの提供によって化学的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２０以下、１５以下、１０以下、８以下、６以下、または４以下の２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約２～約６の２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約４の２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５以下の修飾された糖を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む２つのヌクレオシド、及び３’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む２つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む４、３、または２以下のヌクレオシド、及び３’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む４、３、または２以下のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２０以下、１５以下、１０以下、８以下、または６以下のホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約２～約１０のホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約６つのホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で約３つのホスホロチオエート連結及び３’端で約３つのホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で５、４、または３以下のホスホロチオエート連結及び３’端で５、４、または３以下のホスホロチオエート連結を含む。実施例７は、限定的な数の修飾が、ｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドの安定性及び機能のために十分であることを実証する結果を提供する。

【0155】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２’Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾または２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本開示に従うｇｓｎｏＲＮＡのほとんど全体は、例えば２’－Ｏ－メチル化された糖部分（２’－ＯＭｅ）を備えたヌクレオチド及び／または２’－Ｏメトキシエチル糖部分（２’－ＭＯＥ）を備えたヌクレオチドの提供によって化学的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは５’ヘアピン、Ｈボックス（コンセンサス配列ＡＮＡＮＮＡ）、３’ヘアピン、及びＡＣＡボックス（コンセンサス配列ＡＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のヘアピン及びＨボックス（それぞれ５’半分のｇｓｎｏＲＮＡコード配列またはｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドについて、ｇＨ５またはｒＨ５として本明細書において称される）を含み、ＡＣＡボックスを欠如する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のヘアピン及びＡＣＡボックス（それぞれ３’半分のｇｓｎｏＲＮＡコード配列またはｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドについて、ｇＨ３またはｒＨ３として本明細書において称される）を含み、Ｈボックスを欠如する。いくつかの実施形態において、単一のヘアピンを含むｇｓｎｏＲＮＡは、６０～７０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、単一のヘアピンを含むｇｓｎｏＲＮＡは、約６５ヌクレオチドの長さである。

【0156】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、インビトロの転写によって調製される。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６のうちの任意の１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾または５’ヘアピン（例えばＵ６＋Ｕ２７発現カセットの）を含む。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾を含む。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、ｍ^７Ｇ修飾（例えばキャップ０修飾、キャップ１修飾、またはキャップ２修飾）またはｍ^６Ａ_ｍ修飾である。ＲＮＡオリゴヌクレオチドへの５’キャップの添加に好適な方法は、例えば米国特許第１０，４９４，３９９号（その内容は参照することによってその全体が本明細書に援用される）中で記載されている。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、３’ヘアピンをさらに含む（例えばｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、及び２２～３６のうちの任意の１つの配列、ならびに３’ヘアピンを含む）。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾を含み、３’ヘアピンを含まない（例えば図１５Ａ中で示されるような）。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体を使用して、インビトロの転写によって導入される。

【0157】

様々なケミストリー及び修飾は、オリゴヌクレオチドの分野において公知であり、本開示に従って容易に使用され得る。ヌクレオチド間の規則的なヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合のモノチオエーション（ｍｏｎｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ）またはジチオエーション（ｄｉｔｈｉｏａｔｉｏｎ）によって変更されて、それぞれホスホロチオエートエステルまたはホスホロジチオエートエステルをもたらし得る。ヌクレオシド間連結の他の修飾は可能であり、アミド化リンカー及びペプチドリンカーが挙げられる。好ましい態様において、本開示のｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの最も端末のヌクレオチド間で（したがって好ましくは５’端及び３’端の両方で）１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のホスホロチオエート連結を有し、３つのホスホロチオエート連結の事例において、その結果、最終的な４つのヌクレオチドが連結されることを意味する。かかる連結の数が、標的配列に依存して、または他の態様（毒性等）に基づいて、各々の端部で変動し得ることが、当業者によって理解されよう。しかしながら、ｇｓｎｏＲＮＡが、端末の７つのヌクレオチドでの任意の位置間で１つまたは複数のＰＳ連結を含むことは、本開示のいくつかの実施形態である。

【0158】

リボース糖は、低級アルキル（２’－ＯＭｅ等のＣ１－４）、アルケニル（Ｃ２－４）、アルキニル（Ｃ２－４）、メトキシエチル（２’－メトキシエトキシ；または２’－Ｏ－メトキシエチル；または２’－ＭＯＥ）、または他の置換基による２’－Ｏ部分の置換によって修飾され得る。いくつかの実施形態において、２’ＯＨ基の置換基は、メチル基、メトキシエチル基、または３，３’－ジメチルアリル基である。後者は、その嵩高さに起因してヌクレアーゼ感度を阻害する一方で、ハイブリダイゼーションの効率を改善する特性が公知である。代替的に、リボース環の内部の２’－４’の分子内架橋（通常２’酸素と４’炭素との間のメチレン架橋）連結を含むロック核酸配列（ＬＮＡ）が適用され得る。プリン核酸塩基及び／またはピリミジン核酸塩基は、それらの特性を変更するたに、例えばヘテロ環式環のアミノ化または脱アミノ化によって修飾され得る。本開示のｇｓｎｏＲＮＡ中に存在し得る他の修飾は、２’－Ｆ修飾糖、ＢＮＡ、及びｃＥｔである。厳密なケミストリー及びフォーマットは、オリゴヌクレオチドコンストラクト毎に、及び適用毎に異なり、当業者の希望及び好みに従って遂行され得る。

【0159】

本開示のｇｓｎｏＲＮＡ中の化学修飾の例は、糖部分の修飾であり、糖（リボース）部分内の置換基の架橋（例えばＬＮＡまたはロック核酸、ＢＮＡ、ｃＥｔ、及び同種のものにおけるように）によるもの、上で指定される長さを有する、アルキル（例えば２’－Ｏ－メチル）基、アルキニル（２’－Ｏ－アルキニル）基、アルケニル（２’－Ｏ－アルケニル）基、アルコキシアルキル（例えば２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－ＭＯＥ）基、及び同種のものによる２’－Ｏ原子の置換によるものが挙げられる。本開示の文脈において、糖「修飾」は、２’デオキシリボースも含む（ＤＮＡ中でのように）。加えて、主鎖のホスホジエステル基は、チオエーション（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）、ジチオエーション（ｄｉｔｈｉｏａｔｉｏｎ）、アミド化、及び同種のものによって修飾されて、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなどのヌクレオシド間連結をもたらし得る。ヌクレオシド間連結は、ペプチド連結によって完全にまたは部分的に置き換えられて、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）配列及び同種のものをもたらし得る。代替的にまたは加えて、核酸塩基は、アミノ化によって（脱）修飾されて、イノシンまたは２’６’－ジアミノプリン及び同種のものをもたらし得る。さらなる修飾は、ヌクレオチドのシチジン部分中のＣ５のメチル化かあり得、ＣｐＧ配列と関連することが公知である潜在的な免疫原性特性を低減する。

【0160】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含まない。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、非天然のヌクレオシド間連結を含まない。

【0161】

哺乳動物のＨ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡは、概して、タンパク質をコードする遺伝子のプレｍＲＮＡイントロン領域内に埋め込まれる（位置する）。転写伸長の間に、シュードウリジン化における機能的役割のある複数のタンパク質（ＮＯＰ１０、ジスケリン（ＤＫＣ１）、またはＮＨＰ２等）は、新生Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡ配列へ結合する。スプライシングに続いて、ガイドＲＮＡは、デブランチング及び末端核酸分解プロセシングを介してプロセシングされ、「核内低分子リボ核タンパク質」（ｓｎＲＮＰ、またはｓｎＲＮＰ複合体）と呼ばれるＲＮＡタンパク質複合体をもたらす。ボックスＨ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡは、イントロンの５’端または３’端に対する局在化の優先性はなく、小さなイントロンまたは非常に大きなイントロン中に存在し得るが、通常、３’スプライス部位の６０～９０ヌクレオチド上流に局在し、比較的小さなイントロンでコードされるボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡとは対照的である。所与のｓｎｏＲＮＡ配列が、任意の所与の能動的にスプライスされたｍＲＮＡのイントロン領域から切除され、完全にプロセシングされ得ることが、Ｋｉｓｓ ａｎｄ Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ（１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ９（１１）：１４１１－１４２４）によって示唆されている。このｓｎｏＲＮＡプロセシングが、宿主イントロンコンテキストとは独立して実行可能であることを示すために、Ｋｉｓｓ ａｎｄ Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚは、ヒトβ－グロビン遺伝子の第２のイントロンの中へ複数のｓｎｏＲＮＡ（ＩＩＩ７ａ、Ｕ１７ｂ、及びＵ１９）を人工的に埋め込み、線維芽細胞様細胞においてもたらされたベクターを発現させた。トランスフェクション後に、人工的なイントロンにより送達されたｓｎｏＲＮＡが、ヒトβ－グロビンイントロンから適切にプロセシングされ、β－グロビンプレｍＲＮＡが正確にスプライスされることを見出した。Ｄａｒｚａｃｑ ｅｔ ａｌ．（２００２，ＥＭＢＯ Ｊ ２１（１１）；２７４６－２７５６）は、他のガイドＲＮＡが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下の発現ベクターを使用して、ヒトβ－グロビン遺伝子の第２のイントロンの中へ挿入され、トランスフェクションを介して哺乳動物細胞へ送達され得ることを確認した。

【0162】

本出願の発明者らは、予想外に、異なるｇｓｎｏＲＮＡのシュードウリジン化編集効率に対する多様な宿主イントロンコンテキスト依存性効果を同定した（実施例１中で考察されように）。例えば、本発明者らは、野生型ＡＣＡ１９（ＥＩＦ３Ａの宿主イントロン中に埋め込まれた）、ＡＣＡ－４４（ＳＮＨＧ１２の宿主イントロン中に埋め込まれた）、ＡＣＡ２７（ＲＰＬ２１の宿主イントロン中に埋め込まれた）、及びＥ２（ＲＰＳＡの宿主イントロン中に埋め込まれた）の宿主遺伝子に基づくｇｓｎｏＲＮＡ、ならびにＨＢＢ遺伝子の非宿主イントロン中に埋まれたｇｓｎｏＲＮＡのＰＴＣリードスルー効率を試験した（図２Ａ及び２Ｂ）。驚くべきことに、本発明者らは、Ｅ２スキャフォールドに基づくｇｓｎｏＲＮＡの編集効率は、ｇＥ２がＨＢＢイントロン中に埋め込まれ場合に宿主ＲＰＳＡイントロンに比較してより低いが、ｇＡＣＡ１９の編集効率は、ＨＢＢイントロン中に埋め込まれた場合に宿主ＥＩＦ３Ａイントロンに比較して類似していたことを見出した。宿主遺伝子配列が異なるｇｓｎｏＲＮＡに対して多様な効果を有するというこの観察に基づいて、本発明者らは、宿主遺伝子効果無しでｇｓｎｏＲＮＡを直接的に発現させることは、ＰＴＣリードスルーの効率をさらに増加させ得ることを想定した。したがって、本発明者らは、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子がイントロン中に埋め込まれていないｇｓｎｏＲＮＡ発現コンストラクトのシリーズをデザインした。実施例１において考察されるように、本発明者らは、ｈＵ６プロモーター（ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）及びｈＵ１プロモーター（ｓｎＲＮＡ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター）によって駆動されるｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子において、イントロン中に埋め込まれていないｇｓｎｏＲＮＡのシュードウリジン化活性が促進されることを実証した。したがって、一態様において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子であって、小分子ＲＮＡプロモーター（例えばＵ６プロモーターまたはＵ１プロモーター）の制御下にある、前記核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸は、イントロン配列中に埋め込まれない。

【0163】

いくつかの態様において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸コンストラクトが本明細書において提供される。本明細書において記載される方法のうちのいくつかの実施形態において、方法は、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子を宿主細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、小分子ＲＮＡプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、小分子ＲＮＡプロモーターは、Ｕ６プロモーター（ポリメラーゼＩＩＩによって転写される）またはＵ１プロモーター（ポリメラーゼＩＩによって転写される）である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される方法に従う小分子ＲＮＡプロモーターからのｇｓｎｏＲＮＡの発現は、宿主イントロン配列または他のイントロン配列中に埋め込まれた同じｇｓｎｏＲＮＡに比較して、シュードウリジン化効率の増加（例えばＰＴＣリードスルー効率の増加）を提供する。いくつかの実施形態において、小分子ＲＮＡプロモーターの制御下の核酸から発現されたｇｓｎｏＲＮＡのシュードウリジン化効率は、宿主イントロン中に埋め込まれた同じｇｓｎｏＲＮＡに比較して１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍高い。実施例１（図１Ａ～１Ｅ及び図２Ａ～２Ｃ）は、イントロンに埋め込まれたｇｓｎｏＲＮＡに比較して、小分子ＲＮＡプロモーターの制御下の核酸から発現されたｇｓｎｏＲＮＡによるＰＴＣリードスルーの促進を実証する結果を提供する。

【0164】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、第１のエクソン配列と第２のエクソン配列との間に所在するイントロン配列中に埋め込まれる。いくつかの実施形態において、第１のエクソン配列、イントロン配列、及び第２のエクソン配列は、天然に存在する遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、イントロンは、追加のヌクレオチドを含み得る（ガイド領域を含む本開示の核酸分子の他に）。ガイド領域がイントロン配列から発現されるので、かかる追加のヌクレオチドは、イントロンからの最も効率的な発現を与えるように選択され得る。いくつかの実施形態において、エクソンＡ／イントロン／エクソンＢ配列は、ベクター（プラスミドまたはウイルスベクター等）中に存在する。かかるベクターを使用して、エクソン－イントロン－エクソン配列を細胞へ送達することができる。追加のイントロン及びエクソンは、かかるベクター中に存在し得る。いくつかの実施形態において、エクソンＡ配列（ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸（それは転写後に発現される）を保有するイントロンの上流）は、ヒトβ－グロビン遺伝子のエクソン１を含むかまたは当該エクソンからなり、エクソンＢ配列（ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸（それは転写後に発現される）を保有するイントロンの下流）は、ヒトβ－グロビン遺伝子のエクソン２を含むかまたは当該エクソンからなる。いくつかの実施形態において、エクソンＡ配列（ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸（それは転写後に発現される）を保有するイントロンの上流）は、ヒトヘモグロビンサブユニットβ（ＨＢＢ）遺伝子のエクソン２を含むかまたは当該エクソンからなり、エクソンＢ配列（ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸（それは転写後に発現される）を保有するイントロンの下流）は、ヒトヘモグロビンサブユニットβ（ＨＢＢ）遺伝子のエクソン３を含むかまたは当該エクソンからなる。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、第１のエクソン配列と第２のエクソン配列との間のイントロン配列中に埋め込まれ、イントロン配列、第１のエクソン配列、及び第２のエクソン配列は、天然に存在するｓｎｏＲＮＡを保有する宿主遺伝子の配列に対応する。いくつかの実施形態において、イントロンに埋め込まれたｇｓｎｏＲＮＡコード配列を含むコンストラクトは、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。

【0165】

いくつかの態様において、疾患関連ＰＴＣを標的化する操作されたｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、疾患関連ＰＴＣを標的化する操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの編集効率及び／または発現を促進するために１つまたは複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、疾患関連ＰＴＣを標的化する操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号７１～８４から選択される（図１４～１５中で示される）。疾患関連ＰＴＣを標的化する例示的な操作されたｇｓｎｏＲＮＡの配列は、以下の表４中で示される。

【0166】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、遊離形態（またはベクターのコンテキストの無い「裸の」）で投与され得るか、または他の手段（リポソームまたはナノ粒子等）によって、もしくはイオントフォレシスの使用によって細胞へ送達され得る。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡはリボヌクレオタンパク質複合体中で（例えばＤＫＣ１、ＨＮＰ２、ＮＯＰ１０、及び／またはＧＡＲ１を含む複合体中で）投与され得る。いくつかの実施形態において、遊離ｇｓｎｏＲＮＡは、上で記載されるような１つまたは複数の化学的に修飾されたヌクレオシド及び／またはヌクレオシド間連結を含む。

【0167】

いくつかの態様において、ＤＫＣ１（例えば上のセクションＩＩＡ中で記載されるＤＫＣ１タンパク質のうちの任意のもの）をコードする核酸コンストラクトが本明細書において提供される。本明細書において記載される方法のうちのいくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＤＫＣ１をコードするヌクレオチド配列へ作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。

【0168】

本明細書において開示される時、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを保有してもよく、概して、ベクターが導入される細胞中でプロセシングされた後に、本開示のｇｓｎｏＲＮＡコンストラクト及び／またはＤＫＣ１タンパク質コンストラクトを発現させるために使用される。これは、概して、ベクター中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの転写を介するものである。いくつかの実施形態において、ベクターは、当業者に公知の様々な手法で細胞の中へ導入され得るウイルスベクター（治療される標的細胞を感染させるために使用され得る）、またはプラスミドである。

【0169】

いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子及び／またはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子は、ウイルスベクター中に存在する。いくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１タンパク質をコードする第１の核酸配列及びｇｓｎｏＲＮＡをコードする第２の核酸配列を含むベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）を宿主細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

【0170】

例示的な操作されたＡＣＡスキャフォールド配列は、以下の表２中で示される。ガイド配列は、（Ｘｎ）として示され、下線が引かれ、配列中、Ｘｎは、長さｎのＸヌクレオチドの配列であり、Ｘは、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣのうちの任意のものであり、ｎは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２である。ガイド配列（Ｘｎ）は、当業者によって理解されるように、所望される標的部位へｇｓｎｏＲＮＡを標的化するために修飾され得る。いくつかの実施形態において、ｎは、ガイド領域に好適な長さの整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、４、５、６、７、８、または９である。

【0171】

例示的なガイド配列を含む例示的な操作されたｇｓｎｏＲＮＡ配列は、以下の表３中で示される。

【0172】

例示的な疾患関連ＰＴＣを標的化する例示的な操作されたｇｓｎｏＲＮＡ配列は、以下の表４中で示される。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0173】

一態様において、本発明者らは、ｇｓｎｏＲＮＡがその標的ＲＮＡとタンデムにコードされた場合にｇｓｎｏＲＮＡの編集効率が驚くほど高いことを見出した。実施例３は、ｇｓｎｏＲＮＡ及び標的ＲＮＡをタンデムにコードするレポーターコンストラクトを使用して、編集効率の増加を実証する結果を提供する。

【0174】

したがっていくつかの態様において、ガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とタンデムに含む核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｕ６プロモーターまたはＵ１プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とタンデムにコードされたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ＲＮＡとは分離した核酸分子中でコードされた同じｇｓｎｏＲＮＡに比較して、少なくとも標的ＲＮＡの１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍の多い編集効率を提供する。

【0175】

ＩＩＩ．方法
いくつかの実施形態において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）及びＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォーム（例えばアイソフォーム３）である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、同じ種の野生型ＤＫＣ１タンパク質に比べて核局在化シグナル（ＮＬＳ）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、短縮されたＤＫＣ１バリアントまたは欠失を含むＤＫＣ１バリアント（上のセクションＩＩＡ中で記載される短縮バリアントまたは欠失バリアントのうちの任意のもの等）である。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、宿主細胞において、ＮＯＰ１０、ＧＡＲ１、及びＮＨＰ２を動員する。

【0176】

いくつかの実施形態において、方法は、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸（例えば核酸ベクター）を細胞の中へ導入することを含む。他の実施形態において、方法は、ｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドを細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、第１のヘアピン及びＨボックス、及び第２のヘアピン、及びＡＣＡボックスを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、インビトロの転写によって調製される。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、及び１５～１９、２２～３６のうちの任意の１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾または５’ヘアピン（例えばＵ６＋Ｕ２７発現カセットの）を含む。いくつかの実施形態において、インビトロの転写によって調製されたｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾を含む。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、ｍ^７Ｇ修飾（例えばキャップ０修飾、キャップ１修飾、またはキャップ２修飾）またはｍ^６Ａ_ｍ修飾である。ＲＮＡオリゴヌクレオチドへの５’キャップの添加に好適な方法は、例えば米国特許第１０，４９４，３９９号（その内容は参照することによってその全体が本明細書に援用される）中で記載されている。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、３’ヘアピンをさらに含む（例えばｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、及び２２～３６のうちの任意の１つの配列、ならびに３’ヘアピンを含む）。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５’キャップ修飾を含み、３’ヘアピンを含まない（例えば図１５Ａ中で示されるような）。いくつかの実施形態において、インビトロで転写されたｇｓｎｏＲＮＡは、細胞におけるガイディング標的化シュードウリジン化が可能である。いくつかの実施形態において、５’キャップ修飾は、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体を使用して、インビトロの転写によって導入される。

【0177】

いくつかの実施形態において、方法は、ｇｓｎｏＲＮＡの半分の（例えば単一のヘアピン及びＨボックスを含むか、または単一のヘアピン及びＡＣＡボックスを含む）ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸（例えば核酸ベクター）を細胞の中へ導入することを含む。他の実施形態において、方法は、ｇｓｎｏＲＮＡの半分の（例えば単一のヘアピン及びＨボックスを含むか、または単一のヘアピン及びＡＣＡボックスを含む）ｇｓｎｏＲＮＡを細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２０以下、１５以下、１０以下、８以下、６以下、または４以下の２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約２～約６の２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約４の２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、５以下の修飾された糖を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む２つのヌクレオシド、及び３’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む２つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む４、３、または２以下のヌクレオシド、及び３’端で修飾された糖部分（例えば２’－ＯＭｅ）を含む４、３、または２以下のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、２０以下、１５以下、１０以下、８以下、または６以下のホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約２～約１０のホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、約６つのホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で約３つのホスホロチオエート連結及び３’端で約３つのホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの５’端で５、４、または３以下のホスホロチオエート連結及び３’端で５、４、または３以下のホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは５’ヘアピン、Ｈボックス（コンセンサス配列ＡＮＡＮＮＡ）、３’ヘアピン、及びＡＣＡボックス（コンセンサス配列ＡＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のヘアピン及びＨボックス（それぞれ５’半分のｇｓｎｏＲＮＡコード配列またはｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドについて、ｇＨ５またはｒＨ５として本明細書において称される）を含み、ＡＣＡボックスを欠如する。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、単一のヘアピン及びＡＣＡボックス（それぞれ３’半分のｇｓｎｏＲＮＡコード配列またはｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドについて、ｇＨ３またはｒＨ３として本明細書において称される）を含み、Ｈボックスを欠如する。いくつかの実施形態において、単一のヘアピンを含むｇｓｎｏＲＮＡは、６０～７０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、単一のヘアピンを含むｇｓｎｏＲＮＡは、約６５ヌクレオチドの長さである。

【0178】

本開示は、通常、翻訳終止及びｍＲＮＡ分解を導くナンセンス終止突然変異の効果（ナンセンス媒介性崩壊を介して、以下参照）を回復させるがこれらに限定されないことによって、例示される。別の態様において、標的化シュードウリジン化は、例えば重要なタンパク質領域（タンパク質キナーゼ活性部位等）においてアミノ酸置換を介してタンパク質機能を調節する手段としての、ウリジン含有コドンを再コードする手段として作用し得る。

【0179】

遺伝子のコーディング配列中のＰＴＣを導く突然変異の帰結のうちの１つは、ｍＲＮＡのレベルの減少である。これはナンセンス媒介性崩壊（ＮＭＤ）として公知のメカニズムに起因し、異常なｍＲＮＡの転写物を分解し、正確にプロセシングされなかった転写物が翻訳されることを防止する、細胞監視メカニズムである。遺伝的障害の３分の１がＰＴＣへ導く突然変異の結果であると推定される（例えばＣＦ、網膜色素変性症（ＲＰ）、及びβサラセミアにおいて等）。正常なシナリオにおいて、エクソン－ジャンクション複合体（ＥＪＣ）は、スプライシングの間に形成される。次いで第１の翻訳ラウンドの間に、リボソームは、これらのＥＪＣを置き換える。その一方で、ＰＴＣが最後のＥＪＣの５０～５４ヌクレオチド以上上流に所在する場合に、ＮＭＤ経路は、ＥＪＣ関連ＮＭＤ因子からなる終結複合体の形成によって誘発される。これが翻訳の最初のパイオニアラウンドの間に起こり、リボソームが少なくとも１つのＥＪＣとそれらの所在位置の下流で共存する場合に、このことは、脱キャッピング及び５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性、ならびにさらにテールの脱アデニル化及び３’から５’のエキソヌクレアーゼ媒介性転写物崩壊を誘発する。前述の遺伝的障害または類似の突然変異に起因する任意の障害に取り組むために、したがって、遺伝子特異的様式及び配列特異的様式でのこの経路の阻害は重要である。

【0180】

いくつかの態様において、ｍＲＮＡのレベルの増加をもたらし、再コードｍＲＮＡの全長のタンパク質への翻訳リードスルーをもたらす、ＰＴＣを再コードするための方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法及び組成物は、４％超、５％超、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、または３０％超のＰＴＣリードスルーを可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書における方法及び組成物は、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、または３０％超までナンセンス媒介性崩壊（ＮＭＤ）の抑制を可能にする。ＰＴＣリードスルーは、タンパク質レベルの評価によって（タンパク質発現を直接的に定量することによって、または発現させたタンパク質の活性のアッセイによって、のいずれかで）アッセイされ得る。ＮＭＤ抑制を査定するための方法も、当技術分野において公知である。例えば、ＮＭＤ抑制を査定するために、公知のＮＭＤ阻害レポーターアッセイ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９８，ＲＮＡ ４（７）：８０１－８１５）が使用され得、ＰＴＣを保有する遺伝子の翻訳リードスルーも査定され得る。本明細書において例証されるように、ナンセンス突然変異を保有する蛍光レポーター遺伝子は、標的配列として使用された。修正無しでは、このナンセンス突然変異は、より低い存在量のｍＲＮＡ（ＮＭＤの結果として）、そして短縮されたタンパク質を導き、蛍光シグナルの非存在をもたらす。本明細書において示されるように、標的化シュードウリジン化を介する突然変異の修正は、全長タンパク質がｍＲＮＡから翻訳されることを可能にする。当業者は、本明細書において記載される蛍光レポーターコンストラクトのＰＴＣ領域が、他のモデルまたは関心のある治療的に関連する標的ＲＮＡによって、交換され得ることを理解する。

【0181】

いくつかの実施形態において、タンパク質をコードするＲＮＡ中のＰＴＣを再コードするための方法であって、宿主細胞において、未成熟終止コドン無しの全長タンパク質の発現レベルの少なくとも４％（例えば少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％）の全長タンパク質の発現をもたらす、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、方法は、全長タンパク質の発現をもたらし、タンパク質の発現は、エンリッチメント無しで（例えば免疫沈降によるエンリッチメント無しで）検出可能である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タグ（例えば蛍光タグを介して）を介して検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、当技術分野において公知の方法に従って免疫染色によって検出される。いくつかの実施形態において、方法は、宿主細胞のうちの少なくとも２０％（例えば宿主細胞のうちの少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％）において全長タンパク質の発現をもたらす。

【0182】

いくつかの態様において、標的ｍＲＮＡのナンセンス媒介性ＲＮＡ崩壊を、治療、予防、及び／またはブロックするための方法であって、ガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）及びＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ｍＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む未成熟終止コドン（ＰＴＣ）配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾し、それによって、標的ウリジンのシュードウリジン化が、ＰＴＣのリードスルーを促進する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームである。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、同じ種の野生型ＤＫＣ１タンパク質に比べて核局在化シグナル（ＮＬＳ）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、短縮されたＤＫＣ１バリアントまたは欠失を含むＤＫＣ１バリアント（上のセクションＩＩＡ中で記載される短縮バリアントまたは欠失バリアントのうちの任意のもの等）である。

【0183】

いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞の内在性タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞の内在性の天然に発現されるＤＫＣ１アイソフォームであり、ＤＫＣ１アイソフォームは、宿主細胞において細胞質内局在を有する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１タンパク質のアイソフォーム２に対応する。

【0184】

いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１及びｓｎｏＲＮＡは、細胞の中へ一緒に（例えばリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部として）送達され得る。いくつかの実施形態において、ｓｎｏＲＮＰは、ｇｓｎｏＲＮＡ、ならびにＤＫＣ１、ＮＨＰ２、ＧＡＲ１、及び／またはＮＯＰ１０を含む。

【0185】

いくつかの実施形態において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、宿主細胞が、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームを発現し、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１アイソフォームを動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、方法は、スプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を宿主細胞の中へ導入することを含み、ＡＳＯは、宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を促進する。

【0186】

スプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、スプライス部位選択を指令することによってスプライシングを変更する。スプライス－スイッチングＡＳＯは、標的プレｍＲＮＡへ結合し、特定のスプライス部位へのスプライシング装置のアクセスをブロックすることによって、プレｍＲＮＡスプライシングを調節し、新規のスプライスバリアントを産生するか、異常なスプライシングを修正するか、またはオルタナティブスプライシングをマニピュレーションするために使用され得る。スプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン及び細胞への送達のための方法は、例えば米国特許公報ＵＳ２０１８０３３４６７７及びＵＳ２０１２００４０９１７、米国特許第１０，１９０，１１７号、及びＤｉｓｔｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｊｕｌ；２５（７）：５８７－９８（それらの内容は参照することによってそれらの全体が本明細書に援用される）中で記載されている。

【0187】

いくつかの実施形態において、スプライス－スイッチングＡＳＯは、ＤＫＣ１遺伝子のプレｍＲＮＡへ結合し、ＤＫＣ１アイソフォーム３のスプライシングを指令する。いくつかの実施形態において、スプライス－スイッチングＡＳＯの導入は、ＡＳＯの非存在下の宿主細胞における同じアイソフォームの発現に比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍まで、宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態において、スプライス－スイッチングＡＳＯの投与は、ＡＳＯの非存在下の宿主細胞におけるＤＫＣ１アイソフォーム３の発現に比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍まで、ＤＫＣ１アイソフォーム３の発現を増加させる。

【0188】

いくつかの実施形態において、スプライス－スイッチングＡＳＯは、アプタマー、逆分子センチネルナノプローブ、ＡＳＯカプセル化リポソームＤＮＡポリカチオン、またはＡＳＯカプセル化リポソーム－プロタミン－ヒルロイック酸（ｈｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ナノ粒子、及び同種のものを介して送達され得る。アプタマーを送達する好適な方法は、Ｋｏｔｕｌａ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｔａｍｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｐｌｉｃｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ，２０１２．２２（３）：ｐ．１８７－９５（それらの内容は参照することによってそれらの全体が本明細書に援用される）中で見出され得る。

【0189】

いくつかの実施形態において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、野生型ＡＣＡ１９、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、ＡＣＡ１７、ＡＣＡ２ｂ、またはＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型ＡＣＡ２ｂまたはＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームである。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。

【0190】

いくつかの実施形態において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、野生型ＡＣＡ１９、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、ＡＣＡ１７、ＡＣＡ２ｂ、またはＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。操作されたｇｓｎｏＲＮＡは、セクションＩＩＢ中で記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意の１つでありえる。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームである。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、同じ種の野生型ＤＫＣ１タンパク質に比べて核局在化シグナル（ＮＬＳ）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、短縮されたＤＫＣ１バリアントまたは欠失を含むＤＫＣ１バリアント（上のセクションＩＩＡ中で記載される短縮バリアントまたは欠失バリアントのうちの任意のもの等）である。

【0191】

いくつかの実施形態において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームである。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、全長ヒトＤＫＣ１タンパク質のアミノ酸残基１～４１９に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号１に従う。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、同じ種の野生型ＤＫＣ１タンパク質に比べて核局在化シグナル（ＮＬＳ）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、短縮されたＤＫＣ１バリアントまたは欠失を含むＤＫＣ１バリアント（上のセクションＩＩＡ中で記載される短縮バリアントまたは欠失バリアントのうちの任意のもの等）である。

【0192】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、ガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とタンデムに含む核酸分子を宿主細胞の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｕ６プロモーターまたはＵ１プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とタンデムにコードされたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ＲＮＡとは分離した核酸分子中でコードされた同じｇｓｎｏＲＮＡに比較して、少なくとも標的ＲＮＡの１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍の多い編集効率を提供する。

【0193】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、宿主細胞の内在性核酸分子へのガイド核小体低分子ＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）を導入することを含み、内在性核酸分子は、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、導入は、ｇｓｎｏＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を、標的ＲＮＡをコードする領域へ直接的または間接的に隣接する内在性核酸分子の領域の中へ挿入することを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｕ６プロモーターまたはＵ１プロモーターによって駆動される。ヌクレオチド配列を内在性核酸分子の中へ挿入する方法は、当技術分野において公知であり、ガイド型ヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）編集及び相同組み換え修復等である。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列へ直接的または間接的に隣接する内在性核酸分子の領域の中へ挿入されたｇｓｎｏＲＮＡは、標的ＲＮＡとは分離した核酸分子中でコードされた同じｇｓｎｏＲＮＡに比較して、少なくとも標的ＲＮＡの１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍多い編集効率を提供する。

【0194】

いくつかの実施形態において、細胞において存在するシュードウリジン化される実体を動員及び向け直す程度は、ｇｓｎｏＲＮＡの投薬及び投薬レジメンによって調節され得る。これは、実験者（例えばインビトロ）、または通常第Ｉ相及び／または第ＩＩ相の臨床試験において臨床医によって決定されることである。

【0195】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、真核生物（例えば後生動物細胞またはヒト細胞等の哺乳動物細胞）における標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）配列の修飾を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法及び組成物は、任意の器官（例えば皮膚、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、腸、筋肉、腺、眼、脳、血液、及び同種のもの）からの細胞により使用され得る。細胞は、インビトロまたはインビボに置かれ得る。本開示の方法、組成物、系、キット、及び製造品の１つの利点は、生きている生物体中で細胞によりインサイチューでそれらが使用され得るが、培養中でも細胞により使用され得るということである。いくつかの実施形態において、細胞は、エクスビボで治療され、次いで生きている生物体の中へ導入される（例えばそれらが元々由来する生物体の中へ再導入される）。本開示の方法、組成物、系、キット、及び製造品は、いわゆるオルガノイド内の細胞における標的ＲＮＡ配列を編集するためにも使用され得る。オルガノイドは三次元のインビトロ由来の組織として見なされ得るが、個別の単離された組織を生成するための特定の条件を使用して行なわれる（例えばＬａｎｃａｓｔｅｒ ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ．２０１４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５（６１９４）：１２４７１２５を参照）。治療設定において、患者の細胞からインビトロで由来し、次いで自己由来材料として患者に再導入され得、それは通常の移植よりも拒絶される可能性が低いので、オルガノイドは有用である。治療される細胞は、概して遺伝的突然変異を有するだろう。突然変異は、ヘテロ接合体またはホモ接合体であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法及び組成物は、点突然変異を修飾するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法及び組成物は、例えばヒト対象がＰＴＣと関連する疾患を患う場合に、対象（例えばヒト対象）の疾患状態に関与する細胞、組織、または器官における配列の修飾に好適である。

【0196】

本開示は、編集される部位を標的化し、ＲＮＡ編集タンパク質（例えばＤＫＣ１）を動員して編集反応（複数可）をもたらすことが可能なオリゴヌクレオチド（例えば上のセクションＩＩＢ中で記載されるｇｓｎｏＲＮＡのうちの任意のもの、または上のセクションＩＩＢ中で記載される操作されたスキャフォールドに基づく任意のｇｓｎｏＲＮＡ）の使用を介して真核生物細胞における標的ＲＮＡ配列の変化（シュードウリジン化）を行うために使用され得る方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１は、内在性ＤＫＣ１である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１は、外来的に送達される。いくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１アイソフォーム３または細胞質内局在のあるＤＫＣ１タンパク質の相対的比率を増加させることを含む。標的ＲＮＡ配列は、修正または変更することを望む点突然変異（トランジションまたはトランスバージョン）等の突然変異を含み得る。標的ＲＮＡは、任意の細胞配列またはウイルスＲＮＡ配列であり得るが、通常は、タンパク質コーディング機能を備えたプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的配列は、真核生物（例えば哺乳類、例えばヒト）細胞に対して内在性である。

【0197】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、ＰＴＣのリードスルーの促進に好適であり、ＰＴＣは、オパールコドン（ＵＧＡ）、アンバーコドン（ＵＡＧ）、またはオーカーコドン（ＵＡＡ）である。いくつかの実施形態において、ＰＴＣは、オパールコドンであり、方法は、リードスルー効率は、ＰＴＣを欠如する対照に比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％のリードスルー効率もたらし、タンパク質の発現または活性（例えば蛍光強度）のパーセントとしてアッセイされる。いくつかの実施形態において、ＰＴＣは、アンバーコドン（ＵＡＧ）であり、方法は、リードスルー効率は、ＰＴＣを欠如する対照に比較して、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、または少なくとも１４％のリードスルー効率もたらし、タンパク質の発現または活性（例えば蛍光強度）のパーセントとしてアッセイされる。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％の検出可能なレベルの、ＰＴＣを含む標的遺伝子によりコードされた全長タンパク質を発現する細胞をもたらす。

【0198】

いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的ウリジンは、タンパク質をコードする配列中の未成熟終止コドンであり、方法は、宿主細胞において、未成熟終止コドン無しの全長タンパク質の発現レベルの少なくとも４％（例えば少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、またはそれ以上）の全長タンパク質の発現をもたらす。

【0199】

いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的ウリジンは、タンパク質をコードする配列中の未成熟終止コドンであり、方法は、全長タンパク質の発現をもたらし、タンパク質の発現は、エンリッチメント無しで（例えば免疫沈降によってエンリッチメント無しで）検出可能である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タグ（例えば蛍光タグを介して）を介して検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、当技術分野において公知の方法に従って免疫染色によって検出される。

【0200】

いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的ウリジンは、タンパク質をコードする配列中の未成熟終止コドンであり、方法は、宿主細胞のうちの少なくとも２０％（例えば宿主細胞のうちの少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上のパーセンテージ）において全長タンパク質の発現をもたらす。

【0201】

本明細書において記載される方法（標的ＲＮＡを編集する方法または治療の方法等）のうちの任意の１つにおける使用のための、本明細書において記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡ組成物または操作されたＲＮＡ編集系も提供される。疾患または病態の治療のための医薬品の調製物中で本明細書において記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡ組成物または操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意の１つの使用。

【0202】

Ａ．治療の方法
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、標的ＲＮＡを修飾するためにＤＫＣ１タンパク質を動員するｇｓｎｏＲＮＡを使用して、標的ＲＮＡを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、標的ウリジン残基を含む標的配列へハイブリダイズし、ＲＮＡの修飾は、標的ウリジンのシュードウリジンへの修飾を含む。

【0203】

いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、細胞（例えば哺乳動物細胞またはヒト細胞等の真核生物細胞）の内在性ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、細胞の内在的に転写された（例えば細胞の内在性核酸配列から転写された）ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、細胞の中へ導入された核酸配列から転写される（例えば外来的に添加された核酸分子から転写されたＲＮＡ）。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、リボソームＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

【0204】

いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的ウリジンを含む配列は、終止コドンであり、標的ウリジンのシュードウリジンへの修飾は、終止コドンをコーディングコドンとして翻訳されるようにする。いくつかの実施形態において、終止コドンは、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）である。いくつかの実施形態において、ＰＴＣは、遺伝性の疾患または病態と関連する。本開示の手段及び方法の使用によって、かかるＰＴＣ中の標的ウリジンをシュードウリジンへ変換すると、次いで翻訳の間の読み取りフレームの適切なリードスルーをもたらし、それによって、（部分的または完全に）機能的な全長タンパク質を提供する。

【0205】

いくつかの実施形態において、対象における標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する疾患または病態を治療する方法であって、本明細書において記載されるＲＮＡ編集方法のうちの任意のものを使用して、対象の細胞における標的ＲＮＡを編集することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、標的ＲＮＡ中のＰＴＣへハイブリダイズするガイド配列を含み、ＰＴＣ中のウリジン残基のシュードウリジン残基への修飾が、標的ＲＮＡ中のＰＴＣの翻訳リードスルーを引き起こし、それによって、対象における疾患または病態を治療する、前記方法が本明細書において提供される。

【0206】

いくつかの実施形態において、対象における標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する疾患または病態を治療する方法は、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを対象の宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、標的ＲＮＡ中のウリジン残基を含むＰＴＣへハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、野生型ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、またはＡＣＡ１７に由来するスキャフォールド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞の内在性ＤＫＣ１タンパク質である。いくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸を宿主細胞の中へ導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞において細胞質内局在を有する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質のアミノ酸残基４１～４２０に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号２に従う。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８に少なくとも８５％（例えば少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちの任意の１つ）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。

【0207】

いくつかの実施形態において、対象における標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する疾患または病態を治療する方法は、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを対象の宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含むＰＴＣへハイブリダイズするガイド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号４～６、９～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、宿主細胞においてＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞の内在性ＤＫＣ１タンパク質である。いくつかの実施形態において、方法は、ＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸を宿主細胞の中へ導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、宿主細胞において細胞質内局在を有する。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ヒトＤＫＣ１アイソフォーム３タンパク質のアミノ酸残基４１～４２０に対応するＤＫＣ１タンパク質断片を含み、アミノ酸ナンバリングは配列番号２に従う。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８に少なくとも８５％（例えば少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちの任意の１つ）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。

【0208】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ｇｓｎｏＲＮＡの半分（例えば単一のヘアピン及びＨボックス、または単一のヘアピン及びＡＣＡボックスを含む）である。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、図１２Ｂ及び図１３中で示されるように、配列番号８９～１００及び１１３～１２８において示される配列のうちの任意の１つを含むかまたはそれらからなる。

【0209】

いくつかの実施形態において、対象における標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する疾患または病態を治療する方法は、操作されたｇｓｎｏＲＮＡを対象の宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号７１～８４から選択される配列を含む。例示的な疾患関連ＰＴＣのウリジン残基を標的化する例示的な操作されたｇｓｎｏＲＮＡの配列は、表４中で示される。

【0210】

いくつかの実施形態において、対象における標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する疾患または病態を治療する方法は、（ａ）操作されたｇｓｎｏＲＮＡ及び（ｂ）スプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を対象の宿主細胞の中へ導入することを含み、ｇｓｎｏＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含み、ＡＳＯは、宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を促進し、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾する。いくつかの実施形態において、スプライス－スイッチングＡＳＯは、ＤＫＣ１遺伝子のプレｍＲＮＡへ結合し、ＤＫＣ１アイソフォーム３のスプライシングを指令する。いくつかの実施形態において、スプライス－スイッチングＡＳＯの導入は、ＡＳＯの非存在下の宿主細胞における同じアイソフォームの発現に比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍まで、宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態において、スプライス－スイッチングＡＳＯの投与は、ＡＳＯの非存在下の宿主細胞におけるＤＫＣ１アイソフォーム３の発現に比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍まで、ＤＫＣ１アイソフォーム３の発現を増加させる。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９、ＡＣＡ２ｂ、ＡＣＡ３６、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、Ｅ２、ＡＣＡ３、及びＡＣＡ１７からなる群から選択される、野生型Ｈ／ＡＣＡ－ｓｎｏＲＮＡに由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ２ｂに由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ３６に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ＡＣＡ１９に由来するスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号３～１２、１５～１９、２２～３６、及び１７７～１７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、配列番号１５～１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0211】

いくつかの実施形態において、疾患または病態は、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠乏症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、８－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、水疱性表皮剥離症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫様ポリープ、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン舞踏病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーベル先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型及びＩＩ型、神経繊維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏｌ関連癌、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異等）、肺高血圧症（常染色体優性）、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌形赤血球貧血症、脊髄筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全症、スタージ・ウェーバー症候群、及びがんからなる群から選択される。標的ＲＮＡ中のＰＴＣと関連する例示的な疾患または病態は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤＲ（ｈｇｍｄ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋで利用可能））及びＣｌｉｎＶａｒ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｌａｎｄｒｕｍ ｅｔ ａｌ．ＣｌｉｎＶａｒ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ａｃｃｅｓｓｉｎｇ ｄａｔａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０２０；４８（Ｄ１）：Ｄ８３５－Ｄ８４４を参照；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ／ｉｎｔｒｏで利用可能）中でリストされる。いくつかの実施形態において、スレオニンまたはセリンは、ΨＡＡコドン及びΨＡＧのコドンで取り込まれ、フェニルアラニンまたはチロシンは、ΨＧＡコドンで取り込まれる。

【0212】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書においてリストされる疾患のうちの１つまたは複数の治療のための医薬品の製造における核酸分子（本明細書において記載される操作されたｇｓｎｏＲＮＡをコードする）の使用を提供する。いくつかの実施形態において、嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療における使用のための操作されたｇｓｎｏＲＮＡが本明細書において提供される。例えば国際特許公開ＷＯ２０１９１９１２３２（それらの内容は参照することによってそれらの全体が本明細書に援用される）中で記載されるように、ＣＦと関連する例示的なＰＴＣは当技術分野において公知である。例示的な嚢胞性線維症関連ＰＴＣ突然変異は、Ｇ５４２Ｘ（ＵＧＡ）、Ｗ１２８２Ｘ（ＵＧＡ）、Ｒ５５３Ｘ（ＵＧＡ）、Ｒ１１６２Ｘ（ＵＧＡ）、Ｙ１２２Ｘ（ＵＡＡ）、Ｗ１０８９Ｘ、Ｗ８４６Ｘ、及びＷ４０１Ｘの突然変異が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、シュードウリジン化を介してアミノ酸をコードするコドンへ修飾され得、それによって全長タンパク質への翻訳を可能にする。例えば、終止コドンとして見なされる代わりに、ΨＡＡコドン及びΨＡＧコドンの両方がセリンまたはスレオニンへ翻訳されるが、ΨＧＡがチロシンまたはフェニルアラニンへ翻訳されることは、当技術分野において十分に確立されている（Ｋａｒｉｊｏｌｉｃｈ ａｎｄ Ｙｕ，２０１１）。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、古細菌細胞または真核生物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、方法は、インビボで実行される。他の実施形態において、方法は、エクスビボで実行される。

【0213】

本開示の方法は、広範囲の公知の疾患関連ＰＴＣについて、疾患関連ＰＴＣのＮＭＤを抑制する、及び／またはＰＴＣリードスルーを促進するために適用され得る。それぞれの疾患遺伝子中のナンセンス突然変異から生じる多数のヒト疾患がある。例えば、アッシャー症候群は、聴覚障害及び失明の併発の主要な原因である遺伝性網膜ジストロフィー（ＩＲＤ）である。ナンセンス突然変異がアッシャー症候群患者の１２％において起こり、異なる遺伝子（ＵＳＨ２Ａ遺伝子等）において記載されている。骨格異常及び認知機能不全を患う何人かのハーラー症候群患者は、これらの患者において機能的な全長ＩＤＵＡタンパク質の産生を防止するＩＤＵＡ遺伝子中のナンセンス突然変異を保有する。肺及び消化器系に影響する疾患である嚢胞性線維症（ＣＦ）症例のかなりの割合は、ＣＦＴＲ遺伝子中のナンセンス突然変異に起因する。これらのナンセンス突然変異から生じるＰＴＣは、複数の異なる部位のコード領域中で同定され、その各々は機能的な全長ＣＦＴＲタンパク質の完全な欠如を導く。ナンセンス突然変異は、多くのがん患者のいくつかの関連するがん遺伝子中でも見出され、全長タンパク質産物の完全な欠如をもたらす。遺伝子発現及び疾患におけるナンセンス突然変異の有害な役割を考慮すると、ナンセンス抑制は、魅力的な戦略であり、これらの疾患と闘う最終的な目標となる。

【0214】

Ｃ．標的細胞への送達
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、ｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質、あるいはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸を、標的ＲＮＡを含む宿主細胞へ送達すること（例えば投与すること）を含む。投与されるｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸及び／またはＤＫＣ１タンパク質の量、投薬量、及び投薬レジメンは、細胞型間の差、治療される疾患、標的集団、投与モード（例えば全身ｖｓ局所）、疾患の重症度、及び副活性の許容されるレベルで変動し得るが、これらは、インビトロの研究の間に試行錯誤によって、前臨床試験及び臨床試験において、査定され得、そして査定されるべきである。修飾された配列が容易に検出される表現型変化を導く場合に、試験は特に簡単である。

【0215】

いくつかの実施形態において、方法は、１つもしくは複数の核酸（例えばｇｓｎｏＲＮＡ、あるいはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸）及び／または前形成されたｇｓｎｏＲＮＡタンパク質複合体（それは、ｇｓｎｏＲＮＡ、ＤＫＣ１タンパク質、ＮＯＰ１０タンパク質、ＧＡＲ１タンパク質、及び／またはＮＨＰ２タンパク質を含み得る）を、細胞（例えば哺乳動物細胞またはヒト細胞）へ送達することを含む。例示的な細胞内送達方法としては、ウイルスまたはウイルス様物質；化学物質ベースのトランスフェクション方法（リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、または陽イオン性ポリマー（例えばＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン）を使用するもの等）；非化学的な方法（マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、インペールフェクション、プロトプラスト融合、細菌の接合、プラスミドの送達、またはトランスポゾン等）；粒子ベースの方法（遺伝子銃の使用、マグネクトフェクション（ｍａｇｎｅｃｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）または磁石支援トランスフェクション、粒子衝撃等）；及びハイブリッド方法（ヌクレオフェクション等）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本出願は、かかる方法によって産生された細胞、及びかかる細胞を含むかまたは当該細胞から産生された生物体（例えば非ヒト哺乳動物）をさらに提供する。

【0216】

核酸の非ウイルス性送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤促進ＤＮＡ取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号中で記載され、リポフェクション試薬は商業的に販売される（例えばＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ（登録商標））。いくつかの実施形態において、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００は、ｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸（例えばｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸ベクター）をトランスフェクションするために使用される。

【0217】

１つの好適な試験技法は、本開示に従う核酸分子を細胞抽出物、細胞株、または試験生物体へ送達し、次いでその後に様々な時間点で生検サンプルを採取することを包含する。標的ＲＮＡの配列は、生検サンプル中で査定され得、修飾を有する細胞の割合は容易に追跡され得る。この試験が一回遂行された後でも、次いで生検サンプルを採取する必要なしに、知見は保持され、今後の送達は遂行され得る。本開示の方法は、したがって細胞の標的ＲＮＡ配列中の所望される変化の存在を同定し、それによって標的ＲＮＡ配列が修飾されていると確認するステップを包含し得る。変化は、タンパク質のレベル（長さ、糖鎖付加、機能、または同種のもの）について、または例えば標的ＲＮＡ配列によってコードされたタンパク質がイオンチャンネルである場合に、いくつかの機能的な読み取り（（誘導性）電流等）によって査定され得る。ＣＦＴＲ機能の事例において、ヒトを含む哺乳動物におけるウッシングチャンバーアッセイまたはＮＰＤ試験は、回復または機能獲得を査定する当業者に周知である。

【0218】

シュードウリジン化が細胞中で起こった後に、修飾されたＲＮＡは、例えば細胞分裂、編集されたＲＮＡの限定的な半減期などに起因して、時間の経過と共に希釈されるようになり得る。したがって、実践的な治療期間において、本開示の方法は、患者へ有形の利益を提供する、及び／または利益を経時的に維持するために、十分な標的ＲＮＡが修飾されるまでオリゴヌクレオチドの反復して送達することを包含し得る。

【0219】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡは、ネイキッド核酸の形態で細胞へ送達され得る。かかるコンストラクト（ｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質、あるいはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸）が細胞へ送達され得る（インビトロ、エクスビボ、またはインビボのいずれかで）他の手法によるものは、送達ビヒクル（ウイルスベクター等）の使用によるものである。

【0220】

核酸送達のための従来のウイルスベースの系としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、及び単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム中での組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス方法により可能であり、多くの場合挿入された導入遺伝子の長期的な発現をもたらす。追加で、高い形質導入効率は、異なる細胞型において観察されている。レトロウイルスの指向性は、外因性エンベロープタンパク質を取り込むことによって変更され得、標的細胞の可能性のある標的集団を増大させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高ウイルス力価を産生することが可能なレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターは、６～１０ｋｂまでの外因性配列をパッケージングする能力を備えたシス作用長末端反復から構成される。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングのために十分であり、次いでそれは、核酸を標的細胞の中へ組み込んで永続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものが挙げられる。一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系が使用され得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞タイプにおいて非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要求しない。かかるベクターにより、高力価及び高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。

【0221】

パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３Ｔ細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。ウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子へとパッケージングする細胞株の産生によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及び後続する宿主の中への組み込みのために要求される最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチド（複数可）のための発現カセットによって置き換えられる。欠損しているウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノムの中への組み込みのために要求される、ＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを保持する。ウイルスＤＮＡは、細胞株（他のＡＡＶ遺伝子（すなわちｒｅｐ及びｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する）中でパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスによっても感染され得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば熱処理によって低減させることができ、アデノウイルスはＡＡＶよりも熱処理により感受性がある。

【0222】

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、例えばレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター及び同種のもの等）である。また、プラスミド、人工染色体、ならびに細胞のヒトゲノム中の標的化された相同組み換え及び組み込みのために使用可能なプラスミドは、本明細書において記載されるｇｓｎｏＲＮＡの送達のために好適に適用され得る。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡがウイルスベクターによって送達される場合に、これは、転写物の一部中で本開示に従うオリゴヌクレオチドの配列を含むＲＮＡ転写物の形態である。いくつかの実施形態において、本開示に従うＡＡＶベクターは、組み換えＡＡＶベクターであり、ＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質のタンパク質シェル中で本開示に従うエクソン－イントロン－エクソン配列を含むＡＡＶゲノムの一部をカプシドで包まれて含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの一部は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及び他等のアデノ随伴ウイルス血清型に由来する逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有し得る。カプシドタンパク質から構成されるタンパク質シェルは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び他等のＡＡＶ血清型に由来し得る。タンパク質シェルは、カプシドタンパク質シェルとも命名され得る。ＡＡＶベクターは、１つまたはすべての野生型ＡＡＶ遺伝子を欠失し得るが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含み得る。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、及びパッケージングのために必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であり得るか、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、もしくは１００％の配列同一性を有し得るか、またはそれらが機能的なままである限り、例えばヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失、もしくは置換で改変され得る。この文脈において、機能性は、ゲノムのカプシドシェルの中へのパッケージングを指令し、次いで感染される宿主細胞または標的細胞中での発現を可能にする能力を指す。本開示の文脈においてカプシドタンパク質シェルは、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲとは異なる血清型であり得る。本開示に従うＡＡＶベクターは、したがってカプシドタンパク質シェル（すなわち１つのＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ血清型２）のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）を含む、２０面体カプシド）から構成され得るが、そのＡＡＶ２ベクター中で含有されるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む上で記載されるＡＡＶ血清型のうちの任意のものであり得る。したがって「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含む一方で、例えば「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質シェルを含み、それによって、いずれかは、本開示に従う任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲをカプシドで包み得る。いくつかの実施形態において、本開示に従う組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８、またはＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ＡＡＶベクター中に存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８、またはＡＡＶ血清型９に由来し；かかるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、またはＡＡＶ９／９ベクターと称される。

【0223】

いくつかの実施形態において、本開示に従う組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型５に由来し；かかるベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターと称される。いくつかの実施形態において、本開示に従う組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型８に由来し；かかるベクターは、ＡＡＶ２／８ベクターと称される。いくつかの実施形態において、本開示に従う組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型９に由来し；かかるベクターは、ＡＡＶ２／９ベクターと称される。いくつかの実施形態において、本開示に従う組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来し；かかるベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターと称される。いくつかの実施形態において、選択の核酸配列によって提示される本開示に従うエクソン－イントロン－ガイドＲＮＡ－イントロン－エクソン配列を保有する核酸分子は、上で同定されるＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列の間に、例えばコーディング配列へ作動可能に連結された発現調節エレメント及び３’終結配列を含む発現コンストラクトの間に挿入される。「ＡＡＶヘルパー機能」は、概して、トランスでＡＡＶベクターへ供給されるＡＡＶ複製及びパッケージングのために要求される対応するＡＡＶ機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターにおいて欠損しているＡＡＶ機能を補完するが、ＡＡＶ ＩＴＲを欠如する（それはＡＡＶベクターゲノムによって提供される）。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要ＯＲＦ（すなわちｒｅｐコード領域及びｃａｐコード領域またはその機能的な実質的に同一の配列）を含む。Ｒｅｐ領域及びＣａｐ領域は、当技術分野において周知である。ＡＡＶヘルパー機能は、プラスミドであり得るＡＡＶヘルパーコンストラクト上で供給され得る。

【0224】

ヘルパーコンストラクトの宿主細胞の中への導入は、本明細書において同定されるＡＡＶベクター中に存在するＡＡＶゲノムの導入の前またはそれと同時に、例えば形質転換、トランスフェクション、または形質導入によって生じ得る。したがって、本開示のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方ではＡＡＶベクターのカプシドタンパク質シェルについて、他方では前記ＡＡＶベクターの複製及びパッケージング中に存在するＡＡＶゲノムについて、血清型の所望される組み合わせを産生するように選ばれ得る。「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶの複製及びパッケージングのために要求される追加機能を提供する。

【0225】

好適なＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型及び２型等）、及びワクシニアウイルスが挙げられる。ＵＳ６，５３１，４５６中で記載されるように、ヘルパーウイルスによって提供された追加機能は、ベクターを介しても宿主細胞の中へ導入され得る。いくつかの実施形態において、本開示に従う組み換えＡＡＶベクター中に存在するＡＡＶゲノムは、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子またはｃａｐ（カプシド）遺伝子等）を含まない。ＡＡＶゲノムは、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子（例えば抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えばｇｆｐ）をコードする遺伝子、あるいは当技術分野において公知の化学的に、酵素的に、または他の場合には検出可能な及び／または選択可能な産物をコードする遺伝子（例えばｌａｃＺ、ａｐｈなど）等）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本開示に従うＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、ＡＡＶ２／９ベクター、またはＡＡＶ２／２ベクターである。

【0226】

いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡ及びＤＫＣ１は、リボヌクレオタンパク質複合体（例えばｇｓｎｏＲＮＡ、ＤＫＣ１、ＮＯＰ１０、ＧＡＲ１、及び／またはＮＨＰ２を含む複合体）として細胞へ送達される。タンパク質またはタンパク質複合体（前形成されたｇｓｎｏＲＮＡ－ＤＫＣ１／ＮＯＰ１０／ＧＡＲ１／ＮＨＰ２複合体等）の細胞内送達のための方法としては、機械的方法（マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及びマイクロ流体デバイスを使用する細胞の機械的変形等）；担体ベースの方法（細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ウイルス様粒子、超荷電タンパク質、ナノ担体、超分子担体ベースの送達系、及びナノ粒子安定化ナノカプセル剤等）が挙げられるがこれらに限定されない。例えばＦｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１４，２５，１６０２－１６０８を参照されたい。いくつかの機械的方法（マイクロインジェクション及びエレクトロポレーション等）は侵襲的且つ低スループットであり得る。いくつかの実施形態において、リボヌクレオタンパク質複合体は、マイクロ流体系（ＣＥＬＬ ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）等）を介して細胞を通過させる間に細胞膜を介して複合体を挿入することによって、細胞の中へ送達される（例えば米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号を参照）。

【0227】

上で記載されるように、本開示に従う核酸分子の細胞の中への導入は、当業者に公知の一般的な方法によって遂行される。シュードウリジン化後に、効果の読み取り（標的ＲＮＡ配列の変異）は、任意選択の同定ステップにおいて異なる手法を介してモニタリングされ得る。したがって、標的ウリジンの所望されるシュードウリジン化が実際に起こったかどうかの同定ステップは、概して、標的ＲＮＡ配列中の標的ウリジンの位置、及びウリジンの存在によって生じる効果（点突然変異、ＰＴＣ）に依存する。したがって、いくつかの実施形態において、ＵからΨへの変換の最終的な効果に依存して、同定ステップは、機能的な、伸長した、全長の、及び／または野生型のタンパク質の存在の査定；プレｍＲＮＡのスプライシングがシュードウリジン化によって変更されたかどうかの査定；またはシュードウリジン化後の標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長した、及び／または野生型のタンパク質をコードする、機能的な読み取りの使用を含む。本明細書において言及される疾患の各々についての機能的な査定は、概して、当業者に公知の方法に従うだろう。

【0228】

核酸分子（ｇｓｎｏＲＮＡ発現コンストラクトまたは本開示に従うベクター等）は、好適には、薬学的使用と適合する、添加物、賦形剤、他の成分を任意選択で含む、水溶液（例えば食塩水）または懸濁物中で投与される。投与は、鼻内、経口の吸入（例えば霧化を介する）による、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、硝子体内、筋肉内、気管内、腹腔内、直腸内、及び同種のものの注射または点滴によるものであり得る。投与は、固体の形態で、粉末、ピルの形態で、またはヒトにおける薬学的使用と適合する他の形態であり得る。本開示は、遺伝性疾患（ＣＦ）の治療のために特に好適である。

【0229】

いくつかの実施形態において、核酸分子（ｇｓｎｏＲＮＡ、発現コンストラクト、またはベクター等）は、全身的に送達され得る。いくつかの実施形態において、核酸分子（ｇｓｎｏＲＮＡ、発現コンストラクト、またはベクター等）は、細胞に送達されるか、または標的配列の表現型が観察される組織に局所的に送達され得る。例えば、ＣＦＴＲにおける突然変異は、肺上皮組織において主として見られるＣＦを引き起こし、したがって、ＣＦＴＲ標的配列に関するいくつかの実施形態において、肺へオリゴヌクレオチドコンストラクトを特異的且つ直接的に送達する。これは、典型的には、ネブライザーの使用を介して、例えば粉末またはエアロゾルの吸入によって好都合に達成され得る。いくつかの実施形態において、ネブライザーは、いわゆる振動メッシュを使用するネブライザーであり、ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ （Ｒａｐｉｄ）またはＲｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓからのｉ－ｎｅｂが挙げられる。本開示に従うオリゴヌクレオチドコンストラクトの吸入送達も、効率的にこれらの細胞を標的化し、ＣＦＴＲ遺伝子標的化の症例においてＣＦと関連する胃腸症状の軽快も導き得ることが期待される。いくつかの疾患において、粘液層は厚みの増加を示し、肺を介する医薬品の吸収の減少を導く。かかる疾患の１つは、慢性気管支炎であり、別の例はＣＦである。様々な粘液正常化物質が、入手可能であり、ＤＮａｓｅ、高張生理食塩水、またはマンニトール等が、Ｂｒｏｎｃｈｉｔｏｌのという名称で商業的に入手可能である。粘液正常化物質が、シュードウリジン化オリゴヌクレオチドコンストラクト（本開示に従うｇｓｎｏＲＮＡコンストラクト等）と組み合わせて使用される場合に、それらは、医薬品の有効性を増加させ得る。したがって、本開示に従うオリゴヌクレオチドコンストラクトの対象（ヒト対象等）への投与は、粘液正常化物質と組み合わせられ得る。加えて、本開示に従うオリゴヌクレオチドコンストラクトの投与は、ＣＦの治療のための小分子（ポテンシエーター化合物（例えばＫａｌｙｄｅｃｏ（イバカフトール；ＶＸ－７７０））、またはコレクター化合物（例えばＶＸ－８０９（ルマカフトール）及び／またはＶＸ－６６１）等）の投与と組み合わせられ得る。代替的に、または粘液正常化物質と組み合わせて、粘液透過性の粒子またはナノ粒子中の送達は、例えばシュードウリジン化分子の肺及び腸の上皮細胞への効率的な送達のために適用され得る。いくつかの実施形態において、本開示に従うオリゴヌクレオチドコンストラクトの対象（ヒト対象等）への投与は、細菌感染、ならびに粘液増加及び／またはバイオフィルム形成等の細菌感染の症状を低減させるために抗生物質治療と組み合わせられる。抗生物質は、全身的もしくは局所的または両方で投与され得る。ＣＦ患者における適用のために、本開示に従うオリゴヌクレオチドコンストラクト、または本開示に従うパッケージングまたは複合体化オリゴヌクレオチドコンストラクトは、任意の粘液正常化物質（ＤＮａｓｅ、マンニトール、高張生理食塩水、及び／または抗生物質等）、及び／またはＣＦの治療のための小分子（ポテンシエーター化合物（例えばイバカフトール）、またはコレクター化合物（例えばルマカフトール及び／またはＶＸ－６６１）等）と組み合わせられる。標的細胞へのアクセスを増加させるために、気管支肺胞ファベージ（Ｂｒｏｎｃｈｅｏ－Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｆａｖａｇｅ）（ＢＡＦ）を適用して、本開示に従うオリゴヌクレオチドの投与の前に肺を洗浄することができる。

【0230】

ＩＶ．医薬組成物、キット、及び製造品
いくつかの態様において、本明細書において記載されるｇｓｎｏＲＮＡ、核酸コンストラクト／分子、または操作されたＲＮＡ編集系のうちの任意のもの、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。

【0231】

医薬組成物は、所望される純度を有する本明細書において記載される治療剤を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。許容される担体、賦形剤、または安定化物質は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントへ非毒性であり、バッファー、抗酸化物質（アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを包含する）；防腐物質、等張化物質（例えば塩化ナトリウム）、安定化物質、金属複合体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；キレート剤（ＥＤＴＡ及び／または非イオン性界面活性物質等）が挙げられる。

【0232】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、一回使用のバイアル（一回使用の密封バイアル）中で含有される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、複数回使用のバイアル中で含有される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、容器中でバルクで含有される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、凍結保存される。

【0233】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ｇｓｎｏＲＮＡを含む。他の実施形態において、医薬組成物は、ｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸コンストラクト（例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクター等のベクター）を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、遊離ｇｓｎｏＲＮＡ（「ネイキッド」ｇｓｎｏＲＮＡ）、または取り込みのための及び／または細胞内トラフィッキングのための他の構成要素（標的化のためのリガンド等）へコンジュゲートされたｇｓｎｏＲＮＡを含む。ｇｓｎｏＲＮＡは、水溶液（概して薬学的に許容される担体及び／または溶媒）中で使用され得るか、またはトランスフェクション剤、リポソーム、もしくはナノ粒子の形態（例えばＳＮＡＬＰ、ＬＮＰ、及び同種のもの）を使用して製剤化され得る。かかる製剤は、生物学的利用能及び同種のものを促進するために機能的なリガンドを含み得る。

【0234】

本出願は、本明細書において記載される治療方法の任意の実施形態で使用されるキット及び製造品をさらに提供する。キット及び製造品は、本明細書において記載される製剤及び医薬組成物のうちの任意の１つを含み得る。

【0235】

いくつかの態様において、セクションＩＩＢ中で記載されるｇｓｎｏＲＮＡまたは核酸分子のうちの任意のものを含む宿主細胞中の標的ＲＮＡを編集するためのキットが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、キットは、宿主細胞における内在性ＤＫＣ１アイソフォーム３の発現の促進のための薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、スプライス－スイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み、ＡＳＯは、宿主細胞において細胞質内局在のある内在性ＤＫＣ１アイソフォームであるＤＫＣ１タンパク質の発現を促進する。いくつかの実施形態において、キットは、ＤＫＣ１タンパク質をコードするＤＫＣ１タンパク質または核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォーム（例えばアイソフォーム３）である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、同じ種の野生型ＤＫＣ１タンパク質に比べて核局在化シグナル（ＮＬＳ）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、短縮されたＤＫＣ１バリアントまたは欠失を含むＤＫＣ１バリアント（上のセクションＩＩＡ中で記載される短縮バリアントまたは欠失バリアントのうちの任意のもの等）である。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書において記載される方法のうちの任意のものに従う標的ＲＮＡを編集するための指示書をさらに含む。

【0236】

いくつかの態様において、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、操作されたＲＮＡ編集系を含み、操作されたＲＮＡ編集系が、（ａ）宿主細胞における標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基を含む配列へハイブリダイズするガイド配列を含むｇｓｎｏＲＮＡ、またはｇｓｎｏＲＮＡをコードする核酸分子；及び（ｂ）ＤＫＣ１タンパク質、またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を含み、ｇｓｎｏＲＮＡが、ＤＫＣ１タンパク質を動員して、標的ＲＮＡ中の標的ウリジン残基をシュードウリジン残基へと修飾することが可能である、前記キットが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォームである。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、細胞質内局在のあるＤＫＣ１アイソフォーム（例えばアイソフォーム３）である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、ｇｓｎｏＲＮＡと会合するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の一部である。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、同じ種の野生型ＤＫＣ１タンパク質に比べて核局在化シグナル（ＮＬＳ）の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＤＫＣ１タンパク質は、短縮されたＤＫＣ１バリアントまたは欠失を含むＤＫＣ１バリアント（上のセクションＩＩＡ中で記載される短縮バリアントまたは欠失バリアントのうちの任意のもの等）である。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書において記載される方法のうちの任意のものに従う標的ＲＮＡを編集するための指示書をさらに含む。

【0237】

本開示のキットは、好適なパッケージング中にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング（例えば密封マイラーバッグまたはプラスチックバッグ）、及び同種のものが挙げられるがこれらに限定されない。キットは、任意選択で追加の構成要素（バッファー及び解釈の情報等）を提供し得る。本出願は、したがって製造物品も提供し、バイアル（密封バイアル等）、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング、及び同種のものを含む。

【0238】

組成物の使用に関する指示書は、概して、意図される治療のための投薬量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば複数回用量パッケージ）、またはサブ単位用量であり得る。例えば、個体または多くの個体の有効な治療を提供するために、ｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質、あるいは本明細書において開示されるｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子の十分な投薬量を含有するキットが提供され得る。追加で、個体への複数の投与を可能にするために、十分な投薬量のｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質、あるいはｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を含有するキットが提供され得る。キットは、複数の単位用量の医薬組成物及び使用のための指示書も含み、薬局（例えば病院薬局及び調剤薬局）における、保管及び使用のために十分な量でパッケージングされる。

【0239】

いくつかの実施形態において、キットは、送達系を含む。送達系は、単位用量送達系であり得る。これらの様々な投薬形態についての送達系は、単位用量パッケージまたは複数回の用量パッケージのいずれかでの、シリンジ、ドロッパーボトル、プラスチックスクイーズユニット、アトマイザー、ネブライザー、または薬学的エアロゾルであり得る。いくつかの実施形態において、ｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質、あるいはｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子ならびにｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質の送達のためのデバイス、あるいはｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子を含む、ｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質、あるいは本明細書において記載されるｇｓｎｏＲＮＡ及び／またはＤＫＣ１タンパク質をコードする核酸分子のうちの任意の１つの送達系が提供される。

【0240】

本明細書において開示される特色のすべては、任意の組み合わせで組み合わせられ得る。本明細書において開示される各々の特色は、同じ、同等、または類似する目的を供する代替の特色によって置き換えられ得る。したがって、別段明示的に述べられない限り、開示される各々の特色は、一般的なシリーズの同等または類似の特色の例のみである。

【実施例】

【0241】

本開示は、以下の実施例への参照によってより完全に理解されるだろう。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。本明細書において記載される実施例及び実施形態は、例示のみを目的とするものであり、それらに照らした様々な修飾または変化は、当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されるものであることが理解される。

【0242】

実施例１。未成熟終止コドンのリードスルーのために操作されたガイドｓｎｏＲＮＡの活用
本実施例は、操作されたガイドｓｎｏＲＮＡによる標的ＲＮＡのシュードウリジン化（例えばシュードウリジン化依存性ＰＴＣリードスルーによって証明される、ｍＲＮＡのシュードウリジン化）の効率を実証し、ガイドｓｎｏＲＮＡのための異なる発現系を提供する。

【0243】

ｍＲＮＡ中での部位特異的シュードウリジン化をインビボで達成するために、人工ガイドｓｎｏＲＮＡ（ｇｓｎｏＲＮＡ）を、修飾のために特異的なｍＲＮＡを標的化するように操作した（図１Ａ）。Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡは、Ｈボックスモチーフ及びＡＣＡボックスモチーフが続く２つのヘアピンを含有し、本明細書において提供される操作されたｓｎｏＲＮＡの両方のヘアピンは、ＰＴＣ部位を標的化することが可能なガイド配列を含有する。ＰＴＣリードスルーの効率を査定するために、Ｖｅｎｕｓレポーター（レポーター－１）を、１５４番目アミノ酸コドンと１５５番目のアミノ酸コドンとの間に挿入したアンバーコドン（ＴＡＧ）を備えたＶｅｎｕｓ蛍光レポーター遺伝子を発現させて、Ｖｅｎｕｓ翻訳を未成熟に終結させるようにデザインした。かかるレポーターは、Ｖｅｎｕｓの発現レベルのモニタリングによってＰＴＣリードスルーの効率の測定を可能にする。同じ位置でグリシンコドン（ＧＧＴ）を備えた陽性対照が含まれていた（図１Ｂ）。ｓｎｏＲＮＡガイド型シュードウリジン化による対応する終止コドンの修飾の結果としてのＰＴＣリードスルーをアッセイするために、レポーター－１（ＶｅｎｕｓＴＡＧ）または対照（Ｖｅｎｕｓ－ＧＧＴ）を、ｇｓｎｏＲＮＡ発現コンストラクト（ｇＣｔｒｌ（配列番号１４）、ｇＡＣＡ１９（配列番号３７）、ｇＡＣＡ４４（配列番号３８）、ｇＡＣＡ２７（配列番号３９）、ｇＥ２（配列番号４０）、ｇＡＣＡ１９－Ｓ（配列番号４１）、またはｇＡＣＡ１９－Ｌ（配列番号４２））と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の中へコトランスフェクションした。ＰＴＣリードスルーの効果を、ハイコンテントイメージング系によって測定し、陽性対照群と比較することによって定量した（図１Ｃ、１Ｄ）。相対的Ｖｅｎｕｓ発現を、対照（Ｖｅｎｕｓ－ＧＧＴ）に比較して検出されたＶｅｎｕｓのパーセント（％）として報告する。これらのｇｓｎｏＲＮＡは、第一世代ＲＥＳＴＡＲＴ（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１）として供された。

【0244】

対照ｇｓｎｏＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）の配列を以下で提供し、ガイド領域に下線を引いた（配列番号１４）。

【化1】

【0245】

ヒトゲノム中で、ｓｎｏＲＮＡ遺伝子の９０％超は、プレｍＲＮＡイントロン中にコードされる^１。本発明者らは、最初に宿主遺伝子イントロン中に所在する複数のｇｓｎｏＲＮＡによって媒介されるＰＴＣリードスルーの効果を評価した（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．０）。本発明者らは、最初に、ＡＣＡ１９、ＡＣＡ４４、ＡＣＡ２７、及びＥ２（それぞれＥＩＦ３Ａ、ＳＮＨＧ１２、ＲＰＬ２１、ＲＰＳＡの宿主遺伝子内の）を含むヒト２において高発現レベルを有する４つの内在性ｓｎｏＲＮＡを選択し（図２Ａ～２Ｃ及び図３Ａ～３Ｆ）、ＶｅｎｕｓレポーターＰＴＣを標的化するために、これらのスキャフォールドに基づいてｇｓｎｏＲＮＡを操作した。ｓｎｏＲＮＡを含む宿主遺伝子断片を、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるコンストラクトの中へクローニングした。レポーター－１を、これらのｇｓｎｏＲＮＡを発現するコンストラクト（宿主－ｇＣｔｒｌ；宿主－ｇＡＣＡ１９、宿主ｇＡＣＡ－４４、宿主－ｇＡＣＡ２７、及び宿主－ｇＥ２）と共にコトランスフェクションした後に、Ｖｅｎｕｓ発現によって示されるＰＴＣリードスルーの証拠が観察され、５．２％及び５．０％のＶｅｎｕｓ陽性細胞（対照Ｖｅｎｕｓ－ＧＧＴレポーターに比較して）が、それぞれ宿主－ｇＡＣＡ１９及び宿主－ｇＥ２をトランスフェクションした細胞から検出された一方で、他のものは無視できるシグナルを示した（図２Ａ）。対照ｇｓｎｏＲＮＡ（ｇＣｔｒｌ）がＶｅｎｕｓ発現を活性化することができなかったので、Ｖｅｎｕｓ発現は明らかに配列依存性であった。本発明者らは、ｇＡＣＡ１９スキャフォールド及びｇＥ２スキャフォールド（他のスキャフォールドよりも高い活性を示した）は、ｇＡＣＡ４４及びｇＡＣＡ２７よりも安定的な二次構造を有することが予測され（図３Ａ～３Ｄ）、ＰＴＣリードスルーによって証明される標的修飾のより高い効率は、二次構造の安定性と相関していることを示唆することを認識した。ＰＴＣリードスルー効率に対するｇｓｎｏＲＮＡを保有する宿主遺伝子配列の効果を試験するために、本発明者らは、ヘモグロビンサブユニットβ（ＨＢＢ）遺伝子のエクソン２とエクソン３との間のイントロンの中へ異なるｇｓｎｏＲＮＡをクローニングすることによって、さらなる比較を実行した。ｇＡＣＡ１９は、レポーター－１についてのＰＴＣリードスルーの媒介において最も高い効率（相対的Ｖｅｎｕｓ陽性細胞：７．３％）を再び示し、ｇＥ２は、２番目に最も高い効率（相対的Ｖｅｎｕｓ陽性細胞：１．８％）を示した（図２Ｂ）。

【0246】

宿主遺伝子配列が異なるｇｓｎｏＲＮＡに対して多様な効果があるという本発明者らの観察に基づいて（図２Ａ～２Ｂ中で示されるように）、本発明者らは、宿主遺伝子効果無しでｇｓｎｏＲＮＡを直接的に発現させることは、ＰＴＣリードスルーの効率をさらに増加させ得ることを想定した。したがって、本発明者らは、ｈＵ６（ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）及びｈＵ１（ｓｎＲＮＡ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター）プロモーター（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．１）によって駆動されるｇｓｎｏＲＮＡ発現コンストラクトのシリーズをデザインし（図１Ｃ～１Ｄ及び図２Ｃ）、それらをレポーター－１と一緒にＨＥＫ２９３Ｔ細胞の中へコトランスフェクションした。ｈＵ６プロモーター駆動ｇＡＣＡ１９のＰＴＣリードスルー効率は、宿主遺伝子イントロンに埋め込まれたｇＡＣＡ１９及びＨＢＢイントロンに埋め込まれたｇＡＣＡ１９のものに比較して、それぞれ１．９倍及び１．３倍増加した（図１Ｃ～１Ｄ及び図２Ａ～２Ｂ）。ｈＵ６プロモーター駆動されるｇｓｎｏＲＮＡの効率は、ｈＵ１プロモーター駆動ｇｓｎｏＲＮＡのものに類似する（図２Ｃ）。ＰＴＣリードスルーの効果は、ｇｓｎｏＲＮＡを伸長または短縮することによってさらに特徴づけられた。明白な効果は、ｇＡＣＡ１９の伸長（ｇＡＣＡ１９－Ｌ、５’で９ヌクレオチド及び３’で９ヌクレオチド）から観察されなかったが、短縮されたｇＡＣＡ１９（ｇＡＣＡ１９－Ｓ、５’で３ヌクレオチド）は、全長ｇＡＣＡ１９に比較して、レポーター－１ ＰＴＣリードスルー効率を３５％に低減した（図１Ｄ及び図２Ｅ～２Ｆ）。小分子ＲＮＡプロモーターによって駆動されるｇｓｎｏＲＮＡが、イントロンに埋め込まれたｇｓｎｏＲＮＡに比較して、ＰＴＣリードスルーの媒介においてより高い効率を示したので、本発明者らは、ｈＵ６プロモーターによって駆動されるｇｓｎｏＲＮＡを選択して、後続の分析を遂行した。

【0247】

内在性ＤＫＣ１タンパク質が上記の観察についての原因であるかどうか決定するために、本発明者らは、ＤＫＣ１を安定的にノックダウンした（ＤＫＣ１ ＫＤ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．１を実行した（図１Ｅ）。ＰＴＣリードスルーは、ＤＫＣ１－ＫＤ細胞からのｇｓｎｏＲＮＡについて観察されなかったが、これらのｇｓｎｏＲＮＡは、対照群におけるＶｅｎｕｓの発現を活性化し（図１Ｆ）、レポーター－１のＰＴＣリードスルーの媒介における内在性ＤＫＣ１の役割を支持する（図１Ａ）。まとめると、これらの観察は、ｇｓｎｏＲＮＡが標的化された転写のＰＴＣリードスルーを誘導し得ることを実証した。

【0248】

実施例２：ｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドの最適化は、ＰＴＣリードスルーの効率を改善する
最適なｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドを同定するために、本発明者らは、さらなる特性評価（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．２）のための候補スキャフォールドとして、ＲＮＡｆｏｌｄ^３によって予測された安定的二次構造を備えた５つのｓｎｏＲＮＡ（ｇＡＣＡ３、ｇＡＣＡ１７、ｇＡＣＡ１９、ｇＡＣＡ２ｂ、及びｇＡＣＡ３６）を選択した（図４Ａ及び図５Ａ）。本発明者らは、ｈＵ６プロモーター駆動ｇｓｎｏＲＮＡ及びＣＭＶプロモーター駆動ＢＦＰ遺伝子（トランスフェクション効率を正規化するために利用された）からなるｓｎｏＲＮＡ発現コンストラクトをデザインした（図４Ｂ）。その中でも、ｇＡＣＡ３６及びｇＡＣＡ２ｂは、ｇＡＣＡ１９に勝り、最も高い効率のＰＴＣリードスルー（相対的Ｖｅｎｕｓ陽性細胞は、それぞれ１３．７％及び１２．２％）を示した（図４Ｃ～４Ｄ）。ｇＡＣＡ１９は、－３７．１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの最小自由エネルギーを有し、ｇＡＣＡ２ｂは、－５４．９０ｋｃａｌ／ｍｏｌの最小自由エネルギーを有し、ｇＡＣＡ３６は、－４３．５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの最小自由エネルギーを有する。ｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールドの安定性と編集効率との間に直接関係がないように思われる。

【0249】

ｇｓｎｏＲＮＡの２つのヘアピンの役割を調査するために、本発明者らは、それぞれ５’ガイドエレメント及び３’ガイドエレメント中に突然変異を導入した（図４Ａ、図５Ａ、及び図６Ａ）。ｇＡＣＡ１９ ５’ヘアピン突然変異（ｇＡＣＡ１９－５ｍ）の編集効率は、ｇＡＣＡ１９のものに匹敵した一方で、ｇＡＣＡ１９－３ｍは効率の低減を示した（図４Ｅ～４Ｆ）。ｇＡＣＡ３６について、ｇＡＣＡ３６－３ｍの編集効率は、ｇＡＣＡ３６のものに匹敵した一方で、ｇＡＣＡ３６－５ｍは無視できるシグナルを示した（図６Ｂ）。これらの結果は、ｇＡＣＡ１９／ｇＡＣＡ３６の１つのヘアピンのみが主要な役割を果たし、同じ部位を標的化するｇｓｎｏＲＮＡの２つのヘアピンは互いと競合しないかもしれないことを示した。

【0250】

次に本発明者らは、ｇｓｎｏＲＮＡスキャフォールド（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．３）を操作することによってＰＴＣリードスルー効率をさらに改善しようと努力した（図４Ｅ～４Ｆ及び図３～４）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが小ポリＵストレッチで転写を終結させることを考慮して、本発明者らは、ｇＡＣＡ１９の頂点ループにおける「ＵＵＵＵ」配列へ単一塩基突然変異を導入した（図４Ａ及び図５Ｃ）。顕著なことには、ｇＡＣＡ１９－ＵＵＣＵ及びｇＡＣＡ１９－ＵＧＵＵの両方は、改善を示した（図４Ｅ～４Ｆ）。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチドとＨ／ＡＣＡボックスとの間の距離が、１４ヌクレオチドであるように、ｇｓｎｏＲＮＡヘアピン中の距離を変更することが、ｇｓｎｏＲＮＡの編集効率を増加させたことを認識した。一例において、本発明者らは、標的ウリジンへハイブリダイズするガイド領域中のヌクレオチドとＨ／ＡＣＡボックスとの間の距離が、１４ヌクレオチドであるように、ｇＡＣＡ１９のＵ１１５後に単一の塩基を挿入した（図４Ａ及び図５Ｄ）。ｇＡＣＡ１９－３ａｄｄＧは、非修飾ｇＡＣＡ１９に比較して、１．４倍まで効率を増加させた（図４Ｅ～４Ｆ）。さらに、理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、ｇｓｎｏＲＮＡヘアピンのガイドエレメントをよりオープンにすること（例えばガイド領域内の二次構造の塩基対合確率を減少させること）が、ｇｓｎｏＲＮＡの編集効率を増加させ得ることを見出した。ガイドエレメントをよりオープンにするために、本発明者らは、ｇＡＣＡ１９の５’ヘアピン中のＵ８後にジヌクレオチドを挿入した（図４Ａ及び図５Ｄ）。顕著なことには、ｇＡＣＡ１９－５ａｄｄＣＵは、ＰＴＣリードスルー効率を６０％増加させた（図４Ｅ～４Ｆ）。しかしながら、操作されたｇＡＣＡ３６スキャフォールドは、ＰＴＣリードスルーの効率をさらに改善はしなかった（図６Ａ～６Ｂ）。本発明者らは、ｇＡＣＡ１９の最適化された突然変異を組み合わせて２つのタンデムｇｓｎｏＲＮＡも発現させたが、どちらもさらに効率を改善はしなかった。

【0251】

実施例３：ｇｓｎｏＲＮＡ及び標的ＰＴＣ部位の空間的近接効果
本発明者らは、次に、ｇｓｎｏＲＮＡ及び標的ＰＴＣ部位の空間的近接が、ＰＴＣリードスルーの効率に対して影響を有するかどうかを問うた。本発明者らは、２つの新しいレポーターをデザインした。（１）レポート－２は、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰのコード領域との間にＰＴＣ部位を含有し、ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．３からのｇｓｎｏＲＮＡによって活性化された。ｍＣｈｅｒｒｙを、トランスフェクション効率を正規化するために利用した。（２）レポーター－３（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．４）において、ｇｓｎｏＲＮＡを、ＰＴＣレポーターとタンデムにアレンジし、これはレポーター－２と同じＰＴＣレポーターである。ｇｓｎｏＲＮＡは、レポーター－２及びレポーター－１の両方のＰＴＣの抑制において匹敵する効率を有し、ｇｓｎｏＲＮＡは、異なるレポーターで働くことを示す。予想外に、ｇｓｎｏＲＮＡは、レポーター－３におけるＰＴＣリードスルー効率を増加させた（相対的ＥＧＦＰ陽性細胞：約３０％、ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．３に比較して約２倍）。

【0252】

実施例４。ＲＥＳＴＡＲＴは、複数の細胞株におけるＰＴＣリードスルーを可能にする
本発明者らは、３つのヒト細胞株及び１つのマウス細胞株を含む、別個の組織から生じた４つの異なる細胞株においてＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．４を試験した。効率的なＰＴＣリードスルー事象が、試験されたすべての細胞株について観察され、本開示のｇｓｎｏＲＮＡデザインが、異なる哺乳動物細胞型においてＰＴＣを抑制する多用性のある戦略であることを示唆した。

【0253】

実施例５。ＤＫＣ１アイソフォーム３発現の増加は、有意にＰＴＣリードスルーを改善する
顕著なことには、最適化された突然変異の組み合わせも、２つのタンデムｇｓｎｏＲＮＡのコンストラクトのトランスフェクションによるｇｓｎｏＲＮＡ発現レベルの増加も、ＰＴＣリードスルーをさらに増加させず、ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．３は、最適な構造及び発現レベルを備えたｇｓｎｏＲＮＡを提供することが示唆される。本開示の操作されたｇｓｎｏＲＮＡが、最適化されたｇｓｎｏＲＮＡ構造及び発現レベルを提供したという本発明者の認識に基づいて、本発明者らは、ｇｓｎｏＲＮＡ安定性及び発現ではなく、酵素レベル及びアクセス容易性が、律速因子であるのではないかと考えた。ＤＫＣ１は、シュードウリジンのｓｎｏＲＮＡガイド型付着及び付随するＲＥＳＴＡＲＴにおけるＰＴＣリードスルーに関与する（図１Ａ、１Ｆ）。ヒト細胞において２つのＤＫＣ１アイソフォームがある。ＤＫＣ１アイソフォーム１は、二部構成のＮ末端及びＣ末端の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するカノニカルなＤＫＣ１形態である。ＤＫＣ１アイソフォーム３は、オルタナティブスプライシングバリアントであり、それはイントロン１２の保持によって産生され、Ｃ末端ＮＬＳを欠如する（図７Ａ）。アイソフォーム１の内在性ｍＲＮＡ発現レベルは、アイソフォーム３のものよりもおよそ２０倍高い^４。

【0254】

最初に、本発明者らは、ＤＫＣ１を安定的に過剰発現する細胞株を生成し、前記ＤＫＣ１アイソフォーム１を過剰発現する細胞にレポーター－３をトランスフェクションした（図７Ｂ～７Ｃ）。ＤＫＣ１アイソフォーム１の過剰発現は、対照細胞のものに比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合及び相対的ＥＧＦＰ強度を、それぞれ１．２倍及び１．３倍にわずかに増加させただけである（図７Ｄ～７Ｆ）。驚くべきことに、アイソフォーム３過剰発現細胞において、ＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合及び相対的ＥＧＦＰ強度は、それぞれ２．５倍及び５．２倍に大きく増加した（図７Ｄ～７Ｆ）。これらの観察は、レポーター－１及びｇｓｎｏＲＮＡコンストラクトをＤＫＣ１を安定的に過剰発現する細胞の中へコトランスフェクションすることによってさらに確認された（図８Ａ～８Ｃ）。ＤＫＣ１の一過性の役割をさらに調査するために、レポーター－３を、ＤＫＣ１を発現するコンストラクトと一緒にコトランスフェクションした。この場合もやはり、アイソフォーム３の一過性過剰発現は、ＰＴＣリードスルーを大きく増加させた（図８Ｄ）。ＤＫＣ１アイソフォーム３のＮ末端ＮＬＳも欠失させ、これらの短縮は、アイソフォーム３と類似するＰＴＣリードスルーの効率を有していた（図９）。これらの予想外の結果は、外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３がＰＴＣリードスルーの効率を有意に改善し、６１．４％のＥＧＦＰ陽性細胞（対照レポーターに比べて）及び１３．２％のＥＧＦＰ強度（対照レポーターに比べて）を達成できることを実証する。ｇｓｎｏＲＮＡ及びＤＫＣ１アイソフォーム３は、第二世代ＲＥＳＴＡＲＴ（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ２）として供された。

【0255】

ＲＥＳＴＡＲＴをより特徴づけるために、レポーター３の追加のセットを、３つの型すべての終止コドンを含むように構築し、もたらされたレポーターコンストラクトを、外来性ＤＫＣ１アイソフォーム３有り及び無しで、ＨＥＫ２９３Ｔの中へトランスフェクションした（図７Ｂ）。ＲＥＳＴＡＲＴ媒介性リードスルーの効率は、基底翻訳リードスルーまたは薬物誘導性翻訳リードスルーのものと正に相関し^５、オパールコドン（ＵＧＡ）で最も高いリードスルー、続いてアンバーコドン（ＵＡＧ）、次いでオーカーコドン（ＵＡＡ）であった（図７Ｇ～７Ｈ及び図１０Ａ～１０Ｄ）。ＵＧＡ（オパール）コドンについて、ＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合及び相対的ＥＧＦＰ強度は、それぞれ４５．３％及び５．８％（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．４）、ならびに７２．３％及び２８．６％（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ２）であった。一方で、ＵＡＡコドンは、外来性ＤＫＣ１無しで無視できるシグナルを示し（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ１．４）、ＤＫＣ１アイソフォーム３過剰発現で、２．９％の相対的ＥＧＦＰ陽性細胞及び０．２％の相対的ＥＧＦＰ強度であった（ＲＥＳＴＡＲＴ ｖ２）（図７Ｇ～７Ｈ及び図１０Ａ～１０Ｂ）。ＤＫＣ１アイソフォーム３発現コンストラクトの量の増加は、１４．８％の相対的ＥＧＦＰ陽性細胞までＵＡＡ（オーカー）コドンのＰＴＣリードスルーを改善したが、ＵＡＧ（アンバー）及びＵＧＡ（オパール）に比較して、依然として、それぞれ２５％及び１９％であった（図１０Ｃ～１０Ｅ）。総合すると、ＲＥＳＴＡＲＴは、３つのすべてのナンセンスコドンリードスルーを促進した。

【0256】

次に、３つの終止コドンの各々のレポーター－３コンストラクトを、２００ｎｇのＤＫＣ１アイソフォーム３発現コンストラクトと一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の中へ個別にコトランスフェクションした。標的の遺伝子座特異的シュードウリジン修飾を、放射性同位体標識無しのｑＰＣＲベースの方法^６によって検出した（図７Ｉ及び図１１Ａ～１１Ｃ）。融解曲線への変化は、３つのすべての終止コドンについて観察された（図７Ｉ）一方で、無視できる変化がΨ修飾を欠くｇＣｔｒｌ群について観察された（図１１Ａ）。これとは対照的に、１８Ｓ ｒＲＮＡ中のΨ１０４５部位についての融解曲線変化は、ｇＡＣＡ１９群とｇＣｔｒｌ群との間に匹敵していた（図１１Ａ～１１Ｃ）。まとめると、これらの結果から、ＤＫＣ１アイソフォーム３によってｇｓｎｏＲＮＡガイド型シュードウリジン化が３つのすべてのＰＴＣコドンリードスルーを効率的に促進することができることが実証される。

【0257】

実施例６。ＲＥＳＴＡＲＴは、疾患関連ＰＴＣを抑制する
この実施例は、ＲＥＳＴＡＲＴを使用する、疾患関連未成熟終止コドン（ＰＴＣ）の修正を実証する。ＲＥＳＴＡＲＴ系による疾患関連ＰＴＣのＲＮＡガイド型シュードウリジン化は、全長遺伝子産物の発現をもたらした。さらに、ＲＥＳＴＡＲＴを使用するタンパク質の機能の回復を、疾患関連ＰＴＣを含有するＣＦＴＲ遺伝子について実証した。以下の実施例において、「Ｘ」は、終止コドン突然変異を示す。試験したｇｓｎｏＲＮＡの配列を、表４中で提供する。

【0258】

ＰＴＣ部位を含有する疾患遺伝子の後にＥＧＦＰが続く、ＰＴＣ疾患レポーターを構築した（図１２Ａ中で示されるように）。ｇＡＣＡ１９ベースのｇｓｎｏＲＮＡ及びｇＡＣＡ３６ベースのｇｓｎｏＲＮＡをデザインし、６つの病原遺伝子（ＰＥＸ７、ＳＭＮ１、ＡＬＤＯＢ、Ｃ８ｏｒｆ３７、ＰＣＣＢ、及びＣＢＳ）からの７つの疾患関連ナンセンス突然変異を標的化して試験した（図１２Ｂ～１３）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｇｓｎｏＲＮＡ／ＰＴＣ疾患遺伝子ペアの共発現によって（ＲＥＳＴＡＲＴｖ１）、すべての部位でＰＴＣリードスルーが達成された。６．７％（ＡＬＤＯＢ－Ｗ１４８Ｘを発現する細胞）、２５．２％（ＳＭＮ１－Ｗ１９０Ｘ）、３３．８％（ＰＥＸ７－Ｒ２３２Ｘ）、１．７％（Ｃ８ｏｒｆ３７－Ｗ１８５Ｘ）、３８．８％（ＰＣＣＢ－Ｒ１１１Ｘ）、２２．１％（ＣＢＳ－Ｃ２７５Ｘ）、及び８．０％（ＣＢＳ－Ｗ３９０Ｘ）のＥＧＦＰ陽性細胞が、陽性対照に比較して、それぞれ検出された（図１４Ａ）。次に、疾患遺伝子のＰＴＣリードスルーを、ＲＥＳＴＡＲＴｖ２（ＤＫＣ１アイソフォーム３の過剰発現）について試験した（図１４Ｂ）。ＤＫＣ１アイソフォーム３の過剰発現（ＲＥＳＴＡＲＴｖ２）は、ＲＥＳＴＡＲＴｖ１に比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＴＣリードスルーを示す）の相対的割合を平均で約２．８倍増加させた。ＡＬＤＯＢ－Ｗ１４８Ｘ及びＣＢＳ－Ｗ３９０Ｘを発現する細胞について、ＥＧＦＰ陽性細胞の相対的割合は、図１４Ａ～１４Ｂ中で示されるように、ＤＫＣ１アイソフォーム３つの過剰発現（それぞれ４．８倍及び６．３倍によって）により大きく増加した。

【0259】

ＲＥＳＴＡＲＴは、図１４Ｃ中で示されるように、疾患関連ＰＴＣ ＬＭＮＡ－Ｒ２２５Ｘ（伝導障害を伴う家族性拡張型心筋症（ＤＣＭ）（ＤＣＭ－ＣＤ）と関連）、Ｆ９－Ｙ２２Ｘ及びＦ９－Ｇ２１Ｘ（血友病Ｂと関連）、ＡＢＣＡ４－Ｒ４０８Ｘ（スタルガルト病と関連）、ＲＳ１－Ｙ６５Ｘ（Ｘ連鎖性網膜分離症と関連）、及びＲｐｅ６５－Ｒ４４Ｘ（レーベル先天黒内障と関連）の抑制についてさらに確認された。

【0260】

最終的に、ＲＥＳＴＡＲＴを使用するタンパク質機能の回復を、疾患関連ＰＴＣを含有するＣＦＴＲ ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）遺伝子について実証した。ＣＦＴＲにおける突然変異は、単遺伝子疾患の嚢胞性線維症を引き起こし、白人の生存出生のおよそ１：２５００で発症する。ＲＥＳＴＡＲＴが、ＣＦＴＲ Ｒ５５３Ｘ（ＣＧＡ－ＴＧＡ）ＰＴＣ部位及びＷ１２８２Ｘ（ＴＧＧ－ＴＧＡ）ＰＴＣ部位を修復し、タンパク質機能を回復させる能力を、ＣＦＴＲの機能的なレスキューの評価のための「ゴールドスタンダード」である電気生理学アッセイによって試験した。ＲＥＳＴＡＲＴの送達後に、ＰＴＣを含有するＣＦＴＲの機能を野生型ＣＦＴＲレベルの約３０％までレスキューすることができ、ある特定の単遺伝子疾患の標的化におけるＲＥＳＴＡＲＴの治療能力を示した。

【0261】

実施例７。臨床的に妥当なｇｓｎｏＲＮＡのフォーマットによるＲＥＳＴＡＲＴの送達
この実施例は、細胞へのｇｓｎｏＲＮＡ送達のための機能的なオリゴヌクレオチドのデザイン及び合成を実証する。

【0262】

全長ｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドを、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製した。細胞におけるｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を増加させるために、５’キャップ修飾（ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体）を、ｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドへ添加した。５’キャップ修飾は、内在性イントロンｓｎｏＲＮＡ中に存在しない。一例として、レポーター－２（ｒＡＣＡ１９）を標的化する５’キャップ修飾された全長ｇＡＣＡ１９オリゴヌクレオチドを、インビトロ転写によって調製した（図１５Ａ～Ｃ）。注目すべきことには、ｒＡＣＡ１９は、ｇＡＣＡ１９発現コンストラクトベクターに比較して、ＲＥＳＴＡＲＴｖ１及びＲＥＳＴＡＲＴｖ２の両方についてＰＴＣリードスルーの効率を増加させた（図１５Ｄ；平均値±標準偏差として示されたデータ）。

【0263】

図１５Ｅ中で示されるように、２’－Ｏメチル及びホスホロチオエート連結修飾を備えた化学的に合成されたｒＡＣＡ１９オリゴヌクレオチドの半分を調製し、細胞における効率的なＰＴＣリードスルーを達成する能力について試験した（「Ｐ」はホスホロチオエート連結を示し、「２’Ｏ－メチル」２’Ｏ－メチル修飾ヌクレオシドを示す）。ｇｓｎｏＲＮＡを、トランスフェクションによって細胞へ送達した。

【0264】

有利なことには、ｇｓｎｏＲＮＡオリゴヌクレオチドの半分は、効率的に合成するには長すぎる全長のｇｓｎｏＲＮＡ（約１３０ヌクレオチド）に比較して、化学的合成を促進する。さらに、ｒＨ５及びｒＨ３のオリゴヌクレオチドは、１つのオリゴヌクレオチドあたり、６つのホスホロチオエート連結及び４つの２’Ｏ－メチル修飾のみを備えて合成され、少数の修飾が、化学的に合成されたｇｓｎｏＲＮＡの半分の安定性及び機能を促進するのに十分であると示した。５’ヘアピンコンストラクト（ｇＨ５、Ｈボックス有り）及び３’ヘアピンコンストラクト（ｇＨ３、ＡＣＡボックス有り）は、ＩＶＴによって調製したｇＡＣＡ１９オリゴヌクレオチドに比較して、ＰＴＣリードスルーの効率を低減した。しかしながら、ｒＨ５オリゴヌクレオチド及びｒＨ３オリゴヌクレオチドの両方（それはｇＨ５及びｇＨ３と同じ配列を有する）は、全長ｇＡＣＡ１９コンストラクトに匹敵する効率を呈した（図１５Ｄ）。

【0265】

これらの結果は、インビトロ転写によって調製した全長ＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば安定性を増加させるために５’キャップを備えた）として、または化学合成によって調製した５’ヘアピンもしくは３’ヘアピンを含むオリゴヌクレオチドの半分として、ｇｓｎｏＲＮＡを細胞へ効果的に送達できることを示す。さらに、データから、６つのホスホロチオエート連結及び４つの２’Ｏ－メチル修飾のみを備えた、化学的に合成されたｒＨ３またはｒＨ５が、細胞において安定的且つ機能的であることを実証される。有利なことには、少数の修飾を備えた化学的に合成されたｒＨ３オリゴヌクレオチド及びｒＨ５オリゴヌクレオチドの使用は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを調製する費用を低減することができる。送達されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、同じｇｓｎｏＲＮＡコンストラクトをコードするＤＮＡベクターとして細胞へ送達された同じコンストラクトよりも、良好に機能し得る。

【0266】

参照文献
１．Ｄｉｅｃｉ，Ｇ．，Ｐｒｅｔｉ，Ｍ．＆ Ｍｏｎｔａｎｉｎｉ，Ｂ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｎｏＲＮＡｓ： ａ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９４，８３－８ （２００９）．

【0267】

２．Ｊｏｒｊａｎｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｎｏＲＮＡｏｍｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４，５０６８－８２ （２０１６）．

【0268】

３．Ｇｒｕｂｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｌｏｒｅｎｚ，Ｒ．，Ｂｅｒｎｈａｒｔ，Ｓ．Ｈ．，Ｎｅｕｂｏｃｋ，Ｒ．＆ Ｈｏｆａｃｋｅｒ，Ｉ．Ｌ．Ｔｈｅ Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ ｗｅｂｓｕｉｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６，Ｗ７０－４ （２００８）．

【0269】

４．Ａｎｇｒｉｓａｎｉ，Ａ．，Ｔｕｒａｎｏ，Ｍ．，Ｐａｐａｒｏ，Ｌ．，Ｄｉ Ｍａｕｒｏ，Ｃ．＆ Ｆｕｒｉａ，Ｍ．Ａ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｄｙｓｋｅｒｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８１０，１３６１－８ （２０１１）．

【0270】

５．Ｄａｂｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｂｕｋｏｗｙ－Ｂｉｅｒｙｌｌｏ，Ｚ．＆ Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ，Ｅ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ－－Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １２，９５０－８（２０１５）．

【0271】

６．Ｌｅｉ，Ｚ．＆ Ｙｉ，Ｃ．Ａ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ－Ｆｒｅｅ，ｑＰＣＲ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｌｏｃｕｓ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５６，１４８７８－１４８８２（２０１７）．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図7I】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【配列表】

2024519733000001.app

【国際調査報告】