▶ ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポールの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】誘導ラマン散乱トモグラフィシステム及び方法
(51)【国際特許分類】
G02B 21/06 20060101AFI20240514BHJP
G02B 21/00 20060101ALI20240514BHJP
G01N 21/65 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
G02B21/06
G02B21/00
G01N21/65
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572624
(86)(22)【出願日】2022-05-23
(85)【翻訳文提出日】2024-01-16
(86)【国際出願番号】 SG2022050340
(87)【国際公開番号】W WO2022250610
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】10202105493U
(32)【優先日】2021-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507335687
【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100135079
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 修
(72)【発明者】
【氏名】フアン，ジィウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ゴォン，リー
(72)【発明者】
【氏名】リン，シュラン
【テーマコード（参考）】
2G043
2H052
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043BA16
2G043EA03
2G043FA02
2G043HA01
2G043HA02
2G043HA09
2G043HA15
2G043KA01
2G043KA08
2G043KA09
2G043LA03
2H052AA00
2H052AB02
2H052AC05
2H052AC14
2H052AC20
2H052AC34
2H052AF14
2H052AF25
(57)【要約】
【要約】
誘導ラマン散乱トモグラフィシステムは、第１の入力光ビームを生成する手段と、第２の入力光ビームを生成する手段と、対物レンズと、集光器と、検出器とを含む。第１の入力光ビームは位相変調され、第２の入力光ビームは振幅変調される。対物レンズは、第１および第２の入力光ビームを試料上に向けるように構成される。集光器は、試料からの出力光ビームを集光するように構成される。検出器は、第１の入力光ビームに対応する出力光ビームの少なくとも一部を検出するように構成される。システムは、前記出力光ビームの前記検出された部分から前記試料の深度分解画像を形成するための手段をさらに含む。
誘導ラマン散乱トモグラフィシステムは、第１の入力光ビームを生成する手段と、第２の入力光ビームを生成する手段と、対物レンズと、集光器と、検出器とを含む。第１の入力光ビームは位相変調され、第２の入力光ビームは振幅変調される。対物レンズは、第１および第２の入力光ビームを試料上に向けるように構成される。集光器は、試料からの出力光ビームを集光するように構成される。検出器は、第１の入力光ビームに対応する出力光ビームの少なくとも一部を検出するように構成される。システムは、前記出力光ビームの前記検出された部分から前記試料の深度分解画像を形成するための手段をさらに含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
誘導ラマン散乱トモグラフィシステムであって、第１の入力光ビームを生成する手段であって、前記第１の入力光ビームが位相変調される、生成する手段と、
第２の入力光ビームを生成する手段であって、前記第２の入力光ビームが振幅変調される、生成する手段と、
前記第１および第２の入力光ビームを試料上に向けるように構成された対物レンズと、
前記試料からの出力光ビームを集光するように構成された集光器と、
前記第１の入力光ビームに対応する前記出力光ビームの少なくとも一部を検出するように構成された検出器と、
前記出力光ビームの検出された部分から前記試料の深さ分解画像を形成する手段と、を備える、誘導ラマン散乱トモグラフィシステム。
【請求項2】
前記第１の入力光ビームを生成する手段は、レーザ光源の第１の出力を含み、前記第２の入力光ビームを生成する手段は、前記レーザ光源の第２の出力を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記レーザ光源は、広帯域フェムト秒レーザ光源を含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項4】
前記第１の入力光ビームはポンプビームを含み、前記第２の入力光ビームはストークスビームを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
前記第１の入力光ビームを生成する手段は、所定のパターンに基づく前記ポンプビームを位相変調するための空間的光変調器をさらに含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項6】
前記第２の入力光ビームを生成する手段は、所定の周波数において前記ストークスビームを振幅変調するための電気光学的変調器をさらに含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項7】
前記ポンプビームとストークスビームは、共線ベッセルビームを含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項8】
前記対物レンズは、水浸顕微鏡対物レンズを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
コンデンサの後に配置され、前記第１の入力光ビームに対応する前記出力光ビームの前記部分をスペクトル的に分離するように構成された帯域通過フィルタセットをさらに含む、請求項１に記載のシステム。、
【請求項10】
前記検出器は、フォトダイオードを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項11】
前記試料の前記深さ分解画像を形成するための前記手段は、前記試料からの前記出力光ビームの前記検出された部分を復調するためのロックイン増幅器を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項12】
前記ロックイン増幅器は、逆高速フーリエ変換に基づいて前記出力光ビームの前記検出された部分を復調するように構成される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項13】
前記出力光ビームは、前記試料からの反射ビームを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項14】
前記出力光ビームは、前記試料からの透過ビームを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項15】
誘導ラマン散乱トモグラフィ方法であって、第１の入力光ビームを生成することであって、前記第１の入力光ビームは位相変調される、生成することと、
第２の入力光ビームを生成することであって、前記第２の入力光ビームは振幅変調される、生成することと、
前記第１および第２の入力光ビームを試料上に向けることと、
前記試料から出力光ビームを収集することと、
前記第１の入力光ビームに対応する前記出力光ビームの少なくとも一部分を検出することと、
前記出力光の前記検出された一部分から前記試料の深さ分解画像を形成することと、を含む、方法。
【請求項16】
前記第１の入力光ビームはポンプビームを含み、前記第２の入力光ビームはストークスビームを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ポンプビームは、空間光変調器を用いて所定のパターンに基づいて位相変調される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ストークスビームは、電気光学変調器を用いて所定の周波数で振幅変調される、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記ポンプビーム及びストークスビームを生成することは、共線ベッセルビームを形成することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記試料の前記深さ分解画像を形成することは、ロックイン増幅器を使用して、前記試料からの前記出力光ビームの前記検出された部分を復調することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項21】
前記出力光ビームの前記検出された部分を復調することは、逆高速フーリエ変換を適用することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
請求項１５に記載の方法を含む、３次元体積撮像方法。
【請求項23】
前記試料は、化学試料又は生物試料を含む、請求項２２に記載の３次元体積撮像方法。
【請求項24】
前記試料は、ラベルフリーである、請求項２２に記載の３次元体積撮像方法。
【請求項25】
前記第１および第２の入力光ビームを前記試料上に向けることは、前記第１または第２の入力光ビームの焦点を前記試料の深さにわたって走査することなく、前記第１および第２の入力光ビームを向けることを含む、請求項２２に記載の３次元体積撮像方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、広義には、誘導ラマン散乱トモグラフィシステム及び方法に関するが、これに限定されない。
【背景技術】
【0002】
三次元（３Ｄ）光学顕微鏡法（例えば、共焦点顕微鏡法、多光子顕微鏡法、および高調波発生顕微鏡法）は、生体組織および細胞についての時空間情報（例えば、構造およびアーキテクチャ、代謝機能、ニューロンネットワーク、細胞分裂および遊走など）に関する重要なデータを送達するための強力な画像化ツールである。従来の３Ｄ体積データは、一連の２次元（２Ｄ）断面画像を取得するために対物レンズまたは試料ステージのいずれかを走査すること（例えば、ラスタ走査）を通して、ｚ方向を機械的に横断する点毎または線走査を介して取得されることができる。従来の３Ｄ顕微鏡撮像技術の主な制限は、点走査に典型的に使用される密に集束されたガウスビームが、混濁媒体（例えば、組織）における屈折率不連続性に起因する強い光散乱に遭遇し、制限された光透過（約１００～２００μｍ）を被り、したがって、体積測定深部組織撮像が不可能であることである。散乱効果を軽減するために、その伝播経路に沿って散乱が生じた後に固有の自己再構成能力を有する非回折ベッセルビームが、高度な３Ｄ撮像技術（例えば、ライトシート顕微鏡法、２光子顕微鏡法、光コヒーレンス顕微鏡法）において回折及び散乱が支配的である混濁組織の深い領域への浸透を助けるために利用されてきた。しかしながら、ベッセルビーム顕微鏡法は、一般に、深さ情報が失われた試料の投影画像を提供する。
【0003】
誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡法は、生体分子特異性を有する新興の無標識化学撮像技術であり、生物学的および生物医学的システムにおいて広範な用途が見出されている。従来のガウスビームＳＲＳ ３Ｄ撮像の撮像深度を改善するために、ベッセルビーム励起と結合された光学投影トモグラフィ（ＯＰＴ）が、複数の投影角度における一連の２Ｄ画像から３Ｄ ＳＲＳ画像を取り出すために使用されてきたが、ＯＰＴベースのＳＲＳ ３Ｄ撮像は、依然として、試料ステージまたは入射光ビームを機械的に回転させる必要があり、これは、迅速なインビボ生物学的／生物医学的用途には好適ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
従って、上記の問題の少なくとも一部に対処することができる断層撮影システム及び方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
第１の態様によれば、第１の入力光ビームを生成する手段であって、第１の入力光ビームが位相変調される、生成する手段と、第２の入力光ビームを生成する手段であって、第２の入力光ビームが振幅変調される、生成する手段と、第１および第２の入力光ビームを試料上に向けるように構成された対物レンズと、試料からの出力光ビームを集光するように構成された集光器と、第１の入力光ビームに対応する出力光ビームの少なくとも一部を検出するように構成された検出器と、出力光ビームの検出された部分から試料の深さ分解画像を形成する手段とを備える誘導ラマン散乱トモグラフィシステムが提供される。
【0006】
第２の態様によれば、位相変調された第１の入力光ビームを生成することと、振幅変調された第２の入力光ビームを生成することと、第１および第２の入力光ビームを試料上に向けることと、試料から出力光ビームを収集することと、第１の入力光ビームに対応する出力光ビームの少なくとも一部を検出することと、出力光ビームの検出された部分から試料の深さ分解画像を形成することとを含む誘導ラマン散乱トモグラフィ方法が提供される。
【0007】
第２の態様の方法を含む３次元ボリューム撮像方法も開示される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
本発明の実施形態は、単なる例として、図面と併せて、以下の記載から、当業者にはよりよく理解され、容易に明らかになるであろう。
【0009】
【図1】例示的な実施形態によるＳＲＳＴ撮像システムの概略図である。
【図2】２ａ～２ｃを含み、位相変調の例と、結果として得られるビートパターンを有する光ビームとを示す図である。
【図3】３ａ～３ｇを含み、ポリスチレン（ＰＳ）およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズを含有する試料を使用したＳＲＳＴの性能評価を示す図である。
【図4】４ａ～４ｅを含み、マウス耳皮膚の試料を使用したＳＲＳＴと従来のＳＲＳとの間の性能比較を示す図である。
【図5】５ａ～５ｆを含み、ＤＰＢＤ結晶、春玉葱及び豚肉組織の試料を用いたＳＲＳＴと従来のＳＲＳとの間のパフォーマンス比較を示す図である。
【図6】例示的な実施形態による春玉葱中のクロロプラストのＳＲＳスペクトルを示す図である。
【図7】７ａ～７ｂを含み、軸方向分解能測定の例示的な方法を示す図である。
【図8】８Ａ～８Ｃを含み、それぞれ、古典的、間葉系、および前神経ＧＢＭ組織の代表的なｅｐｉ検出ハイパースペクトルＳＲＳ画像を示す図である。
【図9】９Ａ～９Ｅを含み、ディープラーニングアルゴリズムを使用したＧＢＭサブタイプのＳＲＳＴ診断の図を示す図である。
【図10】例示的な実施形態によるＳＲＳＴ方法を示すフローチャートである。
【図11】例示的な実施形態による、生のＳＲＳＴ画像、取り戻されたＳＲＳＴ画像、および従来のＳＲＳの間のＳＮＲの比較を示す図である。
【図12】１２（ａ）～１２（ｆ）を含み、強いバックグラウンドを有する溶媒中のＳＲＳＴのＳＮＲのシミュレーション結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本開示は、非回折ゼロ次ベッセルビームに関連する光ビーティング技術（ＯＢＴ）によって可能になるｚスキャンフリーＳＲＳトモグラフィ（ＳＲＳＴ）に関し、試料または対物レンズの機械的走査を必要とせずに３Ｄ ＳＲＳのより深い化学撮像を実現する。ＳＲＳＴでは、試料は、空間周波数領域において試料の深さ分解された化学情報を符号化する空間光変調器（ＳＬＭ）を使用することによって生成される調整可能な光ビートパターンを有するベッセルビームによって照射される。３Ｄ ＳＲＳ断層像は、逆高速フーリエ変換（ＩＦＦＴ）を実施することによって迅速に取り戻すことができる。本開示はまた、独特のベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴ撮像方法の理論的な導出および分析を示し、また、ベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴ撮像システムの開発を示して、様々な試料（例えば、ポリマービーズファントム、ラマン活性結晶、植物細胞、および生物組織）に対する無標識の体積測定によるより深い化学撮像のためのＳＲＳＴの能力を実験的に実証する。
【0011】
図１は、例示的な実施形態によるＳＲＳＴ撮像システム１００の概略図を示す。２つのレーザ出力（１０４１ ｎｍの１つはストークスビーム１０２として使用され、他の調整可能な出力（６８０～１３００ ｎｍ）はポンプビーム１０４として機能する）を有するフェムト秒（ｆｓ）レーザ源（Ｉｎｓｉｇｈｔ ＤＳ ｄｕａｌ、Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ－図示せず）が、ＳＲＳＴ撮像における組織励起のために使用される。ポンプビーム１０４およびストークスビーム１０２は、８０ ＭＨｚの繰り返し率で動作する約１００ ｆｓのパルス幅を有する。ポンプビーム１０４は、空間光変調器（ＳＬＭ）１０６（ＰＬＵＴＯ ＢＢ、Ｈｏｌｏｅｙｅ）によって位相変調される。ストークス光１０２は、アキシコン１０８（ＡＸ２５１－Ｂ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を用いてベッセルビームに変換され電気光学変調器（ＥＯＭ）（ＡＰＥ－ベルリン－図示せず）。ポンプビーム１０４とストークスビーム１０２は、ダイクロイックミラー１１０を用いて結合される。ポンプビーム１０４およびストークスビーム１０２を受け取るレンズＬ１（ｆ＝１００ ｍｍ）の焦点面上のリングパターンは、４－ｆシステムを通して多光子走査顕微鏡（ＭＰＭ－４Ｒ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）のガルボミラー上に結像され、次いで、さらに、レンズＬ１の背面開口上に投影される。水浸顕微鏡対物レンズ１１２（Ａｐｏ ＬＷＤ ２５Ｘ、１．１０ｗ、Ｎｉｋｏｎ）から、顕微鏡の別の内部４－ｆシステムを通して得た。順方向では、コンデンサ１１４（ＣＣ Ａｃｈｒｏｍａｔ／Ａｐｌａｎａｔ、Ｎ．Ａ．＝１．４、Ｎｉｋｏｎ）を使用して、透過ポンプビームおよび透過ストークスビームを収集する。透過ポンプビームは、バンドパスフィルタセット１１６（Ｓｅｍｒｏｃｋ）を使用して透過ストークスビームからスペクトル的に分離され（すなわち、透過ストークスビームは遮断される）、大面積フォトダイオード１１８（ＦＤＳ１０１０、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）によって検出される。ロックイン増幅器１２０（ＡＰＥ－Ｂｅｒｌｉｎ）を使用して、フィルタリングされたポンプビームを復調し、試料からＳＲＳ信号（すなわち、誘導ラマン損失（ＳＲＬ））を取得する。深度分解ＳＲＳＴ画像は、例えば、逆高速フーリエ変換を実施することによって、ＳＲＳ信号から迅速に取り戻すことができる。
【0012】
ＳＲＳ撮像では、試料は、共線ポンプビーム（ωｐ）、および高開口数（Ｎ．Ａ．）対物レンズを通して厳密に焦点を合わせたもとでのストークスビーム（ωｓ）（ ωｓ＜ωｐ）によって照射される。生成されるＳＲＳ信号は、ポンプビーム強度とストークスビーム強度との積ＩｐＩｓに比例する。ポンプ励起ビームとストークス励起ビームの両方が、試料を励起するベッセルビームである場合、それらの強度分布は、以下のように表すことができる。
ここで、ρは、ρ（ｐｕｍｐ）またはρ（Ｓｔｏｋｅｓ）であり得る。Ｉρ（ｚ）は、軸方向に沿った強度分布であり、Ｊ０（ｋｒρｒ）は、第１種のゼロ次ベッセル関数である。ｋｒρは、横方向波数ベクトルであり、ｒは、横方向座標である。ベッセルビームは非常に細いニードルビームであるので、その横方向の寸法を無視することによって、３Ｄ試料ｆ（ｘ，ｙ，ｚ）の２Ｄ投影ＳＲＳ画像Ｆ（ｘ，ｙ）は、次のように表される。
【数1】
【数2】
【0013】
光学ビーティング技術（ＯＢＴ）は、ベッセルポンプビームが空間周波数Δｋｚを有するビーティングパターンを含むことを必要とする。すなわち、Ｉｐ（ｚ）がＩｐ（ｚ）［ｃｏｓ（Δｋｚｚ）＋１］ｄｚとなり、次いで、２Ｄ投影Ｆ（ｘ，ｙ，Δｋｚ）は、以下のように空間周波数領域における試料の深さ情報を反映する。
【数3】
【0014】
Δｋｚ空間では、式（２）の余弦関数の周波数は、ｚに比例する。すなわち、より深い位置ｚにある物体は、Δｋｚ空間でより速く振動する。その逆フーリエ変換は、以下のようにあらわされる。
ここで、Δｋｚは、Δｋｚ，ｍｉｎからΔｋｚ，ｍａｘまでに範囲であり、
であり、“＊”は畳み込みを示す。方程式（３）の右辺の３つの項は、それぞれ、取り戻された画像ｆ（ｘ，ｙ，ｚ’）Ｉｐ（ｚ’）Ｉｓ（ｚ’）、鏡像ｆ（ｘ，ｙ，－ｚ’）Ｉｐ（－ｚ’）Ｉｓ（－ｚ’）、直流（ＤＣ）成分Ｃδ（ｚ’）を表す。再構成された３Ｄ画像ｆ（ｘ，ｙ，ｚ’）は、照明関数Ｉｐ（ｚ’）Ｉｓ（ｚ’）へ正規化し、しかし、鏡像とＤＣ成分を省くことによって得ることができる。
【数4】
【数5】
【0015】
軸方向分解能は、方程式（３）におけるｓｉｎｃ関数によって決定され、そこで、半値全幅（ＦＷＨＭ）は、以下の通りである。
【数6】
【0016】
軸方向分解能は、Δｋｚ，ｍａｘ－Δｋｚ，ｍｉｎのビート周波数範囲に反比例する。
【0017】
図１を参照すると、ＳＬＭ １０６は、ベッセルビーム生成のためにポンプビーム１０４に位相パターンを課すために使用される。光学ビーティングパターンを有するベッセルポンプビーム１０４は、ＳＬＭ １０６の後に形成され得、顕微鏡対物レンズの後部開口上に現れる２つの同心リングをもたらす。最終的に、ベッセルポンプビームの光ビーティングパターンは、４－ｆシステム（Ｌ１および顕微鏡対物レンズ１１２）を通して試料上に投影される。対物レンズ１１２の後部開口上で、ベッセルストークスビーム１０２は単一のリングを形成する。これら２つのビームの積は、依然として、試料内にビーティングパターンを有する。
【0018】
ＳＲＳＴのためのＯＢＴにおけるビーティングパターン生成のメカニズムを解明するために、図２ａは、ＳＬＭ １０６上の位相パターンのいくつかの例を表示する。例示的な実施態様では、位相パターンは、異なる収束角を有する２つのアキシコン位相から構成される。顕微鏡対物レンズ１１２の後部開口上の対応する強度分布も示されている（図２ｂのリングを参照）。外側リングおよび内側リングの半径は、それぞれ、ｒ１とｒ２である。各リングは、顕微鏡対物レンズを通過した後に、試料上にベッセルビームを生成する。２つの重畳されたベッセルビームは、異なる軸方向の波数ベクトル、すなわち、
および
を有し、ここで、λｐは、ポンプ波長であり、nは、サンプルの屈折率であり、
および
であり、Ｒは、対物レンズの後部開口の半径である。それらの干渉は、試料内のベッセルビームに沿って光ビーティングパターンをもたらす。ビート周波数Δｋｚは、
である。
【数7】
【数8】
【数9】
【数10】
【数11】
【0019】
式（５）によれば、ビート周波数Δｋｚはｒ１またはｒ２を変化させることにより可変である。ビーティングパターンを有する対応するビーティングベッセルビームが図２ｃに示されている。
【0020】
周波数領域光コヒーレンストモグラフィ（ＦＤ－ＯＣＴ）と同様に、式（３）は、取り戻された画像、鏡像、およびＤＣ成分を含む。ＦＤ－ＯＣＴでは、これらが重なり合って、取得された画像が判別できなくなることがある。しかし、ＳＲＳＴは、そのような重複の問題がないという利点を有する。レンズＬ１および対物レンズは、４－ｆシステム（図１参照）を形成し、したがって、サンプル上のビームは、ＳＬＭ １０６の後のビームの像である。式（２）によれば、試料上のｚ＝０平面は、任意のΔｋｚに対して位相φ＝Δｋｚｚが０の平面である。ＳＬＭ １０６上の位相パターンの中心画素の位相は、任意のΔｋｚに対してゼロであるので、料上のｚ＝０平面は、ちょうどＳＬＭ１０６の像平面である。ベッセルビームは、ＳＬＭ１０６の後に形成され、したがって、ｚ＞０のときのみ照明関数Ｉｐ（ｚ）＞０である。したがって、例示的な実施形態によるＳＲＳＴで取り戻された画像は、鏡像およびＤＣ成分と区別することができる。さらに、インターフェログラムを生成するために試料の外側に参照アームを必要とし、その撮像を反射モードのみに制限する（ほとんどの生体撮像に適用可能であるが）ＯＣＴとは異なり、例示的な実施形態によるＯＢＴベースのＳＲＳＴは、インターフェログラムがＳＲＳＴにおける３Ｄ組織撮像のために試料の内側で直接生成されるので、外部参照アームを必要とせずに透過モードと反射モードの両方で生体撮像に適用され得る汎用性がある。
【0021】
（ｉ）Δｋｚ空間における撮像範囲およびステップサイズ：例示的な実施形態によるＳＲＳＴ撮像では、１４１個のフレームの位相パターンがＳＬＭ１０６上に１つずつ表示され、これはステップサイズ０．００４９μｍ－１で０から０．６８μｍ－１までの範囲でのベッセルポンプビーム１０４の１４１個のビート周波数Δｋｚを生成する。１４１個の生ＳＲＳ画像が、画像スタックを形成するために、各位相パターンに対して連続的に取得される。次いで、３Ｄ深度分解ＳＲＳＴ画像が、逆高速フーリエ変換（ＩＦＦＴ）によってＳＲＳ原画像のスタックから迅速に取り出される。
【0022】
（ｉｉ）試料内のベッセルビームの長さ： 例示的なＳＲＳＴシステムでは、ポンプビームとストークスベッセルビームの両方の長さは、約２００μｍである。
【0023】
（ｉｉｉ） レーザ出力： レーザ出力：試料上の平均レーザ出力は、典型的には、例示的なＳＲＳＴシステムに対してＰＳＲＳＴ＝１００ｍＷであり、従来のＳＲＳに対してＰｃｏｎ－ＳＲＳ＝１０ｍＷである一方、対応するピーク電力密度は、ＳＲＳＴに対して
であり、従来のＳＲＳに対して
である。ここで、ｆ＝８０ＭＨｚはレーザ繰り返し率であり、τ＝１００ｆｓはパルス幅であり、Ａ＝π（ｄ／２）２＝０．７μｍ２は焦点スポット面積であり（半径ｄは
である）、Ｃ＝１／４０はガウスビームとベッセルビームとの間の軸方向に沿った長さの比であるスケーリング係数である。ベッセルビームのレーザパワーは軸方向に沿って広がるため、ピークパワー密度はＳＲＳＴ撮像では比較的低い。
【数12】
【数13】
【数14】
【0024】
撮像時間：一例では、典型的な画素滞留時間は、ＳＲＳＴに対してΔτＳＲＳＴ＝４５μｓであり、従来のＳＲＳに対してΔτｃｏｎ－ＳＲＳ＝１１μｓである。そのようなピクセル滞留時間は、試料におけるＳＲＳＴ撮像の良好な品質のための適切な信号対雑音比（ＳＮＲ）レベルを維持するために選定される。画素数５１２×５１２に対して、２Ｄラスタ走査速度は、ＳＲＳＴ撮像に対して１２ｓであり、従来のＳＲＳ撮像に対して３ｓである。使用されるＳＬＭ１０６（ＰＬＵＴＯ ＢＢ、Ｈｏｌｏｅｙｅ）のフレームレートは約６０Ｈｚであり、顕微鏡のｚモータ走査は５０Ｈｚである。
【0025】
例示的な撮像用途で使用される化学的および生物学的試料は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）およびポリスチレン（ＰＳ）ビーズ、１，４－ジフェニルブタ－１，３－ジイン（ＤＰＢＤ）結晶、春玉葱、ブタ組織、およびマウスの耳を含む。
【0026】
撮像用の第１の試料は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）およびポリスチレン（ＰＳ）を含む。この実施例では、１０μｍポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）およびポリスチレン（ＰＳ）ビーズの混合物がＳＲＳＴ撮像用の２ｗｔ％硬化アガロースゲルファントムに包埋する。設計されたビーズゲルファントムの寸法は２×２×３ｃｍ３であり、ビーズファントム内のポンプ（８００ｎｍ）およびストークス（１０４０ｎｍ）レーザビームの散乱平均自由経路は、それぞれ６５μｍおよび５５μｍである。ＰＭＭＡビーズは２９５０ｃｍ－１においてシグナルを与える（Ｏ－ＣＨ３中のＣ－Ｈの対称振動およびＣＨ２の非対称振動）一方で、ＰＳビーズは２９５０ｃｍ－１および３０５０ｃｍ－１の両方のラマンシフトにおいてＳＲＳシグナルを生成する。２９５０ｃｍ－１および３０５０ｃｍ－１におけるＰＳのＳＲＳ強度比は約０．８：１である。アガロースゲルのＳＲＳシグナルは、使用されるその低濃度（約２重量％）のために、これらの２つのラマンシフトにおいてＰＳおよびＰＭＭＡよりもはるかに弱い。ＰＭＭＡビーズのＳＲＳ画像は、２９５０ｃｍ－１～３０５０ｃｍ－１におけるＳＲＳ画像を差し引くことによって得られ、これらはＳＲＳ強度比へ正規化される。
【0027】
例えば、上述のようなポリマービーズアガロースゲルにおけるポンプ光ビームおよびストークス光ビームの散乱平均自由行路は、ミー散乱モデルに基づいて推定することができる。ファントム内の混合ビーズの濃度Ｎｓｐｈｅｒｅは約１０５ｓｐｈｅｒｅ／ｍｍ３である。８００ｎｍ（ポンプビーム）におけるＰＭＭＡ及びＰＳの屈折率は、それぞれ、１．４８及び１．５８である（［ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ．ｉｎｆｏ／］）． ファントム内のアガロースゲルの屈折率は約１．３４である。ミー散乱モデル化を単純化するために、全てのビーズの平均屈折率は約１．５３である（［ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ．ｉｎｆｏ／］）。ファントム内のアガロースゲルの屈折率は約１．３４である。Ｍｉｅ散乱モデル化を単純化するために、全てのビーズの平均屈折率は約１．５３であると仮定する。
【0028】
上記のパラメータをＭｉｅ散乱計算モデル［ｈｔｔｐｓ：／／ｏｍｌｃ．ｏｒｇ／ｃａｌｃ／ｍｉｅ＿ｃａｌｃ．ｈｔｍｌ］に与えると、得られたビーズのＭｉｅ散乱断面積σは１５７．７７μｍ２であり、散乱係数μｓはσＮｓｐｈｅｒｅ＝１５７．７７ｃｍ－１である。したがって、ビーズゲルファントムにおける８００ｎｍでのポンプビームの散乱平均自由経路
は、約６５μｍである。同様に、ビーズゲルファントムにおける１０４０ｎｍ（ストークス波長）において散乱係数μｓは１８１．６１．ｃｍ－１であり、したがってビーズゲルファントムにおける１０４０ｎｍでのストークスビームの散乱平均自由経路
は約５５μｍである。
【数15】
【数16】
【0029】
図３は、アガロースゲルファントムのマトリックスに埋め込まれた混合された１０μｍのポリスチレン（ＰＳ）及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズのＳＲＳＴに基づく例示的なＳＲＳＴシステムの性能評価を示す。混合された１０μｍのポリスチレン（ＰＳ）及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズを上記のようにアガロースゲルファントムに包埋したものの化学選択的ＳＲＳＴ画像および従来の点スキャンガウシアンベームＳＲＳ画像を、それぞれ図３ａおよび３ｂに示す。ファントム内のビーズのｚ深さは、疑似カラースケールを使用することによって示される。例示的な実施形態によるＳＲＳＴシステムは、異なるファントム深さにわたって異なるポリマービーズに関する深さ分解化学情報を正確に識別し、これは、従来のポイントスキャンＳＲＳ撮像とほぼ同一である。ビーズの深さ情報がＳＲＳＴにおいてどのように決定されるかを示すために、一例として、図３ａのより深いビーズ（ビーズ１）およびより浅いビーズ（ビーズ２）が観察のために選択される。図２ｃは、これら２つのビーズを横切って引かれた線に沿った空間周波数領域における測定データを示す。これは、より深いビーズはΔｋｚ軸に沿ってより速く振動することを明確に示し、これは、式（２）の予測と一致する。図３ｄは、ｘ－ｚ平面上のビーズ１およびビーズ２の取り戻されたＳＲＳＴ画像を示し、ｚスキャンフリー３ｄ撮像のためのＳＲＳＴの光学切片化能力を確認する。
【0030】
より深い３Ｄ化学撮像のための例示的な実施形態によるＳＲＳＴ技術の利点を実証するために、ＳＲＳＴ及び従来のＳＲＳにおけるビーズのクラスタが、それぞれ図３ｅ及び図３ｆに表示される。このクラスタの最上層は約ｚ＝２１μｍである。ｚ＝３２μｍにおけるＳＲＳＴ画像とＳＲＳ画像を比較すると、はるかに強いＳＲＳ信号が提供される。より深い深さｚ＝４６μｍでは、ビーズは、ＳＲＳＴにおいて依然として明確に観察することができ、より深い領域におけるビーズのＳＲＳＴ画像輝度レベルは、ｚ＝２１μｍでのより浅いビーズのそれよりわずかに薄暗いのみである。対照的に、ｚ＝４６μｍでのビーズの従来のガウスビームＳＲＳ信号レベルは、より浅いビーズのものよりもはるかに弱い（図３ｆを参照）。結果は、ＳＲＳＴ撮像で使用されるベッセルビームが、散乱障害物を迂回した後に自己再構築され、それにより、例示的な実施形態によるＳＲＳＴ技術が、試料内の他のより浅いビーズの影の下にあるより深いビーズにより良好に到達することが可能になり、より深い組織撮像がもたらされることを確認する。
【0031】
ベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴによる撮像深度の改善を定量的に分析するために、図３ｇは、従来のガウスビームＳＲＳ顕微鏡法（線３０４）と比較した、ＳＲＳＴにおける異なる深度でのビーズの正規化されたＳＲＳ強度（線３０２）を示す。プロットは、指数関数的減衰関数
によって適合される。ここで、ｚ０は、浸透深さである。ＳＲＳＴについてはｚ０＝１３０μｍ（９５％信頼区間：［７７μｍ， １８３μｍ］）である一方、従来のＳＲＳについてはｚ０＝５８μｍ（９５％信頼区間：［４２μｍ， ７３μｍ］）である。例示的な実施形態によるＳＲＳＴ技術は、従来のＳＲＳ顕微鏡法と比較して、透過深度において２倍を超える改善を提供することができ、より深い組織の３Ｄ撮像のためのＳＲＳＴの可能性をさらに確認することができることが分かる。この増強効果は、図３ａを図３ｂと比較することによっても明確に観察することができ、ＳＲＳＴにおいてより深い深さに位置するビーズ（例えばビーズ１）は、従来のＳＲＳ画像におけるものよりもはるかに明るく見え、試料におけるガウスビームよりもベッセルビームのより深い光透過を証明する。
【数17】
【0032】
例示的な実施形態によるベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴシステムは、生体試料における深部組織撮像にも使用することができる。例えば、図４ａおよび４ｂは、異なる深度でのマウスの耳の皮膚のＳＲＳＴおよび従来のＳＲＳ画像（タンパク質および脂質のＣＨ３ストレッチの２９３５ ｃｍ－１でのラマンシフト）の比較を示す。皮膚表面の近く（ｚ＝２０μｍ）ではＳＲＳＴおよびＳＲＳ撮像の両方で脂質の豊富な皮脂腺がはっきりと見られたが、組織のより深くに進むと、ＳＲＳＴは、従来のＳＲＳ撮像と比較して、はるかに強いＳＲＳ信号を示す（例えば、図４ａおよび４ｂにおける矢印によってマークされるそれらの場所）。図４ｃは、図４ａおよび図４ｂの選択された領域（楕円）における強度を比較する。異なる深さでのＳＲＳＴ画像からの測定強度は、表面に近い（ｚ＝２０μｍ）強度に正規化される。従来のＳＲＳ画像からの強度は、同じ方法で正規化される。図４ｃは、ＳＲＳＴの強度が、組織深度の増加に伴って、従来のＳＲＳのものよりはるかにゆっくりと減衰することを明確に示し、ＳＲＳＴが、より深い組織撮像のためのはるかに優れた能力を有することを確認する。図４ｄおよび図４ｅは、ＳＲＳＴおよび従来のＳＲＳの３Ｄ画像を比較し、ＳＲＳＴおよび従来のＳＲＳの両方が、皮膚表面により近い組織領域において非常に類似した画像を与えるが、ＳＲＳＴは、より深い組織深度においてはるかに鮮明な画像を提供することを反映している。
【0033】
例示的な実施形態によるＳＲＳＴシステムは、様々な撮像ターゲット（例えば、生体組織、ラマン活性結晶、及び植物細胞）上の３Ｄ体積測定深部分子撮像にも使用される（図５）。より良好な視覚化のために、図５ａ～図５ｃに示されるように、深度情報は、疑似カラースケールを使用することによって提示される。
【0034】
図５ａは、１，４－ジフェニルブタ－１，３－ジイン（ＤＰＢＤ）結晶
のＳＲＳＴ ３Ｄ画像を示す。ＤＰＢＤは、生体試料中の小分子の追跡及び細胞小器官の標的化に広く適用される有用なラマンタグである。図５ｄは、例示的な実施形態によるシステムに基づくＳＲＳＴ画像を、２つの異なる深度における従来のポイントスキャンＳＲＳ画像と比較する。より浅い深さ（例えば、ｚ＝４０μｍ）での結晶子は、ＳＲＳＴと従来のＳＲＳ撮像との間で同様のＳＲＳ信号レベルを生成する一方で、より深い結晶子（矢印でマークされる）（例えばｚ＝１３３μｍ）は、ＳＲＳＴにおいて明確に見出すことができるが、従来のＳＲＳにおいてはほとんど不可視である。ＳＲＳＴは、はるかに良好な撮像深度を示す。
【数18】
【0035】
図５ｂは、春玉葱の葉緑体の２９３５ｃｍ－１におけるＳＲＳＴ ３Ｄ画像（２９３５ｃｍ－１におけるＳＲＳＴ信号は以下に記載するようにクロロフィルにおけるＣ－Ｈ伸縮および２光子吸収の両方を含む）を示す。葉緑体の大部分は植物組織表面のより近くに分布し、それによって、暗い環境下でさえも有効な光合成を可能にする。図５ｅは、例示的な実施形態によるシステムに基づくＳＲＳＴ画像を、図５ｂのボックス内で強調表示された選択された領域の従来のＳＲＳ画像と比較する。いくつかの葉緑体（矢印でマークされる）は、ＳＲＳＴ（例えば、ｚ＝４５μｍ） において明確に観察され得る。これは、おそらく、ＳＲＳ撮像におけるガウスビーム照明下では、それらのより深い葉緑体が、いくつかのより浅い葉緑体の影の下にある（例えば、ｚ＝２７μｍ）という理由による。一方、本発明の実施形態によるＳＲＳＴシステムで使用されるベッセルビームは、植物細胞内の浅い葉緑体をバイパスすることによって、深い葉緑体に到達することができる。
【0036】
本実施例では、スペクトルフォーカシングＳＲＳシステムを用いて、春玉葱葉のクロロプラストのＳＲＳスペクトルを測定する。各測定は、１６６ｃｍ－１をカバーすることができる。したがって、ポンプビームの中心波長は、４回シフトされて、２７８６～３０４５ｃｍ－１のスペクトル範囲全体をカバーする。２９００～２９５０ｃｍ－１におけるラマンピークは４つの測定の全てにおいて明確に観察され（図６を参照）、ＣＨ３振動に対応する。ＣＨ３基は、異なるタイプのクロロフィルにおいて一般的に観察される。加えて、強い非化学的に特異的な２光子吸収バックグラウンド（ラマンピーク強度の約７０％）も観察される。３０００ｃｍ－１を超えて、水からのＳＲＳ信号により信号が増加する。
【0037】
図５ｃは、豚肉組織中の脂肪の（脂質のＣＨ２の２８４５ｃｍ－１における）ＳＲＳＴ ３Ｄ撮像の別の例を示す。細胞および組織生理機能（例えば、エネルギー貯蔵）において重要な役割を果たす脂質液滴の３Ｄ形態および分布は、ＳＲＳＴ撮像において、より深い組織領域においてさえも明確に観察することができる。図５ｆは、例示的な実施形態によるシステムに基づくＳＲＳＴ画像を、図５ｃにおいてボックスによってラベル付けされた選択されたエリアの従来のＳＲＳ画像と比較する。例えば、１５μｍにおいて矢印でマークされた３つの小さな脂肪滴がある。ガウスビーム照明を用いた従来のＳＲＳ撮像では、光の影が、より深い脂肪滴（例えば、ｚ＝１５μｍ） 内にアーチファクト（矢印によってもマークされる）を生成するが、組織におけるベッセルビーム伝播の自己再構成特性の利点のために、ＳＲＳＴ撮像においてはそのようなアーチファクトは観察されない。上記の結果は、例示的な実施形態によるベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴが、生物学的および生物医学的システムにおける体積測定のより深い組織撮像のための強力な無標識３Ｄ分子撮像ツールであることをさらに実証する。
【0038】
例示的な実施形態によるＳＲＳＴと従来のＳＲＳ撮像との間の軸方向分解能及び横方向分解能も比較される。ＳＲＳＴでは、深度分解能は、式（４）によって決定され、Δｋｚは、式（５）によって決定される。本発明の実施形態に係るＳＲＳＴ撮像において、ｒ１は固定され、
に対応し、ｒ２は０．５ｒ１からｒ１まで変化し、０．２７から０．５４までの
に対応する。ここで、ｎ＝１．３３が、使用される組織の屈折率（水の屈折率に近い）である。したがって、λｐ＝８００ｎｍに対してΔｋｚの範囲は０～０．６μｍである。Ｆ（ｘ，ｙ，Δｋｚ）はΔｋｚの偶関数あるから、撮像取り戻しのためのΔｋｚの有効ビート周波数はー０．６８～０．６８μｍ―１まで変化し、これはＳＲＳＴ撮像における５．６μｍの深さ分解能に対応する。この予測されたＳＲＳＴ深さ分解能は、測定された深さ分解能５．４９μｍと一致する（以下の計算参照）。Ｎ．Ａ．＝０．５４を使用した従来の点走査ＳＲＳとの比較において、軸方向に沿ったエアリーディスクの半値全幅（ＦＷＨＭ）（２λ／Ｎ．Ａ．２）は、λｐ＝８００ｎｍおよびλｓ＝１０４１ｎｍに対して、それぞれ、５．５μｍおよび７．１μｍである。深さ分解能は、従来のＳＲＳ撮像では、
である。一方、横方向の非回折ベッセルビームサイズは、試料中のガウシアンビーム（λｐ＝８００ｎｍ、Ｎ．Ａ．＝０．５４）の横方向分解能（約０．９０μｍ）の約１．３３分の１に絞ることができる。したがって、例示的な実施形態によるＳＲＳＴ撮像は、従来のＳＲＳと同様の軸方向分解能を共有するが、細胞内分解能を有する無標識３Ｄ容積測定深部組織撮像を達成するためのより高い横方向分解能を有する。
【数19】
【数20】
【数21】
【0039】
図７ａは、ｘ－ｚ平面における、水中に浸漬されたＤＰＢＤ結晶のＳＲＳＴ画像を示す。図７ｂは、図７ａに示される白線に沿った結晶と水との界面にわたる強度プロファイルを示す。データは、誤差関数
を使用してフィッティングされる。ここで、Ａ１、Ａ２、およびｚ０は、フィッティングパラメータである。フィッティング結果は、曲線７０２としてプロットされる。軸方向分解能は、フィッティング関数ｈ（ｘ）内のガウス関数のＦＷＨＭである。すなわち、強度プロファイルに示され、上で述べたように、分解能は
である。
【数22】
【数23】
【0040】
例示的な実施形態によるｅｐｉ検出ＳＲＳＴ技術は、腫瘍内不均一性の迅速な無標識分子評価、及びサブミクロン分解能での全膠芽腫（ＧＢＭ）組織標本における分子サブタイプ化にも適用することができる。図８ Ａ～８ Ｃは、例示的な実施形態によるＳＲＳＴシステムを使用して、ほんの一瞬の間に２８５０ｃｍ－１および２９４０ｃｍ―１のラマンシフトで取得された３つのＧＢＭサブタイプ（それぞれ、古典的、間葉系および前神経）の代表的なＳＲＳ画像を示す。各ラマンシフトは、２８５０ ｃｍ－１で、ＧＢＭ中の脂質分布が脂質分子のＣＨ２結合の対称伸縮により可視化される、明確な生体分子分布を提供し（図８の第１列）、一方、脂質およびタンパク質の両方におけるＣＨ３結合の伸縮による２９４０ ｃｍ－１のラマンシフトへの共鳴は、組織の均一な輝度を生じる（第２列）。タンパク質に対する特異性を高めるために、２８５０ ｃｍ－１でのＳＲＳ画像を２９４０ ｃｍ－１から減算して、タンパク質分布を強調する（第３列）。さらに、２８５０ ｃｍ－１および減算画像を重ね合わせて、ミエリンを含む細胞形態を示す（最後のカラム）。一般に、ミエリンの濃度および統合性は、前神経－古典的－間葉の順に減少していることが観察され得、これは、迅速なＧＢＭ分子サブタイプ化のためのＳＲＳＴ画像化技術の染色のない組織学的可能性を示唆する。
【0041】
ＳＲＳ撮像の結果は、染色なしのＳＲＳＴ組織学的画像および２Ｄサブタイプマップの両方が２０～３０分以内に得られることを示す。代替実施形態では、例えば、より高速のスキャナを使用することによって、かかる時間をさらに短縮することができることが理解されるであろう。このような性能は、従来の単一細胞ＲＮＡ配列決定よりも優れている。ＳＲＳ組織学的結果は、脱髄状態を新しい診断特徴として評価するが、不均一性マッピングは、腫瘍内不均一性への新規の洞察を明らかにする。ＧＢＭ組織の大部分はゲノム解析の診断結果と一致するが、標本中の残りの画像タイルの重要な部分は他の分子サブタイプに属することが見出され、無標識ＳＲＳ撮像によって明らかにされたＧＢＭ不均一性の実質的な程度を示唆する。
【0042】
さらなる実施態様では、各ＧＢＭ組織上のハイパースペクトルＳＲＳ撮像から取り出されたＳＲＳスペクトルは、ＧＢＭ分子サブタイプ化のためのディープラーニングアルゴリズムを用いて調査される。組織画像全体の各画像タイルは、サブタイプ間の比較のために５１２×５１２ピクセルを平均することによって単一のスペクトルを生成する。一般に、ＭＥＳ－ＣＬ－ＰＮの順にＣＨ２およびＣＨ３伸縮ピーク（２８５０および２９４０ ｃｍ－１）の減少がある。これに対して、ＧＢＭサブタイプのタンパク質スペクトルは互いに類似しており、比較的低い診断情報が埋め込まれていることを示唆している。ＳＲＳ撮像からのＳＲＳ分光情報がＧＢＭサブタイピングのための有意な診断性能をもたらすことができるかどうかを検証するために、ＳＲＳスペクトルが二次サポートベクターマシンモデルに提供される。訓練セットおよび検証セットについて８０／２０の比を有するハンドアウト検証は、混同行列（図９Ａ）に示されるように、８０．６％の診断精度を与える。ディープラーニング診断モデルのロバスト性は、約０．８９の平均面積積分を有する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によってさらに確認される（図９Ｃ～９Ｅ）。したがって、この実装形態で開発されたディープラーニングアルゴリズムは、無染色脳腫瘍診断のためのＳＤ－ＳＲＳＴ ３Ｄ撮像、および精密神経手術のための腫瘍マージン画定にさらに拡張され得る。
【0043】
図１０は、例示的な実施形態による誘導ラマン散乱トモグラフィ方法のフローチャートを示す。ステップ１００２において、第１の入力光ビームが生成される。第１の入力光ビームは位相変調される。ステップ１００４では、第２の入力光ビームが生成される。第２の入力光ビームは振幅変調される。ステップ１００６では、第１および第２の入力光ビームが試料上に方向付けられる。ステップ１００８では、試料からの出力光ビームが収集される。ステップ１０１０では、第１の入力光ビームに対応する出力光ビームの少なくとも一部が検出される。ステップ１０１２では、出力光ビームの検出された部分から試料の深度分解画像が形成される。
【0044】
上述のように、従来の３Ｄ体積撮像における課題、例えば、（ｉ）生細胞及び組織における病態生理学的環境を乱す可能性がある蛍光標識（共焦点蛍光顕微鏡法）の必要性、及び（ｉｉ）混濁組織における集束ガウスビーム照明の散乱によるより短い撮像深度は、生物系における迅速な動的及び機能的３Ｄ撮像のためのそれらの広範な適用を妨げてきた。本発明の実施形態によるベッセルビーム－光ビーティング技法（ＯＢＴ）に基づくｚ－スキャンフリー誘導ラマン散乱トモグラフィ（ＳＲＳＴ）は、上記の問題を解決して、無標識の体積測定によるより深い組織の撮像を達成することができる。例示的な実施形態では、組織深さにわたってレーザ集束の機械的走査を必要とせずに、ＳＬＭを通してポンプビームに投影される位相パターンを電子的に変化させることによって、試料内の２つの重なり合うベッセルビームの干渉により、光学切片化のためのポンプビームの光学ビーティングパターンを迅速に生成することができる。試料内のビーティングベッセルポンプビームとベッセルストークスビームとの重ね合わせは、３Ｄ ＳＲＳ撮像のための深度符号化ＳＲＳを生成する。したがって、細胞内分解能を有する体積測定試料についての深度分解３Ｄ化学分布は、ＩＦＦＴを実施することによって迅速に取り出すことができる。
【0045】
上述の例は、本ベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴ技術の有用性を実証しており、アガロースゲルに埋め込まれた多数の試料（例えば、ポリマービーズ（ＰＭＭＡおよびポリスチレン）、ラマン活性結晶、植物細胞、および生物組織（マウスの耳の皮膚、ブタの組織））における体積測定のより深い化学撮像を可能にする。３Ｄ ＳＲＳ撮像深度を改善するために、ポンプビーム及びストークスビームとしての非回折ゼロ次ベッセルビームが、ＯＢＴベースのＳＲＳＴ撮像に用いられ、これは、光路に沿って遭遇する障害物を超えて自己再構成特性を示し、混濁媒体における散乱効果に対して顕著な復元力を有する。ベッセルビーム伝搬の固有の自己再構成能力は、ＳＲＳＴによるより深い３Ｄ化学撮像について実証されており、これは、上述の例において明確に示されている。これらの例は、障害物の後のベッセルビーム伝播の自己回復を確認し、それによって障害物の影の下の分子を照射し、ＳＲＳ撮像における影のアーチファクトを排除し、散乱弾性特性を有する高散乱媒体中を伝播するときのベッセルビームによるエネルギー損失が比較的低いことを確認する。結果として、例示的な実施形態によるベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴ撮像は、より深い生物医学的撮像における進歩をもたらすことができ、混濁媒体における回折及び散乱は、従来のガウスビームＳＲＳ顕微鏡法を使用することによるタイトな焦点の形成を妨げる。
【0046】
ＳＲＳＴは、本質的に、多重化検出技術（すなわち、生画像データが、層ごとの走査ではなく、投影画像として取得される）であり、ノイズが試料とは無関係であるという条件で、フェレットの利点により、取り戻された画像のＳＮＲを改善することができることが理解されるであろう。実際に、ＳＲＳは、レーザ源の固有の特性である励起レーザビームのショットノイズによって制限されるので、例示的な実施形態によるＳＲＳのノイズは、試料とは無関係である。図３に示される例では、ＳＮＲは、生データから取り出されたＳＲＳＴまで５．３倍改善される。取り戻されたＳＲＳＴ画像の最終的なＳＮＲは、ＳＲＳＴ撮像における試料中の溶媒バックグラウンドによって影響されない。
【0047】
例示として、図１１は、ＳＲＳＴにおける生データの信号対雑音比（ＳＮＲ）、取り戻されたＳＲＳＴ画像（図３ａ）、およびビーズの従来のＳＲＳ（図３ｂ）を比較する。これは、Ｆｅｌｌｇｅｔｔの利点により、ＳＮＲが、生データ（ＳＮＲ＝３）から取り戻されたＳＲＳＴ（ＳＮＲ＝１６）まで約５．３倍改善されることを示す。取り戻されたＳＲＳＴのＳＮＲは、従来のＳＲＳ撮像のＳＮＲ（ＳＮＲ＝２１）に匹敵するが、ＳＲＳＴでは、４倍低いピーク電力密度があり、１６倍弱い局所信号をもたらし、１０倍高い平均電力があり、
高いノイズをもたらす。
【数24】
【0048】
溶媒バックグラウンド信号がＳＲＳＴ撮像のＳＮＲを劣化させないことを示すために、ＳＲＳシミュレーション結果を図１２に示す。具体的には、シミュレーションで使用される２つの異なる試料が、それぞれ図１２ａ～図１２ｂに示されている。試料Ｉは溶媒なしでｚ＝１００μｍにおけるビーズであり、試料ＩＩは溶媒中の同じビーズである（溶媒４０～１６０μｍの範囲で、溶媒バックグラウンドシグナルレベルはビーズの６０％である）。ＳＲＳＴにおける生データ（投影画像）は、それぞれ図１２ｃ～図１２ｄにプロットされているように、Δｋｚ空間（フーリエ領域）における両方の試料のＳＲＳ信号を記録する。図１２ ｅ～図１２ｆは、それぞれ図１２ｃ～図１２ｄにプロットされた曲線の逆高速フーリエ変換（ＩＦＦＴ）によって得られる、ｚ軸に沿った取得されたＳＲＳＴ画像の強度プロファイルを示す。図１２ｃ～図１２ｆにおいて、曲線の一方のセットは、純粋なビーズＳＲＳ信号を表し、曲線の他方のセットは、純粋なビーズＳＲＳ信号＋ノイズを表す。
【0049】
示された生データ中のノイズは、試料とは無関係であるべきである。いくつかの実装形態では、図１２ｃおよび図１２ｄにおいて同じポアソンノイズ（７×１０―４ｎＪ／ｐｉｘｅｌ）が加えられている。信号レベルは図１２ｄ（約７×１０―４ｎＪ／ｐｉｘｅｌ）における方が図１２ｃ（約５×１０―４ｎＪ／ｐｉｘｅｌ）における方よりはるかに高い。なぜならば、溶媒は投影画像においてはるかに強いバックグラウンドシグナルを生成するからである。最後に、取り戻されたＳＲＳＴ画像（図１２ｅ～図１２ｆ）のＳＮＲは、ほぼ同じであり、強いＳＲＳバックグラウンド信号を有する溶媒がＳＲＳＴ撮像の最終ＳＮＲに影響を及ぼさないことを証明している。
【0050】
ＳＲＳＴにおけるベッセルビーム照明下では、レーザパワーは、軸方向に沿って伸びる（（約１００μｍの例示的な実施形態）に沿って広がることが理解されるであろう。したがって、ＳＲＳＴは、従来のガウスＳＲＳ撮像と比較して、試料上で同じ局所出力密度を達成するために、はるかに高い総レーザ出力を有する必要がある。光損傷は、主に、試料上に与えられる局所的な電力密度に依存するので、ＳＲＳＴ撮像においてより高い総電力を使用することは、試料を損傷しない。本ＳＲＳＴの例では、ＳＲＳＴ（１００ｍＷ）における試料上の総レーザパワーは、試料に光損傷を引き起こすことなく、従来のＳＲＳ（１０ｍＷ）のそれより高い。一方、従来のＳＲＳでは、総パワーが約３０ｍＷを超える場合、明らかな光損傷が観察される。、
【0051】
ＳＲＳＴは、修正された撮像モード、いわゆる周波数領域ＳＲＳＴ（ＦＤ－ＳＲＳＴ）において撮像速度を著しく改善することができることが期待される。これは、以下のように説明することができる。式（５）によれば、複数の波長成分Δλｐを有する広帯域レーザ源λｐは、複数のΔｋｚを生成するために使用することができる。したがって、ＦＤ－ＳＲＳＴでは、ＳＲＳ信号は、スペクトルが各ピクセル内に記録される分光計によって検出されることができ、深度情報は、ＩＦＦＴを用いて取得されたスペクトルを通して容易に明らかにされることができる。３Ｄ画像は、２Ｄラスタスキャンを１回だけ実行することによって迅速に取得することができる。したがって、３Ｄ撮像速度は、２Ｄ撮像と同じくらい速くなり得る。このような実施形態では、ポンプビームとストークスベッセルビームの両方が広帯域であるべきである。同時に、両方のビームは、高速３Ｄ ＳＲＳ撮像のためにスペクトル集束技術が広帯域励起の下でさえ特定のラマンピークを選択するために適用され得るように、チャープされるべきである。
【0052】
例示的な実施形態によるベッセルビーム－ＯＢＴ法のｚスキャンフリー光学切片化特性は、ＳＲＳＴ ３Ｄ撮像のみに固有ではなく、普遍的であることが理解されるであろう。記載されるＯＢＴ法は、高速３Ｄ組織撮像のための実質的に任意の他の非線形光学撮像モダリティに容易に適合され得る。例えば、現在のＯＢＴベースのＳＲＳＴシステムは、フォトダイオードを光電子増倍管（ＰＭＴ）に置き換えて、より深い組織領域から３Ｄ ＣＡＲＳ信号を収集することによって、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）トモグラフィの準備ができている。ＳＲＳＴ撮像システムにおいてポンプビームまたはストークスビームのみを使用する場合、ＯＢＴ－ＳＲＳＴ技術は、第２／第３高調波発生（ＳＨＧ／ＴＨＧ）トモグラフィ、蛍光トモグラフィ、および多光子トモグラフィに簡略化することができる。さらに、ＳＲＳＴ撮像におけるベッセルビーム－ＯＢＴ法は、高速超解像３Ｄ深部組織撮像を実現するために、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法、飽和誘導ラマン散乱顕微鏡法、および高次コヒーレントラマン散乱顕微鏡法（高Ｎ．Ａ． 対物レンズが使用される場合）などの超解像顕微鏡法技法とも適合する。
【0053】
要約すると、例示的な実施形態は、細胞内分解能を有するラベルフリーの体積測定化学撮像においてより深い浸透を達成するために、自己再構成ベッセルビームと結合された光ビーティング技術（ＯＢＴ）を使用することによって可能にされるｚスキャンフリーの誘導ラマン散乱トモグラフィ（ＳＲＳＴ）を提供する。軸方向に沿った機械的走査を必要とせずに、体積組織に関する深さ分解ＳＲＳ信号は、位相変調器を用いてベッセルポンプビームの光ビート周波数を電子的に調整することによって空間周波数領域において符号化され、したがって、深さ分解ＳＲＳＴは、３Ｄ ＳＲＳ撮像のためにＩＦＦＴを実施することによって取り出すことができる。例示的な実施形態はまた、ベッセルビームＯＢＴベースのＳＲＳＴ撮像が、従来のポイントスキャンガウスビームＳＲＳ顕微鏡法と比較して、高散乱媒体における撮像深度の少なくとも２倍の改善を提供することを示す。無標識の容積測定のより深い分子撮像のためのＳＲＳＴ技術の有用性は、様々な試料（例えば、ラマン活性結晶、生体組織、および植物細胞）に対して実証され、これは、透過深度の点で従来のＳＲＳ顕微鏡法よりも優れている。ＳＲＳＴにおけるベッセルビーム－ＯＢＴ法のｚスキャンフリー光学切片化能力の一般性は、生物学的および生物医学的システムにおける深部組織体積３Ｄ撮像のための実質的に任意の他の非線形光学撮像モダリティに容易に拡張することができる。したがって、ｚスキャンフリー光学切片化のためのＳＲＳＴにおける強力なベッセルビーム－ＯＢＴ法は、高度な３Ｄ顕微鏡撮像用途の分野全体に対して著しい影響を有し得る。
【0054】
当業者であれば、広範に記載された本発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示された本発明に対して多数の変形および／または修正を行うことができることを理解するであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないと考えられるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】