特表 2024-519819 眼疾患および障害を処置するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】眼疾患および障害を処置するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20240514BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 27/12 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240514BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240514BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

C12N15/35 ZNA

C12N15/864 100Z

A61P27/02

A61K48/00

A61P25/00

A61P27/12

A61P27/06

A61P21/00

A61P17/00

A61P3/00

A61P7/04

A61P7/06

A61P3/10

A61P19/02

A61P35/00

A61P9/00

A61P25/08

A61P25/14

A61P25/16

A61P25/28

A61P43/00 105

A61P43/00 111

A61K31/7105

A61K31/713

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571323

(86)(22)【出願日】2022-05-18

(85)【翻訳文提出日】2024-01-15

(86)【国際出願番号】 US2022029797

(87)【国際公開番号】W WO2022245919

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】63/189,836

(32)【優先日】2021-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/275,527

(32)【優先日】2021-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/334,949

(32)【優先日】2022-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520032893

【氏名又は名称】アビオナ・セラピュ―ティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ａｂｅｏｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】パデジマス， ライナス

(72)【発明者】

【氏名】ケバニー， ブライアン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA13

4C084MA41

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA10

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA061

4C084ZA151

4C084ZA161

4C084ZA331

4C084ZA361

4C084ZA531

4C084ZA551

4C084ZA891

4C084ZA941

4C084ZA961

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4C084ZB261

4C084ZC211

4C084ZC351

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4C084ZC541

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA41

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA58

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA10

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA06

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA33

4C086ZA36

4C086ZA53

4C086ZA55

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4C086ZA94

4C086ZA96

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC21

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4C086ZC41

4C086ZC54

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

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4C087CA12

4C087MA13

4C087MA41

4C087MA52

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4C087MA56

4C087MA58

4C087MA59

4C087MA60

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4C087MA66

4C087NA10

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA06

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA33

4C087ZA36

4C087ZA53

4C087ZA55

4C087ZA89

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4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZC21

4C087ZC35

4C087ZC41

4C087ZC54

(57)【要約】

向上した遺伝子治療のための組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶウイルスベクター、カプシドタンパク質、および投与方法、ならびにそれらの生産および使用方法が本明細書において提供される。本発明は、例えば、眼疾患または障害の処置を必要とする対象において眼疾患または障害を処置する方法であって、前記対象へのＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

眼疾患または障害の処置を必要とする対象において眼疾患または障害を処置する方法であって、前記対象へのＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、方法。

【請求項2】

眼疾患または障害の処置を必要とする対象において眼疾患または障害を処置する方法であって、前記対象へのＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号１～３、３０～３４、４９、６７、８４、および１６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、方法。

【請求項3】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が配列番号１～３、３０～３４、４９、６７、８４および１６４のいずれか１つと異なるアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号２のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号２と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１２９におけるロイシン（Ｌ）、配列番号２のアミノ酸５８６におけるアスパラギン（Ｎ）、および配列番号２のアミノ酸７２３におけるグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号１のアミノ酸配列または最大２、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、アミノ酸１２９におけるロイシン（Ｌ）、アミノ酸１４８におけるプロリン（Ｐ）、アミノ酸１５２におけるアルギニン（Ｒ）、アミノ酸１５３におけるセリン（Ｓ）、アミノ酸１５８におけるスレオニン（Ｔ）、アミノ酸１６３におけるリシン（Ｋ）、アミノ酸１６９におけるアルギニン（Ｒ）、アミノ酸３０６におけるトリプトファン（Ｗ）、アミノ酸３０８におけるフェニルアラニン（Ｆ）、およびアミノ酸３１９におけるアスパラギン（Ｎ）を含み、アミノ酸位置が配列番号１に関して番号付けされたものである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号１６４のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号１６４と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号６７のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号６７と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項10】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号３のアミノ酸配列または最大２、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号３と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項11】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含むＶＰ３部分を含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩがアミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩがアミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶがアミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）またはＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱ（配列番号１７１）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖがアミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩがアミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩがアミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩがアミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸがアミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、
請求項２～３および１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＶＲ－Ｉ領域が、ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）、ＮＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号５３）、ＳＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号８７）、またはＮＧＴＳＧＧＳＴ（配列番号１７０）を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記眼疾患または障害が、優性視神経萎縮症、網膜色素変性症、黄斑変性症、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子中の変異に関する眼障害、レーバー先天性黒内障、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病、コロイデレミア、アッシャー症候群、網膜分離症、ビエッティ結晶性ジストロフィーおよび色覚異常からなる群より選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記網膜色素変性症が、常染色体劣性、常染色体優性、またはＸ連鎖性である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ＢＥＳＴ－１遺伝子中の変異に関する前記眼障害が、卵黄様黄斑ジストロフィー、加齢性黄斑変性症、常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症、緑内障、または白内障である、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＳＰＡＴＡ７、ＬＲＡＴ、ＴＵＬＰ１、ＡＩＰＬ１、ＲＰＧＲ、ＡＩＰＬ１、ＡＢＣＡ４、ＣＨＭ、ＭＹ０７Ａ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ２Ａ、ＣＬＲＮ１、ＲＳ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＲＨＯ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥ６Ｃ、ＰＤＥ６Ｈ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、およびＢＥＳＴ－１から選択される遺伝子をコードするＡＡＶベクターゲノムを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶベクターを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記眼疾患または障害が視神経の機能障害に関する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記眼疾患または障害が優性視神経萎縮症である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＯＰＡ１またはＯＰＡ３導入遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記眼疾患または障害が網膜分離症である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＲＳ１導入遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記傍網膜投与が、網膜の表面から０～１３ミリメートル（ｍｍ）、０～１０ｍｍ、０～５ｍｍ、または０～３ｍｍの距離において目の後部硝子体腔中に注射することを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記対象がヒトである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

ＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、前記ＶＰ３部分が可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩがアミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩがアミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶがアミノ酸配列ＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱ（配列番号１７１）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖがアミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩがアミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩがアミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩがアミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸがアミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、
核酸。

【請求項26】

前記ＶＲ－Ｉ領域がＮＧＴＳＧＧＳＴ（配列番号１７０）を含む、請求項２５に記載の核酸。

【請求項27】

前記ＶＰ３部分が配列番号１６６のアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の核酸。

【請求項28】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ｉ）ＶＰ２部分またはｉｉ）ＶＰ１部分およびＶＰ２部分をさらに含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項29】

コードされる前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６４と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項30】

コードされる前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６５と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項31】

コードされる前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項32】

前記核酸の配列が、配列番号１６７～１６９から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項33】

前記核酸の配列が、配列番号１６７～１６９から選択されるヌクレオチド配列に対して１００％同一である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項34】

請求項２５～３３のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。

【請求項35】

請求項２５～３３のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。

【請求項36】

配列番号１６４、１６５もしくは１６６のアミノ酸配列、または配列番号１６４、１６５もしくは１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。

【請求項37】

請求項２５～３３のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるＡＡＶカプシドタンパク質およびＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルスベクターであって、前記ＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のＡＡＶ逆位末端反復配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル、および
（ｅ）第２のＡＡＶ逆位末端反復配列
を含む、ＡＡＶウイルスベクター。

【請求項38】

前記異種核酸が、構成的プロモーターに作動可能に連結している、請求項３７に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【請求項39】

前記異種核酸がポリペプチドをコードする、請求項３７または３８に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【請求項40】

前記異種核酸が、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする、請求項３７または３８に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【請求項41】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６４、１６５または１６６のアミノ酸配列を含む、請求項３７～４１のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【請求項42】

（ｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質および
（ｉｉ）ＡＡＶベクターゲノム
を含むＡＡＶウイルスベクターであって、前記ＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のＡＡＶ逆位末端反復配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル；および
（ｅ）第２のＡＡＶ逆位末端反復配列
を含む、ＡＡＶウイルスベクター。

【請求項43】

前記異種核酸が、配列番号１４２～１４４および１７７～１８１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項３７～３９および４１～４２のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【請求項44】

前記異種核酸が、配列番号１１６～１１８および１７２～１７６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【請求項45】

疾患または障害を処置する方法であって、請求項３７～４４のいずれかに記載のＡＡＶウイルスベクターを対象に投与することを含む、方法。

【請求項46】

前記ＡＡＶウイルスベクターが、前記対象に経口的に、直腸に、経粘膜的に、吸入により、経皮的に、非経口的に、静脈内に、皮下に、皮内に、筋肉内に、胸膜内に、脳内に、髄腔内に、脳内に、脳室内に、鼻腔内に、耳内に、眼内に、眼周囲に、外用で、リンパ内に、槽内に、硝子体内に、傍網膜的に、または網膜下に投与される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記疾患または障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ファブリー病、ポンペ病、ＣＬＮ３病（もしくは若年性神経セロイドリポフスチノーシス）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、若年性バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、がん、関節炎、筋消耗、心臓疾患、内膜過形成、癲癇、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー－シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡもしくはＭＰＳ ＩＩＩＡ）、サンフィリポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢもしくはＭＰＳ ＩＩＩＢ）、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー－ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄脳性運動失調症、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、関節炎、黄斑変性症、網膜色素変性症、神経セロイドリポフスチノーシス１（ＣＬＮ１）、アデノシンデアミナーゼ欠損症、優性視神経萎縮症、網膜分離症、シュタルガルト病、ビエッティ結晶性ジストロフィーまたはＢＥＳＴ卵黄様黄斑ジストロフィーである、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項48】

前記疾患または障害が眼疾患または障害である、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項49】

前記眼疾患または障害が、優性視神経萎縮症、網膜色素変性症、黄斑変性症、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子中の変異に関する眼障害、レーバー先天性黒内障、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病、コロイデレミア、アッシャー症候群、網膜分離症、ビエッティ結晶性ジストロフィーおよび色覚異常からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記対象がヒトである、請求項４５～４９のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月１８日に出願された米国仮出願第６３／１８９，８３６号、２０２１年１１月４日に出願された米国仮出願第６３／２７５，５２７号、および２０２２年４月２６日に出願された米国仮出願第６３／３３４，９４９号の利益を主張し、該仮出願のすべては参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照による組込み
本明細書と共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読取り可能な形式のコピー（ファイル名：ＡＢＥＯ＿００８＿０３ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ、作成日：２０２２年５月１７日、ファイルサイズ：約６３６ｋｂ）。

【背景技術】

【0003】

背景
アデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子治療のための有望な送達ベクターである。しかしながら、それらの治療有効性は、ベクターの送達経路、送達効率により損なわれている。したがって、選択されたＡＡＶウイルスベクターをより良好な治療的な潜在能力を伴って送達するための新たな戦略に対する緊急の必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

概要
本開示は、概しては、遺伝子治療の分野に関し、特に、新規のカプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子（ＡＡＶウイルスベクターとしても公知である）、それらの生産、それらの送達方法、および導入遺伝子を送達して疾患または障害を処置または予防するためのそれらの使用に関する。

【0005】

一態様では、本開示は、眼疾患または障害の処置を必要とする対象において眼疾患または障害を処置する方法であって、対象へのＡＡＶウイルスベクターの傍網膜（ｐａｒａ－ｒｅｔｉｎａｌ）投与を含み、ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、方法を提供する。

【0006】

一態様では、本開示は、眼疾患または障害の処置を必要とする対象において眼疾患または障害を処置する方法であって、対象へのＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与を含み、ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号１～３、３０～３４、４９、６７、８４、および１６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、方法を提供する。

【0007】

実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が配列番号１～３、３０～３４、４９、６７、８４および１６４のいずれか１つと異なるアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号２のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号２と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１２９におけるロイシン（Ｌ）、配列番号２のアミノ酸５８６におけるアスパラギン（Ｎ）、および配列番号２のアミノ酸７２３におけるグルタミン酸（Ｅ）を含む。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号１のアミノ酸配列または最大２、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸１２９におけるロイシン（Ｌ）、アミノ酸１４８におけるプロリン（Ｐ）、アミノ酸１５２におけるアルギニン（Ｒ）、アミノ酸１５３におけるセリン（Ｓ）、アミノ酸１５８におけるスレオニン（Ｔ）、アミノ酸１６３におけるリシン（Ｋ）、アミノ酸１６９におけるアルギニン（Ｒ）、アミノ酸３０６におけるトリプトファン（Ｗ）、アミノ酸３０８におけるフェニルアラニン（Ｆ）、およびアミノ酸３１９におけるアスパラギン（Ｎ）を含み、アミノ酸位置は配列番号１に関して番号付けされたものである。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号１６４のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号１６４と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号６７のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号６７と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号３のアミノ酸配列または最大２、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号３と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。

【0008】

実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含むＶＰ３部分を含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩはアミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩはアミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶはアミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）またはＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱ（配列番号１７１）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖはアミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩはアミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩはアミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩはアミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸはアミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む。
実施形態では、ＶＲ－Ｉ領域は、ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）、ＮＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号５３）、ＳＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号８７）、またはＮＧＴＳＧＧＳＴ（配列番号１７０）を含む。

【0009】

実施形態では、眼疾患または障害は、優性視神経萎縮症、網膜色素変性症、黄斑変性症、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子中の変異に関する眼障害、レーバー先天性黒内障、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病、コロイデレミア、アッシャー症候群、網膜分離症、ビエッティ結晶性ジストロフィーおよび色覚異常からなる群より選択される。実施形態では、網膜色素変性症は、常染色体劣性、常染色体優性、またはＸ連鎖性である。実施形態では、ＢＥＳＴ－１遺伝子中の変異に関する眼障害は、卵黄様黄斑ジストロフィー、加齢性黄斑変性症、常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症（ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｃｈｏｒｏｉｄｏｐａｔｈｙ）、緑内障、または白内障である。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、ＳＰＡＴＡ７、ＬＲＡＴ、ＴＵＬＰ１、ＡＩＰＬ１、ＲＰＧＲ、ＡＩＰＬ１、ＡＢＣＡ４、ＣＨＭ、ＭＹ０７Ａ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ２Ａ、ＣＬＲＮ１、ＲＳ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＲＨＯ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥ６Ｃ、ＰＤＥ６Ｈ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、およびＢＥＳＴ－１から選択される遺伝子をコードするＡＡＶベクターゲノムを含む。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶベクターを含む。実施形態では、眼疾患または障害は視神経の機能障害に関する。

【0010】

実施形態では、眼疾患または障害は優性視神経萎縮症である。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、ＯＰＡ１またはＯＰＡ３導入遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムを含む。

【0011】

実施形態では、眼疾患または障害は網膜分離症である。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、ＲＳ１導入遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムを含む。

【0012】

実施形態では、傍網膜投与は、網膜の表面から０～１３ミリメートル（ｍｍ）、０～１０ｍｍ、０～５ｍｍ、または０～３ｍｍの距離において目の後部硝子体腔（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｖｉｔｒｅｏｕｓ ｃａｖｉｔｙ）中に注射することを含む。実施形態では、傍網膜投与は、網膜の表面から０～１３ｍｍの距離において後部硝子体腔中に注射することを含む。実施形態では、傍網膜投与は、網膜の表面から０～１０ｍｍの距離において後部硝子体腔中に注射することを含む。実施形態では、傍網膜投与は、網膜の表面から０～５ｍｍの距離において後部硝子体腔中に注射することを含む。実施形態では、傍網膜投与は、網膜の表面から０～３ｍｍの距離において後部硝子体腔中に注射することを含む。

【0013】

実施形態では、対象はヒトである。

【0014】

一態様では、本開示は、ＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、ＶＰ３部分が可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩがアミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩがアミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶがアミノ酸配列ＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱ（配列番号１７１）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖがアミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩがアミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩがアミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩがアミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸがアミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、
核酸を提供する。
実施形態では、ＶＲ－Ｉ領域はＮＧＴＳＧＧＳＴ（配列番号１７０）を含む。実施形態では、ＶＰ３部分は配列番号１６６のアミノ酸配列を有する。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ｉ）ＶＰ２部分またはｉｉ）ＶＰ１部分およびＶＰ２部分をさらに含む。

【0015】

実施形態では、コードされるＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１６４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６４と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。実施形態では、コードされるＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１６５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６５と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。実施形態では、コードされるＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１６６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。実施形態では、核酸配列は、配列番号１６７～１６９から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である。実施形態では、核酸配列は、配列番号１６７～１６９から選択されるヌクレオチド配列に対して１００％同一である。

【0016】

一態様では、本開示は、本開示の核酸を含むベクターを提供する。

【0017】

一態様では、本開示は、本開示の核酸によりコードされるＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。実施形態では、タンパク質は、配列番号１６４、１６５もしくは１６６のアミノ酸配列、または配列番号１６４、１６５もしくは１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。

【0018】

一態様では、本開示は、本開示の核酸によりコードされるＡＡＶカプシドタンパク質およびＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルスベクターであって、ＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のＡＡＶ逆位末端反復配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル、および
（ｅ）第２のＡＡＶ逆位末端反復配列
を含む、ＡＡＶウイルスベクターを提供する。

【0019】

実施形態では、異種核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。実施形態では、異種核酸はポリペプチドをコードする。実施形態では、異種核酸は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１６４、１６５または１６６のアミノ酸配列を含む。

【0020】

一態様では、本開示は、
（ｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質ならびに
（ｉｉ）ＡＡＶベクターゲノムであって、ＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のＡＡＶ逆位末端反復配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル；および
（ｅ）第２のＡＡＶ逆位末端反復配列
を含む、ＡＡＶベクターゲノム
を含む、ＡＡＶウイルスベクターを提供する。

【0021】

実施形態では、異種核酸は、配列番号１４２～１４４および１７７～１８１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。実施形態では、異種核酸は、配列番号１１６～１１８および１７２～１７６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【0022】

一態様では、本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、本開示のＡＡＶウイルスベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、対象に経口的に、直腸に、経粘膜的に、吸入により、経皮的に、非経口的に、静脈内に、皮下に、皮内に、筋肉内に、胸膜内に、脳内に、髄腔内に、脳内に、脳室内に、鼻腔内に、耳内に、眼内に、眼周囲に、外用で、リンパ内に、槽内に（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、硝子体内に、傍網膜的に、または網膜下に投与される。実施形態では、疾患または障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ファブリー病、ポンペ病、ＣＬＮ３病（もしくは若年性神経セロイドリポフスチノーシス）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、若年性バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、がん、関節炎、筋消耗、心臓疾患、内膜過形成、癲癇、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー－シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡもしくはＭＰＳ ＩＩＩＡ）、サンフィリポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢもしくはＭＰＳ ＩＩＩＢ）、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー－ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄脳性運動失調症（ｓｐｉｎａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｔａｘｉａ）、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、関節炎、黄斑変性症、網膜色素変性症、神経セロイドリポフスチノーシス１（ＣＬＮ１）、アデノシンデアミナーゼ欠損症、優性視神経萎縮症、網膜分離症、シュタルガルト病、ビエッティ結晶性ジストロフィーまたはＢＥＳＴ卵黄様黄斑ジストロフィーである。実施形態では、疾患または障害は眼疾患または障害である。実施形態では、眼疾患または障害は、優性視神経萎縮症、網膜色素変性症、黄斑変性症、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子中の変異に関する眼障害、レーバー先天性黒内障、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病、コロイデレミア、アッシャー症候群、網膜分離症、ビエッティ結晶性ジストロフィーおよび色覚異常からなる群より選択される。実施形態では、対象はヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、眼内投与の様々なモードの実例である。Yiu et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Jan 21;16:179-191（その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）から適合させた。

【0024】

【図2A】図２Ａ～２Ｅは、硝子体内または傍網膜投与を介した非ヒト霊長類動物モデルの目におけるＡＡＶウイルスベクター媒介性ＧＦＰ発現を示す。走査型レーザー検眼鏡検査（ＳＬＯ）イメージングを指し示されるＡＡＶウイルスベクターの注射後２６日目に行った。図２Ａは、ＡＡＶ２０４カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの硝子体内注射により媒介された形質導入の拡大を示す。図２Ｂは、ＡＡＶ２０４カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの傍網膜注射により媒介された形質導入の拡大を示す。図２Ｃは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの傍網膜注射により媒介された形質導入の拡大を示す。図２Ｄは、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの傍網膜注射により媒介された形質導入の拡大を示す。図２Ｅは、ＡＡＶ２１４－Ｄ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの傍網膜注射により媒介された形質導入の拡大を示す。

【図2B-1】同上。

【図2B-2】同上。

【図2C-1】同上。

【図2C-2】同上。

【図2D】同上。

【図2E】同上。

【0025】

【図3A】図３Ａ～３Ｆは、ＡＡＶ投与後の網膜のイメージング分析を示す。図３Ａは、ＡＡＶ２０４硝子体内投与後の網膜の合成画像を示す。図３Ｂは、ＡＡＶ２０４傍網膜投与後の網膜の合成（左上）、ロドプシン（右上）、および拡大合成（下）画像を示す。図３Ｃは、ＡＡＶ２０４傍網膜投与後の網膜の合成（左上）、ロドプシン（右上）、および拡大合成（下）画像を示す。図３Ｄは、ＡＡＶ２０４またはＡＡＶ８ウイルスベクターの傍網膜注射の１か月後のロドプシンおよびＧＦＰ発現の免疫組織化学分析を示す。図３Ｅは、ＡＡＶ２０４ウイルスベクターの傍網膜注射後の中心窩におけるロドプシンおよびＧＦＰ発現を示す。図３Ｆは、ＡＡＶ２０４ウイルスベクターの傍網膜注射後の乳頭黄斑束（ｐａｐｉｌｌｏｍａｃｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）に沿ったロドプシンおよびＧＦＰ発現を示す。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図3E】同上。

【図3F】同上。

【0026】

【図4A】図４Ａ～４Ｃは、網膜下投与を介した非ヒト霊長類動物モデルの目におけるＡＡＶウイルスベクター媒介性ＧＦＰ発現を示す。ＳＬＯイメージングを指し示されるＡＡＶウイルスベクターの注射後２７日目に行った。図４Ａは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの網膜下注射により媒介された形質導入の拡大を示す。図４Ｂは、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの網膜下注射により媒介された形質導入の拡大を示す。図４Ｃは、ＡＡＶ２１４－Ｄ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの網膜下注射により媒介された形質導入の拡大を示す。図４Ｄは、ＡＡＶ８網膜下投与後の網膜の合成（左上）、ロドプシン（右上）、および拡大合成（下）画像を示す。図４Ｅは、ＡＡＶ２１４網膜下投与後の網膜の合成（左上）、ロドプシン（右上）、および拡大合成（下）画像を示す。図４Ｆは、ＡＡＶ２１４－Ｄ５網膜下投与後の網膜の合成（左上）、ロドプシン（右上）、および拡大合成（下）画像を示す。

【図4B】同上。

【図4C】同上。

【図4D】同上。

【図4E】同上。

【図4F】同上。

【0027】

【図5】図５は、カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３部分の図表を示す。ＶＰ１およびＶＰ２特異的部分をＶＰ３部分と共に指し示しており、ＶＰ３部分は、製造されるＶＰ３タンパク質と同一である。ＡＡＶ２１４ ＶＰ３のアミノ酸配列（配列番号４１）を示しており、可変領域Ｉ～ＩＸを指し示している。ＡＡＶ２１４についての完全ＶＰ１タンパク質アミノ酸配列は配列番号３として提供される。

【0028】

【図6-1】図６は、ＡＡＶ２１４（配列番号３）およびＡＡＶ２１４－Ｄ５（配列番号１６４）のＶＰ１タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。

【図6-2】同上。

【発明を実施するための形態】

【0029】

詳細な説明
本開示による一部の実施形態が以下においてより完全に記載される。本開示の態様は、しかしながら、異なる形態において具現化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されるとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全なものとなり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。本明細書の記載において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、限定的であることは意図されない。

【0030】

他に定義されなければ、本明細書において使用されるすべての用語（科学技術用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。用語、例えば一般的に使用される辞典において定義される用語は、本出願および関連技術の文脈におけるそれらの意味と合致する意味を有するとして解釈されるべきであり、本明細書において明示的にそのように定義されなければ、理想化されたまたは過度に形式的な意味において解釈されるべきではないことがさらに理解される。

【0031】

文脈が他に指し示さなければ、本明細書に記載される発明の様々な特徴は任意の組合せで使用され得ることが特に意図される。さらに、本開示はまた、実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組合せは除外または省略され得ることを想定する。実例を挙げると、複合体は成分Ａ、ＢおよびＣを含むことが本明細書において述べられている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはその組合せは、単独でまたは任意の組合せで省略および放棄され得ることが特に意図される。

【0032】

他に明示的に指し示されなければ、すべての明示される実施形態、特徴、および用語は、記載される実施形態、特徴、または用語およびその生物学的同等物の両方を含むことを意図する。

【0033】

参照による組込み
本明細書において参照されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、参照によりそれらの全体がすべての目的のために組み込まれる。しかしながら、本明細書において参照される任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願への言及は、それらが世界の任意の国において有効な先行技術を構成するか、または一般常識の部分を形成することの承認または任意の形態の示唆ではなく、またそのように解釈されるべきではない。

【0034】

定義
本技術の実施は、他に指し示されなければ、当技術分野の技術的範囲内にある有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術を用いる。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989);Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987));the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (RI. Freshney, ed. (1987))を参照。

【0035】

常に明示的に述べられるわけではないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的なものであること、およびその同等物が当技術分野において公知であることもまた理解されるべきである。

【0036】

用語「約」は、測定可能な値、例えば量または濃度などを指す場合に本明細書で使用される場合、指定される量の１０％の変動を包含することが意味される。

【0037】

用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書に開示される任意の成分、範囲、投与形態などの選択を記載するために使用される場合、前記成分、範囲、投与形態などが、開示される目的のために好適であることを意図する。

【0038】

特に記載されなければ、用語「宿主細胞」は、例えば、真菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む、真核宿主細胞を含む。真核宿主細胞の非限定的な例は、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類およびヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞を含む。

【0039】

用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的物質または細胞材料を指す。

【0040】

本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。そのため、この用語は、プリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学的にもしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる一本鎖、二本鎖、または多鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはポリマーを含むが、それに限定されない。

【0041】

「遺伝子」は、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードする能力を有する少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」または、代替的に、「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写および翻訳された場合に生成されるアミノ酸配列（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。

【0042】

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される２ステッププロセス、および／または、転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。

【0043】

「転写制御下」は、当技術分野においてよく理解される用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントに該配列が作動可能に連結していることに依存することを指し示す。「作動可能に連結した」は、複数のポリヌクレオチドが、それらが細胞中で機能することを可能とする方式で並べられていることを意図する。一態様では、本発明は、下流の配列に作動可能に連結したプロモーターを提供する。

【0044】

用語「コードする」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、そのネイティブな状態にあるか、または当業者に周知の方法により操作された場合に、転写されてポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを生成することができる、ポリペプチドを「コードする」といわれるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コード配列はそれらから導出され得る。

【0045】

用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、コード配列、例えば遺伝子または導入遺伝子の転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列を意味する。プロモーターは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であってもよい。プロモーターは、調節タンパク質ならびに分子、例えばＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子が結合し得る遺伝子エレメントを含有してもよい。非限定的な例示的なプロモーターは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じてＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、遍在的ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａもしくはＵ１ｂ）プロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小ＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーターまたはＥＦＩプロモーターを含む。

【0046】

本明細書において提供される追加の非限定的な例示的なプロモーターは、ＥＦｌａ、Ｕｂｃ、ヒトβ－アクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、Ｕｂｉ、およびα－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）を含むが、それに限定されない。そのようなプロモーターのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ転写の効率を増加または減少させるために改変されてもよいことが当技術分野において公知である。例えば、Gao et al. (2018) Mol. Ther.: Nucleic Acids 12:135-145を参照（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写を消失させ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激するための７ＳＫ、Ｕ６およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスの改変）。合成により誘導されたプロモーターは、遍在的なまたは組織特異的な発現のために使用されてもよい。さらに、その一部は上記される、ウイルス由来プロモーターは、本明細書に開示される方法において有用なことがあり、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＡＡＶプロモーターがある。実施形態では、プロモーターは、転写効率を増加させるためにエンハンサーと共に使用される。エンハンサーの非限定的な例は、間質レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、ＲＳＶエンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを含む。

【0047】

エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供する能力を有する配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長鎖末端反復配列は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結しているエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学技術）によって遺伝子に並置して置かれたエンハンサー／プロモーターであって、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターにより誘導されるようなものである。本明細書において提供される方法、組成物および構築物における使用のための連結されるエンハンサー／プロモーターの非限定的な例は、ＰＤＥプロモーター＋ＩＲＢＰエンハンサーまたはＣＭＶエンハンサー＋Ｕ１ａプロモーターを含む。エンハンサーは、内因性または異種プロモーターの位置に対するそれらの配向性にかかわらず、距離をおいて機能できることが当技術分野において理解される。そのため、プロモーターから距離をおいて機能するエンハンサーは、ベクター中のその位置またはプロモーターの位置に対するその配向性にかかわらずそのプロモーターに「作動可能に連結している」ことがさらに理解される。

【0048】

用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、交換可能におよびそれらの最も広い意味において使用され、アミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の２つまたはより多くのサブユニットの化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合により連結されてもよい。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンならびにＤおよびＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む、天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸を指す。

【0049】

本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、通常は新たに合成された分泌または膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸配列を意図する。それは、特異的な細胞位置、例えば細胞膜を越えて、細胞膜中に、または核中に、ポリペプチドを方向付けるように作用する。実施形態では、シグナルペプチドは局在化後に除去される。シグナルペプチドの例は当技術分野において周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号、同第５，９５８，７３６号、および同第８，７９５，９６５号に記載されるものである。実施形態では、シグナルペプチドはＩＤＵＡシグナルペプチドであり得る。

【0050】

用語「同等物」または「生物学的同等物」は、特定の分子、生物学的材料、または細胞材料を指す場合に交換可能に使用され、所望される構造または機能性を依然として維持しながら最小の相同性を有するものを意図する。同等のポリペプチドの非限定的な例は、参照ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチド；または参照ポリヌクレオチド（例えば、野生型ポリヌクレオチド）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９７％の配列同一性もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む。

【0051】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。同一性パーセントは、比較の目的のためにアライメントされ得る各々の配列中の位置を比較することにより決定され得る。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合、分子はその位置において同一である。配列間の同一性の程度は、これらの配列により共有されるマッチする位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、２５％未満の同一性を共有する。アライメントおよび配列同一性パーセントは、本明細書において提供される核酸またはアミノ酸配列について、前記核酸またはアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／において利用可能）およびＧｏｎｎｅｔ（タンパク質用）重みマトリックスにインポートすることおよびこれらを使用することにより決定されてもよい。実施形態では、本明細書において見出される核酸配列を使用して核酸配列アライメントを行うために使用されるＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡ用）重みマトリックスを使用して生成される。

【0052】

本明細書で使用される場合、アミノ酸改変は、置換、欠失または挿入であってもよい。アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的置換え（保存的変異、保存的置換または保存的変更とも呼ばれる）は、所与のアミノ酸を、類似した生化学的特性（例えば、電荷、疎水性またはサイズ）を有する異なるアミノ酸に変化させるタンパク質中のアミノ酸の置換えである。本明細書で使用される場合、「保存的変更」は、別の、生物学的に類似した残基による、アミノ酸残基の置換えを指す。保存的変更の例は、１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンでの、別の疎水性残基の置換；または１つの荷電性もしくは極性残基での、別の荷電性もしくは極性残基の置換、例えばアルギニンでのリシンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、およびグルタミンでのアスパラギンの置換などを含む。保存的置換の他の実例は、アラニンからセリンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；リシンからアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸へ；フェニルアラニンからチロシンへ、セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；およびチロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへなどの変化を含む。

【0053】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、例えばトランスフェクション、感染、または形質転換のプロセスにより、細胞内に置かれた場合に、複製され得るようなインタクトなレプリコンを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸を指す。細胞の内側に入ると、ベクターは、染色体外（エピソーム）エレメントとして複製されてもよく、または宿主細胞染色体に組み込まれてもよいことが当技術分野において理解される。ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変されたバキュロウイルス、パポバウイルス、または他に改変された天然に存在するウイルスに由来する核酸を含んでもよい。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターは、ネイキッドＤＮＡ；単独でまたはカチオン性ポリマーと組み合わせて、カチオン性脂質と複合体化したＤＮＡ；アニオン性およびカチオン性リポソーム；ＤＮＡ－タンパク質複合体、ならびにカチオンポリマー、例えば不均質ポリリシン、定義される長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミンと共に凝集したＤＮＡを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる粒子であって、一部の場合には、リポソーム中に含有されるもの；ならびにウイルスおよびポリリシン－ＤＮＡを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる三元複合体の使用を含む。

【0054】

一般的な組換え技術に関して、ポリヌクレオチドが作動可能に連結し得るプロモーターおよびクローニング部位の両方を含有するベクターは、当技術分野において周知である。そのようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写する能力を有し、供給元、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）から商業的に入手可能である。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、余分な、潜在的な不適切な選択的翻訳開始コドン、または、転写もしくは翻訳のレベルで、発現に干渉し得るかもしくは発現を低減させ得る他の配列を排除するために、クローニングされた導入遺伝子の５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更することが必要であり得る。代替的に、発現を増強するために開始コドンのすぐ５’にコンセンサスリボソーム結合部位が挿入され得る。

【0055】

「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞中に送達されるべきポリヌクレオチドを含有する、組換えにより製造されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、ＡＡＶウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターなどを含む。アルファウイルスベクター、例えばセムリキ森林ウイルスベースベクターおよびシンドビスウイルスベースベクターもまた、遺伝子治療および免疫治療における使用のために開発されている。例えば、Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439およびYing, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照。

【0056】

本明細書で使用される場合、用語「組換え発現システム」または「組換えベクター」は、組換えにより形成されたある特定の遺伝子材料の発現用の１つまたは複数の遺伝子構築物を指す。

【0057】

「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞中に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む、ミセル生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工的なウイルスエンベロープ；金属粒子；細菌；ウイルス、例えばバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス；バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、および真菌ベクター；ならびに様々な真核性および原核性宿主における発現について記載されており、遺伝子治療の他に単純なタンパク質発現のために使用され得る、当技術分野において典型的に使用される他の組換えビヒクルである。標的化抗体またはその断片も含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるリポソームは、本明細書に開示される方法において使用され得る。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、細胞または細胞集団への本明細書に記載されるタンパク質の直接的な導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技術により行うことができ、代替的に、本明細書に開示されるタンパク質の発現を増強することおよび／または活性を促進することができる培養条件は、他の非限定的な技術である。

【0058】

本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達され得る。「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、および「形質導入」などは、本明細書で使用される場合、導入のために使用される方法にかかわらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」として参照される場合がある）の導入を指す用語である。そのような方法は、様々な周知の技術、例えばベクター媒介性遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または様々な他のタンパク質ベースもしくは脂質ベース遺伝子送達複合体によるもの）の他に、「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を促す技術（例えば電気穿孔、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドの導入のために使用される様々な他の技術）を含む。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定的にまたは一過的に維持されてもよい。安定な維持は、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含有するか、または宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）もしくは核もしくはミトコンドリア染色体に組み込まれることを典型的には要求する。当技術分野において公知であるように、および本明細書に記載されるように、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介する能力を有するいくつかのベクターが公知である。

【0059】

「プラスミド」は、典型的には染色体ＤＮＡとは別々の、かつ染色体ＤＮＡから独立して複製する能力を有するＤＮＡ分子である。多くの場合に、それは環状および二本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内での水平の遺伝子移入のための機構を提供し、典型的には所与の環境状態下での選択的な利点を提供する。プラスミドは、競合的な環境ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を保有してもよく、または、代替的に、産生されるタンパク質は、類似した状況下で毒素として作用してもよい。プラスミドベクターは多くの場合に染色体外環状ＤＮＡ分子として存在するが、プラスミドベクターはまた、無作為にまたは標的化された方式で宿主染色体に安定的に組み込まれるように設計されてもよく、そのような組込みは、環状プラスミドまたは宿主細胞への導入に先立って線状化されたプラスミドのいずれかを使用して達成されてもよいことが当技術分野において公知である。

【0060】

遺伝子操作において使用される「プラスミド」は「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドがそのような使用のために商業的に入手可能である。複製されるべき遺伝子は、特定の抗生物質に対して細胞を耐性とする遺伝子、およびこの位置におけるＤＮＡ断片の容易な挿入を可能とするいくつかの一般的に使用される制限部位を含有する短い領域であるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含有するプラスミドのコピーに挿入される。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質の作製である。この場合、研究者は、目的の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌または真核細胞を増殖させ、該プラスミドは、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導され得る。

【0061】

遺伝子移入がＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）により媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分、および導入遺伝子を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリヌクレオチドを指す。

【0062】

用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書で使用される場合、この名称と関連付けられ、かつデペンドパルボウイルス属、パルボウイルス科に属する、ウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスにより提供される細胞中でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報および総説は、例えば、Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228およびBerns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)において見出され得る。これらの総説に記載される同じ原理が、該総説の刊行日後に特徴付けられる追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが完全に予想され、その理由は、様々な血清型は、遺伝子レベルにおいてさえ、構造的および機能的の両方で、かなり密接に関連していることが周知であるからである。（例えば、Blacklowe, 1988, pp. 165-174, Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.;およびRose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)を参照）。例えば、すべてのＡＡＶ血清型は、相同的なｒｅｐ遺伝子により媒介される非常に類似した複製特性を呈するようであり；すべては、ＡＡＶ２において発現されるもののような３つの関連するカプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の大規模なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロデュプレックス分析；および「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在によりさらに示唆される。類似した感染力パターンはまた、各々の血清型における複製機能が、類似した調節制御下にあることを示唆する。このウイルスの複数の血清型は遺伝子送達のために好適であることが公知であり；すべての公知の血清型は様々な組織タイプからの細胞に感染することができる。少なくとも１１個の逐次的に番号付けされたＡＡＶ血清型が当技術分野において公知である。本明細書に開示される方法において有用な非限定的な例示的な血清型は、１１個の血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアント血清型、例えば、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのいずれかを含む。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質：ＶＰｌ、ＶＰ２およびＶＰ３を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７４を指す。

【0063】

「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の異種核酸（ＨＮＡ）配列および１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含むベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物の機能性を提供し、かつＩＴＲおよびＩＴＲの間の核酸が感染性ウイルス粒子中にパッケージングされることを可能とする宿主細胞中に存在する場合に複製され得る。実施形態では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸、ならびに／または感染性ＡＡＶ粒子中にパッケージングされる隣接するＩＴＲ内のエンハンサーおよび／もしくはターミネーターを含む。ＩＴＲおよびＩＴＲの間の核酸は、ＡＡＶカプシド中にカプシド被包されることができ、核酸のこのカプシド被包される部分は「ＡＡＶベクターゲノム」として参照されることがある。ＡＡＶベクターは、カプシド被包される部分に加えてエレメント、例えば、抗生物質耐性遺伝子、または生産目的のためにプラスミド中に含まれるがＡＡＶ粒子中にパッケージングされない当技術分野において公知の他のエレメントを含有してもよい。

【0064】

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性シェルまたはコートを指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド被包し、保護し、輸送し、かつ宿主細胞中に放出するために機能する。カプシドは、タンパク質（「カプシドタンパク質」）のオリゴマー構造サブユニットから一般に構成される。本明細書で使用される場合、用語「カプシド被包された」は、ウイルスカプシド内に囲まれていることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは、３つのウイルスカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物から構成される。Sonntag F et al., (June 2010). "A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22): 10220-5、およびRabinowitz JE, Samulski RJ (December 2000). "Building a better vector: the manipulation of AAV virions". Virology. 278 (2): 301-8（これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の混合物は、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）または１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比でＴ＝１正二十面体対称性に並べられた６０個の単量体を含有する。

【0065】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド被包されたＡＡＶベクターゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。

【0066】

本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関する用語「ヘルパー」は、本明細書に開示されるＡＡＶベクターゲノムのいずれか１つの複製およびパッケージングのために必要な追加の成分を提供するために使用されるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによりコードされる成分は、ビリオンアセンブリー、カプシド被包、ゲノム複製、および／またはパッケージングのために要求される任意の遺伝子を含んでもよい。例えば、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、ウイルスゲノムの複製のための必要な酵素をコードしてもよい。ＡＡＶ構築物との使用のために好適なヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例は、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）を含む。実施形態では、ｐＨＥＬＰプラスミドはｐＨＥＬＰＫプラスミドであってもよく、ここで、アンピシリン発現カセットはカナマイシン発現カセットと交換されており；ｐＨＥＬＰＫは配列番号９２に示される配列を有する。

【0067】

本明細書で使用される場合、パッケージング細胞（またはヘルパー細胞）は、ウイルスベクターを製造するために使用される細胞である。組換えＡＡＶウイルスベクターの製造は、トランスで提供されるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の他に、ＡＡＶ複製を助けるアデノウイルスからの遺伝子配列を要求する。一部の態様では、パッケージング／ヘルパー細胞は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれるプラスミドを含有する。他の態様では、パッケージング細胞は一過的にトランスフェクトされてもよい。典型的には、パッケージング細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞または昆虫細胞である。

【0068】

本明細書で使用される場合、レポータータンパク質は、プロモーターの発現（例えば、組織特異性および／または強度）をアッセイするためにプロモーターに作動可能に連結される検出可能なタンパク質である。態様では、レポータータンパク質はポリペプチドに作動可能に連結されてもよい。態様では、レポータータンパク質は、ＤＮＡ送達方法、プロモーターおよびエンハンサーエレメントの機能的な同定および特徴付け、翻訳および転写調節、ｍＲＮＡプロセシングならびにタンパク質：タンパク質相互作用のモニタリングにおいて使用されてもよい。レポータータンパク質の非限定的な例は、β－ガラクトシダーゼ；蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；ルシフェラーゼ；グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ；およびマルトース結合タンパク質である。

【0069】

「医薬組成物」は、活性成分、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体またはウイルスベクターと、組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用のために好適なものとする、不活性または活性の、担体、例えば固体支持体との組合せを含むことが意図される。

【0070】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝食塩溶液、水、およびエマルション、例えば油／水または水／油エマルション、ならびに様々なタイプの湿潤剤のいずれも包含する。組成物はまた、安定化剤および防腐剤を含むことができる。担体、安定化剤およびアジュバントの例について、Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)を参照。

【0071】

診断または処置の「対象」は、細胞または動物、例えば哺乳動物、もしくはヒトである。対象は、特有の種に限定されず、サル、マウス、ラット、イヌ、またはウサギ科動物種の他に、他の家畜類、競技動物、または愛玩動物を限定なしに含む、診断または処置に供される非ヒト動物および感染または動物モデルに供される非ヒト動物を含む。実施形態では、対象はヒトである。

【0072】

用語「組織」は、生きたもしくは死んだ生物の組織または生きたもしくは死んだ生物に由来するかもしくは該生物を模倣するために設計された任意の組織を指すために本明細書において使用される。組織は、健常であり、疾患状態であり、かつ／または遺伝的変異を有するものであってもよい。生物学的組織は、任意の単一の組織（例えば、相互接続されていてもよい細胞の集合物）、または生物の身体の臓器もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含んでもよい。組織は、均質な細胞材料を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるものであってもよく、または複合構造物、例えば、例えば肺組織、骨格組織、および／もしくは筋肉組織を含むことができる胸郭を含む身体の領域中に見出されるものであってもよい。例示的な組織は、以下の任意の組合せを含む、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆樹、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸に由来するものを含むが、それに限定されない。

【0073】

本明細書で使用される場合、対象において疾患を「処置すること」または対象における疾患の「処置」は、（１）素因を有するかもしくは疾患の症状を未だ示していない対象において症状もしくは疾患が起こることを予防すること；（２）疾患を阻害するかもしくはその発症を停止させること；または（３）疾患もしくは疾患の症状を好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）かもしくはその退縮を引き起こすことを指す。当技術分野において理解されるように、「処置」は、臨床的結果を含む、有益なまたは所望される結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のために、有益なまたは所望される結果は、検出可能または検出不可能のいずれであれ、１つまたは複数の症状の軽減または好転、状態（疾患を含む）の程度の縮小、状態（疾患を含む）の安定化した（すなわち、悪化しない）状況、状態（疾患を含む）、進行の遅延または緩慢化、状態（疾患を含む）、状況の好転または一時的緩和および寛解（部分または完全のいずれであれ）の１つまたは複数を含むことができるが、それに限定されない。

【0074】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望される効果を達成するために十分な量を意味することを意図する。治療的または予防的適用の文脈において、有効量は、問題とする状態のタイプおよび重症度ならびに個々の対象の特徴、例えば全般的健康状態、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する忍容性に依存する。遺伝子治療の文脈において、実施形態では、有効量は、対象において欠損した遺伝子の部分的なまたは完全な機能の再獲得を結果としてもたらすために十分な量である。実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の有効量は、対象において遺伝子の発現を結果としてもたらすために十分な量である。当業者は、これらおよび他の要因に依存して適切な量を決定することができる。

【0075】

実施形態では、有効量は、問題とする適用のサイズおよび性質に依存する。それはまた、標的対象の性質および感受性ならびに使用される方法に依存する。当業者は、これらおよび他の検討事項に基づいて有効量を決定することができる。有効量は、実施形態に依存して組成物の１または複数の投与を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるものであってもよい。

【0076】

本明細書で使用される場合、用語「投与する」または「投与」は、対象、例えば動物またはヒトへの物質の送達を意味することを意図する。投与は、１用量で、処置の過程の全体を通じて連続的にまたは間欠的にもたらされ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、治療のために使用される組成物、治療の目的の他に、処置されている対象の年齢、健康状態または性別によって変動する。単回または複数回の投与は、処置医または愛玩動物および他の動物の場合に処置獣医により選択される用量レベルおよびパターンで実行され得る。

【0077】

ＡＡＶの構造および機能
ＡＡＶは複製欠損型パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの約１４５ヌクレオチド逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７において提供されており；ＡＡＶ－２の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１およびSrivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)において提供されており；ＡＡＶ－３の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿ｌ８２９において提供されており；ＡＡＶ－４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９において提供されており；ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６において提供されており；ＡＡＶ－６の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２において提供されており；ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも部分はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９において提供されており；ＡＡＶ－９ゲノムはGao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)において提供されており；ＡＡＶ－１０ゲノムはMol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)において提供されており；ＡＡＶ－１１ゲノムはVirology, 330(2): 375-383 (2004)において提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は米国特許第９，４３４，９２８号（参照により全体が本明細書に組み込まれる）において提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号はまた、カプシドタンパク質および自己相補的なゲノムの配列を提供する。一態様では、ゲノムは自己相補的なゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド被包／パッケージングおよび宿主細胞染色体組込みを誘導するシス作用性配列はＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名されている）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）単一のＡＡＶイントロンの差次的なスプライシングと連結された２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、およびｒｅｐ ４０）の産生を結果としてもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製の原因となる複数の酵素特性を有する。

【0078】

ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生の原因となる。より特には、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の各々がそこから翻訳される単一のｍＲＮＡが転写された後に、それは２つの異なる方式でスプライシングされることができ、より長いイントロンまたはより短いイントロンのいずれかが切除されて、ｍＲＮＡの２つのプール：２．３ｋｂおよび２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡプールの形成を結果としてもたらすことができる。より長いイントロンは多くの場合に好ましく、そのため２．３ｋｂの長さのｍＲＮＡは主要なスプライスバリアントと呼ばれ得る。この形態は、ＶＰ１タンパク質の合成がそこから開始される第１のＡＵＧコドンを欠いており、ＶＰ１タンパク質合成の全体的なレベルの低減を結果としてもたらす。主要なスプライスバリアント中に残存する第１のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質のための開始コドンである。しかしながら、同じオープンリーディングフレーム中のそのコドンの上流に、最適なＫｏｚａｋ（翻訳開始）の文脈により取り囲まれたＡＣＧ配列（スレオニンをコードする）が存在する。Becerra SP et al., (December 1985). "Direct mapping of adeno-associated virus capsid proteins B and C: a possible ACG initiation codon". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (23): 7919-23、Cassinotti P et al., (November 1988). "Organization of the adeno-associated virus (AAV) capsid gene: mapping of a minor spliced mRNA coding for virus capsid protein 1". Virology. 167 (1): 176-84、Muralidhar S et al., (January 1994). "Site-directed mutagenesis of adeno-associated virus type 2 structural protein initiation codons: effects on regulation of synthesis and biological activity". Journal of Virology. 68 (1): 170-6、およびTrempe JP, Carter BJ (September 1988). "Alternate mRNA splicing is required for synthesis of adeno-associated virus VP1 capsid protein". Journal of Virology. 62 (9): 3356-63（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、これは、ＶＰ１と同様に、実際に追加のＮ末端残基を有するＶＰ３タンパク質であるＶＰ２タンパク質の低いレベルの合成に寄与する。単一のコンセンサスポリアデニル化シグナルはＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)において総説されている。

【0079】

各々のＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分およびＶＰ３部分を含有する。ＶＰ１部分は、配列番号１６４のアミノ酸１～１３７部分に対応する、ＶＰ１タンパク質に独特のＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、配列番号１６４のアミノ酸１３８～２０２部分に対応する、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分にも見出されるＶＰ１タンパク質内に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分およびＶＰ３タンパク質は同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、配列番号１６４のアミノ酸２０３～７３７部分に対応する、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質と共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。図５を参照。

【0080】

ＶＰ３タンパク質は、別々の可変表面領域Ｉ～ＩＸ（ＶＲ－Ｉ～ＩＸ）にさらに分割され得る。DiMatta et al., "Structural Insight into the Unique Properties of Adeno-Associated Virus Serotype 9" J. Virol., Vol. 86 (12): 6947-6958, June 2012（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、可変表面領域（ＶＲ）の各々は、単独でまたは他のＶＲの各々の特異的なアミノ酸配列と組み合わせて、特定の血清型に対して独特の感染表現型（例えば、他のＡＡＶ血清型と比べた抗原性の減少、形質導入および／または組織特異的トロピズムの向上）を付与することができる特異的なアミノ酸配列を含むかまたは含有することができる。

【0081】

ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、細胞に外来ＤＮＡを送達するためのウイルスベクターとしてそれを魅力的なものとする独特の特徴を有する。培養における細胞のＡＡＶ感染は非細胞傷害性であり、ヒトおよび他の動物の天然の感染はサイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染して、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能とする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂するおよび分裂しない細胞に形質導入し、転写的に活性の核内エピソーム（染色体外エレメント）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたり持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中にクローニングされたＤＮＡとして挿入され、これは組換えゲノムの構築を実行可能なものとする。さらには、ＡＡＶ複製およびゲノムカプシド被包を誘導するシグナルはＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるので、ゲノム（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の内部約４．３ｋｂの一部またはすべては、ＡＡＶベクターゲノムを生成するために外来ＤＮＡで置き換えられてもよい。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質はトランスで提供されてもよい。ＡＡＶの別の意義深い特徴は、それは極めて安定かつ丈夫なウイルスであるということである。それは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性をより小さいものとする。ＡＡＶは凍結乾燥されることさえある。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重感染に対して抵抗性ではない。

【0082】

複数の研究は、筋肉における長期間（＞１．５年）の組換えＡＡＶ媒介性タンパク質発現を実証している。Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996);およびXiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996)を参照。Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000)およびChao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001)も参照。さらに、筋肉は高度に血管形成しているので、Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997)およびMurphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997)に記載されるように、組換えＡＡＶ形質導入は、筋肉内注射後の全身循環における導入遺伝子産物の出現を結果としてもたらした。さらに、Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)は、骨格筋線維が、正確な抗体グリコシル化、フォールディング、および分泌のための必要な細胞因子を有することを実証しており、筋肉は分泌されるタンパク質治療剤の安定発現が可能であることを指し示している。本発明の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、治療用タンパク質（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２、ＲＳ１、ＰＤＥ６Ｂ、ＡＢＣＡ４、ＢＥＳＴ１、ＯＰＡ１またはＯＰＡ３）をコードする核酸分子および該核酸分子に隣接する１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ ｒｈ７４を含むが、それに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよい。シュードタイプｒＡＡＶの製造は、例えば、国際公開第２００１０８３６９２号において開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えばカプシド変異を有するｒＡＡＶもまた想定される。例えば、Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)を参照。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。

【0083】

ＡＡＶベクター粒子、カプシドタンパク質、およびＡＡＶベクター
望ましい組織特異性を有し、かつ、疾患の処置において有用な核酸およびタンパク質を含む、様々な治療的ペイロードの送達において用途を有するＡＡＶベクター粒子、ＡＡＶベクター、およびカプシドタンパク質が本明細書において提供される。

【0084】

ＡＡＶカプシドタンパク質
本開示は、高い遺伝子移入効率および増加した組織トロピズムの特性を有するＡＡＶ粒子を提供する。ＡＡＶウイルスベクターの送達は現在、ウイルスの天然のトロピズムに基づくかまたは標的組織への直接注射による組織標的化のための血清型選択の使用に依拠する。多くの現在利用可能なＡＡＶウイルスベクターは、しかしながら、特異的な標的部位に遺伝子を送達するために最適ではない。

【0085】

本開示は、それらを含むＡＡＶ粒子において高い遺伝子移入効率および増加した組織特異性を付与するＡＡＶカプシドタンパク質配列を提供する。実施形態では、そのようなＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子は、特異的な標的部位への最適な送達を達成するために特異的な送達経路を介して投与される。

【0086】

実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質は、表１に列記されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または表１に列記されるアミノ酸配列のいずれか１つと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が変異、欠失もしくは付加された配列を含む。実施形態では、最大１５個のアミノ酸、最大２０個のアミノ酸、最大３０個のアミノ酸、または最大４０個のアミノ酸が、これらの配列と比較して変異、欠失または付加されていてもよい。実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質は、表１に列記される核酸配列のいずれか１つ、または表１に列記される核酸配列のいずれか１つに対して最大５個、最大１０個、最大３０個、もしくは最大６０個のヌクレオチド変化を有する配列によりコードされる。

【表1】

【0087】

実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ１タンパク質は、配列番号１～３、３０～３４、４９、８４もしくは１６４のアミノ酸配列、または配列番号１～３、３０～３４、４９、８４もしくは１６４と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なる配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。これらのＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。実施形態では、ＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５、１８～２３、４７、８２、９８もしくは１６７の配列または配列番号１５、１８～２３、４７、８２、９８もしくは１６７に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0088】

実施形態では、ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶ－１１０カプシドタンパク質（配列番号１）、ＡＡＶ２０４カプシドタンパク質（配列番号２）、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質（配列番号３）またはＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５カプシドタンパク質（配列番号４９）である。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶ２１４カプシドタンパク質のバリアントである。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ－２１４－ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）、またはＡＡＶ２１４－Ｄ５（配列番号１６４）である。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶ２１４－Ｄ５（配列番号１６４）である。

【0089】

実施形態では、ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶ２０４カプシドタンパク質（配列番号２）、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質（配列番号３）、ＡＡＶ２１４－Ｄ５カプシドタンパク質（配列番号１６４）またはＡＡＶ８カプシドタンパク質（配列番号６７）である。

【0090】

例示的なＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の配列は表２および表３において提供される。ＶＰ２およびＶＰ３配列を考慮して、ＶＰ１部分は、完全なＶＰ１タンパク質配列とのアライメントにより決定されてもよい。

【表2】

【0091】

実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ２タンパク質は、配列番号３５～４０、５０、８５および１６５のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３５～４０、５０、８５もしくは１６５と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なる配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ２タンパク質は、配列番号１６５のアミノ酸配列、または配列番号１６５と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なる配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0092】

これらのＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。実施形態では、ＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列、または配列番号４７に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６８の配列、または配列番号１６８に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0093】

他のカプシドＶＰ２部分のための例示的な核酸は、ＶＰ１カプシドタンパク質核酸の対応する部分から導出されてもよい。

【表3】

【0094】

ＡＡＶ２１４、ＡＡＶ２１４ｅ、ＡＡＶ２１４ｅ８、ＡＡＶ２１４ｅ９、ＡＡＶ２１４ｅ１０のＶＰ３タンパク質は、同じアミノ酸（配列番号４１）および核酸（配列番号２４）配列を有する。

【0095】

実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ３タンパク質は、配列番号１７、４１～４６、５１、８６、もしくは１６６のアミノ酸配列、または配列番号１７、４１～４６、５１、８６、もしくは１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なる配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ３タンパク質は、配列番号１６６のアミノ酸配列、または配列番号１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なる配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0096】

これらのＶＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。実施形態では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６、２４～２９、４８、８３もしくは１６９の配列、または配列番号１６、２４～２９、４８、８３、もしくは１６９に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６９の配列、または配列番号１６９に対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0097】

実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はキメラタンパク質である。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３部分は、本明細書に開示される異なるＡＡＶカプシドタンパク質からのＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３部分で置き換えられてもよい。

【0098】

実施形態では、アミノ酸１２９におけるロイシン残基、アミノ酸５８６におけるアスパラギン残基およびアミノ酸７２３におけるグルタミン酸残基を含むＡＡＶカプシドタンパク質であって、ＡＡＶカプシドタンパク質中のアミノ酸位置が配列番号２のアミノ酸配列中のアミノ酸位置に関して番号付けされたものである、ＡＡＶカプシドタンパク質が本明細書において提供される。一部の場合には、タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の場合には、これらのアミノ酸は他のカプシドタンパク質に導入されてもよい。

【0099】

実施形態では、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分およびＶＰ３部分を含むＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質であって、ＶＰ１部分がアミノ酸１２９におけるロイシン（Ｌ）残基を含み、ＶＰ２部分がアミノ酸１５７におけるスレオニン（Ｔ）またはアスパラギン（Ｎ）残基およびアミノ酸１６２におけるリシン（Ｋ）またはセリン（Ｓ）残基を含み、かつＶＰ３部分が、アミノ酸２２３におけるアスパラギン（Ｎ）残基、アミノ酸２２４におけるアラニン（Ａ）残基、アミノ酸２７２におけるヒスチジン（Ｈ）残基、アミノ酸４１０におけるスレオニン（Ｔ）残基、アミノ酸７２４におけるヒスチジン（Ｈ）残基およびアミノ酸７３４におけるプロリン（Ｐ）残基を含み、ＡＡＶカプシドタンパク質中のアミノ酸位置が配列番号３のアミノ酸配列中のアミノ酸位置に関して番号付け（すなわち、ＶＰ１カプシドサブユニット番号付け）されたものである、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質が本明細書において提供される。

【0100】

実施形態では、ＶＰ１部分はアミノ酸２４におけるアスパラギン酸（Ｄ）またはアラニン（Ａ）残基をさらに含み、ＡＡＶカプシドタンパク質中のアミノ酸位置は配列番号３のアミノ酸配列中のアミノ酸位置に関して番号付けされたものである。実施形態では、ＶＰ２部分は、（ｉ）アミノ酸１４８におけるプロリン（Ｐ）残基；（ｉｉ）アミノ酸１５２に挿入されたアルギニン（Ｒ）残基；（ｉｉｉ）アミノ酸１６８におけるアルギニン（Ｒ）残基；（ｉｖ）アミノ酸１８９におけるイソロイシン（Ｉ）残基；および（ｖ）アミノ酸２００におけるセリン（Ｓ）残基のうちの１つまたは複数をさらに含み、ＡＡＶカプシドタンパク質中のアミノ酸位置は配列番号３のアミノ酸配列中のアミノ酸位置に関して番号付けされたものである。

【0101】

実施形態では、開示されるＶＰ３部分カプシドタンパク質中の１つまたは複数の可変領域Ｉ～ＩＸ（図５を参照）は、除去され、かつ代替的な領域で置き換えられてもよい。好適な代替物は、以下の表６において同定される。これらの位置の他に、追加の代替物の同一性は、図５に示されるように配列番号４１に対するアライメントにより同定されてもよい。実施形態では、１つまたは複数のＶＲは、１、２または３つのアミノ酸の挿入を有してもよい。実施形態では、１つまたは複数のＶＲは、１、２または３つのアミノ酸の欠失を有してもよい。

【表6】

【0102】

本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質のいずれか１つをコードする核酸を提供する。本開示はまた、本明細書に開示される核酸のいずれか１つを含むベクターを提供する。

【0103】

実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９血清型である。代替的な血清型または改変されたカプシドウイルスを使用して神経トロピズムを最適化することができる。代替的なベクターは、標準的なＡＡＶ９よりも高い神経トロピズムのための改変されたＡＡＶ９血清型ベクター、例えば、神経に標的化されたベクターを同定するためにＣｒｅ－ｌｏｘ組換えシステムを使用するＰＨＰ．Ｂを含む。代替的に、ＡＡＶ９ ＰＨＰ．Ｂは、肝臓トロピズムを低減させるためのアスパラギンからリシンへのＶＰ１のアミノ酸４９８の改変を有する。変異したいくつかのアミノ酸を有するＡＡＶｒｈ７４のさらなるバリアントは、脳を含む非常に広い組織トロピズムのために使用され得る。

【0104】

ＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、対象における核酸の発現の制御に関与するエレメントの他に、カプシド被包を促すためのＩＴＲを含むＡＡＶベクター粒子中にカプシド被包される核酸を供給する。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、少なくとも１つの異種核酸（ＨＮＡ）配列を含み、ＨＮＡ配列は、対象の細胞中で発現された場合に、疾患または障害を処置するために有効である。実施形態では、ＨＮＡ配列は導入遺伝子を含む。実施形態では、ＡＡＶベクターは少なくとも１つのＩＴＲ配列および少なくとも１つの導入遺伝子を含む。実施形態では、導入遺伝子は治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする。

【0105】

実施形態では、宿主細胞における導入遺伝子発現の制御は、プロモーター配列、およびポリアデニル化シグナルを含む、ＡＡＶベクター内に含有される調節エレメントにより調節されてもよい。実施形態では、ＡＡＶベクターはまたシグナルペプチドをコードしてもよい。実施形態では、ＡＡＶベクターは５’および３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を有する。５’ ＩＴＲはプロモーターの上流に位置し、プロモーターは次いで導入遺伝子の上流にある。実施形態では、５’および３’ ＩＴＲは同じ配列を有する。実施形態では、それらは異なる配列を有する。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’への方向に、第１（５’）のＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル、および第２（３’）のＩＴＲを含んでもよい。

【0106】

実施形態では、ＨＮＡ（例えば、導入遺伝子を含むＨＮＡ）は構成的プロモーターに作動可能に連結している。構成的プロモーターは、当技術分野において公知のおよび／または本明細書において提供される任意の構成的プロモーターであり得る。実施形態では、構成的プロモーターは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じてＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、ｍＭｅＰ４１８プロモーター、ｍＭｅＰ４２６プロモーター、最小ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＥＦ１プロモーターを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。そのようなプロモーターのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ転写の効率を増加または減少させるために改変されてもよいことが当技術分野において公知である。例えば、Gao et al. (2018) Mol. Ther.: Nucleic Acids 12:135-145を参照（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写を消失させ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激するための７ＳＫ、Ｕ６およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスの改変）。実施形態では、ＨＮＡ配列は、組織特異的制御プロモーター、または誘導性プロモーターに作動可能に連結している。実施形態では、組織特異的制御プロモーターは、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、皮膚特異的プロモーター、筋肉特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、目特異的プロモーター（例えば、ＶＭＤ２、またはｍＲｈｏプロモーター）である。

【0107】

実施形態では、プロモーターは、配列番号９６（マウスＵ１プロモーター）または配列番号９７（Ｈ１プロモーター）の配列を有するポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるかまたはそれからなるものであってもよい。実施形態では、プロモーターは、Ｕ１ａもしくはＵ１ｂプロモーター、ＥＦ１プロモーター、またはＣＢＡ（ニワトリベータ－アクチン）である。実施形態では、プロモーターは、表５に列記される核酸配列のいずれか１つ、または表５に列記される核酸配列のいずれか１つに対して最大５、最大１０、最大２０、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、それから本質的になるかまたはそれからなるものであってもよい。実施形態では、プロモーターは、表５に列記される核酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるものであってもよい。

【表5】

【0108】

実施形態では、ＨＮＡ配列は追加の調節エレメントに作動可能に連結している。追加の調節エレメントはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（「ＷＰＲＥ」）であり得る。実施形態では、ＡＡＶベクターは、ベクター製造の目的のための細菌宿主中でのベクターの増殖および培養のために好適な調節成分を含んでもよい。例えば、ベクターは、抗生物質耐性、および細菌中でのプラスミドの維持のための遺伝子の他に、細菌中でのタンパク質発現を制御するための付随する調節エレメントを含んでもよい。

【0109】

実施形態では、ＨＮＡ配列はポリアデニル化シグナルに作動可能に連結している。実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ＭｅＣＰ２ポリアデニル化シグナル、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＰＡ４９ポリアデニル化シグナル、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリアデニル化シグナル、ｓＮＲＰポリアデニル化シグナル、またはＴＫ６５ポリアデニル化シグナルを含むか、それから本質的になるかまたはそれからなる。例示的なＳＰＡ４９ポリアデニル化シグナルは、Ostedgaard et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (Feb. 22, 2005) 102:2952-2957（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0110】

異種核酸（ＨＮＡ）
本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、標的組織に感染し、かつ１つまたは複数の異種核酸（ＨＮＡ）を標的組織に送達する。実施形態では、ＨＮＡ配列は、標的組織の細胞中で転写され、かつ必要に応じて翻訳される。

【0111】

一部の場合には、ＨＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする。改変のために生細胞のゲノムを標的化するためにＣＲＩＳＰＲ技術が使用されている。Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムを通じた遺伝子修復を媒介するために標的組織および細胞に効率的に送達されなければならない大きい酵素であり、現在のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子修正プロトコールはいくつかの欠点を抱えている。Ｃａｓ９の長期発現は宿主免疫応答を誘発し得る。追加のガイドＲＮＡが、パッケージングの制約に起因して別々のベクターを介して送達されてもよい。実施形態では、ＨＮＡはＣａｓ９タンパク質またはその同等物をコードする。

【0112】

実施形態では、ＨＮＡは、タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、該タンパク質は、ネイティブなタンパク質の活性の低減または排除に起因する疾患または障害を処置するために対象の細胞において発現されてもよい。そのため、実施形態では、導入遺伝子は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）、テロメア生存運動ニューロン１（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ １， ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）（ＳＭＮ１）、バイオミネラリゼーション関連アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（ＡＬＰＬ；ＴＮＡＬＰとしても公知）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ１）、イズロニダーゼアルファ－Ｌ－（ＩＤＵＡ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、神経セロイドリポフスチノーシス１（ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ， ｎｅｕｒｏｎａｌ， １）（ＣＬＮ１）、ロドプシン（Ｒｈｏ）、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶメンバー２（ＣＹＰ４Ｖ２）、レチノスキシン１（ＲＳ１）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ１）、ＯＰＡ１ミトコンドリアダイナミン様ＧＴＰａｓｅ（ＯＰＡ１）、および視神経萎縮症３（Ｏｐｔｉｃ Ａｔｒｏｐｈｙ ３）（ＯＰＡ３）から選択されるタンパク質をコードしてもよい。

【0113】

実施形態では、導入遺伝子はシトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶメンバー２（ＣＹＰ４Ｖ２）をコードする。実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２導入遺伝子は、ＣＹＰ４Ｖ２の変異体配列、コドン最適化配列、および／または切断型配列を含む。実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２導入遺伝子は、配列番号１１６の配列、または配列番号１１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を有する核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２導入遺伝子は、配列番号１４２のアミノ酸配列、または配列番号１４２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターゲノムは、ＣＹＰ４Ｖ２をコードし、かつビエッティ結晶性ジストロフィーを処置するためのものである。

【0114】

実施形態では、導入遺伝子はレチノスキシン１（ＲＳ１）をコードする。実施形態では、ＲＳ１導入遺伝子は、ＲＳ１の変異体配列、コドン最適化配列、および／または切断型配列を含む。実施形態では、ＲＳ１導入遺伝子は、配列番号１１７の配列、または配列番号１１７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を有する核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＲＳ１導入遺伝子は、配列番号１４３のアミノ酸配列、または配列番号１４３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターゲノムは、ＲＳ１をコードし、かつ網膜分離症を処置するためのものである。

【0115】

実施形態では、導入遺伝子はホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）をコードする。実施形態では、ＰＤＥ６Ｂ導入遺伝子は、ＰＤＥ６Ｂの変異体配列、コドン最適化配列、および／または切断型配列を含む。実施形態では、ＰＤＥ６Ｂ導入遺伝子は、配列番号１１８の配列、または配列番号１１８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を有する核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＰＤＥ６Ｂ導入遺伝子は、配列番号１４４のアミノ酸配列、または配列番号１４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターゲノムは、ＰＤＥ６Ｂをコードし、かつ網膜色素変性症を処置するためのものである。

【0116】

実施形態では、導入遺伝子はＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）をコードする。実施形態では、ＡＢＣＡ４導入遺伝子は、ＡＢＣＡ４の変異体配列、コドン最適化配列、および／または切断型配列を含む。実施形態では、ＡＢＣＡ４導入遺伝子は、配列番号１７２の配列、または配列番号１７２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を有する核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＡＢＣＡ４導入遺伝子は、配列番号１７７のアミノ酸配列、または配列番号１７７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターゲノムは、ＡＢＣＡ４をコードし、かつシュタルガルト病を処置するためのものである。

【0117】

実施形態では、導入遺伝子はベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）をコードする。実施形態では、ＢＥＳＴ－１導入遺伝子は、ＢＥＳＴ－１の変異体配列、コドン最適化配列、および／または切断型配列を含む。実施形態では、ＢＥＳＴ－１導入遺伝子は、配列番号１７３もしくは１７４の配列、または配列番号１７３もしくは１７４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を有する核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＢＥＳＴ－１導入遺伝子は、配列番号１７８もしくは１７９のアミノ酸配列、または配列番号１７８もしくは１７９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターゲノムは、ＢＥＳＴ－１をコードし、かつＢＥＳＴ卵黄様黄斑ジストロフィーを処置するためのものである。

【0118】

実施形態では、導入遺伝子はＯＰＡ１ミトコンドリアダイナミン様ＧＴＰａｓｅ（ＯＰＡ１）をコードする。実施形態では、ＯＰＡ１導入遺伝子は、ＯＰＡ１の変異体配列、コドン最適化配列、および／または切断型配列を含む。実施形態では、ＯＰＡ１導入遺伝子は、配列番号１７５の配列、または配列番号１７５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を有する核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＯＰＡ１導入遺伝子は、配列番号１８０のアミノ酸配列、または配列番号１８０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターゲノムは、ＯＰＡ１をコードし、かつ優性視神経萎縮症を処置するためのものである。

【0119】

実施形態では、導入遺伝子は視神経萎縮症３（ＯＰＡ３）をコードする。実施形態では、ＯＰＡ３導入遺伝子は、ＯＰＡ３の変異体配列、コドン最適化配列、および／または切断型配列を含む。実施形態では、ＯＰＡ３導入遺伝子は、配列番号１７６の配列、または配列番号１７６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を有する核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。実施形態では、ＯＰＡ３導入遺伝子は、配列番号１８１のアミノ酸配列、または配列番号１８１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターゲノムは、ＯＰＡ３をコードし、かつ優性視神経萎縮症を処置するためのものである。

【0120】

実施形態では、導入遺伝子は、表４に列記される核酸配列のいずれか１つ、または表４中のＤＮＡ配列（配列番号１１６～１１８および１７２～１７６）のいずれか１つに対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む。実施形態では、導入遺伝子は、表４に列記されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または表４に列記されるアミノ酸配列（配列番号１４２～１４４および１７７～１８１）のいずれか１つと最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なる配列をコードする。

【表4】

【0121】

実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９９～１３３および１７２～１７６のいずれか１つに記載される核酸配列、または配列番号９９～１３３および１７２～１７６のいずれか１つに対して最大５個、最大１０個、もしくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含む。実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１３４～１５１および１７７～１８１のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列、または配列番号１３４～１５１および１７７～１８１のアミノ酸配列のいずれか１つと最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なる配列をコードする。

【0122】

実施形態では、異種核酸は、レポータータンパク質；例えば、蛍光タンパク質をコードする。

【0123】

ＡＡＶウイルスベクターを製造する方法
様々なアプローチがＡＡＶウイルスベクターを製造するために使用され得る。実施形態では、パッケージングは、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞系を使用することにより達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、ウイルスベクターの製造を促すエレメントおよび配列を含有する。別の態様では、ヘルパープラスミドは、パッケージング細胞系のゲノムに安定的に組み込まれ、その結果、パッケージング細胞系は、ヘルパープラスミドでの追加のトランスフェクションを要求しない。

【0124】

実施形態では、細胞はパッケージングまたはヘルパー細胞系である。実施形態では、ヘルパー細胞系は、真核細胞；例えば、ＨＥＫ ２９３細胞または２９３Ｔ細胞である。実施形態では、ヘルパー細胞は酵母細胞または昆虫細胞である。

【0125】

実施形態では、細胞は、テトラサイクリン活性化因子タンパク質をコードする核酸；およびテトラサイクリン活性化因子タンパク質の発現を調節するプロモーターを含む。実施形態では、テトラサイクリン活性化因子タンパク質の発現を調節するプロモーターは構成的プロモーターである。実施形態では、プロモーターはホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはＣＭＶプロモーターである。

【0126】

ヘルパープラスミドは、例えば、複製能のないＡＡＶをパッケージングするために要求されるすべてのビリオンタンパク質をトランスでコードする、および、複製能のあるＡＡＶの製造なしに、高い力価で複製能のないＡＡＶをパッケージングする能力を有するビリオンタンパク質を製造するための、複製能のないウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含んでもよい。

【0127】

ＡＡＶをパッケージングするためのヘルパープラスミドは当技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２３５１７４ Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。該文献において記載されるように、ＡＡＶヘルパープラスミドは、非限定的な例として、それらのそれぞれの元々のプロモーターによりまたは異種プロモーターにより制御されるＡｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡをヘルパーウイルスＤＮＡ配列として含有してもよい。ＡＡＶヘルパープラスミドは、所望される標的細胞のトランスフェクションの単純な検出を可能にするためのマーカータンパク質、例えば蛍光タンパク質の発現用の発現カセットを追加的に含有してもよい。

【0128】

本開示は、ＡＡＶ粒子を製造する方法であって、パッケージング細胞系に、本明細書に開示されるＡＡＶヘルパープラスミドのいずれか１つ；および本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれか１つをトランスフェクトすることを含む、方法を提供する。実施形態では、ＡＡＶヘルパープラスミドおよびＡＡＶベクターは、パッケージング細胞系に共トランスフェクトされる。実施形態では、細胞系は、哺乳動物細胞系、例えば、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞系である。本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶベクターおよび／またはＡＡＶ粒子のいずれか１つを含む細胞を提供する。

【0129】

医薬組成物
本開示は、本明細書に記載されるＡＡＶベクター、ＡＡＶカプシドおよび／またはＡＡＶ粒子のいずれか１つを含む医薬組成物を提供する。典型的には、ＡＡＶ粒子は治療のために投与される。

【0130】

本明細書に記載されている医薬組成物は、薬理学の分野において公知のまたは開発された任意の方法により製剤化されてもよく、該方法は、活性成分（例えば、ウイルス粒子またはＡＡＶベクター）を賦形剤または他の副成分と接触させること、生成物を用量単位に分割または包装することを含むがそれに限定されない。望ましい特徴、例えば、増加した安定性、増加した細胞トランスフェクション、持続または遅延された放出、体内分布またはトロピズム、ｉｎ ｖｉｖｏでのコードされるタンパク質のモジュレートまたは増強された翻訳、およびｉｎ ｖｉｖｏでのコードされるタンパク質の放出プロファイルを有する本開示のウイルス粒子が、製剤化されてもよい。

【0131】

そのため、医薬組成物は、食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＡＡＶベクターでトランスフェクトされたかＡＡＶウイルス粒子で形質導入された細胞（例えば、対象への移植用）、ナノ粒子模倣物またはその組合せをさらに含んでもよい。実施形態では、医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。実施形態では、ナノ粒子は、自己集合した核酸ナノ粒子である。

【0132】

本開示による医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として調製、包装、および／または販売されてもよい。活性成分の量は、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量および／またはそのような投薬量の好都合な比率、例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１などに概して等しい。本発明の製剤は、１つまたは複数の賦形剤を含むことができ、その各々は、一緒になって、ウイルスベクターの安定性を増加させ、ウイルスベクターによる細胞トランスフェクションもしくは形質導入を増加させ、ウイルスベクターによりコードされるタンパク質の発現を増加させ、かつ／またはウイルスベクターによりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変更する量であり得る。実施形態では、医薬組成物は賦形剤を含む。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、分散媒体、希釈剤、もしくは他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、防腐剤、またはその組合せを含む。

【0133】

実施形態では、医薬組成物は凍結保護剤を含む。用語「凍結保護剤」は、凍結の間の物質への損傷を低減または排除する能力を有する作用物質を指す。凍結保護剤の非限定的な例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノースおよび／またはマンニトールを含む。

【0134】

治療方法
本開示は、障害を予防または処置する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物のいずれか１つを投与することを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、方法を提供する。

【0135】

実施形態では、障害は、ＣＮＳ障害、皮膚障害、肺障害、筋肉障害、肝臓障害、または眼疾患（もしくは網膜疾患）である。実施形態では、障害は嚢胞性線維症である。実施形態では、障害は眼疾患である。実施形態では、障害は網膜疾患である。

【0136】

実施形態では、障害は、低ホスファターゼ血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、リソソーム貯蔵障害（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、およびベッカー型筋ジストロフィーを含む）、若年性バッテン病、乳児バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、ビエッティ結晶性ジストロフィー、網膜分離症（例えば、変性性、遺伝性、牽引性、滲出性）、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ファブリー病、ポンペ病、神経セロイドリポフスチノーシス１（ＣＬＮ１）、ＣＬＮ３病（もしくは若年性神経セロイドリポフスチノーシス）、ゴーシェ病、がん、関節炎、筋消耗、心臓疾患、内膜過形成、レット症候群、癲癇、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群（ＭＰＳ ＩＨ）、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー－シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡもしくはＭＰＳ ＩＩＩＡ）、サンフィリポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢもしくはＭＰＳ ＩＩＩＢ）、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー－ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、脊髄脳性運動失調症、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、貧血、関節炎、またはアデノシンデアミナーゼ欠損症である。

【0137】

本明細書に開示される特異的な導入遺伝子に加えて、公知の活性酵素配列が、機能的な酵素活性を伝達するための導入遺伝子として使用されてもよい。

【0138】

実施形態では、障害はＣＬＮ３病である。ＣＬＮ３病または若年性神経セロイドリポフスチノーシスは、ＣＬＮ３遺伝子における常染色体劣性遺伝的変異により引き起こされるリソソーム貯蔵疾患である。ＣＬＮ３病は、中枢神経系（ＣＮＳ）が大いに影響されて、行動上の問題、視力低下、および他の認知障害を結果としてもたらす、進行性の神経変性障害である。

【0139】

実施形態では、障害はファブリー病である。ファブリー病は、リソソームにおける糖脂質生成物、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）およびｌｙｓｏ－Ｇｂ３の蓄積を結果としてもたらすアルファ－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）活性における欠損により引き起こされるＸ連鎖性リソソーム貯蔵障害である。疾患の提示は高度に不均質であるが、末梢神経栄養性疼痛の頻繁な発作、被角血管腫、汗産生の低減、角膜ジストロフィー、および消化管合併症を通常は含む。疾患が進行するにつれて、患者は、心筋症、腎不全および脳血管疾患を患い、これらのすべては、ファブリー患者における寿命の低減の主要な原因である。男性は、ＧＬＡ遺伝子中に変異を有する患者の最も重度に影響される集団であるが、女性患者もまた頻繁に症候性であるが多くの場合に誤診されることがますます明確になってきた。酵素置換治療（ＥＲＴ）は現在、ファブリーを処置するための唯一のＦＤＡ承認済みの治療であり、比較的大量の組換えタンパク質の２週毎の注射を要求する。ＥＲＴは、心臓、腎臓および血管系におけるＧｂ３の蓄積を低減させるが、ＣＮＳに効率的に入ることができないことに主に起因して、ファブリーのすべての症状を完全に処置するわけではない。遺伝子治療戦略が研究されており、多くは糖脂質蓄積の矯正において大きな有望性を示しているが、ほとんどは、ＣＮＳに効率的に入ることに失敗しており、そしてまたＧＬＡ置換の間に多くの場合に見られる免疫応答を抱えている。

【0140】

実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、ＥＲＴに対して非応答性であるか、またはＥＲＴがすべての症状に対処しない場合の患者においてファブリー病を処置するために使用される。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、ＥＲＴを既に投与されている患者においてファブリー病を処置するために使用される。

【0141】

実施形態では、障害はポンペ病である。ポンペ病は、リソソームにおけるグリコーゲンの蓄積を結果としてもたらす酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性における欠損により引き起こされるリソソーム貯蔵障害である。疾患は、早期死亡を伴う、平滑筋系および横紋筋系の両方の他に中枢神経系（ＣＮＳ）に主に影響する筋ジストロフィーの形態として現れる。酵素置換治療（ＥＲＴ）は現在、ポンペを処置するための唯一のＦＤＡ承認済みの治療であり、比較的大量の組換えタンパク質の２週毎の注射を要求する。ＥＲＴは、治療なしで２歳までに典型的には死亡する乳児ポンペ患者の死亡率を有意に低減させるが、ＣＮＳに効率的に入ることができないことおよび結果的なＧＡＡタンパク質に対する免疫応答に主に起因して、ポンペのすべての症状を完全に好転させるわけではない。遺伝子治療戦略が研究されており、多くはグリコーゲン蓄積およびポンペの他の症状の矯正において大きな有望性を示している。ほとんどは、ＧＡＡ置換の間に見られる重度の免疫応答を抱えている。肝臓特異的な発現は、動物をＧＡＡタンパク質に対して忍容性とすることができ、かつ液性応答を有意に低減できることを、先行する研究は実証している。

【0142】

実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、ＥＲＴを既に投与されている患者；例えばＥＲＴに対して非応答性であるか、またはＥＲＴがすべてのそれらの症状に対処しなかった場合の患者において、ポンペ病を処置するために使用される。

【0143】

実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、がんを処置するために使用される。実施形態では、がんは、固形がん；例えば、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、口唇、口腔、肝臓、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺、非黒色腫皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、肉腫、小細胞肺腫瘍、または甲状腺のものである。

【0144】

実施形態では、障害は眼疾患である。目は免疫特権的な組織である。ごく少数のウイルスが治療利益のために必要である。実施形態では、眼疾患は光受容細胞およびＲＰＥ細胞に影響する。実施形態では、眼疾患は、網膜色素変性症（例えば、常染色体劣性（ＳＰＡＴＡ７遺伝子；ＬＲＡＴ遺伝子；ＴＵＬＰ１遺伝子）、常染色体優性（ＡＩＰＬ１遺伝子）、およびＸ連鎖性（ＲＰＧＲ遺伝子））、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１もしくはＢＥＳＴ１）遺伝子における変異に関する眼障害（例えば、卵黄様黄斑ジストロフィー、加齢性黄斑変性症、常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症、緑内障、白内障）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ；アリール－炭化水素相互作用タンパク質様１（ａｒｙｌ－ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｋｅ １；ＡＩＰＬ１）遺伝子）、錐体桿体ジストロフィー（ＣＲＤ；ＡＢＣＡ４遺伝子）、シュタルガルト（ＡＢＣＡ４遺伝子）、コロイデレミア（ＣＨＭ遺伝子）、アッシャー症候群（ＭＹＯ７Ａ遺伝子；ＣＤＨ２３遺伝子；ＵＳＨ２Ａ遺伝子；ＣＬＲＮ１遺伝子）、優性視神経萎縮症（例えば、常染色体（ＯＰＡ１遺伝子；ＯＰＡ３遺伝子））、網膜色素変性症（ＰＤＥ６Ｂ遺伝子）、網膜分離症（ＲＳ１遺伝子）、ビエッティ結晶性ジストロフィー（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子）または色覚異常（ＣＮＧＡ３遺伝子、ＣＮＧＢ３遺伝子、ＧＮＡＴ２遺伝子、ＰＤＥ６Ｃ遺伝子、もしくはＰＤＥ６Ｈ遺伝子）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0145】

実施形態では、本開示は、網膜細胞において導入遺伝子を発現させる方法を提供する。実施形態では、方法は、本開示の核酸を網膜細胞に送達することを含む。実施形態では、方法は、本開示のＡＡＶウイルスベクターで網膜細胞を形質導入することを含む。

【0146】

実施形態では、本開示の標的細胞は網膜細胞を含む。実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞、双極細胞、網膜神経節細胞、水平細胞、またはアマクリン細胞を含む。実施形態では、網膜細胞は網膜神経節細胞を含む。実施形態では、網膜細胞は双極細胞を含む。実施形態では、網膜細胞は水平細胞を含む。実施形態では、網膜細胞はアマクリン細胞を含む。実施形態では、網膜細胞は光受容細胞を含む。実施形態では、光受容細胞は桿体細胞および／または錐体細胞を含む。

【0147】

実施形態では、本開示の標的細胞は、光受容細胞を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

【0148】

実施形態では、対象は、哺乳動物；例えば、ヒトである。特定の態様では、ヒトは、ヒト乳児；例えば、３歳未満、２歳未満、または１歳未満のヒト乳児である。

【0149】

本明細書に開示される処置および予防方法は、治療または予防のための患者を同定および選択するための適切な診断技術と組み合わせられてもよい。例えば、本明細書に開示される障害を処置または予防する方法は、対象において障害に関する遺伝的変異または欠失を同定するために遺伝子検査を行うステップをさらに含んでもよい。実施形態では、障害を処置または予防する方法は、障害に関する変異を有するとして、または（例えば、遺伝的要因に基づいて）障害を発症する高いリスクがあるとして以前に同定された対象に投与することを含む。

【0150】

本開示は、宿主細胞においてタンパク質のレベルを増加させる方法であって、宿主細胞を本明細書に開示されるＡＡＶ粒子のいずれか１つと接触させることを含み、ＡＡＶ粒子が、該タンパク質をコードするＨＮＡ配列を含む、本明細書に開示されるＡＡＶベクターゲノムのいずれか１つを含む、方法を提供する。実施形態では、タンパク質は治療用タンパク質である。実施形態では、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏのものである。実施形態では、宿主細胞は対象に由来する。実施形態では、対象は、正常な対象におけるタンパク質のレベルおよび／または機能性と比較してタンパク質のレベルおよび／または機能性の低減を結果としてもたらす障害を患っている。

【0151】

実施形態では、タンパク質のレベルは、宿主細胞において約１×１０^－７ｎｇ、約３×１０^－７ｎｇ、約５×１０^－７ｎｇ、約７×１０^－７ｎｇ、約９×１０^－７ｎｇ、約１×１０^－６ｎｇ、約２×１０^－６ｎｇ、約３×１０^－６ｎｇ、約４×１０^－６ｎｇ、約６×１０^－６ｎｇ、約７×１０^－６ｎｇ、約８×１０^－６ｎｇ、約９×１０^－６ｎｇ、約１０×１０^－６ｎｇ、約１２×１０^－６ｎｇ、約１４×１０^－６ｎｇ、約１６×１０^－６ｎｇ、約１８×１０^－６ｎｇ、約２０×１０^－６ｎｇ、約２５×１０^－６ｎｇ、約３０×１０^－６ｎｇ、約３５×１０^－６ｎｇ、約４０×１０^－６ｎｇ、約４５×１０^－６ｎｇ、約５０×１０^－６ｎｇ、約５５×１０^－６ｎｇ、約６０×１０^－６ｎｇ、約６５×１０^－６ｎｇ、約７０×１０^－６ｎｇ、約７５×１０^－６ｎｇ、約８０×１０^－６ｎｇ、約８５×１０^－６ｎｇ、約９０×１０^－６ｎｇ、約９５×１０^－６ｎｇ、約１０×１０^－５ｎｇ、約２０×１０^－５ｎｇ、約３０×１０^－５ｎｇ、約４０×１０^－５ｎｇ、約５０×１０^－５ｎｇ、約６０×１０^－５ｎｇ、約７０×１０^－５ｎｇ、約８０×１０^－５ｎｇ、または約９０×１０^－５ｎｇのレベルまで増加される。

【0152】

本開示は、対象において細胞に目的の遺伝子を導入する方法であって、細胞を有効量の本明細書に開示されるＡＡＶウイルス粒子のいずれか１つと接触させることを含み、ＡＡＶウイルス粒子が、目的の遺伝子を含む、本明細書に開示されるＡＡＶベクターゲノムのいずれか１つを含有する、方法を提供する。

【0153】

投薬量および投与
投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的および処置されている対象によって変動する。単回または複数回の投与は、用量レベルおよびパターンが処置医により選択されて実行され得る。投薬量は投与の経路により影響され得ることが留意される。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は当技術分野において公知である。そのような好適な投薬量の非限定的な例は、１投与当たり１０^９ベクターゲノムもの低さから１０^１７ベクターゲノムもの高さまでであってもよい。

【0154】

本明細書に記載される方法の実施形態では、対象に投与されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）の数は、約１０^９～約１０^１７の範囲内である。実施形態では、約１０^１０～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１３、約１０^１１～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１４、約５×ｌ０^１１～約５×１０^１２、または約１０^１２～約１０^１３個のウイルス粒子が対象に投与される。ヒトの目への投与のために、約１×１０^１０ｖｇ／目の総用量が使用されてもよく、５×１０^９ｖｇ／目の総用量がマウスの目のために使用されてもよい。非侵襲的なｉｎ ｖｉｖｏイメージング技術を使用して動物における有効性／安全性をモニターすることができ、該技術は、走査型レーザー検眼鏡検査（ＳＬＯ）、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）、マルチフォトン顕微鏡法、フルオレセイン血管造影法を含むがそれに限定されない。

【0155】

実施形態では、ＡＡＶ粒子は、対象において遺伝子欠損を修復する。実施形態では、成功裏に処置された細胞、組織、臓器または対象における修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、修復されていない標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する比は、少なくとも約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、または約１，０００，０００：１である。修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量または比は、ウエスタン分析、ノーザン分析、サザン解析、ＰＣＲ、シークエンシング、質量分析、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、次世代シークエンシング、イムノブロット、およびＥＬＩＳＡを含むがそれに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法により決定され得る。

【0156】

実施形態では、ウイルス粒子は、対象に静脈内に、髄腔内に、脳内に、脳室内に、鼻腔内に、気管内に、耳内に、眼内に、または眼周囲に、経口的に、直腸に、経粘膜的に、吸入により、経皮的に、非経口的に、皮下に、皮内に、筋肉内に、胸膜内に、外用で、リンパ内に、嚢内に導入され；そのような導入はまた、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、大脳内、脳室内、網膜下、傍網膜、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内、またはその任意の組合せであってもよい。実施形態では、ウイルス粒子は、所望される標的組織に、例えば、非限定的な例として、肺、目、またはＣＮＳに、送達される。実施形態では、ウイルス粒子の送達は全身性である。槽内の投与経路は、直接的に脳室の脳脊髄液中への薬物の投与を伴う。それは、大槽への直接注射によりまたは永久的に配置された管を介して行われ得る。

【0157】

眼内で眼疾患（または眼障害）を処置するために、涙腺（ＬＧ）投与、外用点眼、角膜への間質内投与、前房内投与（前眼房）、硝子体内投与、網膜下投与、傍網膜投与、全身投与、またはその組合せを含むがそれに限定されない、当業者に公知の複数の投与のモードがある。遺伝的眼障害の８０％は光受容細胞において起こる。小体積の遺伝子治療の硝子体内送達は外来診療所で行うことができる。

【0158】

実施形態では、投与のモードは傍網膜投与である。本明細書で使用される場合、用語「傍網膜投与」は、網膜の所望される領域に近接させて硝子体腔中に治療剤（例えば、ＡＡＶウイルスベクター）を注射する硝子体内投与の形態（すなわち、標的化された送達）を指す。実施形態では、網膜の所望される領域は、網膜の中心窩領域の近くである。中部硝子体腔中に生成物を沈着させるために設計された短い針を使用して行われ、直接的な視覚化を要求しない慣用的な硝子体内投与とは対照的に、傍網膜注射は、網膜の近くの後部硝子体腔中に生成物を送達する能力を有するより長い針の直接的な視覚化の下で行われる。実施形態では、治療剤は、網膜の表面から０ｍｍ～１３ｍｍの距離において、網膜の表面から０ｍｍ～１０ｍｍの距離において、網膜の表面から０ｍｍ～５ｍｍの距離において、または網膜の表面から０ｍｍ～３ｍｍの距離において硝子体腔中に沈着される。実施形態では、治療剤は、網膜の表面から０～１３ｍｍ、０～１２ｍｍ、０～１１ｍｍ、０～１０ｍｍ、０～９ｍｍ、０～８ｍｍ、０～７ｍｍ、０～６ｍｍ、０～５ｍｍ、０～４ｍｍ、０～３ｍｍ、０～２ｍｍ、または０～１ｍｍの距離において硝子体腔中に沈着される。

【0159】

実施形態では、傍網膜投与は、網膜下注射が適切でない状況において使用される。実施形態では、傍網膜投与は、視神経の標的化された形質導入のために使用される。実施形態では、傍網膜投与は、視神経の機能障害に関する疾患または障害を処置するために使用される。実施形態では、傍網膜投与は、優性視神経萎縮症または網膜分離症を処置するために使用される。

【0160】

実施形態では、傍網膜投与は、ヒトの目の後極に達するために十分な長さ（２５ｍｍまたは同様の長さ）を有する小ゲージ針（３０ゲージまたは同様のゲージ）、眼外照明（ｅｘｏ－ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）または眼内照明（ｅｎｄｏ－ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）および顕微鏡を使用する視覚化の使用、ならびに後部硝子体腔および網膜に焦点を合わせることを可能とする角膜コンタクトレンズの使用を伴う。これは典型的には十分な鎮痛および消毒後に実行し、その時点において角膜コンタクトレンズを目に着け、後部網膜を見るために顕微鏡を位置させる。針を、目の壁を通して毛様体扁平部領域に挿入し、その先端を視覚化する。直接的な視覚化の下で、針の先端を、網膜表面の近くの所望される位置に進める。シリンジプランジャーを進めて、ウイルスベクター（任意の好適な組成物または製剤中に含有され得る）を緩徐に沈着させる。針を引き抜き、目を検査する。ポートは、縫合糸を用いて閉じてもよいが、十分に小口径の針（例えば３０ゲージ）の場合、穿刺経路（ｎｅｅｄｌｅ ｔｒａｃｔ）を閉じるために縫合糸は必要とされない。軟膏およびアイシールドを適用してもよく、所望される場合、対象を、生成物の高い傍網膜濃度をさらに促すために術後の期間にわたり仰臥位に保ち得る。送達器具における変形形態は、ブラントカニューレの使用を可能とするための硝子体切除ポートの使用を伴うかもしくは伴わない強膜切開の創出、ならびに／または網膜表面への近接性および安全性を最適化するためのテーパー状かつ／もしくは柔軟な伸長可能な先端もしくは側部ポートを有するカニューレ設計、ならびに／または単純なシリンジプランジャーの代わりに空気圧式システムの使用を含むことができる。傍網膜投与の追加の記載は、例えば、国際公開第２０２０／０１８７６６号およびZeng et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Sep 11; 18: 422-427（これらの各々の内容は参照により全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる）において開示されている。

【0161】

実施形態では、投与のモードは網膜下投与であり、網膜下投与では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞と光受容細胞との間の網膜下空間に材料を注射する。網膜下空間中で、注射された材料は、光受容細胞の形質膜、およびＲＰＥ細胞および網膜下ブレブと直接的に接触される。実施形態では、網膜下投与のために使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ２１４またはＡＡＶ２１４－Ｄ５のカプシドタンパク質を含む。実施形態では、網膜下投与は、シュタルガルト病、ビエッティ結晶性ジストロフィー、またはＢＥＳＴ卵黄様黄斑ジストロフィーを処置するためである。網膜下投与の追加の記載は、例えば、Peng et. al., Ophthalmic Res 2017;58:217-226;およびHartman et al., J Ocul Pharmacol Ther. 2018 Mar 1; 34(1-2): 141-153（これらの各々の内容は参照により全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる）において開示されている。

【0162】

本開示のＡＡＶウイルス粒子または組成物の投与は、１用量で、処置の過程の全体を通じて連続的にまたは間欠的にもたらされ得る。実施形態では、本開示のＡＡＶウイルス粒子または組成物は、注射、注入または移植により非経口的に投与される。

【0163】

実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、脳および頚椎についての増強されたトロピズムを示す。実施形態では、本開示のウイルス粒子は血液脳関門（ＢＢＢ）を越えることができる。実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、傍網膜、網膜下および／または硝子体内注射により高い網膜トロピズムを示す。実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、複数の眼細胞タイプ、例えば、錐体、桿体、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）などを標的化する。実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、天然血清型に対する中和抗体を回避し、そのため潜在的な再投与を可能にする。さらなる態様では、本開示のＡＡＶ粒子および組成物は、処置されている障害のための他の公知の処置と組み合わせて投与されてもよい。

【0164】

キット
本明細書に記載される薬剤、ウイルスベクター、または組成物は、実施形態では、治療的、診断的または研究的適用におけるそれらの使用を促すために集められて、医薬キットまたは診断キットまたは研究キットにされてもよい。実施形態では、本開示のキットは、本明細書に記載されている改変されたＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶベクター、ＡＡＶウイルス粒子、宿主細胞、単離された組織、組成物、または医薬組成物のいずれか１つを含む。

【0165】

実施形態では、キットは、使用のための指示をさらに含む。特に、そのようなキットは、本明細書に記載される１つまたは複数の薬剤を、これらの薬剤の意図される適用および適正な使用を記載する指示と共に含んでもよい。例として、実施形態では、キットは、キットの１つもしくは複数の成分を混合するためならびに／または試料を単離および混合するためならびに対象に適用するための指示を含んでもよい。実施形態では、キット中の薬剤は、特定の適用および薬剤の投与方法のために好適な医薬製剤中および投薬量において存在する。研究目的のキットは、様々な実験を実行するための適切な濃度または量で成分を含有してもよい。

【0166】

キットは、本明細書に記載される方法の使用を促すために設計されてもよく、多くの形態を取ることができる。キットの組成物の各々は、適用可能な場合、液体形態（例えば、溶液中）、または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供されてもよい。ある特定の場合には、組成物の一部は、例えば、キットと共に提供されてもよいしそうでなくてもよい好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加により、（例えば、活性形態に）構成可能または他に加工可能であってもよい。実施形態では、組成物は、保存溶液（例えば、凍結保存溶液）中で提供されてもよい。保存溶液の非限定的な例は、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を含む。実施形態では、保存溶液は、ある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含有する。

【0167】

実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器中に本明細書に記載される成分の任意の１つまたは複数を含有する。そのため、実施形態では、キットは、本明細書に記載される薬剤を収容する容器を含んでもよい。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は、無菌で調製され、シリンジ中に包装され、冷蔵されて輸送されてもよい。代替的に、それらは、貯蔵用のバイアルまたは他の容器中に収容されてもよい。第２の容器は、無菌で調製された他の薬剤を有してもよい。代替的に、キットは、シリンジ、バイアル、管、または他の容器中で予備混合および輸送される活性剤を含んでもよい。キットは、対象に薬剤を投与するために要求される成分、例えばシリンジ、局所的適用デバイス、またはＩＶ針管状材料およびバッグの１つまたは複数またはすべてを有してもよい。

【0168】

本発明が上記の実施形態と組み合わせて記載されたが、上記の記載および例は、本発明の範囲の実例を示すことが意図され、該範囲を限定することは意図されないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点および修飾は、本発明が関する技術分野の当業者に明らかである。

【0169】

追加的に、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点において記載される場合、本発明はそれにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点においても記載されることを当業者は認識する。

【0170】

さらなる番号付けされた実施形態
実施形態１．眼疾患または障害の処置を必要とする対象において眼疾患または障害を処置する方法であって、対象へのＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与を含み、ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、方法。

【0171】

実施形態２．眼疾患または障害の処置を必要とする対象において眼疾患または障害を処置する方法であって、対象へのＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与を含み、ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号１～３、３０～３４、４９、６７、８４、および１６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、方法。

【0172】

実施形態３．ＡＡＶウイルスベクターが、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が配列番号１～３、３０～３４、４９、６７、８４および１６４のいずれか１つと異なるアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態２に記載の方法。

【0173】

実施形態４．ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号２のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号２と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態２に記載の方法。

【0174】

実施形態５．ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１２９におけるロイシン（Ｌ）、配列番号２のアミノ酸５８６におけるアスパラギン（Ｎ）、および配列番号２のアミノ酸７２３におけるグルタミン酸（Ｅ）を含む、実施形態４に記載の方法。

【0175】

実施形態６．ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号１のアミノ酸配列または最大２、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態２に記載の方法。

【0176】

実施形態７．ＡＡＶカプシドタンパク質が、アミノ酸１２９におけるロイシン（Ｌ）、アミノ酸１４８におけるプロリン（Ｐ）、アミノ酸１５２におけるアルギニン（Ｒ）、アミノ酸１５３におけるセリン（Ｓ）、アミノ酸１５８におけるスレオニン（Ｔ）、アミノ酸１６３におけるリシン（Ｋ）、アミノ酸１６９におけるアルギニン（Ｒ）、アミノ酸３０６におけるトリプトファン（Ｗ）、アミノ酸３０８におけるフェニルアラニン（Ｆ）、およびアミノ酸３１９におけるアスパラギン（Ｎ）を含み、アミノ酸位置が配列番号１に関して番号付けされたものである、実施形態６に記載の方法。

【0177】

実施形態８．ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号１６４のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号１６４と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態２に記載の方法。

【0178】

実施形態９．ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号６７のアミノ酸配列または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号６７と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態２に記載の方法。

【0179】

実施形態１０．ＡＡＶウイルスベクターが、配列番号３のアミノ酸配列または最大２、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が配列番号３と異なるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、実施形態２に記載の方法。

【0180】

実施形態１１．ＡＡＶカプシドタンパク質が、可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含むＶＰ３部分を含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩがアミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩがアミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶがアミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）またはＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱ（配列番号１７１）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖがアミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩがアミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩがアミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩがアミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸがアミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、
実施形態２～３および１０のいずれか１つに記載の方法。

【0181】

実施形態１２．ＶＲ－Ｉ領域が、ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）、ＮＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号５３）、ＳＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号８７）、またはＮＧＴＳＧＧＳＴ（配列番号１７０）を含む、実施形態１１に記載の方法。

【0182】

実施形態１３．眼疾患または障害が、優性視神経萎縮症、網膜色素変性症、黄斑変性症、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子中の変異に関する眼障害、レーバー先天性黒内障、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病、コロイデレミア、アッシャー症候群、網膜分離症、ビエッティ結晶性ジストロフィーおよび色覚異常からなる群より選択される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0183】

実施形態１４．網膜色素変性症が、常染色体劣性、常染色体優性、またはＸ連鎖性である、実施形態１３に記載の方法。

【0184】

実施形態１５．ＢＥＳＴ－１遺伝子中の変異に関する眼障害が、卵黄様黄斑ジストロフィー、加齢性黄斑変性症、常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症、緑内障、または白内障である、実施形態１３に記載の方法。

【0185】

実施形態１６．ＡＡＶウイルスベクターが、ＳＰＡＴＡ７、ＬＲＡＴ、ＴＵＬＰ１、ＡＩＰＬ１、ＲＰＧＲ、ＡＩＰＬ１、ＡＢＣＡ４、ＣＨＭ、ＭＹ０７Ａ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ２Ａ、ＣＬＲＮ１、ＲＳ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＲＨＯ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥ６Ｃ、ＰＤＥ６Ｈ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、およびＢＥＳＴ－１から選択される遺伝子をコードするＡＡＶベクターゲノムを含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0186】

実施形態１７．ＡＡＶウイルスベクターが、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶベクターを含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0187】

実施形態１８．眼疾患または障害が視神経の機能障害に関する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。

【0188】

実施形態１９．眼疾患または障害が優性視神経萎縮症である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。

【0189】

実施形態２０．ＡＡＶウイルスベクターが、ＯＰＡ１またはＯＰＡ３導入遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムを含む、実施形態１９に記載の方法。

【0190】

実施形態２１．眼疾患または障害が網膜分離症である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。

【0191】

実施形態２２．ＡＡＶウイルスベクターが、ＲＳ１導入遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムを含む、実施形態２１に記載の方法。

【0192】

実施形態２３．傍網膜投与が、網膜の表面から０～１３ミリメートル（ｍｍ）、０～１０ｍｍ、０～５ｍｍ、または０～３ｍｍの距離において目の後部硝子体腔中に注射することを含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0193】

実施形態２３．１．傍網膜投与が、網膜の表面から０～１３ｍｍの距離において目の後部硝子体腔中に注射することを含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0194】

実施形態２３．２．傍網膜投与が、網膜の表面から０～１０ｍｍの距離において目の後部硝子体腔中に注射することを含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0195】

実施形態２３．３．傍網膜投与が、網膜の表面から０～５ｍｍの距離において目の後部硝子体腔中に注射することを含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0196】

実施形態２３．４．傍網膜投与が、網膜の表面から０～３ｍｍの距離において目の後部硝子体腔中に注射することを含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0197】

実施形態２４．対象がヒトである、実施形態１～２３．４のいずれか１つに記載の方法。

【0198】

実施形態２５．ＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、ＶＰ３部分が可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩがアミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩがアミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶがアミノ酸配列ＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱ（配列番号１７１）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖがアミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩがアミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩがアミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩがアミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸがアミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、
核酸。

【0199】

実施形態２６．ＶＲ－Ｉ領域がＮＧＴＳＧＧＳＴ（配列番号１７０）を含む、実施形態２５に記載の核酸。

【0200】

実施形態２７．ＶＰ３部分が配列番号１６６のアミノ酸配列を有する、実施形態２５に記載の核酸。

【0201】

実施形態２８．ＡＡＶカプシドタンパク質が、ｉ）ＶＰ２部分またはｉｉ）ＶＰ１部分およびＶＰ２部分をさらに含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の核酸。

【0202】

実施形態２９．コードされるＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６４と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の核酸。

【0203】

実施形態３０．コードされるＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６５と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の核酸。

【0204】

実施形態３１．コードされるＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列または配列番号１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の核酸。

【0205】

実施形態３２．核酸の配列が、配列番号１６７～１６９から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載の核酸。

【0206】

実施形態３３．核酸の配列が、配列番号１６７～１６９から選択されるヌクレオチド配列に対して１００％同一である、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載の核酸。

【0207】

実施形態３４．実施形態２５～３３のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。

【0208】

実施形態３５．実施形態２５～３３のいずれか１つに記載の核酸によりコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。

【0209】

実施形態３６．配列番号１６４、１６５もしくは１６６のアミノ酸配列、または配列番号１６４、１６５もしくは１６６と最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。

【0210】

実施形態３７．実施形態２５～３３のいずれか１つに記載の核酸によりコードされるＡＡＶカプシドタンパク質およびＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルスベクターであって、ＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のＡＡＶ逆位末端反復配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル、および
（ｅ）第２のＡＡＶ逆位末端反復配列
を含む、ＡＡＶウイルスベクター。

【0211】

実施形態３８．異種核酸が、構成的プロモーターに作動可能に連結している、実施形態３７に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【0212】

実施形態３９．異種核酸がポリペプチドをコードする、実施形態３７または３８に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【0213】

実施形態４０．異種核酸が、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする、実施形態３７または３８に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【0214】

実施形態４１．ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１６４、１６５または１６６のアミノ酸配列を含む、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクター。

【0215】

実施形態４２．（ｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質および
（ｉｉ）ＡＡＶベクターゲノム
を含むＡＡＶウイルスベクターであって、ＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’への方向に、
（ａ）第１のＡＡＶ逆位末端反復配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル；および
（ｅ）第２のＡＡＶ逆位末端反復配列
を含む、ＡＡＶウイルスベクター。

【0216】

実施形態４３．異種核酸が、配列番号１４２～１４４および１７７～１８１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、実施形態３７～３９および４１～４２のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクター。

【0217】

実施形態４４．異種核酸が、配列番号１１６～１１８および１７２～１７６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、実施形態４３に記載のＡＡＶウイルスベクター。

【0218】

実施形態４５．疾患または障害を処置する方法であって、実施形態３７～４４のいずれかに記載のＡＡＶウイルスベクターを対象に投与することを含む、方法。

【0219】

実施形態４６．ＡＡＶウイルスベクターが、対象に経口的に、直腸に、経粘膜的に、吸入により、経皮的に、非経口的に、静脈内に、皮下に、皮内に、筋肉内に、胸膜内に、脳内に、髄腔内に、脳内に、脳室内に、鼻腔内に、耳内に、眼内に、眼周囲に、外用で、リンパ内に、槽内に、硝子体内に、傍網膜的に、または網膜下に投与される、実施形態４５に記載の方法。

【0220】

実施形態４７．疾患または障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ファブリー病、ポンペ病、ＣＬＮ３病（もしくは若年性神経セロイドリポフスチノーシス）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、若年性バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、がん、関節炎、筋消耗、心臓疾患、内膜過形成、癲癇、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー－シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡもしくはＭＰＳ ＩＩＩＡ）、サンフィリポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢもしくはＭＰＳ ＩＩＩＢ）、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー－ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄脳性運動失調症、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、関節炎、黄斑変性症、網膜色素変性症、神経セロイドリポフスチノーシス１（ＣＬＮ１）、アデノシンデアミナーゼ欠損症、優性視神経萎縮症、網膜分離症、シュタルガルト病、ビエッティ結晶性ジストロフィーまたはＢＥＳＴ卵黄様黄斑ジストロフィーである、実施形態４５または４６に記載の方法。

【0221】

実施形態４８．疾患または障害が眼疾患または障害である、実施形態４５または４６に記載の方法。

【0222】

実施形態４９．眼疾患または障害が、優性視神経萎縮症、網膜色素変性症、黄斑変性症、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子中の変異に関する眼障害、レーバー先天性黒内障、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病、コロイデレミア、アッシャー症候群、網膜分離症、ビエッティ結晶性ジストロフィーおよび色覚異常からなる群より選択される、実施形態４８に記載の方法。

【0223】

実施形態５０．対象がヒトである、実施形態４５～４９のいずれかに記載の方法。

【実施例】

【0224】

（実施例１）
様々なＡＡＶウイルスベクターを使用した、非ヒト霊長類傍網膜および網膜下投薬の特徴付け
複数の眼投与モードを介するＡＡＶ２０４、ＡＡＶ２１４、ＡＡＶ２１４－Ｄ５、またはＡＡＶ８カプシドを含むＡＡＶウイルスベクターの形質導入効率を以下に記載されるように評価した。

【0225】

この実施例において使用したすべてのＡＡＶウイルスベクターは、ＣＢｈプロモーターに作動可能に連結した強化型緑色蛍光タンパク質（以下において「ＥＧＦＰ」または「ＧＦＰ」）レポーター導入遺伝子をコードする組換え核酸を含む。

【0226】

ｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶウイルスベクターの形質導入効率を試験するために、指し示されるＡＡＶウイルスベクターの傍網膜、網膜下、または硝子体内投与により非ヒト霊長類（ＮＨＰ）Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓに投薬した。各々の投与モードのための用量／体積は以下の通りであった：
・傍網膜投薬 － １００μＬの注射体積中１．０Ｅ＋１１ｖｇ
・網膜下投薬 － １００μＬの注射体積中２．５Ｅ＋１０ｖｇ
・硝子体内投薬 － １５０μＬの注射体積中１．５Ｅ＋１２ｖｇ
傍網膜投与は、硝子体膜と内境界膜との間で網膜の上にウイルスを層にすることにより行い、そのため網膜下剥離を作出しなかった。走査型レーザー検眼鏡検査（ＳＬＯ）を使用してＧＦＰ発現をモニターした。注射の２６～２７日後に収集した試料についてＳＬＯ画像を撮影した。注射の２８日後に、目を収集し、処理し、免疫組織化学により分析した。

【0227】

図２Ｂ～２Ｅは、ＡＡＶ２０４（図２Ｂ）、ＡＡＶ８（図２Ｃ）、ＡＡＶ２１４（図２Ｄ）、またはＡＡＶ２１４－Ｄ５（図２Ｅ）のカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの傍網膜注射のＳＬＯ結果を示す。試験したカプシドタンパク質の中で、ＡＡＶ２０４カプシドを含むＡＡＶウイルスベクターは、傍網膜注射を介する黄斑、乳頭黄斑束、および網膜神経線維におけるロバストな形質導入を示し、他の試験したカプシドと比較してはるかに高い形質導入効率であった。

【0228】

追加的に、ＡＡＶ２０４カプシドを含むＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与（図２Ｂ）はまた、同じＡＡＶウイルスベクターの伝統的な硝子体内投与（図２Ａ）と比較してはるかに高い局所的な形質導入効率（特には視神経形質導入について）を示す。

【0229】

これらの２つの投与経路の形質導入効率をさらに比較するために、網膜をイメージング分析のために処理した（図３Ａ～３Ｃ）。再び、ＡＡＶ２０４カプシドを含むＡＡＶウイルスベクターの傍網膜投与を与えられた網膜（図３Ｂ～３Ｃ）は、同じＡＡＶウイルスベクターの硝子体内投与を与えられた網膜（図３Ａ）よりもはるかにロバストな黄斑および視神経形質導入を示している。

【0230】

ＡＡＶ２０４ウイルスベクターの傍網膜注射の１か月後のロドプシンおよびＧＦＰのさらなる免疫組織化学分析（図３Ｄ）は、網膜全体にわたる網膜神経節細胞（ＲＧＣ）における高いＧＦＰ発現を示し、高いＧＦＰ発現を有する神経線維が、網膜に沿っておよび視神経に入って観察された。比較として、ＡＡＶ８ウイルスベクターの傍網膜注射（図３Ｄ）は、ＲＧＣにおけるはるかに低いＧＦＰ発現を示した。図３Ｅ～３Ｆに示されるように、ＡＡＶ２０４ウイルスベクターの傍網膜投与はまた、ＮＨＰ中心窩におけるおよび斑と視神経との間の乳頭黄斑束に沿ったロバストなＧＦＰ発現を結果としてもたらした。これらの結果はＳＬＯ分析と合致していた。そのため、ＡＡＶ２０４ウイルスベクターの傍網膜投与は、当分野において一般的に使用される硝子体内ＡＡＶ注射と比較して１０分の１以下の用量で、斑および中心窩における標的細胞の他に、網膜神経節細胞、および視神経にまで及ぶ付随する網膜神経線維において効率的な形質導入を結果としてもたらす。

【0231】

ＡＡＶ８（図４Ａ；図４Ｄ）、ＡＡＶ２１４（図４Ｂ；図４Ｅ）、およびＡＡＶ２１４－Ｄ５（図４Ｃ；図４Ｆ）のカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクターの形質導入効率もまた取得した。これらの３つのカプシドは網膜下に投与された場合に類似した形質導入効率を示すことを結果は示す。

【0232】

結論：ＡＡＶ２０４カプシドを含むＡＡＶベクターの傍網膜注射はペイロードを斑または視神経／網膜神経節細胞層に効率的に送達できることをこれらの結果は示す。

【図1】

【図2A】

【図2B-1】

【図2B-2】

【図2C-1】

【図2C-2】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【配列表】

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【国際調査報告】