特表 2024-519799 筋ジストロフィを処置するための組換えＡＡＶベクターの産生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】筋ジストロフィを処置するための組換えＡＡＶベクターの産生

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20240514BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240514BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240514BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20240514BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

A61K38/02

A61K35/76

A61K31/7088

A61K48/00

A61P21/02

C12N15/12

C12N7/02

C12N5/10

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571156

(86)(22)【出願日】2022-05-13

(85)【翻訳文提出日】2024-01-12

(86)【国際出願番号】 US2022029328

(87)【国際公開番号】W WO2022245675

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】63/189,676

(32)【優先日】2021-05-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/209,733

(32)【優先日】2021-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/243,944

(32)【優先日】2021-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/253,998

(32)【優先日】2021-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501237039

【氏名又は名称】サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アラム， マルーフ

(72)【発明者】

【氏名】ロディーノ－クラパック， ルイーズ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA94

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA94

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA94

(57)【要約】

本開示は、ヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子を発現させるために懸濁条件で培養された哺乳動物の接着細胞中で産生された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）などの遺伝子治療ベクターを提供する。また、本開示は、筋ジストロフィ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィなど）を処置するためのこれらのｒＡＡＶの組成物およびその使用方法を提供する。上記ｒＡＡＶは、本明細書中に記載の懸濁シードプロセスによって、懸濁条件で培養された接着細胞から産生され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

懸濁シードプロセスによって哺乳動物接着細胞中で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを産生する方法であって、
（ａ）Ｎ－２コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の成長培地を用いて培養する工程；
（ｂ）前記第１の培地から前記細胞を取り出す工程；
（ｃ）Ｎ－１コンテナ中で、前記工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前記第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；
（ｄ）前記Ｎ－１コンテナ中で前記細胞を懸濁条件下で培養する工程；および
（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に前記工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程
を含む、方法。

【請求項2】

前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ｒＡＡＶが、配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記懸濁シードプロセスが、
（ｆ）前記接着細胞を、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミド、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドでトランスフェクトする工程をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミドが、
配列番号９の核酸配列；
配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１；または
配列番号８のヌクレオチド１～４９７７
を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミドが、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびｒＡＡＶｒｈ７４ｃａｐ遺伝子を含む、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、アデノウイルス５型のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記懸濁シードプロセスが、
（ｇ）前記接着細胞を溶解する工程
をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記接着細胞を、凍結融解、固体せん断、高張および／もしくは低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出し、界面活性剤溶解、またはこれらの組み合わせによって溶解する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記懸濁シードプロセスが、
（ｈ）少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップによって前記ｒＡＡＶを精製する工程
をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップが、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記懸濁シードプロセスが、Ｎ－３コンテナ中で、細胞を、前記第１の成長培地を用いて培養する工程をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記懸濁シードプロセスが、Ｎ－４コンテナ中で、細胞を、前記第１の成長培地を用いて培養する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記バイオリアクターが接着性バイオリアクターである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記ｒＡＡＶを、接着性バイオリアクター中で産生された培養物から精製する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記バイオリアクター中の第３の培地が、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子を含む、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記少なくとも１つの細胞接着を促進する因子が、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外基質のプロテオグリカンまたは非プロテオグリカンポリサッカリド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記バイオリアクター中の第３の培地が、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記接着細胞を、懸濁条件下で約４８～７２時間培養する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記Ｎ－１コンテナが懸濁振盪フラスコである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、およびＣＯＳ細胞からなる群から選択される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ－２９３細胞である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記接着細胞がＨＥＫ－２９３細胞である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記接着細胞が懸濁に適合していない、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞を懸濁条件下で培養する工程が、前記細胞の接着依存性を変化させない、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記培養する工程が、前記細胞を、新規の細胞株を作出するように変化させない、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶが、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法によって作製される、組成物。

【請求項29】

前記組成物が、
ａ）配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子；
ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子；および／または
ｃ）配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ粒子
を含む、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置する方法であって、請求項２９に記載の組成物を前記ヒト被験体に投与する工程を含む、方法。

【請求項31】

前記ｒＡＡＶを、全身投与経路を使用し、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記全身投与経路が静脈内経路であり、前記ｒＡＡＶの投与用量が約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ｒＡＡＶの用量を約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与する、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ｒＡＡＶを、注射、注入、または移植によって投与する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ｒＡＡＶを、およそ１時間にわたって注入によって投与する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ｒＡＡＶを、四肢の末梢静脈を介した静脈内経路によって投与する、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記筋ジストロフィが、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィである、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記筋ジストロフィがデュシェンヌ型筋ジストロフィである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記被験体の細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルが、前記ｒＡＡＶの投与後に前記ｒＡＡＶの投与前の前記マイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルと比較して増加する、請求項３０～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、前記ｒＡＡＶの投与前および投与後に生検を実施した筋肉中のウェスタンブロットによってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記発現が、ｒＡＡＶの投与後に投与前と比較して少なくとも５５．４％である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記被験体の筋肉組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維の平均百分率が、ｒＡＡＶの投与後に、前記ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィン陽性線維数と比較して増加する、請求項３０～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記ｒＡＡＶの投与前および投与後の筋生検において免疫蛍光（ＩＦ）によって検出した場合、前記マイクロ－ジストロフィン陽性線維の平均百分率が少なくとも７０．５％であり、平均強度が少なくとも１１６．９％である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

ベクターゲノムカウントによるマイクロ－ジストロフィン形質導入が、核あたり少なくとも３．８７の平均ベクターゲノムコピー数である、請求項３０～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記組成物を、遺伝子型判定した患者に投与する、請求項３０～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記遺伝子型判定した患者を、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン１８～７９中の少なくとも１つの変異について遺伝子型判定する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記ヒト被験体のＤＭＤ遺伝子を、前記ヒト被験体への前記組成物の投与前に遺伝子型判定する工程をさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項48】

前記遺伝子型判定が、ＤＭＤ遺伝子のエクソン１８～７９中の少なくとも１つの変異を検出する、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記少なくとも１つの変異が、前記ヒトジストロフィンタンパク質が発現しなくなるフレームシフト欠失、フレームシフト重複、未熟終止、または他の病原性バリアントである、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置するための請求項２８または２９に記載の組成物の使用。

【請求項51】

筋ジストロフィの処置のための医薬の製造における請求項２８または２９に記載の組成物の使用。

【請求項52】

前記筋ジストロフィが、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィである、請求項５０または５１に記載の使用。

【請求項53】

前記筋ジストロフィがデュシェンヌ型筋ジストロフィである、請求項５２に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月８日出願の米国仮出願第６３／２５３，９９８号、２０２１年９月１４日出願の米国仮出願第６３／２４３，９４４号、２０２１年６月１１日出願の米国仮出願第６３／２０９，７３３号、および２０２１年５月１７日出願の米国仮出願第６３／１８９，６７６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。
電子的に提出された配列表の参照

【0002】

本出願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表（ファイル名：４１４０＿０５２ＰＣ０４＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：６０，１９４バイト；および作成日：２０２２年５月１３日）の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
分野

【0003】

本開示は、遺伝子治療分野に属する。より具体的には、本開示は、小型化ヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子を発現するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子治療ベクターであって、ここで、ＡＡＶは、懸濁条件で培養された接着細胞から産生される、遺伝子治療ベクターを提供する。また、本開示は、筋ジストロフィを罹患している被験体において、骨格筋（横隔膜および心筋が挙げられる）中でマイクロ－ジストロフィンを発現し、筋線維を傷害から保護し、筋力を増大させ、線維症を軽減および／または予防するためにこれらのベクターを使用する方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

背景
移動および呼吸などの日常活動ならびに全身代謝のために筋肉量および筋力が重要であることには疑いの余地がない。筋機能が欠損すると筋力低下および筋消耗を特徴とする筋ジストロフィ（ＭＤ）を発症し、生活の質に深刻な影響を及ぼす。最もよく特徴づけられたＭＤは、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の変異に起因する。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋線維鞘－細胞骨格係留の喪失に関連する膜脆弱性に起因する。デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、新生男児５，０００人あたり１人が罹患する最も破壊的な筋疾患のうちの１つである。

【0005】

ＤＭＤは、ｍＲＮＡの減少およびジストロフィン（ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する４２７ｋＤ筋線維鞘タンパク質）の不在に至るＤＭＤ遺伝子の変異が原因である（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１：９１９－２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、筋線維鞘において、ジストロフィン、アクチン結合タンパク質、およびアルファ－ジストログリカン（ラミニン結合タンパク質）を介して細胞外基質（ＥＣＭ）と細胞骨格との間に連結構造を形成する複数のタンパク質から構成される。これらの連結構造は、収縮中の筋細胞膜を安定させ、収縮によって誘発される損傷から保護するように作用する。ジストロフィンが喪失すると膜が脆弱になり、その結果、筋線維鞘が裂け、カルシウムが流入し、カルシウム活性化プロテアーゼの作用を誘発し、限局的に線維が壊死する（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０：１６８－７５（１９９７））。この無制御の筋肉の変性および再生サイクルは、最終的に筋幹細胞集団を疲労させ（Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４３：１０５９－１０７１（２０１０）；Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７１：３７－５７（２００９））、その結果、進行性の筋力低下、筋内膜炎症、および線維瘢痕化に至る。
ジストロフィンまたはマイクロ－ジストロフィンに由来する膜安定化がない場合、ＤＭＤは、無制御の組織の損傷および修復サイクルとして発現し、最終的に結合組織の増殖を介して喪失した筋線維が線維性瘢痕組織に置き換わるであろう。線維症は、ＥＣＭ基質タンパク質（コラーゲンおよびエラスチンが挙げられる）の過剰な沈着物を特徴とする。ＥＣＭタンパク質は、主に、ストレスおよび炎症に応答している活性化された線維芽細胞によって放出されるサイトカイン（ＴＧＦβなど）から産生される。ＤＭＤの主な病理学的特徴が筋線維の変性および壊死であるにもかかわらず、病理学的結果としての線維症が及ぼす影響は同等である。線維性組織の過剰産生により、筋再生が制限され、この制限がＤＭＤ患者における進行性の筋力低下に寄与する。１つの研究では、１０年間の追跡において、最初のＤＭＤ筋生検での線維症の存在は、運動能力低下アウトカムと高度に相関した（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６８：７６２－７６７（２００９））。これらの結果は、線維症がＤＭＤ筋機能不全の主な寄与因子であることを示し、明白な線維症を発現する前の早期介入の必要性を際立たせている。
国際公開番号ＷＯ２０１９／２４５９７３Ａ１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ヒト被験体における筋ジストロフィ（例えば、ＤＭＤ）を処置するためのマイクロ－ジストロフィン遺伝子のＡＡＶベクター送達を記載している。しかしながら、かかるＡＡＶベクターの改良された産生方法、特に、かかる遺伝子治療ベクターの大規模製造に好適な方法が当該分野で依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１９／２４５９７３号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１：９１９－２８，１９８７

【非特許文献2】Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０：１６８－７５（１９９７）

【非特許文献3】Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４３：１０５９－１０７１（２０１０）

【非特許文献4】Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７１：３７－５７（２００９）

【非特許文献5】Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６８：７６２－７６７（２００９）

【発明の概要】

【0008】

要旨
本開示は、筋線維を傷害から保護し、筋力を増大させ、線維症を軽減および／または予防するための、骨格筋（横隔膜および心筋が挙げられる）中でヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子を発現する本明細書中に記載の懸濁シードプロセスによって産生された遺伝子治療ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に関する。

【0009】

本開示は、懸濁シードプロセスによって哺乳動物接着細胞中で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを産生する方法であって、（ａ）Ｎ－２コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の成長培地を用いて培養する工程；（ｂ）前述の第１の培地から前述の細胞を取り出す工程；（ｃ）Ｎ－１コンテナ中で、前述の工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前述の第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；（ｄ）前述のＮ－１コンテナ中で前述の細胞を懸濁条件下で培養する工程；および（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程を含む、方法を提供する。

【0010】

いくつかの態様では、本明細書中に記載の方法で使用されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。

【0011】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｆ）前述の接着細胞を、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミド、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドでトランスフェクトする工程をさらに含む。

【0012】

いくつかの態様では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミドは、配列番号９の核酸配列；配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１；または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含む。いくつかの態様では、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミドは、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびｒＡＡＶｒｈ７４ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの態様では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス５型のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。

【0013】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｇ）接着細胞を溶解する工程をさらに含む。いくつかの態様では、接着細胞を、凍結融解、固体せん断、高張および／もしくは低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出し、界面活性剤溶解、またはこれらの組み合わせによって溶解する。

【0014】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｈ）少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップによってｒＡＡＶを精製する工程をさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップは、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはこれらの組み合わせを含む。

【0015】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、Ｎ－３コンテナ中で、細胞を、第１の成長培地を用いて培養する工程をさらに含む。いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、Ｎ－４コンテナ中で、細胞を、第１の成長培地を用いて培養する工程をさらに含む。

【0016】

いくつかの態様では、バイオリアクターは接着性バイオリアクターである。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、接着性バイオリアクター中で産生された培養物から精製する。

【0017】

いくつかの態様では、バイオリアクター中の第３の培地は、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子は、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外基質のプロテオグリカンまたは非プロテオグリカンポリサッカリド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクター中の第３の培地は、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む。

【0018】

いくつかの態様では、接着細胞を、懸濁条件下で約４８～７２時間培養する。

【0019】

いくつかの態様では、Ｎ－１コンテナは懸濁振盪フラスコである。

【0020】

いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、およびＣＯＳ細胞からなる群から選択される。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞はＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、細胞を懸濁条件下で培養する工程は、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、培養する工程は、細胞を、新規の細胞株を作出するように変化させない。

【0021】

また、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含む組成物であって、前述のｒＡＡＶが本明細書中に記載の方法のうちのいずれかによって作製される、組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物は、ａ）配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子；ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子；および／またはｃ）配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ粒子を含む。

【0022】

いくつかの態様では、本開示は、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置するための組成物であって、前述の組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ｒｈ７４ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含み、ここで、ｒＡＡＶは接着細胞中で産生され、接着細胞はＮ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養される、組成物を提供する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列および配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列を含む。

【0023】

いくつかの態様では、組成物は、（ａ）配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ；（ｂ）配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子；（ｃ）配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ；（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子；（ｅ）配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ；および／または（ｆ）配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ粒子を含む。

【0024】

また、本開示は、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置する方法であって、本明細書中に記載のｒＡＡＶを含む組成物を前述のヒト被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、全身投与経路を使用し、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの態様では、全身投与経路は静脈内経路であり、ｒＡＡＶの投与用量は約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。

【0025】

いくつかの態様では、ｒＡＡＶの用量を、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、注射、注入、または移植によって投与する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、およそ１時間にわたって注入によって投与する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、四肢の末梢静脈を介した静脈内経路によって投与する。

【0026】

いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィである。いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィである。

【0027】

いくつかの態様では、被験体の細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルは、ｒＡＡＶの投与後にｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルと比較して増加する。いくつかの態様では、細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、ｒＡＡＶの投与前および投与後に生検を実施した筋肉中のウェスタンブロットによってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。いくつかの態様では、発現は、ｒＡＡＶの投与後に投与前と比較して少なくとも５５．４％である。

【0028】

いくつかの態様では、被験体の筋肉組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維の平均百分率は、ｒＡＡＶの投与後に、ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィン陽性線維数と比較して増加する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶの投与前および投与後の筋生検において免疫蛍光（ＩＦ）によって検出した場合、マイクロ－ジストロフィン陽性線維の平均百分率は少なくとも７０．５％であり、平均強度は少なくとも１１６．９％である。いくつかの態様では、ベクターゲノムカウントによるマイクロ－ジストロフィン形質導入は、核あたり少なくとも３．８７の平均ベクターゲノムコピー数である。

【0029】

いくつかの態様では、組成物を、遺伝子型判定した患者に投与する。いくつかの態様では、患者のヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子を、遺伝子型判定する。いくつかの態様では、遺伝子型判定した患者を、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン１８～７９中の少なくとも１つの変異について遺伝子型判定する。

【0030】

いくつかの態様では、筋ジストロフィを処置する方法は、前述のヒト被験体のＤＭＤ遺伝子を、前述のヒト被験体への前述の組成物の投与前に遺伝子型判定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、遺伝子型判定は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン１８～７９中の少なくとも１つの変異を検出する。いくつかの態様では、少なくとも１つの変異は、ヒトジストロフィンタンパク質が発現しなくなるフレームシフト欠失、フレームシフト重複、未熟終止、または他の病原性バリアントである。

【0031】

また、本開示は、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置するための本明細書中に記載の組成物の使用を提供する。いくつかの態様では、また、本開示は、筋ジストロフィの処置のための医薬の製造における本明細書中に記載の組成物の使用を提供する。

【0032】

いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィである。いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィである。

【図面の簡単な説明】

【0033】

図面の簡単な説明

【図1】図１は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を示す。この構築物では、ｃＤＮＡ発現カセットは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。構築物は、インフレームのロッド欠失（Ｒ４－Ｒ２３）を特徴とし、一方、ヒンジ１、２、および４（Ｈ_１、Ｈ_２、およびＨ_４）ならびにシステインリッチドメインは依然として１３８ｋＤａタンパク質を産生する。マイクロ－ジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）によってガイドされる。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロ－ジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始コドンおよびｍＲＮＡ終結のための小型の５３ｂｐ合成ポリＡシグナルの直前にコンセンサスＫｏｚａｋを有していた。ヒトマイクロ－ジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：２５３－２６１（２００２））によって以前に記載された（Ｒ４－Ｒ２３／Δ７１－７８）ドメインを含んでいた。

【0034】

【図2-1】図２は、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの核酸配列（配列番号３）を提供する。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図2-4】同上。

【0035】

【図3】図３は、ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４ ＡＡＶ ヘルパープラスミドマップを提供する。

【0036】

【図4】図４は、ＡｄヘルパープラスミドｐＨＥＬＰを提供する。

【0037】

【図5】図５は、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロ－ジストロフィンプラスミド構築物を示す。

【0038】

【図6-1】図６は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロ－ジストロフィンの核酸配列（配列番号５）を提供する。

【図6-2】同上。

【図6-3】同上。

【図6-4】同上。

【0039】

【図7】図７は、免疫細胞化学によって測定した場合の腓腹筋生検の筋線維中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子発現を実証する。

【0040】

【図8-1】図８Ａ～８Ｃは、正確な分子量でのマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現を実証しているウェスタンブロットを提供する。図８Ａおよび８Ｂでは、ウェスタンブロット分析により、被験体１（５歳）、被験体２（４歳）、および被験体３（６歳）においてマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現が検出された。図８Ｃでは、被験体４の試料（＊）を、最初の分析でＵＬＤＱ（８０％超）を超えたので１：４（線形範囲まで）に希釈し、正常と比較する最終値を得るために、平均値に希釈補正係数を乗じた。正常に対する平均マイクロ－ジストロフィン発現は、方法１において１８２．７％および方法２において２２２．０％であった。

【図8-2】同上。

【図8-3】同上。

【0041】

【図9-1】図９Ａ～９Ｃは、被験体１（図９Ａ）、被験体２（図９Ｂ）、および被験体３（図９Ｃ）においてｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンがＤＡＰＣタンパク質（アルファ－サルコグリカンおよびベータ－サルコグリカン）の発現を上方制御することを実証している。

【図9-2】同上。

【図9-3】同上。

【0042】

【図10】図１０は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを投与した場合のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）値の持続的な劇的低下を示すグラフを提供する。

【0043】

【図11】図１１は、２７０日目までのベースラインからの平均クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の変化を示すグラフを提供する。このデータは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に経時的にＣＫが有意に減少したことを実証している。

【0044】

【図12】図１２は、２７０日目までのベースラインからの平均ＮＳＡＡの変化および平均ＣＫの変化を示すグラフを提供する。このデータは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に経時的にＮＳＡＡが有意に増加したことを実証している。

【0045】

【図13】図１３は、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物の４９７７塩基の核酸配列（配列番号９）を提供する。以下に分子エレメントを説明する：５’ＩＴＲ（塩基１～１４５）；ＭＨＣＫ７プロモーター（１９０～９８１（７９２塩基））；イントロン（９９１～１１４０（１５０塩基））；ヒトマイクロ－ジストロフィン配列（１１５１～４７２９（３５７９塩基））；ポリＡテール（４７３２～４７８４（５３塩基））；および３’ＩＴＲ（４８３３～４９７７（１４５塩基））。

【0046】

【図14】図１４は、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンプラスミド構築物を示す。

【0047】

【図15-1】図１５は、カナマイシン耐性遺伝子を含むＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンプラスミド構築物の核酸配列（配列番号８）を提供する。

【図15-2】同上。

【図15-3】同上。

【図15-4】同上。

【0048】

【図16】図１６は、本明細書中に記載のハイブリッドシードトレイン拡大法の視覚的表示である。

【0049】

【図17】図１７は、本明細書中に記載のハイブリッドシードトレイン拡大法を使用したＡＡＶ粒子産生の視覚的表示である。

【0050】

【図18】図１８Ａ～１８Ｂは、本明細書中に開示のハイブリッドシードトレイン拡大法に従って培養した場合（図１８Ａ）および接着条件下のみで培養した場合（図１８Ｂ）のＨＥＫ－２９３細胞の生存能を示すグラフを提供する。

【0051】

【図19】図１９Ａ～１９Ｂは、本明細書中に開示のハイブリッドシードトレイン拡大法に従って培養した場合（図１９Ａ）および接着条件下のみで培養した場合（図１９Ｂ）のＨＥＫ－２９３細胞の生存細胞密度を示すグラフを提供する。

【0052】

【図20】図２０は、実施例７に記載のコホート１（ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンで処置した第１の１１人の患者）由来の平均ＮＳＡＡスコアを示すグラフである。第１の１１人の患者は、ベースラインから３ポイント改善した。６～７歳（ｎ＝９）では、ベースラインから２．９ポイント改善した。各時点は、１１人の患者を示す。

【0053】

【図21】図２１Ａ～２１Ｃは、実施例１１で考察するように、生理食塩水（図２１Ａ）と比較した、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の１２週間後（図２１Ｂ）および２４週間後（図２１Ｃ）のＤＭＤ^ｍｄｘラットの骨格筋および心筋中のマイクロ－ジストロフィンの発現（免疫蛍光）を実証する。略語：ＬＴＡ＝左前脛骨筋；ＨＲＴ＝心臓。

【0054】

【図22】図２２Ａ～２２Ｂは、実施例１１で考察するように、デランディストロゲンモキセパルボベック（ｄｅｌａｎｄｉｓｔｒｏｇｅｎｅ ｍｏｘｅｐａｒｖｏｖｅ）での処置の１２週間後および２４週間後のＤＭＤ^ｍｄｘラットの筋組織中のマイクロ－ジストロフィン発現（免疫蛍光）（図２２Ａ）およびベクター形質導入（ベクターゲノムコピー数）（図２２Ｂ）の定量を示す棒グラフである。略語：ＴＡ＝脛骨筋；ＨＲＴ＝心臓；ＭＧ＝内側腓腹筋；ＬＧ＝外側内側腓腹筋；ＤＩＡ＝横隔膜；ＴＲＩ＝三頭筋；ＰＳＯ＝大腰筋。

【0055】

【図23】図２３Ａ～２３Ｂは、実施例１１で考察するように、生理食塩水と比較した、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の１２週間後および２４週間後のＤＭＤ^ｍｄｘラットにおける歩行（図２３Ａ）および立ち上がり行動（図２３Ｂ）の増加を示す棒グラフである。活動ケージ中でのラットの運動（歩行および立ち上がり行動）を、１時間あたりのレーザー光線の遮断数によって測定した。各ポイントは、各動物についての値を示す。データを平均±ＳＤとして報告する；^＊＊＊＝ｐ＜０．００１；^＊＊＝ｐ＜０．０１。ＳＤ＝標準偏差。

【0056】

【図24-1】図２４Ａ～２４Ｂは、実施例１１で考察するように、生理食塩水と比較して、ＤＭＤ^ｍｄｘラットにおけるデランディストロゲンモキセパルボベック遺伝子導入の１２週間後および２４週間後の骨格筋における中心核形成分析によって筋肉変性が有意に軽減したこと示す。図２４Ａは、腓腹筋のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。図２４Ｂは、中心核を有する線維の百分率を示す棒グラフである。バーを平均±ＳＤとして報告する；^＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＳＤ＝標準偏差。

【図24-2】同上。

【0057】

【図25-1】図２５Ａ～２５Ｂは、実施例１１で考察するように、生理食塩水と比較して、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の１２週間後および２４週間後にＤＭＤ^ｍｄｘラットにおいて線維症の軽減を示す、骨格筋および心筋中のコラーゲン沈着の分析を示す。図２５Ａは、処置１２時間後のマッソントリクローム（Ｔｒｉｃｈｏｍｅ）染色を示す。図２５Ｂは、処置の１２週間後および２４週間後についての骨格筋および心筋中のコラーゲン沈着を定量した棒グラフを提供する。略語：ＨＲＴ＝心臓；ＭＧ＝内側腓腹筋；ＤＩＡ＝横隔膜。データを平均±ＳＤとして報告する；^＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１；^＊＝ｐ＜０．０５。ＳＤ＝標準偏差。

【図25-2】同上。

【0058】

【図26】図２６は、実施例１１で考察するように、生理食塩水と比較して、血中の血清トロポニンＩレベルが、ＤＭＤ^ｍｄｘラットにおけるデランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の１週間後および１２週間後に有意に変化しないことを示す棒グラフである。バーは、平均＋ＳＤを示す。各ポイントは、各動物についての値を示す。

【0059】

【図27】図２７Ａ～２７Ｃは、実施例１１で考察するように、生理食塩水と比較して、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の２４週間後のＤＭＤ^ｍｄｘラットにおける心エコー検査法によって決定された心機能を分析している棒グラフである。図２７Ａは、左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）についてのデータを示す。図２７Ｂは、駆出率（％）（ＥＦ）についてのデータを示す。図２７Ｃは、短縮率（％）（ＦＳ）についてのデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0060】

詳細な説明
本開示は、ヒトマイクロ－ジストロフィンを発現する遺伝子治療ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）であって、ｒＡＡＶが哺乳動物の接着細胞中に産生され、接着細胞がＮ－１コンテナ中で懸濁条件下にて培養される、遺伝子治療ベクターを提供する。

【0061】

本開示は、懸濁シードプロセスによって哺乳動物接着細胞中で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを産生する方法であって、（ａ）Ｎ－２コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の成長培地を用いて培養する工程；（ｂ）前述の第１の培地から前述の細胞を取り出す工程；（ｃ）Ｎ－１コンテナ中で、前述の工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前述の第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；（ｄ）前述のＮ－１コンテナ中で前述の細胞を懸濁条件下で培養する工程；および（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程を含む、方法を提供する。

【0062】

また、本開示は、本明細書中に開示のｒＡＡＶを含む組成物（例えば、医薬組成物）および本明細書中に開示の組成物を使用して筋ジストロフィ（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法を提供する。

【0063】

ＤＭＤ診断の最初期に行った筋生検において顕著な結合組織増殖が明らかである。筋線維症は、多くの場合に有害である。筋線維症は、結合組織バリアを介した筋内膜の栄養素の正常な通過を減少させ、血流を減少させ、筋肉から血管由来の栄養成分を奪い、四肢拘縮による早期の歩行不能に機能的に寄与する。顕著な筋線維症の結果として、長期間の複数回の処置が試みられる。これを、連続した時点で結合組織増殖を比較する筋生検において観察することができる。この過程は悪化し続け、歩行不能に至り、特に車椅子使用者において制御不能が加速する。

【0064】

線維症を軽減するための並行アプローチを含む早期処置を行わない場合、エクソンスキッピング、終止コドンリードスルー、または遺伝子置換治療の利点を完全に得ることができる可能性は低い。小分子またはタンパク質の置換ストラテジーでさえも、筋線維症を軽減するためのアプローチを使用しない場合に失敗する可能性が高い。ＡＡＶ．マイクロ－ジストロフィンで処置した既存の線維症を有する老齢ｍｄｘマウスにおける以前の研究において、本発明者らが完全な機能回復を達成できなかったことが実証された（Ｌｉｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１：２４５－２５６（２００５））。ＤＭＤ心筋症の進行には心室壁中の瘢痕および線維症を伴うことも公知である。
定義

【0065】

別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。矛盾がある場合、定義を含む本出願を優先するであろう。文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0066】

本開示を通して、用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、１またはそれを超える実体を指す；例えば、「ポリヌクレオチド」は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドを示すと理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１またはそれを超える」、および「少なくとも１つの」は、本明細書中で互換的に使用され得る。

【0067】

さらに、本明細書中で使用される「および／または」は、２つの指定した特徴または構成要素の各々の、他の特徴または構成要素を含むか含まない具体的開示と解釈されるものとする。従って、本明細書中の「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）が含まれることが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される用語「および／または」は、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

【0068】

用語「約」を、およそ、大体、おおよそ、またはその領域内を意味するために本明細書中で使用する。用語「約」を数値範囲と併せて使用する場合、これは、記載した数値の上下の境界を拡大することによってその範囲を修正する。別段の指示がない限り、一般に、用語「約」は、本明細書中で、記載した値の上下１０パーセントのばらつきに数値を修正する（上げるまたは下げる（より高くするまたはより低くする））ために使用される。

【0069】

１つの数値または一連の数値の前の「少なくとも」という用語は、文脈から明確な場合、用語「少なくとも」に隣接する数値、および論理的に含まれ得る全ての後続の数値または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチド数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチドの核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドが表示の性質を有することを意味する。一連の数値または範囲の前に少なくともが存在する場合、「少なくとも」が一連の数値または範囲中の各々の数値を修飾することができると理解される。また、「少なくとも」は、整数に制限されない（例えば、「少なくとも５％」には、有効数字の数値を考慮することなく、５．０％、５．１％、５．１８％が含まれる）。

【0070】

具体的に他の意味を示さない限り、本明細書中ではヌクレオチド配列を右から左に５’から３’への方向で一本鎖のみを示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸を、本明細書中では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する様式で、または（アミノ酸については）一文字表記または三文字表記のいずれかによって、共に連邦規則集３７編§１．８２２および確立された用法にしたがって示す。

【0071】

本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ホスホジエステル結合によって連結したヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドを、本明細書中では、５’から３’の方向で示す。本開示のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。ヌクレオチド塩基を、本明細書中で、以下の一文字表記によって示す：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、およびウラシル（Ｕ）。

【0072】

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

【0073】

用語「コード配列」または「コードする」配列を、本明細書中で、特定のタンパク質（例えば、インスリンまたはグルコキナーゼなど）を「コードする」ＤＮＡ領域またはＲＮＡ領域（転写された領域）を意味するために使用する。コード配列は、適切な調節領域（プロモーターなど）の調節下に置かれた場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ＲＮＡ）。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物または真核生物由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物由来のゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列を挙げることができるが、これらに限定されない。転写終結配列を、コード配列の３’側に配置することができる。

【0074】

遺伝子は、いくつかの作動可能に連結された断片（プロモーター、５’リーダー配列、イントロン、コード配列、および３’非翻訳配列（例えば、ポリアデニル化部位またはシグナル配列を含む）など）を含むことができる。本明細書中で使用される場合、「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写され、そして／または活性タンパク質に翻訳される過程を指す。

【0075】

本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に配置された１またはそれを超える遺伝子（またはコード配列）の転写を調節するように機能する核酸配列または断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および任意の他のＤＮＡ配列（転写因子結合部位、サプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写量を直接または間接的に制御することが当業者に公知の任意の他のヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない）の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的条件および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的条件および発生条件に依存して制御されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の分化細胞／組織型で優先的に活性である。

【0076】

本明細書中で使用される場合、用語「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用エレメントである。また、転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも称される。エンハンサーは、コード配列および転写領域の下流の位置から数キロベース対（ｋｂ）までの距離にわたっていずれかの方向で機能することができる（例えば、コード配列と会合することができる）。

【0077】

用語「作動可能に連結された」は、制御エレメントのヌクレオチド配列（例えば、プロモーターのヌクレオチド配列）の、前述の制御エレメントによって前述のヌクレオチド配列を発現させるための位置決めを指す。

【0078】

本明細書中で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、細胞に移入される遺伝子（例えば、マイクロ－ジストロフィン）または核酸分子を指す。導入遺伝子の一例は、治療ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの態様では、遺伝子は存在することができるが、いくつかの場合、遺伝子は、細胞中で正常に発現されないか、不十分なレベルで発現される。この文脈では、「不十分な」は、前述の遺伝子が細胞中で正常に発現されるが、症状および／または疾患を依然として発症し得ることを意味する。ある特定の態様では、導入遺伝子は、遺伝子の発現を増加させるか過剰に発現させることが可能である。導入遺伝子は、細胞に由来する配列を含むことができるか、細胞中に天然に存在しない配列を含むことができるか、両方の組み合わせを含むことができる。ある特定の態様では、導入遺伝子は、遺伝子発現に適切な制御配列に作動可能に連結することができる配列を含むことができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれない。

【0079】

本明細書中で使用される場合、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染しているヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供された細胞中でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、ＡＡＶは、１３種類の血清型が特徴づけられている。ＡＡＶの一般的な情報および概説を、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。しかしながら、種々の血清型が、遺伝子レベルにおいてさえも構造および機能の両方において極めて密接に関連していることが周知であるので、これらの同一の原理を追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることは十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．；およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を見かけ上示す；全てが、３つの関連するキャプシドタンパク質（ＡＡＶ２中で発現するものなど）を保有する。この類似度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広域の交差ハイブリッド形成；および「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端での類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二重鎖分析によってさらに示唆される。また、類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の制御管理下にあることを示唆している。

【0080】

本明細書中で使用される場合、用語「アデノ随伴ベクター」または「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する１またはそれを超える目的のポリヌクレオチド（またはマイクロ－ジストロフィンなどの導入遺伝子）を含むベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物をコードして発現するベクターでトランスフェクトされている宿主細胞中に存在するときに複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。

【0081】

本明細書中で使用される場合、用語「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド形成したポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、この粒子は、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単純に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生は、必然的に、ＡＡＶベクターの産生を含む。そのようなものとして、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含まれる。

【0082】

用語「筋特異的調節エレメント」は、筋組織中の発現に特異的なコード配列の発現を制御するヌクレオチド配列を指す。これらの調節エレメントとしては、エンハンサーおよびプロモーターが挙げられる。本開示は、筋特異的調節エレメントであるＭＣＫＨ７プロモーター、ＭＣＫプロモーター、およびＭＣＫエンハンサーを含む構築物を提供する。

【0083】

「筋肉細胞」または「筋組織」は、任意の種類の筋肉（例えば、骨格筋および平滑筋（例えば、消化管、膀胱、血管、または心組織に由来する））由来の細胞または細胞群を意味する。かかる筋肉細胞は、分化または未分化であり得る（筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、および心筋芽細胞など）。

【0084】

本明細書中で使用される場合、用語「形質導入」は、レシピエント細胞によってマイクロ－ジストロフィンを発現する、本開示の複製欠損性ｒＡＡＶを介したｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでのマイクロ－ジストロフィンのコード領域のレシピエント細胞への投与／送達を指す。

【0085】

本明細書中で使用される場合、細胞の「トランスフェクション」という用語は、細胞を遺伝的に改変する目的で遺伝子材料を細胞に移入することを意味する。トランスフェクションを、当該分野で公知の種々の手段（例えば、形質導入またはエレクトロポレーション）によって行うことができる。

【0086】

本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。「組換え」は、自然界で一般に見出されるものと異なることを意味する。

【0087】

ベクターまたはウイルスキャプシドに関する「血清型」は、キャプシドタンパク質配列およびキャプシド構造に基づいた免疫学的プロファイルの相違によって定義される。

【0088】

「ＡＡＶ Ｃａｐ」は、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、ならびにそのアナログを意味する。

【0089】

「ＡＡＶ Ｒｅｐ」は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはそのアナログを意味する。

【0090】

本明細書中で使用される場合、他のエレメントに隣接する配列に関する「隣接する」は、配列に対して上流側および／または下流側（すなわち、５’側および／または３’側）の１またはそれを超える隣接エレメントの存在を示す。用語「隣接する」は、配列が必ず連続していることを示すことを意図しない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接エレメントの間に介在配列が存在し得る。２つの他のエレメント（例えば、ＩＴＲ）に「隣接する」配列（例えば、導入遺伝子）は、一方のエレメントが配列に対して５’側に配置されており、他方が配列に対して３’側に配置されていること示す；しかしながら、間に介在配列が存在してよい。

【0091】

本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子治療」は、疾患または症状を処置するための核酸配列（例えば、導入遺伝子（例えば、マイクロ－ジストロフィン）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸）の、個体の細胞および／または組織への挿入を指す。かかる導入遺伝子は、外因性であり得る。外因性の分子または配列は、処置すべき細胞、組織、および／または個体中に通常は存在しない分子または配列であると理解される。

【0092】

本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子型判定」は、ゲノム内の１またはそれを超える位置で細胞および／または被験体の特異的対立遺伝子の組成を、例えば、その位置での核酸配列の決定によって決定するプロセスを指す。遺伝子型判定は、核酸分析および／または核酸レベルでの分析を指す。いくつかの態様では、被験体のヒトジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）を、本明細書中に開示の組成物を用いた処置が特に実現可能と考えられる遺伝子の変異を特徴づけるために遺伝子型判定する。多数の遺伝子型判定技術が当業者に公知である。

【0093】

用語「ストリンジェントな」を、当該分野で一般的にストリンジェントと理解される条件を指すために使用する。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、温度、イオン強度、および変性剤（ホルムアミドなど）の濃度によって主に決定される。ハイブリッド形成および洗浄についてのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（６５～６８℃）または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド（４２℃）である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）も使用してよいが、しかしながら、ハイブリッド形成率に影響を及ぼすであろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を考慮する場合、追加の例示的なストリンジェントなハイブリッド形成条件には、３７℃（１４塩基オリゴ用）、４８℃（１７塩基オリゴ用）、５５℃（２０塩基オリゴ用）、および６０℃（２３塩基オリゴ用）での６×ＳＳＣ（０．０５％ピロリン酸ナトリウム含有）中の洗浄が挙げられる。非特異的および／またはバックグラウンドハイブリッド形成を軽減する目的で、他の薬剤をハイブリッド形成緩衝液および洗浄緩衝液に含めてもよい。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、ｆｉｃｏｌｌ、デンハルト溶液、超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の好適な薬剤も使用することができる。これらの添加物の濃度および型を、ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変化させることができる。ハイブリッド形成実験を、通常はｐＨ６．８～７．４で行うが、しかしながら、典型的なイオン強度条件では、ハイブリッド形成率は、ｐＨにほぼ依存する。Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９８）を参照のこと。当業者は、ハイブリッド形成条件を、これらの変動に適合し、配列関連性が異なるＤＮＡとのハイブリッド形成を可能にするために調整することができる。

【0094】

本明細書中で使用される場合、用語「培地（ｍｅｄｉａ）」、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「細胞培養培地」、「培養培地」、「組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」、「組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」、および「成長培地」は、成長中の培養真核細胞に栄養を与える栄養素を含む溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最小限の成長および／または生存のために細胞が必要とする必須および非必須のアミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および微量元素を提供する。また、溶液は、最小の速度を超える成長および／または生存を増強する構成要素（ホルモンおよび成長因子が挙げられる）を含むことができる。溶液は、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に配合される。また、培地は、「限定培地」または「既知組成培地」（タンパク質、加水分解物、未知の組成物の構成要素を含まない無血清培地）であり得る。限定培地は、動物由来の構成要素を含まず、全ての構成要素が既知の化学構造を有する。当業者は、限定培地が組換え糖タンパク質またはタンパク質（例えば、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、および他のシグナル伝達分子が挙げられるが、これらに限定されない）を含むことができると理解する。

【0095】

本明細書中で使用される場合、用語「基本培地調合物」または「基本培地」は、補足やある特定の構成要素の選択的除去のいずれによっても改変されていない、細胞培養のために使用される任意の細胞培養培地を指す。

【0096】

本明細書中で使用される場合、用語「培養物」、「細胞培養物」、および「真核細胞培養物」は、真核細胞集団の生存および／または成長に好適な条件下にて培地中で維持されたか成長した、表面に付着しているか（すなわち、接着性）懸濁液中のいずれかの真核細胞集団を指す。当業者に明白なように、本明細書中で使用されるこれらの用語は、哺乳動物細胞集団と集団が懸濁された培地とを含む組み合わせを指すことができる。

【0097】

本明細書中で使用される場合、用語「回分培養」は、細胞培養において最終的に使用される全ての構成要素（培地および細胞自体が挙げられる）が、培養過程の開始時に提供される細胞培養方法を指す。回分培養を、典型的には、いくつかの時点で停止し、培地中の細胞および／または構成要素を採取し、必要に応じて精製する。

【0098】

本明細書中で使用される場合、用語「流加培養」は、培養過程開始後のいくつかの時点で追加の構成要素を培養物に提供する細胞培養方法を指す。流加培養を、基本培地を使用して開始することができる。培養過程開始後のいくつかの時点で追加の構成要素を培養物に提供する培養培地は、フィード培地である。提供される構成要素は、典型的には、培養過程中に枯渇した細胞のための栄養補給剤を含む。流加培養を、典型的には、いくつかの時点で停止し、培地中の細胞および／または構成要素を採取し、必要に応じて精製する。

【0099】

本明細書中で使用される場合、用語「灌流培養」は、培養過程開始後に追加の構成要素を連続的または半連続的に培養物に提供する細胞培養方法を指す。提供される構成要素は、典型的には、培養過程中に枯渇した細胞のための栄養補給剤を含む。培地中の細胞および／または構成要素の一部を、典型的には連続的または半連続的に採取し、必要に応じて精製する。

【0100】

細胞培養の「増殖期」は、細胞が一般に急速に分裂する指数関数的細胞成長期（対数期）を指す。この期の間、細胞を、一定期間（通常は、１～４日間）、細胞成長が最大になるような条件下で培養する。宿主細胞の成長周期を、過度の実験を行うことなく予想される特定の宿主細胞について決定することができる。「細胞成長が最大になる期間およびかかる条件下」などは、特定の細胞株について細胞の成長および分裂に最適であると決定される培地条件を指す。いくつかの態様では、増殖期中、細胞を、特定の細胞株が最適に成長するように、必要な添加物を含む栄養培地中にて、一般に、約２５℃～４０℃の加湿された制御雰囲気下で培養する。

【0101】

いくつかの態様では、細胞を、およそ１日間と７日間との間の期間（例えば、２日間と６日間の間、例えば、６日間）、増殖期で維持する。特定の細胞のための増殖期の長さを、過度の実験を行うことなく決定することができる。例えば、増殖期の長さは、培養物が成長条件下に維持された場合に可能な限り最大の生存細胞密度の約２０％～８０％の範囲内の生存細胞密度に特定の細胞を再生するのに十分な期間であろう。いくつかの態様では、「最大成長速度」は、特異的な細胞株／クローンの、細胞が新鮮な培養培地に存在する間のその指数関数的増殖期に測定された（例えば、栄養素が十分に存在し、かつ培養物の任意の構成要素に由来するいかなる有意な成長阻害も存在しない場合の培養中のある時点で測定された）成長速度を指す。

【0102】

本明細書中で使用される場合、用語「細胞生存能」は、所与の一連の培養条件または多様な実験条件下にて培養物中で細胞が生存する能力を指す。また、本明細書中で使用されるこの用語は、特定の時点での培養物中の生細胞および死細胞の総細胞数に対するその時点で生存している細胞の部分を指す。

【0103】

本明細書中で使用される場合、用語「細胞密度」は、所与の培地体積中に存在する細胞数を指す。

【0104】

本明細書中で使用される場合、用語「バイオリアクター」または「培養容器」は、哺乳動物細胞培養物の成長のために使用される任意の容器を指す。バイオリアクターは、哺乳動物細胞の培養に有用である限り、任意のサイズであり得る。

【0105】

本明細書中で使用される場合、用語「バイオリアクターの運転」は、細胞培養サイクル中の誘導期、対数期、またはプラトー期の成長期のうちの１つまたは複数を含むことができる。

【0106】

本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ－ｌ培養容器」、「Ｎ－ｌシードトレイン培養容器」、「Ｎ－ｌ容器」、「Ｎ１－培養」、または「Ｎ１コンテナ」は、Ｎ培養容器（製造培養容器）の直前の培養容器を指し、その後のＮ（製造）培養容器への接種のために高い生存細胞密度まで細胞培養物を成長させるために使用される。Ｎ－ｌ培養容器中で成長させる細胞培養物を、Ｎ－ｌ培養容器前のいくつかの容器（Ｎ－４、Ｎ－３、およびＮ－２容器など）中での細胞培養後に得てもよい。

【0107】

本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ培養容器」、「製造培養容器」、「Ｎ容器」、「Ｎバイオリアクター」、または「製造バイオリアクター」は、Ｎ－ｌバイオリアクター後のバイオリアクター中の細胞培養物を指す。Ｎ培養物を、ＡＡＶの産生で使用する。

【0108】

本明細書中で使用される場合、用語「播種」または「接種」は、細胞培養物をバイオリアクターまたは別の容器に提供する過程を指す。１つの態様では、細胞は、別のバイオリアクターまたは容器中で事前に増殖されている。別の態様では、細胞は、バイオリアクターまたは容器への提供直前に凍結融解されている。この用語は、任意の数の細胞（単一細胞が挙げあられる）を指す。
ｒＡＡＶおよびｒＡＡＶ（またはｒＡＡＶを含む組成物）（例えば、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン）の産生方法

【0109】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを含む組成物であって、ここで、ｒＡＡＶが哺乳動物接着細胞中で産生され、接着細胞がＮ－１コンテナ中、懸濁条件下で培養される、組成物を提供する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４（例えば、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン）のｒＡＡＶである。

【0110】

また、本開示は、懸濁シードプロセスによって哺乳動物接着細胞中で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを産生する方法であって、（ａ）Ｎ－２コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の成長培地を用いて培養する工程；（ｂ）前述の第１の培地から前述の細胞を取り出す工程；（ｃ）Ｎ－１コンテナ中で、前述の工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前述の第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；（ｄ）前述のＮ－１コンテナ中で前述の細胞を懸濁条件下で培養する工程；および（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程を含む方法、を提供する：

【0111】

いくつかの態様では、本明細書中に記載の方法で使用されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。

【0112】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｆ）前述の接着細胞を、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミド、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドでトランスフェクトする工程をさらに含む。

【0113】

いくつかの態様では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミドは、配列番号９の核酸配列；配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１；または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含む。いくつかの態様では、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミドは、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびｒＡＡＶｒｈ７４ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの態様では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス５型のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。

【0114】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｇ）接着細胞を溶解する工程をさらに含む。いくつかの態様では、接着細胞を、凍結融解、固体せん断、高張および／もしくは低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出し、界面活性剤溶解、またはこれらの組み合わせによって溶解する。

【0115】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｈ）少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップによってｒＡＡＶを精製する工程をさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップは、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはこれらの組み合わせを含む。

【0116】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、Ｎ－３コンテナ中で、細胞を、第１の成長培地を用いて培養する工程をさらに含む。いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、Ｎ－４コンテナ中で、細胞を、第１の成長培地を用いて培養する工程をさらに含む。

【0117】

いくつかの態様では、バイオリアクターは接着性バイオリアクターである。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、接着性バイオリアクター中で産生された培養物から精製する。

【0118】

いくつかの態様では、バイオリアクター中の第３の培地は、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子は、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外基質のプロテオグリカンまたは非プロテオグリカンポリサッカリド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクター中の第３の培地は、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む。

【0119】

いくつかの態様では、接着細胞を、懸濁条件下で約４８～７２時間培養する。

【0120】

いくつかの態様では、Ｎ－１コンテナは懸濁振盪フラスコである。

【0121】

いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、およびＣＯＳ細胞からなる群から選択される。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞はＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、細胞を懸濁条件下で培養する工程は、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、培養する工程は、細胞を、新規の細胞株を作出するように変化させない。

【0122】

いくつかの態様では、哺乳動物接着細胞中でｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを産生するために使用される懸濁シードプロセスは、以下を含む：
（ａ）Ｎ－２コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の成長培地を用いて培養する工程；
（ｂ）前述の第１の培地から前述の細胞を取り出す工程；
（ｃ）Ｎ－１コンテナ中で、前述の工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前述の第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；
（ｄ）前述のＮ－１コンテナ中で前述の細胞を懸濁条件下で培養する工程；
（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程、
（ｆ）前述の細胞を、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミド、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドでトランスフェクトする工程、
（ｇ）前述の細胞を溶解する工程、および
（ｈ）少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップによってｒＡＡＶを精製する工程。

【0123】

いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、国際公開番号ＷＯ２０１９／２４５９７３Ａ１号（その全体が本明細書中で参考として明確に援用される）に記載されている。

【0124】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損性パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂ長であり、１４５個のヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む）。ＡＡＶには複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５－５６４（１９８３）に示されている（Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正済み）。他の例として、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されている；ＡＡＶ－３の全ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されている；ＡＡＶ－４の全ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されている；ＡＡＶ－５ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されている；ＡＡＶ－６の全ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００ １８６２に提供されている；ＡＡＶ－７ゲノムおよびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されている（ＡＡＶ－８に関しては米国特許第７，２８２，１９９号および同第７，７９０，４４９号も参照のこと）；ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されている；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されている；ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用配列は、ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（マップ上の相対的な位置からｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部読み取り枠の発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７および２２２７での）の差異的スプライシングと連動して、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）を産生する。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製を担う複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。オルタナティブスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の産生を担う。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。

【0125】

ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療で外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の特徴を保有している。培養細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物への自然感染は無症状かつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的にすることが可能である。さらに、ＡＡＶは分裂速度の遅い細胞および非分裂細胞に形質導入し、転写活性を示す核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的に前述の細胞の生涯にわたって存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性を示すため、組換えゲノムの構築が可能になる。さらに、ＡＡＶの複製、ゲノムのキャプシド形成、および組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノム内部のおよそ４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつかまたはすべては、プロモーター、目的のＤＮＡ、およびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットなどの外来ＤＮＡと置換され得る。ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質はトランスで提供されてもよい。ＡＡＶの別の重要な特徴は、非常に安定した頑強なウイルスであることである。ＡＡＶはアデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６℃から６５℃で数時間）に容易に耐えるため、ＡＡＶの冷蔵保存の重要性は低くなる。ＡＡＶは凍結乾燥さえも可能である。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は重複感染に耐性を示さない。

【0126】

複数の研究により、筋肉における長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：６５９－６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ ９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）；およびＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照のこと。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２：６１９－６２３（２０００）ａｎｄ Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４：２１７－２２２（２００１）も参照のこと。さらに、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：５８０４－５８０９（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載のように、筋肉は高度に血管新生しているので、組換えＡＡＶ形質導入により、筋肉内注射後の体循環中に導入遺伝子産物が出現した。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が抗体の正しいグリコシル化、折り畳み、および分泌に必要な細胞因子を保有していることを実証しており、これは筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示している。

【0127】

本開示の組換えＡＡＶゲノムは、本開示の核酸分子および核酸分子に隣接する１またはそれを超えるＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３が挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得る。シュードタイプ化ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント（例えば、キャプシド変異を有するｒＡＡＶ）も意図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照のこと。上記の背景の節で述べたように、種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。

【0128】

本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染が許容され得る細胞に導入される。パッケージングすべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生には、以下の構成要素が単一細胞（本明細書中ではパッケージング細胞として示される）内に存在することが必要である：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個の（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中にはない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型に由来してよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してよい。これらの血清型には、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３が挙げられるが、これらに限定されない。シュードタイプ化ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。

【0129】

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要なすべての構成要素を安定に発現する細胞株を作出することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）を、細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ ７９：２０７７－２０８１（１９８２）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２３：６５－７３（１９８３））などの手順によるか、直接の平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：４６６１－４６６６（１９８４））によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適なことである。適切な方法の他の例は、プラスミドよりもむしろアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。

【0130】

ｒＡＡＶ産生の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５３３－５３９（１９９２）；およびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。種々のアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３（１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２－３８２８（１９８９）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５号および対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２号；ＷＯ９６／１７９４７号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号；ＷＯ９７／０９４４１号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号）；ＷＯ９７／０８２９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号）；ＷＯ９７／２１８２５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号）；ＷＯ９７／０６２４３号（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号）；ＷＯ９９／１１７６４号；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０（１９９５）；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；ならびに米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、その全体が本明細書中で参考として援用され、ｒＡＡＶ産生に関する文書の節に特に重点を置いている。

【0131】

したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。１つの態様では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの安定に形質転換された癌細胞であり得る。別の態様では、パッケージング細胞は、形質転換癌細胞ではない細胞（継代数の低い２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）など）である。

【0132】

本開示の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性キャプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な態様では、両方のｒＡＡＶのゲノムはＡＡＶｒｅｐＤＮＡおよびＡＡＶｃａｐＤＮＡを欠いている（すなわち、ゲノムのＩＴＲの間にＡＡＶｒｅｐＤＮＡまたはＡＡＶｃａｐＤＮＡが存在しない）。本開示の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２号）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

【0133】

例示的な態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクタープラスミドであるｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン、ｐＮＬＲｅｐ２－Ｃａｐｒｈ７４、およびｐＨＥＬＰを使用するトリプルトランスフェクション法（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：２２２４－２２３２（１９９８））によって産生される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するマイクロ－ジストロフィン遺伝子発現カセットを含む。ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにキャプシド化されるのはこの配列である。プラスミドは、マイクロ－ジストロフィン配列ならびに遺伝子発現を駆動するためのＭＨＣＫ７エンハンサーおよび筋肉特異的プロモーターのコアプロモーターエレメントを含む。また、発現カセットは、高レベルの遺伝子発現を促進するためのＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）を含み、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが効率的な転写終結のために使用される。

【0134】

ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４は、血清型ｒｈ７４由来の４つの野生型ＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質および３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４プラスミドの概略地図を図３に示す。

【0135】

ｐＨＥＬＰアデノウイルスヘルパープラスミドは１１，６３５ｂｐであり、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓから入手した。このプラスミドは、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、つまり、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、およびＶＡ ＲＮＡを含む（アデノウイルスＥ１機能は、２９３細胞によって提供される）。このプラスミド中に存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの約４０％のみを表しており、アデノウイルス末端反復などの複製に重要なシスエレメントを含まない。したがって、かかる産生システムからは感染性アデノウイルスが生成されることは予想されない。ｐＨＥＬＰプラスミドの概略マップを図４に示す。

【0136】

ｒＡＡＶを、本明細書中に開示するように、当技術分野で標準的な方法によって（カラムクロマトグラフィまたは塩化セシウム勾配などによって）精製し得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９ ４２７－４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示の方法が挙げられる。

【0137】

１つの態様では、本開示は、筋特異的調節エレメントのヌクレオチド配列、およびマイクロ－ジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。例えば、ヌクレオチド配列は、機能的マイクロ－ジストロフィンタンパク質をコードし、ここで、ヌクレオチドは、例えば、配列番号１に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、このタンパク質は、マイクロ－ジストロフィン活性を保持する。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋肉の収縮中に筋肉膜に安定性をもたらし、例えば、マイクロジストロフィンは、筋肉の収縮中にショック・アブソーバとして作用する。

【0138】

１つの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン（すなわち、ＭＨＣＫ７プロモーター／エンハンサーによって駆動されるマイクロジストロフィン導入遺伝子を含む核酸発現カセットまたはゲノムをキャプシドで包んでいるｒＡＡＶ血清型ｒｈ７４キャプシドのウイルス粒子形態）であり、被験体への投与の文脈においては、非専売薬物名デランディストロゲンモキセパルボベックとも称されている。いくつかの態様では、デランディストロゲンモキセパルボベックを投与した実施形態における被験体の研究に言及する場合、データ（例えば、棒グラフ）を、より簡潔に「処置済み」と示し得る。

【0139】

１つの態様では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンであり、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0140】

また、本開示は、ｒＡＡＶであって、ここで、そのヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列またはその相補物にハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含み、機能的マイクロ－ジストロフィンタンパク質をコードする、ｒＡＡＶを提供する。

【0141】

１つの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンと呼ばれる非複製の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する。このベクターゲノムは、遺伝子発現に必要な最小限のエレメント（ＡＡＶ２ 逆位末端反復（ＩＴＲ）、マイクロ－ジストロフィン、ＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）、および合成ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルが挙げられる）を含み、これらは全てＭＨＣＫ７プロモーター／エンハンサーの調節下にある。ベクターゲノムおよび発現カセットの概略図を図１に示す。ＡＡＶｒｈ７４血清型を使用して、ＩＶ投与後の骨格筋および心筋中に効率的に遺伝子導入することができる。

【0142】

１つの態様では、本開示は、ｒＡＡＶであって、ここで、筋特異的調節エレメントは、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、心遅筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素症誘導性核性因子、ステロイド誘導性エレメント、または糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である、ｒＡＡＶを提供する。

【0143】

例えば、筋特異的調節エレメントは、ＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列（配列番号２または配列番号７）であるか、あるいは筋特異的調節エレメントは、ＭＣＫヌクレオチド配列（配列番号４）である。さらに、本開示の任意のｒＡＡＶベクター中で、筋特異的調節エレメントのヌクレオチド配列（例えば、ＭＨＣＫ７またはＭＣＫのヌクレオチド配列）は、マイクロ－ジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。例えば、ＭＨＣＫ７プロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２または配列番号７）は、図１もしくは図２（配列番号３）または図１３（配列番号９）に提供された構築物中に記載のヒトマイクロ－ジストロフィンコード配列（配列番号１）に作動可能に連結される。別の例では、ＭＣＫプロモーター（配列番号４）は、図５または図６に提供される構築物（配列番号５）に示されるように、ヒトマイクロ－ジストロフィンコード配列（配列番号１）に作動可能に連結される。別の態様では、本開示は、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および配列番号７のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。また、本開示は、配列番号１および配列番号４のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。

【0144】

さらなる態様では、本開示は、配列番号３、配列番号５、配列番号６、または配列番号８のヌクレオチド配列を含むプラスミド中に含まれるｒＡＡＶ構築物を提供する。例えば、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号３のＩＴＲ内にあり、かつそれを含み、図２に示されるヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、および３’ＩＴＲを含む。１つの態様では、ベクターは、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含む。配列番号３に記載のプラスミドは、アンピシリン耐性およびｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミドバックボーンをさらに含む。

【0145】

別の態様では、本開示は、配列番号９のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶであって、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する、ｒＡＡＶを提供する。例えば、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクター構築物は、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、図１３に示される。このｒＡＡＶベクター構築物は、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子のコード配列、およびポリＡを含む。１つの態様では、ｒＡＡＶベクター構築物は、プロモーターの５’側にＩＴＲ、およびポリＡの３’側にＩＴＲをさらに含む。１つの態様では、ｒＡＡＶはＡＡＶｒｈ７４である。

【0146】

別の態様では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクター（すなわち、ウイルスベクター）は、配列番号８のＩＴＲ内にあり、かつそれを含み、図１５に示されるヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、および３’ＩＴＲを含む。１つの態様では、ベクターは、配列番号９のヌクレオチド１～４９７７を含む。配列番号３に記載のプラスミドは、カナマイシン耐性およびｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミドバックボーンをさらに含む。

【0147】

別の態様では、本開示は、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含むプラスミドを提供する。１つの態様では、プラスミドは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、および３’ＩＴＲを含む。１つの態様では、プラスミドはカナマイシン耐性を含み、必要に応じて、ｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミドバックボーンを含む。特定の態様では、プラスミドは配列番号８に記載され、図１４および１５に示される。

【0148】

本開示は、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターであって、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する、組換えＡＡＶベクターを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。

【0149】

また、本開示は、配列番号３中のＩＴＲ内にあり、かつそれを含むＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物のヌクレオチド配列、配列番号８中のＩＴＲ内にあり、かつそれを含むヌクレオチド配列、または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶをであって、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する、ｒＡＡＶを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。

【0150】

本開示のｒＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型（血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３など）であり得る。

【0151】

また、本開示は、本開示のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物（または本明細書中では単に「組成物」と呼ばれることもある）も提供する。

【0152】

別の態様では、本開示は、ｒＡＡＶベクター粒子を産生する方法であって、本開示の任意のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされている細胞を培養する工程、およびトランスフェクトされた細胞の上清からｒＡＡＶ粒子を回収する工程を含む、方法を提供する。また、本開示は、本開示の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。
ｒＡＡＶを含む組成物およびその投与

【0153】

別の態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶを含む組成物を意図する。本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび薬学的に許容され得る担体を含む。また、組成物は、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分を含み得る。許容され得る担体、希釈剤、およびアジュバントは、レシピエントに対して無毒であり、使用される投薬量および濃度で不活性であることが好ましく、緩衝液および表面活性剤（プルロニック（登録商標）など）を含む。

【0154】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを含む、筋ジストロフィ（例えば、ＤＭＤ）の処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置するための組成物であって、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する、組成物を提供する。

【0155】

いくつかの態様では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含む組成物であって、ここで、ｒＡＡＶを、本明細書中に記載の懸濁シードプロセスによって哺乳動物接着細胞中で産生する、組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物は、ａ）配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子；ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子；および／またはｃ）配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ粒子を含む。

【0156】

本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、処置目標、個体、および標的となる細胞型（複数可）に応じて変動するであろう。力価は、当該分野で標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌあたり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。また、投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る。カプセル化ベクターゲノム力価を決定する１つの例示的な方法は、（Ｐｏｚｓｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５：８５５－８６９（２０１７））に記載の方法などの定量的ＰＣＲを使用する。

【0157】

ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法が本開示によって意図される。ｉｎ ｖｉｖｏ方法は、有効用量または有効複数回用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、必要とする動物（ヒトが挙げられる）に投与するステップを含む。障害／疾患の発症前に用量が投与される場合、その投与は予防的である。障害／疾患の発症後に用量が投与される場合、その投与は治療的である。本開示の態様では、有効用量は、処置される障害／病態に関連する少なくとも１つの徴候を軽減（消失または軽減）する、障害／病態への進行を遅らせるか予防する、障害／病態の進行を遅らせるか予防する、疾患の程度を軽減する、疾患の（部分的または完全な）寛解をもたらす、および／または延命する用量である。本開示の方法を用いた予防または処置が意図される疾患の一例は、ＤＭＤである。

【0158】

併用療法も本開示によって意図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時処置および逐次処置の両方を含む。本開示の方法と標準的な医学的処置（例えば、コルチコステロイド）との組み合わせは、新規の治療法との組み合わせと同様に、特に意図される。

【0159】

有効用量の組成物の投与は、当該分野で標準的な経路（筋肉内、非経口、静脈内、経口、口内、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣が挙げられるが、これらに限定されない）によるものであり得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ構成要素（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびキャプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、処置中の感染症および／または疾患状態ならびにマイクロ－ジストロフィンタンパク質を発現することになる標的細胞／組織（複数可）を考慮して当業者によって選択および／または適合され得る。

【0160】

本開示は、有効用量の本開示のｒＡＡＶおよび組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、全身が影響を受けるように循環系に投与される。全身投与としては、胃腸管を通した吸収などの経腸投与および注射、注入、または移植による非経口投与が挙げられる。

【0161】

特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与としては、筋肉への注射および血流への注射が挙げられるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁するだけで、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与できる担体や他の成分については既知の制限はない（とはいえ、ｒＡＡＶを用いた通常の様式では、ＤＮＡを分解する組成物は回避されるべきである）。ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの特定の目的の標的組織を標的とするように改変され得る。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３号（その開示が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。医薬組成物を、注射用製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所用製剤として調製することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本開示の実施で使用することができる。ｒＡＡＶを、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容され得る担体とともに使用することができる。

【0162】

本開示の１つの態様では、本明細書中に記載のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．００１％ポロクサマー１８８を含む緩衝液中で製剤化される。

【0163】

本明細書中に開示の方法で投与すべきｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、処置目標、個人、および標的となる細胞型に応じて変化するであろう。前述の用量は、当該分野で標準的な方法によって決定され得る。投与される各ｒＡＡＶの力価は、ｍｌあたり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、約２×１０^１４、または約１×１０^１５またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。また、投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る（すなわち、それぞれ、１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、１×１０^１４ｖｇ、２×１０^１４ｖｇ、１×１０^１５ｖｇ）。また、投薬量は、体重１キログラム（ｋｇ）あたりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る（すなわち、それぞれ、１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶの力価を測定する方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載されている。

【0164】

特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与としては、筋肉への注射および血流への注射が挙げられるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁するだけで、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与できる担体や他の成分については既知の制限はない（とはいえ、ｒＡＡＶを用いた通常の様式では、ＤＮＡを分解する組成物は回避されるべきである）。ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの特定の目的の標的組織を標的とするように改変され得る。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３号（その開示が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。医薬組成物を、注射用製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所用製剤として調製することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本開示の実施で使用することができる。ｒＡＡＶを、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容され得る担体とともに使用することができる。

【0165】

筋肉内注射の目的のために、ゴマ油またはピーナッツ油などのアジュバント中の溶液、または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに滅菌水溶液を使用することができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースと等張にすることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容され得る塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。また、ｒＡＡＶの分散液を、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための防腐剤を含む。これに関連して、使用される滅菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準技術によって容易に入手可能である。

【0166】

注射に好適な薬学的担体、希釈剤、または賦形剤は、滅菌水溶液または分散液および注射用の滅菌溶液または懸濁液の即時調製のための滅菌散剤を含む。あらゆる場合において、前述の形態は、無菌でなければならず、シリンジ操作が容易な範囲の流体でなければならない。前述の形態は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。微生物作用を、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールなど）によって防止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用よって、注射用組成物を長期間吸収させることができる。

【0167】

滅菌注射液を、適切な溶媒中に必要量のｒＡＡＶを、必要に応じて上記列挙の種々の他の成分と共に組み込み、その後に濾過滅菌することによって調製する。一般に、分散液を、基本分散媒および必要な上記列挙の成分由来の他の成分を含む滅菌ビヒクルに滅菌有効成分を組み込むことによって調製する。滅菌注射液調製用の滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌した有効成分の溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。

【0168】

また、ｒＡＡＶを用いた形質導入はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。１つの態様では、所望の標的筋細胞が被験体から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、被験体に再移入される。あるいは、被験体において不適切な免疫応答を生じない同系または異種の筋肉細胞を使用することができる。

【0169】

形質導入および形質導入された細胞の被験体への再移入のための好適な方法は、当該分野で公知である。１つの態様では、例えば、適切な培地中でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択マーカーを使用して目的のＤＮＡを保有する細胞をスクリーニングすることによって、細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入することができる。次いで、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、その組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射、または例えばカテーテルを使用した平滑筋および心筋への注射などによる様々な技術によって被験体に移入することができる。

【0170】

本開示のｒＡＡＶで細胞を形質導入すると、マイクロ－ジストロフィンタンパク質が持続的に発現する。したがって、本開示は、マイクロ－ジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、組織（筋肉などの組織、肝臓および脳などの臓器、ならびに唾液腺などの腺が挙げられるが、これらに限定されない）に１またはそれを超える本開示のｒＡＡＶを形質導入する工程を含む。形質導入は、組織特異的調節エレメントを含む遺伝子カセットを用いて実行され得る。例えば、本開示の１つの態様は、筋特異的調節エレメント（ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーなどのアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照のこと）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１））、ヒト骨格アクチン遺伝子（Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７））、心臓アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照のこと）、およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメントに由来する調節エレメント、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、心遅筋トロポニンＣ遺伝子、および遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する調節エレメント：低酸素症誘導性核性因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘導性エレメントおよびプロモーター（糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）が挙げられる）（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照のこと）に由来する調節エレメント、ならびに他の調節エレメントに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない）によって指示される筋肉細胞および筋組織に形質導入する方法を提供する。

【0171】

筋組織は、必須器官ではなく、アクセスが容易であるため、ｉｎ ｖｉｖｏＤＮＡ送達にとって魅力的な標的である。本開示は、形質導入された筋線維からのマイクロ－ジストロフィンの持続的発現を意図する。

【0172】

したがって、本開示は、有効用量（または本質的に同時に投与される用量または間隔をあけて与えられる用量）のマイクロ－ジストロフィンをコードするｒＡＡＶを、それを必要とする被験体（筋ジストロフィを有する被験体）に投与する方法を提供する。

【0173】

本開示は、配列番号３、８、または９のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。また、本開示は、配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ、および配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子を提供し、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する。

【0174】

本開示の別の態様は、配列番号３、８、または９のヌクレオチド配列を含む核酸分子、配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ、および配列番号９の核酸配列または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供し、ここで、ｒＡＡＶは、接着細胞中で産生され、接着細胞を、Ｎ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する。本明細書中に開示の方法のいずれかは、これらの組成物を用いて実施され得る。
接着細胞のハイブリッドシードトレインによる拡大

【0175】

本開示のいくつかの態様は、細胞を拡大する方法であって、（ａ）Ｎ－２コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の培地を用いて培養する工程；（ｂ）前述の第１の培地から前述の細胞を取り出す工程；（ｃ）Ｎ－１コンテナ中で、前述の工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前述の第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；（ｄ）前述のＮ－１コンテナ中で前述の細胞を懸濁条件下で培養する工程；および（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程を含む、方法に関する。１つの態様では、第２の培地は無血清培地である。別の態様では、第２の培地は、第１の培地中の血清濃度より低い濃度の血清を含む。

【0176】

本開示のいくつかの態様は、シードトレイン拡大方法であって、（ａ）Ｎ－３コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の培地を用いて培養する工程；（ｂ）前述の第１の培地から前述の細胞を取り出す工程；（ｃ）Ｎ－２コンテナ中で、前述の工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前述の第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；（ｄ）前述のＮ－２コンテナ中で前述の細胞を懸濁条件下で培養する工程；（ｅ）およびＮ－１容器中の前述の第２の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程；および（ｆ）バイオリアクター中の第３の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程を含む、方法に関する。１つの態様では、第２の培地は無血清培地である。別の態様では、第２の培地は、第１の培地中の血清濃度より低い濃度の血清を含む。

【0177】

本開示のいくつかの態様は、接着細胞の細胞拡大方法であって、（ａ）血清を含む第１の培地中で接着細胞を接着条件下で培養する工程；（ｂ）第１の培地から接着細胞を取り出す工程；（ｃ）接着細胞を、血清を含まないか、第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に懸濁する工程；（ｄ）前述の接着細胞を懸濁条件下で培養する工程；および（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に、工程（ｄ）由来の接着細胞を接種する工程を含む、方法に関する。いくつかの態様では、方法は、工程（ａ）の接着細胞を、接着条件下で少なくとも１回継代することをさらに含むことができる。いくつかの態様では、方法は、工程（ｄ）の接着細胞を、懸濁条件下で少なくとも１回継代することをさらに含むことができる。１つの態様では、第２の培地は無血清培地である。別の態様では、第２の培地は、Ｎ－１コンテナ中の第１の培地より低い濃度の血清を含む。

【0178】

第１の培地、第２の培地、および第３の培地は、培養される特定の細胞に好適な任意の培地であり得る。いくつかの態様では、培地は、例えば、無機塩、炭水化物（例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、またはフルクトースなどの糖）、アミノ酸、ビタミン（例えば、ビタミンＢ群（例えば、Ｂ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン、およびビオチン）、脂肪酸および脂質（例えば、コレステロールおよびステロイド）、タンパク質およびペプチド（例えば、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、およびフェチュイン）、血清（例えば、アルブミン、成長因子および成長抑制物質、例えば、ウシ胎児血清、新生仔ウシ血清、およびウマ血清を含む組成物）、微量元素（例えば、亜鉛、銅、セレン、およびトリカルボン酸中間体）、加水分解産物（植物源および動物源由来の加水分解タンパク質）、およびこれらの組み合わせを含む。成長培地は、５倍濃縮ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ ｆｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢＤ Ｒｅｃｈａｒｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ Ｆｅｅｄ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｅｘ－ｃｅｌｌ ＣＨＯＺＮ Ｆｅｅｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＨＯ Ｆｅｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳｈｅｆｆＣＨＯ（Ｋｅｒｒｙ）、Ｚａｐ－ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｉａ）、ＡｃｔｉＣＨＯ（ＰＡＡ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地であり得る。

【0179】

いくつかの態様では、血清を含まないか、第１の血清より低い濃度の血清を含む無血清二次成長培地は、細胞の係留を支持すると考えられるカルシウムイオン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、細胞外基質のプロテオグリカンまたは非プロテオグリカンポリサッカリドを実質的に含まない（超微量以下を含む）。１つの態様では、第２の培地は無血清培地である。別の態様では、第２の培地は、第１の培地中の血清濃度より低い濃度の血清を含む。

【0180】

いくつかの態様では、成長培地は、約６．５と約７．５との間、約６．５と約７．４との間、約６．５と約７．３との間、約６．５と約７．２との間、約６．５と約７．１との間、約６．５と約７．０との間、約６．５と約６．９との間、約６．５と約６．８との間、約６．５と約６．７との間、約６．６と約７．５との間、約６．６と約７．４との間、約６．６と約７．３との間、約６．６と約７．２との間、約６．６と約７．１との間、約６．６と約７．０との間、約６．６と約６．９との間、約６．６と約６．８との間、約６．７と約７．５との間、約６．７と約７．４との間、約６．７と約７．３との間、約６．７と約７．２との間、約６．７と約７．１との間、約６．７と約７．０との間、約６．７と約６．９との間、約６．８と約７．５との間、約６．８と約７．４との間、約６．８と約７．３との間、約６．８と約７．２との間、約６．８と約７．１との間、約６．８と約７．０との間、約６．９と約７．５との間、約６．９と約７．４との間、約６．９と約７．３との間、約６．９と約７．２との間、約６．９と約７．１との間、約７．０と約７．５との間、約７．０と約７．４との間、約７．０と約７．３との間、約７．０と約７．２との間、約７．１と約７．５との間、約７．１と約７．４との間、約７．１と約７．３との間、約７．２と約７．５との間、約７．２と約７．４、または約７．３と約７．５との間のｐＨを有することができる。

【0181】

いくつかの態様では、細胞を、３２℃～約３９℃、約３２℃～約３７℃、約３２℃と約３７．５℃との間、約３４℃と約３７℃との間、約３５℃と約３７℃との間、約３５．５℃と約３７．５℃との間、約３６℃と約３７℃との間、または約３６．５℃の温度で培養することができる。いくつかの態様では、細胞を、培養期間の開始から終了まで約３７℃の温度で培養することができる。いくつかの態様では、温度は、変化させることができるか、培養期間中（例えば、時間または日の単位で）わずかに変動してよい。いくつかの態様では、温度を、培養期間開始から約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１４日後、もしくは１５日後、または培養期間内の任意の時点で変化させるか移行（例えば、増加または減少）することができる。いくつかの態様では、温度を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０．０℃上方へ移行させることができる。いくつかの態様では、温度を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０℃下方へ移行させることができる。

【0182】

いくつかの態様では、約１％～約１５％ＣＯ_２を含む大気を使用して細胞を培養することができる。いくつかの態様では、約１４％ＣＯ_２、１２％ＣＯ_２、１０％ＣＯ_２、８％ＣＯ_２、６％ＣＯ_２、５％ＣＯ_２、４％ＣＯ_２、３％ＣＯ_２、２％ＣＯ_２、または約１％ＣＯ_２を含む大気を使用して細胞を培養することができる。

【0183】

いくつかの態様では、細胞培養物中の溶存酸素（ｄＯ_２）を、約３％と約５５％との間、約３％と約５０％との間、約３％と約４５％との間、約３％と約４０％との間、約３％と約３５％との間、約３％と約３０％との間、約３％と約２５％との間、約３％と約２０％との間、約３％と約１５％との間、約５％と約５５％との間、約５％と約５０％との間、約５％と約４５％との間、約５％と約４０％との間、約５％と約３５％との間、約５％と約３０％との間、約５％と約２５％との間、約５％と約２０％との間、約５％と約１５％との間、約５％と約１０％との間、約１０％と約５５％との間、約１０％と約５０％との間、約１０％と約４５％との間、約１０％と約４０％との間、約１０％と約３５％との間、約１０％と約３０％との間、約１０％と約２５％との間、約１０％と約２０％との間、約１５％と約５５％との間、約１５％と約５０％との間、約１５％と約４５％との間、約１５％と約４０％との間、約１５％と約３５％との間、約１５％と約３０％との間、約１５％と約２５％との間、約１５％と約２０％との間、約２０％と約５５％との間、約２０％と約５０％との間、約２０％と約４５％との間、約２０％と約４０％との間、約２０％と約３５％との間、約２０％と約３０％との間、約２０％と約２５％との間、約２５％と約５５％との間、約２５％と約５０％との間、約２５％と約４５％との間、約２５％と約４０％との間、約２５％と約３５％との間、約２５％と約３０％との間、約３０％と約５５％との間、約３０％と約５０％との間、約３０％と約４５％との間、約３０％と約４０％との間、約３０％と約３５％との間、約３５％と約５５％との間、約３５％と約５０％との間、約３５％と約４５％との間、約３５％と約４０％との間、約４０％と約５５％との間、約４０％と約５０％との間、約４０％と約４５％との間、約４５％と約５５％との間、約４５％と約５０％との間、または約５０％と約５５％との間に維持することによって細胞を培養することができる。

【0184】

いくつかの態様では、細胞培養物のｐＨを、塩基溶液（アルカリ塩基溶液など）の添加によって特異的ｐＨ値に維持することができる。細胞培養物のｐＨを、約６．５と約７．５との間、約６．５と約７．４との間、約６．５と約７．３との間、約６．５と約７．２との間、約６．５と約７．１との間、約６．５と約７．０との間、約６．５と約６．９との間、約６．５と約６．８との間、約６．５と約６．７との間、約６．６と約７．５との間、約６．６と約７．４との間、約６．６と約７．３との間、約６．６と約７．２との間、約６．６と約７．１との間、約６．６と約７．０との間、約６．６と約６．９との間、約６．６と約６．８との間、約６．７と約７．５との間、約６．７と約７．４との間、約６．７と約７．３との間、約６．７と約７．２との間、約６．７と約７．１との間、約６．７と約７．０との間、約６．７と約６．９との間、約６．８と約７．５との間、約６．８と約７．４との間、約６．８と約７．３との間、約６．８と約７．２との間、約６．８と約７．１との間、約６．８と約７．０との間、約６．９と約７．５との間、約６．９と約７．４との間、約６．９と約７．３との間、約６．９と約７．２との間、約６．９と約７．１との間、約７．０と約７．５との間、約７．０と約７．４との間、約７．０と約７．３との間、約７．０と約７．２との間、約７．１と約７．５との間、約７．１と約７．４との間、約７．１と約７．３との間、約７．２と約７．５との間、約７．２と約７．４との間、または約７．３と約７．５との間のｐＨに維持することができる。

【0185】

いくつかの態様では、静置または混合／振盪懸濁細胞拡大に好適な任意のタイプの細胞培養フラスコ中で（例えば、Ｔ－フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、もしくは振盪フラスコ；またはこれらの組み合わせを使用して）懸濁条件下で細胞培養を行うことができる。いくつかの態様では、Ｎ－１コンテナは、振とうフラスコである。

【0186】

いくつかの態様では、懸濁条件には、いくつかの撹拌形態を含むことができる。いくつかの態様では、撹拌は、回転撹拌であり得る。いくつかの態様では、約２５ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約２５ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約１００ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約８０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約６０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約４０ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３５ＲＰＭとの間、約２５ＲＰＭと約３０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭから約５００ＲＰＭの間、約５０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約１００ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約８０ＲＰＭとの間、約５０ＲＰＭと約６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭから約５００ＲＰＭの間、約７５ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約１００ＲＰＭとの間、約７５ＲＰＭと約８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭから約５００ＲＰＭの間、約１００ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１４０ＲＰＭとの間、約１００ＲＰＭと約１２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭから約５００ＲＰＭの間、約１５０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約２００ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約１８０ＲＰＭとの間、約１５０ＲＰＭと約１６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭから約５００ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭと４８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約３００ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、または約４００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間の回転数で撹拌することができる。連続的または周期的に撹拌することができる。

【0187】

いくつかの態様では、細胞を、懸濁条件下で２回以下継代する。

【0188】

いくつかの態様では、細胞を、懸濁培養において約２４～約９６時間培養する。いくつかの態様では、細胞を、懸濁培養において約３６～約８４時間培養する。いくつかの態様では、細胞を、懸濁培養において約４８～約７２時間培養する。いくつかの態様では、細胞を、懸濁培養において約５４～約６６時間培養する。いくつかの態様では、細胞を、懸濁培養において約２４、約３０、約３６、約４２、約４８、約５４、約６０、約６６、約７２、約７８、約８４、約９０、または約９６時間培養する。

【0189】

本開示のいくつかの態様では、細胞は接着細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、またはＣＯＳ細胞である。いくつかの態様では、接着細胞はヒトである。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞はＨＥＫ－２９３細胞である。

【0190】

いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、細胞を懸濁条件下で培養する工程は、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、方法は、細胞を、新規の細胞株を作出するように変化させない。本明細書中に開示の方法は、細胞のゲノムプロファイルまたはトランスクリプトームプロファイルを変化させない。本明細書中に開示の方法は、細胞の表現型を変化させない。

【0191】

いくつかの態様では、細胞を、Ｎ－１コンテナに接種する前に接着条件下にて血清を補足した成長培地中で複数回継代する。いくつかの態様では、細胞を、Ｎ－１コンテナに接種する前にＮ－２、Ｎ－３、Ｎ－４、Ｎ－５、Ｎ－６、Ｎ－７、Ｎ－８、Ｎ－９、またはＮ－１０コンテナ中で培養する。いくつかの態様では、細胞を、Ｎ－３およびＮ－２コンテナ中で培養する。いくつかの態様では、細胞を、Ｎ－４、Ｎ－３、およびＮ－２コンテナ中で培養する。

【0192】

いくつかの態様では、バイオリアクターは接着性バイオリアクターである。いくつかの態様では、接着細胞を、接着性バイオリアクター中に産生された培養物から精製する。

【0193】

いくつかの態様では、バイオリアクターは、少なくとも１つの、より好ましくは複数の担体を含み、この担体上は、拡大された細胞が接着する傾向にあり、バイオリアクター中で浮遊または固定され得る。好ましくは、前述の担体を、例えば、ポリエチレンテレフタラート、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ＤＥＡＥ－デキストラン、コラーゲン、ガラス、アルギナート、またはアクリルアミドを使用して作製することができる。いくつかの態様では、バイオリアクターは、ビーズ型微小担体（例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）ブランドのビーズ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｎｃ．ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｒｐ．で販売されている）またはマトリックス型担体（例えば、Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ（商標）ブランドのディスク、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｒｐ．で販売されている）を含むバイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノまたはｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００バイオリアクター（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびＰａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆａｌｌ Ｒｉｖｅｒ，Ｍａｓｓ）から市販されている）などで使用されるポリエステル繊維担体を使用する。

【0194】

いくつかの態様では、バイオリアクター中の第３の培地は、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子は、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外基質のプロテオグリカンまたは非プロテオグリカンポリサッカリド；およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞接着を促進する因子を、バイオリアクター中への懸濁細胞の接種の直前、間、または後に第３の培地に添加することができる。

【0195】

いくつかの態様では、成長培地は、ＤＭＥＭおよび約１０重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約２重量％～約２０重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約３重量％～約１９重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約４重量％～約１８重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約５重量％～約１７重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約６重量％～約１６重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約７重量％～約１５重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約８重量％～約１４重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約９重量％～約１３重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約１０重量％～約１２重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０重量％のＦＢＳを含む。

【0196】

いくつかの態様では、工程（ｄ）由来の懸濁液で拡大された細胞を、バイオリアクター中に直接接種することができる。いくつかの態様では、バイオリアクター中への細胞の接種量は、バイオリアクターのサイズに基づいて変動する。いくつかの態様では、４ｍ２のバイオリアクター（例えば、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノバイオリアクター）を使用する。いくつかの態様では、４ｍ２のバイオリアクターに、約１×１０^８細胞と１×１０^９細胞との間を接種する。いくつかの態様では、４ｍ２のバイオリアクターに、約３×１０^８細胞と７×１０^８細胞との間を接種する。いくつかの態様では、４ｍ２のバイオリアクターに、約４×１０^８細胞と６×１０^８細胞との間を接種する。いくつかの態様では、４ｍ２のバイオリアクターに、約５×１０^８細胞を接種する。いくつかの態様では、他のサイズのバイオリアクターについては、等価な細胞密度を使用する。

【0197】

いくつかの態様では、本開示の方法は、バイオリアクター中で細胞を培養する工程をさらに含むことができる。いくつかの態様では、細胞培養は、回分培養を含む。いくつかの態様では、細胞培養は、流加培養を含む。いくつかの態様では、細胞培養は、灌流培養を含む。

【0198】

流加培養は、細胞培養物から成長培地を実質的にまたは相当に除去することなく、最初の細胞培養物にフィード培養培地を漸増的（周期的）または連続的に添加することを含む。流加培養中の細胞培養物を、バイオリアクター（例えば、１０，０００Ｌの製造バイオリアクターなどの製造バイオリアクター）中に配置することができる。いくつかの態様では、フィード培養培地は、成長培地と同一であり得る。フィード培養培地は、液体または乾燥粉末のいずれかであり得る。いくつかの態様では、フィード培養培地は、濃縮形態の成長培地であり、そして／または乾燥粉末として添加される。いくつかの態様では、第１の液体フィード培養培地および異なる第２の液体フィード培養培地の両方を、成長培地に添加する（例えば、連続的に添加する）ことができる。いくつかの態様では、培養物への第１の液体フィード培養培地の添加および第２の液体フィード培養培地の添加を、ほぼ同時に開始することができる。いくつかの態様では、全培養期間にわたって培養物に添加される第１の液体フィード培養培地および第２の液体フィード培養培地の総体積は、ほぼ同一であり得る。

【0199】

フィード培養培地を連続的に添加する場合、フィード培養培地の添加速度を、培養期間にわたって一定に保持するか、増加（例えば、着実に増加）させることができる。フィード培養培地の連続添加を、培養期間中の特定の時点（例えば、細胞が標的生存細胞密度（例えば、約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．１×１０６細胞／ｍＬ、約１．２×１０６細胞／ｍＬ、約１．３×１０６細胞／ｍＬ、約１．４×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１．６×１０６細胞／ｍＬ、約１．７×１０６細胞／ｍＬ、約１．８×１０６細胞／ｍＬ、約１．９×１０６細胞／ｍＬ、または約２．０×１０６細胞／ｍＬの生存細胞密度）に到達したとき）で開始することができる。いくつかの態様では、フィード培養培地の連続添加を、培養期間の２日目、３日目、４日目、または５日目に開始することができる。

【0200】

いくつかの態様では、フィード培養培地の漸増的（周期的）添加を、細胞が標的細胞密度（例えば、約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．１×１０６細胞／ｍＬ、約１．２×１０６細胞／ｍＬ、約１．３×１０６細胞／ｍＬ、約１．４×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１．６×１０６細胞／ｍＬ、約１．７×１０６細胞／ｍＬ、約１．８×１０６細胞／ｍＬ、約１．９×１０６、または約２．０×１０６細胞／ｍＬ）に到達したときに開始することができる。いくつかの態様では、フィード培養培地の漸増添加を、一定間隔で（例えば、毎日、２日毎、または３日毎）行うことができるか、細胞が特定の標的細胞密度（例えば、培養期間にわたって増加する標的細胞密度）に到達したときに行うことができる。いくつかの態様では、フィード培養培地の添加量を、フィード培養培地の第１の漸増添加とフィード培養培地のその後の添加との間で漸増させることができる。いくつかの態様では、培養期間中の任意の２４時間にわたって最初の細胞培養物に添加される液体培養のフィード培養培地の体積は、培養物を含むバイオリアクターの最初の体積のいくつかの画分または最初の培養物の体積のいくつかの画分であり得る。

【0201】

いくつかの態様では、液体フィード培養培地の（連続的または周期的な）添加を、培養期間の開始後６時間と７日間との間、約６時間と約６日間との間、約６時間と約５日間との間、約６時間と約４日間との間、約６時間と約３日間との間、約６時間と約２日間との間、約６時間と約１日間との間、約１２時間と約７日間との間、約１２時間と約６日間との間、約１２時間と約５日間との間、約１２時間と約４日間との間、約１２時間と約３日間との間、約１２時間と約２日間との間、約１日間と約７日間との間、約１日間と約６日間との間、約１日間と約５日間との間、約１日間と約４日間との間、約１日間と約３日間との間、約１日間と約２日間との間、約２日間と約７日間との間、約２日間と約６日間との間、約２日間と約５日間との間、約２日間と約４日間との間、約２日間と約３日間との間、約３日間と約７日間との間、約３日間と約６日間との間、約３日間と約５日間との間、約３日間と約４日間との間、約４日間と約７日間との間、約４日間と約６日間との間、約４日間と約５日間との間、約５日間と約７日間との間、または約５日間と約６日間との間である時点で行うことができる。

【0202】

いくつかの態様では、任意の２４時間の期間にわたって最初の細胞培養物に（連続的または周期的に）添加される液体フィード培養培地の体積は、バイオリアクターの容量の０．０１倍と約０．３倍との間であり得る。画分は、バイオリアクターの容量の約０．０１倍と約０．２８倍との間、約０．０１倍と約０．２６倍との間、約０．０１倍と約０．２４倍との間、約０．０１倍と約０．２２倍との間、約０．０１倍と約０．２０倍との間、約０．０１倍と約０．１８倍との間、約０．０１倍と約０．１６倍との間、約０．０１倍と約０．１４倍との間、約０．０１倍と約０．１２倍との間、約０．０１倍と約０．１０倍との間、約０．０１倍と約０．０８倍との間、約０．０１倍と約０．０６倍との間、約０．０１倍と約０．０４倍との間、約０．０２倍と約０．３倍との間、約０．０２倍と約０．２８倍との間、約０．０２倍と約０．２６倍との間、約０．０２倍と約０．２４倍との間、約０．０２倍と約０．２２倍との間、約０．０２倍と約０．２０倍との間、約０．０２倍と約０．１８倍との間、約０．０２倍と約０．１６倍との間、約０．０２倍と約０．１４倍との間、約０．０２倍と約０．１２倍との間、約０．０２倍と約０．１０倍との間、約０．０２倍と約０．０８倍との間、約０．０２倍と約０．０６倍との間、約０．０２倍と約０．０５倍との間、約０．０２倍と約０．０４倍との間、約０．０２倍と約０．０３倍との間、約０．０２５倍と約０．３倍との間、約０．０２５倍と約０．２８倍との間、約０．０２５倍と約０．２６倍との間、約０．０２５倍と約０．２４倍との間、約０．０２５倍と約０．２２倍との間、約０．０２５倍と約０．２０倍との間、約０．０２５倍と約０．１８倍との間、約０．０２５倍と約０．１６倍との間、約０．０２５倍と約０．１４倍との間、約０．０２５倍と約０．１２倍との間、約０．０２５倍と約０．１０倍との間、約０．０２５倍と約０．０８倍との間、約０．０２５倍と約０．０６倍との間、約０．０２５倍と約０．０４倍との間、約０．０５倍と約０．３倍との間、約０．０５倍と約０．２８倍との間、約０．０５倍と約０．２６倍との間、約０．０５倍と約０．２４倍との間、約０．０５倍と約０．２２倍との間、約０．０５倍と約０．２０倍との間、約０．０５倍と約０．１８倍との間、約０．０５倍と約０．１６倍との間、約０．０５倍と約０．１４倍との間、約０．０５倍と約０．１２倍との間、約０．０５倍と約０．１０倍との間、約０．１倍と約０．３倍との間、約０．１倍と約０．２８倍との間、約０．１倍と約０．２６倍との間、約０．１倍と約０．２４倍との間、約０．１倍と約０．２２倍との間、約０．１倍と約０．２０倍との間、約０．１倍と約０．１８倍との間、約０．１倍と約０．１６倍との間 約０．１倍と約０．１４倍との間、約０．１倍の間、約０．１５倍と約０．３倍との間、約０．１５倍と約０．２倍との間、約０．２倍と約０．３倍との間、または約０．２５倍と約０．３倍との間であり得る。

【0203】

いくつかの態様では、培養期間中の任意の２４時間の期間にわたって最初の細胞培養物に（連続的または周期的に）添加される液体フィード培養培地の体積は、最初の細胞培養物の体積の０．０２倍と約１．０倍との間、約０．０２倍と約０．９倍との間、約０．０２倍と約０．８倍との間、約０．０２倍と約０．７倍との間、約０．０２倍と約０．６倍との間、約０．０２倍と約０．５倍との間、約０．０２倍と約０．４倍との間、約０．０２倍と約０．３倍との間、約０．０２倍と約０．２倍との間、約０．０２倍と約０．１倍との間、約０．０２倍と約０．０８倍との間、約０．０２倍と約０．０６倍との間、約０．０２倍と約０．０５倍との間、約０．０２倍と約０．０４倍との間、約０．０２倍と約０．０３倍との間、約０．０５倍と約１．０倍との間、約０．０５倍と約０．８倍との間、約０．０５倍と約０．７倍との間、約０．０５倍と約０．６倍との間、約０．０５倍と約０．５倍との間、約０．０５倍と約０．４倍との間、約０．０５倍と約０．３倍との間、約０．０５倍と約０．２倍との間、約０．０５倍と約０．１倍との間、約０．１倍と約１．０倍との間、約０．１倍と約０．９倍との間、約０．１倍と約０．８倍との間、約０．１倍と約０．７倍との間、約０．１倍と約０．６倍との間、約０．１倍と約０．５倍との間、約０．１倍と約０．４倍との間、約０．１倍と約０．３倍との間、約０．１倍と約０．２倍との間、約０．２倍と約１．０倍との間、約０．２倍と約０．９倍との間、約０．２倍と約０．８倍との間、約０．２倍と約０．７倍との間、約０．２倍と約０．６倍との間、約０．２倍と約０．５倍との間、または約０．２倍と約０．４倍との間であり得る。

【0204】

いくつかの態様では、全培養期間にわたって（連続的または周期的に）添加されるフィード培養培地の総量は、最初の培養物の体積の約１％と約４０％との間（例えば、約１％と約３５％との間、約１％と約３０％との間、約１％と約２５％との間、約１％と約２０％との間、約１％と約１５％との間、約１％と約１０％との間、約１％と約５％との間、約１％と約４％との間、約２％と約４０％との間、約２％と約３５％との間、約２％と約３０％との間、約２％と約２５％との間、約２％と約２０％との間、約２％と約１５％との間、約２％と約１０％との間、約２％と約５％との間、約３％と約４０％との間、約３％と約３５％との間、約３％と約３０％との間、約３％と約２５％との間、約３％と約２０％との間、約３％と約１５％との間、約３％と約１０％との間、約３％と約５％との間、約４％と約４０％との間、約４％と約３５％との間、約４％と約３０％との間、約４％と約２５％との間、約４％と約２０％との間、約４％と約１５％との間、約４％と約１０％との間、約４％と約８％との間、約５％と約４０％との間、約５％と約３５％との間、約５％と約３０％との間、約５％と約２５％との間、約５％と約２０％との間、約５％と約１５％との間、約５％と約１０％との間、約１０％と約４０％との間、約１０％と約３５％との間、約１０％と約３０％との間、約１０％と約２５％との間、約１０％と約２０％との間、約１０％と約１５％との間、約１５％と約４０％との間、約１５％と約３５％との間、約１５％と約３０％との間、約１５％と約２５％との間、約１５％と約２０％との間、約２０％と約４０％との間、約２０％と約３５％との間、約２０％と約３０％との間、約２０％と約２５％との間、約２５％と約４０％との間、約２５％と約３５％との間、約２５％と約３０％との間、約３０％と約４０％との間、約３０％と約３５％との間、約３５％と約４０％との間）であり得る。

【0205】

いくつかの態様では、２つの異なるフィード培養培地を、フィードバッチ培養中に（連続的または漸増的に）添加する。いくつかの態様では、第１のフィード培養培地および第２のフィード培養培地の添加量または添加体積は、実質的に同一であり得るか、異なり得る。いくつかの態様では、第１のフィード培養培地は、液体の形態であり得、第２のフィード培養培地は固体の形態であり得る。いくつかの態様では、第１のフィード培養培地および第２のフィード培養培地は、液体フィード培養培地であり得る。

【0206】

灌流培養は、バイオリアクターから第１の体積の成長培地を除去し、製造バイオリアクターに第２の体積の第２の成長培養培地を添加する工程を含み、ここで、第１の体積および第２の体積はほぼ等しい。細胞は、細胞保持デバイスによるか、沈降コーン中での細胞沈降などの技術によってバイオリアクター中に保持される。いくつかの態様では、成長培地の除去および添加を、同時もしくは連続的、またはこれら２つのいくかの組み合わせで行うことができる。いくつかの態様では、除去および添加を、バイオリアクターの容量の０．１％から８００％の間、１％と７００％との間、１％と６００％との間、１％と５００％との間、１％と４００％との間、１％と３５０％との間、１％と３００％との間、１％と２５０％との間、１％と１００％との間、１００％と２００％との間、５％と１５０％との間、１０％と５０％との間、１５％と４０％との間、８％と８０％との間、または４％と３０％との間の体積を除去および置換する速度などで連続的に行うことができる。

【0207】

いくつかの態様では、除去される第１の体積の第１の成長培地および添加される第２の体積の第２の成長培地を、各々の２４時間の期間にわたっておよそ同一に保持することができる。いくつかの態様では、第１の体積の第１の成長培地を除去する速度（体積／単位時間）および第２の体積の第２の成長培地を添加する速度（体積／単位時間）を、変動することができ、この速度は特定の細胞培養系の条件に依存する。いくつかの態様では、第１の体積の第１の成長培地を除去する速度（体積／単位時間）および第２の体積の第２の成長培地を添加する速度（体積／単位時間）は、ほぼ同一であり得るか、異なり得る。

【0208】

いくつかの態様では、除去体積および添加体積を、各々の２４時間の期間にわたって漸増させることによって変化させることができる。いくつかの態様では、各々の２４時間の期間内に除去される第１の成長培地の体積および添加される第２の成長培地の体積を、培養期間にわたって増加させることができる。いくつかの態様では、体積を、２４時間の期間にわたってバイオリアクターの容積の０．５％から約２０％までの間である体積分を増加させることができる。いくつかの態様では、体積を、２４時間の期間にわたってバイオリアクターの容量または第１の液体培養培地の体積約２５％～約１５０％である体積まで培養期間にわたって増加させることができる。

【0209】

いくつかの態様では、培養期間の第１の４８～９６時間後、各々の２４時間の期間中に、除去される第１の体積の第１の成長培地および添加される第２の体積の第２の成長培地は、第１の成長培地の体積の約１０％～約９５％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約６０％～約８０％、または約７０％である。

【0210】

いくつかの態様では、第１の成長培地および第２の成長培地は、同一のタイプの培地であり得る。いくつかの態様では、第１の成長培地および第２の成長培地は異なり得る。いくつかの態様では、第２の液体培養培地は、１またはそれを超える培地の構成要素の濃度がより高くてよい。

【0211】

いくつかの態様では、第１の体積の第１の成長培地を、任意の自動化システムを使用することによって除去することができる。いくつかの態様では、交互接線流濾過を使用し得る。いくつかの態様では、第１の体積の第１の成長培地を、細胞を排除する分子量カットオフを有する滅菌メンブレンを介した第１の体積の第１の成長培地の浸透または重力流によって除去することができる。いくつかの態様では、第１の体積の第１の成長培地を、少なくとも１分間、少なくとも２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４０分間、５０分間、または１時間、撹拌を停止するか撹拌速度を有意に低下させ、製造バイオリアクターの上部から第１の体積の成長培地を除去または吸引することによって除去することができる。

【0212】

いくつかの態様では、第２の体積の第２の液体培養培地を、ポンプによって第１の液体培養培地に添加することができる。いくつかの態様では、第２の液体培養培地を、第１の液体培地に、第１の液体培養培地上に第２の体積の第２の液体培養培地を直接ピペット操作するか注入することなどによって手作業で添加することができるか、自動化様式で添加することができる。

【0213】

いくつかの態様では、方法は、細胞を第１のポリヌクレオチド配列と接触させる工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、細胞をポリヌクレオチド配列でトランスフェクトする工程をさらに含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列はプラスミドである。いくつかの態様では、プラスミドは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のキャプシドをコードする。いくつかの態様では、細胞を、バイオリアクター中に細胞を接種する前にトランスフェクトする。いくつかの態様では、細胞を、バイオリアクター中に細胞を接種した後にトランスフェクトする。いくつかの態様では、細胞を、第２のポリヌクレオチドを用いて接触させるかトランスフェクトし、導入遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、細胞を、ウイルスベクターを産生する条件下で培養する。いくつかの態様では、方法は、産生されたウイルスベクターを単離する工程をさらに含む。

【0214】

いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。これらのベクターは、多数の分裂性および非分裂性の細胞型（滑膜細胞および肝細胞が挙げられる）に感染する。上に示すように、細胞侵入後のアデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターはエピソーム性を示すため、これらのベクターは治療に適用するのに好適である（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３－２６０４（２０００））；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２（１）：４３ ２００５））。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子を非常に長期間安定性して発現させることができる（イヌにおいて９年間まで（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１３（４）：７９７－８０６（２００９））およびヒトにおいて２年間まで（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６５（２５）：２３５７－２３６５（２０１１）；Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８（３）：６４３－５０（２０１０），Ｅｐｕｂ ２００９ Ｄｅｃ．１））。いくつかの態様では、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００，前出）によって概説されるように、アデノウイルスベクターは、宿主応答を軽減するように改変される。ＡＡＶベクターを使用した遺伝子の治療方法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．Ｍａｒｃｈ ９（オンライン先行公開）；Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．６：４８２－９０（２００４）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｙｅ １８：１０４９－５５（２００４）；Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２２；３６５：２３５７－６５（２０１１）；およびＡｐｐａｒａｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６（４）：４２６－３４（２００５）によって記載されている。

【0215】

いくつかの態様では、第１のポリヌクレオチド配列は、逆位末端反復、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶ構造キャプシドタンパク質をコードする核酸、またはこれらの組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。

【0216】

いくつかの態様では、細胞を、組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養する。いくつかの態様では、方法は、産生された組換えウイルス粒子を単離する工程をさらに含む。

【0217】

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、適切な制御配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含む。用語「制御配列」としては、プロモーター、エンハンサー、およびタンパク質の転写または翻訳を調節する他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。かかる制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。いくつかの態様では、制御配列は、プロモーター配列を含むことができる。いくつかの態様では、プロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ウイルス長末端反復 プロモーター（ＬＴＲ）（モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス、またはＨＴＬＶ－１に由来するものなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターであり得る。

【0218】

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、さらなるポリペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、さらなるポリペプチドは、ウイルスベクターを含む細胞を同定、選択、および／またはスクリーニング可能な（選択）マーカーポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、マーカーポリペプチドは、蛍光タンパク質ＧＦＰ、および選択マーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地での選択用）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢでの選択用）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８での選択用）、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートでの選択用）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子であり得る。これらのマーカー遺伝子を得るための供給源およびその使用方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに提供されている。
ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）の産生方法

【0219】

本開示のいくつかの態様は、ウイルスベクター（例えば、本明細書中に開示のｒＡＡＶ）を産生する方法であって、本明細書中に開示のシードトレイン拡大法のうちのいずれか１つにしたがって細胞を拡大する工程、バイオリアクター中の成長培地に細胞を接種する工程、ウイルス粒子をコードするポリヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクトする工程、および細胞をバイオリアクター中で前述のウイルス粒子が産生される条件下にて培養する工程を含む、方法に関する。いくつかの態様では、ウイルスベクターの産生は、米国特許出願第６３／１２３，６０２号（本明細書中で参考として明確に援用される）に開示されている。

【0220】

外因性核酸を宿主細胞に移入する方法は、当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変動するであろう。技術としては、デキストラン媒介トランスフェクション、硫酸カルシウム沈降、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、リポソーム中のポリヌクレオチド（複数可）のカプセル化、および核へのＤＮＡの直接微量注入が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクションは、一過性または安定性のいずれかであり得る。

【0221】

いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列はプラスミドである。いくつかの態様では、プラスミドは、ＡＡＶ由来のウイルス粒子をコードする。

【0222】

いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列はウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、ウイルス粒子をコードする。好ましい態様では、ウイルス粒子はＡＡＶに由来する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号９の核酸配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号８のヌクレオチド１～４９８８を含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0223】

いくつかの態様では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）を含むことができる。本明細書中で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書中に開示のＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質のタンパク質シェル中にキャプシド形成されたＡＡＶゲノムの一部を含む組換えベクターを指す。いくつかの態様では、ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２など）由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むことができる。

【0224】

典型的には、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶキャプシド中へのベクターゲノムの効率的なパッケージングを可能にするための隣接する５’および３’ＩＴＲ配列を使用することが必要である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、少なくとも、ＡＡＶ血清型のうちの１つの逆位末端反復領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列、または前述のヌクレオチド配列と実質的に一致しているヌクレオチド配列、および好適な制御エレメント（例えば、プロモーター）の調節下で導入遺伝子をコードする核酸配列を含み、ここで、制御エレメントおよび改変された核酸配列（複数可）が、２つのＩＴＲの間に挿入されている。

【0225】

いくつかのＡＡＶ血清型および対応するＩＴＲの全ゲノムは、配列決定されている（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９－１３１９（１９９９））。これらを、クローン化するか、当該分野で公知の化学合成（例えば、オリゴヌクレオチド合成機（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）が提供する）を使用）または標準的な分子生物学技術によって作製することができる。ＩＴＲを、ＡＡＶウイルスゲノムからクローン化するか、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターから切り出すことができる。ＩＴＲヌクレオチド配列のいずれかの末端を、標準的な分子生物学技術を使用して１またはそれを超える治療タンパク質をコードするヌクレオチド配列にライゲートすることができるか、ＩＴＲの間の野生型ＡＡＶ配列を、所望のヌクレオチド配列と置換することができる。

【0226】

いくつかの態様では、パッケージングされたウイルスベクターのウイルスキャプシド構成要素は、パルボウイルスキャプシド（例えば、ＡＡＶ Ｃａｐ）および／またはキメラキャプシドであり得る。好適なパルボウイルスのウイルスキャプシド構成要素の例は、パルボウイルス科（自律性パルボウイルスまたはディペンドウイルスなど）由来のキャプシド構成要素である。例えば、ウイルスキャプシドは、ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８ ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２キャプシド；当業者は、同一または類似の機能を果たす依然として同定されていない他のバリアントが存在する可能性が高いことを知っているであろう）であり得るか、あるいは、２またはそれを超えるＡＡＶキャプシド由来の構成要素を含み得る。ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全な相補物は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全未満の相補性のＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含むことができるか、あるいは、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全な相補物を提供することができる。

【0227】

いくつかの態様では、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のうちの１つまたは複数は、２またはそれを超えるウイルス、好ましくは２またはそれを超えるＡＡＶ由来のＡＡＶ Ｃａｐのアミノ酸配列を含むキメラタンパク質であり得る。例えば、キメラウイルスキャプシドは、ＡＡＶ１ Ｃａｐタンパク質またはサブユニットおよび少なくとも１つのＡＡＶ２ Ｃａｐまたはサブユニットを含むことができる。いくつかの態様では、ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、いかなるウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（キャプシド）遺伝子など）も含まない。いくつかの態様では、ｒＡＡＶゲノムは、マーカーまたはレポーター遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子または当該分野で公知の化学的、酵素的、またはその他の検出可能なおよび／もしくは選択可能な産物（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）をコードする遺伝子など）をさらに含むことができる。

【0228】

いくつかの態様では、前述のｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含むことができる。

【0229】

いくつかの態様では、また、好適な３’非翻訳配列を、導入遺伝子をコードする改変された核酸配列に作動可能に連結することができる。好適な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列に天然に会合するものであり得るか、例えば、ウシ成長ホルモン３’非翻訳領域などの異なる遺伝子（例えば、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー配列）に由来し得る。

【0230】

別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の方法は、組換えパルボウイルスおよびＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、パルボウイルスＲｅｐおよび／またはＣａｐ配列を発現するパッケージングベクター、ならびに一過性にまたは安定に処理されたパッケージング細胞の構築のために使用され得る。かかる技術は、当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｌ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。

【0231】

いくつかの態様では、また、好適な３’非翻訳配列を、導入遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結することができる。好適な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列に天然に会合するものであり得るか、例えば、ウシ成長ホルモン３’非翻訳領域などの異なる遺伝子（例えば、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー配列）に由来し得る。

【0232】

いくつかの態様では、追加のヌクレオチド配列を、導入遺伝子をコードする核酸配列（シグナル配列、核局在化シグナル、および発現エンハンサーなどをコードするヌクレオチド配列など）に作動可能に連結することができる。

【0233】

別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の方法は、レンチウイルス構築物、ベクター、および一過性におよび安定に処理されたパッケージング細胞の構築のために使用され得る。かかる技術は、当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｌ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。

【0234】

いくつかの態様では、本開示の方法は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミド、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドで細胞をトランスフェクトする工程を含む。いくつかの態様では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミドは、以下を含む：配列番号９の核酸配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７。いくつかの態様では、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミドは、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびｒＡＡＶｒｈ７４ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの態様では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス５型のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。

【0235】

いくつかの態様では、方法は、産生されたウイルス粒子を単離する工程をさらに含む。ウイルスベクターは、細胞の内側で複製されることよって増幅され、ウイルス粒子を産生する。ウイルス感染により、トランスフェクトされた細胞が溶解する。したがって、ＡＡＶなどのウイルスベクターの溶解特性により、ウイルス粒子の産生および単離という異なる２つの様式が可能である。第１の様式は、細胞を溶解するための外部因子を使用して、細胞溶解前にウイルス粒子を採取することである。第２の様式は、産生されたウイルスによるほとんど完全な細胞溶解後の上清からのウイルス粒子の採取である。

【0236】

活性細胞溶解のために使用することができる方法は、当業者に公知である。いくつかの態様では、細胞を、凍結融解、固体せん断、高張および／もしくは低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出し、界面活性剤溶解、ならびに前述の組み合わせなどによって溶解することができる。

【0237】

いくつかの態様では、細胞を、少なくとも１つの界面活性剤を使用して溶解することができる。いくつかの態様では、界面活性剤としては、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性、および非イオン性の界面活性剤を挙げることができる。いくつかの態様では、界面活性剤の濃度は、約０．１％～５％（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００であり得る。

【0238】

いくつかの態様では、ヌクレアーゼを使用して、トランスフェクトされた細胞から夾雑物を含む核酸（すなわち、未変性核酸）を除去することができる。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）、または当該分野で一般的に使用されている任意の他のＤＮａｓｅおよび／もしくはＲＮａｓｅであり得る。

【0239】

トランスフェクトされた細胞からウイルスベクターを採取または単離する方法は、ＷＯ２００５／０８０５５６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に広く開示されている。

【0240】

いくつかの態様では、ウイルスベクターの採取または単離の時間は、トランスフェクション後約２４時間と１２０時間との間、約３６と１０８時間との間、トランスフェクション後約４８時間と約９６時間との間、トランスフェクション後約６０時間と約８４時間との間である。いくつかの態様では、ベクターの採取または単離の時間は、トランスフェクション後約７２時間である。

【0241】

いくつかの態様では、単離されたウイルス粒子をさらに精製することができる。いくつかの態様では、ウイルス粒子の精製を、清澄化、限外濾過、透析濾過、またはクロマトグラフィを用いた分離を含むいくつかの工程で行うことができる。かかる方法は、ＷＯ２００５／０８０５５６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。いくつかの態様では、清澄化は、細胞溶解物から細胞デブリおよび他の夾雑物を除去する濾過工程によって行われ得る。いくつかの態様では、限外濾過を使用して、ウイルス溶液を濃縮する。いくつかの態様では、透析濾過、緩衝液交換、または限外濾過膜を使用して、塩および糖などを除去および交換することができる。当業者は、各精製工程に最適な条件を見出す方法を心得ている。

【0242】

いくつかの態様では、密度勾配遠心分離によって精製することができる。いくつかの態様では、精製は、少なくとも１つのクロマトグラフィ工程を使用する。いくつかの態様では、ウイルスベクターを、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはこれらの組み合わせによって精製することができる。
筋ジストロフィ（例えば、ＤＭＤ）を処置する方法

【0243】

本開示は、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを投与する工程を含み、ここで、ｒＡＡＶを、全身投与経路によって約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与し、ｒＡＡＶを哺乳動物の接着細胞中で産生し、接着細胞をＮ－１コンテナ中にて懸濁条件下で培養する、方法を提供する。いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィである。いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィである。

【0244】

また、本開示は、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置する方法であって、本明細書中に記載のｒＡＡＶを含む組成物を前述のヒト被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、全身投与経路を使用し、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの態様では、全身投与経路は静脈内経路であり、ｒＡＡＶの投与用量は約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。

【0245】

いくつかの態様では、ｒＡＡＶの用量を、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、注射、注入、または移植によって投与する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、およそ１時間にわたって注入によって投与する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、四肢の末梢静脈を介した静脈内経路によって投与する。

【0246】

いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィである。いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィである。

【0247】

いくつかの態様では、被験体の細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルは、ｒＡＡＶの投与後にｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルと比較して増加する。いくつかの態様では、細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、ｒＡＡＶの投与前および投与後に生検を実施した筋肉中のウェスタンブロットによってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。いくつかの態様では、発現は、ｒＡＡＶの投与後に投与前と比較して少なくとも５５．４％である。

【0248】

いくつかの態様では、被験体の筋肉組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維の平均百分率は、ｒＡＡＶの投与後に、ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィン陽性線維数と比較して増加する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶの投与前および投与後の筋生検において免疫蛍光（ＩＦ）によって検出した場合、マイクロ－ジストロフィン陽性線維の平均百分率は少なくとも７０．５％であり、平均強度は少なくとも１１６．９％である。いくつかの態様では、ベクターゲノムカウントによるマイクロ－ジストロフィン形質導入は、核あたり少なくとも３．８７の平均ベクターゲノムコピー数である。

【0249】

いくつかの態様では、ＤＭＤを有する患者を処置する方法におちえ、組成物を、遺伝子型判定した患者に投与する。いくつかの態様では、患者のヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子を、遺伝子型判定する。いくつかの態様では、遺伝子型判定した患者を、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン１８～７９中の少なくとも１つの変異について遺伝子型判定する。

【0250】

いくつかの態様では、筋ジストロフィを処置する方法は、前述のヒト被験体のＤＭＤ遺伝子を、前述のヒト被験体への前述の組成物の投与前に遺伝子型判定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、遺伝子型判定は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン１８～７９中の少なくとも１つの変異を検出する。いくつかの態様では、少なくとも１つの変異は、ヒトジストロフィンタンパク質が発現しなくなるフレームシフト欠失、フレームシフト重複、未熟終止、または他の病原性バリアントである。

【0251】

いくつかの態様では、ヒトジストロフィンタンパク質が発現しなくなるフレームシフト欠失、フレームシフト重複、未熟終止、または他の病原性バリアントが検出された場合、被験体が本明細書中に開示の組成物を投与されるのに適することが確認される。

【0252】

１つの態様では、ＤＭＤ遺伝子中の少なくとも１つの変異が、エクソン１～１７中の変異、インフレーム欠失、インフレーム重複、意義不明の変異（ＶＵＳ）、またはエクソン４５中に完全に含まれる変異である場合、被験体が本明細書中に開示の組成物を投与されるのに適さないと同定される。

【0253】

また、本開示は、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置するための本明細書中に記載の組成物の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示。また、本開示は、筋ジストロフィの処置のための医薬の製造における本明細書中に記載の組成物の使用を提供する。

【0254】

いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィである。いくつかの態様では、筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィである。

【0255】

例えば、ｒＡＡＶの投与用量は、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または 約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１５、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１５、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。

【0256】

いくつかの態様では、ヒト被験体は、約４歳と８歳未満との間である。いくつかの態様では、ヒト被験体は、約４歳、約４．２５歳、約４．５歳、約４．７５歳、約５歳、約５．２５歳、約５．５歳、約５．７５歳、約６歳、約６．２５歳、約６．５ 約６．７５歳、約７歳、約７．２５歳、約７．５歳、または約７．７５歳である。

【0257】

いくつかの態様では、ヒト被験体は、約８歳と１８歳未満との間である。いくつかの態様では、ヒト被験体は、約８歳、約８．２５歳、約８．５歳、約８．７５歳、約９歳、約９．２５歳、約９．５歳、約９．７５歳、約１０歳、約１０．２５歳、約１０．５歳、約１０．７５歳、約１１歳、約１１．２５歳、約１１．５歳、約１１．７５歳、約１２歳、約１２．２５歳、約１２．５歳、約１２．７５歳、約１３歳、約１３．２５歳、約１３．５歳、約１３．７５歳、約１４歳、約１４．５歳、約１４．７５歳、約１５歳、約１５．２５歳、約１５．５歳、約１５．７５歳、約１６歳、約１６．２５歳、約１６．５歳、約１６．７５歳、約１７歳、約１７．２５歳、約１７．５歳、または約１７．７５歳である。

【0258】

１つの態様では、本開示の方法は、ｒＡＡＶの全身投与を含み、ここで、全身投与経路は静脈内経路であり、ｒＡＡＶの投与用量は約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。別の態様では、本開示の方法は、ｒＡＡＶの全身投与を含み、ここで、全身投与経路は静脈内経路であり、ｒＡＡＶの投与用量は、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンまたはＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0259】

本開示の方法のうちのいずれかでは、ｒＡＡＶの用量を、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、または約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、または８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇまたは約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、または１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇで投与することができる。特定の態様では、用量またはｒＡＡＶを、約１０ｍＬ／ｋｇで投与する。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンまたはＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0260】

本開示の方法のうちのいずれかでは、ｒＡＡＶの用量を、注射、注入、または移植によって投与することができる。例えば、ｒＡＡＶの用量を、およそ１時間にわたる注入によって投与する。さらに、ｒＡＡＶの用量を、四肢の末梢静脈（腕の末梢静脈または脚の末梢静脈など）を介した静脈内経路によって投与する。あるいは、およそ３０分間、またはおよそ１．５時間、またはおよそ２時間、またはおよそ２．５時間、またはおよそ３時間にわたって注入によって投与され得る。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0261】

本開示の方法のうちのいずれかによって投与されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含むことができる。さらに、本開示の方法のうちのいずれかによって投与されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。例えば、ｒＡＡＶは、配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を含むことができる。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。

【0262】

１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0263】

本開示の方法のうちのいずれかでは、投与されるｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ７．４のｒＡＡＶである。

【0264】

いくつかの態様では、本開示の方法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィを処置する。例示的な態様は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィを処置する方法であって、ある用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを投与する工程を含み、ここで、投与経路が静脈内注入であり、ｒＡＡＶの投与用量が、およそ１時間にわたって約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶベクターが、配列番号９のヌクレオチド配列もしくは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む、方法である。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９もしくは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0265】

筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体の細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルは、ｒＡＡＶの投与後に増加する。細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、ｒＡＡＶの投与前および投与後に生検を実施した筋肉中のウェスタンブロットによってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。特に、マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％または少なくとも約７１％または少なくとも約７２％または少なくとも約７３％または少なくとも約７４％または少なくとも約７５％または少なくとも約７６％または少なくとも約７７％または少なくとも約７８％または少なくとも約７９％または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。

【0266】

さらに、細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、ｒＡＡＶの投与前および投与後の筋生検における免疫組織化学によってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％または少なくとも約７１％または少なくとも約７２％または少なくとも約７３％または少なくとも約７４％または少なくとも約７５％または少なくとも約７６％または少なくとも約７７％または少なくとも約７８％または少なくとも約７９％または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。

【0267】

筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。例えば、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約６５％～約９０％または約６５％～約９５％または約７５％～約９０％または約８０％～約９０％または約８５％～約９５％または約８７％～約９５％または約８７％～約９０％減少する。特に、本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約８７％減少し、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約７２％減少し、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約７３％減少し、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約７８％減少する。あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約９５％減少する。筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体の筋組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維数は、ｒＡＡＶの投与前のマイクロ－ジストロフィン陽性線維数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。例えば、マイクロ－ジストロフィン陽性線維数を、ｒＡＡＶの投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0268】

筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、本明細書中に記載のように、ｒＡＡＶを投与すると、ＤＡＰＣタンパク質（アルファ－サルコグリカンまたはベータ－サルコグリカンなど）の発現が上方制御される。例えば、被験体中のアルファ－サルコグリカンレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカンレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。さらに、被験体中のベータ－サルコグリカンレベルは、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカンレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。アルファ－サルコグリカンまたはベータ－サルコグリカンのレベルを、ｒＡＡＶの投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンまたはベータ－サルコグリカンのタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0269】

筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体における疾患の進行は、６分間歩行試験、立ち上がり所要時間、４段昇り、４段階段昇降、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、タイムアップアンドゴー、および／または粗大運動サブテスト調整（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定した場合に、ｒＡＡＶの投与後に遅延する。

【0270】

例えば、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後にＮＳＡＡスコアが少なくとも１．５、２．０、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５ポイント改善する。さらに、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶ投与前の立ち上がり所要時間と比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後に立ち上がり所要時間が少なくとも約０．８秒改善する。さらに、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶ投与前の４段昇り所要時間試験と比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後に４段昇り所要時間試験が少なくとも約１．２秒改善する。さらに、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶ投与前の１００ｍ計時試験と比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後に１００ｍ計時試験が少なくとも約７秒改善する。

【0271】

別の態様では、本開示は、患者の細胞中でマイクロ－ジストロフィン遺伝子を発現させる方法であって、配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を患者に投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、患者の細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物の投与前および投与後の筋生検におけるウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。さらに、マイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現は、患者において核あたりより多くのベクターゲノム数を検出することによって測定され、ここで、核あたり１ベクターゲノムは約５０％マイクロ－ジストロフィン発現であり、核あたり１コピー超はマイクロ－ジストロフィンの発現レベルと一致する。例えば、細胞は、核あたり１．２ベクターコピー、または核あたり１．３ベクターコピー、または核あたり１．４ベクターコピー、または核あたり１．５ベクターコピー、または核あたり１．６ベクターコピー、または核あたり１．７ベクターコピー、または核あたり１．８ベクターコピー、または核あたり１．９ベクターコピーを有する。

【0272】

いくつかの態様では、本開示は、血清ＣＫレベルを減少させることを必要とする患者において血清ＣＫレベルを低下させる方法であって、患者に配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、患者中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに少なくとも約６５％～約９０％または約６５％～約９５％または約７５％～約９０％または約８０％～約９０％または約８５％～約９５％または約８７％～約９５％または約８７％～約９０％減少する。特に、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約８７％減少し、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約７２％減少し、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約７３％減少し、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約７８％減少し、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置する方法のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約９５％減少する。

【0273】

また、本開示は、患者の筋組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維を増加させる方法であって、患者に配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、マイクロ－ジストロフィン陽性線維数を、ｒＡＡＶの投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。さらに、マイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現は、患者において核あたりより多くのベクターゲノム数を検出することによって測定され、ここで、核あたり１ベクターゲノムは約５０％マイクロ－ジストロフィン発現であり、核あたり１コピー超はマイクロ－ジストロフィンの発現レベルと一致する。例えば、細胞は、核あたり１．２ベクターコピー、または核あたり１．３ベクターコピー、または核あたり１．４ベクターコピー、または核あたり１．５ベクターコピー、または核あたり１．６ベクターコピー、または核あたり１．７ベクターコピー、または核あたり１．８ベクターコピー、または核あたり１．９ベクターコピーを有する。

【0274】

別の態様では、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現を増大させることを必要とする患者においてアルファ－サルコグリカンの発現を増大させる方法であって、患者に配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、アルファ－サルコグリカンレベルを、ｒＡＡＶの投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0275】

さらに、本開示は、ベータ－サルコグリカンの発現を増大させることを必要とする患者においてベータ－サルコグリカンの発現を増大させる方法であって、患者に配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、ベータ－サルコグリカンレベルを、ｒＡＡＶの投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0276】

また、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー筋ジストロフィを有する患者を処置する方法であって、６分間歩行試験、立ち上がり所要時間、４段昇り、４段階段昇降、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、タイムアップアンドゴー、および／または粗大運動サブテスト調整（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定した場合に、患者における疾患の進行が遅延するように、患者に配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0277】

例えば、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後にＮＳＡＡスコアが少なくとも１．５、２．０、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５ポイント改善する。さらに、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶ投与前の立ち上がり所要時間と比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後に立ち上がり所要時間が少なくとも約０．８秒改善する。さらに、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶ投与前の４段昇り所要時間試験と比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後に４段昇り所要時間試験が少なくとも約１．２秒改善する。さらに、方法のうちのいずれかでは、被験体は、ｒＡＡＶ投与前の１００ｍ計時試験と比較して、ｒＡＡＶ投与の少なくとも２７０日後に１００ｍ計時試験が少なくとも約７秒改善する。

【0278】

「線維症」は、傷害時の組織（骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓が挙げられる）における細胞外基質（ＥＣＭ）構成要素の過剰または無秩序な沈着および異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ構成要素としては、フィブロネクチンおよびコラーゲン（例えば、コラーゲン１、コラーゲン２、またはコラーゲン３）が挙げられる。

【0279】

また、本開示は、筋ジストロフィを罹患している被験体における線維症を軽減または予防する方法であって、治療有効量の、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶ；または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを投与する工程を含む、方法を提供する。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７または配列番号６のヌクレオチド５６～５０６６のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。さらなる態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0280】

別の態様では、本開示は、線維症の予防を必要とする被験体における線維症を予防する方法であって、治療有効量の、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列；または配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターを投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、本開示のｒＡＡＶのいずれかを、線維症を予防するために筋ジストロフィを罹患している被験体に投与することができ、例えば、ヒトマイクロ－ジストロフィンタンパク質を発現する本開示のｒＡＡＶを、被験体において線維症が観察される前に投与する。さらに、ヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子を発現する本開示のｒＡＡＶを、線維症を発症するリスクのある被験体（筋ジストロフィ（例えば、ＤＭＤ）を罹患しているか、または診断された被験体など）に投与することができる。本開示のｒＡＡＶを、筋ジストロフィを罹患している被験体に、これらの被験体における新たな線維症を予防するために投与することができる。

【0281】

本開示は、被験体において線維症が観察される前にｒＡＡＶを投与することを意図する。さらに、ｒＡＡＶを、線維症を発症するリスクのある被験体（筋ジストロフィ（例えば、ＤＭＤ）を罹患しているか、または診断された被験体など）に投与することができる。ｒＡＡＶを、線維症をすでに発症している筋ジストロフィを罹患している被験体に、これらの被験体者における新たな線維症を予防するために投与することができる。

【0282】

また、本開示は、筋ジストロフィを罹患している被験体における筋力および／または筋肉量を増加させる方法であって、治療有効量の配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列；または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを投与する工程を含む、方法を提供する。

【0283】

本開示は、被験体において線維症が観察される前、筋力が低下する前、または筋肉量が減少する前に、ＤＭＤと診断された被験体にｒＡＡＶベクターを投与することを意図する。

【0284】

また、本開示は、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列；または配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶを、線維症をすでに発症している筋ジストロフィを罹患している被験体に、これらの被験体者における新たな線維症を予防するために、またはこれらの被験体者における線維症を軽減するために投与することを意図する。また、本開示は、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列；または配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターを、筋力がすでに低下しているか、筋肉量が低下している筋ジストロフィを罹患している被験体に、さらなる傷害から筋肉を保護するために投与することを提供する。

【0285】

また、本開示は、筋ジストロフィ（例えば、ＤＭＤ）を有するヒト被験体における心筋症を処置する方法であって、本明細書中に記載の組成物のうちのいずれか（例えば、デランディストロゲンモキセパルボベック）を前述のヒト被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、この方法を、ＤＭＤを有する被験体における心機能を改善するために使用する。いくつかの態様では、心機能は、例えば、駆出率（ＥＦ）の増加；短縮率（ＦＳ）の増加；拡張期左心室内径（ＬＶＩＤｄ）の減少；左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）の減少；および／または血清トロポニン血中レベルの維持もしくは減少によって改善される。本開示の方法のうちのいずれかでは、被験体は、筋ジストロフィ（ＤＭＤなど）、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィを罹患していてもよい。

【0286】

本明細書中に記載の本開示の方法のうちのいずれかの他の態様では、被験体中の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、以下からなる群から選択される百分率のレベルが減少する：
ａ）投与後９０、１８０、または２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または８５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、８８、９３、または９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０、１８０、または２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、または２７０日までに少なくとも５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）投与後９０、１８０、または２７０日までに少なくとも５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％。

【0287】

別の態様では、本開示は、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体において筋ジストロフィを処置するための組成物であって、前述の組成物は、ある用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含み、前述の組成物は、全身投与経路のために製剤化されており、前述のｒＡＡＶの用量は、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、組成物を提供する。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0288】

例えば、本開示の組成物は、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または 約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１５、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１５、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0289】

１つの態様では、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化され、約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである用量のｒＡＡＶを含む。別の態様では、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化され、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０^１５である用量のｒＡＡＶを含む。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。別の態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0290】

本開示の組成物のうちのいずれかでは、ｒＡＡＶの用量は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、または約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、または８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、または１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇで送達される。特定の態様では、組成物は、約１０ｍＬ／ｋｇで送達される用量のｒＡＡＶを含む。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0291】

本開示の組成物は、注射、注入、または移植による投与のために製剤化される。例えば、組成物は、およそ１時間にわたる注入による投与のために製剤化される。さらに、本開示の組成物は、四肢の末梢静脈（腕の末梢静脈または脚の末梢静脈など）を介した静脈内投与のために製剤化される。あるいは、およそ３０分間、またはおよそ１．５時間、またはおよそ２時間、またはおよそ２．５時間、またはおよそ３時間にわたって注入によって投与され得る。

【0292】

本開示の組成物のうちのいずれかは、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含むｒＡＡＶ、または配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターを含む。

【0293】

特に、本開示の組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィを処置するために使用する。例えば、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィの処置を行うための組成物であって、組成物は、ある用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含み、組成物は、およそ１時間にわたる静脈内注入による投与のために製剤化されており、ｒＡＡＶの投与用量は約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。

【0294】

別の態様では、また、本発明は、線維症を軽減することを必要とする被験体における線維症を軽減するためのｒＡＡＶを含む組成物を提供する。さらに、本開示は、筋ジストロフィを罹患している被験体における線維症を予防するためのｒＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。

【0295】

また、本開示は、筋ジストロフィを罹患している被験体における筋力および／または筋肉量を増加させるためのｒＡＡＶを含む組成物を提供する。さらなる態様では、本開示は、筋ジストロフィの処置のための本開示のｒＡＡＶのうちのいずれかを含む組成物を提供する。

【0296】

本開示の組成物のいずれかの他の態様では、筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体への前述の組成物の投与後、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、以下からなる群から選択される百分率のレベルが減少する：
ａ）投与後９０、１８０、または２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、７０、または８５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、９９、９３、または９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０、１８０、または２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、または２７０日までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）投与後９０、１８０、または２７０日までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％。

【0297】

別の態様では、本開示は、筋ジストロフィの治療を必要とするヒト被験体における筋ジストロフィの治療のための医薬の調製のための、ある用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの使用であって、ここで、医薬は全身投与経路用に製剤化されており、ｒＡＡＶの用量は約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、使用を提供する。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0298】

例えば、医薬は、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または 約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１５、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０^１４、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１５、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０^１４、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０^１４、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0299】

１つの態様では、本開示の医薬は、ある用量のｒＡＡＶの全身投与のために製剤化されており、ここで、全身投与経路は静脈内経路であり、ｒＡＡＶの投与用量は約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。別の態様では、本開示の医薬は、ある用量のｒＡＡＶの全身投与のために製剤化されており、ここで、全身投与経路は静脈内経路であり、ｒＡＡＶの用量は、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約７．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約９．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．２５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約３．７５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0300】

本開示の使用のいずれかでは、医薬は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、または約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、または８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋｇ、または約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、または１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。特定の態様では、用量またはｒＡＡＶは、約１０ｍＬ／ｋｇで送達される用量のｒＡＡＶを含む。１つの態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。１つの態様では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。

【0301】

本開示の使用のいずれかでは、医薬は、注射、注入、または移植による投与のために製剤化される。例えば、医薬は、およそ１時間にわたる注入による投与のために製剤化される。さらに、医薬は、四肢の末梢静脈（腕の末梢静脈または脚の末梢静脈など）を介した静脈内投与のために製剤化される。あるいは、およそ３０分間、またはおよそ１．５時間、またはおよそ２時間、またはおよそ２．５時間、またはおよそ３時間にわたって注入によって投与され得る。

【0302】

本開示の使用のいずれかでは、医薬は、配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含むｒＡＡＶ、または配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む。

【0303】

本開示の特定の用途は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィの処置のための医薬の調製のためである。例えば、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィの処置を必要とするヒト被験体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー型筋ジストロフィの処置のための医薬の調製のための、ある用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの使用であって、ここで、医薬はおよそ１時間にわたる静脈内注入による投与のために製剤化され、ｒＡＡＶの投与用量が約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶは、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む、使用を提供する。

【0304】

さらなる態様では、本開示は、線維症の軽減を必要とする被験体における線維症を軽減するための医薬を調製するためのｒＡＡＶの使用を提供する。例えば、必要とする被験体は、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィなどの筋ジストロフィを罹患している可能性がある。

【0305】

別の態様では、本開示は、筋ジストロフィを罹患している被験体における線維症を予防するための医薬を調製するためのｒＡＡＶの使用を提供する。

【0306】

さらに、本開示は、筋ジストロフィを罹患している被験体の筋力および／または筋肉量を増加させるための医薬を調製するためのｒＡＡＶの使用を提供する。

【0307】

また、本開示は、筋ジストロフィの処置用の医薬を調製するためのｒＡＡＶの使用を提供する。

【0308】

本開示は、筋ジストロフィの処置のための医薬を調製するための配列番号１のヒトマイクロ－ジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２または配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクター、または筋ジストロフィの処置のための配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、もしくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｆ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含むｒＡＡＶベクターの使用を提供する。

【0309】

本開示の使用のうちのいずれかの他の態様では、被験体中の血清ＣＫレベルは、被験体へのｒＡＡＶの投与後、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、以下からなる群から選択される百分率のレベルが減少する：
ａ）投与後９０、１８０、または２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、７０、または９５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、または９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、８８、９３、または９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０、１８０、または２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、または２７０日までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％；および
ｈ）投与後９０、１８０、または２７０日までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％。

【0310】

筋ジストロフィを処置するための組成物または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用のうちのいずれかでは、被験体の細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現レベルは、組成物または医薬の投与後に増加する。細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、組成物または医薬の投与前および投与後に生検を実施した筋肉中のウェスタンブロットによってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。特に、マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、組成物の投与後に少なくとも約７０％または少なくとも約７１％または少なくとも約７２％または少なくとも約７３％または少なくとも約７４％または少なくとも約７５％または少なくとも約７６％または少なくとも約７７％または少なくとも約７８％または少なくとも約７９％または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。

【0311】

さらに、細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、組成物または医薬の投与前および投与後の筋生検における免疫組織化学によってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、または少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、または少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルは、組成物または医薬の投与前のマイクロ－ジストロフィンレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に少なくとも約７０％または少なくとも約７１％または少なくとも約７２％または少なくとも約７３％または少なくとも約７４％または少なくとも約７５％または少なくとも約７６％または少なくとも約７７％または少なくとも約７８％または少なくとも約７９％または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％増加する。

【0312】

筋ジストロフィを処置するための組成物のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。例えば、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約６５％～約９０％または約６５％～約９５％または約７５％～約９０％または約８０％～約９０％または約８５％～約９５％または約８７％～約９５％または約８７％～約９０％減少する。特に、本開示の筋ジストロフィを処置するための組成物のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約８７％減少するか、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置するための組成物または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用のいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約７２％減少するか、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置するための組成物のうちのいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約７３％減少するか、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置するための組成物または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用のいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約７８％減少するか、あるいは本開示の筋ジストロフィを処置するための組成物または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用のいずれかでは、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約９５％減少する。筋ジストロフィを処置するための組成物または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用のうちのいずれかでは、被験体の筋組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維数は、組成物または医薬の投与前のマイクロ－ジストロフィン陽性線維数と比較して、組成物または医薬の投与後に増加する。例えば、マイクロ－ジストロフィン陽性線維数を、組成物または医薬の投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0313】

筋ジストロフィを処置するための組成物または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用のうちのいずれかでは、組成物または医薬を投与すると、ＤＡＰＣタンパク質（アルファ－サルコグリカンまたはベータ－サルコグリカンなど）の発現が上方制御される。例えば、被験体中のアルファ－サルコグリカンレベルは、組成物または医薬の投与前のアルファ－サルコグリカンレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に増加する。さらに、被験体中のベータ－サルコグリカンレベルは、組成物または医薬の投与前のベータ－サルコグリカンレベルと比較して、組成物または医薬の投与後に増加する。アルファ－サルコグリカンまたはベータ－サルコグリカンのレベルを、組成物または医薬の投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンまたはベータ－サルコグリカンのタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0314】

筋ジストロフィを処置するための組成物または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用のうちのいずれかでは、被験体における疾患の進行は、６分間歩行試験、立ち上がり所要時間、４段昇り、４段階段昇降、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、タイムアップアンドゴー、および／または粗大運動サブテスト調整（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定した場合に、組成物または医薬の投与後に遅延する。

【0315】

例えば、筋ジストロフィを処置するための組成物のいずれかの投与または筋ジストロフィを処置するための医薬の使用の後に、被験体は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後にＮＳＡＡスコアが少なくとも１．５、２．０、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５ポイント改善する。さらに、方法のうちのいずれかでは、被験体は、組成物または医薬の投与前の立ち上がり所要時間と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に立ち上がり所要時間が少なくとも約０．８秒改善する。さらに、本開示の方法または使用のいずれかでは、被験体は、組成物または医薬の投与前の４段昇り所要時間試験と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に４段昇り所要時間試験が少なくとも約１．２秒改善する。さらに、本開示の方法または使用のいずれかでは、被験体は、組成物または医薬の投与前の１００ｍ計時試験と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に１００ｍ計時試験が少なくとも約７秒改善する。

【0316】

別の態様では、本開示は、配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を含む、患者の細胞中でマイクロ－ジストロフィン遺伝子を発現させための組成物を提供する。さらなる態様では、本開示は、患者の細胞中でマイクロ－ジストロフィン遺伝子を発現させるための医薬の調製のための、ある用量の配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物の使用を提供する。例えば、患者の細胞中のマイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現を、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の投与前および投与後の筋生検におけるウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってマイクロ－ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。さらに、マイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現は、患者において核あたりより多くのベクターゲノム数を検出することによって測定され、ここで、核あたり１ベクターゲノムは約５０％マイクロ－ジストロフィン発現であり、核あたり１コピー超はマイクロ－ジストロフィンの発現レベルと一致する。例えば、細胞は、核あたり１．２ベクターコピー、または核あたり１．３ベクターコピー、または核あたり１．４ベクターコピー、または核あたり１．５ベクターコピー、または核あたり１．６ベクターコピー、または核あたり１．７ベクターコピー、または核あたり１．８ベクターコピー、または核あたり１．９ベクターコピーを有する。

【0317】

さらなる態様では、本開示は、血清ＣＫレベルを減少させることを必要とする患者において血清ＣＫレベルを低下させるための組成物であって、組成物は、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。さらに、本開示は、血清ＣＫレベルを減少させることを必要とする患者において血清ＣＫレベルを低下させるための医薬の調製のための、ある用量の配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の使用を提供する。例えば、患者中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに少なくとも約６５％～約９０％または約６５％～約９５％または約７５％～約９０％または約８０％～約９０％または約８５％～約９５％または約８７％～約９５％または約８７％～約９０％減少する。特に、被験体中の血清ＣＫレベルは、組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約８７％減少するか、あるいは組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約７２％減少するか、あるいは組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約７３％減少するか、あるいは組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約７８％減少するか、あるいは組成物または医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物または医薬の投与後６０日までに約９５％減少する。

【0318】

また、本開示は、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む、患者の筋組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維を増加させるための組成物を提供する。さらに、本開示は、患者の筋組織中のマイクロ－ジストロフィン陽性線維を増加させるための医薬の調製のための、ある用量の配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の使用を提供する。例えば、マイクロ－ジストロフィン陽性線維数は、組成物または医薬の投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出する。さらに、マイクロ－ジストロフィン遺伝子の発現は、患者において核あたりより多くのベクターゲノム数を検出することによって測定され、ここで、核あたり１ベクターゲノムは約５０％マイクロ－ジストロフィン発現であり、核あたり１コピー超はマイクロ－ジストロフィンの発現レベルと一致する。例えば、細胞は、核あたり１．２ベクターコピー、または核あたり１．３ベクターコピー、または核あたり１．４ベクターコピー、または核あたり１．５ベクターコピー、または核あたり１．６ベクターコピー、または核あたり１．７ベクターコピー、または核あたり１．８ベクターコピー、または核あたり１．９ベクターコピーを有する。

【0319】

別の態様では、本開示は、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む、アルファ－サルコグリカンの発現を増大させることを必要とする患者においてアルファ－サルコグリカンの発現を増大させるための組成物を提供する。また、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現を増大させることを必要とする患者においてアルファ－サルコグリカンの発現を増大させるための医薬の調製のための、ある用量の配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の使用を提供する。例えば、アルファ－サルコグリカンレベルを、組成物または医薬の投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0320】

さらに、本開示は、配列番号９、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む、ベータ－サルコグリカンの発現を増大させることを必要とする患者においてベータ－サルコグリカンの発現を増大させるための組成物を提供する。また、本開示は、ベータ－サルコグリカンの発現を増大させることを必要とする患者においてベータ－サルコグリカンの発現を増大させるための医薬の調製のための、配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の使用を提供する。例えば、ベータ－サルコグリカンレベルを、組成物または医薬の投与前または投与後の筋生検に対するウェスタンブロットまたは免疫組織化学によってベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出する。

【0321】

また、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィまたはベッカー筋ジストロフィを有する患者を処置するための医薬の調製のための、ある用量の配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、または配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の使用であって、前述の医薬の投与により、６分間歩行試験、立ち上がり所要時間、４段昇り、４段階段昇降、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、タイムアップアンドゴー、および／または粗大運動サブテスト調整（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定した場合に、患者における疾患の進行が遅延する、使用を提供する。

【0322】

例えば、被験体は、組成物または医薬の投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日間後にＮＳＡＡスコアが少なくとも１．５、２．０、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５ポイント改善する。さらに、被験体は、組成物または医薬の投与前の立ち上がり所要時間と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に立ち上がり所要時間が少なくとも約０．８秒改善する。さらに、被験体は、組成物または医薬の投与前の４段昇り所要時間試験と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に４段昇り所要時間試験が少なくとも約１．２秒改善する。さらに、被験体は、組成物または医薬の投与前の１００ｍ計時試験と比較して、組成物または医薬の投与の少なくとも２７０日後に１００ｍ計時試験が少なくとも約７秒改善する。

【0323】

概要および要約の節ではなく、詳細な説明の節がクレームを解釈するために使用されることが意図されると認識すべきである。概要および要約の節は、本発明者（複数可）が予期する本開示の１またはそれを超える例示的な態様を記載しているが全てではない可能性があり、したがって、いかなる方法によっても本開示および添付のクレームを制限することを意図しない。

【0324】

以下の実施例は、例示として提供されるものであり、本発明を限定するものではない。記載の数値範囲は、各範囲内の各整数値ならびに記載された整数の最小値および最大値を含む。

【実施例】

【0325】

実施例
実施例１
Ａ）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の生成
ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンプラスミドは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接したヒトマイクロ－ジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含む（図１を参照のこと）。マイクロ－ジストロフィン構築物は、インフレームのロッド欠失（Ｒ４－Ｒ２３）を特徴としていた一方で、ヒンジ１、２、および４、ならびにシステインリッチドメインは依然として１３８ｋＤａタンパク質を産生する。マイクロ－ジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９２ｂｐ）によってガイドされた。プラスミドを、ＭＣＫプロモーターを除去し、ＭＨＣＫ７プロモーターを挿入することによって、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロ－ジストロフィンプラスミドから構築した。コアプロモーターの後に、５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）が効率的な転写開始のために存在し、ＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（１５０ｂｐ）および小型５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロ－ジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始コドンおよびｍＲＮＡ終結のための小型の５３ｂｐ合成ポリＡシグナルの直前にコンセンサスＫｏｚａｋを有していた。ヒトマイクロ－ジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，２５３－２６１（２００２））によって以前に記載された（Ｒ４－Ｒ２３／Δ７１－７８）ドメインを含んでいた。相補ＤＮＡは、ヒトで使用するためにコドン最適化されており、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８，１０９－１１７（２０１０））によって合成した。このベクター中に含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスのＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なＡＡＶ２の逆位末端反復であった。マイクロ－ジストロフィンカセットは、ｍＲＮＡ終結のための小型５３ｂｐ合成ポリＡシグナルを有する。

【0326】

以前の研究において、ＭＨＣＫ７プロモーターを使用した心臓での発現（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５、３２０－３２９（２００７）ならびにＡＡＶｒｈ７４が骨格筋、横隔膜、および心筋で発現すること（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，２５６－２７０（２０１５））が立証されており、図１の構築物の配列を、ＡＡＶｒｈ．７４ビリオン中にキャプシド化した。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンを、アカゲザルリンパ節からクローン化した。これはＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）で考察されている。

【0327】

表１は、プラスミドＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン分子（配列番号３）の特徴を示す。

【表1】

Ｂ）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物
およびカナマイシン（Ｋａｎ）耐性をコードするプラスミドの生成

【0328】

ＭＨＣＫ７．μＤｙｓ．ＫＡＮのクローン化を、ＭＨＣＫ７．μＤｙｓ．ＡＭＰプラスミドおよびカナマイシンバックボーンからＭＨＣＫ７．μＤｙｓ断片を単離し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用してこれらをアニーリングすることによって行った。ＭＨＣＫ７．μＤｙｓ断片を、ＳｎａＢＩでの制限酵素消化によって単離した。５０μＬの総反応体積にて１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）および１μＬ ＳｎａＢＩ中、３７℃で１時間消化を行った。得られた断片を、１％アガロースゲルを用い、１０５ボルトで１．５時間運転した電気泳動によって単離した。ＭＨＣＫ７．μＤｙｓインサートに対応するバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。得られた断片は、ＤＮＡ濃度が１０ｎｇ／μＬであった。Ｋａｎバックボーン断片を、５０μＬの反応体積にて１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）および１μＬ ＸｂａＩを用いた３７℃で１時間のＸｂａＩ制限酵素消化によって単離した。得られた断片を、１％アガロースゲルを用い、１０５ボルトで１．５時間運転した電気泳動によって単離した。Ｋａｎバックボーンに対応するバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）によって精製した。得られた断片は、ＤＮＡ濃度が８．１ｎｇ／μＬであった。２つの断片を、重複配列と有する２つの断片を接合することができるＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用してアニーリングした。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニング反応を、製造者のプロトコールに従って、総体積２０μＬについて１×ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックス中で比率１：１のＭＨＣＫ７．μＤｙｓおよびカナマイシンバックボーンを使用して、５０℃で１５分間行った。得られたクローンを、２．５μＬクローニング産物を細胞に添加し、その後に氷上に３０秒間、次いで、４２℃で３０秒間、および氷上でさらに５分間置くことによってＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃ３０４０）に形質転換した。形質転換後、９５０μＬの増殖培地を細胞に添加し、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１．５時間成長させた。増殖後、４５０μＬのこれらの細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンＬＢ寒天プレートにプレートし、乾燥インキュベーター内で３０℃で一晩インキュベートした。コロニーをこのプレートから採取し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ内で一晩成長させた。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、３ｍＬのこの培養物からＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、クローニング産物を確認するために使用した。クローニング産物を、ＰｍｅＩ、ＭｓｃＩ、およびＳｍａＩによる制限酵素消化、それに続くゲル電気泳動によって確認した。クローニング産物を、配列決定によって追加で確認した。得られたプラスミドを、配列番号８に記載し、図１４および１５に示す。配列番号９の配列に対応する図１３の構築物の配列、および配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を、上記のＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにキャプシド化した。
実施例２
デュシェンヌ型筋ジストロフィの全身遺伝子送達臨床試験

【0329】

これは、ＤＭＤ被験体についての配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを使用した単一用量対照試験であった。コホートＡは、３ヶ月から３歳までの６人の被験体を含んでおり、コホートＢは、４歳から７歳までの６人の被験体を含んでいた。全ての被験体に、静脈内マイクロ－ジストロフィンベクター（１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を投与した。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．００１％ポロクサマー１８８を含む緩衝液中で製剤化した。

【0330】

この研究では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを、体内の全ての筋肉に到達することができるように、腕の末梢静脈を介して注入した。コホートＡ中の３ヶ月から３歳までの６人のＤＭＤ被験体、およびコホートＢ中の４歳から７歳までの６人のＤＭＤ被験体が登録された。全ての被験体に、静脈内マイクロ－ジストロフィンベクター（１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を投与した。投与用量についてのカプセル化ベクターゲノムの力価を、ＭＨＣＫ７プロモーターに指向するプライマーを用いたＰｒｉｓｍ７５００ Ｔａｑｍａｎ検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する定量ＰＣＲを使用して、スーパーコイルＤＮＡプラスミド標準と比較して決定した（Ｐｏｚｓｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（４）：８５５－８６９（２０１７））。

【0331】

被験体に、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの小児集中治療室（ＰＩＣＵ）で１時間にわたって注入を行った。遺伝子治療の前に、筋生検をスクリーニング来院時に行った。被験体は、送達９０日後に遺伝子が喪失ジストロフィンタンパク質と置き換えられたかを決定するための第２の筋生検を受けるであろう。遺伝子導入後、患者を、処置による任意の副作用について慎重にモニタリングした。このモニタリングには、遺伝子注射に由来する副作用がないことを確認するためのスクリーニング来院中および０、１、７、１４、３０、６０、９０、および１８０日目、ならびに９、１２、１８、２４、３０、および３６ヶ月目の血液検査および尿検査、ならびに身体検査を含んでいた。

【0332】

コホートＡの被験体（ｎ＝６）は、３ヶ月から３歳の間であり、この被験体にｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンベクター（１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。遺伝子導入の１日前に、コホートＡの被験体に対して、プレドニゾンまたはデフラザコルト１ｍｇ／ｋｇを開始し、免疫応答をモニタリングしながら３０日間維持した。３０日目に陰性の場合、ステロイドを１週間にわたって休薬した。ＡＡＶまたはマイクロ－ジストロフィンに対するＴ細胞応答が１２５ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣを超える場合、ステロイドレベルをこの閾値未満に低下するまで維持した。

【0333】

コホートＢの被験体（ｎ＝６）は、４歳から７歳の間であり、この被験体にｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンベクター（１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０^１４ｖｇ／ｋｇを静脈内投与した。これらの被験体に対して、試験を通して安定な用量のコルチコステロイドを維持したが、ＡＡＶまたはマイクロ－ジストロフィンに対するＴ細胞応答が１２５ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣを超える場合は、短期間増量する場合があった。
適格基準

【0334】

研究の選択基準は以下の通りであった：
・参加年齢：コホートＡ：３ヶ月から７歳まで、およびコホートＢ：４～７歳の間（両端の数値を含む）。
・分子がフレームシフト（欠失または重複）を有するＤＭＤ遺伝子、またはエクソン１８から５８までの間の未熟終止コドン変異を特徴とすること。
・１０００Ｕ／Ｌを超えるＣＫの上昇
・コホートＡ被験体：９以下の調整スコアとして定義される粗大運動についてのＢａｙｌｅｙ－ＩＩＩ運動査定が平均未満
・コホートＢ：推定８０％未満として定義される１００メートル計時試験が平均未満
・任意の人種集団の男性。
・運動査定試験に協力できること。
・コホートＡ被験体：以前にコルチコステロイドで処置されていないこと。
・コホートＢ被験体：スクリーニングおよび投与前の少なくとも１２週間の経口コルチコステロイドと等価な安定用量が、研究を通して一定（体重変化に適応させるための修正を除く）のままであることが予想されること。

【0335】

研究の除外基準は、以下の通りであった：
・臨床所見に基づいた活動性ウイルス感染。
・心筋症の兆候（駆出率４０％未満の心エコー図が挙げられる）。
・ＨＩＶ感染、またはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠。
・自己免疫疾患の診断（または処置中）
・臨床的に有意とみなされる異常な臨床検査値
・ＰＩの意見による、遺伝子導入の不必要なリスクが生じる併発疾患または慢性薬物処置の必要性。
・ＥＬＩＳＡ免疫アッセイによって判定した場合のＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶ８の抗体価が１：４００を超える被験体。
・治験責任医師の意見によると、被験体がプロトコールに必要とされる試験もしくは手技に従う能力を損ない得るか、患者の福祉、安全性、または臨床上の解釈可能性を損ない得る病状または酌量すべき病状。
・遺伝子導入のための来院の４週間前以内の重度の感染症（例えば、肺炎、腎盂腎炎、または髄膜炎）（参加は延期され得る）。
・この試験のためのスクリーニングの最後の６ヶ月前に、実験または他の目的で任意の研究中の薬剤（コルチコステロイド以外）またはエクソンスキッピング剤（ＥｘｏｎＤｙｓ５１（登録商標）が挙げられる）を投与されていること。
・任意のタイプの遺伝子治療、細胞ベースの治療（例えば、幹細胞移植）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９治療を受けていたこと。
・家族が、患者の研究参加をかかりつけ医および他の医療提供者に開示することを望まない場合。
アウトカム尺度

【0336】

主要アウトカム尺度は、有害事象（時間枠：３年間）を有する参加者数に基づくと安全であった。有害作用をモニタリングし、重症度および研究項目に対する関係性についてスコアリングした。

【0337】

副次アウトカム尺度は以下の通りであった：

【0338】

粗大運動サブテスト調整（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年間）：粗大運動調整スコアにより、運動発達を測定した。Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ粗大運動サブテストにより、コホートＡについて３０日目から開始して３年間にわたって追跡来院毎にスコアリングした。スクリーニング時点で４３～４７ヶ月（両端の数値を含む）であった任意の被験体は、４２ヶ月の小児の基準データと比較して計算された調整スコアを有していた。Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩから、１～４２ヶ月の小児についての基準データを得た。

【0339】

理学療法査定である１００メートル計時試験（１００ｍ）（時間枠：スクリーニング、３０日間～３年間）：１００ｍは、コホートＢの主要運動アウトカムであった。１００メートル計時試験は、小児が３歳になってからできるだけ早期にコホートＡについて開始される診査アウトカムであった。

【0340】

理学療法査定であるノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年間）：ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）は、小児が４歳になってからできるだけ早期のコホートＡおよびコホートＢについて開始される診査アウトカムであった。ＮＳＡＡは、デュシェンヌ型筋ジストロフィを有する男児における歩行の質を測定する。

【0341】

理学療法査定である小児のために修正されたタイムアップアンドゴー（ＴＵＧ）（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年間）：コホートＢのための診査アウトカムは、小児のために修正されたタイムアップアンドゴー（ＴＵＧ）を含んでいた。

【0342】

理学療法査定である４段階段昇降（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年間）：コホートＢのための診査アウトカムは、４段階段昇降を含むであろう。

【0343】

理学療法査定であるハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）（時間枠：スクリーニング、３０日目～３年間）：コホートＢのための診査アウトカムは、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についてのハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）を含んでいた。

【0344】

免疫蛍光によるマイクロ－ジストロフィン遺伝子発現の定量（時間枠：スクリーニング、９０日目）：マイクロ－ジストロフィン遺伝子発現レベルを、免疫蛍光によって定量し、筋生検の前および後に比較した。

【0345】

ウェスタンブロットによるマイクロ－ジストロフィン遺伝子発現の定量（時間枠：スクリーニング、９０日目）：マイクロ－ジストロフィン遺伝子発現レベルを、ウェスタンブロット分析によって定量し、筋生検の前および後に比較した。

【0346】

遺伝子治療後のＣＫの減少（時間枠：３年間）：循環血中のＣＫレベルの減少。

【0347】

心臓の磁気共鳴画像法（１年目）。
マイクロ－ジストロフィン遺伝子発現

【0348】

免疫蛍光（ＩＦ）線維強度を介したマイクロ－ジストロフィン発現のベースラインからの変化を、分析および定量した。表２に示すように、被験体１（５歳）では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に腓腹筋生検の筋線維中の７８％のマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現が実証された；被験体２（４歳）では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に腓腹筋生検の筋線維中の７３．５％のマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現が実証された；被験体３（６歳）では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に腓腹筋生検の筋線維中の７７．０％のマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現が実証された。被験体４（４歳）では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に腓腹筋生検の筋線維中の９６．２％のマイクロ－ジストロフィン発現が実証された。全患者は、形質導入されたマイクロ－ジストロフィンの頑強な発現を示し、これは、免疫組織化学によって測定した場合に筋線維鞘に適切に局在化されている（図７）。

【表2】

【0349】

また、ベースラインから６０日目までのマイクロ－ジストロフィン遺伝子発現の変化を、生検を行った筋組織のウェスタンブロットによって測定したマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現の定量によって査定した。図８Ａおよび８Ｂに示すように、ウェスタンブロット分析により、被験体１（５歳）、被験体２（４歳）、および被験体３（６歳）においてマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現が検出された。図８Ｃは、被験体４（４歳）におけるマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現を検出するウェスタンブロット分析を提供する。全ての処置後生検は、ウェスタンブロットによって測定した場合に健全なレベルのマイクロ－ジストロフィンを示し、被験体１～４の平均は、方法１を利用して正常と比較した場合に７４．３％であり、脂肪線維および線維性組織について調整している方法２に従って正常と比較した場合に９５．８％であった。

【0350】

各被験体について、筋線維の核あたりのベクターゲノムコピー数を測定した。表３に示すように、ヌクレアーゼあたりのベクターゲノムコピー数は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に被験体の各々について１を超えていた。１コピーのベクターは、マイクロ－ジストロフィン遺伝子のおよそ５０％発現を示す。細胞核あたり平均１．６個のベクターコピー数が被験体１～３で測定され、これは、観察された高マイクロ－ジストロフィン発現レベルと一致していた。被験体４の値を含んだ場合、平均ベクターコピー数／μｇＤＮＡは１０^５を超え、細胞核あたり平均ベクターコピー数は３．３であった。

【表3】

【0351】

筋生検組織におけるアルファ－サルコグリカンおよびベータ－サルコグリカンのタンパク質レベルを、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与前および投与後の免疫組織化学によって測定した。また、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７の投与により、被験体におけるＤＡＰＣタンパク質が上方制御された。図９に示すように、筋生検組織中のアルファ－サルコグリカンおよびベータ－サルコグリカンの発現は、被験体１（図９Ａ）、被験体２（図９Ｂ）、および被験体３（図９Ｃ）において、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７の投与前の筋生検中のこれらのタンパク質のレベルと比較して増加した。
循環血清ＣＫレベル

【0352】

血液試料を、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンベクター（１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）の静脈内注入による投与後３０日毎に得た。ＣＫレベルを、各来院時に測定し、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与前（来院０日目）に得たベースラインレベルと比較した。ベースライン血清ＣＫレベル（単位／リットル）を、以下の表４に提供する。図１０に示すように、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与２ヶ月後に循環血清ＣＫレベルが約８７％減少した。全被験体は、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルの有意な減少を示し、処置２ヶ月後の平均ＣＫ減少率は８７％を超えた（ｎ＝３）。ＣＫは、筋損傷に関連する酵素であり、ＤＭＤを有する患者は、高レベルのＣＫを一様に示す。実際、有意に上昇したＣＫは、ＤＭＤの予備診断ツールとして使用されることが多く、次いで、確認のための遺伝子検査が続く。

【0353】

表４および図１０は、各被験体についてのＣＫレベルを提供する。図１１は、経時的な平均ＣＫレベルを提供し、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの投与後に平均ＣＫレベルが経時的に有意に減少することを実証している。平均ベースラインＣＫレベル２７，０６４Ｕ／Ｌ（表４の平均）は、平均９，９８２Ｕ／Ｌ（平均、２７０日目、表５）まで約６３％減少する。

【表4】

【表5】

有効性の査定

【0354】

マイクロ－ジストロフィンおよびＣＫレベルに加えて、以下の機能試験によって有効性を測定した：床からの立ち上がり所要時間、４段昇り、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、立ち上がり所要時間試験、四段階段昇り試験、１０メートル計時試験（１０ｍ）、および１００メートル計時試験（１００ｍ）。データを以下の表６および表７に提供し、このデータは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン投与の９ヶ月後の時点で、一貫性のある永続的な改善を実証している。また、ＮＳＡＡの経時的な改善を、図１２に提供する。

【表6】

【表7】

安全性の査定

【0355】

研究において重篤な有害事象（ＳＡＥ）は認められなかった。３人の被験体でガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）が上昇したが、１週間以内にステロイドを増量することによって解決され、ベースラインに戻った。他の臨床的に有意な検査所見は認められなかった。患者は、一般に治療の第１週中に一過性の嘔気を生じ、これは、ステロイドの投与量の増加と一致した。これは、肝臓酵素の上昇やいかなる他の異常とも相関しなかった。
実施例３
無作為化二重盲検プラセボ対照全身遺伝子
送達第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験

【0356】

これは、ＤＭＤ被験体についてのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを使用した無作為化二重盲検単回用量試験である。この研究は、２４人の４～７歳の被験体を含んでいた。被験体を、参加時に処置群またはプラセボ群に無作為化した。１２人の被験体に、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンベクター（およそ１０ｍＬ／ｋｇ中２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、１３人の被験体に、１０ｍＬ／ｋｇプラセボ（乳酸加リンゲル液）を投与した。プラセボ被験体は、１２人の予め処置された被験体と同一の様式で施される処置を、最後の処置被験体への投与１年後に受けるであろう。被験体に、マイクロ－ジストロフィンを保有するｒＡＡＶまたは乳酸加リンゲル液をおよそ１時間にわたって注入する。処置前および処置後（９０日後）の針筋生検を腓腹筋に対して行う。

【0357】

この研究の主目的は、四肢の末梢静脈を介したＤＭＤ被験体のためのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンの静脈内投与の安全性の査定である。安全性エンドポイントを、血液学、血清化学、尿検査、ｒＡＡＶｒｈ７４およびマイクロ－ジストロフィンに対する免疫応答、ならびに報告された病歴および徴候の所見の変化によって査定する。ジストロフィン遺伝子発現は、安全性と共に主要アウトカム尺度としての機能を果たす。立証済みの免疫蛍光および免疫ブロットアッセイを使用して定量する。遺伝子治療後のＣＫの減少は、二次アウトカムとしての機能を果たす。以下の機能試験によって有効性を測定する：立ち上がり所要時間、４段昇り、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時試験（１０ｍ）、１００メートル計時試験（１００ｍ）。診査尺度としては、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についてのハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）が挙げられる。

【0358】

研究のための選択基準は、以下の通りである：
・参加年齢：４～７歳の間（両端の数値を含む）。
・分子がフレームシフト（欠失または重複）を有するＤＭＤ遺伝子、またはエクソン１８から５８までの間の未熟終止コドン変異を特徴とすること。
・症候性筋ジストロフィの指標：１０００Ｕ／Ｌを超えるＣＫ上昇および１００メートル歩行試験での平均推定時間の百分率未満
・任意の人種集団の男性が適格であろう。
・運動査定試験に協力できること。
・スクリーニングおよび投与前の少なくとも１２週間の経口コルチコステロイドと等価な安定用量が、研究を通して一定（体重変化に適応させるための考え得る修正を除く）のままであることが予想されること。

【0359】

研究の除外基準は、以下の通りである：
・臨床所見に基づいた活動性ウイルス感染。
・心筋症の兆候（駆出率４０％未満の心エコー図が挙げられる）。
・ＨＩＶ感染、またはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠。
・自己免疫疾患の診断（または処置中）
・臨床的に有意とみなされる異常な臨床検査値（ＧＧＴ ３×ＵＬＮ超、ビリルビン３．０ｍｇ／ｄＬ以上、クレアチニン１．８ｍｇ／ｄＬ以上、Ｈｇｂ ８ｇ／Ｄｌ未満または１８ｇ／Ｄｌ超；ＷＢＣ１８，５００／ｃｍｍ超）、血小板５０，０００以下）。
・ＰＩの意見による、遺伝子導入の不必要なリスクが生じる併発疾患または慢性薬物処置の必要性。
・ＥＬＩＳＡ免疫アッセイによって判定した場合のＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶ８の抗体価が１：４００を超える被験体。エンドポイント力価がスクリーニング時に陽性である場合、除外前に試験を繰り返し得る。
・治験責任医師の意見によると、被験体がプロトコールに必要とされる試験もしくは手技に従う能力を損ない得るか、患者の福祉、安全性、または臨床上の解釈可能性を損ない得る病状または酌量すべき病状を有すること。
・遺伝子導入のための来院の４週間前以内の重度の感染症（例えば、肺炎、腎盂腎炎、または髄膜炎）（参加は延期され得る）。
・この研究のためのスクリーニングの最後の６ヶ月前に、実験または他の目的で任意の試験中の薬剤（コルチコステロイド以外）またはエクソンスキッピング剤（ＥｘｏｎＤｙｓ５１（登録商標）が挙げられる）を投与されていたこと。
・任意のタイプの遺伝子治療、細胞ベースの治療（例えば、幹細胞移植）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９治療を受けていたこと。
・家族が、患者の研究参加をかかりつけ医および他の医療提供者に開示することを望まない場合。
有効性の査定

【0360】

ジストロフィン遺伝子発現は、安全性と共に主要アウトカム尺度としての機能を果たす。立証済みの免疫蛍光および免疫ブロットアッセイを使用して定量する。遺伝子治療後のＣＫの減少は、二次アウトカムとしての機能を果たす。さらに、以下の機能試験によって有効性を測定する：床からの立ち上がり所要時間、４段昇り、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時試験（１０ｍ）、１００メートル計時試験（１００ｍ）］。診査尺度としては、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についてのハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）が挙げられる。

【0361】

超音波誘導を用いた筋生検を使用して、ベースラインと９０日目を比較して導入遺伝子発現を定量する。最初の生検と同一の筋肉であるが、反対側の脚の筋肉に対して生検を行う。全被験体が投与された１年後に、プラセボクロスオーバー被験体は、来院１日目に研究タイムラインを再開するであろう。プラセボ被験体は、第２のベースラインスクリーニングで以下を行わないであろう：心臓ＭＲＩおよび筋生検。プラセボ被験体は、９０日目に筋生検を受ける（合計で３回の筋生検）。凍結切片を、間接的免疫蛍光（ＩＦ）を使用してジストロフィンについて染色する。スライドのフルスキャニングを行い、マイクロ－ジストロフィンの強度および陽性線維率を、立証済みの画像走査およびＭｕｓｃｌｅＭａｐ（商標）解析アルゴリズムを使用して定量する。筋肉の形態計測（線維サイズヒストグラムが挙げられる）を盲検で行う。盲検による凍結筋生検切削物を使用して、立証済みのウェスタンブロット法を使用したマイクロ－ジストロフィンについてのタンパク質定量分析を行う。

【0362】

腓腹筋の筋肉針生検（ＰＩによって特定の被験体には禁忌とされるとみなされない場合に限る。禁忌の場合、ＰＩは代替の筋肉生検を選択するであろう）を使用して、マイクロ－ジストロフィン発現を定量する。
有効性分析

【0363】

主要有効性エンドポイントは、生検を行った筋組織のウェスタンブロットによって測定した場合のマイクロ－ジストロフィンタンパク質の発現量におけるベースラインから９０日目までの変化である。処置群の主要有効性エンドポイントの相違を、固定因子としての処置および共変量としてのベースライン値を用いた共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）モデルを用いて査定する。ウィルコクソンの順位和検定を、支援的分析として行う。免疫蛍光（ＩＦ）線維強度を介したマイクロ－ジストロフィン発現のベースラインからの変化を、同様に分析する。

【0364】

支援的有効性エンドポイントは、床からの立ち上がり所要時間、４段昇り、ＮＳＡＡ、１０メートル計時試験（１０ｍ）、１００メートル計時試験（１００ｍ）、およびＣＫ変化の各々の予定された査定に対するベースラインからの変化を含む。診査尺度は、膝伸筋および膝屈筋、ならびに肘屈筋および肘伸筋についてのＨＨＤを含む。処置群の差を、固定因子としての処置および共変量としてのベースライン値を用いたＡＮＣＯＶＡモデルを用いて査定する。ウィルコクソンの順位和検定を、支援的分析として行う。
実施例４

【0365】

上記の実施例２および３に記載の試験および研究を、配列番号９に記載の；配列番号８（ヌクレオチド１～４９７７）に記載の；または配列番号６（ヌクレオチド５６～５０２２）に記載のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を代わりに利用して行う。
実施例５
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロ－ジストロフィン構築物の生成

【0366】

ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロ－ジストロフィンプラスミドを、コドン最適化されたヒトマイクロ－ジストロフィンｃＤＮＡ配列を駆動するＭＣＫ発現カセットを、ＡＡＶクローニングベクターｐｓｕｂ２０１に挿入することによって構築した（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１０）：３０９６－３１０１（１９８７））。筋特異的制御エレメントを、筋特異的遺伝子発現を駆動するために構築物中に含めた。この制御エレメントは、３５１ｂｐ ＭＣＫコアプロモーター（近位）に融合したマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）を含んでいた。コアプロモーターの後に、構築物は、効率的な転写開始のための５３ｂｐ内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）を含み、ＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）および小型５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来していた。マイクロ－ジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前のコンセンサスＫｏｚａｋおよびｍＲＮＡ終結のための小型５３ｂｐ合成ポリＡシグナルを有する。Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（３）：２５３－６１（２００２）によって以前に記載のように、ヒトマイクロ－ジストロフィンカセットは、（Ｒ４－Ｒ２３／Δ７１－７８）ドメインを含む。

【0367】

ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロ－ジストロフィンプラスミドは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接したヒトマイクロ－ジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含んでいた（図５を参照のこと）。この配列を、ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにキャプシド化した。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンを、アカゲザルリンパ節からクローン化した。これはＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に記載されている。
実施例６
ハイブリッドシードトレイン拡大を使用したｒＡＡＶ産生

【0368】

以下の過程を使用して、本明細書中に記載のｒＡＡＶ構築物を産生することができる。

【0369】

ＨＥＫ－２９３細胞を、接着条件で４回継代した。最後から２番目の拡大培養に入る前に、細胞を採取し、遠心分離して血清を洗い流し（３００ｇで５分間）、懸濁振盪フラスコ中の無血清成長培地（ＥＸＰＩ２９３）中にて播種密度０．５＋Ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁した。次いで、細胞を４８～７２時間成長させて細胞数を拡大した。次いで、懸濁細胞を回収し、バイオリアクターへの接種に必要な生存細胞数に応じて振とうフラスコ中またはＷＡＶＥバッグ中に接種した。７２時間後に、生存細胞の濃度を、セルカウンティング装置を使用して決定した。次いで、好ましい総生存細胞数を含めるために必要な体積を、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む接着性バイオリアクターに添加した。最終ＦＢＳ濃度が１０％に維持されるように、無血清懸濁培養物体積の添加を考慮して追加のＦＢＳを適切に添加した。

【0370】

図１８に示すように、シードトレインおよび接着システムの両方における細胞生存能は類似していた。生存細胞密度（ＶＣＤ）に関して、ハイブリッドシードトレインシステムでは、第６継代後のＶＣＤは第１継代後のものより高く（図１９Ａ）、これは、接着システムに匹敵する（図１９Ｂ）。

【0371】

接着性バイオリアクター（ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標））への接種に続いて、接着培養物を、本明細書中に記載のマイクロ－ジストロフィン構築物を保有する導入遺伝子プラスミド（例えば、配列番号８の導入遺伝子プラスミド中に含まれる配列番号９に記載の構築物が挙げられる）で一過性にトランスフェクトする。導入遺伝子プラスミドに加えて、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ＡＡＶ２ｒｅｐ／ｒｈ７４ｃａｐ）およびヘルパープラスミドを含める。所望の成長期間後に、ｒＡＡＶ粒子を、細胞溶解およびカラムクロマトグラフィによって採取する。

【0372】

いくつかの態様では、ｒＡＡＶを、以下を含む懸濁シードプロセスによって産生する：
（ａ）Ｎ－２コンテナ中で、細胞を、血清を含む第１の成長培地を用いて培養する工程；
（ｂ）前述の第１の培地から前述の細胞を取り出す工程；
（ｃ）Ｎ－１コンテナ中で、前述の工程（ｂ）由来の細胞を、血清を含まないか、前述の第１の培地より低い濃度の血清を含む第２の培地中に接種する工程；
（ｄ）前述のＮ－１コンテナ中で前述の細胞を懸濁条件下で培養する工程；および
（ｅ）バイオリアクター中の第３の培地に前述の工程（ｄ）由来の細胞を接種する工程。

【0373】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、以下をさらに含む：
（ｆ）細胞を、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミド、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドでトランスフェクトする工程。

【0374】

いくつかの態様では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む導入遺伝子プラスミドは、以下を含む：配列番号９の核酸配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、または配列番号８のヌクレオチド１～４９７７。いくつかの態様では、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含むプラスミドは、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびｒＡＡＶｒｈ７４ｃａｐ遺伝子を含む。

【0375】

いくつかの態様では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス５型のＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含む。

【0376】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｇ）細胞を溶解する工程をさらに含む。いくつかの態様では、細胞を、凍結融解、固体せん断、高張および／もしくは低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出し、界面活性剤溶解、またはこれらの組み合わせによって溶解する。

【0377】

いくつかの態様では、懸濁シードプロセスは、（ｈ）少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップによってｒＡＡＶを精製する工程をさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのカラムクロマトグラフィステップは、陰イオン交換クロマトグラフィもしくはサイズ排除クロマトグラフィまたはこれらの組み合わせを含む。
実施例７
デュシェンヌ型筋ジストロフィを有する被験体におけるｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物由来の安全性および拡大を評価するための市販の代表的材料を使用したオープンラベル全身遺伝子送達研究

【0378】

これは、デュシェンヌ型筋ジストロフィを有する男児で行ったｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の市販の代表的材料を使用した第１ｂ相非盲検研究である。最初に、２０人の患者が参加し、この実施例７は、８歳未満の最初の１１人の患者由来のデータを示す（例えば、２人の患者は４～５歳である；９人の患者は６～７歳である）（コホート１；４歳以上から８歳未満までの２０人までの男性ＤＭＤの歩行可能な被験体）（表７）。実施例８にさらに記載するように、研究を、コホート２（８歳以上１８歳未満のおよそ６人の男性ＤＭＤ歩行可能被験体）およびコホート３（およそ６人のＤＭＤ歩行不可能被験体）を含むようにその後に拡大した。

【表8-1】

【表8-2】

【0379】

主目的は、生検を行った筋組織のウェスタンブロットによって測定した場合の注入後１２週目（パート１）のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物（例えば、市販の代表的材料）由来のマイクロ－ジストロフィン発現を、ウェスタンブロットによって測定した場合のベースラインから１２週目まで（パート１）のマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現量の変化の対応するエンドポイントを使用して評価することであった。副次的目的は、以下を査定することであった：（１）１２週目での免疫蛍光（ＩＦ）線維強度によるマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現；（２）１２週目のジストロフィン陽性線維のＩＦ百分率（ＰＤＰＦ）によるマイクロ－ジストロフィン発現；および（３）安全性。
研究のための実施例７および８に適用可能な選択基準は、以下の通りである：

【0380】

被験体は、この研究に参加するための適格性を有するために、以下の基準の全てを満たさなければならない：
１．コホート１のみ（８歳未満で歩行可能）：出生時に男性であり、歩行可能であり、スクリーニング時に４歳以上から８歳未満までであり、スクリーニング来院時にＮＳＡＡスコアが１７超かつ２６以下である。
２．コホート２のみ（８歳以上で歩行可能）：出生時に男性であり、歩行可能であり、スクリーニング時に８歳以上から１８歳未満までであり、スクリーニング来院時にＮＳＡＡスコアが１５以上かつ２６以下である。
３．コホート３のみ（歩行不可能）：出生時に男性であり、最短で９ヶ月間歩行不可能であり、ＮＳＡＡ歩行スコアが「０」であり、スクリーニング来院時に１０ＭＷＲを実施不可能であり、ＰＵＬ登録項目スコアが２以上である。歩行喪失の発生を、参加者または介護者が車椅子の連続使用を報告した年齢（直近の月に近似）と定義する。
４．臨床所見の書類に基づいたスクリーニング前および確認のための遺伝子検査前に、臨床診断のための遺伝子検査を用いたＤＭＤの確定診断を受けている。
５．以下の症候性筋ジストロフィの指標を有する：
・ＣＫ評価 １０００Ｕ／Ｌ超および
・コホート１および２のみ（歩行可能）：１００ＭＷＲに関する予測時間の９５パーセント未満。
６．運動査定試験に協力できること。
７．スクリーニングおよび投与前の少なくとも１２週間の経口コルチコステロイドと等価な安定週間用量が、研究の初年を通して一定（体重変化に適応させるための修正を除く）のままであることが予想されること。
８．ＥＬＩＳＡによって決定した場合のｒＡＡＶｒｈ７４の抗体価が１：４００以下（すなわち、上昇なし）である。
９．性的に活動的な被験体は、全研究期間にコンドームを使用することに同意しなければならず、女性の性的パートナーも、医学的に許容され得る産児制限形態（例えば、経口避妊薬）を使用しなければならない。
１０．親（複数可）または法的後見人（複数可）を有するか、研究のための来院スケジュールおよび全ての他のプロトコール要件を理解し、遵守することができる１８歳以上の被験体である。
１１．インフォームド・アセントまたはインフォームド・コンセント（該当する場合）を提供する意思があり、親（複数可）または法的後見人（複数可）を有するか、研究に参加するための被験体のための書面によるインフォームド・コンセントを提供する意志がある１８歳以上の被験体である。
研究の除外基準は、以下の通りであった：

【0381】

以下の基準のうちのいずれかを満たす被験体は、この研究から除外されるであろう：
１．スクリーニング時のＥＣＨＯにおいて左室駆出率４０％未満または心筋症の臨床徴候および／もしくは症状がある。
２．コホート２および３のみ（８歳以上で歩行可能および歩行不可能）：スクリーニング時のＦＶＣが予測値の５０％未満および／または夜間の換気補助を必要とする。
３．１日目以前の３ヶ月以内の大手術またはこの研究中のいずれかの時期に手術を予定していること。
４．ＤＭＤ以外の任意の他の有意な遺伝病の存在。
５．現在、慢性、または活性なヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎、またはＢ型肝炎の感染症の血清学的証拠を有する。
６．自己免疫疾患の診断を受けている。
７．治験責任医師の意見によると遺伝子導入の不必要なリスクが生じる併発疾患または慢性薬物処置の必要性を有する。
８．治験責任医師の意見によると、被験体がプロトコールに必要とされる試験もしくは手技に従う能力を損ない得るか、患者の福祉、安全性、または臨床上の解釈可能性を損ない得る病状または酌量すべき病状を有する。
９．１日目以前の４週間以内に徴候性感染（例えば、上気道感染、肺炎、腎盂腎炎、髄膜炎）を有する。
１０．治験責任医師の意見によると、運動発達と混同し得る認知の低下または機能障害が実証される。
１１．以下に指定の時間枠に従った以下の治療のうちのいずれかでの処置：
・任意の時期：
－遺伝子治療
－細胞ベースの治療（例えば、幹細胞移植）
－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、または任意の他の遺伝子編集形態
・１日目の１２週間以内：
－ヒト増殖因子、またはバモロロンの使用
・１日目の６ヶ月以内：
－任意の試験中の投薬
－コホート１のみ：ジストロフィン発現を増加させるように設計された任意の処置（例えば、Ｔｒａｎｓｌａｒｎａ（商標）、ＥＸＯＮＤＹＳ５１、ＶＹＯＮＤＹＳ５３、ＶＩＬＴＥＰＳＯ（商標））。注釈：これらの処置を行ったコホート２および３の被験体は、１日目以前に休薬することが期待される。ジストロフィン発現を増加させるように設計された処置を、７２週間後に再開および／または開始してよい。
１２．１日目の来院の４週間以内に生ウイルスワクチンを受けたか、２週間以内に不活性ワクチンを受けたか、１日目から最初の３か月後の間にワクチン接種を受けることが予想される。
１３．以下が挙げられるが、これらに限定されない臨床的に有意とみなされる異常な臨床検査値を有する：
・ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）が正常上限（ＵＬＮ）の２倍を超える
・総ビリルビンがＵＬＮを超える。総ビリルビンの上昇がジルベール症候群に起因するとみなされる場合は除外されないことに留意のこと。
・白血球数１８，５００／μｌ超
・血小板数１５０，０００／μＬ以下
１４．被験体または家族が、被験体の研究参加を一般医／かかりつけ医および他の医療提供者に開示することを望まない場合。

【0382】

治験責任医師の意見として、被験体が研究プロトコールを遵守する可能性が低い。全被験体に、単回ＩＶ注入によってｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物（１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）（例えば、市販の代表的材料）を投与した。
有効性の査定：

【0383】

マイクロ－ジストロフィン発現の評価のための筋生検を、ベースラインおよび１２週目の全被験体から回収した。筋生検を、開放生検またはＶＡＣＯＲＡコア生検を使用して回収した。生検は、腓腹筋内側からの筋組織の回収が必要であった。腓腹筋内側で実行できない場合、代替の筋肉の使用について治験依頼者からの事前承認が必要であった。

【0384】

生検試料を使用して、ウェスタンブロット、ＩＦ強度、およびＰＤＰＦによって導入遺伝子発現を定量した。

【0385】

核あたりの平均ベクターゲノムコピー数、およびベースラインからの変化は、３．８７（±２．４）であることが決定された。ウェスタンブロットによって決定した場合、正常なマイクロ－ジストロフィン発現の平均百分率、およびベースラインからの変化は、５５．４％（±４３．４）であることが決定された。免疫蛍光によって決定した場合、ジストロフィン陽性線維の平均百分率は、７０．５％（５７．７％（±２２．２）のベースラインからの変化）であり、平均強度は１１６．９％（７５．９％±４６．４のベースラインからの変化）であることが決定された。これらの結果は、実施例４に記載の材料を投与した実施例３のプラセボ群患者と一致する（例えば、核あたりの平均ベクターコピー数－２．６２；正常発現の百分率－５１．７％；ジストロフィン陽性線維の百分率－７９．２％；強度百分率１００．６％）。

【0386】

図２０は、コホート１（ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンで処置した第１の１１人の患者）由来の平均ＮＳＡＡスコアのグラフを示す。第１の１１人の患者は、ベースラインから３ポイント改善した。６～７歳（ｎ＝９）では、ベースラインから２．９ポイント改善した。各時点は、１１人の患者を示す。

【0387】

市販の代表的材料の安全性は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を用いた事前の経験と一致していた。７９の処置により発現した有害事象が、１１人の患者で認められた。最もよく見られる有害事象は嘔吐であり、この嘔吐は典型的には第１週内で発症し、軽症であり、標準的な制吐薬を用いて処置した。肝酵素の増加は一過性であり、これはステロイドに対する応答であり、いかなる患者においても肝機能障害の兆候はなかった。２人の患者において重篤な有害事象が認められたが、完全に解決された。１人の患者はトランスアミナーゼが増加し、静脈内ステロイドで処置した。１人の患者に嘔気および嘔吐があった。補体媒介事象を示唆する有害事象は認められなかった。

【0388】

概して、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の特徴を、市販の代表的材料を用いて確認した。頑強な形質導入（例えば、核あたりの平均ベクターゲノムコピー数３．８７）が認められた。筋線維鞘膜に適切に局在した平均頑強発現が認められた（例えば、ウェスタンブロット－５５．４％；陽性線維－７０．５％；強度－１１６．９％）。安全で、忍容性が高く、かつ一貫した安全性プロファイルが、市販の代表的材料の投与で認められた。臨床的に補体の出現は認められなかった。まとめると、これらの結果は、製造過程および分析を裏付けるのに十分であり、デュシェンヌ集団に供給するのに十分である。
実施例８

【0389】

実施例７に記載の試験および研究を、以下の３つのコホートにわたるおよそ３２人の被験体に拡大する：コホート１は、４歳以上から８歳未満までの２０人の男性ＤＭＤ歩行可能被験体からなる；コホート２は、８歳以上から１８歳未満までのおよそ６人の男性ＤＭＤ歩行可能被験体からなる；コホート３は、およそ６人の男性ＤＭＤ歩行不可能被験体からなる。

【0390】

各コホート中の最初に参加した２人の被験体は、少なくとも１週間の間隔をおいて投与された前哨被験体であろう。コホート２および３の組み合わせでは、５０ｋｇ未満の少なくとも３人の被験体を参加させ、５０ｋｇ以上の少なくとも３人の被験体を参加させるであろう。研究は、以下のとおり４つの期間からなるであろう：
１．およそ３週間までのスクリーニング期間（注入前）。この期間に疾患の特徴およびベースライン治療を査定し、注入前評価を完了する。
２．ベースライン期間（注入前）。この期間は、適格性が確認されたときに開始して１日目の注入の前日に終了し、この間にベースライン査定を完了するであろう。
３．注入期間。この期間中、ｒＡＡＶｒｈ７４酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試料取得の３１日以内に、全被験体にオープンラベルｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを単回静脈内（ＩＶ）注入するであろう。１日目に７０ｋｇ未満の被験体に、ＩＶ ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン（１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を投与するであろう；１日目に７０ｋｇ以上の被験体に、総固定用量が９．３１×１０^１５ｖｇ（７０ｋｇ被験体についての１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量と等価である）のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンを投与するであろう。注入の前日から開始して、被験体に、注入から少なくとも６０日後に被験体のベースライン安定経口コルチコステロイド用量に加えて少なくとも１ｍｇ／ｋｇの糖質コルチコイド（プレドニゾン等価物）を毎日投与するであろう；総１日量６０ｍｇ／日まで１ｍｇ／ｋｇ／日のステロイドの追加投与が続くであろう（関連するＧＧＴ増加事象および／または他の臨床的に有意な肝機能異常事象におけるステロイドの追加を除く）。注入後にＧＧＴレベルが１５０Ｕ／Ｌ以上であることが確認されるか、他の臨床的に有意な肝機能の異常が認められる場合、注入後の免疫抑制のための糖質コルチコイドの追加を、１日２ｍｇ／ｋｇまで増加すべきである（すなわち、被験体の固定用量が６０ｍｇ／日である場合、この用量を１２０ｍｇ／日まで増加するべきである）。治験責任医師は、その後の急性肝外傷または他のＡＥの経過に対して、その後の免疫抑制療法を調整し得る。肝臓生化学（ベースラインに対するＧＧＴ、ビリルビン、およびＡＬＴが挙げられる）の重篤なまたな重症の上昇、または２ｍｇ／ｋｇ／日もしくは１２０ｍｇ／日に応答しない上昇についてそれぞれ肝臓専門医に助言を求めなければならない。この状況では、ＩＶボーラスステロイドが考慮され得る。この実施例８、および実施例７に示した投薬量を、線状化ＤＮＡ ｑＰＣＲ標準を使用して決定する。そうでなければ、本明細書中に示した投薬量を、スーパーコイルＤＮＡ ｑＰＣＲ標準を利用して決定する。例えば、実施例７および８に示した投薬量１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇは、本明細書中に別記の投薬量２×１０^１４ｖｇ／ｋｇに相当する。上の実施例７および８に記載の試験および研究を、現在および過去において、配列番号９に記載の；配列番号８（ヌクレオチド１～４９７７）に記載の；または配列番号６（ヌクレオチド５６～５０２２）に記載のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィン構築物を利用して行う。
４．２６０週の追跡期間（注入後）。この期間に安全性、有効性、および発現のパラメーターを評価するであろう。被験体は、必要な手技／査定を完了するために、遠隔および対面の来院の両方に出席すると予想されるであろう。追跡期間のパート１は、注入後（１日目）から開始され、１２週目まで続くであろう。追跡期間のパート２は、１２週後から開始され、２６０週目まで続くであろう。注入後の第１の１２週間（パート１）は、頻繁な来院（ほぼ毎週）が必要である。治験責任医師の臨床判断にしたがって、さらなる予定外の来院が許可される。研究を完了する被験体について、２６０週目に最後の研究のために来院するであろう。注入後の追跡を早期に中断する被験体について、早期終了のための来院が必要であろう；しかしながら、注入後２６０週までの追跡を研究し続けるために、各被験体に強く働きかけるべきである。

【0391】

研究を、３歳以上から４歳未満までのおよそ６人の男性ＤＭＤ歩行可能被験体からなるコホート４を含むようにさらに拡大する。コホート４の被験体（スクリーニング時に被験体のＤＭＤのための経口コルチコステロイドを投与されていない）は、注入の１週間前に１．５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾン／プレドニゾロン投与を開始し、注入後少なくとも６０日間継続するであろう。

【0392】

以下の除外基準を、コホート１および４のみのために指定する：ジストロフィン発現を増加させるように設計された任意の処置（例えば、Ｔｒａｎｓｌａｒｎａ（商標）、ＥＸＯＮＤＹＳ５１、ＶＹＯＮＤＹＳ５３、ＶＩＬＴＥＰＳＯ（商標））。ジストロフィン発現を増加させるように設計された処置を、７２週間後に再開および／または開始してよい。
実施例９
遺伝子診断

【0393】

追加の研究では、あるいは、上記の研究では、該当する場合、被験体は、臨床所見の書類に基づいたスクリーニング前および臨床診断のための遺伝子検査を使用した確認のための遺伝子検査前にＤＭＤの確定診断を受けていなければならない。

【0394】

遺伝子検査を使用して、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子中の少なくとも１つの変異について患者を遺伝子型判定する。本明細書中で使用される場合、「遺伝子型判定」は、ゲノム内の１またはそれを超える位置の細胞および／または被験体の特異的な対立遺伝子組成を、例えば、その位置の核酸配列を決定することによって決定する過程を指す。遺伝子型判定は、核酸分析および／または核酸レベルでの分析を指す。

【0395】

１つの態様では、本明細書中に記載のＤＭＤを処置する方法は、ヒト被験体のヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子を、前述のヒト被験体に組成物を投与する前に遺伝子型判定する工程をさらに含む。

【0396】

いくつかの態様では、被験体のヒトジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）を遺伝子型判定して、本明細書中に開示の組成物での処置に適していると考えられる遺伝子の変異を特徴づける。

【0397】

いくつかの態様では、被験体を、ＤＭＤ遺伝子のエクソン１８～７９中の少なくとも１つの変異について遺伝子型判定する。具体的には、被験体に対して、患者中のジストロフィンタンパク質の不在に至ると予想される変異を遺伝子型判定する。例えば、いくつかの態様では、患者に対して、エクソン１８から７９の間を完全に含むＤＭＤ遺伝子中のフレームシフト欠失、フレームシフト重複、未熟終止、または他の病原性バリアントを遺伝子型判定する。これらの変異のうちの少なくとも１つが同定される場合、患者が本開示の処置に適格であることを示す。

【0398】

いくつかの態様では、患者に対してＤＭＤ遺伝子を遺伝子型判定すると、被験体が本開示の処置に適格ではないことを示す結果を得ることができる。例えば、エクソン１～１７の間または両端の数値を含む数値の間の変異、インフレーム欠失、インフレーム重複、意義不明の変異（「ＶＵＳ」）、エクソン４５内に完全に含まれる変異を実証する遺伝子型判定の結果は、患者が本開示の処置に適格ではないことを示す。

【0399】

多数の遺伝子型判定技術が当業者に公知である。
実施例１０
デュシェンヌ型筋ジストロフィを有する被験体におけるデランディストロゲンモキセパルボベックの安全性および有効性を評価するための、第３相多国籍ランダム化二重盲検プラセボ対象全身遺伝子送達研究

【0400】

これは、およそ１２０人の４歳以上から８歳未満までの男性ＤＭＤ歩行可能被験体における、治験薬ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン（上の実施例６～８にも記載）の全身遺伝子送達のランダム化二重盲検プラセボ対照２パート研究である。ランダム化を、ランダム化時の年齢群（４歳以上から６歳未満まで対６歳以上から８歳未満まで）およびスクリーニング時のＮＳＡＡ総スコア（２２歳以下対２２歳超）に層別化するであろう；少なくとも５０％の被験体を、ランダム化時に４歳以上から６歳未満までの群にランダム化しなければならない。全患者は、パート１またはパート２のいずれかで静脈内（ＩＶ）治験薬（１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を投与される機会を有するであろう。処置アームでは、参加者は、１日目に治験薬を単回静脈内（ＩＶ）注入されるであろう。次いで、参加者は、２年目に適合するプラセボを単回ＩＶ注入されるであろう。プラセボアームでは、参加者は、１日目に適合するプラセボをＩＶ注入されるであろう。次いで、参加者は、２年目に治験薬を単回ＩＶ注入される機会を有するであろう。研究は、以下のとおり４つの期間からなるであろう：
・スクリーニング期間（注入前）。１日目の注入の最大３１日前に開始し、この期間に疾患の特徴およびベースライン治療を査定し、注入前評価を完了するであろう。
・ベースライン期間（注入前）。この期間は、適格性が確認されたときに開始して１日目の注入の前日に終了し、この間にベースライン査定を完了するであろう。
・注入期間。この期間に、ｒＡＡＶｒｈ７４酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試料取得の３１日以内に、二重盲検で治験薬またはプラセボを単回静脈内（ＩＶ）注入するであろう。パート１の注入期間に、およそ６０人の被験体にＩＶ治験薬（１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ；線状ＤＮＡ ｑＰＣＲ標準を使用して決定した場合）を投与し、およそ６０人の被験体にプラセボ（生理食塩水、０．９％塩化ナトリウム溶液）を投与するであろう。パート２の注入期間に、パート１でプラセボを投与した被験体にＩＶ治験薬を投与し、パート１で治験薬を投与した被験体にプラセボを投与するであろう。非盲検の施設の薬剤師を除く全ての被験体、両親／介護者、治験責任医師、施設のスタッフは、被験体への処置（治験薬またはプラセボ）に対して盲検化されるであろう。全被験体に追加の糖質コルチコイド（プレドニゾン等価物）を、注入の前日から開始して、少なくとも６０日間投与するであろう。
・１０４週の追跡期間（パート１注入後）。この期間にパート１およびパート２における安全性および有効性のパラメーターを評価するであろう。被験体は、必要な手技／査定を完了するために、遠隔および対面の来院の両方に出席すると予想されるであろう。追加で、治験責任医師の臨床判断にしたがって、予定外の来院が許可される。研究を完了する被験体について、パート２の５２週目に最後の研究のために来院するであろう。注入後の追跡を早期に中断する被験体について、研究終了／早期終了のための来院が必要であろう；しかしながら、各注入後５２週までの追跡を研究し続けるために、各被験体に強く働きかけるべきである。
選択／除外基準：
選択基準：

【0401】

被験体は、この研究に参加するための適格性を有するために、以下の基準の全てを満たさなければならない：
１．出生時に男性であり、歩行可能であり、ランダム化時に４歳以上から８歳未満までである。
２．臨床所見の書類に基づいたスクリーニング前および確認のための遺伝子検査前に、臨床診断のための遺伝子検査を用いたＤＭＤの確定診断を受けている。遺伝子の報告書には、ジストロフィンタンパク質の消失に至ると予想されるエクソン１８～７９の間（両端の数値を含む）に完全に含まれるＤＭＤ遺伝子中のフレームシフト欠失、フレームシフト重複、未熟終止（「ナンセンス」）、標準的なスプライス部位の変異、または他の病原性バリアントを記載していなければならない。
ａ．エクソン１～１７の間または両端の数値を含む数値の間の変異は、適格ではない。
ｂ．インフレーム欠失、インフレーム重複、および意義不明の変異（「ＶＵＳ」）は、適格ではない。
ｃ．エクソン４５（この数値を含む）内に完全に含まれる変異は、適格ではない。
３．運動査定試験に協力できること。
４．スクリーニング来院時のＮＳＡＡスコアが１６超かつ２９未満である。
５．スクリーニング来院時の床からの立ち上がり所要時間が５秒未満である。
６．スクリーニングおよび投与およびレジメンの前の少なくとも１２週間の経口コルチコステロイドの安定な１日量が、研究を通して一定（体重変化に適応させるための修正を除く）のままであることが予想される。
７．ＥＬＩＳＡによって決定した場合、ｒＡＡＶｒｈ７４抗体価が１：４００未満である（すなわち、上昇していない）。
８．性的に活動的な被験体は、全研究期間にコンドームを使用することに同意しなければならず、女性の性的パートナーも、医学的に許容され得る産児制限形態（例えば、経口避妊薬）を使用しなければならない。
９．研究のための来院スケジュールおよび全ての他のプロトコール要件を理解し、遵守することができる親（複数可）または法的後見人（複数可）を有する。
１０．インフォームド・コンセント（該当する場合）を提供する意思があり、研究に参加するための被験体のためのインフォームド・コンセントを提供する意志がある親（複数可）または法的後見人（複数可）を有する。
除外基準

【0402】

以下の基準のうちのいずれかを満たす被験体は、この研究から除外されるであろう：
１．スクリーニング時のＥＣＨＯにおいて左室駆出率４０％未満または心筋症の臨床徴候および／もしくは症状がある。
２．１日目以前の３ヶ月以内の大手術またはこの研究中のいずれかの時期に研究実施を妨害すると考えられる手術もしくは手技を予定していること。
３．任意の他の臨床的に有意な疾患（心臓、肺、肝臓、腎臓、血液学的、免疫学的、もしくは行動の疾患、または感染症もしくは悪性疾患が挙げられる）、または治験責任医師の意見による、遺伝子導入の不必要なリスクが生じる併発疾患もしくは慢性薬物処置の必要性、または治験責任医師の意見による、被験体がプロトコールに必要とされる試験もしくは手技に従う能力を損ない得るか、被験体の福祉、安全性、もしくは臨床上の解釈可能性を損ない得る病状もしくは酌量すべき病状の存在。
４．現在、慢性、または活性なヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎、またはＢ型肝炎の感染症の血清学的証拠を有する。
５．１日目以前の４週間以内に徴候性感染（例えば、上気道感染、肺炎、腎盂腎炎、髄膜炎）を有する。
６．治験責任医師の意見によると、運動発達と混同し得る認知の低下または機能障害が実証される。
７．以下に指定の時間枠に従った以下の治療のうちのいずれかでの処置：
・任意の時期：
－遺伝子治療
－細胞ベースの治療（例えば、幹細胞移植）
－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、または任意の他の遺伝子編集形態
・１日目の１２週間以内および研究中の任意の時期：
－ヒト増殖因子またはバモロロンの使用
・１日目の６ヶ月以内および研究中の任意の時期：
－任意の試験中の投薬
－ジストロフィン発現を増加させるように設計された任意の処置（例えば、Ｔｒａｎｓｌａｒｎａ（商標）、ＥＸＯＮＤＹＳ５１（商標）、ＶＩＬＴＥＰＳＯ（商標））
８．１日目の来院の４週間以内に生ウイルスワクチンを受けたか、２週間以内に不活性ワクチンを受けたか、１日目から最初の３か月後の間にワクチン接種を受けることが予想される。
９．以下が挙げられるが、これらに限定されない臨床的に有意とみなされる異常な臨床検査値を有する：
・ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼが正常上限（ＵＬＮ）の２倍を超える
・グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）が１５Ｕ／Ｌを超える
・総ビリルビンがＵＬＮを超える。注釈；総ビリルビンの上昇がジルベール症候群に起因すると確認される場合は除外されない。
・白血球数１８，５００／μｌ超
・血小板数１５０，０００／μＬ以下
１０．家族が、被験体の研究参加を一般医／かかりつけ医および他の医療提供者に開示することを望まない場合。
１１．治験責任医師の意見として、被験体が研究プロトコールを遵守する可能性が低い。
遺伝子診断

【0403】

被験体は、臨床所見の書類に基づいたスクリーニング前および確認のための遺伝子検査前に、臨床診断のための遺伝子検査を用いたＤＭＤの確定診断を受けていなければならない。遺伝子の報告書には、ジストロフィンタンパク質の不在に至ると予想されるエクソン１８から７９（両端の数値を含む）の間を完全に含むＤＭＤ遺伝子中のフレームシフト欠失、フレームシフト重複、未熟終止、または他の病原性バリアントを記載していなければならない。
ａ．エクソン１～１７の間または両端の数値を含む数値の間の変異は、適格ではない。
ｂ．インフレーム欠失、インフレーム重複、および意義不明の変異（「ＶＵＳ」）は、適格ではない。
ｃ．エクソン４５（この数値を含む）内に完全に含まれる変異は、適格ではない。
統計学的方法：
サンプルサイズ：

【0404】

この研究のサンプルサイズは、ベースラインから５２まで（パート１）の主要有効性エンドポイント（ＮＳＡＡ総スコアの変化）の検出力に基づく。

【0405】

第一種過誤０．０５（両側）を用いて全被験体における標準偏差３．５および５２週目（パート１）の低下率１０％を仮定すると、ランダム化比１：１のサンプルサイズ１２０は、治験薬群とプラセボ群との間のベースラインから５２週目まで（パート１）のＮＳＡＡ総スコアの変化の平均値の差２．２を検出ための検出力はおよそ９０％であろう。

【0406】

また、研究は、４歳以上から６歳未満までの年齢群に検出力を有する。研究には少なくとも６０人の４歳以上から６歳未満までの被験体が参加するであろう。第一種過誤０．０５（両側）を用いて４歳以上から６歳未満までの年齢群における主要エンドポイントについての標準偏差３．２および５２週目（パート１）での低下率１０％を仮定すると、ランダム化比１：１のサンプルサイズ６０は、治験薬群とプラセボ群との間のベースラインから５２週目まで（パート１）のＮＳＡＡ総スコアの変化の平均値の差２．５を検出ための検出力は少なくとも８０％であろう。

【0407】

多重性を調整するための試験手順を使用して、両側レベル０．０５での第一種過誤全体を調節するであろう。詳細は、ＳＡＰ中に指定される。
ランダム化

【0408】

被験体を、単回ＩＶ注入によって治験薬またはプラセボのいずれかを投与するために、１：１の比にランダム化するであろう。研究のパート１で治験薬を投与した被験体に、パート２でプラセボを投与するであろう。研究のパート１でプラセボを投与した被験体は、パート２で治験薬を投与する機会を有するであろう。

【0409】

ランダム化を、ランダム化時の年齢群（４歳以上から６歳未満までまたは６歳以上から８歳未満まで）およびスクリーニング時のＮＳＡＡ総スコア（２２歳以下または２２歳超）に層別化するであろう；少なくとも５０％の被験体を、ランダム化時に４歳以上から６歳未満までの年齢群にランダム化しなければならない。全患者は、パート１またはパート２のいずれかで静脈内（ＩＶ）治験薬（１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を投与される機会を有するであろう。
コルチコステロイド

【0410】

被験体は、最初のスクリーニング来院の前の少なくとも１２週間の経口コルチコステロイドの１日量が安定でなければならず、この用量は、研究を通して一定（体重変化に適応させるための修正を除く）のままである。コルチコステロイドのタイプ、投与頻度、コルチコステロイド投薬の開始日および終了日、ならびに投薬量の全ての変化は、被験体の原始書類中またはｅＣＲＦ上に記録されるであろう。
注入前の免疫抑制剤

【0411】

注入（治験薬またはプラセボ）の前日に、被験体は、被験体のＤＭＤのためのベースライン安定経口コルチコステロイドに加えて、免疫抑制のための追加の糖質コルチコイド（プレドニゾン等価物）を開始するであろう。被験体のＤＭＤのためにベースラインの毎日のコルチコステロイド投与を受けている被験体は、追加される１ｍｇ／ｋｇ／日の免疫抑制用量に加えて、被験体の通常のＤＭＤコルチコステロイドを投与されるであろう。１ｍｇ／ｋｇ／日の投与が、総１日量６０ｍｇ／日まで続くであろう。
注入後の免疫抑制剤

【0412】

注入後最初の６０日間、被験体は、被験体のＤＭＤのためのベースラインの毎日の安定な経口コルチコステロイド用量を維持し、それに加えて、免疫抑制のために１ｍｇ／ｋｇ／日の糖質コルチコイド（プレドニゾン等価物）を投与されるであろう。メディカルモニターの了承を得た上で有害事象（ＡＥ）を管理するために早期に漸減させることが許可され得る。総１日量６０ｍｇ／日まで１ｍｇ／ｋｇ／日の投与が続くであろう（ＧＧＴ増加および／または他の臨床的に有意な肝機能異常事象におけるステロイドの追加を除く）。

【0413】

被験体が嘔吐のために経口免疫抑制糖質コルチコイドに耐えることができない場合、糖質コルチコイドを静脈内投与すべきである。

【0414】

注入後にＧＧＴレベルが１５０Ｕ／Ｌ以上であることが確認されるか、他の臨床的に有意な肝機能の異常が認められる場合、注入後の免疫抑制のための糖質コルチコイドの追加を増加すべきである。治験責任医師は、その後の急性肝外傷または他のＡＥの経過に対して、その後の免疫抑制療法を調整し得る。肝臓生化学（ベースラインに対するＧＧＴ、ビリルビン、ＧＬＤＨ、およびＡＬＴが挙げられる）の重篤なまたな重症の上昇、または２ｍｇ／ｋｇ／日もしくは１２０ｍｇ／日に応答しない上昇についてそれぞれ肝臓専門医に助言を求めなければならない。この状況では、ＩＶボーラスステロイドが考慮され得る。
・被験体が被験体のＤＭＤステロイドに加えて免疫抑制のために１ｍｇ／ｋｇのステロイドを追加している場合、被験体のＤＭＤステロイドに加えて、この用量を、摂取すべき免疫抑制のためのステロイドを追加して２ｍｇ／ｋｇに増加すべきである。
・被験体が６０ｍｇ／日の固定用量にある場合、この用量を１２０ｍｇ／日に増加すべきである。

【0415】

６０日目のＧＧＴ値が正常であり、かつ急性肝外傷の兆候がない被験体は、２週間にわたって被験体に対する免疫抑制糖質コルチコイドを漸減すべきである。漸減期間を、治験責任医師の判断に従ってＡＥを管理するために調整してよいが、９０日を超えたベースラインの毎日のレジメンを超える用量でのステロイドの継続は、メディカルモニターと議論すべきである。６０日目にＧＧＴ値が上昇し、そして／または急性肝外傷の兆候が認められる被験体における免疫抑制糖質コルチコイドを、ＧＧＴ値が正常になり（あるいは、明確に正常に向かう傾向がある）、かつ急性肝外傷の全ての兆候が解決されるまで上記のように管理すべきであり、その時点で、被験体の免疫抑制糖質コルチコイドを２週間にわたって漸減すべきである。免疫抑制のための追加のステロイドが漸減された時点で、体重に基づいて任意に必要な調整を行いながらＤＭＤのための被験体のベースラインの毎日のステロイドレジメンを維持すべきである。
有効性分析：
ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＳＡ）

【0416】

主要エンドポイントおよびいくつかの副次評価項目を、両側０．０５レベルでのファミリーあたりの第一種過誤率を強力に調節する適切な多重検定アプローチを使用した階層的様式で試験するであろう。

【0417】

ベースラインから５２週目まで（パート１）のＮＳＡＡ総スコアの変化の主要エンドポイントについて、要約統計量は、処置群によって、ベースラインでのＮＳＡＡ総スコア、パート１中の各ベースライン後来院、およびベースラインからパート１中の各ベースライン後来院までの変化について提供されるであろう。２スコアのＮＳＡＡが回収されるベースラインおよび５２週目（パート１）の来院について、平均ＮＳＡＡスコアを分析で使用するであろう。

【0418】

主要解析として、制限付き最大尤度に基づく混合モデル反復測定分析を使用して、ベースラインから５２週目まで（パート１）のＮＳＡＡ総スコアの変化について２つの処置群を比較するであろう。このモデルでは、応答ベクトルは、パート１中の各ベースライン後来院でのＮＳＡＡ総スコアのベースラインからの変化からなる。このモデルは、処置群（カテゴリカル）、来院（カテゴリカル）、処置群－来院交互作用、ランダム化での年齢群の共変量を含むであろう。

【0419】

ＮＳＡＡは、種々の機能活動の遂行を格付けする臨床医が施すスケールである（Ｍａｚｚｏｎｅ，Ｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．２０（１１）：７１２－７１６（２０１０））。これは、立つことができるＤＭＤの男児で使用されるように設計され、研究年齢範囲（４歳以上かつ８歳未満）のＤＭＤ男児で使用されている（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｍｏｔｏｒ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｙｏｕｎｇ ｂｏｙｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＤＭＤ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，’’ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．２３（７）：５２９－５３９（２０１３））；Ｍｅｒｃｕｒｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｙｏｕｎｇ Ｂｏｙｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，’’ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（８）：ｅ０１６０１９５（２０１６））。

【0420】

この査定の間、被験体は、１７種の異なる機能活動（１０ＭＷＲ、座位からの立ち上がり，片足での直立、ボックス階段の昇り、ボックス階段の降り、臥位から座位への起き上がり、床からの起き上がり、床からの頭部の持ち上げ、かかと立ち、および跳躍が挙げられる）を行う。

【0421】

被験体を、以下のように格付けするであろう：２＝正常、明確な活動の変容なし；１＝方法は修正されるが、他者からの身体介助なしで目的を果たす；および０＝独立して目的を果たすことが不可能。

【0422】

ＮＳＡＡ投与の詳細は、臨床評価者マニュアルに提供されている。

【0423】

２つのＮＳＡＡスコアを、ベースラインの２つの個別の日、パート１中の５２週目の２つの個別の日、およびパート２中の５２週目の２つの個別の日に収集するであろう。
床からの立ち上がり所要時間

【0424】

床からの立ち上がり所要時間試験は、ＮＳＡＡ（項目数１１）の一部であり、被験体が両腕を体側につけた状態の仰臥位から開始して、両腕を体側につけた状態で直立位置に立ち上がるために必要な時間を定量する（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ，ＥＫ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ４８（１）：５５－６７（２０１３））。被験体がこのタスクを完了するために必要な時間を、ＮＳＡＡ実施中に記録するであろう。ＮＳＡＡと同様に、床からの立ち上がり所要時間を、ベースラインならびにパート１およびパート２中の５２週目の来院時に２日分収集するであろう。
１０メートル歩行／走行

【0425】

計時１０ＭＷＲは、ＮＳＡＡ（項目数１７）の一部であり、被験体が（真っ直ぐな通路を）立位から１０メートルを走行または歩行するのに要する時間を定量する（ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＣＭ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ４８（３）：３５７－３６８（２０１３））。被験体は、１０メートルのマークを走り抜けるように促される。被験体がこの距離を走行するのに要する時間を、ＮＳＡＡ実施中に記録するであろう。ＮＳＡＡと同様に、計時１０ＭＷＲを、ベースラインならびにパート１およびパート２中の５２週目の来院時に２日分収集するであろう。
４段昇りに要する時間

【0426】

計時４段試験は、被験体が標準的な４つの階段を昇るのに要する時間を定量する（各階段の高さは６インチである）（Ｂｕｓｈｂｙ，Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ（Ｌｏｎｄ）．１（９）：１２１７－１２３５（２０１１））。被験体が４つの標準的なサイズの階段を昇るのに要する時間を記録するであろう。
１００メートル歩行／走行

【0427】

１００ＭＷＲは、被験体が（真っ直ぐな通路を）立位から１００メートルを走行または歩行するのに要する時間を定量する（Ａｌｆａｎｏ，ＬＮ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．２７（５）：４５２－４５７（２０１７））。被験体は、１００メートルのマークを走り抜けるように促される。被験体がこの距離を走行するのに要する時間を、記録するであろう。
ウェアラブルデバイス

【0428】

被験体に、毎日の身体活動を収集するためのウェアラブルデバイスを提供するであろう。ウェアラブルデバイスの目的は、調査施設への来院を除く日常生活中の被験体の運動および活動レベルを正確に測定することである。デバイスは、２つのセンサーからなり、そのうちの１つを各々のくるぶしに装着する。ウェアラブルデバイスの電池を毎日使用後に充電する必要があるので、センサーは夜間に装着しないであろう。施設の人員、被験体、および親／介護者を、デバイスを正確に使用するように訓練するであろう。

【0429】

注入前期間中、ウェアラブルデバイスを、ベースライン値を得るために３週間にわたって両方のくるぶしに毎日装着するであろう。追跡期間中、ウェアラブルデバイスを、パート１およびパート２中の１２、２４、３６、および５２週目／早期終了のためのクリニック来院前の３週間にわたって両方のくるぶしに毎日装着するであろう。ウェアラブルデバイスは、クリニック来院中は装着しないであろうが、被験体は、クリニック内での試験の完了直後に使用を再開するであろう。
マイクロ－ジストロフィン発現

【0430】

マイクロ－ジストロフィン発現の評価のための筋生検を、パート１の１２週目およびパート２の１２週目に被験体の部分集団から回収するであろう。筋生検を、治験依頼者の承認を得て開放生検またはＶＡＣＯＲＡコア生検を使用して回収すべきである。生検は、腓腹筋内側からの筋組織の回収を要件としなければならない。腓腹筋内側で実行できない場合、代替の筋肉の使用前に治験依頼者からの事前承認が必要である。

【0431】

生検試料を使用して、筋肉含有量のために調整されたウェスタンブロットによるマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現を定量し、マイクロ－ジストロフィンの局在化を、ＩＦ強度としての免疫組織化学、およびＰＤＰＦを使用して査定するであろう。生検組織の取り扱いおよび処理についてのさらなる詳細については、「Ｂｉｏｐｓｙ Ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」を参照のこと。
ベクターゲノムおよび定量

【0432】

血清を回収して、種々の時点でのベクター定量を査定するであろう。１日目に、試料を、注入終了からおよそ４時間～６時間後に回収するであろう。

【0433】

筋生検試料中のベクターゲノムコピー数を、パート１中の１２週目およびパート２中の１２週目に、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して測定するであろう。
クレアチンキナーゼ

【0434】

治験薬注入後のクレアチンキナーゼレベルは、診査有効性の尺度としての機能を果たすであろう。
患者報告アウトカム測定法情報システム

【0435】

地域的に利用可能である被験体の部分集団に対してＰＲＯＭＩＳ尺度を完了するであろう；参加国は、研究運用マニュアルに概説されるであろう。

【0436】

ＰＲＯＭＩＳは、健康に関連した生活の質を査定するために開発され、検証された一連の手段である（ＰＲＯＭＩＳ小児自身および親の代理による回答プロフィール手段。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｌｔｈｍｅａｓｕｒｅｓ．ｎｅｔ／ｉｍａｇｅｓ／ＰＲＯＭＩＳ／ｍａｎｕａｌｓ／ＰＲＯＭＩＳ＿Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ＿ａｎｄ＿Ｐｒｏｘｙ＿Ｐｒｏｆｉｌｅ＿Ｓｃｏｒｉｎｇ＿Ｍａｎｕａｌ．ｐｄｆ．，１０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１８，Ｂｅｖａｎｓ，ＫＢ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｒｅｓ．１０（４）：３８５－３９６（２０１０）で利用可能である。ＰＲＯＭＩＳ尺度は、患者報告アウトカムの査定のための食品医薬品局の方法論的基準と連携して開発されており（Ｂｅｖａｎｓ，ＫＢ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｒｅｐｏｒｔｅｄ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ：Ｕｓｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｃｌａｉｍｓ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｄｒｕｇｓ／ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ｕｃｍ１９３２８２．ｐｄｆ．；１０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１８）、成人および小児の身体、精神、および社会的な健康を評価およびモニタリングする人間中心の項目から構成される。この研究における小児アウトカムの具体的な尺度は、以下の代理尺度を含むであろう：
・ＰＲＯＭＩＳ親代理項目バンクＶ２．０－可動性
・ＰＲＯＭＩＳ親代理ＳＦ Ｖ２．０－上肢－縮小版８ａ
・ＰＲＯＭＩＳ親代理ＳＦ Ｖ２．０－疲労－縮小版１０ａ

【0437】

被験体が研究期間内に８歳になる場合、以下の小児用ＰＲＯＭＩＳ尺度も被験体によって実施し、完了するであろう。親／介護者は、代理尺度を継続して完了させるであろう。
・ＰＲＯＭＩＳ小児用項目バンクＶ２．０－可動性
・ＰＲＯＭＩＳ小児用項目バンクＶ２．０－上肢－縮小版８ａ
・ＰＲＯＭＩＳ小児用項目バンクＶ２．０－疲労－縮小版１０ａ
パート１における重要な有効性の査定のまとめ：

【0438】

主要アウトカム尺度：５２週目のＮＳＡＡ総スコアのベースラインからの変化。

【0439】

副次アウトカム尺度：
－参加者の部分集団におけるウェスタンブロットによって測定した場合の１２週目のマイクロ－ジストロフィンタンパク質発現量（１２週目）。
－５２週目の床からの立ち上がり所要時間、１００および１０メートル歩行／走行を完了するのに要する時間、および計時四段階段昇り試験のベースラインからの変化（ベースライン、５２週目）
－ウェアラブルデバイスによって測定した場合のストライド速度の９５センタイル（ＳＶ９５Ｃ）のベースラインからの変化（５２週目までのベースライン）
－５２週目のドメインあたりの患者報告アウトカム測定法情報（ＰＲＯＭＩＳ）スコアのベースラインからの変化（ベースライン、５２週目）
ＰＲＯＭＩＳは、健康に関連した生活の質を査定するために開発され、検証された一連の手段である。親は、「お子さんの観察可能な症状、身体能力、日常的活動を行う能力、および全体的な健康の全ての局面を考慮した場合、以下の格付けスケールを使用して、研究開始以後のお子さんの臨床的状態の変化をどのように格付するでしょうか？：１＝非常に改善した、２＝より改善した、３＝改善は最小限であった、４＝変化なし、５＝悪化は最小限であった、６＝より悪化した、および７＝非常に悪化した」と依頼されるであろう。
－パート１：ＮＳＡＡによって測定した場合の５２週目の取得または改善したスキルの数（５２週目までのベースライン）。
実施例１１
デランディストロゲンモキセパルボベックの全身送達後のＤＭＤ^ｍｄｘラットにおける心機能の評価

【0440】

ＤＭＤ^ｍｄｘラットモデルは、ヒトＤＭＤ病理学に非常に近い表現型特性を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｏｐｈｙ）（ＤＭＤ）の有益な小型動物モデルである。Ｌａｒｃｈｅｒ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ９（１０）：ｅ１１０３７１（２０１４）；Ｓｚａｂｏ^－，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ １４：ｄｍｍ０４７７０４．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０４７７０４（２０２１）を参照のこと。この研究の目的は、単回用量（１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）のデランディストロゲンモキセパルボベックの全身送達後の２１～２８日齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ ＤＭＤ変異ラット（ＤＭＤ^ｍｄｘラット）の心機能を生理食塩水と比較して評価することであった。

【0441】

研究エンドポイントは、安全性についての薬理学的測定、骨格筋および心筋中の標的マイクロ－ジストロフィン（ｍｉｃｒｏ－ｄｙｔｒｏｐｈｉｎ）発現、生体内分布、組織学、および心機能を評価するための心エコー図を含んでいた。処置コホートは、単回用量（１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）の本明細書中に記載のｒＡＡＶ ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロ－ジストロフィンベクター（デランディストロゲンモキセパルボベック）を全身投与されたＤＭＤ^ｍｄｘラットを含んでいた。対照コホートは、生理食塩水を投与されたＤＭＤ^ｍｄｘラットを含んでいた。下記のように、２コホート間の心機能を、１２週目および２４週目の時点で査定した。
骨格筋および心筋中のマイクロ－ジストロフィンの標的発現

【0442】

デランディストロゲンモキセパルボベックの全身送達により、骨格筋および心筋の両方での標的化発現が実証された。生理食塩水に対するデランディストロゲンモキセパルボベックでの処置後のＤＭＤ^ｍｄｘラットの骨格筋および心筋（免疫蛍光）中のマイクロ－ジストロフィン発現の可視化を、図２１Ａ～２１Ｃに示す。図２１Ａ～２１Ｃは、生理食塩水（図２１Ａ）と比較した、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の１２週間後（図２１Ｂ）および２４週間後（図２１Ｃ）のＤＭＤ^ｍｄｘラットの骨格筋（「ＬＴＡ」）および心筋（「ＨＲＴ」）中のマイクロ－ジストロフィン発現を実証している。

【0443】

図２２Ａ～２２Ｂは、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の１２週間後および２４週間後のＤＭＤ^ｍｄｘラットのいくつかの筋組織中のマイクロ－ジストロフィン発現（免疫蛍光）（図２２Ａ）およびベクター形質導入（ベクターゲノムコピー数）（図２２Ｂ）の定量を示す。略語：ＴＡ＝脛骨筋；ＨＲＴ＝心臓；ＭＧ＝内側腓腹筋；ＬＧ＝外側内側腓腹筋；ＤＩＡ＝横隔膜；ＴＲＩ＝三頭筋；ＰＳＯ＝大腰筋。
筋肉変性および線維症の軽減

【0444】

生理食塩水と比較して、ＤＭＤ^ｍｄｘラットにおいてデランディストロゲンモキセパルボベック投与の１２週間後および２４週間後の両方で、骨格筋における中心核形成分析によって筋肉変性の有意な軽減が認められた。図２４Ａは左内側腓腹筋のＨ＆Ｅ染色を示し、これは、生理食塩水で処置したＤＭＤ^ＭＤＸラットで示されたより重度のジストロフィ表現型と比較して、デランディストロゲンモキセパルボベック処置ＤＭＤ^ＭＤＸラットの筋肉病理学が改善されたことを示した。

【0445】

ＬＭＧ中の組織学的パラメーターの定量も行った。中心核形成および線維径（筋肉変性のマーカー）を試験した。Ｐａｓｔｏｒｅｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒ Ｓｃｉ １２９：９７－１０５（１９９５）；Ｌ．Ｒ．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２２：４９２９－４９３７（２０１３），Ｐｏｔｔｅｒ Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３２：３７５－８９（２０２１）を参照のこと。平均中心核形成は、処置動物の中心核形成（ＣＮ）が改善されたことを示し、これは、処置動物における筋肉変性の減少を示していた。生理食塩水を投与したラットは、１２週および２４週コホートの両方についての中心核形成の平均陽性率が５０％を超えた一方で、１２週および２４週コホートの両方についてのデランディストロゲンモキセパルボベックによる中心核形成は２５％未満であった（図２４Ｂ）。１２週目および２４週目の生理食塩水で処置した動物とデランディストロゲンモキセパルボベックで処置した動物との間の差は、共に統計的に有意であり、デランディストロゲンモキセパルボベック処置を用いた変性／再生過程の改善および筋線維損傷の減少が実証された。線維径は、１２週目および２４週目の両方で生理食塩水に対してデランディストロゲンモキセパルボベックで処置した線維のサイズ分布の正常化および線維の平均直径の増加を示し、これは、筋肉環境の正常化を示す。

【0446】

線維症を、組織切片中のコラーゲンの百分率を定量することによって分析した。図２５Ａ～２５Ｂは、骨格筋および心筋中のコラーゲン沈着の分析を示す。図２５Ａ中の画像は、処置１２時間後のマッソントリクローム（Ｔｒｉｃｈｏｍｅ）染色を示す。図２５Ａ中の代表的な画像は、デランディストロゲンモキセパルボベックおよび生理食塩水で処置した動物の投与１２時間後のＭＧおよびＨＲＴの線維症を示す。青色染色は線維症を示し、赤色染色は筋線維を示す。線維症は、生理食塩水と比較して、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の１２週間後および２４週間後のＤＭＤ^ｍｄｘラットにおいて軽減された。図２５Ｂは、処置の１２週間後および２４週間後の種々のタイプの骨格筋および心筋中のコラーゲン沈着を定量している。線維症の定量により、全ての分析された組織において、デランディストロゲンモキセパルボベック処置コホートが、生理食塩水処理コホートよりも染色筋肉切片あたりの線維領域の百分率が低かった（図２５Ｂ）ことが示された。（ＨＲＴ＝心臓；ＭＧ＝内側腓腹筋；ＤＩＡ＝横隔膜）。
心機能の評価

【0447】

ＤＭＤ^ｍｄｘラットにおける収縮期心室の性能を、生理食塩水と比較したデランディストロゲンモキセパルボベックの投与の２４週間後に心エコー検査法によって評価した。「処置」コホート対対照（「生理食塩水」）コホートについてのデータを示す棒グラフを、図２７Ａ（左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）について；図２７Ｂ（駆出率（％）（ＥＦ）について）ｌ、および図２７Ｃ（短縮率（％）（ＦＳ）について）中に示す。

【0448】

デランディストロゲンモキセパルボベックの投与により、生理食塩水処置ＤＭＤ^ＭＤＸラットに対して、駆出率（ＥＦ）（図２７Ｂ）および短縮率（ＦＳ）（図２７Ｂ）がわずかに改善される。デランディストロゲンモキセパルボベックを用いると拡張が逆転する傾向により、ＬＶＩＤｄ（左心室内径、拡張期）およびＬＶＩＤｓ（左心室内径、収縮期）／ＬＶＥＳＤ（左室収縮末期径）の軽度の減少、ならびに拡張末期容量（ＥＤＶ）の低下に至った。生理食塩水に対するデランディストロゲンモキセパルボベックでの処置２４時間後の左室収縮末期径の軽度の減少を、図２７Ａの棒グラフに示す。

【0449】

心機能の３つの心エコー測定を反映する図２７Ａ～２７Ｃ中に示すデータは、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置の２４週間後の心機能の維持に向かう正の傾向を示す。データは、ＤＭＤ^ＭＤＸラットにおける心機能の改善および有害な心臓リモデリングの逆行におけるデランディストロゲンモキセパルボベックの有効性を裏付けている。
歩行および垂直運動の改善

【0450】

ＤＭＤ^ｍｄｘラットの運動を、オープンフィールド活動ケージ中のレーザーモニタリングを使用して生存中に測定した。歩行および立ち上がり行動（垂直運動の測定）を、１時間あたりの光線の遮断数に基づいて測定した。罹患動物は、筋損傷に起因して経時的に歩行および垂直運動の能力を失う。活動ケージを、剖検の２週間以内に行った。

【0451】

運動（歩行および立ち上がり行動の両方）は、全ての処置群について全ての時点で有意に増加した。デランディストロゲンモキセパルボベックの全身送達の１２週間後に歩行および立ち上がり行動の統計的に有意な増加が実証された（図２３Ａおよび２３Ｂ）。同一の傾向が２４週目の時点で認められる。

【0452】

生理食塩水コホートに対して処置コホートにおいて２４週間で歩行に有意差が認められる（図２３Ａ）。２４週目の立ち上がり行動の改善はあまり顕著ではないが、生理食塩水で処置した年齢適合ＤＭＤ^ＭＤＸコホートと比較して依然として統計的に有意である（図２３Ｂ）。

【0453】

要するに、このデータは、１２週および２４週の両方の時点において、生理食塩水に対してデランディストロゲンモキセパルボベックでの処置後にＤＭＤ^ＭＤＸラットの可動性が有意に機能的に改善することを示す。
血清トロポニンレベル

【0454】

血清中のトロポニンＩレベルを、生理食塩水（ｎ＝６）投与に対して１．３３×１０^１４デランディストロゲンモキセパルボベック（ｎ＝６）の投与１週間後（７日後）のＤＭＤ^ｍｄｘラットの部分集団において評価した。トロポニンＩを、生理食塩水（ｎ＝５）に対して、剖検での投与１２週間後の動物（ｎ＝５）の異なる部分集団において評価した。

【0455】

トロポニンＩは、血清中のトロポニンＩタンパク質レベルを測定する。これらのタンパク質は、心筋が損傷されたときに放出され、心臓発作などを伴う。心臓がさらに損傷を受けると、血清中のトロポニンＩの存在量が増加する。ＤＭＤ動物モデルと一致して、血清中のトロポニンＩの上昇および心疾患は、ＤＭＤ^ＭＤＸラットモデルの特徴である。

【0456】

しかしながら、図２６に示すように、血清トロポニン１の血中レベルは、生理食塩水で処置した動物とデランディストロゲンモキセパルボベックで処置した動物との間で投与１週間後および投与１２週間後の両方において有意差がなかった－これは、遺伝子治療による処置に原因する心毒性が存在しないことを示唆している。
結論

【0457】

この研究を、ＤＭＤ^ＭＤＸラットモデルにおけるデランディストロゲンモキセパルボベック処置の有効性および機能改善を試験するためにデザインした。ＤＭＤ^ＭＤＸラットモデルは、ＤＭＤ^ＭＤＸマウスモデルよりも重度の表現型を示し、ＤＭＤ患者の心臓および線維症表現型のより良好なモデルである。

【0458】

生存中の活動ケージの機能アウトカムは、デランディストロゲンモキセパルボベックでの処置による改善を示した。立ち上がり行動および歩行の両方は、全時点にわたって生理食塩水対照と比較して処置動物で有意に改善された。全時点にわたる機能改善の維持は、臨床的に意図される用量の１．３３×１０^１４ｖｇ／ｋｇデランディストロゲンモキセパルボベックの全身送達の発現および機能の耐久性を実証している。

【0459】

心エコー検査法では、処置の１２週間後および２４週間後の両方において、デランディストロゲンモキセパルボベック全身処置により心疾患の指標が改善された。概して、このデータは、送達後２４週間を通して、ＤＭＤ^ＭＤＸラットモデルにおいてデランディストロゲンモキセパルボベック処置で心機能が改善されたことを実証している。

【0460】

マイクロ－ジストロフィンは、ＤＭＤ^ｍｄｘラットモデルにおいて筋肉の至る所（心臓が挙げられる）に発現し、これは、ジストロフィ発症の軽減および歩行の改善に関連していた。心エコー検査法によって実証されるように、心臓中のマイクロ－ジストロフィンの標的発現は、心筋線維症を軽減し、心機能を改善した。要するに、デランディストロゲンモキセパルボベックは、骨格筋および心筋中の標的発現が実証され、この発現は、ｍｄｘラットモデルにおける機能的アウトカム（例えば、心臓）の改善に対応していた。
文献

【化1】

【化2】

【化3】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25-1】

【図25-2】

【図26】

【図27】

【配列表】

2024519799000001.app

【国際調査報告】