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特表2024-519933ヒアルロン酸複合体を含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】ヒアルロン酸複合体を含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/728 20060101AFI20240514BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240514BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20240514BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240514BHJP
A61P 17/08 20060101ALI20240514BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20240514BHJP
A61P 17/12 20060101ALI20240514BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240514BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240514BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20240514BHJP
【ＦＩ】
A61K31/728
A61P17/00
A61P37/08
A61P17/10
A61P17/06
A61P17/08
A61P17/04
A61P17/12
A61K47/28
A61K9/06
C12Q1/6876 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572006
(86)(22)【出願日】2022-07-14
(85)【翻訳文提出日】2023-11-20
(86)【国際出願番号】 KR2022010310
(87)【国際公開番号】W WO2023287230
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】10-2021-0092915
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515131404
【氏名又は名称】アジュ ユニバーシティー インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＡＪＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ウク・キム
(72)【発明者】
【氏名】ウン・ハ・キム
(72)【発明者】
【氏名】ワン・ヒ・イ
(72)【発明者】
【氏名】スル・ビ・イ
(72)【発明者】
【氏名】ジュ・ファン・ユン
(72)【発明者】
【氏名】ソ・ヒ・ユ
(72)【発明者】
【氏名】ユ・ジン・ソン
(72)【発明者】
【氏名】ホン・ソ・チェ
(72)【発明者】
【氏名】イェ・ヨン・ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ス・ハ・キム
(72)【発明者】
【氏名】ジュン・ギ・ロー
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ヒェ・ハン
(72)【発明者】
【氏名】ソ・フイ・クウォン
【テーマコード（参考）】
4B063
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
4C076AA06
4C076BB31
4C076CC18
4C076CC20
4C076DD70N
4C076FF34
4C076FF63
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA25
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA28
4C086NA05
4C086NA11
4C086ZA89
4C086ZA91
(57)【要約】
本発明は、ヒアルロン酸複合体を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物に関し、前記ヒアルロン酸複合体は、ヒアルロン酸と疎水性基を提供する疎水性物質とが自己集合して結合した形態であって、ヒアルロン酸分解酵素の抵抗性および経皮透過能に優れ、皮膚障壁機能の保護または回復、細胞増殖関連因子および炎症性サイトカインの発現抑制、Ｍ１大食細胞の分極化抑制およびＴＬＲ４シグナル伝達遮断に優れた効果を有するので、多様な皮膚疾患治療剤として活用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項2】
前記疎水性物質は、分配係数（ｃＬｏｇＰ）が２～１０である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項3】
前記ヒアルロン酸複合体は、下記化学式１、化学式２、または化学式３で表される化合物である、請求項１に記載の薬学組成物：【化1】
【化2】
【化3】
【請求項4】
前記ヒアルロン酸複合体は、ヒアルロン酸と疎水性物質との質量比が１：０．００５～０．５である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項5】
前記ヒアルロン酸複合体は、水溶液状態で自己集合（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）により形成されたものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項6】
前記ヒアルロン酸複合体は、直径が５０～５００ｎｍである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項7】
前記ヒアルロン酸複合体は、経皮透過用である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項8】
前記皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、ニキビ（ａｃｎｅ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アレルギー性皮膚炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、炎症性皮膚炎（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｋｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、皮膚硬化症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、サルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、白斑症（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）、ウオノメ（ｃｏｒｎｓ）、イボ（ｗａｒｔｓ）および扁平苔癬（ｌｉｃｈｅｎ ｐｌａｎｕｓ）からなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項9】
ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体を有効成分として含む組成物を個体に投与するステップを含む、皮膚疾患の予防または治療方法。
【請求項10】
ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体の皮膚疾患の予防または治療用途。
【請求項11】
ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体の、皮膚疾患の予防または治療のための医薬の製造のための用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒアルロン酸複合体を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
本出願は、汎省庁国家新薬開発事業団の依頼を受け、国家新薬開発事業の新薬基盤拡充研究の一環として進められたものである。 本出願の研究課題名は、「免疫細胞活性制御機能性ヒアルロン酸ナノ粒子の最適化-プロファイリング-生産技術確立を通じた皮膚炎症疾患治療剤先導物質の確保」であり、課題番号はRS-2021-DD120838（旧 HN21C0958）である。
【0003】
薬物を投与する方法は、大きく、経口投与と、経皮投与とに分けられる。このうち、局所、特に皮膚に薬物を供給するためには、経口よりは経皮投与法が様々な面でメリットがある。例えば、経口投与は、肝の代謝作用で相当部分分解されるため、一定の薬効を得るためには薬物の量が過剰投与されなければならず、薬効を維持するために薬物を繰り返し投与しなければならない。これに対し、経皮を通した薬物伝達は、投与された薬物が肝の代謝作用を経ずに直接、調節的に患部へ伝達されるため、経口投与によって発生しうるデメリットを解消することができる。また、経皮投与は、注射法からもたらされる患者の苦痛、心的負担を低減することができ、不便さもないという利点がある。したがって、主に局所的に発生し、皮膚およびその周辺組織に発生する皮膚疾患を治療する上で経皮投与は効果的な投薬法として提示される。
【0004】
皮膚は、大きく、表皮、真皮および皮下脂肪からなっており、皮膚組織が密に形成されているため、薬物の分子量、用量、特性などによって経皮吸収が難しかったり、皮膚刺激性が激しくて薬物の選択が限られる。したがって、効果的な経皮投薬のためには、ナノ粒子化された薬物を用いたり、薬物が皮膚表面から内部まで伝達されることを助ける多様な薬物伝達体を使用することができる。最近は、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）など多様な生分解性高分子を含む経皮透過用薬物伝達体が開発されている。
【0005】
ヒアルロン酸は、１×１０５～１×１０７Ｄａの範囲の分子量を有する線状多糖重合体で、（β，１－４）－Ｄ－グルクロン酸（Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＧｌｃＵＡ）と（β，１－３）－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、ＧｌｃＮＡｃ）単位の繰り返し配列で構成されている。大部分の人体組織の細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）および細胞表面で発見され、特に、関節滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）、軟骨などに多量存在する。したがって、ヒアルロン酸は、生体適合性を有し、血液内のヒアルロン酸酵素であるヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）によって生分解されるため、薬物伝達体、組織工学用支持体など生体材料として用いられる。特に、ヒアルロン酸は、癌細胞または転移癌細胞表面で過発現するＣＤ４４、ＲＨＡＭＭと結合してエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞内吸収（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）され、リソソームのような低いｐＨ環境で分解される。また、ヒアルロン酸は、細胞の運動性、細胞分化、傷治癒および癌転移においてシグナル分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として重要な役割を果たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
線状のヒアルロン酸は、皮膚を透過するのに分子量が過度に大きくて皮膚吸収率が低いため、現在までヒアルロン酸を経皮投与して疾患治療に適用した例がなく、体内でヒアルロン酸分解酵素によって分解されやすくてその薬効を持続にくいという問題があった。したがって、このような問題を克服してヒアルロン酸を経皮投与に適用できるように体内で安定的かつ経皮透過率が向上したヒアルロン酸含有薬物体または薬物伝達体を開発する努力が切実に要求されている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ヒアルロン酸に疎水性物質が結合したヒアルロン酸複合体を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0008】
本発明によるヒアルロン酸複合体は、ヒアルロン酸と疎水性基を提供する疎水性物質とが自己集合して結合した形態であって、ヒアルロン酸分解酵素の抵抗性および経皮透過能に優れ、皮膚障壁機能の保護または回復、細胞増殖関連因子および炎症性サイトカインの発現抑制、Ｍ１大食細胞の分極化抑制およびＴＬＲ４シグナル伝達遮断に優れた効果を有するので、多様な皮膚疾患治療剤として活用できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３）の自己集合特性を示す図であって、（ａ）は、ヒアルロン酸－リトコール酸複合体の化学構造および自己集合に関する模式図であり、（ｂ）は、ヒアルロン酸－リトコール酸複合体の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真であり、（ｃ）は、ヒアルロン酸－リトコール酸複合体の大きさおよびゼータ電位であり、（ｄ）は、時間に応じた粒子の大きさおよびゼータ電位の変化を測定して得た安定性に関するグラフである。
【図2】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３）のヒアルロン酸分解酵素の抵抗性を示す。
【図3】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３）の乾癬治療効果を示す。（ａ）は、実験日程であり、（ｂ）は、紅斑および角質が起きたマウスの皮膚状態とこれに対するＰＡＳＩ点数である。
【図4】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３）の乾癬治療効果を示す図であって、マウスの皮膚を組織染色して測定された皮膚の厚さと炎症性サイトカイン（ＩＬ－１βおよびＩＬ－２３）の発現量である。
【図5】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３）の皮膚障壁機能の保護効果を示す図であって、マウスの皮膚を組織染色して測定された皮膚障壁機能関連の標識物質（Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－１およびＳ１００Ａ９）の発現量である。
【図6】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の皮膚障壁機能の回復効果を示す。
【図7】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮透過能を示す図であって、経皮吸収セルを透過したＣｙ５．５－ＨＡＬＮの蛍光強度グラフである。
【図8】正常マウスと皮膚疾患（乾癬）マウスにおいてヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮透過能を示す図であって、マウスの皮膚組織におけるＣｙ５．５－ＨＡＬＮの蛍光強度イメージである。
【図9】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮透過能を示す図であって、マウスの皮膚組織の深さに応じた蛍光強度である。
【図10】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３）の経皮透過能を示す。
【図11】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮投与による濃度別（０．５、２．５、５ｍｇ）の乾癬治療効果を示す。（ａ）は、実験日程であり、（ｂ）は、紅斑および角質が起きたマウスの皮膚状態とこれに対するＰＡＳＩ点数である。
【図12】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮投与による濃度別（０．５、２．５、５ｍｇ）の乾癬治療効果を示す図であって、マウスの皮膚を組織染色して測定された皮膚の厚さと、細胞増殖関連因子（Ｋｉ－６７）および炎症性サイトカイン（ＣＤ６８、ＩＬ－２３およびＩＬ－１７）の発現量である。
【図13】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮投与による濃度別（２、１０ｍｇ）の乾癬予防効果を示す図であって、（ａ）は、実験日程であり、（ｂ）は、紅斑および角質が起きたマウスの皮膚状態とこれに対するＰＡＳＩ点数である。
【図14】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮投与による濃度別（２、１０ｍｇ）の乾癬予防効果を示す図であって、マウスの皮膚を組織染色して測定された皮膚の厚さと、細胞増殖関連因子（Ｋｉ－６７）および炎症性サイトカイン（ＣＤ６８、ＩＬ－２３およびＩＬ－１７）の発現量である。
【図15】ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ－３）の経皮投与による皮膚障壁機能の保護効果を示す図であって、マウスの皮膚を組織染色して測定された皮膚障壁機能関連の標識物質（Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－１およびＳ１００Ａ９）の発現レベルである。
【図16】ＨＡＬＮの大きさによる大食細胞の分極化抑制効果を示す図であって、（ａ）は、ＨＡＬＮ－１～３によるＭ１大食細胞の分極標識物質（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２ｐ４０およびＩＬ－２３ｐ１９）の発現量であり、（ｂ）は、ＨＡＬＮ－３によるＭ１大食細胞の分極化レベルである。
【図17】ヒアルロン酸－コラン酸複合体（ＨＡＣＮ）の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真および化学式を示す。
【図18】ヒアルロン酸－コラン酸複合体の経皮透過能を示す図であって、マウスの皮膚組織で測定されたＣｙ５．５－ＨＡＣＮの蛍光強度である。
【図19】ヒアルロン酸－コラン酸複合体の大食細胞依存的乾癬治療効果を示す図であって、（ａ）は、実験日程であり、（ｂ）は、紅斑および角質が起きたマウスの皮膚状態とこれに対するＰＡＳＩ点数である。
【図20】ヒアルロン酸－コラン酸複合体の大食細胞依存的乾癬治療効果を示す図であって、クロドロネートを処理しないマウスの皮膚を組織染色して測定された（ａ）皮膚の厚さと、（ｂ）皮膚細胞増殖関連因子（Ｋｉ－６７）の発現レベルである。
【図21】ヒアルロン酸－コラン酸複合体の大食細胞依存的乾癬治療効果を示す図であって、クロドロネート処理の有無によるマウスの皮膚で測定された炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－２３およびＩＬ－１７）の発現レベルである。
【図22】ＨＡＣＮの大きさによる大食細胞の分極化抑制効果を示す図であって、（ａ）は、ＨＡＣＮによるＭ１大食細胞の分極標識物質（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＣＯＸ－２、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－２３ｐ１９およびＣＸＣＬ１０）の発現量であり、（ｂ）は、ＨＡＣＮによるＭ１大食細胞の分極化レベルである。
【図23】表面プラズモン共鳴法によりＨＡＣＮとＴＬＲ４の相互作用を示す。
【図24】蛍光細胞分析法によりＴＬＲ４との結合に対するＬＰＳとＨＡＣＮの競合を示す。
【図25】多様な種類のヒアルロン酸複合体の皮膚疾患治療効果を確認した図である。
【図26】多様な種類のヒアルロン酸複合体の皮膚疾患治療効果を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明者らは、体内で安定的かつ経皮透過率に優れたヒアルロン酸含有薬物体または薬物伝達体を開発するために、生分解性を有し、親水性物質の低分子ヒアルロン酸と、疎水性物質としてリトコール酸、コラン酸、またはコレステロールを自己集合してナノサイズのヒアルロン酸複合体を作製し、このようなヒアルロン酸複合体が優れた体内安定性および経皮透過能を有し、乾癬のような皮膚疾患に対して効果的な症状改善または治療効果があることを確認することにより、本発明を完成した。
【0011】
本発明の一態様は、ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0012】
本発明で使用された「疎水性物質」は、疎水性置換基を含む化合物であって親水性ヒアルロン酸に疎水性を付与する物質を意味し、ナノ粒子サイズのヒアルロン酸複合体の形成を誘導できる疎水性を有する物質であってもよい。
【0013】
本発明の一具体例によれば、前記疎水性物質は、分配係数（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ－ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ、ｃＬｏｇＰ）が２～１０であってもよいし、好ましくは３～８であってもよい。
【0014】
このような分配係数値を有する疎水性物質は、ナノ粒子サイズのヒアルロン酸複合体を形成することができる。
【0015】
本発明の一具体例によれば、前記疎水性物質は、ヒアルロン酸複合体を５０～５００ｎｍの粒子サイズに誘導するものであってもよい。
【0016】
本発明による疎水性物質は、生体で生産される酵素によって分解されたり、生体内の代謝過程で分解されやすい生分解特性を有することが好ましい。
【0017】
より具体的には、前記疎水性物質は、胆汁酸の一種である疎水性コラン酸またはその誘導体であってもよい。
【0018】
本発明の一具体例によれば、前記疎水性物質は、リトコール酸（ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コラン酸（ｃｈｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸（ｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリココール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、タウロコール酸（ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、７－オキソ－リトコール酸（７－ｏｘｏ－ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【0019】
本発明の一具体例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、ヒアルロン酸と疎水性物質とがアミド結合で連結されたものであってもよい。
本発明の一実施例によれば、ヒアルロン酸と疎水性物質とを結合させるために、リトコール酸またはコラン酸とエチレンジアミンとを反応させてアミノ化された疎水性物質を生成し、このような疎水性物質のアミン基とヒアルロン酸のカルボキシル基とが結合してヒアルロン酸複合体を形成した。
本発明の一実施例によれば、ヒアルロン酸と疎水性物質とを結合させるために、リトコール酸またはコラン酸とエチレンジアミンとを反応させてアミノ化された疎水性物質を生成し、このような疎水性物質のアミン基とヒアルロン酸のカルボキシル基とが結合してヒアルロン酸複合体を形成した。
【0020】
本発明の一実施例によれば、ヒアルロン酸と疎水性物質とを結合させるために、コレステロールとＤＣＣなどとを反応させてアミノ化された疎水性物質を生成し、このような疎水性物質のアミン基とヒアルロン酸のカルボキシル基とが結合してヒアルロン酸複合体を形成した。
【0021】
本発明の一具体例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、下記化学式１または化学式２または化学式３で表される化合物であってもよい。
【0022】
【化1】
【0023】
前記化学式１において、ａおよびｂは、それぞれ独立した整数であって、互いに同一または異なり、ａは、１～７５０の整数であり、ｂは、１～１００の整数であり、この時、ｂ／（ａ＋ｂ）は、０．０１～０．４０の範囲を有する。
【0024】
より具体的には、前記化学式１のａは、１～３００の整数（好ましくは１～１５０の整数）であり、ｂは、１～４０の整数（好ましくは１～２０の整数）であり、この時、ｂ／（ａ＋ｂ）は、０．０１～０．３０（好ましくは０．０２～０．２０）であってもよい。
【0025】
【化2】
【0026】
前記化学式２において、ａおよびｂは、それぞれ独立した整数であって、互いに同一または異なり、ａは、１～７５０の整数であり、ｂは、１～１００の整数であり、この時、ｂ／（ａ＋ｂ）は、０．０１～０．４０の範囲を有する。
【0027】
より具体的には、前記化学式２のａは、１～１００の整数（好ましくは１～３０の整数）であり、ｂは、１～１０の整数（好ましくは１または２）であり、この時、ｂ／（ａ＋ｂ）は、０．０１～０．２０（好ましくは０．０２～０．１０）であってもよい。
【0028】
【化3】
【0029】
前記化学式３において、ａおよびｂは、それぞれ独立した整数であって、互いに同一または異なり、ａは、１～７５０の整数であり、ｂは、１～１００の整数であり、この時、ｂ／（ａ＋ｂ）は、０．０１～０．４０の範囲を有する。
【0030】
より具体的には、前記化学式３のａは、１～３００の整数（好ましくは１～１５０の整数）であり、ｂは、１～４０の整数（好ましくは１～２０の整数）であり、この時、ｂ／（ａ＋ｂ）は、０．０１～０．３０（好ましくは０．０２～０．２０）であってもよい。
【0031】
本発明の一具体例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、ヒアルロン酸と疎水性物質との質量比が１：０．００５～０．５であってもよい。
【0032】
より具体的には、前記ヒアルロン酸複合体において疎水性物質がリトコール酸またはコラン酸の場合、ヒアルロン酸またはコラン酸とリトコール酸との質量比が１：０．００５～０．５、１：０．０１～０．３、または１：０．０２～０．１５であってもよい。
【0033】
一般的な線状のヒアルロン酸は、分子量が大きくて（約１×１０５～１×１０７Ｄａ）、皮膚を透過することが容易でない。本発明では、皮膚吸収が容易となるように低分子量を有するヒアルロン酸であることが好ましい。
【0034】
本発明の一具体例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、分子量１～３００ｋＤａであってもよい。
【0035】
より具体的には、前記ヒアルロン酸複合体の数平均分子量は、前記化学式１の場合、１０～２５０ｋＤａであることが好ましく、４０～８０ｋＤａであることがさらに好ましく、前記化学式２の場合、１～５０ｋＤａであることが好ましく、５～３０ｋＤａであることがさらに好ましい。前記化学式３の場合、１～５０ｋＤａであることが好ましく、５～３０ｋＤａであることがさらに好ましい。
【0036】
本発明の一具体例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、水溶液状態で自己集合（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）によりナノ粒子を形成するものであってもよい。
【0037】
本発明の一具体例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、ナノ粒子化されたもので、直径が５０～５００ｎｍのものであってもよい。
【0038】
本発明の一具体例によれば、供給率（ｆｅｅｄ ｒａｔｉｏ、ＦＲ）によって調節された疎水性物質の量によって置換度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、ＤＳ：ヒアルロン酸内の１００個のｓｕｇａｒ ｒｅｓｉｄｕｅあたりに付いている疎水性部分の個数）が異なる。疎水性物質の置換度は、１～５０の整数であってもよく、好ましくは２～１５の整数である。
【0039】
本発明の一実施例によれば、ヒアルロン酸複合体の疎水性基の置換度（ＤＳ）が増加すれば、ナノ粒子化されたヒアルロン酸複合体の大きさが減少することを確認した。このようなナノ粒子化されたヒアルロン酸複合体は、大きさが小さいほど、ヒアルロン酸分解酵素の抵抗性の増加、経皮透過能の増加、皮膚増殖関連因子および炎症性サイトカインの発現抑制に対する効果に優れていることを確認した。したがって、本発明では、ナノ粒子化されたヒアルロン酸複合体の直径が１００～４００ｎｍであることが好ましく、１５０～３００ｎｍであることがさらに好ましい。ナノ粒子化されたヒアルロン酸の大きさが前記範囲を超える場合には、ヒアルロン酸複合体の経皮透過率が低下し、これによってヒアルロン酸複合体による皮膚疾患の予防または治療効果が減少する。
【0040】
本発明の一具体例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、経皮透過用であってもよい。
【0041】
本発明の一実施例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、皮膚組織に対する透過能または吸収能に優れ、線状のヒアルロン酸に比べてより深い皮膚組織まで吸収されることを確認した。したがって、本発明によるヒアルロン酸複合体は、経皮投与に適するものであることが分かる。
【0042】
本発明の一具体例によれば、前記皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、ニキビ（ａｃｎｅ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アレルギー性皮膚炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、炎症性皮膚炎（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｋｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、皮膚硬化症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、サルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、白斑症（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）、ウオノメ（ｃｏｒｎｓ）、イボ（ｗａｒｔｓ）および扁平苔癬（ｌｉｃｈｅｎ ｐｌａｎｕｓ）からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【0043】
本発明の一実施例によれば、前記ヒアルロン酸複合体は、乾癬が誘発されたマウスの皮膚で現れた紅斑および角質を減少させて皮膚状態を改善し、損傷した皮膚障壁機能を回復させ、皮膚増殖関連因子Ｋｉ－６７と、炎症性サイトカインＣＤ６８、ＩＬ－２３およびＩＬ－１７の発現を抑制することを確認した。
【0044】
また、前記ヒアルロン酸複合体は、ＴＬＲ４と結合してＴＬＲ４シグナル伝達を遮断することにより、ＴＬＲ４シグナル伝達によって発生する多様な皮膚疾患を予防したり、治療することができることが分かる。
【0045】
このようなヒアルロン酸複合体を有効成分として含む薬学組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができる。前記添加剤は、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイドシリコンジオキシド、ヒドロキシカルシウムホスフェート、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアガム、前糊化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトールおよびタルクなどであってもよいが、これらに限定されない。
【0046】
本発明の一具体例によれば、前記薬学組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。前記担体は、薬剤の製造時に通常用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、ヒアルロニックアシッド、デンプン、アカシアガム、カルシウムホスフェート、アルギネート、ゼラチン、カルシウムシリケート、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【0047】
本発明の一具体例によれば、前記薬学組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。好適な薬学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２２ｔｈ ｅｄ．、２０１３）に詳しく記載されている。
【0048】
本発明の薬学組成物は、実際の臨床投与時に経口および非経口の様々な剤形に投与できるが、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製できる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、酸剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の薬学組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）またはゼラチンなどを混合して調製できる。また、単純な賦形剤のほか、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用可能である。
【0049】
本発明の薬学組成物は、目的とする方法により、経口投与したり、非経口投与してもよいし、非経口投与時、経皮投与、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式を選択することができる。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
【0050】
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野によく知られた要素によって決定可能である。本発明の一具体例による組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次または同時に投与されてもよいし、単一または多重投与されてもよい。上記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定可能である。
【0051】
具体的には、本発明による薬学組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって異なり、一般的には、体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇ～１，０００ｍｇ、０．０１ｍｇ～１００ｍｇ、または０．１ｍｇ～１０ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日１～３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、疾患の重症度、性別、体重、年齢などによって増減可能なため、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【0052】
本発明の他の態様は、ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体を有効成分として含む組成物を個体に投与するステップを含む、皮膚疾患の予防または治療方法を提供する。
【0053】
本発明の一具体例によれば、前記方法においてヒアルロン酸、疎水性物質、ヒアルロン酸複合体、皮膚疾患については上述した通りである。
【0054】
本発明の一具体例によれば、前記組成物の投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ／日（ｄａｙ）～１００ｍｇ／ｋｇ／日（ｄａｙ）であってもよい。
【0055】
本発明の一具体例によれば、前記個体は、皮膚疾患の予防または治療を必要とする個体であってもよい。前記個体は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類、またはこれから分離された細胞または組織またはその培養物であってもよい。この時、前記患者は、ヒトを除いた哺乳動物であってもよい。
【0056】
本発明の他の態様は、ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体の皮膚疾患の予防または治療用途を提供する。
【0057】
本発明の他の態様は、ヒアルロン酸および疎水性物質で構成されたヒアルロン酸複合体の医薬の製造のための用途であって、皮膚疾患の予防または治療のための医薬製造のための用途を提供する。
【0058】
本発明の一具体例によれば、前記用途においてヒアルロン酸、疎水性物質、ヒアルロン酸複合体、皮膚疾患については上述した通りである。
【実施例】
【0059】
以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるものではない。
【0060】
実施例１．ヒアルロン酸－リトコール酸複合体の製造
１－１．リトコール酸のアミノ化
リトコール酸（Ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ＬＣＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇをメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）２０ｍＬに溶解した後、ＨＣｌ（１２Ｎ）１８０μＬを入れて、７０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応が終了すると、溶媒を減圧蒸留して除去し、生成された固体状態の１次生成物を水で希釈し、沈殿物を減圧濾過して得て、これを真空状態で乾燥させて、最終的にメチルエステル形態（ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｆｏｒｍ）のリトコール酸を得た。メチルエステル－ＬＣＡ９２０ｍｇはエチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）（ＴＣＩ）１５ｍＬに溶解させた後、１３０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応終了後、エチレンジアミンを減圧蒸留して除去し、生成された２次生成物を水で希釈した後、沈殿した物質を減圧濾過して得た。これを乾燥させて、最終的にアミノ化された（ａｍｉｎａｔｅｄ）ＬＣＡを得た。
１－１．リトコール酸のアミノ化
リトコール酸（Ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ＬＣＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇをメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）２０ｍＬに溶解した後、ＨＣｌ（１２Ｎ）１８０μＬを入れて、７０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応が終了すると、溶媒を減圧蒸留して除去し、生成された固体状態の１次生成物を水で希釈し、沈殿物を減圧濾過して得て、これを真空状態で乾燥させて、最終的にメチルエステル形態（ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｆｏｒｍ）のリトコール酸を得た。メチルエステル－ＬＣＡ９２０ｍｇはエチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）（ＴＣＩ）１５ｍＬに溶解させた後、１３０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応終了後、エチレンジアミンを減圧蒸留して除去し、生成された２次生成物を水で希釈した後、沈殿した物質を減圧濾過して得た。これを乾燥させて、最終的にアミノ化された（ａｍｉｎａｔｅｄ）ＬＣＡを得た。
【0061】
１－２．ヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ）
６０ｋＤａのヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）１２０ｍｇ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ）をホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍＬに溶解した。以後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ）（ＴＣＩ）（５６．１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）とＮ－ヒドロスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）（Ｓｉｇｍａ）（３３．３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を入れて、３０分間撹拌してＨＡ混合液を用意した。Ｆｅｅｄ Ｒａｔｉｏ（ＦＲ）値に合った適切な量のアミノ化されたＬＣＡ（８～８０ｍｇ）をジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）５ｍＬに溶かした後、この溶液を点滴（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）してＨＡ混合液に入れた。生成された１次混合物を常温で２４時間撹拌した。反応終了後、１３Ｋ ＭＷＣＯ透析バッグ（ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｔｕｂｉｎｇ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、メタノール単独溶媒で２日、メタノール：蒸留水混合溶媒（ｖ：ｖ＝１：１）で１日、蒸留水単独溶媒で２日間透析した。透析が終わった後、反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を５０秒間音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した（１０秒作動、１秒休止）。音波処理後、混合物を０．８μｍの注射器フィルタ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した。濾過液を凍結乾燥して、最終的にヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ）を得た。以後、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）実験により分析された疎水性部分の置換度（ＤＳ）によって、それぞれＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３と名付けた。
６０ｋＤａのヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）１２０ｍｇ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ）をホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍＬに溶解した。以後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ）（ＴＣＩ）（５６．１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）とＮ－ヒドロスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）（Ｓｉｇｍａ）（３３．３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を入れて、３０分間撹拌してＨＡ混合液を用意した。Ｆｅｅｄ Ｒａｔｉｏ（ＦＲ）値に合った適切な量のアミノ化されたＬＣＡ（８～８０ｍｇ）をジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）５ｍＬに溶かした後、この溶液を点滴（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）してＨＡ混合液に入れた。生成された１次混合物を常温で２４時間撹拌した。反応終了後、１３Ｋ ＭＷＣＯ透析バッグ（ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｔｕｂｉｎｇ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、メタノール単独溶媒で２日、メタノール：蒸留水混合溶媒（ｖ：ｖ＝１：１）で１日、蒸留水単独溶媒で２日間透析した。透析が終わった後、反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を５０秒間音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した（１０秒作動、１秒休止）。音波処理後、混合物を０．８μｍの注射器フィルタ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した。濾過液を凍結乾燥して、最終的にヒアルロン酸－リトコール酸複合体（ＨＡＬＮ）を得た。以後、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）実験により分析された疎水性部分の置換度（ＤＳ）によって、それぞれＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３と名付けた。
【0062】
１－３．ＨＡＬＮ特性分析
ＨＡＬＮの化学的特性は６００ＭＨｚの核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）実験により分析し、分析時、溶媒は重水素化されたメタノール（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ）：酸化重水素（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｏｘｉｄｅ）＝１：１（ｖ：ｖ）で測定した。動的光散乱器（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）（ＥＬＳ－Ｚ、Ｏｔｓｕｋａ）を活用して生成されたＨＡＬＮの大きさとゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。測定時には、ＨＡＬＮをＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かして測定した。
ＨＡＬＮの化学的特性は６００ＭＨｚの核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）実験により分析し、分析時、溶媒は重水素化されたメタノール（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ）：酸化重水素（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｏｘｉｄｅ）＝１：１（ｖ：ｖ）で測定した。動的光散乱器（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）（ＥＬＳ－Ｚ、Ｏｔｓｕｋａ）を活用して生成されたＨＡＬＮの大きさとゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。測定時には、ＨＡＬＮをＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かして測定した。
【0063】
その結果、図１に示すように、乾燥したＨＡＬＮをＰＢＳに分散させると、リトコール酸の官能基が互いに凝集して球状に存在した。供給率（ＦＲ）の増加によって置換度（Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、ＤＳ）が増加したＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３が合成された。ＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３の大きさは、それぞれ４２８±２０ｎｍ、３３１±２ｎｍおよび２１１±２ｎｍであり、ＤＳの増加によってＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３の順に大きさが小さくなり（約１５０～４４０ｎｍ）、ゼータ電位値は大きくなることを確認した。
【0064】
実験例１．ヒアルロン酸分解酵素に対するＨＡＬＮの抵抗性分析
ヒアルロン酸分解酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ）（Ｈ２１２６、ｓｉｇｍａ）と大きさおよび電気化学的値が異なるＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３をそれぞれ３７℃で０．５、１、２、４および６時間反応させた後、１００℃の熱を加えて反応を停止し、四ホウ酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅ）およびＤＭＡＢ溶液を順次処理した後、３７℃の水槽で反応した。反応液を２００μｌずつ９６ウェルプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にローディングし、分光光度計（Ｃｙｔａｔｉｏｎ３、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）で５４４ｎｍにおける吸光度を測定した。
ヒアルロン酸分解酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ）（Ｈ２１２６、ｓｉｇｍａ）と大きさおよび電気化学的値が異なるＨＡＬＮ－１、ＨＡＬＮ－２およびＨＡＬＮ－３をそれぞれ３７℃で０．５、１、２、４および６時間反応させた後、１００℃の熱を加えて反応を停止し、四ホウ酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅ）およびＤＭＡＢ溶液を順次処理した後、３７℃の水槽で反応した。反応液を２００μｌずつ９６ウェルプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にローディングし、分光光度計（Ｃｙｔａｔｉｏｎ３、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）で５４４ｎｍにおける吸光度を測定した。
【0065】
その結果、図２に示すように、ＨＡＬＮ－３は、ヒアルロン酸単独（６０ｋＤａの線状ＨＡ）および他の複合体（ＨＡＬＮ－１およびＨＡＬＮ－２）に比べて著しく高いヒアルロン酸分解酵素の抵抗性を有することを確認した。
【0066】
実験例２．ＨＡＬＮの乾癬治療効果
乾癬動物モデルを作製するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ）が用いられた（グループあたり５匹）。正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されるマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発する前に、ＨＡＬＮ－１～３をそれぞれＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、インスリン注射器を用いて２０ｍｇ／ｋｇで４日間皮下注射したり、またはＨＡＬＮの代わりにＰＢＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）のみを投与した。薬物投与して２時間後、マウスの体重とＰＡＳＩ点数を測定した。そして、薬物投与後、毛の除去されたマウスの背中にアルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ；ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩＭＱ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布した。５日目にすべてのマウスの皮膚組織を採取して分析した。
乾癬動物モデルを作製するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ）が用いられた（グループあたり５匹）。正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されるマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発する前に、ＨＡＬＮ－１～３をそれぞれＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、インスリン注射器を用いて２０ｍｇ／ｋｇで４日間皮下注射したり、またはＨＡＬＮの代わりにＰＢＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）のみを投与した。薬物投与して２時間後、マウスの体重とＰＡＳＩ点数を測定した。そして、薬物投与後、毛の除去されたマウスの背中にアルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ；ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩＭＱ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布した。５日目にすべてのマウスの皮膚組織を採取して分析した。
【0067】
ＰＡＳＩ点数は乾癬面積および重症の程度によって点数付けをした：０；なし、１；軽微、２；中等度、３；大きい、４；非常に明らかである。
【0068】
マウスの皮膚を組織染色するために、各組織を４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ）で固定した後、パラフィンブロックを作製して０．４ｕｍの切片にスライドを作製した後、ヘマトキシリンとエオシンを用いて核と細胞質を染色した。以後、炎症性サイトカインの発現を確認するために、ＩＬ－１βとＩＬ－２３抗体を用いて染色した。
【0069】
皮膚の厚さはＩｍａｇｅ Ｊプログラムの「ＭＲＩ Ｓｋｉｎ Ｔｏｏｌ」機能を用いて自動分析した。各組織あたり３つの部分のイメージ値の平均を用いた。
【0070】
その結果、図３および４に示すように、ＨＡＬＮ－１～３を投与した場合には、ＰＢＳを投与した場合に比べて紅斑、角質、皮膚の厚さが減少し、特に、大きさが最も小さいＨＡＬＮ－３がその効果に優れていることを確認した。また、ＨＡＬＮ－３は、ＨＡＬＮ－１およびＨＡＬＮ－２に比べて乾癬において重要な炎症性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－２３の発現を効果的に抑制することを確認した。結論的に、ＨＡＬＮ－３は、ＨＡＬＮ－１およびＨＡＬＮ－２に比べて乾癬の予防または治療効果に最も優れていた。
【0071】
実験例３．ＨＡＬＮの皮膚障壁機能の保護効果
乾癬動物モデルを作製するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスが使用された（グループあたり５匹）。正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されるマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発する前に、毛の除去されたマウスの背中にＨＡＬＮ－１～３をそれぞれＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、インスリン注射器を用いて２０ｍｇ／ｋｇで皮下注射したり、またはＨＡＬＮの代わりにＰＢＳ２０ｍｇ／ｋｇを投与した。薬物投与３時間後、アルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを４日間塗布した。投与最終日にすべてのマウスの皮膚組織を採取して、皮膚障壁機能を示す標識物質（Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－１およびＳ１００Ａ９）を免疫染色法で染色した。
乾癬動物モデルを作製するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスが使用された（グループあたり５匹）。正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されるマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発する前に、毛の除去されたマウスの背中にＨＡＬＮ－１～３をそれぞれＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、インスリン注射器を用いて２０ｍｇ／ｋｇで皮下注射したり、またはＨＡＬＮの代わりにＰＢＳ２０ｍｇ／ｋｇを投与した。薬物投与３時間後、アルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを４日間塗布した。投与最終日にすべてのマウスの皮膚組織を採取して、皮膚障壁機能を示す標識物質（Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－１およびＳ１００Ａ９）を免疫染色法で染色した。
【0072】
その結果、図５に示すように、ＨＡＬＮ－３は、ＨＡＬＮ－１およびＨＡＬＮ－２に比べて乾癬誘導によって破壊された皮膚障壁機能を復旧させる効果に最も優れていることが確認された。
【0073】
また、前記実験と同様に、乾癬動物モデルにＰＢＳまたはＨＡＬＮ－３を投与した後、最終日にすべてのマウスにＣｙ５．５－ＨＡＬＮ－３を経皮投与し、４時間後に皮膚組織を蛍光顕微鏡で観察した。
【0074】
その結果、図６に示すように、ＨＡＬＮ－３が注入された乾癬動物モデルでは、ＰＢＳを注入した乾癬動物モデルに比べてＣｙ５．５－ＨＡＬＮ－３の経皮吸収が少ないことが明らかになり、ＨＡＬＮ－３が乾癬誘導によって破壊された皮膚障壁機能を回復させたことが分かった。
【0075】
実験例４．ＨＡＬＮの経皮透過能分析
４－１．経皮吸収セル
経皮吸収セル（Ｆｒａｎｚ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｅｌｌ）にマイクロピッグ（ｍｉｃｒｏｐｉｇ）に由来する皮膚組織を固定させた後、皮膚組織上にＣｙ５．５－ＨＡＬＮ－３（０．５ｍｌ）を塗布した。塗布して０、１、２、４、６、１２および２４時間目にレシーバチャンバから溶液２０ｕｌを抽出して黒色の９６ウェルプレートにローディングし、分光光度計（Ｃｙｔａｔｉｏｎ３、ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を用いて蛍光（吸収波長：６７０ｎｍ、放出波長：７００ｎｍ）を測定した。対照群としてはＣｙ５．５を使用した。
４－１．経皮吸収セル
経皮吸収セル（Ｆｒａｎｚ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｅｌｌ）にマイクロピッグ（ｍｉｃｒｏｐｉｇ）に由来する皮膚組織を固定させた後、皮膚組織上にＣｙ５．５－ＨＡＬＮ－３（０．５ｍｌ）を塗布した。塗布して０、１、２、４、６、１２および２４時間目にレシーバチャンバから溶液２０ｕｌを抽出して黒色の９６ウェルプレートにローディングし、分光光度計（Ｃｙｔａｔｉｏｎ３、ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を用いて蛍光（吸収波長：６７０ｎｍ、放出波長：７００ｎｍ）を測定した。対照群としてはＣｙ５．５を使用した。
【0076】
その結果、図７に示すように、時間が経過するほど、皮膚組織を透過したＣｙ５．５－ＨＡＬＮが増加することが明らかになり、ＨＡＬＮが経皮透過能があることが分かった。
また、ＰＢＳを塗布した正常マウスと実験例３のように乾癬を誘発したマウスから摘出した背中皮膚を経皮吸収セルに固定させた後、皮膚組織上にＣｙ５．５－ＨＡＬＮ（０．５ｍｌ）を塗布した。塗布後１、２、４および１２時間目に皮膚組織を採取して各組織を４％ＰＦＡで固定した後、パラフィンブロックを作製し、０．４ｕｍの切片にスライドを作製して組織染色標本を用意した。そして、ＤＡＰＩ染色後、蛍光顕微鏡で皮膚組織を観察した。
また、ＰＢＳを塗布した正常マウスと実験例３のように乾癬を誘発したマウスから摘出した背中皮膚を経皮吸収セルに固定させた後、皮膚組織上にＣｙ５．５－ＨＡＬＮ（０．５ｍｌ）を塗布した。塗布後１、２、４および１２時間目に皮膚組織を採取して各組織を４％ＰＦＡで固定した後、パラフィンブロックを作製し、０．４ｕｍの切片にスライドを作製して組織染色標本を用意した。そして、ＤＡＰＩ染色後、蛍光顕微鏡で皮膚組織を観察した。
【0077】
その結果、図８に示すように、乾癬が誘導されたマウス（ＩＭＱ）では、正常マウスに比べて同じ時間条件で蛍光強度が強くなり、乾癬皮膚においてＨＡＬＮの経皮透過能により優れていることを確認した。
【0078】
そして、実験例３のように乾癬を誘導したマウスから摘出した背中皮膚を経皮吸収セルに固定させた後、皮膚組織上にＰＢＳ、Ｃｙ５．５（０．５ｍｌ）、Ｃｙ５．５－ＨＡ（０．５ｍｌ）またはＣｙ５．５－ＨＡＬＮ（０．５ｍｌ）を塗布した。以後、４時間経た時、皮膚組織を採取して組織染色標本を作製した後、二光子顕微鏡（Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で蛍光を観察した。
【0079】
その結果、図９に示すように、ＨＡＬＮは、同じ皮膚組織の深さにおいてＣｙ５．５とｆｒｅｅ ＨＡに比べて蛍光の強度が強く、より深い所でも蛍光が観察された。このような結果は、ＨＡＬＮの経皮透過能に非常に優れていることを示唆する。
【0080】
４－２．ＨＡＬＮ－１～３の経皮透過能の比較
ＰＢＳを塗布した正常マウスと実験例３のように乾癬を誘導したマウスの背中皮膚にＣｙ５．５－ＨＡＬＮ－１～３をそれぞれ塗布した。以後、４時間経た時、皮膚組織を採取して蛍光顕微鏡で観察した。
ＰＢＳを塗布した正常マウスと実験例３のように乾癬を誘導したマウスの背中皮膚にＣｙ５．５－ＨＡＬＮ－１～３をそれぞれ塗布した。以後、４時間経た時、皮膚組織を採取して蛍光顕微鏡で観察した。
【0081】
その結果、図１０に示すように、乾癬動物モデルでは、正常マウスに比べてすべてのＨＡＬＮの経皮透過能が増加し、特にＨＡＬＮ－３の経皮透過能に最も優れていることが確認された。
【0082】
実験例５．ＨＡＬＮの経皮投与による濃度別の乾癬治療および予防効果
乾癬動物モデルを作製するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスが用いられた（グループあたり５匹）。正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されたマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発するために、毛の除去されたマウスの背中にアルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布した。塗布２日目からアルダラクリーム投与３時間前に筆を用いてＰＢＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＨＡＬＮ－３（０．５、２．５、５ｍｇ）を毎日１回ずつ３日間塗布した。５日目にすべてのマウスから皮膚組織と脾臓を採取した。
乾癬動物モデルを作製するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスが用いられた（グループあたり５匹）。正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されたマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発するために、毛の除去されたマウスの背中にアルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布した。塗布２日目からアルダラクリーム投与３時間前に筆を用いてＰＢＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＨＡＬＮ－３（０．５、２．５、５ｍｇ）を毎日１回ずつ３日間塗布した。５日目にすべてのマウスから皮膚組織と脾臓を採取した。
【0083】
実験例２と同様の方法でＰＡＳＩ点数を採点し、組織染色を行って皮膚の厚さと細胞増殖関連因子（Ｋｉ－６７およびＣＤ６８）および炎症性サイトカイン（ＩＬ－２３およびＩＬ－１７）の発現を測定した。
【0084】
その結果、図１１および１２に示すように、ＨＡＬＮを投与した場合には、濃度依存的に皮膚状態が好転し、細胞増殖関連因子および炎症性サイトカインが効果的に抑制されることが確認された。
【0085】
このような結果は、ＨＡＬＮが乾癬のような皮膚炎症疾患を治療するのに効果的であることを示唆する。
【0086】
また、乾癬動物モデルを作製するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスが用いられた（グループあたり５匹）。正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されたマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発する前に、毛の除去されたマウスの背中に筆を用いてＰＢＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＨＡＬＮ－３（２、１０ｍｇ）を毎日２回ずつ３時間間隔で４日間塗布した。薬物を塗布して３時間後、アルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布した。５日目にすべてのマウスから皮膚組織を採取した。
【0087】
実験例２と同様の方法でＰＡＳＩ点数を採点し、組織染色を行って皮膚の厚さと細胞増殖関連因子（Ｋｉ－６７およびＣＤ６８）および炎症性サイトカイン（ＩＬ－２３およびＩＬ－１７）の発現を測定した。
【0088】
その結果、図１３および１４に示すように、ＨＡＬＮを投与した場合には、濃度依存的に皮膚状態が好転し、細胞増殖関連因子および炎症性サイトカインが効果的に抑制されることが確認された。
【0089】
このような結果は、ＨＡＬＮが乾癬のような皮膚炎症疾患を予防するのに効果的であることを示唆する。
【0090】
実験例６．ＨＡＬＮの経皮投与による皮膚障壁機能の保護効果
正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されたマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発する前に、毛の除去されたマウスの背中に筆を用いてＰＢＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＨＡＬＮ－３（２、１０ｍｇ）を毎日２回ずつ３時間間隔で４日間塗布した。薬物を塗布して３時間後、アルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布した。５日目にすべてのマウスから皮膚組織を採取した。皮膚組織において皮膚障壁機能を示す標識物質（Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－１およびＳ１００Ａ９）を免疫染色法で染色した。
正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されたマウス（ＩＭＱ）とに区分した。乾癬を誘発する前に、毛の除去されたマウスの背中に筆を用いてＰＢＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＨＡＬＮ－３（２、１０ｍｇ）を毎日２回ずつ３時間間隔で４日間塗布した。薬物を塗布して３時間後、アルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布した。５日目にすべてのマウスから皮膚組織を採取した。皮膚組織において皮膚障壁機能を示す標識物質（Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－１およびＳ１００Ａ９）を免疫染色法で染色した。
【0091】
その結果、図１５に示すように、ＨＡＬＮ－３を投与した場合には、濃度依存的に乾癬誘導によって破壊された皮膚障壁機能を復旧させることが確認された。
【0092】
実験例７．ＨＡＬＮの大きさによる大食細胞の分極化抑制効果
ヒト由来単核球であるＴＨＰ－１細胞を６ウェルプレート（ＳＰＬ）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注すると同時に、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）５０ｎｇ／ｍｌを処理して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）が含有された培地（ＲＰＭＩ－１６４０）に交換した後、追加的に、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。
ヒト由来単核球であるＴＨＰ－１細胞を６ウェルプレート（ＳＰＬ）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注すると同時に、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）５０ｎｇ／ｍｌを処理して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）が含有された培地（ＲＰＭＩ－１６４０）に交換した後、追加的に、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。
【0093】
各ＨＡＬＮをＬＰＳとＩＦＮγが含まれた無血清培地（ＲＰＭＩ－１６４０）で希釈して５０μｇ／ｍｌの濃度にして１ｍｌをＴＨＰ－１細胞に処理した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で４時間培養した。実験が完了した細胞はトリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｅｎｔｅｒ）を用いてＲＮＡを分離した後、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて２６０／２８０ ｒａｔｉｏ ２．０以上の収率を有するサンプルを分析に使用した。分離されたＲＮＡは逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）でｃＤＮＡ鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を合成し、ｃＤＮＡ鋳型を各遺伝子に特異的なヌクレオチドプライマー（下記表１参照）を用いてＳＹＢＲ－ＧＲＥＥＮを入れて、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ－Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＣＦＸ ｃｏｎｎｅｔＴＭ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で増幅してｑＰＣＲを行った。
【0094】
【表1】
【0095】
その結果、図１６ａに示すように、ＨＡＬＮ－１～３は、ＬＰＳおよびＩＦＮγによって増加したＭ１大食細胞特異的な遺伝子の発現をすべて減少させ、特に大きさが最も小さいＨＡＬＮ－３がＭ１大食細胞への分極化を最も効果的に抑制することを確認した。
【0096】
また、ＨＡＬＮ－３をＬＰＳとＩＦＮγが含まれた無血清培地（ＲＰＭＩ－１６４０）で希釈して０、２５、５０、１００μｇ／ｍｌの濃度にして１ｍｌをＴＨＰ－１細胞に処理した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で４８時間培養した。処理の完了した細胞はＰＢＳで１回洗浄した後、細胞分離溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ）を用いて細胞培養皿（ｄｉｓｈ）から離した後、遠心分離して回収された細胞を各ＦＡＣＳ ｔｕｂｅあたり５×１０５細胞ずつ入れた後、反応溶液（ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＦＢＳおよび２％ＢＳＡ含有）で１回洗浄する。その後、Ｍ１大食細胞の標識物質（ｍａｒｋｅｒ）であるＣＤ８６を含む反応溶液を入れて、４℃の暗室条件で１時間反応させた。その後、反応溶液を用いて細胞を３回洗浄後、反応溶液３００μｌを入れて細胞がかたまらないように分散させた後、フローサイトメーター（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＡＰＣの蛍光を測定した。
【0097】
その結果、図１６ｂに示すように、ＬＰＳおよびＩＦＮγによって増加したＭ１大食細胞のＣＤ８６発現量は、ＨＡＬＮ－３の濃度に依存的に減少することを確認した。このような結果は、ＨＡＬＮ－３がＭ１大食細胞の分極化を効果的に抑制することを示唆する。
【0098】
実施例２．ヒアルロン酸－コラン酸複合体（ＨＡＣＮ）の製造
２－１．コラン酸のアミノ化
５β－コラン酸（５β－ｃｈｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ、ＣＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇをメタノール２０ｍＬに溶解した後、ＨＣｌ（１２Ｎ）１８０μＬを入れて、７０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応が終了すると、溶媒を減圧蒸留して除去し、生成された固体状態の１次生成物を水で希釈し、沈殿物を減圧濾過して得た後、これを真空状態で乾燥させて、最終的にメチルエステル形態のＣＡを得た。メチルエステル－ＣＡ９２５ｍｇはエチレンジアミン（ＴＣＩ）１５ｍＬに溶解させた後、１３０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応終了後、エチレンジアミンを減圧蒸留して除去し、生成された２次生成物を水で希釈した後、沈殿した物質を減圧濾過して得た。これを乾燥させて、最終的にアミノ化されたＣＡを得た。
２－１．コラン酸のアミノ化
５β－コラン酸（５β－ｃｈｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ、ＣＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇをメタノール２０ｍＬに溶解した後、ＨＣｌ（１２Ｎ）１８０μＬを入れて、７０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応が終了すると、溶媒を減圧蒸留して除去し、生成された固体状態の１次生成物を水で希釈し、沈殿物を減圧濾過して得た後、これを真空状態で乾燥させて、最終的にメチルエステル形態のＣＡを得た。メチルエステル－ＣＡ９２５ｍｇはエチレンジアミン（ＴＣＩ）１５ｍＬに溶解させた後、１３０℃で８時間還流条件で撹拌した。反応終了後、エチレンジアミンを減圧蒸留して除去し、生成された２次生成物を水で希釈した後、沈殿した物質を減圧濾過して得た。これを乾燥させて、最終的にアミノ化されたＣＡを得た。
【0099】
２－２．ヒアルロン酸－コラン酸複合体（ＨＡＣＮ）
１０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）１２０ｍｇ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ）をホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍＬに溶かした。以後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＴＣＩ）とＮ－ヒドロスクシンイミドを入れて、３０分間撹拌してＨＡ混合液を用意した。そして、ＤＳ値が３に合ったＦｅｅｄ Ｒａｔｉｏ量のアミノ化されたＣＡ（２９．４ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５ｍＬに溶かした後、この溶液を点滴してＨＡ混合液に入れた。生成された１次混合物を常温で２４時間撹拌した。反応終了後、３５Ｋ ＭＷＣＯ透析バッグ（ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メタノール単独溶媒で２日、メタノール：蒸留水混合溶媒（ｖ：ｖ＝１：１）で１日、蒸留水単独溶媒で２日間透析した。透析が終わった後、反応混合物を５０秒間音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した（１０秒作動、１秒休止）。音波処理後、混合物を０．８μｍの注射器フィルタで濾過した。濾過した溶液を凍結乾燥して、最終的にヒアルロン酸－コラン酸複合体（ＨＡＣＮ）を得た。
１０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）１２０ｍｇ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ）をホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍＬに溶かした。以後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＴＣＩ）とＮ－ヒドロスクシンイミドを入れて、３０分間撹拌してＨＡ混合液を用意した。そして、ＤＳ値が３に合ったＦｅｅｄ Ｒａｔｉｏ量のアミノ化されたＣＡ（２９．４ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５ｍＬに溶かした後、この溶液を点滴してＨＡ混合液に入れた。生成された１次混合物を常温で２４時間撹拌した。反応終了後、３５Ｋ ＭＷＣＯ透析バッグ（ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メタノール単独溶媒で２日、メタノール：蒸留水混合溶媒（ｖ：ｖ＝１：１）で１日、蒸留水単独溶媒で２日間透析した。透析が終わった後、反応混合物を５０秒間音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した（１０秒作動、１秒休止）。音波処理後、混合物を０．８μｍの注射器フィルタで濾過した。濾過した溶液を凍結乾燥して、最終的にヒアルロン酸－コラン酸複合体（ＨＡＣＮ）を得た。
【0100】
２－３．ＨＡＣＮ特性分析
ＨＡＣＮの化学的特性は６００ＭＨｚの核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）実験により分析し、分析時、溶媒は重水素化されたメタノール（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ）：酸化重水素（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｏｘｉｄｅ）＝１：１（ｖ：ｖ）で測定した。動的光散乱器（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）（ＥＬＳ－Ｚ、Ｏｔｓｕｋａ）を活用して生成されたＨＡＣＮの大きさとゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。測定時には、ＨＡＣＮをＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かして測定した。
ＨＡＣＮの化学的特性は６００ＭＨｚの核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）実験により分析し、分析時、溶媒は重水素化されたメタノール（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ）：酸化重水素（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｏｘｉｄｅ）＝１：１（ｖ：ｖ）で測定した。動的光散乱器（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）（ＥＬＳ－Ｚ、Ｏｔｓｕｋａ）を活用して生成されたＨＡＣＮの大きさとゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。測定時には、ＨＡＣＮをＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かして測定した。
【0101】
その結果、図１７に示すように、乾燥したＨＡＣＮをＰＢＳに分散させると、コラン酸の官能基が互いに凝集して球状に存在した。このようなＨＡＣＮのＤＳ（ＣＡの置換度）、大きさおよびゼータ電位（ζ）は下記表２の通りである。
【0102】
【表2】
【0103】
実験例８．ＨＡＣＮの経皮透過能分析
ＰＢＳを塗布した正常マウスと乾癬を誘発したマウスの背中皮膚を経皮吸収セルに固定させた後、皮膚組織上にＣｙ５．５－ＨＡＣＮ（０．３ｍｌ）を塗布した。乾癬は毛の除去されたマウスの背中にアルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布して誘発した。Ｃｙ５．５－ＨＡＣＮの塗布後１、４および１２時間目に皮膚組織を採取して各組織を４％ＰＦＡで固定した後、パラフィンブロックを作製し、０．４ｕｍの切片にスライドを作製して組織染色標本を用意した。そして、ＤＡＰＩ染色後、蛍光顕微鏡で皮膚組織を観察した。
ＰＢＳを塗布した正常マウスと乾癬を誘発したマウスの背中皮膚を経皮吸収セルに固定させた後、皮膚組織上にＣｙ５．５－ＨＡＣＮ（０．３ｍｌ）を塗布した。乾癬は毛の除去されたマウスの背中にアルダラクリーム（Ａｌｄａｒａ ｃｒｅａｍ）６２．５ｍｇを毎日１回ずつ４日間塗布して誘発した。Ｃｙ５．５－ＨＡＣＮの塗布後１、４および１２時間目に皮膚組織を採取して各組織を４％ＰＦＡで固定した後、パラフィンブロックを作製し、０．４ｕｍの切片にスライドを作製して組織染色標本を用意した。そして、ＤＡＰＩ染色後、蛍光顕微鏡で皮膚組織を観察した。
【0104】
その結果、図１８に示すように、正常マウス（ＰＢＳ）の皮膚では、時間が経過するほど、Ｃｙ５．５－ＨＡＣＮが皮膚を浸透したことが観察された。乾癬が誘導されたマウス（ＩＭＱ）では、正常マウスに比べて同じ時間条件で蛍光強度が強くなり、乾癬皮膚においてＨＡＣＮの経皮透過能により優れていることを確認した。
【0105】
実験例９．ＨＡＣＮの大食細胞依存的乾癬治療効果
７～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにクロドロネートリポソーム（Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を２００μｌ／匹（１．４ｍｇ）で１次腹腔内注射した後、４日目に１００μｌ／匹（０．７ｍｇ）で２次腹腔内注射して大食細胞の欠乏を誘導した。１次注射後、翌日に背中部分を除毛した後、１日猶予期間をおいてアルダラクリーム６２．５ｍｇを背中に毎日１回ずつ５日間塗布して乾癬皮膚疾患モデルを誘導した。ＨＡＣＮまたはＰＢＳはアルダラクリームを塗布する２時間前に、尾静脈注射で同じ期間投与した（グループあたり５匹）。乾癬誘導の初日と最終日に乾癬誘導部位を写真で残して比較し、毎日各個体のＰＡＳＩ点数を測定してこれを比較した。背中皮膚を切開して４％ＰＦＡで固定した後、パラフィンブロックを作製し、４ｕｍの厚さに切断して皮膚組織標本スライドを作製した。Ｈ＆Ｅ染色により表皮の厚さを測定し、Ｋｉ－６７染色により皮膚細胞増殖と炎症性サイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－２３およびＩＬ－１７染色により炎症反応の程度を測定した。
７～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにクロドロネートリポソーム（Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を２００μｌ／匹（１．４ｍｇ）で１次腹腔内注射した後、４日目に１００μｌ／匹（０．７ｍｇ）で２次腹腔内注射して大食細胞の欠乏を誘導した。１次注射後、翌日に背中部分を除毛した後、１日猶予期間をおいてアルダラクリーム６２．５ｍｇを背中に毎日１回ずつ５日間塗布して乾癬皮膚疾患モデルを誘導した。ＨＡＣＮまたはＰＢＳはアルダラクリームを塗布する２時間前に、尾静脈注射で同じ期間投与した（グループあたり５匹）。乾癬誘導の初日と最終日に乾癬誘導部位を写真で残して比較し、毎日各個体のＰＡＳＩ点数を測定してこれを比較した。背中皮膚を切開して４％ＰＦＡで固定した後、パラフィンブロックを作製し、４ｕｍの厚さに切断して皮膚組織標本スライドを作製した。Ｈ＆Ｅ染色により表皮の厚さを測定し、Ｋｉ－６７染色により皮膚細胞増殖と炎症性サイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－２３およびＩＬ－１７染色により炎症反応の程度を測定した。
【0106】
その結果、図１９～２１に示すように、クロドロネートを処理しないグループ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）では、ＨＡＣＮがＰＡＳＩ点数および表皮の厚さを減少させ、皮膚細胞増殖および炎症反応を抑制することにより、乾癬治療効果があることが確認された。しかし、クロドロネートを処理したグループでは、大食細胞が欠乏してＨＡＣＮによる乾癬治療効果が減少した。このような結果は、ＨＡＣＮの乾癬治療効果が大食細胞に依存的であることを示唆する。
【0107】
実験例１０．ＨＡＣＮの大食細胞の分極化抑制効果
ＨＡＬＮの代わりにＨＡＣＮ０、１０、２５、５０μｇ／ｍｌを使用し、表１のプライマーの代わりに下記表３のプライマーを用いたことを除けば、実験例７と同様の方法でｑＰＣＲを行った。
ＨＡＬＮの代わりにＨＡＣＮ０、１０、２５、５０μｇ／ｍｌを使用し、表１のプライマーの代わりに下記表３のプライマーを用いたことを除けば、実験例７と同様の方法でｑＰＣＲを行った。
【0108】
【表3】
【0109】
その結果、図２２ａに示すように、ＨＡＣＮは、ＬＰＳおよびＩＦＮγによって増加したＭ１大食細胞特異的な遺伝子の発現を濃度依存的にすべて減少させて、ＨＡＣＮがＴＨＰ－１大食細胞の分極化を抑制することを確認した。
【0110】
また、ＨＡＬＮの代わりにＨＡＣＮ０、１０、２５、５０μｇ／ｍｌを用いることを除けば、実験例７と同様の方法でＡＰＣ蛍光を測定した。
【0111】
その結果、図２２ｂに示すように、ＬＰＳおよびＩＦＮγによって増加したＭ１大食細胞のＣＤ８６発現量は、ＨＡＣＮの濃度に依存的に減少することを確認した。このような結果は、ＨＡＣＮがＭ１大食細胞の分極化を効果的に抑制することを示唆する。
【0112】
実験例１１．ＨＡＣＮとＴＬＲ４の相互作用分析
１１－１．表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）
分析チップにターゲット受容体を固定するために、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶媒を流すと同時に、組換え（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＴＬＲ４を一緒に流すことにより、受容体をチップ上に固定させた。その後、エタノールアミンを流してチップに弱く固定されていたり、あるいは固定できない受容体を除去した。完成した組換えＴＬＲ４が結合したチップ上にそれぞれＰＢＳと、ＰＢＳを溶媒として用いたＨＡＣＮと１０ｋＤａ ｆｒｅｅ ＨＡをそれぞれ０、２５、５０、１００、２００、４００、８００μｇ／ｍｌの濃度で１０μｌ／ｍｉｎずつ流し、１２０秒間ＲＵ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ）値の変化を観察した。
１１－１．表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）
分析チップにターゲット受容体を固定するために、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶媒を流すと同時に、組換え（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＴＬＲ４を一緒に流すことにより、受容体をチップ上に固定させた。その後、エタノールアミンを流してチップに弱く固定されていたり、あるいは固定できない受容体を除去した。完成した組換えＴＬＲ４が結合したチップ上にそれぞれＰＢＳと、ＰＢＳを溶媒として用いたＨＡＣＮと１０ｋＤａ ｆｒｅｅ ＨＡをそれぞれ０、２５、５０、１００、２００、４００、８００μｇ／ｍｌの濃度で１０μｌ／ｍｉｎずつ流し、１２０秒間ＲＵ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ）値の変化を観察した。
【0113】
その結果、図２３に示すように、ＨＡＣＮの濃度増加に伴ってＲＵ値が一緒に増加することを確認することができ、これによりＴＬＲ４とＨＡＣＮとが互いに相互作用することを確認することができた。これに対し、対照群として用いられたＰＢＳまたは１０ｋＤａ ｆｒｅｅ ＨＡのみを流したグループでは、ＨＡＣＮグループから確認されたＲＵ値の増加が確認されなかった。したがって、ＴＬＲ４との結合はＨＡＣＮの固有の特徴であることが分かる。
【0114】
１１－２．蛍光細胞分析法
ＴＨＰ－１細胞を３５ｍｍの細胞培養皿（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）（ＳＰＬ）に細胞数が５×１０５となるように分注し、同時にＰＭＡ５０ｎｇ／ｍｌを処理して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、１０％ＦＢＳが含有された培地（ＲＰＭＩ－１６４０）に交換した後、追加的に、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。ＨＡＣＮと１０ｋＤａ ｆｒｅｅ ＨＡを無血清培地（ＲＰＭＩ－１６４０）で希釈して、それぞれ０、１０、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度にして用意した。用意された希釈溶液１ｍｌを細胞に処理した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で１時間培養した。その後、細胞培養液に蛍光物質のＣｙ５．５が結合したＬＰＳ（Ｃｙ５．５－ｌａｂｌｅｄ ＬＰＳ）とＨＡＣＮを追加的に１ｍｌ処理した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で３０分間追加的に培養した。実験完了した細胞は冷たいＰＢＳで洗浄した後、４％ＰＦＡで固定した。固定完了した細胞は蛍光顕微鏡を用いて傾向性を分析した。
ＴＨＰ－１細胞を３５ｍｍの細胞培養皿（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）（ＳＰＬ）に細胞数が５×１０５となるように分注し、同時にＰＭＡ５０ｎｇ／ｍｌを処理して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、１０％ＦＢＳが含有された培地（ＲＰＭＩ－１６４０）に交換した後、追加的に、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。ＨＡＣＮと１０ｋＤａ ｆｒｅｅ ＨＡを無血清培地（ＲＰＭＩ－１６４０）で希釈して、それぞれ０、１０、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度にして用意した。用意された希釈溶液１ｍｌを細胞に処理した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で１時間培養した。その後、細胞培養液に蛍光物質のＣｙ５．５が結合したＬＰＳ（Ｃｙ５．５－ｌａｂｌｅｄ ＬＰＳ）とＨＡＣＮを追加的に１ｍｌ処理した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で３０分間追加的に培養した。実験完了した細胞は冷たいＰＢＳで洗浄した後、４％ＰＦＡで固定した。固定完了した細胞は蛍光顕微鏡を用いて傾向性を分析した。
【0115】
その結果、図２４に示すように、ＴＨＰ－１大食細胞においてＣｙ５．５－ｌａｂｌｅｄ ＬＰＳの結合はＨＡＣＮの濃度に依存的に減少するが、１０ｋＤａ ｆｒｅｅ ＨＡによっては減少しなかった。このような結果は、ＨＡＣＮがＬＰＳと競合的にＴＬＲ４に結合してＬＰＳによるＴＬＲ４の活性化を抑制することを示唆する。
【0116】
実施例３．ヒアルロン酸－コレステロール複合体（ＨＡＣＨＮ）の製造
３－１．コレステロールのアミノ化
コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇ、Ｎ－Ｂｏｃ－グリシン（Ｎ－Ｂｏｃ－ｇｌｙｃｉｎｅ、Ａｌｆａ ａｅｓａｒ）５４４ｍｇ、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）６４０ｍｇ、ＤＭＡＰ（４－（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ、Ａｌｆａ ａｅｓａｒ）４７．４ｍｇをジクロロメタン２５ｍＬに溶解した後、２５℃で２４時間撹拌した。反応が終了した後、真空状態で乾燥させて、液相クロマトグラフィー（ヘキサン：エチルアセテート＝１：１０）で分離した。これを乾燥させて、最終的にＢｏｃ－Ｇｌｙ－コレステロールを得た。次に、Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－コレステロール１．０９ｇをジクロロメタン２０ｍＬに溶解した後、４Ｎ塩酸１，４－ジオキサン溶液５ｍＬを添加して、２５℃で１時間撹拌した。反応が終了した後、真空状態で乾燥させて、最終的にアミノ化されたコレステロールを得た。
３－１．コレステロールのアミノ化
コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇ、Ｎ－Ｂｏｃ－グリシン（Ｎ－Ｂｏｃ－ｇｌｙｃｉｎｅ、Ａｌｆａ ａｅｓａｒ）５４４ｍｇ、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）６４０ｍｇ、ＤＭＡＰ（４－（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ、Ａｌｆａ ａｅｓａｒ）４７．４ｍｇをジクロロメタン２５ｍＬに溶解した後、２５℃で２４時間撹拌した。反応が終了した後、真空状態で乾燥させて、液相クロマトグラフィー（ヘキサン：エチルアセテート＝１：１０）で分離した。これを乾燥させて、最終的にＢｏｃ－Ｇｌｙ－コレステロールを得た。次に、Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－コレステロール１．０９ｇをジクロロメタン２０ｍＬに溶解した後、４Ｎ塩酸１，４－ジオキサン溶液５ｍＬを添加して、２５℃で１時間撹拌した。反応が終了した後、真空状態で乾燥させて、最終的にアミノ化されたコレステロールを得た。
【0117】
３－２．ヒアルロン酸－コレステロール複合体（ＨＡＣＨＮ）
１０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）１２０ｍｇ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）をホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍＬに溶かした。以後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＴＣＩ）とＮ－ヒドロスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れて、それぞれ２０分間撹拌してＨＡ混合液を用意した。そして、ＤＳ値が２に合ったＦｅｅｄ Ｒａｔｉｏ量のアミノ化されたコレステロール（７０．１ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５ｍＬにトリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＣＩ）と一緒に溶かした後、この溶液を点滴してＨＡ混合液に入れた。生成された１次混合物を常温で２４時間撹拌した。反応終了後、３．５Ｋ ＭＷＣＯ透析バッグ（ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メタノール単独溶媒で２日、メタノール：蒸留水混合溶媒（ｖ：ｖ＝１：１）で１日、蒸留水単独溶媒で２日間透析した。透析が終わった後、反応混合物を５０秒間音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した（１０秒作動、１秒休止）。音波処理後、混合物を０．８μｍの注射器フィルタで濾過した。濾過した溶液を凍結乾燥して、最終的にヒアルロン酸－コレステロール複合体（ＨＡ－Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＨＡＣＨＮ）を得た。
１０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）１２０ｍｇ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）をホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍＬに溶かした。以後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＴＣＩ）とＮ－ヒドロスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れて、それぞれ２０分間撹拌してＨＡ混合液を用意した。そして、ＤＳ値が２に合ったＦｅｅｄ Ｒａｔｉｏ量のアミノ化されたコレステロール（７０．１ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５ｍＬにトリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＣＩ）と一緒に溶かした後、この溶液を点滴してＨＡ混合液に入れた。生成された１次混合物を常温で２４時間撹拌した。反応終了後、３．５Ｋ ＭＷＣＯ透析バッグ（ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メタノール単独溶媒で２日、メタノール：蒸留水混合溶媒（ｖ：ｖ＝１：１）で１日、蒸留水単独溶媒で２日間透析した。透析が終わった後、反応混合物を５０秒間音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した（１０秒作動、１秒休止）。音波処理後、混合物を０．８μｍの注射器フィルタで濾過した。濾過した溶液を凍結乾燥して、最終的にヒアルロン酸－コレステロール複合体（ＨＡ－Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＨＡＣＨＮ）を得た。
【0118】
３－３．ＨＡＣＨＮ特性分析
ＨＡＣＨＮの１Ｈ ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）ｓｐｅｃｔｒａは６００ＭＨｚの核磁気共鳴分光器（ＪＮＭ－ＥＣＺ ６００Ｒ、ＪＥＯＬ）実験により分析し、分析時、溶媒は重水素化されたメタノール（ＭＥＴＨＡＮＯＬ－Ｄ６）：酸化重水素（ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ ＯＸＩＤＥ）＝１：１（ｖ：ｖ）で測定した。動的光散乱器（ＥＬＳ－Ｚ、Ｏｔｓｕｋａ）を活用して生成されたＨＡＣＨＮの大きさとゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。測定時には、ＨＡＣＨＮをＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かして測定した。その結果、乾燥したＨＡＣＨＮをＰＢＳに分散させると、コレステロールの官能基が互いに凝集して球状に存在した。このようなＨＡＣＨＮのＤＳ（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの置換度）、大きさおよびゼータ電位（ζ）は下記表４の通りである。
ＨＡＣＨＮの１Ｈ ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）ｓｐｅｃｔｒａは６００ＭＨｚの核磁気共鳴分光器（ＪＮＭ－ＥＣＺ ６００Ｒ、ＪＥＯＬ）実験により分析し、分析時、溶媒は重水素化されたメタノール（ＭＥＴＨＡＮＯＬ－Ｄ６）：酸化重水素（ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ ＯＸＩＤＥ）＝１：１（ｖ：ｖ）で測定した。動的光散乱器（ＥＬＳ－Ｚ、Ｏｔｓｕｋａ）を活用して生成されたＨＡＣＨＮの大きさとゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。測定時には、ＨＡＣＨＮをＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かして測定した。その結果、乾燥したＨＡＣＨＮをＰＢＳに分散させると、コレステロールの官能基が互いに凝集して球状に存在した。このようなＨＡＣＨＮのＤＳ（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの置換度）、大きさおよびゼータ電位（ζ）は下記表４の通りである。
【0119】
【表4】
【0120】
実験例１２．ＨＡＣＨＮを含む様々な種類のヒアルロン酸複合体の皮膚疾患治療効果分析
雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス２８匹を、正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されたマウス（ＩＭＱ）とに区分した。試薬としてアルダラクリーム、ＰＢＳ、ＨＡＬＮ、１０ｋ－ＨＡＬＮ、１０ｋ－ＨＡＣＮ、１０ｋ－ＨＡＣＨＮを下記のように用意した。
ＨＡＬＮ：分子量６０ｋＤａのヒアルロン酸＋リソコール酸（リトコール酸）
１０ｋ－ＨＡＬＮ：分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸＋リソコール酸
１０ｋ－ＨＡＣＮ：分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸＋コラン酸
１０ｋ－ＨＡＣＨＮ：分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸＋コレステロール
雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス２８匹を、正常マウス（ＣＯＮ）と乾癬が誘発されたマウス（ＩＭＱ）とに区分した。試薬としてアルダラクリーム、ＰＢＳ、ＨＡＬＮ、１０ｋ－ＨＡＬＮ、１０ｋ－ＨＡＣＮ、１０ｋ－ＨＡＣＨＮを下記のように用意した。
ＨＡＬＮ：分子量６０ｋＤａのヒアルロン酸＋リソコール酸（リトコール酸）
１０ｋ－ＨＡＬＮ：分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸＋リソコール酸
１０ｋ－ＨＡＣＮ：分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸＋コラン酸
１０ｋ－ＨＡＣＨＮ：分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸＋コレステロール
【0121】
乾癬を誘発するために、対照群（ＣＯＮ）を除いた各グループのマウスにアルダラクリームを６２．５ｍｇずつ毎日１回ずつ４日間塗布した。この時、アルダラクリームを塗布する６時間前に各グループのマウスに当該薬物を背中皮膚に筆を用いて塗布し、ＨＡナノ粒子複合体はＰＢＳに溶かした後、２ｍｇを塗布した。５日目にすべてのマウスから皮膚組織を得て分析した。
【0122】
分析方法としては、Ｓｃｏｒｅ方法として「０、ｎｏｎｅ；１、ｓｌｉｇｈｔ；２、ｍｏｄｅｒａｔｅ；３、ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ；および４、ｖｅｒｙ ｗｅｌｌ ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ」のＰｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）分析方法に従い、組織染色方法としては、組織を固定およびエンベディング（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）して０．４μｍにセクションの後、ヘマトキシリン、エオシン、そしてＤＡＢ染色キットと抗体を用いて染色し分析した。Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ測定方法は、［Ｉｍａｇｅ Ｊ］プログラムとＬｅｉｃａ ＤＭｉ８ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて分析し、各組織の３つの部分のイメージ値の平均を用いた。
【0123】
その結果、図２５および２６のように、他の種類の疎水性物質が結合したヒアルロン酸複合体をそれぞれ適用した群においてすべて、ＰＡＳＩ ｓｃｏｒｅ、皮膚の厚さ、皮膚細胞増殖および炎症反応を減少させて皮膚疾患の効果があることが確認された。
【0124】
まとめると、本発明によるヒアルロン酸と疎水性物質とが結合したヒアルロン酸複合体は、ヒアルロン酸分解酵素に強い抵抗性および経皮透過能を有し、特に、複合体の大きさが小さいほど、経皮透過能に優れ、皮膚障壁機能の保護または回復、細胞増殖関連因子および炎症性サイトカインの発現抑制、Ｍ１大食細胞の分極化抑制に対する優れた効果とＴＬＲ４シグナル伝達を遮断する作用により、乾癬、悪性黒色腫、細菌性および真菌性炎症、自己免疫疾患などの多様な皮膚疾患を予防または治療するのに効果的であることが分かる。
【0125】
これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれると解釈されなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0126】
本発明は、ヒアルロン酸複合体を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物に関し、多様な皮膚疾患治療剤として活用可能であり、産業上の利用可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
【国際調査報告】