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特表2024-519986ホルミルグリシン含有ポリペプチドの切断を制御する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】ホルミルグリシン含有ポリペプチドの切断を制御する方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/02 20060101AFI20240514BHJP
【ＦＩ】
C07K1/02 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572612
(86)(22)【出願日】2022-05-25
(85)【翻訳文提出日】2023-12-27
(86)【国際出願番号】 US2022030922
(87)【国際公開番号】W WO2022251357
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】63/193,960
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520355792
【氏名又は名称】アール．ピー．シェーラー テクノロジーズ，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ホルダー，パトリック
(72)【発明者】
【氏名】バーフィールド，ロビン・エム
(72)【発明者】
【氏名】ラブカ，デヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】ドレイク，ペネロペ・エム
(72)【発明者】
【氏名】キム，ユンチョル
(72)【発明者】
【氏名】ブレック，グレゴリー・ティー
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045EA20
4H045EA60
4H045FA15
4H045FA72
4H045GA45
(57)【要約】
ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減するための方法が提供される。そのような方法は、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することを含み得る。また、本明細書で提供されるのは、標的領域におけるタンパク質の切断を誘導するための方法であって、標的領域が、ｆＧｌｙアミノ酸を含む、方法である。本方法は、タンパク質を、フラビンの存在下で３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む可視光に曝露させることを含み得る。タンパク質の切断は、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で行われ得る。タンパク質の切断は、フラビンの存在下で行われ得る。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減する方法であって、前記方法が、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露から前記タンパク質を保護することを含む、方法。
【請求項2】
前記方法が、細胞を培養することを含み、前記細胞が、前記タンパク質を含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露から前記タンパク質を保護することが、前記培養中に５００ｎｍ超の波長を有する可視光を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記タンパク質を合成することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露から前記タンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長を有する可視光の中で前記タンパク質を合成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記タンパク質を精製することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露から前記タンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長を有する可視光の中で前記タンパク質を精製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
精製することが、細胞又は前記細胞を含む細胞培養培地から前記タンパク質を単離することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
５００ｎｍ超の波長を有する前記可視光が、５００ｎｍ超かつ６２０ｎｍ未満の波長を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
５００ｎｍ超の波長を有する前記可視光が、緑色の光、黄色の光、及び／又は橙色の光に限定される可視光を生成する光源によって生成される、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
５００ｎｍ超の波長を有する前記可視光が、可視光を、３８０ｎｍ～５００ｎｍの範囲の可視光の透過を大幅に遮断するフィルタを通過させることによって生成される、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記方法が、細胞を培養することを含み、前記細胞が、前記タンパク質を含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露から前記タンパク質を保護することが、可視光の不在下で前記細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記タンパク質を合成することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露から前記タンパク質を保護することが、可視光の不在下で前記タンパク質を合成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記タンパク質の前記切断が、前記ｆＧｌｙアミノ酸において、又は前記ｆＧｌｙアミノ酸に隣接して生じる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ｆＧｌｙアミノ酸が、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位において生成される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１Ｃ／ＳＸ２Ｐ／ＡＸ３Ｒを含み、Ｘ１が、存在するか、又は不在であり、存在する場合、任意のアミノ酸であり、ただし、前記ＦＧＥ認識部位が、前記タンパク質のＮ末端にある場合、Ｘ１が、存在し、Ｘ２及びＸ３が、各々独立して、任意のアミノ酸であることを条件とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＰＳＲを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＳＸ２ＰＸ３Ｒを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＳＴＰＳＲを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＣＸ２ＡＸ３Ｒを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＲを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項20】
前記タンパク質が、抗体及び／又は治療用タンパク質である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記タンパク質の切断が、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で生じる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記分子が、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露によって光活性化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記タンパク質の切断が、フラビンの存在下で生じる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記フラビンが、リボフラビンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記フラビンが、フラビンモノヌクレオチド又はフラビンアデニンジヌクレオチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
標的領域においてタンパク質の切断を誘導する方法であって、前記標的領域が、ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含み、前記方法が、前記タンパク質を、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、方法。
【請求項27】
前記光が、３２５ｎｍ～４９５ｎｍの間の波長に限定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記方法が、前記ｆＧｌｙアミノ酸を前記標的領域に導入することを含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
前記タンパク質を前記光に曝露させることが、前記光の中で前記タンパク質を含む細胞を培養すること、及び／又は
前記光の中で前記タンパク質を精製すること、を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記タンパク質の前記切断が、前記ｆＧｌｙアミノ酸において、又は前記ｆＧｌｙアミノ酸に隣接して生じる、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ｆＧｌｙアミノ酸が、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位において生成される、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１Ｃ／ＳＸ２Ｐ／ＡＸ３Ｒを含み、Ｘ１が、存在するか、又は不在であり、存在する場合、任意のアミノ酸であり、ただし、前記ＦＧＥ認識部位が、前記タンパク質のＮ末端にある場合、Ｘ１が、存在し、Ｘ２及びＸ３が、各々独立して、任意のアミノ酸であることを条件とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＰＳＲを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＳＸ２ＰＸ３Ｒを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＳＴＰＳＲを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＣＸ２ＡＸ３Ｒを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項37】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＲを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＡを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項39】
前記方法が、前記標的領域にホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位を導入することを含む、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記タンパク質が、Ｆｃ領域を含む抗体であり、前記標的領域が、前記抗体の前記Ｆｃ領域とＣＨ１ドメインとの間に位置する、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記タンパク質が、精製タグを含み、前記標的領域が、前記タンパク質配列と前記精製タグとの間に位置する、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で、前記タンパク質を３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、請求項２６～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記分子が、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露によって光活性化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記タンパク質を、フラビンの存在下で３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、請求項２６～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記フラビンが、リボフラビンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記フラビンが、フラビンモノヌクレオチド又はフラビンアデニンジヌクレオチドである、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２７日出願の米国仮特許出願第６３／１９３，６９０号の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月２７日出願の米国仮特許出願第６３／１９３，６９０号の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
序論
部位特異的標識又は部位特異的切断のためのタンパク質の修飾のための戦略は、研究及び治療薬におけるそのようなタンパク質の重要性に起因して、広く研究されている。ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質は、目的の部分の部位特異的付着のための化学ハンドルとしてｆＧｌｙアミノ酸のアルデヒド部分を利用することによって、標識することができる。タンパク質は、多くの場合、例えば、精製タグを除去するための切断を必要とするタンパク質又はペプチドなどのタグと融合される。そのようなタグは、通常、切断可能なリンカー配列を介してタンパク質に融合される。
部位特異的標識又は部位特異的切断のためのタンパク質の修飾のための戦略は、研究及び治療薬におけるそのようなタンパク質の重要性に起因して、広く研究されている。ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質は、目的の部分の部位特異的付着のための化学ハンドルとしてｆＧｌｙアミノ酸のアルデヒド部分を利用することによって、標識することができる。タンパク質は、多くの場合、例えば、精製タグを除去するための切断を必要とするタンパク質又はペプチドなどのタグと融合される。そのようなタグは、通常、切断可能なリンカー配列を介してタンパク質に融合される。
【発明の概要】
【0003】
ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減するための方法が提供される。そのような方法は、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することを含み得る。また、本明細書で提供されるのは、標的領域におけるタンパク質の切断を誘導するための方法であって、標的領域が、ｆＧｌｙアミノ酸を含む、方法である。本方法は、タンパク質を、フラビンの存在下で３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む可視光に曝露させることを含み得る。タンパク質の切断は、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で行われ得る。タンパク質の切断は、フラビンの存在下で行われ得る。
【0004】
図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】アルデヒドタグ付き抗体調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。
【図2】アルデヒドタグ付き抗体調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。
【図3】細胞培養培地中、又は２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム中のいずれかで光に曝露させたｆＧｌｙ含有モノクローナル抗体のＨＰＬＣ。
【図4】光への曝露前後のｆＧｌｙ含有タンパク質調製物中の抗体断片の質量分析の要約。
【図5】ｆＧｌｙ含有抗体の切断に対するビタミンＢ１２対細胞培養培地の影響の分析。
【図6A】ｆＧｌｙ含有抗体の切断に対するリボフラビン及び光の影響の分析。
【図6B】ｆＧｌｙ含有抗体の切断に対するチアミン及び光の影響の分析。
【図7A】ｆＧｌｙペプチド、ＡＬｆＧｌｙＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列番号１）の切断に対するリボフラビン及び光の影響の分析。
【図7B】ｆＧｌｙペプチド、ＡＬｆＧｌｙＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列番号１）の切断に対するチアミン及び光の影響の分析。
【図8A】逆相クロマトグラフィーによって検出される、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）ペプチドのリボフラビン及び光が媒介する切断は、Ｎ及びＣ末端断片をもたらす。Ｓ．Ｍ．＝出発物質。
【図8B】リボフラビン及び光の存在下で、ＡＬｆＧｌｙＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列番号１）及びＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）の切断後に観察されたペプチド断片の質量分析。
【図9A】ランプ出力、列挙されたフィルタを透過させた光、及びリボフラビン吸収スペクトルの強度及び波長を示す。
【図9B】列挙されたフィルタ及び白色の光と関連付けられる光作用（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｏｎ）スペクトルを示す。
【図9C】リボフラビン、及びバンドパスフィルタを用いるか又は用いない光でインキュベートし、ＨＰＬＣによって分析した、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）ペプチドの切断の結果。
【図10】ｆＧｌｙ含有タンパク質のリボフラビンが媒介する切断の動態。
【図11A】変動するタンパク質量によって評価した、切断に対するリボフラビン対ｆＧｌｙ含有タンパクの比の影響。
【図11B】変動するリボフラビン量によって評価した、切断に対するリボフラビン対ｆＧｌｙ含有タンパクの比の影響。
【発明を実施するための形態】
【0006】
本発明について記載する前に、本発明は、記載の特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら、変動し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0007】
値の範囲が提供される場合、文脈上別段の指示のない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在値も、下限のユニットの１０分の１まで具体的に開示されていることを理解されたい。任意の記載値又は記載された範囲内の間に介在する値と、任意の他の記載値又はその記載された範囲内の間に介在する値との間の、各より小さい範囲が、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれていても、除外されていてもよく、いずれか、どちらでもない、又は両方の限定が小さい範囲に含まれている各範囲も、記載された範囲の中で任意の具体的に除外された限定に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が、限定の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限定のうちのいずれか又は両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【0008】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と同様又は均等な任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用され得るが、いくつかの潜在的かつ例示的な方法及び材料がここで記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物に関連する方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示は、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先されることを理解されたい。
【0009】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段文脈による明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことが留意される必要がある。したがって、例えば、「アルデヒドタグ」への言及は、複数のそのようなタグを含み、「ポリペプチド」への言及は、当業者に既知の１つ以上のポリペプチド及びその均等物への言及などを含む。
【0010】
特許請求の範囲は、任意選択であり得る任意の要素を除外するように試案され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の列挙に関連して、「単に」、「のみ」などのそのような排他的な用語の使用、又は「否定的な」限定の使用に対する前提的な根拠として機能することが意図される。
【0011】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。本明細書におけるいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような公開に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。
【0012】
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指すために、本明細書では交換可能に使用される。別段の特定の指示がない限り、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、遺伝子的にコードされるアミノ酸及びコードされないアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾されるか、若しくは誘導体化されるアミノ酸、並びに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。用語は、限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種及び相同リーダー配列を有する融合、少なくとも１つのＮ末端メチオニン残基を含むタンパク質（例えば、組換え細菌宿主細胞において産生を容易にする）を含む融合タンパク質、免疫学的にタグ付きタンパク質などを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指すために、本明細書では交換可能に使用される。別段の特定の指示がない限り、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、遺伝子的にコードされるアミノ酸及びコードされないアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾されるか、若しくは誘導体化されるアミノ酸、並びに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。用語は、限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種及び相同リーダー配列を有する融合、少なくとも１つのＮ末端メチオニン残基を含むタンパク質（例えば、組換え細菌宿主細胞において産生を容易にする）を含む融合タンパク質、免疫学的にタグ付きタンパク質などを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。
【0013】
「標的ポリペプチド」は、本明細書に記載のｆＧｌｙアミノ酸を含むように修飾されているポリペプチドを指すために本明細書で使用される。修飾は、その後、目的の部分の付着又はポリペプチドの切断に使用され得る。
【0014】
本明細書で使用される「標的領域」は、タンパク質の切断が所望される、タンパク質中の配列を指す。標的領域は、スルファターゼモチーフを含み得る。
【0015】
「アルデヒドタグ」又は「ａｌｄ－タグ」とは、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によって、２－ホルミルグリシン残基（本明細書では「ｆＧｌｙ」と称される）を含有するように変換されているスルファターゼモチーフに由来するアミノ酸配列を含有する、アミノ酸配列を意味する。そのようなスルファターゼモチーフは、本明細書では、ＦＧＥ認識部位（ＦＲＳ）と称される。ＦＧＥによって生成されるｆＧｌｙ残基は、「ホルミルグリシン」又は「２－ホルミルグリシン」とも称され得る。言い換えれば、「アルデヒドタグ」という用語は、「変換された」スルファターゼモチーフ（すなわち、ＦＧＥの作用によって、システイン又はセリン残基がｆＧｌｙに変換されているスルファターゼモチーフを含むアミノ酸配列を指すために本明細書で使用される。変換されたスルファターゼモチーフは、「変換されていない」スルファターゼモチーフ（すなわち、ＦＧＥによって、システイン又はセリン残基がｆＧｌｙに変換されていないが、変換されることが可能であるスルファターゼモチーフ）を含むアミノ酸配列から産生され得る。スルファターゼモチーフに対するＦＧＥの作用の文脈において使用される「変換」とは、スルファターゼモチーフにおけるシステイン又はセリン残基のホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）残基への（例えば、ＣｙｓからｆＧｌｙへの、又はＳｅｒからｆＧｌｙへの）生化学的修飾を指す。部位特異的タンパク質修飾におけるアルデヒドタグ及びその使用の更なる態様は、米国特許第７，９８５，７８３号及び同第８，７２９，２３２号に記載されており、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0016】
スルファターゼモチーフに対するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用の文脈において使用される際の「変換」は、スルファターゼモチーフにおいてホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）残基（例えば、ＣｙｓからｆＧｌｙへ、又はＳｅｒからｆＧｌｙへ）へのシステイン又はセリン残基の生化学的修飾を指す。
【0017】
「天然アミノ酸配列」又は「親アミノ酸配列」は、標的ポリペプチドの文脈において本明細書では交換可能に使用され、少なくとも１つの異種ＦＧＥ認識部位（ＦＲＳ）を含むように修飾される前の標的ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。
【0018】
ポリペプチド、ペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列に関して使用される「遺伝子的にコード可能な」は、アミノ酸配列が、そのアミノ酸配列をコードする核酸の転写及び翻訳によって産生することができるアミノ酸残基から構成され、転写及び／又は翻訳が、細胞中、又は無細胞インビトロ転写／翻訳系において生じ得ることを意味する。
【0019】
「制御配列」という用語は、特定の発現系、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、無細胞合成などにおいて操作可能に連結されたコード配列の発現を容易にするＤＮＡ配列を指す。原核生物系に好適である制御配列は、例えば、プロモータ、任意選択でオペレータ配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞系は、プロモータ、ポリアデニレーションシグナル、及びエンハンサを利用し得る。
【0020】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「操作可能に連結されている」。例えば、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、プレ配列若しくは分泌リーダーをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする別の核酸に操作可能に連結され、配列の転写に影響を与える場合には、プロモータ若しくはエンハンサが、コード配列に操作可能に連結されるか、又は翻訳の開始を容易にするように位置する場合には、リボソーム結合部位が、コード配列に操作可能に連結される。
【0021】
本明細書で使用される「発現カセット」という用語は、（例えば、目的の構築物へのライゲーションと適合性のある制限部位の使用によって、又は目的の構築物へ、若しくは宿主細胞ゲノムへの相同組換えによって）核酸に挿入することができる、核酸（通常はＤＮＡ）のセグメントを指す。概して、核酸セグメントは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセット及び制限部位は、転写及び翻訳のための適切なリーディングフレームへのカセットの挿入を容易にするように設計される。発現カセットはまた、宿主細胞中で対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を容易にする要素を含む。これらの要素としては、限定されないが、プロモータ、最小プロモータ、エンハンサ、応答要素、ターミネータ配列、ポリアデニル化配列などが挙げられ得る。
【0022】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、化合物が天然で存在するものとは異なる環境にある目的の化合物を説明することを意味する。「単離された」は、目的の化合物が実質的に濃縮されており、かつ／又は目的の化合物が部分的若しくは実質的に精製されている、試料内にある化合物を含むことを意味する。
【0023】
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」という用語は、その天然環境から除去され、天然に関連する他の構成要素を少なくとも６０％含まず、通常７５％含まず、ほとんどの場合、通常９０％含まない化合物を指す。
【0024】
「生理学的条件」という用語は、生細胞と適合性のあるそれらの条件、例えば、生細胞と適合性のある温度、ｐＨ、塩分などの主に水性条件を包含することを意味する。
【0025】
「異種」とは、第１の実体及び第２の実体（又はそれ以上の実体）が、通常は天然では見出されない関連で提供されることを意味する。例えば、第１の配列及び第２の配列を含有するタンパク質であって、２つの配列が天然の単一のタンパク質中に存在しない。
【0026】
「Ｎ末端」は、遊離アミン基を有するポリペプチドの末端アミノ酸残基を指し、非Ｎ末端アミノ酸残基中のアミン基が、通常、ポリペプチドの共有結合性骨格の一部を形成する。
【0027】
「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基を有するポリペプチドの末端アミノ酸残基を指し、非Ｃ末端アミノ酸残基中のカルボキシル基が、通常、ポリペプチドの共有結合性骨格の一部を形成する。
【0028】
「Ｎ末端」とは、Ｃ末端よりもＮ末端に近い、ポリペプチドの領域を意味する。
【0029】
「Ｃ末端」とは、Ｎ末端よりもＣ末端に近い、ポリペプチドの領域を意味する。
【0030】
「可視光」及び「光」という用語は、人間の目が見ることができる電磁スペクトルのセグメントを指すために、本明細書では交換可能に使用される。典型的には、健康なヒトの眼は、波長が可視光スペクトルを形成する、約３８０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の波長を検出することができる。可視光スペクトルは、６つの異なる色を含む。赤色の光は、約７００ｎｍ～約６２０ｎｍの波長を有する。橙色の光は、約６２０ｎｍ～約５９７ｎｍの波長を有する。黄色の光は、約５９７ｎｍ～約５７７ｎｍの波長を有する。緑色の光は、約５７７ｎｍ～約４９２ｎｍの波長を有する。青色の光は、約４９２ｎｍ～約４５５ｎｍの波長を有する。紫色の光は、約４５５ｎｍ～約３８０ｎｍの波長を有する。
【0031】
本明細書で使用される「フラビン」という用語は、リボフラビン、並びにフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラボセミキノン、スルホリボフラビン、リボフラビンのエステル誘導体、リボフラビンテトラカルボキシレート、リボフラビン酢酸、リボフラビンテトラアセテート、リボフラビンプロピオン酸、ロセオフラビンなどのその誘導体及び類似体を指す。リボフラビンは、ビタミンＢ２としても知られている。
【0032】
ＦＧＬＹ含有タンパク質の光クリッピングを低減する方法
ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減する方法が提供される。本方法は、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することを含む。
ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減する方法が提供される。本方法は、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することを含む。
【0033】
ある特定の実施形態では、タンパク質の切断は、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で、例えば、分子も含む溶液中にタンパク質が存在する場合に、生じ得る。ある特定の実施形態では、分子は、５００ｎｍ以下、例えば、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を有する可視光への曝露によって光活性化される。ある特定の実施形態では、タンパク質の切断は、フラビンの存在下、例えば、フラビンも含む溶液中に、タンパク質が存在する場合に生じ得る。ある特定の実施形態では、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子は、フラビンであり得、例えば、フラビンは、５００ｎｍ以下、例えば、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を有する可視光への曝露によって光活性化される。ある特定の実施形態では、タンパク質の切断は、タンパク質を発現する細胞、細胞培養培地、又はその両方で生じ得る。細胞培養培地は、原核細胞又は真核細胞などの細胞を培養するために使用される、任意の標準的な成長培地であり得る。
【0034】
ある特定の実施形態では、本方法は、細胞を培養することを含み、細胞が、タンパク質を発現し、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、培養中に５００ｎｍ超の波長を有する可視光を使用することを含む。例えば、５００ｎｍ超の波長に限定された周囲光、すなわち、５００ｎｍ以下の波長を有する光を含まない周囲光の中で、細胞培養物はインキュベート及び／又は取り扱われ得る。ある特定の実施形態では、細胞培養物を取り扱うことは、細胞から細胞培養培地を分離するステップを含み得、このステップは、５００ｎｍ超の波長を有する光の中で実施される。したがって、培養中及び／又は細胞からの培養培地の分離中にタンパク質が曝露される可視光は、赤色の光、緑色の光（例えば、５００ｎｍ～５７７ｎｍの波長）、黄色の光、及び橙色の光のうちの１つ以上に限定され得る。ある特定の実施形態では、培養中及び／又は細胞からの培養培地の分離中にタンパク質が曝露される可視光は、緑色の光、黄色の光、及び橙色の光のうちの１つ以上に限定され得、赤色の光は含まれない。
【0035】
ある特定の実施形態では、細胞培養物は、実質的な量の可視光がインキュベータに入ることを可能にしないインキュベータ内に配置され得る。そのようなインキュベータは、光に対して実質的に不透過性である不透明な材料から作製されるインキュベータであり得る。加えて、インキュベータは、周囲光が５００ｎｍ超の波長を有するように収容され得、インキュベータドアが開かれ、細胞培養物が周囲光に曝露されるときに、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露に起因する切断から、そのような周囲光がタンパク質を保護する。ある特定の実施形態では、細胞培養物は、例えば、ガラスのドアを通じて、実質的な量の可視光がインキュベータに入ることを可能にするインキュベータ内に配置され得る。そのような実施形態では、インキュベータの周りの周囲光は、５００ｎｍ超の波長の光に限定され得る。ある特定の実施形態では、細胞培養物を、５００ｎｍ以下の波長を有する光に対して不透過性である容器内で成長させ、それによって、５００ｎｍ以下の波長を有する光への曝露から細胞培養物中の細胞によって発現されるタンパク質を保護する。ある特定の実施形態では、の切断を低減するための方法は、可視光の不在下でタンパク質を培養することを含み得る。
【0036】
ある特定の実施形態では、方法は、タンパク質を合成することを含み得、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長に限定された可視光の中でタンパク質を合成することを含む、すなわち、可視光は、５００ｎｍ以下の波長を有する光を含まない。ある特定の実施形態では、タンパク質が合成中に曝露される可視光の部分は、赤色の光、緑色の光（例えば、５００ｎｍ～５７７ｎｍの波長）、黄色の光、及び橙色の光のうちの１つ以上に限定され得る。ある特定の実施形態では、タンパク質が合成中に曝露される可視光の部分は、緑色の光（例えば、５００ｎｍ～５７７ｎｍの波長）、黄色の光、及び橙色の光のうちの１つ以上に限定され得、赤色の光は含まない。ある特定の実施形態では、切断を低減するための方法は、可視光の不在下でタンパク質を合成することを含み得る。
【0037】
ある特定の実施形態では、本方法は、細胞培養培地からタンパク質を精製することを含み得、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長に限定された可視光の中でタンパク質を精製することを含む。ある特定の実施形態では、タンパク質が精製中に曝露される可視光の部分は、赤色の光、緑色の光（例えば、５００ｎｍ～５７７ｎｍの波長）、黄色の光、及び橙色の光のうちの１つ以上に限定され得る。ある特定の実施形態では、タンパク質が精製中に曝露される可視光の部分は、緑色の光（例えば、５００ｎｍ～５７７ｎｍの波長）、黄色の光、及び橙色の光のうちの１つ以上に限定され得、赤色の光は含まない。ある特定の実施形態では、の切断を低減するための方法は、可視光の不在下でタンパク質を精製することを含み得る。ある特定の実施形態では、タンパク質を精製することは、細胞を細胞培養培地から分離すること、タンパク質が細胞内若しくは細胞上に位置する場合に細胞を処理すること、又はタンパク質が分泌される場合に細胞培養培地を処理することを含み得る。タンパク質が細胞内又は細胞上に位置する場合、細胞を処理することは、細胞を溶解させることを含み得る。
【0038】
タンパク質の培養、合成、及び／又は精製に使用される可視光は、５００ｎｍ超であり得、例えば、５００ｎｍ超の波長を有する可視光は、５１０ｎｍ超、５２０ｎｍ超、５３０ｎｍ超、５４０ｎｍ超、５５０ｎｍ超、又は最大約７００ｎｍまでの波長を有する可視光であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質を培養、合成、及び／又は精製するために使用される可視光は、５００ｎｍ超かつ６２０ｎｍ未満であり得、例えば、５００ｎｍ超の波長を有する可視光は、５１０ｎｍ～６２０ｎｍ未満、５２０ｎｍ～６２０ｎｍ未満、５３０ｎｍ～６２０ｎｍ未満、５４０ｎｍ～６２０ｎｍ未満、又は５５０ｎｍ～６２０ｎｍ未満の範囲の波長を有する可視光であり得る。
【0039】
ある特定の実施形態では、ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減するための方法は、５００ｎｍ～３８０ｎｍの範囲の波長を有する光へのタンパク質の曝露を避けながら、タンパク質を５５０ｎｍ～６１０ｎｍの波長の光に限定された可視光に曝露させることを含み得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子を含む溶液中に存在し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、フラビンを含む溶液中に存在し得る。
【0040】
ある特定の実施形態では、５００ｎｍ超の波長を有する可視光は、約３８０ｎｍ～約７００ｎｍ（例えば、４００ｎｍ～７００ｎｍ）の波長の光を含む可視光を、３８０ｎｍ～５００ｎｍの範囲の可視光の透過を大幅に遮断するフィルタを通過させることによって生成される。ある特定の実施形態では、３８０ｎｍ～５００ｎｍの範囲の可視光の透過を遮断するために、１つ以上のフィルタが利用され得る。１つ又は複数のフィルタは、３８０ｎｍ～５００ｎｍの波長の光を含む光を生成する光源に隣接して位置され得る。ある特定の実施形態では、５００ｎｍ超の波長を有する可視光は、そのような光を生成し、３８０ｎｍ～５００ｎｍの波長範囲の光を生成しない光源を使用することによって生成される。
【0041】
ある特定の実施形態では、１つ又は複数のフィルタは、バンドパスフィルタであり得る。バンドパスフィルタは、干渉フィルタであり得、例えば、積み重ねられた構成で配置された分布ブラッグ反射器（ＤＢＲ）を備え得る。ＤＢＲは、個々に使用される場合、狭線幅反射器として作用し得るが、近接して（例えば、透過波長に関連する指定された距離で）積み重ねられた構成で配置されると、ＤＢＲは、帯域の外側で高い反射度を有する狭帯域透過フィルタとして作用し得る。一実施形態によれば、バンドパスフィルタは、他の材料を使用することが可能であるが、ヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）などの材料を含み得る。バンドパスフィルタとして使用するためのＤＢＲは、ＧａＡｓ、並びに他の同様の材料（例えば、ヒ化インジウムガリウム（ＩｎＧａＡｓ）及び他）の堆積を介して製作することができる。異なる屈折率を有するＧａＡｓのドープされたバージョンは、ＤＢＲに必要な構造を生成することができる。最も単純な形態のバンドパスフィルタは、数ナノメートル（ｎｍ）程度の比較的狭いバンドパス（例えば、透過帯域）を有する。しかしながら、２つのＤＢＲ間の異なる屈折率を使用することによって、又はＤＢＲの層の厚さを変動させることによって、帯域幅は、これよりも実質的に広く（例えば、数十～数百ｎｍ）なるように調整され得る。
【0042】
光源としては、限定されないが、ＬＥＤランプ、白熱ランプ、蛍光ランプ、及びレーザーが挙げられる。レーザー又はＬＥＤの場合、フィルタは必要ではない場合があり、代わりに、出力は、所望の波長範囲内であり得る。例えば、タンパク質光クリッピングを保護するために、緑色ＬＥＤ（例えば、５００ｎｍ～５７７ｎｍの波長）、黄色ＬＥＤ、橙色ＬＥＤ、又は赤色ＬＥＤのうちの１つ以上が光源として使用され得る。ある特定の実施形態では、光クリッピングは、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子によって媒介され得る。ある特定の実施形態では、光クリッピングは、フラビンによって媒介され得る。
【0043】
ある特定の実施形態では、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子は、フラビンであり得る。ある特定の実施形態では、フラビンは、リボフラビン、ＦＭＮ、又はＦＡＤであり得る。ある特定の実施形態では、フラビンは、フラボセミキノン、スルホリボフラビン、リボフラビンのエステル誘導体、リボフラビンテトラカルボキシレート、リボフラビン酢酸、リボフラビンテトラアセテート、リボフラビンプロピオン酸、又はロセオフラビンであり得る。
【0044】
ｆＧｌｙ残基を含むタンパク質は、ｆＧｌｙ残基を含むように修飾されている任意のタンパク質であり得る。このタンパク質は、本明細書では標的タンパク質とも称される。標的タンパク質は、２つ以上のｆＧｌｙ残基、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、又は最大１０個以上のｆＧｌｙ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ｆＧｌｙ残基は、化学合成を使用して導入される。他の実施形態では、標的タンパク質は、ＦＧＥ認識部位に存在するシステイン又はセリン残基に対するＦＧＥの作用の結果としてｆＧｌｙ残基が存在する、タンパク質であり得る。ＦＧＥ認識部位は、本明細書ではスルファターゼモチーフとも称される。
【0045】
ある特定の実施形態では、ｆＧｌｙ残基は、タンパク質コンフォメーションに悪影響を及ぼさない位置の標的ポリペプチドに位置する。いくつかの実施形態では、ＦＧＥ認識部位（ＦＲＳ）は、折り畳まれている場合（例えば、無細胞環境、通常は、無細胞生理学的環境において）及び／又は細胞膜内又は細胞膜上に提示される場合（例えば、膜貫通タンパク質などの細胞膜会合ポリペプチドでは）、その構造を考慮して、標的ポリペプチドに位置することが望ましい。例えば、ＦＲＳは、折り畳まれた標的ポリペプチドの溶媒アクセス可能な部位に位置し得る。したがって、折り畳まれたポリペプチドの溶媒アクセス可能なＦＲＳは、セリン又はシステインのｆＧｌｙへの変換のためにＦＧＥにアクセス可能である。同様に、アルデヒドタグ付きポリペプチドの溶媒アクセス可能なｆＧｌｙ残基は、目的の部分へのコンジュゲートのための反応性パートナー試薬にアクセス可能である。ＦＲＳが溶媒アクセス可能な部位に位置する場合、タンパク質を変性させることを必要とせずに、ＦＧＥが媒介するインビトロでの変換、及び反応性パートナーとの反応による部分とのコンジュゲーションを実施することができる。また、溶媒アクセス可能な部位としては、（例えば、標的ポリペプチドの膜貫通領域以外の）宿主細胞内で発現される場合、細胞外又は細胞内細胞表面で曝露される、標的ポリペプチド領域を挙げることができる。
【0046】
したがって、１つ以上のＦＲＳは、例えば、溶媒アクセス可能なＮ末端、溶媒アクセス可能なＮ末端領域、溶媒アクセス可能なＣ末端、溶媒アクセス可能なＣ末端領域、及び／又はループ構造（例えば、細胞外ループ構造及び／又は細胞内ループ構造）から独立して選択される部位に提供され得る。いくつかの実施形態では、ＦＲＳは、ポリペプチドのＣ末端以外の部位に位置する。他の実施形態では、ＦＲＳが位置するポリペプチドは、全長ポリペプチドである。
【0047】
他の実施形態では、ＦＲＳは、天然標的ポリペプチドにおいて翻訳後修飾されている部位に位置する。例えば、ＦＲＳは、天然標的ポリペプチドにおけるグリコシル化（例えば、Ｎ－グリコシル化、Ｏ－グリコシル化）、リン酸化、硫酸化、ユビキチン化、アシル化、メチル化、プレニル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化の部位などに導入され得る。多様な翻訳後修飾部位のコンセンサス配列、及びポリペプチドにおける翻訳後修飾部位の同定のための方法は、当該技術分野で周知である。翻訳後修飾部位は、ポリペプチドの天然に存在する部位、又は（例えば、ＥＰＯのハイパーグリコシル化バリアントのグリコシル化部位におけるように）ポリペプチドに（例えば、組換え技法を介して）非天然である翻訳後修飾部位を含むように操作されているそのような部位であり得ることが理解される。後者の実施形態では、非天然翻訳後修飾部位を有し、目的の生物学的活性を呈することが実証されているポリペプチドは、特定の目的のものである。
【0048】
ＦＲＳは、（例えば、天然アミノ酸配列内の５又は６つのアミノ酸残基挿入を提供するような）挿入によって、又は（例えば、標的ポリペプチドのＮ又はＣ末端での）付加によって、標的ポリペプチドに提供され得る。ＦＲＳはまた、ＦＲＳの連続したアミノ酸配列を用いる天然アミノ酸残基の完全な又は部分的な置換によって提供され得る。例えば、異種ＦＲＳは、天然アミノ酸配列の１、２、３、４、又は５つ（又は１、２、３、４、５、又は６つ）のアミノ酸残基を、ＦＲＳの対応するアミノ酸残基で置き換えることによって、標的ポリペプチドに提供され得る。アルデヒドタグのｆＧｌｙの同じ部分又は異なる部分の付着を提供するために、２つ以上のＦＲＳを有する標的ポリペプチドが使用され得る。
【0049】
標的ポリペプチドは、任意のタンパク質又はペプチド、例えば、組換えタンパク質又はペプチドであり得る。標的ポリペプチドは、融合タンパク質、抗体（ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＭ、ＩｇＡ）、酵素（例えば、プロテアーゼ）、ホルモン、成長因子、受容体、リガンド、糖タンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質など、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。標的タンパク質の例としては、サイトカインが挙げられ、サイトカインは、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γなど）、ケモカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７など）、リンホカイン、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ－αなど）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）などであり得る。一実施形態では、標的ポリペプチドは、治療利益、特に、部分への付着が、例えば、標的薬物送達、血清半減期の増加、有害な免疫応答の減少、追加若しくは代替的な生物学的活性若しくは機能性など、又は有害な副作用の他の利益若しくは低減のうちの１つ以上を提供することができるポリペプチドを提供し得る。治療用ポリペプチドが、ワクチン用の抗原である場合、修飾は、ポリペプチドの免疫原性の向上を提供することができる。
【0050】
治療用タンパク質のクラスの例としては、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、抗体、及び抗原であるものが挙げられる。更なる例としては、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－オメガ、コンセンサスインターフェロンなど）、インスリン、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩなど）、血液因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）など）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）など）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ－ベータ、ＴＧＦ－アルファ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１２など）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＲＡＮＴＥＳなどが挙げられる。
【0051】
更なる例としては、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗原結合断片（例えば、Ｆ（ａｂ）’、Ｆａｂ、Ｆｖ）、一本鎖抗体、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡなどが挙げられる。特に目的のものは、腫瘍抗原、免疫細胞抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８など）、微生物の抗原、特に病原性微生物（例えば、細菌、ウイルス、真菌、又は寄生抗原）などに特異的に結合する抗体である。ｆＧｌｙ残基を使用して付着することができる目的の部分としては、薬物（例えば、低分子）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、検出可能な標識などが挙げられる。
【0052】
作業実施例に説明されるように、細胞培養培地中に存在するリボフラビンは、可視光、特に、リボフラビンによって吸収される３８０～５００ｎｍの範囲の波長を有する光に曝露すると、細胞によって発現されるｆＧｌｙタンパク質の切断を引き起こす。したがって、本明細書に開示される方法では、少なくとも、タンパク質がリボフラビン又はその誘導体若しくは類似体から分離されるまで、３８０～５００ｎｍの範囲の波長を有する光への曝露を限定することによって、標的タンパク質は、切断から保護される。
【0053】
ＦＧＬＹ含有タンパク質の光クリッピングを誘導する方法
標的領域がホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含む、標的領域においてタンパク質の切断を誘導する方法が開示される。本方法は、タンパク質を、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、タンパク質を３２５ｎｍ～５００ｎｍ、３２５ｎｍ～４９５ｎｍ、３５０ｎｍ～５００ｎｍ、３５０ｎｍ～４８０ｎｍ、又は３５０ｎｍ～４５０ｎｍの波長を有する光に曝露させることを含み得る。ある特定の実施形態では、光は、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長に限定され、５００ｎｍ超、例えば、５１０ｎｍ～７００ｎｍの波長の光を含まない。
標的領域がホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含む、標的領域においてタンパク質の切断を誘導する方法が開示される。本方法は、タンパク質を、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、タンパク質を３２５ｎｍ～５００ｎｍ、３２５ｎｍ～４９５ｎｍ、３５０ｎｍ～５００ｎｍ、３５０ｎｍ～４８０ｎｍ、又は３５０ｎｍ～４５０ｎｍの波長を有する光に曝露させることを含み得る。ある特定の実施形態では、光は、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長に限定され、５００ｎｍ超、例えば、５１０ｎｍ～７００ｎｍの波長の光を含まない。
【0054】
ある特定の実施形態では、タンパク質は、細胞培養培地、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞を培養するために使用される標準的な成長培地、又は哺乳動物細胞などの真核細胞を培養するために使用される標準的な成長培地中に存在し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子を含む溶液中に存在し得る。ある特定の実施形態では、分子は、塩素、ポルフィセン、フタロシアニン、及びナフタロシアニンなどのポルフィリン及びそれらのテトラピロール類似体などの光増感剤である。本明細書で使用される場合、光増感剤という用語は、可視光の吸収によって光活性化され、一重項酸素種を放出する分子を指す。ある特定の実施形態では、分子は、３８０ｎｍ～５００ｎｍの波長の可視光を吸収する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、フラビンを含む溶液中に存在し得る。ある特定の実施形態では、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子は、フラビンであり得る。ある特定の実施形態では、標的領域がｆＧｌｙアミノ酸を含む、標的領域におけるタンパク質の切断を誘導する方法は、タンパク質及び光増感剤を含む溶液を可視光に曝露させることを含み得る。光増感剤は、可視光の吸収によって光活性化され、一重項酸素種を放出する任意の分子であり得る。実施例の段落で説明されているように、リボフラビンは、可視光に曝露されるとｆＧｌｙ含有タンパク質の切断を媒介する光増感剤である。
【0055】
曝露の長さ及び／又は分子（例えば、フラビン）の量は、変動させてもよく、経験的に決定することができる。タンパク質が光に曝露される期間はまた、光の強度及び／又は分子（例えば、フラビン）の濃度及び／又は温度を増加させることによって、変動させてもよい。ある特定の実施形態では、タンパク質及び分子（例えば、フラビン）を含有する溶液は、１分～４８時間、３分～４０時間、５分～３６時間、１０分～２４時間、１５分～２０時間、２０分～１０時間、１分～１時間、３分～３０分、１分～３０分、５分～３０分、又は１０分～３０分の期間の間、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露され得る。溶液中の分子（例えば、リボフラビンなどのフラビン）の濃度は、少なくとも０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ、又はそれ以上、例えば、最大２０μＭであり得る。ｆＧｌｙ残基での光クリッピングを誘導するためにタンパク質を光に曝露させる場合、タンパク質及び分子（例えば、フラビン）を含む溶液は、４℃、室温、３７℃、又はより高い温度、例えば、最大６０℃、又は約４℃～６０℃の間の任意の温度でインキュベートされ得る。
【0056】
ある特定の実施形態では、タンパク質は、ＬＥＤランプ、白熱ランプ、蛍光ランプ、又はレーザーなどの任意の好適な光源を使用することによって、分子（例えば、フラビン）の存在下で可視光に曝露され得る。タンパク質のフラビンが媒介する（例えば、リボフラビンが媒介する）光クリッピングを誘導するために、例えば、紫色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、又は紫色及び青色ＬＥＤが使用され得る。
【0057】
光に曝露されるタンパク質及び分子（例えば、フラビン）を含有する溶液は、緩衝液、例えば、７～８、例えば、約７．４のｐＨを有する緩衝液を含む、溶液であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、細胞によって発現されるタンパク質であり得、ある特定の実施形態では、タンパク質を発現する細胞から細胞培養培地中に分泌される。そのような実施形態では、細胞培養培地中に存在する光活性化されて一重項酸素種を放出する分子（例えば、フラビン）は、切断を誘導するのに十分であり得、単離された分子（例えば、フラビン）の追加は必要ではない。ある特定の実施形態では、細胞培養培地中に存在するフラビンは、フラビンを培地に添加することによって補充され得る。
【0058】
ある特定の実施形態では、フラビンは、リボフラビン、ＦＭＮ、又はＦＡＤであり得る。ある特定の実施形態では、フラビンは、フラボセミキノン、スルホリボフラビン、リボフラビンのエステル誘導体、リボフラビンテトラカルボキシレート、リボフラビン酢酸、リボフラビンテトラアセテート、リボフラビンプロピオン酸、又はロセオフラビンであり得る。
【0059】
ある特定の実施形態では、本方法は、タンパク質の標的領域にホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位を導入するステップを含み得る。ＦＧｌｙ残基を含むタンパク質は、ｆＧｌｙ残基に隣接する切断を引き起こすことによって反応する、任意のタンパク質であり得る。このタンパク質は、本明細書では標的タンパク質とも称される。ある特定の態様では、標的タンパク質は、分泌シグナル（例えば、シグナルペプチド）を含む、タンパク質であり得る。分泌シグナルは、タンパク質のＮ末端に存在し得、ｆＧｌｙ残基は、分泌シグナルとタンパク質の残りの部分のタンパク質のＮ末端との間に位置する標的領域に含まれ得る。（フラビン、例えば、リボフラビンを含む）細胞培養培地中の分泌タンパク質を、可視光、例えば、波長３００ｎｍ～５００ｎｍを有する光に曝露させると、分泌シグナルは切断され得る。
【0060】
別の実施形態では、タンパク質は、タグ、例えば、Ｎ末端又はＣ末端の精製タグを含み得る。ｆＧｌｙ残基は、タグと、タンパク質の残りの部分のタンパク質のＮ末端又はＣ末端との間に位置する標的部位に存在し得る。タンパク質が精製された後、タグは、開示の方法によって切断され得る。いくつかの実施形態では、フラビンが媒介するタンパク質の光クリッピングを防止するための、タンパク質の培養及び／又は精製は、前の段落に開示されるように実施され得る。タンパク質が精製されると、精製タグは、フラビンの存在下で可視光（例えば、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光）に曝露させることによる光クリッピングを誘導することによって除去され得る。
【0061】
主題の方法を使用して切断されるタンパク質は、前の段落に記載の治療用タンパク質などの任意のタンパク質であり得る。
【0062】
別の実施形態では、タンパク質は、Ｆｃ領域を含む抗体であり、標的領域は、抗体のＦｃ領域とＣＨ１ドメインとの間に位置する。標的領域内のｆＧｌｙ残基を切断することによって、Ｆａｂ及びＦｃ断片の生成が生じる。
【0063】
別の実施形態では、タンパク質は、タンパク質を発現する細胞の細胞膜と会合し得る。タンパク質は、膜貫通領域を含み得る。ｆＧｌｙ残基は、膜貫通領域に対するＮ末端又は膜貫通領域に対するＣ末端である、標的領域に位置し得る。タンパク質は、アンカー部分、例えば、脂質部分を介して膜に付着し得る。ｆＧｌｙ残基は、アンカー部分の付着領域の前に、タンパク質のＣ末端にあるか、又はそれに隣接する標的領域に位置し得る。本明細書に開示の方法を使用する標的部位での切断は、膜会合タンパク質を細胞表面から放出するために使用され得る。
【0064】
ＦＧＥ認識部位（ＦＲＳ）
前の段落に記載されるように、１つ以上のｆＧｌｙ残基は、標的タンパク質に存在し得る。１つ以上のｆＧｌｙ残基は、化学合成を使用することによって導入され得る。他の実施形態では、１つ以上のｆＧｌｙ残基は、スルファターゼモチーフに対するＦＧＥの作用によって生成され、これによって、モチーフにおけるシステイン又はセリンの酸化がもたらされて、ｆＧｌｙ残基が生成される。本明細書で使用される場合、「スルファターゼモチーフ」及び「ＦＧＥ認識部位」という用語は、交換可能に使用され、ＦＧＥによって認識されるアミノ酸の連続配列を指す。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、スルファターゼモチーフを天然に含み得る。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、スルファターゼモチーフを含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、切断が所望されるタンパク質の位置に存在するスルファターゼモチーフは、標的部位であっても、標的部位内に位置してもよい。
前の段落に記載されるように、１つ以上のｆＧｌｙ残基は、標的タンパク質に存在し得る。１つ以上のｆＧｌｙ残基は、化学合成を使用することによって導入され得る。他の実施形態では、１つ以上のｆＧｌｙ残基は、スルファターゼモチーフに対するＦＧＥの作用によって生成され、これによって、モチーフにおけるシステイン又はセリンの酸化がもたらされて、ｆＧｌｙ残基が生成される。本明細書で使用される場合、「スルファターゼモチーフ」及び「ＦＧＥ認識部位」という用語は、交換可能に使用され、ＦＧＥによって認識されるアミノ酸の連続配列を指す。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、スルファターゼモチーフを天然に含み得る。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、スルファターゼモチーフを含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、切断が所望されるタンパク質の位置に存在するスルファターゼモチーフは、標的部位であっても、標的部位内に位置してもよい。
【0065】
任意のスルファターゼモチーフ配列は、標的タンパク質に含まれ得る。いくつかの実施形態では、スルファターゼモチーフにおけるＣ又はＳ残基をｆＧｌｙに変換するために、スルファターゼモチーフを認識するＦＧＥは、標的タンパク質を発現する細胞によって産生されるか、又は細胞培養培地若しくは精製されたタンパク質に添加されるかのいずれかである。
【0066】
ＦＧＥは、真核生物ＦＧＥ（例えば、ヒトＦＧＥを含む哺乳動物ＦＧＥ）又は原核生物ＦＧＥであり得る。ＦＧＥは、修飾されたＦＧＥが由来する野生型ＦＧＥと比較して、修飾されたＦＧＥが、異なるか又は追加のスルファターゼモチーフを認識するような、修飾されたＦＧＥであり得る。
【0067】
スルファターゼモチーフは、以下の式を有し得、
Ｘ１（Ｃ／Ｓ）Ｘ２（Ｐ／Ａ）Ｘ２Ｚ３
式中、
Ｘ１が、存在しても不在であってもよく、存在する場合、任意のアミノ酸であり得るが、通常、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、又は極性非帯電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸又は帯電アミノ酸以外）、通常、Ｌ、Ｍ、Ｓ、又はＶであり得、ただし、スルファターゼモチーフが、標的ポリペプチドのＮ末端にある場合、Ｘ１が存在することを条件とし、
Ｘ２及びＸ３が、独立して、任意のアミノ酸であり得るが、通常、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、又は極性非帯電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸又は帯電アミノ酸以外）、通常、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｇ、又はＣ、より通常には、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｖ、又はＧであり得、
Ｚ３が、塩基性アミノ酸（アルギニン（Ｒ）以外であり得、リジン（Ｋ）又はヒスチジン（Ｈ）、通常、リジンであり得る）、又は脂肪族アミノ酸（アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、又はプロリン（Ｐ）、通常、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、又はＩであり得る。
Ｘ１（Ｃ／Ｓ）Ｘ２（Ｐ／Ａ）Ｘ２Ｚ３
式中、
Ｘ１が、存在しても不在であってもよく、存在する場合、任意のアミノ酸であり得るが、通常、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、又は極性非帯電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸又は帯電アミノ酸以外）、通常、Ｌ、Ｍ、Ｓ、又はＶであり得、ただし、スルファターゼモチーフが、標的ポリペプチドのＮ末端にある場合、Ｘ１が存在することを条件とし、
Ｘ２及びＸ３が、独立して、任意のアミノ酸であり得るが、通常、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、又は極性非帯電アミノ酸（すなわち、芳香族アミノ酸又は帯電アミノ酸以外）、通常、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｇ、又はＣ、より通常には、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｖ、又はＧであり得、
Ｚ３が、塩基性アミノ酸（アルギニン（Ｒ）以外であり得、リジン（Ｋ）又はヒスチジン（Ｈ）、通常、リジンであり得る）、又は脂肪族アミノ酸（アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、又はプロリン（Ｐ）、通常、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、又はＩであり得る。
【0068】
スルファターゼモチーフの例としては、以下のコンセンサス配列が挙げられる：
Ｘ１ＳＸ２ＰＸ２Ｒ
Ｘ１ＳＸ２ＰＸ２Ｒ
【0069】
スルファターゼモチーフの別の例としては、以下のコンセンサス配列が挙げられる：
Ｘ１ＣＸ２ＰＸ２Ｒ
Ｘ１ＣＸ２ＰＸ２Ｒ
【0070】
スルファターゼモチーフの具体例としては、ＬＣＴＰＳＲ、ＭＣＴＰＳＲ、ＶＣＴＰＳＲ、ＬＣＳＰＳＲ、ＬＣＡＰＳＲ ＬＣＶＰＳＲ、ＬＣＧＰＳＲ、ＩＣＴＰＡＲ、ＬＣＴＰＳＫ、ＭＣＴＰＳＫ、ＶＣＴＰＳＫ、ＬＣＳＰＳＫ、ＬＣＡＰＳＫ、ＬＣＶＰＳＫ、ＬＣＧＰＳＫ、ＬＣＴＰＳＡ、ＩＣＴＰＡＡ、ＭＣＴＰＳＡ、ＶＣＴＰＳＡ、ＬＣＳＰＳＡ、ＬＣＡＰＳＡ、ＬＣＶＰＳＡ、ＬＣＧＰＳＡ、ＬＳＴＰＳＲ、ＬＣＴＡＳＲ、及びＬＣＴＡＳＡが挙げられる。他の特定のスルファターゼモチーフは、本明細書に提供される開示から容易に明らかである。標的タンパク質は、そのようなスルファターゼモチーフのうちの１つ以上を含み得る。
【0071】
ＦＧＥ認識部位を含む標的ポリペプチドの修飾
１つ以上のＦＧＥ認識部位を含むように標的ポリペプチドを修飾することは、所望の標的ポリペプチドをコードする核酸を産生するように、組換え分子遺伝子技法を使用して達成され得る。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、クローニング方法、部位特異的変異方法などが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（ｅｄｓ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９０及び追録を参照されたい）。代替的に、例えば、１つ以上のＦＧＥ認識部位を標的ポリペプチドのＣ末端に付加するために、非組換え技法を使用して、例えば、天然化学ライゲーション又は擬似天然化学ライゲーションを使用して、１つ以上のＦＧＥ認識部位は、付加され得る（例えば、ＵＳ６，１８４，３４４、ＵＳ６，３０７，０１８、ＵＳ６，４５１，５４３、ＵＳ６，５７０，０４０、ＵＳ２００６／０１７３１５９、ＵＳ２００６／０１４９０３９を参照されたい）。Ｒｕｓｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊａｎ ５，２００６）Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．８（１）：１３１－４も参照されたい。
１つ以上のＦＧＥ認識部位を含むように標的ポリペプチドを修飾することは、所望の標的ポリペプチドをコードする核酸を産生するように、組換え分子遺伝子技法を使用して達成され得る。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、クローニング方法、部位特異的変異方法などが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（ｅｄｓ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９０及び追録を参照されたい）。代替的に、例えば、１つ以上のＦＧＥ認識部位を標的ポリペプチドのＣ末端に付加するために、非組換え技法を使用して、例えば、天然化学ライゲーション又は擬似天然化学ライゲーションを使用して、１つ以上のＦＧＥ認識部位は、付加され得る（例えば、ＵＳ６，１８４，３４４、ＵＳ６，３０７，０１８、ＵＳ６，４５１，５４３、ＵＳ６，５７０，０４０、ＵＳ２００６／０１７３１５９、ＵＳ２００６／０１４９０３９を参照されたい）。Ｒｕｓｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊａｎ ５，２００６）Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．８（１）：１３１－４も参照されたい。
【0072】
ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）
スルファターゼモチーフにおけるシステイン又はセリンをｆＧｌｙに酸化する任意の酵素は、本明細書では「ホルミルグリシン生成酵素」又は「ＦＧＥ」と称される。したがって、上で考察されたように、「ＦＧＥ」は、スルファターゼモチーフのシステイン（Ｃ）のｆＧｌｙへの変換を媒介するｆＧｌｙ生成酵素として作用することができる任意の酵素、又はスルファターゼモチーフのセリン（Ｓ）のｆＧｌｙへの変換を媒介することができるものを指すために本明細書で使用される。概して、文献は、スルファターゼモチーフ中でＦＧＥとしてＣをｆＧｌｙに変換するｆＧｌｙ生成酵素を指し、スルファターゼモチーフ中でＡｔｓ－ＢなどとしてＳをｆＧｌｙに変換する酵素を指すことを留意されるべきである。しかしながら、本開示の目的では、「ＦＧＥ」は、一般的には、適切なＦＧＥが適切なスルファターゼモチーフを含有する（すなわち、Ｃ含有又はＳ含有）標的反応性パートナーに従って選択されるであろうという理解の下で、スルファターゼモチーフにおけるｆＧｌｙ生成酵素活性を呈する、任意の種類の酵素を指すために使用される。
スルファターゼモチーフにおけるシステイン又はセリンをｆＧｌｙに酸化する任意の酵素は、本明細書では「ホルミルグリシン生成酵素」又は「ＦＧＥ」と称される。したがって、上で考察されたように、「ＦＧＥ」は、スルファターゼモチーフのシステイン（Ｃ）のｆＧｌｙへの変換を媒介するｆＧｌｙ生成酵素として作用することができる任意の酵素、又はスルファターゼモチーフのセリン（Ｓ）のｆＧｌｙへの変換を媒介することができるものを指すために本明細書で使用される。概して、文献は、スルファターゼモチーフ中でＦＧＥとしてＣをｆＧｌｙに変換するｆＧｌｙ生成酵素を指し、スルファターゼモチーフ中でＡｔｓ－ＢなどとしてＳをｆＧｌｙに変換する酵素を指すことを留意されるべきである。しかしながら、本開示の目的では、「ＦＧＥ」は、一般的には、適切なＦＧＥが適切なスルファターゼモチーフを含有する（すなわち、Ｃ含有又はＳ含有）標的反応性パートナーに従って選択されるであろうという理解の下で、スルファターゼモチーフにおけるｆＧｌｙ生成酵素活性を呈する、任意の種類の酵素を指すために使用される。
【0073】
活性部位にｆＧｌｙを有するスルファターゼの遍在的な存在によって証明されるように、ＦＧＥは、真核生物及び原核生物の両方を含む多種多様な細胞型に見出される。ＦＧＥには少なくとも２つの形態が存在する。真核生物のスルファターゼは、それらのスルファターゼモチーフにシステインを含有し、「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥによって修飾される（Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００３，１１３，（４），４４５－５６、Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００３，１１３，（４），４３５－４４）。ｆＧｌｙ生成酵素（ＦＧＥ）は、ＳＵＭＦ１遺伝子によってコードされる。原核生物のスルファターゼは、それらのスルファターゼモチーフにシステイン又はセリンのいずれかを含有し得、それぞれ、「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥ又は「ＡｔｓＢ型」ＦＧＥのいずれかによって修飾される（Ｓｚａｍｅｉｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９，２７４，（２２），１５３７５－８１）。真核生物において、この修飾は、共翻訳的に、又は小胞体（ＥＲ）における翻訳の直後に生じると考えられる（Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７，９４（２２）：１１９６３－８）。理論を固持するものではないが、原核生物では、ＳＵＭＦ１型ＦＧＥは、細胞質で機能し、ＡｔｓＢ型ＦＧＥは、細胞膜の近く又は細胞膜で機能すると考えられる。脊椎動物及び棘皮動物を含む後口動物のＳＵＭＦ２ ＦＧＥについても記載されている（例えば、Ｐｅｐｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１３，４４５－４５６、Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１３，４３５－４４４、Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２３，５７６－５８１を参照されたい）。
【0074】
概して、標的ポリペプチドのスルファターゼモチーフにおけるシステイン又はセリンのｆＧｌｙへの変換を容易にするために使用されるＦＧＥは、標的ポリペプチドに存在するスルファターゼモチーフに従って選択される。ＦＧＥは、標的ポリペプチドが発現される宿主細胞に対して天然であり得るか、又は宿主細胞は、適切なＦＧＥを発現するように遺伝子修飾され得る。いくつかの実施形態では、ヒトＦＧＥ（例えば、ＳＵＭＦ１型ＦＧＥ、例えば、Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １１３，４４５－５６（２００３）、Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １１３，４３５－４４（２００３）を参照されたい）と適合性のあるスルファターゼモチーフを使用すること、及びＦＧＥを発現するヒト細胞において、又は宿主細胞において、通常、ヒトＦＧＥを発現するように遺伝子修飾された哺乳動物細胞において標的タンパク質を発現することが望ましい場合がある。
【0075】
概して、本明細書に開示される方法での使用のためのＦＧＥは、天然型供給源から得ることができるか、又は合成的に生成され得る。例えば、適切なＦＧＥは、ＦＧＥを天然に生成するか、又はＦＧＥをコードする組換え遺伝子を発現するように遺伝子修飾されている生物学的供給源に由来し得る。多くのＦＧＥをコードする核酸は、当該技術分野で既知であり、容易に利用可能である（例えば、Ｐｒｅｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（１５）：１４９００－１０（Ｅｐｕｂ ２００５ Ｊａｎ １８）、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．７９（１５）：１４５７０－８（Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊａｎ ２８）、Ｌａｎｄｇｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．２００３ Ｏｃｔ １６；３１６：４７－５６、Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２３（１）：６１－５、Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００３ Ｍａｙ １６；１１３（４）：４３５－４４、Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３ Ｍａｙ １６）Ｃｅｌｌ １１３（４）：４４５－５６、Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ（２００３ Ｍａｙ １６）Ｃｅｌｌ １１３（４）：４２１－２（考察）、Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００５ Ｍａｙ ２０；１２１（４）：５４１－５２、Ｒｏｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６ Ｊａｎ ３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（１）：８１－６、Ｓａｒｄｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（２００５ Ｎｏｖ １）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１４（２１）：３２０３－１７、ＷＯ２００４／０７２２７５、及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１８２７６０を参照されたい。したがって、本開示は、標的ポリペプチドに存在するＦＲＳとの使用に適合性のあるＦＧＥを発現するように遺伝子修飾された組換え宿主細胞を提供する。一実施形態では、ＦＧＥは、結核マイコバクテリウム（Ｍｔｂ）から得られ、例示的なＭｔｂ ＦＧＥは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ番号ＮＰ＿２１５２２６（ｇｉ：１５６０７８５２）で提供されるアミノ酸配列を有するものである。
【0076】
無細胞がスルファターゼモチーフ含有ポリペプチドを変換するために使用される場合、単離されたＦＧＥが使用され得る。任意の好都合なタンパク質精製手順は、ＦＧＥを単離するために使用され得、例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（Ｄｅｕｔｈｓｅｒ ｅｄ．）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）を参照されたい。例えば、ライセートは、所望のＦＧＥを産生する細胞から調製され得、例えば、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、親和性クロマトグラフィーなどを使用して精製されたＦＧＥ。
【0077】
ＦＧＬＹポリペプチドの産生のための発現ベクター及び宿主細胞
本開示は、ＦＲＳを含む標的ポリペプチド又はＦＲＳをコードする核酸、並びに核酸を含有する構築物及び宿主細胞を提供する。そのような核酸は、ＦＲＳ、又はＦＲＳを含む標的ポリペプチドをコードし、ほとんどの実施形態では、適切な条件下で、発現されることが可能であるオープンリーディングフレームを有するＤＮＡの配列を含む。「核酸」は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びそのような核酸を含むベクターを包含する。
本開示は、ＦＲＳを含む標的ポリペプチド又はＦＲＳをコードする核酸、並びに核酸を含有する構築物及び宿主細胞を提供する。そのような核酸は、ＦＲＳ、又はＦＲＳを含む標的ポリペプチドをコードし、ほとんどの実施形態では、適切な条件下で、発現されることが可能であるオープンリーディングフレームを有するＤＮＡの配列を含む。「核酸」は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びそのような核酸を含むベクターを包含する。
【0078】
ＦＲＳ、並びにＦＲＳを含む標的ポリペプチドをコードする核酸が、本明細書で提供される。そのような核酸としては、ＦＧＥ認識部位をコードする配列の挿入によって修飾されたゲノムＤＮＡ、及び標的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが挙げられる。本明細書で使用される「ｃＤＮＡ」という用語は、天然成熟ｍＲＮＡ種（スプライスバリアントを含む）に見出される配列要素の配置を共有する全ての核酸を含むことを意図しており、配列要素は、エクソン、並びに３’及び５’非コード領域である。通常、ｍＲＮＡ種は、連続したエクソンを有し、介在するイントロンが存在する場合、核ＲＮＡスプライシングによって除去されて、主題発明によるタンパク質をコードする連続的なオープンリーディングフレームを作製する。
【0079】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド（例えば、ＦＧＥ認識部位を含むポリペプチド）をコードするオープンリーディングフレーム、及び任意選択で任意のイントロンを有する核酸を意図し、発現の調節に関与する隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列（例えば、転写及び／又は翻訳の調節因子、例えば、プロモータ、エンハンサ、翻訳調節シグナルなど）を、コード領域を最大約２０ｋｂ超えるが、更に可能性としていずれかの方向で更に含み得、隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列が、コード配列に対して内因性又は異種性であり得る。転写領域の５’又は３’末端のいずれかで、約１ｋｂ、更に可能性としてそれ以上の隣接するゲノムＤＮＡを含む、プロモータ、エンハンサなどの転写及び翻訳調節配列が含まれ得る。
【0080】
本明細書で企図される核酸は、ベクター（構築物とも称される）の一部として提供され得、多種多様なベクターが当該技術分野で既知であり、本明細書で詳述される必要はない。例示的なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）、非ウイルスベクター、人工染色体（ＹＡＣ、ＢＡＣなど）、ミニ染色体などが挙げられる。
【0081】
ベクターの選択は、伝播が望ましい細胞の型及び伝播の目的などの様々な因子に依存するであろう。ある特定のベクターは、大量の所望のＤＮＡ配列を増幅及び作製するのに有用である。他のベクターは、培養物中の細胞における発現に好適である。なお他のベクターは、動物全体の細胞における移動及び発現に好適である。適切なベクターの選択は、十分当該技術分野内である。そのようなベクターの多くが市販されている。
【0082】
構築物を調製するために、ポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターの切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ付着の手段によって、ベクターに挿入される。代替的に、所望のヌクレオチド配列は、相同組換え又は部位特異的組換えによって挿入され得る。
【0083】
ベクターは、宿主細胞内で染色体外維持を提供し得るか、又は宿主細胞ゲノム内に組み込みを提供し得る。ベクターは、当業者に周知の無数の刊行物に十分に記載されている。使用され得る例示的なベクターとしては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡに由来するものが挙げられる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １９／１８、ｐＵＣ １１８、１１９、及びＭ１３ ｍｐ系列のベクターなどのプラスミドベクターが使用され得る。バクテリオファージベクターは、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８～２３、λＺＡＰ／Ｒ、及びＥＭＢＬ系列のバクテリオファージベクターを含み得る。利用され得るコスミドベクターとしては、限定されないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ １０３、ｐＣＶ １０７、ｐＣＶ １０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６、及びｃｈａｒｏｍｉｄ９系列のベクターが挙げられる。代替的に、組換えウイルスベクターは、操作され得、限定されないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来するものが挙げられる。
【0084】
目的のポリペプチドの発現には、発現カセットが用いられ得る。したがって、本発明は、主題の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。発現ベクターは、転写及び翻訳調節配列を提供し、誘導性又は構成的な発現を提供し得、コード領域が、転写開始領域の転写制御、並びに転写及び翻訳終端領域下で操作可能に連結される。これらの制御領域は、ポリペプチド（例えば、標的ポリペプチド又はＦＧＥ）をコードする遺伝子に対して天然であり得るか、又は外因的供給源に由来し得る。概して、転写調節配列及び翻訳調節配列は、限定されないが、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサ又は活性化配列を含み得る。
【0085】
発現ベクターは概して、プロモータ配列の近くに位置する好都合な制限部位を有し、対象のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主内で操作性の選択可能なマーカーは、ベクターを含む細胞の選択を容易にするために存在し得る。選択遺伝子は、当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞と共に変化するであろう。
【0086】
ＦＲＳをコードする核酸、及び標的ポリペプチドをコードする核酸のフレーム内挿入のためのタグ－コード配列に隣接する好適な制限部位を含む、ＦＧＥ認識部位（ＦＲＳ）コードカセットも本明細書で提供される。そのような発現構築物は、標的ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端でのＦＲＳの付加を提供することができる。ＦＲＳカセットは、プロモータ配列に操作可能に連結されて、ＦＲＳを含む結果として生じるポリペプチドの発現を提供することができ、１つ以上の選択可能なマーカーを更に含み得る。
【0087】
本開示はまた、ＦＲＳを含む（例えば、Ｃ末端に、Ｎ末端に位置するＦＲＳを有する）ポリペプチドを産生するための発現カセットを提供する。そのような発現カセットは、概して、ＦＲＳコード配列を含む第１の核酸、及び目的のポリペプチドをコードする第２の核酸の挿入のための少なくとも１つの制限部位を含む。制限部位は、ＦＲＳコード配列の５’及び／又は３’に位置し得る。ＦＲＳコード配列を含むフレーム内のポリペプチドコード配列の挿入は、本明細書に記載のＦＲＳ含有ポリペプチドである融合タンパク質をコードする組換え核酸の産生を提供する。そのような発現カセットを含有する構築物はまた、概して、産生されるＦＲＳ含有ポリペプチドの発現を提供するために、発現カセットに操作可能に連結されたプロモータを含む。発現構築物の他の構成要素は、選択可能なマーカー及び他の好適な要素を含み得る。
【0088】
宿主細胞
多くの好適な宿主細胞のうちのいずれも、ＦＲＳ含有ポリペプチドの産生に使用され得る。ＦＲＳ含有ポリペプチドの産生に使用される宿主細胞は、任意選択で、（例えば、宿主細胞に対して天然のＦＧＥ（これは、細胞の内因性コード配列から発現され得、及び／又は組換え構築物から産生され得る）の作用によって、宿主細胞に対して天然ではないＦＧＥの作用によって、又はその両方によって）ＦＧＥが媒介する変換を提供することができるので、産生されるポリペプチドは、ＦＧＥによる発現及び翻訳後修飾の後にアルデヒドタグを含有する。代替的に、宿主細胞は、ＦＲＳ含有ポリペプチドの産生を提供し得（例えば、アルデヒドタグの産生を容易にするＦＧＥの発現を欠くことに起因する）、次いで、ＦＧＥへの曝露によって修飾されるであろう。
多くの好適な宿主細胞のうちのいずれも、ＦＲＳ含有ポリペプチドの産生に使用され得る。ＦＲＳ含有ポリペプチドの産生に使用される宿主細胞は、任意選択で、（例えば、宿主細胞に対して天然のＦＧＥ（これは、細胞の内因性コード配列から発現され得、及び／又は組換え構築物から産生され得る）の作用によって、宿主細胞に対して天然ではないＦＧＥの作用によって、又はその両方によって）ＦＧＥが媒介する変換を提供することができるので、産生されるポリペプチドは、ＦＧＥによる発現及び翻訳後修飾の後にアルデヒドタグを含有する。代替的に、宿主細胞は、ＦＲＳ含有ポリペプチドの産生を提供し得（例えば、アルデヒドタグの産生を容易にするＦＧＥの発現を欠くことに起因する）、次いで、ＦＧＥへの曝露によって修飾されるであろう。
【0089】
概して、本明細書に説明されるポリペプチドは、発現の目的に応じて、従来の方式に従って原核生物又は真核生物中で発現され得る。標的ポリペプチドをコードする核酸を含む、宿主細胞、例えば、遺伝子修飾された宿主細胞は、宿主細胞に対して内因性又は異種性であり得る組換えＦＧＥを更に任意選択で含み得る。
【0090】
変換されていないか若しくは（宿主細胞が好適なＦＧＥを発現する）変換されたＦＲＳ含有ポリペプチドの産生（大規模産生を含む）、又は（例えば、無細胞方法での使用のための）ＦＧＥの産生のための宿主細胞は、多様な利用可能な宿主細胞のうちのいずれかから選択され得る。例示的な宿主細胞としては、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）、酵母又は菌類（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．など）などの原核又は真核の単細胞生物のものが挙げられ、他のそのような宿主細胞が使用され得る。昆虫、脊椎動物、特に哺乳動物（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫなど）などの高等生物にもともと由来する例示的な宿主細胞は、発現宿主細胞として使用され得る。
【0091】
対象の特異的発現系は、発現系に由来する細菌、酵母菌、昆虫の細胞及び哺乳動物細胞を含む。
【0092】
アルデヒドタグの産生及びコンジュゲーションのための方法
ＦＲＳ含有ポリペプチドにおけるアルデヒドタグの産生は、細胞に基づく方法（インビボ）又は無細胞の方法（インビトロ）によって達成され得る。同様に、ポリペプチドにおけるアルデヒドタグのコンジュゲーションは、細胞に基づく方法（インビボ）又は無細胞の方法（インビトロ）によって達成され得る。これらは、以下により詳細に説明される。
ＦＲＳ含有ポリペプチドにおけるアルデヒドタグの産生は、細胞に基づく方法（インビボ）又は無細胞の方法（インビトロ）によって達成され得る。同様に、ポリペプチドにおけるアルデヒドタグのコンジュゲーションは、細胞に基づく方法（インビボ）又は無細胞の方法（インビトロ）によって達成され得る。これらは、以下により詳細に説明される。
【0093】
「インビボ」宿主細胞産生及びコンジュゲーション
ＦＲＳポリペプチドにおけるアルデヒドタグの産生は、好適なＦＧＥを含有する細胞におけるＦＲＳ含有ポリペプチドの発現によって達成され得る。この実施形態では、アルデヒドタグを産生するためのシステイン又はセリンの変換は、宿主細胞における翻訳中又は翻訳後に生じる。
ＦＲＳポリペプチドにおけるアルデヒドタグの産生は、好適なＦＧＥを含有する細胞におけるＦＲＳ含有ポリペプチドの発現によって達成され得る。この実施形態では、アルデヒドタグを産生するためのシステイン又はセリンの変換は、宿主細胞における翻訳中又は翻訳後に生じる。
【0094】
ＦＲＳを含有する標的ポリペプチドの性質に応じて、アルデヒドタグの産生後、ポリペプチドは、宿主細胞において細胞内に保持されるか、分泌されるか、又は宿主細胞の細胞外膜と会合するかのいずれかである。ＦＲＳ含有ポリペプチドが細胞表面に存在する場合、産生されたアルデヒドタグのコンジュゲーションは、生理学的条件下で反応性パートナーを使用して反応性パートナーの部分を表面アクセス可能なアルデヒドタグのｆＧｌｙ残基に付着させることによって達成され得る。アルデヒドタグ付きポリペプチドへの反応性パートナー部分のコンジュゲーションを達成するための使用に好適な条件は、Ｍａｈａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７ Ｍａｙ １６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６（５３１５）：１１２５－８に記載されているものと同様である。
【0095】
本発明の方法のためのタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、Ｅｘｐｉ２９３培地などの市販の成長培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、又は米国特許再発行第３０，９８５号に記載の培地のうちのいずれも、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれも、必要に応じて、ホルモン、及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＭＥＳ及びＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース、又は等価のエネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【0096】
ある特定の実施形態では、本方法は、細胞内で行われ、細胞は、インビトロ、例えば、インビトロ細胞培養、例えば、細胞が、単一細胞懸濁液中インビトロで又は付着性細胞培養物として培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＥを活性化することができる酸化試薬の存在下で培養される。酸化試薬は、Ｃｕ２＋であり得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＥを発現する細胞は、培地で好適な量のＣｕ２＋の存在下で培養される。ある特定の態様では、Ｃｕ２＋は、０．１μＭ～１０ｍＭ、１μＭ～１ｍＭ、２μＭ～５００μＭ、４μＭ～３００μＭ、又は５μＭ～２００μＭ（例えば、１０μＭ～１５０μＭ）などの１ｎＭ～１００ｍＭの濃度で細胞培養培地中に存在する。培地は、Ｃｕ２＋を提供するように任意の好適な銅塩が補充され得る。好適な銅塩としては、限定されないが、硫酸銅（すなわち、硫酸銅（ＩＩ）、ＣｕＳＯ４）、クエン酸銅、酒石酸銅、硝酸銅、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0097】
「インビトロ」（無細胞）変換及びコンジュゲーション
ＦＲＳ含有ポリペプチドのアルデヒドタグのインビトロ（無細胞）産生は、スルファターゼモチーフのシステイン又はセリンのｆＧｌｙへの変換に好適な条件下でポリペプチドをＦＧＥと接触させることによって達成され得る。例えば、ＦＲＳ含有ポリペプチドをコードする核酸は、アルデヒドタグ付きポリペプチドの産生を提供するのに好適なＦＧＥの存在下でインビトロ転写／翻訳系において発現され得る。
ＦＲＳ含有ポリペプチドのアルデヒドタグのインビトロ（無細胞）産生は、スルファターゼモチーフのシステイン又はセリンのｆＧｌｙへの変換に好適な条件下でポリペプチドをＦＧＥと接触させることによって達成され得る。例えば、ＦＲＳ含有ポリペプチドをコードする核酸は、アルデヒドタグ付きポリペプチドの産生を提供するのに好適なＦＧＥの存在下でインビトロ転写／翻訳系において発現され得る。
【0098】
代替的に、ＦＲＳ含有ポリペプチドは、単離され得、その後、好適なＦＧＥを欠く宿主細胞において組換え産生されるか、又は合成産生される。次いで、単離されたＦＲＳ含有ポリペプチドを、アルデヒドタグ産生を提供するための条件下で、好適なＦＧＥと接触させる。
【0099】
アルデヒドタグのコンジュゲーションに関して、コンジュゲーションは、通常、インビトロで行われる。アルデヒドタグ付きポリペプチドは、産生供給源（例えば、組換え宿主細胞産生物、合成産生物）から単離され、アルデヒドタグのｆＧｌｙへの反応性パートナーの部分のコンジュゲーションを提供するのに好適な条件下で、反応性パートナーと接触させる。アルデヒドタグが溶媒アクセス可能ではない場合、アルデヒドタグ付きポリペプチドは、反応性パートナーと反応させる前に、当該技術分野で既知の方法によって広げられ得る。
【0100】
本開示の例示的な非限定的な態様
上述の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、又は１つ以上の他の態様若しくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の記載を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様は、別々に付番された条項として以下に提供される。本開示を閲読すると当業者には明らかであろうように、個々に付番された条項の各々は、前の又は後続の個々に付番された条項のうちのいずれかと共に使用してもよいか、又は組み合わせてもよい。これは、そのような態様の全ての組み合わせに対する支持を提供することを意図している。本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
上述の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、又は１つ以上の他の態様若しくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の記載を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様は、別々に付番された条項として以下に提供される。本開示を閲読すると当業者には明らかであろうように、個々に付番された条項の各々は、前の又は後続の個々に付番された条項のうちのいずれかと共に使用してもよいか、又は組み合わせてもよい。これは、そのような態様の全ての組み合わせに対する支持を提供することを意図している。本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【0101】
そのような条項としては、以下を挙げることができる。
１．ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減する方法であって、方法が、
５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することを含む、方法。
２．方法が、細胞を培養することを含み、細胞が、タンパク質を含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、培養中に５００ｎｍ超の波長を有する可視光を使用することを含む、条項１に記載の方法。
３．タンパク質を合成することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長を有する可視光の中でタンパク質を合成することを含む、条項１に記載の方法。
４．タンパク質を精製することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長を有する可視光の中でタンパク質を精製することを含む、条項１に記載の方法。
５．精製することが、細胞又は細胞を含む細胞培養培地からタンパク質を単離することを含む、条項４に記載の方法。
６．５００ｎｍ超の波長を有する可視光が、５００ｎｍ超かつ６２０ｎｍ未満の波長を含む、条項２～５のいずれか１つに記載の方法。
７．５００ｎｍ超の波長を有する可視光が、緑色の光、黄色の光、及び／又は橙色の光に限定される可視光を生成する光源によって生成される、条項２～６のいずれか１つに記載の方法。
８．５００ｎｍ超の波長を有する可視光が、可視光を、３８０ｎｍ～５００ｎｍの範囲の可視光の透過を大幅に遮断するフィルタを通過させることによって生成される、条項２～７のいずれか１つに記載の方法。
９．方法が、細胞を培養することを含み、細胞が、タンパク質を含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、可視光の不在下で細胞を培養することを含む、条項１に記載の方法。
１０．タンパク質を合成することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、可視光の不在下でタンパク質を合成することを含む、条項１に記載の方法。
１１．タンパク質の切断が、ｆＧｌｙアミノ酸において、又はｆＧｌｙアミノ酸に隣接して生じる、条項１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．ｆＧｌｙアミノ酸が、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位において生成される、条項１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１Ｃ／ＳＸ２Ｐ／ＡＸ３Ｒを含み、Ｘ１が、存在するか、又は不在であり、存在する場合、任意のアミノ酸であり、ただし、ＦＧＥ認識部位が、タンパク質のＮ末端にある場合、Ｘ１が、存在し、Ｘ２及びＸ３が、各々独立して、任意のアミノ酸であることを条件とする、条項１２に記載の方法。
１４．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＰＳＲを含む、条項１３に記載の方法。
１５．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＳＸ２ＰＸ３Ｒを含む、条項１３に記載の方法。
１６．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＳＴＰＳＲを含む、条項１５に記載の方法。
１７．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＣＸ２ＡＸ３Ｒを含む、条項１３に記載の方法。
１８．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＲを含む、条項１７に記載の方法。
１９．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＡを含む、条項１３に記載の方法。
２０．タンパク質が、抗体又は治療用タンパク質である、条項１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．タンパク質の切断が、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で生じる、条項１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．分子が、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露によって光活性化される、条項２１に記載の方法。
２３．タンパク質の切断が、フラビンの存在下で生じる、条項１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２４．フラビンが、リボフラビンである、条項２３に記載の方法。
２５．フラビンが、フラビンモノヌクレオチド又はフラビンアデニンジヌクレオチドである、条項２３に記載の方法。
２６．標的領域においてタンパク質の切断を誘導する方法であって、標的領域が、ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含み、方法が、
タンパク質を、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、方法。
２７．光が、３２５ｎｍ～４９５ｎｍの間の波長に限定される、条項２６に記載の方法。
２８．方法が、ｆＧｌｙアミノ酸を標的領域に導入することを含む、条項２６又は２７に記載の方法。
２９．タンパク質を光に曝露させることが、
光の中でタンパク質を含む細胞を培養すること、及び／又は
光の中でタンパク質を精製すること、を含む、条項２６～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．タンパク質の切断が、ｆＧｌｙアミノ酸において、又はｆＧｌｙアミノ酸に隣接して生じる、条項２６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．ｆＧｌｙアミノ酸が、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位において生成される、条項２６～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１Ｃ／ＳＸ２Ｐ／ＡＸ３Ｒを含み、Ｘ１が、存在するか、又は不在であり、存在する場合、任意のアミノ酸であり、ただし、ＦＧＥ認識部位が、タンパク質のＮ末端にある場合、Ｘ１が、存在し、Ｘ２及びＸ３が、各々独立して、任意のアミノ酸であることを条件とする、条項３１に記載の方法。
３３．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＰＳＲを含む、条項３２に記載の方法。
３４．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＳＸ２ＰＸ３Ｒを含む、条項３２に記載の方法。
３５．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＳＴＰＳＲを含む、条項３４に記載の方法。
３６．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＣＸ２ＡＸ３Ｒを含む、条項３２に記載の方法。
３７．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＲを含む、条項３６に記載の方法。
３８．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＡを含む、条項３２に記載の方法。
３９．方法が、標的領域にホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位を導入することを含む、条項２６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．タンパク質が、Ｆｃ領域を含む抗体であり、標的領域が、抗体のＦｃ領域とＣＨ１ドメインとの間に位置する、条項２６～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．タンパク質が、精製タグを含み、標的領域が、タンパク質配列と精製タグとの間に位置する、条項２６～３９のいずれか１つに記載の方法。
４２．光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で、タンパク質を３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、条項２６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．分子が、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露によって光活性化される、条項４２に記載の方法。
４４．タンパク質を、フラビンの存在下で３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、条項２６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４５．フラビンが、リボフラビンである、条項４４に記載の方法。
４６．フラビンが、フラビンモノヌクレオチド又はフラビンアデニンジヌクレオチドである、条項４４に記載の方法。
１．ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含むタンパク質の切断を低減する方法であって、方法が、
５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することを含む、方法。
２．方法が、細胞を培養することを含み、細胞が、タンパク質を含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、培養中に５００ｎｍ超の波長を有する可視光を使用することを含む、条項１に記載の方法。
３．タンパク質を合成することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長を有する可視光の中でタンパク質を合成することを含む、条項１に記載の方法。
４．タンパク質を精製することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、５００ｎｍ超の波長を有する可視光の中でタンパク質を精製することを含む、条項１に記載の方法。
５．精製することが、細胞又は細胞を含む細胞培養培地からタンパク質を単離することを含む、条項４に記載の方法。
６．５００ｎｍ超の波長を有する可視光が、５００ｎｍ超かつ６２０ｎｍ未満の波長を含む、条項２～５のいずれか１つに記載の方法。
７．５００ｎｍ超の波長を有する可視光が、緑色の光、黄色の光、及び／又は橙色の光に限定される可視光を生成する光源によって生成される、条項２～６のいずれか１つに記載の方法。
８．５００ｎｍ超の波長を有する可視光が、可視光を、３８０ｎｍ～５００ｎｍの範囲の可視光の透過を大幅に遮断するフィルタを通過させることによって生成される、条項２～７のいずれか１つに記載の方法。
９．方法が、細胞を培養することを含み、細胞が、タンパク質を含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、可視光の不在下で細胞を培養することを含む、条項１に記載の方法。
１０．タンパク質を合成することを含み、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することが、可視光の不在下でタンパク質を合成することを含む、条項１に記載の方法。
１１．タンパク質の切断が、ｆＧｌｙアミノ酸において、又はｆＧｌｙアミノ酸に隣接して生じる、条項１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．ｆＧｌｙアミノ酸が、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位において生成される、条項１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１Ｃ／ＳＸ２Ｐ／ＡＸ３Ｒを含み、Ｘ１が、存在するか、又は不在であり、存在する場合、任意のアミノ酸であり、ただし、ＦＧＥ認識部位が、タンパク質のＮ末端にある場合、Ｘ１が、存在し、Ｘ２及びＸ３が、各々独立して、任意のアミノ酸であることを条件とする、条項１２に記載の方法。
１４．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＰＳＲを含む、条項１３に記載の方法。
１５．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＳＸ２ＰＸ３Ｒを含む、条項１３に記載の方法。
１６．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＳＴＰＳＲを含む、条項１５に記載の方法。
１７．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＣＸ２ＡＸ３Ｒを含む、条項１３に記載の方法。
１８．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＲを含む、条項１７に記載の方法。
１９．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＡを含む、条項１３に記載の方法。
２０．タンパク質が、抗体又は治療用タンパク質である、条項１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．タンパク質の切断が、光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で生じる、条項１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．分子が、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露によって光活性化される、条項２１に記載の方法。
２３．タンパク質の切断が、フラビンの存在下で生じる、条項１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２４．フラビンが、リボフラビンである、条項２３に記載の方法。
２５．フラビンが、フラビンモノヌクレオチド又はフラビンアデニンジヌクレオチドである、条項２３に記載の方法。
２６．標的領域においてタンパク質の切断を誘導する方法であって、標的領域が、ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）アミノ酸を含み、方法が、
タンパク質を、３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、方法。
２７．光が、３２５ｎｍ～４９５ｎｍの間の波長に限定される、条項２６に記載の方法。
２８．方法が、ｆＧｌｙアミノ酸を標的領域に導入することを含む、条項２６又は２７に記載の方法。
２９．タンパク質を光に曝露させることが、
光の中でタンパク質を含む細胞を培養すること、及び／又は
光の中でタンパク質を精製すること、を含む、条項２６～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．タンパク質の切断が、ｆＧｌｙアミノ酸において、又はｆＧｌｙアミノ酸に隣接して生じる、条項２６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．ｆＧｌｙアミノ酸が、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位において生成される、条項２６～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１Ｃ／ＳＸ２Ｐ／ＡＸ３Ｒを含み、Ｘ１が、存在するか、又は不在であり、存在する場合、任意のアミノ酸であり、ただし、ＦＧＥ認識部位が、タンパク質のＮ末端にある場合、Ｘ１が、存在し、Ｘ２及びＸ３が、各々独立して、任意のアミノ酸であることを条件とする、条項３１に記載の方法。
３３．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＰＳＲを含む、条項３２に記載の方法。
３４．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＳＸ２ＰＸ３Ｒを含む、条項３２に記載の方法。
３５．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＳＴＰＳＲを含む、条項３４に記載の方法。
３６．ＦＧＥ認識部位が、コンセンサス配列Ｘ１ＣＸ２ＡＸ３Ｒを含む、条項３２に記載の方法。
３７．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＲを含む、条項３６に記載の方法。
３８．ＦＧＥ認識部位が、配列ＬＣＴＡＳＡを含む、条項３２に記載の方法。
３９．方法が、標的領域にホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位を導入することを含む、条項２６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．タンパク質が、Ｆｃ領域を含む抗体であり、標的領域が、抗体のＦｃ領域とＣＨ１ドメインとの間に位置する、条項２６～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．タンパク質が、精製タグを含み、標的領域が、タンパク質配列と精製タグとの間に位置する、条項２６～３９のいずれか１つに記載の方法。
４２．光活性化されて一重項酸素種を放出する分子の存在下で、タンパク質を３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、条項２６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．分子が、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露によって光活性化される、条項４２に記載の方法。
４４．タンパク質を、フラビンの存在下で３００ｎｍ～５００ｎｍの波長を含む光に曝露させることを含む、条項２６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４５．フラビンが、リボフラビンである、条項４４に記載の方法。
４６．フラビンが、フラビンモノヌクレオチド又はフラビンアデニンジヌクレオチドである、条項４４に記載の方法。
【実施例】
【0102】
以下の実施例は、本発明をどのように作製及び使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが自分たちの発明とみなす範囲を限定することを意図せず、かつ、以下の実験が、実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用された数字（例えば量、温度など）に対する精度を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧又はほぼ大気圧である。
【0103】
実施例１：ＦＧＬＹ含有タンパク質及びペプチドのフォトクリッピング
細胞培養物からの培地の回収が実施された場合と比較して、抗体バッチが、調整された培地から早期及び後期の２つの異なる時間に精製された、アルデヒドタグ付き抗体調製物（ｐｒｅｐ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。図１及び２を参照されたい。早期又は後期に抗体産生バッチから精製されたアルデヒドタグ付き抗体のＬＣ／ＭＳ分析を実施した。早期及び後期の抗体ｐｒｅｐから得られた比較結果では、後期ｐｒｅｐで観察された新しいピークが明らかであり、これらの抗体に存在するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位ＬＣＴＰＳＲ（配列番号３）のｆＧｌｙ残基とＴｈｒ残基との間のアルデヒドタグで生じる潜在的な断片化に質量でほぼ整列する。
細胞培養物からの培地の回収が実施された場合と比較して、抗体バッチが、調整された培地から早期及び後期の２つの異なる時間に精製された、アルデヒドタグ付き抗体調製物（ｐｒｅｐ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。図１及び２を参照されたい。早期又は後期に抗体産生バッチから精製されたアルデヒドタグ付き抗体のＬＣ／ＭＳ分析を実施した。早期及び後期の抗体ｐｒｅｐから得られた比較結果では、後期ｐｒｅｐで観察された新しいピークが明らかであり、これらの抗体に存在するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）認識部位ＬＣＴＰＳＲ（配列番号３）のｆＧｌｙ残基とＴｈｒ残基との間のアルデヒドタグで生じる潜在的な断片化に質量でほぼ整列する。
【0104】
４℃又は３７℃での細胞培養培地（Ｅｐｉ２９３培地）中のｆＧｌｙ含有ペプチドの安定性の評価を実施した。（ガラスドア、窓に面した）４℃のデリケース内で１日後には、ｆＧｌｙペプチドは検出可能ではなかった。可視光を通さない３７℃の閉鎖オーブン内で１日後には、ｆＧｌｙペプチドの濃度は変化しない。
【0105】
細胞培養培地中、又は２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム中のいずれかのｆＧｌｙ含有ｍＡｂを、デスクランプからの光に１時間曝露させ、次いでＨＰＬＣによって分析した。図３を参照されたい。
【0106】
図４．光への曝露前後のｆＧｌｙ含有タンパク質調製物中の抗体断片の質量分析。抗体を、ＰＮＧａｓｅＦを使用して脱グリコシル化し、ＡＢＳｃｉｅｘ４０００ＱＴＲＡＰ機器でのＲＰ－ＬＣ／ＭＳによって分析した。分析前にＤＴＴでＰｒｅｐ１９及び８３～８９を還元させた。Ｆ（ａｂ）２ドメインからＦｃを遊離させるために、ＩｄｅＳプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＰｒｅｐ９９を処理した。
【0107】
抗体配列：
異なる位置にＦＧＥ認識部位を担持する抗体重鎖定常領域。ＦＧＥ認識部位、ＬＣＴＰＳＲは、太字で示す。ＦＧＥによるＬｆＧｌｙＴＰＳＲへの変換後、タンパク質は、リボフラビンの存在下で光に曝露されると、ロイシン残基とｆＧｌｙ残基との間で切断された。
異なる位置にＦＧＥ認識部位を担持する抗体重鎖定常領域。ＦＧＥ認識部位、ＬＣＴＰＳＲは、太字で示す。ＦＧＥによるＬｆＧｌｙＴＰＳＲへの変換後、タンパク質は、リボフラビンの存在下で光に曝露されると、ロイシン残基とｆＧｌｙ残基との間で切断された。
【0108】
ヒンジ１．６：
[配列表１]
[配列表１]
【0109】
ＣＨ１－３．１：
[配列表２]
[配列表２]
【0110】
ＣＴ：
[配列表３]
[配列表３]
【0111】
図１．光への曝露前後の、調整された培地から精製したアルデヒドタグ付き抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。分析前にＤＴＴで抗体を還元させた。
【0112】
図２．光への曝露前後の、調整された培地から精製したアルデヒドタグ付き抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。分析前にＤＴＴで抗体を還元させた。
【0113】
図３．細胞培養培地中でのｆＧｌｙ含有抗体の光を伴うインキュベーションは、切断産生物を生じる。ＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグを担持するｆＧｌｙ含有抗体を、Ｅｘｐｉ２９３細胞培養培地中、又は２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．５中のいずれかで、光と共にインキュベートした。試料を、デスクランプからの光に１時間曝露させ、次いで、Ｃ８逆相ＨＰＬＣによって分析した。５０ｍＭのＤＴＴ及び０．５％のＳＤＳ（最終濃度）を添加し、５０℃で３０分間加熱することによって、ＨＰＬＣ分析のために試料を調製した。
【0114】
図４．光への曝露前後のｆＧｌｙ含有タンパク質調製物中の抗体断片の質量分析。抗体を、ＰＮＧａｓｅＦを使用して脱グリコシル化し、ＡＢＳｃｉｅｘ４０００ＱＴＲＡＰ機器でのＲＰ－ＬＣ／ＭＳによって分析した。分析前にＤＴＴでＰｒｅｐ１９及び８３～８９を還元させた。Ｆ（ａｂ）２ドメインからＦｃを遊離させるために、ＩｄｅＳプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＰｒｅｐ９９を処理した。
【0115】
実施例２：ＦＧＬＹ含有タンパク質及びペプチドの光クリッピングは、リボフラビンによって媒介される
ｆＧｌｙ含有ペプチド分解を監視するための分析条件を決定したが、細胞培養培地中のＵＶ／Ｖｉｓによって予期しないピークが検出された。ピークは、ビタミンＢ１２の存在を示していると仮定した。ビタミンＢ１２は、他の分子を感作させるか、又は一重項酸素を生成するために、多様な光化学反応を実施することができ、基底状態の一重項有機分子と反応することができる。
ｆＧｌｙ含有ペプチド分解を監視するための分析条件を決定したが、細胞培養培地中のＵＶ／Ｖｉｓによって予期しないピークが検出された。ピークは、ビタミンＢ１２の存在を示していると仮定した。ビタミンＢ１２は、他の分子を感作させるか、又は一重項酸素を生成するために、多様な光化学反応を実施することができ、基底状態の一重項有機分子と反応することができる。
【0116】
ｆＧｌｙ含有ペプチド断片化に対するビタミンＢ１２の影響を試験した。顕著な断片ピークは、ｍＡｂを培地と共にインキュベートした場合にのみ見られた。最大７５モル当量のビタミンＢ１２の添加は、微量の光断片化のみを誘導した。図５を参照されたい。
【0117】
ｆＧｌｙ含有ＣＨ１－アルデヒドタグ付き抗体断片化に対する、細胞培養培地中に見出される、リボフラビン及びチアミンなどの他の光吸収分子の影響を試験した。リボフラビン＋光は、新しいタンパク質断片を誘導した（図６Ａ）が、チアミンは、タンパク質切断に対して顕著な影響を有するようには思われなかった（図６Ｂ）。
【0118】
ｆＧｌｙ含有ペプチドに対するリボフラビン及びチアミンの影響（「ｆＧｌｙペプチド」、配列：ＡＬｆＧｌｙＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列番号１））を試験した。リボフラビン＋光でインキュベートしたｆＧｌｙペプチドのＬＣＭＳ分析によって、新しいペプチドピークが検出された（図７Ａ）。チアミン＋光でインキュベートしたｆＧｌｙペプチドの切断は、検出されなかった（図７Ｂ）。
【0119】
リボフラビン及び光への曝露後のｆＧｌｙペプチド試料のＬＣ／ＭＳ分析は、元のペプチドのＣ末端部分を表す新しいペプチド断片を明らかにした。観察されたペプチド断片の配列は、ｆＧｌｙＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲである。
【0120】
切断されたペプチドのＮ末端側を検出するために、ＬｆＧｌｙＴＰＳＲ配列の前により多くのアミノ酸を有する異なるペプチド配列を選択した。このペプチド、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）を、デスクランプによって照射した５０ｍｇ／Ｌのリボフラビンと共に１ｍｇ／ｍＬで３０分間インキュベートした。次いで、試料をＣ１８逆相クロマトグラフィーによって分析した。Ｎ及びＣ末端断片の両方が観察された。図８Ａ及び８Ｂ．Ｓ．Ｍ．、出発物質。Ｎ断片（ＧＰＳＶＦＰＬ）及びＣ末端断片（ｆＧｌｙＴＰＳＲ）の両方が観察された（図８Ａ）。リボフラビン及び光を用いた切断後に観察されたペプチド断片の質量分析の結果を、図８Ｂに表にする。ＡＬｆＧｌｙＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列番号１）ペプチドの予想されるＮ末端断片は、ＡＬであった。このジペプチドは、実験条件下でカラムに保持されていない可能性が高いので、クロマトグラフィー又は質量分析によって観察されなかった。より長いＮ末端断片を生成するので、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）ペプチドを使用し、これは、クロマトグラフィー（図８Ａ）及び質量分析（図８Ｂ）の両方によって検出された。
【0121】
リボフラビンの吸収スペクトルに対応する波長を有する光の影響を試験した。リボフラビン＋バンドパスフィルタを用いるか又は用いない光でＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）ペプチドをインキュベートし、ＨＰＬＣによって分析した。５５０以上のロングパスフィルタを使用すると、断片化は観察されなかった（図９Ｃ）。図９Ａは、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）ペプチドのリボフラビンが媒介する切断に対する可視光の波長の影響を決定するために使用した器具類を示す。Ｔｈｏｒ ｌａｂｓからの広域スペクトルランプ（ＱＴＨ１０）のランプ出力を、図９Ａにプロットする。列挙されたフィルタを通ることができる光の波長を示している。リボフラビンによって吸収される光の波長も、プロットしている。リボフラビンは、約３００ｎｍ～５００ｎｍの範囲の光を吸収し、ピーク吸収は、約４５０ｎｍであり、低いピークは、約３８０ｎｍである。光作用、図９Ｂ．白色の光、及びリボフラビン吸光度（３００～５００ｎｍ未満）の枠内で光を通過させる全てのフィルタが、切断と関連付けられた。断片化結果、図９Ｃ．フィルタを使用した光のうち、４００ｎｍロングパスフィルタは、最大レベルの切断（消費される出発物質の約９５％）と関連付けられた。これは、約４５０ｎｍでのリボフラビン光吸収のピーク面積に対応した。５５０以上のロングパスフィルタを使用すると、断片化は観察されなかった。したがって、光及びリボフラビンが媒介するｆＧｌｙ含有ペプチドの切断は、リボフラビンによる光の吸収に依存していた。その吸収を遮断することは、ペプチドを切断から効果的に保護した。
【0122】
反応に一重項酸素クエンチャー（アジ化物）を添加することによって、光クリッピングのメカニズムを更に調査した。アジ化物の添加は、ｆＧｌｙ含有ペプチドに対する、光及びリボフラビンによって誘導される光クリッピングを阻害し、断片化のかなり部分が、ｆＧｌｙと一重項酸素との反応から生じることを示している。
【0123】
先述の実験は、光及びリボフラビンの存在下で、ｆＧｌｙ含有タンパク質が切断されることを確立している。切断は、ｆＧｌｙと、ｆＧｌｙに対して近接するアミノ酸Ｎ末端との間で生じるように思われる。タンパク質が曝露される光が、リボフラビンによって吸収される波長を含まない場合、この切断は防止される。言い換えれば、約３００～５００ｎｍの範囲の波長へのｆＧｌｙ含有タンパク質の曝露を防止することは、リボフラビン、例えば、細胞培養培地中に存在するリボフラビンの存在下でさえも、タンパク質の光切断を防止する。
【0124】
したがって、ここに提示されるデータは、リボフラビンも有する溶液中にｆＧｌｙ含有タンパク質が存在する場合、光切断を低減するために、５００ｎｍ以下の範囲の光へのタンパク質の曝露を限定すべきであることを示している。タンパク質を処理する、例えば、タンパク質を精製するために光が必要である場合、５００ｎｍ超の波長に限定された光、例えば、青色の光、緑色の光、黄色の光、赤色の光、及び／又は橙色の光を使用して、タンパク質が存在する溶液からリボフラビンが除去されるまで、分解からタンパク質を保護しながら、可視性を提供することができる。
【0125】
このデータはまた、標的部位でのタンパク質の切断が望ましい場合、光クリッピングを引き起こす波長の光、及びタンパク質が存在する溶液中にリボフラビンを含めることを使用して、例えば、標的部位にｆＧｌｙ残基を含めることによって、標的部位での切断を達成することができることを示している。タンパク質を、リボフラビンによって吸収される波長範囲、例えば、約３００～５００ｎｍの範囲のより高い強度の光に曝露させることによって、この切断を向上することができる。
【0126】
アジ化物による光クリッピングの阻害は、断片化のかなりの部分が、ｆＧｌｙが一重項酸素と反応することから生じることを示している。他のフラビン、例えば、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）は、光に曝露すると反応性酸素（ＲＯＳ）を生成することが知られているので、光（例えば、約３００～５００ｎｍの範囲の光）に曝露すると一重項酸素を生成するリボフラビン類似体及び誘導体などのフラビンを使用して、標的領域がｆＧｌｙアミノ酸を含む、標的領域におけるタンパク質の切断を誘導することができることが予想される。更に、例えば、５００ｎｍ以下の波長を有する可視光への曝露からタンパク質を保護することによって、フラビンによって吸収される可視光への曝露からタンパク質を保護して一重項酸素を放出することによって、ｆＧｌｙアミノ酸を含むタンパク質のフラビンが媒介する切断を低減することができることが予想される。
【0127】
図５．ｆＧｌｙ含有ペプチドの断片化に対するビタミンＢ１２及び光の影響を試験すること。１０μＭの緩衝液中で、ビタミンＢ１２のモル当量を増加させて、ＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグを担持するｆＧｌｙ含有抗体をインキュベートした。具体的には、抗体と比較して１、１０、２５、５０、及び７５のモル当量で、ビタミンＢ１２を試験した。タンパク質切断の陽性対照として、Ｅｘｐｉ２９３培地中で抗体をインキュベートした。試料をデスクランプからの光に１時間曝露させ、次いでＣ８逆相クロマトグラフィーによって分析した。５０ｍＭのＤＴＴ及び０．５％のＳＤＳ（最終濃度）を添加し、５０℃で３０分間加熱することによって、ＨＰＬＣ分析のために試料を調製した。顕著な切断は、抗体を培地と共にインキュベートした場合（上面パネル）にのみ見られた。最大７５モル当量のビタミンＢ１２を添加することは、微量の光断片化のみを誘導した（データは示さず）。
【0128】
図６Ａ及び６Ｂ．ｆＧｌｙ含有タンパク質の切断を媒介するために、細胞培養培地中に見出される他の光吸収分子の潜在性を評価すること。１２０μＭのリボフラビン又は１ｍＭのチアミンのいずれかを含む緩衝液中１ｍｇ／ｍＬで、ＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグを担持するｆＧｌｙ含有抗体をインキュベートした。試料をデスクランプからの光に１時間曝露させ、次いで、３０ＭＷＣＯフィルタを使用して、０．１Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液を交換した。５０ｍＭのＤＴＴ及び０．５％のＳＤＳ（最終濃度）を添加し、５０℃で３０分間加熱することによって、試料を分解させた。次いで、試料をＣ８逆相クロマトグラフィーによって分析した。リボフラビン及び光は、新しいタンパク質断片を誘導した（図６Ａ）が、チアミンは、誘導したようには思われなかった（図６Ｂ）。
【0129】
図７Ａ及び７Ｂ．ｆＧｌｙ含有ペプチド、ＡＬｆＧｌｙＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列番号１）に対するチアミン又はリボフラビンの影響を試験すること。緩衝液中のペプチドを、リボフラビン（図７Ａ）又はチアミン（図７Ｂ）のいずれかと混合し、デスクランプからの光に１時間曝露させ、続いてＣ１８逆相クロマトグラフィーによって分析した。チアミン及び光ではなく、リボフラビン及び光が、新しいペプチドピークを誘導した。
【0130】
図８Ａ．逆相クロマトグラフィーによって検出される、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）ペプチドのリボフラビン及び光が媒介する切断は、Ｎ及びＣ末端断片をもたらす。ペプチド、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）を、デスクランプによって照射した５０ｍｇ／Ｌのリボフラビンと共に１ｍｇ／ｍＬで３０分間インキュベートした。次いで、試料をＣ１８逆相クロマトグラフィーによって分析した。Ｎ及びＣ末端断片の両方が観察された。Ｓ．Ｍ．、出発物質。
【0131】
図８Ｂ．リボフラビン及び光を用いた切断後に観察されたペプチド断片の質量分析。
【0132】
図９Ａ．ランプ出力によって網羅される関連するＵＶ－Ｖｉｓ範囲、リボフラビン吸収、及びフィルタ。光源として、ＴｈｏｒＬａｂｓ広域スペクトルランプ（ＱＴＨ１０）を使用した。ＴｈｏｒＬａｂｓフィルタセット（ＵＶ～ＮＩＲ）を試験した。
【0133】
図９Ｂ～９Ｃ．リボフラビンが媒介するペプチド切断に対する光の波長の影響を評価すること。１００μＭのリボフラビンを含むトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．４）中２０μＭで、ＧＰＳＶＦＰＬｆＧｌｙＴＰＳＲ（配列番号２）ペプチドをインキュベートした。室温のＴｈｏｒＬａｂｓ広域スペクトルランプ（ＱＴＨ１０）からの光に試料を１時間曝露させた。いくつかの試料では、ＴｈｏｒＬａｂｓＵＶ－ＮＩＲフィルタセットからのフィルタで光源を覆った。インキュベーション後、試料をＣ１８逆相クロマトグラフィーによって分析し、出発物質（ＳＭ）の損失を監視することによって切断を定量化した。
【0134】
実施例３．ＦＧＬＹ含有タンパク質のリボフラビンが媒介する切断の動態
５０μＭのリボフラビンを含むか又は含まない緩衝液中５μＭで、ＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグを有するｆＧｌｙ含有抗体をインキュベートした。５分～２時間の範囲の変動する時間の長さの間、試料を光に曝露させた。次いで、材料をＤＴＴで還元し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、出発物質（それぞれ、２３ｋＤ及び４９ｋＤの軽鎖及び重鎖）及び重鎖切断産生物（それぞれ、１７ｋＤ及び３２ｋＤのＮ末端断片及びＣ末端断片）を検出した。図１０を参照されたい。試料は脱グリコシル化されず、分析物の見かけの分子量が増加したことに留意されたい。
５０μＭのリボフラビンを含むか又は含まない緩衝液中５μＭで、ＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグを有するｆＧｌｙ含有抗体をインキュベートした。５分～２時間の範囲の変動する時間の長さの間、試料を光に曝露させた。次いで、材料をＤＴＴで還元し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、出発物質（それぞれ、２３ｋＤ及び４９ｋＤの軽鎖及び重鎖）及び重鎖切断産生物（それぞれ、１７ｋＤ及び３２ｋＤのＮ末端断片及びＣ末端断片）を検出した。図１０を参照されたい。試料は脱グリコシル化されず、分析物の見かけの分子量が増加したことに留意されたい。
【0135】
実施例４．切断に対するリボフラビン対ＦＧＬＹ含有タンパク質の比の影響
２つのｆＧｌｙ含有タンパク質基質を試験した。一方は、酵素－Ｆｃ接合部（ＤＮＡｓｅＩ－Ｆｃ）にアルデヒドタグを担持するＦｃドメインに付加されたヒトＤＮＡｓｅＩであった。他方は、ＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグ（ＨｕＩｇＧ－ＣＨ１タグ）を担持するｆＧｌｙ含有抗体であった。変動する量のタンパク質（図１１Ａに示される）を、５０μＭのリボフラビンを含有する１０μＬの緩衝液中でインキュベートした。試料を光に２０分間曝露させた。次いで、材料をＤＴＴで還元させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、出発物質及び切断産生物を検出した。ＤＮＡｓｅＩ－Ｆｃについて、出発物質は、５５ｋＤであり、Ｎ末端断片及びＣ末端断片の切断産生物は、それぞれ、２９ｋＤ及び２６ｋＤであった。ＨｕＩｇＧ－ＣＨ１タグについては、抗体の軽鎖及び重鎖の出発物質は、それぞれ、２３ｋＤ及び４９ｋＤであった。Ｎ末端断片及びＣ末端断片のＨｕＩｇＧ－ＣＨ１タグ重鎖切断産生物は、それぞれ、１７ｋＤ及び３２ｋＤであった。試料は脱グリコシル化されず、分析物の見かけの分子量が増加したことに留意されたい。
２つのｆＧｌｙ含有タンパク質基質を試験した。一方は、酵素－Ｆｃ接合部（ＤＮＡｓｅＩ－Ｆｃ）にアルデヒドタグを担持するＦｃドメインに付加されたヒトＤＮＡｓｅＩであった。他方は、ＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグ（ＨｕＩｇＧ－ＣＨ１タグ）を担持するｆＧｌｙ含有抗体であった。変動する量のタンパク質（図１１Ａに示される）を、５０μＭのリボフラビンを含有する１０μＬの緩衝液中でインキュベートした。試料を光に２０分間曝露させた。次いで、材料をＤＴＴで還元させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、出発物質及び切断産生物を検出した。ＤＮＡｓｅＩ－Ｆｃについて、出発物質は、５５ｋＤであり、Ｎ末端断片及びＣ末端断片の切断産生物は、それぞれ、２９ｋＤ及び２６ｋＤであった。ＨｕＩｇＧ－ＣＨ１タグについては、抗体の軽鎖及び重鎖の出発物質は、それぞれ、２３ｋＤ及び４９ｋＤであった。Ｎ末端断片及びＣ末端断片のＨｕＩｇＧ－ＣＨ１タグ重鎖切断産生物は、それぞれ、１７ｋＤ及び３２ｋＤであった。試料は脱グリコシル化されず、分析物の見かけの分子量が増加したことに留意されたい。
【0136】
６０μＭ（飽和溶液の５０％、試料＃１）～５０ｎＭ（試料＃１１）の範囲の変動する濃度のリボフラビンと共に、１μＭのＣＨ１－３．１位にアルデヒドタグを担持するｆＧｌｙ含有抗体をインキュベートした。図１１Ｂを参照されたい。試料を光に２０分間曝露させた。次いで、材料をＤＴＴで還元させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、出発物質及び切断産生物を検出した。最適なリボフラビン対タンパク質比は、およそ１．６μＭのリボフラビン対１μＭの抗体の試料＃６において観察された。出発物質は、それぞれ、抗体軽鎖及び重鎖を表す、２３ｋＤ及び４９ｋＤであった。抗体重鎖切断産生物は、それぞれ、Ｎ末端断片及びＣ末端断片を表す１７ｋＤ及び３２ｋＤであった。試料は脱グリコシル化されず、分析物の見かけの分子量が増加したことに留意されたい。
【0137】
酵素－Ｆｃ接合部にアルデヒドタグを担持するヒトＤＮＡｓｅＩ－Ｆｃ構築物配列。ＦＲＳ、ＬＣＴＰＳＲは、太字で示す。
【0138】
ＤＮａｓｅＩ－Ｆｃ：
[配列表４]
[配列表４]
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【国際調査報告】