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特表2024-519943ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240514BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240514BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240514BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240514BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240514BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240514BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240514BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240514BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240514BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240514BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240514BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240514BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240514BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/13
C12N5/0783
C12N5/10
C07K16/28
C07K14/47
A61K38/16
A61K48/00
A61K35/17
A61P37/02
A61P37/06
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572071
(86)(22)【出願日】2022-05-19
(85)【翻訳文提出日】2023-11-17
(86)【国際出願番号】 CN2022093782
(87)【国際公開番号】W WO2022242710
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/094605
(32)【優先日】2021-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522318966
【氏名又は名称】上海詩健生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＥＳＣＵＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ７１０，Ｎｏ．７８１ Ｃａｉｌｕｎ Ｒｄ，Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】523437352
【氏名又は名称】広州茵諾莱生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＹＩＮＮＵＯＬＡＩ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｃ４， Ｒｏｏｍ ８７６， Ｖａｎｋｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｐｌａｚａ， Ｈｕａｇｕａｎ Ｒｏａｄ １９９３， Ｔｉａｎｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０６５３， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】張新敏
(72)【発明者】
【氏名】粘偉紅
(72)【発明者】
【氏名】許伝営
(72)【発明者】
【氏名】何峰
(72)【発明者】
【氏名】周清
(72)【発明者】
【氏名】張剣氷
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA02
4C084BA41
4C084NA14
4C084ZB07
4C084ZB08
4C084ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB08
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本出願は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子、前記受容体分子をコードする核酸、前記受容体分子を含む操作された免疫エフェクター細胞、医薬組成物、及びそれらの使用を開示する。前記受容体分子は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するドメインと活性化刺激ドメインとを含み、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識して結合した後に下流のシグナル伝達経路を活性化し、ＢＡＦＦ－Ｒに対する免疫応答反応を引き起こし、促進し、または増強することができ、最終的にはＢ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患を治療または予防する目的を達成することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
特異的認識ドメイン、活性化刺激ドメイン、及び前記特異的認識ドメインと前記活性化刺激ドメインとの間に位置する膜貫通ドメインを含む、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子であって、前記特異的認識ドメインが、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、及びＣＤＲ Ｈ３を含み、前記ＣＤＲ Ｈ１が配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｈ２が配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｈ３が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域が、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、及びＣＤＲ Ｌ３を含み、前記ＣＤＲ Ｌ１が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｌ２が配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｌ３が配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項2】
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域がさらにヒト抗体フレームワーク領域を含む、請求項１に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項3】
前記重鎖可変領域が、配列番号５に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号９に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項4】
前記重鎖可変領域が前記軽鎖可変領域に連結されてｓｃＦｖを形成し、前記ｓｃＦｖが、配列番号４に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項5】
前記活性化刺激ドメインがシグナル伝達ドメインを含み、前記シグナル伝達ドメインが免疫受容体チロシン活性化モチーフを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項6】
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲ１β、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０もしくはＤＡＰ１２分子の細胞内領域のシグナル伝達ドメイン、または同じ機能を保持するそれらのバリアントを含む、請求項５に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項7】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項8】
前記活性化刺激ドメインが、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項9】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴＲ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドのうちの１つ以上の分子の細胞内領域に由来する、請求項８に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項10】
前記共刺激ドメインが、配列番号１８に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項11】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８もしくはＣＤ３ζの膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン、または同じ機能を保持するそのバリアントを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項12】
前記膜貫通ドメインが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項13】
前記膜貫通ドメインと前記特異的認識ドメインとはヒンジ領域を介して連結されており、前記ヒンジ領域はＩｇＧ、ＩｇＤ、またはＣＤ８α／ＣＤ２８のヒンジ領域から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項14】
前記ヒンジ領域が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子をコードする核酸分子。
【請求項16】
配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項17】
膜局在シグナルペプチド分子のコード配列をさらに含む、請求項１５または１６に記載の核酸分子。
【請求項18】
膜局在シグナルペプチド分子のコード配列が、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項19】
配列番号１、配列番号３、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９のポリヌクレオチド配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を、５’末端から３’末端にこの順に含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項20】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子及び／または請求項１５～１９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項21】
ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項２０に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項22】
治療有効量の、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の核酸分子、及び／または請求項２０もしくは２１に記載の操作された免疫エフェクター細胞を含む、医薬組成物。
【請求項23】
請求項２２に記載の医薬組成物を受験者に投与することを含む、それを必要とする前記受験者における疾患を治療または予防する方法であって、前記疾患がＢ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患から選択される、方法。
【請求項24】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片対宿主病、及び腫瘍を含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【ＡＳＣＩＩテキスト形式での配列表の提出】
【0001】
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルで提出された全内容は、参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：ＴＰＦ０２３２４－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、記録日：２０２２年５月１２日、サイズ：１２ＫＢ）。
【技術分野】
【0002】
本出願は、操作された特異的抗原認識受容体分子、及びその受容体分子を含む操作された免疫エフェクター細胞に関する。
【背景技術】
【0003】
最近数十年で、従来の腫瘍治療法（手術、化学療法、放射線療法など）は大きく進歩したが、生存率、再発、転移などの点では依然として大きな課題が残されている。腫瘍生物学と免疫学の研究の急速な発展に伴い、近年、免疫療法は腫瘍治療の新たなスターとなりつつある。中でも、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）療法は、現在最も有望な腫瘍免疫療法の１つとなっている。
【0004】
Ｔリンパ球は腫瘍免疫応答において主要な役割を果たし、腫瘍細胞に対して極めて強力な殺傷能力を持っているが、その役割を果たすにはＭＨＣ拘束性を有する。遺伝子工学的手法を使用して、ＭＨＣ非拘束的に標的抗原を認識する単鎖抗体を、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及びＴ細胞活性化モチーフなどと連結してＣＡＲ構造に組み立て、ウイルスなどのベクターによりＣＡＲ構造をＴ細胞に組み込み、最終的にＴ細胞が腫瘍細胞表面関連抗原に特異的に結合して活性化されるようにし、すなわち、ＣＡＲ－Ｔとする。ＣＡＲ－Ｔは、パーフォリン、グランザイムＢなどを放出することで腫瘍細胞を直接殺すが、活性化されたＣＡＲ－Ｔはさらにサイトカインを放出し、ヒト体内の内因性免疫細胞を動員して腫瘍細胞を殺し、腫瘍を効果的に阻害するという目的を達成する。同時に、免疫メモリーＴ細胞も形成されて、特異的な抗腫瘍の長時間作用機構を獲得することもできる。
【0005】
一般に、キメラ抗原受容体は細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び活性化刺激ドメインから構成される。通常、細胞外ドメインは、抗原認識ドメインと、連結の役割を果たすヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）とから構成される。抗原認識ドメインは、ＣＡＲが腫瘍抗原に特異的に結合するための基盤であり、その主な構造はｓｃＦｖであり、通常はモノクローナル抗体の軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）がポリペプチドを介して連結されてなり、抗原に対する抗体の特異性及び親和性を保持している。ヒンジ領域はｓｃＦｖと膜貫通ドメインとを連結し、ほとんどのＣＡＲのヒンジ領域はＩｇＧのヒンジまたはＣＤ８α／ＣＤ２８細胞外領域に由来している。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインを細胞内活性化刺激ドメインに連結し、受容体をＴ細胞膜にアンカーする。一般的に使用される膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、及びＣＤ３ζに由来する膜貫通ドメインを含む。活性化刺激ドメインは細胞内共刺激ドメインとシグナル伝達ドメインで構成され、共刺激ドメインは通常ＣＤ２８受容体ファミリー（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）または腫瘍壊死因子受容体ファミリー（４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７）に由来し、シグナル伝達ドメインは通常、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ、ＩＴＡＭ）を含むＴ細胞受容体ＴＣＲ／ＣＤ３ζ鎖である。活性化刺激ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達を媒介し、Ｔ細胞が活性化して増殖し、最終的に腫瘍の死滅を完了するまで、肝心な役割を果たす。
【0006】
Ｂ細胞悪性腫瘍は発生率の高い悪性腫瘍であり、世界中で毎年約３０万人の新規患者がおり、年間増加率は５％～７％である。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に広く使用されており、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、難治性Ｂ細胞悪性腫瘍に非常に効果的であり、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及びさまざまな非ホジキンリンパ腫サブタイプの患者における応答率は８０％～９０％と高い。しかし、長期的な有効性を示すのは患者の約４０％～５０％のみであり、ＣＤ１９のダウンレギュレーション／陰性再発は患者の約３０％で発生する。遺伝子修飾によって引き起こされるＣＤ１９発現のダウンレギュレーション、甚だしきに至っては完全な喪失、または他の形態への剪断によって引き起こされるＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞の認識不能などは、いずれもＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法に大きな課題をもたらす。Ｂ細胞悪性腫瘍の臨床予後は、免疫療法や分子標的薬の進歩により近年大幅に改善されているが、高い再発率が依然として問題となっている。したがって、Ｂ細胞の表面で高度に発現している他の抗原標的を探索することは、現在、再発及び難治性のＢ細胞悪性腫瘍を解決するための重要な研究方向である。
【0007】
腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーの１つであるＢリンパ球刺激因子（Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ、ＢＬｙＳと略称）は、ＴＮＦ及びＡｐｏＬ関連白血球発現リガンド１（ＴＮＦ－ ａｎｄ ＡｐｏＬ ｒｅｌａｔｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｌｉｇａｎｄ １、ＴＡＬＬ－１）とも呼ばれ、アポトーシス、核内因子－κＢ、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼを活性化するＴＮＦホモログ（ＴＮＦ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－κＢ ａｎｄ ｃ－Ｊｕｎ ＮＨ２－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ、ＴＨＡＮＫ）、腫瘍スーパーファミリーメンバー１３Ｂ（ＴＮＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、Ｂ細胞活性化因子（Ｂ ｃｅｌｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＢＡＦＦ）、及びｚＴＮＦ４は、Ｂ細胞に特異的に結合できるＩＩ型膜貫通タンパク質であり、Ｂ細胞の生存、増殖、発生及び分化において重要な役割を果たす。ＢＡＦＦには、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＢＡＦＦ－Ｒ）、Ｂ細胞成熟抗原（Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ、ＢＣＭＡ）、及び膜貫通活性化因子、カルシウムモジュレーターとシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＮＦＲ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒｇｒａｔｏｒ、ＴＡＣＩ）の３つの受容体があり、いずれもＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡとＴＡＣＩはＢＡＦＦに結合するだけでなく、ＴＮＦリガンドファミリーの別のメンバーである増殖誘導リガンド（ａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ、ＡＰＲＩＬ）にも結合できる一方、ＢＡＦＦ－ＲはＢＡＦＦの特異的受容体であり、Ｂリンパ球の制御において他の２つの受容体よりも重要な役割を果たす。
【0008】
ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｂ細胞活性化因子受容体）は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３Ｃ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）としても知られ、Ｂ細胞膜上のＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＴＮＦＲ）メンバーの１つであり、シグナルペプチドを欠くＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。公開されているヒトＢＡＦＦ－Ｒアミノ酸配列は、全長１８４アミノ酸であり、そのうち１～７８番目のアミノ酸が細胞外領域であり、７９～９９番目のアミノ酸が膜貫通ドメインであり、１００～１８４番目のアミノ酸が細胞内領域であり、そのコード遺伝子は染色体２２ｑ１３．１領域に位置する。ＢＡＦＦ－Ｒは主にＢ細胞で発現し、ＮＦ－κＢ経路を活性化することでＢ細胞の生存と増殖を促進し、さまざまなＢ細胞悪性腫瘍細胞の表面で高度に発現する。
【0009】
ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡は、自己免疫疾患、移植片対宿主病、及び腫瘍など、異常または正常細胞におけるＢＡＦＦ－Ｒの異常な高発現によって引き起こされる一連の病変を含む、生体の免疫の不均衡を引き起こす可能性がある。この標的は、Ｂ細胞成熟プロセスの幅広い段階をカバーしており、形質細胞疾患（多発性骨髄腫）を除くすべてのＢ細胞悪性疾患を標的にすることができ、適用範囲が広い。また、この標的は幹細胞やＢ前駆細胞には発現しないため、正常なＢ細胞の回復と機能の再構築に永久的な損傷を与えることはなく、安全性が優れている。
【0010】
免疫療法と分子標的薬の画期的な進歩により、Ｂ細胞悪性腫瘍の臨床予後は大幅に改善されたが、高い再発率が依然として問題となっている。したがって、再発及び難治性のＢ細胞悪性腫瘍を解決するには、Ｂ細胞の表面に高度に発現する他の抗原標的及び治療薬を探索する必要がある。
【発明の開示】
【0011】
本出願は、Ｂ細胞悪性腫瘍など、Ｂ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患に対して、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子（ＣＡＲ分子）、及び操作された免疫エフェクター細胞（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ））を提供する。研究により、本出願のＢＡＦＦ－Ｒ標的キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対する極めて強力な殺傷効果及びインビボでの抗腫瘍効果を有し、開発の可能性を有することが証明された。
【0012】
具体的には、本出願は以下のことに係る。
【0013】
１、特異的認識ドメインと、活性化刺激ドメインと、前記特異的認識ドメインと前記活性化刺激ドメインとの間に位置する膜貫通ドメインとを含む、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子であって、前記特異的認識ドメインが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0014】
２、前記特異的認識ドメインが、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、項１に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
配列番号６、配列番号７、配列番号８、から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、項１に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0015】
いくつかの実施形態において、本出願は、特異的認識ドメイン、活性化刺激ドメイン、及び前記特異的認識ドメインと前記活性化刺激ドメインとの間に位置する膜貫通ドメインを含む、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子に関し、ここで、前記特異的認識ドメインは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、及びＣＤＲ Ｈ３を含み、前記ＣＤＲ Ｈ１が配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｈ２が配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｈ３が配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、及びＣＤＲ Ｌ３を含み、前記ＣＤＲ Ｌ１が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｌ２が配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ Ｌ３が配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む。前記ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３及びＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３）に従って決定された。
【0016】
３、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域がさらにヒト抗体フレームワーク領域を含む、項２に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。いくつかの実施形態では、前記ヒト抗体フレームワーク領域は、ヒトユニバーサルフレームワーク領域である。いくつかの実施形態では、前記ヒトユニバーサルフレームワーク領域は、ＶＬのカッパＩサブグループ（κ Ｉ ｓｕｂｇｒｏｕｐ）フレームワーク配列及びＶＨのＩＩＩサブグループ（ＶＨ ＩＩＩ ｓｕｂｇｒｏｕｐ）フレームワーク配列を含む。前記フレームワーク領域は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３）に従って決定された。いくつかの実施形態では、前記ヒトユニバーサルフレームワーク領域は、１～１５、１～１０、２～９、３～８、４～７、または５～６個のアミノ酸変化を含む。
【0017】
４、前記重鎖可変領域が、配列番号５に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号９に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項２または３に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0018】
５、前記重鎖可変領域が前記軽鎖可変領域に連結されて（例えば、（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍからなるリンカーまたはコネクタなどのペプチド鎖を介して連結され、ここで、ｎまたはｍは１～１０の任意の整数であり得る）ｓｃＦｖを形成し、前記ｓｃＦｖが、配列番号４に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項４に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0019】
６、前記活性化刺激ドメインが、免疫受容体チロシン活性化モチーフを含有するシグナル伝達ドメインを含む、項１～５のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0020】
７、前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲ１β、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２分子の細胞内領域に由来する、項６に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。いくつかの実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲ１β、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０もしくはＤＡＰ１２分子の細胞内領域のシグナル伝達ドメイン、または同じ機能を保持するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζもしくはＦｃεＲＩγの細胞内領域のシグナル伝達ドメイン、または同じ機能を保持するそのバリアントを含む。
【0021】
８、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項７に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0022】
９、前記活性化刺激ドメインが、１つ、２つ、またはそれ以上の共刺激ドメインをさらに含む、項６～８のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。いくつかの実施形態では、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８受容体ファミリーまたは腫瘍壊死因子受容体ファミリーの共刺激ドメインに由来する。
【0023】
１０、前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴＲ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、特異的にＣＤ８３に結合するリガンド、及び同じ機能を保持するそれらのバリアントのうちの１つ以上の分子の細胞内領域を含み、好ましくは、４－１ＢＢの細胞内領域、ＣＤ２８の細胞内領域、ＯＸ４０の細胞内領域の共刺激ドメイン、または同じ機能を保持するそれらのバリアントを含む、項９に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0024】
１１、前記共刺激ドメインが、配列番号１８に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項１０に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0025】
１２、前記膜貫通ドメインが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴＲ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９α、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃからなる群から選択される分子の膜貫通ドメイン、または同じ機能を保持するそのバリアントを含み、好ましくは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＰＤ１、もしくは４－１ＢＢの膜貫通ドメイン、または同じ機能を保持するそのバリアントを含む、項１～１１のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0026】
１３、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αの膜貫通ドメイン、または同じ機能を保持するそのバリアントを含む、項１２に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0027】
１４、前記膜貫通ドメインが前記特異的認識ドメインに直接に連結されている、項１～１３のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0028】
１５、前記膜貫通ドメインと前記特異的認識ドメインとはヒンジ領域を介して連結されている、項１～１３のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８αもしくは抗体のＦｃフラグメントまたはその機能的等価物、フラグメントもしくは誘導体、ヒトＣＤ８αもしくは抗体のヒンジ領域またはその機能的等価物、フラグメントもしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＣＤ８αもしくはＣＤ２８のヒンジ領域アミノ酸配列、または同じ機能を保持するそのバリアントを含む。
【0029】
１６、前記ヒンジ領域が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項１５に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0030】
１７、任意の分泌タンパク質または膜タンパク質のシグナルペプチド配列から選択されるシグナルペプチドをさらに含む、項１～１６のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチド配列は、ＣＤ８αのシグナルペプチドである。
【0031】
１８、前記シグナルペプチド配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項１７に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子。
【0032】
１９、項１～１８のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子をコードする核酸分子。
【0033】
２０、配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、項１９に記載の核酸分子。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、特定の細胞または組織に基づいて配列番号３のヌクレオチド配列をコドン最適化することによって得られるヌクレオチド配列を含む。
【0034】
２１、膜局在シグナルペプチド分子のコード配列をさらに含む、項１９または２０に記載の核酸分子。いくつかの実施形態では、前記膜局在シグナルペプチド分子のコード配列は、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【0035】
２２、配列番号１、配列番号３、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９のポリヌクレオチド配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を、５’末端から３’末端にこの順に含む、項２１に記載の核酸分子。
【0036】
２３、項１～１８のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子及び／または項１９～２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、操作された免疫エフェクター細胞。
【0037】
２４、ＣＡＲ－Ｔ及び／またはＣＡＲ－ＮＫ細胞である、項２３に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【0038】
２５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２のアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する操作されたＴ細胞受容体。
【0039】
２６、前記Ｔ細胞受容体が、α鎖可変領域（Ｖα）及びβ鎖可変領域（Ｖβ）を含み、
前記Ｖαが、配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記Ｖβが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいは
前記Ｖβが、配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記Ｖαが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
項２５に記載のＴ細胞受容体。
前記Ｖαが、配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記Ｖβが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいは
前記Ｖβが、配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記Ｖαが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
項２５に記載のＴ細胞受容体。
【0040】
２７、項２５または２６に記載のＴ細胞受容体をコードする核酸分子。
【0041】
２８、項２５または２６に記載のＴ細胞受容体及び／または項２７に記載の核酸分子を含む、操作された免疫エフェクター細胞。
【0042】
２９、ＴＣＲ－Ｔ細胞である、項２８に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【0043】
３０、治療有効量の、項１～１８のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子、項２５もしくは２６に記載のＴ細胞受容体、請求項１９～２２もしくは２７のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項２３、２４、２８もしくは２９に記載の操作された免疫エフェクター細胞を含む、医薬組成物。
【0044】
３１、項３０に記載の医薬組成物を受験者に投与することを含む、それを必要とする前記受験者における疾患を治療または予防する方法であって、前記疾患がＢ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患から選択される、方法。
【0045】
３２、前記疾患が、自己免疫疾患、移植片対宿主病、及び腫瘍を含む、項３１に記載の方法。
【0046】
本出願によって提供されるＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識するキメラ抗原受容体分子は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識して結合した後に下流のシグナル伝達経路を活性化し、ＢＡＦＦ－Ｒに対する免疫応答反応を引き起こし、促進し、または増強することができ、例えば、インビトロまたはインビボでＢＡＦＦ－Ｒを発現する標的細胞を特異的に殺し、最終的にはＢ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患を治療または予防する目的を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】本発明のＢＡＦＦ－Ｒのキメラ抗原受容体の構造の一例である。
【図2】例示的な抗ＢＡＦＦ－Ｒキメラ抗原受容体レンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｈ９０－１１ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔのプラスミドマップである。
【図3】対照としてのレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ）のプラスミドマップである。
【図4】ＦＩＴＣ－ＥＧＦＲｔ抗体を使用してＣＡＲ陽性率を検出したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図5】ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質を使用してＣＡＲ陽性率を検出したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図6】Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ標的細胞を特異的に死滅させる結果を示す図である。
【図8A】マウスにおけるＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔのインビボ抗腫瘍効果の図である。図８Ａは、異なる時点でのマウスのインビボイメージングの結果を示す図であり、図８Ｂは、異なる時点でのマウスのインビボ絶対発光量をプロットしたグラフであり、図８Ｃは、２２日間以内のマウスの体重変化をプロットしたグラフである。
【0048】
発明の詳細
Ｂ細胞悪性腫瘍の治療効果をさらに改善・増強するために、本出願では、Ｂ細胞の表面に特異的かつ高度に発現するＢＡＦＦ－Ｒタンパク質に対して、ＢＡＦＦ－Ｒを認識する新規なキメラ抗原受容体分子を設計し、その受容体をコードする核酸分子、その受容体を含む操作された免疫エフェクター細胞、医薬組成物、及び、それらの、Ｂ細胞悪性腫瘍など、Ｂ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患の治療または予防のための使用を提供する。
Ｂ細胞悪性腫瘍の治療効果をさらに改善・増強するために、本出願では、Ｂ細胞の表面に特異的かつ高度に発現するＢＡＦＦ－Ｒタンパク質に対して、ＢＡＦＦ－Ｒを認識する新規なキメラ抗原受容体分子を設計し、その受容体をコードする核酸分子、その受容体を含む操作された免疫エフェクター細胞、医薬組成物、及び、それらの、Ｂ細胞悪性腫瘍など、Ｂ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患の治療または予防のための使用を提供する。
【0049】
定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、またその逆も同様である。以下に示す定義が参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する限り、以下に示す定義が優先されるものとする。
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、またその逆も同様である。以下に示す定義が参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する限り、以下に示す定義が優先されるものとする。
【0050】
本明細書で使用する場合、「受容体」とは、ホルモン、神経伝達物質、薬物、または細胞内シグナル伝達分子などに結合し、細胞機能に変化を引き起こすことができる生体高分子を指す。細胞内の受容体の位置に応じて、受容体は細胞膜受容体と細胞内受容体との２つのカテゴリーに分類できる。受容体自体には少なくとも２つの活性部位が含まれており、１つはリガンドを認識して結合する活性部位（本出願では「特異的認識ドメイン」と呼ぶ）であり、もう１つは応答反応の生成を担う機能的活性部位（本明細書では「活性化刺激ドメイン」と呼ばれる）である。前記活性化刺激ドメインは、前記受容体とリガンドが結合して二元複合体を形成してアロステリックになるしか応答反応を起こすことができず、それによって一連の生化学反応が開始され、最終的に前記受容体が位置するエフェクター細胞の生物学的効果を引き起こす。本明細書で使用される場合、前記「活性化刺激ドメイン」は、シグナル伝達ドメインを含むか、または１つ以上のシグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激ドメインを含む。本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「シグナル伝達ドメイン」は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球を活性化する第１のシグナルを提供し、「共刺激ドメイン」は、リンパ球を活性化する第２のシグナルを提供する。いくつかの実施形態では、前記抗原認識領域と前記活性化刺激ドメインとの間に膜貫通ドメインがさらに含まれる。いくつかの実施形態では、前記抗原認識領域と膜貫通ドメインとはヒンジ領域によって連結されている。
【0051】
本明細書で使用される場合、「細胞内ドメイン」と「細胞内領域」を置き換えて使用することができ、細胞内に位置し、受容体がリガンドに結合した後にシグナル伝達の役割を果たす受容体分子のドメインを指し得る。
【0052】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、一般に免疫細胞上で発現され、特定の標的腫瘍細胞または他の罹患細胞に対する操作された免疫細胞の殺傷を媒介する、操作された細胞表面受容体の一類である。ＣＡＲは受容体として、特異的認識ドメイン及び活性化刺激ドメインも含む。ＣＡＲの特異的認識ドメインは抗原を特異的に認識できるため、抗原認識領域とも呼ばれる。通常、ＣＡＲの抗原認識領域は細胞膜の外側に位置する。いくつかの実施形態では、前記抗原認識領域は、Ｉｇの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、「ｓｃＦｖ」は、Ｉｇの１つの重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記ＶＬ領域及びＶＨ領域は、ペプチド鎖によって連結される。
【0053】
「重鎖」（「ＣＨ」）、「軽鎖」（「ＣＬ」）、「軽鎖可変領域」（「ＶＬ」）、「重鎖可変領域」（「ＶＨ」）、「フレームワーク領域」（「Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ」）という用語は、天然に存在する免疫グロブリンのドメイン及び合成した（例えば、組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体）の対応するドメインを指す。天然に存在する免疫グロブリン（ＩｇＧなど）の基本構造単位は、２つの軽鎖と２つの重鎖を持つ四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、約１００～１１０、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、主に抗原認識に関与している。各鎖のカルボキシル末端（「Ｃ」部分）は定常領域を定義し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメインと１つのヒンジ領域を有する。したがって、ＩｇＧ分子の天然に存在する軽鎖の構造はＮ－ＶＬ－ＣＬ－Ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はＮ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ（Ｈはヒンジ領域）である。ここで、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３は抗体重鎖定常領域の構成要素であり、ＣＨ３領域は細胞膜表面受容体結合に関与し、ＣＨ２は補体活性化経路に関与し、補体結合部位である。ＣＨ１はＩｇアロタイプの遺伝的マーカーを持っている。ＩｇＧの可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と非ＣＤＲフラグメント（フレームワーク領域と呼ばれる）で構成される。ここで、ＣＤＲは抗原と接触する残基を含み、フレームワーク領域は、可変領域の構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定するために使用される。したがって、ＶＬドメインとＶＨドメインは、Ｎ－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－Ｃという構造を有する。
【0054】
いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインは、ｓｃＦｖ以外のポリペプチドまたはタンパク質リガンドである。例えば、修飾されたインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）分子を使用して特異的認識ドメインを調製することができ、それによって、神経膠芽腫の治療のためのＩＬ－１３Ｒα２特異的ＣＡＲを得ることができる。
【0055】
本明細書で使用される場合、「単鎖可変フラグメント」、「単鎖抗体可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」抗体という用語は、リンカーペプチドによって連結される、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域のみを含む抗体形態を指す。ｓｃＦｖは一本鎖ポリペプチドとして発現できる。ｓｃＦｖは、その由来となる完全な抗体の特異性を保持している。軽鎖及び重鎖は、標的抗原に対するｓｃＦｖの特異性が保持されている限り、例えばＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨなど、任意の順序であってもよい。いくつかの特別な実施形態では、リンカーも省略することができる。
【0056】
本明細書で使用する「リンカー」という用語は、本発明のＣＡＲの任意のドメイン／領域を一緒に連結する、長さ約１～１００アミノ酸のオリゴペプチドまたはポリペプチド領域を指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが相互に自由に移動できるように（グリシンやセリンなどの）柔軟な残基で構成されている。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにしたい場合は、より長いリンカーを使用することができる。選択可能なリンカーは当業者に知られており、本発明の代替実施形態と併せて使用することができる。
【0057】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン、またはＦｃ（結晶化可能断片）領域もしくはＦｃ領域のＦｃＲｎ結合フラグメント（本明細書では「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃドメイン」と呼ばれる）を有するモノクローナルまたはポリクローナル抗原結合フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の（インタクトな）抗体の酵素的または化学的切断によって生成できる。抗原結合フラグメントは、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、及び特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。Ｆｃドメインは２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３部分を含み、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の抗体の酵素的（例えば、パパイン切断）もしくは無傷の抗体の化学的切断によって産生することができる。「抗体フラグメント」という用語は、無傷の抗体の一部のみを含み、通常は無傷の抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持しているタンパク質フラグメントを指す。本明細書に記載される抗体フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆａｂ’フラグメント、すなわち、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント、（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有し、且つＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント、（ｖ）抗体の一方のアームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９））、（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって架橋された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９－５８８３（１９８８））、（ｘ）同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディ」（例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む「直鎖状抗体」（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５）；及び米国特許第５，６４１，８７０号）を含むが、これらに限定されない。
【0058】
本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、抗体が特定の抗原に結合するが、その特定の抗原以外の他の抗原には結合しないことを意味する。前記特異的抗原は１つ以上であってもよく、いくつかの実施形態では、前記特異的抗原は同じまたは類似の抗原エピトープを含む。いくつかの実施形態では、前記特異的結合は、抗体と抗原との間の接触に関して少なくとも１０－６Ｍの結合親和性を有する。特定の実施形態では、前記抗体は少なくとも約１０－７Ｍ、好ましくは１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍの親和性で結合する。
【0059】
本出願では、「ポリヌクレオチド」または「核酸」、「核酸分子」という用語は置き換えて使用でき、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ及び／またはｔＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
【0060】
本明細書で使用される場合、「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進することができるベクターを指す。ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスなどを含む。
【0061】
本明細書で使用される場合、前記「シグナル伝達ドメイン」は、一般に、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ、ＩＴＡＭ）を含み、その基本組成は、ＹＸＸＬ／Ｖである。ここで、Ｙはチロシン、Ｌ／Ｖはロイシンまたはバリン、Ｘは任意のアミノ酸を指す。受容体が対応するリガンドに結合すると、それに連結したＩＴＭＡ内のチロシンが、細胞膜に連結しているプロテインチロシンキナーゼの一種であるＰＴＫによってリン酸化され、それによって細胞内の他の遊離プロテインキナーゼまたはアダプタータンパク質を動員して、細胞内に活性化シグナルを伝達する。いくつかの実施形態では、前記「シグナル伝達ドメイン」は、ＴＣＲξ（ＣＤ３ξ）またはＦｃεＲＩγの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される。
【0062】
本明細書で使用される場合、前記「共刺激ドメイン」は、「共刺激シグナルドメイン」とも呼ばれ、主に、例えば、記憶細胞の増殖、生存及び／または発達の促進など、免疫細胞の能力を高めるために共刺激シグナルを提供するために使用される。いくつかの実施形態では、前記「共刺激ドメイン」は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）などから選択される。
【0063】
本明細書で使用される場合、「膜貫通領域」としても知られる前記「膜貫通ドメイン」は、細胞膜にアンカーされた熱力学的に安定なタンパク質構造領域を指す。膜貫通ドメインは、天然タンパク質から取得でき、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する膜貫通ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメインから選択される。
【0064】
本明細書において使用される場合、前記「ヒンジ領域」は、抗原認識領域と膜貫通ドメインとを連結する一連のペプチド鎖であり、通常は弾性である。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＩｇＧのヒンジまたはＣＤ８α／ＣＤ２８の細胞外領域に由来する。ＩｇＧの「ヒンジ」とは、ＩｇＧのＣＨ１機能領域とＣＨ２機能領域との間の領域を指し、通常、大量のプロリンが含まれている。
【0065】
本明細書において使用される場合、「抗ＢＡＦＦ－Ｒキメラ抗原受容体」は、「ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体」の１つである。具体的には、抗ＢＡＦＦ－Ｒ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を抗原認識領域に含むキメラ抗原受容体を指す。前記キメラ抗原受容体は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識し、シグナル伝達を通じて前記受容体が存在する細胞の下流経路を活性化することができる。いくつかの実施形態では、前記抗ＢＡＦＦ－Ｒキメラ抗原受容体は、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞などから選択される免疫細胞の表面に位置し、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識した後、前記免疫エフェクター細胞を活性化することにより、体液性免疫、細胞性免疫、及び／または細胞傷害性などの免疫効果を活性化し、あるいは前記免疫細胞を活性化してさらに増殖させることなどをする。
【0066】
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター細胞」は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの、標的抗原または標的細胞に対して、免疫殺傷効果及び免疫応答効果などの免疫効果及び免疫応答を達成することができる細胞を指す。
【0067】
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ」はすなわち、細胞表面上でキメラ抗原受容体分子が発現されており、細胞表面上の標的抗原を認識できるＴ細胞であるキメラ抗原受容体Ｔ細胞を指す。ＣＡＲ－Ｔは現在第４世代まで開発されている。その第１世代ＣＡＲ－ＴのＣＡＲ分子は、ＣＤ３ζ鎖やＦｃεＲＩγのシグナル伝達ドメインと抗原認識領域とが連結・融合して形成されており、共刺激ドメインを含まない。第１世代ＣＡＲ－Ｔは体内での増殖能力が限られており、アポトーシスを起こしやすい性質がある。第２世代ＣＡＲでは、ＣＤ２８や４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの共刺激ドメインが追加されている。ＣＤ２８は強力な抗腫瘍活性を持っており、４－１ＢＢの利点は、Ｔリンパ球の生存時間を延長し、抗腫瘍効果を維持できることである。第２世代ＣＡＲは、第１世代よりも強力な増殖能力を持ち、より多くのサイトカインと抗アポトーシスタンパク質を分泌できる。第３世代ＣＡＲ－Ｔは、２つの共刺激シグナル伝達分子を同時に発現できるだけでなく、より多くのＩＦＮ－γを分泌し、より高い抗腫瘍細胞傷害作用を示す。第４世代ＣＡＲ－Ｔは、腫瘍内で特定のサイトカイン（ＩＬ－１２など）を分泌することもでき、それによって腫瘍微小環境を変え、他の免疫細胞に影響を与えて活性化して免疫応答を引き起こす。
【0068】
本明細書で使用する場合、前記「シグナルペプチド」とは、新たに合成されたタンパク質の分泌経路への移動を誘導する短いペプチド鎖を指し、通常長さは５～３０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドは、膜局在シグナルペプチド、すなわち、タンパク質の膜貫通移動（局在化）を指示するために使用されるアミノ酸配列である。ほとんどの場合、シグナルペプチドはアミノ酸配列のＮ末端に位置する。ｍＲＮＡでは、シグナルペプチドのコード配列は通常、開始コドンの後に位置し、疎水性アミノ酸配列をコードするＲＮＡ領域である。シグナルペプチドがタンパク質を誘導してその局在化を完了した後、通常はシグナルペプチダーゼの作用によって切除される。
【0069】
本明細書で使用する場合、前記タンパク質または核酸の「バリアント」とは、特定のタンパク質または核酸と同じ機能を有するが、その配列に１つ以上の変異を有するタンパク質または核酸を指す。例えば、あるタンパク質の「バリアント」とは、人為的または天然の変異により、前記あるタンパク質のアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換などの変異を生じさせて得られる、そのタンパク質と同じ機能を持ち、少なくとも７０％の配列同一性を持つタンパク質である。
【0070】
本明細書で使用される配列の「同一性」とは、ＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントソフトウェアによって決定される、アミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の類似性の程度を指す。
【0071】
当業者は、ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡が、自己免疫疾患、移植片対宿主病、腫瘍などを含む様々な疾患を引き起こす可能性があることを知っているべきである。前記腫瘍には、形質細胞病変（多発性骨髄腫）を除くすべてのＢ細胞悪性腫瘍、例えば、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病などが含まれる。前記自己免疫疾患には、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、または自己免疫性溶血性貧血などが含まれる。
【0072】
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書に開示される１つ以上のペプチド、タンパク質、核酸、またはそれらの変異体、バリアント、類似体、もしくは誘導体を含む医薬組成物の量を指し、そのような「有効量」または「治療有効量」の医薬組成物を受ける患者または受験者は、医学的治療の合理的な利益／リスク比を得ることができ、それによって、疾患または状態の少なくとも１つ以上の症状を緩和または予防し、所望の治療または予防効果を達成することができる。
【0073】
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者には容易に知られる各値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び説明する）。本明細書で使用される場合、「約」という用語が数値の前にある場合、それはその数値の上下１０％の範囲を意味する。例えば、「約１００」は９０と１１０とをカバーする。
【0074】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段の記載がない限り、複数の指示対象を含む。
【0075】
本明細書で別途定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0076】
キメラ抗原受容体
本出願は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体を提供する。いくつかの実施形態では、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である場合、特異的認識ドメイン、活性化刺激ドメイン、及び前記特異的認識ドメインと活性化刺激ドメインとの間に位置する膜貫通ドメインを含み、ここで、前記特異的認識ドメインとは、標的細胞上の標的抗原に特異的に結合するＣＡＲの部分を指す。いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインは、抗体もしくはその機能的等価物、またはそのフラグメントもしくはその誘導体を含み、例えば、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価の単鎖抗体またはダイアボディを含み得、それぞれが標的抗原に特異的である。しかし、サイトカイン（サイトカイン受容体を持つ細胞を認識する）、アフィボディ、天然受容体由来のリガンド結合ドメイン、受容体の可溶性タンパク質／ペプチドリガンド（例えば、腫瘍細胞上）など、多くの代替物も存在し、それぞれが本発明のさまざまな実施形態で使用することができる。当業者であれば、前記標的抗原に高親和性で結合するほぼあらゆる分子またはドメインを特異的認識ドメインとして使用できることを理解すべきである。いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその抗原認識部分、たとえば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む。このようなＴＣＲを調製する方法は当技術分野で知られている。例えば、ｓｃＴＣＲを、リンカー（例えば、柔軟なペプチド）によって連結されたＴ細胞クローンからのＶαｌ遺伝子及びＶβ遺伝子を含むように操作することができる。
本出願は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体を提供する。いくつかの実施形態では、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である場合、特異的認識ドメイン、活性化刺激ドメイン、及び前記特異的認識ドメインと活性化刺激ドメインとの間に位置する膜貫通ドメインを含み、ここで、前記特異的認識ドメインとは、標的細胞上の標的抗原に特異的に結合するＣＡＲの部分を指す。いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインは、抗体もしくはその機能的等価物、またはそのフラグメントもしくはその誘導体を含み、例えば、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価の単鎖抗体またはダイアボディを含み得、それぞれが標的抗原に特異的である。しかし、サイトカイン（サイトカイン受容体を持つ細胞を認識する）、アフィボディ、天然受容体由来のリガンド結合ドメイン、受容体の可溶性タンパク質／ペプチドリガンド（例えば、腫瘍細胞上）など、多くの代替物も存在し、それぞれが本発明のさまざまな実施形態で使用することができる。当業者であれば、前記標的抗原に高親和性で結合するほぼあらゆる分子またはドメインを特異的認識ドメインとして使用できることを理解すべきである。いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその抗原認識部分、たとえば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む。このようなＴＣＲを調製する方法は当技術分野で知られている。例えば、ｓｃＴＣＲを、リンカー（例えば、柔軟なペプチド）によって連結されたＴ細胞クローンからのＶαｌ遺伝子及びＶβ遺伝子を含むように操作することができる。
【0077】
いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインは、
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、及びＣＤＲ Ｈ３を含み、前記ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、及びＣＤＲ Ｈ３はそれぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれぞれそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域はまた、３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、及びＣＤＲ Ｌ３を含み、前記ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、及びＣＤＲ Ｌ３はそれぞれ、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２のアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それらと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、フレームワーク領域、好ましくはヒト抗体フレームワーク領域をさらに含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、リンカーを介して連結されてｓｃＦｖを形成し、前記ｓｃＦｖは、配列番号４に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0082】
ＣＡＲは通常、特異的認識ドメイン、活性化刺激ドメイン、及びそれらの間の膜貫通ドメインを含む。従来のＣＡＲ構造は３種類あり、その違いは主に活性化刺激ドメインにあり、以下のものを含む：
第１世代ＣＡＲは、活性化刺激ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインが含まれ、共刺激ドメインがない；
第２世代ＣＡＲは、活性化刺激ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインと１つの共刺激ドメインが含まれる；
第３世代ＣＡＲは、活性化刺激ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインと２つの共刺激ドメインが含まれる。
第１世代ＣＡＲは、活性化刺激ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインが含まれ、共刺激ドメインがない；
第２世代ＣＡＲは、活性化刺激ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインと１つの共刺激ドメインが含まれる；
第３世代ＣＡＲは、活性化刺激ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインと２つの共刺激ドメインが含まれる。
【0083】
したがって、本出願のいくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、シグナル伝達ドメインが細胞質にあり得、エフェクター機能シグナルを伝達し、その特殊な機能を実行するように細胞に指示することができる、第１世代のＣＡＲである。前記シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはその任意のホモログ（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γ、β鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）、ＣＤ３ポリペプチド（γ、δ、及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、及びＴ細胞形質導入に関与するその他の分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ５、及びＣＤ２８が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部領域、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせであり得る。ほかの細胞内シグナル伝達ドメインは当業者には明らかであり、本発明の代替実施形態と併せて使用することができる。いくつかの実施形態では、前記活性化刺激ドメインに含まれるシグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフを含むシグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、ＦｃεＲ１β、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２分子の細胞内領域、または同じ機能を保持するそのバリアントから選択される１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζもしくはＦｃεＲＩγの細胞内領域、または同じ機能を保持するそのバリアントを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内領域に由来する。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0084】
本願のいくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは第２世代ＣＡＲであり、シグナル伝達ドメインは上記のシグナル伝達ドメインであり、さらに含まれる共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴＲ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、または同じ機能を保持するそれらのバリアントのうちのいずれか１つの分子の細胞内領域である。
【0085】
本願のいくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは第３世代ＣＡＲであり、シグナル伝達ドメインが上記のシグナル伝達ドメインであり、さらに含まれる共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴＲ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、または同じ機能を保持するそれらのバリアントのうちの任意の２つ、３つ、またはそれ以上の分子の細胞内領域である。
【0086】
いくつかの好ましい実施形態において、前記共刺激ドメインは、好ましくは、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、またはそれらと同じ機能を保持する変異体である。いくつかの特定の実施形態では、前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢに由来する細胞内領域を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記共刺激ドメインは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0087】
当業者であれば、前記シグナル伝達ドメインと前記共刺激ドメインとを適切な方法で配置して組み合わせることで、ＣＡＲがリガンドに結合するときに、前記ＣＡＲが存在するエフェクター細胞が適切な活性化シグナルを得ることができることが分かるであろう。
【0088】
いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインと活性化刺激ドメインとの間の膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインを有する任意タンパク質（Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む）の膜貫通配列に由来することができる。さらに、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴＲ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９α、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫＧ２Ｃからなる群から選択される分子の膜貫通ドメインを含み、好ましくは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＰＤ１、もしくは４－１ＢＢの膜貫通ドメイン、または同じ機能を保持するそのバリアントである。
【0089】
いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインに隣接する１つ以上の別のアミノ酸、例えば、前記膜貫通ドメインが由来するタンパク質の細胞外領域に会合する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～１５のアミノ酸）及び／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域に会合する１つ以上の別のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～１５のアミノ酸）を含んでもよい。一態様では、前記膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、またはヒンジドメインが由来するのと同じタンパク質に由来する。別の態様では、前記膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインが由来するのと同じタンパク質に由来しない。本願のいくつかの好ましい実施形態では、前記膜貫通ドメインはＣＤ８αの膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、前記特異的認識ドメインに直接に連結されている。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインと前記特異的認識ドメインはヒンジ領域を介して連結されている。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８αもしくは抗体のＦｃフラグメントまたはその機能的等価物、フラグメントもしくは誘導体、ヒトＣＤ８αもしくは抗体のヒンジ領域またはその機能的等価物、フラグメントもしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＣＤ８αまたはＣＤ２８のヒンジ領域アミノ酸配列である。いくつかの例示的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域及びＣＨ２領域、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域及びＣＨ２領域、または（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記ヒンジ領域はヒトＣＤ８αのヒンジ領域である。いくつかの特定の実施形態では、前記ヒンジ領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲはシグナルペプチドをさらに含む。通常、シグナルペプチド（ＳＰ）はタンパク質のＮ末端に位置し、タンパク質の分泌情報を運び、タンパク質の分泌経路及び分布の決定に関与する。当業者であれば、核内、ミトコンドリア内、及び細胞質に局在化するタンパク質、ならびにサイトゾル内の遊離タンパク質及び分泌されるかまたは最終的に細胞膜にアンカーされるタンパク質は、通常、異なるシグナルペプチドを有することが分かるであろう。当業者は、ソフトウェア予測及びシグナルペプチドデータベースを通じて、特定のタンパク質の機能の発揮に適したシグナルペプチド配列を選択することができる。したがって、本出願のいくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドは、任意の分泌タンパク質もしくは細胞膜タンパク質のシグナルペプチド配列、または同じ機能を保持するそのバリアントから選択される。いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチド配列は、ＣＤ８αのシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、前記シグナルペプチド配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0092】
操作されたＴ細胞受容体
一方では、本出願は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も提供する。Ｔ細胞の表面の特異的な受容体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原の認識を担当する。Ｔ細胞受容体は、２つの異なるサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。通常、Ｔ細胞受容体の９５％はαサブユニットとβサブユニットで構成され、残りの５％はγサブユニットとδサブユニットで構成される。各サブユニットには、可変領域と定常領域という２つの細胞外ドメインが含まれている。各サブユニットの可変領域（例えば、αサブユニットの可変領域Ｖα、βサブユニットの可変領域Ｖβ、γサブユニットの可変領域Ｖγ、δサブユニットの可変領域Ｖδ）には、少なくとも３つの高度に可変な相補性決定領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が含まれる。ＣＤＲ３は、ＭＨＣが提示するポリペプチドに直接結合する役割を担っており、αサブユニット及びβサブユニットのＣＤＲ１はそれぞれポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に作用し、ＣＤＲ２はＭＨＣの認識に関与する。
一方では、本出願は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も提供する。Ｔ細胞の表面の特異的な受容体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原の認識を担当する。Ｔ細胞受容体は、２つの異なるサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。通常、Ｔ細胞受容体の９５％はαサブユニットとβサブユニットで構成され、残りの５％はγサブユニットとδサブユニットで構成される。各サブユニットには、可変領域と定常領域という２つの細胞外ドメインが含まれている。各サブユニットの可変領域（例えば、αサブユニットの可変領域Ｖα、βサブユニットの可変領域Ｖβ、γサブユニットの可変領域Ｖγ、δサブユニットの可変領域Ｖδ）には、少なくとも３つの高度に可変な相補性決定領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が含まれる。ＣＤＲ３は、ＭＨＣが提示するポリペプチドに直接結合する役割を担っており、αサブユニット及びβサブユニットのＣＤＲ１はそれぞれポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に作用し、ＣＤＲ２はＭＨＣの認識に関与する。
【0093】
いくつかの実施形態では、前記操作されたＴ細胞受容体は、
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶα、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶβ；または
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶβ、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶαを含む。
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶα、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶβ；または
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶβ、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶαを含む。
【0094】
他の実施形態では、前記操作されたＴ細胞受容体は、
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶγ、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶδ；または
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶδ、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶγを含む。
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶγ、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶδ；または
配列番号６、配列番号７、配列番号８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶδ、及び、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶγを含む。
【0095】
前記操作されたＴＣＲは、ＭＨＣによって提示されるＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識し、シグナル伝達を担うＣＤ３δ／ε二量体、ＣＤ３γ／ε二量体、及びＣＤ２４７ζ／ζまたはζ／η二量体と一緒に、いくつかの実施形態では、共受容体（コレセプター）と一緒に、下流のシグナル伝達経路を活性化する。
【0096】
核酸分子
本出願は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体またはそのフラグメントをコードする核酸分子も提供する。いくつかの実施形態において、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、上記のキメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態において、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、上記の操作されたＴ細胞受容体である。前記核酸分子は、上記のキメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体もしくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。前記核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、前記酸分子は直鎖状であり、いくつかの実施形態では、前記核酸分子は環状である。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は二本鎖である。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は一本鎖である。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は化学合成されてなる。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、細胞または動物内でより安定にするために化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は細菌細胞、真菌細胞、または動物細胞によって合成される。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、またはオリゴヌクレオチドである。
本出願は、ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体またはそのフラグメントをコードする核酸分子も提供する。いくつかの実施形態において、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、上記のキメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態において、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、上記の操作されたＴ細胞受容体である。前記核酸分子は、上記のキメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体もしくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。前記核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、前記酸分子は直鎖状であり、いくつかの実施形態では、前記核酸分子は環状である。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は二本鎖である。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は一本鎖である。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は化学合成されてなる。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、細胞または動物内でより安定にするために化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は細菌細胞、真菌細胞、または動物細胞によって合成される。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、またはオリゴヌクレオチドである。
【0097】
いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体の特異的認識ドメインをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記特異的認識ドメインはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるＤＮＡ配列及び／またはそれに相補的なＤＮＡ、あるいはそれに対応するもしくは相補的なＲＮＡ配列、あるいはこの段落に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列と約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される場合、核酸の「相補性」とは、２つのポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることを意味し、ストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、２つのポリヌクレオチドがハイブリダイズするとき、各塩基または各ヌクレオチドがいずれもＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成規則に従い、すなわちＡとＴまたはＵ、ＣとＧまたはＩとマッチングすることを指す。本明細書で使用する場合、ＤＮＡ配列に「対応する」ＲＮＡとは、前記ＤＮＡ配列の塩基配列と一致し、すべてのＴ塩基がＵ塩基に置換されているリボヌクレオチド（ＲＮＡ）配列を指す。
【0098】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、膜局在シグナルペプチド分子のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、前記膜局在シグナルペプチドは、ＣＤ８αの膜局在シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、前記膜局在シグナルペプチド分子のコード配列は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列及び／またはそれに相補的なＤＮＡ、またはそれに対応するもしくは相補的なＲＮＡ配列、またはこの段落に記載のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列と約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子はヒンジ領域をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされる前記ヒンジ領域は、ＣＤ８αのヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域をコードする配列は、配列番号１３に示されるＤＮＡ配列及び／またはそれに相補的なＤＮＡ、またはそれに対応するもしくは相補的なＲＮＡ配列、またはこの段落に記載のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列と約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、前記シグナル伝達ドメインをコードする配列は、配列番号１９に示されるＤＮＡ配列及び／またはそれに相補的なＤＮＡ、またはそれに対応するもしくは相補的なＲＮＡ配列、またはこの段落に記載のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列と約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記共刺激ドメインは４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、前記シグナル伝達ドメインをコードする配列は、配列番号１７に示されるＤＮＡ配列及び／またはそれに相補的なＤＮＡ、またはそれに対応するもしくは相補的なＲＮＡ配列、またはこの段落に記載のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列と約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、上記の共刺激ドメインをコードする配列、上記のシグナル伝達ドメインをコードする配列、上記のヒンジ領域をコードする配列、上記の膜局在シグナルペプチド分子のコード配列、及び上記の特異的認識ドメインをコードする配列を含む。上記核酸分子が細胞に導入された後、完全な前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体を成功裏に合成するために、前記核酸分子に含まれる配列をどのように配置するか、発現を調節するどのような関連成分を加えればよいか、当業者には明らかであろう。いくつかの特定の実施形態では、前記核酸分子は、５’末端から３’末端まで順次に、配列番号１、配列番号３、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９のポリヌクレオチド配列、またはそれと約７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、それと約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、ここで、前記ポリヌクレオチド配列の間に他の配列が含まれていてもよい。
【0103】
本出願は、複数の核酸分子を含む混合物も提供する。前記複数の核酸分子はそれぞれ、上記の共刺激ドメインをコードする配列、上記のシグナル伝達ドメインをコードする配列、上記のヒンジ領域をコードする配列、前記膜局在シグナルペプチド分子のコード配列、上記の特異的認識ドメインをコードする配列から選択される１つ以上を含む。この混合物を細胞に同時導入することにより、完全な前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体を合成できる。
【0104】
操作された免疫エフェクター細胞
前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体または前記核酸分子を含む、操作された免疫エフェクター細胞。
前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体または前記核酸分子を含む、操作された免疫エフェクター細胞。
【0105】
いくつかの実施形態では、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、上記のキメラ抗原受容体であり、前記操作された免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞である。
【0106】
いくつかの実施形態では、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、上記の操作されたＴ細胞受容体であり、前記操作された免疫エフェクター細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、前記ＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体は、上記の操作されたＴ細胞受容体であり、前記操作された免疫エフェクター細胞は、ＴＣＲ－ＮＫ細胞である。
【0107】
ウイルス粒子、リポソーム、脂質ナノ粒子、医薬組成物
本出願はまたウイルスプラスミドを提供し、ここで、パッケージされたウイルスベクターが上記のキメラ抗原受容体もしくは操作されたＴ細胞受容体、及び／または前記キメラ抗原受容体もしくは操作されたＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本出願はまた、前記のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体もしくはそのフラグメント、または受容体もしくはそのフラグメントをコードする核酸分子を含むリポソームまたは脂質ナノ粒子を提供する。
本出願はまたウイルスプラスミドを提供し、ここで、パッケージされたウイルスベクターが上記のキメラ抗原受容体もしくは操作されたＴ細胞受容体、及び／または前記キメラ抗原受容体もしくは操作されたＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本出願はまた、前記のＢＡＦＦ－Ｒを特異的に認識する受容体もしくはそのフラグメント、または受容体もしくはそのフラグメントをコードする核酸分子を含むリポソームまたは脂質ナノ粒子を提供する。
【0108】
本出願はさらに、治療有効量の、上記のキメラ抗原受容体、上記のＴ細胞受容体、上記の核酸分子、上記の操作された免疫エフェクター細胞、上記のウイルス粒子、リポソーム、脂質ナノ粒子から選択される１つ以上を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、適切な賦形剤、担体、及び／または安定剤をさらに含む。このような許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量及び濃度ではレシピエントに対して無毒であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩または酢酸塩などの緩衝液（典型的にはｐＨ５．０～８．０、場合により６．０～７．０）；塩化ナトリウム、塩化カリウムなど、等張性を達成する塩；抗酸化剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質；ポリソルベート８０などの親水性ポリマー；グリシンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート剤；糖；及び当業者に知られている他の標準成分を含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
【0109】
治療
本出願はまた、有効量の上記の医薬組成物を受験者に投与することを含む、それを必要とする受験者における疾患または症状を治療または予防するための方法を開示し、前記疾患は、Ｂ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患から選択される。任意選択で、この方法は、ＣＤ２０抗原に結合できるモノクローナル抗体、ＣＤ１９に結合できるモノクローナル抗体、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイントに結合できるモノクローナル抗体、またはＣＤ２０、ＣＤ１９、及びＰＤ－１を標的とする操作された免疫エフェクター細胞などの第２の治療薬を受験者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記疾患は、自己免疫疾患、移植片対宿主病、または腫瘍のいずれかから選択される。
本出願はまた、有効量の上記の医薬組成物を受験者に投与することを含む、それを必要とする受験者における疾患または症状を治療または予防するための方法を開示し、前記疾患は、Ｂ細胞ＢＡＦＦ－ＢＡＦＦ－Ｒシグナル伝達経路の不均衡によって引き起こされる疾患から選択される。任意選択で、この方法は、ＣＤ２０抗原に結合できるモノクローナル抗体、ＣＤ１９に結合できるモノクローナル抗体、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイントに結合できるモノクローナル抗体、またはＣＤ２０、ＣＤ１９、及びＰＤ－１を標的とする操作された免疫エフェクター細胞などの第２の治療薬を受験者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記疾患は、自己免疫疾患、移植片対宿主病、または腫瘍のいずれかから選択される。
【0110】
いくつかの実施形態では、前記疾患はがんである。任意選択で、前記がんは、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である。任意選択で、前記がんはリンパ腫である。任意選択で、リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、またはバーキットリンパ腫である。任意選択で、前記がんは白血病である。任意選択で、白血病は、リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、または有毛細胞白血病である。任意選択で、前記がんは骨髄腫である。任意選択で、骨髄腫は多発性骨髄腫である。
【0111】
いくつかの実施形態では、前記疾患は自己免疫疾患である。任意選択で、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、または自己免疫性溶血性貧血である。
【0112】
別の態様では、本出願はまた、細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、前記細胞を本出願で提供される医薬組成物と接触させ、それによって接触細胞を形成することを含む。抗ＢＡＦＦ－Ｒ受容体またはその機能的断片は細胞上のＢＡＦＦ－Ｒタンパク質に結合・接触し、それによって細胞の増殖を阻害する。任意選択で、前記細胞はリンパ球である。任意選択で、前記細胞はＢ細胞またはがん細胞である。任意選択で、前記細胞はリンパ腫細胞である。
【0113】
本明細書で使用される場合、疾患または状態を治療または予防することは、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得る方法を指す。有益なまたは所望の臨床結果は、１つ以上の症状または状態の緩和もしくは改善；状態、症状、または疾患の重症度の軽減；状態、症状、または疾患の状態の安定化；状態、症状、または疾患の発症の予防；状態、症状、または疾患の蔓延の予防；状態、症状、または疾患の進行を遅らせるまたは遅くすること；状態、症状、または疾患の発症を遅らせるまたは遅くすること；状態、症状、または疾患の状態の改善または軽減；及び部分的または全体的な改善を含むことができるが、これらに限定されない。治療は、治療がなかった場合に予想される以上に受験者の生存を延長することも意味する場合がある。治療はまた、状態、症状、または疾患の進行を阻害すること、状態、症状、または疾患の進行を一時的に遅らせることも意味する場合があるが、場合によっては、状態、症状、または疾患の進行を永久に停止することも含む。
【0114】
以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で、他の適切な方法による様々な技術的特徴の組み合わせを含む、本発明の技術案に対して様々な簡単な変更を加えることができる。これらの簡単な変更及び組み合わせも本発明の開示内容と見なすべき、本発明の保護範囲に属する。
【0115】
上記の説明及び以下の実施例は、説明を目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点、及び修正は、本発明が属する技術分野の当業者には明らかであろう。
【実施例】
【0116】
実施例１：ＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体の設計
本発明は、抗ＢＡＦＦ－Ｒキメラ抗原受容体（Ｈ９０－１１ ＣＡＲ、米国特許出願公開第２０２１／０２６１６７６号Ａ１に示されるようなＨ９０－１１ ｍＡｂモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、上記米国特許出願公開第２０２１／０２６１６７６号Ａ１の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を構築した。図１の構造模式図に示すように、当該キメラ抗原受容体は、ＣＤ８αシグナルペプチド配列（リーダー）、ＢＡＦＦ－Ｒ抗原に特異的に結合する一本鎖抗体配列（ｓｃＦｖ）、ヒトＣＤ８αのヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）及び膜貫通ドメイン配列（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン配列及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン配列を含み、各部分の具体的な順序は次のとおりであり、具体的な配列について表１を参照されたい。
ヒトＣＤ８α分子シグナルペプチド（リーディングシグナル）のポリヌクレオチド配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
ヒト化ＢＡＦＦ－Ｒ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のポリヌクレオチド配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示す。ここで、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号５であり、前記ＶＨに含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８である。前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号９であり、前記ＶＬに含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２である。
ヒトＣＤ８αヒンジ領域（ＣＤ８ Ｈｉｎｇｅ）のポリヌクレオチド配列を配列番号１３に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。
ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＣＤ８ ＴＭ）のポリヌクレオチド配列を配列番号１５に示し、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。
ヒト４－１ＢＢ分子の細胞内領域（４－１ＢＢ）のポリヌクレオチド配列を配列番号１７に示し、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。
ヒトＣＤ３ζ分子の細胞内領域（ＣＤ３ζ）のヌクレオチド配列を配列番号１９に示し、アミノ酸配列を配列番号２０に示す。
本発明は、抗ＢＡＦＦ－Ｒキメラ抗原受容体（Ｈ９０－１１ ＣＡＲ、米国特許出願公開第２０２１／０２６１６７６号Ａ１に示されるようなＨ９０－１１ ｍＡｂモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、上記米国特許出願公開第２０２１／０２６１６７６号Ａ１の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を構築した。図１の構造模式図に示すように、当該キメラ抗原受容体は、ＣＤ８αシグナルペプチド配列（リーダー）、ＢＡＦＦ－Ｒ抗原に特異的に結合する一本鎖抗体配列（ｓｃＦｖ）、ヒトＣＤ８αのヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）及び膜貫通ドメイン配列（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン配列及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン配列を含み、各部分の具体的な順序は次のとおりであり、具体的な配列について表１を参照されたい。
ヒトＣＤ８α分子シグナルペプチド（リーディングシグナル）のポリヌクレオチド配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
ヒト化ＢＡＦＦ－Ｒ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のポリヌクレオチド配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示す。ここで、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号５であり、前記ＶＨに含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８である。前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号９であり、前記ＶＬに含まれる３つの相補性決定領域ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２である。
ヒトＣＤ８αヒンジ領域（ＣＤ８ Ｈｉｎｇｅ）のポリヌクレオチド配列を配列番号１３に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。
ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＣＤ８ ＴＭ）のポリヌクレオチド配列を配列番号１５に示し、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。
ヒト４－１ＢＢ分子の細胞内領域（４－１ＢＢ）のポリヌクレオチド配列を配列番号１７に示し、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。
ヒトＣＤ３ζ分子の細胞内領域（ＣＤ３ζ）のヌクレオチド配列を配列番号１９に示し、アミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【0117】
【表1-1】
【0118】
【表1-2】
【0119】
実施例２：キメラ抗原受容体発現ベクターの構築
抗ＢＡＦＦ－Ｒ Ｈ９０－１１ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｈ９０－１１ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔ及び対照のＥＧＦＲｔ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ）がいずれもＮａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成及び構築された。具体的な実験手順は次のとおりである。
抗ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ遺伝子配列はＮａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって合成され、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ ａｓｓｅｍｂｌｙシームレスクローニング試薬の製造元のプロトコールに従って、遺伝子合成されたｓｃＦｖ配列をｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔベクター（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、注文番号：Ｃ０４６ＥＥＥ３１０）に挿入し、抗ＢＡＦＦ－Ｒキメラ抗原受容体レンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｈ９０－１１ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、注文番号：Ｃ９４０１ＦＧ２１０）を得た。ベクターマップを図２に示す。
ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（ｉＣａｒＴａｂにより提供）レンチウイルス発現ベクターは、Ｔ２ＡリンカーにＡＴＧ開始コドンがあるため、ＥＧＦＲｔはフレームシフト変異により正常に発現できず、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ ａｓｓｅｍｂｌｙシームレスクローニング試薬の製造元のプロトコールに従って、ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔベクターのＴ２Ａを削除して、対照のＥＧＦＲｔ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ）（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって構築）を得た。ベクトルマップを図３に示す。
抗ＢＡＦＦ－Ｒ Ｈ９０－１１ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｈ９０－１１ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔ及び対照のＥＧＦＲｔ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ）がいずれもＮａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成及び構築された。具体的な実験手順は次のとおりである。
抗ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ遺伝子配列はＮａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって合成され、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ ａｓｓｅｍｂｌｙシームレスクローニング試薬の製造元のプロトコールに従って、遺伝子合成されたｓｃＦｖ配列をｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔベクター（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、注文番号：Ｃ０４６ＥＥＥ３１０）に挿入し、抗ＢＡＦＦ－Ｒキメラ抗原受容体レンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｈ９０－１１ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、注文番号：Ｃ９４０１ＦＧ２１０）を得た。ベクターマップを図２に示す。
ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（ｉＣａｒＴａｂにより提供）レンチウイルス発現ベクターは、Ｔ２ＡリンカーにＡＴＧ開始コドンがあるため、ＥＧＦＲｔはフレームシフト変異により正常に発現できず、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ ａｓｓｅｍｂｌｙシームレスクローニング試薬の製造元のプロトコールに従って、ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔベクターのＴ２Ａを削除して、対照のＥＧＦＲｔ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ）（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって構築）を得た。ベクトルマップを図３に示す。
【0120】
実施例３：レンチウイルスのパッケージング及び力価測定
レンチウイルスのパッケージング
１５ｃｍ培養皿に２９３Ｔ細胞を１×１０７個接種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１００９９－１４１）含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：４１９６５－０６２）完全培地を加え、３７℃に置き、５％ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１４１９０－２５０）２ｍＬを６ウェルプレートの１つのウェルに入れ、２０μｇレンチウイルス発現プラスミド（ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔまたはｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ））及び３０μＬレンチウイルスパッケージングプラスミドＭｉｘ（ｉＣａｒＴａｂ、カタログ番号：ＬＶＰ２ＭＩＸ）をそれぞれ加え、上下にピペッティングして十分に混合し、１５０μＬ ＬＶＴｒａｎｓｍトランスフェクション試薬（ｉＣａｒＴａｂ、カタログ番号：ＬＶＴｒａｎ１００）を加え、すぐに上下にピペッティングして均一に混合し、室温で１０分間静置した。１５ｃｍ培養皿（シャーレ）に上記のＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を一滴ずつ滴下して加え、培養皿を軽く振り、よく混ぜた。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、６～８時間培養した後、トランスフェクション試薬を含む培地を捨て、新しい完全培地に入れ替えた。４８時間培養を続けた後、培養皿中のウイルス含有培養上澄みを集め、０．４５μｍのフィルターメンブレンでろ過し、遠心分離管に移し、２０，０００ｇ、４℃で２時間遠心分離した。遠心分離後、バイオセーフティキャビネット内で、遠心分離管内の液体を捨て、５００μＬのＰＢＳ緩衝液を加えてウイルスペレットを再懸濁し、分注した後にウイルスを－８０℃の冷蔵庫で保存した。
ウイルス力価の測定
２９３Ｔ細胞を蘇生させ、細胞状態を対数増殖期に調整した。新しい６ウェルプレートを用意し、２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり８×１０５細胞で播種し、最終容量２ｍＬになるまで培地を補充した。６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、一晩培養した。濃縮したレンチウイルスを上記の６ウェルプレートに５０μＬ加え、同時に最終濃度６μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：１０７６８９－１０Ｇ）を加え、６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに戻し、４８時間培養を続けた。
培養後、各ウェルの細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：９７６５）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ２０００を用いて測定した。以下の表２に示すＰＣＲ反応系に従って、蛍光定量ＰＣＲ反応マスターミックスを調製した。
レンチウイルスのパッケージング
１５ｃｍ培養皿に２９３Ｔ細胞を１×１０７個接種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１００９９－１４１）含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：４１９６５－０６２）完全培地を加え、３７℃に置き、５％ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１４１９０－２５０）２ｍＬを６ウェルプレートの１つのウェルに入れ、２０μｇレンチウイルス発現プラスミド（ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔまたはｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ））及び３０μＬレンチウイルスパッケージングプラスミドＭｉｘ（ｉＣａｒＴａｂ、カタログ番号：ＬＶＰ２ＭＩＸ）をそれぞれ加え、上下にピペッティングして十分に混合し、１５０μＬ ＬＶＴｒａｎｓｍトランスフェクション試薬（ｉＣａｒＴａｂ、カタログ番号：ＬＶＴｒａｎ１００）を加え、すぐに上下にピペッティングして均一に混合し、室温で１０分間静置した。１５ｃｍ培養皿（シャーレ）に上記のＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を一滴ずつ滴下して加え、培養皿を軽く振り、よく混ぜた。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、６～８時間培養した後、トランスフェクション試薬を含む培地を捨て、新しい完全培地に入れ替えた。４８時間培養を続けた後、培養皿中のウイルス含有培養上澄みを集め、０．４５μｍのフィルターメンブレンでろ過し、遠心分離管に移し、２０，０００ｇ、４℃で２時間遠心分離した。遠心分離後、バイオセーフティキャビネット内で、遠心分離管内の液体を捨て、５００μＬのＰＢＳ緩衝液を加えてウイルスペレットを再懸濁し、分注した後にウイルスを－８０℃の冷蔵庫で保存した。
ウイルス力価の測定
２９３Ｔ細胞を蘇生させ、細胞状態を対数増殖期に調整した。新しい６ウェルプレートを用意し、２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり８×１０５細胞で播種し、最終容量２ｍＬになるまで培地を補充した。６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、一晩培養した。濃縮したレンチウイルスを上記の６ウェルプレートに５０μＬ加え、同時に最終濃度６μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：１０７６８９－１０Ｇ）を加え、６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに戻し、４８時間培養を続けた。
培養後、各ウェルの細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：９７６５）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ２０００を用いて測定した。以下の表２に示すＰＣＲ反応系に従って、蛍光定量ＰＣＲ反応マスターミックスを調製した。
【0121】
【表2】
【0122】
使用したプライマーの配列及び蛍光基を以下の表３に示す。
【0123】
【表3】
【0124】
ｐＵＣ－ＬＴＲ（購入先：ｉＣａｒＴａｂ）及びｐＵＣ－ＡＬＢプラスミド（購入先：ｉＣａｒＴａｂ）を冷蔵庫から取り出し、それぞれ１０倍、合計６点に希釈し、蛍光定量ＰＣＲに必要な検量線サンプルを調製した。新しい９６ウェルＰＣＲ反応プレートを用意し、各ウェルにゲノムサンプルまたは検量線サンプル５μＬを加え、次いで上記で調製したＰＣＲ反応マスターミックス１５μＬを各ウェルに加え、シーリングフィルムで密封した後、１分間軽く遠心分離した。以下の表４のＰＣＲ手順に従ってＰＣＲ反応を実行した。
【0125】
【表4】
【0126】
ＰＣＲ反応終了後、Ｒｏｃｈｅ ４８０のサポートソフトウェアを使用して検量線のＣｔ値及びサンプルのＣｔ値を取得した。縦軸にＣｔ値、横軸にコピー数のＬｏｇ値を使用して検量線を作成し、検量線に基づいてサンプルのコピー数を計算した。そして、次の式に従ってウイルスの力価を計算した。
【0127】
【数1】
【0128】
【表5】
【0129】
表５からわかるように、高力価レンチウイルスがパッケージ化されており、その後Ｔ細胞に感染させてＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するために使用できる。
【0130】
実施例４：ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
末梢血ＰＢＭＣからのＴ細胞の分離
抗凝固処理した末梢血サンプル１０ｍＬを１５ｍＬの滅菌遠心管に移し、８００ｇで２０分間遠心分離し、上部の淡黄色の血清層を除去してから、等体積のＰＢＳを下部の末梢血球層に加え、上下を軽く反転して均一に混ぜた。リンパ球分離液（Ｈａｏ Ｙａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：１０７７）を取り出し、上下を数回反転して十分に均一に混合した。別の１５ｍＬ遠心管にリンパ球分離液５ｍＬを加え、分離液と血液検体の混合を避けるため、希釈した血液検体を管壁に沿ってリンパ球分離液の上層にゆっくりと加え、８００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離後、遠心管を穏やかに取り出し、中央の白色単核球層を新しい滅菌遠心管に吸引し、等体積の生理食塩水を加えて軽く混ぜ、８００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄みを除去し、ＰＢＭＣをもう一度洗浄し、細胞密度を５×１０７細胞／ｍＬに調整し、１ｍＬ／チューブで２ｍＬ細胞凍結保存チューブに移した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：１１１４１Ｄ）をＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＬ細胞凍結保存チューブ内のＰＢＭＣに適量のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を加え、軽く均一に混合し、室温で２０分間インキュベートした。２ｍＬ細胞凍結保存チューブを磁極に挿入し、室温で１分間放置した後、静かに反転させてチューブ内の液体を注ぎ出した。細胞凍結保存チューブを磁極から取り出し、適量のＸ－Ｖｉｖｏ １５培地（２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｕａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、カタログ番号：２０１５０７１３Ｂ）を含む）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７（ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ、カタログ番号：１０１－０７）、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５（ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ、カタログ番号：１０１－１５）を加えて再懸濁してカウントし、細胞密度を０．５～１×１０６細胞／ｍＬに調整し、６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、４８時間連続培養した。
Ｔ細胞のレンチウイルス感染
培養後のＴ細胞の密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、－８０℃の超低温冷蔵庫からレンチウイルスを取り出し、３７℃のウォーターバスで急速に解凍し、最終濃度６μｇ／ｍＬになるように、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：１０７６８９－１０Ｇ）を調製したＴ細胞に加え、適切な量のウイルス（感染多重度ＭＯＩ＝２５）を加え、ピペットで静かにピペッティングして均一に混合し、培養容器をパラフィルムで密封し、８００ｇ、室温で１時間遠心分離した。遠心分離後、２４時間培養を続け、培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養を続けた。
Ｔ細胞の大量増殖
完全に分離されるまで、培養系内のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）／細胞ペレットを毎日軽くピペッティングし、カウントした。細胞密度が１×１０６細胞／ｍＬを超えたら、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５培地（２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５を含む）を加え、細胞密度を０．５×１０５細胞／ｍＬに調整し、培養を続けた。増殖及び培養の１０日目に細胞を収集し、細胞凍結保存溶液に保存した。
ＣＡＲ－Ｔ陽性率の検出
ＦＩＴＣ－Ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ抗体（ｉＣＡＲＴＡＢ、カタログ番号：ＩＡＢ００６Ａ）（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を使用してＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｐＣＤＨ－ＥＦＩａ－Ｈ９０－１１ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔレンチウイルスに感染したＴ細胞）及びＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ）レンチウイルスに感染したＴ細胞）とそれぞれインキュベートし、暗所、室温で３０分間インキュベートした後、ＣＡＲ－Ｔ細胞陽性率を反映するＥＧＦＲｔの発現をフローサイトメトリーで検出した結果、図４に示すように、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は３６．１％であり、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は７８．１％であった。同時に、ＢＡＦＦ－Ｒ Ｌｉａｍａ ＩｇＧ２ｂ Ｆｃ Ｔａｇ組換えタンパク質（Ａｃｒｏ、カタログ番号：ＢＡＲ－Ｈ５２５８）（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を使用して、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞とそれぞれインキュベートし、室温で３０分間インキュベートした後、５００ｇ、５分間遠心分離後、上澄みを捨て、ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ Ｌｉａｍａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｎｏｖｕｓ、カタログ番号：ＮＢＰ１－４７６２７）を０．５％ＢＳＡ ＰＢＳで１：１０００に希釈した。細胞ペレットを１００μＬ／サンプルで再懸濁し、暗所、室温で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳでＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率を検出した結果、図５に示すように、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は３０．２％であり、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は０．６５％であった。Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＥＧＦＲｔタンパク質と抗ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ分子との両方を発現し、陽性率は基本的に同じであったが、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ分子を発現せずにＥＧＦＲｔタンパク質のみを発現した。これは、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞との両方が正常に調製されたことを示している。
末梢血ＰＢＭＣからのＴ細胞の分離
抗凝固処理した末梢血サンプル１０ｍＬを１５ｍＬの滅菌遠心管に移し、８００ｇで２０分間遠心分離し、上部の淡黄色の血清層を除去してから、等体積のＰＢＳを下部の末梢血球層に加え、上下を軽く反転して均一に混ぜた。リンパ球分離液（Ｈａｏ Ｙａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：１０７７）を取り出し、上下を数回反転して十分に均一に混合した。別の１５ｍＬ遠心管にリンパ球分離液５ｍＬを加え、分離液と血液検体の混合を避けるため、希釈した血液検体を管壁に沿ってリンパ球分離液の上層にゆっくりと加え、８００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離後、遠心管を穏やかに取り出し、中央の白色単核球層を新しい滅菌遠心管に吸引し、等体積の生理食塩水を加えて軽く混ぜ、８００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄みを除去し、ＰＢＭＣをもう一度洗浄し、細胞密度を５×１０７細胞／ｍＬに調整し、１ｍＬ／チューブで２ｍＬ細胞凍結保存チューブに移した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：１１１４１Ｄ）をＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＬ細胞凍結保存チューブ内のＰＢＭＣに適量のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を加え、軽く均一に混合し、室温で２０分間インキュベートした。２ｍＬ細胞凍結保存チューブを磁極に挿入し、室温で１分間放置した後、静かに反転させてチューブ内の液体を注ぎ出した。細胞凍結保存チューブを磁極から取り出し、適量のＸ－Ｖｉｖｏ １５培地（２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｕａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、カタログ番号：２０１５０７１３Ｂ）を含む）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７（ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ、カタログ番号：１０１－０７）、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５（ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ、カタログ番号：１０１－１５）を加えて再懸濁してカウントし、細胞密度を０．５～１×１０６細胞／ｍＬに調整し、６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、４８時間連続培養した。
Ｔ細胞のレンチウイルス感染
培養後のＴ細胞の密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、－８０℃の超低温冷蔵庫からレンチウイルスを取り出し、３７℃のウォーターバスで急速に解凍し、最終濃度６μｇ／ｍＬになるように、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：１０７６８９－１０Ｇ）を調製したＴ細胞に加え、適切な量のウイルス（感染多重度ＭＯＩ＝２５）を加え、ピペットで静かにピペッティングして均一に混合し、培養容器をパラフィルムで密封し、８００ｇ、室温で１時間遠心分離した。遠心分離後、２４時間培養を続け、培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養を続けた。
Ｔ細胞の大量増殖
完全に分離されるまで、培養系内のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）／細胞ペレットを毎日軽くピペッティングし、カウントした。細胞密度が１×１０６細胞／ｍＬを超えたら、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５培地（２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５を含む）を加え、細胞密度を０．５×１０５細胞／ｍＬに調整し、培養を続けた。増殖及び培養の１０日目に細胞を収集し、細胞凍結保存溶液に保存した。
ＣＡＲ－Ｔ陽性率の検出
ＦＩＴＣ－Ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ抗体（ｉＣＡＲＴＡＢ、カタログ番号：ＩＡＢ００６Ａ）（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を使用してＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｐＣＤＨ－ＥＦＩａ－Ｈ９０－１１ＣＡＲ－４－１ＢＢ－ＥＧＦＲｔレンチウイルスに感染したＴ細胞）及びＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｐＣＤＨ－ＥＦ１ａ－ＥＧＦＲｔ－ＡＴ－Ｆｒｅｅ（ｄｅｌｅｔｅ Ｔ２Ａ）レンチウイルスに感染したＴ細胞）とそれぞれインキュベートし、暗所、室温で３０分間インキュベートした後、ＣＡＲ－Ｔ細胞陽性率を反映するＥＧＦＲｔの発現をフローサイトメトリーで検出した結果、図４に示すように、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は３６．１％であり、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は７８．１％であった。同時に、ＢＡＦＦ－Ｒ Ｌｉａｍａ ＩｇＧ２ｂ Ｆｃ Ｔａｇ組換えタンパク質（Ａｃｒｏ、カタログ番号：ＢＡＲ－Ｈ５２５８）（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を使用して、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞とそれぞれインキュベートし、室温で３０分間インキュベートした後、５００ｇ、５分間遠心分離後、上澄みを捨て、ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ Ｌｉａｍａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｎｏｖｕｓ、カタログ番号：ＮＢＰ１－４７６２７）を０．５％ＢＳＡ ＰＢＳで１：１０００に希釈した。細胞ペレットを１００μＬ／サンプルで再懸濁し、暗所、室温で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳでＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率を検出した結果、図５に示すように、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は３０．２％であり、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は０．６５％であった。Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＥＧＦＲｔタンパク質と抗ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ分子との両方を発現し、陽性率は基本的に同じであったが、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ分子を発現せずにＥＧＦＲｔタンパク質のみを発現した。これは、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞との両方が正常に調製されたことを示している。
【0131】
実施例５：ＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体Ｔ細胞によるインビトロでの腫瘍細胞の殺傷の評価
ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の溶解
Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞は、ヒトＢＡＦＦ－Ｒを高発現する急性リンパ芽球性白血病細胞であり、Ｎａｌｍ６細胞（Ｇｅｎｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入）にレンチウイルスを感染させて得られたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼ）過剰発現細胞である。ルシフェラーゼ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２６１０）を使用して、Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ標的細胞に対するＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を検出し、対照としてＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。具体的なステップは下記通りである。
Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ標的細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、標的細胞を２×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、一晩インキュベートした。調製したＣＡＲ－Ｔ細胞を遠心分離により回収し、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁した。インキュベーターから９６ウェルプレートを取り出し、ウェル内の培地を完全に吸引し、滅菌ＰＢＳで細胞を穏やかに一回洗浄し、０．５：１、１：１、２．５：１、５：１、及び１０：１のエフェクト対ターゲット比でＣＡＲ－Ｔ細胞を加え、ダブルウェルを設定し、最終容量を２００μＬ／ウェルに補充した。Ｍａｘｉ ｌｙｓｉｓウェルとＭｉｎｉ ｌｙｓｉｓウェルに同数の標的細胞を接種したが、ＣＡＲ－Ｔ細胞は追加しなかった。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、１８時間培養した。培養後、ルシフェラーゼ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２６１０）の取扱説明書に従って、組換えＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞を溶解する能力を反映するルシフェラーゼ活性を検出した。標的細胞溶解率の計算式：Ｌｙｓｉｓ％＝（１－［ＲＬＵ］＿Ｓａｍｐｌｅ）／（［ＲＬＵ］＿Ｍａｘ）×１００％
結果を図６に示す。ＢＡＦＦ－Ｒを発現するＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞に対するＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果は、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ群の殺傷効果よりもはるかに高く、エフェクト対ターゲット比が０．５：１、１：１、２．５：１、５：１、及び１０：１である場合、標的細胞に対するＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔの殺傷率は、それぞれ６２．７％、８３．１％、９５．４％、９８．９、及び９９．７％であり、標的細胞に対するＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ群の殺傷率は、それぞれ２．１％、１０．５％、１０．５％、１８．１％、及び２４．７％であった。このことは、本発明の方法によって調製されたＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体Ｔ細胞が強い腫瘍殺傷能を有することを示している。
ＣＡＲ－Ｔサイトカイン分泌レベルの検出
標的細胞Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ及び調製したＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養上澄み中のＩＬ－２とＩＦＮ－γの発現レベルをＥＬＩＳＡ法により検出した。
Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ標的細胞を完全培地に再懸濁し、標的細胞を９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、一晩培養した。組換えＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれエフェクター細胞として使用し、エフェクター細胞と標的細胞の共培養系を確立した。エフェクト対ターゲット比０．５：１、１：１、２．５：１、５：１、及び１０：１で、ダブルウェルを設定した。ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、１８時間培養した。培養終了後、ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、９６ウェルプレートを１２００ｇ、室温で５分間遠心分離し、ウェルプレートを穏やかに取り外し、移した上澄みは、ＩＬ－２（Ｆｃｍａｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，、カタログ番号：ＦＭＳ－ＥＬＨ００３）及びＩＦＮ－γ検出キット（Ｆｃｍａｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，、カタログ番号：ＦＭＳ－ＥＬＨ０３５）を使用してＩＬ－２及びＩＦＮ－γの発現レベルを検出した（詳細な手順については、ＥＬＩＳＡ検出キットのプロトコールを参照されたい）。
結果を図７Ａ（ＩＬ－２）及び７Ｂ（ＩＦＮ－γ）に示す。ＢＡＦＦ－Ｒを発現するＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞及びＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔの共培養上澄み中のＩＬ－２とＩＦＮ－γサイトカインレベルは、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ群よりも有意に高く、勾配的に増加した。この結果は、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＢＡＦＦ－Ｒを発現する標的細胞によって刺激されると、Ｔｈ１系サイトカインを分泌できることを示している。
ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の溶解
Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞は、ヒトＢＡＦＦ－Ｒを高発現する急性リンパ芽球性白血病細胞であり、Ｎａｌｍ６細胞（Ｇｅｎｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入）にレンチウイルスを感染させて得られたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼ）過剰発現細胞である。ルシフェラーゼ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２６１０）を使用して、Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ標的細胞に対するＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を検出し、対照としてＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。具体的なステップは下記通りである。
Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ標的細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、標的細胞を２×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、一晩インキュベートした。調製したＣＡＲ－Ｔ細胞を遠心分離により回収し、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁した。インキュベーターから９６ウェルプレートを取り出し、ウェル内の培地を完全に吸引し、滅菌ＰＢＳで細胞を穏やかに一回洗浄し、０．５：１、１：１、２．５：１、５：１、及び１０：１のエフェクト対ターゲット比でＣＡＲ－Ｔ細胞を加え、ダブルウェルを設定し、最終容量を２００μＬ／ウェルに補充した。Ｍａｘｉ ｌｙｓｉｓウェルとＭｉｎｉ ｌｙｓｉｓウェルに同数の標的細胞を接種したが、ＣＡＲ－Ｔ細胞は追加しなかった。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、１８時間培養した。培養後、ルシフェラーゼ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２６１０）の取扱説明書に従って、組換えＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞を溶解する能力を反映するルシフェラーゼ活性を検出した。標的細胞溶解率の計算式：Ｌｙｓｉｓ％＝（１－［ＲＬＵ］＿Ｓａｍｐｌｅ）／（［ＲＬＵ］＿Ｍａｘ）×１００％
結果を図６に示す。ＢＡＦＦ－Ｒを発現するＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞に対するＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果は、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ群の殺傷効果よりもはるかに高く、エフェクト対ターゲット比が０．５：１、１：１、２．５：１、５：１、及び１０：１である場合、標的細胞に対するＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔの殺傷率は、それぞれ６２．７％、８３．１％、９５．４％、９８．９、及び９９．７％であり、標的細胞に対するＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ群の殺傷率は、それぞれ２．１％、１０．５％、１０．５％、１８．１％、及び２４．７％であった。このことは、本発明の方法によって調製されたＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体Ｔ細胞が強い腫瘍殺傷能を有することを示している。
ＣＡＲ－Ｔサイトカイン分泌レベルの検出
標的細胞Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ及び調製したＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養上澄み中のＩＬ－２とＩＦＮ－γの発現レベルをＥＬＩＳＡ法により検出した。
Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ標的細胞を完全培地に再懸濁し、標的細胞を９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、一晩培養した。組換えＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれエフェクター細胞として使用し、エフェクター細胞と標的細胞の共培養系を確立した。エフェクト対ターゲット比０．５：１、１：１、２．５：１、５：１、及び１０：１で、ダブルウェルを設定した。ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、１８時間培養した。培養終了後、ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、９６ウェルプレートを１２００ｇ、室温で５分間遠心分離し、ウェルプレートを穏やかに取り外し、移した上澄みは、ＩＬ－２（Ｆｃｍａｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，、カタログ番号：ＦＭＳ－ＥＬＨ００３）及びＩＦＮ－γ検出キット（Ｆｃｍａｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，、カタログ番号：ＦＭＳ－ＥＬＨ０３５）を使用してＩＬ－２及びＩＦＮ－γの発現レベルを検出した（詳細な手順については、ＥＬＩＳＡ検出キットのプロトコールを参照されたい）。
結果を図７Ａ（ＩＬ－２）及び７Ｂ（ＩＦＮ－γ）に示す。ＢＡＦＦ－Ｒを発現するＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞及びＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔの共培養上澄み中のＩＬ－２とＩＦＮ－γサイトカインレベルは、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ群よりも有意に高く、勾配的に増加した。この結果は、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＢＡＦＦ－Ｒを発現する標的細胞によって刺激されると、Ｔｈ１系サイトカインを分泌できることを示している。
【0132】
実施例６：マウスにおけるＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷の評価
急性リンパ芽球性白血病Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞株をＮＳＧマウスモデルに異種移植し、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔのインビボ活性を評価した。
６～８週齢のＮＳＧマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ社より購入）（体重１８～２２ｇ）を２０匹取り、１週間馴化培養した後、Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼを尾静脈に接種した。各マウスに１×１０６個の腫瘍細胞を接種した。腫瘍細胞を尾静脈に接種してから５日後に、１回目のインビボイメージングを行ったが、イメージング効果は理想的ではなかった。接種８日後、モデリングに失敗したマウスを後続の実験群から除外し、マウスのインビボイメージング結果に従って群を分け、マウスをランダムに２つの群に分け、各群８匹のマウスとし、２．２５×１０６のＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ尾静脈から注入し、マウスに７日ごとにＤ－ルシフェリン（Ｓｉｎｏｃｈｒｏｍｅ／Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、カタログ番号：ＢＣ２１９－１０）を腹腔内注射すると同時に、ガス麻酔機を使用してマウスを麻酔した。腫瘍のインビボイメージングデータを収集し、マウスの体重変化を記録してマウスの生存曲線を描いた。
モデリング後８、１５、２２日目に、小動物インビボイメージング装置を使用してインビボイメージング観察を行った。イメージングの結果を図８Ａに示し、絶対発光量曲線を図８Ｂに示す。イメージング結果によれば、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ対照群と比較して、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔは腫瘍細胞に対して有意な殺傷効果を示した；８日目にＣＡＲ－Ｔ細胞注入治療後、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ注入対照群と比較して、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ注入群のマウスは注入後から１５日目までに腫瘍負荷（絶対発光量）の増加が遅くなり、１５日目以降に腫瘍負荷は急激に減少した。描かれたマウスの体重変化曲線のグラフを図８Ｃに示す。ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ対照細胞を注入したマウスの体重は、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入したマウスの体重と同等であった。実験中、マウスの体重は緩やかに増加し、これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の注入が重篤な毒性反応を引き起こさないことを示している。
急性リンパ芽球性白血病Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞株をＮＳＧマウスモデルに異種移植し、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔのインビボ活性を評価した。
６～８週齢のＮＳＧマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ社より購入）（体重１８～２２ｇ）を２０匹取り、１週間馴化培養した後、Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼを尾静脈に接種した。各マウスに１×１０６個の腫瘍細胞を接種した。腫瘍細胞を尾静脈に接種してから５日後に、１回目のインビボイメージングを行ったが、イメージング効果は理想的ではなかった。接種８日後、モデリングに失敗したマウスを後続の実験群から除外し、マウスのインビボイメージング結果に従って群を分け、マウスをランダムに２つの群に分け、各群８匹のマウスとし、２．２５×１０６のＨ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ尾静脈から注入し、マウスに７日ごとにＤ－ルシフェリン（Ｓｉｎｏｃｈｒｏｍｅ／Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、カタログ番号：ＢＣ２１９－１０）を腹腔内注射すると同時に、ガス麻酔機を使用してマウスを麻酔した。腫瘍のインビボイメージングデータを収集し、マウスの体重変化を記録してマウスの生存曲線を描いた。
モデリング後８、１５、２２日目に、小動物インビボイメージング装置を使用してインビボイメージング観察を行った。イメージングの結果を図８Ａに示し、絶対発光量曲線を図８Ｂに示す。イメージング結果によれば、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ対照群と比較して、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔは腫瘍細胞に対して有意な殺傷効果を示した；８日目にＣＡＲ－Ｔ細胞注入治療後、ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ注入対照群と比較して、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ注入群のマウスは注入後から１５日目までに腫瘍負荷（絶対発光量）の増加が遅くなり、１５日目以降に腫瘍負荷は急激に減少した。描かれたマウスの体重変化曲線のグラフを図８Ｃに示す。ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－Ｔ対照細胞を注入したマウスの体重は、Ｈ９０－１１ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入したマウスの体重と同等であった。実験中、マウスの体重は緩やかに増加し、これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の注入が重篤な毒性反応を引き起こさないことを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】
【国際調査報告】